BRPI0716373A2 - Processos para a produção de plantas transgênicas - Google Patents

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BRPI0716373A2
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Anisha Akula
David R Duncan
Brenda Lowe
Michael T Mann
William L Petersen
Jyoti R Rout
David D Songstad
Joel B Wilks
Wanggen Zhang
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Monsanto Technology Llc
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS".
Fundamento da Invenção
Este pedido de patente reivindica a prioridade do pedido de Patente U.S. provisório N- de Série 60/841.519 depositado em 31 de agosto de 2006, cuja descrição inteira é incorporada aqui como referência. Campo da Invenção
A micropropagação de plantas tem sido feita de forma rotineira em grandes bateladas e de forma automatizada. Na micropropagação, um explante é geralmente coletado e colocado em um meio de regeneração que tem que ser mantido fresco para ao longo da duração do processo de rege- neração para produzir uma série de plantas. Isto é contrasta com os proces- sos de transformação, que são planejados para produzir novos eventos transgênicos e requerem a integração do DNA estranho dentro de uma célu- Ia vegetal. A automatização do processo de cultura de tecido vegetal, parti- cularmente o processo de transformação, tem sido difícil. Os tecidos vege- tais passam por estágios diferentes que requerem tipos diferentes de meios e condições de crescimento. Os processos de transformação requerem vá- rias etapas e vários meios. Por exemplo, na transformação mediada por Agrobacterium, o processo começa com o isolamento de um explante que pode ser regenerado e transformado. Então o explante é inoculado com Agrobacterium em um meio de inoculação. Após a inoculação, o excesso de Agrobacterium é tipicamente removido e o explante e o Agrobacterium são cocultivados juntos para permitir a transferência de DNA. Após o cocultivo, a presença de Agrobacterium é deletéria para a cultura de tecido vegetal (por exemplo, causa contaminação indesejada durante as etapas de manipulação e de cultura de tecido subsequentes), de forma que tipicamente os explantes são transferidos para meio fresco contendo antibióticos para inibir o cresci- mento de Agrobaeterium. Este meio pode ou não conter agentes de seleção. Se não tiver, então é chamado de meio de retardo ou de repouso. Os ex- plantes podem ser colocados em meio de retardo para permitir que durante algum tempo cresçam antes de serem opcionalmente colocados no meio de seleção. Outros protocolos colocam os explantes diretamente no meio de seleção para a seleção de eventos transgênicos. Os regimes de seleção va- riam amplamente dependendo do agente de seleção e do sistema do explante. Freqüentemente são utilizadas várias etapas de seleção e quanti- dades variáveis de agente de seleção podem ser necessárias nas etapas diferentes. Após a seleção dos eventos transgênicos, os eventos transgêni- cos vivos são então transferidos para o meio de regeneração em plantículas que podem então ser transferidas para o solo. Até o momento atual, os pro- cessos de transformação têm sido demorados e trabalhosos e não são ca- pazes de ser realizados em uma grande escala. A automatização do proces- so de transformação permitiria que números grandes de plantas transgêni- cas fossem produzidos com trabalho, material e sobrecarga ergonômica re- duzidos.
A presente invenção superou as limitações anteriores na trans- formação através do fornecimento de métodos e de aparatos para a realiza- ção de algumas ou de todas as etapas de transformação e opcionalmente algumas das etapas de regeneração, em um único recipiente. Assim, os pre- sentes métodos superaram as deficiências dos protocolos de transformação atuais através da eliminação de etapas demoradas para o subcultivo de teci- do vegetal e troca de meio. Os métodos e os aparatos são particularmente adequados para a automatização da transformação, para a automatização da regeneração e/ou para a produção em grande escala de células, tecidos e plantas transformados.
A invenção de genômica possibilitou a identificação e o isola- mento de um grande número de genes e tinha a necessidade de sistemas de produção de transformação de alto rendimento confiáveis e eficientes para testar a utilidade destes genes através da transformação dos mesmos em plantas de cultivo economicamente importantes tal como o milho. Os mé- todos de transformação de milho atuais requerem, pelo menos, quatro eta- pas de transformação desde a etapa de seleção de uma célula transformada até a etapa de transferência de plantas transgênicas para o solo requerendo assim custos materiais mais altos, por exemplo, placas e meios de cultura e custos de trabalho. Várias transferências manuais de tecidos também avali- am o risco de danos ergonômicos causados por movimento repetidos.
Assim, há uma necessidade na técnica de transformação de mi- lho de um sistema automatizado de alto rendimento para a transformação, a seleção e a regeneração de plantas que produz um grande número de plan- tas transgênicas para testar genes e criar plantas úteis enquanto os custos de materiais e de trabalho são diminuídos. Há ainda uma necessidade na técnica de métodos que podem diminuir o risco de danos ergonômicos tor- nando o local de trabalho mais seguro. Aqui, os inventores fornecem um método de transformação de
milho para a seleção e para a regeneração de plantas de milho transforma- das adequadas para o sistema de automatização de alto rendimento. O mé- todo emprega uma matriz de suporte adequada em combinação com meio de seleção e de regeneração líquido. O uso deste método de cultura líquido elimina a necessidade de várias transferências que são normalmente neces- sárias quando é utilizado um meio sólido para as etapas de seleção e de regeneração. Ainda, este método possibilita o aumento da regeneração que tem sido um problema no meio de cultura líquido até agora. Ainda adicio- nalmente, a etapa de seleção de uma célula transformada e a regeneração podem ser conseguidas em um único recipiente tal como um copo de sun- dae até as plantas serem transferidas para o solo. Sumário da Invenção
A presente invenção fornece novos métodos para a automatiza- ção de processos de transformação de plantas através do fornecimento de um método de transformação estável e opcionalmente de seleção e de re- generação parcial de uma planta em um recipiente. Em algumas modalida- des, um único recipiente pode ser utilizado para realizar os métodos da pre- sente invenção. Em outras modalidades, vários recipientes (por exemplo, um sistema de vasos interconectados) podem ser fornecidos para facilitar o uso e a otimização da presente invenção.
Em um aspecto da invenção, é fornecido um método para pro- dução de planta de milho transgênica. O método compreende a obtenção de um explante de milho que pode ser transformado; a transformação do ex- plante de milho que pode ser transformado; a seleção de uma célula de mi- lho transformada partindo do explante de milho que pode ser transformado em um meio de seleção; e a regeneração da célula transformada em uma planta em um meio de regeneração, em que a transformação, a seleção e a regeneração são realizadas no mesmo recipiente. Opcionalmente, a seleção no recipiente pode ser omitida e a plantícula transgênica ou a planta trans- gênica pode ser submetida à seleção após ser colocada no solo (por exem- plo, borrifada com um agente de seleção). O recipiente pode ser um biorreator, uma placa de Petri, uma
placa de várias cavidades, um frasco, uma jarra, uma garrafa, uma moringa, um PlantCon®, um sistema de emersão temporária e uma combinação dos mesmos e é fornecido com uma maneira de fornecer e de remover o meio. Em algumas modalidades, o recipiente é uma placa de Petri, uma placa de várias cavidades, uma PlantCon ou um sistema de emersão temporária.
O explante pode ser selecionado do grupo que consiste em um calo, um embrião e uma suspensão de células.
O meio pode ser um meio líquido, um meio sólido ou uma com- binação dos mesmos. Em uma modalidade, o meio de seleção é um meio sólido e o meio de regeneração é um meio líquido que cobre o meio de sele- ção sólido.
O explante pode ser colocado em contato com o meio tempora- riamente. Em uma modalidade, o explante é colocado em contato com o meio de seleção e o meio de regeneração durante aproximadamente 1 até aproximadamente 5 minutos aproximadamente a cada 12 até 24 horas.
Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a obtenção de explante para a produção de uma planta de milho transgênica. O método compreende a divisão de um calo em pedaços de calo menores. Em uma modalidade, o calo é um calo do tipo I. Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido
um método para a preparação de uma suspensão de células de Agrobacte- rium para a inoculação de um explante. O método compreende o cultivo de um estoque em glicerol congelado de Agrobacterium diretamente em um meio de indução.
Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma cultura de células de milho que compreende células que podem ser transformadas e embriogênicas.
Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a produção de uma cultura de células de milho que podem ser transformadas e embriogênicas. O método compreende a obtenção de um calo partindo de embriões de milho e o cultivo do calo durante aproxima- damente 5 dias até 30 dias em um meio líquido para produzir a cultura de células. Em uma modalidade, o calo é um calo do tipo II. Breve Descrição do Desenho
Figura 1 Exemplo de mapa de plasmídeo de pMON30113. Descrição Detalhada As definições a seguir auxiliarão o entendimento da descrição
da invenção.
"Calo" refere-se a uma massa proliferante desdiferenciada de células ou tecido.
"Explante" refere-se a uma parte da planta que é capaz de ser transformada e subseqüentemente regenerada em uma planta transgênica. Os explantes típicos incluem embriões imaturos, calos, cotilédones, meris- temas, folhas ou caules.
"Meio de cultura de tecido" refere-se a meios líquidos, semilíqui- dos ou sólidos utilizados para sustentar o crescimento e o desenvolvimento da planta em um ambiente que não é o solo. Os meios de cultura de tecido vegetal adequados são conhecidos por um versado na técnica, como discu- tido em detalhes subseqüentemente. Os componentes do meio podem ser obtidos em fornecedores sem ser os identificados aqui e podem ser otimiza- dos para uso pelos versados na técnica de acordo com seus requerimentos. "Seqüência codificadora", "região codificadora" ou "quadro aber-
to de leitura" refere-se a uma região de tercetos de ácidos nucléicos seqüen- ciais contínuos que codificam uma proteína, um polipeptídeo ou uma se- quência peptídica.
"Endógeno" refere-se a materiais que se originam de dentro do organismo ou da célula.
"Exógeno" refere-se a materiais que se originam da parte exter- na do organismo ou da célula. Refere-se a moléculas de ácidos nucléicos utilizadas na produção de células e plantas hospedeiras transformadas ou transgênicas. Como utilizado aqui, é pretendido que exógeno se refira a qualquer ácido nucléico que é introduzido em uma célula receptora, inde- pendentemente do fato de um ácido nucléico similar já poder estar presente em tal célula.
"Genoma" refere-se ao DNA cromossômico de um organismo. O genoma é definido como um conjunto haplóide de cromossomos de uma espécie diplóide. Para as finalidades deste pedido de patente, o genoma inclui ainda o genoma das organelas. "Monocot" ou "monocotiledônea" refere-se a plantas que possu-
em um único cotilédone. Os exemplos incluem cereais tais como milho, ar- roz, trigo, aveia e cevada.
"Ácido nucléico" refere-se ao ácido desoxirribonucléico (DNA) ou ao ácido ribonucléico (RNA). "Fenótipo" refere-se a uma característica exibida por um orga-
nismo que resulta da interação do genótipo e o ambiente.
"Sinal de poiiadenilação" ou "sinal de poliA" refere-se a uma se- qüência de ácido nucléico localizada a 3' de uma região codificadora que promove a adição de nucleotídeo adenilados na extremidade a 3' do mRNA transcrito partindo da região codificadora.
"Promotor" ou "região promotora" refere-se a uma seqüência de ácido nucléico, geralmente encontrada a 5' da seqüência codificadora, que controla a expressão da seqüência codificadora através do controle da pro- dução de RNA mensageiro (mRNA) através do fornecimento do sítio de re- conhecimento para a RNA polimerase ou outros fatores necessários para o início da transcrição no sítio correto.
"Vetor de ácido nucléico recombinante" ou "vetor" refere-se a qualquer agente tal como um plasmídeo, um cosmídeo, um vírus, uma se- qüência de replicação autônoma, um fago um segmento de nucleotídeos de DNA ou de RNA de filamento simples ou de filamento duplo linear ou circu- lar, derivado de qualquer fonte, capaz de se integrar no genoma ou de se replicar de forma autônoma, que compreende uma molécula de ácido nucléi- co em que uma ou mais seqüências de ácidos nucléicos foram ligadas de uma maneira funcionalmente operacional. Tais vetores ou construtos de áci- dos nucléicos recombinantes são capazes de introduzir uma seqüência regu- ladora ou uma região promotora a 5' e uma seqüência de DNA para um pro- duto gênico selecionado em uma célula de tal maneira que a seqüência de DNA é transcrita em um mRNA funcional, que é subseqüentemente traduzi- do em um polipeptídeo ou uma proteína.
"Regeneração" refere-se ao processo de crescimento de uma planta partindo de uma célula vegetal. "Meio de regeneração" refere-se a um meio de cultura de tecido
vegetal necessário para conter um agente de seleção.
"Calo que pode ser regenerado" refere-se ao calo partindo do qual plantas inteiras podem ser produzidas, mas que o modo de regenera- ção (embriogênese ou organogênese) não foi determinado ou não é perti- nente para discussão.
"Marcador que pode ser selecionado" ou "marcador que pode ser verificado" refere-se a uma seqüência de ácido nucléico cuja expressão confere um fenótipo que facilita a identificação de células que contêm a se- qüência de ácido nucléico. "Seleção" refere-se ao contato de um explante inoculado com
um meio de seleção para a obtenção de uma célula, um tecido ou uma plan- ta transformada.
"Meio de seleção" refere-se a um meio de cultura de tecido ve- getal que contém um agente de seleção. "Transcrição" refere-se ao processo de produção de uma cópia
de RNA partindo de um molde de DNA.
"Transformação" refere-se a um processo de introdução de uma seqüência de ácido nucléico exógena (vetor ou construção) em uma célula ou um protoplasto, em que o ácido nucléico exógeno é incorporado no DNA nuclear, no DNA de plastóide ou é capaz de se replicar de forma autônoma.
"Transgênico" refere-se a organismos nos quais uma seqüência de ácido nucléico exógena foi integrada.
"Explante que pode ser transformado" refere-se a qualquer parte de uma planta que é receptiva à transformação.
A presente invenção fornece um sistema em que a transforma- ção estável pode ser realizada em um único recipiente. O processo de trans- formação começa com a inoculação do explante que pode ser transformado com Agrobacterium e resulta em uma plantícula transformada de forma es- tável com raízes adequadas para a transferência para o solo.
Há muitos recipientes que podem ser utilizados para esta finali- dade. Biorreatores1 incluindo o sistema de imersão temporária, podem ser utilizados. Muitos recipientes diferentes têm sido utilizados para a cultura líquida de tecidos vegetais, incluindo, mas não limitados a placas de Petri de vários tamanhos, placas de várias cavidades, frascos, jarras, garrafas, mo- ringas e PIantCons. Estes recipientes são geralmente fornecidos com meios tais como uma entrada e uma saída para o fornecimento do meio fresco e para a remoção do meio gasto. Um grande número de recipientes pode ser conectado para a obtenção de um sistema de alto rendimento.
Estes recipientes podem incluir algum suporte para o explante. Tal suporte pode ser, mas não está limitado a papel de filtro, feltro, barque- tas, esferas de vidro, esferas de zircônia/sílica, espuma ou meio sólido. O meio líquido é geralmente colocado no recipiente e então trocado quando necessário. Esta troca pode ser feita manualmente ou mecanicamente.
Os recipientes podem conter muitos explantes de uma vez ou podem ser pequenos o suficiente para conterem apenas um único explante. No caso de placas de várias cavidades, um arranjo de cavidades pequenos cada um contendo um explante é utilizado para cultivar grandes números de explantes. As vantagens das placas de várias cavidades incluem o isolamen- to de quaisquer explantes contaminados. Os explantes podem ser prepara- dos manualmente ou mecanicamente.
A finalidade da invenção é ter um sistema que pode ser facil- mente automatizado desde o início até o fim; entretanto, qualquer um destes sistemas de cultura líquida e recipientes pode ser utilizado em combinação com outras etapas de transformação, seleção e regeneração conhecidas por um versado na técnica.
Pode ser desenvolvido um sistema de transformação de alto rendimento em que os recipientes podem ser manipulados por braços robó- ticos em uma tabela de trabalho que pode ser configurada livremente que pode incluir incubadoras e agitadores em adição a artigos para laboratório padronizados. Várias ferramentas de manipulação de líquidos equipadas com uma ou mais ponteiras de pipetagem podem ser utilizadas para forne- cer o meio fresco e remover o meio gasto. A tabela de trabalho, os braços robóticos e as ferramentas de manipulação de líquidos podem ser controla- dos por software através de um computador. Alternativamente, o meio líqui- do para a seleção e para a regeneração da célula transformada pode ser fornecido ao recipiente através de um ou mais tubos conectados a um reci- piente de armazenamento de meio e removido através de um ou mais tubos conectados a um recipiente de descarte. O fornecimento e a remoção do meio podem ser controlados manualmente ou mecanicamente.
Para iniciar um processo de transformação de acordo com a presente invenção, é necessário primeiro selecionar os componentes genéti- cos que serão inseridos nas células ou o nos tecidos vegetais. Os compo- nentes genéticos podem incluir qualquer ácido nucléico que é introduzido em uma célula ou um tecido vegetal utilizando o método de acordo com a inven- ção. Os componentes genéticos podem incluir DNA sem ser de planta, DNA de planta ou DNA sintético.
Em uma modalidade preferida, os componentes genéticos são incorporados em uma composição de DNA tal como uma molécula de plas- mídeo ou de vetor de filamento duplo recombinante que compreende pelo menos um ou mais dos tipos a seguir de componentes genéticos: (a) um promotor que funciona nas células vegetais para causar a produção de uma seqüência de RNA, (b) uma seqüência de DNA estrutural que causa a pro- dução de uma seqüência de RNA que codifica um produto de utilidade agro- nômica e (c) uma seqüência de DNA não traduzida a 3' que funciona nas células vegetais para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados na ex- tremidade a 3' da seqüência de RNA.
O vetor pode conter um número de componentes genéticos para facilitar a transformação da célula ou do tecido vegetal e regular a expressão do(s) gene(s) desejado(s). Em uma modalidade preferida, os componentes genéticos ficam orientados de forma a expressar um mRNA, que em uma modalidade pode ser traduzido em uma proteína. A expressão de uma se- qüência codificadora estrutural de planta (um gene, um cDNA, um DNA sin- tético ou outro DNA) que existe na forma de filamento duplo envolve a trans- crição do RNA mensageiro (mRNA) partindo de um filamento do DNA pela enzima RNA polimerase e o processamento subsequente do produto da transcrição primária do mRNA dentro do núcleo. Este processamento envol- ve uma região não traduzida a 3' que adiciona nucleotídeos poliadenilados nas extremidades a 3' do mRNA.
Os meios para preparar plasmídeos ou vetores que contêm os componentes genéticos desejados são bem conhecidos na técnica. Os veto- res consistem tipicamente de um número de componentes genéticos, inclu- indo, mas não limitados a elementos reguladores tais como promotores, líde- res, íntrons e seqüências terminadoras. Os elementos reguladores também são referidos como elementos reguladores em eis ou em trans, dependendo da proximidade do elemento às seqüências ou ao(s) gene(s) que controlam. A transcrição do DNA em mRNA é regulada por uma região de
DNA geralmente referida como o "promotor". A região promotora contém uma seqüência de bases que sinaliza para a RNA polimerase se associar ao DNA e iniciar a transcrição em mRNA utilizando um dos filamentos de DNA como um molde para produzir um filamento complementar correspondente de RNA. Um número de promotores que são ativos nas células vegetais
foi descrito na literatura. Tais promotores incluiriam, mas não estão limitados aos promotores da nopalina sintase (NOS) e da octopina sintase (OCS) que são carregados em plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tume- faciens, os promotores de caulimovírus tais como os promotores 19S e 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) e o promotor 35S do vírus mosaico da escrofulária (FMV)1 o promotor CaMV35S intensificado (e35S), o promo- tor que pode ser induzido pela luz da subunidade pequena da ribulose bis- fosfato carboxilase (ssRUBISCO, um polipeptídeo vegetal muito abundante). Todos estes promotores foram utilizados para criar vários tipos de construtos de DNA que foram expressas em plantas.
Híbridos de promotores também podem ser construídos para aumentar a atividade transcricional (Patente U.S. N2 5.106.739) ou para combinar a atividade transcricional desejada, a capacidade de indução e a especificidade ao tecido ou a especificidade ao estágio de desenvolvimento. Os promotores que funcionam em plantas incluem, mas não estão limitados a promotores que podem ser induzidos, virais, sintéticos, constitutivos como descrito e regulados de forma temporal, regulados de forma espacial e regu- lados de forma espaço-temporal. Outros promotores que são intensificados no tecido, específicos ao tecido ou regulados em relação ao estágio de de- senvolvimento também são conhecidos na técnica e previstos como possu- indo utilidade na prática desta invenção. Os promotores podem ser obtidos partindo de uma variedade de
fontes tais como plantas e vírus de DNA de plantas e incluem, mas não es- tão limitados aos promotores CaMV35S e FMV35S e aos promotores isola- dos de genes de plantas tais como os genes da ssRUBISCO. Como descrito a seguir, é preferido que o promotor particular selecionado seja capaz de causar expressão suficiente para resultar na produção de uma quantidade eficiente do produto gênico de interesse.
Os promotores utilizados nos construtos de DNA (por exemplo, genes de plantas quiméricos/recombinantes) da presente invenção podem ser modificados, se desejado, para afetar suas características de controle. Os promotores podem ser derivados através da ligação com regiões opera- doras, mutagênese aleatória ou controlada etc. Além disso, os promotores podem ser alterados para conter várias "seqüências intensificadoras" para auxiliar no aumento da expressão gênica.
O mRNA produzido por uma DNA construção da presente in- venção também pode conter uma seqüência líder não traduzida a 5'. Esta seqüência pode ser derivada do promotor selecionado para expressar o ge- ne e pode ser especificamente modificada de forma a aumentar a tradução do mRNA. As regiões não traduzidas a 5' também podem ser obtidas partin- do de RNAs virais, de genes eucarióticos adequados ou de uma seqüência gênica sintética. Tais seqüências "intensificadoras" podem ser desejáveis para aumentar ou para alterar a eficiência da tradução do mRNA resultante. A presente invenção não está limitada a construtos em que a região não tra- duzida é derivada da seqüência não traduzida a 5' que acompanha a se- qüência promotora. Ao invés disso, a seqüência líder não traduzida pode ser derivada de promotores ou de genes não relacionados (ver, por exemplo, a Patente U.S. N- 5.362.865). Outros componentes genéticos que servem pa- ra aumentar a expressão ou para afetar a transcrição ou a tradução de um gene também são previstos como componentes genéticos.
A região não traduzida a 3' dos construtos quiméricos deve con- ter um terminador da transcrição ou um elemento que possui função equiva- lente e um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados na extremidade a 3' do RNA. Os exemplos de regiões a 3' adequadas são (1) as regiões não traduzidas transcritas a 3' que contêm o sinal de poliadenilação dos genes plasmideais indutores de tumor de Agrobacterium (Ti), tal como o gene da nopalina sin- tase (NOS) e (2) os genes de plantas tais como os genes de proteína de armazenamento da soja e a subunidade pequena do gene da ribulose-1,5- bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO). Um exemplo de uma região a 3' prefe- rida é aquela do gene E9 da ssRUBISCO da ervilha (Pedido de Patente Eu- ropeu 0385 962).
Tipicamente, as seqüências de DNA localizadas algumas cente- nas de pares de bases a jusante do sítio de poliadenilação servem para ter- minar a transcrição. As seqüências de DNA são referidas aqui como regiões de término da transcrição. As regiões são requeridas para a poliadenilação eficiente do RNA mensageiro transcrito (mRNA) e são conhecidas como re- giões não traduzidas a 3'. A RNA polimerase transcreve uma seqüência de DNA codificadora através de um sítio em que ocorre a poliadenilação.
Em uma modalidade preferida, o vetor contém um gene marca- dor que pode ser selecionado, verificado e classificado. Estes componentes genéticos são também referidos aqui como componentes genéticos funcio- nais, uma vez que fornecem um produto que tem uma função na identifica- ção de uma planta transformada ou de um produto de utilidade agronômica. O DNA que serve como um dispositivo de seleção funciona em um tecido de planta que pode ser regenerado para produzir um composto que conferiria ao tecido de planta resistência a um composto que seria de outra maneira tóxico. Os genes de interesse para uso como um marcador que pode ser selecionado, verificado ou classificado incluiriam, mas não estão limitados a GUS, proteína fluorescente verde (GFP), genes relacionados com a biossín- tese de antocianina (C1, Bperu), Iuciferase (LUX)1 antibióticos como a cana- micina (Dekeyser e outros, 1989) e herbicidas como glifosato (Della-Cioppa e outros, 1987). Outros dispositivos de seleção também podem ser imple- mentados incluindo, mas não limitados a tolerância a fosfinotricina, biala- phos, dicamba e mecanismos de seleção positiva e se encaixariam ainda dentro do âmbito da presente invenção.
A presente invenção pode ser utilizada com qualquer plasmídeo ou vetor de transformação de planta adequado que contém um marcador que pode ser selecionado ou que pode ser verificado e elementos regulado- res associados como descrito, junto com um ou mais ácidos nucléicos ex- pressos de uma maneira suficiente para conferir uma característica particu- lar. Os exemplos de genes estruturais adequados de interesses agronômi- cos previstos pela presente invenção incluiriam, mas não estão limitados a genes para tolerância a insetos ou pragas, tolerância a herbicidas, genes para melhorias na qualidade tal como rendimento, melhorias nutricionais, tolerâncias ambientais ou a estresses ou quaisquer alterações desejáveis na fisiologia, no crescimento, no desenvolvimento, na morfologia da planta ou no(s) produto(s) da planta. Alternativamente, as DNA seqüências codificadoras podem afe- tar estes fenótipos através da codificação de uma molécula de RNA que não pode ser traduzida que causa a inibição direcionada da expressão de um gene endógeno, por exemplo, através de mecanismos mediados por antis- senso ou por co-supressão (ver, por exemplo, Bird e outros, 1991). O RNA poderia também ser uma molécula de RNA catalítica (por exemplo, uma ri- bozima) engenheirada para clivar um produto de mRNA endógeno desejado (ver, por exemplo, Gibson e Shillitoe, 1997). Mais particularmente, para uma descrição da regulação antissenso da expressão gênica em células vegetais, ver a Patente U.S. Ne 5.107.065 e para uma descrição da supressão gênica em plantas através da transcrição de um dsRNA ver a Patente U.S. N- 6.506.559, a Publicação de Pedido de Patente U.S. N2 2002/0168707 A1 e os Pedidos de Patentes U.S. IM- de Série 09/423.143 (ver WO 98/53083), 09/127.735 (ver WO 99/53050) e 09/084,942 (ver WO 99/61631), dos quais todos são incorporados aqui como referência. Assim, qualquer gene que produz uma proteína ou um mRNA que expressa um fenótipo ou uma altera- ção na morfologia de interesse é útil para a prática da presente invenção.
Os exemplos de ácidos nucléicos que podem ser introduzidos através dos métodos abrangidos pela presente invenção incluem, por exem- pio, seqüências de DNA ou genes de uma outra espécie ou ainda genes ou seqüências que se originam de ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporados nas células receptoras através de métodos de engenharia genética ao invés de técnicas de reprodução ou de cruzamento clássicas. Entretanto, é também pretendido que o termo exógeno se refira a genes que não estão normalmente presentes na célula que será transformada ou talvez simplesmente que não estão presentes na forma, na estrutura etc., que é encontrada no segmento de DNA transformante ou a gene ou genes que estão normalmente presentes apesar do que é desejado, por exemplo, para serem superexpressos. Assim, é pretendido que o termo gene ou DNA "exó- geno" se refira a qualquer gene ou segmento de DNA que é introduzido em uma célula receptora, independente do fato de um gene similar já poder es- tar presente em tal célula. O tipo de DNA incluído no DNA exógeno pode incluir o DNA que já está presente na célula vegetal, o DNA de uma outra planta, o DNA de um organismo diferente ou um DNA gerado externamente, tal como uma seqüência de DNA que contém uma mensagem antissenso de um gene ou uma seqüência de DNA que codifica uma versão sintética ou modificada de um gene.
Em consideração a esta descrição, vários outros genes marca- dores que podem ser selecionados ou que podem ser verificados possíveis, elementos reguladores e outras seqüências de interesse serão evidentes aos versados na técnica. Portanto, é pretendido que a discussão anterior seja um exemplo ao invés de completa.
As tecnologias para a introdução de DNA nas células são bem conhecidas pelos versados na técnica e podem ser divididas em categorias que incluem, mas não estão limitadas a: (1) métodos químicos; (2) métodos físicos tais como microinjeção, eletroporação e bombardeio de microprojé- teis; (3) vetores virais; (4) mecanismos mediados por receptores; e 5) méto- dos de transformação de plantas mediados por Agrobacterium.
Para a transformação mediada por Agrobacterium, após a cons- trução do vetor ou do construto de transformação de plantas, a dita molécula de ácido nucléico, preparada na forma de uma composição de DNA in vitro, é introduzida em um hospedeiro adequado tal como E. coli e cruzada com um outro hospedeiro adequado tal como Agrobacterium ou transformada diretamente em Agrobacterium competente. Estas técnicas são bem conhe- cidas pelos versados na técnica e foram descritas para um número de sis- temas de plantas incluindo soja, algodão e trigo (ver, por exemplo, as Paten- tes U.S. N- 5.569.834 e 5.159.135 e WO 97/48814, incorporadas aqui como referência em sua totalidade).
A presente invenção abrange o uso de cepas bacterianas para a introdução de um ou mais componentes genéticos em plantas. Os versados na técnica reconheceriam a utilidade dos métodos de transformação media- da por Agrobacterium. Um número de cepas do tipo selvagem e desarmadas de Agrobaeterium tumefaeiens e Agrobaeterium rhizogenes que carregam os plasmídeos Ti ou Ri pode ser utilizado para a transferência gênica para plan- tas. Preferencialmente, os hospedeiros de Agrobacterium contêm plasmí- deos Ti e Ri desarmados que não contêm os oncogenes que causam tumo- rigênese ou rizogênese, respectivamente, que são utilizados como os veto- res e contêm os genes de interesse que são subseqüentemente introduzidos nas plantas. As cepas preferidas incluiriam, mas não estão limitadas a cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens, uma cepa do tipo nopalina que é utiliza- da para mediar a transferência de DNA para uma célula vegetal, cepas do tipo octopina tal como LBA4404 ou cepas do tipo succinamopina, por exem- plo, EHA101 ou EHA105. Outras bactérias tais como Sinorhizobium, Rhizo- bium e Mesorhizobium que interagem com as plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência gênica para um número de plan- tas distintas. Estas bactérias simbióticas associadas às plantas podem ser tornadas competentes para a transferência gênica através da aquisição tanto de um plasmídeo Ti desarmado quanto de um vetor binário adequado (Broo- thaerts e outros, 2005).
O uso destas cepas para a transformação de plantas foi relatado e os métodos são familiares aos versados na técnica.
Os explantes podem ser de um único genótipo ou de uma com- binação de genótipos. Qualquer semente de milho que pode germinar é um material de partida viável. Em uma modalidade preferida, os explantes supe- riores de híbridos de plantas podem ser utilizados como explantes. Por e- xemplo, uma linhagem de células de crescimento rápido com uma resposta de cultura rápida (maior freqüência de formação de calo embrionário, taxa de crescimento, freqüência de regeneração de plantas etc.) pode ser gerada utilizando embriões híbridos contendo vários genótipos. Em uma modalidade preferida, um híbrido F1 ou a prole de primeira geração de cruzamento de indivíduos de origens diferentes pode ser utilizada como uma planta doadora e cruzada com um outro genótipo. Os versados na técnica estão cientes que a heterose, também referida aqui como "vigor do híbrido", ocorre quando dois cruzamentos de indivíduos de mesma origem são cruzados. A presente invenção abrange ainda o uso de um explante resultante de um cruzamento em três vias, em que pelo menos um ou mais dos cruzamentos de indivíduos de mesma origem podem ser altamente regenerados e transformados e a freqüência de transformação e de regeneração do explante de cruzamento em três vias excede as freqüências dos cruzamentos de indivíduos de mes- ma origem individualmente. É também previsto que outros tecidos possuem utilidade na prática da presente invenção. Os explantes podem incluir embri- ões maduros, embriões imaturos, meristemas, tecido de calo ou qualquer outro tecido que pode ser transformado ou regenerado.
Qualquer meio de cultura de planta adequado pode ser utilizado durante o processo de transformação. Os exemplos de meios adequados incluiriam, mas não estão limitados a meios à base de MS (Murashige e Skoog, 1962) ou meios à base de N6 (Chu e outros, 1975) suplementados com reguladores de crescimento de planta adicionais incluindo, mas não limitados a auxinas tais como picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloropico- línico), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) e dicamba (ácido 3,6- dicloroanísico); citoquininas tais como BAP (6-benzilaminopurina) e cinetina; ABA; e giberelinas. Outros aditivos de meios podem incluir, mas não estão limitados a aminoácidos, macroelementos, ferro, microelementos, inositol, vitaminas e compostos orgânicos, carboidratos, componentes de meio inde- finidos tais como hidrolisados de caseína, antagonistas de etileno incluindo nitrato de prata com ou sem um agente de formação de gel apropriado tal como uma forma de ágar, tal como uma agarose de baixo ponto de fusão ou Gelrite®, se desejado. Os versados na técnica estão familiarizados com a variedade de meios de cultura de tecido, que quando suplementados apro- priadamente, sustentam o crescimento e o desenvolvimento do tecido de planta e são adequados para a transformação e para a regeneração da plan- ta. Estes meios de cultura de tecido podem ser obtidos na forma de uma preparação comercial ou preparados e modificados pelo usuário. Os exem- plos de tais meios incluiriam, mas não estão limitados a meios de Murashige e Skoog (1962), N6 (Chu e outros, 1975), de Linsmaier e Skoog (1965), de Uchimiya e Murashige (1962), de Gamborg (Gamborg e outros, 1968), meio D (Duncan e outros, 1985), meios de plantas Lenhosas de McCown (Mc- Cown e Lloyd, 1981), Nitsch e Nitsch (1969) e Schenk e Hildebrandt (1972) ou derivações destes meios suplementadas de forma correspondente. Os versados na técnica estão cientes que os meios e os suplementos de meios tais como nutrientes e reguladores de crescimento para uso na transforma- ção e na regeneração e outras condições de cultura tais como intensidade da luz durante a incubação, pH e temperaturas de incubação podem ser oti- mizados para a variedade particular de interesse.
Uma vez que o tecido de planta que pode ser transformado é i- solado, a etapa seguinte do método é a introdução dos componentes genéti- cos no tecido da planta. Este processo é também referido aqui como "trans- formação". As células vegetais são transformadas e cada célula vegetal transformada independentemente é selecionada. Os transformantes inde- pendentes são referidos como eventos transgênicos. Um número de méto- dos foi relatado e pode ser utilizado para inserir componentes genéticos no tecido de planta que pode ser transformado. O bombardeio de microprojéteis e o fornecimento gênico mediado por Agrobacterium são os dois métodos de transformação de plantas mais comumente utilizados, mas outros métodos são conhecidos.
Os versados na técnica estão cientes das etapas típicas no pro- cesso de transformação de plantas. Os versados na técnica estão familiari- zados com os procedimentos para o crescimento e com as condições de cultura adequadas para Agrobacterium assim como com os procedimentos de inoculação subsequentes. A densidade da cultura de Agrobacterium utili- zada para a inoculação e a proporção de células de Agrobacterium em rela- ção ao explante podem variar de um sistema para o seguinte e, portanto, é esperada a otimização destes parâmetros para qualquer método de trans- formação. A Agrobacterium também pode ser induzida diretamente partindo de estoques congelados ou pode ser cultivada de várias maneiras conheci- das por um versado na técnica.
O estágio seguinte do processo de transformação é a inocula- ção. Neste estágio, os explantes e as suspensões de células de Agrobaete- rium são misturados juntos. Isto pode ser conseguido através de incubação dos explantes na suspensão de células de Agrobaeterium. Em outras moda- Iidades descritas aqui, os explantes foram inoculados enquanto ainda esta- vam ligados ao tecido doador, enquanto os explantes eram removidos do tecido doador, após o plaqueamento dos explantes no meio de seleção ou através de uma combinação. A duração e a condição da inoculação e a den- sidade de células de Agrobacterium variarão dependendo do sistema de transformação de planta.
Após a inoculação, qualquer suspensão de Agrobacterium em excesso pode ser removida e a Agrobacterium e o material vegetal alvo são cocultivados. O cocultivo refere-se ao tempo pós-inoculação e antes da transferência para um meio de retardo ou de seleção. Qualquer número de meios de cultura de tecido de planta pode ser utilizado para a etapa de co- cultivo. Os tecidos vegetais após a inoculação com Agrobacterium podem ser cultivados em um meio líquido ou em um semissólido. O cocultivo é tipi- camente realizado durante aproximadamente um até três dias a uma tempe- ratura de aproximadamente 18°C - 30°C. O cocultivo pode ser realizado na luz ou em condições de limitação de luz. As condições de luminosidade po- dem ser otimizadas para cada sistema de planta que é conhecido pelos ver- sados na técnica.
Após o cocultivo com Agrobacterium, os explantes tipicamente podem ser colocados diretamente em meio seletivo. Alternativamente, após o cocultivo com Agrobaeterium, os explantes poderiam ser colocados em meio sem o agente seletivo e subseqüentemente colocados em meio seleti- vo. Os versados na técnica estão cientes das várias modificações nos regi- mes de seleção, nos meios e nas condições de crescimento que podem ser variados dependendo do sistema de planta e do agente seletivo. Os agentes seletivos típicos incluem, mas não estão limitados a antibióticos tal como geneticina (G418), canamicina, paromomicina ou outros compostos químicos tais como glifosato, fosfinotricina, bialaphos e dicamba. Os componentes de meios apropriados adicionais podem ser adicionaidos no meio de seleção ou de retardo para inibir o crescimento de Agrobacterium. Tais componentes do meio podem incluir, mas não estão limitados a antibióticos tal como carbeni- cilina ou cefotaxime. Em uma modalidade, as etapas de inoculaçâo, cocultivo e sele- ção foram combinadas em uma única etapa através do plaqueamento dos explantes inoculados diretamente sobre um meio que continha agentes sele- tivos para a supressão do crescimento de Agrobacterium e para matar célu- Ias de explantes não transformadas para aumentar a eficiência do sistema de produção de transformação.
As culturas são subseqüentemente transferidas para um meio adequado para a recuperação das plantículas transformadas. Os versados na técnica estão cientes do número de métodos para a recuperação das plantas transformadas. Uma variedade de meios e requerimentos de transfe- rência pode ser implementada e otimizada para cada sistema de planta para a transformação de plantas e para a recuperação de plantas transgênicas. Consequentemente, tais meios e condições de cultura divulgados na presen- te invenção podem ser modificados ou substituídos por componentes nutri- cionalmente equivalentes ou processos similares para a seleção e para a recuperação de eventos transgênicos e ainda se encaixam dentro do âmbito da presente invenção.
A presente invenção inclui todas as etapas descritas anterior- mente; entretanto, são feitas modificações quando apropriado para facilitar o processo em um único recipiente. A cultura líquida em vários tipos de supor- te é utilizada para facilitar a troca do meio de etapa para etapa. Um biorrea- tor com sistema de imersão temporária ou outro dispositivo que fornece re- sultados similares pode ser utilizado para a substituição do meio.
No caso do calo como o explante, o calo pode ser cortado fina- mente utilizando vários dispositivos incluindo, mas não limitados a um es- premedor de alho, uma tesoura, bisturi ou outros dispositivos de corte. O calo pode ser cortado de forma muito fina para caber dentro de um sistema de placa de várias cavidades pequenas, em que a expectativa é a obtenção de um único evento em cada cavidade. Estas modificações fornecem alívio ergonômico e podem ser utilizadas para recuperar muitos eventos transgêni- cos partindo de um único pedaço de calo.
Os transformantes produzidos são subseqüentemente analisa- dos para determinar a presença ou a ausência de um ácido nucléico particu- lar de interesse contido no vetor de transformação. As análises moleculares podem incluir, mas não estão limitadas a análises de Southern blots (Sou- thern, 1975) ou de PCR (reação em cadeia da polimerase), abordagens de diagnóstico imunológico e avaliações no campo. Estes e outros métodos bem conhecidos podem ser realizados para confirmar a estabilidade das plantas transformadas produzidas através dos métodos divulgados. Estes métodos são bem conhecidos pelos versados na técnica e foram relatados (ver, por exemplo, Sambrook e outros, 1989). Os versados na técnica considerarão as muitas vantagens dos
métodos e das composições fornecidos pela presente invenção. Os exem- plos a seguir são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser considerado pelos versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionarem bem na prática da invenção e assim podem ser consideradas como constituindo os modos preferidos para a sua prática. En- tretanto, os versados na técnica devem, à luz da presente descrição, consi- derar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado igual ou similar sem sair do espírito e do âmbito da invenção. Todas as referências citadas aqui são in- corporadas aqui como referência até a extensão que suplementam, expli- cam, fornecem um fundamento para ou ensinam uma metodologia, técnicas ou composições empregadas aqui. Exemplos
Os exemplos a seguir são fornecidos com a finalidade de ilus-
tração de várias modalidades da invenção e não devem ser entendidos co- mo Iimitantes da presente invenção de forma alguma. Um versado na técni- ca considerará facilmente que a presente invenção é bem adaptada para realizar os objetivos e para obter as finalidades e as vantagens menciona- das, assim como os objetivos, as finalidades e as vantagens inerentes conti- dos aqui. Os presentes exemplos, junto com os métodos descritos aqui são agora representativos das modalidades preferidas, são exemplos e não são pretendidos como limitações do âmbito da invenção. As alterações contidas aqui e outros usos que são abrangidos dentro do espírito da invenção que é definido pelo âmbito das reivindicações ocorrerão aos versados na técnica. Exemplo 1
Fonte de Explantes e Condições de Cultura
Calos de oito dias de idade (oito dias após o subcultivo) obtidos partindo de embriões imaturos de milho foram cultivados em meio 211V geli- ficado (mistura de sais basais de N6, 1 mg/L de 2-4-D, 1 mg/L de Tiamina HCI, 1 mg/L de Ácido Nicotínico, 0,91 g/L de L-Asparagina Monoidratada, 0,1 g/L de myo-inositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCI2 6H20, 0,1 g/L de hidro- Iisado de caseína, 0,69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarose, 0,1 mM de nitrato de prata, 6 g/L de Phyta ágar).
Sempre que o uso de meio gelificado for mencionado, foram uti- lizadas placas de Petri de 25 X 100 mm contendo 50 mL de meio com 12 explantes por placa e todas as transferências foram feitas manualmente.
O meio líquido consistia de 212V (sais basais de N6 com 2 mg/L de 2-4-D, 1 mg/L de Tiamina HCI, 1 mg/L de Ácido Nicotínico, 0,91 g/L de L- Asparagina Monoidratada, 0,1 g/L de myo-inositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCI2 6H20, 0,1 g/L de hidrolisado de caseína, 0,69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarose, 0,01 mM de nitrato de prata, pH ajustado em 5,8 e autocla- vado a 1210C e 105 kPa durante 20 min. Após a autoclavação, a Carbenicili- na e a Paromomicina esterilizadas por filtração a 250 mg/L ou 500 mg/L e 100 mg/L ou 200 mg/L de concentração foram adicionadas ao meio como um agente seletivo.
Para a cultura líquida, foi utilizado um recipiente de Sistema de
Imersão Temporária (TIS), placas de Petri de 240 χ 240 mm de dimensão ou placas de Petri de 25 χ 100 mm ou placas de várias cavidades.
Todas as culturas foram incubadas a 27-28°C na escuridão em uma câmara de crescimento (Percival scientific Series 101 US). Infeccão e cocultivo com Agrobacterium tumefaciens. Calos de
oito dias de idade de tamanho uniforme em crescimento ativo foram selecio- nados e inoculados com uma suspensão de Agrobacterium (0,25 X 109 ufc/mL) durante 30 minutos. Os calos foram lavados com meio líquido 212V contendo 0,1 mM de AgNCh e transferidos para um recipiente TIS ou uma placa de Petri de 25 X 100 mm contendo papel de filtro ou uma placa de Pe- tri rasa grande (240 X 240 mm) contendo duas camadas de (220 X 220 mm) feltro de poliéster. Os tratamentos de cocultivo foram realizados na escuri- dão a 23°C.
Cepas e plasmídeos de A. tumefaciens. A cepa C58 ABI de Agrobacterium foi utilizada para mediar a transferência de DNA para dentro das células vegetais. O plasmídeo pMON30113 (figura 1) continha o gene da neomicina fosfotransferase Il (NPTII) como o marcador que pode ser sele- cionado e um gene da proteína de fluorescência verde (GFP) como o mar- cador que pode ser verificado controlados pelo promotor 35S. Exemplo 2
Sistema de Imersão Temporária (TIS) Um TIS modificado foi construído como a seguir. Duas câmaras
de uma unidade de filtro de 250 ml_ que pode ser autoclavada (Nalge Nunc Intl., Rochester, NY) foram conectadas através da inserção de um tubo de vidro na base da placa de suporte normalmente utilizada para sustentar o filtro de membrana. Mangueiras de ar foram conectadas nas duas câmaras. O fluxo de ar foi esterilizado por passagem através de filtros de membrana PTFE hidrofóbicos com 50 mm de diâmetro e tamanho de poro de 0,2 pm (Millipore, Billerica, MA). O meio líquido foi colocado na câmara inferior e os materiais de explante foram colocados sobre um disco de suporte na câmara superior. O ar foi bombeado para dentro da câmara inferior para deslocar o meio líquido através do tubo de vidro até a câmara superior, cobrindo o calo com líquido. O ar bombeado para a câmara superior forçou o meio a retornar para a câmara inferior (apenas um filme fino de meio líquido permanece so- bre os tecidos). Um cronômetro eletrônico foi utilizado para operar as sole- nóides que controlam o fluxo de ar para a câmara superior ou inferior. O cro- nômetro foi programado em relação ao fluxo de ar para dentro da câmara inferior, ao fluxo de ar para a câmara superior ou "tempo ocioso" (sem fluxo de ar). Os tempos de emissão de fluxo de ar foram ajustados em 1 até 5 min cada enquanto que o tempo ocioso podia variar. O programa foi então ajus- tado para rodar em um ciclo contínuo ao longo de estágios diferentes do processo de transformação. Desta maneira, os tecidos ficaram completa- mente imersos durante aproximadamente 1-5 min nos intervalos de tempo ajustados. Isto é chamado de freqüência do ciclo de imersão.
Otimização das freqüências do ciclo de imersão. O tecido foi cul- tivado em uma imersão com duração de 1 min e quatro freqüências de ciclo de imersão diferentes (uma vez a cada 6 h, 8 h, 12 h e 24 h) cada, durante um período de 8 semanas foram testadas. Como um controle, metade dos calos derivados da mesma espiga foi cultivada em meio gelificado 211V com seleção.
Foi observado que o intervalo de tempo de imersão tem impacto significativo sobre a taxa de proliferação de calo no TIS. A taxa máxima de aumento de proliferação e de biomassa dos calos ocorreu utilizando uma freqüência de imersão de 12 h ou 24 h. Com estas duas freqüências de ciclo de imersão, 70-80% dos calos produziram setores positivos para GFP. Au- mentando a freqüência de imersão para um ciclo a cada 6 ou 8 horas, não foi observado qualquer sinal de proliferação de calo e dentro do período de até 14 dias, o calo ficou marrom e eventualmente morreu. Efeito da Carbenicilina sobre o Crescimento de A. tumefaciens.
Os calos foram inoculados com pMON30113 como descrito anteriormente. Após a inoculação, os calos infectados foram transferidos para o meio de proliferação de calos (212V) suplementado com 0, 100, 250, 500 ou 1000 mg/L de carbenicilina. O crescimento de Agrobacterium foi avaliado visual- mente através da observação da turvação do meio líquido na câmara inferior do aparato do TIS. Uma unidade do TIS separada com o tratamento de con- trole não inoculado foi incluída. Um controle adicional de calo não inoculado também foi cultivado sobre meio gelificado suplementado com carbenicilina (211V) para estudar o efeito da carbenicilina sobre a cultura de calo. Não foi observada uma diferença significativa na qualidade do ca-
lo quando o calo não inoculado cultivado em meio 211V (gelificado) e 212V (líquido) com ou sem suplementação de carbenicilina, indicando que não há efeito negativo da carbenicilina sobre o crescimento e o desenvolvimento do calo não inoculado. Entretanto, foram observadas diferenças no crescimento de A. tumefaciens e setores positivos para GFP à medida que a concentração de carbenicilina era aumentada de 0,0 até 1000 mg/L. A carbenicilina a uma concentração de 100 mg/L não podia suprimir o crescimento de Agrobacteri- um em meio líquido ou gelificado. Foi observado que a concentração ótima de carbenicilina era de 500 mg/L para meio gelificado e líquido.
Efeito da Paromomicina sobre a Proliferação de Calos e de Bro- tos. Para inibir a proliferação de calos não transgênicos, os meios de cultura tanto gelificados (controle) quanto líquidos foram suplementados com o a- gente seletivo paromomicina (25, 50, 75, 100 ou 200 mg/L). Os tratamentos de controle eram (1) calo não inoculado em meio seletivo, (2) calo não inocu- lado em meio sem seleção e (3) calo inoculado em meio sem seleção.
0 meio de cultura básico consistia em 211V ou 212V. Para este experimen- to, foram utilizadas placas de Petri fundas de 25 X 100 mm. Com a cultura
líquida, duas camadas de feltro de 60 X 60 mm foram utilizadas para apoiar os explantes. O agente seletivo para a cultura inoculada com Agrobacterium continha carbenicilina e paromomicina.
A paromomicina em baixas concentrações inibia de forma mais eficiente o crescimento de calos embriogênicos e a regeneração da planta em meio líquido que em meio gelificado. Não foram obtidas plantas partindo de calo não inoculado em meio líquido contendo tão pouco quanto 50 mg/L de paromomicina, enquanto 50% dos calos produziram plantículas em meio gelificado na mesma concentração de paromomicina. A paromomicina em uma concentração de 100 mg/L inibia o crescimento dos calos tanto em meio líquido quanto gelificado.
Otimização da Quantidade de Meio Líquido Utilizada no TIS. Os calos em desenvolvimento foram cultivados em uma de quatro quantidades diferentes de meio líquido (20 mL, 30 mL, 50 mL e 100 mL/recipiente). Seleção e Regeneração no TIS. Após 3 dias de cocultivo no TIS,
mL de meio de seleção 212VRT (sais basais de N6 com 2 mg/L de 2,4-D,
1 mg/L de Tiamina HCI, 1 mg/L de Ácido Nicotínico, 0,91 g/L de L- Asparagina Monoidratada, 0,1 g/L de myo-inositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCI2 6H20, 0,1 g/L de hidrolisado de caseína, 0,69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarose, 0,01 mM de nitrato de prata, 500 mg/L de Carbenicilina e 100 mg/L de Paromomicina) foram injetados na câmara inferior do TIS. Os calos foram imersos durante um minuto uma vez a cada 12 horas. Após duas se- manas de incubação, o meio 212VRT foi aspirado da câmara inferior utili- zando uma bomba a vácuo e substituído por 20 mL de meio 212RT (sem nitrato de prata). Os calos foram imersos durante um minuto uma vez a cada 24 horas durante mais duas semanas. Após completar 4 semanas da fase de seleção, o meio de seleção foi substituído por meio com pulso de BAP 217A (sais basais de N6 com 1 mg/L de Tiamina HCI, 1 mg/L de Ácido Nico- tínico, 3,52 mg/L de BAP, 0,91 g/L de L-Asparagina Monoidratada, 0,1 g/L de myo-inositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCI2 6H20, 0,1 g/L de hidrolisado de caseína, 0,69 g/L de Prolina, 20 g/L de sacarose, 250 mg/L de Carbenici- lina). Os calos foram tratados com meio 217A durante 7 dias com um minuto de imersão uma vez a cada 12 horas.
Para a regeneração da planta, o meio 217A foi substituído pelo meio 632AG (mistura de sais de MS, vitaminas de MS, 50 mg/L de myo- inositol, sacarose a 60 g/L, paromomicina a 50 mg/L e carbenicilina a 250 mg/L). O meio foi injetado na câmara superior do TIS e duas rodadas rápi- das de um minuto de imersão foram realizadas para diluir qualquer meio 217A residual. As luzes no Percival foram ligadas em um ciclo de 16 h ace- sas / 8 h apagadas. O TIS foi mantido ocioso (sem qualquer imersão) duran- te 72 horas e, depois disso, os calos foram imersos uma vez a cada 24 ho- ras até os brotos se desenvolverem até o tamanho de 5-20 mm.
Após 10-12 semanas de seleção e regeneração em um recipien- te, as plantas transgênicas foram obtidas. Uma freqüência de transformação de 5,9% foi conseguida no TIS. Esta se compara a 17,7% no controle. Exemplo 3 Uso de Placas de Petri
Os calos obtidos como no Exemplo 1 foram lavados com o meio líquido 212V contendo 0,1 mM de AgNO3 e transferidos para uma placa de Petri de 25 χ 100 mm contendo papel de filtro ou uma placa de Petri rasa grande (240 χ 240 mm) contendo duas camadas de feltro de acrílico (220 X 220 mm).
Os explantes foram então cultivados como descrito no TIS no Exemplo 2 com as diferenças sendo que as trocas de meios líquidos foram feitas manualmente. O meio líquido foi comparado com o meio gelificado. Na placa de Petri menor, o meio líquido forneceu uma freqüência de transfor- mação de 4,2% comparada com 6,6% com meio gelificado. Na placa de Pe- tri maior, o meio líquido forneceu uma freqüência de transformação de 7,8% comparada com 11,5% com meio gelificado. Isto demonstra que o meio lí- quido é uma alternativa viável para os protocolos padronizados de meio sóli- do. O meio líquido permitirá uma maior automatização. Exemplo 4
Uso de Placas de Várias Cavidades como Recipiente As placas de várias cavidades também podem ser utilizadas co-
mo o sistema de um único recipiente. Foram feitos experimentos como descri- to anteriormente exceto pelo uso de placas de várias cavidades ao invés de placas de Petri. As placas de várias cavidades da Costar (Corning Life Scien- ces, Acton, MA) foram utilizadas com ou sem seus insertos Transwell®. O ta- manho dos poros de membrana utilizados (0,1 μ) permite que o meio penetre através da membrana no tecido de milho quando necessário, sem submergir o tecido. As portas de acesso das ponteiras de pipeta permitem que o meio seja rapidamente removido e adicionado nas cavidades para a troca do meio. Du- rante as transferências de meio, o meio dentro das cavidades é trocado aspi- rando o meio velho com uma mangueira a vácuo e pipetando ali o meio novo.
As placas de várias cavidades utilizadas nesta invenção vêm em um tamanho de 24 cavidades separadas (com insertos) por placa. Alternati- vamente, podem ser utilizadas placas de várias cavidades com um reserva- tório de meio comum oposto para separação. As placas são tipicamente em- brulhadas com Nescofilm® ou Parafilm® ou deixadas não embrulhadas e ar- mazenadas em incubadoras (27°C) da mesma maneira que é feita com a seleção em meio sólido. O fato de que as cavidades são separados um de cada outro é particularmente benéfico porque a contaminação bacteriana não se espalha para outros explantes, como poderia ser o caso em reserva- tórios de meio comuns, seleção líquida em feltro ou seleção em meio sólido.
O vetor pMON 68410 foi utilizado para a transformação e conti- nha o gene npt\\ como um marcador que pode ser selecionado e gfp como um marcador que pode ser classificado. O tecido de calo de LH244 foi utili- zado como um explante. As etapas de transformação eram as mesmas que as divulgadas no Exemplo 8. Os experimentos também foram feitos nas pla- cas de várias cavidades Costar com e sem matrizes diferentes para o forne- cimento de suporte para o explante em meio líquido. As esferas de vidro, as esferas de silício, o feltro, a espuma e o meio sólido com meio líquido adi- cional foram utilizados. Os tratamentos de controle eram: cultura em meio sólido em placas de Petri (trt #1; Tabela 1) e apenas meio líquido em placas de várias cavidades (trt #2; Tabela 1). As matrizes diferentes foram utilizadas em quatro experimentos por quatro pessoas diferentes. Todos os tratamen- tos forneceram plantas transgénicas. Entretanto, o uso de matriz de esfera de silício e os feltros pequenos estavam de acordo com o tratamento de con- trole de cultura em meio sólido em placas de Petri.
Tabela 1. Uso de placas de várias cavidades com e sem matrizes para a
prod ução de plantas de milho transgénicas partindo de explantes de calo. Trt N0 Matriz/Meio N0 de pedados de calo para cada experimento % de TF Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Total 1 Gel/sólido em placa de Petri 48 39,6 50,0 50,0 25,0 41,1 2 Nenhuma/Líquido 24 4,2 25,0 16,7 8,3 13,5 3 Esferas de Vidro/líquido 24 25,0 12,5 33,3 16,7 21,9 4 Esferas de Silício/líquido 24 33,3 25,0 29,2 50,0 34,4 Feltro Pequeno/líquido 24 41,7 25,0 54,2 29,2 37,5 6 Espuma 24 0,0 16,7 0,0 4,2 5,2 7 Meio sólido com meio líquido adicional 24 16,7 16,7 12,5 4,2 12,5
A Tabela 2 mostra que o sistema de várias cavidades com (trt n° 3 até 5) e sem (trt n° 6) matrizes também pode ser utilizado para a produção de plantas de milho transgênicas utilizando embriões imaturos como explan- tes e glifosato como um agente seletivo. O vetor pMON 92690 para este es- tudo continha os genes cp4 e gus. A transferência de meio em várias cavi- dades foi feita em uma base semanal.
Tabela 2. Uso de placas de várias cavidades com e sem matrizes para a pro- dução de plantas de milho transgênicas partindo de explantes de embrião.
Trt N0 Recipiente Meio Matriz N0 de embriões % de TF 1 Placa de Petri Sólido Qe| 40 60,0% 2 Placa de Petri Líquido Feltros 40 45,0% 3 Várias cavidades Líquido Esferas de Silício 40 25,0% 4 Várias cavidades Líquido Esferas de Vidro 40 15,0% Várias cavidades Líquido Feltro Pequeno 40 37,5% 6 Várias cavidades Líquido Nenhuma 48 2,1%
Exemplo 5
Uso de Uma Única Placa de Petri com Meio Sólido Seguido por Meio Líquido Um outro exemplo de um sistema de um único recipiente é o
uso de uma única placa de Petri com meio sólido e subseqüentemente a adição de meio líquido para facilitar a seleção e a regeneração na única pla- ca sem a substituição do meio velho. O calo de milho foi obtido e inoculado como descrito no Exemplo 7. O calo foi então cocultivado em uma placa de Petri funda de 25
X 100 contendo um papel de filtro Whatman e 100 pL de meio 1/2 MSPL a 23°C. Após 3 dias, o calo foi transferido para o meio sólido 850QRT (4,33 g/L de sais de MS, 0,5 mg/L de tiamina HCI, 0,5 mg/L de piridoxina HCI, 0,5 mg/L de ácido nicotínico, 100 mg/L de myo-inositol, 0,5 g/L de hidrolisado de caseína, 1,38 g/L de prolina, 30 g/L de sacarose, 0,5 mg/L de 2,4-D, 10 pg/L de BAP, 20 μΜ de AgN03, 500 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de paromo- micina, pH 5,8, 6 g/L de ágar).
Após 14 dias, 7-10 mL de meio 850QRTT fresco (850QRT sem o ágar e com 200 mg/L de paromomicina) foram adicionados e as placas foram incubadas em luz baixa. Após 14 dias adicionais, 7-10 mL de meio 850RT fresco (4,33 g/L de sais de MS, 0,5 mg/L de tiamina HCI, 0,5 mg/L de piridoxina HCI, 0,5 mg/L de ácido nicotínico, 100 mg/L de myo-inositol, 0,5 g/L de hidrolisado de caseína, 1,38 g/L de prolina, 30 g/L de sacarose, 0,5 mg/L, 10 pg/L de BAP, 500 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de paromomici- na, pH 5,8) foram adicionados e as placas foram adicionalmente incubadas em luz fraca.
Após mais 14 dias, os brotos regenerados foram transferidos pa- ra o meio 632AT (4,33 g/L de sais de MS, 0,5 mg/L de tiamina HCI, 0,5 mg/L de piridoxina HCI, 0,5 mg/L de ácido nicotínico, 50 mg/L de myo-inositol, 60 g/L de sacarose, 250 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de paromomicina, pH 5,8, 6 g/L de ágar). As plantas regeneradas foram então transferidas para phytatrays contendo o mesmo meio após 14 dias e então transferidas para o solo em 2 semanas.
As plantas selecionadas e regeneradas em meio sólido produzi- ram aproximadamente 46% de plantas transformadas que podiam ser utili- zadas comparadas com 47% de plantas transformadas que podiam ser utili- zadas partindo do método de controle utilizando meio líquido sobre um su- porte de feltro. Exemplo 6
Transformação de Milho mediada por Aprobacterium Utilizando um novo Mé- todo de Cultura em Suspensão
É conhecido na técnica que a produção de cultura de suspensão de células que podem ser transformadas é demorada e resulta freqüente- mente na produção de células não embrionárias. Este exemplo descreve um método altamente reproduzível (referido aqui como "cultura em suspensão curta" ou "SSC") para a produção de uma cultura em suspensão rápida que é altamente embriogênica e muito competente para a transformação gênica mediada por Agrobacterium. A SSC como um explante combina as caracte- rísticas desejáveis do calo (embrionário e fácil de utilizar) e de culturas em suspensão (uniformes, que podem ser altamente regeneradas e que podem ser aperfeiçoadas para a produção de alto rendimento). Neste exemplo não limitante, a neomicina fosfotransferase Il (npfll) foi empregada como um marcador que pode ser selecionado e um sistema de vetor binário padroni- zado foi utilizado para a seleção e a regeneração eficientes dos eventos transgênicos estáveis mediados por Agrobacterium no milho.
Cepa, plasmídeo e cultura de Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens EHA 101 desarmado carregando o vetor binário pMON25457 foi utilizado neste experimento. O pMON25457 continha genes selecionáveis (npfll) e repórteres (uidk), cada um controlado por um promotor 35S intensi- ficado ("e35S") e seguido por um íntron hsp70 não traduzido. O gene uidA possui um íntron adicional dentro de sua seqüência codificadora para mini- mizar a expressão bacteriana. Os plasmídeos foram introduzidos na cepa de Agrobacterium por eletroporação com um Bio-Rad Gene Pulser operado a 2,5 kV e 400 Ohms. As colônias transformadas foram selecionadas em meio Luria-Bertani (LB) sólido (Sambrook e Russell, 2001) contendo 100 mg/L de cada um de canamicina e gentamicina.
Indução e cultivo de Agrobaeterium. As células de Agrobaeteri- um utilizadas para a transformação foram pré-induzidas com acetossiringona (200 μΜ) e glicose (2%) em meio de indução à base de AB (0,1 M de MES, 0,5 mM de NaH2PO4, 2% de glicose, 1 g/L de NH4CI, 300 mg/L de Mg- SOWH2O, 150 mg/L de KCI1 10 mg/L de CaCI2 anidro, 2,5 mg/L de Fe- S04«7H20, pH ajustado em 5,4 com NaOH).
Um procedimento geral para a indução de células de Agrobaete- rium é como a seguir. Uma alça cheia de colônias de bactérias foi coletada de uma placa fresca e cultivada a 28°C em 50 mL de meio LB contendo an- tibióticos apropriados. A densidade óptica em 660 nm da cultura de bactérias após aproximadamente 15 até 24 horas de cultivo era de aproximadamente 1,4. Uma alíquota de 10 mL da cultura foi transferida para 50 mL de meio LB fresco contendo antibióticos apropriados e cultivada durante 6 até 8 horas adicionais até uma densidade óptica em 660 nm de aproximadamente 1,2. As células de Agrobaeterium foram centrifugadas a 4°C durante 10 min a 3250 χ g. O pélete resultante foi ressuspenso no meio de indução até uma densidade óptica final em 660 nm de aproximadamente 0,2 e incubado a 28°C durante aproximadamente 12 até 15 horas. Antes do uso para trans- formação, as células de Agrobacterium foram centrifugadas a 4°C durante min a 3250 χ g. Após decantar o sobrenadante, o pélete foi ressuspenso em meio 1/2 MSVI (2,2 g/L de sal de MS (Gibco), 1 mL/L de estoque de vi- taminas 1000x de MS, 115 mg/L de prolina, 10 g/L de glicose, 20 g/L de sa- carose, pH 5,4, esterilizados por filtração) e suplementado com 200 μΜ de acetossiringona. Pelo menos 100 mL de meio 1/2 MS Vl suplementado com 200 μΜ de acetossiringona foram utilizados para cada 1 L de suspensão de Agrobacterium. As células suspensas foram aliquotadas em volumes meno- res, centrifugadas a 4 graus C durante 10 min a 3250 χ g, o sobrenadante foi descartado e as pelotas foram armazenadas em gelo até o uso (até 4 horas). As pelotas foram ressuspensas até uma densidade óptica desejada com meio 1/2 MS Vl suplementado com 200 μΜ de acetossiringona, com uma suspensão de aproximadamente 109 células/mL fornecendo uma densidade óptica em 660 nm de aproximadamente 0,2.
Crescimento de plantas de estoque e formação de calo. Os ge- nótipos de milho Hi-Il e FBLL foram crescidos na estufa em um período de dia de 16 h. Os cruzamentos envolvendo estes genótipos foram feitos e os embriões imaturos foram cortados sobre um meio N6 modificado (Chu e ou- tros, 1976) suplementado com 1,0 mg/L de 2,4-D,1 mg/L de tiamina HCI, 0,5 mg/L de ácido nicotínico, 0,91 g/L de L-Asparagina Monoidratada1 100 mg/L de myo-inositol, 0,5 g/L de MES, 1,6 g/L de MgCI2 6H20, 100 mg/L de hidroli- sado de caseína, 0,69 g/L de prolina e 20 g/L de sacarose; o meio N6 modi- ficado foi solidificado com 2 g/L de Gelgro (número de catálogo 150180, ICN Biomedicals) e o pH do meio foi ajustado em pH 5,8 com KOH (pré- autoclave). As mesmas condições de crescimento foram utilizadas para o genótipo de elite RBDQ2. As linhagens do híbrido FBLL χ Hi-Il e de calo RBDQ2 foram subcultivadas em intervalos de duas semanas e mantidas a 28°C na escuridão durante até quatro meses no mesmo meio. Este protocolo de subcultura também funcionava com as linhagens Hi-Il e FBLL-MAB.
Formação de cultura em suspensão curta (SSC). Um protocolo geral para produzir uma SSC partindo de calos é como a seguir. Para iniciar a formação de SSC, aproximadamente 2 g de calos, duas semanas após o subcultivo, foram transferidos para um frasco com aletas de 250 mL conten- do 80 mL de meio MS Fromm suplementado com 2,0 mg/L de 2,4-D, 20 g/L de sacarose, 150 mg/L de L-Asparagina, 100 mg/L de myo-inositol, 1 mL de estoque de vitaminas 1000x de MS Fromm contendo 650 mg/L de ácido ni- cotínico, 125 mg/L de piridoxina HCI, 125 mg/L de tiamina HCI e 125 mg/L de pantotenato de cálcio (pH do meio ajustado em 5,8 com KOH). As SSC foram geradas em um agitador giratório ajustado em 170 rpm e 28°C. Duran- te cada transferência subsequente, foi permitido que os tecidos assentassem por um curto período de tempo no fundo dos frascos para remover os tipos de células indesejáveis (por exemplo, células que estavam alongadas, com parede espessa, com baixo conteúdo citoplasmático ou que não estavam em divisão), antes da suspensão ser transferida com uma pipeta descartável esterilizada Falcon® de boca larga. No dia 1 após o início, o tecido do frasco foi transferido para um frasco novo contendo 80 mL de meio MS modificado e crescido durante mais dois dias; esta etapa de transferência foi repetida no dia 3 após o início. No dia 5 após o início, o tecido foi dividido igualmente entre dois frascos, fornecendo um volume de aproximadamente 2,5 mL de células compactadas (PCV) por frasco. Depois disso, o meio foi substituído a cada 3 dias. No dia 14 após o início, o volume de células compactadas resul- tante em cada frasco era de aproximadamente 6 mL (aproximadamente 4 g por frasco ou aproximadamente um aumento de quatro vezes no PCV total ao longo de duas semanas). Estas células ("SSC") foram transferidas para meio fresco no dia 14 após o início e a transformação foi iniciada no dia 15 após o início. A troca relativamente freqüente de meio ao longo de todo este procedimento de SSC permitiu uma rápida proliferação do tecido. Uma van- tagem adicional do procedimento de SSC era que nenhuma seleção visual de tecidos era necessária em cada etapa de transferência, tomando este sistema tanto prático quanto reproduzível.
Inoculação e cocultura. Três frascos contendo um total combinado de aproximadamente 18 mL de PCV foram utilizados em um estudo de trans- formação de explantes em SSC de híbridos de FBLL χ Hi—II. Experimentos pilo- tos foram realizados para melhorar os parâmetros envolvidos nas várias etapas de transformação. Uma técnica de cocultura modificada foi utilizada como des- crito por Cheng e outros (2003), que é incorporado aqui como referência. Uma etapa de dessecação foi empregada após a infecção com Agmbacterium, que foi observada como aumentando enormemente a transferência de T-DNA as- sim como aumentando a recuperação de eventos transgênicos.
O tecido em SSC do híbrido FBLL χ Hi-Il de cada frasco junto com parte do meio líquido foi igualmente dividido e transferido para dois ca- vidades de uma placa de cultura de tecido de seis cavidades (Corning CoS- tar®, não tratada, peça número 9088) ou, alternativamente, para uma placa de Petri de 20 X 60 mm. O meio líquido foi removido de cada cavidade ou placa. Cinco mL da suspensão de Agrobacterium (D0660nm ~0,5) em meio 1/2 MS Vl suplementado com 200 μΜ de acetossiringona foram adicionados em cada cavidade ou placa, seguidos por um período de inoculação de 1 h. No final do período de inoculação, a maior parte da suspensão de Agrobac- terium foi cuidadosamente removida e as células em SSC inoculadas foram lavadas com 5 mL de meio 1/2 MS Vl suplementado com 200 μΜ de acetos- siringona. As células de cada cavidade ou placa foram transferidas para uma placa de Petri contendo 3 camadas de papel de filtro esterilizado para absor- ver o líquido em excesso das células e então divididas igualmente e transfe- ridas para duas placas de Petri de 60 X 20 mm, cada uma contendo um pe- daço de papel de filtro esterilizado de 5,5 cm de diâmetro (Baxter). Um total de 12 placas de cocultura contendo papel de filtro foi obtido dessa maneira (4 de cada frasco original). As células transferidas foram dispostas em 6 até 8 grupos sobre o papel de filtro. Uma cocultura de um diasob dessecação foi realizada utilizando um protocolo modificado de Cheng e outros (2003), que é incorporado aqui como referência em sua totalidade. Cem pL de meio 1/2 MS Vl suplementado com 200 μΜ de acetossiringona foram adicionados em cada papel de filtro e as placas foram embrulhadas com Parafilm® e incuba- das na escuridão a 23 graus C. A freqüência de transformação foi calculada como o número de eventos independentes regenerados por mL de PCV. Os experimentos de transformação foram realizados similarmente com explantes em SSC de RBDQ2, utilizando três volumes de células com- pactadas em réplicas (4,5 mL cada). O procedimento de transformação era geralmente o mesmo que o utilizado com os explantes em SSC de híbridos FBLL χ Hi-Il1 exceto pelo fato de que, para um dos dois cavidades por frasco, o meio 1/2 MS Vl suplementado com 200 μΜ de acetossiringona e contendo μΜ de AgNO3 foi utilizado durante as etapas de inoculação e de lavagem.
Seleção e regeneração de plantas transgênicas. O protocolo pa- ra a transformação de SSC com nptll utilizando seleção com paromomicina envolvia um suporte de papel de filtro simples para a transferência de ex- plantes durante a seleção, que diminuía o trabalho, garantia a eliminação rápida de Agrobacterium, aumentava a taxa de crescimento do tecido e re- sultava em uma seleção mais rápida.
Este procedimento foi realizado em SSC de híbridos FBLL χ Hi-Il como a seguir. No dia 0 da transformação (que é no final da etapa de cocul- tura), foi realizada uma etapa de lavagem com 5 mL de meio MS Fromm su- plementado com 1000 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina, 100 mg/L de vancomicina e 40 mM de AgNO3 que foram adicionados diretamen- te em cada uma das placas de cocultura e os grupos de células foram sua- vemente agitados utilizando uma espátula esterilizada para garantir a sub- mersão. O meio de lavagem foi removido das placas e os papéis de filtro carregando as células foram transferidos para placas de Petri contendo meio "D" de Duncan sólido fresco contendo 3,0 mg/L de 2,4-D suplementado com 1000 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina e 40 micromolares de AgNO3 como um meio de retardo. O meio "D" de Duncan contém sais basais e vitaminas do meio "D" como descrito por Duncan e outros (1985), que é incorporado aqui como referência; geralmente 500 mL de um estoque 2X deste meio foram preparados e adicionados em 500 mL de água destilada esterilizada autoclavada contendo 6 g de Phytagar. As células foram manti- das no meio de retardo durante 6 dias. No dia 6 de transformação, uma pri- meira etapa de seleção foi realizada com os papéis de filtro carregando as células transferidas para placas de Petri contendo o meio "D" de Duncan com 1,5 mg/L de 2,4-D suplementado com 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilína, 40 micromolares de AgN03 e 50 mg/L de paromomicina como um primeiro meio de seleção. Duas semanas após o final da etapa de cocultura, uma segunda etapa de seleção foi realizada com os papéis de filtro carregando as células transferidas para as placas de Petri contendo o meio "D" de Duncan com 1,5 mg/L de 2,4-D suplementado com 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina, 40 micromolares de AgN03 e 100 mg/L de paromomicina como um segundo meio de seleção. Três semanas após o final da etapa de cocultura, uma terceira etapa de seleção foi realiza- da com grupos do tamanho de ervilhas de tecido removido de cada papel de filtro e plaqueados sobre um meio "D" de Duncan sólido com 1,5 mg/L de 2,4-D suplementado com 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina e 100 mg/L de paromomicina como um terceiro meio de seleção. Havia apro- ximadamente 4 até 6 grupos resultantes de células plaqueadas de cada pa- pel de filtro e cada grupo de células foi tratado individualmente dali em diante nos experimentos. Um grupo plaqueado por papel de filtro foi analisado his- toquimicamente em relação ao tamanho do setor transgênico, que foi obser- vado como sendo de aproximadamente 1 até 2 mm de diâmetro. Quatro se- manas após o final da etapa de cocultura, uma quarta etapa de seleção foi realizada com cada grupo transferido para placas de Petri contendo meio "D" de Duncan suplementado com 1,5 mg/L de 2,4-D suplementado com 750 mg/L de carbenicilina, 100 mg/L de ticarcilina e 100 mg/L de paromomicina. No final deste quarto ciclo de seleção, foi obtido um total de 232 linhagens híbridas FBLL χ Hi-Il resistentes à paromomicina. Sete semanas após o final da etapa de cocultura, uma etapa de seleção e pré-regeneração foi realizada com os calos resistentes transferidos para placas de Petri fundas (20 X 100 mm) contendo 3,52 mg/L de 6-BAP, 500 mg/L de carbenicilina e 100 mg/L de paromomicina durante uma semana. Finalmente, os tecidos em regene- ração foram transferidos para um meio de regeneração MS durante duas semanas em placas de Petri, seguidas pela transferência para um Phytatray durante três semanas adicionais. O meio de regeneração MS consistia de meio MS modificado suplementado com 10 g/L de glicose, 20 g/L de sacaro- se, 100 mg/L de myo-inositol, 150 mg/L de L-Asparagina e 1 mL/L de esto- que de vitaminas 1000x de MS Fromm contendo 650 mg/L de ácido nicotíni- co, 125 mg/L de piridoxina HCI, 125 mg/L de tiamina HCI e 125 mg/L de pan- totenato de cálcio e 6 g/L de Phytagar; o pH do meio foi ajustado em 5,8 com KOH pré-autoclave e 250 mg/L de carbenicilina e 100 mg/L de paromomicina foram adicionados pós-autoclave. Treze semanas após o final da etapa de cocultura, as plantículas resultantes foram transferidas para o solo.
Análise da progênie de plantas transgênicas. A atividade de ui- dA foi analisada em vários estágios de seleção e transformação, seguindo o procedimento histoquímico descrito por Jefferson (1987), que é incorporado aqui como referência, em vários estágios de transformação e crescimento vegetal. A detecção e a análise do número de cópias de nptll foram realiza- das com ensaios INVADER® (Third Wave Technologies, Madison, Wl). Pelo menos sob as condições experimentais descritas anteriormente, foi observa- do que uma etapa de retardo seguida por um aumento em etapas na pres- são de seleção era necessária para recuperar setores transgênicos de ex- plantes em SSC. Em geral, foi observado que a competência para a trans- formação mediada por Agrobacterium de células de milho era aumentada submetendo o calo a pelo menos uma fase líquida curta antes do início da transformação. Por exemplo, foi observado que os explantes em SSC de híbridos FBLL χ Hi-Il eram altamente competentes à transferência de T-DNA entre aproximadamente 5 dias até aproximadamente 14 dias após o início da SSC com 80% dos tecidos expressando gus 3 dias após a transformação. Também foi observado que culturas SSC mais velhas (2 meses) eram com- petentes à transformação, com aproximadamente 20% dos explantes exibin- do coloração histoquímica em relação à atividade de uidA 3 dias após a transformação. Em contraste, foi observado que os calos de híbridos FBLL χ Hi-Il mantidos em meio N6 modificado com 211 eram pouco competentes, com menos de 20% dos explantes exibindo coloração histoquímica em rela- ção à atividade de UidA 3 dias após a transformação.
No caso do genótipo de híbridos FBLL χ Hi-Il1 foi obtido um total de 232 linhagens resistentes à paromomicina partindo dos três frascos origi- nais. Das 76 linhagens de calos resistentes testadas, foi observado que 56 (aproximadamente 74%) expressavam uidA. Um subconjunto de 35 linha- gens resistentes à paromomicina foi regenerado; destas, foi observado que 24 de 25 eventos que foram regenerados em plantas continham uidA. Sou- thern blots e ensaios histoquímicos de plantas com origem em vários expe- rimentos em SSC confirmaram a integração do transgene na geração R1 e a herança dos transgenes pelas gerações RO e R1. No caso do genótipo RBDQ2, 3 frascos em réplica (cada um contendo aproximadamente 4 mL de PCV) forneceram um total de 37 supostos eventos positivos em relação a uidA resistentes à paromomicina. A freqüência de transformação foi subes- timada porque alguns tecidos foram sacrificados para os ensaios histoquími- cos para UidA. Neste genótipo, o uso de AgNO3 durante a inoculação ou a lavagem não aumentou a freqüência de transformação, sugerindo que a su- pressão do crescimento de Agrobacterium por dessecação era suficiente para minimizar a toxicidade do Agrobacterium. Um total de 29 supostos ca- los resistentes à paromomicina foi gerado, do qual 18 supostos eventos fo- ram transferidos para o solo. Foi observado que dezessete dos 18 eventos eram positivos em relação a uidA através de ensaios histoquímicos do tecido foliar. Assim, a freqüência de transformação em SSC de RBDQ2 (com base nos supostos eventos) foi estimada como sendo de aproximadamente 1,4 evento/1 mL de PCV (17 eventos/12 mL de PCV).
Este procedimento de SSC foi assim capaz de estabelecer rapi- damente culturas em suspensão do tipo Il que podiam ser regeneradas, a- dequadas para a transformação estável mediada por Agrobacterium, partin- do tanto do híbrido FBLL χ Hi-Il quanto dos genótipos RBDQ2 de elite de propriedade. Os explantes em SSC podem ser especialmente úteis no de- senvolvimento de um sistema de avaliação gênica de alto rendimento. Exemplo 7
Preparação de Aarobacterium para Transformação Através da Inoculação Dire- ta de um Estoque em Glicerol Congelado de Aorobacterium em um Meio de Indução
Este é um exemplo não Iimitante de um método de preparação de Agrobacterium para transformação. Mais especificamente, este exemplo descreve a inoculação direta de um estoque em glicerol congelado de Agro- bacterium em um caldo de indução vir.
A transferência de T-DNA para células vegetais utilizando o plasmídeo Ti requer a ativação dos genes vir que codificam as proteínas Vi- rA e VirG. Os sinais para a tivação de VirA incluem, por exemplo, pH ácido, compostos fenólicos (por exemplo, acetossiringona) e certos açúcares que atuam de forma sinérgica com compostos fenólicos. Convencionalmente, a pré-indução de genes vir envolve o cultivo de células de Agrobacterium (ge- ralmente partindo de um estoque congelado) em um meio de cultivo durante um período de tempo variável, a medida da densidade de Agrobacterium, o ajuste até uma densidade desejada, o crescimento em meio de indução mí- nimo AB ou outro meio adequado para indução, a centrifugação e a lavagem das células e finalmente o ajuste da cultura de Agrobacterium até uma den- sidade desejada antes da inoculação. As várias etapas envolvidas requerem tempo e esforço consideráveis e fornecem oportunidades para variabilidade indesejável nos experimentos.
É divulgado aqui um procedimento de indução direta de Agro- bacterium em uma única etapa rápido que reduz o tempo, o esforço e a vari- abilidade nos experimentos de transformação. A redução no número de eta- pas necessárias para a indução também é vantajosa para as finalidades de controle de qualidade e para a redução de sobrecarga ergonômica.
Nas modalidades não Iimitantes descritas aqui, foi utilizado o ve- tor pMON 70801 que carrega um gene (cp4) para resistência ao glifosato (ver a Patente U.S. Ns 5.633.435, que é incorporada aqui como referência em sua totalidade); entretanto, muitos outros vetores de Agrobaeterium po- deriam ser utilizados, como é conhecido na técnica. As densidades ópticas (DO) foram medidas em 660 nanômetros. Procedimentos adequados adicio- nais, incluindo descrições de meios e reagentes, para a transformação de plantas utilizando a seleção com glifosato, foram divulgados, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente U.S. N- 2004/0244075 a Cai e outros, que é incorporada aqui como referência em sua totalidade. Indução direta com meio de indução MS modificado. Em uma modalidade não limitante, o procedimento pode envolver a pré-indução de um estoque em glicerol de Agrobacterium congelado em um meio de indu- ção MS contendo componentes de indução vir necessários. Após a pré- indução, as células de Agrobacterium são utilizadas diretamente nos expe- rimentos de transformação.
O Agrobacterium foi cultivado partindo de um estoque congelado com meio MS (sais de 1/2MS, 100 μΜ de MES1 2% de glicose com 25% (v/v) de glicerol). O estoque congelado feito com sais de MS foi ressuspenso em um caldo de indução MS modificado contendo acetossiringona (sais de Y2MS1 100 μΜ de MES1 2% de glicose) suplementado com antibióticos apro- priados (Spec/Strep 50 pg/mililitro, Canamicina 50 pg/mililitro e Cloranfenicol microgramas/mililitro e 200 μΜ de acetossiringona). Um total de 5 horas foi acompanhado com uma DO inicial de 0,4. Para a indução, foi utilizado um frasco (frasco com aletas de 250 ml_) com 50 mililitros de meio de indução. No final da indução, a suspensão de Agrobacterium foi utilizada diretamente para a inoculação e foi suplementada com 20 μΜ de AgNO3 logo antes da inoculação.
O protocolo de indução direta em MS modificado descrito anteri- ormente foi comparado com um protocolo convencional envolvendo as eta- pas a seguir: o Agrobaeterium foi cultivado partindo de um estoque congela- do durante 8 horas em LB líquido com antibióticos apropriados (Spec/Strep 100 microgramas/mililitro, canamicina 100 microgramas/mililitro e cloranfeni- col 25 microgramas/mililitro). O Agrobaeterium foi centrifugado e ressuspen- so em um caldo de indução mínimo AB com antibióticos apropriados (spec/Strep 50 microgramas/mililitro, canamicina 50 microgramas/mililitro e cloranfenicol 25 microgramas/mililitro) e 200 micromolares de acetossiringo- na. Um total de indução de 13 horas foi acompanhado com uma DO inicial de 0,2. Para a indução, foi utilizado um frasco (frasco com aletas de 1 litro) contendo 300 mililitros de meio de indução. No final da indução o Agrobaete- rium foi centrifugado e ressuspenso com 1/4MSVI suplementado com 200 mi- cromolares de acetossiringona até uma DO de 0,4. O AgNO3 foi adicionado até uma concentração final de 20 micromolares logo antes da inoculação.
Os explantes para este estudo eram calos derivados de uma li- nhagem de milho quase elite subcultivada em meio fresco 8 dias antes do início da transformação em meio 201 à base de N6. A inoculação foi realiza- da em placas fundas de 25 χ 100 milímetros. Aproximadamente 6 gramas de calos foram transferidos para uma placa funda contendo 50 mililitros de ΛΑ MS Vl (uma placa por tratamento). Os explantes foram lavados e todo o lí- quido foi removido. Vinte mililitros de suspensão de Agrobacterium (DO 0,4) suplementado com acetossiringona (concentração de final 200 micromola- res) e AgNO3 (concentração final de 20 micromolares) e uma inoculação de 1 hora foram utilizados. A suspensão de Agrobacterium foi removida após a inoculação e os explantes foram lavados com 15 mililitros de ΛΑ MSVI suple- mentado até a concentração de 20 micromolares de AgNO3 e 200 micromo- lares de acetossiringona. Os calos de cada placa de inoculação foram trans- feridos para uma placa funda contendo 10 papéis de filtro (7,5 milímetros; número de catálogo da Baxter 28313-046) para remover o líquido em exces- so. Aproximadamente 0,5 grama (peso úmido) ou aproximadamente 2,5 gramas (peso seco) de calo foram transferidos para uma única placa de co- cultura (25 χ 60 milímetros) contendo um único papel de filtro (5,5 milíme- tros; número de catálogo da Baxter 28297-868). Os explantes foram dispos- tos em quatro grupos voltados para a beira da placa de cocultivo. O cocultivo foi realizado com ou sem dessecação (1 mililitro de 1/4 MSVI foi adicionado) a 23°C durante 18 horas. Para cada tratamento, que é a indução convencional ou a indução com MS modificado, foram utilizadas sete réplicas (4 sem des- secação, 3 com dessecação). Nenhuma diferença estatisticamente significa- tiva foi observada entre os dois protocolos de indução. Foi mostrado que o protocolo de indução direta com MS modificado produzia aproximadamente o mesmo número de supostos eventos como produzia o protocolo conven- cional mais prolongado. Indução direta com meio de indução AB. Em uma outra modali-
dade não limitante, o procedimento envolvia a pré-indução de um estoque em glicerol de Agrobacterium congelado em um meio de indução AB con- tendo os componentes de indução vir necessários. Após a pré-indução, as células de Agrobacterium foram ajustadas até a densidade desejada e utili- zadas diretamente nos experimentos de transformação. O Agrobacterium foi cultivado partindo de um estoque congelado em LB regular com uma densi- dade óptica (DO) de Agrobacterium de 3,0 medida em 660 nanômetros (concentração final).
Uma cultura de Agrobacterium foi preparada e dividida em duas partes. Uma parte foi cultivada durante 4,5 horas adicionais até uma DO ~0,6 em 36 mililitros de meio 2XYT, centrifugada, ressuspensa em DO -3,0 em meio mínimo AB contendo 20% de glicerol e congelada para uso em um protocolo de indução direta. Para a indução, 5 mililitros do estoque congela- do foram descongelados, adicionados a 70 mililitros de meio mínimo AB con- tendo acetossiringona e induzidos durante a noite.
A segunda parte da cultura de Agrobacterium foi estriada sobre placas e incubada 3 dias; uma primeira cultura de semeadura preparada par- tindo destas placas foi crescida durante a noite. Esta foi seguida por uma segunda cultura de semeadura preparada partindo da primeira cultura de semeadura. Crescida durante um dia e induzida durante a noite a DO ~0,2 em meio mínimo AB contendo acetossiringona. As duas preparações de Agrobaeterium induzidas foram utiliza-
das para inocular embriões de milho em experimentos paralelos. Os embri- ões de milho da metade de cada espiga foram cortados dentro de cada uma das preparações de Agrobaeterium (DO ~1,0) durante 15 minutos e então foi permitido que se acomodassem durante 5 minutos. Os embriões foram re- movidos e colocados sobre placas de cocultura. Utilizando o protocolo con- vencional, um total de 883 embriões foi inoculado, resultando em um total de 174 (20%) plantas no solo e uma freqüência média de transformação de 17% (desvio padrão = 11,4). Utilizando o protocolo de indução direta, um total de 814 embriões foi inoculado, resultando em um total de 153 (19%) plantas no solo e uma freqüência média de transformação de 19% (desvio padrão = 11,6). Foi observado que o número de cópias do transgene ep4 era similar entre os tratamentos. Exemplo 8
Métodos para a Preparação de Calo de Milho para Subcultivo Através de Meios Mecânicos
Um dos processos de maior sobrecarga ergonômica e demora- dos de um sistema de produção de transformação de milho é o estabeleci- mento e a manutenção do calo embrionário para a transformação mediada por Agrobacterium que requer a ruptura manual do calo durante a etapa de subcultura. Além disso, durante o processo de transformação, muitas células são transformadas em um único embrião imaturo ou um único pedaço de calo. Entretanto, as práticas de seleção e de regeneração atuais tratam cada população de células transformadas em um único embrião imaturo ou peda- ço de calo como um único evento, regenerando geralmente uma planta por pedaço de tecido.
Para aliviar a sobrecarga ergonômica criada pela compressão manual através de fórceps do calo, especialmente do calo do tipo I, vários meios mecânicos tais como moedores de café, moinhos para alimentos para bebês, moedores de pimenta em grão, moedores de ervas, cortadores de alho e facas para recortes de decoração foram testados como um meio para romper ou cortar o calo para subcultura. Dentre estes meios, foi observado que o moedor de ervas e a faca para recortes de decoração são os mais adequados para romper ou cortar o calo e na produção de pedaços de calo adequados para subcultura e transformação.
O uso de meios mecânicos para a preparação de calo de milho para a subcultura também pode ser feito para separar muitas células trans- formadas dentro de uma certa unidade de tecido através do corte ou da rup- tura do tecido em unidades menores de células transformadas individual- mente partindo das quais uma planta transformada pode ser regenerada sendo obtidas assim mais plantas transgênicas partindo da mesma unidade de tecido.
O calo para este exemplo foi derivado do cultivo de embriões de
milho imaturos em meio de calo 1074 (Tabela 3), que foram isolados dos grãos em desenvolvimento aproximadamente 10 dias após a polinização. Um calo de cinco até nove semanas de idade foi tratado com um moedor de ervas e colocado em contato com Agrobacterium contendo um vetor carre- gando o gene nptll para a seleção durante até 60 minutos. O calo inoculado foi seco em blot e cocultivado/dessecado durante 2-3 dias a 23°C na escuri- dão. O tecido do calo foi então transferido para pedaços de feltro em meio de seleção líquido 1086 (Tabela 3) contendo aproximadamente 50 mg/L de paromomicina e cultivado durante até 30 dias a 27-28°C na escuridão para selecionar o tecido transformado contendo o gene marcador que pode ser selecionado npfll. O tecido transformado foi então regenerado em plantas através do cultivo do tecido que sobreviveu à seleção em meio de brotamen- to 1087 (Tabela 3) contendo BAP para induzir a formação de brotos durante 5-7 dias a 27-28°C em 16 h de luz. O tecido em crescimento foi incubado em meio 1067 (Tabela 3) durante 2-3 semanas adicionais para induzir raízes. Os brotos saudáveis com ou sem raízes foram transferidos para Phytatrays contendo meio 1067 e subseqüentemente para o solo para crescimento.
Tabela 3: Composições dos meios utilizados.
Componentes do Meio/L (Fornecedor) 1074 1086 1087 1067 Sais Basais de MS (Phytotech) 4,33 g 4,33 g 4,33 g 4,33 Vitaminas de MS (100X) (Phytotech) 10 mL 10 mL 0 0 Vitaminas de MS Fromm (1000X)* 0 0 1 mL 1 mL BAP (Sigma) 0 0 3,5 mg 0 Tiamina HCI (Sigma) 0,5 mg 0,5 mg 0 0 2,4-D (Phytotech) 0,5 mg 0,5 mg 0 0 Sacarose (Phytoteeh) 30 g 30 g 30 g 0 Glicose (Phytoteeh) 0 0 0 10 g Maltose (Phytoteeh) 0 0 0 20 g Prolina (Sigma) 1,38 g 1,38 g 1,38 g 0 Casaminoácidos (Difeo) 0,5 g 0,5 g 0,5 g 0 Asparagina Monohidratada (Sigma) 0 0 0 0,15 g Myo-inositol (Sigma) 0 0 0 0,1 g Tabela 3: Composições dos meios utilizad os. Phytagel (Sigma) 3 g 0 3g 0 Phytagar (Gibco) 0 0 0 6g Carbenicilina (Phytoteeh) 0 500 mg 250 mg 250 mg Picloram (Sigma) 2,2 mg 2,2 mg 0 0 Paromomicina (Phytotech) 0 100 mg 100 mg 100 mg Nitrato de Prata (Sigma) 3,4 mg 3,4 mg 0 0 PH 5,8 5,8 5,8 5,8 compreendendo 1250 mg/L de ácido nicotínico (Sigma), 250 mg/L de piridoxina HCI (Sigma), 250 mg/L de tiamina HCI (Sigma) e 250 mg/L de pantotenato de cálcio (Sigma).
Os resultados indicam que o moedor de ervas pode ser utilizado
de forma bem sucedida para romper o calo em pedaços adequados para a subcultura e para a transformação (Tabela 4).
Tabela 4. Uso de moedor de ervas para romper pedaços de calo para sub- cultura e para transformação.____
Expt Tratamento & Descri- ção Gramas de calo utilizado N0 de pedaços de calo colocados em seleção N0 de plan- tas produ- zidas TF (%) 1 1. Cortado manual- mente, subcultivado manualmente 2,5 192 53 27,6 2. Cortado manual- mente, subcultivado mecanicamente 2,5 185 39 21,1 2 1. Cortado manual- mente, subcultivado manualmente 1,5 144 9 6,3 2. Cortado manual- mente, subcultivado mecanicamente 1,5 116 17 14,7
Uma faca para recortes de decoração (Pickle Slicer, N0 4428 da International Culinary, Mystic, CT) foi também utilizada como um meio para cortar calo para reduzir a sobrecarga ergonômica de métodos de subcultura manuais. A faca para recortes de decoração consistia de 8 lâminas paralelas acopladas à extremidade de um cabo de plástico. A faca foi esterilizada com imersão em um alvejante brando, seguida por uma imersão em etanol e en- tão deixada secar durante aproximadamente 30 minutos. Enquanto a faca estava secando, os calos de 4 semanas de idade (subcultivados manual- mente em 2 semanas) foram colocados em uma placa de Petri de 150 χ 15 mm e divididos em 3 até 4 pilhas menores dentro de cada placa, cada uma contendo aproximadamente 40 - 60 pedaços de calo. Trabalhando com uma pilha por vez, a faca foi utilizada para cortar ao longo do calo. Com um uten- sílio esterilizado, o calo foi empurrado para fora da faca que o tinha coletado entre as lâminas para a placa, onde foi cortado uma segunda vez. Outras pilhas de calos foram tratadas da mesma maneira. O calo cortado foi utiliza- do para a subcultura e para a transformação.
Os dados provenientes de vários experimentos com a faca para recortes de decoração exibiram uma freqüência de transformação de 13,16%. Em testes adicionais, a freqüência de transformação do calo subcul- tivado manualmente de 21,5% era comparável com a do calo preparado a- través da faca para recortes de decoração (18,9%). Ainda em outros 74 ex- perimentos utilizando uma faca para recortes de decoração como um meio para cortar o calo por 5 usuários diferentes, as freqüências médias de trans- formação entre todos os usuários eram de 19,4% indicando utilidade deste método. Exemplo 9
Métodos para Inoculacão de Explantes com Aarobacterium Para Transformação
Os presentes métodos para a transformação mediada por Agro- bacterium, por exemplo, de embriões imaturos de milho utilizam muitas eta- pas que envolvem o corte de um embrião em um momento dos grãos, a in- cubação do mesmo em suspensão de células de Agrobacterium, a remoção da suspensão de Agrobacterium, a transferência dos embriões para uma placa de cocultura para que a infecção ocorra, a orientação dos embriões e a colocação dos mesmos com a parte do escutelo voltada para cima e final- mente a transferência dos embriões para um meio de seleção ou de retardo para manipulações adicionais tais como seleção e regeneração. Muitas des- tas etapas são ergonomicamente adversas e também aumentam a possibili- dade de danificar os embriões cortados e de maior incidência de morte celu- lar relacionada com Agrobacterium resultando assim em uma freqüência de transformação reduzida. Portanto, há uma necessidade na técnica de trans- formação de milho para simplificar a etapa de inoculação, tal que seja ergo- nomicamente favoráveis e resulte em uma maior freqüência de transforma- ção.
Os inventores simplificaram agora a etapa de inoculação através da redução do número total de etapas inoculando os explantes que podem ser transformados, por exemplo, embrião imaturo, através de 1) imersão de uma espátula em suspensão de Agrobacterium antes de cortar o embrião com a espátula; 2) através de encharcamento da espiga de milho com a suspensão de Agrobacterium antes do corte do embrião; ou 3) através da combinação das duas etapas, por exemplo, através do encharcamento da espiga de milho com a suspensão de Agrobacterium seguido pelo corte dos embriões por uma espátula imersa na suspensão de Agrobacterium. Em geral, foi utilizado o método de transformação a seguir. Os
embriões de milho imaturos provenientes de uma linhagem de milho recepto- ra foram dessecados partindo de grãos em desenvolvimento aproximada- mente 10 dias após a polinização e inoculados através de incubação, espá- tula imersa (18,0%) ou encharcamento da espiga com Agrobacterium con- tendo o construto. Os embriões inoculados foram cocultivados em meio de cocultura 1514 (Tabela 5) durante aproximadamente 24 h a 23°C na escuri- dão. Os embriões foram então transferidos para seleção em meio de seleção 1278 (Tabela 5) contendo 0,1 mM de glifosato para selecionar o tecido trans- formado contendo o gene marcador que pode ser selecionado ep4 e 500 mg/L de Carbenicilina para inibir o crescimento de Agrobaeterium através da incubação durante 2-3 semanas a 27°C na escuridão. O tecido de milho transformado foi então regenerado em plantas através da transferência dos pedaços de calo transformados para o primeiro meio de regeneração 1073 (Tabela 5) e cultivado durante 5-7 dias com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuridão e uma temperatura de 27°C. O tecido foi então transferido para o segundo meio de regeneração 1071 (Tabela 5) durante aproximadamente duas semanas. Os brotos regenerados foram transferidos para o meio de enraizamento 1084 (Tabela 5) em Phytatrays. As plantículas em desenvolvimento foram então transferidas para o solo, deixadas enrijecer em uma câmara de crescimento a 27°C, 80% de umidade e intensidade lu- minosa baixa durante aproximadamente uma semana e então transferidas para uma estufa e crescidas sob condições padronizadas de estufa.
O Agrobacterium carregando o plasmídeo pMON 92689 conten- do um gene CP4 aroA modificado para a seleção com glifosato (Patente U.S. N2 5.627.061) foi crescido para inoculação partindo de um estoque congelado feito com meio de indução MS como descrito no Exemplo 7. Os grãos na espiga foram esterilizados com 80% de etanol e cortados na coroa e então lavados com 100 ml_ de % MSVI e receberam aplicação de 20 mL de suspensão de Agrobacterium. Uma espátula foi imersa na suspensão de Agrobacterium e os embriões imaturos foram cortados e plaqueados no meio de cocultura 1514 durante 24 h a 23°C na escuridão. Estes tratamentos fo- ram comparados com um tratamento padronizado em que os embriões fo- ram cortados em um momento e incubados com a suspensão de Agrobaete- rium durante até 5 min. O tamanho dos embriões era de 1,5-1,8 mm. Entre- tanto, foi observado que o método funcionava bem com outros tamanhos de embrião também, por exemplo, tamanhos de embrião variando de 1,4 até 2,2 mm. Os eventos transgênicos podiam ser obtidos através da inoculação direta dos explantes com Agrobacterium enquanto os explantes ainda esta- vam aderidos ao tecido materno e através da inoculação dos explantes en- quanto estes estavam sendo removidos da fonte. As freqüências de trans- formação a seguir foram obtidas para cada tratamento: inoculação por incu- bação (20,7%), inoculação por espátula imersa (18,0%) e inoculação por encharcamento da espiga (17,0%).
Outros meios de colocar os explantes em contato com Agrobae- 10
terium e a duração do contato podem ser previstos pelos versados na técni- ca. Por exemplo, uma faca imersa na suspensão de Agrobacterium pode ser utilizada para a inoculação através do corte do tecido foliar ou de calo em pedaços menores ou uma agulha imersa pode ser utilizada para inocular o tecido da planta através da inserção da agulha no tecido da planta.
Foi observado que o método aumenta a freqüência de transfor- mação permitindo menor manipulação do tecido e menor morte celular rela- cionada com Agrobacterium. Com 6 construtos diferentes, o método da es- pátula imersa produziu uma TF média de 14,3% acima do método de incu- bação padronizado que produziu uma TF de 9,2%.
Componentes do Meio/ L (Fornecedores) 1233 1278 1514 1524 1073 1071 1084 Sais Basais de MS (Phyto- tech) 2,165 g 4,33 g 4,33 g 4,33 g 4,33 g 4,33 g 2,165 g Vitaminas de MS (100X) (Phytotech) 10mL 10mL 10mL 10mL 0 0 0 Vitaminas de MS Fromm (1000X)* O 0 0 0 1 mL 1 mL 0 BAP (Siqma) O 0,01 mg 0 0 3,5 mg 0 0 Tiamina HCL (Sigma) 0,5 mg 0,5 mg 0,5 mg 0,5 mg 0 0 0 2,4-D (Phytotech) 3 mg 0,5 mg 0,5 mg 0,5 mg 0 0 0 NAA (Siqma) O 0 0 0 0 0 0,5 mg IBA (Sigma) O 0 0 0 0 0 0,75 mg Saearose (Phytoteeh) 20 g 30 g 30 g 30 g 30 g 0 20 g Glicose (Phytotech) 10g 0 0 0 0 10g 0 Maltose (Phytoteeh) O 0 0 0 0 20 g 0 Prolina (Siqma) 115 mg 1,38 g 1,38 g 1,38 g 1,38 g 0 0 Casaminoácidos (Difeo) O 0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,05 q 0,5 0 Asparagina Monoidratada O 0 0 0 0 0,15 0 Tabela 5: Composições dos meios utilizados.
Componentes do Meio/ L (Fornecedores) 1233 1278 1514 1524 1073 1071 1084 (Sigma) Myo-inositol (Siqma) 0 0 0 0 0 0,1 g 0 Low EEO Agarose (Sigma) 5,5 g 0 0 0 0 0 0 Phytagel (Sigma) 0 3g 3g 3g 3g 3g 3g Acetossiringona (AIdrich) 200 uM 0 0 0 0 0 0 Carbenieilina (Phytoteeh) 500 mg 500 mg 500 mg 500 mg 250 mg 250 mg 0 Glifosato (Gateway Chemi- cal) 0 0,1 mM 0,1 mM 0,1 mM 0,1 mM 0,1 mM 0,1 mM Nitrato de prata (Sigma) 3,4 mg 3,4 mg 3,4 mg 3,4 mg 0 0 0 PH 5,2 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 'Compreendendo 1250 mg/L de ácido nicotínico (Sigma), 250 mg/L de piridoxina HCI (Sigma), 250 mg/L de tiamina HCI (Sigma) e 250 mg/L de pantotenato de cálcio (Sigma). Para os meios líquidos o Phytagel foi ex- cluído da composição.
Exemplo 10
Transformação Mediada por Agrobacterium de Milho Realizando Inoculação, cocuItura e Seleção em uma Única Etapa
Normalmente, os métodos de transformação mediada por Agro- bacterium envolvem 3 etapas distintas: inoculação de um explante com A- grobacterium, cocultivo do explante inoculado em um meio sem um antibióti- co para permitir a sobrevivência de Agrobacterium e para aumentar a infec- ção do explante e seleção da célula transformada em um meio contendo um agente seletivo tal como canamicina e glifosato. Há sempre uma necessida- de de reduzir o número de etapas necessárias em um método de transfor- mação para aumentar as eficiências de produção. Os inventores forneceram agora um método para a transformação de milho mediada por Agrobacteri- um em que as etapas de inoculação, cocultura e seleção podem ser combi- nadas em uma única etapa através do plaqueamento dos explantes inocula- dos diretamente sobre um meio que contém agentes seletivos para a su- pressão do crescimento de Agrobacterium e para matar as células do ex- plante não transformadas permitindo assim a inoculação, a cocultura e a se- leção em uma única etapa, aumentando dessa maneira as eficiências do sistema de produção de transformação.
Em geral, foi utilizado o método de transformação divulgado no Exemplo 9. O Agrobacterium que contém pMON65375 contendo um gene CP4 aroA modificado para seleção com glifosato (Patente U.S. N- 5.627.061) para inoculação foi preparado partindo de um estoque congelado feito em meio de indução mínimo AB como divulgado no Exemplo 7.
A espátula foi imersa na suspensão de Agrobacterium antes de cortar cada embrião e os embriões cortados foram plaqueados no meio de cocultura 1233 e então no meio de seleção 1278 ou plaqueados diretamente no meio de seleção 1278. Os resultados mostram que a transformação pode ser feita através da combinação da inoculação, da cocultura e da seleção em uma única etapa com uma variedade de concentrações de Agrobacterium e tamanhos de embrião.
Em uma outra modalidade, a transformação também foi conse- guida cultivando primeiro os embriões on a meio de seleção e então aplican- do a suspensão de Agrobaeterium imediatamente aos embriões ao invés de primeiro aplicar Agrobaeterium e então cultivar os embriões no meio de sele- ção. As plantas transgênicas poderiam também ser obtidas através da apli- cação de Agrobaeterium adicional durante o cocultivo e a seleção. Exemplo 11
Seleção de Células Transformadas em Sorbarods e Desenvolvimento de Sistema de Alto Rendimento
Explantes adequados tais como calos e embriões imaturos po- dem ser obtidos através de meios de corte mecânicos e manuais conhecidos na técnica e podem ser inoculados com Agrobaeterium contendo um plasmí- deo que compreende qualquer gene de interesse conhecido na técnica. Em uma modalidade, a seleção de uma célula transformada é feita sobre um pedaço de feltro colocado no meio líquido e a regeneração é feita sobre um bloco de Sorbarod® (Baumgartner Papiers SA1 Crissier-Lausanne, Suíça) colocado no meio líquido. Em uma outra modalidade, tanto a seleção quanto a regeneração da célula transformada são realizadas sobre um bloco de Sorbarod® colocado no meio líquido.
A utilidade destas modalidades é demonstrada através de vários
exemplos de dados fornecidos na Tabela 6. As composições dos meios utili- zados são mostradas na Tabela 5 exceto que para os meios líquidos o Phy- tagel foi excluído. Embriões imaturos de milho da linhagem receptora foram dessecados de grãos em desenvolvimento e inoculados com Agrobacterium contendo o vetor binário pMON42()73 compreendendo um gene CP4 para seleção com glifosato. Os embriões inoculados foram cocultivados em meio de cocultivo 1514 (ver a Tabela 5 para a composição) durante aproximada- mente 24 h a 23°C na escuridão. Os embriões inoculados foram então trans- feridos para um pedaço de feltro quadrado de 5 X 5 cm (Consumer Products - 15 Enterprises (CPE) Inc., Union, South Carolina) ou um bloco de Sorbarod (I- LACON Limited, Kent, UK) colocado no meio de seleção líquido 1278 (ver a a.
Tabela 5 para a composição) contendo 0,1 mM de glifosato para selecionar o tecido transformado. Após esta etapa, o meio líquido de seleção 1278 u- sado foi removido e substituído pelo primeiro meio de regeneração líquido 1073 (ver a Tabela 5 para a composição). O tecido foi cultivado durante 5-7 dias com 16 horas de luz a 27°C. Normalmente, esta etapa requer a transfe- rência do tecido selecionado para o primeiro meio de regeneração sólido para cultivo adicional. Este método elimina esta etapa. O tecido parcialmente regenerado no primeiro meio de regeneração líquido foi então transferido para um bloco de Sorbarod colocado dentro de um segundo meio de regene- ração líquido (ver a Tabela 5 para a composição) em um copo de Sundae para regeneração completa. Esta etapa de transferência foi eliminada se os embriões inoculados tivessem sido cultivados diretamente sobre o bloco de Sorbarod para iniciar. Em tal caso, o primeiro meio de regeneração líquido foi simplesmente removido e substituído pelo segundo meio de regeneração líquido. O tecido foi cultivado durante aproximadamente duas semanas. Nor- malmente, esta etapa requer a transferência do tecido em regeneração do primeiro meio de regeneração sólido para o segundo meio de regeneração sólido para cultivo adicional. Este método elimina esta etapa. Plantículas de milho menores completamente regeneradas no bloco de Sorbarod foram transferidas diretamente para o solo. Normalmente, esta etapa requer a transferência de uma plantícula menor completamente regenerada do se- gundo meio de regeneração sólido para o meio de enraizamento sólido 1084 (ver a Tabela 5 para a composição) para cultivo adicional. Este método eli- mina esta etapa. As plantículas em desenvolvimento foram deixadas enrije- cer em uma câmara de crescimento a 27°C, 80% de umidade e intensidade luminosa baixa durante aproximadamente uma semana e então transferidas para uma estufa e crescidas sob condições de estufa padronizadas e testa- das em relação à presença do gene CP4. A Tabela 6 mostra a produção de milho transgênico utilizando cultura líquida em combinação com feltro e blo- co de Sorbarod e eliminando várias etapas de transferência. É desenvolvido um sistema de transformação de alto rendimento
para o milho em que os recipientes são manipulados por braços robóticos em uma mesa de trabalho que pode ser livremente configurada que inclui incubadoras e agitadores que podem ser utilizados em adição a utensílios de laboratório padronizados. Várias ferramentas de manipulação de líquidos equipadas com uma ou mais ponteiras de pipeta são utilizadas para fornecer o meio fresco e para remover o meio gasto. A mesa de trabalho, os braços robóticos e as ferramentas de manipulação de líquidos são controlados por software através de um computador. Alternativamente, o meio líquido para a seleção e para a regeneração da célula transformada pode ser fornecido ao recipiente através de um ou mais tubos conectados a um recipiente de ar- mazenamento de meio e removido através de um ou mais tubos conectados a um recipiente de descarte. O fornecimento e a remoção do meio líquido são controlados manualmente ou mecanicamente. Tabela 6. Freqüência de transformação (TF) de milho utilizando meio líquido em combinação com matrizes diferentes. A freqüência de transformação é calculada como a porcentagem de embriões cultivados que produziram plan- tas transgênicas._
Meio Matriz Conduções de cultura durante a seleção N0 Explan- tes N0 Plants regenera- ted % TF Es- piga 1 Sólido Nenhuma 14-21 d, 27°C escuridão 20 2 10 Sólido Nenhuma 10-d, 30°C escuridão; 7-d, 28°C luz 20 3 15 Líquido tampão 10-d, 30°C escuridão; 7-d, 28°C luz 72 5 6,9 Líquido feltro/bloco 10-d, 30°C escuridão; 7-d, 28°C luz 63 5 7,9 Es- piga 2 Sólido Nenhuma 14-21 d, 2TC escuridão 20 2 10 Sólido Nenhuma 10-d, 30°C escuridão; 7-d, 28°C luz 20 4 20 Líquido bloco 10-d, 30°C escuridão; 7-d, 28°C luz 72 7 9,7 Líquido feltro/bloco 10-d, 30°C escuridão; 7-d, 28°C luz 63 8 12,7 Es- piga 3 Sólido Nenhuma 14-21 d, 27°C escuridão 30 6 20 Sólido Nenhuma 10-d, 30°C escuridão; 7-d, 28°C luz 30 9 30 Líquido bloco 10-d, 30°C escuridão; 7-d, 28°C luz 70 7 10 Líquido feltro/bloco 10-d, 30°C escuridão; 7-d, 28°C luz 63 8 12,7
REFERÊNCIAS
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Claims (20)

1. Processo para produção de uma planta de milho transgênica que compreende as etapas de: a) obtenção de um explante de milho que pode ser transfor- mado; b) transformação do explante de milho que pode ser trans- formado; c) seleção de uma célula de milho transformada proveniente do explante de milho que pode ser transformado em um meio de seleção; e d) regeneração da célula transformada em uma planta em um meio de regeneração, em que as etapas b), c) e d) são realizadas no mesmo recipiente.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o recipien- te é selecionado do grupo que consiste em um biorreator, uma placa de Pe- tri, uma placa de várias cavidades, um frasco, um jarro, uma garrafa, uma moringa, um PIantConl um sistema de imersão temporário, copo de Sundae e uma combinação dos mesmos.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o recipien- te é fornecido com uma maneira de fornecer e remover o meio.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o explante é selecionado do grupo que consiste em um calo, um embrião e uma suspen- são de células.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o meio é um meio líquido.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o meio de seleção é um meio sólido e o meio de regeneração é um meio líquido dis- posto sobre o meio de seleção sólido.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o explante é colocado em contato com o meio temporariamente.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o explante é colocado com o meio de seleção e de regeneração durante aproximada- mente 1 até aproximadamente 5 minutos aproximadamente a cada 12 até aproximadamente 24 horas.
9. Processo para a obtenção do explante para a produção de uma planta de milho transgênica que compreende a divisão de um calo em pedaços de calo menores.
10. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o calo é um calo do tipo I.
11. Processo para a preparação de suspensão de células de Agrobacterium para a inoculação de um explante que compreende o cultivo de um estoque em glicerol congelado de Agrobacterium diretamente em um meio de indução.
12. Cultura de células de milho que compreende células que po- dem ser transformadas e embriogênicas.
13. Processo para a produção de uma cultura de células de mi- lho que podem ser transformadas e embriogências que compreende: a) obtenção de um calo partindo de embriões de milho; e b) cultivo do calo durante aproximadamente 5 dias até 30 di- as em um meio líquido para produzir a cultura de células.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que o calo é um calo do tipo II.
15. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que as eta- pas c) e d) são realizadas sobre uma matriz, em que a matriz é selecionada do grupo que consiste em feltro, bloco Sorbarod e uma combinação dos mesmos.
16. Processo de produção de uma planta transgênica que com- preende: a) o cocultivo de um explante de planta que pode ser regenera- do com Agrobacteria recombinante que compreende um gene marcador que pode ser selecionado que confere tolerância a um agente seletivo e meio que compreende uma quantidade do agente seletivo que é seletivo em rela- ção às células do explante que são transformadas como gene marcador se- lecionável; e b) a regeneração de uma planta transgênica que compreende o marcador que pode ser selecionado partindo do explante.
17. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o ex- plante compreende um embrião imaturo.
18. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o ex- plante é proveniente de uma planta de milho.
19. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o meio compreende um agente que suprime o crescimento da Agrobacteria.
20. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o cocul- tivo do explante de planta que pode ser regenerado com Agrobacteria re- combinante compreende o contato do explante com uma espátula que com- preende a Agrobacteria seguido pela colocação do explante no meio.
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