CN103154022A - 抗害虫植物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含：（i）编码至少一种毒性肽的核酸序列，所述毒性肽是蜘蛛毒素；以及（ii）编码连接于分泌信号序列的壳多糖酶的核酸序列。还公开了其应用和表达其的植物。

Description

抗害虫植物

技术领域

本发明，在其一些实施方式中，涉及抗害虫植物（pest-resistant plants）以及产生抗害虫植物的方法。

背景技术

通过在植物组织上觅食和通过传染微生物和病毒病，害虫是造成大规模产量损失的原因。杀虫剂和组合物已被开发用来控制虫害如农业园艺害虫、卫生害虫、或木材为食的害虫，并且在实践中已用作单剂或混合剂。

然而，认为，即使在化学防除的情况下，由于害虫攻击，在田地里每年也损失约十亿美元。自从在20世纪40年代引入DDT，已几乎完全由有限数目的广谱的化学杀虫剂来控制虫害，其已导致在若干重要害虫群中抗性种群的发展。化学杀虫剂的滥用和任意使用是造成天敌的环境和生态破坏以及数百万鸟类和鱼类连同虫害一起死亡的原因。另外，存在强有力的流行病学和实验证据，其表明，癌症、帕金森病和其它神经障碍的发生与杀虫剂暴露有关。因此，在这个时候重要的是，确定和表征具有杀虫活性的新化合物。

蜘蛛毒液包含大量的生物活性物质，其中的一些是毒素。它们被认为是杀虫化合物的丰富来源，这是因为蜘蛛毒液的主要作用是通过靶向这些生物体的神经系统而杀死或麻痹节肢动物猎物。一些蜘蛛毒素仅在昆虫中起作用的特异性具有用作生物杀虫剂的巨大潜力。在澳大利亚漏斗网蜘蛛（漏斗网蜘蛛（Hadronyche versuta））的毒液中发现的x-ACTX-Hv1a毒素（Hvt）是昆虫特异性钙通道拮抗剂（Norton RS,Toxicon,1998,36,1573–83）。该肽对于鞘翅目、鳞翅目和双翅目的广泛的农业上重要的节肢动物是毒性的并且已报道对许多哺乳动物没有影响（Norton RS,Toxicon,1998,36,1573–83）。最近，已克隆活性重组蜘蛛毒素并表达在原核（FitchesE.et al.,Insect.Biochem.Mol.Biol.,2002,32,1653-61,Khan et al.,Transgenic Res.,2006,15,349-57）和真核系统（Fitches E.et al.,Insect.Biochem.Mol.Biol.,2002,32,1653-61）中，以及表达蜘蛛杀虫肽的转基因植物耐昆虫侵袭（Khan et al.,Transgenic Res.,2006,15,349-57）。

使用转基因植物来控制害虫可以减少或消除使用外部施加的化学杀虫剂的需要，所述外部施加的化学杀虫剂对于某些物种如较大的森林树种，往往不是实用的或经济上可行的。另外，转基因植物的使用可以有效地靶向否则不容易接触到外部施加的杀虫剂的害虫。例如，某些害虫存在于保护瘿中和/或渗透入植物组织，其中经由隧道式转移（隧道工程，tunneling）或其它难以捉摸的机制，其部分或完全地保护害虫以避免外部施加的毒素。表达苏云金杆菌（Bt）Cry毒素的抗害虫转基因作物（包括稻）已成功并广泛使用超过10年。这些毒素相对于鞘翅目、双翅目和鳞翅目昆虫是高度活性的，但相对于膜翅目害虫（黄蜂和蚂蚁）则缺少任何有效活性。

蜘蛛毒液由物质的复杂混合物组成，其包含各种毒性成分。分离自不同蜘蛛物种的毒腺的具有杀虫活性的多肽呈现空间结构同源性并与可兴奋膜的离子通道相互作用，从而影响其功能。

在烟草中ω-ACTX-Hv1a毒素（Hvt）的转基因表达有效地保护植物免受棉铃虫（Helicoverpa armigera）和斜纹夜蛾（Spodoptera littoralis）幼虫的影响，并在48小时内具有100%死亡率（Khan S.A.et al.,Transgenic Res.,2006,15,349-57）。

在转基因植物中使用节肢动物神经毒素来控制咀嚼组织害虫（tissue-chewing pests）直到目前并不十分成功。

昆虫受到由壳多糖制成的硬化的外骨架表面的保护。壳多糖，连同另外的蛋白质一起，还存在于围食膜（PM），一种膜状结构中，其将食物与肠组织分开。它保护上皮免受食物磨损和微生物影响并具有其它功能（基于酶的区室化）。壳多糖酶是这样的酶，其降解壳多糖但它们本身并不能够控制组织咀嚼害虫（Shakhbazau,(BLR),Rus.J.Genet.2008,44:1013-22）。对喂养壳多糖酶-转基因植物的昆虫的发育影响是轻度至重度，其取决于物理上伤害肠的消化组织的刚度，但植物并不完全抗害虫。

美国专利号7,196,057教导了植物，该植物表达融合蛋白，其包含转运部分如凝集素和对昆虫有毒的部分，包括壳多糖酶。

美国专利申请号20020197689教导了杀虫肽，其包括源自阴暗拟隙蛛（Pireneitega luctuosa）的肽。

美国专利号5,177,308教导了植物，该植物表达杀虫肽，其包括源自漏斗网蜘蛛（Agelenopsis aperta）的肽。

WO9949035A2教导了植物，该植物表达杀虫肽，其包括源自Segestriaflorentina的肽。

发明内容

按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了分离的多核苷，其包含：

（i）编码至少一种毒性肽（toxic peptide）的核酸序列，所述毒性肽是蜘蛛毒素；以及

（ii）核酸序列，其编码连接于（附着于，attach to）分泌信号序列（secretion signal sequence）的壳多糖酶（chitinase）。

按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了分离的多核苷酸，其包含：

（i）编码至少一种毒性肽的核酸序列，所述毒性肽不是壳多糖酶；以及

（ii）编码壳多糖酶的核酸序列。

按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了核酸构建物（nucleicacid construct），其包含本发明的分离的多核苷酸以及顺式调节元件（cisregulatory element）。

按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了核酸构建物系统，其包含：

（i）第一核酸构建物，该第一核酸构建物包含含有编码毒性肽的核酸序列的分离的多核苷酸以及顺式调节元件；以及

（ii）第二核酸构建物，该第二核酸构建物包含含有编码壳多糖酶的核酸序列的分离的多核苷酸以及顺式调节元件。

按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含毒性肽的分离的多肽，所述毒性肽包含利用国家生物技术信息中心（National Center ofBiotechnology Information）（NCBI）的BlastP软件利用默认参数（缺省参数，default parameters）确定的与选自由SEQ ID NO:9、15、24、30、55和56-60组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的序列，所述毒性肽连接于植物凝集素（plant lectin）。

按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种杀虫组合物（insecticidal composition），该组合物包含：

（i）毒性肽；以及

（ii）壳多糖酶。

按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了控制或消灭昆虫的方法，该方法包括在昆虫的寄生植物中表达本发明的任何分离的多核苷酸，从而控制或消灭昆虫。

按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了控制或消灭昆虫的方法，该方法包括在昆虫的寄生植物中表达分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码毒性肽的核酸序列，所述毒性肽选自由SEQ ID NO:9、15、24、30和55-57组成的组。

按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了控制或消灭昆虫的方法，该方法包括使昆虫与本发明的任何杀虫组合物接触，从而控制或消灭昆虫。

按照本发明的一些实施方式，毒性肽源自昆虫，该昆虫选自由蜜蜂、黄蜂、蟑螂、丽蝇、蚊子、结网毛虫（结网虫，webworm）、甲虫、对映体（antipode）、千足虫（millipede）、螃蟹、龙虾、小虾、对虾、蜘蛛、蝎子、螨（mite）和蜱（tick）组成的组。

按照本发明的一些实施方式，毒性肽源自蜘蛛。

按照本发明的一些实施方式，毒性肽包含利用国家生物技术信息中心（NCBI）的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO:9、15、24、30、55、56和57组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的氨基酸序列。

按照本发明的一些实施方式，毒性肽连接于植物凝集素。

按照本发明的一些实施方式，壳多糖酶并不连接于植物凝集素。

按照本发明的一些实施方式，植物凝集素包括雪花莲凝集素（Galanthus nivalis agglutinin）（GNA）。

按照本发明的一些实施方式，毒性肽连接于分泌信号序列。

按照本发明的一些实施方式，壳多糖酶连接于分泌信号序列。

按照本发明的一些实施方式，分泌信号序列由在SEQ ID NO:7、21和61-68中陈述的核酸加以编码。

按照本发明的一些实施方式，壳多糖酶包含利用国家生物技术信息中心（NCBI）的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO:36、42和58-60组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的氨基酸序列。

按照本发明的一些实施方式，上述至少一种毒性肽包括第一毒性肽和第二毒性肽，其中第一毒性肽靶向在钠（Na V）通道中的第一位点（site）以及第二毒性肽靶向在Na V通道中的第二位点。

按照本发明的一些实施方式，上述至少一种毒性肽包括第一毒性肽、第二毒性肽和第三毒性肽，其中第一毒性肽靶向在钠（Na V）通道中的第一位点，第二毒性肽靶向在Na V通道中的第二位点以及第三毒性肽靶向在Na V通道中的第三位点。

按照本发明的一些实施方式，第一毒性肽是P83591，第二毒性肽是P83558以及第三毒性肽是P11060。

按照本发明的一些实施方式，上述至少一种毒性肽包括至少4种毒性肽，其中至少4种毒性肽中的第一种是P83591，至少4种毒性肽中的第二种是P83558，至少4种毒性肽中的第三种是P11060，以及至少4种毒性肽的第一种是P61095。

按照本发明的一些实施方式，毒性肽连接于植物凝集素。

按照本发明的一些实施方式，毒性肽连接于分泌信号序列。

按照本发明的一些实施方式，壳多糖酶连接于分泌信号序列。

按照本发明的一些实施方式，分离的多肽进一步包括分泌信号肽。

按照本发明的一些实施方式，分离的多核苷酸包含编码本发明的分离的多肽的核酸序列。

按照本发明的一些实施方式，分离的多核苷酸进一步包括编码壳多糖酶的核酸序列。

按照本发明的一些实施方式，核酸构建物包含本发明的分离的多核苷酸和顺式调节元件。

按照本发明的一些实施方式，核酸构建物系统包含：

（i）本发明的核酸构建物；以及

（ii）包含分离的多核苷酸的核酸构建物，所述分离的多核苷酸包含编码壳多糖酶的核酸序列；

按照本发明的一些实施方式，顺式调节元件是启动子。

按照本发明的一些实施方式，启动子是SVBV或sgFiMV。

按照本发明的一些实施方式，启动子是植物启动子。

按照本发明的一些实施方式，植物启动子是叶特异性启动子（叶特异性表达启动子，leaf-specific promoter）。

按照本发明的一些实施方式，植物包含本发明的核酸构建物。

按照本发明的一些实施方式，植物包含本发明的核酸构建物系统。

按照本发明的一些实施方式，植物是树。

按照本发明的一些实施方式，植物是桉树（eucalyptus tree）。

按照本发明的一些实施方式，杀虫组合物包含本发明的分离的多肽。

按照本发明的一些实施方式，昆虫包括无柄瘿筑巢昆虫（sessile gallnesting insect）。

按照本发明的一些实施方式，无柄瘿筑巢昆虫包括瘿蜂（gall wasp）。

按照本发明的一些实施方式，利用包含叶特异性启动子的核酸构建物来进行表达。

按照本发明的一些实施方式，寄生植物包括树。

按照本发明的一些实施方式，树是桉树。

除非另有限定，否则本文使用的所有技术和/或科学术语均具有如与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然在本发明的实施方式的实施或测试中可以使用类似或等价于本文所描述的方法和材料，但下文描述了示例性方法和/或材料。在发生冲突的情况下，本专利说明书（包括定义）为准。另外，材料、方法、和实施例仅是说明性的而并不旨在是必需限制性的。

附图说明

仅通常举例的方式参照附图，在本文描述了本发明的一些实施方式。现详细具体参照附图，强调的是，示出的细节是通过举例的方式并用于本发明的实施方式的说明性讨论。在这方面，连同附图的描述使本领域技术人员显而易见的是，可以如何实施本发明的实施方式。

在附图中：

图1A-B是示出按照本发明的一个实施方式的表达载体（载体#257）的结构的图解。图1A示出合成片段以及图1B示出它被插入其中的载体。

图2是限制性分析的照片，其证实了将抗昆虫6盒（AntiInsects6Cassete）插入到载体的插入和正确方向。

图3A-C是示意图，其示出按照本发明的一个实施方式的表达载体（载体#258）的结构。图3A和3B示出合成片段以及图3C示出它被插入其中的载体。

图4是限制性分析的照片，其证实了将抗昆虫6CDS GNA（AntiInsects6CDS GNA）插入到载体的插入。

图5是示出本发明的具有注释序列的两个示例性建构物（构建体，construct）的图解。

具体实施方式

本发明，在其一些实施方式中，涉及抗害虫植物以及产生抗害虫植物的方法。

在详细解释本发明的至少一个实施方式以前，应当理解的是，本发明的应用不一定限制于在以下描述中陈述的或通过实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方式或以各种方式加以实施或进行。虫害是全球性问题，其引起对农作物的严重损害，并且它们的控制通常是基于化学杀虫剂。然而，杀虫剂对环境和人类健康的负面影响强调了发展用于虫害控制的替代方法的必要性。

通过在植物组织上觅食以及通过传染微生物和病毒病，害虫是造成大规模产量损失的原因。

使用转基因植物来控制害虫可以减少或消除使用外部施加的化学杀虫剂的需要，所述外部施加的化学杀虫剂对于某些物种如较大的森林树种往往不是实用的或经济上可行的。另外，转基因植物的使用可以有效地靶向否则不容易接触到外部施加的杀虫剂的害虫。例如，某些害虫存在于保护瘿（protective galls）中和/或渗透入植物组织中，其中借助于隧道式转移（tunneling）或其它难以捉摸的机制，其部分或完全地保护害虫以免受外部施加的毒素。

已表达在植物中用于控制害虫的一种特定的毒素是壳多糖酶。这种毒素是通过溶解虫害的外表皮和它的围食膜（PM）（将食物与肠组织分开的膜状结构）两者来起作用。

然而，软组织和液汁饲养昆虫不太可能受到PM的破裂的影响。因此，本发明人提出在植物中壳多糖酶和蜘蛛神经毒素的共同表达以控制食草害虫。壳多糖酶将干扰完整的壳多糖，从而改善蜘蛛毒素穿透血淋巴的机会。

本发明人进一步建议蜘蛛神经毒素与植物分泌前导肽的融合。这将允许毒素以ER途径被翻译并被分泌到细胞外基质。以这种方式，可以受到保护以免受内细胞剂的影响的汁液喂养和瘿筑巢害虫（gall nesting pests）可以暴露于蜘蛛神经毒素：不仅通过植物材料的消化而且通过它的外表面。因此，通过消化和表皮吸收两者，在虫瘿内发育的瘿筑巢害虫将很长时间暴露于毒素。

因此，按照本发明的第一方面，提供了控制或消灭昆虫的方法，该方法包括在昆虫的寄生植物中表达壳多糖酶和至少一种毒性肽，从而控制或消灭昆虫。

用于控制或消灭的预期的昆虫包括那些影响植物的生长、发育、繁殖、收获、产量或效用的昆虫。

根据一个实施方式，待根除的昆虫是无柄昆虫（sessile insect）。根据另一个实施方式，昆虫是瘿筑巢昆虫，如例如无柄瘿蜂（sessile gall wasps）（瘿蜂科（Cynipidae））。无柄瘿蜂的特别设想的物种包括但不限于桉树枝瘿姬小蜂（Leptocybe invasa）、桉干瘿姬小蜂（Ophelimus maskelli）和Selitrichodes globulus。用于控制或消灭的其它昆虫包括但不限于鞘翅目，例如，南方玉米根虫（Southern corn rootworm）（Diabroticaundecimpunctata）；cowpea bruchid（四纹豆象（Callosobruchus maculatus））；鳞翅目，例如，欧洲玉米螟（Ostinia nubilalis）；烟草天蛾（烟草天蛾（Manduca sexta））；蛀茎昆虫（Chilo partellus）；同翅目害虫，例如，水稻褐飞虱（Rice brown plant hopper）（褐飞虱（Nilaparvata lugens））；黑尾叶蝉（黑尾叶蝉（Nephotettix cinciteps））；马铃薯叶蝉（马铃薯小绿叶蝉（Empoasca fabae））；桃马铃薯蚜虫（peach potato aphid）（烟蚜（Myzuspersicae））。

如在本文中所使用的，术语“植物”涵盖全植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括籽、芽、茎、根（包括块茎）、以及植物细胞（plant cell）、组织和器官。植物可以具有任何形式，包括悬浮培养物、胚胎、分生组织区、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉、和小孢子。在本发明的方法中特别有用的植物包括属于总科植物界（Viridiplantee）的所有植物，尤其是单子叶和双子叶植物，包括饲料或饲料豆科植物，观赏植物，粮食作物，树，或灌木，其选自包括下述的清单：相思树（Acacia spp.）、槭木（Acerspp.）、猕猴桃（Actinidia spp.）、七叶树属（Aesculus spp.）、南方贝壳杉（Agathis australis）、合欢（Albizia amara）、南洋沙椤（Alsophila tricolor）、蓝茎草（Andropogon spp.）、花生属（Arachis spp）、槟榔树（Areca catechu）、Astelia fragrans、鹰咀黄芪（Astragalus cicer）、罗得西亚柚木（Baikiaeaplurijuga）、桦木属（Betula spp.）、油菜属（Brassica spp.）、木榄（Bruguieragymnorrhiza）、伯克苏木（Burkea africana）、豆科紫矿树（Butea frondosa）、伞形科植物（Cadaba farinosa）、朱樱花属（Calliandra spp）、茶（Camelliasinensis）、美人蕉（Canna indica）、辣椒（Capsicum spp.）、鸡翅木（Cassiaspp.）、距瓣豆（Centroema pubescens）、Chacoomeles spp.、肉桂（Cinnamomum cassia）、咖啡（Coffea arabica）、可乐豆木（Colophospermummopane）、小冠花（Coronillia varia）、栒子属（Cotoneaster serotina）、山楂属（Crataegus spp.）、甜瓜属（Cucumis spp.）、柏树（Cupressus spp.）、银白树蕨（Cyathea dealbata）、榲桲（Cydonia oblonga）、日本柳杉（Cryptomeriajaponica）、香水茅（Cymbopogon spp.）、银白树蕨（Cynthea dealbata）、榲桲（Cydonia oblonga）、黄檀属（Dalbergia monetaria）、马尾丝（Davalliadivaricata）、山蚂蝗属（Desmodium spp.）、子草（Dicksonia squarosa）、Dibeteropogon amplectens、大果豆属（Dioclea spp.）、扁豆属（Dolichos spp.）、Dorycnium rectum、野青茅（Echinochloa pyramidalis）、Ehraffia spp.、龙爪稷（Eleusine coracana）、画眉草属（Eragrestis spp.）、刺桐属（Erythrina spp.）、桉树属（Eucalyptus spp.）、Euclea schimperi、Eulalia vi/losa、Pagopyrum spp.、南美稔（Feijoa sellowlana）、草莓属（Fragaria spp.）、千金藤（Flemingia spp）、Freycinetia banksli、老鹳草（Geranium thunbergii）、银杏属（GinAgo biloba）、野大豆（Glycine javanica）、南洋樱属（Gliricidia spp）、抗虫棉（Gossypiumhirsutum）、银桦属（Grevillea spp.）、鞘籽古夷苏木（Guibourtiacoleosperma）、岩黄芪属（Hedysarum spp.）、Hemaffhia altissima、Heteropogon contoffus、大麦（Hordeum vulgare）、红苞茅（Hyparrhenia rufa）、小连翘（Hypericum erectum）、Hypeffhelia dissolute、Indigo incamata、鸢尾类（Iris spp.）、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子（Lespediza spp.）、Lettucaspp.、银合欢（Leucaena leucocephala）、Loudetia simplex、Lotonus bainesli、木兰属（Lotus spp.）、扁豆（Macrotyloma axillare）、海棠（Malus spp.）、木薯（Manihot esculenta）、苜蓿（Medicago saliva）、水杉（Metasequoiaglyptostroboides）、大蕉（Musa sapientum）、烟草（Nicotianum spp.）、红豆草属（Onobrychis spp.）、蒿属（Ornithopus spp.）、稻属（Oryza spp.）、非洲双翼豆（Peltophorum africanum）、狼尾草属（Pennisetum spp.）、鳄梨（Persea gratissima）、矮牵牛（Petunia spp.）、豆科菜豆属（Phaseolus spp.）、加拿列刺葵（Phoenix canariensis）、新西兰麻属（Phormium cookianum）、石楠属（Photinia spp.）、白云杉（Picea glauca）、海岸松属（Pinus spp.）、豌豆（Pisum sativam）、桃拓罗汉松（Podocarpus totara）、Pogonarthria fleckii、Pogonaffhria squarrosa、杨树属（Populus spp.）、牧豆树（Prosopis cineraria）、花旗松（Pseudotsuga menziesii）、Pterolobium stellatum、矮生西洋梨（Pyruscommunis）、红橡木（Quercus spp.）、厚叶石斑木（Rhaphiolepsis umbellata）、刷子椰子（Rhopalostylis sapida）、盐肤木属（Rhus natalensis）、正醋栗（Ribesgrossularia）、醋栗属（Ribes spp.）、刺槐（Robinia pseudoacacia）、蔷薇属（Rosa spp.）、黑莓属（Rubus spp.）、柳木属（Salix spp.）、红裂稃草（Schyzachyrium sanguineum）、Sciadopitys vefficillata、北美红杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、鼠尾草(Sporobolus fimbriatus)、Stiburusalopecuroides、矮柱花草（Stylosanthos humilis）、金桔属(Tadehagi spp)、落羽松(Taxodium distichum)、黄背草(Themeda triandra)、三叶苜蓿（Trifolium spp.）、小麦属（Triticum spp.）、异叶铁杉（Tsuga heterophylla）、越橘属（Vaccinium spp.）、巢菜属（Vicia spp.）、葡萄（Vitis vinifera）、Watsoniapyramidata、马蹄莲（Zantedeschia aethiopica）、王蜀黍（Zea mays）、苋菜（amaranth）、朝鲜蓟、芦笋（asparagus）、嫩茎花椰菜、芽甘蓝（Brusselssprouts）、甘蓝、油菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、绿色芥蓝菜（collard greens）、亚麻、羽衣甘蓝（kale）、小扁豆、油菜、黄秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、西红柿、南瓜茶（squash tea）、树。可替换地，藻类和其它非绿色植物界（Viridiplantae）可以用于本发明的方法。按照一个具体实施方式，树是桉树。

如前面提到的，通过在植物中共同表达至少一种毒性肽和至少一种壳多糖酶来实现本发明的方法。

为了在植物中表达毒性肽和壳多糖酶，将编码毒性肽和壳多糖酶的多核苷酸插入表达构建物中并引入到植物（植物转化），以致在植物中发生表达，如下文进一步描述的。

本发明设想表达一种、两种、三种、四种或更多种毒性肽。毒性肽包括任何肽（包括它的代谢前体或前剂（pro-agent）），其影响昆虫的健康、生长或繁殖和/或其生活周期的任何阶段。根据一个实施方式，毒性肽源自昆虫或相关的节肢动物。

在本发明的一个优选的实施方式中，在植物中表达的毒性肽具有它的成熟形式，并且，理想地，是天然或合成的节肢动物来源的肽或蛋白质或其代谢物或类似物，能够引起对虫害的生长、发育繁殖或死亡率的有害影响；如昆虫或相关的节肢动物等源性蛋白或肽或神经肽或其代谢物或类似物。

适当地，毒性肽源自昆虫如蟑螂、丽蝇、蚊子、结网毛虫、甲虫、黄蜂、蜜蜂，或相关的节肢动物如对映体、千足虫、螃蟹、龙虾、小虾、对虾、蜘蛛、蝎子、螨、蜱等。

可以用来实施本发明的示例性昆虫毒素描述于美国专利号6,162,430和美国专利号7,196,057中，将两者的内容以引用方式结合于本文。

根据一个实施方式，毒性肽对于特定昆虫具有选择性毒性。上述毒素进一步描述于Nicholson（Toxicon49（2007）490–512），其内容以引用方式结合于本文。

根据另一个实施方式，毒性肽对于非脊椎动物具有选择性毒性。

适宜的毒性昆虫肽包括任何一种或多种以下神经肽和它们的天然或合成的代谢物或类似物：烟草天蛾（Manduca sexta）咽侧体抑制素（Manse-AS）；蟑螂咽侧体抑制素如在以下物种Diplotera punctata或美洲大蠊（Periplaneta americana）的任一种中发现的那些咽侧体抑制素或丽蝇咽侧体抑制素如在物种反吐丽蝇（Calliphora vomitaria）中的咽侧体抑制素；可替换地，可以使用这样的肽，其包含、或源自昆虫利尿激素如分离自任何一种或多种上述物种的昆虫利尿激素、或相关的节肢动物激素。

有用的蝎子毒素是，例如，来自黄肥尾蝎（Androctonus australis）的AaIT。Zlotkin等人,Biochimie,53,1073-1078（1971）。有用的蜗牛毒液是来自蜗牛蠟黃芋螺（Conus querciones）的蜗牛毒液，其是动物通过口加以递送并且其一些个别的毒素似乎对节肢动物（包括昆虫）是有选择性的。参见，例如，Olivera等人,"Diversity of Conus Neuropeptides,"Science,249:257-263（1990）。

按照一个特定的实施方式，毒性肽是蜘蛛毒素（例如蜘蛛神经毒素）。

蜘蛛神经毒素可以通过靶向昆虫的电压门控钠（voltage gated sodium）（Na_V）通道来起作用。

示例性昆虫选择性蜘蛛毒素包括但不限于海南捕鸟蛛毒素（hainantoxin）（其靶向Na_V通道的位点1）；Tx4（6-1）和Magi2（其靶向Na_V通道的位点3）；以及δ岩沙海葵毒素（δPalutoxin）（其靶向Na_V通道的位点4）。

如前面提到的，本发明设想表达一种、两种、三种、四种或更多种毒性肽。按照一个具体的实施方式，被表达的每种肽靶向不同位点，因而可以获得毒性肽的协同效应。因此，例如，本发明设想选择蜘蛛毒素，其靶向电压门控钠通道上的不同位点如P83591（靶向钠通道的位点1）、P83558（靶向钠通道的位点3）和P11060（靶向钠通道的位点4）。

在植物中可以表达的蜘蛛毒素的示例性组合是P83591、P83558、P11060和P61095。

按照一个优选的实施方式，昆虫肽源自海南捕鸟蛛（Haplopelmahainanum）、巨型上戶蜘蛛（Macrothele gigas）、巴西漫游蜘蛛（Phoneutrianigriventer）、阴暗拟隙蛛（Pireneitega luctuosa）、漏斗网蜘蛛（Agelenopsisaperta）或Segestria florentina。

设想的肽毒素包括那些肽毒素，所述肽毒素具有利用国家生物技术信息中心（NCBI）的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO:9、15、24、30、55、56和57组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的序列。

毒性肽的选择通过待破坏的病原体的特性确定。例如，可以基于待穿透的肠壁的类型来选择毒剂的尺寸并且毒剂的有效性将基于待破坏的昆虫的类型。

根据一个实施方式，本发明的此方面的毒性肽连接于植物凝集素。

按照一个特定的实施方式，毒性肽和/或壳多糖酶是在凝集素的上游。

可以连接于毒性肽和/或壳多糖酶的适宜植物凝集素包括能够渗入昆虫肠中的任何植物凝集素。待选择的凝集素类型的选择取决于它在昆虫肠中的稳定性、待穿透的肠壁的类型和它的毒性水平；非毒性凝集素是优选的。

植物凝集素的实例包括但不限于雪花莲凝集素（GNA）、豌豆凝集素Pisum sativum（豌豆凝集素）（P-lec）、花生凝集素Arachis hypogaea（花生凝集素）、菜豆凝集素（PHA，phytohaemo glutinin）、葱莲（Zephyranthescandida）凝集素、Amaryllis minuta凝集素、朱顶红（Hippeastrum vittatum）凝集素、君子兰（Clivia miniata）凝集素、石蒜（Lycoris radiate）凝集素、水仙（Narcissus tazetta）凝集素和喇叭水仙（Narcissus hybrid）凝集素以及它们的类似物。

在本发明的一个优选的实施方式中，植物蛋白选自以下蛋白质组：GNA（雪花莲凝集素；SEQ ID NO:46）；P-lec豌豆凝集素；以及花生凝集素。

优选地，通过基因或生物化学方式，将毒性肽和凝集素连接在一起，因此，在第一实例中，通过至少一种连接肽，或在第二实例中，通过共价或非共价键或连接部分。在肽用来将成员连接在一起的情况下，当融合蛋白处于生物活性构象时，肽的数目取决于每个成员的相关末端之间的距离。上述部分可以被可释放地连接，其中通过适应于在昆虫肠中原位解离并释放毒剂的方式，例如在通过昆虫的代谢时，或可以保持不变，其取决于毒剂的活性形式。

因此，本发明的示例性多核苷酸是在SEQ ID NO:47中陈述的一种多核苷酸，其编码来自sp|Q56YT0|LAC3_At漆酶+蜘蛛毒素P83591+GNA的融合植物分泌前导肽，如在SEQ ID NO:48中陈述的。本发明的另一个示例性多核苷酸是在SEQ ID NO:49中陈述的一种多核苷酸，其编码来自sp|Q56YT0|LAC3_At漆酶+蜘蛛毒素P83558+GNA的融合植物分泌前导肽，如在SEQ ID NO:50中陈述的。本发明的另一个示例性多核苷酸是在SEQ ID NO:51中陈述的一种多核苷酸，其编码来自tr|Q6TDS6|Q6TDS6_GOSAR分泌型漆酶树棉（Gossypium arboreum）+蜘蛛毒素P11060+GNA的融合植物分泌前导肽，如在SEQ ID NO:52中陈述的。本发明的另一个示例性多核苷酸是在SEQ ID NO:53中陈述的一种多核苷酸，其编码来自sp|Q56YT0|LAC3_At漆酶+蜘蛛毒素P61095+GNA的融合植物分泌前导肽，如在SEQ ID NO:54中陈述的。

如前面提到的，通过在植物中共同表达壳多糖酶和毒性肽来实现本发明的方法。

如在本文中所使用的，术语“壳多糖酶”是指一种酶，其消化壳多糖[聚（β-1,4-N-乙酰基D-葡糖胺）]以产生寡糖和N-乙酰基葡糖胺。为了测试多肽是否包含壳多糖酶活性，可以使多肽与壳多糖酶的底物接触，然后分析壳多糖酶底物的消化和/或其程度[例如，Johannes等人,Infect.Immun.,69,4041-4047(2001)]。例如，将待测试的多肽加入包含壳多糖酶的适当底物（例如，乙二醇壳多糖或壳多糖）的琼脂糖凝胶的孔中，并温育预定时间（例如，在37°C下12小时）。用适当的染料[例如，荧光增白剂28（Sigma）]染色凝胶并在紫外线下加以观测。其中壳多糖被壳多糖酶消化的部分并不与染料反应，因而变成黑色。在这种情况下，可以判断，待测试的多肽呈现壳多糖酶活性。相反地，当壳多糖酶反应并不发生时，与染料的反应会增白凝胶。在这种情况下，可以判断，待测试的多肽并不呈现壳多糖酶活性。

在植物中可以共同表达的适宜的壳多糖酶包括昆虫壳多糖酶如例如在烟草天蛾（M.sexta）、家蚕（Bombyx mori）、冈比亚按蚊的蚊子（mosquitoAnopheles gambiae）、美国白蛾（fall webworm Hyphantria cunea）、辣根猿叶甲（beetle Phaedon cochleariae）、或番茄蛾（Lacanobia oleracea）中发现的那些昆虫壳多糖酶。

根据一个实施方式，壳多糖酶源自生物体，其消化作为它的饮食的一部分的昆虫壳多糖。因此，设想，例如，来自植物印度猪笼草（Nepentheskhasiana）和真菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）的壳多糖酶用于本发明。

壳多糖酶已分离自许多植物种类并且按照它们的多域结构它们被分为5类（I-V）（Collinge et al.,1993;Hamel et al.,1997）并且本发明设想使用任何这些类。

第I类壳多糖酶主要包括碱性蛋白质（basic protein）（具有碱性pI值），大多靶向液泡并存在于单子叶植物和双子叶植物两者中。这些酶呈现高特异性活性并且是造成在根、茎干和花中大部分的植物壳多糖分解活性的原因（Legrand et al.,1987）。第I类壳多糖酶包括5个结构域：（i）N端信号肽（20-27个氨基酸残基），其规定蛋白质进入内质网的途径；（ii）富含半胱氨酸的域（约40个氨基酸的CRD），其涉及壳多糖结合并且包含在高度保守位置中的8个半胱氨酸残基；（iii）富含脯氨酸（大部分羟脯氨酸）的铰链区（HR），其大小有所不同；（iv）催化域（CD>220个氨基酸），包含蛋白质的中心结构域，其显示与第II类和第IV类壳多糖酶的催化域的高度同源性以及与细菌壳多糖酶的CD的低同源性；以及（v）羧基末端延伸（CTE），其将蛋白质引入液泡并且存在于大多数第I类壳多糖酶中（Graham and Sticklen,1994;Hamel et al.,1987）。在细胞溶胞（其来自对病原体入侵的过敏反应）期间发生大量的液泡区室化壳多糖酶的快速释放。还已表征了若干第I类碱性壳多糖酶，其缺乏CTE。这些壳多糖酶被分泌到细胞外间隙（Legrand et al.,1987;Swegle et al.,1992;Vad et al.,1991）。

第II类壳多糖酶是酸性的（具有酸性pI），仅包含信号肽和催化域。后者显示与第I类和第IV类壳多糖酶的催化域的高度氨基酸序列同源性。酸性壳多糖酶的特异性活性低于第I类壳多糖酶的特异性活性。假定，第II类壳多糖酶的主要功能是通过真菌病原体细胞壁的部分降解来产生防御反应的诱导物（Graham and Sticklen,1994）。

第III类壳多糖酶包括具有壳多糖酶/溶菌酶活性的碱性或酸性胞外蛋白。它们的催化域不同于第I类和第II类壳多糖酶的催化域，但和来自酵母和丝状真菌的壳多糖酶共享显著同一性。

第IV类壳多糖酶与第I类壳多糖酶共享结构域相似性但并不共享高氨基酸序列同一性。所有第IV类酶缺乏CTE，因而被靶向非原质体。另外，与第I类蛋白质的氨基酸序列对比显示4个不同缺失：一个在壳多糖结合域中以及三个在催化域内。此组包括来自豆的PR4壳多糖酶、来自油菜的ChB4以及许多其它壳多糖酶（Hamel et al.,1997）。

第V类壳多糖酶共享与细菌起源的外切壳多糖酶的某些同源性，例如，粘质沙雷氏菌（Serracia marcescens）、环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）和褶皱链霉菌（Streptomyces plicatus）。

示例性壳多糖酶序列包括但不限于这样的壳多糖酶序列，其具有利用国家生物技术信息中心（NCBI）的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO:36、42和58-60组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的序列。

本发明设想，将毒性肽、壳多糖酶或两者连接于信号肽。根据一个实施方式，信号肽是分泌信号肽，以致它们被分泌到细胞外基质中。

如在本文中所使用的，短语“信号肽”是指框内连接于多肽的氨基末端的肽并将编码的多肽引入细胞的分泌途径中。

因此，本发明设想多核苷酸序列SEQ ID NO:11，其编码SEQ ID NO:12（融合植物分泌前导肽形式sp.Q56YTO/LAC3_At漆酶和蜘蛛毒素P83591）；多核苷酸序列SEQ ID NO:17，其编码SEQ ID NO:18（融合植物分泌前导肽形式sp.Q56YTO/LAC3_At漆酶和蜘蛛毒素P83558）；多核苷酸序列SEQ ID NO:25，其编码SEQ ID NO:26（融合植物分泌前导肽，其来自tr|Q6TDS6|Q6TDS6_GOSAR分泌型漆酶树棉（Gossypiumarboreum）和蜘蛛毒素P11060）；多核苷酸序列SEQ ID NO:31，其编码SEQ ID NO:32（融合植物分泌前导肽形式sp.Q56YTO/LAC3_At漆酶和蜘蛛毒素P61095）；多核苷酸序列SEQ ID NO:37，其编码SEQ ID NO:38（融合植物分泌前导肽形式sp.Q56YTO/LAC3_At漆酶和真菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）壳多糖酶gb/ACF32998.1）；多核苷酸序列SEQ IDNO:43，其编码SEQ ID NO:44（融合植物分泌前导肽，其来自tr|Q6TDS6|Q6TDS6_GOSAR分泌型漆酶树棉（Gossypium arboreum）和真菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）内切壳多糖酶gb/AAN41261.1）。

如提到的，为了在植物中表达毒性肽和壳多糖酶，将编码毒性肽和壳多糖酶的多核苷酸引入植物（植物转化）以便在植物中进行表达。

按照本发明的此方面的核酸序列可以是互补多核苷酸序列（cDNA）、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列（例如，上述序列的组合）。

如在本文中所使用的，短语“互补多核苷酸序列”是指一种序列，其来自信使RNA的反转录，其中利用反转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶。随后可以利用DNA依赖性DNA聚合酶来体内或体外扩增上述序列。

如在本文中所使用的，短语“基因组多核苷酸序列”是指源自（分离自）染色体的序列，因此它代表染色体的邻近部分。

如在本文中所使用的，短语“复合多核苷酸序列”是指一种序列，其是至少部分互补序列和至少部分基因组序列。复合序列可以包括为编码本发明的多肽所需要的一些外显子序列以及插入其间的一些内含子序列。内含子序列可以具有任何来源（包括其它基因），并且通常将包括保守的剪接信号序列。上述内含子序列可以进一步包括顺式作用表达调节元件。

编码按照本发明的此方面的毒性肽和壳多糖酶的核酸序列可以加以改变，以进一步改善在植物表达系统中的表达水平。例如，可以按照用于植物表达的优选的密码子选择来修饰毒性肽和/或壳多糖酶的核酸序列。可以通过利用修饰或衍生的核苷酸序列来增加毒性肽和/或壳多糖酶在植物中的表达。上述序列修饰的实例包括但不限于改变的G/C含量以更加接近通常存在于植物中的G/C含量，和除去非典型地存在于植物中的密码子，通常称为密码子优化。

短语“密码子优化”是指选择适当的DNA核苷酸用于结构基因或其片段内，上述结构基因或其片段接近在植物中的密码子选择。因此，优化基因或核酸序列是指基因，其中天然或自然发生的基因的核苷酸序列已被修饰以采用植物中统计上优选的或统计上有利的密码子。通常在DNA水平检查核苷酸序列并优化编码区在植物中的表达，其利用任何适宜的程序确定，例如如在Sardana et al.（1996,Plant Cell Reports15:677-681）中所描述的。在此方法中，可以通过首先发现，相对于高度表达植物基因的选择的平方正比偏差，天然乙酰肝素酶基因的每种密码子的选择的平方正比偏差，接着计算平均方差，来计算密码子选择的标准偏差，密码子选择偏好的一种度量。所使用的公式是：1SDCU=n=1N[（Xn-Yn）/Yn]2/N，式中Xn是指在高度表达植物基因中密码子n的选择的频率，其中Yn是指在感兴趣的基因中密码子n的选择的频率，以及N是指在感兴趣的基因中密码子的总数。利用Murray et al.（1989,Nuc Acids Res.17:477-498）的数据编制了来自双子叶植物的高度表达基因的密码子选择的表。

编码毒性肽和/或壳多糖酶的核酸序列可以加以改变，以进一步改善表达水平，例如，通过优化核酸序列，其中按照用于特定植物细胞类型的优选密码子选择，上述特定植物细胞类型被选择用于毒性肽和/或壳多糖酶多肽的表达。烟草植物用于毒性肽和/或壳多糖酶的表达（如在下文的实例部分中所描述的）可以限制对优化核酸序列（按照优选密码子选择）的需要，这是因为烟草植物密码子选择/偏爱通常非常类似于人类。

优化核酸序列的一种方法（按照用于特定植物细胞类型的优选的密码子选择）是基于直接使用密码子优化表而没有进行任何另外的统计计算，如在线提供于密码子选择数据库并通过日本的NIAS（国家农业生物科学研究所）DNA库（www.kazusa.or.jp/codon/）的那些密码子优化表。密码子选择数据库包含用于若干不同物种的密码子选择表，其中每个密码子选择表是基于在基因库中存在的数据加以统计确定。

通过利用上述表来确定最优选的或最有利的用于在特定物种（例如，稻）中的每种氨基酸的密码子，编码感兴趣的蛋白质的天然存在的核苷酸序列可以是优化用于上述特定植物种类的密码子。其实施是通过用就氨基酸而言统计上更加有利的相应密码子替代在特定物种基因组中可以具有较低统计发生率的密码子。然而，可以选择一种或多种较不利的密码子以删去现有的限制位点，从而在潜在有用的接头处产生新的限制位点（5'和3'末端以添加信号肽或终止盒（试剂盒），内位点，其可以用来一起切割和剪接区段以产生正确的全长序列），或消除可以负面影响mRNA稳定性或表达的核苷酸序列。

编码核苷酸序列的天然存在的或天然的毒性肽和/或壳多糖酶可以在任何修饰之前已经包含许多密码子，其对应于在特定植物种类中的统计上有利的密码子。因此，天然毒性肽和/或壳多糖酶核苷酸序列的密码子优化可以包括确定在天然毒性肽和/或壳多糖酶核苷酸序列内相对于特定植物而言并不是统计上有利的密码子，然后按照特定植物的密码子选择表来修饰这些密码子，以产生密码子优化的衍生物。编码毒性肽和/或壳多糖酶的修饰或衍生核苷酸序列可以100%包括植物优选密码子序列，同时用与由天然毒性肽和/或壳多糖酶编码序列产生的相同的氨基酸序列来编码多肽。可替换地，编码毒性肽和/或壳多糖酶的修饰核苷酸序列可以仅部分地包含植物优选密码子序列，其中剩余密码子保留源自天然毒性肽和/或壳多糖酶编码序列的核苷酸序列。修饰核苷酸序列可以被全部或部分优化用于植物密码子选择，条件是，在高于由相应天然存在的或天然的基因编码的蛋白质的水平下，产生由修饰核苷酸序列编码的蛋白质。例如，修饰毒性肽和/或壳多糖酶可以包含约60%至约100%的优化用于植物表达的密码子。作为另一个实例，修饰毒性肽和/或壳多糖酶可以包含90%至100%的优化用于植物表达的密码子。

通过改变密码子选择所形成的合成基因的结构描述于例如PCT专利申请93/07278中。

可以利用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术来建构可用于按照本发明的方法的建构物（或载体）。可以将基因建构物插入载体中，所述载体可以是商购获得的，适用于转化进入植物中并适用于在转化细胞中表达感兴趣的基因。基因建构物可以是表达载体，其中异源核酸序列可操作地连接于顺式作用调节元件，从而允许在植物细胞中的表达。

如在本文中所使用的，短语“顺式作用调节元件”是指多核苷酸序列，优选启动子，其结合反式作用调节子并调节位于其下游的编码序列的转录。

如在本文中所使用的，短语“可操作地连接”是指顺式调节元件（例如，启动子）的功能定位，以便允许调节所选核酸序列的表达。例如，就转录和翻译的方向而言，启动子序列可以位于所选核酸序列的上游。

优选地，在本发明的核酸构建物中的启动子是植物启动子，所述植物启动子用于指导异源核酸分子在植物细胞内的表达。

如在本文中所使用的，短语“植物启动子”是指启动子序列（包括向其中添加或包含在其中的任何另外的调节元件），至少能够诱导、授予、激活或增强在植物细胞、组织或器官（优选单子叶或双子叶植物细胞、组织、或器官）中的表达。根据一个实施方式，启动子不是花启动子（因而保护蜜蜂和其它食蜜性昆虫免受毒素的影响）。

根据又一个实施方式，启动子是叶启动子。可用于本发明的方法的优选的启动子的实例包括：

sgFiMV-Bhattacharyya(USA),Virus Research,2002,90:47–62。

SVBV–Wang(ISL),Virus Genes,2000,20:11-7；Pattanaik(USA),Plant Science,2004,167:427–38。

PCISV–Maiti(USA),BIOCH.BIOPHYS.RES.COM.1998,244:440–4。

sgMiMV–Dey(USA),Transgenic,2003,4:35-53。

MiMV–Dey(USA),Plant Molecular Biology,1999,40:771–82。

FiMV–Maiti(USA),Transgen.Res.1997,6:143-56。

CsVMV–Verdaguer(USA),AJRTC,1997,2:204-8。

35S启动子，其来自pBI121（AF485783.1），如在SEQ ID NO:6中陈述的。

AtUBQ1启动子，如在SEQ ID NO:14中陈述的。

At肌动蛋白7(AtActin7)启动子，如在SEQ ID NO:20中陈述的。

Atδtip（At Delta tip）启动子，如在SEQ ID NO:28中陈述的。

AtγTIP2（At GammTIP2）启动子，如在SEQ ID NO:34中陈述的。

Sg FiMV启动子，如在SEQ ID NO:40中陈述的。

其它示例性启动子列于表I、II和III中。

表I

用于实施本发明的示例性组成型启动子

表II

用于实施本发明的示例性种子优选启动子

表III

用于实施本发明的可替换的水稻启动子

增强子元件可以刺激转录多达1,000倍（来自连接同源或异源启动子）。当放置在转录起始位点的下游或上游时增强子是活性的。源自病毒的许多增强子元件具有广泛的宿主范围并且在各种组织中是活性的。例如，SV40早期基因增强子适用于许多细胞类型。适用于本发明的一些实施方式的其它增强子/启动子组合包括那些组合，其源自多瘤病毒、人或鼠巨细胞病毒（CMV）、来自各种逆转录病毒的长末端重复（long termrepeat），如小鼠白血病病毒、小鼠或Rous肉瘤病毒和HIV。参见，Enhancersand Eukaryotic Expression,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.1983，其以引用方式结合于本文。

本发明设想的特定增强子元件是烟草蚀纹病毒翻译增强子（tobaccoetch virus translational enhancer）（SEQ ID NO:2）。

在表达载体的结构中，启动子在它的天然环境中优选大约定位于离异源转录起始位点相同的距离（相同于它离转录起始位点的距离）。然而，如本领域中已知的，可以允许该距离的一些变化而没有损失启动子功能。

还可以将多聚腺苷化序列加入表达载体以便增加mRNA翻译的效率。为了获得准确和有效的多聚腺苷化，需要两个不同的序列元件：位于多聚腺苷化位点的下游的富含GU或U的序列以及位于11-30个核苷酸上游的6个核苷酸（AAUAAA）的高度保守的序列。适用于本发明的一些实施方式的终止和多聚腺苷化信号包括那些源自SV40的终止和多聚腺苷化信号。可以用于本发明的载体中的CaMV多A（CaMV PolyA）和终止子的示例性序列是如在SEQ ID NO:5中陈述的。

由本发明设想的其它终止子是那些在SEQ ID NO:13、19、27、33、39、45中陈述的终止子。

除了已经描述的元件以外，本发明的一些实施方式的表达载体可以通常包含其它专门化元件，其旨在增加克隆核酸的表达水平或便于确定携带重组DNA的细胞。例如，许多动物病毒包含DNA序列，其促进在允许细胞类型中病毒基因组的染色体外复制（extra chromosomal replication）。游离型复制承载这些病毒复制子的质粒，只要由基因（携带在质粒上或连同宿主细胞的基因组）提供适当的因子。

载体可能或不可能包括真核复制子。如果存在真核复制子，那么载体在真核细胞中是可扩增的，其中利用适当的可选择的标志物。如果载体并不包含真核复制子，则附加体扩增是不可能的。相反，重组DNA整合到工程细胞的基因组中，其中启动子引导所期望的核酸的表达。

本发明的载体可以包含核酸序列，所述核酸序列编码赋予抗生素抗性的多肽。上述序列在本领域中是已知的并且包括例如那些由SEQ ID NO:3陈述的序列，多肽序列是如在SEQ ID NO:4中陈述的。

本发明的核酸构建物还可以包含编码信号肽的另外的核酸序列，其允许将框内与其融合的毒性肽/壳多糖酶转运到植物内的亚细胞器、细胞壁或分泌到细胞外基质（根据需要）。植物细胞的亚细胞器的实例包括但不限于白色体、叶绿体、色质体、线粒体、细胞核、过氧化物酶体、内质网、非原质体和液泡。

在植物细胞内毒性肽/壳多糖酶重组蛋白的区室化、接着它的分泌是使产物容易可纯化的一个先决条件。研究表明，通过与适当的信号肽融合来将重组蛋白靶向内质网可以使融合多肽被靶向分泌途径。在细胞的亚细胞器中蛋白质的累积也可以是优选的以便于以相对高浓度存储蛋白质而没有暴露于例如在液泡中存在的降解化合物。信号序列可以源自植物如小麦、大麦、棉花、稻、大豆、和马铃薯。

示例性核酸分泌信号序列，其引导多肽经由ER到细胞外间隙，包括那些在SEQ ID NO:7和61-66中陈述的核酸分泌信号序列。这种分泌信号序列的氨基酸序列陈述于SEQ ID NO:8中。

本发明设想的另一种核酸分泌信号序列是在SEQ ID NO:21、67和68中陈述的核酸分泌信号序列。这种分泌信号序列的氨基酸序列陈述于SEQID NO:22中。

本文中可以使用的另外的信号肽包括烟草发病机制相关蛋白（PR-S）信号序列（Sijmons et al.,1990,Bio/technology,8:217-221）、凝集素信号序列（Boehn et al.,2000,Transgenic Res,9(6):477-86）、来自富含羟脯氨酸的糖蛋白（来自菜豆（Phaseolus vulgaris））的信号序列（Yan et al.,1997,PlantPhyiol.115（3）:915-24和Corbin et al.,1987,Mol Cell Biol7（12）:4337-44）、马铃薯块茎特异蛋白（patatin）信号序列（Iturriaga,G et al.,1989,Plant Cell1:381-390和Bevan et al.,1986,Nuc.Acids Res.41:4625-4638.）和大麦α淀粉酶信号序列（Rasmussen and Johansson,1992,Plant Mol.Biol.18(2):423-7）。上述靶向信号可以从毒性肽/壳多糖酶序列被体内切割，当使用非原质体靶向信号，如烟草发病机制相关蛋白-S（PR-S）信号序列时，其通常是这种情况（Sijmons et al.,1990,Bio/technology,8:217-221）。

按照本发明的此方面还可以使用的其它信号序列包括信号保留序列。这些序列的使用导致在特定位置处增加的累积，因而可以更容易地纯化毒性肽/壳多糖酶。例如，专利申请号20050039235教导了信号和保留多肽用于将重组胰岛素靶向在植物细胞中的ER或ER源性储存小泡（例如，油体），从而增加胰岛素在种子中的累积。

ER保留基序的实例包括KDEL、HDEL、DDEL、ADEL和SDEL序列。

如上所述，信号多肽还可以用于将相关的重组蛋白靶向非原质体。已经表明，与其中将MAb靶向细胞液的植物相比，将重组免疫球蛋白（MAb）靶向非原质体会显著增加蛋白质产量[Conrad and Fiedler,38Plant Mol.Biol.101-109(1998)]。

用来便于纯化/证实的又一种重要策略是融合重组毒性肽/壳多糖酶和亲和标记物，其中通过在本发明的核酸构建物中包括标记物的序列。这种方法广泛地用于蛋白质的体外纯化。用于本发明的示例性纯化标记物包括但不限于血凝素表位（HA TAG）、多组氨酸、V5、myc、蛋白A、谷胱甘肽-S-转移酶（gluthatione-S-fransferase）、麦芽糖结合蛋白（MBP）和纤维素结合域（CBD）[Sassenfeld,1990,TIBTECH,8,88-9]。本发明的核酸构建物还可以包含有助于蛋白酶剪切的序列，例如，凝血酶剪切序列。这样的序列可以允许毒性肽/壳多糖酶与连接的共翻译序列如上述ER保留序列分离。

因此，本发明包括上文所描述的核酸序列，其片段，可与其杂交的序列，与其同源的序列，与其直源的序列，编码类似多肽（具有不同密码子选择）的序列，改变的序列，其特征在于突变，如一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代（自然发生或人为诱导的，随机地或以靶向方式）。

可以用本发明的核酸构建物来稳定或瞬时转化植物细胞。在稳定转化中，将本发明的核酸分子整合到植物基因组中并因此它表示稳定和遗传性状。在瞬时转化中，核酸分子由转化的细胞表达但并没有被整合到基因组中，因此它表示瞬态性状。

存在各种方法来将外源基因引入单子叶和双子叶植物两者中（Potrykus,I.,Annu.Rev.Plant.Physiol.,Plant.Mol.Biol.(1991)42:205-225;Shimamoto et al.,Nature(1989)338:274-276）。

将外源DNA稳定整合到植物基因组DNA中的主要方法包括两种主要方式：

（i）土壤杆菌属介导的基因转移：Klee et al.(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38:467-486；Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants,Vol.6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,eds.Schell,J.,and Vasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.2-25；Gatenby,in Plant Biotechnology,eds.Kung,S.and Arntzen,C.J.,Butterworth Publishers,Boston,Mass.(1989)p.93-112。

（ii）直接DNA摄取：Paszkowski et al.,in Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants,Vol.6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds.Schell,J.,and Vasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.52-68；包括用于将DNA直接摄取到原生质体中的方法，Toriyama,K.etal.(1988)Bio/Technology6:1072-1074。通过植物细胞的短暂电击所诱导的DNA摄取：Zhang et al.Plant Cell Rep.(1988)7:379-384.Fromm et al.Nature(1986)319:791-793。通过粒子轰击，将DNA注射入植物细胞或组织中，Klein et al.Bio/Technology(1988)6:559-563；McCabe et al.Bio/Technology(1988)6:923-926；Sanford,Physiol.Plant.(1990)79:206-209；通过使用微量吸液系统：Neuhaus et al.,Theor.Appl.Genet.(1987)75:30-36；Neuhaus andSpangenberg,Physiol.Plant.(1990)79:213-217；细胞培养物、胚胎或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化，美国专利号5,464,765，或通过用萌发花粉直接温育DNA，DeWet et al.in Experimental Manipulation of Ovule Tissue,eds.Chapman,G.P.and Mantell,S.H.and Daniels,W.Longman,London,(1985)p.197-209；以及Ohta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715-719。

土壤杆菌属系统包括使用质粒载体，所述质粒载体包含整合到植物基因组DNA中的限定的DNA区段。植物组织的接种的方法取决于植物种类和土壤杆菌属递送系统而变化。广泛使用的方式是叶盘程序，其可以借助于任何组织外植体来进行，其中上述组织外植体为全植物分化的起始提供良好来源。Horsch et al.in Plant Molecular Biology Manual A5,KluwerAcademic Publishers,Dordrecht(1988)p.1-9。一种辅助方式采用土壤杆菌属递送系统以及真空渗入。在转基因双子叶植物的产生中土壤杆菌属系统尤其是可行的。

存在各种将DNA直接转移到植物细胞中的方法。在电穿孔中，将原生质体简单地暴露于强电场。在微注射中，利用非常小的微量移液器，将DNA直接机械注入细胞中。在微粒轰击中，将DNA吸附在微粒如硫酸镁晶体或钨颗粒上，然后物理加速微粒以使其进入细胞或植物组织中。

在稳定转化以后，进行植物繁殖。植物繁殖的最常用方法是通过种子。然而，通过种子繁殖的再生有不足之处：由于杂合性，所以缺乏作物均匀性，这是因为通过植物并按照受控于孟德尔规则的遗传方差来产生种子。基本上，每个种子是基因上不同的并且每个种子将生长并具有其自身特定性状。因此，优选的是，产生转化植物，以致再生植物具有亲本转基因植物的相同的性状和特性。因此，优选的是，通过微繁殖来再生转化植物，上述微繁殖可以提供转化植物的快速、一致的繁殖。

微繁殖是从已经切除自所选亲本植株或品种的单片组织来生长新代植物的方法。此方法允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物的大量繁殖。产生的新代植物是基因上与原植物相同并具有原植物的所有特征。微繁殖允许在短时间内大规模生产质量植物材料以及提供所选栽培品种的快速增殖并保存原始转基因或转化植物的特征。克隆植物的优点在于植物增殖的速度以及产生的植物的质量和均匀性。

微繁殖是多阶段程序，其需要改变在阶段之间的培养基或生长条件。因此，微繁殖过程涉及四个基本阶段：第一阶段，最初的组织培养；第二阶段，组织培养物增殖；第三阶段，分化和植株的形成；以及第四阶段，温室培养和硬化。在第一阶段（最初的组织培养）期间，建立组织培养物并证明其无污染的。在第二阶段期间，增殖初始组织培养物直到产生足够数量的组织样品以满足生产目标。在第三阶段期间，在第二阶段中生长的组织样品被分化和生长成个体小植株。在第四阶段，将转化小植株转移到温室进行硬化，其中植物对光的耐受性逐渐增加以致它可以生长在自然环境中。

虽然稳定转化目前是优选的，但本发明还设想叶细胞、分生细胞或全植物的瞬时转化。

可以通过任何上述的直接DNA转移方法或通过利用修饰植物病毒的病毒感染来实现瞬时转化。

已表明可用于植物宿主的转化的病毒包括CaMV、TMV和BV。利用植物病毒对植物的转化描述于美国专利号4,855,237（BGV），EP-A67,553（TMV），日本公开申请号63-14693（TMV），EPA194,809（BV），EPA278,667（BV）；以及Gluzman,Y.et al.,Communications in Molecular Biology:Viral Vectors,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,pp.172-189（1988）中。用于在许多宿主（包括植物）中表达外源DNA的假病毒颗粒描述于WO87/06261中。

用于在植物中引入和表达非病毒外源核酸序列的植物RNA病毒的结构说明于上述参考文献以及Dawson,W.O.et al.,Virology(1989)172:285-292；Takamatsu et al.EMBO J.(1987)6:307-311；French et al.Science(1986)231:1294-1297；以及Takamatsu et al.FEBS Letters(1990)269:73-76中。

当病毒是DNA病毒时，可以对病毒本身进行适当的修饰。可替换地，可以首先将病毒克隆到细菌质粒以易于建构所期望的具有外源DNA的病毒载体。然后可以从质粒切除病毒。如果病毒是DNA病毒，则可以将细菌复制起点连接于病毒DNA，其然后通过细菌加以复制。这种DNA的转录和翻译将产生外壳蛋白，其将壳体化病毒DNA。如果病毒是RNA病毒，则通常将病毒克隆为cDNA并插入质粒中。然后质粒用来构成所有结构。然后通过转录质粒的病毒序列和病毒基因的翻译来产生RNA病毒，从而产生壳体化病毒RNA的一种或多种外壳蛋白。

用于在植物中引入和表达非病毒外源核酸序列（如在本发明的建构物中包括那些核酸序列）的植物RNA病毒的结构说明于上述参考文献以及美国专利号5,316,931中。

在一个实施方式中，提供了植物病毒核酸，其中已经从下述删除天然外壳蛋白编码序列：病毒核酸、非天然植物病毒外壳蛋白编码序列和非天然启动子，优选地已插入非天然外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子，其能够在植物宿主中表达，包装重组植物病毒核酸，以及确保宿主的全身性感染（通过重组植物病毒核酸）。可替换地，可以通过在其内插入非天然核酸序列来灭活外壳蛋白基因，以致产生蛋白质。重组植物病毒核酸可以包含一种或多种另外的非天然亚基因组启动子。每种非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达邻近基因或核酸序列并且不能彼此重组和与天然亚基因组启动子重组。可以相邻于天然植物病毒亚基因组启动子或天然和非天然植物病毒亚基因组启动子（如果包括大于一种核酸序列）来插入非天然（外源）核酸序列。在亚基因组启动子的控制下在寄生植物中转录或表达非天然核酸序列以产生所期望的产物。

在第二实施方式中，如在第一实施方式中提供重组植物病毒核酸，不同之处在于：相邻于非天然外壳蛋白亚基因组启动子放置天然外壳蛋白编码序列来代替非天然外壳蛋白编码序列。

在第三实施方式中，提供了重组植物病毒核酸，其中天然外壳蛋白基因相邻于它的亚基因组启动子并且一种或多种非天然亚基因组启动子已被插入病毒核酸中。插入的非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达邻近基因并且不能彼此重组和与天然亚基因组启动子重组。可以相邻于非天然亚基因组植物病毒启动子插入非天然核酸序列，以致在亚基因组启动子的控制下在寄生植物中转录或表达序列，以产生所期望的产物。

在第四实施方式中，如在第三实施方式中提供重组植物病毒核酸，不同之处在于：由非天然外壳蛋白编码序列取代天然外壳蛋白编码序列。

用由重组植物病毒核酸编码的外壳蛋白来包围病毒载体以产生重组植物病毒。重组植物病毒核酸或重组植物病毒用来感染适当的寄生植物。重组植物病毒核酸能够在宿主中复制，在宿主中系统扩散，以及在宿主中转录或表达一个或多个外源基因（分离的核酸），以产生所期望的蛋白质。

除了上述以外，还可以将本发明的核酸分子引入叶绿体基因组中，从而能够进行叶绿体表达。

用于将外源性核酸序列引入叶绿体的基因组的技术是已知的。此技术涉及以下程序。首先，化学处理植物细胞以便将叶绿体/细胞的数目减少至约1。然后，经由粒子轰击将外源性核酸引入细胞中，其目的是将至少一种外源性核酸分子引入叶绿体中。选择外源性核酸以致它可整合进入叶绿体的基因组中，其中经由通过叶绿体固有的酶可以容易实现的同源重组。为此，外源性核酸包括（除感兴趣的基因以外）至少一段核酸序列（核酸伸长，nucleic acid stretch），其源自叶绿体的基因组。另外，外源性核酸包括可选择的标志物，所述可选择的标志物通过依次选择程序用来确定在上述选择以后叶绿体基因组的所有或几乎所有的拷贝将包括外源性核酸。与该技术有关的进一步的细节可参见美国专利号4,945,050和5,693,507，其以引用方式结合于本文。因此可以通过叶绿体的蛋白表达系统来产生多肽并将多肽整合到叶绿体的内膜中。

各种建构物图解可以用来表达来自单核酸构建物的两种重组蛋白（即毒素和壳多糖酶）。例如，两种重组蛋白可以，作为多顺反子信息（polycistronic message），从核酸构建物的单启动子序列共转录。为了使能够共翻译来自单多顺反子信息的毒素和壳多糖酶，可以经由连接序列来转录融合第一和第二多核苷酸区段，其中上述连接序列包括内部核糖体进入位点（IRES）序列，其使得能够翻译在IRES序列下游的多核苷酸区段。在这种情况下，转录的多顺反子RNA分子（包括第一和第二生长因子两者的编码序列）将从带帽的5'末端和多顺反子RNA分子的内部IRES序列中翻译，从而产生毒素和壳多糖酶两者。

可替换地，可以借助于由蛋白酶可切割的蛋白酶识别位点来翻译融合第一和第二多核苷酸区段，其中上述蛋白酶由待用核酸构建物加以转化的细胞所表达。在这种情况下，细胞表达的蛋白酶将切割翻译的嵌合多肽，从而产生毒素和壳多糖酶。

仍然可替换地，本发明的核酸构建物可以包括两种或更多种启动子序列，各自用于分别表达毒素和另外的重组蛋白。这些启动子（其可以是相同或不同的）可以是在一种或多种细胞类型中发挥功能的组成型、组织特异性或可调节（例如诱导型）启动子。

将理解的是，毒性肽和壳多糖酶可以从两个单独的建构物（即核酸构建物系统）中表达。

按照另一个方面，本发明的毒性肽（以及可选地本发明的壳多糖酶）可以在异源系统中表达并作为杀虫组合物提供给昆虫。

宿主细胞可以是原核或真核宿主细胞如细菌、昆虫、真菌、植物或动物宿主细胞并且在每种情况下相应地适应调节序列以使得能够在宿主物种中表达一种或多种多核苷酸。例如，在宿主细胞是植物细胞的情况下，调节序列包含在植物细胞中活性的启动子，这样的启动子是本领域技术人员众所周知的并且刚好的一个实例是玉米的多聚泛蛋白基因的启动子。

可选地，可以在回收以后使用毒性肽/壳多糖酶。术语“回收”是指至少部分纯化以产生植物提取物、匀浆物、植物匀浆物的组分等。部分纯化可以包括但不限于破坏植物细胞结构，从而产生组合物，该组合物包含可溶性植物成分，和不溶性植物成分，其可以例如但不限于通过离心法、过滤或它们的组合来加以分离。在这方面，利用真空或离心提取，可以容易获得在叶或其它组织的细胞外间隙内分泌的蛋白质，或可以在压力下借助于通过辊或研磨等来提取组织，以从细胞外间隙内挤压或释放游离的蛋白质。最少回收还可以涉及毒性肽/壳多糖酶的粗提取物的制备，因为这些制备将具有可以忽略的来自次要植物产物的污染。另外，最少回收可以涉及方法如在Woodleif et al.,Tobacco Sci.25,83-86(1981)中披露的那些用于制备F1P的方法。这些方法包括通过借助于任何适当盐（例如但不限于KHSO₄）的沉淀从绿色烟叶水提取可溶性蛋白。其它方法可以包括大规模离析和汁提取以便允许提取物的直接使用。

可替换地，可以利用在本领域中众所周知的更加复杂的纯化方法来从植物（全植物）或植物培养物中回收毒性肽/壳多糖酶多肽。例如，毒性肽/壳多糖酶从植物细胞或植物中的收集和/或纯化可以取决于特定的表达系统和表达的序列。分离和纯化技术可以包括，例如，超滤法、亲和层析法和/或电泳。在特定情况下，本领域技术人员已知的分子生物学技术可以用来产生具有一种或多种异源肽的变体，其可以帮助蛋白质纯化（纯化标记，如上所述）。上述异源肽可以被保留在最终的功能蛋白中或可以在收集/分离/纯化处理期间或之后被除去。

因此，按照本发明的再一个方面，提供了包含上述肽/壳多糖酶的杀虫组合物。优选地，如上文所定义的组合物具有任何所期望制剂的形式如溶液、乳剂、喷雾剂、混悬剂、散剂、泡沫、糊剂、颗粒、气雾剂、胶囊或其它精细或粗分材料或用于天然或合成材料的浸渍剂。

在一个实施方式中，杀虫组合物的形式为喷雾剂、混悬剂等，并与适宜的稀释剂、佐剂、防腐剂、分散剂、溶剂、乳化剂等的混合。适宜的组成成分是在本领域中常规使用的、尤其是适用于目前口服给药应用的那些组成成分。可以借助于任何适宜的溶剂，优选水、醇、矿物油等，任何适宜固体载体如白陶土、粘土、滑石粉、白垩、石英、绿坡缕石、蒙脱土、硅藻土、硅石等，借助于任何固体载体作为用于颗粒的载体如方解石、大理石、浮石和压碎的天然纤维材料，来获得上述组合物。可以另外以与其它已知杀虫剂、生长促进或调节物质、除草剂、杀真菌剂、增效剂等的紧密或物理混合物来采用用于本发明的组合物。

组合物优选适用于物理或化学相关植物或它们的基因座，以及适用于通过病原体口服摄取。

按照本发明的一个优选的实施方式，提供了一种用于生产上述组合物的方法，该方法包括：在适合于表达融合蛋白的条件下培养上述宿主细胞；以及从培养物收获毒性肽/壳多糖酶。

按照本发明的再一个方面，提供了一种用于产生耐疾病的转基因植物细胞或植物的方法，该方法包括：用本发明的一种或多种上述建构物来转化选择的植物基因组（如上文所描述的）。

按照本发明的又一个方面，提供了一种通过上述方法产生的转基因植物细胞或植物、或它们的后代。

应当理解的是，本发明不一定将它的应用限制于在以下描述中所陈述的细节。本发明能够具有其它实施方式或者能够以各种方式实施或进行。

如在本文中所使用的，术语“约”是指±10%。

术语“包含”、“包括”、“含有”、“含”、“具有”以及它们的缀合词（conjugates）是指“包括但不限于”。

术语“由…组成”是指“包括并限于”。

术语“基本上由…组成”是指组合物、方法或结构可以包括另外的组分、步骤和/或部分，但前提是，上述另外的组分、步骤和/或部分并不重大改变所要求的组合物、方法或结构的基本和新颖特点。

如在本文中所使用的，除非上下文清楚地另外指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括它们的混合物。

如在本文中所使用的，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，其包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或容易从已知方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。

应该理解的是，为清楚起见描述于单独实施方式内容中的本发明的某些特点，也可以联合提供在单个实施方式中。反过来，为简便起见描述于单个实施方式内容中的本发明的各种特点，也可以分别或以任何适当的子组合加以提供或在合适的情况下提供在本发明的任何其它描述的实施方式中。在不同实施方式内容中描述的某些特点并不被看作是那些实施方式的基本特点，除非在没有那些要素的情况下实施方式是不能实行的。

虽然已连同其具体实施方式描述了本发明，但显而易见的是，许多替代、改进和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，它旨在包括属于所附权利要求书的精神和广泛范围的所有上述替代、改进和变化。

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请的全部内容以引用方式结合于本说明书中，其程度好像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用方式结合于本文中相同。另外，在此申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这样的参考文献可作为本发明的先有技术获得。在使用章节标题的程度上，它们不应该被解释为一定限制性的。

如上文描述的以及如在所附权利要求部分中要求的本发明的不同实施方式和方面在以下实施例中获得实验支持。

实施例

现参照以下实施例，其连同以上描述一起并以非限制性方式来说明本发明的一些实施方式。

通常，本文中使用的术语和在本发明中采用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。在文献中详细解释了上述技术。参见，例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wileyand Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide toMolecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York;Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(1998)；如在美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中阐述的方法；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture ofAnimal Cells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-IIIColigan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可用的免疫测定被广泛地描述于专利和科学文献，参见，例如，美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,andHiggins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,andHiggins S.J.,eds.(1984);"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide toMolecular Cloning"Perbal,B.,(1984)以及"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press;"PCR Protocols:A Guide To Methods AndApplications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory CourseManual"CSHL Press(1996)；所有上述文献以引用方式结合于本文，认同完全陈述在本文中。在整个该文献中提供了其它一般参考文献。其中的程序被认为是在本领域中众所周知的并加以提供以方便读者。其中包含的所有信息以引用方式结合于本文。

实施例1

载体257的结构

建构物157（总共14115bp，如图1B所示），其包含二元载体pBI121，基因库：AF485783.1，NPTII选择性元件（SEQ ID NO:3），35S启动子（SEQID NO:1）和CaMV终止子（SEQ ID NO:5），用Xba和Sac1消化葡糖醛酸糖苷酶（glucoronidase）并将抗昆虫6盒（AntiInsects6Cassete）多核苷酸（10730bp）插入建构物中，如图1A-B所示。

为了确认抗昆虫6盒（AntiInsects6Cassete）多核苷酸被正确插入载体中，进行了限制性分析。具体地说，用XbaI+SalI+SacI来共消化DNA。预期的片段大小是：12275bp+8640bp+2090bp。另外，使用标准方法来测定所有蛋白质编码区的序列。

结果

如图2所示，证实了，载体257包含抗昆虫6盒（AntiInsects6Cassete）多核苷酸。

实施例2

载体258的结构

通过利用XbaI-XhoI将合成片段抗昆虫6CDS_GNA（AntiInsects6CDS_GNA）（6881bp）插入抗昆虫6盒（AntiInsects6Cassette）多核苷酸来建构载体#258（14115b.p.），如图3A-B所示。随后用Xba和SacI来消化获得的插入片段并插入载体157中以便获得载体258。

为了确认抗昆虫6CDS GNA（AntiInsects6CDS GNA）多核苷酸被正确插入载体中，进行了限制性分析。具体地说，用XbaI+XhoI来共消化DNA。预期的片段大小是：17499bp+6881。另外，使用标准方法来测定所有蛋白质编码区的序列。

结果

如图4所示，证实了载体258包含抗昆虫6CDS GNA（AntiInsects6CDSGNA）多核苷酸。

实施例3

借助于载体257和258的烟草转化

材料和方法培养基：

TR：4.4g/L的MS盐+维生素（Duchefa.Cat#M0222），3%蔗糖（30g/1升），通过KOH调节为pH5.8。0.65%植物琼脂（将3.25g/0.5L分别加入每个瓶中），压热器。

液体TR：4.4g/L的MS盐+维生素（Duchefa.Cat#M0222），3%蔗糖（30g/1升），通过KOH调节为pH5.8。

TR+H:TR并具有另外的激素：2mg/L玉米素+0.1mg/L IAA；2mg/L激动素+0.8mg/L IAA。

土壤杆菌属的制备：在28°C、200rpm下，在100ml LB+利福平（100mg/L）、和50mg/L卡那霉素中生长土壤杆菌属培养物48小时。

烟草外植体的制备：获取具有暗绿色叶子的新鲜烟草植物（N.tabacum plant）。将叶切割成～1cm x1cm的片并放置在包含TR液体培养基（p.H5.8）的140mm培养皿上。

消除微量的抗生素：在土壤杆菌属培养物达到1-2.0的OD（约24-48小时）以后，旋转减慢30ml培养物并将沉淀物再悬浮在30ml的TR液体培养基（p.H5.8）中。再次旋转减慢悬浮的培养物并再悬浮在TR中至OD₆₀₀=0.5-1.0的最终浓度。

共培养：从平板除去TR液体培养基（参见烟草外植体的制备）并代替添加农用悬浮液（Agro suspension）。利用解剖刀（scalpe），在每片叶子的主导管（main vessel）中进行两次切割。在农用悬浮液中温育叶5-30分钟。从平板除去农用悬浮液并在无菌纸上干印迹叶。将外植体转移到固体TR+H平板，其中叶的上侧面朝上。进行共培养2天。

选择/再生：将5/6外植体/平板转移到TR+H+选择板。选择培养基包括抗生素以消除农业生长（例如头孢氨噻肟（Cefatoxime）（200mg/L）和羧苄青霉素（Carbenicillin）（320mg/L）或力百汀（Augmentin）（200mg/L）或特美汀（100mg/L）并连同用于选择转基因茎干的有关抗生素（Kana100mg/L/潮霉素25mg/L）。重要的是，外植体与培养基完全接触。每7天更换选择培养基（力百汀和特美汀，在1周以后降解），直到茎干发育。

生根：到6周时，将单茎干转移到包含选择抗生素的TR培养基。

证实：为了证实转基因表达在植物中，可以借助于NPTII抗体来进行蛋白质印迹分析。另外，可以借助于NPTII引物、壳多糖酶1引物和毒素引物来进行PCR分析和/或RT-PCR分析。

实施例4

借助于载体257和258，桉树下胚轴和子叶的转化

植物材料：用70%乙醇表面消毒细叶桉（E.Tereticornis）的种子2分钟并用0.1%（w/v）氯化汞水溶液表面消毒10分钟，然后用灭菌蒸馏水洗涤三次。

在含有25ml种子萌发培养基的90×15-mm培养皿中并在无菌条件下发芽20个种子/平板，其中上述种子萌发培养基包含MS基础培养基，其由3%（w/v）蔗糖和0.8%（w/v）琼脂组成。

土壤杆菌属:包埋载体257或258的根癌农杆菌（A.tumefaciens）的LBA4404菌株用于转化。对在晚对数期（A600）收集的细菌培养物加以造粒并再悬浮在MS基础培养基中。

协议：分离7天幼苗的子叶和下胚轴外植体并用作用于转化实验的外植体。

用补充有0.5mg/l BAP和0.1mg/l NAA的MS再生培养基预培养外植体2天。

在细菌悬浮液中轻轻摇动预培养的子叶和下胚轴外植体10分钟并在无菌过滤纸上干印迹。其后，将它们转移到补充有0.5mg/l BAP和0.1mg/lNAA的MS再生培养基，时间为2天。

在共培养以后，在MS液体培养基中洗涤外植体，在无菌过滤纸上干印迹，并转移到MS再生培养基，其包含0.5mg/l BAP和0.1mg/l NAA并补充有40mg/l卡那霉素和300mg/l头孢氨噻肟。

以培养4-5周以后，从外植体的边缘观测再生。将外植体转移到在纸桥上的液体延伸培养基（MS培养基，补充有0.5mg/l BAP、40mg/l卡那霉素、和300mg/l头孢氨噻肟）。

将伸长的茎干（1.5-2cm）生根在具有1.0mg/l IBA和40mg/l卡那霉素的MS培养基中。

证实：为了证实转基因在植物中被表达，可以进行借助于NPTII抗体的蛋白质印迹分析。可以进行借助于NPTII引物、壳多糖酶1引物和毒素引物的进一步PCR分析和/或RT-PCR分析。

实施例5

测定毒性肽在桉树植物中的表达

寄生植物:赤桉（Eucalyptus camaldulensis）克隆118。

目标生物体：1.瘿蜂桉树枝瘿姬小蜂（Leptocibe invasa），2.瘿蜂桉干瘿姬小蜂（Ophelimus maskelli）。

借助于载体257、载体258或借助于仅用于对照的载体，来转化赤桉（E.camaldulensis）。在防虫笼中在温室下并连同成年瘿蜂一起生长转基因、野生型和对照桉树植物。防虫笼将接种物保持在其中，同时防止外部害虫进入笼中。在黄蜂接种以后，评估在叶脉和叶中虫瘿的出现。检查植物以确定虫瘿的数目、虫瘿尺寸（最大长度）、在虫瘿中活幼虫的数目、和出现成熟瘿蜂的数目。测试了转基因桉属植物（transgenic eucalyptus）的5个独立的转化事件。以3次独立重复，用成年瘿蜂接种每个转化事件的10个系。在接种以后的1、2、3和4个月，记录虫瘿的数目、虫瘿尺寸、活幼虫/10个虫瘿以及出现成体（按照出口孔（exit hole））。

实施例6

测定毒性肽在烟草植物中的表达

寄生植物：烟草

目标生物体：烟粉虱（Whitefly Bemisia tabaci）。

借助于载体257、258或借助于仅用于对照的载体来转化烟草（Nicotiana tabaccum）。

在防虫温室中生长转基因、野生型和对照烟草植物。将每个最好表达植物系（plant line）的3个重复放置在防虫笼中。将100只换羽同步（moult-synchronized）的烟粉虱（B.tabaci）收集在围绕一个叶建造的特殊容器中（3片叶/植物-总共81个特殊容器）。每3天，计数存活的烟粉虱（B.tabaci）以计算百分比死亡率。

实施例7

测定毒性肽在烟草植物中的表达

寄生植物：烟草。

目标生物体：鳞翅目，斜纹夜蛾（Spodoptera littoralis）。

借助于载体257或258或借助于仅用于对照的载体来转化烟草（Nicotiana tabaccum）。

在防虫温室中生长转基因、野生型和对照烟草植物。将每个最好表达植物系的3个重复放置在防虫笼中。将30只换羽同步的斜纹夜蛾（S.littoralis）放置在具有一片叶的培养皿中（3片叶/植物-总共81个特殊容器）。每天，计数存活的斜纹夜蛾（S.littoralis）以计算百分比死亡率。每天，记录对吃过叶的损害并与野生型和对照叶比较。对于蜕皮水平#1、#3和#5，重复这种生物测定。

结果

转录蜘蛛毒素和壳多糖酶建构物的转基因植物预期会呈现显著更高的斜纹夜蛾（S.Littoralis）死亡率并且不可见食叶损伤。与对照以及野生型植物（其被感染、完全吃掉并且不会引起斜纹夜蛾（S.Littoralis）死亡）相比，转基因植物系耐斜纹夜蛾（S.Littoralis）感染。

Claims (45)

1.一种分离的多核苷酸，包含：

（i）编码至少一种毒性肽的核酸序列，所述毒性肽是蜘蛛毒素；以及

（ii）编码连接于分泌信号序列的壳多糖酶的核酸序列。

2.一种分离的多核苷酸，包含：

（i）编码至少一种毒性肽的核酸序列，所述毒性肽不是壳多糖酶；以及

（ii）编码壳多糖酶的核酸序列。

3.根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中，所述毒性肽源自昆虫，所述昆虫选自由蜜蜂、黄蜂、蟑螂、丽蝇、蚊子、结网毛虫、甲虫、对映体、千足虫、螃蟹、龙虾、小虾、对虾、蜘蛛、蝎子、螨和蜱组成的组。

4.根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中，所述毒性肽源自蜘蛛。

5.根据权利要求1或4所述的分离的多核苷酸，其中，所述毒性肽包含利用国家生物技术信息中心（NCBI）的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO:9、15、24、30、55、56和57组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述毒性肽连接于植物凝集素。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述壳多糖酶并不连接于植物凝集素。

8.根据权利要求6所述的分离的多核苷酸，其中，所述植物凝集素包括雪花莲凝集素（GNA）。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述毒性肽连接于分泌信号序列。

10.根据权利要求2-9中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述壳多糖酶连接于分泌信号序列。

11.根据权利要求1、9或10中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述分泌信号序列由在SEQ ID NO:7、21和61-68中陈述的核酸编码。

12.根据权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中，所述壳多糖酶包含利用国家生物技术信息中心（NCBI）的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO:36、42和58-60组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的氨基酸序列。

13.根据权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中，所述至少一种毒性肽包括第一毒性肽和第二毒性肽，其中所述第一毒性肽靶向钠（Na_V）通道中的第一位点以及所述第二毒性肽靶向在所述Na_V通道中的第二位点。

14.根据权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中，所述至少一种毒性肽包括第一毒性肽、第二毒性肽和第三毒性肽，其中所述第一毒性肽靶向在钠（Na_V）通道中的第一位点，所述第二毒性肽靶向在所述Na_V通道中的第二位点以及所述第三毒性肽靶向在所述Na_V通道中的第三位点。

15.根据权利要求14所述的分离的多核苷酸，其中，所述第一毒性肽是P83591，所述第二毒性肽是P83558以及所述第三毒性肽是P11060。

16.根据权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中，所述至少一种毒性肽包括至少4种毒性肽，其中所述至少4种毒性肽中的第一种是P83591，所述至少4种毒性肽中的第二种是P83558，所述至少4种毒性肽中的第三种是P11060，所述至少4种毒性肽的第一种是P61095。

17.一种核酸构建物，包含根据权利要求1-16中任一项所述的分离的多核苷酸以及顺式调节元件。

18.一种核酸构建物系统，包括：

（i）第一核酸构建物，所述第一核酸构建物包含含有编码毒性肽的核酸序列的分离的多核苷酸以及顺式调节元件；以及

（ii）第二核酸构建物，所述第二核酸构建物包含含有编码壳多糖酶的核酸序列的分离的多核苷酸以及顺式调节元件。

19.根据权利要求18所述的核酸构建物系统，其中，所述毒性肽连接于植物凝集素。

20.根据权利要求18-19所述的核酸构建物系统，其中，所述毒性肽连接于分泌信号序列。

21.根据权利要求18-19所述的核酸构建物系统，其中，所述壳多糖酶连接于分泌信号序列。

22.一种分离的多肽，包含毒性肽，所述毒性肽包含利用国家生物技术信息中心（NCBI）的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQID NO:9、15、24、30、55和56-60组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的序列，所述毒性肽连接于植物凝集素。

23.根据权利要求22所述的分离的多肽，进一步包括分泌信号肽。

24.一种分离的多核苷酸，包含编码根据权利要求22-23所述的分离的多肽的核酸序列。

25.根据权利要求24所述的分离的多核苷酸，进一步包括编码壳多糖酶的核酸序列。

26.一种核酸构建物，包含根据权利要求24所述的分离的多核苷酸和顺式调节元件。

27.一种核酸构建物系统，包含：

（i）根据权利要求26所述的核酸构建物；以及

（ii）包含分离的多核苷酸的核酸构建物，所述分离的多核苷酸包含编码壳多糖酶的核酸序列。

28.根据权利要求17或26所述的核酸构建物，其中，所述顺式调节元件是启动子。

29.根据权利要求28所述的核酸构建物，其中，所述启动子是SVBV或sgFiMV。

30.根据权利要求28所述的核酸构建物，其中，所述启动子是植物启动子。

31.根据权利要求30所述的核酸构建物，其中，所述植物启动子是叶特异性启动子。

32.一种植物，包含根据权利要求17或26所述的核酸构建物。

33.一种植物，包含根据权利要求18或27所述的核酸构建物系统。

34.根据权利要求32或33所述的植物，是树。

35.根据权利要求34所述的植物，是桉树。

36.一种杀虫组合物，包含：

（i）毒性肽；以及

（ii）壳多糖酶。

37.一种杀虫组合物，包含根据权利要求22所述的分离的多肽。

38.一种控制或消灭昆虫的方法，所述方法包括在所述昆虫的寄生植物中表达根据权利要求1-12、24和25中任一项所述的分离的多核苷酸，从而控制或消灭所述昆虫。

39.一种控制或消灭昆虫的方法，所述方法包括在所述昆虫的寄生植物中表达分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码毒性肽的核酸序列，所述毒性肽选自由SEQ ID NO:9、15、24、30和55-57组成的组。

40.一种控制或消灭昆虫的方法，所述方法包括使所述昆虫与根据权利要求36或37所述的杀虫组合物接触，从而控制或消灭所述昆虫。

41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中，所述昆虫包括无柄瘿筑巢昆虫。

42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述无柄瘿筑巢昆虫包括瘿蜂。

43.根据权利要求38或39所述的方法，其中，利用包含叶特异性启动子的核酸构建物来进行所述表达。

44.根据权利要求38或39所述的方法，其中，所述寄生植物包括树。

45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述树是桉树。

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