RS60129B1 - Kompozicije alfa-galaktozidaze - Google Patents

Description

Opis

OBLAST I STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0001] Prikazani pronalazak, u nekim svojim izođenjima, se odnosi na ekspresiju konstrukta nukleinske kiseline i određenije, ali ne isključivo, na konstrukt nukleinske kiseline za ekspresiju α-galaktozidaze u biljnoj ćeliji, ćelije koje eksprimuju konstrukt nukleinske kiseline i humanu α-galaktozidazu, i njihovu upotrebu.

[0002] Fabrijeva bolest je X –hromozomno nasledna lizozomna bolest nakupljanja koja je izazvana deficijentom aktivnošću lizozomnog enzima α-galaktozidaze A (α-Gal A). Pacijeti sa klasičnom Fabrijevom bolešću tipično imaju α-Gal A aktivnost manju od 1% i često poakazuje pun spektar simptoma, uključujući ozbiljan bol u ekstremitetima (akroparestezija), hipohidroza, promene rožnjače i sočiva, lezije na koži (angiokeratoma), otkazivanje bubrega, kardiovakularna bolest, otkazivanje pluća, neurološki simptomi i moždani udar. Kod atipične Fabrijeve bolesti, pojedinici sa zaostalom enzimskom aktivnošću pokazuju simptome kasnije u životu, i simtomi su uglavnom ograničeni na jedan ili više organa. Kliničke manifestacije kod ženskih nosioca variraju zbog nasumične inaktivacije X-hromozoma. Mada nosači uobičajeno ostaju asimptomatični u toku života, mnogi pokazuju kliničke simptome kao promenjive i ozbiljne kao one kod bolesnih muškaraca. De Duve prvi je sugerisao zamenu nedostajućeg lizozomnog enzima sa egzogenim biološki aktivnim enzimog može biti održiv pristup lečenju lizozomne bolesti nakupljanja [Fed Proc.23:1045 (1964)].

[0003] Rekombinantna α-Galaktozidaza A za terapiju supstitucije enzima je proizvedena u ćelijama insekta (sf9) (videti US 7,011,831) u humanim fibroblastima (videti US 6,395,884) i u biljnim ćelijama (videti US 6,846,968 i WO2008/132743). Klinička ispitivanja sa rekombinantom a-Gal A (agalzidaza beta [Fabrazyme®]: Genzyme Corporation, Cambridge, Mass; agalzidaza alfa [Replagal®]: Shire Human Genetic Therapies Corporation, Cambridge, Mass) su izvedena, i oba leka su odobrena za kliničku upotrebu. Od 2009, više od 2000 pacijenata je lečeno sa ili bilo kojom od dve dostupne formulacije, i generalno, pokazana je sigurnost i efikasnost obe (Hoffmann, Orphanet J Rare Dis.2009;4:21).

[0004] Klinička iskustva su pokazala da dostupne kompozicije rekombinantog enzima se razlikuju u pogledu tolerance pacijenta, imunogenosti, doznog režima i kliničke efikasnosti (Hoffmann, Orphanet J Rare Dis.2009;4:21). Još jedan nedostatak je u vezi sa postojećim rekombinantim enzimima je njihova cena, koja može predstavljati teško ekonomsko opterećenje na zdravstvene sisteme. Visoka cena ovih rekombinantih enzima, kada se proizvode u ćelijskim kulturama sisara, bioreaktorima ili ćelijama insekata su posledica prečišćavanja kompleksa i modifikacije protokola, i relativno velikih količina terapeutika potrebnih za postojeća lečenja. Prema tome, postoji urgentna potreba za smanjivanjem cene α-galaktozidaze tako da ova terapija koja spašava život može biti dostupnija onima kojima je to potrebno .

[0005] Humani lizozomni enzimi mogu biti dobijeni u transgenim biljkama u cilju rešavanja problema sigurnosti, virusnih infekcija, imunih reakcija, prinosa proizvodnje i cene. US 2002/0088024 opisuje ekspresiju u biljnim ćelijama rekombinantne humane α-galaktozidaze, pomoću signalnog peptida pirinčane-amilaze koji cilja ER, i humane α-galaktozidazne kodirajuće sekvence skraćene na C-krajnjem delu radi efikasnosti ekspresije i sekrecije u intracelularnu tečnost.

[0006] WO 97/10353 opisuje proizvodnju lizozomnih enzima u biljkama, specifično IDUA i glukocerebrozidaze, korišćenjem ranom izazvanog MeGA promotera i FLAG taga za regeneraciju. WO 97/10353 ne obezbeđuje uputstvo za specifične konstrukte koji eksprimuju rekombinantnu humanu α-galaktozidazu.

[0007] Cramer et al. (Curr. Topics Trans. 1999 Plants 95-118) daje pregled postupaka ekspresije glukocerebrozidaze i IDUA u biljkama na sličan način kao u WO 97/10353, što je u endomembrani (IF) lišća duvana, i opisuje generalno ekspresiju u biljkama ali ne obezdeđuje uputstvo za ekspresiju humane rekombinantne galaktozidaze.

[0008] US2006-0204487 opisuje postupke za ekspresiju humanih lizozomih enzima u biljkama, pri čemu se koriste različite strategije za lečenje rekombinantih polipeptida (specifično, glukocerebrozidaze) za efikasnu glikozilaciju i remodelovanje glikana. Kloniranje i ekspresija rekombinantne humane α-galaktozidaze iz specifičnih konstrukta nije opisano.

[0009] WO2007/010533 opisuje davanje rekombinantih bioaktivnih molekula eksprimovanih u biljnim ćelijama, na primer, lizozomni enzimi kao što je humana glukocerebrozidaza i humana α-galaktozidaza. Kloniranje i ekspresija rekombinantne humane α-galaktozidaze nije opisana.

[0010] WO2008/132743 opisuje kloniranje humane kodirajuće sekvence α-galaktozidaze u biljni ekspresioni vektor, i njegovu ekspresiju u ćelijama duvana, dovodeći do biološki aktivnog, glikozilovanog enzima α-galaktozdaze pune dužine koji pokazuje preuzimanje u fibroblastima. Međutim, potrebni su napredniji α-galaktozidazni ekspresioni vektori za još više poboljšanu efikasnost ekspresije i proizvodnje rekombinantog humanog α-galaktozidaznog proteina koji ima poboljšanu farmakokinetiku pod kliničkim uslovima .

SUŠTINA PRONALASKA

[0011] Pronalazak je definisan patenim zahtevima. Prema jednom aspektu nekih izvođenja prikaznaog pronalaska obezbeđen je ekspresioni konstrukt nukleinske kiseline, konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiselina koja kodira humani protein α-galaktozidaze , gde humani protein α-galaktozidaze je translatorno spojen za N-kraj sa signalnim peptidom Arabidopsis-a ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum i gde je humani protein α-galaktozidaze translatorno spojen za C-terminal sa signalnim peptidom zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu.

[0012] Prema jednom aspektu nekih izvođenja prikazanog pronalaska obezbeđen je humani protein αgalaktozidaze koji ima N-terminalni glicinski ostatak, gde humani protein α-galaktozidaze je translatorno spojen za C-kraj sa signalnim peptidom zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu.

[0013] Prema nekim izvođenjima pronalaska, sekvenca nukleinske kiseline sadrži SEQ ID NO: 22.

[0014] Prema nekim izvođenjima pronalaska signalni peptid Arabidopsis ABPI koji cilja enoplazmatični retikulum je dat kao SEQ ID NO: 4.

[0015] Prema nekim izvođenjima pronalaska, konstrukt nukleinske kiseline sadrži sekvencu nukleinske kiselina koja kodira signalni peptid koji cilja endoplazmatični retikukum koji je dat u SEQ ID NO: 5.

[0016] Prema nekim izvođenjima pronalaska, signalni peptid zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu je dat u SEQ ID NO: 6.

[0017] Prema nekim izvođenjima pronalaska, konstrukt nukleinske kiseline sadrži sekvencu nukleinske kiselina koja kodira peptid zadržavanja u enoplazmatilnom retikulumu dat u SEQ ID NO: 19.

[0018] Prema nekim izvođenjima pronalaska, sekvenca nukleinske kiselima ima sekvencu datu u SEQ ID NO: 2

[0019] Prema nekim izvođenjima pronalaska, humani protein α-galaktozidaze ima aminokiselinsku sekvencu koja je data u SEQ ID NO: 1.

[0020] Prema nekim izvođenjima pronalaska, upotreba kodona sekvence nukleinske kiseline je optimizirana za Nicotinia tabaccum.

[0021] Prema nekim aspektima izvođenja pronalaska obezbeđena je izolovana ćelija koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline prema pronalasku.

[0022] Prema nekim izvođenjima pronalaska, ćelija rekombinanto proizvodi humani enzim αgalaktozidazu.

[0023] Prema nekim izvođenjima pronalaska, humana α-galaktozidaza sadrži N-terminalni glicinski ostatak.

[0024] Ćelija je biljna ćelija.

[0025] Prema nekim izvođenjima pronalaska, biljna ćelija je ćelija duvana .

[0026] Prema nekim izvođenjima pronalaska, ćelija duvana je Y-2 ćelija.

[0027] Prema nekim izvođenjima pronalaska, humani α-galaktozidazni protein je rekombinanto proizveden tako da ima bar jedan izloženi manozni ostatak .

[0028] Prema nekim izvođenjima pronalaska, humani protein α-galaktozidaze je rekombinanto proizveden tako da ima bar jednu β-(1,2) ksilozu u osnovnoj strukturi ili nar jednu α-(1,3) fukozu u osnovnoj strukturi ili obe .

[0029] Prema nekim izvođenjima pronalaska, konstrukt nukleinske kiseline je stabilno integrisan u genom ćelije .

[0030] Prema nekim izvođenjima pronalaska, ćelija je ćelija Agrobacterium tumefaciens .

[0031] Prema jednom aspektu nekih izvođenja prikazanog pronalaska obezbeđen je postupak za dobijanje rekominantog humanog proteina α-galaktozidaze, koji obuhvata obezbeđivanje ćelije prema pronalasku; i gajenje ćelije tako da proizvede rekombinanti humani protein α-galaktozidaze; i izolovanje rekombinantnog humanog proteina α-galaktozidaze iz ćelije.

[0032] Prema nekim izvođenjima pronalaska, ćelija je izolovana ćelija kultivisana u ćelijskom medijumu za kulture.

[0033] Prema nekim izvođenjima pronalaska, kultivisanje se postiže u jednokratnom reaktoru .

[0034] Prema nekim izvođenjima pronalaska, humani protein α-galaktozidaze, ima aminokiselinsku sekvencu koja je data u SEQ ID NO: 16.

[0035] Prema jednom aspektu nekih izvođenja prikazanog pronalaska obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži aktivno sredstvo, humani protein α-galaktozidaze prema prikazanom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0036] Prema jednom aspektu nekih izvođenja prikazanog pronalaska obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži, aktivno sredstvo, ćeliju prema prikazanom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0037] Prema jednom aspektu nekih izvođenja prikazanog pronalaska obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži, aktivno sredstvo, populaciju humanih proteina α-galaktozidaze prema pronalasku, gde predominantne strukture glikana pomenute populacije humanih proteina αgalaktozidaze su manoza 4-β-(1,2) ksiloza (M4X); manoza 3-β-(1,2) ksiloza- α-(1,3) fukoza [Fc(3)M3X] i manoza 8 (M8), i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0038] Prema jednom aspektu nekih izvođenja prikazanog pronalaska obezbeđen je postupak lečenja Faberove bolesti kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje subjektu farmaceutske kompozicije prema pronalasku.

[0039] Prema jednom aspektu nekih izvođenja prikazanog pronalaska obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži humani protein α-galaktozidaze prema pronalasku, koji ima strukturu glikana koja sadrži devet manoznih ostataka, gde su tri izložena manozna ostatak i farmaceutski prihvatljiv nosač. Humani protein α-galaktozidaza koji ima strukturu glikana sadrži devet manoznih ostataka, gde su tri manozna izložena ostatka mogu biti 0.5%, 0.8%, 1.0%, 1.3%, 2% ili više populacije humanih proteina α-galaktozidaze kompozicije.

[0040] Prema jednom aspektu nekih izvođenja prikazanog pronalaska obezbeđen je postupak lečenja Fabrijeve bolesti kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje subjektu farmaceutske kompozicije koja sadrži ćelije prema pronalasku .

[0041] Prema jednom aspektu nekih izvođenja prikazanog pronalaska obezbeđena je upotreba humanog proteina α-galaktozidaze prema pronalasku za proizvodnju leka za lečenje Fabrijeve bolesti kod subjekta kome je to potrebno.

[0042] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i/ili naučni izrazi koji su ovde korišćeni imaju uobičajena značenja poznata osobi iz oblasti na koju se odnosi pronalazak. Mada postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima ovde opisanim mogu biti korišćeni u praksi ili testrianju izvođenja pronalaska, primeri postupaka i/ili materijala su dole opisani. U slučaju konfilkta, opis patenta, uključujući definicije je merodavan. Pored toga, materijali, postupci i primeri su samo za ilustraciju i nemaju nameru da ograničavaju.

KRATAK OPISA SLIKA NACRTA

[0043] Neka izvođenja prema pronalasku su ovde opisana, samo kao primeri, sa pozivanjem na prateće slike. Sa specifičnim pozivanjem na detalje sa crteža, istaknuto je da je sve dato kao primer i za svrhe ilustrativne diskusije izvođenja prema pronalasku. U ovom pogledu, opis uzet zajedno sa nacrtima čini očiglednim osobama iz struke kako izvođenja prema pronalasku mogu biti izvedena.

[0044] Na slikama nacrta:

SLIKA. 1 je poravnanje aminokiselinske sekvence α-galaktozidaze kodirane nukleinskom kiselinom prema pronalasku (SEQ ID NO: 1, niža sekveca), i prirodni humani protein αgalaktozidaze (GenBank: X05790, gornja sekvenca), uključujući prirodni signalni vodeći peptid (SEQ ID NO: 3, obeleženo crveno). Signalni peptid Arabidopsis ABPI koji cilja enoplazmatični retikulum (SEQ ID NO: 4) je obeležen zeleno. Signalni peptid SEKDEL zadržavanja u enoplazmatičnom retikulumu (SEQ ID NO: 6) je smešten na C-kraj proteina eksprimovanog u biljci. Sekvenca zrelog prirodnog proteina enzima α-galaktozidaze (SEQ ID NO: 7) je obeležena žuto.

SLIKA 2 je skenirani SDS-PAGE gel koji ilustruje ekspresione nivoe raznovrsnih humanih αgalaktozidazih konstrukata u biljakama. Ekstrakti lišća iz biljaka N. benthamaina infiltrirani sa različitim humanim konstruktima α-galaktozidaze su odvojeni na 12% SDS-PAGE redukovanom gelu, i bojeni sa Coomassie Blue radi vizuelizacije proteina. Traka 1= proizvodi ekspresije konstrukta (SEQ ID NO:8) koji kodira α-galaktozidazu sa signalim peptidom jabučne pektinaze koji cilja enoplazmatilni retikulum (signalni peptid jabučne pektinaze=SEQ ID NO: 9). Traka 2= proizvodi ekspresije SEQ ID NO: 2, koji kodira α-galaktozidazu sa signalnim peptidom ABPI koji cilja endoplazmatilni retikulum (ABPI signalni peptid = SEQ ID NO: 4). Traka 3= proizvodi ekspresije SEQ ID NO: 11, koji kodira SEQ ID NO:12 sa signalnim peptidom jabučne pektinaze koji cilja endoplazmatični retikulum (SEQ ID NO: 9). Traka 4= Negativna (bez kodirajuće sekvence α-galaktozidaze) kontrola. Istaknuta traka u traci 2 (strelica) odgovara veličini zrelog rekombinantnog monomera α-galaktozidazne (SEQ ID NO: 21). Coomassie obojena traka ukazuje na mnoštvo proteina α-galaktozidaze;

FIG. 3 je histogram koji pokazuje nivoe katalitičke aktivnosti u ekstraktima biljaka koji eksprimuju različite humane konstrukte α-galaktozidaze. Lišće biljaka N. benthamaina je infiltrirano sa različitim humanim konstruktima α-galaktozidaze kao što sledi: A= SEQ ID NO: 8, kodira protein α-galaktozidaze sa signalnim proteinom jabučne peptidaze koji cilja enoplazmatični retikulm (signalni peptid jabučne peptidaze = SEQ ID NO: 9). B= SEQ ID NO: 2, koji kordira protein α-galaktozidaze sa signalnim peptidom ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum (ABPI signalni peptid = SEQ ID NO: 4). C= SEQ ID NO: 13, kodira protein αgalaktozidaze sa signalim proteinom endohitinaze B koji cilja endoplazmatični retikulum (signalni protein endohitinaze=SEQ ID NO: 14). D= SEQ ID NO: 11, koji kodira protein αgalaktozidaze (SEQ ID NO: 12) sa signalim pepridom jabučne pektinaze koji cilja enodplazmatični retikulum (signalna sekvenca jabučne pektinaze = SEQ ID NO: 9). Lišće iz odgovarajućih biljaka je ekstrahovano u puferu za testove aktivnosti, i katalitička aktivnost je određena pomoću p-nitrofenilalfa-D-galaktopiranozida (pNP-alfa-D-Gal, GBB1290, IRIS Biotech, Germany) kao supstrata za hidrolizu. Stvaranje p-nitrofenolatne hromofore je praćeno na 405 nm;

SLIKA.4 je grafik koji upoređuje stabilnost dve biljne rekombinantne humane α-galaktozidaze u humanoj plazmi (37 °C) merenu zaistalom katalitičkoom aktivnošću . α-galaktozidaza iz lišća biljaka N. benthamaina transformisanja sa SEQ ID NO: 11, kodira SEQ ID NO:12 sa signalnim peptidom jabučne pektinaze koji cilja enoplazmatični retikulum (otvoreni kvadrati) i αgalaktozidaze iz lišća biljaka N. benthamaina transformisanim sa SEQ ID NO: 2, kodira αgalaktozidazu (SEQ ID NO: 1) koja ima signalni peptid ABPI koji cilja enoplazmatični retikulum (zatvoreni kvadrati) je prečišćen uništavanjem biljke, isoljavanjem i hromatografijom, i inkubiranjem u humanoj plazmi na 37 °C u toku do 1 sata, da bi se stimulisala in-vivo farmakokinetika. Uzorci su testirani na katalitičkiu aktivnost α-galaktozidaze sa PNP-G testom u naznačenim intervalima. Primetite veću stabilnost α-galaktozidaze iz lišća biljaka N. benthamaina koje ekprimiju SEQ ID NO: 1 (zatvoreni kvadrati);

SLIKA.5 je grafik koji upoređuje stabilnost katalitičke aktivnost biljnih ćelija koje eksprimuju αgalaktozidazu (zatvoreni kvadrati) sa komercijalnom humanom recombinantnom αgalaktozidazom eksprimovanom u kulturi humanih ćelija (Replagal®, otvoreni trouglovi). Neprečišćeni ekstrakti BY2 ćelija koji eksprimuju SEQ ID NO: 2, kodiraju α-galaktozidazu (SEQ ID NO: 1) koja ima signalni peptid ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum (zatvoreni kvadrati) i humana rekombinanta α-galaktozidaza eksprimovana u ćelijskoj kulturi sisara (Replagal®, otvoreni trouglovi), su inkubirani u plazmi na 37 °C do 1 sata, da bi se stimulisala in-vivo farmakokinetika. Uzorci su testiranu na katalitičku aktivnost α-galaktozidaze sa PNP-G testom u naznačenim intervalima. Primetiti sličnu stabilnost enzima eksprimovanih u biljnim ćelijama i humanim ćelijama;

SLIKA. 6 je grafik koji upoređuje stabilnost katalitičke aktivnosti α-galaktozidaze (zatvoreni kvadrati) eksprimovane u biljci sa onom komercijalne humane rekomninantne α-galaktozidaze eksprimovane u humanoj ćelijskoj kulturi (Replagal®, otvoreni trouglovi). Neprečišćeni ekstrakt BY2 ćelija koje eksprimuju SEQ ID NO: 2, kodira α-galaktozidazu (SEQ ID NO: 1) koja ima signalni peptid ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum (zatvoreni kvadrati) i humana rekombinantna α-galaktozidaza eksprimovana u ćelijskoj kulturi sisara (Replagal®, open triangles), su inkubirane pod uslovima koji stimulišu okolinu lizozoma [kiseli (pH 4.6)] na 37 °C do 11 dana. Uzorci su testirani na katalitičku aktivnost α-galaktozidaze sa PNP-G testom u naznačenim intervalima, dok su inkubirani. Primetite sličnu stabilnost enzima eksprimovanih u biljkama i u sisarima do 9 dana;

SLIKA.7 je hromogram koji pokazuje raspoređenost struktura glikana u proizvodima cepanja glikozilaznom α-galaktozidaze eksprimovane u biljnim ćelijama. Uzorci ekstrakta BY2 ćelija koje eksprimuju SEQ ID NO: 2, koji kodiraju α-galaktozidazu (SEQ ID NO: 1) koja ima signalni peptid ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum su redukovani, alkilovani i odvojeni na SDS-PAGE. Proteinske trake su sakupljene za analizu glikana cepanjem sa tripsinom pračeno sa cepanjem i PNGazom A i PNGazom F . Dobijeni slobodni glikani su ekstrahovani, prečišćeni, obeleženi sa fluorescentnim reagensom antranilamidom (2AB), odvojeni pomoću TSK gel Amida 80 sa normalno faznim HPLC-om, i detektovani pomoću fluorescentog detektora . Primetite glavne signale na 5.9 i 8.9 GU (84.55 minuta i 108.05 minuta), i manje signale M9 na 112.35; SLIKA. 8 je tabela koja pokazuje profil glikana biljne ćelije koja eksprimuje α-galaktozidazu, izražene kao procentna površina pojedinačnih glikana prikazanih u hromogranu na slici 7. Primetiti identične profile svake nezavisne analize (A i B).

OPIS SPECIFIČNIH IZVOĐENJA PRONALASKA

[0045] Prikazani pronalazak, u nekim njegovim izvođenjma, odnosi se na ekspresioni vektor za rekombinantnu ekspresiju humane α-galaktozidaze u biljnim ćelijama, postupke za njihovou ekspresiju u biljnim ćelijama i tako dobijenu humanu α-galaktozidazu.

[0046] Razume se da pronalazak nije neophodno ograničen na njegovu primenu do detalja datih u sledećem opisu ili prikazanom u primerima. Pronalazak može biti izveden u drugim izvođenjima ili izveden na različite načine.

[0047] Navedeni pronalazači su konstruisali ekspresioni vektor za rekombinantnu ekspresiju humane α-galaktozidaze u biljnim ćelijama, transformisanim biljkama duvana i biljnim ćelijama sa vektorom, i izolovali su katalitički aktivnu humanu α-galaktozidazu iz biljaka i ćelijskih kultura. Eksprimovana rekombinantna humana α-galaktozidaza zadržava korisnu katalitičku aktivnost pod uslovima koji simuliraju one koji se normalno sreću pri in-vivo davanju, sugerišući poboljšano simuliranu farmakokinetiku u poređenju sa drugom rekombinantiom humanom α-galaktozidazom poreklom iz biljke, i sličnom onoj rekombinantnoj humanoj α-galaktozidazi (Replagal®)eksprimovanoj u sisarima

[0048] Prema tome, prema jednom aspektu prikazanog pronalaska, obezbeđen je ekspresioni konstrukt nukleinske kiseline, konstrukt se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani protein α-galaktozidaze, gde humani protein α-galaktozidaze je translaciono povezan za N-kraj sa signalnin peptidom Arabidopsis ABPI koji cilja enodplazmatični retikulum i gde humani protein αgalaktozidaze je translatorno povezan za C-kraj sa signalnim peptidom zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu.

[0049] Ovde korišćeni izraz "humani protein α-galaktozidaze " odnosi se na humani polipeptid agalaktozidaze A (a-D-galaktozid galaktohidrolaza; EC 3.2.1.22; a-Gal A) . Prema nekim izvođenjima pronalaska, humani protein α-galaktozidaze je zreli humani protein α-galaktozidaze, koji ima aminokiselinsku sekvencu datu kad SEQ ID NO: 7 (zreli humani A-Gal). Smatra se da humani α-protein galaktozidaze može biti modifikovani humani protein α-galaktozidaze, koji ima aminokiselinsku sekvencu različuitu od SEQ ID NO: 7. Jedan neograničavajući primer modifikovanog humanog proteina α-galaktozidaze kodiranog ekspresionim vektorom prema pronalasku je SEQ ID NO: 16 (G-A-Gal). U još jednom neograničavajućem primeru humanog proteina α-galaktozidaze kodiranog sa ekspresionim vektorom može biti smeša humanim proteina α-galaktozidaze koji sadrže oba proteina α-galaktozidaze koja imaju N-terminal glicinski ostatak (G), kao što je SEQ ID NO: 16 ili SEQ ID NO: 21, i odsutan jedan N-terminalni glicinski ostatak, kao što je, ali bez ograničenja na SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 20.

[0050] Prema jeoš jednom aspektu pronalaska, humani protein α-galaktozidaze je translatorno spojen za N-kraj sa signalnim peptidom Arabidopsis ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum i humani protein α-galaktozidaze je takođe translatorno spojen za C-kraj sa signalnim peptidom zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu .

[0051] Kako je ovde korišćen izraz "translaciono spojen za N-kraj" ili "translaciono spojen za C-kraj" odnosi se na kovalentno vezivanje navedenog peptida pomoću peptidne veze za N-kraj ili C-kraj aminokiseline zrelog humanog proteina α-galaktozidaze tipično kao rezultata rekombinantne ekspresije.

[0052] Kako je ovde korišćeno, izraz "signalni peptid Arabidopsis ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum" odnosi se na vodeću peptidnu sekvencu vezujućeg proteina auksina Arabidopsis thaliana (Uni-Prot Accession No. P33487), koji je u stanju da usmerava eksprimovani proteinu u endoplazmatični retikulum u okviru biljne ćelije. U jednom izvođenju, signalni peptid Arabidopsis ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum je polipeptid od 33 aminokiseline kako je prikazano u SEQ ID NO: 4.

[0053] Kako je ovde korišćeno, izraz "signalni peptid zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu" odnosi se na peptidnu sekvencu koja, kada je prisutna na N-ili C-kraju polipeptida, izaziva da polipeptid bude preuzet iz Goldžijevog aparata, i zadržan u endoplazmatičnom retikulumu (videti Rayon et al. Journal of Experimental Botany, Vol. 49, No. 326, pp. 1463-1472, 1998; i Neumann, et al Annals of Botany, 2003;92:167-180). U jednom izvođenju, signalni peptid zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu je KDEL (SEQ ID NO: 17) ili SEKDEL (SEQ ID NO: 6). Drugi pogodni biljni signali endoplazmatičnog retikuluma su poznati u stanju tehnike (videti Pagny et al, Journal of Experimental Botany, Vol.50, pp.157-64).

[0054] Prema tome, prema izvođenju prikazanog pronalaska, humani protein α-galaktozidaze translatorno je spojen za N-kraju sa signalnim peptidom Arabidopsis ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum i humani protein α-galaktozidaze translatorno spojen za C-krajem signalnog peptida retencije u endoplazmatičnom retikulumu koji ima aminokiselinsku sekvencu datu kao SEQ ID NO: 1.

[0055] Ovde korišćen izran "sekvenca nukleinske kiseline" odnosi se na pojedinačnu ili dvostruku sekvencu nukleinske kiseline koja je izolovana i obezbeđena u obliku RNK sekvence, komplementarne polinukleotidne sekvence (cDNK), genomske polinukleotidne sekvence i/ili mešovite polinukleotidne sekvence (npr., kombinacije gore pomenutih).

[0056] Ovde korišćena fraza "komlementarna polinukleotidna sekvenca" odnosi se na sekvencu, koja rezultuje iz reverzne transkripcije informacione RNK korišćnjem reverzne transkriptaze ili bilo koje druge RNK zavisne DNK polimeraze. Takva sekvenca može biti naknadno pojačana in vivo ili in vitro pomoću DNK zavisne DNK polimeraze.

[0057] Ovde korišćena fraza "genomska polinukleotidna sekvenca" odnosi se na sekvencu koja potiče (izolovana je) iz hromozoma i prema tome predstavlja susedni deo hromozoma .

[0058] Ovde korišćena fraza "mešovita polinukleotidna sekvenca" odnosi se na sekvencu, koja je bar delimično komplementarna i bar parcijalno genomska. Mešovita sekvenca može obuhvatati neke egzonske sekvence potrebne za kodiranje polipetida prikazanog pronalaska, kao i neke intronske sekvence umetnute između njih. Intronske sekvence mogu biti iz bilo kog izvora, uključujući druge gene, i tipično će uključivati konzervativne spajajuće signalne sekvence. Takve intronske sekvence mogu dalje uključivati cis delujuće ekspresione regulatorne elemente.

[0059] Prema nekim izvođenjima prikazanog pronalaska, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide prema prikazanom pronalasku su optimizirane za ekspresuju. Primeri takvih modifikacija sekvenca uključuju, ali bez ograničenja, izmenjeni sadržaj G/C da bi se približilo onome koji se uobičajeno nalazi u biljnim vrstama od interesa, i uklanjanje kodona koji se atipično nalaze u biljnim vrstama na koje se uobičajeno poziva kao na optimizaciju kodona. U jednom izvođenju, upotreba kodona sekvence nukleinske kiselinekoja kodira humani protein α-galaktozidaze translatorno spojen za N-kraj sa signalnim peptidom Arabidopsis ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum i humani protein α-galaktozidaze i translatorno spojen za C-kraj sa signalnim pepetidom zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu je optimiziran za Nicotiana tobacuum ili Nicotiana benthamiana.

[0060] Fraza "optimizacija kodona" odnosi se na odabir odgovarajućih DNK nukleotida za upotrebu u okviru strukturnog gena ili njegovog fragmenta koji približavaju upotrebu kodona u okviru biljke od interesa. Prema tome, optimizirani gen ili nukleinska sekvenca odnosi se na gen u kome nukleotidna sekvenca prirodnog ili gena koji se javlja u prirodi je bila modifikovana u cilju upotrebe statitstički poželjnih ili statistički favorizovanih kodona u okviru biljke. Nukleotidna sekvenca je tipično ispitivana na DNK nivou i kodirajući region optimiziran za ekspresiju u biljnoj vrsti određen upotrebom pogodnog postupka, na primer opisan u Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). U ovom postupku, standardna devijacija upotrebe kodona, mera odstupanja upotrebnjenog kodona , može biti izračunata prvo pronalaženjem proporcijalne kvadratne devijacije upotrebe svakog kodona prirodnog gena u odnosi na visoko eksprimovane gene biljke, praćeno izračunavanjem srednje vrednosti kvadratne devijacije. Korišćena formula je : 1 SDCU = n = 1 N [(Xn -Yn) / Yn] 2 / N, gde Xn se odnosi na frekvencu upotrebe kodona n u genu od interesa i N se odnosi na ukupan broj kodona u genu od interesa. Tabela upotrebe kodona iz visoko eksprimovanih gena dikotiledonih biljaka je sastavljanja korišćenjem podataka Murray et al. (1989, Nuc Acids Res.17:477-498).

[0061] Jedan postupak optimizacije sekvence nukleinske kiseline prema poželjnoj upotrebi kodona za posebnu biljnu ćeliju je zasnovan na direktnoj upotrebi, bez izvođenja bilo kojih posebnih statističkih izračunavanja, Taela optimizacije kodona kao što su one obezbeđene on-line u Codon Usage Database preko NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences) DNK banci u Japanu (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) kazusa (dot) or (dot) jp/codon/). Codon Usage Database sadrži tabele upotrebe kodona za brojne različite vrste, sa svakom tabelom upotrebe kodona koja je statistički određena na osnovi prisutnih podataka u Genbank.

[0062] Korišćenjem gornjih Tabela za određivanje najpoželjnijih ili najpogodnih kodona za svaku aminokiselinu posebne vrste (na primer, pirinča), nukleotidne sekvence koja se javlja u prirodi koja kodira protein od interesa može biti kodon optimiziran za posebne biljne vrste. Ovo se postiže zamenom kodona koji imaju nisko statističku javljanje u posebnim vrstama genoma sa odgovarajućim kodonima, u odnosu na aminokiseline , koje su statistički pogodnije. Međutim, jedan ili više manje pogodnih kodona može biti izabrano da izbriše postojeća restrikciona mesta, da se stvore nova na potencijalno korisnim spojevima (5’ i 3’ krajevima da se doda signalni peptid ili terminacione kasete, unutrašnja mesta koja mogu biti korišćena za isecanje i povezivanje segmenata zajedno da bi se dobila tačna sekvenca pune dužine ), ili da se eliminišu nukleotidne sekvence koje mogu negativno uticati na stabilnost ili ekspresiju mRNK .

[0063] Željene kodirajuće nukleotidne sekvence mogu već, pre bilo koje modifikacije, sadržati brojne kodone koji odgovaraju statistički pogodnom kodonu u posebnim biljnim vrstama. Prema tome, optimizacija kodona prirodne nukelotidne sekvence može sadržati određivanje koje kodone, u okviru željene nukleotidne sekvence , nisu statistički pogodni u odnosu na određenju biljku, i modifikovanje ovih kodona prema tabelama upotrebe kodna određene biljke da se proizvede derivat optimizovanog kodona. Modifikovana nukleotidna sekvenca može biti potpuno ili parcijalno optimizirana za upotrebu

1

biljnog kodona uz uslov da protein kodiran sa modifikovanom nukleotidnom sekvencom je proizveden na višem nivou od proteina koji kodira odgovarajući gen koji se javlja u prirodi ili prirodni gen. Konstrukcija sintetskih gena menjanjem upotrebe kodona je opisana na primer PCT Patentnoj prijavi 93/07278.

[0064] Prema nekim izvođenjima pronalaska, humani protein α-galaktozidaze je kodiran sa sekvencom nukleinske kiselina koja je data u SEQ ID NO: 18. Prema daljim izvođenjima pronalaska, signalni peptid Arabidopsis ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum je kodiran sa sekvencom nukleinske kiselina koja je data kao SEQ ID NO: 5. Prema još jednom daljem izvođenju signalni peptid zadržavanja u endoplazmatilčnom retikulumu je kodiran sa sekvencom nukleinske kiseline koja je data u SEQ ID NO: 19. Prema još jednom drugom izvođenju humani protein α-galaktozidaze translatorno spojen za N-kraj sa signalnim peptidom Arabidopsis ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum i humani protein αgalaktozidaze i translaciono spojen za C-kraj sa signalnim peptidom zadržavanja endoplazmatičnog retikuluma je kodiran sa sekvencom nukleotidne kiseline date u SEQ ID NO: 2.

[0065] Kako je ovde korišćen izraz "ekspresioni konstrukt nukleinske kiseline" odnosi se na konstrukt nukleinske kiselina koji obuhvata nukleinsku kiselinu nekih izvođenja prema pronalasku (npr., SEQ ID NO: 2) i bar jedan promoter za usmeravanje transkripcije nukleinske kiseline u biljnoj ćeliji domaćina. Drugi detalji pogodnih prilaza transformaciji su dole dati.

[0066] Prema nekim izvođenjima pronalaska, obezbeđen je ekspresioni konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema pronalasku, i promoter za usmeravanja transkripcije sekvence nukleinske kiseline u biljnoj ćeliji domaćina.

[0067] Prema nekim izvođenjima pronalaska, nukleinska kiselina je poželjno povezana sa sekvencom promoterom.

[0068] Kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline "operativno vezana" za regulatornu sekvencu (npr., promoter) ukoliko je regulatorna sekvenca u stanju da pokaže regulatorni efekat na kodirajuću sekvencu koja je za nju vezana.

[0069] Bilo koja pogodna sekvenca promotera može biti korišćena od strane konstrukta nukleinske kiseline prema prikazanom pronalasku. Poželjno promoter je konstitutivni promoter, specifičan za tkivo, ili induktibilni promoter.

[0070] Odavde korišćena fraza "biljno-eksprimovani" odnosi se na sekvencu promotera, uključujući bilo koje dodatne regulacione elemente dodate u njih ili koji ih sadrže, koji su bar u stanju da izazovu, ustanove, aktiviraju ili poboljšanju ekspresiju u biljnoj ćeliji, tkivu ili organu, poželjno monokotiledone ili dikotiledone biljne ćelije, tkiva ili organa. Takav promoter može biti konstitutivan, tj., sposoban da upravlja visokim nivoom ekspresije gena u velikom broju tkiva, tkivima specifičnim tj., sposobnim da upravljaju ekspresijom gena u određenom tkivu ili tkivima, tj., u stanju da upravlja ekspresijom gena uz podsticaj ili himerno, tj. obrazovanjem dela bar dva različita promotera .

[0071] Primeri poželjnih promotera korisnih u postupcima istih izvođenja prema pronalasku su prisutni u Tabelama I, II, III i IV.

Tabela I

Tabela II

(nastavak)

Tabela III

1 Tabela IV

(nastavak)

1

(nastavak)

1

[0072] Prema specifičnom izvođenju, korišćeni promoter korišćen u predmetnom pronalasku je jak i konstitutivni promoter tako da prekomerna ekspresija inserta konstrukta je postignuta sledećom transformacijom. U izvesnim izvođenjima, promoter je promoter Aktin 2 (ACT2) Arabidopsis (pristupni broj: U41998, videti gore tabelu I ).

[0073] Konstrukt nukleinske kiseline nekih izvođenja prema pronalasku može dalje uključivati odgovarajući selektivni marker i/ili poreklo replikacije. Prema nekim izvođenjima pronalaska, konstrukt nukleinske kiseline je korišćen kao šatl vektor, koji se može razmnožavati i u E. coli (gde konstrukt sadrži odgovarajući selektivni marker i poreklo replikacije) i može biti kompatibilan sa propagacijom u ćelijama. Konstrukt prema prikazanom pronalasku može biti na primer, plazmid, bakmid, fagemid, kozmid, fag, virus ili veštački hromozom .

[0074] Konstrukt nukleinske kiseline nekih izvođenja prema pronalasku može biti korišćen da stabilno ili prelazno transformiše biljne ćelije. U stabilnoj transformaciji, nukleinska kiselina je integrisana u genom biljke i kao takva predstavlja stabilnu i naslednu osobinu. U trenutnim transformacija , egzogeni polinukleotid je eksprimovan u transformisanim ćelijama ali nije ugrađen u genom i kao takav predstavlja prolaznu osobinu.

[0075] Prema tome, prema nekim aspektima prikazanog pronalaska, obezbeđena je izolovana ćelija koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline prema pronalasku.

[0076] Ovde korišćen izraz "izolovana ćelija" odnosi se na ćeliju bar delom odvojenu od biljke. U istim izvođenjima, izolovana ćelija je biljna ćelija cele biljke. Izolovana ćelije je biljna ćelija, na primer,biljna ćelija u kulturi .

[0077] Izraz ’"biljka" koji je ovde korišćen obuhvata cele biljke, pretke i potomstvo biljaka i biljnih delova, uključujući semena, izdanke, korene (uključujući lukovice), i biljne ćelije, tkiva i organe. Biljka može biti u bilo kom obliku uključujući supenzione kulture, embrione, meristemske regione, kalusno tkivo, lišće, gametofite, sporofite, polen, i mikrospore. Biljke su naročito korisne u postupcima prema pronalasku obuhvataju sve biljke koje pripadaju superfamiliji Viridiplantae, posebno monokotiledonim i dikotiledonim biljkama uključujući stočne i krmne mahunarke, ukrasne biljke, jestive useve, drvo ili grm izabran iz grupe koju čine Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva,

1

Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amarant, artičoka, špargla, brokoli, kelj pupčar, kupus,kanola, šargarepa, karfiol, celer, raštan, lan, kelj, sočivo, uljana repica, bamija, crni luk, krompir, pirinač, soja, slama, šećerna repa, šećerna trska, suncokret, paradajz,bundeva čaj, kukuruz, pšenica, ječam, žito, ovas, kikiriki, grašak, sočivo i lucerka, pamuk, uljana repica, kanola, biber, suncokret, duvan, patlidžan, eukaliptus, drvo, ukrasna biljka, višegodišnja trava i krmni usev. Alternativno, alge i druge ne-Viridiplantae mogu biti korišćene za postupke prema prikazanom pronalasku .

[0078] Prema nekim izvođenjima pronalaska, biljka ili biljna ćelija koja je korišćena u postupku prema pronalasku je usevna biljka ili ćelija usevne biljke kao što je pirinač, kukuruz, pšenica, ječam, kikiriki, krompir, susam, maslinovo drvo, uljana palma, banana, soja, suncokret, kanola, šećerna trska, lucerka, proso, leguminoze (pasulj, grašak), lan, lupina, uljana repica, duvan, topola i pamuk.

[0079] Prema daljim izvođenjima biljne ćelije uključuju ćelije duvana, Agrobacterium rihzogenes transformisane ćelije korena, ćelija celera, ćelija đumbira, ćelija rena i ćelije šargarepe. U jednom izvođenju ćelije duvana su iz linije ćelija duvana, kao što su, ali bez ograničenja svetlo žute ćelije Nicotiana tabacum L. cv (BY-2) (Nagata et al, Int Rev Cytol 1992;132:1-30). Biljne ćelije mogu biti gajene prema bilo kom od tipova pogodnog postupka za kultivisanje, uključujući ali bez ograničenja na kulture na čvrstoj površini (kao što je plastični sud za kultivisanje ili ploča na primer) ili u suspenziji. Treba primetiti da neke ćelije, kao što su BY-2 i ćelije šargarepe mogu biti kultivisane i gajene u suspenziji. Pogodni uređaji i postupci za kultivisanje ćelijskih biljaka u suspenziji je poznato u stanju tehnike, na primer, kao što je opisano u međunarodnim patentim prijavama PCT WO98/13469, WO2005/080544 i WO2007/010533. U još jednom izvođenju ćelije celih biljaka duvana ili biljnih tkiva, uključujući, ali bez ograničenja Nicotiana benthamiana.

[0080] Postoje različiti postupci uvođenja stranih gana u obe monokotiledone i dikotiledone biljke (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

[0081] Osnovni postupci izazivanja stabilne integracije egzogene DNK u biljnu genomsku DNK uključuje dva glavna prilaza:

(i) Genski transfer posredovan agrobakterijom: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol.

38:467-486; Klee and Rogers u Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., i Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, u Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p.93-112.

1

(ii) Direktno DNK preuzimanje: Paszkowski et al., u Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol.6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., i Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p.52-68; uključujući postupke za direktno preuzimanje DNK u protoplaste, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. DNK preuzimanje izazvano sa kratkim elektro šokom biljne ćelije: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. DNK injektovanje u biljne ćelije ili tkiva bombardovanjem česticama, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; upotrebom sistema mikropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformacija ćelijskih kultura embriona ili kalusnog tkiva, staklenim vlaknima ili nitima silikon karbida, U.S. Pat. No. 5,464,765 ili direktnom inkubacijom DNK sa germinativnim polenom, DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p.197-209; and Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

[0082] Agrobakterijski sistem uključuje upotrebu plazmidnih vektora koji sadrže definisane DNK segmente koji su integrisani u biljnu genomsku DNK. Postupci inokulacije biljnog tkiva variraju u zavisnosti od biljne vrste i sistema Agrobakterije za dostavljanje. Široko korišćen pristup je postupak sa lisnim diksom koji može biti izveden sa bilo kojim tkivnim eksplantom koji obezbeđuje dobrar izvor za inicijaciju diferencijacije cele biljke. Videti npr., Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p.1-9. Još jedan prilaz koristi sistem Agrobakterije za davanje u kombinaciji sa vaukuum inflitracijom. Sistem agrobakterije je naročito živ u stvaranju transegenih dikotiledonih biljaka .

[0083] Postoje različiti postupci za usmerenog DNK transfera u biljne ćelije. U elektroporaciji, protoplasti su kratko izloženi jakom električnom polju. U mikroinjekciji, DNK je mehanički injektovan direktino u ćelije koje koriste veoma male mikropipete. U bombardovanju ćelijama, DNK je adsorbovan na mikroprojektile kao što su kristali magnezijum sulfata čestice volframa, i mikroprojektilu su fizički ubrzani u ćelijska ili biljna tkiva.

[0084] Sledeća stabilna transformacija biljne propagacije je izvršena. Najuobičajeniji postupak biljne propagacije pomoću semena. Regeneracija pomoću propagacije semenom, međutim, ima nedostatak koji je usled heterozigotnosti postoji nedostatak jednoobraznosti u usevu, s obzirom da su semena dobijena od biljaka prema genetičkim varijantama koje prate Mendeljejeva pravila. Osnovno, svako takvo seme je genetički različito i svako će rasti sa njegovim sopstvenim specifičnim osobinama. Prema tome, poželjno je da transformisana biljka može biti proizvedena kao takva da regenerisana biljka ima identične osobine i karakteristike roditeljske transgene biljke. Prema tome, poželjno je da transformisana biljka će biti regenerisana mikropropagacijom koja obezbeđuje brzu, konzistentu reprodukciju transformisanih biljaka.

[0085] Mikropropagacija je postupak gajenja nove generacije biljaka iz jednog dela tkiva koji je bio isečen iz odabrane roditeljske biljke ili kultivara . Ovaj postupak dozvoljava masovnu proizvodnju biljaka koje imaju poželjno tkivo koje eksprimuje fuzioni protein. Nova generacija biljaka koje su proizvedene su genetički identične sa njom i imaju sve njene karakteristike, originalne biljke. Mikropropagacija dozvoljava masovnu proizvodnju kvalitetnog biljnog materijala u kratkom vremenskom periodu i nude brzo umnožavanje izabranih kultivara u održavanju karakteritika

1

originalnih trangenih ili transformisanih biljaka. Prednosti kloniranja biljaka su brzina razmnožavanja biljaka i jednoobraznost proizvedenih biljaka.

[0086] Mikropropagacija je višestupni postupak koji zahteva menjanja medijuma za kulture ili uslova rasta u okviru stupnjeva. Prema tome, postupak mikropropagacije uključuje četiri osnovna stupnja: prvi supanj, početno kultivisanje tkiva; drugi stupanj, umnožavanje kulture tkiva; stupanj tri, diferencijacija i obrazovanje biljke; i stupanj četiri, gajenje u stakleniku i očvršćavanje . U toku prvog stupnja, početno kultivisanje tkiva, ustanovljena je kultura tkiva i sertifikovano je bez zagađivača. U toku drugog stupnja, početna kultura tkiva je umnožena do dobijanja dovoljnog broja uzoraka tkiva da bi se ispunio proizvodni cilj. U toku trećeg stupnja, uzorci tkiva gajeni u drugom stupnju su podeljeni i gajeni u pojedinačne biljke. U stupnju četiri, transformisane biljke su premeštene u staklenik za očvršćavanje gde bilna toleranca na svetlo je postepeno povećavana tako da može biti gajena u prirodnom okruženju.

[0087] Prema nekim izvođenjima pronalaska, transgene biljke su stvorene trenutnom transformacijom ćelija na lišću, meristematskim ćelijama ili cele biljke.

[0088] Trenutna transformacija se može postići bilo kojim direktnim postupcima transfera DNK gore opisanim ili virusnom infekcijom korišćenjem modifikovanih biljnih virusa .

[0089] Virusi koji du se pokazali kao korisni za transformaciju biljnih domaćina uključuju CaMV, virus mozaika duvana (TMV), virus mozaika ovsika (BMV) i virus običnog mozaika pasulja (BV ili BCMV). Transformacije biljaka pomoću biljnih virusa su opisane u US pat. br.4,855,237 (virus zlatnog mozaika pasulja; BGV), EP-A 67,553 (TMV), japanskoj objavljenoj prijavi br.63-14693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV); and Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp.172-189 (1988). Čestice Pseudovirusa za upotrebu u ekspresiji strane DNK u mnogo domaćina , uključujući biljke su opisane u WO 87/06261.

[0090] Prema nekim izvođenjima pronalaska, korišćeni virus u trenutnim transformacijama je avirulentan i prema tome je nesposoban da izazove ozbiljne simptome kao što je smanjena stopa rasta, mozaik, prstenaste pege, uvijanje lista, žutilo, pruge, obrazovanje šarke, obrazovanje tumora i brazdanje. Pogodni avirulentni virus može biti avirulentni virus koji se javlja u prirodi ili veštački oslabljeni virus. Slabljenje virusa se može postići korišćenjem postupaka dobro poznatih u ovoj oblasti uključujući, ali bez ograničenja, subletalno zagrevanje, hemijski tretman ili sa direktim tehnikama mutageneze kao što su opisane, na primer kod Kurihara i Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Gal-on et al. (1992), Atreya et al. (1992) and Huet et al. (1994).

[0091] Pogodni sojevi virusa mogu biti dobijeni iz dostupnih izvora, kao što su , na primer, American Type culture Collection (ATCC) ili izolovanji iz inficiranih biljaka. Izolovanje virusa iz inficiranih biljnih tkiva može se postići tehnikama dobro poznatim u oblasti tehnike kao što su opisane na primer kod Foster and Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. Ukratko, tkiva inficiranih biljaka za koje se veruje da sadrže visoke koncentracije pogodnih virusa, poželjno mladi listovi i cvetne latice, su samleveni u rastvoru pufera (npr., fosftnom rastvoru pufera) da se dobije virusom inficirani biljni sok koji može biti korišćen u naknadnim inokulacijama .

2

[0092] Konstrukcija biljnih RNK virusa za uvođenje i ekspresiju nevirusnih sekvenci nukleinske kiseline u biljkama je pokazano u gornjim referencama kao i u Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; and U.S. Pat. No.5,316,931.

[0093] Kada je virus DNK virus, pogodne modifikacije mogu biti napravljene na samom virusu. Alternativno, virus može biti prvo kloniran u bakterijski plazmid radi lakoće konstruisanja željenog virusnog vektora sa stranom DNK. Virus može zatim biti isečen iz plazmida. Ukoliko je virus DNK virus, bakterijsko poreklo replikacije može biti vezano za virusnu DNK, koja je zatim replicirana sa bakterijom. Transkripcija i translacija ove DNK će proizvesti protein omotača koji će inkapsulirati virusnu DNK. Ukoliko je virus RNK virus, virus je generalno kloniran kao cDNK i umetnut je plazmid . Plazmid je zatim korišćen da se naprave svi konstrukti. RNK virus je zatim proizveden transkripcijom virusne sekvence plazmida i translacijom virusnih gena da bi se dobili proteini omotača koji enkapsuliraju virusnu RNK.

[0094] U jednom izvođenju, obezbeđen je biljni virusni polinukleotid u kome je prirodna kodirajuća sekvenca proteinskog omotača izbrisana iz virusnog polinukleotida, neprirodna biljna virusna sekvenca kodiranja proteina omotača i neprirodni promoter, poželjno subgenomski promoter neprirodne sekvence kodiranja proteinskog omotača, u stanju da eksprimuje u biljci domaćinu, pakovanje rekombinantnog virusnog biljnog polinukleotida, i obezbeđivanje sistemske infekcije domaćina rekombinantnim biljnim virusnim polinukleotidom koji je umetnut. Alternativno, gen proteina omotača može biti inaktiviran umetanjem neprirodne polinukleotidne sekvence u nju, tako da se proizvodi protein. Rekombinantni biljni virusni polinukleotid može sadržati jedan ili više neprirodnih subgenomskih promotera. Svaki neprirodni subgenomski promoter je u stanju da se transkribuje ili eksprimuje susedne gene ili polinukleotidne sekvence kod biljke domaćina i nesposoban je za rekombinovanje jedan sa drugim i sa prirodnim subgenomskim promoterom. Neprirodne (strane) polinukleotidne sekvence mogu biti umetnute pored prirodnih biljnih virusnih subgenomskih promotera ili prirodnih i neprirodnih biljnih virusnih subgenomskih promotera ukoliko je uključeno više od jedne polinukleotidne sekvence. Neprirodna polinukleotidna sekvenca je transkribovana ili eksprimovana kod biljnog domačina pod kontrolom subgenomskog promotera da bi se dobili željeni proizvodi.

[0095] U drugim izvođenju, rekombinanti biljni virusni polinukleotid je obezbeđen kao u prvom izvođenju osim što prirodna kodirajuća sekvenca proteina omotača je smeštena pored jedne neprirodnog subgenomskog promotera proteina omotača umesto neprirodne kodirajuće sekvence proteina omotača .

[0096] U trećem izvođenju, obezbeđen je rekombinantni biljni virusni polinukleotid u kome prirodni gen proteina omotača je pored njegovog subgenomskog promotera i jedan ili više subgenomskih promotera je bilo umetnuto u virusni polinukleotid. Umetnuti neprirodni subgenomski promoteri su u stanju da transkribuju ili eksprimuju susedne gene u biljci domaćinu i nisu u stanju da se međusobno rekombinuju i sa prirodnim subgenomskim promoterima. Neprirodne polinukleotidne sekvence mogu biti umetnute pored neprirodnih subgenomskih biljnih virusnih promotera kao što su sekvence transkribovane ili eksprimovane u biljkama domaćinima pod kontrolom subgenomskih promotera da bi se dobio željeni proizvod .

[0097] U četvrtom izvođenju, obezbeđen je rekombinantni biljni virusni polinukletoid kao u trećem izvođenju osim što je prirodna kodirajuća sekvenca proteina omotača zamenjena sa neprirodnom kodirajućom sekvencom proteina omotača .

[0098] Virusni vektori su inkapsulirani sa proteinama omotača kodiranim sa rekombinantnim biljnim virusnim polinukleotidom da bi se dobio rekombinanti biljni virus. Rekombinantni biljni virusni polinukleotid ili rekombinanti biljni virus je korišćen za infekcju odgovarajućih biljaka domaćina. Rekombinanti biljni virusni polinukleotid je u stanju da se replicira u domaćinu, sistemski raširi u domaćinu, i transkripcija ili ekspresija stranog gena (egzogenog polinukleotida) u domaćinu da bi se dobio željeni protein.

[0099] Tehnike za inokulaciju virusa u biljkama se mogu naći kod Foster and Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh and Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; and Kado and Agrawa, eds. "Principles and Techniques in Plant Virology", Van Nostrand-Reinhold, New York.

[0100] Pored gore navedenog, polinukleotid prema prikazanom pronalasku može takođe biti uveden u genom hloroplasta na taj način omogućavajući ekspresiju u hloroplastu .

[0101] Tehnike za unošenje egzogenih sekvenci nukleinske kiseline u genom hloroplasta su poznate. Ova tehnika uključuje sledeće postupke . Prvo, biljne ćelije su hemijski tretirane tako da se redukuje broj hloroplasta po ćeliji do oko jednog. Zatim, egozeni polinukleotid je unet pomoću bombardovanja česticama u ćelije u cilju uvođenja bar jednog egozenog molekula polunukleotida u hloroplaste . Egzogeni polinukleotidi izabrani tako da se integrišu u genom hloroplasta pomoću homolognih rekombinacija koje se lako postižu sa enzimima svojstvenim hloroplastu. Sa ove strane, sekvenca nukleinske kiseline uključuje, pored gena od interesa, bar jedan polinukleotidni deo (engl.’strech’) koji potiče iz genoma hloroplasta. Pored toga, egzogeni polinukleotidi uključuju selektabilni marker, koji služi sekvencionalnim selekcionim postupcima da bi se osiguralo da sve ili suštinske sve kopije genoma hlorplasta koje slede takvu selekciju će uključivati egzogeni polinukleotid. Dalji detalji koji se odnose na ovu tehniku se naleze u U.S. Pat. Nos. 4,945,050; i 5,693,507 na koje se ovde poziva . Polipeptid može prema tome biti dobijen sistemom ekspresije proteina hloroplasta i postati integrisan u unutrašnju membranu hloroplasta .

[0102] Prema nekim izvođenjima pronalaska, postupak dalje obuhvata gajenje biljnih ćelija koje eksprimuju nukleinsku kiselinu. Biljna ćelija može biti gajena kao deo cele biljke, ili, alternativno, u biljnoj ćelijskoj kulturi. U jednom izvođenju, biljna ćelija je gajena u akseničnoj suspenziji za kulture , u bioreaktoru. Bioreaktori koji su pogodni za kultivisanje suspenzija biljnih ćelija prema pronalasku i postupaka za rast biljnih ćelija u suspenziji su opisani do detalja u, inter alia, US Patent Nos.6,391,638 and 7,951,557 i PCTs WO98/13469, WO2005/080544, WO2007/010533, WO2008/135991 i WO2008/132743, na koje se sve ovde poziva.

[0103] Prema tome, pronalazak obuhvata biljke ili biljne kulture koje eksprimuju sekvence nukleinske kiseline, tako da se proizvodi rekombinantni humani protein α-galaktozidaze prema pronalasku. Jednom eksprimovan u okviru biljne ćelije ili cele biljke, nivo humanog proteina α-galaktozidaze kodiran sekvencom nukleinske kiseline može biti određen dobro poznatim postupcima u ovoj obalsti kao što su , testovi aktivnosti, Western blotovi koji koriste antitela u stanju da se specifično vežu za humani protein α-galaktozidaze , enzimski imunosorbentni test (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay-ELISA), radio-imune-testove(RIA), imunohistohemije, imunocitohemije, imunofluorescencije i slično .

[0104] Postupci određivanje nivoa u biljkama transkribovane RNK iz sekvence nukleinske kiseline su dobro poznati i ovoj oblasti i uključuju, na primer, Northern blot analize, analize reverzne transkipcije lančane reakcije polimeraze (RT-PCR) (uključujući kvantitativni, semi-kvantitativni ili u relnom vremenu RT-PCR) i RNK-in situ hibridizaciju.

[0105] Analiza glikana eksprimovanog rekombinantnog humanog proteina α-galaktozidaze prema prikazanom pronalasku ukazuje da je polipeptid glikozilovan u biljnoj ćeliji, dovodeći do rekombinantog humanog proteina α-galaktozidaze koji ima izoloženu manozu i biljne specifične ostatke glikana (videti dole primer IV). Prema tome, prema nekim izvođenjima pronalaska, ćelije koje eksprimuju vektor prema pronalasku proizvode humani α-galaktozidazni protein koji ima bar jedan, opciono bar dva, opciono bar tri ili opciono bar četiri ili više ostataka β-(1,2) ksiloze u osnovnoj strukturi. U drugim izvođenjima, ćelije koje eksprimuju ekspresioni vektor prema pronalasku proizvode humani protein αgalaktozidaze koji ima bar jedan, opciono bar dva, opciono bar tri ili opciono bar četiri ili više α-(1,3) fukoznih ostataka u osnovnoj strukturi. U drugim izvođenjima, ćelije koje eksprimuju ekspresioni vektor prema pronalasku proizvode humani α-galaktozidazni protein koji ima bar jedan, opciono bar dva, opciono bar tri ili opciono bar četiri ili više krajnjih β(1-2)N acetilglukozamina. U drugim izvođenjima, ćelije koje eksprimuju vektor prema pronalasku proizvode humani protein αgalaktozidaze koji ima bar jedan, opciono bar dva, opciono bar tri ili opciono bar četiri ili više izloženih manoznih ostataka. U jednom posebnom izvođenju ćelije koje eksprimuju ekspresioni vektor prema pronalasku proizvode humani protein α-galaktozidaze koji ima devet ostataka manoze (M9), bar jedan, opciono bar dva, opciono bar tri od njih koji su izloženi manozni ostaci. U jednom izvođenju, ćelije koje eksprimuju ekspresioni vektor prema pronalasku proizvode humani protein α-galaktozidaze koji ima bar jedan izloženi ostatak manoze, bar jedan β-(1,2) ksilozni ostatak u osnovnoj strukturi i bar jedan α-(1,3) fukozni ostatak.

[0106] Nadalje, prema nekim izvođenjima pronalaska, obezbeđena je kompozicija koja sadrži višestruke humane molekule proteina α-galaktozidaze proizvedenih ćelijama koje eksprimuju ekspresioni vektor prema pronalasku, gde najzastupljenija struktura glikana višestrukih molekula proteina humane α-galaktozidaze su manoza 3-β-(1,2) ksiloza-α-(1,3) fukoza [Fc(3)M3X] i / ili manoza 4-β-(1,2) ksiloza (M4X); i manoza 8 (M8). U nekim izvođenjima prema pronalasku, strukture glikana manoza 3-β-(1,2) ksiloza-α-(1,3) fukoza[Fc(3)M3X] i / ili manoza 4-β-(1,2) ksiloza (M4X) sadrži oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35% ili oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 70%, oko 80% profila molekula proteina humane α-galaktozidaze u većini, i strukture glikana manoze 8 (M8) sadrži oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35% ili oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 70%, oko 80% profila molekula humanog proteina α-galaktozidaze u većini.

[0107] U drugim izvođenjima prikazanog pronalaska, kompozicija sadrži višestruke humane molekule proteina α-galaktozidaze proizvedenih od strane ćelije koja je eksprimuje ekspresioni vektor prema pronalasku, gde pomenuti višestruki molekuli proteina humane α-galaktozidaze sadrže bar oko 0.5%, bar oko 0.6 %, oko 0.7 %, oko 0.8 %, oko 0.9 %, oko 1.0 %, oko 1.1 %, oko 1.2 %, oko 1.3 %, oko 1.4 %, oko 1.5 %, oko 1.75 %, oko 2.0 %, oko 2.5 %, oko 3.0 %, oko 3.5 %, oko 4.0 %, oko 4.5 %, oko 5.0 % ili

2

više molekula proteina humane α-galaktozidaze koji imaju strukture glikana od devet manoznih ostataka, bar jednog, opciono dva, opciono bar tri od njih su izloženi manozni ostaci.

[0108] Humani α-galaktozidazni protein proizveden od ćelija koje eksprimuju ekspresioni vektor prema pronalasku je prikazano da imaju α-galaktozidaznu katalitičku aktivnost identičnu onoj prirodnih enzima humane α-galaktozidaze. Izlaganje rekombinantoj α-galaktozidazi prema pronalasku u uslovima simuliranja in-vivo okoline enzima kada se daje kao terapija zamene enzima dalje ukazuje da će humani protein α-galaktozidaze dobijen od ćelija koje eksprimuju ekspresioni vektor prema pronalasku posedovati farmakokinetiku koja je slična onoj ćelija sisara koje eksprimuju rekombinantnu humanu α-galaktozidazu (Replagal®) (videti ovde primer 3 i slike.2 i 3 ).

[0109] Prema tome, humani protein α-galaktozidaze dobijen ćelijama koje eksprimuju ekspresioni vektor prema pronalasku mogu biti korišćeni da proizvde farmaceutsku kompoziciju. Farmaceutska kompozicija može biti korišćena za lečenje ili prevenciju Fabrijeve bolesti kod subjekta kome je to potrebno. U nekim izvođenjima, ćelije koje eksprimuju humani protein α -galaktozidaze može biti korišćen za lečenje ili prevenciju Fabrijeve bolesti kod subjekta kome je to potrebno. Postupci za dobijanje i davanje biljnih ćelija koje rekombinanto eksprimuju proteine su poznati u ovoj oblasti, na primer, PCT WO2007/010533 od Shaaltiel et al.

[0110] Prema tome, prema još jednom aspektu prema prikazanom pronalasku obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja uključuje, kao njihov aktivni sastojak, humani protein α-galaktozidaze translatorno spojen sa C-krajem signalnog peptida zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim izvođenjima prema prikazanom pronalasku, humani protein αgalaktozidaze ima glicinski ostatak na N-kraju. U nekim izvođenjima prikazanog pronalaska, humani protein α-galaktozidaze ima aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 16. U nekim izvođenjima, humani protein α-galaktozidaze translatorno je povezan za C-krajem sa signalim peptidom zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu koji ima aminokiselinu sevkecnu datu u SEQ ID NO: 21.

[0111] Kao je ovde korišćeno "farmaceutska kompozicija" odnosi se na dobijanje jednog ili više aktivnih sastojaka koji su odve opisani sa drugim hemijskim komponentama kao što su fiziološki stabilni nosači ili ekscipijenti. Svrha farmaceutske kompozicije je da olakša davanje jedinjenja u organizam .

[0112] Ovde izraz "aktivni sastojak" odnosi se na rekombinanti humani protein α-galaktozidaze odgovoran za biološko dejstvo.

[0113] Ovde i nadalje fraze "fiziološki prihvatljiv nosač" i "farmaceutski prihvatljiv nosač" koje mogu biti zamenjivo korišćene odnose se na nosač ili razblaživač koji ne izaziva značajnu iritaciju organizma i ne smanjuje biološku aktivnost i osobine davanja jedinjenja. Adjuvant je obuhvaćen ovim frazama.

[0114] Ovde izraz "ekscipijent" odnosi se na inertene supstance dodate u farmaceutsku kompoziciju da bi se dalje olakšalo davanje aktivnog sastojka. Primeri bez ograničenja, ekscipienata uključuju kalcijum karbonat, kalcijum fosfat, različite šećere i tipove skroba, derivata celuloze, želatina, biljnih ulja i polietilen glikola.

[0115] Tehnike za formulsanje i davanje lekova mogu se naći u "Remington’s Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, zadnje izdanje, koje je uključeno ovde kao referenca.

[0116] Pogodni načini davanja mogu, na primer, uključivati, oralno, rektalno , transmukozno, naročito transnazalno, intestinalno ili parenteralno davanje, uključujući intramuskularne, subkutanozne i intramedularne injekcije kao i intratekalne, direktne intraventrikularne, intrakardijačne, npr., u desni ili levu ventrikularnu šupljinu, u običnu koronarnu arteriju, intravenskim, inrtaperitonealnim, intranazalnim, ili intraokularnim injekcijama.

[0117] Konvencionalni pristupi za davanje leka u centalni nervni sistem (CNS) ukljujučuju: neurohiruške strategije (npr., intracerebralnu injekciju ili intracerebralnoventrikularnu infuziju); molekulsku manipulaciju sredstva (npr., proizvodnju himernog fuzionog proteina koji sadrži transportni pepetid koji ima afinitet za molekul ćelijske endotelijalne površine u kombinaciji sa sredstvom koje je samo nije u stanju prelaženja BBB) u pokušaju da se iskoristi jedan od endogenih puteva transporta BBB; farmakološke strategije napravljene da povećaju lipidnu rastvorljivost sredstva (npr., konjugovanje vodorastvornih sredstava za lipidne ili holesterolske nosače); i prolazno remećenje integriteta BBB sa hiperosmotskim remećenjem (kao posledica infuzije rastvora manitola u karotidnu arteriju ili upotrebe biološki aktivnog sredstva kao što je peptid angiotenzin). Međutim, svaka od ovih strategija ima ograničenja, kao nenalsedni rizici u vezi sa invazivnim hiruškim postupkom, veličinom ograničenja nametnutom ograničenjem nasleđenim u endogenim transpornim sistemima, potencijalno nepoželjnim biološkim sporednim dejstvima u vezi sa sistemskim davanjem himernih molekula koji sadrže motiv nosača koji može biti aktivan van CNS, mogući rizik oštećenja mozga u okviru regiona mozga gde je poremećena BBB , koja čini njegov suboptimalni postupak davanja.

[0118] Alternativno, neko može davati farmaceutsku kompoziciju lokalno pre nego na sistemski način, na primer, pomoću injekcije farmaceutske kompozicije direktno u region tkiva pacijenta.

[0119] Izraz "tkivo" odnosi se na deo organizma koji se sastoji od ćelija koje su napravljene da obavljaju funkciju ili funkcije. Primeri uključuju, ali bezograničenja, tkivo mozga, retine, tkivo kože, tkivo jetre, tkivo pankreasa, kostiju, hrskavice, vezivno tkivo, krv, mišićno tkivo, srčano tkivo, tkivo mozga, vaskularno tkivo, tkivo retine, plućno tkivo, tkivo žlezde, hematopoietsko tkivo.

[0120] Farmaceutske kompozicije nekih izvođenja prema pronalasku mogu biti proizvedene postupcima dobro poznatim u ovoj oblasti, npr. pomoću konvencionalnog mešanja, rastvaranja, granulisanja, pravljenja dražea, sprašivanja, emulgovanja, inkapsuliranja, zarobljavanja ili postupka liofiliziranja.

[0121] Farmaceutske kompozicije za upotrebu prema nekim izvođenjima pronalaska mogu biti formulisane na konvencionalni način korišćenjem jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača koji sadrže ekscipijente i pomoćne supstance, koji olakšavaju obradu aktivnih sastojaka u preparatima koji, mogu biti korišćeni farmaceutski. Podesne formulacije su zavisne od načina izabranog davanja.

[0122] Za injekciju, aktivni sastojci farmaceutske kompozicije mogu biti formulisani u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima kao što je Hank-ov rastvor, Ringerov rastvor ili pufer fizioloških soli. Za transmukozno davanje, odgovarajuća sredstva za prodiranje kroz barijeru su korišćena u formulaciji. Takva sredstva za prodiranje su generalno poznata u ovoj oblasti tehnike.

[0123] Za oralno davanje, aktivni sastojci mogu opciono biti formulsani preko davanja celih ćelija koje proizvode humani protein α-galaktozidaze prema prikazanom pronalasku. Aktivni sastojci mogu takođe opciono biti formulisani kombinovanjem aktivnih sastojaka i/ili ćelija sa farmaceutski

2

prihvatljivim nosačima dobro poznatim u ovoj oblasti, dobijanjem farmaceutskih kompozicija. Takvi nosači omogućavaju da ćelije i/ili farmaceutske kompozicije budu formulisane kao tablete, pilule, dražee, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupu, suspenzije, i slično, za oralno davanje pacijentu. Kada su korišćeni za oralno davanje, cele ćelije, ili frakcije ćelija mogu biti sveže ili obrađene (npr. liofilizovane, smrznute, osušene, itd.).

[0124] Farmakološki preparati za oralnu upotrebu mogu biti napravljeni korišćenjem čvrstog ekscipijenta, opciono mlevenjem dobijene smeše, i obradom smeše u granule, posle dodavanja pogodnih pomoćnih supstanci ukoliko je potrebno, da bi se dobile tablete ili jezgra dražea. Pogodni ekscipijenti, su posebno, punioci kao što su šećeri, uključujući laktozu, manitol ili sorbitol; celulozne preparate kao što su na primer, kukuruzni skrob, pšenični skrob, krompirni skrob, želatin, tragakant guma, metil celuloza, hidroksipropilmetilceluloza, natrijum karbometilceluloza; i/ili fiziološki prihvatljivi polimeri kao što je polivinilpirolidon (PVP). Ukoliko je poželjno, sredstva za dezintegraciju mogu biti dodata, kao što su umreženi polivnil pirodlidon, agar, ili alginska ksielina ili njegova so kao što je natrijum alginat .

[0125] Jezgra dražea su obezbeđena sa pogodnim oblogama. Za ovu svrhu, može biti korišćen koncentrovani rastvor šećera koji opciono sadrže gumiarabiku, talk, polivinil pirolidon, karbopol gel, polietilen glikol, titanijum dioksid, rastvore lakova i pogodne organske rastvarače ili smeše rastvarača. Sredstva za bojenje i pigmenti mogu biti dodati u tablete ili obloge za dražeje radi identifikacije ili karakterizacije različitih kombinacija aktivnih doza jedinjenja .

[0126] Farmaceutske kompozicije koje mogu biti korišćene oralno, uključuju ’push-fit ’ kaspule napravljene od želatina kao i meke, zatopljene kapsule napravljene od želatina i plastifikatora, kao što su glicerol ili sorbitol. ’Push-fit’ kapsule mogu sadržati aktivne sastojke u smeši sa puniocima kao što je laktoza, vezivna sredstva, kao što su skrobovi, sredstva za klizanje kao što su talk ili magnezijum stearat i opciono , stabilizatori. U mekanim kapuslama, aktivni sastojci mogu biti rastvoreni ili suspendovani u pogodne tečnosti, kao što us masna ulja, tečni parafin, ili tečni polietilen glikoli. Pored toga, mogu biti dodati stabilizatori. Sve formulacije za oralno davanje treba da budu u dozama za izabrane načine davanja.

[0127] Za bukalno davanje, kompozicije mogu biti uzete u obliku tableta ili lozengi formulisanih na konvencionalni način .

[0128] Za davanje nazalnom inhalacijom, aktivni sastojci za upotrebu prema nekim izvođenjima pronalaska su konvencionalno davani u obliku aerosolnog spreja prikazanog kao pakovanje pod pritiskom ili nebulizera sa upotrebom pogodnog propelanta, npr., dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetrafluoroetana ili ugljen dioksida. U slučaju aerosola pod pritiskom, dozna jedinica može biti određena obezbeđivanjem ventila za odmeravanje količine. Kapsule i kartridži npr., želatin za upotrebu u sredstvu za raspršivanje mogu biti formulisani da sadrže sprašenu mešavinu jedinjenja i pogodnu bazu praha kao što je laktoza ili skrob.

[0129] Farmaceutska kompozicija koja je ovde opisana može biti formulisana za parenteralnu upotrebu, npr., bolusnom injekcijom ili kontinualnom infuzijom. Formulacije za injekciju mogu biti prikazane u jedničnom dozom obliku , npr., u ampulama ili kontejnerima sa višestrukim dozama sa opciono, dodatim sredstvima za održavanje. Kompozicije mogu biti suspenzije, rastvori ili emulzije u

2

ulju ili vodenim sredstvima i mogu sadržati sredstva za formulisanje kao što su sredstva za suspendovanje, sredstva za stabilizaciju i/ili sredstva za dispergovanje sredstava .

[0130] Farmaceutske kompozicije za parenteralno davanje uključuju rastvore aktivnog preparata u vodorastvoronom obliku. Dodatno, suspenzije aktivnih supstanci mogu biti pripremljene odgovarajućim injekcijama suspenzija zasnovanih na ulju ili vodi. Pogodni liofilni rastvarači ili sredstva uključuju masna ulja kao što je susamovo ulje, sintetičke estre masnih kiselina kao što su etil oleat, trigliceridi ili lipozomi. Vodene injekcione suspenzije mogu sadržati supstance, koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što je natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol ili dekstran. Opciono, suspenzija može sadržati pogodne stabilizatore ili sredstva koja povećavaju rastvorljivost aktivnih sastojaka da bi se omogućilo pripremanje visoko-koncentrovanih rastvora .

[0131] Alternativno, aktivna sastojak može biti u obliku praha za konstituisanje pre upotrebe sa pogodnim nosačem, npr. sterilanim rastvorom na bazi vode bez pirogena.

[0132] Farmaceutska kompozicija nekih izvođenja prema pronalasku može biti takođe formulisana u rektalne kompozicije kao što su supozitorije ili retencione eneme, korišćenjem npr. konvencionalnih supozitorija zasnovanih na kakobuteru ili drugim gliceridima.

[0133] Farmaceutske kompozicije pogodne za upotrebu u kontekstu nekih izovođenja prema pronalasku uključuju kompozicije u kojima se aktivne sredstva nalaze u količinama efikasnim za postizanje navedene svrhe. Određenije, terapeutski efikasne količine označavaju količinu aktivnih sastojaka (a-galaktozidaze) efikasne u sprečavanju, ublažavanju ili ublažavanju simptoma poremećaja (npr., Fabrijeve bolesti) ili produžavanja opstanka subjekta koji se leči.

[0134] Određivanje terapeutski efikasne količine je u okviru sposobnosti osoba iz struke, naročito u odnosu na detaljan opis koji je ovde obezbeđen .

[0135] Za bilo koji preparat korišćen u postupcima prema pronalasku, terapeutski efikasna količina ili doza može biti procenjena inicijalno in vitro i testovima ćelijskih kultura. Na primer, doza može biti formulisana na životinjskom modelu da bi se postigla željena koncentracija ili titar. Takva informacija može biti korišćena da se preciznije odrede doze za ljude .

[0136] Toksičnost i terpautska efikasnost ovde opisanih aktivnih sastojaka može biti određena standardnim farmaceutskim postupcima in vitro, u ćelijskim kulturama ili ekperimentalnim životinajma. Dobijeni podaci iz ovih testova in vitro i ćelijskih kultura i životinjskoh studija mogu biti korišćeni u formulisanju opsega doze za čoveka Doza može varirati u zavisnosti od doze koja je korišćena i korišćenog načina davanja. Tačna formulacija, način davanja i doza mogu biti izabrani od strane pojedinačnog lekara u odnosu na stanje pacijenta. (videti npr., Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p.1).

[0137] Dozna količina i interval mogu biti prilagođeni pojedinačno da se obezbede serumski i ćelijski nivoi aktivne supstance koja je dovoljna da izazove ili suzbije biološki efekat (minimalna efikasna koncentracija , MEC). MEC će varirati za svaki preparat, ali može biti procenjena iz in vitro podataka. Doze neophodne za postizanje MEC će zavisiti od pojedinačnih karakteristika i načina davanja. Detekcioni testovi mogu biti korišćeni za određivanje koncentracija u plazmi.

2

[0138] U zavisnosti od ozbiljnosti i odgovora stanja koje se leči, doziranje može biti pojedinačno ili višestruka davanja, sa tokom lečenja koji traje od nekoliko dana do nekoliko nedelja ili do postizanja izlečenja ili smanjenja stanja bolesti.

[0139] Količina kompozicije koja se daje će naravno zavisiti od subjekta koji se leči, ozbiljnosti stanja, načina davanja, ocene odgovarajućeg lekara itd.

[0140] Kompozicije nekih izvođenja prema pronalasku mogu, ako je poželjno, biti prikazane u pakovanju ili uređaju za raspoređivanje, kao što je odobreni kit od strane FDA, koji može sadržati jednu ili više doznih oblika koji sadrže aktivno sredstvo. Paket može, na primer, sadržati metalnu ili plastičnu foliju, kao što je blister pakovanje. Pakovanje ili uređaj za raspoređivanje može biti praćen instrukcijama za davanje. Pakovanje ili uređaj za raspoređivanje može takođe biti praćeno sa napomenom vezanom za sud u obliku koji prepisuje agencija za lekove koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutika, a napomena se odnosi na dozvolu agencije za oblik kompozicija ili humanih ili životinjskih davanja. Takva napomena, na primer, može biti nalepnica obezbeđena od strane U.S. Food and Drug Administration za lekove koji se izdaju na recepte ili odobrenim uputstvima za proizvod. Kompozicije koje sadrže preparat prema pronalasku formulisan u kompatibilnim farmaceutskim nosačima mogu takođe biti pripremljeni, smešteni u odgovarajući kontejner i obeležene za lečenje navedenih stanja, kao je detaljnije gore dato.

[0141] Farmaceutska kompozicija može biti korišćena za lečenje ili prevenciju Fabrijeve bolesti u subjektu kome je to potrebno. Prema tome, prema još jednom aspektu prikazanog pronalaska obezbeđen je postupak lečenja ili prevencije Fabrijeve bolesti kod subjekta kome je to potrebno , postupka koji obuhvata davanje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja uključuje, aktivno sredstvo, humani protein α-galaktozidaze spojen na C-kraju sa signalim peptidom zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu i farmaceutski prihvatljivim nosačem. U nekim izvođenjima, humani protein α-galaktozidaze ima N-krajnji ostatak glicina. U drugim izvođenjima, humani protein αgalaktozidaze ima aminokiselinsku sekvencu datu kao u SEQ ID NO: 16.

[0142] Izraz "lečenje" odnosi se na inhibiranje, sprečavanje ili zaustavljanje razvijanja patologije (bolesti, poremećaja ili stanja) i/ili izazivanja smanjenja , ponovnog javljanja ili regresije patologije. Osobe iz struke će znati da različite metodologije i testovi mogu biti korišćeni za procenu razvoja patologije, i slično, različite metodologije i testove mogu biti korišćeni za smanjenje, ponovno javljanje ili regresiju patologije.

[0143] Ovde korišćen, izraz "sprečavanje" odnosi se na sprečavanje da se bolest, poremećaj ili stanje jave kod subjekta koji može biti u riziku od bolesti, ali kod koga još nije dijagnozirana bolest.

[0144] Ovde korišćen izraz "subjekat" obuhvata sisare, poželjno živa bića koja su u bilo kojim godinama koji pate od patologije. Poželjno, ovaj izraz obuhvata pojedince koji su u riziku od razvijanja patologije

[0145] Ovde korišćena fraza "režim lečenja" odnosi se plan lečenja, dozu, raspored i/ili trajanje obezbeđenog lečenja subjektu kome je to potrebno (npr., subjektu kod koga je dijagnozirana patologija). Odabrani režim lečenja može biti onaj agresivni za koga se očekuje da je dovede do najboljeg kliničkog ishoda (npr., potpunog izlečenja patologije) ili umerenijeg koji može dovesti do oslobađanja od simtoma patologije dovodeći do do nepotpunog izlečenja patologije. Zna se da izvesni slučajevi agresivnijih režima lečenja mogu biti u vezi sa nekom nelagodom subjekta ili neželjenim

2

sporednim dejstvima (npr, ošćećenjem zdravih ćelija ili tkiva ). Tip lečenja može uključivati hiruške intervencije (npr., uklanjanje lezija, bolesnih ćelija, tkiva ili ograna), terapije zamene ćelija, davanje terapeuskog leka (npr., agoniste receptora, antagoniste, hormone, hemoterapeutska sredstva) u lokalnom ili sistemskom modu, izlaganje radiacionoj terapiji korišćenjem spoljnog izvora (npr., spoljašnji snop) i/ili unutrašnji izvor (npr., brahiterapiju) i/ili bilo koje njihove kombinacije. Doza, raspored i trajanje mogu varirati, u zavisnosti od ozbiljnosti patologije i izabranog tipa lečenja i osobe iz stuke su u stanju da prilagode tip lečenja sa dozom, rasporedom i trajanjem lečenja.

[0146] Očekuje se da u toku života patenta koji proizilazi iz ove prijave će biti razvijeno mnogo relevantih vektora, promoterskih elemenata, biljnih ćelija i nosača i obim uslova koji su ovde obezbeđeni ima nameru da obuhvatati sve takve nove tehnologije a priori.

[0147] Ovde korišćen izraz "oko" odnosi se na ± 10 %.

[0148] Izrazi "sadrži", "sastoji se", "obuhvata", "čini", "ima" i njihovi konjugovani oblici označavaju "uključuje, ali nije ograničen samo na to".

[0149] Izraz "sastoji se od sredstava "uključuje i ograničen je na".

[0150] Izraz "sastoji se suštinski od" označava da kompozicija, postupak ili struktura može sadržati dodatne sastojke, korake i/ili delove, ali samo ako su dodatni sastojci, koraci i/ili delovi materijalno ne menjaju osnovu i nove karakterisitke kompozicije, postupka ili strukture za koju je zatražena zaštita.

[0151] Kako je ovde korišćeno, oblici jednine uključuju pozivanje i na množinu ukoliko kontekst jasno ne sugreiše drugačije. Na primer, izraz "jedinjenje" ili "bar jedno jedinjenje" može uključiti više jedinjenja, uključujući njihove smeše .

[0152] Kroz ovu prijavu, različita izvođenja pronalaska mogu biti prikazana u formatu raspona. Podrazumeva se da format raspona u opisu je samo radi praktičnosti i sažetosti i ne treba ga smatrati kao nefleksibilno ograničenje obima pronalaska. Prema tome, opis opsega treba smatrati da ima specifično opisane sve moguće podopsege kao indivudualne numeričke vrednosti u okviru tog opsega. Na primer, opis opega od 1 do 6 treba smatrati da ima specifično opisane podopsege kao što su od 1 do 3, od 1 do 4, od 1 do 5, od 2 do 4, od 2 do 6, od 3 do 6 itd., kao i pojedinačni brojevi u okviru tog opsega, na primer, 1, 2, 3, 4, 5, i 6. Ovo se primenjuje bez obrzira na širinu opsega.

[0153] Kad god je naveden numerički opseg, misli se da uključuje bilo koji broj (razlomke ili cele brojeve) u okivu navedenog opsega. Fraze "u opegu/u opegu između" prvog navedenog broja i drugog navedenog broja i "u opesgu/u opsegu od" prvog broja "do" drugog navedenog broja su ovde korišćeni zamenjivo i smatra se da su uključeni prvi i drugo navedeni brojevi i svi razlomci i celi brojevi između njih.

[0154] Ovde korišćen izraz "postupak" odnosi se na način, sredstva, tehnike i postupke za postizanje datog zadatka uključujući, ali bez ograničenja, one načine, sredstva, tehnike i postupke ili poznate, ili lako razvijene od poznatih načina, sredstva, tehnika, i postupaka od strane osoba koje izvode ovaj pronalazak iz hemije, farmakologije, biologije, biohemije i medicine.

2

[0155] Ovde korišćeni izraz "lečenje" obuhvata ukidanje, suštinske inhibiciju, usporavanje ili preokretanje napredovanja stanja, suštinsko ublažavanje kliničkih ili estetskih simptoma stanja ili suštinski sprečavanje javljanja kliničkih ili estetskih simptoma stanja.

[0156] Smatra se da izvesne karakteristike prema pronalasku, koje su radi jasnoće opisane u kontekstu odvojenih izvođenja, mogu takođe biti obezbeđene u kombinaciji u jednom izvođenju. Obrnuto, različite karakteristike prema pronalasku, koje su, radi sažetosti, opisane u kontekstu pojedinačnog izvođenja, mogu takođe biti obezbeđene odvojeno ili u bilo kojoj drugoj podkombinaciji ili pogodne u bilo kom drugom opisanom izvođenju pronalaska. Izvesne karakteristike opisane u kontekstu različitih izvođenja ne smatraju se suštinskim karakteristikama ovih izvođenja, osim ako se izvođenje ne može izvesti bez ovih elemenata.

[0157] Različita izvođenja i apsekti prikazanog pronlaska kako je gore opisano i za koje je zatražena zaštita dole u delu patenih zahteva imaju eksperimentalnu podršku u sledećim primerima.

PRIMERI

[0158] Pozivanja na sledeće primere, zajedno sa ovim opisom prikazuju neka izvođenja pronalaska na neograničavajući način.

[0159] Generalno, ovde korišćena nomenklatura i laboratorijski postupci korišćeni u prikazanom pronalasku uključuju molekulske, biohemijske, mikrobiološke i rekombinantne DNK tehnike. Takve tehnike su potpuno objašenjene u literaturi. Videti na primer, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols.1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologije prikazane u U.S. Pat. Nos.4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells -A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); dostupni imunotestovi su iscrpno opisani u patentnoj i naučnoj literaturi, videti, na primer, U.S. Pat. Nos.

3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 and 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol.1, 2, 317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization -A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996).

[0160] Druge opšte reference su obezbeđene u ovom dokumetu. Postupci dati u njima se veruje da su dobro poznati u staju tehnike i obezbeđeni su radi pogodnost onoga koji čita .

PRIMER I: KONSTRUKCIJA EKSPRESIONOG KONSTRUKTA BILJNE α-GALAKTOZIDAZE

[0161] cDNK koji kodira humani protein α-galaktozidaze (EC 3.2.1-22 GenBank: X05790) je optimiziran i sitetisan od GENEART AG (Regensburg, Germany). Korišćenje kodona bez vodećeg peptida (signalnog peptida koji cilja endoplazmatilčni retikulum) je prilagopđen kodonu sličnom genu Nicotiana tabacum. U toku postupka optimizacije sledeći motivi cis-delujuće sekvence su izbegnuti : Interni TATA-boksovi, ’chi’-mesta i ribozomalna ulazna mesta, AT-bogate ili GC-bogate delovi sekvence (engl. stretches), elementi nestabilnosti RNK ("killer" motivi, motivi ubice), ponovljene sekvence i RNK sekundarne strukture, donor spajanja (kriptični) i mesta akceptora, tačke granjanja. Pored toga, regioni veoma visokog (>80%) ili veoma niskog (<30%) GC sadržaja su izbegnuti.

[0162] Nukleotidna sekvenca prirodnog humanog α-galaktozidaznog vodećeg peptida (signalnog peptida koji cilja endoplazmatični retikulum ) (slika 1, prvih 31 aminokiselina crveno) proteina humane α-galaktozidaze pune dužine (GenBank: X05790) je zamenjena sa nukleinskom sekvencom koja kodira 33 aminokiseline signalnog pepetida koji cilja endoplazmatični retikulum (vodeći peptid) proteina Arabidopsis ABPI (obeleženog zeleno na slici 1, SEQ ID NO: 4). Ovaj signalni peptid obezbeđuje efikasno ciljanje α-galaktozidaze u sekretorni put i odcepljen je od polipeptida, sa signalnom peptidazom, onda kada je protein premešten u endoplazmatični retikulum. Nukleotidna sekvence (SEQ ID NO: 19) koja koridra signal SEKDEL (SEQ ID NO: 6) zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu je dodata na sekvencu cDNK na 3’ kraju, omogućavajući povraćaj eksprimiranog proteina iz Goldžijevog aparata, efikasno održavajući protein u endoplazmatičnom retikulumu. SEQ ID NO: 2 predstavlja kompletnu kodirajuću sekvencu eksprimirane rekombinantne humane α-galaktozidaze (SEQ ID NO: 1), uključujući N-krajnji signalni peptid ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum, humani α-galaktozidazni protein i signal SEKDEL zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu.

PRIMER II: EKSPRESIJA REKOMBINANTNE HUMANE α-GALAKTOZIDAZE U BILJKAMA

Trenutni ekspresioni sitem u N.benthamiana

[0163] Upotreba biljnih virusnih vektora je odabrana u ovom slučaju alternativnih do transgenih biljaka, dozvoljavajući brzi, visoki nivo trenutne ekspresije proteina u zrelim celim biljkama.

[0164] Protein od interesa je eksprimovan iz jakog subgenomskog protmotera virusnog omotača proteina. Sistem se oslanja na trenutnu amplifikaciju (agroinfekcijom) virusnih vektora koji su dostavljeni biljci od strane Agrobacterium, u kojoj funkcionali promoter biljke i cDNK kodirajući virusni replikon su transfekovani kao T-DNK iz agrobacterium u biljne ćelije. T-DNK je transkribovan u biljku sa biljnim promoterom da da bi se dobio biološki aktivan virusni RNK koji incira samoreplikaciju.

[0165] Za trenutnu ekspresiju 3 vektora korišćen je rekomninatni sistem zasnovan na sistemu prethodno razvijenom kao što je opisano (Gleba et al., Vaccine 232042-2048, 2005), α-galaktozidazni cDNK je umetnut u jedan od vektora, i dva druga vektora koji sadrže gene za konstrukciju celog virusnog replikona (RdRp i Integraza), tako stvarajući biološki aktivan virusni RNK u stanju da inicira samoreplikaciju.

1

Transfekcija celih biljki -

[0166] Biljke N. Benthamiana su razmnožavane i gajene na komercijalnom mešovitom zemljištu (Givaat Ada, IL) obogaćenom sa granularnim đubrivom sa sporim oslobađanjem (Scott Marysville, OH) u režimu duge obdanice (16h svetlo / 8h mrak) na 24°C-25°C.

[0167] Agrobacteria su transformisane sa sistemom vektora replikona zasnovnog na pICH20866-alfa-GAL pomoću elektroporacije (2500V, 5msec) [den Dulk-Ra, A. and Hooykaas, P.J. (1995) Methods Mol. Biol.55:63-72]. Biljke su infiltrirane sa Agrobacteria koja sadrži plazmide 3 ICON vakuum infiltracijom sa standardnim postupcima poznatim u ovoj oblasti . Ukratko, biljke N. benthamiana , 5-6 nedelja stare su infiltrirane uranjenjem svih vazdušnih organa biljke u bakterijsku suspenziju i smeštene su u vakuum komoru. Primenjen je vakuum od minus (-) 0.8 bara u toku 1 minuta, praćen brzim povratkom na atmosferski pritisak. Biljke su vraćene u staklenik u toku dodatnih 5-7 dana pod istim uslovima rasta.

Biljni ekstrakt duvana:

[0168] Uzorci lišća Nicotiana benthamiana su sakupljeni 5 dana posle infiltracije i ekstrahovani u Laemmli puferu za SDS-PAGE, ili puferu testa za aktivnost (20mM limunska kiseline, 30 mM natrijum fosfat, 0.1%BSA i 0.67% etanol, pH 4.6.) za katlitičku aktivnost biljke koja eksprimuje protein .

Prečišćavanje biljnog ekstrakta duvana :

[0169] Humani protein α-galaktozidaze iz biljnih ekstrakta je prečišćen taloženjem u dva koraka sa amonijum sulfatom ("izoljavanje": 1. korak 0.57M; 2. korak 2.27M), praćen hromatografijom sa hidrofobnim interakcijama (fenil 650 M smola) i hromatografijom sa katjonskom izmenom .

Stabilna ekspresija u ćelijama N. tobaccum BY2

[0170] Transformacija posredovana Agrobacterium je široko korišćena da se unesu strani geni u genom biljne ćelije. Ova tehnika je zasnovana na prirodnoj sposobnosti agrobakterije da transformiše biljne ćelije prenošenjem segmenta DNK plazmida , prenesenog DNK (T-DNK), u genom ćelije domaćina . Korišćenjem ovog prilaza, T-DNK molekul, koji se sastoji od stranog gena i njegovih regulatornih elemenata, je nasumično unet u biljni genom. Mesto integracije, kao i broj kopija genskih umetaka nije kontrolisan, prema tome rezultati postupaka transformacije u ’pool’-u transgenih ćelija sastavljenih od ćelija sa različitim nivoima ekspresije transgena. Transgeni ’pool’ je naknadno korišćen za izolaciju klona. Rezultati izolovanja klona u ustanovljenom velikom broju pojedinačnih ćelijskih linija, iz kojih je zatim odabran klon sa najvišim nivoom ekspresije stranog gena .

[0171] Kultura suspenzije BY2 je zajedno kultivisana, u toku 48 sati, sa sojem Agrobacterium tumefactiens EHA105 koji nosi vektor gajenja α-GAL gena i selekcioni gen neomicin fosfotransferaze (NPTII) .

[0172] Naknadno, ćelije su održavane u mediju obogaćenom sa 50mg/L Kanamaicina i 250mg/L Cefotaksima. NPTII gen daje otpornosti prema kanamicinu, prema tome samo NPTII pozitivne BY2 ćelije preživljavaju u ovom selekcionom medijumu. Cefotaksim je korišćen da selektivno ubija agrobacterium, biljne ćelije su rezistentne na antibiotik . Jednom kada je ustanovljena dobra suspenzija za rast transgenih ćelija, korišćena je za odabir i izolovanje pojedinačnih linija. Da bi se dopustio odabir pojedinačnih ćelijskih linija, alikvoti visoko razblažene suspenzije ćelija su raspoređeni na čvrstom BY-

2

2 medijumu. Ćelije su zatim gajene do mailih razvojenih stabljika. Svaka stabljika je zatim ponovo suspendovana u tečnoj kulturi. Ćelije su zatim uzorkovane i uzorci su procenjeni za nivo α-GAL . Linije koje eksprimuju relativno visoke nivoe α-GAL su zatim ponovo anlaizirani i upoređeni sa nivoima α-GAL koji se završavaju sa krajnjim odabirom kandidata linija koji eksprimuju α-GAL .

Ćelijski ekstrakti duvana:

[0173] 100 mg transformisanih BY2 ćelija koje eksprimuju humani protein α-galaktozidaze su homogenizovane u toku 5min u 200ul 20mM fosfatnog pufera 0.5M koji sadrži 20mM EDTA 2mM DTT i 2mM PMSF, pH=7.2. Homogenat je centrifugiran i supernatat koji sadrži humani protein αgalaktozidaze je sakupljen [sirovi ekstrakt]. Katalitička aktivnost α-galaktozidaze u sirovom delu je određena sa PNP-G testom.

PNP-G test

[0174] α-galaktozidazna galaktozidna hidrolazna aktivnost je određena korišćenjem p-nitrofenilalfa-D-galaktopiranozida (pNP-alfa-D-Gal, GBB1290, IRIS Biotech, Germany) kao suprtrata za hidrolizu. Pufer za test je sadžao 20 mM limunske kiseline, 30 mM natrijum fosfata, 0.1 % BSA i 0.67 % etanola na pH 4.6. Uzorci (50 µl) su inkubirani sa 150 µl pufera za test. Dodat je supstrat (pNP-alfa-D-Gal) (30 µL) u krajnjoj koncentraciji od 8 mM p-NP-alfa-D Gal. Reakciona smeša je inkubirana na 37°C u toku 90 minuta. Posle 90 minuta, reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl natrijum karbonata (2M) u svaki bunarčić, u cilju završetka reakcija i omogućavanja stvaranja p-nitrofenolatne hromofore. Rezultati su izračunati iz merene apsorbance na 405 nm .

[0175] Modifikacija humane α-galaktozidaze eksprimovane u biljkama: Sekvenciranje proteinskog proizvoda iz transformisanih biljaka su otkrila, da u nekim slučajevimam posle cepanja ABPI signala, rekombinantni humani protein α-galaktozidaze zadržva bar jedan aminokiselinski glicin signalnog peptida na N kraju zrelog proteina α-galaktozidaze. Prema tome, rekombinanti humani protein αgalaktozidaze može biti ili bez glicina signalnog pepetida na N-kraju (npr. SEQ ID NO: 20, kodirajuća sekvenenca kao u SEQ ID NO: 22) ili uključuje glicin na N-kraju (npr. SEQ ID NO: 21, kodirajuća sekvenca kao u SEQ ID NO: 23).

[0176] Analiza glikana humane α-galaktozidaze eksprimovene u biljkama: Uzorci proizvoda rekombinantnog humanog proteina α-galaktozidaze iz transformisanih biljaka su redukovani, alkilovani sa DTT i jodoacetamidom, i odvojeni na 12.5% SDS-PAGE. Trake koje odgovaraju tačnoj molekulskoj masi su isečene, protein je ekstrahovan i podvrgnut analizi glikana koja se sastoji od cepanja sa tripsinom koje je praćeno cepanjem sa i PNGazom A i PNGazom F . Cepanje sa PNGazom A oslobađa sve glikane vezane za N-kraj i PNGaze F oslobađa sve glikane osim onih koji sadrže α 1-3 fukozu u osnovnoj strukturi.

[0177] Slobodni glikatni su ekstrahovani, prečišćeni i zatim obeleženi sa fluorescentim reagensom antranilamidom (2AB) što je praćenom uklanjanjem viška 2AB.

[0178] Glikani su odvojeni pomoću TSK gel Amida 80 HPLC sa normalnom fazom i detektovani pomoću florescentnog detektora. Hidrolizat dekstrana je služio kao lestvica za izračunavanje vrednosti glukoznih jedinica (GU) Profil glikana je konstruisan izračunavanjem relativnih površina signala iz hromatograma cepanja PNGazom A. Dodeljivanje glikana je ustanovljeno izračunavanjem GU vrednosti signala nađenih u oba endoglikozidna cepanja i zasnovano na dodatnim različitim egzoglikozidim cepanjima.

Rezultati:

[0179] Upoređivanje između različitih konstrukata α-galaktozidaze, otkriveno je da dodavanje signalnog proteina ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum (SEQ ID NO: 4) na humani polipeptid rekombinantne α-galaktozidaze poboljšava trenutnu ekspresiju rekombinantog proteina u biljkama N. benthamiana (slika 2, traka 2), u poređenju sa sekvencama α-galaktozidaze koje su eksprimovane sa signalim proteinom pektinaze jabuke koji cilja endoplazmatični retikulum (signalni peptid pektinaze jabuke koji cilja ER je kodiran sa SEQ ID NO: 10) (a-galaktozidazni protein - signalni peptid ERjabučne pektinaze kodiran sa SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 11), ili α-galaktozidazni protein eksprimovan sa signalnim peptidomn endohitinaze B koji cilja endoplazmatični retikulum (endohitinazni signalni protein, SEQ ID NO: 14, kodiran sa SEQ ID NO: 15). Testovi katalitičke aktivnosti (videti gore) potvrđuju da povećanje proteina viđeno na slici 2 se odrazlilo na prateću povećanje enzimske aktivnosti (slika 3, kolona B) po kg lišća, u poređenju sa sekvencom α-galaktozidaze koja je eksprimovana sa signalnim peptidom pektinaze jabuke koji cilja endoplazmatični retikulum ili proteinom α-galaktozidaze koji je ekprimovan sa signalnim peptidom endohitinaze B koji cilja endoplazmatičan retikulum (signalni protein endohitinaze, SEQ ID NO: 14, kako je kodirano SEQ ID NO: 15).

[0180] Analiza glikana proteinskog proizvoda rekombinantne humane α-galaktozidaze iz transformisanih ćelija duvana koje eksprimuju humani protein α-galaktozidaze uz dodavanje signalnog peptida ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum (npr. SEQ ID NO: 1, kodiran sa SEQ ID NO: 2) otkriva profil glikana koji sadrži glavne glikanske strukture visoko manoznih glikanskih struktura (npr.3 do 6, 7, 8 ili 9 manoznih ostataka, sa krajnjim, izloženim manozama), i specifični glikani karakteristični za biljke, kao što su β-(1,2) ksiloza i α-(1,3) fukoza (Slika 7). Pretežno strukture glikana predstavljaju visoki procenat profila glikana koji uključuje oko 30% manoza 3-β-(1,2) ksiloze-α-(1,3) fukoze [Fc(3)M3X] i/ili manoze 4-α-(1,2) ksiloze (M4X); i ostale oko 30% manoze 8 (M8) glikana (Slika 8). Slika 8 je prikazana kao tabela koja prikazuje raspored struktura glikana u okviru proteinskih uzoraka iz transformisanih ćelija. A-Gal A i A-Gal-Bsu dve reprezentativne analize prozvoda proteina rekombinantne humane αgalaktozidaze iz transformisanih biljnih ćelija.

[0181] Strukture glikana mogu dalje biti kategorizovane prema šećenim ostacima prisutnim u kompleksima glikana. Dole tabela V daje podatke o raspoređenosti struktura glikana kod proteinskih proizvoda humane α-galaktozidaze iz transformisanih biljaka, prema specifičnim šećerima:

Tabela V-Sadržaj saharida u glikanima

4

[0182] Prema tome, humani proteinski proizvod α-galaktozidaze eksprimovan u ćelijskoj kulturi duvana iz konstrukta koji sadrži SEQ ID NO: 2 je karakterisan sa značajnim procentom struktura glikana specifičnih za biljake (koji imaju fukozne i ksilozne komponente ), i visoko manoznu glikolizilaciju.

PRIMER III-STABILNOST HUMANE REKOMBINANTNE A-GALAKTOZIDAZE EKSPRIMOVANE OD STRANE BILJAKA POD IN-VIVO USLOVIMA

[0183] U cilju aproksimativne farmakokinetike biljke koje eksprimuju humanu rekombinantnu αgalaktozidazu, preparati rekombinantog enzima su izloženi simulaciji in-vivo uslova i praćena je katalitička aktivnost.

Stabilnost u plazmi:

[0184] Stabilnost enzimske aktivnosti u plazmi je procenjena dodavanjem rekombinantog biljnog ekstrakta ili α-galaktozidaze prečišćene iz biljnog ekstrakta u humanu plazmu do krajnje koncentracije od 1 µg/ml (npr.10 µl ekstrakta ili prečišćene α-galaktozidaze u 190 µl humane plazme), inkubirane na 37 °C, i praćenjem α-galaktozidazne aktivnosti u uzorcima u predviđenim intervalima u toku sat vremena.

[0185] Upoređivanje između α-galaktozidaze iz biljaka N. benthamaina transformisanih sa SEQ ID NO: 11, koje kodiraju α-galaktozidazu sa signalim peptidom pektinaze jabuke koji cilja endoplazmatični retikulum (SEQ ID NO: 12) i α-galaktozidazom iz biljaka N. benthamaina transformisanih sa SEQ ID NO: 2, koje kodiraju α-galaktozidazu sa signalnim peptidom ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum (SEQ ID NO: 1) (Slika 4) ukazuje na jasnu prednost α-galaktozidaze eksprimovane u N. benthamiana-iz kontrukta koji ima signalni peptid ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum (slika 4, zatvoreni ili čvrsti kvadrati), u poređenju sa rekombinantom α-galaktozidazom eksprimovanom iz konstrukta sa vodećim signalom pektinaze jabuke koji cilja endoplazmatični retikulum (slika 4, otvoreni kvadrati).

[0186] Upoređivanje između α-galaktozidaze eksprimovane u biljnim ćelijama N. tabacuum (BY2) transformisane sa SEQ ID NO: 2, koja kodira protein α-galaktozidaze sa signalnim peptidom ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum (SEQ ID NO: 1), što dovodi do zrelog rekombinantog proteina αgalaktozidaze date kao SEQ ID NO: 21 sa α-galaktozidazom eksprimovanom u ćelijama sisara (REPLAGAL™) su otkrile sličnu stabilnost enzimske aktivnosti kada su inkubirane u toku jednog sata na 37 °C u plazmi (slika 5), i kada su inkubirane preko 9 dana u uslovima sličnim lizozimima (pH=4.6 i 37 °C, slika 6). Ova sličnost pod simuliranim in-vivo uslovima sugeriše da biljne ćelije koje eksprimuju rekombinantu α-galaktozidazu bi imale farmakokinetiku koja je uporediva sa onim koje su eksprimovane u ćelijama sisara , klinički odobrenim enzimom (RE-PLAGAL™).

[0187] Pored toga, citat ili identifikaciju bilo koje reference u ovoj prijavi ne treba smatrati da je takva referenca prethodno stanje tehnike prikazanog pronalaska . U meri ukojoj se koriste naslovi odeljaka ne treba ih tumačiti kao nužno ograničavajuće.

4

4

4

�

�

4

4

�

2

4

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Humani protein α-galaktozidaze koji sadrži glicin kao N-krajnji ostatak u kome pomenuti humani protein α-galaktozidaze je translatorno spojen na C-kraju sa signalnim peptidom za zadržavanje u endoplazmatičnom retikulumu i gde humani protein α-galaktozidaze je dobijen ekspresijom proteina u biljnoj ćeliji koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humani protein α-galaktozidaze translatorno spojen na N-kraju sa signalnim peptidom Arabidopsis ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum i translatorno spojenim na C-kraju sa signalnim peptidom zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu.

2. Humani protein α-galaktozidaze prema zahtevu 1, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu humanog proteina α-galaktozidaze navedenu kao SEQ ID NO: 21.

3. Humani protein α-galaktozidaze prema zahtevu 1 ili 2, gde pomenuti signal zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu ima aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO: 6.

4. Humani protein α-galaktozidaze prema bilo kom od zahteva 1-3, gde pomenuta sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira pomenuti humani protein α-galaktozidaze je translatorno spojena na N-kraju sa signalnim peptidom Arabidopsis ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum i translatorno je spojena na C-kraju sa signalnim peptidom zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu je kodon optimiziran za ekspresiju u biljnim ćelijama duvana .

5. Humani protein α-galaktozidaze prema bilo kom od zahteva 1-3, gde pomenuta sekvenca nukleinske kiseline koja kodira pomenuti protein humane α-galaktozidaze translatorno je spojena na N-kraju sa signalnim pepetidom Arabidopsis ABPI koji cilja endoplazmatični retikulum i translatorno je spojena na C-kraju sa signalnim peptidom zadržavanja u endoplazmatičnom retikulumu koji sadrži SEQ ID NO: 2.

6. Humani protein α-galaktozidaze prema bilo kom od zahteva 1-3, gde pomenuti humani protein αgalaktozidaze je prečišćeni humani protein α-galaktozidaze .

7. Humani protein α-galaktozidaze prema bilo kom od zahteva 1-6, gde pomenuti humani protein αgalaktozidaze je katalitički aktivan kao što je određeno sa p-nitrofenilalfa-D-galaktopiranozidnim testom.

8. Višestruki proteini humane α-galaktozidaze prema bilo kom od zahteva 1-6, gde bar 0.5% pomenutih višestrukih proteina humane α-galaktozidaze ima strukturu glikana koja sadrži devet manoznih ostataka, u kojima su tri izloženi manozni ostaci .

9. Višestruki proteini humane α-galaktozidaze prema zahtevu 8, gde predominantne strukture glikana pomenutih višestrukih proteina humane α-galaktozidaze su manoza 4-β-(1,2) ksiloza (M4X); manoza 3-β-(1,2) ksiloza- α-(1,3) fukoza [Fc(3)M3X] i manoza 8 (M8), i farmaceutski prihvatljiv nosač.

10. Izolovane biljane ćelija koja sadrži humani protein α-galaktozidaze prema bilo kom od zahteva 1-7 ili višestruke proteine humane α-galaktozidaze prema zahtevu 8 ili 9.

11. Izolovana biljna ćelija prema zahtevu 10, gde pomenuta biljna ćelija je ćelija ćelijske linije duvana.

12. Izolovana biljna ćelija prema zahtevu 10, gde je pomenuta biljna ćelija BY-2 celija.

13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži, aktivno sredstvo, humani protein α-galaktozidaze prema bilo kom od zahteva 1-7 ili višestruke proteine humane α-galaktozidaze prema zahtevu 7 ili zahtevu 8 i farmaceutski prihvatljiv nosač .

14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži, aktivno sredstvo, biljnu ćeliju prema bilo kome od zahteva 10-12 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

15. Humani protein α-galaktozidaze prema bilo kom od zahteva 1-7, višestruki proteini humane αgalaktozidaze prema zahtevu 7 ili zahtevu 8, izolovana biljna ćelija prema bilo kom od zahteva 10-12 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 13 ili 14 za upotrebu u lečenju Fabrijeve bolesti kod subjekta kome je to potrebno .

1