CN103443270B - 用于在植物和植物细胞中表达α‑半乳糖苷酶的核酸构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了核酸表达构建体，更具体地，提供了用于在植物细胞中表达人α‑半乳糖苷酶的核酸构建体及其应用，所述细胞表达核酸构建体以产生人α‑半乳糖苷酶。

Description

用于在植物和植物细胞中表达α-半乳糖苷酶的核酸构建体
技术领域
本发明在其一些实施方式中涉及核酸表达构建体，并且更具体但不排它地，涉及用于表达植物细胞中α-半乳糖苷酶的核酸构建体及其应用，所述细胞表达核酸构建体和人α-半乳糖苷酶。
背景技术
法布里病（Fabry disease）是一种由溶酶体酶α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）的活性缺陷引起的伴X溶酶体贮积病。患有典型法布里病的患者通常具有的α-Gal A活性小于1%，并且通常表现出很多种症状，包括四肢剧痛（肢端感觉异常）、少汗、角膜和晶状体改变、皮肤损伤（血管角质瘤）、肾衰竭、心血管病、肺衰竭、神经症状、以及中风。在非典型的法布里病中，带有残余酶活性的个体在生命后期表现出症状，并且这些症状通常限于一个或几个器官。由于X染色体的随机失活，女性携带者的临床表现差异很大。尽管携带者通常保持整个生命期间无症状，然而许多携带者表现出与男性患者相同的可变性和严重性。De Duve首次提出用外源生物活性酶代替缺失的溶酶体酶可能是治疗溶酶体贮积病的可行方法[FedProc.23:1045(1964)]。
用于酶替代疗法的重组α-半乳糖苷酶A已经在昆虫（sf9）细胞（参见US 7,011,831）、人成纤维细胞（参见US 6,395,884）、以及植物细胞（参见US 6,846,968和WO 2008/132743）中产生。已经用重组α-Gal A（半乳糖苷酶β[Fabrazyme]）：GenzymeCorporation,Cambridge,Mass；半乳糖苷酶α[Replagal]：Shire Human GeneticTherapies Corporation,Cambridge,Mass）进行了临床试验，并且两种药物已经批准用于临床应用。自2009年起，多于2000例患者已经用这两种可用的制剂中的任一种治疗，总体而言，已经证明了这两种制剂的安全性和有效性（Hoffmann,Orphanet J RareDis.Dis.2009;4:21）。
临床经验已经表明：考虑到患者的耐受性、免疫原性、给药方案、以及临床疗效，可用的重组酶组合物有所不同（Hoffmann,Orphanet J Rare Dis.Dis.2009,4:21）。与现有重组酶相关的另一个缺点是它们的费用，这一缺点可以对健康管理系统造成沉重的经济负担。当在哺乳动物细胞培养物、生物反应器、或昆虫细胞中生产重组酶时，复杂的纯化、修饰方案和现有治疗所需的相当大量的治疗导致了这些重组酶的高成本。因此，迫切需要降低α-半乳糖苷酶的成本，使得这种挽救生命的治疗可以更低廉地向所有需要这种治疗的患者提供。
可以在转基因植物中生产人溶酶体酶以解决安全性、病毒感染、免疫反应、产物产率和成本的问题。US 2002/0088024教导了使用水稻-淀粉酶ER靶向信号肽以及在C端部分截短的人α-半乳糖苷酶编码序列在植物细胞中表达重组人α-半乳糖苷酶，所述人α-半乳糖苷酶编码序列用于有效表达和分泌到细胞内液。
WO 97/10353教导了使用创伤诱导（wound-induced）MeGA启动子和用于恢复的FLAG标签在植物中生产溶酶体酶，尤其是IDUA和葡糖脑苷酯酶。WO 97/10353没有提供用于表达重组人α-半乳糖苷酶特定构建体的指导。
Cramer等（Curr.Topics Trans.1999 Plants95-118）以与WO 97/10353类似的方式重复了在植物细胞中，即在烟叶的内膜（IF）中葡糖脑苷酯酶和IDUA表达的方法，并且大体上描述了植物表达，但是没有提供用于人重组α-半乳糖苷酶的指导。
US2006-0204487教导了用于在植物细胞中表达人溶酶体酶的方法，针对用于有效糖基化和聚糖重建（remodel）的靶向重组多肽（尤其是葡糖脑苷酯酶），所述方法使用了多种策略。没有披露由特异性构建体克隆与表达重组人α-半乳糖苷酶。
WO2007/010533教导了表达重组生物活性分子的植物细胞的施用，所述生物活性分子如溶酶体酶（如人葡糖脑苷酯酶和人α-半乳糖苷酶）。没有披露重组人α-半乳糖苷酶的克隆与表达。
WO 2008/132743描述了将人α-半乳糖苷酶编码序列克隆在植物表达载体中，并描述了其在烟草细胞中的表达，产生了具有生物活性的全长糖基化α-半乳糖苷酶，证明了所述α-半乳糖苷酶在成纤维细胞中的吸收。然而，需要在临床条件下进一步提高具有改善的药代动力学（pharmacokinetics）的重组人α-半乳糖苷酶蛋白的表达和生产效率的更先进的α-半乳糖苷酶表达载体。
发明内容
根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了一种核酸表达构建体，所述构建体包括编码人α-半乳糖苷酶蛋白的核酸序列，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在N端被翻译融合至拟南芥ABPI内质网靶向信号肽，并且其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻译融合至内质网滞留（retention）信号肽。
根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了具有N端甘氨酸残基的人α-半乳糖苷酶蛋白，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻译融合至内质网滞留信号肽。
根据本发明的一些实施方式，核酸序列包括SEQ ID NO:22。
根据本发明的一些实施方式，拟南芥ABPI内质网靶向信号肽如SEQ ID NO:4中所示。
根据本发明的一些实施方式，核酸构建体包括如SEQ ID NO:5中所示的编码内质网靶向信号肽的核酸序列。
根据本发明的一些实施方式，内质网滞留信号肽如SEQ ID NO:6中所示。
根据本发明的一些实施方式，核酸构建体包括如SEQ ID NO:19中所示的编码内质网滞留肽的核酸序列。
根据本发明的一些实施方式，核酸序列具有如SEQ ID NO:2中所示的序列。
根据本发明的一些实施方式，人α-半乳糖苷酶蛋白具有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方式，核酸序列的密码子使用是针对烟草（Nicotiniatabaccum）优化的。
根据本发明的一些实施方式的一些方面，提供了包括本发明的核酸构建体的分离细胞。
根据本发明的一些实施方式，细胞重组产生人α-半乳糖苷酶。
根据本发明的一些实施方式，人α-半乳糖苷酶包括N端甘氨酸残基。
根据本发明的一些实施方式，细胞是植物细胞。
根据本发明的一些实施方式，植物细胞是烟草细胞。
根据本发明的一些实施方式，烟草细胞是BY-2细胞。
根据本发明的一些实施方式，人α-半乳糖苷酶蛋白重组产生，以具有至少一个暴露的甘露糖残基。
根据本发明的一些实施方式，人α-半乳糖苷酶蛋白重组产生，以具有至少一个核β-(1,2)木糖、或至少一个核α-(1,3)岩藻糖、或者至少一个核β-(1,2)木糖和至少一个核α-(1,3)岩藻糖。
根据本发明的一些实施方式，核酸构建体稳定整合在细胞的基因组中。
根据本发明的一些实施方式，细胞是根癌土壤杆菌（农杆菌，（Agrobacteriumtumefaciens）细胞。
根据本发明一些实施方式的一方面，提供了生产重组人α-半乳糖苷酶蛋白的方法，所述方法包括：提供根据本发明的细胞，然后培养所述细胞以产生所述重组人α-半乳糖苷酶蛋白，以及从所述细胞中分离所述重组人α-半乳糖苷酶蛋白。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞是在细胞培养基中培养的分离细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述培养是在一次性生物反应器中进行的。
根据本发明的一些实施方式，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有如在SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。
根据本发明一些实施方式的一方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的本发明的人α-半乳糖苷酶蛋白和药用载体。
根据本发明一些实施方式的一方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的本发明的细胞和药用载体。
根据本发明一些实施方式的一方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的本发明的人α-半乳糖苷酶蛋白的群体以及药用载体，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白的群体的主要聚糖结构是甘露糖4-β-(1,2)木糖（M4X）、甘露糖3-β-(1,2)木糖-α-(1,3)岩藻糖[Fc(3)M3X]、以及甘露糖8（M8）。
根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了在需要其的受试者中治疗法布里病的方法，所述方法包括给予受试者本发明的药物组合物。
根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包括本发明的人α-半乳糖苷酶蛋白以及药用载体，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有包括9个甘露糖残基并且其中3个是暴露的甘露糖残基的聚糖结构。具有包括9个甘露糖残基并且其中3个是暴露的甘露糖残基的聚糖结构的人α-半乳糖苷酶蛋白可以组成0.5%、0.8%、1.0%、1.3%、2%以上的人α-半乳糖苷酶蛋白的群体。
根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了在需要其受试者中治疗法布里病的方法，所述方法包括给予受试者包括本发明的细胞的药物组合物。
根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了本发明的人α-半乳糖苷酶蛋白在制备用于在需要其的受试者中治疗法布里病的药物中的应用。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和/或科学术语与本发明所属领域的任何普通技术人员通常理解的具有相同的意义。虽然类似于或等价于本文中描述的那些的方法和材料可以用于本发明的实施方式的实施或试验，但是如下描述了示例性的方法和/或材料。在矛盾的情况下，专利说明书包括定义将用于对照。此外，材料、方法、以及实施例仅是示例性的，并非旨在必要的限制。
附图说明
参照附图，仅通过实施例在本文中描述了本发明的一些实施方式。现在具体参照详细的附图，强调了通过实例的方式示出细节，并且这些细节是为了示例性地讨论本发明的实施方式。在这点上，利用附图进行的描述使得可以如何实施本发明的实施方式对本领域技术人员而言是显而易见的。
在附图中：
图1是由本发明的核酸编码的α-半乳糖苷酶（SEQ ID NO:1，下面序列）与包括天然信号前导肽（SEQ ID NO:3，以红色突出显示）的天然人α-半乳糖苷酶蛋白（基因库：X05790，上面的序列）的氨基酸序列的排列。拟南芥ABPI内质网靶向信号肽（SEQ ID NO:4）以绿色突出显示。SEKDEL内质网滞留信号肽（SEQ ID NO:6）位于植物表达蛋白的C端。成熟的天然α-半乳糖苷酶蛋白序列（SEQ ID NO:7）以黄色突出显示。
图2是示出植物细胞中不同人α-半乳糖苷酶构建体表达水平的SDS-PAGE凝胶扫描。用不同的人α-半乳糖苷酶构建体浸润（infiltrate）的本氏烟（N.benthamaina）植物叶片的提取物在12%的SDS-PAGE还原凝胶上分离，并且使用用于蛋白可视化的考马斯蓝染色。泳道（lane）1=编码具有苹果果胶酶内质网靶向信号肽（苹果果胶酶信号肽=SEQ ID NO:9）的α-半乳糖苷酶构建体（SEQ ID NO:8）的表达产物。泳道2=编码具有ABPI内质网靶向信号肽（ABPI信号肽=SEQ ID NO:4）的α-半乳糖苷酶的SEQ ID NO：2的表达产物。泳道3=编码具有苹果果胶酶内质网靶向信号肽（SEQ ID NO:9）的SEQ ID NO：12的SEQ ID NO:11的表达产物。泳道4=阴性（没有α-半乳糖苷酶编码序列）对照。泳道2中的突出带（箭头）对应成熟重组α-半乳糖苷酶单体的大小（SEQ ID NO:21）。考马斯染色带显示丰富的α-半乳糖苷酶蛋白；
图3是示出表达不同人α-半乳糖苷酶构建体的植物提取物中催化活性水平的柱状图。本氏烟植物的叶片用如下的不同人α-半乳糖苷酶构建体浸润：A=SEQ ID NO:8，其编码具有苹果果胶酶内质网靶向信号肽（苹果果胶酶信号肽=SEQ ID NO:9）的α-半乳糖苷酶蛋白。B=SEQ ID NO:2，其编码具有ABPI内质网靶向信号肽（ABPI信号肽=SEQ ID NO:4）的α-半乳糖苷酶蛋白。C=SEQ ID NO:13，其编码具有内切壳多糖酶B内质网靶向信号肽（内切壳多糖酶信号蛋白=SEQ ID NO:14）的α-半乳糖苷酶蛋白。D=SEQ ID NO:11，其编码具有苹果果胶酶内质网靶向信号肽（苹果果胶酶信号序列=SEQ ID NO:9）的α-半乳糖苷酶蛋白（SEQ IDNO:12）。在活性检测缓冲液中提取各植物的叶片，使用对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷（pNP-α-D-Gal,GBB1290,IRIS Biotech,Germany）作为水解基质（substrate）测定催化活性。在405nm下监测对硝基苯酚酯/盐生色团的生成。
图4是通过残基的催化活性测定的人血浆（37℃）中两种植物重组人α-半乳糖苷酶稳定性的比较图。用SEQ ID NO:11转化的本氏烟植物叶片中的α-半乳糖苷酶，所述SEQ IDNO:11编码具有苹果果胶酶内质网靶向信号肽（空心方形）的SEQ ID NO:12；以及用SEQ IDNO:2转化的本氏烟植物叶片中的α-半乳糖苷酶，所述SEQ ID NO:2编码具有ABPI内质网靶向信号肽（实心方形）的α-半乳糖苷酶（SEQ ID NO:1），通过植物破碎、盐析、以及层析纯化，并在37℃下的人血浆中温育至多达1小时以模拟体内药代动力学。在指定的时间间隔内，通过PNP-G检测测定样品的α-半乳糖苷酶的催化活性。记录表达SEQ ID NO:1（实心方形）的本氏烟植物叶片中α-半乳糖苷酶的较大的稳定性。
图5是植物细胞中表达的α-半乳糖苷酶（实心方形）与人细胞培养物中表达的商用人重组α-半乳糖苷酶（Replagal，空心三角形）催化活性稳定性的比较图。表达SEQ IDNO:2的BY2细胞的未纯化提取物，所述SEQ ID NO:2编码具有ABPI内质网靶向信号肽（实心方形）的α-半乳糖苷酶（SEQ ID NO:1）；以及在哺乳动物细胞培养物（Replagal，空心三角形）中表达的人重组α-半乳糖苷酶在37℃的血浆中温育至多达1小时以模拟体内药代动力学。在指定的时间间隔内，通过PNP-G检测测定样品的α-半乳糖苷酶的催化活性。记录植物细胞表达酶和人细胞表达酶的相似稳定性。
图6是植物细胞中表达的α-半乳糖苷酶（实心方形）与人细胞培养（Replagal，空心三角形）中表达的商用人重组α-半乳糖苷酶的催化活性的稳定性比较图。表达SEQ IDNO:2的BY2细胞的未纯化提取物，所述SEQ ID NO:2编码具有ABPI内质网靶向信号肽（实心方形）的α-半乳糖苷酶（SEQ ID NO:1）；以及在哺乳动物细胞培养物（空心三角形）中表达的人重组α-半乳糖苷酶在37℃下的模拟溶酶体环境[酸性（pH4.6）]的条件下温育11天。当温育时，在指定的时间间隔内，通过PNP-G检测测定样品的α-半乳糖苷酶的催化活性。记录植物表达酶和哺乳动物表达酶至多达9天的相似稳定性。
图7是示出植物细胞表达的α-半乳糖苷酶的糖基酶消化产物中聚糖结构分布的彩图。还原、烷基化、并在SDS-PAGE上分离表达SEQ ID NO:2的BY2细胞提取物样品，所述SEQID NO:2编码具有ABPI内质网靶向信号肽的α-半乳糖苷酶（SEQ ID NO:1）。通过胰蛋白酶消化，随后用PNGase A（肽N-糖苷酶A）和PNGase F（肽N-糖苷酶F）消化，采用蛋白带进行聚糖分析。萃取、纯化、用荧光试剂邻氨基苯甲酰胺（2AB）标记、使用TSK凝胶酰胺80正相HPLC分离、并使用荧光检测器检测生成的自由聚糖。记录在5.9GU和8.9GU（84.55分钟和108.05分钟）处的主锋，以及在112.35处的次峰（minor peak）M9；
图8是示出植物细胞表达α-半乳糖苷酶的聚糖分布（profile）的表格，所述聚糖分布表示为图7的彩图中表示的单个聚糖的百分比面积。记录各次单独分析（A和B）的相同分布。
具体实施方式
在本发明的一些实施方式中涉及用于在植物细胞中重组表达人α-半乳糖苷酶的表达载体、用于在植物细胞中表达人α-半乳糖苷酶的方法、以及由此产生的人α-半乳糖苷酶。
应当理解，本发明并非将其应用必要地限于如下描述中所给出的或由实施例举例说明的细节。本发明可以是其它实施方式，或能够以各种方式实施或进行。
本发明人已构建了用于在植物细胞中重组表达人α-半乳糖苷酶的表达载体，用载体转化的烟草植物和植物细胞，并且从植物和细胞培养物中催化分离了活性人α-半乳糖苷酶。表达的重组人α-半乳糖苷酶在模拟通常体内施用所存在的条件下保持良好的催化活性，这表明与其它源于植物的重组人α-半乳糖苷酶相比，其具有改善的模拟药代动力学，并且与那些哺乳动物表达的重组人α-半乳糖苷酶相似。
因此，根据本发明的一方面，提供了核酸表达构建体，所述构建体包括编码人α-半乳糖苷酶蛋白的核酸序列，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在N端被翻译融合至拟南芥ABPI内质网靶向信号肽，并且其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻译融合至内质网滞留信号肽。
如在本文中使用的，术语“人α-半乳糖蛋白”是指人α-半乳糖苷酶A（α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶；EC3.2.1.22；α-Gal A）多肽。根据本发明的一些实施方式，人α-半乳糖苷酶蛋白是具有如SEQ ID NO:7（成熟人A-Gal）所示的氨基酸序列的成熟人α-半乳糖苷酶蛋白。将理解，人α-半乳糖苷酶蛋白可以是改变的人α-半乳糖苷酶蛋白，具有不同于SEQ ID NO:7的氨基酸序列。由本发明的表达载体编码的改变的人α-半乳糖苷酶蛋白的一个非限制性实例是SEQ ID NO:16（G-A-Gal）。在另一个非限制性实例中，由表达载体编码的人α-半乳糖苷酶可以是包括具有N端甘氨酸残基（G）如SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:21，以及不具有N端甘氨酸残基如，但不限于，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:20的α-半乳糖苷酶蛋白的人α-半乳糖苷酶蛋白混合物。
根据本发明的另一方面，人α-半乳糖苷酶蛋白在N端被翻译融合在拟南芥ABPI内质网靶向信号肽，并且人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻译融合在内质网滞留信号肽。
如在本文中使用的，术语“在N端翻译融合”或“在C端翻译融合”指的是指定的肽通过肽键共价连接至成熟人α-半乳糖苷酶蛋白的N端氨基酸或C端氨基酸，作为重组表达的结果。
如在本文中使用的，术语“拟南芥ABPI内质网靶向信号肽”是指拟南芥（Arabidopsis thaliana）生长素结合蛋白的前导肽序列（Uni-Prot登记号：P33487），所述前导肽序列能够直接表达在植物细胞内的内质网中。在一个实施方式中，拟南芥ABPI内质网靶向信号肽是如SEQ ID NO:4所示的33个氨基酸的多肽。
如在本文中使用的，术语“内质网滞留信号肽”是指当存在于多肽的N端或C端时引起多肽从高尔基体中返回（retrieve），并保留在内质网中的多肽序列（参见Rayon等，Journal of Experimental Botany,Vol.49,No.326,pp.1463-1472,1998；以及Neumann等Annals of Botany,2003;92:167-180）。在一个实施方式中，内质网滞留信号肽是KDEL（SEQID NO:17）或SEKDEL（SEQ ID NO:6）。本领域已知其它合适的植物内质网信号（参见Pagny等，Journal of Experimental Botany,Vol.50,pp.157-64）。
因此，根据本发明的一个实施方式，在N端被翻译融合至拟南芥ABPI内质网靶向信号肽的人α-半乳糖苷酶蛋白，并且在C端被翻译融合至内质网滞留信号肽的人α-半乳糖苷酶蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
如在本文中使用的，术语“核酸序列”是指能够分离和以RNA序列、互补多核苷酸序列（cDNA）、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列（例如，以上序列的组合）形式提供的单链核酸序列或双链核酸序列。
如在本文中使用的短语“互补多核苷酸序列”是指使用反转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶由信使RNA的反转录得到的序列。这种序列随后可以使用DNA依赖性DNA聚合酶在体内或体外扩增。
如在本文中使用的短语“基因组多核苷酸序列”是指源于（分离自）染色体的序列，从而它代表染色体的连续部分。
如在本文中使用的短语“复合多核苷酸序列”是指其为至少部分互补的并且至少部分基因组的序列。复合序列可以包括一些编码本发明的多肽需要的外显子序列，以及插入在其中的一些内含子序列。内含子序列可以是包括其它基因的任何来源，并且通常将包括保守剪接信号序列。这种内含子序列还可以包括顺式作用表达调控元件。
根据本发明的一些实施方式，编码本发明多肽的核酸序列是用于表达的最佳序列。这种序列改变的实例包括，但不限于，改变G/C含量以更接近通常在关注的植物中确定的含量，以及去除在植物中发现的非典型密码子，通常被称为密码子优化。在一个实施方式中，编码人α-半乳糖苷酶蛋白的核酸序列的密码子使用是用于烟草或本氏烟的优化密码子，所述人α-半乳糖苷酶在N端被翻译融合至拟南芥ABPI内质网靶向信号肽，并且所述人α-半乳糖苷酶在C端被翻译融合至内质网滞留信号肽。
短语“密码子优化”是指选择适当的DNA核苷酸用于结构基因或其片段内，其接近在关注的植物内的密码子使用。因此，优化的基因或核酸序列是指其中已将原始或天然存在的基因改变以在植物中利用统计学优选的或统计学有利的密码子的基因。通常在DNA水平以及用于在植物中表达的优化编码区检查核苷酸序列，使用任何合适的程序测定，例如在Sardana等（1996，Plant Cell Reports15:677-681）中描述的。在该方法中，首先可以通过找到相对于高度表达的植物基因，天然基因的每个密码子的使用的比例方差，随后计算平均方差来计算密码子使用的标准偏差（一种密码子使用偏性的测度）。使用的公式是：1SDCU=n=1 N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn是指在高表达的植物基因中密码子n的使用频率，Yn是指在关注的基因中的密码子n的使用频率，并且N是指关注的基因中的密码子的总数。来自双子叶植物的高表达基因中的密码子使用的表格是利用Murray等（1989，Nuc AcidsRes.17:477-498）的数据编译的。
根据用于特定植物细胞类型的优选密码子使用的核酸序列优化的一个方法基于直接使用密码子优化表，如通过日本的NIAS（National Institute of AgrobiologicalSciences）DNA库（Hypertext Transfer Protocol Hypertext Transfer ProtocolHypertext Transfer Protocol://World Wide Web(dot)kazusa(dot)or(dot)jp/codon/）在密码子使用资料库（Codon Usage Database）在线提供的那些，而没有进行任何额外的统计计算。密码子使用数据库包括用于许多不同物种的密码子使用表，每个密码子使用表已经基于存在于基因库中的数据进行统计学测定。
通过利用上述表格以测定针对在特定物种（例如，水稻）中的每种氨基酸的最优选或最有利的密码子，编码关注的蛋白的天然存在的核苷酸序列可以是针对特定植物品种的优化密码子。这是通过取代那些可能在具有相应密码子的特定物种的基因组中具有低统计学发生率的密码子实现的，就氨基酸而言，那些是统计学更有利的。然而，可以选择一种或多种不太有利的密码子以删除现有的限制性位点，从而在潜在有用的连接（5′和3′端以增加信号肽或终止盒，可能用于切断和剪接区段以产生正确的全长序列的内部位点）处创建新的连接，或者除去可能对mRNA稳定性或表达产生负面影响的核苷酸序列。
在任何改变之前，期望的编码核苷酸序列可以已经包含相应于在特定植物品种中统计学有利的密码子的许多密码子。因此，天然核苷酸序列的密码子优化可以包括：在期望的核苷酸序列内确定对于特定植物而言统计学不利的密码子，以及根据特定植物的密码子使用表改变这些密码子以产生密码子优化衍生物。改变的核苷酸序列可以针对植物密码子使用完全或部分优化，条件是由改变的核苷酸序列编码的蛋白以比由相应天然产生或原始基因编码的蛋白更高的水平产生。通过改变密码子使用构建的合成基因描述于，例如，PCT专利申请93/07278中。
根据本发明的一些实施方式，通过如SEQ ID NO:18所示的核酸序列编码人α-半乳糖苷酶蛋白。根据本发明的进一步的实施方式，通过如SEQ ID NO:5所示的核酸序列编码拟南芥ABPI内质网靶向信号肽。根据本发明的还进一步的实施方式，通过如SEQ ID NO:19所示的核酸序列编码内质网滞留信号肽。因此，根据本发明的又进一步的实施方式，通过如SEQ ID NO:2所示的核酸序列编码在N端被翻译融合在拟南芥ABPI内质网靶向信号肽的人α-半乳糖苷酶蛋白，并且在C端被翻译融合在内质网滞留信号肽的人α-半乳糖苷酶蛋白。
如在本文中使用的，术语“核酸表达构建体”是指包括本发明的一些实施方式的核酸（例如，SEQ ID NO:2）和至少一种用于在宿主植物细胞中直接转录核酸的启动子的核酸构建体。在下文中进一步详细地提供了合适的转化方法。
根据本发明的一些实施方式，提供了包括本发明的核酸序列以及用于在植物宿主细胞中直接转录核酸序列的核酸构建体。
根据本发明的一些实施方式，核酸可操作地连接至启动子序列。
如果调节序列能够在连接至其上的编码序列发挥调节作用，编码核酸序列是“可操作地连接”至调节序列（例如，启动子）。
本发明的核酸构建体可以使用任何合适的启动子序列。优选地，启动子是组成型启动子、组织特异性启动子、或诱导型启动子。
如在本文中使用的，短语“植物可表达”是指包括加入其中或包含在其中的任何另外的调控元件的启动子序列是至少能够诱导、赋予、激活、或增强植物细胞、组织、器官，优选单子叶植物或双子叶植物细胞、组织、或器官中的表达。这种启动子可以是组成型，即在多种组织中能够直接高水平基因表达；组织特异性的，即在特定的一种或多种组织中能够直接基因表达；可诱导的，即在刺激下能够直接基因表达；或嵌合的，即由至少两种不同的启动子部分形成。
可用于本发明的一些实施方式中的方法的优选启动子的实例显示在表I、表II、表III、和表IV中。
表I
用于进行本发明的一些实施方式的示例性组成型启动子
表II
用于进行本发明的一些实施方式的示例性种子优选启动子
表III
用于进行本发明的示例性花特异性启动子。
表IV
用于进行本发明的可替代水稻启动子
根据具体实施方式，本发明使用的启动子是强组成型启动子，以使构建体插入的过表达通过以下转化实现。在某些实施方式中，启动子是拟南芥肌动蛋白2（ACT2）启动子（登记号：U41998，参见以上表I）。
本发明的一些实施方式的核酸构建体可进一步包括适当的选择标记物和/或复制起点。根据本发明的一些实施方式，使用的核酸构建体是穿梭载体，所述穿梭载体既可以在大肠杆菌（其中所述构建体包括适当的选择标记物和复制起点）中增殖，又可以与细胞增殖相容。根据本发明的构建体可以是，例如，质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。
可以利用本发明的一些实施方式的核酸构建体以稳定地或或瞬时地转化植物细胞。在稳定转化中，将核酸整合在植物基因组中，以使它表现出稳定的遗传性状。在瞬时转化中，通过转化的细胞表达外源多核苷酸而没有将其整合在基因组中，以使它表现出瞬时性状。
因此，根据本发明的一些方面，提供了包括本发明核酸构建体的分离细胞。
如在本文中使用的，术语“分离细胞”是指至少部分与自然环境如植物分离的细胞。在一些实施方式中，分离细胞是整个植物的植物细胞。在一些实施方式中，分离细胞是植物细胞，例如，培养物中的植物细胞。
本文所用术语“植物”包括整个植物、植物的祖代和后代以及植物部分，包括种子、芽、茎、根（包括块茎）、以及植物细胞、组织和器官。植物可以是任何形式，包括悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉以及小胞子。在本发明方法中尤其有用的植物包括所有属于植物总科的植物，尤其是单子叶和双子叶植物，所述单子叶和双子叶植物包括饲料或豆科牧草、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，所述植物选自包括以下的清单，包括：金合欢属、枫属、猕猴桃属、七叶树属、澳大利亚贝壳杉（Agathis australis）、合欢属、三色桫椤属、须芒草属、落花生属、槟榔、Astelia fragrans、鹰嘴紫云英（Astragaluscicer）、多小叶红苏木（Baikiaea plurijuga）、桦木属、芸苔属、木榄、伯克苏木（Burkeaafricana）、多叶状紫铆属、Cadaba farinosa、朱缨花属、野茶树、美人蕉、辣椒属、桂皮属、距瓣豆、木瓜属（Chacoomeles spp.）、肉桂、阿拉比卡咖啡（Coffea arabica）、可乐豆（Colophospermum mopane）、绣球小冠花（Coronillia varia）、枸子、山楂属、瓜属、柏属、白粉桫椤蛛（Cyathea dealbata）、榅桲、日本柳杉、香茅属、白粉桫椤蛛（Cyathea dealbata）、榅桲、黄檀属、骨碎补属、山马蝗属、新西兰树蕨、Dibeteropogon amplectens、迪奥豆属、镰扁豆属、Dorycnium rectum、金字塔稗、Ehraffia spp.、穇子、Eragrestis spp.、刺桐属、桉属、假乌木属、金茅属vi/losa、Pagopyrum spp.、费约果、草莓属、千斤拔属、藤露兜属、童氏老鹳草（Geranium thunbergii）、银杏、罗德毛豆、南洋樱属（Gliricidia spp.）、陆地棉、银桦属、古夷布提木属、岩黄芪属（Hedysarum spp.）、Hemaffhia altissima、Heteropogoncontoffus、大麦、红苞茅草、金丝桃属、Hypeffhelia dissolute、Indigo incamata、鸢尾、刘夙（Leptarrhena pyrolifolia）、胡枝子属（Lespediza spp.）、莴苣属（Lettuca spp.）、银合欢属、单罗得草（Loudetia simplex）、Lotonus bainesli、莲属、硬皮豆属、苹果属、木薯、紫花苜蓿、水杉（Metasequoia glyptostroboides）、芭蕉属、烟草属、红豆草（Onobrychis spp.）、鸟足豆属（Ornithopus spp.）、稻属、非洲双翼豆、狼尾草属、牛油果、矮牵牛属、菜豆属、长叶刺葵、新西兰麻纤维、石楠属、白云杉、松属、豌豆、桃柘罗汉松（Podocarpus totara）、Pogonarthria fleckii、杨属、牧豆树属、黄杉属、老虎刺属（Pterolobium stellatum）、洋梨、栎属、厚叶石斑木（Rhaphiolepsis umbellata）、尼卡棕榈树（Rhopalostylis sapida）、纳塔尔漆树（Rhus natalensis）、欧洲醋栗（Ribesgrossularia）、茶藨子属、刺槐、蔷薇属、悬钩子属、柳属、Schyzachyrium sanguineum、Sciadopitys vefficillata、红杉、巨杉、双色高粱、菠菜属、鼠尾粟属（Sporobolusfimbriatus）、Stiburus alopecuroides、柱花草（Stylosanthos humilis）、葫芦茶属、落羽松、阿拉伯黄背草、三叶草属、小麦属、加州铁杉、越桔属、野豌豆属、葡萄、Watsoniapyramidata、马蹄莲、玉米、苋菜、朝鲜蓟、芦笋、绿花椰菜、球芽甘蓝、卷心菜、油菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝、亚麻、无头甘蓝（kale）、扁豆、油菜（oilseed rape）、秋葵、洋葱、马铃薯、水稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、壁球茶、玉米、小麦、大麦、黑麦、燕麦、花生、豌豆、扁豆、和苜蓿、棉花、油菜籽、卡诺拉（canola）、胡椒、向日葵、烟草、茄子、桉树、乔木、观赏植物、多年生牧草、和饲料作物。可替代地，藻类和其它非植物可以用于本发明方法中。
根据本发明的一些实施方式，本发明方法使用的植物或植物细胞是作物或作物细胞，如水稻、玉米、小麦、大麦、花生、马铃薯、芝麻、橄榄树、棕榈油、香蕉、大豆、向日葵、卡诺拉、甘蔗、苜蓿、粟、豆科（豆子、豌豆）、亚麻、羽扇豆、油菜籽、烟草、白杨、和棉花。
根据进一步的实施方式，所述植物细胞包括烟草细胞、发根土壤杆菌（发根农杆菌，Agrobacterium rihzogenes）转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞以及胡萝卜细胞。在一个实施方式中，所述烟草细胞来自烟草细胞系，如，但不限于，烟草L.cv金黄烟（BY-2）细胞（Nagata等,Int Rev Cytol1992;132:1-30）。可以根据任何适宜的培养方法培养植物细胞，所述培养方法包括，但不限于，在固体表面（如，例如，塑料培养管或塑料培养盘）上或悬浮液中培养。值得注意的是可以在悬浮液中培养和生长一些细胞如BY-2和胡萝卜细胞。本领域已知用于在悬浮液中培养植物细胞的适宜装置和方法，例如在国际专利申请PCTWO98/13469、WO2005/080544以及WO2007/010533中所描述的。在又一个实施方式中，所述细胞是包括，烟草植株的整株烟草或植物组织的细胞，但不限于，本氏烟。
存在多种方法可以将外源基因引入单子叶和双子叶植物中（Potrykus,I.,Annu.Rev.Plant.Physiol.,Plant.Mol.Biol.(1991)42:205-225;Shimamoto等,Nature(1989)338:274-276）。
引起外源DNA稳定整合在植物基因组DNA中的原理方法包括两个主要方法：
（i）土壤杆菌（农杆菌）介导的基因转移：Klee等（1987)Annu.Rev.PlantPhysiol.38:467-486;Klee and Rogers,Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants，卷6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,eds.Schell,J.,and Vasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego San Diego,Calif.(1989)p.2-25;Gatenby,PlantBiotechnology,eds.Kung,S.and Arntzen C.J.,Butterworth Publishers,Boston,Mass.(1989)p.93-112。
（ii）直接DNA摄取：Paszkowski等，Cell Culture and Somatic Cell Geneticsof Plants，卷6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds.Schell,J.,andVasil L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.52-68；包括用于将DNA直接摄取至原生质体中的方法，Toriyama,K.等，(1988)Bio/Technology6:1072-1074。通过植物细胞短暂电击引起的DNA吸收：Zhang et al.Plant Cell Rep.(1988)7:379-384。Fromm等，Nature(1986)319:791-793。通过以下方法将DNA注射至植物细胞中：粒子轰击，Klein等，Bio/Technology(1988)6：559-563；McCabe等，Bio/Technology(1988)6：923-926；Sanford，Physiol.Plant.(1990)79：206-209；利用微量吸液系统：Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.(1987)75：30-36；Neuhaus and Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79：213-217；细胞培养物、胚、或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化，美国专利号5,464,765，或者通过DNA与发芽花粉直接温育，DeWet等，Experimental Manipulation ofOvule Tissue，eds.Chapman，G.P.and Mantell，S.H.and Daniels，W.Longman，London，(1985)p.197-209；以及Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：715-719。
土壤杆菌(农杆菌)系统包括质粒载体的应用，质粒载体包含整合在植物基因组DNA中的定义的DNA区段。植物组织的接种方法根据植物品种和土壤杆菌(农杆菌)递送系统而改变。广泛使用的方法是叶盘程序，其可以利用向全植物分化的开始提供良好来源的任何组织块。参见，例如Horsch et al.Plant Molecular Biology Manual A5，KluwerAcademic Publishers，Dordrecht(1988)p.1-9。另一种方法使用土壤杆菌(农杆菌)递送系统与真空浸润的结合。土壤杆菌(农杆菌)系统在产生转基因双子叶植物中是特别可行的。
存在多种DNA直接转移至植物细胞中的方法。在电穿孔中，将原生质体短暂地暴露于强电场中。在显微注射中，利用非常小的微量吸液管将DNA机械地直接注入至细胞中。在粒子轰击中，将DNA吸附在微粒(如硫酸镁晶体或钨粒)上，并将微粒物理地加速进入细胞或植物组织中。
实施下列稳定转化植物繁殖。最普通的植物繁殖的方法是通过种子。然而，通过种子繁殖的再生由于杂合性在作物中缺少一致性而具有缺陷，这是因为种子是根据取决于孟德尔法则的遗传差异由植物产生的。基本上，每个种子在遗传学上是不同的，并且每个将伴随其自身的特定状生长。因此，优选产生转基因植物以使得再生植物具有与亲本转基因植物一样的性状和特征。因此，优选通过提供快速的、一致的转基因植物繁殖的微体繁殖来再生转基因植物。
微体繁殖是由已从所选择的亲本植株或栽培种上切除的单片组织培育新一代植物的方法。该方法允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物进行大量繁殖。所生产的新一代植物与原植物是基因相同的，并且具有原植物的所有特征。微体繁殖使得优质植物材料能够在短时间内大量生产，并在保存原转基因植物或转化植物的特征的条件下提供所选择的栽培种的快速增殖。克隆植物的优点是植物增殖的速度以及所生产的植物的品质和一致性。
微体繁殖是多步骤方法，其需要在步骤之间改变培养基或生长条件。从而，微体繁殖方法包括四个基本步骤：步骤一、最初的组织培养；步骤二、组织培养增殖；步骤三、分化和植株形成；步骤四、温室栽培和硬化。在步骤一期间，最初的组织培养，建立组织培养并且证实无污染物。在步骤二期间，最初的组织培养增殖直至产生足够的组织样品量以达到生产目标。在步骤三期间，将在步骤二中培养的组织样品分开，培育成单独的小植株。在步骤四中，将转化的小植株转移到温室以硬化，在温室中小植株对光的耐受性逐渐增强以使其能够在自然环境中生长。
根据本发明的一些实施方式，通过瞬时转化叶细胞、分生细胞、或整个植株而产生转基因植物。
瞬时转化可以通过如上所述的DNA直接转移法或利用改变的植物病毒进行病毒感染中的任一个实现。
已经显示为对植物宿主转化有用的病毒包括CaMV、烟草花叶病毒(TMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、以及菜豆普通花叶病毒(BV或BCMV)。在美国专利号4,855，237(菜豆金黄花叶病毒；BGV)、EP-A 67,553(TMV)、日本公开申请号63-14693(TMV)、EPA 194,809(BV)、EPA 278,667(BV)；以及Gluzman，Y et al.，Communications in Molecular Biology：ViralVectors，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，pp.172-189(1988)中描述了使用植物病毒对植物的转化。WO 87/06261中描述了用于在多种宿主(包括植物)中表达外源DNA的假病毒颗粒。
根据本发明的一些实施方式，用于瞬时转化的病毒是无毒性的，因而不能够引起严重的症状如降低的生长速率、花叶症、环斑、卷叶、黄化、斑纹、痘形成、构造、肿瘤形成以及凹斑。合适的无毒病毒可以是天然存在的无毒病毒或人工减毒病毒。病毒弱化可以通过使用本领域公知的方法进行，所述方法包括，但不限于，亚致死加热、化学处理、或通过定向诱变技术，例如，通过Kurihara and Watanabe(Molecular Plant Pathology 4：259-269，2003)，Gal-on et al.(1992)，Atreya et al.(1992)and Huet et al.(1994)所描述的。
合适的病毒菌株可以从可用来源，如，例如，美国模式菌种收集中心(AmericanType culture Collection，ATCC)得到或通过从被感染的植物中分离而获得。从被感染的植物组织中分离病毒可以通过本领域公知的技术进行，所述技术如，描述于，例如Foster和Tatlor编辑的“Plant Virology Protocols From Virus Isolation to TransgenicResistance(Methods in Molecular Biology(Humana Pr)，Vol 81)”，Humana Press，1998中。简而言之，认为被感染的植物组织包括高浓度的适当病毒，所述植物组织优选嫩叶和花瓣，将所述植物组织在缓冲液(如磷酸盐缓冲液)中磨制以产生可用于随后的接种中的病毒感染液。
通过上述参考文献以及通过Dawson，W.O.等Virology(1989)172：285-292；Takamatsu et al.EMBO J.(1987)6：307-311；French et al.Science(1986)231：1294-1297；和Takamatsu et al.FEBS Letters(1990)269：73-76.Virology(1989)172：285-292；Takamatsu et al.EMBO J.(1987)6：307-311；French et al.Science(1986)231：1294-1297；Takamatsu et al.FEBS Letters(1990)269：73-76；以及美国专利号5,316,931证明了用于在植物中引入和表达非病毒核酸序列的植物RNA病毒的构建。
当病毒是DNA病毒时，可以对病毒本身进行适当的改变。可替代地，首先可以将病毒克隆在细菌质粒中以便于构建所期望的具有外源DNA的病毒载体。然后可以将病毒从质粒中切除。如果病毒是DNA病毒，可将细菌的复制起点连接至病毒DNA上，然后通过细菌复制病毒DNA。该DNA的转录和翻译将产生包封病毒DNA的鞘蛋白。如果病毒是RNA病毒，通常将病毒克隆为cDNA，并将其插入质粒中。然后将质粒用于构造所有的构建体。然后通过转录质粒的病毒序列和翻译病毒基因以生产RNA病毒，从而产生包封病毒RNA的一种或多种鞘蛋白。
在一个实施方式中，提供了植物病毒多核苷酸，其中天然鞘蛋白编码序列已经从病毒多核苷酸、非天然植物病毒鞘蛋白编码序列以及非天然启动子中删除，已经优选插入能够在植物宿主中表达的非天然鞘蛋白编码序列的次基因组启动子，包装重组植物病毒多核苷酸，并且确保通过重组植物病毒多核苷酸系统侵染宿主。可替代地，通过在鞘蛋白基因内插入非天然多核苷酸序列可以使鞘蛋白基因失活，从而产生蛋白。重组植物病毒多核苷酸可以包含一种或多种另外的非天然次基因组启动子。每个非天然次基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达相邻的基因或多核苷酸序列，并且不能与彼此以及与天然的次基因组启动子进行重组。如果包括了超过一个多核苷酸序列，则非天然(外来)多核苷酸序列可以邻近于天然植物病毒次基因组的启动子或者天然和非天然植物病毒次基因组的启动子插入。在次基因组启动子的控制下，在宿主植物中转录或表达非天然多核苷酸序列以产生所期望的产物。
在第二个实施方式中，如在第一个实施方式中提供重组植物病毒多核苷酸，除了将天然鞘蛋白编码序列定位于邻近非天然鞘蛋白次基因组启动子中的一个，而不是非天然鞘蛋白编码序列。
在第三个实施方式中，提供了重组植物病毒多核苷酸，其中天然鞘蛋白基因邻近其次基因组启动子，并且已经将一个或多个非天然次基因组启动子插入病毒多核苷酸中。被插入的非天然次基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达相邻的基因，并且不能与彼此以及与天然次基因组启动子进行重组。可以邻近于非天然次基因组植物病毒启动子将非天然多核苷酸序列插入，以使得在次基因组启动子的控制下在宿主植物中转录或表达序列以生产所期望的产物。
在第四个实施方式中，如在第三个实施方式中提供重组植物病毒多核苷酸，除了用非天然鞘蛋白编码序列替代天然鞘蛋白编码序列。
用由重组植物病毒多核苷酸编码的鞘蛋白包封病毒载体以产生重组植物病毒。重组植物病毒多核苷酸或重组植物病毒用于感染适当的宿主植物。重组植物病毒多核苷酸能够在宿主中复制、在宿主中系统性扩散、并在宿主中转录或表达一种或多种外源基因(外源多核苷酸)以产生所期望的蛋白。
用于向植物接种病毒的技术可以在以下参考文献中找到：Foster and Taylor，eds.“Plant Virology Protocols：From Virus Isolation to Transgenic Resistance(Methods in Molecular Biology(Humana Pr)，Vol 81)”，Humana Press，1998；Maramorosh and Koprowski，eds.“Methods in Virology”7vols，Academic Press，NewYork1967-1984；Hill，S.A.“Methods in Plant in Plant Virology”，Blackwell，Oxford，1984；Walkey，D.G.A.“Applied Plant Virology”，Wiley，New York，1985；和Kado andAgrawa eds.“Principles and Techniques in Plant Virology”，Van Nostrand-Reinhold，New York。
除上述之外，也可以将本发明的多核苷酸引入至叶绿体基因组中，从而使叶绿体能够表达。
用于向叶绿体的基因组中引入外源核酸序列的技术是已知的。该技术包括以下步骤。首先，对植物细胞进行化学处理以将每个细胞的叶绿体数目降低为约1个。然后，为了将至少一个外源多核苷酸分子引入叶绿体中，经由粒子轰击将外源多核苷酸引入细胞中。选择外源多核苷酸以其经由同源重组可整合至叶绿体的基因组中，同源重组容易通过叶绿体固有酶类实现。为这个目的，除了关注的基因之外，核酸序列还包括来源于叶绿体的基因组的至少一个多核苷酸链。此外，外源多核苷酸包括选择标记物，选择标记物通过顺序选择程序起作用以确定按照这种选择的所有或基本所有的叶绿体基因组的拷贝将包括外源多核苷酸。在美国专利号4,945,050；和5,693,507中找到了关于该技术的更多的细节，通过引用将其结合于此。从而通过叶绿体的蛋白表达系统可以产生多肽，并将多肽整合至叶绿体的内膜中。
根据本发明的一些实施方式，所述方法进一步包括培育表达核酸的植物。植物细胞可以生长为整个植物的部分，或可替代地，在植物细胞培养物中生长。在一个实施方式中，植物细胞在生物反应器中的无菌悬浮培养液中生长。适于培养本发明的植物细胞悬浮液的生物反应器以及用于悬浮液中植物细胞生长的方法在(同上)美国专利号6,391,638和7,951,557，以及PCT WO 98/13469、WO 2005/080544、WO 2007/010533、WO 2008/135991和WO 2008/132743中进行了详细的描述，通过引用将其全部内容并于本文中。
因此，本发明包括表达核酸序列的植物或植物培养物，从而产生本发明的重组人α-半乳糖苷酶蛋白。在植物细胞或整个植物内表达之后，由核酸序列编码的人α-半乳糖苷酶蛋白水平可以通过本领域公知的方法测定，如活性测定、能够特异性结合人α-半乳糖苷酶蛋白的蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光等。
在植物中测定由核酸序列转录的RNA的水平的方法是本领域公知的，包括，例如，Northern印迹分析、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析(包括定量、半定量或实时RT-PCR)、和RNA-原位杂交。
表达的本发明的重组人α-半乳糖苷酶蛋白的聚糖分析显示多肽在植物细胞中糖基化，产生具有暴露的甘露糖和植物特异性聚糖残基的重组人α-半乳糖苷酶蛋白(参见以下实施例IV)。因此，根据本发明的一些实施方式，表达本发明的表达载体的细胞产生人α-半乳糖苷酶蛋白，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有至少一个、可选地至少两个、可选地至少三个、或可选地至少四个以上核β-(1，2)木糖残基。在其它实施方式中，表达本发明的表达载体的细胞产生人α-半乳糖苷酶蛋白，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有至少一个、可选地至少两个、可选地至少三个、或可选地至少四个以上核α-(1，3)岩藻糖残基。在其它实施方式中，表达本发明的表达载体的细胞产生人α-半乳糖苷酶蛋白，所述α-半乳糖苷酶蛋白具有至少一个、可选地至少两个、可选地至少三个、或可选地至少四个以上端β(1，2)N-乙酰葡糖胺。在其它实施方式中，表达本发明的表达载体的细胞产生人α-半乳糖苷酶蛋白，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有至少一个、可选地至少两个、可选地至少三个、或可选地至少四个以上暴露的甘露糖残基。在一个特定的实施方式中，表达本发明的表达载体的细胞产生人α-半乳糖苷酶蛋白，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有9个甘露糖残基(M9)，所述9个甘露糖残基中的至少一个、可选地至少两个、可选地至少三个是暴露的甘露糖残基。在一个实施方式中，表达本发明的表达载体的细胞产生人α-半乳糖苷酶蛋白，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有至少一个暴露的甘露糖残基、至少一个核β-(1，2)木糖残基、以及至少一个α-(1，3)岩藻糖残基。
还进一步地，根据本发明的一些实施方式，提供了一种组合物，所述组合物包括由表达本发明的表达载体的细胞产生的多种人α-半乳糖苷酶蛋白分子，其中多种人α-半乳糖苷酶蛋白分子中最主要的聚糖结构是甘露糖3-β-(1，2)木糖-α-(1，3)岩藻糖［Fc(3)M3X］和/或甘露糖4-β-(1，2)木糖(M4X)；以及甘露糖8(M8)。在本发明一些实施方式中，在多种人α-半乳糖苷酶蛋白分子中，聚糖结构甘露糖3-β-(1，2)木糖-α-(1，3)岩藻糖［Fc(3)M3X］和/或甘露糖4-β-(1，2)木糖(M4X)组成约20％、约25％、约30％、约35％、或约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约70％、约80％的人α-半乳糖苷酶蛋白质分子分布，并且在多种人α-半乳糖苷酶蛋白分子中，聚糖结构甘露糖8(M8)组成20％、约25％、约30％、约35％、或约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约70％、约80％的人α-半乳糖苷酶蛋白分子分布。
在本发明还进一步的实施方式中，组合物包括多种由表达本发明的表达载体的细胞产生的人α-半乳糖苷酶蛋白分子，其中所述多种人α-半乳糖苷酶蛋白分子包括至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.75％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％、约5.0％以上的人α-半乳糖苷酶蛋白质分子，所述人α-半乳糖苷酶蛋白质分子具有含9个甘露糖残基的聚糖结构，所述9个甘露糖残基中的至少一个、可选地至少两个、可选地至少三个是暴露的甘露糖残基。
由表达本发明的表达载体的细胞产生的人α-半乳糖苷酶蛋白显示具有等同于天然人α-半乳糖苷酶的α-半乳糖苷酶催化活性。当给予以用于酶替代疗法时，本发明的重组α-半乳糖苷酶暴露至模拟酶体内环境的条件下，进一步显示由表达本发明的表达载体的细胞产生的人α-半乳糖苷酶蛋白可以具有与那些哺乳动物细胞表达的重组人α-半乳糖苷酶(Replagal)相似的药代动力学(参见本文中的实施例3以及图2和图3)。
因此，由表达本发明的表达载体的细胞产生的人α-半乳糖苷酶蛋白可以用于生产药物组合物。药物组合物可以用于在需要其的受试者中治疗或预防法布里病。在一些实施方式中，表达人α-半乳糖苷酶蛋白的细胞可以用于在需要其的受试者中治疗或预防法布里病。本领域已公知用于制备和给予重组表达人蛋白的植物细胞的方法，例如，Shaaltiel等的PCT WO 2007/010533。
因此，根据本发明的另一方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包括作为其活性成分的在C端被翻译融合在内质网滞留信号肽的的人α-半乳糖苷酶蛋白和药用载体。在本发明的一些实施方式中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有N端甘氨酸残基。在本发明的一些实施方式中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有如在SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，在C端被翻译融合至内质网滞留信号肽的人α-半乳糖苷酶蛋白具有如SEQID NO：21所示的氨基酸。
如在本文中使用的，“药物组合物”是指本文所述的一种或多种活性成分与其它化学组分如生理适用载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是便于将化合物给予有机体。
在本文中术语“活性成分”是指具有生物效应的重组人α-半乳糖苷酶蛋白。
下文中，可以互换使用的短语“生理用载体”和“药用载体”是指不会对有机体产生显著刺激并且不会破坏所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些短语包括辅剂。
在本文中，术语“赋形剂”是指加入药物组合物中以进一步便于活性成分给予的惰性物质。赋形剂的实例包括，但不限于，碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物的配制和给予技术可参见最新版的“Remington’s PharmaceuticalSciences，”Mack Publishing Co.，Easton，PA，其通过引用并入本文。
适当的给予途径可以，例如，包括口服、直肠、经粘膜(特别是经鼻)、肠道、或肠胃外给予，包括肌内、皮下和髓内注射以及膜内、直接心室内、心脏内(例如进入右室腔或左室腔，进入常见冠状动脉)、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
用于药物递送至中枢神经系统(CNS)的常规方法包括：神经外科策略(例如，脑内注射或脑室内注入)；试剂的分子操纵(例如生产包括对于内皮细胞表面分子具有亲和性的转运肽与其本身不能穿过BBB(血脑屏障)的试剂相结合的嵌合融合蛋白)以试图探索BBB的内源性转运途径之一；用于增加试剂的脂溶性的药理学策略(例如，将水溶性试剂结合至脂类或胆固醇载体上)；以及通过高渗破坏暂时破坏BBB的完整性(原因是甘露醇溶液注入颈动脉中或使用生物活性剂如血管紧缩素肽)。然而，这些策略中的每一种都有局限性，如与侵入性手术操作相关的固有风险、由内源性转运系统中固有的限制产生的尺寸限制、与全身给予由在CNS外可以是活性的载体基序构成的嵌合分子相关的潜在不期望的生物学副作用，以及当BBB被破坏时在大脑区域内可能的脑损伤风险，这使得其不是最佳的递送方法。
可替代地，可以将药物组合物以局部方式而不是全身方式给予，例如，通过将药物组合物直接注射到病人的组织区域中。
术语“组织”是指由用于进行其一种或多种功能的细胞组成的生物体的部分。实例包括，但不限于，脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织、脑组织、血管组织、肾脏组织、肺组织、性腺组织、造血组织。
本发明的一些实施方式中的药物组合物可以通过本领域公知的方法制备，例如通过常规混合、溶解、制粒、制糖衣、磨粉、乳化、胶囊化、包埋、或冻干工艺。
用于根据本发明的一些实施方式的药物组合物可以利用一种或多种生理用载体以常规方式配制，所述一种或多种生理用载体包括赋形剂和助剂，以便于活性成分加工成药学上可使用的制剂。合适的制剂取决于所选择的给予途径。
对于注射剂，药物组合物的活性成分可以配制成水性溶液，优选生理相容的缓冲液，例如汉克氏溶液、林格氏溶液、或生理盐缓冲液。对于经粘膜给予，在制剂中使用适合透过屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的。
对于口服给予，通过给予产生根据本发明的人α-半乳糖苷酶蛋白的整个细胞可以可选地配制活性成分。活性成分还可以可选地通过将活性成分和/或本领域公知的具有药用载体的细胞结合以配制，产生药物组合物。这样的载体能够将细胞和/或药物组合物配制为片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、淤浆剂、混悬剂等以供患者口服摄入。当用于口服给予时，全细胞或细胞碎片可以新鲜或经处理使用(例如，冻干、冷冻、干燥等)。
供口服使用的药物制剂可以使用固体赋形剂制备，可选地研磨所产生的混合物，并将混合物加工成颗粒，如果需要，加入合适的助剂后，获得片剂或糖衣丸的核。合适的赋形剂为，特别是，填充剂如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨糖醇；纤维素制剂，如，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠；和/或生理用聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐如海藻酸钠。
提供具有合适包衣的糖衣丸核。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、涂膜(lacquer)溶液、和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可在片剂或糖衣丸包衣中加入染料或色素以用于识别或赋予活性化合物剂量的不同组合的特征。
可用于口服的药物组合物包括由明胶制备的推入适配胶囊(压入式胶囊，push-fit capsule)，以及由明胶和增塑剂如甘油和山梨醇制备的软密封胶囊。推入适配胶囊可包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁、以及可选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可将活性成分溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡、或液态聚乙二醇。此外，也可加入稳定剂。口服给予的所有制剂的剂量应适合于所选择的给予途径。
对于口腔(buccal)给予，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于经鼻吸入给予，根据本发明的一些实施方式所使用的活性成分可以以气雾剂喷雾的形式方便地递送，其通过使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳，由加压包装(pressurized pack)或喷雾器提供。对于加压的气雾剂而言，可通过提供阀(valve)来递送计量的量以确定剂量单位。可配制在分配器中使用的例如明胶胶囊和药管(cartridge)，以包含化合物和合适的粉基(powder base)(如乳糖或淀粉)的混合粉末。
可配制本文所述的药物组合物以用于肠胃外给予，例如，通过大丸剂注射或持续输注。用于注射的制剂可以以，例如，在安瓿中的单位剂型提供，或与可选的添加防腐剂一起以多剂量容器提供。组合物可以是在油性或水性载体(vehicle)中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可以包括诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的制剂。
用于肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水性溶液。此外，活性成分的混悬剂可制备成基于合适的油或水的注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸如油酸乙酯、甘油三酸酯或脂质体。水性注射混悬剂可以含有能够增加混悬剂粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，混悬剂也可包含合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度以使得能够制备高浓度溶液的试剂。
可替代地，活性成分可以为粉末形式以在使用前溶于合适的载体，例如，基于无菌无热原水的溶液。
本发明的一些实施方式的药物组合物也可配制为直肠用组合物(如栓剂)或使用例如常规栓剂基质(base)如可可油或其它甘油酯的保留灌肠剂。
适用于本发明的一些实施方式的上下文的药物组合物包括组合物，其中含有有效量的活性成分以达到预期目的。更具体地说，治疗有效量意味着可有效防止、减轻或缓解疾病症状(例如，法布里病)或延长接受治疗的受试者的存活期的活性成分(α-半乳糖苷酶)的量。
治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细披露。
对于用于本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可通过体外和细胞培养实验初步估算。例如，可配制剂量用于动物模型以获得期望的浓度或滴度。此信息可用于更准确地确定在人类中的有用剂量。
本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可通过在体外、细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定。由体外和细胞培养物实验以及动物研究获得的数据可用来配制用于人类的多种剂量。剂量根据所采用的剂型和所使用的给予途径而有所不同。准确的制剂、给予途径和剂量可由医生个人参照患者病情进行选择(参见，例如Fingl等，1975，“ThePharmacological Basis of Therapeutics”，Ch.1 p.1)。
可以个别地调节给药量和间隔以提供活性成分足以诱导或抑制生物效应的浆液和细胞水平(最小有效浓度，MEC)。针对每种制剂MEC可以变化，但是可以从体外数据进行估计。达到MEC所必需的剂量将取决于个体特征以及给药途径。可以使用检测测定法来确定血浆浓度。
根据所治疗疾病的严重性和响应性，给药可以是单次或多次给予，疗程持续数日至数周或者直至治愈或实现疾病状态的减轻。
当然，所给予组合物的量将取决于被治疗的受试者、患病的严重性、给药方式、处方医生的判断等。
如果需要，本发明的一些实施方式的组合物可以包装或分配装置提供，如FDA批准的试剂盒，其可含有一种或多种包含活性成分的单位剂型。包装可以包括，例如，金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配装置可以附有用于给予的使用说明书。也可通过由监管药品生产、使用或销售的政府机构规定的形式，通过与容器有关的公告对包装或分配装置进行调整，该公告反应了机构批准的组合物或人类或动物给予的形式。这样的公告可以为，例如，美国食品和药品监督管理局批准的标签，其用于处方药或作为已批准产品的说明书。也可制备包括与相容性药学载体配制的包括本发明的所述制剂的组合物，放置于合适的容器中，并标示用于治疗所指示的疾病(如上文进一步详述的)。
药物组合物可以用于在需要其的受试者中治疗或预防法布里病。因此，根据本发明的另一方面，提供了用于在需要其的受试者中治疗和预防法布里病的方法，所述方法包括给予受试者有效量的药物组合物，所述药物组合物包括作为其活性成分的人α-半乳糖苷酶蛋白以及药用载体，所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻译融合至内质网滞留信号肽。在本发明的一些实施方式中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有N端甘氨酸残基。在其它实施方式中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有如在SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列。
术语“治疗”是指抑制、预防、或阻止病情(疾病、紊乱、或病症)发展和/或引起病情减轻、缓解、或退行。本技术领域人员将理解可以使用各种方法和检测来评价病情的进展，并且相似地，可以使用各种方法和检测来评价病情的减轻、缓解或退行。
如在本文中使用的，术语“预防”是指防止疾病、紊乱或病症发生在可能罹患所述疾病的风险而尚未诊断患有所述疾病的受试者中。
如在本文中使用的，术语“受试者”包括哺乳动物，优选患有病状的各年龄段的人。优选地，这一术语包括处于发展病症的危险之中的个体。
如在本文中使用的术语“治疗方案”是指提供给需要其的受试者(例如，诊断患有病症的受试者)特定类型的治疗、剂量、时间表和/或持续时间的治疗计划。选定的治疗方案可以是期望产生最佳临床效果的积极方案(例如，完全治愈病症)，或是可以缓解疾病症状并且产生不完全治疗病状的更适度的方案。将理解在某些情况下更积极的治疗方案可能伴有受试者的一些不适或不良副作用(例如，对健康细胞或组织的损伤)。治疗的类型可以包括外科手术(例如，去除病灶，病变细胞、组织、或器官)、以局部或全身模式给予治疗药物的细胞代替治疗(例如，受体激动剂、拮抗剂、激素、化疗剂)、使用外源(例如，外粒子束)暴露放射疗法和/或内源(例如，短程疗法)暴露放射疗法和/或其任何组合。治疗的剂量、时间表和持续时间可以根据病状的严重性和选择的治疗类型而改变，并且本领域技术人员能够调节具有治疗的剂量、时间表和持续时间的治疗类型。
预期在本专利申请直到被授予专利权期间，将开发出许多相关的运载体(vector)、启动子元件、植物细胞以及载体(carrier)，并且本文中提供的术语的范围包括之前所有此类新技术。
文中使用的术语“约”是指±10％。
术语“包含”、“含有”、“包括”、“具有”以及它们的结合意味着“包括，但不限于”。
术语“由…组成”的意思是“包括且限于”。术语“基本由…组成”的意思是组合物、方法或结构可以包括另外的成份、步骤和/或部分，但是只有在该另外的成份、步骤和/或部分没有显著改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新特征的情况下。
如在本文中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括其复数形式，除非上下文清楚地指示为其它。例如，术语“该化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物(包括其混合物)。
在整个说明书中，本发明的各种实施方式可以以范围的形式表示。应当理解，以范围形式描述仅是为了方便和简要，不应当解释为对本发明的范围的固定限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，应认为范围的描述，如1至6具体公开了子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5、和6。不论范围宽窄这都是适用的。
当在本文中指出数值范围时，这意味着该数值范围包括在所指定的范围内的任何引用的数值(小数或整数)。短语“范围为”第一指定数值至第二指定数值、“范围在”第一指定数值至第二指定数值“之间”，以及在第一指定数值“至”第二指定数值的“的范围内”在本文中可互换使用，是指包括第一和第二指定数值以及在其间的所有小数和整数数值。
如在本文中使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、方法、技术和程序，包括，但不限于，化学、药物、生物、生物化学和医学领域的从业者已知的或者容易从已知的方式、方法、技术和程序开发的方式、方法、技术和程序。
如在本文中使用的术语“治疗”包括消除、基本抑制、减缓或逆转病症的进展，基本改善病症的临床或美学症状，或基本预防病症的临床或美学症状的出现。
应当理解，在单独的实施方式的内容中描述的本发明的某些特征，是为了清楚，它们还可以以单独的实施方式的组合提供。相反，在单个实施方式的内容中描述的本发明的各种特征，是为了简要，它们也可以分开提供或以任何适当的子组合提供，或适当地提供至本发明所描述的任何其它实施方式中。认为在各个实施方式的内容中描述的某些特征不是那些实施方式的必要特征，除非在没有那些要素的情况下，该实施方式不起作用。
如上所述以及如随附的权利要求部分所要求的本发明的各种实施方式和方面可以从以下实施例中得到实验性支持。
实施例
现在参考以下实施例，与以上描述一起以非限制的方式示出本发明的一些实施方式。
通常，本文中使用的命名法和在本发明中利用的实验方法包括分子技术、生物化学技术、微生物学技术、和重组DNA技术。这类技术已在文献中充分解释。参见，例如，″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook等，(1989)；″Current Protocols inMolecular Biology″卷I-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等，″Current Protocolsin Molecular Biology″，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″APractical Guide to Molecular Cloning″，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等，″Recombinant DNA″，Scientific American Books，New York；Birren等(eds)″GenomeAnalysis：A Laboratory Manual Series″，Vols.1-4，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York(1998)；美国专利第4,666,828号、第4,683,202号、第4,801,531号、第5,192,659号、和第5,272,057号中示出的方法；″Cell Biology：A Laboratory Handbook″，卷I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；Freshney，Wiley-Liss，″Culture of Animal Cells-AManual of Basic Technique″N.Y(1994)，Third Edition；″Current Protocols inImmunology″卷I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites等(eds)，″Basic and ClinicalImmunology″(8th Edition)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds)，″Selected Methods in Cellular Immunology″，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；专利和科学文献对可用的免疫测定法进行了广泛描述，参见，例如，美国专利第3,791,932号、第3,839,153号、第3,850,752号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、第3,879,262号、第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,345号、第4,034,074号、第4,098,876号、第4,879,219号、第5,011,771号以及第5,281,521号；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.I.，ed.(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide toMolecular Cloning″Perbal，B.，(1984)和″Methods in Enzymology″Vol.1，2，317，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications″，AcademicPress，San Diego，CA(1990)；Marshak等，″Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual″CSHL Press(1996)；将其全部内容以引用方式并入本文，如同在本文完全阐述。其它一般参考文献在该文献中提供。认为其中的程序是本领域公知的，为了方面阅读而提供。在其中包含的全部信息通过引用结合于此。
实施例I：构建植物α-半乳糖苷酶表达构建体
通过GENEART AG(Regensburg，Germany)优化合成编码人α-半乳糖苷酶蛋白(EC3.2.1-22基因库：X05790)的cDNA。没有前导肽(内质网靶向信号肽)的密码子使用适于烟草基因的密码子偏倚性。在优化过程中，避免以下顺式-作用基序：内在TATA盒、嵌合位点(chi-site)、以及核糖体进入位点、富含AT序列或富含GC序列链、RNA不稳定元件(“杀伤基序(killer motif)”)、重复序列、以及RNA二级结构、剪切供体(隐含)和受体位点、分支点。此外，已避免GC含量非常高(＞80％)的区域或非常低(＜30％)的区域。
全长人α-半乳糖苷酶蛋白(基因库：X05790)的天然人α-半乳糖苷酶前导肽(内质网靶向信号肽)(图l，红色的前31个氨基酸)的核苷酸序列被编码33个氨基酸的拟南芥ABPI蛋白内质网靶向信号肽(前导肽)的核苷酸序列替代(在图1中以绿色标出，SEQ ID NO：4)。这一信号肽提供α-半乳糖苷酶靶向分泌途径的有效性，并且在蛋白已转移至内质网之后，所述信号肽通过信号肽酶从多肽中切除。将编码内质网滞留信号SEKDEL(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)加入cDNA序列的3’端，使得表达的蛋白能够从高尔基体返回，有效地保持内质网中的蛋白。SEQ ID NO：2代表表达的重组人α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO：1)的完整编码序列，所述完整编码序列包括N端ABPI内质网靶向信号肽、人α-半乳糖苷酶蛋白和SEKDEL内质网滞留信号。
实施例Ⅱ：植物中重组人α-半乳糖苷酶的表达
本氏烟中的瞬时表达系统
在这种情况下，选择使用植物病毒载体作为转基因植物的替代物，其使得能够在成熟的整株植物中蛋白的快速、高水平瞬时表达。
关注的蛋白从强烈的次基因组病毒鞘蛋白启动子开始表达。系统依赖通过土壤杆菌属(农杆菌属)递送至植物的病毒载体的瞬时扩增(通过土壤杆菌感染法)，其中植物功能化的启动子和编码病毒复制子的cDNA作为T-DNA从土壤杆菌属转移至植物细胞。T-DNA通过植物启动子原位(in-planta)转录以产生开始自复制的生物学活性病毒RNA。
对于瞬时表达，使用基于之前开发的所述系统的3载体重组系统(Gleba等，Vaccine 23 2042-2048，2005)。将α-半乳糖苷酶cDNA插入一种载体中，以及其它两种包含用于构建整个病毒复制子(RdRp和整合酶)基因的载体，从而产生能够开始自复制的生物学活性病毒RNA。
转染整株植物
在24℃-25℃下的长日照方案(16h光照/8h黑暗)条件下，本氏烟植物在补充颗粒状缓释肥料(Scott Marysville，OH)的商用混合土(Givaat Ada，IL)中发芽和生长。
通过电穿孔(2500V，5毫秒)[den Dulk-Ra，A.和Hooykaas，P.J.(1995)MethodsMol.Biol.55：63-72]，利用基于pICH20866-α-GAL的复制子载体系统转化土壤杆菌。通过本领域已知的标准方法真空浸润，用包含3 ICON质粒的土壤杆菌浸润植物。简要地，通过将所有气生植物器官浸渍在细菌悬浮液中以浸润5-6周龄的本氏烟植物，并将其置于真空室中。施加负(-)0.8巴的真空1分钟，随后快速升至大气压。在相同的生长条件下，在另外的5-7天中将植物重置于温室。烟草植物提取物：
浸润5天之后收获本氏烟叶片样品并在用于SDS-PAGE的电泳缓冲液中提取，或者在用于植物表达蛋白的催化活性试验的活性试验缓冲液中(20mM柠檬酸、30mM磷酸钠、0.1％的BSA、以及0.67％的乙醇，pH4.6)提取。
烟草植物提取物的纯化：
通过两步硫酸铵示差沉淀(“盐析”：第一步：0.57M；第二步：2.27M)随后通过疏水作用层析(苯基650M树脂)和阳离子交换层析，从植物提取物中纯化人α-半乳糖苷酶蛋白。
烟草BY2细胞中的稳定表达
土壤杆菌属介导的转化广泛用于将异源基因引入植物细胞基因组中。这一技术基于土壤杆菌属的本能，通过将质粒DNA区段、转移的DNA(T-DNA)转移至宿主细胞基因组而转化植物细胞。使用这种方法，由异源基因和其调控元件组成的T-DNA分子随机引入植物基因组中。没有控制整合的位点以及基因插入的拷贝数，从而转化过程产生由具有多种转基因表达水平的细胞组成的转基因细胞的‘池(pool)’。转基因‘池’随后用于克隆分离。克隆分离产生构建的许多单细胞系，随后从所述单细胞系中选择具有异源基因最高表达水平的克隆。
BY2悬浮培养物与携带具有α-GAL基因和新霉素磷酸转移酶(NPTII)选择基因的载体的土壤杆菌EHA105菌株一起共培养48小时。
随后，将细胞保持在补充有50mg/L卡那霉素和250mg/L头孢噻肟的培养基中。NPTII基因赋予针对卡那霉素的耐受性，从而仅NPTII阳性的BY2细胞在该选择培养基中存活。头孢噻肟用于选择性地杀死土壤杆菌属，植物细胞对这种抗生素具有耐受性。在建立较好生长的转基因细胞悬浮液之后，其用于筛选和分离单个的细胞系。考虑到单个细胞系的选择性，高度稀释的细胞悬浮液的等份分散在固体BY-2培养基中。随后培养细胞直到发展出小的愈伤组织。随后在液体培养液中再悬浮各愈伤组织。随后对细胞进行取样，并将样品用于α-GAL水平的评价。随后进一步再分析表达相对高α-GAL活性水平的细胞系，并与以候选α-GAL表达系的最终选择结束的α-GAL水平比较。
烟草细胞提取物：
将100mg的转化的、表达人α-半乳糖苷酶蛋白的BY2细胞在包含20mM EDTA、2mMDTT和2mM PMSF(pH＝7.2)的200ul20mM的磷酸盐缓冲液0.5M中均质化5分钟。离心分离匀浆并收集包含重组人α-半乳糖苷酶蛋白的上清液[粗提取]。通过PNP-G检测测定粗产物中α-半乳糖苷酶的催化活性。
PNP-G检测
使用对硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷(pNP-α-D-Gal，GBB 1290，IRIS Biotech，Germany)作为水解基质测定α-半乳糖苷酶半乳糖苷水解酶活性。检测缓冲液包括20mM的柠檬酸、30mM的磷酸钠、0.1％的BSA和0.67％的乙醇(pH4.6)。用150μl检测缓冲液温育样品(50μl)。加入基质(pNP-α-D-Gal)(30μL)至最终浓度为8mM p-NP-α-D Gal。反应混合物在37℃下温育90分钟。90分钟之后，通过向各孔中加入100μl的碳酸钠(2M)淬灭反应，以终止反应并使得能够产生对硝基苯酚酯/盐生色团。由在405nm处测定的吸光度计算结果。
改变的植物表达人α-半乳糖甘酶：来自转化植物的蛋白产品的测序显示，在某些情况下，在切除ABPI信号之后，重组人α-半乳糖苷酶蛋白在成熟α-半乳糖苷酶蛋白的N端保留信号肽的最终氨基酸甘氨酸。因此，重组人α-半乳糖苷酶蛋白可以没有N端信号肽甘氨酸(例如，SEQ ID NO：20，如在SEQ ID NO：22的编码序列)，或包含N端甘氨酸(例如，SEQ IDNO：21，如在SEQ ID NO：23中的编码序列)。
植物表达人α-半乳糖苷酶的聚糖分析：将来自转化植物的重组人α-半乳糖苷酶蛋白产品的样品还原，用DTT和碘代乙酰胺烷基化，并在12.5％的SDS-PAGE上分离。切除相应于校准分子量的条带，提取蛋白，并进行由胰蛋白酶消化随后由PNGase A和PNGase F消化组成的聚糖分析。PNGase A消化释放所有的N连接的聚糖，并且PNGase F释放所有除包含α1-3核岩藻糖之外的所有聚糖。
提取、纯化并用荧光试剂邻氨基苯甲酰胺(2AB)标记自由聚糖，随后去除过量的2AB。
使用TSK凝胶酰胺80正相HPLC分离聚糖并使用荧光检测器检测。葡萄糖水解产物作为阶梯(ladder)用于计算葡萄糖单体(GU)值。通过计算来自PNGase A消化的色谱的相对峰面积构建聚糖分布。通过计算在内切糖苷消化和基于另外的各种外切糖苷消化中确定的峰的GU值建立聚糖的分配(assignment)。
结果：
比较不同α-半乳糖苷酶构建体，表明了相比于用苹果果胶酶内质网靶向信号肽表达的α-半乳糖苷酶序列(通过SEQ ID NO：10编码的苹果果胶酶ER靶向信号肽)(通过SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：11编码的α-半乳糖苷酶-苹果果胶酶ER信号肽蛋白)、或利用内切壳多糖酶B内质网靶向信号肽(内切壳多糖酶信号蛋白，SEQ ID NO：14，通过SEQ ID NO：15编码)表达的α-半乳糖苷酶蛋白，将ABPI内质网靶向信号肽(SEQ ID NO：4)加入至人重组α-半乳糖苷酶多肽中，提高了在瞬时表达本氏烟植物中重组蛋白的表达(图2，泳道2)。催化活性试验(参见上文)证明：相比于用苹果果胶酶内质网靶向信号肽表达的α-半乳糖苷酶序列或用内切壳多糖酶B内质网靶向信号肽(内切壳多糖酶信号蛋白，SEQ ID NO：14，通过SEQ ID NO：15编码)表达的α-半乳糖苷酶序列，在图2中所见的提高的蛋白表明随之增加的酶活性(图3，柱B)每kg叶片。
通过添加ABPI内质网靶向信号肽(例如，SEQ ID NO：1，通过SEQ ID NO：2编码)的表达人α-半乳糖苷酶蛋白的转化烟草细胞产生的重组人α-半乳糖苷酶蛋白产物的聚糖分析示出了包括高甘露糖聚糖结构(例如，3至6、7、8或9个甘露糖残基，具有端部暴露的甘露糖)的主要聚糖结构的聚糖分布，以及特征植物特异性聚糖类，如β-(1，2)木糖和α-(1，3)岩藻糖(图7)。表示高比例聚糖分布的优选聚糖结构包括约30％的含有甘露糖3-β-(1，2)木糖-α-(1，3)岩藻糖[Fc(3)M3X]和/或甘露糖4-α-(1，2)木糖(M4X)，以及另一种约30％的甘露糖8(M8)聚糖(图8)。图8是显示来自转化细胞中的蛋白样品内的聚糖结构分布的表格。A-Gal和A-Gal-B是来自转化细胞的重组人α-半乳糖苷酶蛋白产物的两种典型分析。
聚糖结构可以进一步根据存在于复合聚糖中的糖残基进行分类。根据特异性糖，以下表V详细地描述了来自转化植物的人α-半乳糖苷酶蛋白产物中聚糖结构的分布：
表V聚糖的糖类含量
聚糖类型 总聚糖的％
含岩藻糖的聚糖 约35
含木糖的聚糖 约50
高甘露糖 约60
含N-乙酰氨基葡糖胺的聚糖 约10
因此，在烟草细胞培养物中由包含SEQ ID NO：2的构建体表达的人α-半乳糖苷酶蛋白产物通过显著百分比的植物特异性聚糖结构(含有岩藻糖和木糖组分)以及高甘露糖糖基化表征。
实施例III-在体内条件下植物表达的人重组α-半乳糖苷酶的稳定性
为了近似估测植物表达的人重组α-半乳糖苷酶的药代动力学，将重组酶制剂暴露于模拟的体内条件下并监测催化活性。在血浆中的稳定性：
通过向最终浓度为1μg/ml的血浆中加入重组植物提取物或从植物提取物中纯化的α-半乳糖苷酶(例如，10μl提取物或纯化的α-半乳糖苷酶比190μl人血浆)，在37℃下温育，随后在一个小时的时间内测定样品每隔一段时间的α-半乳糖苷酶催化活性。
比较来自用SEQ ID NO：11转化的本氏烟植物的α-半乳糖苷酶，其中SEQ ID NO：11编码具有苹果果胶酶内质网靶向信号肽(SEQ ID NO：12)的α-半乳糖苷酶，以及来自用SEQID NO：2转化的本氏烟植物的α-半乳糖苷酶，其中SEQ ID NO：2编码具有ABPI内质网靶向信号肽(SEQ ID NO：1)的α-半乳糖苷酶(图4)，结果显示，来自具有ABPI内质网靶向信号肽的构建体的本氏烟表达的α-半乳糖苷酶(图4，闭合或实心方形)比来自具有苹果果胶酶内质网靶向信号肽前导序列的构建体的重组α-半乳糖苷酶(图4，空心方形)具有明显优势。
在用SEQ ID NO2转化的烟草植物细胞(BY2)中表达的α-半乳糖苷酶，所述SEQ IDNO2编码具有ABPI内质网靶向信号肽(SEQ ID NO：1)的α-半乳糖苷酶而产生成熟的重组α-半乳糖苷酶蛋白如酶SEQ ID NO：21所示；上述α-半乳糖苷酶与在哺乳动物细胞(REPLAGALTM)中表达的α-半乳糖苷酶的比较显示：当在血浆中在37℃下温育1小时(图5)，以及当在类溶酶体条件下温育超过9天时(pH＝4.6和37℃，图6)时显示具有相似的酶活性稳定性。这种在模拟的体内条件下的相似性显示，植物细胞表达的重组α-半乳糖苷酶将具有与那些哺乳动物细胞表达、临床批准的酶(REPLAGALTM)相当的药代动力学。
尽管本发明已经结合其具体实施方式进行了描述，但是显然许多替代、修改和变型对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，意图包括属于所附权利要求的精神和宽范围内的所有这类替代、修改和变型。
在该说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用将其全部并于本说明书中，其程度如同特别地且单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用结合于此。此外，本申请中任何参考文献的引用或识别不应解释为承认该参考文献作为本发明的现有技术是可行的。至于所使用的章节标题，不应当将它们解释为必要的限制。

Claims (39)

1.一种核酸表达构建体，所述构建体包括编码人α-半乳糖苷酶蛋白的核酸序列，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白的氨基酸序列由(a) SEQ ID NO: 20 的氨基酸序列和 (b) 拟南芥ABPI 内质网靶向信号肽组成，其中所述SEQ ID NO: 20 的氨基酸序列在N 端被翻译融合至所述拟南芥ABPI 内质网靶向信号肽。
2.根据权利要求1 所述的核酸表达构建体，其中，所述拟南芥ABPI 内质网靶向信号肽如SEQ ID NO: 4 所示。
3.根据权利要求1 所述的核酸表达构建体，其中，SEQ ID NO: 20 的氨基酸序列由如SEQ ID NO: 22 所示的核酸序列编码。
4.根据权利要求1 所述的核酸表达构建体，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白的所述氨基酸序列由如SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求4 所述的核酸表达构建体，其中，所述编码人α-半乳糖苷酶蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求1 所述的核酸表达构建体，其中，所述核酸序列的密码子使用是针对烟草（Nicotinia tabaccum）优化的。
7.一种包括权利要求1 所述的核酸表达构建体的分离细胞。
8.根据权利要求7所述的细胞，其中所述核酸表达构建体被稳定整合在所述细胞的基因组中。
9.根据权利要求7 所述的细胞，重组产生所述人α-半乳糖苷酶。
10.根据权利要求8所述的细胞，重组产生所述人α-半乳糖苷酶。
11.根据权利要求7所述的细胞，其中，所述细胞是植物细胞。
12.根据权利要求8的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
13.根据权利要求9的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
14.根据权利要求10的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
15.根据权利要求11所述的细胞，其中，所述植物细胞是烟草细胞。
16.根据权利要求12所述的细胞，其中所述细胞是烟草细胞。
17.根据权利要求13所述的细胞，其中所述细胞是烟草细胞。
18.根据权利要求14所述的细胞，其中所述细胞是烟草细胞。
19.根据权利要求15 所述的细胞，其中，所述烟草细胞是BY-2 细胞。
20.权利要求16所述的细胞，所述烟草细胞是BY-2 细胞。
21.权利要求17所述的细胞，所述烟草细胞是BY-2 细胞。
22.权利要求18所述的细胞，所述烟草细胞是BY-2 细胞。
23.根据权利要求9所述的细胞，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白是重组产生的，以具有至少一个暴露的甘露糖残基。
24.根据权利要求10所述的细胞，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白是重组产生的，以具有至少一个暴露的甘露糖残基。
25.根据权利要求13所述的细胞，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白是重组产生的，以具有至少一个暴露的甘露糖残基。
26.根据权利要求14所述的细胞，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白是重组产生的，以具有至少一个暴露的甘露糖残基。
27.根据权利要求17所述的细胞，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白是重组产生的，以具有至少一个暴露的甘露糖残基。
28.根据权利要求18所述的细胞，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白是重组产生的，以具有至少一个暴露的甘露糖残基。
29.根据权利要求21所述的细胞，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白是重组产生的，以具有至少一个暴露的甘露糖残基。
30.根据权利要求22所述的细胞，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白是重组产生的，以具有至少一个暴露的甘露糖残基。
31.根据权利要求9至30 中任一项所述的细胞，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白是重组产生的，以具有至少一个核β-(1,2)木糖。
32.根据权利要求9至30 中任一项所述的细胞，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白是重组产生的，以具有至少一个核α-(1,3)岩藻糖。
33.根据权利要求9 至30中任一项所述的细胞，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白是重组产生的，以具有至少一个核β-(1,2)木糖和至少一个核α-(1,3)岩藻糖。
34.根据权利要求7 所述的细胞，其中，所述细胞是根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）细胞。
35.一种产生重组人α-半乳糖苷酶蛋白的方法，包括：
提供根据权利要求8 至33中任一项所述的细胞；以及培养所述细胞以产生所述重组人α-半乳糖苷酶蛋白；以及从所述细胞中分离所述重组人α-半乳糖苷酶蛋白。
36.根据权利要求35 所述的方法，其中，所述细胞是在细胞培养基中培养的分离细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述培养是在一次性生物反应器中进行的。
38.一种药物组合物，包括作为活性成分的根据权利要求7 至33中任一项所述的细胞以及药用载体。
39.根据权利要求7-33中任一项所述的细胞在制备在需要其的受试者中用于治疗法布里病的药物中的用途。
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