CN103843592B - 一种抗疫病不同生理小种的耐热辣椒砧木的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗疫病不同生理小种辣椒耐热砧木的选育方法，该方法综合了辣椒杂种优势育种技术与嫁接技术的优点，选育的抗病辣椒耐热砧木可明显提高综合性状优良、但抗病耐热性较差品种的抗病性和耐热性。该方法具有操作简单，节约育种时间，选育成本低等优点。这种通过选育砧木解决优良品种抗病性和耐热性的方法，极大地加快了辣椒抗性育种的进程。
Description
技术领域
本发明属于蔬菜育种领域，涉及一种辣椒砧木的选育方法，特别涉及抗疫病不同生理小种的耐热辣椒砧木的选育方法，它将杂种优势育种技术与嫁接技术巧妙地结合，选育的抗病、耐热砧木可有效提高辣椒综合农艺性状优良，但抗病耐热性差品种的抗病性和耐热性。
背景技术
辣椒（CapsicumannuumL.）是典型的“喜温不耐热”植物，当辣椒生长的环境温度超过32℃时就会发生热胁迫，导致授粉受精不良和落花落果现象的发生，严重时可使坐果率降至10%～20%，最终影响辣椒的品质和产量。在我国，大棚蔬菜已经成为蔬菜生产的重要栽培模式。在夏季，大棚虽只保留“天棚”（大棚四周大通风，只留棚顶塑料薄膜）进行通风，但棚内温度仍然很高，中午13：00-15：00时常常达到45℃以上，影响大棚辣椒越夏期的开花、坐果，甚至导致死秧现象，严重制约大棚辣椒的越夏生产。同时，辣椒疫病又是危害辣椒生产的主要病害之一，在世界上许多国家都有发生，特别是在夏季，大棚中的辣椒经常处于高温、高湿的环境中，辣椒疫病更是频繁发生。在我国青海、新疆、甘肃、陕西、北京、辽宁、上海、浙江、湖南、四川、云南等辣椒主产区辣椒疫病均曾大面积发生。随着辣椒产业的发展，辣椒疫病有逐年加重的趋势，造成了严重的经济损失。该病害的病原菌为辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeon），辣椒的苗期、成株期均可受害，致使茎、叶和果实发病。辣椒疫病传播速度快，发病田经常绝产，造成严重的经济损失。目前生产上控制辣椒疫病以化学防治为主，防治成本高，且严重污染环境。
选育既抗疫病又耐热的辣椒品种是防止或减轻越夏辣椒栽培中疫病和高温危害的有效途径，但现有抗疫病的抗源，其果形小、品质较差、转育难度大，难以满足辣椒产业化对品种更新换代的要求。生产上，一些优良品种往往具有品质好、产量高等优良特性，但不兼具耐热、抗病特性。然而，选育品质优良，综合农艺性状好，高抗疫病且耐热的品种是一项复杂又漫长的育种过程。本发明通过选育辣椒耐热纯系和抗病纯系，配制一代杂种（F1），以F1幼苗作为砧木，选品质佳，综合农艺性状优良，但抗病耐热性差的品种作为接穗进行嫁接，对嫁接苗和非嫁接苗作耐热和抗病性鉴定。结果表明，嫁接苗的抗病性和耐热性均得到了明显提高。该方法具有操作简单，节约育种时间，选育成本低等优点。这种通过选育砧木解决优良品种抗病性和耐热性的方法，极大地加快了辣椒抗性育种的进程。
以下是相关的参考文献：
1.CloningandExpressionunderHeatStressofASmallHeatShockProteinGeneCaHSP24fromPepper.ZhuWei，LuMinghui，GongZhenhui，andChenRugang[J].AfricanJournalofBiotechnology，2011，10（25）：4968-4976。
2.张莹丽，巩振辉，李大伟，黄炜，逯明辉，陈儒钢.陕西辣椒疫病病原鉴定及其防治剂的室内筛选[J]，西北农业学报，2009，18（5）：336-340。
3.马宝鹏，辣椒耐热性鉴定体系的建立及高温胁迫下花药基因表达差异的研究[M].西北农林科技大学硕士学位论文（导师：巩振辉），2013，p6-8。
4.杨茹薇，秦勇，吴慧，季金凤.辣椒嫁接抗疫病效果研究【J】，新疆农业大学学报，2010，33（1）：27-30。
发明内容
针对以上辣椒育种中存在的问题，本发明的目的在于，提出一种抗疫病不同生理小种的辣椒耐热砧木的选育方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术解决方案：
一种抗疫病不同生理小种的辣椒耐热砧木的选育方法，其特征在于，以抗辣椒疫病某一（或某些）生理小种的辣椒品系A及耐热性较强的辣椒品系B作为选育砧木的原始材料，通过连续三代单株自交分别获得纯系A-1和B-1，再以纯系A-1为母本，以B-1为父本配制一代杂种F1，以F1为砧木，以综合农艺性状优良的品种为接穗，进行嫁接，然后对嫁接苗作抗病性和耐热性鉴定，得到抗疫病不同生理小种的辣椒耐热砧木。
具体包括以下步骤：
1）抗疫病某一（或某些）生理小种辣椒纯系和耐热辣椒纯系的选育
选用抗疫病不同生理小种和耐热辣椒的抗源，将它们的种子分别经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；出芽后，每天傍晚用喷壶给苗子喷一次水，以基质湿润为止，培养期间浇Hoagland's营养液2-3次，直至幼苗长出7-8片真叶时将它们移栽于塑料大棚中；
当植株进入花期时，选取株型健壮、生长势良好的单株进行人工自交，并挂牌标记，在果实完熟后，采收单株自交种子，室内考种、风干，留作翌年继续选育。以同样的方法经连续三代自交纯化，分别选育出表型一致、遗传性稳定、抗疫病某一（或某些）生理小种的辣椒纯系A-1和耐热辣椒纯系B-1。
2）配制一代杂种
以抗疫病某一（或某些）生理小种的辣椒纯系A-1为母本，以耐热辣椒纯系B-1为父本，配制、生产一代杂交种F1种子。
3）一代杂交种F1幼苗的培养
将杂交种F1的种子，以及综合农艺性状优良的辣椒品种的种子，分别经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；然后将穴盘置于人工气候箱中进行培养，培养所需的昼夜温光周期条件为：相对湿度50%-70%，光照3000-4000lx，白天温度25℃-30℃，16h，夜间温度18℃，8h，培养期间浇Hoagland's营养液，直至幼苗长出4-5片真叶时，进行嫁接以及抗疫病和耐热性鉴定。
4）嫁接
嫁接选在每年的3-6月份在温室进行，这一时期嫁接成活率高。砧木先于接穗5d播种。待砧木长到5-7片真叶，接穗为4-5片真叶，茎粗2mm左右时嫁接为宜。采用劈接法进行嫁接。嫁接后，及时把嫁接苗移入密闭的小拱棚内。嫁接愈合时的温度控制在白天25-26℃，夜间20-22℃，相对湿度95%以上。为防止强光照射和保持棚内湿度稳定，需在小拱棚外面覆盖纸被，嫁接后的前5d全部遮光，以后两侧见光，并逐步加大见光与通风量。随着伤口愈合逐渐撤掉覆盖物，两周后转入正常管理。
5）耐热性鉴定
将辣椒嫁接苗和对照（综合性状优良，但抗病耐热性差）秧苗子叶上方同一叶龄的功能叶带柄采下，作为鉴定其耐热性的样品。每种材料的辣椒供试离体叶样品10片，重复3次，将采集的辣椒功能叶按待检辣椒品系编号，插入装满蒸馏水的250mL三角瓶中，在三角瓶壁上用记号笔标明待检辣椒品系编号；随后把插有待检样品的三角瓶置于38℃的光照培养箱中，光照3000～4000lx，连续光照处理60h后，统计热害指数；在鉴定期间，每天检查三角瓶中水位并及时补加蒸馏水，使离体的辣椒功能叶的叶柄一直浸在水中；
按照以下辣椒离体叶片耐热性鉴定分级标准统计待检辣椒品系叶片级数：
0级：全叶青绿，无热害症状；
1级：叶片失水，轻度萎蔫；
3级：叶片轻度失绿，轻度萎蔫；
5级：全叶转色为浅黄绿色，叶片萎蔫，叶尖部分坏死；
7级：全叶转色为黄绿色，叶尖坏死，叶缘翻卷；
9级：全叶发黄，叶尖叶缘重度坏死焦枯，叶缘重度翻卷；
按下式计算热害指数：
热害指数=∑（各级热害指数叶片数×该热害级别值）÷（调查总叶片数×最高级值）×100；
热害指数计算时，如重复间差异不显著，取3次重复的平均值；如差异显著，再重复3次，取其3次差异不显著的平均值作为该检测辣椒耐热性品系的热害指数；最后，根据以下群体分级标准确定待测辣椒品系的耐热性：
热害指数≤35.0为耐热品系；
热害指数在35.1～59.9为较耐热品系；
热害指数≥60.0为热敏品系。
6）抗病性鉴定
菌液制备
将病原菌接到马铃薯琼脂蔗糖固体培养基（PDA）上，在28℃恒温培养箱里暗培养7d，然后置于40W日光灯下，培养皿与灯管相距30-40cm，室温下诱导孢子囊的产生。将产生的孢子囊刮到清水中，4℃下放置1h，再在常温下放置1h，孢子囊就会释放大量的游动孢子，过滤后收集滤液，镜检，最后稀释到6个孢子囊/100倍视野作为接种液备用。
待嫁接苗成活后（从嫁接当天起算约2周），这时嫁接苗生长正常。将生长有对照苗（非嫁接苗）和嫁接苗的营养钵分别灌透水，用1ml蓝色枪头在距幼苗根茎约1cm处的基质中扎一个小孔，并注入辣椒疫霉菌某一生理小种2ml的接种液，嫁接苗和对照苗（接种无菌水）各接种30株。接种后采用塑料薄膜覆盖保湿培养5d-7d，温度保持在25-30℃。观察感病状况，计算病情指数，鉴定嫁接苗的抗病性。
调查分级标准
接种后第6天统计疫病发生情况，并计算病情指数。单株分级标准与群体分级标准如下：
单株分级标准：
0级：无任何症状；
1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；
2级：幼苗根茎部变黑达1-2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；
3级：幼苗根茎部变黑超过1-2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；
4级：幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；
5级：植株枯死。
病情指数（DI）=【∑（病级数×该病级植株数）×100】/（病级最高值×调查株数）
群体分级标准：
免疫（I）：DI=0；
高抗（HR）：0＜DI≦10；
抗病（R）：10＜DI≦30；
中抗（MR）：30＜DI≦50；
感病（S）：DI＞50。
本发明的抗疫病不同生理小种辣椒耐热砧木的选育方法，综合了辣椒杂种优势育种技术与嫁接技术的优点，选育的抗病辣椒耐热砧木可明显提高综合性状优良，但抗病耐热性差的品种的抗病性和耐热性。该方法的显著特点是操作简便，选育成本低，可迅速应用于提高综合农艺性状优良，但抗病耐热性差的辣椒品种的抗病性和耐热性。可极大地加快辣椒抗性育种的进程。
附图说明
图1为辣椒叶片耐热鉴定分级标准：从左至右分别为0、1、3、5、7、9级；
图2为辣椒疫病感病症状分级标准：从左至右分别为0、1、2、3、4、5级。
以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本发明首次提出一种抗疫病不同生理小种辣椒耐热砧木的选育方法，该方法综合了辣椒杂种优势育种技术与嫁接技术的优点，选育的抗病、耐热辣椒砧木可较好地提高综合性状优良，但抗病耐和热性差的品种的抗病性和耐热性。该方法具有操作简单，节约育种时间，选育成本低等优点。这种通过选育砧木解决优良品种抗病性和耐热性的方法，极大地加快了辣椒抗性育种的进程。其具体步骤如下：
1）抗疫病某一（或某些）生理小种辣椒纯系和耐热辣椒纯系的选育
选用抗疫病不同生理小种和耐热辣椒的抗源，将它们的种子分别经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；出芽后，每天傍晚用喷壶给苗子喷一次水，以基质湿润为止，培养期间浇Hoagland's营养液2-3次，直至幼苗长出7-8片真叶时将它们移栽于塑料大棚中。当植株进入花期时，选取株型健壮、生长势良好的单株进行人工自交，并挂牌标记，在果实完熟后，采收单株自交种子，室内考种、风干，留作翌年继续选育。以同样的方法经连续三代自交纯化，分别选育出表型一致、遗传性稳定、抗疫病某一（或某些）生理小种的辣椒纯系（如：A-1）和耐热辣椒纯系（如：B-1）。
2）配制一代杂种
以抗疫病某一（或某些）生理小种的辣椒纯系A-1为母本，以耐热辣椒纯系B-1为父本，配制、生产一代杂交种F1种子。
3）一代杂交种F1幼苗的培养
将杂交种F1的种子，以及综合农艺性状优良的辣椒品种的种子，分别经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；然后将生长有辣椒苗的穴盘置于人工气候箱中进行培养，培养所需的昼夜温光周期条件为：相对湿度50%-70%，光照3000-4000lx，白天温度25℃-30℃，16h，夜间温度18℃，8h，培养期间浇Hoagland's营养液，直至幼苗长出4-5片真叶时，进行嫁接以及抗疫病和耐热性鉴定。
4）嫁接
试验最好选在每年的3-6月份在温室进行，这一时期嫁接成活率高。砧木先于接穗5d播种。待砧木长到5-7片真叶，接穗为4-5片真叶，茎粗2mm左右时嫁接为宜。采用劈接法进行嫁接。嫁接后，及时把嫁接苗移入密闭的小拱棚内。嫁接愈合时的温度控制在白天25-26℃，夜间20-22℃，相对湿度95%以上。为防止强光照射和保持棚内湿度稳定，需在小拱棚外面覆盖纸被，嫁接后的前5d全部遮光，以后两侧见光，并逐步加大见光与通风量。随着伤口愈合逐渐撤掉覆盖物，两周后转入正常管理。
5）耐热性鉴定
将辣椒嫁接苗和对照（综合性状优良，但抗病耐热性差）秧苗子叶上方同一叶龄的功能叶片带柄采下，作为鉴定其耐热性的样品。每种材料的辣椒供试离体叶样品10片，重复3次，将采集的辣椒功能叶按待检辣椒品系编号，插入装满蒸馏水的250mL三角瓶中，在三角瓶壁上用记号笔标明待检辣椒品系编号；随后把插有待检样品的三角瓶置于38℃的光照培养箱中，光照3000～4000lx，连续光照处理60h后，统计热害指数；在鉴定期间，每天检查三角瓶中水位并及时补加蒸馏水，使离体的辣椒功能叶的叶柄一直浸在水中；
按照以下辣椒离体叶片耐热性鉴定分级标准统计待检辣椒品系叶片级数【马宝鹏，辣椒耐热性鉴定体系的建立及高温胁迫下花药基因表达差异的研究【M】，西北农林科技大学硕士学位论文（导师：巩振辉），2013，p6-8】：
0级：全叶青绿，无热害症状；
1级：叶片失水，轻度萎蔫；
3级：叶片轻度失绿，轻度萎蔫；
5级：全叶转色为浅黄绿色，叶片萎蔫，叶尖部分坏死；
7级：全叶转色为黄绿色，叶尖坏死，叶缘翻卷；
9级：全叶发黄，叶尖叶缘重度坏死焦枯，叶缘重度翻卷；
按下式计算热害指数：
热害指数=∑（各级热害指数叶片数×该热害级别值）÷（调查总叶片数×最高级值）×100；
热害指数计算时，如重复间差异不显著，取3次重复的平均值；如差异显著，再重复3次，取其3次差异不显著的平均值作为该检测辣椒耐热性品系的热害指数；最后，根据以下群体分级标准确定待测辣椒品系的耐热性：
热害指数≤35.0为耐热品系；
热害指数在35.1～59.9为较耐热品系；
热害指数≥60.0为热敏品系。
6）抗病性鉴定
菌液制备
将病原菌接到马铃薯琼脂蔗糖固体培养基（PDA）上，在28℃恒温培养箱里暗培养7d，然后置于40W日光灯下，培养皿与灯管相距30-40cm，室温下诱导孢子囊的产生。将产生的孢子囊刮到清水中，4℃下放置1h，再在常温下放置1h，孢子囊就会释放大量的游动孢子，过滤后，收集滤液，镜检，最后稀释到6个孢子囊/100倍视野作为接种液备用。
待嫁接苗成活后（从嫁接当天算约2周），这时嫁接苗生长正常。将生长有对照苗和嫁接苗的营养钵分别灌透水，用1ml蓝色枪头在距幼苗根茎约1cm处的基质中扎一个小孔，并注入辣椒疫霉菌某一生理小种2ml的接种液，嫁接苗和对照苗（接种无菌水）各接种30株。接种后采用塑料覆膜保湿培养5-7d，温度保持在25-30℃。观察感病状况，计算病情指数，鉴定嫁接苗的抗病性（杨茹薇，秦勇，吴慧，季金凤，辣椒嫁接抗疫病效果研究【J】，新疆农业大学学报，2010，33（1）：27-30）。
调查分级标准
接种后第6天统计疫病发生情况，并计算病情指数。单株分级标准与群体分级标准如下。
单株分级标准：
0级：无任何症状；
1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；
2级：幼苗根茎部变黑达1-2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；
3级：幼苗根茎部变黑超过1-2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；
4级：幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；
5级：植株枯死。
病情指数（DI）=【∑（病级数×该病级植株数）×100】/（病级最高值×调查株数）
群体分级标准：
免疫（I）：DI=0；
高抗（HR）：0＜DI≦10；
抗病（R）：10＜DI≦30；
中抗（MR）：30＜DI≦50；
感病（S）：DI＞50。
以下具体的应用实施例，需要说明的是，以下实施例仅是说明性的，本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
（1）抗疫病生理小种1和生理小种2的辣椒纯系和耐热辣椒纯系的选育
选用抗疫病生理小种1（ph1）和生理小种2（ph2）辣椒品系PBC495（张莹丽，巩振辉，李大伟，黄炜，逯明辉，陈儒钢.陕西辣椒疫病病原鉴定及其防治剂的室内筛选，西北农业学报，2009，18（5）：336-340）和耐热辣椒品系B35【ZhuWei，LuMinghui，GongZhenhui，andChenRugang.CloningandExpressionunderHeatStressofASmallHeatShockProteinGeneCaHSP24fromPepper[J].AfricanJournalofBiotechnology，2011，10（25）：4968-4976】，种子由西北农林科技大学园艺学院辣椒课题组提供。将它们的种子分别经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；出芽后，每天傍晚用喷壶给苗子喷一次水，以基质湿润为止，培养期间浇Hoagland's营养液2-3次，直至幼苗长出7-8片真叶时将它们移栽于塑料大棚中。当植株进入花期时，选取株型健壮、生长势良好的单株进行人工自交，并挂牌标记，在果实完熟后，采收单株自交种子，室内考种、风干，留作翌年继续选育。以同样的方法经连续三代自交纯化，分别选育出表型一致、遗传性稳定、抗疫病生理小种1和抗生理小种2的辣椒纯系PBC495-1和耐热辣椒纯系B35-1。
2）配制一代杂种
以抗疫病生理小种1和生理小种2的辣椒纯系PBC495-1为母本，以耐热辣椒纯系B35-1为父本，配制、生产一代杂交种F1种子。
3）一代杂交种F1幼苗的培养
将杂交种F1的种子，以及综合农艺性状优良，但抗病、耐热性较差的辣椒品种EarlyCalwonder的种子，分别经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；然后将穴盘置于人工气候箱中进行培养，培养所需的昼夜温光周期条件为：相对湿度50%-70%，光照3000-4000lx，白天温度25℃-30℃，16h，夜间温度18℃，8h，培养期间浇Hoagland's营养液，直至幼苗长出4-5片真叶时，进行嫁接以及抗疫病和耐热性鉴定。
4）嫁接
嫁接在2013年3月15日在温室进行，这一时期嫁接成活率高。砧木【（PBC495-1×B35-1）F1】先于接穗（EarlyCalwonder）5d播种。待砧木长到5-7片真叶，接穗为4-5片真叶，茎粗2mm左右时嫁接为宜。采用劈接法进行嫁接。嫁接后，及时把嫁接苗移入密闭的小拱棚内。嫁接愈合时的温度控制在白天25℃-26℃，夜间20℃-22℃，相对湿度95%以上。为防止强光照射和保持棚内湿度稳定，需在小拱棚外面覆盖纸被，嫁接后的前5d全部遮光，以后两侧见光，并逐步加大见光与通风量。随着伤口愈合逐渐撤掉覆盖物，两周后转入正常管理。
5）耐热性鉴定
将辣椒嫁接苗和对照（EarlyCalwonder）苗叶上方同一叶龄的功能叶片带柄采下，作为鉴定其耐热性的样品。每种材料的辣椒供试离体叶样品10片，重复3次，将采集的辣椒功能叶按待检辣椒品系编号，插入装满蒸馏水的250mL三角瓶中，在三角瓶壁上用记号笔标明待检辣椒品系编号；随后把插有待检样品的三角瓶置于38℃的光照培养箱中，光照3000～4000lx，连续光照处理60h后，统计热害指数；在鉴定期间，每天检查三角瓶中水位并及时补加蒸馏水，使离体的辣椒功能叶的叶柄一直浸在水中；
按照以下辣椒离体叶片耐热性鉴定分级标准统计待检辣椒品系叶片级数【马宝鹏，辣椒耐热性鉴定体系的建立及高温胁迫下花药基因表达差异的研究【M】，西北农林科技大学硕士学位论文（导师：巩振辉），2013，p6-8】：
0级：全叶青绿，无热害症状；
1级：叶片失水，轻度萎蔫；
3级：叶片轻度失绿，轻度萎蔫；
5级：全叶转色为浅黄绿色，叶片萎蔫，叶尖部分坏死；
7级：全叶转色为黄绿色，叶尖坏死，叶缘翻卷；
9级：全叶发黄，叶尖叶缘重度坏死焦枯，叶缘重度翻卷；
按下式计算热害指数：
热害指数=∑（各级热害指数叶片数×该热害级别值）÷（调查总叶片数×最高级值）×100；
热害指数计算时，如重复间差异不显著，取3次重复的平均值；如差异显著，再重复3次，取其3次差异不显著的平均值作为该检测辣椒耐热性品系的热害指数；最后，根据以下群体分级标准确定待测辣椒品系的耐热性：
热害指数≤35.0为耐热品系；
热害指数在35.1～59.9为较耐热品系；
热害指数≥60.0为热敏品系。
根据热害指数计算公式，计算出选育的抗病耐热嫁接苗【砧木（PBC495-1×B35-1）F1，接穗EarlyCalwonder】的热害指数为22.2，为耐热级；而EarlyCalwonder的热害指数为51.1，为较耐热级。这一结果说明利用本发明选育的抗病耐热砧木嫁接了EarlyCalwonder接穗后的嫁接苗的耐热性明显高于EarlyCalwonder的耐热性。
6）抗病性鉴定
菌液制备
将病原菌接到马铃薯琼脂蔗糖固体培养基（PDA）上，在28℃恒温培养箱里暗培养7d，然后置于40W日光灯下，培养皿与灯管相距30-40cm，室温下诱导孢子囊的产生。将产生的孢子囊刮到清水中，4℃下放置1h，再在常温下放置1h，孢子囊就会释放大量的游动孢子，过滤后，收集滤液，镜检，最后稀释到6个孢子囊/100倍视野作为接种液备用。
待嫁接苗成活后（从嫁接当天算约2周），这时嫁接苗生长正常。将生长有对照（EarlyCalwonder）苗和嫁接苗的营养钵分别灌透水，用1ml蓝色枪头在距幼苗根茎约1cm处的基质中扎一个小孔，分别注入辣椒疫霉菌生理小种1和生理小种2接种液2ml，嫁接苗和对照苗（接种无菌水）各接种30株。接种后采用塑料薄膜覆盖保湿培养5-7d，温度保持在25-30℃。观察感病状况，计算病情指数，鉴定嫁接苗的抗病性【杨茹薇，秦勇，吴慧，季金凤.辣椒嫁接抗疫病效果研究[J].新疆农业大学学报，2010，33（1）：27-30】。
调查分级标准
接种后第6天统计疫病发生情况，并计算病情指数。单株分级标准与群体分级标准如下。
单株分级标准：
0级：无任何症状；
1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；
2级：幼苗根茎部变黑达1-2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；
3级：幼苗根茎部变黑超过1-2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；
4级：幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；
5级：植株枯死。
病情指数（DI）=【∑（病级数×该病级植株数）×100】/（病级最高值×调查株数）
群体分级标准：
免疫（I）：DI=0；
高抗（HR）：0＜DI≦10；
抗病（R）：10＜DI≦30；
中抗（MR）：30＜DI≦50；
感病（S）：DI＞50。
根据病情指数计算公式，接种辣椒疫霉菌生理小种1后，嫁接苗【砧木（PBC495-1×B35-1）F1，接穗EarlyCalwonder】的病情指数为17.4，为抗病级；而EarlyCalwonder的病情指数为51.5，为感病级；接种辣椒疫霉菌生理小种2后，嫁接苗病情指数为28.6，为抗病级；而EarlyCalwonder病情指数57.1，为感病级；这一结果说明利用本发明选育的抗病耐热砧木嫁接了EarlyCalwonder接穗后的嫁接苗的抗病性明显高于EarlyCalwonder的抗病性。
实施例2：
（1）抗疫病生理小种1的辣椒纯系和耐热辣椒纯系的选育
选用抗疫病生理小种1（ph1）辣椒品系PBC137【张莹丽，巩振辉，李大伟，黄炜，逯明辉，陈儒钢.陕西辣椒疫病病原鉴定及其防治剂的室内筛选，西北农业学报，2009，18（5）：336-340】和耐热辣椒品系B35【ZhuWei，LuMinghui，GongZhenhui，andChenRugang.CloningandExpressionunderHeatStressofASmallHeatShockProteinGeneCaHSP24fromPepper[J].AfricanJournalofBiotechnology，2011，10（25）：4968-4976】，种子由西北农林科技大学园艺学院辣椒课题组提供。将它们的种子分别经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；出芽后，每天傍晚用喷壶给苗子喷一次水，以基质湿润为止，培养期间浇Hoagland's营养液2-3次，直至幼苗长出7-8片真叶时将它们移栽于塑料大棚中。当植株进入花期时，选取株型健壮、生长势良好的单株进行人工自交，并挂牌标记，在果实完熟后，采收单株自交种子，室内考种、风干，留作翌年继续选育。以同样的方法经连续三代自交纯化，分别选育出表型一致、遗传性稳定、抗疫病生理小种1的辣椒纯系PBC137-1和耐热辣椒纯系B35-1。
2）配制一代杂种
以抗疫病生理小种1的辣椒纯系PBC137-1为母本，以耐热辣椒纯系B35-1为父本，配制、生产一代杂交种F1种子。
3）一代杂交种F1幼苗的培养
将杂交种F1的种子，以及综合农艺性状优良，但抗病耐热性较差的辣椒品种B12的种子，分别经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；然后将穴盘置于人工气候箱中进行培养，培养所需的昼夜温光周期条件为：相对湿度50%-70%，光照3000-4000lx，白天温度25℃-30℃，16h，夜间温度18℃，8h，培养期间浇Hoagland's营养液，直至幼苗长出4-5片真叶时，进行嫁接以及抗疫病性和耐热性鉴定。
4）嫁接
嫁接在2013年3月15日在温室进行，这一时期嫁接成活率高。砧木【选育的抗病耐热砧木（PBC137-1×B35-1）】先于接穗（辣椒品种B12）5d播种。待砧木长到5-7片真叶，接穗为4-5片真叶，茎粗2mm左右时嫁接为宜。采用劈接法进行嫁接。嫁接后，及时把嫁接苗移入密闭的小拱棚内。嫁接愈合时的温度控制在白天25-26℃，夜间20-22℃，相对湿度95%以上。为防止强光照射和保持棚内湿度稳定，需在小拱棚外面覆盖纸被，嫁接后的前5d全部遮光，以后两侧见光，并逐步加大见光与通风量。随着伤口愈合逐渐撤掉覆盖物，两周后转入正常管理。
5）耐热性鉴定
将辣椒嫁接苗和对照（B12）苗子叶上方同一叶龄的功能叶片带柄采下，作为鉴定其耐热性的样品。每种材料的辣椒供试离体叶样品10片，重复3次，将采集的辣椒功能叶按待检辣椒品系编号，插入装满蒸馏水的250mL三角瓶中，在三角瓶壁上用记号笔标明待检辣椒品系编号；随后把插有待检样品的三角瓶置于38℃的光照培养箱中，光照3000～4000lx，连续光照处理60h后，统计热害指数；在鉴定期间，每天检查三角瓶中水位并及时补加蒸馏水，使离体的辣椒功能叶的叶柄一直浸在水中；
按照以下辣椒离体叶片耐热性鉴定分级标准统计待检辣椒品系叶片级数【马宝鹏，辣椒耐热性鉴定体系的建立及高温胁迫下花药基因表达差异的研究[M]，西北农林科技大学硕士学位论文（导师：巩振辉），2013，p6-8】：
0级：全叶青绿，无热害症状；
1级：叶片失水，轻度萎蔫；
3级：叶片轻度失绿，轻度萎蔫；
5级：全叶转色为浅黄绿色，叶片萎蔫，叶尖部分坏死；
7级：全叶转色为黄绿色，叶尖坏死，叶缘翻卷；
9级：全叶发黄，叶尖叶缘重度坏死焦枯，叶缘重度翻卷；
按下式计算热害指数：
热害指数=∑（各级热害指数叶片数×该热害级别值）÷（调查总叶片数×最高级值）×100；
热害指数计算时，如重复间差异不显著，取3次重复的平均值；如差异显著，再重复3次，取其3次差异不显著的平均值作为该检测辣椒耐热性品系的热害指数；最后，根据以下群体分级标准确定待测辣椒品系的耐热性：
热害指数≤35.0为耐热品系；
热害指数在35.1～59.9为较耐热品系；
热害指数≥60.0为热敏品系。
根据热害指数计算公式，计算出选育的抗病耐热嫁接苗【砧木（PBC137-1×B35-1）F1，接穗B12】的热害指数为20.7，为耐热级；而对照辣椒品种B12的热害指数为48.6，为较耐热级。这一结果说明利用本发明选育的抗病耐热砧木嫁接了B12接穗后的嫁接苗的耐热性明显高于对照B12的耐热性。
6）抗病性鉴定
菌液制备
将病原菌接到马铃薯琼脂蔗糖固体培养基（PDA）上，在28℃恒温培养箱里暗培养7d，然后置于40W日光灯下，培养皿与灯管相距30-40cm，室温下诱导孢子囊的产生。将产生的孢子囊刮到清水中，4℃下放置1h，再在常温下放置1h，孢子囊就会释放大量的游动孢子，过滤后，收集滤液，镜检，最后稀释到6个孢子囊/100倍视野作为接种液备用。
待嫁接苗成活后（从嫁接当天算约2周），这时嫁接苗生长正常。将生长有对照（B12）苗和嫁接苗的营养钵分别灌透水，用1ml蓝色枪头在距幼苗根茎约1cm处的基质中扎一个小孔，并注入辣椒疫霉菌生理小种1接种液2ml，嫁接苗和对照苗（接种无菌水）各接种30株。接种后采用塑料薄膜覆盖保湿培养5-7d，温度保持在25-30℃。观察感病状况，计算病情指数，鉴定嫁接苗的抗病性【杨茹薇，秦勇，吴慧，季金凤.辣椒嫁接抗疫病效果研究[J].新疆农业大学学报，2010，33（1）：27-30】。
调查分级标准
接种后第6天统计疫病发生情况，并计算病情指数。单株分级标准与群体分级标准如下。
单株分级标准：
0级：无任何症状；
1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；
2级：幼苗根茎部变黑达1-2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；
3级：幼苗根茎部变黑超过1-2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；
4级：幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；
5级：植株枯死。
病情指数（DI）=【∑（病级数×该病级植株数）×100】/（病级最高值×调查株数）
群体分级标准：
免疫（I）：DI=0；
高抗（HR）：0＜DI≦10；
抗病（R）：10＜DI≦30；
中抗（MR）：30＜DI≦50；
感病（S）：DI＞50。
根据病情指数计算公式，接种辣椒疫霉菌生理小种1后，嫁接苗【砧木（PBC137-1×B35-1）F1，接穗B12品种】的病情指数为11.3，为抗病级；对照辣椒品种B12的病情指数为36.5，为中抗级；这一结果说明利用本发明选育的抗病耐热砧木嫁接了辣椒品种B12接穗后的嫁接苗的抗病性明显高于对照辣椒品种B12的抗病性。
Claims (1)
1.一种抗疫病不同生理小种的辣椒耐热砧木的选育方法，其特征在于，该方法以抗辣椒疫病某一或某些生理小种的辣椒品系A及耐热性较强的辣椒品系B作为选育砧木的原始材料，通过连续三代单株自交分别获得纯系A-1和B-1，再以纯系A-1为母本，以B-1为父本配制一代杂种F1，以F1为砧木，以综合农艺性状优良，但抗病性、耐热性差的品种为接穗，进行嫁接，然后对嫁接苗作抗病性和耐热性鉴定，得到抗疫病不同生理小种的辣椒耐热砧木；
具体包括以下步骤：
1)抗疫病某一或某些生理小种辣椒纯系和耐热辣椒纯系的选育
选用抗疫病不同生理小种和耐热辣椒的抗源，将它们的种子分别经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；出芽后，每天傍晚用喷壶给苗子喷一次水，以基质湿润为止，培养期间浇Hoagland's营养液2～3次，直至幼苗长出7～8片真叶时将它们移栽于塑料大棚中；当植株进入花期时，选取株型健壮、生长势良好的单株进行人工自交，并挂牌标记，在果实完熟后，采收单株自交种子，室内考种、风干，留作翌年继续选育；
以同样的方法经连续三代自交纯化，分别选育出表型一致、遗传性稳定、抗疫病某一或某些生理小种的辣椒纯系A-1和耐热辣椒纯系B-1；
2)配制一代杂种
以抗疫病某一或某些生理小种的辣椒纯系A-1为母本，以耐热辣椒纯系B-1为父本，配制、生产一代杂交种F1种子；
3)一代杂交种F1幼苗的培养
将杂交种F1的种子，以及综合农艺性状优良，但抗病耐热性较差的辣椒品种的种子，分别经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；然后将穴盘置于人工气候箱中进行培养，培养所需的昼夜温光周期条件为：相对湿度50％～70％，光照3000～4000lx，白天温度25℃～30℃，16h，夜间温度18℃，8h，培养期间浇Hoagland's营养液，直至幼苗长出4～5片真叶时，进行嫁接以及抗疫病和耐热性鉴定；
4)嫁接
嫁接选在每年的3-6月份在温室进行，砧木先于接穗5d播种，待砧木长到5-7片真叶，接穗为4-5片真叶，茎粗2mm时嫁接；
采用劈接法进行嫁接，嫁接后，及时把嫁接苗移入密闭的小拱棚内；嫁接愈合时的温度控制在白天25℃～26℃，夜间20℃～22℃，相对湿度95％以上；为防止强光照射和保持棚内湿度稳定，在小拱棚外面覆盖纸被，嫁接后的前5d全部遮光，以后两侧见光，并逐步加大见光与通风量，随着伤口愈合逐步撤掉覆盖物，两周后转入正常管理；
5)耐热性鉴定
将辣椒嫁接苗和对照苗子叶上方同一叶龄的功能叶片带柄采下，作为鉴定辣椒耐热性的样品；每种材料的辣椒供试离体叶样品10片，重复3次，将采集的辣椒功能叶按待检辣椒品系编号，插入装满蒸馏水的250mL三角瓶中，在三角瓶壁上用记号笔标明待检辣椒品系编号；随后把插有待检样品的三角瓶置于38℃的光照培养箱中，光照3000～4000lx，连续光照处理60h后，统计热害指数；在鉴定期间，每天检查三角瓶中水位并及时补加蒸馏水，使离体的辣椒功能叶的叶柄一直浸在水中；
按照以下辣椒离体叶片耐热性鉴定分级标准统计待检辣椒品系叶片级数：
0级：全叶青绿，无热害症状；
1级：叶片失水，轻度萎蔫；
3级：叶片轻度失绿，轻度萎蔫；
5级：全叶转色为浅黄绿色，叶片萎蔫，叶尖部分坏死；
7级：全叶转色为黄绿色，叶尖坏死，叶缘翻卷；
9级：全叶发黄，叶尖叶缘重度坏死焦枯，叶缘重度翻卷；
按下式计算热害指数：
热害指数＝∑(各级热害指数叶片数×热害级别值)÷(调查总叶片数×最高级值)×100；
热害指数计算时，如重复间差异不显著，取3次重复的平均值；如差异显著，再重复3次，取3次差异不显著的平均值作为检测辣椒耐热性品系的热害指数；最后，根据以下群体分级标准确定待测辣椒品系的耐热性：
热害指数≤35.0为耐热品系；
热害指数在35.1～59.9为较耐热品系；
热害指数≥60.0为热敏品系；
6)抗病性鉴定
菌液制备
将病原菌接到马铃薯琼脂蔗糖固体培养基上，在28℃恒温培养箱里暗培养7d，然后置于40W日光灯下，培养皿与灯管相距30-40cm，室温下诱导孢子囊的产生；将产生的孢子囊刮到清水中，4℃下放置1h，再在常温下放置1h，孢子囊就会释放大量的游动孢子，过滤后，收集滤液，镜检，最后稀释到6个孢子囊/100倍视野作为接种液备用；
待嫁接苗成活后，将生长有对照苗和嫁接苗的营养钵分别灌透水，用1ml蓝色枪头在距幼苗根茎约1cm处的基质中扎一个小孔，并注入辣椒疫霉菌某一生理小种2ml的接种液，嫁接苗接种辣椒疫霉菌，对照苗接种无菌水，嫁接苗和对照苗各接种30株；接种后采用塑料覆膜覆盖保湿培养5～7d，温度保持在25℃-30℃；观察感病状况，计算病情指数，鉴定嫁接苗的抗病性；
调查分级标准
接种后第6天统计疫病发生情况，并计算病情指数，单株分级标准与群体分级标准如下：
单株分级标准：
0级：无任何症状；
1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；
2级：幼苗根茎部变黑达1-2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；
3级：幼苗根茎部变黑超过1-2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；
4级：幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；
5级：植株枯死；
病情指数＝【∑(病级数×该病级植株数)×100】/(病级最高值×调查株数)
群体分级标准：
免疫：DI＝0；
高抗：0＜DI≦10；
抗病：10＜DI≦30；
中抗：30＜DI≦50；
感病：DI＞50。
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