KR20080038131A - 생물학적으로 활성인 거대분자의 점막 또는 장관 투여 - Google Patents

Abstract

생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 생물학적으로 활성인 형태로, 이를 필요로 하는 대상에게 전신 전달하는 방법으로서, 상기 대상에게 외인성의 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 발현하는 식물 세포를 치료적 유효량으로 장관 또는 점막 투여함으로써, 상기 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 생물학적으로 활성인 형태로 상기 대상에게 전신 전달하는 것을 포함하는 방법.

식물 세포, 생체분자, 경구 투여, 점막 투여, 형질전환

Description

생물학적으로 활성인 거대분자의 점막 또는 장관 투여{MUCOSAL OR ENTERAL ADMINISTRATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MACROMOLECULES}

본 발명은 생물학적으로 활성인 거대분자의 투여를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는, 예방 또는 치료 용도를 위해 생물학적으로 활성인 재조합 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현하는 배양된 식물 세포의 장관 (예를 들면, 경구) 또는 점막 투여에 관한 것이다.

바이오기술에서의 혁신은 단백질 및 펩티드 치료제 및 기타 거대분자 약물의 수에 현저한 증가를 초래하였다. 84 개가 넘는 거대분자가 현재 미국에서 판매 승인되었고, 거의 350 개가 넘게 임상 개발 중에 있다. 또한, 유전체학 및 단백체학 기술에서의 최근의 진전은 거대분자 치료제 후보의 보급을 계속 증가시킬 것으로 예상된다.

그러나 거대분자를 다루는 작업은 전형적으로, 이들 화합물들을 안전하고 효과적인 치료제로 성공적으로 개발하기 위해 약물 개발자들이 극복해야 할 몇 가지 문제점을 제시한다. 예를 들면, 단백질과 펩티드는 단백질 분해효소에 의해 파괴되는 경향이 있거나, 고분자량 단백질의 경우에는 중화하는 항체를 생성할 수도 있다. 더욱이, 그러한 분자들은 낮은 용해성 또는 열악한 안정성을 나타내어서, 짧 은 저장 수명을 초래할 수 있다. 그 결과, 거대분자 치료제는 종종 그 효과성을 빨리 손실하거나, 더 잦은 투약을 필요로 한다. 이러한 사실들은 치료법의 비용뿐만이 아니라, 환자의 수용 및 순응성에도 영향을 미쳐서, 그 치료의 유용성에 영향을 미친다.

경구 투여:

단백질 및 펩티드계 약물 전달에 가장 흔한 방법은 주사 및 주입과 같은 침습적 약물 전달 방법에 의한 것이다. 이들은 전신성 질환을 위한 거대분자 약물을 투여하기 위한 일차적 방식이지만, 환자 및 의료진에게 있어 가장 바람직하지 못한 것이기도 하다. 이 전달 방법의 명백한 단점은 환자의 수용 및 순응성으로서, 침습적 투여 경로를 사용해야 하는 필요성이 관련된 비용 또는 불편함에 비해 그리 중요하지 않다는 점이 대부분의 거대분자 개발을 제한한다. 약물의 전신 전달을 위한 비-침습적 방법으로서, 경구 투여가 사용의 용이성 및 편리함, 장대한 용적의 흡수성 표면으로의 접근성, 고도의 혈관침투, 비교적 긴 체류 시간, 비활성, 비-대사성 성분의 자연적 폐기 등의 많은 장점을 제공한다.

그럼에도 불구하고, 거대분자 의약품의 경구 투여에 대한 조사에서는 이 경로의 잠재성에 버금갈 만족스러운 수준의 효율이 나타나지 않았다. 상기 장애물의 일부는 알약 및 기타 고형 제제의 섭취의 어려움, 위장관(GI tract)에서의 생물학적으로 활성인 거대분자의 취약성, 점막에서의 생물학적 활성제의 농도, 및 생물학적으로 활성인 거대분자에 대한 GI 막의 투과성이다.

생물학적으로 활성인 물질의 경구 투여 경로는 위장에서의 높은 산성 및 효 소 분해에 의해 복잡해지는데, 이는 생물학적으로 활성인 거대분자가 의도된 표적 조직에 도달하기 전에 상기 분자를 불활성화시키거나 파괴할 수 있는 것이다. 또한 유효 농도의 생물학적으로 활성인 거대분자는 위장관에서 당면하는 큰 용적에서는 달성하기가 어렵다. 따라서 효과를 얻기 위해, 대부분의 약물은 상부 위장관에서의 흡수 및/또는 환경으로부터 보호되어야 하고, 그 후 소장 또는 대장으로 갑자기 방출되어야 한다. 단백질과 같은 거대분자 치료제의 경구 또는 장관 투여와 관련된 문제점을 극복하기 위해, 제약학 산업에서는 다양한 전략이 사용되고 있다. 이러한 전략에는, 담체와의 공유결합, 위장 및 상부 위장관과 같은 가혹 조건하에 활성 성분의 방출을 지연시키거나 방지하도록 고안된 코팅 및 제형물 (pH 민감성 코팅, 고분자 및 다중층 코팅, 캡슐화, 시한 방출 제형물, 생물접착제 시스템, 삼투압 제어 전달 시스템 등)이 포함된다. 그러나 생물학적 활성제를 상기와 같은 제형물로 제조하는 데에는 복잡하고 비용이 드는 공정을 필요로 한다. 또한 점막에서의 증가된 섭취를 위한 점막성 접착제 및 침투 촉진제 (살리실산염, 지질-담즙산염 혼합 마이셀, 글리세리드, 아실카르니틴 등)도 채용된다. 그러나 이들 중 일부는 심각한 국소 독성 문제, 예컨대 국소적 자극, 상피층의 마멸 및 조직의 염증을 일으킬 수 있다. 경구 전달을 개선시키기 위한 다른 전략에는 생물학적 활성제를 아프로티닌, 대두 트립신 저해제 및 아마스타틴과 같은 프로테아제 저해제와 혼합하는 것을 포함하지만; 효소 저해제는 선택적이지 않으며, 내인성 거대분자를 또한 저해하여 원치 않는 부작용을 야기한다. 따라서 생물학적으로 활성인 분자의 본 경구 투여 방법은 표적 조직에서의 목적하는 생물학적 활성의 효율적 전달을 보 장하지 못한다.

식물성 생물의약품:

포유류 세포는 천연적으로 포유류 유전자의 발현에 적당한 것으로 여겨진다. 그러나 이들의 사용은 높은 배양 비용 및 가장 우선적인 염려인 오염 등의 많은 문제점을 제시한다. 시험관내 포유류 세포 배양으로써 수득되는 단백질 발현은 매우 큰 용적을 필요로 하여, 비용이 많이 든다. 유전자도입 동물 (마우스, 양 및 소)의 젖에 함유된 재조합 단백질의 생산은 일부 생산비용이 감소되게 한다. 하지만 윤리적 문제 및 바이러스 및 서브바이러스 오염 (프리온 등)의 문제는 남아있다.

동물 유래 펩티드 및 폴리펩티드의 공급원으로서 식물 시스템이 이로운 점에는, 저렴한 바이오매스 생산, 바이러스, 병원균 및 독소에 의한 오염의 낮은 위험성, 경구 전달의 경우에서 다량체 단백질의 접힘 및 집합이 가능한 식물 세포의 능력, 하류 가공에 대한 저하된 요구조건, 및 감소된 윤리적 문제가 포함된다. 따라서 생물학적으로 활성인 펩티드 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 포유류 유전자를 식물 세포 내에 유전자도입하는 것은, 다량의 새로운 재조합 생물학적 활성 분자를 저감된 생산 비용으로, 또한 동물 세포 바이러스 또는 서브바이러스 오염의 다양한 위험성 없이, 생산하기에 바람직한 경로를 제공할 수 있다.

1983년에는 몇몇 실험실에서, 이종 유전자를 식물 세포의 게놈으로 이전시키고 (Bevan 등, 1983; Herrera-Estrella 등, 1983 a 및 b), 이들 유전자적으로 변형된 세포로부터 유전자도입 식물을 재생하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 두 가지 형질변환 접근법이 식물에서의 재조합 의약품을 제조하는 데 흔히 사용된다. 첫 번째에서는, 안정하게 형질전환된 유전자도입 식물이 아그로박테리움(Agrobacterium)이 매개하는 형질전환, 입자 충돌(particle bombardment), 또는 기타 표준 형질전환 기법을 사용하여 생산된다. 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)이 모델 발현 시스템으로서 폭넓게 사용되는데, 니코티아나 베타미아나(Nicotiana bethamiana) 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 토마토, 바나나, 순무, 광저기, 유채(oilseed rape), 에티오피아 겨자, 감자, 벼, 밀 및 옥수수를 포함한 기타 식물도 사용되었다. 두 번째 전략은 비-유전자도입 식물을, 숙주 내에서 복제 중에 도입유전자(transgene)를 발현하는 재조합 바이러스로 감염시키는 것이다. 가장 자주 사용되는 두 가지 숙주-바이러스 시스템은 담배와 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 또는 광저기와 광저기 모자이크 바이러스 (CPMV)이다.

식물 유전자도입에서의 최초의 약진 이후, 식물 세포 및/또는 유전자도입 식물에서의 포유류 재조합 단백질의 생산에서 많은 진전이 있었다. 이 분야에서 진정 중요한 첫 결과들 중 하나는 유전자도입 담배 식물에서의 항체 생산 ("플랜티바디(Plantibodies)")이었다. 몇몇 진단 및 치료용 "플랜티바디"는 현재 입수가능하게 되었다: 충치에 대한 담배 항-스트렙토코쿠스 분비 IgA (마우스 Guy's 13 IgG); 진단용 알팔파 항-인간 IgG-쥐 IgG 신호 펩티드-C5-1 (IgG); 항-암 밀 및 벼 암배아 항원-쥐 IgG 신호 펩티드; KDEL-ScFvT84.66 (ScFv); 항-암 담배 암배아 항원-TMV 리더; 쥐 IgG 신호 펩티드; KDEL-T84.66 (IgG) (일시적으로 아그로박테리움 침윤됨); 담배 B-세포 림프종 처리; 개별특이형 백신-벼 a-아밀라제-38C13 (scFv), 담배 항-대장암 표면항원-쥐 IgG 신호 펩티드; KDEL-CO17-1A(IgG), 및 대두 항-헤 르페스 심플렉스 바이러스 2-담배 엑스텐신 신호 펩티드-항-HSV-2 (IgG).

1990년에는 Sijmons와 동료들이 인간 혈청 알부민의 유전자를 담배 및 감자의 세포 내에서 발현시켰다. 총 단백질의 0.02% 정도의 인간 혈청 알부민 수준이 감자의 잎, 줄기 및 덩이줄기에서 수득되었다. 그 이후로 식물에서 생산되어 온 다른 포유류 재조합 단백질에는 인간 헤모글로빈; 안티트립신, 프로테아제; 프로테아제 저해제; 콜라겐 및 락토페린 (Legrand 등에 허여된 미국특허출원 제 20030229925 호; Lenee 등에 허여된 제 20040072317 호; 및 Gruber 등에 허여된 제 20030096973 호 참조); B형 간염 표면항원; 인터페론; 콜레라 독소; 인간 상피성장인자 (EGF); 에리트로포이에틴; h-GM-CSF, 및 인터류킨이 포함된다. 또한, 백신접종 및 면역화를 위한 재조합 식물 항원 ("플랜티진(Plantigens)")이 개발되었다. 몇 군데 회사에서는 이미 식물-유래 의약품을 시판하고 있거나 (Prodigene, Inc. 사제의 TrypZean™ 및 AproliZean™), 또는 임상시험 중에 있다 [Planet Biotechnology, Inc. 사 (DoxoRx™ 및 CaroRx™) 및 Meristem Therapeutics 사 (CF용 재조합 인간 리파아제 "Meripase(R)")].

대부분의 경우, 식물 유래의 생물학적으로 활성인 재조합 단백질은 숙주 조직으로부터 단리될 필요가 있다. 고수준의 발현을 달성하고 추출에 가장 편리한 식물 물질을 제공하기 위해, 재조합 단백질을 특정 식물 조직, 예컨대 종자, 잎, 뿌리, 덩이줄기 등, 및 엽록소와 같은 세포기관으로 인도하는 다양한 방법이 사용가능하다. 재조합 단백질은 분비될 수도 있다; 하지만 분비된 재조합 단백질 (예컨대 분비된 "플랜티바디")은 식물 조직 내에 유지되는 재조합 단백질보다 더 쉽게 분해된다. 재조합 단백질을 발현하는 식물 전체 또는 식물 세포 배양물의 투여에 대해 이전에 제시된 적이 있음을 유념해야 한다 (예를 들면, 아라비돕시스 내 재조합 단백질 발현, 미국특허출원 제 20030084484 호 참조). 그러나 재조합 단백질의 표적 조직으로의 이송을 뒷받침하는 실험 데이터는 제공된 바 없다.

식물 세포 배양물:

식물 세포 배양물이 재조합 펩티드 및 폴리펩티드의 생산에 사용될 수 있다. 식물 세포는 제어된 조건 하에 생물반응기 내에서 영양배지 중에서 무균 증식될 수 있으며, 외래 단백질은 바이오매스로부터, 또는 배양액으로부터 수확될 수 있다. 항체 및 항체 단편, 효소, 인터류킨, 인터페론, 인간 호르몬, 성장인자, 혈액인자, 백신, 리보솜 비활성화 단백질, 리신 및 인간 항트립신을 포함하는 생물학적으로 활성인 재조합 거대분자가 식물 세포 배양물에서 생산되었다 (총론으로는, Doran 저, Current Opinion in Biotech 2000; 11; 199-204 참조). 농업적 시스템이 전체적으로 더 큰 수율을 제공할 수는 있지만, 시험관내 세포 배양물은 외래 단백질 수준을 조작할 수 있는 더 큰 능력, 더 짧은 전체적 성장 사이클 및 조절 목적을 위한 성장 환경의 더 강한 제어 등의 장점을 제공한다.

최근, 본 발명자들은 식물 세포를 위한 독특한 고수율 일회용 배양 시스템으로서, 배양물 중에서 생물학적으로 활성인 펩티드 및 폴리펩티드의 생산에 효과적인 것으로 나타나서 (본원에 참조로서 인용된 PCT IL/2005/000228 호 참조), 생물학적으로 활성인 인간 β 인터페론, 인간 X 인자, 인간 글루코세레브로시다아제 및 감염성 점액낭병 VPII 단백질의 생산을 입증한 배양 시스템을 개시하였다. 재조합 의, 식물 세포 유래 글루코세레브로시다아제는 현재 고셔병을 위한 치료법으로서 장래의 사용을 위해 평가되고 있다.

식물 유래 재조합 생물학적 활성 거대분자의 경구 투여:

재조합의 생물학적 활성제를 제공하기 위한 식용 유전자도입 식물의 사용은 농업적 유전공학의 초기 시절부터 추구되어 왔다. 양상추와 같은 식용 잎 작물, 옥수수, 쌀 보리 및 밀과 같은 곡물, 대두 및 완두와 같은 콩 작물, 및 감자, 당근, 토마토 및 바나나와 같은 과일 및 채소의 형질전환이 재조합 백신의 효율적인 전달을 위해 검토되었다. 항원성 단백질의 유전자를 발현하는 식용 유전자도입 식물 (옥수수, 감자)을 통한 경구 DNA 백신접종이 성공적으로 입증되었다. 점막 및 혈청 면역 반응이, 유전자도입 감자를 먹인 마우스에서 콜레라 독소 B 서브유닛에 대해, 유전자도입 감자 덩이줄기를 먹인 인간에서 LT-B 창자독소 항원에 대해 (Mason 등, Vaccine 1998; 16:1336-1340), 유전자도입 루핀 및 양상추 (Kapusta 등, FASEB J, 1999; 13:1796-99), 및 유전자도입 토마티야 (Gao 등; W Jour Gastroent. 2003; 9:996-1002)를 먹인 인간 및 마우스에서 B형 간염-표면 항원에 대해 검출되었다. 다성분 식용 HIV및 HBV 백신을 최근 토마토에서 시험하였고 (Shchelkunov 등, Ves수. Ross. Akad Med Nauk 2004;11:50-55); 다성분 식용 감자 백신을 최근 콜레라, 로타바이러스 및 ETEC에 대해 성공적으로 시험하였다 (최근 총론에 대해서는, Korban 등, J Am Col Nutr 2002; 21:212S-217S 참조). Webster 등 (J of Virol, 2002; 76:7910-12)은 유전자도입 감자 유래 홍역 바이러스 헤마글루티닌 단백질 백신을 이용한, 홍역에 대한 마우스의 성공적인 면역화 및 추가면역 에 대해 보고하였다. Smart 등 (J Immunol 2003; 171:2116-26)은 해바라기씨 항원을 발현하는 유전자도입 루핀을 먹임으로써 마우스를 실험적 천식으로부터 보호할 수 있음을 보여주었다.

경구투여용 유전자도입 식물 물질의 제조 및 용도에 대한 다양한 접근법이 제시되었다. Kirk 등 (미국특허출원 제 20040175440 호)은, 이종 단백질을 발현하는 유전자도입 식물의 안정한 건조 균질액(homogenate)의 제조, 및 효과적인 피임제 항체의 유도를 위한, 투명대(zona pellucida) 당단백질, GnRH, LHRH, LH, LDH 및 항-정자 항원과 같은 재조합 수태-관련 펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 상기 균질액의 경구 투여를 개시한다. Brandle 등 (2002년 5월 3일에 출원된 미국특허출원 제 02/137,647 호)은, 인간 자가항원 및/또는 사이토카인을 발현하는 유전자도입 식물 (식용 및 비-식용 작물에서의) 생산을 비롯하여, 자가면역 질환, 예를 들면 염증성 장질환 (IBD) 및 당뇨병의 조절을 위한, 활성 자가항원에 대한 경구 내성의 자극에 의한 생물학적으로 활성인 분자의 추출 방법을 개시한다.

그러나 상술한 선행기술 중 어느 것도, 생물학적으로 활성인 재조합 거대분자를 발현하는 유전자도입 식물 세포 배양물의 경구 투여를 통한, 재조합 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 혈액 순환계 및/또는 내부 장기 또는 장기 시스템으로의 전신성 투여에 대해서는 교시하지 않는다.

따라서 유전자도입 식물 세포의 투여를 통한 생물학적으로 활성인 거대분자장관 (예를 들면, 경구) 또는 점막 투여를 위한 방법 및 조성물에 대해 그 필요성이 널리 인식되고 있으며, 그러한 방법 및 조성물이 있다면 매우 유리할 것이다.

발명의 개요

본 발명의 한 관점에 따르면, 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 생물학적으로 활성인 형태로, 그를 필요로 하는 대상에게 전신적으로 전달하는 방법으로서, 상기 대상에게 외인성의 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 발현하는 식물 세포를 치료적 유효량으로 경구 또는 점막 투여함으로써, 상기 대상에게 상기 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 생물학적으로 활성인 형태로 전신 전달하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 관점에 따르면, 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 생물학적으로 활성인 형태로, 그를 필요로 하는 대상에게 국소적으로 전달하는 방법으로서, 상기 대상에게 외인성의 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 발현하는 식물 세포를 치료적 유효량으로 경구 또는 점막 투여함으로써, 상기 대상에게 상기 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 생물학적으로 활성인 형태로 국소 전달하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

하기 기술되는 본 발명의 바람직한 실시양태에 있어서 추가적 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 실질적으로 온전한 세포벽을 포함한다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 실질적으로 온전한 세포막을 포함한다.

상술한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 실질적으로 온전한 세포벽 및 세포막을 포함한다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포 는 단리된 세포로서 투여된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 탈수된 식물 세포로서 투여된다.

본 발명의 또다른 관점에 따르면, 활성 성분으로서, 외인성의 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 발현하는 식물 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 비-면역원성 담체이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 장 관련 림프 조직을 자극하지 않는다.

본 발명의 또다른 관점에 따르면, 대상 내 생물학적으로 활성인 생체분자의 국소 전달을 위한 단위 제형으로서, 외인성의 생물학적으로 활성인 생체분자를 발현하는 식물 세포를 치료적 유효량으로 포함하는 단위 제형이 제공된다.

본 발명의 한 부가적 관점에 따르면, 대상 내 생물학적으로 활성인 생체분자의 전신 전달을 위한 단위 제형으로서, 외인성의 생물학적으로 활성인 생체분자를 발현하는 식물 세포를 치료적 유효량으로 포함하는 단위 제형이 제공된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 단위 제형은 경구 투여용으로 제제화된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 단위 제형은 점막 투여용으로 제제화된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 탈수된 식물 세포를 포함한다.

본 발명의 또다른 부가적 관점에 따르면, 질환 치료를 필요로 하는 대상에 있어서 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 대상에게 외인성의 생물학적으로 활성인 생체분자를 발현하는 식물 세포를 치료적으로 유효한 양으로 장관 또는 점막 투여함으로써, 상기 대상에서 질환을 치료하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 생물학적으로 활성인 생체분자는 재조합 인간 글루코세레브로시다아제 단백질을 포함하며, 상기 질환은 고셔병이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 생물학적으로 활성인 생체분자는 재조합 인간 글루코세레브로시다아제 단백질을 포함하며, 상기 질환은 파브리병(Fabry disease)이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 생물학적으로 활성인 생체분자는 재조합 인간 글루코세레브로시다아제 단백질을 포함하며, 상기 질환은 암이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 질환은 전신성 질환이다

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 질환은 만성 질환이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 질환은 급 성 질환이다.

본 발명의 또다른 부가적 관점에 따르면, 의약의 제조를 위한, 외인성의 생물학적으로 활성인 생체분자를 발현하는 식물 세포의 용도가 제공된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 실질적으로 온전한 세포벽을 포함한다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 실질적으로 온전한 세포막을 포함한다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 실질적으로 온전한 세포벽 및 세포막을 포함한다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 단리된 세포로서 투여된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 탈수된 식물 세포로서 투여된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 재조합 생체분자는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 재조합 생체분자는 폴리펩티드이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 재조합 생체분자는 치료적 생체분자, 진단적 생체분자 및 기능성 화장품(cosmeceutical)이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 탈수된 식물 세포는 부형제를 추가 포함한다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 알팔파 식물 세포를 포함한다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 담배에서 얻은 식물 세포를 포함한다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 담배 세포주에서 얻은 식물 세포를 포함한다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 세포는 식물 뿌리 세포를 포함한다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 뿌리 세포는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rizhogenes) 형질전환된 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 서양 고추냉이 세포 및 당근 세포로 이루어진 군에서 선택된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 식물 뿌리 세포는 당근 세포이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 재조합 생체분자는 원핵세포 단백질, 진핵세포 단백질, 키메라성 단백질, 바이러스성 단백질로 이루어진 군에서 선택된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 바이러스 단백질은 감염성 점액낭병 바이러스의 바이러스성 단백질 VPII이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 성가 진핵세포 단백질은 인간 인터페론 β이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 진핵세포 단백질은 인간 응고인자이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 진핵세포 단백질은 인간 X 인자이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 진핵세포 단백질은 인간 라이소좀 효소이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 진핵세포 단백질은 인간 글루코세레브로시다아제이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 진핵세포 단백질은 인간 알파 갈락토시다아제이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 진핵세포 단백질은 인간 성장 호르몬이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 진핵세포 단백질은 FSH이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 진핵세포 단백질은 아세틸콜린 에스테라제이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 재조합 생 체분자는 비-면역원성이다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 의약은 전신 전달용으로 제제화된다.

상기한 바람직한 실시양태에 있어서 또다른 특징에 따르면, 상기 의약은 국소 전달용으로 제제화된다.

본 발명은, 전신적 또는 국소적 전달에 적당한 생물학적으로 활성인 거대분자의 점막 또는 장관 투여를 위한 방법 또는 조성물을 제공함으로써, 현재 알려진 구성의 단점을 성공적으로 해결한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 대등한 방법 및 물질들이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적당한 방법 및 물질을 하기에 기술한다. 대립이 있는 경우, 정의들을 포함한 본 특허 명세서가 지배할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시적일 뿐이며, 제한하려는 의도는 없다.

본 발명을 첨부한 도면을 참조하여 실시예로써 본원에 기술한다. 도면을 상세히 구체적으로 참조하면서, 나타내어진 특정 사항들은 예로서 든 것이고, 단지 본 발명의 바람직한 실시양태를 예시적으로 거론하기 위한 목적을 가지며, 본 발명의 원리 및 개념적 관점의 가장 유용하고 쉽게 이해되는 설명인 것으로 여겨지는 것을 제공하려는 이유 하에 제시됨을 강조한다. 이와 같은 관점에서, 본 발명의 구조적 세부사항을, 발명의 기초적 이해에 필요한 것보다 더 상세하게 나타내도록 노력하지는 않았으며, 도면과 함께 설명은 본 발명의 몇 가지 형태가 실무에 있어서 어떻게 실현될 수 있는지를 당업자에게 명백히 밝힐 것이다.

도면에서:

도 1은 재조합 단백질을 발현하는 당근 배양물을 먹인 마우스의 간에서의 GCD의 활성을 도시하는 막대그래프이다.

도 2는 미감작 BY2 세포가 투여된 동물에 비해, BY2 세포를 발현하는 hGH가 투여된 뇌하수체 절제된 랫트에서의 상승된 hGH 수준을 도시하는 막대그래프이다.

도 3a 및 도 3b는 hGCD 발현 식물 세포가 경구 투여된 랫트의 비장 (도 3a) 및 간 (도 3b)에서의 상승된 hGCD 수준을 도시하는 막대그래프이다. 최고 수준은 투여 후 1 시간 후에 명백해진다.

도 4는 FSH-발현 식물 세포가 경구 투여된 랫트의 혈청 중 상승된 FSH 수준을 도시하는 막대그래프이다. 최고 수준은 투여 후 10 분 후에 명백해진다.

도 5는 GCD 발현 세포의 건조/동결건조 추출물 및 신선 세포 추출물에서 유래된 GCD 수준을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타내는 광학 현미경 사진이다.

본 발명은 진단, 미용, 예방 또는 치료 목적에 사용될 수 있는 생물학적으로 활성인 거대분자의 점막 또는 장관 (예를 들면, 경구) 투여를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 원리 및 작용은 도면 및 첨부한 설명을 참조로 하여 더욱 잘 이해될 수 있다.

본 발명의 하나 이상의 실시양태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 하기의 설명에 서술되는 세부사항에 대한 적용으로 한정되거나, 실시예에 의해 예시되지 않는다는 점을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하거나, 다양한 방법으로 실시되거나 수행되는 것이 가능하다. 또한, 본원에 채용된 표현 및 용어는 설명을 목적으로 하며 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다는 점을 이해해야 한다.

생물의약품의 식물 기반 생산은 이제, 식물 유래 단백질 치료제가 나오고 있음에 따라 시판되고 임상시험 중에 있다. 그러나 식물 배양 배지 또는 바이오매스로부터의 생성물 회수는 비용 효율, 수율 및 활성의 측면에서 상기와 같은 재조합 단백질의 대규모 상업적 사용을 저해한다.

최소한 혹은 더 이상 회수가 되지 않는 것과 같은 단백질 치료제의 투여가 앞서 제시되었다 (예를 들면, 미국특허출원 제 20040175440 호, 제 2003013588 호 및 제 20030084484 호). 그러나 아직까지는, 재조합 단백질을 순환계로 또는 표적 장기 또는 조직 (즉, 표적 장기가 위장관의 일부가 아닌 곳)으로 실제 이송하는지에 대한 실험적 입증은 이루어지지 않았다.

본 발명을 실행함에 있어, 본 발명자들은 재조합 단백질을 발현하는 식물 세포의 투여가 치료용, 진단용 및 예방용 거대분자 (예를 들면, 단백질, 안티센스와 같은 올리고뉴클레오티드 등)의 전신적 투여에 사용될 수 있음을 발견하였다.

하기 및 뒤따르는 실시예 부분에서 예시한 바와 같이, 본 발명자들은 글루코세레브로시다아제 (GCD)를 발현하는 당근 세포 배양물의 경구 투여가, 이를 먹인 마우스의 간에서 활성 효소의 축적을 초래하였다는 것을 나타낼 수 있었다 (도 1, 실시예 1 참조). 또한, 인간 성장 호르몬 (hGH), FSH 및 hGCD를 발현하는 식물 세포를 뇌하수체 절제된 랫트에게 경구 투여하였더니, ELISA 분석에 의해 입증되는 바와 같이 순환계 및 말초 장기로 상기 단백질들이 성공적으로 전달됨을 나타내었다 (실시예 2 내지 4 참조).

따라서 본 발명은 최초로, 식물 세포가 단백질과 같은 생물학적으로 활성인 생체분자의 전신, 점막 또는 장관 전달에 효과적인 담체로서 사용될 수 있다는 증거를 제공한다.

따라서 본 발명의 한 관점에 따르면, 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 생물학적으로 활성인 형태로, 이를 필요로 하는 대상에게 전신 전달하는 방법이 제공된다.

본 발명의 이러한 관점의 방법은 상기 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 식물 세포에서 발현시키고; 상기 대상에게 상기 생물학적으로 활성인 외인성 재조합 생체분자를 발현하는 세포를 치료적 유효량으로 장관 (예를 들면, 경구) 또는 점막 투여함으로써, 상기 대상에게 상기 생물학적으로 활성인 재조합 단백질을 생물학적으로 활성인 형태로 전신 전달함으로써 실시된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 구절 "전신 전달"은, 혈액 순환계를 통해 신체의 장기 (내부 또는 외부)에 제공하는 것을 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 구절 "재조합 생체분자"는, 재조합 DNA 기술을 이용하여 본 발명의 식물 세포에서 외인적으로 발현 (mRNA 또는 단백질 수준)되는 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 펩티드 (예컨대 더 큰 폴리펩티드의 펩티드 단편)를 말한다.

본 발명의 교시에 따라 재조합적으로 발현될 수 있는 단백질의 예에는 원핵세포 단백질, 진핵세포 단백질 (예를 들면, 포유류, 식물), 키메라성 단백질, 바이러스성 단백질 및 펩티드가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 구체예로는 항체 (예를 들면, 항-충치), 호르몬, 성장인자, 프로테아제, 세포외기질 단백질 (예를 들면, 콜라겐), 효소, 감염성 점액낭병 바이러스의 바이러스성 단백질 VPII, 인간 인터페론 베타, 인간 응고인자, 인간 X 인자, 인간 라이소좀 효소, 인간 글루코세레브로시다아제, 인간 알파 갈락토시다아제, 및 아세틸콜린 에스테라제 및 고-만노스 단백질(high mannose proteins) [예를 들면, 인간 Cox-2, 인간 EGF, 인간 자궁조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA), 인간 DNase I, 재조합 gp120, 인간 조직 플라스미노겐 활성화제, 인간 타이로글로불린 (hTG), 인간 CD4 및 인간 플라스미노겐)]이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

유전자 발현 억제에 관련된 올리고뉴클레오티드 (예를 들면, 안티센스, dsRNA, 라이보자임, DNA자임 등)와 같은 기타 생체분자도 본 발명의 교시를 이용하여 전달될 수 있음을 유념해야 한다.

본원에서 사용된 바와 같은 구절 "생물학적 활성"은, 바람직하게는 백신접종 의도를 위한 면역 반응의 유도로 제한되지는 않는, 재조합 단백질의 고유한 생물학적 활성 (예를 들면, 효소적 활성, 결합 활성)을 말한다.

본원에서 사용된 바와 같은 구절 "이를 필요로 하는 대상"은, 본 발명으로 인해 유익을 얻을 수 있는 (예를 들면, 임상적으로, 미용적으로) 다세포 동물 생물체 (예를 들면, 가금류, 예를 들면, 포유류, 예를 들면, 인간)를 말한다.

본원에서 사용된 바와 같은 구절 "식물 세포"는, 생물학적으로 활성인 재조합 (외인성) 생체분자를 발현하는 식물 전체, 그의 일부 (예를 들면, 잎, 뿌리, 과실, 종자) 또는 그로부터 단리된 세포 (균질 또는 비균질 세포 집단)를 말한다.

본원에서 사용된 바와 같은 구절 "단리된 식물 세포"는, 분해된 세포 조직 또는 식물 세포 배양물에서 유래된 식물 세포를 말한다.

본원에서 사용된 바와 같은 구절 "식물 세포 배양물"은, 식물의 생물학적 구조가 하나라도 존재하지 않도록, 완전한 식물을 형성하게 조합되지 않는 임의 종류의 천연 (자연 발생) 식물 세포, 식물 세포주 및 유전자 변형된 식물 세포를 말한다. 경우에 따라서는, 본 발명의 이러한 관점의 식물 세포 배양물은 특정 종류의 식물 세포, 또는 복수의 상이한 종류의 식물 세포를 포함할 수 있다. 경우에 따라 특정 종류의 식물 세포를 특징으로 하는 식물 배양물은 원래 복수의 상이한 종류의 상기와 같은 식물 세포로부터 유래된 것일 수도 있음에 주목해야 한다.

본 발명의 식물 세포는 온전한 세포막 및/또는 세포벽을 포함하는데, 이는 생물활성 분자를 전달하기 위해 투여 전에 이들 구조물을 일부러 파괴할 필요가 없음을 나타낸다. 따라서 바람직하게는 투여된 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 실질적으로 온전한 세포막 및/또는 세포벽을 포함한다.

본 발명의 식물 세포는 재조합 단백질을 그 안에서 발현하도록 유전자 변형을 받을 수 있는 식물 (또는 그의 일부), 바람직하게는 식용 식물에서 유래한다.

본 발명의 이러한 관점에 따라 사용될 수 있는 식물의 예에는 이끼, 해조류, 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물을 비롯하여 기타 식물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예로는 잎 작물, 기름감 작물 (oil crop), 알팔파, 담배, 토마토, 바나나, 당근, 양상추, 옥수수, 오이, 멜론, 감자, 포도 및 흰토끼풀이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 식물 세포는 경우에 따라 식물 뿌리 세포 (즉, 식물 뿌리에서 유래하거나, 수득되거나, 본래 뿌리를 기초로 하는 세포)와 같은 임의 종류의 식물 세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 셀러리 세포, 생강 세포, 서양 고추냉이 세포 및 당근 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 현재 알려진 바람직한 구성에 따르면, 상기 식물 세포는 당근 또는 담배에서 유래한다 (하기 실시예 부분의 실시예 2 내지 4 참조). 뿌리 이외의 구조물에서 유래하는 식물 세포는 하기 추가로 기술하는 바와 같이, 아그로박테리움 라이조게네스로써 형질전환되어서, 모상근(hairy root) 세포 발달을 유도할 수 있음 (예를 들면, Strobel 등에 허여된 미국특허 제 4,588,693 호 참조)을 유념해야 한다. 따라서 상기 기술하고, 하기 실시예 부분에서 상세히 설명하는 바와 같이, 식물 뿌리 세포는 아그로박테리움 라이조게네스로써 형질전환된 뿌리 세포일 수 있다.

현탁액 배양물이 본 발명의 이러한 관점에 따라 바람직하게 사용되지만, 유합조직 (callus) 배양물도 사용될 수 있다.

본 발명의 이러한 관점의 생물학적으로 활성인 재조합 단백질의, 상술한 식물 세포 배양물의 세포에서의 발현은 상기 단백질을 발현하는 핵산 서열을 식물 발현에 적합한 핵산 구조체 내로 결찰시킴으로써 수행된다. 또한, 본 발명의 이러한 관점의 생물학적으로 활성인 단백질의, 상술한 식물 세포 배양물의 세포에서의 발현은 식물 유전자의 과잉발현을 유도하는 핵산 서열을 결찰시킴으로써 수행된다.

상기와 같은 핵산 구조체에는, 세포 내에서 구조적이거나 유도적인 방식으로 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 지시하는 프로모터 서열과 같은 시스-작용 조절 영역이 포함된다. 상기 프로모터는 형질전환된 식물/세포와 동종이거나 이종일 수 있다. 혹은 대안적으로는, 상기와 같은 핵산 구조물이 식물 유전자 (즉, 주입 유전자) 근처에서 식물 게놈 내로 삽입된 인핸서/프로모터 요소를 포함한다.

상기 프로모터는, 숙주 세포 내, 예컨대 식물 세포 및 식물 내에서 연결된 서열의 고수준 전사를 유도할 수 있는 식물 프로모터 또는 비-식물 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 구조적이거나 유도적일 수 있다. 예를 들면, 유도성 프로모터는 식물, 식물 조직 또는 식물 세포의 기계적 유전자 활성화 (MGA) 후의 라이소좀 효소 뉴클레오티드 서열의 발현 또는 증가된 발현을 촉진하는 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

구조적 식물 프로모터의 예에는 CaMV35S 및 CaMV19S 프로모터, FMV34S 프로모터, 사탕수수 간균형(bacilliform) 바드나바이러스 프로모터, CsVMV 프로모터, 아라비돕시스 ACT2/ACT8 액틴 프로모터, 아라비돕시스 유비퀴틴(Arabidopsis ubiquitin) UBQ 1 프로모터, 보리잎 티오닌 BTH6 프로모터, 벼 액틴 프로모터, rbcS, 엽록소 a/b 결합 단백질을 위한 프로모터, AdhI, NOS 및 HMG2, 또는 이들의 변형예 또는 유도체가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

유도성 프로모터는, 예를 들면 빛, 온도, 화학물질, 가뭄, 높은 염도, 삼투압 쇼크, 산화 조건을 포함하는 스트레스 조건과 같은 특정 자극에 의해, 또는 병원성의 경우에 유도되는 프로모터이다. 보통 프로모터는 식물이 수확되기 전에 유도되며, 이와 같은 것을 수확전 프로모터(pre-harvest promoter)라 한다. 유도성 수확전 프로모터의 예에는 완두콩 rbcS 유전자 유래의 광유도성 프로모터, 알팔파 rbcS 유전자 유래의 프로모터, 가뭄 하에 활성인 DRE, MYC 및 MYB 프로모터; 고염도 및 삼투압 스트레스 하에 활성인 INT, INPS, prxEa, Ha hsp17.7G4 및 RD21 프로모터, 및 병원성 스트레스 하에 활성인 hsr2O3J 및 str246C 프로모터가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

유도성 프로모터는 또한 유도성 수확후(post-harvest) 프로모터, 예를 들면 유도성 MeGA.™ 프로모터 (미국특허 제 5,689,056 호)일 수도 있다. MeGA™ 프로모터의 신속한 유도에 활용되는 바람직한 신호는 식물이 수확된 후의 국소화된 상처이다.

본 발명의 핵산 구조체 또한, 원하는 경우, 신호 펩티드에 융합된 재조합 단백질 인-프레임(in-frame)의, 식물 내 세포하위 소기관으로의 이송을 허용하는 신호 펩티드를 코딩하는 부가적 핵산 서열을 포함할 수도 있다. 식물 세포의 세포하위 소기관의 예로는 백색체, 엽록체, 미토콘드리아, 핵, 과산화소체, 소포체 및 액포(vacuole)가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 숙주 세포를 트랜스펙션시키거나 형질전환시키는 데 사용되는 발현 벡터는 식물 및 식물 세포 내 이종 유전자 발현을 증대시키거나 최적화시키는 것으로 당업자에게 알려진 방법에 따라 부가적으로 수식될 수 있다. 그러한 수식에는, 프로모터 능력을 증가시키기 위해, 또는 관심대상인 단백질을 수식하기 위해 DNA 조절 요소를 돌연변이시키는 것을 비롯하여, 코돈 사용을 최적화하는 것이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 코돈 사용을 변경함으로써 합성 유전자를 구축하는 것은, 예를 들면 PCT 특허출원 제 93/07278 호에 기술되어 있다.

핵산 구조체는, 예를 들면 플라스미드, 바크미드(bacmid), 파아지미드, 코스미드, 파아지, 바이러스 또는 인공 염색체일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 구조체는 플라스미드 벡터, 더욱 바람직하게는 이원 벡터이다.

"이원 벡터"란 구절은, Ti 플라스미드 유래의 수식된 T-영역을 지니고; 대장균 및 아그로박테리움 세포 모두 내에서 증식될 수 있으며, 보통 두 개의 경계 영역 사이에서 식물 형질전환을 위한 리포터 유전자(들)를 포함하는 발현 벡터를 말한다. 본 발명에 적당한 이원 벡터에는 pBI2113, pBI121, pGA482, pGAH, pBIG, pBI101 (Clonetech 사), pPI (하기의 실시예 부분의 실시예 5 참조), 또는 이의 수식물이 포함된다.

일부 경우에 활성 폴리펩티드의 생산이 일련의 이벤트를 포함하는데, 폴리펩티드의 발현으로부터 시작하여, 번역 후 수식, 예를 들면 글리코실화, 이량체화, 메틸화 및 술피드릴화, 히드록실화가 뒤따를 수 있다.

식물은 올바른 위치에서 인간 단백질을 글리코실화할 수 있는 반면, 완전히 가공된 복합 식물 글리칸의 조성은 포유류 N-연결된 글리칸과 상이하다. 식물 글리칸은 동물 글리칸에 흔한 말단 시알산 잔기 또는 갈락토스 잔기를 갖지 않고, 종종 포유류에서는 일반적으로 발견되지 않는 연결기와 함께 자일로스 또는 퓨코스 잔기를 함유한다 (Jenkins 등, 14 Nature Biotech 975-981 (1996); Chrispeels 및 Faye, Transgenic Plants pp. 99-114 (Owen, M. 및 Pen, J. 편저. Wiley & Sons, N.Y. 1996; Russel 240 Curr. Top. Microbio. Immunol. (1999)).

본 발명의 핵산 구조체는 식물 세포를 안정하게 또는 일시적으로 형질전환하는 데 활용될 수 있다. 안정한 형질전환에서는, 본 발명의 핵산 분자가 식물 게놈으로 통합되며, 이와 같이 하여 안정하고 고유한 특징을 나타낸다. 일시적 형질전환에서는, 핵산 분자가 형질전환된 세포에 의해 발현되지만 게놈으로 통합되지는 않으며, 이와 같이 하여 특정 단백질의 일시적 발현을 나타낸다.

외래 유전자를 외떡잎식물 및 쌍떡잎식물 모두 내로 도입하는 다양한 방법이 있다 (Potrykus, I. (1991). Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42, 205-225; Shimamoto, K 등 (1989). Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts. Nature (1989) 338, 274-276).

외인성 DNA의 식물 게놈 DNA 내로의 안정한 통합의 주요한 방법에는 두 가지 주된 접근법이 포함된다:

(i) 아그로박테리움-매개 유전자 도입. Klee, H.J. 등 (1987). Annu Rev Plant Physiol 38, 467-486; Klee, H.J. 및 Rogers, S.G. (1989). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, pp. 2-25, J. Schell 및 L.K. Vasil, 편저, Academic Publishers, San Diego, Cal.; 및 Gatenby, A.A. (1989). Regulation and Expression of Plant Genes in Microorgani는, pp. 93-112, Plant Biotechnology, S. Kung 및 C.J. Arntzen, 편저, Butterworth Publishers, Boston, Mass. 참조. 이것은 뿌리 세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우에 특히 바람직하다.

(ii) 직접적 DNA 흡수. 예를 들면: Paszkowski, J. 등 (1989). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, pp. 52-68, J. Schell 및 L.K. Vasil 편저, Academic Publishers, San Diego, Cal.; 및 Toriyama, K. 등 (1988). Bio/Technol 6, 1072-1074 (원형질체 내로의 DNA의 직접적 흡수 방법) 참조. 또한: Zhang 등 (1988). Plant Cell Rep 7, 379-384; 및 Fromm, M.E. 등 (1986). Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nature 319, 791-793 (식물 세포의 순간적 전기 충격에 의해 유도되는 DNA 흡수) 참조. 또한: Klein 등 (1988). Bio/Technology 6, 559-563; McCabe, D.E. 등 (1988). Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Bio/Technology 6, 923-926; 및 Sanford, J.C. (1990). Biolistic plant transformation. Physiol Plant 79, 206-209 （입자 충돌에 의한 식물 세포 또는 조직 내로의 DNA 주입) 참조. 또한: Neuhaus, J.M. 등 (1987). Theor Appl Genet 75, 30-36; 및 Neuhaus, J.M. 및 Spangenberg, G.C. (1990). Physiol Plant 79, 213-217 (마이크로피펫 시스템의 사용) 참조. 미국특허 제 5,464,765 호 (세포 배양물, 배아 또는 유합조직의 유리 섬유 또는 탄화규소 위스커 형질전환) 참조. 또한: DeWet, J.M.J. 등 (1985). "Exogenous gene transfer in maize (Zea mays) using DNA-treated pollen," Experimental Manipulation of Ovule Tissue, G.P. Cahpman 등 편저, Longman, New York-London, pp. 197-209; 및 Ohta, Y. (1986). High Efficiency Genetic Transformation of Maize by a Mixture of Pollen and Exogenous DNA. Proc Natl Acad Sci USA 83, 715-719 (발아 꽃가루를 이용한 DNA의 직접적 인큐베이션) 참조.

상기 아그로박테리움-매개 시스템에는 식물 게놈 DNA 내로 통합되는 정의된 DNA 절편을 함유하는 플라스미드 벡터의 사용을 포함한다. 식물 조직의 접종 방법은 식물종 및 아그로박테리움 전달 시스템에 따라 달라진다. 폭넓게 사용되는 접근법은 리프 디스크(leaf disc) 절차로서, 전-식물 분화 개시의 좋은 공급원을 제공하는 임의의 조직 외식편(explant)을 가지고 수행될 수 있다 (Horsch, R.B. 등 (1988). "Leaf disc transformation." Plant Molecular Biology Manual A5, 1-9, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht). 보충적 접근법은 상기 아그로박테리움 전달 시스템을 진공침투와 조합하여 채용한다. 상기 아그로박테리움 시스템은 특히 유전자도입 쌍떡잎식물의 생성에 특히 유용하다.

식물 세포 내로의 직접적인 DNA 도입 방법은 다양하다. 전기천공에서는, 원형질체가 강한 전기장에 잠시 노출되어 DNA가 들어갈 수 있는 소기공(mini-pore)을 연다. 미세주입에서는, DNA가 마이크로피펫을 이용하여 세포 내로 직접 기계적으로 주입된다. 미세입자 충돌에서는, DNA가 황산마그네슘 결정 또는 텅스텐 입자와 같은 미세투사물(microprojectile) 상에 흡착되고, 상기 미세투사물은 세포 또는 식물 조직 내로 물리적으로 가속된다.

현재는 안정한 형질전환이 바람직하지만, 예를 들면 잎 세포, 분열조직 세포 또는 식물 전체의 일시적 형질전환도 본 발명에 의해 예상된다. 그러나 이 경우, 조절 목적을 위해 바이러스성 서열 또는 선택 유전자 (예를 들면, 항생제 내성)는 제외하는 조치를 취한다.

일시적 형질전환은 상술한 직접적 DNA 도입 방법 중 어느 것에 의해, 또는 수식된 식물 바이러스를 이용한 바이러스 감염에 의해 실시될 수 있다.

식물 숙주의 형질전환에 유용한 것으로 나타난 바이러스에는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV), 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 및 배큘로바이러스 (BV)가 포함된다. 식물 바이러스를 이용한 식물의 형질전환은, 예를 들면: 미국특허 제 4,855,237 호 (콩 금색 모자이크 바이러스, BGMV); EPA 67,553 호 (TMV); 일본 공개출원 제 63-14693 호 (TMV); EPA 194,809 호 (BV); EPA 278,667 호 (BV); 및 Gluzman, Y. 등 (1988). Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 에 기술되어 있다. 식물을 포함한 다양한 숙주 내에서 외래 DNA를 발현함에 있어 슈도바이러스 입자의 사용이 WO 87/06261 호에 기술되어 있다.

식물 내 비-바이러스성 외인성 핵산 서열의 도입 및 발현을 위한 식물 RNA 바이러스의 구축은 상기 참고문헌을 비롯하여, Dawson, W.O. 등 (1989). A tobacco mosaic virus-hybrid expresses and loses an added gene. Virology 172, 285-292; French, R. 등 (1986) Science 231, 1294-1297; 및 Takamatsu, N. 등 (1990). Production of enkephalin in tobacco protoplasts using tobacco mosaic virus RNA vector. FEBS Lett 269, 73-76에 의해 입증된다.

만일 형질전환하는 바이러스가 DNA 바이러스인 경우에는, 당업자는 상기 바이러스 자체에 적당한 수식을 할 수 있다. 대안적으로는, 상기 바이러스는 먼저 외래 DNA를 이용하여 목적하는 바이러스 벡터를 쉽게 구축하기 위해 박테리아성 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 상기 바이러스는 그 후 상기 플라스미드로부터 절제될 수 있다. 만일 상기 바이러스가 DNA 바이러스라면, 박테리아성 복제원점이 바이러스 DNA에 부착될 수 있고, 이는 그후 상기 박테리아에 의해 복제된다. DNA의 전사 및 번역은 외피 단백질을 생산할 것이며, 이는 바이러스성 DNA를 단백질 막으로 쌀 것이다. 상기 바이러스가 RNA 바이러스라면, 상기 바이러스는 일반적으로 cDNA로서 클로닝되고 플라스미드 내로 삽입된다. 상기 플라스미드는 그 후 모든 식물 유전자 구조체를 만드는 데 사용된다. 상기 RNA 바이러스는 이어서 플라스미드의 바이러스성 서열로부터 전사된 후, 바이러스성 유전자로 번역되어, 상기 바이러스성 RNA를 단백질 막으로 싸는 외피 단백질을 생산한다.

비-바이러스성 외인성 핵산 서열, 예컨대 본 발명의 구조체 내에 포함되는 것들의 식물 내 도입 및 발현을 위한 식물 RNA 바이러스의 구축은 상기 참고문헌을 비롯하여 미국특허 제 5,316,931 호에 의해 입증된다.

한 실시양태에서는, 식물 바이러스성 핵산으로서, 상기 바이러스성 핵산으로부터 천연 외피 단백질 코딩 서열, 비-천연 (외래) 식물 바이러스성 외피 단백질 코딩 서열 및 비-천연 프로모터, 바람직하게는 비-천연 외피 단백질 코딩 서열의 서브게놈(subgenomic) 프로모터를 포함하고, 식물 숙주 내에서 발현이 가능하고, 재조합 식물 바이러스 핵산의 포장이 가능하며, 재조합 식물 바이러스성 핵산에 의한 숙주의 전신 감염을 보장할 수 있는 핵산의 삽입이 제공된다. 대안적으로는, 상기 천연 외피 단백질 코딩 서열은, 비-천연 단백질이 생산되게끔 그 안에 비-천연 핵산 서열을 삽입함으로써 전사 불가능하게 만들 수 있다. 상기 재조합 식물 바이러스성 핵산 구조체는 하나 이상의 부가적 비-천연 서브게놈 프로모터를 함유할 수 있다. 각각의 비-천연 서브게놈 프로모터는 식물 숙주 내에서 인접한 유전자 또는 핵산 서열을 전사하거나 발현할 수 있고, 서로와의, 그리고 천연 서브게놈 프로모터와의 재조합은 불가능하다. 또한, 상기 재조합 식물 바이러스성 핵산 구조체는 하나 이상의, 교차 작용하는 조절제와 결합하고 그의 하류에 위치한 코딩 서열의 전사를 조절하는 시스-작용 조절 요소, 예컨대 인핸서를 함유할 수 있다. 비-천연 핵산 서열은, 천연 식물 바이러스성 서브게놈 프로모터에, 또는 하나가 넘는 핵산 서열이 포함되는 경우에는 천연 및 비-천연 식물 바이러스성 서브게놈 프로모터에 인접하게 삽입될 수 있다. 상기 비-천연 핵산 서열은 목적하는 생성물을 생산하도록 서브게놈 프로모터(들)의 제어 하에 숙주 식물 내에서 전사되거나 발현된다.

두 번째 실시양태에서는, 재조합 식물 바이러스성 핵산 구조체가, 천연 외피 단백질 코딩 서열이 비-천연 외피 단백질 코딩 서열에 인접한 대신에 비-천연 외피 단백질 서브게놈 프로모터 중 하나에 인접하게 위치된다는 점을 제외하고는 첫 번째 실시양태에서와 같이 제공된다.

세 번째 실시양태에서는, 재조합 식물 바이러스성 핵산 구조체가, 그의 서브게놈 프로모터, 및 바이러스성 핵산 구조체 내로 삽입된 하나 이상의 비-천연 서브게놈 프로모터에 인접하게 위치한 천연 외피 단백질 유전자를 포함하게 제공된다. 삽입된 비-천연 서브게놈 프로모터는 식물 숙주 내에서 인접한 유전자를 전사하거나 발현할 수 있으며, 서로와의 재조합 및 천연 서브게놈 프로모터와의 재조합은 할 수 없다. 비-천연 핵산 서열은 상기 서열이 목적하는 생성물을 생산하도록 서브게놈 프로모터의 제어 하에 숙주 식물 내에서 전사되거나 발현되도록, 비-천연 서브게놈 식물 바이러스성 프로모터에 인접하게 삽입될 수 있다.

네 번째 실시양태에서는, 재조합 식물 바이러스성 핵산 구조체가, 상기 천연 외피 단백질 코딩 서열이 비-천연 외피 단백질 코딩 서열에 의해 대체된다는 점을 제외하고는 세 번째 실시양태에서와 같이 제공된다.

바이러스성 벡터는 상기 기술한 바와 같이 재조합 식물 바이러스성 핵산 구조체에 의해 코딩된 발현되는 외피 단백질에 의해 캡시드에 싸여서, 재조합 식물 바이러스를 생성한다. 상기 재조합 식물 바이러스성 핵산 구조체 또는 재조합 식물 바이러스는 적절한 숙주 식물을 감염시키는 데 사용된다. 상기 재조합 식물 바이러스성 핵산 구조체는 숙주 내 복제, 숙주 내에서의 전신적 분포, 및 목적하는 단백질을 생성하기 위해 숙주 내에서의 하나 이상의 외래 유전자 (단리된 핵산)의 전사 또는 발현이 가능하다.

또다른 실시양태에서는, 형질전환 운반체가 RNA 의존성 RNA 중합효소 (RdRp), 서브게놈 프로모터, 및/또는 부분적 또는 온전한 이동 단백질 서열을 포함하는 바이러스 유래 서열을 포함하는데, 이때 모든 상기 핵산 단편들은 이원 벡터 내로 클로닝된다 (Gleba 등, Current Opinion in Plant Biology 2004, 7:182-188). 상기에 더하여, 본 발명의 핵산 분자는 또한 엽록체 게놈 내로 도입되어 엽록체 발현을 가능하게 할 수도 있다.

외인성 핵산 서열을 엽록체의 게놈 내로 도입하는 기법은 공지되어 있다. 이 기법은 하기의 절차를 포함한다. 먼저, 식물 세포를 화학적으로 처리하여 세포 당 엽록체의 개수를 약 하나로 감소시킨다. 이어서, 하나 이상의 외인성 핵산 분자를 엽록체 내로 도입하려는 목표 하에, 상기 외인성 핵산을, 바람직하게는 입자 충돌을 통해 세포 내로 도입한다. 상기 외인성 핵산은 동종 재조합을 통해 엽록체의 게놈 내로 통합될 수 있도록 당업자에 의해 선택되는데, 여기서 동종 재조합은 엽록체에 고유한 효소에 의해 용이하게 수행된다. 이를 위해, 상기 외인성 핵산은 관심대상인 유전자 외에도, 엽록체 게놈 유래의 핵산 서열을 하나 이상 포함한다. 또한 상기 외인성 핵산은 선택가능한 마커를 포함하는데, 이는 서열 선택 절차에 의해, 그러한 선택 후에 엽록체 게놈의 모든 또는 실질적으로 모든 카피가 상기 외인성 핵산을 포함하는 것을 당업자가 확신할 수 있게 하는 것이다. 이 기법에 관련한 추가적 세부사항은, 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제 4,945,050 호 및 제 5,693,507 호에서 찾을 수 있다. 따라서 폴리펩티드는 엽록체의 단백질 발현 시스템에 의해 생산될 수 있으며, 엽록체의 내부막 내로 통합된다.

채용된 방법과는 상관없이, 형질전환 후에는, 식물 증식이 일어난다. 이 경우, 미세증식이 초기 조직 배양; 및 추가적 용도를 위해 충분한 세포를 얻도록 조직 배양물 증가를 포함하도록 수행된다.

식물 세포 배양 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 배양 조건 (예를 들면, 배양 배지, 온도, 기체 환경, 바이오반응기)은, 최적의 발현을 달성하기 위해, 사용되는 식물 세포 및 발현되는 단백질에 따라 조정될 수 있다. 전형적으로, 배양은 임의의 통상적 식물 배양 배지를 사용하여 표준 식물 세포 배양 조건 하에 수행된다. 식물 배양 배지는 수성 배지, 및 물을 첨가하여 식물 세포 배양용 수성 배지를 제조할 수 있는 건조 및 농축 배지 모두를 포함한다는 점을 유념해야 한다 (예를 들면, 미국특허 제 6,020,169 호 및 6,589,765 호 참조).

본 발명에 따라 사용될 수 있는 식물 배양 배지의 예로는 하기의 잘 알려진 배지가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다: Anderson (Anderson, In Vitro 14:334, 1978; Anderson, Act. Hort., 112:13, 1980), Chee 및 Pool (Sci. Hort. 32:85, 1987), LCL/Ipomoea (CP) (Chee 등, J. Am. Soc. Hort. Sci. 117:663, 1992), Chu (N.sub.6) (Chu 등, Scientia Sinic. 18:659, 1975; Chu, Proc. Symp. Plant Tiss. Cult. Peking 43, 1978), DCR (Gupta 및 Durzan, Plant Cell Rep. 4:177, 1985), DKW/Juglans (Driver 및 Kuniyuki, HortScience 19:507, 1984; mcGranahan 등, Bonga 및 Durzan 편저, Cell and Tissue Culture in Forestry, Martinus Nijhoff, Dordrecht, 1987), De Greef and Jacobs (De Greef 및 Jacobs, Plant Sci. Lett. 17:55, 1979), Eriksson (ER) (Eriksson, Physiol. Plant. 18:976, 1965), Gamborg's B-5 (Gamborg 등, Exp. Cell Res. 50:151, 1968), Gresshoff and Doy (DBM2) (Gresshoff 및 Doy, Z Pflanzenphysiol. 73:132, 1974), Heller's (Heller, Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. 연재 11회, 14:1, 1953), Hoagland's (Hoagland 및 Arnon, Circular 347, Calif. Agr. Exp. Stat., Berkeley, 1950), kao and Michayluk (Kao 및 Michayluk, Planta 126:105, 1975), Linsmaier and Skoog (Linsmaier 및 Skoog, Physiol. Plant. 18:100, 1965), Litvay's (LM) (Litvay 등, Plant Cell Rep. 4:325, 1985), McCown's Woody 식물 배지 (Lloyd 및 McCown, Proc. int. Plant Prop. Soc. 30:421, 1981), Murashige and Skoog 및 이의 다양한 공지된 변형예 (Murashige 및 Skoog, Physiol. Plant. 15:473, 1962), Nitsch and Nitsch (Nitsch 및 Nitsch, Science 163:85, 1969), Quoirin and Lepoivre (Quoirin 등, C.R. Res. Sta. Cult. fruit mar., Gembloux 93, 1977), Schenk and Hildebrandt (Schenk 및 Hildebrandt, Can. J. Bot. 50:199, 1972), White's (White, The Cultivation of Animal and Plant Cells, Ronlabd Press, NY, 1963), 등. 몇몇 상기와 같은 식물 배양 배지는 Sigma 사 (St. Louis, 미주리주) 및 기타 공급자로부터, 예를 들면 건조 (분말) 배지 및 건조 기초 염 혼합물로서 시판되고 있다.

바람직하게는, 배양은 고수율 일회용 식물 배양 장치를 사용하여 수행되는데, 이 장치는 배양물 중 생물학적으로 활성인 펩티드 및 폴리펩티드의 생산에 효과적인 것으로 나타났다 (본원에 참조로서 인용된 PCT IL/2005/000228 참조).

이 장치는 본질적으로는 일회용이지만, 세포를 함유하는 배지의 적어도 일부를 수확할 수 있게 하는 재사용가능한 수확용 유출구를 가져서, 상기 장치가 하나 이상의 뒤따르는 연속적 배양/수확 사이클에 지속적으로 사용될 수 있게 하는 특징이 있다. 공업적 환경 하에서는, 예를 들어 상기 장치에 제공되고 그로부터 제공되는 모든 필요한 연결 및 단절이 수행될 수 있는 멸균 후드를 제공함으로써, 수확 도중 및 이후에 수확용 유출구의 멸균성이 비교적 낮은 비용으로 현저히 고도로 보장될 수 있다. 상기 장치가 마침내 오염되는 경우에는, 비교적 적은 경제적 손실 하에 폐기될 수 있다. 그러한 장치는 저렴하게 제작될 수 있으며, 생산 용적이 배양물 50 또는 100 리터 이상에 대해서도 그러하다. 또한, 몇 회의 배양/수확 사이클을 수행할 수 있는 능력은 경제적으로 유리하며, 장치 당 유효 비용을 더욱 더 낮춘다.

일련의 상기와 같은 장치는 경제적으로 배치될 수 있으며, 상기 일련 내 장치의 개수는 요구사항에 생산을 근접하게 맞추도록 조절될 수 있다. 따라서 파일럿 플랜트 바이오반응기로부터 대규모 생산으로의 전환 또한, 상기 일련에 더 많은 장치를 부가함으로써 비교적 간단하고 경제적인 방식으로 이루어질 수 있다. 또한, 고체 혼합기가 결핍됨과 함께, 각 장치의 비교적 낮은 생산용적은 전형적인 스테인리스 스틸 바이오반응기와 비교하여 비교적 더 높은 수율을 초래한다.

따라서 본 발명에 따른 식물 세포의 배양은, 하나 이상의 사이클 (본원에 참고문헌으로서 인용된 PCT IL/2005/000228 호에 길이에 대해 기술됨) 중 세포를 무균적으로 배양 및 수확하기 위한 일회용 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 상기와 같은 장치는 상부 말단 및 하부 말단을 갖는 살균가능한 일회용 용기를 포함하는데, 이 용기는 적어도 부분적으로, 적당한 살균 생물학적 세포 배양 배지 및/또는 무균 접종물 및/또는 살균 공기 및/또는 필요한 기타 살균 첨가제로써 채워질 수 있고, 상기 장치는 (i) 용기로부터 과량의 공기 및/또는 폐가스를 제거하기 위한 기체 유출구; (ii) 용기 내로 접종물 및/또는 배양 배지 및/또는 첨가제를 도입하기 위한 첨가제 유입구를 포함하며; 추가로 (iii) 원하는 경우에 세포를 함유하는 배지의 적어도 원하는 일부의 수확을 가능하게 함으로써, 상기 장치가 일회 이상의 추가적 연속적 배양/수확 사이클에 지속적으로 사용될 수 있게 하는 흐름 제어기를 포함하는 재사용가능한 수확기를 포함하며, 여기서 이전의 수확된 사이클에서 남겨진, 상기 세포를 함유하는 배지의 나머지는 다음 회의 배양 및 수확 사이클을 위한 접종물로서의 역할을 할 수 있고, 상기 배양 배지 및/또는 필요한 첨가제가 제공되는 것을 특징으로 한다.

경우에 따라, 상기 일회용 용기는 투명하고/하거나 반투명하다. 또한, 경우에 따라 상기 장치는 제 1 유입구 개구를 통해 상기 배양 배지 중으로 멸균 기체를 기포 형태로 도입하기 위한 공기 유입구를 추가로 포함하는데, 여기서 상기 공기 유입구는 적당한 기체 공급원에 연결 가능하다. 바람직하게는, 상기 공기 유입구는 배양 중에 일회가 넘게 멸균 기체를 도입하기 위한 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 공기 유입구는 멸균 기체를 연속적으로 도입하기 위한 것이다. 경우에 따라, 복수의 상이한 기체가 상기 공기 유입구를 통해 상이한 시간대 및/또는 농도로 도입된다.

바람직하게는, 상기 수확기는 수확기를 통해 상기 용기 내로 오염물이 도입되는 것을 실질적으로 방지하기 위한 오염 방지기를 포함한다.

경우에 따라, 상기 용기는 비-경직성이다. 바람직하게는, 상기 용기는 비-경직성 플라스틱 물질로 만들어진다. 더욱 바람직하게는, 상기 물질은 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌과 나일론의 공중합체, PVC 및 EVA를 포함하는 군에서 선택된다.

경우에 따라, 상기 용기는 상기 물질의 하나가 넘는 층으로 이루어진 적층물로 만들어진다.

또한 경우에 따라, 상기 용기는 적당한 두 장의 상기 물질을, 소정의 이음매를 따라 접합시켜서 형성된다.

바람직하게는, 상기 공기 유입구는, 상기 유입구 개구부로부터 상기 용기의 기저부에 있는 또는 그 근처에 있는 용기 내 일정 위치로 뻗어있는 공기 유입구 파이프를 포함한다.

또한 바람직하게는, 상기 하나 이상의 공기 유입구는 적당한 공기 공급원에 연결가능하고, 복수의 이차 유입구 파이프와 통해 있는 하나 이상의 공기 유입구 파이프를 포함하는데, 상기 이차 유입구 파이프는 각각 적당한 유입구 개구부를 통해 상기 용기 내 일정 위치로 뻗어 있어서, 멸균 공기를 배양 배지 중으로 기포 형태로 도입시키기 위한 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 장치는 전체적 길이, 높이 및 폭을 갖는, 실질적으로 상자 형태의 기하학적 구성을 갖는다. 가장 바람직하게는, 높이-대-길이의 비가 약 1 내지 약 3, 바람직하게는 약 1.85이다. 경우에 따라, 높이-대-폭의 비는 약 5 내지 약 30, 바람직하게는 약 13이다.

바람직하게는, 상기 장치는 실질적으로 상기 장치의 깊이에 걸쳐 형성된 지지체 입구를 포함하는데, 상기 입구는 상기 장치가 적당한 막대 지지체 상에 지지될 수 있도록 맞추어져 있다.

경우에 따라, 상기 장치는 상기 징치 지지용 지지체 구조물을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 지지체 구조물은 한 쌍의 마주보는 프레임을 포함하며, 이 프레임의 각각은 상구 및 하부 지지체 부재를 포함하며, 이 지지체 부재들은 상부 및 하부 지지체 부재들에 적당히 접합된 복수의 실질적으로 평행한 수직 지지체 부재들에 의해 격리되어 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 복수의 수직 지지체 부재들이 상기 상부 및 하부 지지체 부재의 각각의 종방향 극단에 있는 하나 이상의 수직 지지체 부재로 이루어진다.

또한 더욱 바람직하게는, 상기 프레임들은, 상기 프레임들에 탈부착 가능하게 또는 일체화되어 접합된 복수의 격리 막대에 의해 서로로부터 격리되어 있다.

또한 더욱 바람직하게는, 상기 격리 막대는, 상기 장치가 지지체 구조물로부터 비교적 쉽게 삽입되고 제거될 수 있도록 전략적으로 위치된다.

경우에 따라, 상기 각 프레임의 하부 지지체 부재는, 상기 장치의 기저부의 상응하는 부분을 수용하고 지지하도록 맞추어진 하나 이상의 하부 지지체를 포함한다.

바람직하게는, 상기 하부 지지체는 각각, 상기 하부 지지체 부재 각각으로부터 마주보는 프레임의 방향으로 돌출된 적당한 모양의 탭(tab)의 형태이다.

경우에 따라, 상기 프레임은 각각, 각각의 프레임으로부터 마주보는 프레임의 방향으로 돌출된 하나 이상의 상호분할막을 포함하는데, 이 상호분할막은 소정의 위치에서 상기 장치의 측벽에 대하여 밀도록 되어 있어서, 마주보는 상호분할막 쌍들이 상기 소정의 위치에서 장치의 폭을 효과적으로 감소시키게 한다.

바람직하게는, 상기 상호분할막은, 상기 상부 및 하부 지지체 부재로부터 마주보는 프레임을 향하는 방향으로, 적당한 상부 및 하부 스트럿에 의해 격리된 적당한 실질적으로 수직인 부재들을 포함한다.

경우에 따라, 상기 지지체 구조물은 상기 장치의 이송을 위한 복수의 다리바퀴를 포함할 수 있다.

경우에 따라, 상기 공기 기포 중 적어도 일부는 평균 직경이 약 1 mm 내지 약 10 mm이다.

또한 경우에 따라, 상기 공기 기포 중 적어도 일부는 평균 직경이 약 4 mm이다.

경우에 따라, 상기 용기는, 기체 유출구를 통한 상기 용기 내로의 오염물의 도입을 실질적으로 방지하기 위한, 상기 기체 유출구 상에 장착된 적당한 필터를 포함한다.

바람직하게는, 상기 용기는, 상기 첨가제 유입구를 통한 상기 용기 내로의 오염물의 도입을 실질적으로 방지하기 위한, 상기 첨가제 유입구 상에 장착된 적당한 필터를 추가로 포함한다.

또한 바람직하게는, U-모양의 유체 트랩을 포함하는 오염 방지기가 있는데, 상기 트랩의 한쪽 가지는 적당한 무균 연결기에 의해 수확기의 외부 유출구에 무균적으로 장착된다.

바람직하게는, 상기 수확기는 상기 용기의 기저부의 바닥에 위치한다.

또한 바람직하게는, 상기 수확기는 상기 용기의 기저부의 바닥 근처에 위치하여, 각 수확 사이클의 종료 시에 상기 세포를 함유하는 배지의 나머지가 자동적으로 용기의 기저부에, 상기 수확기의 고도 아래의 고도까지 남도록 한다.

경우에 따라 그리고 바람직하게는, 상기 세포를 함유하는 배지의 나머지가, 적어도 부분적으로 용기의 바닥으로부터 수확기까지의 거리 d2에 따라 결정된다.

바람직하게는, 상기 세포를 함유하는 배지의 나머지가 배양 배지 및 접종물의 원래 용적의 약 0.5% 내지 약 45%를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포를 함유하는 배지의 나머지가 배양 배지 및 접종물의 원래 용적의 약 10% 내지 약 20%를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포를 함유하는 배지의 나머지가 배양 배지 및 접종물의 원래 용적의 약 0.5% 내지 2%를 포함한다.

경우에 따라, 상기 기저부는 실질적으로 볼록 형태이다.

또한 경우에 따라, 상기 기저부는 실질적으로 원추대(frusta-conical)형이다.

바람직하게는, 상기 용기는 내부 충진가능한 용적이 약 5 리터 내지 약 200 리터, 바람직하게는 약 50 리터 내지 150 리터, 또한 바람직하게는 약 100리터이다.

경우에 따라, 상기 장치는, 상기 장치를 적당한 지지체 구조물에 부착하기 위한 적당한 부착기를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 부착기는 바람직하게는 상기 용기의 최상부에 일체화되게 부착된 적당한 물질의 루프를 포함한다.

일단 상술한 재조합 단백질을 발현하는 식물 세포가 수득되면, 이들은 대상에게 투여된다.

본 발명의 세포는 그 자체로 (예를 들면, 현탁액 또는 탈수상태), 또는 적당한 담체 또는 부형제와 혼합되어 약학적 조성물로서 대상에게 투여될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 "약학적 조성물"은 본원에 기술된 하나 이상의 활성 성분과 함께, 생리학적으로 적당한 담체 및 부형제와 같은 기타 화학적 성분이 함유된 제제를 말한다. 약학적 조성물의 목적은 화합물의 생물체로의 투여를 용이하게 하는 것이다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "활성 성분"은 의도된 생물학적 효과를 낼 수 있는, 재조합 단백질 발현 세포를 말한다. 하기의 실시예 부분의 실시예 5에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 세포는, 탈수시에도 생물학적 활성을 여전히 유지하므로, 탈수될 수 있다 (예를 들면, 10% 미만의 물을 함유). 바람직하게는, 상기 재조합 생체분자는 탈수된 세포 제제 중의 투명대 당단백질, GnRH, LHRH, LH 및 LDH가 아니다.

이하, 상호교환적으로 사용될 수 있는 "생리학적으로 허용가능한 담체" 및 "약학적으로 허용가능한 담체"란 구절은 생물체에 상당한 자극을 유발하지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐기하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 보조제가 이들 구절에 포함된다. 바람직하게는 사용되는 담체는 비-면역원성 담체이며, 또한 바람직하게는 장 관련 림프조직을 자극하지 않는다.

본원에서 용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다. 부형제의 예에는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당 및 각종 유형의 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물유 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

약물의 제제화 및 투여 기법은 본원에 참조로서 전체가 인용된 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA의 최신판에서 찾을 수 있다.

적당한 투여 경로는, 예를 들면 점막 및 장관을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같은 구절 "장관 투여"는 위장관의 임의 부분을 통한 투여, 예컨대 직장 투여, 대장 투여, 소장 투여 (중앙부 또는 말초부) 및 위장 투여를 말한다. 바람직하게는, 장관 투여는 경구 투여를 말한다.

본 발명에 따라 사용되는 약학적 조성물은 따라서 활성 성분의 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한, 부형제 및 보조제를 포함하는 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 적절한 제제화는 선택된 투여경로에 의존한다.

경구 투여를 위해서는, 활성 화합물을 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 조합함으로써, 약학적 조성물을 용이하게 제제화할 수 있다. 그러한 담체는 약학적 조성물이 환자에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 물약, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제제화될 수 있게 한다. 경구 사용을 위한 약리학적 제제는 고체 부형제를 이용하여, 경우에 따라 원하는 대로 적당한 보조제를 첨가한 후 얻어진 혼합물을 분쇄하고, 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 핵을 수득함으로써 제조할 수 있다. 적당한 부형제는 특히, 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함한 당류; 예를 들면 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸스 검, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 및 소듐 카보메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 생리학적으로 허용가능한 고분자와 같은 충진제이다. 원하는 경우, 붕괴제, 예컨대 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 알긴산소듐이 첨가될 수도 있다.

당의정 핵은 적당한 코팅이 마련된다. 이를 위해, 아라비아검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 젤, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티탄, 라커 용액, 및 적당한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 선택적으로 함유할 수 있는 농축 당 용액이 사용될 수 있다. 염료 또는 안료가, 활성 화합물 투여량의 상이한 조합의 확인을 위해 또는 특징짓기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 약학적 조성물에는 젤라틴으로 만든 푸쉬-핏(push-fit) 캡슐을 비롯하여 젤라틴 및 가소화제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 만들어진 연질의 밀봉 캡슐이 포함된다. 상기 푸쉬-핏 캡슐은 상기 활성 성분을, 락토스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 경우에 따라 안정화제와 혼합하여 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서는, 활성 성분이 적당한 액체, 예컨대 지방산 오일, 유동 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형물은 선택된 투여 경로에 적당한 투여형태로 되어야 한다.

점막 전달의 예에는 구강 전달, 인두(pharynx) 전달, 식도 전달, 직장 전달 및 질 전달이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

바람직하게는, 점막 전달 부위는 구강을 통해서이다. 구강을 통한 점막 전달은, 구강의 바닥 부분을 덮고 있는 점막을 통한 활성제의 전신 전달인 설하(sublingual) 전달, 또는 볼을 덮고 있는 점막 (볼점막)을 통한 활성제 투여인 협측 전달에 의해 영향을 받을 수 있다. 구강 점막 전달에 특히 유용한 제형물에는 스트립, 거품제, 츄잉검, 구강용 스프레이, 드롭프스, 식품, 치약 및 캡슐이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 특히 바람직한 제형물은 츄잉검이다.

상기 제형물, 예를 들면 츄잉검은 저수분 또는 고수분, 가당 또는 무가당, 왁스 함유 또는 무왁스, 저칼로리 (베이스 다량 함유 또는 저칼로리 증량제를 통해) 제형물일 수 있고/있거나, 치과용 약제를 함유할 수도 있다. 이 경우, 투여된 세포의 막 및/또는 벽의 기계적 파괴로 인해, 본 발명의 활성 성분이 구강으로 방출되어 국소적으로 작용 (예컨대 충치 치료 또는 진단용)할 수 있게 된다.

본 발명의 활성제 (즉, 식물 세포)는 또한 캡슐화 또는 봉입되어 점막 제형물로부터 방출이 지연될 수도 있다. 활성제를 부분적 또는 완전히 캡슐화시키는 임의의 표준 기법이 사용될 수 있다. 이러한 기법에는 분무 건조, 분무 냉각, 유동층 코팅 및 코아세르베이션이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 캡슐화 기법은 단일 단계 공정에서 개별적으로, 또는 다단계 공정에서 임의 조합되어 사용될 수 있다.

방출 지연 제형물을 제공하는 다른 방법에는 부분적으로 캡슐화시키는 응결, 또는 역시 부분적으로 캡슐화시키는 고정화 또는 흡수, 압출된 화합물 내로의 봉입이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

활성제상의 코팅 또는 캡슐화 물질의 양 또한 츄잉검으로부터 방출되는 시간의 길이를 제어할 수 있다.

일반적으로, 코팅의 정도가 높아지고 활성제의 양이 낮아질수록, 방출이 늦어진다. 방출 지연 제형물을 제형화하는 방법 및 물질은 당업계에 공지되어 있다. PCT 특허출원공개 제 WO 00/35298 호의 실시예가 방출 지연 제형물을 츄잉검으로 제제화하는 방법 및 물질을 교시한다.

본 발명의 활성제 (즉, 특정 과실 세포 배양물에서 유래되는 활성제)는 상이한 방식으로 제제화되고 동일한 운반체를 통해 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 활성제는 동일한 운반체 중에 빠른 방출, 중간 방출 및 느린 방출을 위해 캡슐화될 수도 있다. 또한, 본 발명의 활성제는 빠른 방출을 위한 검 코팅에 첨가될 수 있고, 또한 느린 방출을 위해 캡슐화되거나 되지 않고, 검 중앙에 첨가될 수도 있다.

더 빠른 흡수는 풍미제 수준을 증가시키는 것을 비롯하여, 다른 풍미제 성분, 예컨대 멘톨 및 멘톨 유도체, 리모넨, 카르본, 이소멘톨, 유칼립톨, 멘톤, 파이넨, 캠퍼 및 캠퍼 유도체를 비롯하여, 모노테르펜 천연 생성물, 모노테르펜 유도체 및 캐리오필렌 및 코파엔을 포함하는 세스퀴테르펜을 첨가함으로써 영향을 받을 수 있다.

상기 제형물들은 상기 활성제의 점막을 통한 혈중 침투를 증대시키는 다른 약제를 포함할 수 있다. 상기와 같은 약제의 예에는 23-라우릴 에테르, 아프로티닌, 아존, 염화벤잘코늄, 염화세틸피리디늄, 브롬화세틸트리메틸암모늄, 사이클로덱스트린, 덱스트란 설페이트, 라우르산, 라우르산/프로필렌 글리콜, 라이소포스파티딜콜린, 멘톨, 메톡시살리실레이트, 메틸올리에이트, 올레산, 포스파티딜콜린, 폴리옥시에틸렌, 폴리소르베이트 80, 소듐 EDTA, 소듐 글리코콜레이트, 소듐 글리코데옥시콜레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 살리실레이트, 소듐 타우로콜레이트, 소듐 타우로데옥시콜레이트, 설폭사이드 및 각종 알킬 글리코사이드가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

기타 수식 또한 활성제의 점막으로의 방출 속도에 영향을 줄 수 있다. 베이스를 연질화하는 질감 변형제는 더 빠른 방출을 초래할 것이고, 경질 베이스는 더 느린 방출을 초래할 수 있다. 중탄산소듐 또는 수산화소듐과 같은 알칼리성 물질의 첨가는 타액을 약간 알칼리성으로 만들어서, 혈류 내로의 의약의 협측(buccal)/설측(lingual) 흡수를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 활성제의 방출은 또한 제형물의 모양 및 크기에 의해 영향을 받을 수도 있다. 예를 들면, 검의 표면적이 큰 납작한 스틱 조각은, 씹었을 때 검으로부터 타액으로의 활성제의 방출을 더 빠르게 할 수 있는 반면, 둥글거나 정방형 조각은 의약 및 활성제를 더 느리게 방출시킬 수 있다.

츄잉검의 정제화는 영국특허공개 제 1,489,832 호; 미국특허 제 4,753,805 호; 유럽특허공개 제 0 221 850 호; 및 이태리 특허공개 제 1,273,487 호에 개시되어 있다. 이들 특허는 츄잉검에 첨가된 후 타정된 활성제에 대해 개시한다.

착색제 또한 상기 제형물에 첨가될 수 있다. 본 발명에서 고려되는 착색제에는 식품 등급의 염료가 포함된다. 시럽에 바람직하게 첨가되는 필름 형성제에는 메틸 셀룰로스, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스 등 및 이들의 조합이 포함된다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 과실 세포 배양물은 비-착색 농축물로 제공된다.

본 발명의 재조합 생체분자를 발현하는 식물 세포는 단위 투여형태 (예컨대 경구 단위 투여형태)로 제제화될 수 있음에 주목해야 한다.

치료적 유효량의 결정은, 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어, 당업자의 능력범위 내에 속한다.

본 발명의 방법에서 사용되는 임의 제제에 대하여, 투여량 또는 치료적 유효량은 우선 시험관내에서, 그리고 세포 배양물 분석에서 추정할 수 있다. 예를 들면, 투여량은 동물 모델에서 목적하는 농도 또는 적정을 달성하도록 제제화될 수 있다. 상기와 같은 정보는 인간에서 유용한 투여량을 더 정확히 결정하는 데 사용될 수 있다.

본원에 기술된 활성 성분의 독성 및 치료 효능은 시험관내, 세포 배양물 중 또는 실험동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 이러한 시험관내 및 세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서의 사용을 위한 투여량의 범위를 제제화하는 데 사용될 수 있다. 상기 투여량은 채용된 투여형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형물, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태의 관점에서 개별 의료진에 의해 선택될 수 있다 (예를 들면, Fingl, E. 등 (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics," 제 1 장, p. 1 참조).

투여량 및 투여 간격은, 생물학적 효과를 유도하거나 억제하기에 충분한 활성 성분의 혈장 또는 뇌 수준 (즉, 최소한으로 효과적인 농도, MEC)을 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다. 상기 MEC는 각각의 제제에 따라 달라질 것이지만, 시험관내 데이터를 통해 추정될 수 있다. MEC를 달성하는 데 필요한 투여량은 개인 특성 및 투여 경로에 의존할 것이다. 검출 분석을 사용하여 혈장 농도를 구할 수 있다.

치료되어야 할 상태의 심각도 및 반응성에 따라, 투약은 단일 또는 복수의 투여로 이루어질 수 있고, 치료 과정은 며칠에서 몇 주간 계속되거나, 또는 완치가 이루어질 때까지 또는 질환 상태의 감퇴가 이루어질 때까지일 수 있다.

투여될 조성물의 양은 물론 치료되는 대상, 고통의 심각도, 투여 방식, 처방하는 의료진의 판단 등에 의존적일 것이다.

본 발명의 조성물은, 원하는 경우 상기 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형태를 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치, 예컨대 FDA 승인된 키트 내에 포장될 수도 있다. 상기 팩은 예를 들면 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 지시서가 수반될 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 또한 의약품의 제조, 용도 또는 판매를 규제하는 정부기관에 의해 처방된 형태의 고지가 수반될 수도 있는데, 상기 고지는 인간 또는 동물 투여용 조성물의 형태에 대한 상기 기관의 승인을 반영하는 것이다. 상기와 같은 고지는, 예를 들면 처방 약물에 대한 미국 식품의약국에 의해 승인되거나, 또는 승인된 제품 삽입물인 라벨을 포함할 수도 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 중에 제제화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 상기에 더욱 상세히 설명한 바와 같이, 제조되고, 적절한 용기에 담겨서, 지시된 상태의 치료를 위해 라벨링될 수 있다.

상술한 바와 같이 투여되는 재조합 단백질은 치료, 진단 및 미용 면에서 수많은 용도를 찾을 수 있다.

따라서, 예를 들면 상술한 교시는, 본 발명의 생체분자의 투여가 치료적으로 유익할 수 있는 임의의 질환 (즉, 만성 또는 급성) 또는 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들은 GCD를 먹인 마우스의 간에서 상기 효소의 축적을 나타내었는데, 이는 이를 고셔병의 치료에 사용할 수 있음을 제시한다.

본 발명의 교시를 이용하여 치료될 수 있는 기타 질환의 에에는 하기가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다:

염증성 질환 - 만성 염증성 질환 및 급성 염증성 질환을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

과민반응 관련 염증성 질환 - 과민반응의 예에는 제 I 형 과민반응, 제 II 형 과민반응, 제 III 형 과민반응, 제 IV 형 과민반응, 즉시 과민반응, 항체 매개 과민반응, 면역 복합체 매개 과민반응, T 림프구 매개 과민반응 및 DTH가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

제 I 형 또는 즉시 과민반응, 예컨대 천식.

제 II 형 과민반응에는 류마티스성 질환, 류마티스성 자가면역 질환, 류마티스성 관절염 (Krenn V. 등, Histol Histopathol 2000 7월; 15(3):791), 척추염, 강직 척추염 (Jan Voswinkel 등, Arthritis Res 2001; 3(3): 189), 전신성 질환, 전신성 자가면역 질환, 전신성 홍반성 루푸스 (Erikson J. 등, Immunol Res 1998; 17(1-2):49), 경화증, 전신성 경화증 (Renaudineau Y. 등, Clin Diagn Lab Immunol. 1999 3월; 6(2):156); Chan OT 등, Immunol Rev 1999 6월; 169:107), 선성 질환, 선성 자가면역 질환, 췌장 자가면역 질환, 당뇨병, 제 I 형 당뇨병 (Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 10월; 3 Suppl:S125), 갑상선 질환, 자가면역성 갑상선 질환, 그레이브병 (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 6월; 29(2):339), 갑상선염, 자발적 자가면역성 갑상선염 (Braley-Mullen H. 및 Yu S, J. Immunol 2000 12월 15일;165(12):7262), 하시모토 갑상선염 (Toyoda N. 등, Nippon Rinsho 1999 8월;57(8):1810), 점액부종, 특발성 점액부종 (Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 8월;57(8):1759); 자가면역성 생식계 질환, 난소 질환, 난소 자가면역 (Garza KM. 등, J Reprod Immunol 1998 2월;37(2):87), 자가면역성 항-정자성 불임증 (Diekman AB. 등, Am J Reprod Immunol. 2000 3월;43(3):134), 반복 유산 (Tincani A. 등, Lupus 1998;7 Suppl 2:S 107-9), 퇴행성 신경질환, 신경계 질환, 신경성 자가면역 질환, 다발성 경화증 (Cross AH. 등, J Neuroimmunol 2001 1월 1;112 (1-2): 1), 알쯔하이머병 (Oron L. 등, J Neural Transm Suppl. 1997;49:77), 중증 근육무력증 (Infante AJ. 및 Kraig E, Int Rev Immunol 1999;18(l-2):83), 운동감각 신경병증 (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 5월;7(3):191), 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 신경병증 및 자가면역성 신경병증 (Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 4월;319 (4):234), 근육무력증 질환, 램버트-이튼(Lambert-Eaton) 근육무력증 증후군 (Takamori M. Am J Med Sci. 2000 4월;319(4):204), 부신생물(paraneoplastic) 신경계 질환, 소뇌 위축, 부신생물 소뇌 위축, 비-부신생물 근육강직 증후군, 소뇌 위축, 진행성 소뇌 위축, 뇌염, 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis), 근위축성 측삭 경화증, 시덴함 무도병(Sydenham chorea), 질 드 라 뚜렛(Gilles de Ia Tourette) 증후군, 다발성 내분비장애, 자가면역성 다발성 내분비장애 (Antoine JC. 및 Honnorat J. Rev Neurol (파리) 2000 1월;156 (1):23); 신경병증, 이상면역성 신경병증 (Nobile-Orazio E. 등, Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419); 신경근긴장증, 후천성 신경근긴장증, 선천성 다발성 관절만곡증 (Vincent A. 등, Ann N Y Acad Sci. 1998 5월 13일;841:482), 심혈관 질환, 심혈관 자가면역 질환, 죽상경맥동화증 (Matsuura E. 등, Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135), 심근경색증 (Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132), 혈전증 (Tincani A. 등, Lupus 1998;7 Suppl 2:S 107-9), 육아종증, 베게너(Wegener's) 육아종증, 동맥염, 타카야스(Takayasu‘s) 동맥염 및 카와사키(Kawasaki) 증후군 (Praprotnik S. 등, Wien Klin Wochenschr 2000 8월 25일;112(15-16):660); 항-제 VIII 인자 자가면역 질환 (Lacroix-Desmazes S. 등, Semin Thromb Hemost. 2000;26(2):157); 혈관염, 괴사성 소혈관 혈관염, 현미경적 다발혈관염, 처어그-스트라우스(Churg and Strauss) 증후군, 사구체신염, 소량 면역침착 국소 괴사성 사구체신염, 초승달 사구체신염 (Noel LH. Ann Med Interne (파리). 2000 5월;151(3):178); 항-인지질 증후군 (Flamholz R. 등, J Clin Apheresis 1999;14(4):171); 심부전, 심부전에서의 어고니스트-유사 베타-아드레날린 수용체 항체 (Wallukat G. 등, Am J Cardiol. 1999 6월 17;83(12A):75H), 혈소판감소성 자반증 (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 4-6월;l4 (2):114); 용혈성 빈혈, 자가면역성 용혈성 빈혈 (Efremov DG. 등, Leuk Lymphoma 1998 1월;28(3-4):285), 위장관 질환, 위장관의 자가면역 질환, 장질환, 만성 염증성 장질환 (Garcia Herola A. 등, Gastroenterol Hepatol. 2000 1월;23(1):16), 복강 질환 (Landau YE. 및 Shoenfeld Y. Harefuah 2000 1월 16일;138(2):122), 근육조직의 자가면역 질환, 근육염, 자가면역성 근육염, 쇼그렌(Sjogren's) 증후군 (Feist E. 등, Int Arch Allergy Immunol 2000 9월;123 (1):92); 평활근 자가면역 질환 (Zauli D. 등, Biomed Pharmacother 1999 6월;53 (5-6):234), 간질환, 간 자가면역 질환, 자가면역성 간염 (Manns MP. J Hepatol 2000 8월;33(2):326), 및 원발성 담즙성 간경변 (Strassburg CP. 등, Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 6월;11(6):595).

제 IV 형 또는 T-세포 매개 과민반응에는 하기가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다: 류마티스성 질환, 류마티스성 관절염 (Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci USA 1994 1월 18일;91(2):437), 전신성 질환, 전신성 자가면역 질환, 전신성 홍반성 루푸스 (Datta SK., Lupus 1998;7(9):591), 선성 질환, 선성 자가면역 질환, 췌장 질환, 췌장 자가면역 질환, 제 1 형 당뇨병 (Castano L. 및 Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647); 갑상선 질환, 자가면역성 갑상선 질환, 그레이브병 (Sakata S. 등, MoI Cell Endocrinol 1993 3월;92(1):77); 난소 질환 (Garza KM. 등, J Reprod Immunol 1998 2월;37(2):87), 전립선염, 자가면역성 전립선염 (Alexander RB. 등, Urology 1997 12월;50(6):893), 다분비선 증후군, 자가면역성 다분비선 증후군, 제 I 형 자가면역성 다분비선 증후군 (Hara T. 등, Blood. 1991 3월 1일;77(5):1127), 신경계 질환, 자가면역성 신경계 질환, 다발성 경화증, 신경염, 시각신경염 (Soderstrom M. 등, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 5월;57(5):544), 중증 근육무력증 (Oshima M. 등, Eur J Immunol 1990 12월;20(12):2563), 근육강직 증후군 (Hiemstra HS. 등, Proc Natl Acad Sci USA 2001 3월 27일;98(7):3988), 심혈관 질환, 샤가스병에서의 심혈관 자가면역 (Cunha-Neto E. 등, J Clin Invest 1996 10월 15일;98(8):1709), 혈소판감소성 자반증 (Semple JW. 등, Blood 1996 5월 15일;87(10):4245), 항-보조 T 림프구 자가면역 (Caporossi AP. 등, Viral Immunol 1998;11(1):9), 용혈성 빈혈 (Sallah S. 등, Ann Hematol 1997 3월;74(3):139), 간질환, 간 자가면역 질환, 간염, 만성 활성 간염 (Franco A. 등, Clin Immunol Immunopathol 1990 3월;54(3):382), 담즙성 간경변, 원발성 담즙성 간경변 (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 11월;91(5):551), 신장 질환, 신장 자가면역 질환, 신염, 간질신장염 (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 8월;l(2):140), 결합조직 질환, 내이 질환, 자가면역성 결합조직 질환, 자가면역성 내이 질환 (Yoo TJ. 등, Cell Immunol 1994 8월;157(1):249), 내이 질환 (Gloddek B. 등, Ann N Y Acad Sci 1997 12월 29일;830:266), 피부질환, 피부층 질환, 진피 질환, 수포성 피부 질환, 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid) 및 낙엽상 천포창(pemphigus foliaceus).

지연형 과민성의 예에는 접촉성 피부염 및 약물 발진이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

T 림프구 매개 과민반응의 종류의 예에는 보조 T 림프구 및 세포독성 T 림프구가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

보조 T 림프구-매개 과민반응의 예에는 T_h1 림프구 매개 과민반응 및 T_h2 림프구 매개 과민반응이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

자가면역 질환

은 심혈관 질환, 류마티스성 질환, 선성 질환, 위장관 질환, 피부 질환, 간 질환, 신경계 질환, 근육 질환, 신장 질환, 생식계 관련 질환, 결합조직 질환 및 전신성 질환이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

자가면역성 심혈관 질환의 예에는 하기가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다: 죽상동맥경화증 (Matsuura E. 등, Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135), 심근경색증 (Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132), 혈전증 (Tincani A. 등, Lupus 1998;7 Suppl 2:S 107-9), 베게너 육아종증, 타카야스 동맥염, 카와사키 증후군 (Praprotnik S. 등, Wien Klin Wochenschr 2000 8월 25일;112(15-16):660), 항-제 VIII 인자 자가면역 질환 (Lacroix-Desmazes S. 등, Semin Thromb Hemost.2000;26(2):157), 괴사성 소혈관 혈관염, 현미경적 다발성 혈관염, 처어그-스트라우스 증후군, 소량 면역침착 국소 괴사성 및 초승달 사구체신염 (Noel LH. Ann Med Interne (파리). 2000 5월; 151(3):178), 항인지질 증후군 (Flamholz R. 등, J Clin Apheresis 1999;14(4):171), 항체-유도 심부전 (Wallukat G. 등, Am J Cardiol. 1999 6월 17일;83(12A):75H), 혈소판감소성 자반증 (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 4-6월;14(2):114; Semple JW. 등, Blood 1996 5월 15일;87(10):4245), 자가면역성 용혈성 빈혈 (Efremov DG. 등, Leuk Lymphoma 1998 1월;28(3-4):285; Sallah S. 등, Ann Hematol 1997 3월; 74(3):139), 샤가스병에서의 심장 자가면역 (Cunha-Neto E. 등, J Clin Invest 1996 10월 15일;98(8):1709) 및 항-보조 T 림프구 자가면역 (Caporossi AP. 등, Viral Immunol 1998;11(1):9).

자가면역성 류마티스성 질환의 예에는 류마티스성 관절염 (Krenn V. 등, Histol Histopathol 2000 7월; 15(3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci USA 1994 1월 18일;91 (2):437) 및 강직성 관절염 (Jan Voswinkel 등, Arthritis Res 2001; 3(3):189)이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

자가면역성 선성 질환의 예에는 췌장 질환, 제 I 형 당뇨병, 갑상선 질환, 그레이브병, 갑상선염, 자발적 자가면역성 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 특발성 점액부종, 난소 자가면역, 자가면역성 항-정자 불임증, 자가면역성 전립선염 및 제 I 형 자가면역성 다분비선 증후군이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 질환에는 췌장의 자가면역 질환, 제 1 형 당뇨병 (Castano L. 및 Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 10월;34 Suppl:S125), 자가면역성 갑상선 질환, 그레이브병 (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 6월;29(2):339; Sakata S. 등, Mol Cell Endocrinol 1993 3월;92(1):77), 자발적 자가면역성 갑상선염 (Braley-Mullen H. 및 Yu S, J Immunol 2000 12월 15일;165(12):7262), 하시모토 갑상선염 (Toyoda N. 등, Nippon Rinsho 1999 8월;57(8):1810), 특발성 점액부종 (Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 8월;57(8):1759), 난소 자가면역 (Garza KM. 등, J Reprod Immunol 1998 2월;37(2):87), 자가면역성 항-정자 불임증 (Diekman AB. 등, Am J Reprod Immunol. 2000 3월;43(3):134), 자가면역성 전립선염 (Alexander RB. 등, Urology 1997 12월;50(6):893) 및 제 I 형 자가면역성 다분비선 증후군 (Hara T. 등, Blood. 1991 3월 1일;77(5):1127)이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

자가면역성 위장관 질환의 예에는 만성 염증성 장질환 (Garcia Herola A. 등, Gastroenterol Hepatol. 2000 1월; 23(1):16), 복강 질환 (Landau YE. 및 Shoenfeld Y. Harefuah 2000 1월 16일; 138(2):122), 대장염, 회장염 및 크론병이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

자가면역성 피부 질환의 예로는 심상성 천포창, 수포성 유천포창 및 낙엽상 천포창과 같은, 그러나 이에 한정되지는 않는 자가면역성 수포성 피부질환이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

자가면역성 간질환의 예에는 간염, 자가면역성 만성 활성 간염 (Franco A. 등, Clin Immunol Immunopathol 1990 3월; 54(3):382), 원발성 담즙산 간경변 (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 11월; 91(5):551; Strassburg CP. 등, Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 6월; 11(6):595) 및 자가면역성 간염 (Manns MP. J Hepatol 2000 8월; 33(2):326)이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

자가면역성 신경계 질환의 예에는 다발성 경화증 (Cross AH. 등, J Neuroimmunol 2001 1월 1일;112(1-2):1), 알쯔하이머병 (Oron L. 등, J Neural Transm Suppl. 1997;49:77), 중증 근육무력증 (Infante AJ. 및 Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18(1-2):83; Oshima M. 등, Eur J Immunol 1990 12월; 20(12):2563), 신경병증, 운동감각 신경병증 (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 5월;7(3):191); 길랑-바레 증후군 및 자가면역성 신경병증 (Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 4월;319(4):234), 근육무력증, 램버트-이튼 근육무력 증후군 (Takamori M. Am J Med Sci. 2000 4월;319(4):204); 부신생물 신경계 질환, 소뇌 위축, 부신생물 소뇌 위축 및 근육강직 증후군 (Hiemstra HS. 등, Proc Natl Acad Sci USA 2001 3월 27일;98(7):3988); 비-부신생물 근육강직 증후군, 진행성 소뇌 위축, 뇌염, 라스무센 뇌염, 근위축성 측삭 경화증, 시덴함 무도병, 질 드 라 뚜렛 증후군 및 자가면역성 다발성 내분비장애 (Antoine JC. 및 Honnorat J. Rev Neurol (파리) 2000 1월; 156(1):23); 이상면역 신경병증 (Nobile-Orazio E. 등, Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419); 후천성 신경근긴장증, 선천성 다발성 관절만곡증 (Vincent A. 등, Ann N Y Acad Sci. 1998 5월 13일;841:482), 신경염, 시각신경염 (Soderstrom M. 등, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 5월;57(5):544) 및 퇴행성 신경질환이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

자가면역성 근육 질환의 예에는 근육염, 자가면역성 근육염 및 원발성 쇼그렌 증후군 (Feist E. 등, Int Arch Allergy Immunol 2000 9월;123(1):92) 및 평활근 자가면역 질환 (Zauli D. 등, Biomed Pharmacother 1999 6월;53(5-6):234)이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

자가면역성 신장 질환의 예에는 신장염 및 자가면역성 간질신장염 (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 8월; 1(2):140)이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

생식계통에 관련된 자가면역 질환의 예에는 반복 유산 (Tincani A. 등, Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9)이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

자가면역성 결합조직 질환의 예에는 내이 질환, 자가면역성 내이 질환 (Yoo TJ. 등, Cell Immunol 1994 8월; 157(1):249) 및 귀 내부의 자가면역 질환 (Gloddek B. 등, Ann N Y Acad Sci 1997 12월 29일; 830:266)이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

자가면역성 전신성 질환의 예에는 전신성 홍반성 루푸스 (Erikson J. 등, Immunol Res 1998;17(1-2):49) 및 전신성 경화증 (Renaudineau Y. 등, Clin Diagn Lab Immunol. 1999 3월;6(2):156); Chan OT. 등, Immunol Rev 1999 6월;169:107)이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

감염성 질환

감염성 질환의 예에는 만성 감염성 질환, 아급성 감염성 질환, 급성 감염성 질환, 바이러스성 질환, 박테리아성 질환, 원충성 질환, 기생충 질환, 진균성 질환, 미코플라스마 질환 및 프리온 질환이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

이식편 거부 질환

이식편의 이식과 관련된 질환의 예에는 이식편 거부, 만성 이식편 거부, 아급성 이식편 거부, 초급성(hyperacute) 이식편 거부, 급성 이식편 거부 및 이식편 대 숙주 질환이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

알러지성 질환

알러지성 질환의 예에는 천식, 두드러기, 두드러기, 꽃가루 알러지, 집먼지진드기 알러지, 뱀독 알러지, 화장품 알러지, 라텍스 알러지, 화학물질 알러지, 약물 알러지, 곤충자상(insect bite) 알러지, 동물 비듬 알러지, 자통(stinging) 식물 알러지, 옻 알러지 및 식품 알러지가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.

암 질환

암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 암 질환의 구체예에는 하기가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다: 만성 골수성 백혈병과 같은 골수 백혈병. 성숙한 급성 골수성 백혈병. 급성 전골수세포성 백혈병, 호염기성 세포가 증가된 급성 비-림프구 백혈병, 급성 단핵구 백혈병. 호산구 증가증이 있는 급성 골수단핵구 백혈병; 버킷형, 비-호지킨형과 같은 악성 림프종; 급성 림프모세포성 백혈병과 같은 림프구 백혈병. 만성 림프구 백혈병; 고형 종양, 양성 수막종, 침샘의 혼합 종양, 대장성 선종과 같은 골수증식성 질환; 소세포 폐암, 신장암, 자궁암, 전립선암, 방광암, 난소암, 대장암, 육종, 지질육종, 점액양 지질육종, 윤활막 육종, 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma) (폐포(alveolar)), 골격외 점액낭성 연골육종(Extraskeletal myxoid chonodrosarcoma), 유잉 종양과 같은 선암종; 기타에는 고환 및 난소 미분화세포종(dysgerminoma), 망막모세포종, 윌름 종양, 신경모세포종, 악성 흑색종, 중피종(mesothelioma), 유방암, 피부암, 전립선암 및 난소암.

본 출원에 의해 고려되는 다른 질환에는 호르몬 및 성장인자 결핍증; 왜소증, 장기 (예를 들면, 신장) 부전 (EPO) 결핍증 및 기타가 포함된다.

언급한 바와 같이, 상기 교시는 진단 용도에도 사용될 수 있다. 따라서 상기 재조합 단백질은, 표적 장기(들) 내에 축적될 수 있고, 생체내 영상화에 적당한 검출가능한 라벨 (예를 들면, GFP)을 추가로 포함할 수 있는 진단용 단백질일 수 있다.

본 발명에 따른 진단용 단백질/시약의 일례는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이다. 항체는 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다.

본 발명의 부가적 목적, 장점 및 신규한 특징은, 제한하려는 의도는 전혀 없는 하기의 실시예의 검토를 통해 당업자에게 명백해질 것이다. 또한, 상기 서술한 바와 같고 하기 청구범위 부분에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시양태 및 관점은 각각 하기 실시예에 의해 실험적으로 뒷받침된다.

이제 상기 설명과 함께 하기 실시예를 참조하여, 본 발명은 비-제한적인 방식으로 예시한다.

일반적으로 본원에서 사용된 명명법 및 본 발명에서 이용된 실험실 절차는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법을 포함한다. 상기와 같은 기법은 문헌에 모두 설명되어 있다. 예를 들면, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook 등, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" 제 I-III 권, Ausubel, R.M., 편저. (1994); Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson 등, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren 등 (편저) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", 제 1-4 권, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국특허 제 4,666,828 호; 제 4,683,202 호; 제 4,801,531 호; 제 5,192,659 호 및 제 5,272,057 호에 기술된 바와 같은 방법론; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", 제 I-III 권, Cellis, J.E., 편저 (1994); "Current Protocols in Immunology" 제 I-III 권, Coligan J.E., 편저 (1994); Stites 등 (편저), "Basic and Clinical Immunology" (제 8 판), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell 및 Shiigi (편저), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., New York (1980)을 참조한다; 이용가능한 면역분석법은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기술되어 있다. 예를 들면, 미국특허 제 3,791,932 호; 제 3,839,153 호; 제 3,850,752 호; 제 3,850,578 호; 제 3,853,987 호; 제 3,867,517 호; 제 3,879,262 호; 제 3,901,654 호; 제 3,935,074 호; 제 3,984,533 호; 제 3,996,345 호; 제 4,034,074 호; 제 4,098,876 호; 제 4,879,219 호; 제 5,011,771 호 및 제 5,281,521 호; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J. 편저 (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B.D. 및 Higgins S.J. 편저 (1985); "Transcription and Translation" Hames, B.D. 및 Higgins S.J. 편저 (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.L, 편저 (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) 및 "Methods in Enzymology" 제 1-317 권, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak 등, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)을 참조한다; 이 모두는 본원에 전체가 기술된 것처럼 참조로서 인용된다. 다른 일반적 참고문헌은 이 문헌 전체를 통해 제공된다. 거기에 주어진 절차는 당업계에서 잘 알려져 있는 것이라 믿어지며, 독자의 편리를 위해 제공된 것이다. 거기에 포함된 모든 정보는 참조로서 본원에 인용된다.

실시예 1

GCD를 발현하는 당근 세포 배양물이 경구 투여된 마우스의 간에서의 GCD 축적

동물, 물질 및 실험 절차

마우스: BALB/C 암컷 마우스 7-8주령

식물 세포 준비

발현 플라스미드의 구축 - GCD를 코딩하는 cDNA (수탁번호 클론 #65696, 서열번호:3-4)를, 아라비돕시스 탈리아나 기초 엔도키티나제 유전자 유래의 ER-표적화 신호, 및 담배 키티나제 A 유래의 액포 표적화 신호를 함유하는 플라스미드 내로 서브클론하였다. 상기 플라스미드는 오픈 리딩 프레임의 5‘ 말단에, 콜리플라워 모자이크 바이러스 유래의 35S 프로모터, 및 이어서 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 오메가 변역 인핸서 요소를 함유하였다. 3’ 말단에는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 옥토핀 신타아제 종결인자 서열이 삽입되었다. 상기 카세트를 중간체 벡터에서 제거하고, 이원 벡터 내로 결찰하였다. 카나마이신 내성은 nos 프로모터에 의해 구동되는 NPTII 유전자에 의해 부여되었다.

당근 세포의 형질전환 및 단리 - 당근 세포 현탁 배양물을 아그로박테리움을 이용하여 형질전환하였다. 간략하게, 아그로박테리아를 전기천공에 의해 상기 GCD 함유 벡터로써 형질전환시키고, 30 mg/ml의 파로모마이신을 이용하여 선별하였다. 당근 세포를 아그로박테리아로써 형질전환시키고, 액상 배지 중 60 mg/ml의 파로모마이신을 이용하여 선별하였다. 형질전환된 당근 세포를 고체 선별 배지상에서 평판배양하고, 개별 세포로부터 유합조직(calli)이 형성되게 하였다. 단백질-고발현 세포주를 동정하고 선별하였다. 유합조직은 추가로 확장시키고 액상 배지로 옮겼다.

웨스턴 블롯에 의한 GCD 발현의 판단 - 웨스턴 블롯을 위해, 단백질 추출물을 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로스 막 (Amersham Life Science 사)에 옮기고, 항-GCD 항체 (1:6500으로 희석) 및 퍼옥시다아제-콘쥬게이트 염소 항-토끼 HRP 이차 항체 (1:15,000으로 희석, Sigma 사)를 이용하여 GCD를 검출하였다.

바이오반응기의 스케일업 - 선택된 유합조직의 현탁 배양물을, 4.4 g/l의 MSD 배지 (Duchefa 사, 네덜란드), 9.9 mg/l의 티아민 HCl (Duchefa 사, 네덜란드), 30 g/l의 수크로스 및 0.1 mg/l의 2,4-디클로로페녹시아세트산 (Sigma 사)을 함 유하는 Murashige and Skoog (MS) 액상 배지 중에서 배양하였다. 현탁 세포 배양물을 진탕 얼렌마이어 플라스크 내에서 배양하고, 10 리터의 폴리에틸렌 바이오반응기의 접종에 사용한 후, 100 리터 폴리에틸렌 바이오반응기로 스케일업하였다. 유전자 변형된 세포들을 바이오반응기 내에서 반복되는 성장 사이클 하에 배양하였다.

경구 투여 - 마우스를 밤새 (14 내지 16 시간) 절식시킨 후, 동물 우리 내에 배치한 식물 세포 물질을 주었다. 2 시간 후, 상기 식물 물질을 제거하고, 상기 동물에게 정상 식단을 주었다. 동물들을 1, 2, 4 및 18 시간 더 지난 후에 희생시켰다. 각 동물에서 간을 제거하고 액체 질소에 냉동시키고, 분석때까지 -70℃에서 보관하였다.

간조직 시료의 제조 - 각 간조직 시료를 0.9% NaCl로 세척하고, ULTRA-TURRAX T25 기본 IKA-WERKE 호모지나이저를 낮은 속도 (11,000 내지 13,000 l/분)에서 45 내지 60 초간 이용하여, 빙냉 하에 조직 1 그램 당 5 ml의 균질화 완충액 (60 mM 인산염 시트르산염, 1.5% Triton-X-100, 1 mM의 PMSF)으로써 균질화시켰다. 시료를 4℃에서 10 분간 10,000g로 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 분액하고, 나중의 분석을 위해 -70℃에서 동결시켰다.

시험관내 글리코시다아제 활성 분석: prGCD의 효소 활성을, p-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드 (Sigma 사)를 기질로 이용하여 구하였다. 분석 완충액은 60 mM의 인산염-시트르산염 완충액 pH=5.5, 0.15%의 Triton X-100, 0.125%의 소듐 타우로콜레이트를 함유하였다. 분석은 30, 12 또는 6 마이크로리터의 시료를 이용하 여 3회 희석한 총 용적 5.5 ml로 수행하였고, 분석 완충액 및 4 mM의 최종 농도로 첨가된 기질과 함께 인큐베이션하였다. 매 15 분마다, 각 시료를 970 마이크로리터씩 제거하고, 각 시료에 30 마이크로리터의 5N NaOH를 첨가하였다. 활성은, 401 nm에서의 흡수에 의해 검출된 생성물 (p-니트로페닐; pNP) 형성률 (Friedman, 1999)에 의해 구하였다.

결과

GCD 발현 당근 배양물을 사용하여, 본 발명의 교시에 따라 생성되고 투여된 재조합 단백질의 표적 장기 내 축적을 시험하였다. 도 1에서 명백한 바와 같이, 간에서의 GCD 활성의 최고치는 급식 후 2 시간 후에 나타났다 (효소 활성이 30% 증가). 이 활성은 급식 후 4 시간 후에 정상 수준으로 되돌아갔다.

실시예 2

식물 재조합 성장 호르몬 (hGH)의 뇌하수체 절제된 랫트로의 경구 전달

위장관을 통해 재조합 hGH를 전신 전달하는 식물 세포의 능력을, 내인성 성장 호르몬을 발현하지 않는 뇌하수체 절제된 랫트에서 조사하였는데, 이는 gGH 수준의 분석을 보다 간단하고 정확하게 한다.

실험 절차

식물 세포 준비 - hGH를 생산하는 담배 BY-2 세포를, 유도성 RNA 의존적 RNA 중합효소가 증대된 안정한 세포 발현 시스템을 이용하여 생산하였다. 상기 시스템은 두 개의 플라스미드 내로 구축되었다. 첫 번째 플라스미드는 35S 프로모터의 제어 하에 억제인자인 LacI 유전자, 하이그로마이신 선별, 및 이어서 IRES (내부 라이보좀 통합 부위)를 지녔다. 두 번째 플라스미드에서는, 천연 리더 및 ER 보유 신호가 측면에 부착된 식물 코돈 최적화된 hGH 유전자 (서열번호: 1 내지 2)를, 유도성 RNA 의존적 RNA 중합효소의 서브게놈 프로모터의 제어 하에 클로닝하였다. 또한, 상기 플라스미드는 RNA 의존적 RNA 중합효소 (TVCV-담배 잎맥 바이러스병(vein clearing virus), IRES-NPTII 선택적 마커 유전자 및 바이러스 복제 기작을 차단하는 LacI 결합 부위를 함유하였다. 20 mM의 IPTG를, 양 플라스미드를 갖는 세포에 첨가하여, GH 발현을 유도하였다. 발현 수준은 50 내지 700 μg/그램의 신선 중량의 범위였다.

재조합 hGH 흡수의 판단은, hGH (GenBank 수탁번호 P01241)를 먹인 랫트의 혈청 및 장기 내 hGH에 대해 ELISA를 이용하여 실시하였다.

두 그룹의 n=4 랫트, 즉 뇌하수체 절제된 Sprague Dawley에게 (1) 천연 BY2 세포 (- Tobacco BY-2 Cells, Nagata, Toshiyuku 편저; Hasezawa, Seiichiro; Inz', Dirk Springer 2004); 및 (2) GH (BY2 아이콘 억제인자 (B5.1+21450)를 발현하는 BY2 세포로서, GHs는 IPTG로 유도된 Nat ER 세포주 18이다.

랫트는 임의로 24 시간 동안 식물 세포만 (랫트 사료는 없음) 먹였다. 24 시간 후에, 랫트를 마취하고 혈액을 채집한 후, 상기 랫트를 희생시키고, hGH 섭취 측정을 위해 장기를 수집하였다. 수집된 장기에는 근육, 간 및 비장이 포함되었다. 혈청을 혈액으로부터 분리하였다. 모든 장기는 분석때까지 -70℃에서 유지되었다. 혈청 및 장기 내 hGH 수준은 ELISA로 측정하였다 (인간 성장 호르몬 효소 면역분석 시험 키트: BioCheck, Inc. 사, 카탈로그 번호 BC-1033).

결과

GH를 발현하는 BY2 세포를 먹인 랫트 네 마리 중 한 마리는 혈청 중 현저히 상승된 수준의 hGH를 나타내었다. GH를 발현하는 BY2 세포를 먹인 랫트 네 마리 중 두 마리는 근육에서 현저히 상상된 수준의 GH를 나타내었다. 모든 다른 랫트 (대조군, BY2 천연 세포를 먹인 군)는 뇌하수체 절제된 표현형에 따라 혈청 또는 근육에서 검출가능한 GH 수준을 갖지 않았다. 결과를 도 2에 나타내고 하기 표 1에 요약하였다.

조직 및 혈청 내 hGH 수준 (2회 독립적인 시험의 평균 결과)
처리	랫트#	혈청 (ng/ml)	근육 (ng/mg)	비장 (ng/mg)	간 (ng/mg)
BY2 GH	1	0.572	0.000	0	0
	5	7.133	24.784	0	0
	9	0.219	0.000	0	0
	46	0.177	58.260	0	0
BY2 -	8	0.012	1.010	데이터 없음	0
	19	0.000	2.055	데이터 없음	0
	31	0.000	0.760	데이터 없음	데이터 없음
	32	0.003	0.265	데이터 없음	데이터 없음

실시예 3

식물 재조합 hGCD의 랫트로의 경구 전달

재조합 단백질의 신체 내로의 흡수를 위해 소화계를 통해 재조합 hGCD를 전달하는 식물 세포의 능력을 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 조사하였다.

동물, 물질 및 실험 절차

랫트: 12 마리의 Sprague Dawley 암컷 랫트 10 내지 11 주령을 사용하였다.

경구 투여: 랫트를 밤새 (14 내지 16 시간) 절식시킨 후, 동물 우리 내에 배치한 식물 세포 물질 (임의, 10 gr/랫트)을 주었다. 2 시간 후, 상기 식물 물질을 제거하고, 상기 동물에게 정상 식단을 주었다. 동물들을 1, 2, 4 및 24 시간 더 지난 후에 희생시켰다 (각 시점에서 3 마리씩). 각 동물에서 간 및 비장을 제거하고 액체 질소에 냉동시키고, 분석때까지 -70℃에서 보관하였다.

비장 및 간 조직의 준비: 실시예 1에 기재된 바와 같음.

결과

GCD 발현 당근 배양물을 사용하여, 본 발명의 교시에 따라 생성되고 경구 투여된 재조합 단백질의 표적 장기 내 축적에 대하여 시험하였다. 도 3a 및 3b에서 분명한 바와 같이, GCD 활성의 증가가 간 및 비장 조직에서 관찰되었고, 급식 후 1 시간 후에 GCD 활성의 최고치가 나타났다 (비장-26%, 간-44%의 효소 활성 증가). 이 활성은 급식 후 4 시간 후에 정상 수준으로 되돌아갔다.

실시예 4

식물 재조합 FSH의 뇌하수체 절제된 랫트로의 경구 전달

위장관을 통해 혈액으로 FSH를 전달하는 식물 세포의 능력을, 식물 세포 물질의 단일 경구 (PO) 투여 후에 조사하였다.

실험 절차

식물 세포 준비

발현 플라스미드의 구축 - FSH α 및 β 사슬을 코딩하는 DNA 및 그 천연 신호를, 콜리플라워 모자이크 바이러스 유래의 35S 프로모터에 이어 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 오메가 번역 인핸서 요소를 함유하는 플리스미드 내로 서브클론하였다. 3‘ 말단에 아그로박테리움 투메파시엔스 유래의 옥토핀 신타아제 종결인자 서열이 삽입되었다. 상기 카세트를 중간체 벡터에서 제거하고, 이원 벡터 내로 결찰하였다. 상기 FSH β 사슬은 nos 프로모터에 의해 구동되는 NPTII 유전자에 의해 카나마이신 내성이 부여되었고, 상기 FSH α 사슬은 nos 프로모터에 의해 구동되는 aphIII 유전자에 의해 하이그로마이신 내성이 부여되었다.

당근 세포의 형질전환 및 단리 - 당근 세포 현탁 배양물을 아그로박테리움을 이용하여 형질전환하였다. 간략하게는, 아그로박테리아를 전기천공에 의해 상기 FSH β 벡터로써 형질전환시키고, 30 mg/ml의 파로모마이신을 이용하여 선별하였다. 당근 세포를 아그로박테리아로써 형질전환시키고, 액상 배지 중 60 mg/ml의 파로모마이신을 이용하여 선별하였다. 형질전환된 당근 세포를 고체 선별 배지상에서 평판배양하고, 개별 세포로부터 유합조직(calli)이 형성되게 하였다. 단백질-고발현 세포주를 동정하고 선별하였다. 유합조직은 추가로 확장시키고 액상 배지로 옮겼다. 상기 세포는 이어서 FSH α 사슬을 갖는 플라스미드로써 재-형질전환시키고, 100 mg/ml의 하이그로마이신을 이용하여 상기와 같이 선별하였다. 웨스턴 블롯 및 ELISA 분석법을 이용하여 가장 잘 발현하는 세포주를 선별하여, 발현 수준을 평가하였다. 그 수준은 1 내지 20 μg/g FW이었다.

동물 및 경구 투여 - 11주령 랫트 (200 그램) 세 마리에게 경구 위관영양법(gavage)에 의해10 ml/식물의 kg의 당근 세포 으깬 것을 투여하였다. 혈액 시료는 투약전 및 투여 후 10, 20, 30, 60, 120 및 240 분 후에 취하고, BioCheck Inc. 사의 키트를 이용하여 ELISA에 의해 FSH 농도를 측정하였다.

결과

도 4에 나타난 바와 같이, FSH 혈청 수준은 투여 후 10 분 후에 5 배 이상만큼 증가하였고, 그 후 기선치로 되돌아갔다.

실시예 5

동결건조된 당근 세포 발현은 GCD 수준 및 활성을 그대로 유지한다

본 발명의 식물 세포의, 탈수 후에 활성을 유지하는 능력을 조사하였다.

실험 절차

상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 생산된, GCD를 발현하는 당근 세포 100 그램을 동결건조하고, 특정 단백질 발현 및 활성에 대해 시험하였다 (상기 실시예 1 및 3 참조).

용해물 제조 - 50 mg의 건조 세포를 1 ml의 추출 완충액 pH=7.2 (20 mM의 인산염 완충액 pH=7.2, 20 mM의 EDTA, 20 mM의 L-아스코르브산, 1%의 Triton X-100)으로써 추출하였다.

웨스턴 블롯에 의한 GCD 발현의 판단 - 웨스턴 블롯을 위해, 단백질 추출물을 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로스 막 (Amersham Life Science 사)에 옮기고, 항-GCD 항체 (1:6500으로 희석) 및 퍼옥시다아제-콘쥬게이트 염소 항-토끼 HRP 이차 항체 (1:15,000으로 희석, Sigma 사)를 이용하여 GCD를 검출하였다.

결과

도 5는 동결건조된 식물 세포 대 신선한 세포에서의 GCD 발현을 나타낸다. 단백질 부하량은 Bradford에 의한 총 단백질 측정에 기초하였다. 나타난 바와 같이, 건조 제제에서의 GCD 발현의 수준은 신선한 제제의 것과 유사하였다. 용해물 중 총 단백질을 측정하고, 동결건조 세포 용해물 및 신선한 세포 용해물 모두에서의 활성 GCD의 양을 평가하였다. 결과를 하기 표 2에 나타낸다.

	총 단백질 mg/ml	GCD 농도 ㎍/ml
동결건조된 세포	2.582	2.010
신선한 세포	2.799	2.505

따라서 본 발명의 건조 제제가 그 생물학적 활성을 유지한다는 것이 명백하다.

종합하여, 상기 결과는 단리되지 않은 식물에서 발현된 재조합 단백질의, 위장관을 통과 이동하여 내부 장기 내에 축적되는 능력을 최초로 입증한다.

분명함을 위해 각기 다른 실시양태의 맥락으로 기재된 본 발명의 특정한 특징들은 단일 실시양태로 조합되어 제공될 수도 있음을 유념해야 한다. 반대로, 간결성을 위해 단일 실시양태의 맥락으로 기술된 본 발명의 다양한 특징들은 각기 따로, 또는 임의의 적당한 하위조합으로 제공될 수도 있다.

본 발명을 구체적인 실시양태와 함께 기재하였으나, 많은 대안예, 변경예 및 변형예가 당업자에게는 자명함이 분명하다. 따라서 첨부된 청구범위의 사상 및 폭넓은 범위 내에 속하는 모든 그러한 대안예, 변경예 및 변형예를 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 언급된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원서 및 GenBank 수탁번호는 본원에 전체가 참조로서 본 명세서에 인용되었으며, 동일한 정도로 각각의 개별 문헌, 특허 또는 특허출원서 또는 GenBank 수탁번호는 구체적으로 및 개별적으로 참조로서 본원에 인용되었음이 표시되었다. 또한, 본 출원서 내 어느 참고문헌의 인용 또는 식별이라도, 그와 같은 참고문헌이 본 발명에 대한 선행기술로서 이용가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

SEQUENCE LISTING <110> Protalix Ltd. Shaaltiel, Yoseph Almon, Einat <120> MUCOSAL OR ENTERAL ADMINISTRATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MACROMOLECULES <130> 31681 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic codon altered construct coding for the human growth hormone <400> 1 atggctactg gatctaggac ttctcttctt cttgctttcg gacttctttg tttgccatgg 60 cttcaagaag gatctgcttt cccaactatt ccactttcta ggcttttcga taacgctatg 120 ttgagggctc ataggcttca tcaacttgct ttcgatacct atcaagagtt tgaggaggct 180 tacattccaa aggagcagaa gtactctttt cttcaaaacc cacaaacctc tctttgtttc 240 tctgaatcta ttccaactcc atcaaatagg gaggagaccc aacaaaagtc aaaccttgag 300 cttcttagga tctcacttct tcttattcaa tcttggcttg agccagttca attccttaga 360 tctgttttcg caaactctct tgtttacgga gcttcagatt caaacgttta cgatcttctt 420 aaggatcttg aggagggtat tcaaactctt atgggaaggc ttgaagatgg atctccaagg 480 actggacaaa tcttcaagca gacctactct aagttcgata ccaactctca taacgatgat 540 gctcttctta agaactacgg acttttgtac tgtttcagga aggatatgga taaggttgag 600 accttcctta ggatcgttca atgtcgttct gttgaaggat cttgcggatt ctcagagaag 660 gatgagttgt aa 672 <210> 2 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic human growth hormone <400> 2 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu 20 25 30 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 35 40 45 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 50 55 60 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 65 70 75 80 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 100 105 110 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 115 120 125 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 130 135 140 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 145 150 155 160 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 165 170 175 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 180 185 190 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 195 200 205 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Glu Lys Asp Glu Leu 210 215 220 <210> 3 <211> 1581 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgaagacta atctttttct ctttctcatc ttttcacttc tcctatcatt atcctcggcc 60 gaattcgccc gcccctgcat ccctaaaagc ttcggctaca gctcggtggt gtgtgtctgc 120 aatgccacat actgtgactc ctttgacccc ccgacctttc ctgcccttgg taccttcagc 180 cgctatgaga gtacacgcag tgggcgacgg atggagctga gtatggggcc catccaggct 240 aatcacacgg gcacaggcct gctactgacc ctgcagccag aacagaagtt ccagaaagtg 300 aagggatttg gaggggccat gacagatgct gctgctctca acatccttgc cctgtcaccc 360 cctgcccaaa atttgctact taaatcgtac ttctctgaag aaggaatcgg atataacatc 420 atccgggtac ccatggccag ctgtgacttc tccatccgca cctacaccta tgcagacacc 480 cctgatgatt tccagttgca caacttcagc ctcccagagg aagataccaa gctcaagata 540 cccctgattc accgagccct gcagttggcc cagcgtcccg tttcactcct tgccagcccc 600 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Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr 165 170 175 Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg 180 185 190 Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys 195 200 205 Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly 210 215 220 Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp 225 230 235 240 Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn 245 250 255 Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly 260 265 270 Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro 275 280 285 Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp 290 295 300 Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp 305 310 315 320 Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu 325 330 335 Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu 340 345 350 Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys 355 360 365 Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln 370 375 380 Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp 385 390 395 400 Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val 405 410 415 Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr 420 425 430 Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe 435 440 445 Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn 450 455 460 Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val 465 470 475 480 Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp 485 490 495 Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His 500 505 510 Thr Tyr Leu Trp His Arg Gln Asp Leu Leu Val Asp Thr Met 515 520 525

Claims (79)

1. 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 생물학적으로 활성인 형태로, 이를 필요로 하는 대상에게 전신 전달하는 방법으로서, 상기 대상에게 외인성의 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 발현하는 식물 세포를 치료적 유효량으로 경구 또는 점막 투여함으로써, 상기 대상에게 상기 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 생물학적으로 활성인 형태로 전신 전달하는 것을 포함하는 방법.
2. 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 생물학적으로 활성인 형태로, 이를 필요로 하는 대상에게 국소 전달하는 방법으로서, 상기 대상에게 외인성의 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 발현하는 식물 세포를 치료적 유효량으로 경구 또는 점막 투여함으로써, 상기 대상에게 상기 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 생물학적으로 활성인 형태로 국소 전달하는 것을 포함하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물 세포가 실질적으로 온전한 세포벽을 포함하는 것인 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물 세포가 실질적으로 온전한 세포막을 포함하는 것인 방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물 세포가 실질적으로 온전한 세포벽 및 세포막을 포함하는 것인 방법.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물 세포가 단리된 세포로서 투여되는 방법.
7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물 세포가 탈수된 식물 세포로서 투여되는 방법.
8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 재조합 생체분자가 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드인 방법.
9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 재조합 생체분자가 폴리펩티드인 방법.
10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 재조합 생체분자가 치료용 생체분자, 진단용 생체분자 및 기능성 화장품으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
11. 제 7 항에 있어서, 상기 탈수된 식물 세포가 부형제를 추가 포함하는 것인 방법.
12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물 세포가 알팔파 식물 세포를 포함하는 것인 방법.
13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물 세포가 담배 식물 세포를 포함하는 것인 방법.
14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물 세포가 담배 세포주에서 수득된 식물 세포를 포함하는 것인 방법.
15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물 세포가 식물 뿌리 세포를 포함하는 것인 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 식물 뿌리 세포가 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes)로써 형질전환된 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 서양 고추냉이 세포 및 당근 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
17. 제 15 항에 있어서, 상기 식물 뿌리 세포가 당근 세포인 방법.
18. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 재조합 생체분자가 원핵세포 단백질, 진핵세포 단백질, 키메라성 단백질 및 바이러스성 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 상기 바이러스성 단백질이 감염성 점액낭병 바이러스의 바이러스성 단백질 VPII인 방법.
20. 제 18 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 인터페론 β인 방법.
21. 제 18 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 응고인자인 방법.
22. 제 18 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 X 인자인 방법.
23. 제 18 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 고-만노스 단백질인 방법.
24. 제 18 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 라이소좀 효소인 방법.
25. 제 18 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 글루코세레브로시다아제인 방법.
26. 제 18 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 알파 갈락토시다아제인 방 법.
27. 제 18 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 성장 호르몬인 방법.
28. 제 18 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 FSH인 방법.
29. 제 18 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 아세틸콜린 에스테라제인 방법.
30. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 재조합 생체분자가 상기 대상 내에서 비-면역원성인 방법.
31. 활성 성분으로서 외인성의 생물학적으로 활성인 재조합 생체분자를 발현하는 식물 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체가 비-면역원성 담체인 약학적 조성물.
33. 제 31 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체가 장관련 림프조직을 자극하지 않는 것인 약학적 조성물.
34. 대상으로의 생물학적으로 활성인 생체분자의 국소 전달을 위한 단위 투여형태로서, 외인성의 생물학적으로 활성인 생체분자를 발현하는 식물 세포를 치료적 유효량으로 포함하는 단위 투여형태.
35. 제 34 항에 있어서, 경구 투여를 위해 제제화된 단위 투여형태.
36. 제 34 항에 있어서, 점막 투여를 위해 제제화된 단위 투여형태.
37. 제 34 항에 있어서, 상기 식물 세포가 탈수된 식물 세포를 포함하는 것인 단위 투여형태.
38. 대상으로의 생물학적으로 활성인 생체분자의 전신 전달을 위한 단위 투여형태로서, 외인성의 생물학적으로 활성인 생체분자를 발현하는 식물 세포를 치료적 유효량으로 포함하는 단위 투여형태.
39. 제 38 항에 있어서, 경구 투여를 위해 제제화된 단위 투여형태.
40. 제 38 항에 있어서, 점막 투여를 위해 제제화된 단위 투여형태.
41. 제 38 항에 있어서, 상기 식물 세포가 탈수된 식물 세포를 포함하는 것인 단 위 투여형태.
42. 질환 치료가 필요한 대상의 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 대상에게 외인성의 생물학적으로 활성인 생체분자를 발현하는 식물 세포를 치료적 유효량으로 장관 또는 점막 투여함으로써, 상기 대상의 질환을 치료하는 것을 포함하는 방법.
43. 제 42 항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 생체분자가 재조합 인간 글루코세레브로시다아제 단백질을 포함하고, 상기 질환이 고셔병(Gaucher's disease)인 방법.
44. 제 42 항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 생체분자가 재조합 인간 글루코세레브로시다아제 단백질을 포함하고, 상기 질환이 파브리병(Fabry disease)인 방법.
45. 제 42 항에 있어서, 상기 생물학적으로 활성인 생체분자가 재조합 인간 글루코세레브로시다아제 단백질을 포함하고, 상기 질환이 암인 방법.
46. 제 42 항에 있어서, 상기 질환이 전신성 질환인 방법.
47. 제 42 항에 있어서, 상기 질환이 만성 질환인 방법.
48. 제 42 항에 있어서, 상기 질환이 급성 질환인 방법.
49. 외인성의 생물학적으로 활성인 생체분자를 발현하는 식물 세포의, 의약 제조를 위한 용도.
50. 제 49 항에 있어서, 상기 식물 세포가 실질적으로 온전한 세포벽을 포함하는 것인 용도.
51. 제 49 항에 있어서, 상기 식물 세포가 실질적으로 온전한 세포막을 포함하는 것인 용도.
52. 제 49 항에 있어서, 상기 식물 세포가 실질적으로 온전한 세포벽 및 세포막을 포함하는 것인 용도.
53. 제 49 항에 있어서, 상기 식물 세포가 단리된 세포로서 투여되는 것인 용도.
54. 제 49 항에 있어서, 상기 식물 세포가 탈수된 식물 세포로서 투여되는 것인 용도.
55. 제 49 항에 있어서, 상기 재조합 생체분자가 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드인 용도.
56. 제 49 항에 있어서, 상기 재조합 생체분자가 폴리펩티드인 용도.
57. 제 49 항에 있어서, 상기 재조합 생체분자가 치료용 생체분자, 진단용 생체분자 및 기능성 화장품으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 용도.
58. 제 54 항에 있어서, 상기 탈수된 식물 세포가 부형제를 추가 포함하는 것인 용도.
59. 제 49 항에 있어서, 상기 식물 세포가 알팔파 식물 세포를 포함하는 것인 용도.
60. 제 49 항에 있어서, 상기 식물 세포가 담배에서 수득된 식물 세포를 포함하는 것인 용도.
61. 제 49 항에 있어서, 상기 식물 세포가 담배 세포주에서 수득된 식물 세포를 포함하는 것인 용도.
62. 제 49 항에 있어서, 상기 식물 세포가 식물 뿌리 세포를 포함하는 것인 용도.
63. 제 62 항에 있어서, 상기 식물 뿌리 세포가 아그로박테리움 라이조게네스로써 형질전환된 뿌리 세포, 셀러리 세포, 생강 세포, 서양 고추냉이 세포 및 당근 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인 용도.
64. 제 62 항에 있어서, 상기 식물 뿌리 세포가 당근 세포인 용도.
65. 제 49 항에 있어서, 상기 재조합 생체분자가 원핵세포 단백질, 진핵세포 단백질, 키메라성 단백질 및 바이러스성 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것인 용도.
66. 제 65 항에 있어서, 상기 바이러스성 단백질이 감염성 점액낭병 바이러스의 바이러스성 단백질 VPII인 용도.
67. 제 65 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 인터페론 β인 용도.
68. 제 65 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 응고인자인 용도.
69. 제 65 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 X 인자인 용도.
70. 제 65 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 라이소좀 효소인 용도.
71. 제 65 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 글루코세레브로시다아제인 용도.
72. 제 65 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 알파 갈락토시다아제인 용도.
73. 제 65 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 성장 호르몬인 용도.
74. 제 65 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 FSH인 용도.
75. 제 65 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 아세틸콜린 에스테라제인 용도.
76. 제 65 항에 있어서, 상기 진핵세포 단백질이 인간 고-만노스 단백질인 용도.
77. 제 49 항에 있어서, 상기 재조합 생체분자가 비-면역원성인 용도.
78. 제 49 항에 있어서, 상기 의약이 전신 전달용으로 제제화된 것인 용도.
79. 제 49 항에 있어서, 상기 의약이 국소 전달용으로 제제화된 것인 용도.

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