BRPI0616012A2 - administração via mucosa ou intestino de macromoléculas biologicamente ativas - Google Patents

Abstract

ADMINISTRAçãO VIA MUCOSA OU INTESTINO DE MACROMOLéCULAS BIOLOGICANENTE ATIVAS, compreendendo um método de administração sistemática de uma biomolécula recombinante biologicamente ativa, em uma forma biologicamente ativa, a um indivíduo com necessidades desta, o método compreendendo a administração via intestino ou via mucosa ao individuo de uma quantidade eficaz de células vegetais, expressando uma biomolécula exógena recombinante biologicamente ativa, assim, administrando de maneira sistemática a biomolécula recombinante biologicamente ativa, em uma forma biologicamente ativa, ao indivíduo.

Description

"ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSA OUINTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS"CAiylPO E HISTÓRICO. DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-sea métodos e composições para a administração demacromoléculas biologicamente ativas e, maisparticularmente, à administração entérica (por exemplo,oral) ou via mucosa de células vegetais cultivadasexpressando peptideos ou ' polipeptídeos recombinantesbiologicamente ativos para aplicações profiláticas ouaplicativos terapêuticos.

Inovações na biotecnologialevaram a um aumento significante no número de terapias comproteína e peptideos e outras drogas macromoleculares. Maisde 84 macromoléculas estão atualmente aprovadas para sercolocadas no mercado nos Estados Unidos e quase 350 maisestão em desenvolvimento clínico. Ainda, avanços recentes emtecnologias genômica e proteômica são esperados paracontinuar a aumentar o fluxo dos candidatos terapêuticosmacromoleculares.

Trabalhar com macromoléculastipicamente significa um número de desafios, entretanto, queos desenvolvedores da droga devem superar a fim dedesenvolver, com sucesso, estes compostos em terapiasseguras e eficazes. Por exemplo, as proteínas e os peptideostendem a ser destruídos por enzimas proteolíticas ou, nocaso de proteínas de peso molecular mais alto, podem geraranticorpos neutralizadores. Além disso, estas moléculaspodem . exibir baixa solubilidade ou pouca estabilidade,levando a uma vida de prateleira curta. Como resultado, asterapias de macromolécula freqüentemente perdem de formarápida sua eficácia ou exigem dosagem freqüente. Estesfatores não somente têm o custo da terapia, mas também aaceitação e conformidade do paciente, assim afetando suautilidade terapêutica.

Administração Oral:

0 método mais comum paraadministração da droga à base de proteína e peptídeo éatravés de métodos invasivos de administração de drogas,como injeções e infusões. Apesar de estes serem modosprimários para a administração de drogas macromolecularespara doenças sistêmicas, eles também são no mínimodesejáveis para pacientes e médicos. A desvantagem óbviadeste método de administração é a aceitação e conformidadedo paciente, limitando a maior parte dodesenvolvimento da macromolécula a indicações em quea necessidade para usar as rotas de administraçãoinvasiva não é excedida em peso através de despesasou inconveniências associadas. Como um método nãoinvasivo para administração sistêmica das drogas, aadministração oral apresenta muitas vantagens:facilidade e conveniência de uso, acesso a um volumeextensivo de superfície absorvente, alto grau devascularização, tempo de retenção relativamente prolongado,disposição natural de ingredientes inativos, nãometabolizados, e mais.Apesar de tudo, asinvestigações da administração oral de farmacêuticosmacromoleculares não indicaram níveis satisfatórios deeficiência para combinar o potencial desta rota. Alguns dosobstáculos são dificuldades de ingestão de comprimidos eoutras formulações sólidas, instabilidade de macromoléculasbiologicamente ativas no trato gastrintestinal, concentraçãode agentes biologicamente ativos na mucosa, e permeabilidadedas membranas gastrintestinais às macromoléculasbiologicamente ativas.

A rota oral da administraçãodas substâncias biologicamente ativas é complicada pelaacidez e degradação enzimática no estômago, que pode tornarinativas ou destruir macromoléculas biologicamente ativasantes que elas possam alcançar seu tecido alvo pretendido.Ainda, as concentrações eficazes de uma macromoléculabiologicamente ativa são difíceis de alcançar nos grandesvolumes encontrados no trato gastrintestinal. Assim, paraser eficaz, a maioria das drogas deve ser protegida daabsorção e/ou ambiente no trato gastrintestinal superior e,então, ser abruptamente liberada no intestino ou colón.Várias estratégias estão sendo usadas na indústriafarmacêutica para superar os problemas associados comadministração oral ou entérica de macromoléculasterapêuticas como proteínas. Estas estratégias incluemligação covalente com um portador, revestimentos eformulações (revestimentos sensíveis ao pH, polímeros erevestimentos muiticamadas, encapsulação, formulações deadministração programadas, sistemas de bioadesivos, sistemasde administração osmóticos controlados, etc) criados parareduzir ou prevenir a administração de ingredientes ativosem condições adversas como o estômago e tratogastrintestinal superior. Entretanto, a preparação deagentes biologicamente ativos nestas formulações requerprocessos complexos e caros. Também são empregados adesivosde mucosa e intensificadores de penetração (salicilatos,micelas mistas com sal biliar, glicerideos, acilcarnitinas,etc) para aumentar a ingestão na mucosa. Entretanto, algunsdestes podem ocasionar sérios problemas de toxidade local,como irritação local, abrasão da camada epitelial einflamação do tecido. Outras estratégias para melhorar aadministração ' oral incluem a mistura de agentebiologicamente ativo com inibidores protease, comoaprotinina, inibidor tripsina da soja e amastatina;entretanto, os inibidores de enzima não são seletivos, etambém inibem macromoléculas endógenas, causando efeitoscolaterais indesejáveis. Assim, os presentes métodos deadministração oral das moléculas biologicamente ativas nãopodem assegurar uma administração eficaz da atividadebiológica desejada no tecido alvo.Biofarmacêuticos vegetais:

Células mamíferas sãonaturalmente consideradas adequadas para expressar genesmamíferos. Entretanto, seu uso apresenta muitos problemas:despesas altas de cultura, e principal preocupação,contaminação. A expressão da proteína obtida com culturas decélulas mamíferas in vitro exige volumes muito grandes,causando altos custos. A produção das proteínasrecombinantes no leite de animais transgênicos (camundongo,ovelha e vacas) permite que alguns custos de produção sejamreduzidos. Entretanto, problemas éticos e problemas' decontaminação viral e subviral (príons, etc) permanecem.

Fatores a favor dos sistemasvegetais como fontes de peptídeos e polipeptídeos de origemanimal incluem: produção de biomassa de baixo custo, baixorisco de contaminação por vírus, elementos patogênicos etoxinas, a capacidade de células vegetais para dobrar ereunir proteínas muitiméricas, no caso de administraçãooral, baixa necessidade de processamento descendente baixo,assim como problemas éticos reduzidos. Assim, a transgênese de genes mamíferos codificando peptídeos e/ou polipeptídeosbiologicamente ativos em uma célula vegetal pode apresentaruma rota desejável para a produção de novas moléculasrecombinantes biologicamente ativas em grandes quantidades aum custo de produção reduzido e sem qualquer risco decontaminação viral ou subviral da célula animal.

Em 1983, vários laboratóriosdescobriram que era possível transferir um gene heterólogopara o genoma de uma célula vegetal (Bevan et al. , 1983;Herrera-Estrella et al., 1983 a e b) e regenerar as plantastransgênicas destas células geneticamente modificadas. Duasabordagens de transformação são freqüentemente usadas paraproduzir farmacêuticos recombinantes em vegetais. Naprimeira, vegetais transgênicos transformados de maneiraestável são produzidos com o uso da transformação mediadapor Agrobacterium, bombardeio de partículas, ou outrastécnicas de transformação padrão. 0 Nicotiana tabacum émuito usado como um sistema de expressão de modelo, masoutras plantas já foram usadas, incluindo Nicotianabethamiana, Arabidopsis thaliana, tomate, banana, nabo,resíduos do óleo de semente de feijão fradinho, mostarda daEtiópia, batata, arroz, aveia e milho. A segunda estratégiaé infectar vegetais não transgênicos com vírus recombinantesque expressam os transgenes durante sua replicação nohospedeiro. Os dois sistemas de vírus hospedeiro maisfreqüentemente usados são tabaco com vírus mosaico de tabaco(TMV) ou feijão de vaca com vírus mosaico de feijão de vaca(CPMV).

Seguindo os atalhos iniciaisem transgênicos vegetais, foram feitos muitos avanços naprodução de proteínas recombinantes mamíferas em célulasvegetais e/ou vegetais transgênicos. Um dos primeirosresultados verdadeiramente significantes neste campo foi aprodução de anticorpos em vegetais transgênicos de tabaco("Corpos vegetais") . Vários "corpos vegetais" de diagnósticoe terapêuticos já estão sendo disponibilizados: IgAsecretória anti-estreptococal do Tabaco (13 IgG docamundongo Guy) contra cáries dentárias; peptídeos - C5-1IgG) de sinal IgG Murine - IgG anti-humano da Alfafa dediagnóstico; antígeno carciembriônico de Aveia e Arrozanticâncer - peptídeo de sinal IgG Murine; KDEL - ScFvT84.66(ScFv); antígeno carciembriônico de Tabaco anticâncerlicier TMV; peptideos de sinal IgG murine; KDEL - T84.66(IgG) (brevemente com infiltração Agrobacterium); tratamentode linfoma de célula B do Tabaco; vacina idiotipo - a-amilase do Arroz - 38C13 (scFv), antígeno de superfície de câncer anti-cólon do Tabaco - peptídeo de sinal IgG Murine;KDEL - COl 7 - IA. (IgG), e vírus 2 simplex anti-Herpes da Soja- peptídeo de sinal extensina do Tabaco - Anti-HSV-2 (IgG) .

Em 1990, Sijmons e colegasexpressaram o gene da albumina de soro humano em células de tabaco e batata. Os níveis de albumina do soro humano daordem de 0,02% das proteínas totais foram obtidos em folhasde batata, caules e tubérculos. Outras proteínasrecombinantes de mamíferos que tinham sido produzidas emvegetais incluem hemoglobina humana; antitripsina, protease;inibidor de protease; colágeno e lactoferrina (ver Pedido dePatente US N°: 20030229925 para Legrand et al; 20040072317para Lenee et al; e 20030096973 para Gruber et al); oantígeno de superfície da hepatite B; interferons; a toxinada cólera; fator de crescimento da epiderme humana (EGF);eritropoietina; h-GM-CSF, e interleucinas. Além disso, osantígenos de vegetais recombinantes para vacinação eimunização ("Plantigenes") estão sendo desenvolvidos. Váriasempresas possuem farmacêuticos derivados de plantascomercialmente disponíveis (TrypZean™ e AproliZean™ daProdigene, Inc.) ou em testes clínicos [PlanetBiotechnology, Inc. (DoxoRx™ e CaroRxra) e MeristemTherapeutics (lípase humana recombinante "Meripase©" paraCF) ] .Na maioria dos casos, asproteínas recombinantes bioiogicamente ativas cie origemvegetal precisam ser isoladas do tecido hospedeiro. Váriosmétodos estão disponíveis para direcionar as proteínasrecombinantes aos tecidos vegetais específicos, comosementes, folhas, raízes, tubérculos, etc, e organelas comocloroplastos, a fim de alcançar altos níveis de expressão, eapresentar os materiais vegetais mais convenientes paraextração. As proteínas recombinantes podem também serseparadas; entretanto, as proteínas recombinantes separadas(como "corpos vegetais" separados) tendem mais à degradaçãodo que as proteínas recombinantes retidas nos tecidosvegetais. Será apreciado que a administração dos vegetaiscompletos ou das culturas de células vegetais expressandoproteína recombinante foram anteriormente sugeridas (ver porexemplo, expressão da proteína recombinante no Ped. de Pat.Arabidopsis U.S. 20030084484). Entretanto, nenhum dadoexperimental é apresentado que apóie o transporte daproteína recombinante ao tecido alvo.

Cultura da célula vegetal:

As culturas de célulasvegetais podem ser usadas para a produção de peptídeos epolipeptídeos recombinantes. As células vegetais podem sercultivadas de forma axênica em meio nutriente em bioreatoressob condições controladas, e proteína estrangeira pode sercolhida da biomassa, ou do líquido de cultura. Asmacromoléculas recombinantes bioiogicamente ativas incluindoanticorpos e fragmentos de anticorpos, enzimas,interleucinas, interferons, hormônios humanos, fatores docrescimento, fatores sangüíneos, proteína de inativação doribossoma da vacina, ricina, e anuitripsina humana foramproduzidos na cultura da célula vegetal (para uma análisevide Doran, Current Opinion em Biotech 2000; li; 199-204).Apesar dos sistemas de agricultura poderem apresentarproduções maiores, a cultura celular in-vitro oferece asvantagens de maior habilidade para manipular o.s níveis deproteína externa, ciclo de crescimento mais curto e maiorcontrole do ambiente de crescimento para propostasregulatórias.

Recentemente, os presentesinventores revelaram um sistema único de cultura descartávelde alta produção para células vegetais, que mostraram sereficazes para a produção de peptídeos e polipeptídeosbiologicamente ativos na cultura (vide PCT IL/2005/000228,que é aqui incorporada por referência), demonstrando aprodução de Interferons β Humano biologicamente ativos,Fator X Humano, Glucocerebrosidase Humana e proteína dadoença de bursa infecciosa VPII. A Glucocerebrosidaserecombinante de origem de célula vegetal está atualmentesendo avaliada para uso futuro como tratamento para a Doençade Gaucher.

Administração oral macromoléculas recombinantes de origem vegetal biologicamente ativas:

o uso de plantas transgênicascomestíveis para apresentar agentes recombinantesbiologicamente ativos foi perseguido desde o primórdio daengenharia genética agrícola. A transformação cie plantaçõesde folhas comestíveis como alface, cereais como: milho,arroz, cevada e aveia, legumes como soja e ervilha, e frutase vegetais como batata, cenoura, tomate e banana foraminvestigados peara a administração eficaz de vacinasrecombinantes. A vacinação oral de DNA via plantastransgênicas comestíveis (milho, batatas) expressando paraproteínas antigênicas foram demonstradas com sucesso.Respostas imunes da mucosa ou soro foram detectadas contra asubunidade B da toxina da cólera em camundongos alimentadoscom batatas transgênicas, contra antígeno enterotoxina LT-Bem humanos alimentados com tubérculos de batatastransgênicas (Mason et al, Vaccine 1998;16:1336-1340),contra antígeno de superfície da hepatite B em humanos ecamundongos alimentados com lupina e alface transgênicas(Kapusta et al FASEB J, 1999; 13: 1796-99) e tomatillatransgênica (Gao et al; W Jour Gastroent. 2003;9:996-1002.Vacinas para HIV e HBV com muiticomponentes comestíveisforam recentemente testadas em tomates (Shchelkunov, et al,Vestn. Ross.Akad Med Nauk 2004; 11:50-55); e uma vacinamulticomponente de batata comestível foi recentementetestadas com sucesso contra cólera, rotavírus e ETEC (parauma análise recente, vide Korban et al, J Am Col Nutr 2002;21 :212S-217S) . Webster et al (J of Virol, 2 002; 76:7910-12)relatou a imunização bem sucedida e estimulo dos camundongoscontra sarampo com vacina da proteína hemoglutinina do vírusdo sarampo derivado da batata. Smart et al (J Immunol 2003;171: 2116-26) mostraram que a lupina transgênica dealimentação expressando antígenos de semente de girassolpode apresentar camundongos com proteção a partir das asmaexperimental.

Várias abordagens para apreparação e uso do material de plantas transgênicas para aadministração oral foram propostas. Kirk et al (Pedido dePatente US No: 20040175440) revela a preparação dehomogenatos secos estáveis de plantas transgênicasexpressando uma proteína heteróloga, e a administração oraldos homogenatos, compreendendo peptídeos e polipeptideosrecombinantes associados com fertilização como glicoproteínade zona pelúcida, GnRH, LHRH, LH, LDH e antígenos anti-espermas, para a indução de anticorpos contraceptivoseficazes. Brandle et al (US Patent Application No:02/137,647 filed May 3, 2002) revelam a produção de plantastransgênicas (em plantações comestíveis e não comestíveis)expressando auto-antígenos humanos e/ou citocinas, assimcomo métodos para a extração das moléculas biologicamenteativas, para a modulação da doença auto-imune, por exemplo.A Doença de Intestino Inflamado (IBD) e diabetes, porestímulo da tolerância oral para auto-antígenos ativos.

Entretanto, nenhuma dastécnicas anteriores acima mencionadas mostra a administraçãos i s t êmi ca de peptídeos e/ou polipeptídeos recombinantes àcirculação sangüínea e/ou aos órgãos internos ou sistemas deórgãos via administração oral da cultura da célula vegetaltransgênicas expressando macromoléculas recombinantesbiologicamente ativos.Há assim uma necessidadeamplamente reconhecida e seria altamente vantajoso termétodos e composições para a administração entérica (porexemplo, oral) ou da mucosa das macromoléculasbiologicamente ativas via administração de células vegetaistransgênicas .

RESUMO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto dapresente invenção é apresentado um método de administraçãosistemática uma biomolécula recombinante biologicamenteativa, em uma forma biologicamente ativa, a um indivíduo comnecessidades desta, o método compreendendo, a administraçãovia oral ou mucosa a um indivíduo uma quantiaterapeuticamente eficaz de células vegetais expressando umabiomolécula exógena recombinante biologicamente ativa, assimadministrando de forma sistemática a biomolécularecombinante biologicamente ativa, em uma formabiologicamente ativa, ao indivíduo.

De acordo com um outro aspectoda presente invenção é apresentado um método deadministração local de uma biomolécula recombinantebiologicamente ativa, em uma forma biologicamente ativa, aum indivíduo com necessidades desta, o método compreendendo,a administração oral ou via mucosa a um indivíduo de umaquantidade terapeuticamente eficaz de células vegetaisexpressando uma biomolécula exógena recombinantebiologicamente ativa, assim administrando localmente abiomolécula recombinante biologicamente ativa, em uma formabiologicamente ativa, ao indivíduo.

De acordo com outrascaracter!sticas nas configurações preferidas da invençãoabaixo descrita, as células vegetais compreendem uma paredecelular substancialmente intacta.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas ascélulas vegetais compreendem uma membrana celularsubstancialmente intacta.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas ascélulas vegetais compreendem uma parede celular e umamembrana celular substancialmente intactas.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas ascélulas vegetais são administradas como células isoladas.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas ascélulas vegetais são administradas como células vegetaisdesidratadas.

De acordo com ainda outroaspecto da presente invenção é apresentada uma composiçãofarmacêutica compreendendo como um ingrediente ativo,células vegetais expressando uma biomolécula exógenarecombinante biologicamente ativa e um portadorfarmaceuticamente aceitável.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, oportador farmaceuticamente aceitável é um portador nãoimunogênico.

De acordo com outrascaracteristicas nas configurações preferidas descritas, oportador farmaceuticamente aceitável não estimula o tecidolinfático associado ao intestino.

De acordo com um outro aspectoda presente invenção, é apresentada uma forma de unidade dedosagem para administração local de uma biomoléculabiologicamente ativa em um indivíduo, a forma de unidade dedosagem compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficazde células vegetais expressando a biomolécula exógenabiologicamente ativa.

De acordo com um aspectoadicional da presente invenção é apresentada uma forma deunidade de dosagem para administração sistêmica de umabiomolécula biologicamente ativa em um indivíduo a forma deunidade de dosagem compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz das células vegetais expressando abiomolécula exógena biologicamente ativa.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas aforma de unidade de dosagem é formulada para administraçãooral.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, aforma de unidade de dosagem é formulada por administraçãovia mucosa.De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas ascélulas vegetais compreendem células vegetais desidratadas.

De acordo com um aspecto dapresente invenção é apresentado um método para tratamento deuma doença em um indivíduo com necessidades deste, o métodocompreendendo a administração entéric a ou vid mu cosa aoindivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz dascélulas vegetais expressando uma biomolécula exógenabiologicamente ativa, assim tratando a doença no indivíduo.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas abiomolécula biologicamente ativa compreende proteínaglucocerebrosidase humana recombinante e a doença é a doençade Gaucher.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, abiomolécula biologicamente ativa compreende a proteínaglucocerebrosidase humana recombinante e a doença é a doençade Fabry.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, abiomolécula biologicamente ativa compreende proteínaglucocerebrosidase humana recombinante e a doença é'a doençade câncer.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas ondea doença é uma doença sistêmica.De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, adoença é uma doença crônica.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, adoença é uma doença aguda.

De acordo com um outro aspectoda presente invenção é apresentado o uso de células vegetaisexpressando uma biomolécula exógena biologicamente ativapara a fabricação de um medicamento.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, ascélulas vegetais compreendem uma parede celularsubstancialmente intacta.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, ascélulas vegetais compreendem uma membrana célulasubstancialmente intacta.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, ascélulas vegetais compreendem uma parede celularsubstancialmente intacta e membrana celular.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, ascélulas vegetais são administradas como células isoladas.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, ascélulas vegetais são administradas como células vegetaisdesidratadas.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, abiomolécula recombinante é um polinucleotídeo ou urapolipeptidio.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, abiomolécula recombinante é um polipeptidio.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, abiomolécula recombinante é uma biomolécula terapêutica, umabiomolécula de diagnóstico e uma cosmecêutica.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, ascélulas vegetais desidratadas ainda compreendem umexcipiente.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, ascélulas vegetais compreendem células vegetais alfafa.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, ascélulas vegetais compreendem células vegetais obtidas dotabaco.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, acélula vegetal compreende células vegetais obtidas da linhacelular do tabaco.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, ascélulas vegetais compreendem células de raízes vegetais.

De acordo com outrascaracter!sticas nas configurações preferidas descritas, ascélulas de raízes vegetais são selecionadas a partir dogrupo consistindo da célula de raiz transformada deAgrobacterium rihzogenes, célula de aipo, célula degengibre, célula de rábano silvestre e célula de cenoura.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, ascélulas de raízes vegetais são células de cenoura.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas abiomolécula recombinante é selecionada a partir do grupoconsistindo de uma proteína' procariótica, uma proteínaeucariótica, uma proteína quimérica e uma proteína viral.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, aproteína viral é a proteína viral do vírus da doença debursa infecciosa VPII.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, aproteína eucariótica é interferon-β humano.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, aproteína eucariótica é um Fator Coagulante Humano.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, aproteína eucariótica é um Fator X Coagulante Humano.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, aproteína eucariótica é uma enzima lisossômica humana.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, aproteína eucariótica é uma glucocerebrosidase humana.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, aproteína eucariótica uma alfa-galactosidase humana.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, aproteína eucariótica é um hormônio humano do crescimento.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, aproteína eucariótica é FSH.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, aproteína eucariótica é acetilcolina esterase.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, abiomolécula recombinante é não imunogênica.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, omedicamento é formulado por administração sistêmica.

De acordo com outrascaracterísticas nas configurações preferidas descritas, omedicamento é formulado por administração local.A presente invenção direcionaos atalhos das configurações já conhecidas apresentandométodos e composições para a administração entérica ou viamucosa das macromoléculas biologicamente ativas adequadaspara administração sisuêmica ou local.

A menos que de outra formadefinidos, todos os termos técnicos e científicos aquiusados possuem o mesmo ' significado como comumentementeentendido por um especialista na técnica ao qual estainvenção pertence. Apesar dos métodos e materiais dapresente invenção similares ou equivalentes àqueles aquidescritos serem possíveis de serem usados na prática outestados, métodos adequados e materiais serão abaixodescritos. No caso do conflito, a especificação da patente,incluindo definições, controlará. Ainda, os materiais,métodos, e exemplos são ilustrativos e não são limitadores.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS.

A invenção é aqui descrita,somente para citar como exemplo, com referência aos desenhosem anexo. Com específica referência agora aos desenhos emdetalhe, é enfatizado que as particularidades mostradas sãopara citar como exemplo e com fins de discussão ilustrativadas configurações preferidas da presente invenção somente, esão apresentadas a fim de estabelecer o que se acredita sera descrição mais útil e prontamente entendida dos princípiose aspectos conceituais- da invenção. Com este propósito,nenhuma tentativa é feita a fim de mostrar detalhesestruturais da invenção com mais detalhes do que onecessário para o entendimento fundamental da invenção, adescrição juntamente com os desenhos torna aparente aosespecialistas na técnica como as várias formas da invençãopodem ser configuradas na prática.

Nos desenhos:

a figura 1 é um gráfico de barras descrevendo a atividadede GCD nos fígados dos camundongos alimentadoscom culturas de cenoura expressando a proteínarecombinante;

a figura 2 é um gráfico de barras descrevendo níveiselevados de hGH em ratos hipofisectomizados quereceberam hGH expressando células BY2 comocomparado aos animais que receberam células BY2naive;

a figuras 3a-b são gráficos de barras descrevendo níveiselevados de hGCD no baço (figura 3a) e fígado(figura 3b) de ratos que receberam célulasvegetais expressando hGCD via oral. Os níveis depico são evidentes 1 hora após a administração;

a figura 4 é um gráfico de barras descrevendo níveiselevados de FSH em soro de ratos que receberamcélulas vegetais expressando FSH via oral. Osníveis de pico são evidentes 10 minutos após aadministração; e

a figura 5 é uma fotomicrográficã mostrando análise WesternBlot apresentando níveis GCD derivados dosextratos celulares secos/liofilizados dascélulas de expressão de GCD.DESCRIÇÃO DA CONFIGURAÇÃO PREFERIDA

A presente invenção é dosmétodos e composições para a administração entérica ou damucosa (por exemplo, oral) das macromoléculas biologicamente ativas que podem ser usadas para fins de diagnóstico,cosmética, profiláticos ou terapêuticos.

Os princípios e operação dapresente invenção podem ser mais bem entendidos comreferência aos desenhos e descrições em anexo.

Antes de explicar no mínimo

uma configuração da invenção em detalhes, deve ser entendidoque a invenção não está limitada a esta aplicação aosdetalhes na descrição a seguir ou exemplificado pelosExemplos. A invenção é capaz de outras configurações ou desere praticada ou executada de várias maneiras. Também, deveser entendido que a fraseologia e a terminologia aquiempregadas é para o propósito de descrição não deve serconsiderado como limitantes.

A produção a base de plantas dos biofarmacêuticos já está no mercado e os testes clínicospara as proteínas terapêuticas derivadas de plantas estão acaminho. Entretanto, a recuperação do produto do meio decultura vegetal ou a biomassa impede o uso comercial emgrande escala destas proteínas recombinantes em termos deeusto-efetivo, produção e atividade.

A administração das proteínasterapêuticas como seguindo mínima ou nenhuma recuperação foianteriormente sugerida (vide exemplo, Ped. Pat. U.S.20040175440, 2003013588 e 20030084484) . Entretanto, atéhoje, nenhuma prova experimental foi apresentada para otransporte atual da proteína recombinante à circulação nempara o órgão alvo ou tecido (i.e., onde o órgão alvo não éparte do trato gastrintestinal).

Enquanto reduzem a presenteinvenção à pratica, os presentes inventores revelaram que aadministração das células vegetais expressando a proteínarecombinante pode ser usado por administração sistêmica,diagnóstico e macromoléculas profiláticas (por exemplo ,proteínas, oligonucleotídeo como antisentido e similares).

Como é ilustrado aqui abaixo ena seção de Exemplos que segue, os presentes inventoresforam capazes de mostrar que a administração oral deculturas de células de cenoura expressandoglucocerebrosidase (GCD) resultaram no acúmulo da enzimaativa nos fígados dos camundongos alimentados com esta (videfigura 1, Exemplo 1). Além da administração oral das célulasvegetais expressando hormônio do crescimento humano (hGH) ,FSH e hGCD para ratos hipofisectomizados mostraram aadministração bem sucedida das proteínas aos órgãos decirculação e periféricos como evidenciado pela análise porELISA (vide Exemplos 2-4).

Assim, a presente invençãoapresenta pela primeira vez a evidência de que as célulasvegetais podem ser usadas como portadores, eficazes paraadministração sistêmica, entérica ou via mucosa debiomolécula biologicamente ativa como proteínas.Assim, de acordo cora umaspecto da presente invenção é apresentado um método deadministração sistemática a uma biomolécula recombinantebiologicamente ativa, em uma forma biologicamente ativa, aum indivíduo com necessidade do mesmo.

0 método destes aspectos dapresente invenção é realizado expressando a biomolécularecombinante biologicamente ativa nas células vegetais; eadministrando de forma entérica (por exemplo , de formaoral) ou via mucosa ao indivíduo uma quantidadeterapeuticamente eficaz das células expressando abiomolécula recombinante biologicamente ativa, assim, aadministração sistemática a proteína recombinantesbiologicamente ativa, em uma forma bio-logicamente ativa, aoindivíduo.

Conforme usada na presente, aexpressão "administração sistemática" refere-se a apresentarórgãos (internos ou externos) do corpo através da circulaçãode sangue.

Como usado no presente, aexpressão "biomolécula recombinante" refere-se a umpolinucleotídeo, um oligonucleotídeo, um polipeptídeo ou umpeptídeo (como um fragmento de peptídeo de um polipeptídeomaior) que é expresso de modo exógeno que é expresso de modoexógeno (mRNA ou nível de proteína) nas células vegetais dapresente invenção usando tecnologia DNA recombinante.

Os exemplos das proteínas quepodem ser expressos de maneira recombinante de acordo com asinstruções da presente invenção incluem, mas sem limitações,proteínas procarióticas, proteínas eucarióticas (por exemplo,mamíferos, vegetais), proteínas quiméricas, proteínas viraise peptídeos. Exemplos específicos incluem, mas semlimitações, anticorpos (por exemplo, caries anti-dentais),hormônios, fatores de crescimento, proteases, . proteínasmatrizes extra-celulares (por exemplo, colágeno) , enzimas,proteína VPII viral do vírus da doença de bursa infecciosa,interferon beta humano, fator coagulante humano, fator Xhumano, enzima lisossomal humana, glucocerebrosidase humana,galactosidase alfa humana, e esterase acetilcolina eproteínas de alta manose [por exemplo, Cox-2 Humano, EGFHumano, ativador plasminogênio do tecido uterino humano(t PA), DNase I Humano, gpl20 recombinante, ativador plasminogênio do tecido humano, tiroglobulina humana (hTG) ,CD4 humano e plasminogênio humano)].

Será apreciado que outrasbiomoléculas possam ser administradas através do uso dasinstruções da presente invenção como oligonucleotídeos queestão envolvidos na paralisação do gene (por exemplo,antisentido, dsRNA, ribozima, DNAzima e similares).

Conforme utilizada napresente, a frase "atividade biológica" refere-se a umaatividade biológica inerente (por exemplo, atividadeenzimática, atividade de ligação) da proteína recombinanteque é preferencialmente não limitada à descoberta de umaresposta imune para intenções de vacinação.Conforme utilizada napresente, a expressão "indivíduo com necessidade deste"refere-se a um organismo animal multicelular (por exemplogalinha, por exemplo, mamífero, por exemplo, humano) quepodem beneficiar (por exemplo, clinicamente e esteticamente)a partir da presente invenção.

Conforme utilizada napresente, a expressão "células vegetais" refere-se a plantasinteiras, porções destas (por exemplo, folha, raiz, fruta,semente) ou células isoladas destas (populações homogêneasou heterogêneas das células) que expressa a biomolécularecombinante biologicamente ativa (exógena).

Conforme utilizada napresente, a expressão "células vegetais isoladas" refere-sea células vegetais que são originadas do tecido celularvegetal desintegrado ou culturas de células vegetais.

Conforme utilizada napresente, a expressão "cultura celular vegetal" refere-se aqualquer tipo das células vegetais nativas (ocorremnaturalmente), linhas de células vegetais e células vegetaisgeneticamente modificadas, que não são unidas para formaruma planta por inteiro, como que no mínimo uma estruturabiológica de uma planta não esteja presente. De modoopcional, a cultura de célula vegetal' deste aspecto dapresente invenção pode compreender um tipo particular de umacélula vegetal ou uma pluralidade dos tipos diferentes dascélulas vegetais. Não deve ser . observado que, de modoopcional, as culturas vegetais caracterizando um tipoparticular da célula vegetal podem ' ser originalmenteα

derivadas de uma pluralidade dos tipos diferentes destascélulas vegetais.

As células vegetais dpresente invenção compreendem uma membrana vegetal intactae/ou parede celular, indicando que nenhuma destruiçãodeliberada destas estruturas é necessária antes daadministração a fim de administrar a molécula bioativa.Assim, preferencialmente, no mínimo 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,80%, 90% ou 100% das células administradas compreendem umamembrana celular e/ou parede celular substancialmenteintacta.

As células vegetais dapresente invenção são originadas de uma planta (ou partedesta), preferencialmente, uma planta comestível, que éacessível à modificação genética de modo que expressa aproteína recombinante nesta.

Exemplos de plantas que podemser usadas de' acordo com este aspecto da presente invençãoincluem, mas sem limitações, musgo, algas, monocotιledôneaou dicotiledônea, assim como outros vegetais. Exemplosincluem, mas sem limitações, plantações de folhosos,plantações de oleaginosos, alfafa, tabaco, tomates, bananas,cenouras, alface, milho, pepino, melão, batatas,, uvas etrevo branco.

A célula vegetal podeopcionalmente ser qualquer tipo de célula vegetal como umacélula de raiz vegetal (i.e. uma célula derivada, obtida, ouoriginalmente com base na raiz vegetal), maispreferencialmente, uma célula de raiz vegetal selecionada dogrupo consistindo de uma célula de aipo, uma célula degengibre, uma célula de rábano silvestre e uma célula decenoura.

De acordo com configuraçãopreferida atualmente conhecida da presente invenção ascélulas vegetais são derivadas de uma cenoura ou de tabaco(vide Exemplos 2-4 da seção de Exemplos abaixo). Seráapreciado que as células vegetais originando-se dasestruturas que não raízes possam ser transformadas comAgrobacterium rhizogenes, induzindo o · desenvolvimentocelular de raiz cabeluda (vide, por exemplo, Patente US No.4.588.693 para Strobel et al), como ainda descrito a seguir.

Assim, como acima descrito e detalhado na seção de Exemplesabaixo, a célula de raiz vegetal pode ser uma célula de raiztransformada Agrobacterium rhizogenes.

As culturas de suspensão sãopreferencialmente usadas de acordo com este aspecto dapresente invenção, apesar das culturas de calos também serempossíveis de serem usadas.

A expressão da proteínarecombinante biologicamente ativa deste aspecto da presenteinvenção na cultura das células vegetais acima descritas éefetuada pela ligação de uma seqüência de ácido nucléicoexpressando a mesma em uma construção de ácido nucléicoadequada para a expressão vegetal. Ainda, uma. expressão daproteína biologicamente ativa deste aspecto da presenteinvenção em células da cultura de célula vegetal acimadescrita é efetuada pela ligação de uma seqüência de ácidonucléico guiando a sobre expressão de um gene vegetal.

Esta construção de ácidonucléico inclui uma região reguladora cis-acting como. umaseqüência promotora para guiar a transcrição da seqüência depolinucleotideo na célula de um modo constitutivo ouinduzivel. O promotor pode ser homólogo ou heterólogo àplanta/célula transformada. Ou, de modo alternativo, estaconstrução de ácido nucléico inclui um elementointensificador/promotor para ser inserido no genoma daplanta em proximidade a um gene vegetal (i.e., sopro).

O promotor pode ser umpromotor vegetal ou um promotor não vegetal que seja capazde guiar altos níveis de transcrição de uma seqüência ligadana célula hospedeira, como nas células vegetais e plantas. 0promotor pode ser constitutivo ou induzivel. Por exemplo, enão por meio de limitação, um promotor induzivel pode ser umpromotor que promove· a expressão ou expressão elevada daseqüência de nucleotídeo de enzima lisossomal após ativaçãomecânica do gene (MGA) da planta, tecido vegetal ou célulavegetal.

Os exemplos de promotoresvegetais constitutivos incluem, mas sem limitações,promotores CaMV3 5S e CaMVl9S, promotor FMV34S, promotorbadnavirus baciliforme da cana-de-açúcar, promotor CsVMV,promotor actina Arabidpsis ACT2/ACT8, promotor ubiquitinaUBQ 1 Arabidpsis, promotor tionina da folha da cevada BTK6,promotor actina do arroz, rbcS, o promotor para a proteínade ligação a/b da clorofila, AdhI, NOS e HMG2, oumodificações ou derivativos deste.

Um promotor induzível por umestimulo é um promotor induzido por um estimulo especificocomo condições de estresse compreendendo, por exemplo, luz,temperatura, químicos, aridez, alta sanilidade, choqueosmótico, condições oxidantes ou em caso de patogenicidade.Normalmente o promotor é induzido antes de a planta sercolhida e como tal, é referido como um promotor pré-colheita. Exemplos de promotores pré-colheita induzíveisincluem, mas sem limitações, o promotor induzível por luzderivado do gene rbcS da ervilha, o promotor do gene rbcS daalfafa, os promotores DRE, MYC e MYB ativos na aridez; ospromotores INT, INPS, prxEa, Ha hspl7.7G4 e RD21 ativos emalta sanilidade e estresse osmótico, e os promotores hsr203Je str246C ativos no estresse patogênico.

0 promotor induzível podetambém ser um promotor induzível pré-colheita por exemplo opromotor induzível MeGA.™ (U.S. Pat. No. 5.639.056). O sinalpreferido utilizado para a rápida indução do promotor MeGA ™ e.uma ferida localizada após a planta ter sido colhida.

A construção de ácido nucléicoda presente invenção pode também compreender uma seqüênciade ácido nucléico codificando um peptídeo de sinal quepermita o transporte da proteína recombinante in-estruturaunido a este a uma organela subcelular dentro da planta,como desejado. Exemplos de organelas subcelulares de célulasvegetais incluem, mas sem limitações, leucoplastos,cloroplastos, cromoplastos, mitocõndria, núcleo,peroxisomas, reticulo endoplasmático e vacúolos.

Os vetores da expressão usadospor transferência ou transformação das células hospedeirasda invenção podem ser ainda modificados de acordo com osmétodos conhecidos aos especialistas para intensificar ouotimizar a expressão do gene heterólogo em plantas e célulasvegetais. Estas modificações incluem, mas sem limitações,elementos reguladores de DNA mutante ρ a ra aumentar a forcado promotor ou para alterar a proteína de interesse, assimcomo otimizar o uso de códons. A construção dos genessintéticos pela alteração do uso de códon é descrita, porexemplo, no Pedido de Patente PCT 93/07278.

A construção do ácido nucléicopode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, umfagemídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomoartificial. Preferencialmente, a construção do ácidonucléico da presente invenção é um vetor plasmídeo, maispreferencialmente um vetor binário.

A expressão "vetor binário"refere-se a uma expressão que carregua uma região Tmodificada do plasmídeo Ti capa ζ de ser multiplicado t anuonas células de E. coli e Agrobacterium, e normalmentecompreendendo gene (s) relatores para transformação vegetalentre as duas regiões limites. Um vetor binário adequadopara a presente invenção inclui pBI21L3, pBI121, pGA432,pGAH, pBIG, pBHOl (Clonetech) , pPI (vide Exemplo 5 da seçãode Exemplos a seguir) ou modificações destes.Será apreciado que a produçãode polipeptideos ativos em alguns casos compreende umaseqüência de eventos, iniciando com a expressão polipeptideoque pode ser seguida pelas modificações tradutóriasposteriores, por exemplo, glicosilação, dimerização,metilação e sulfilação, hidroxilação.

Apesar das plantas seremcapazes de glicolizar as proteínas humanas na posiçãocorreta, a composição dos glicans vegetais complexostotalmente processados difere dos glicans de ligação N dosmamíferos. Os glicans vegetais não têm resíduo ácido siálicoe resíduos de galactose comuns em glicans animais e contêmresíduo de xilose ou fucose com uma ligação que geralmentenão é encontrada em mamíferos (Jenkins et al, 14 NatureBiotech 975-981 (1996); Chrispeels e Faye em plantastransgênicas pp. 99- 114 (Owen, M. e Pen, J. eds. Wiley &Sons, Ν. Y. 1996; Russell 240 Curr. Top. Microbio. Immunol.(1999).

A construção de ácido nucléicoda presente invenção pode ser utilizada para transformar demaneira estável ou de modo passageiro as células vegetais.Na transformação estável, a molécula de ácido nucléico dapresente invenção está integrada no genoma da planta e comotal representa uma característica estável e herdada. Natransformação transitória, a molécula de ácido nucléico éexpressada pela célula transformada, mas não integrada nogenoma e, como tal, representa uma expressão transitória deuma proteína especifica.Há vários métodos de

introduzir genes estrangeiros em plantas monocotiledôneas edicotiledôneas (Potrykus, I. (1991). Annu Rev Plant PhysiolPlant MoI Biol 42, 205-225; Shimamoto, K. et al. (1989).

Plantas de arroz transgênicas férteis regeneradas dosprotoplastos transformados. Nature (1989) 338, 274-276).

Os métodos principais deintegração estável de DNA exógeno em DNA de genoma vegetalincluem duas principais abordagens:(i) Transferência de gene mediado por Agrobacterium. Vide:Klee, H. J. et al . (1987). Annu Rev Plant Physiol 38, 467-486; Klee, H. J. e Rogers, S. G. (1989). Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biologyof Plant Nuclear Genes, pp. 2-25, -J. Schell e L. K. Vasil,eds., xAcademic Publishers, San Diego, CaL; and Gatenby, A.A. (1989). Regulation and Expression of Plant Genes mMicroorganisms, pp. 93-112, Plant Biotechnology, S. Kung andC. J. Arntzen, eds., Butterworth Publishers, Boston, Mass. Éespecialmente favorecido quando células de raiz são usadascomo células hospedeiras.

(ii) Absorção Direta DNA. Vide, por exemplo : Paszkowski, J.et al. (1989). Cell. Culture and Somatic Cell Genenics ofPlants, Vol . 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,pp. 52-68, J. Schell and L. K. Vasil, eds., Academic Publishers, San Diego, CaL; and Toriyama, K. et al. (1988).Bio/Technol 6, 1072-1074 (métodos para absorção" direta deDNA em protoplas tos) . Vide também: Zhang et al. (1988).Plant Cell Rep 7, 379- 384; and Fromm, Μ. E. et al. (1986).Stable transformation of maize after gene transfer byelectroporation. Nature 319, 791-793 (Absorção de DNAinduzida por choques elétricos curtos de células vegetais:.Vide também: Klein et al. (1988). Bio/Technology 6, 559-563; McCabe, D. E. et al. (1988). Stable transformai ion ofsoybean (Glycine max) by particle. acceleration.Bio/Technology 6, 923-926; e Sanford, J. C. (1990).Biolistic plant transformation. Physiol Plant 79, 206-209(Injeção de DNA em células vegetais ou tecidos porbombardeio de partículas) . Vide também: Neuhaus, J. M. etal. (1987). Theor Appl Genet 75, 30-36; e Neuhaus, J. M. eSpangenberg, G. C. (1990). Physiol Plant 79, 213-217 (uso desistemas de micropipeta). Vide U.S. Pat. No. 5.464.765(transformação de fios de fibras de vidro ou carbureto desilicone de culturas celulares, embriões ou tecido decalos). Vide também: DeWet, J. M. J. et al. (1985)."Exogenous gene transfer in maize (Zea mays) using DNA-treated pollen," Experimental Manipulation of Ovule Tissue,G. P. Chapman et al. , eds. , Longman, New York-London, pp.197-209; e Ohta, Y. (1986). High-Efficiency GeneticTransformation of Maize by a Mixture of Pollen and ExogenousDNA. Proc Natl Acad Sci USA 83, 715-719 (incubação direta doDNA com pólen de germinação)

O sistema mediado porAgrobacterium inclui o uso de vetores plasmídeo que contêmsegmentos de DNA definidos que integram no DNA de genomavegetal. Métodos de inoculação do tecido vegetal variamdependendo das espécies vegetais e o sistema deadministração Agrobacterium. Uma abordagem amplamente usadaé o procedimento de disco de folha, que pode ser realizadocom qualquer explante de tecido que apresente uma boa fontepara a iniciação da diferenciação da planta inteira (Horsch,R. B. et al. (1988). "Leaf disc transformation." PlanrMolecular Biology Manual A5, 1-9, Kluwer AcademicPublishers, Dordrecht). Uma abordagem suplementar emprega~osistema de administração Agrobacterium em combinação cominfiltração de vácuo. O sistema Agrobacterium éespecialmente útil na criação de plantas dicotiledonastransgênicas.

Há vários métodos detransferência de DNA direto em células vegetais. Naelectroporação, os protoplastos são brevemente expostos a umforte campo elétrico, com abertura de mini-poros parapermitir que a penetração do DNA. Na microinj eção, o DNA émecanicamente injetado diretamente nas células através demicropipetas. Em bombardeio de micro partículas, o DNA isabsorvido em microprojéteis como cristais de sulfato demagnésio ou partículas de tungstênio e os microprojéteis sãofisicamente acelerados em células ou tecidos vegetais.

Apesar da transformaçãoestável ser atualmente preferida, a transformaçãotransitória de, por exemplo, células de folhas, célulasmeristemáticas, ou a planta inteira é- também contempladapela presente invenção. Entretanto, -neste caso as medidassão tomadas para excluir seqüências virais ou genes deseleção (por exemplo, resistência à antibióticos) para finsreguladores.

A transformação transitóriapode ser efetuada por quaisquer métodos de transferênciadireta de DNA acima descritos usando vírus vegecaismodific a dos .

Os vírus que foram mostradosúteis para a transformação dos hospedeiros vegetais incluemvírus do mosaico da couve-flor (CaMV), vírus do mosaico detabaco (TMV), e baculovírus (BV) . A transformação de planas usando vírus é descrita, por exemplo: U.S. Pat. Mo.4.855.237 (vírus do mosaico dourado do feijoeiro, BGMV); EPA67.553 (TMV); Pedido Japonês Publicado No. 63-14693 (TMV);EPA 194,809 (BV) ; EPA 278,667 (BV) ; e Gluzman, Y. et al.

(1988). Comunicações na Biologia Molecular: Vetores Virais,Cold Spring Harbor Laboratory,. New York, pp. 172-189. 0 usode partículas de pseudovírus DNA estrangeiro de expressão emmuitos hospedeiros, incluindo plantas, é descrito em WO87/06261.

A construção dos vírus RNxAvegetais para a introdução e expressão das seqüências deácido nucléico exógeno não . viral em plantas é demonstradapelas referências acima assim como por: Dawson, W. 0. et al.

(1989) . A tobacco mosaic virus-hybrid expresses and loses anadded gene. Virology 172, 285-292; French, R. et al. (1986)

Science 231, 1294-1297; e Takamatsu, N. et al. (1990) .Production of enkephalin in tobacco protoplasts usingtobacco mosaic virus RNA veçtor. FEBS Lett 269, 73-76.

Se o vírus de- transformação éum vírus DNA, um especialista na técnica poderá realizarmodificações adequadas ao próprio vírus. De modoalternativo, o vírus poderá primeiro ser clonado em umplasmido para facilitar a construção do vetor viral desejado com o DNA estrangeiro. 0 vírus pode, então, ser removido doplasmido. Se o vírus é um vírus de DNA, uma origembacteriana da réplica pode ser anexada ao DNA viral, que é,então, replicado pela bactéria. A transcrição e tradução doDNA produzirá a proteína de cobertura, que encapsulará o DNA viral. Se o vírus for vírus RNA, o vírus é geralmenteclonado como um cDNA e inserido em um plasmido. 0 plasmido éentão usado para fazer todas as construções genéticasvegetais. 0 vírus RNA é então transcrito da seqüência viraldo plasmido, seguido pela tradução dos genes virais para produzir as proteínas de revestimento que encapsulam o RNAviral.

A construção dos vírus RNAvegetais para a introdução e a expressão nas plantas dasseqüências' do viral ácido nucléico exógeno não viral, como aquelas incluídas na construção da presente invenção, édemonstrado nas referências acima assim como in U.S. Pat.No. 5.316.931.

Em uma configuração, éapresentado para inserção um ácido nucléico viral vegetal, compreendendo um apagamento da seqüência de codificação daproteína de revestimento._nativa do ácido nucléico viral, umaseqüência de codificação da proteína de revestimento viralvegetal não-nativa (estrangeira), e um promotor não-nativo,preferencialmente o promotor sufcgenômico da seqüência decodificação da proteína de revestimento não-nativa, ecompetente da expressão no hospedeiro vegetal, envolvendo oácido nucléico viral vegetal, e assegurando uma infecçãosistêmica do hospedeiro pelo ácido nucléico recombinanteviral vegetal. De modo alternativo, a seqüência decodificação da proteína de revestimento nativa pode serfeita de modo não transcrito por inserção da seqüência deácido nucléico não-nativo dentro nela, de modo que umaproteína não nativa seja produzida. A construção de ácidonucléico recombinante viral vegetal pode conter um ou maispromotores subgenômicos não nativos adicionais. Cadapromotor subgenômico não-nativo é capaz de transcrever ouexpressar os genes adjacentes ou seqüências de ácidonucléico no hospedeiro vegetal e incapaz da recombinação umcom outro e com promotores subgenômicos nativos. xAinda, aconstrução de ácido nucléico recombinante viral vegetal podeconter um ou mais elementos reguladores cis-acting, comointensificadores, que ligam um regulador de execução eregulam a transcrição de uma seqüência de codificaçãolocalizada abaixo deste. Seqüências de ácido nucléico não-nativo podem ser inseridas adjacentes ao promotorsubgenômico viral vegetal nativo ou os promotoressubgenômicos virais vegetais nativos e não-nativos se maisde uma seqüência de . ácido nucléico for incluída. Asseqüências de ácido nucléico não nativo são transcritas ouexpressadas na planta hospedeira sib controle dos promotoressubgenômico promotor(s) para produzir os produtos desejados.Em uma segunda configuração,uma construção de ácido nucléico viral vegetal recombinanteé apresentada como na primeira configuração com exceção daseqüência de codificação da proteína de revestimento nativaque é colocada adjacente aos promotores subgenômicos daproteína de revestimento não-nativa ao invés de a umaseqüência de codificação da proteína de revestimento não-nativa.

Em uma terceira configuração,uma construção de ácido nucléico viral vegetal recombinanteé apresentada, compreendendo um gene de proteína derevestimento nativo colocado adjacente ao seu promotorsubgenômico ou mais promotores subgenômicos inseridos naconstrução do ácido nucléico viral. Os promotoressubgenômicos não-nativos são capazes de transcrever ouexpressar genes adjacentes em hospedeiros vegetais e sãoincapazes da recombinação um com o ouro e com promotoressubgenômicos nativos. Seqüências de ácido nucléico não-nativos podem ser inseridas adjacentes aos promotores viraisvegetais subgenômicos não-nativos de modo que as ditasseqüências são transcritas ou expressadas na plantahospedeira sob controle dos promotores subgenômicos paraproduzir o produto desejado.

Em uma quarta configuração,uma construção de ácido nucléico viral vegetal recombinanteé apresentada como na terceira configuração, exceto que aseqüência de codificação da proteína de revestimento nativaé substituída por uma seqüência de codificação da proteínade revestimento não-nativa.

Vetores virais sãoencapsulados pelas proteínas revestidas expressascodificadas pela construção de ácido nucléico viral vegetalrecombinantes como acima descrito, para produzir um vírusvegetal recombinante. A construção de ácido nucléico viralvegetal recombinante ou vírus vegetal recombinante é usadopara infectar plantas hospedeiras apropriadas. A construçãode ácido nucléico viral vegetal recombinante é capaz de replicar em uma disseminação sistêmica hospedeira dentro dahospedeira, e a transcrição ou expressão de um ou mais genesestrangeiros (ácido nucléico isolado) na hospedeira parasproduzir a proteína desejada.

Em uma outra configuração, c veiculo de transformação compreende seqüências de víruscompreendendo polimerase RNA dependente de RNA (RdRp) ,promotor subgenômico e/ou seqüências de proteína demovimento parcial ou completo onde todos os fragmentos deácido nucléico acima são clonados em um vetor binário. (Gleba et. al, Current Opinion in Plant Biology 2004, 7:182-188) . Além do acima mencionado, a molécula de ácido nucléicoda presente invenção pode também ser . introduzida em umgenoma cloroplasto assim possibilitando a expressão.

Uma técnica para introduzir as seqüências de ácido nucléico exógeno ao genoma doscloroplastos é conhecida. Esta técnica envolve os seguintesprocedimentos. Primeiro, as células vegetais sãoquimicamente tratadas de modo a reduzir o número decloroplastos por célula para um. Então, o ácido nucléicoexógeno é introduzido nas células preferencialmente atravésde bombardeio de partículas, com o objetivo de introduzir nomínimo uma molécula de ácido nucléico exógeno noscloroplastos. 0 ácido nucléico exógeno é selecionado por umespecialista na técnica que seja capaz de integração nogenoma do cloroplasto através da recombinação homóloga, queé prontamente efetuado pelas enzimas inerente aocloroplasto. Com este fim, o ácido nucléico exógenocompreende, além de um gene de interesse, no mínimo umaseqüência de ácido nucléico derivada do genoma docloroplasto. Ainda, o ácido nucléico exógeno compreende ummarcador selecionável, que pelos procedimentos de seleçãoseqüencial servem para permitir que um operário certifique-se de que todas ou quase todas as cópias do genoma docloroplasto seguindo esta seleção, inclua o ácido nucléicoexógeno. Maiores detalhes com relação a esta técnica sãoencontrados nas Pat. U.S. Nos. 4.945.050 e 5.693.507, queestão aqui incorporados por referência. Um polipeptídeopode, assim, ser produzido pelo sistema de expressão daproteína do cloroplasto e torna-se integrado na membranainterna do cloroplasto.

Independente do métodoempregado, seguindo a transformação, ocorre a propagação daplanta. Neste caso, a micropropagação é realizada paraincluir cultura de tecido inicial; multiplicação de culturade tecido para obter células suficientes para outros usos.

Métodos de cultura de célulavegetal são bem conhecidos na técnica. As condições decultura (por exemplo, meio de cultura, temperatura, ambientede gás, bioreator) podem ser ajustadas de acordo com acélula vegetal usada e a proteína expressada para alcançaruma ótima expressão. Tipicamente, a cultura é realizada sobcondições de cultura de célula vegetal padrão através do usode qualquer meio de cultura vegetal convencional. Seráapreciado que o meio de cultura vegetal inclua tanto o meioaquoso quando o meio seco e concentrado ao qual água podeser adicionada para produzir meio aquoso para a cultura decélulas vegetais (vide por exemplo, Pat. U.S. Nos. 6.020.169e 6.589.765).

Exemplos de meio de culturavegetal que possa ser usado de acordo com a presenteinvenção incluem, mas sem limitações, os seguintes meios bemconhecidos: Anderson (Anderson, In Vitro 14:334, 1978;Anderson, Act. Hort, 112:13, 1980), Chee and Pool (Sei.Hort. 32:85, 1987), CLC/Ipomoea (CP) (Chee et al, J. Am.Soe. Hort. Sei. 117:663, 1992), Chu (N.sub.6) (Chu et al.,Scientia Sinic. 18:659, 1975; Chu, Proc. Symp. Plant Tiss.Cult., Peking 43, 1978), DCR (Gupta and Durzan, Plant CellRep. 4:177, 1985), DKW/Juglans (Driver and Kuniyuki,HortScience 19:507, 1984; McGranahan et al. , in: Bonga andDurzan, eds., Cell and Tissue Culture in Forestry, MartinusNijhoff, Dordrecht, 1987), De Greef and Jacobs (De Greef andJacobs, Plant Sei. Lett. 17:55, 1979), Eriksson (ER)(Eriksson, Physiol. Plant. 18:976, 1965), Gamborg1S B-5(Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50:151, 1968), Gresshoff andDoy (DBM2) (Gresshoff and Doy, Z Pflanzenphysiol. 73:132,1974), Heller1S (Heller, Ann. Sei. Nat. Bot. Biol. Veg. IlthSer. 14:1, 1953), Hoagland1S (Hoagland and Arnon, Circular347, Calif. Agr. Exp. Stat, Berkeley, 1950), Kao andMichayluk (Kao and Michayluk, Planta 125:105, 1975),Linsmaier and Skoog (Linsmaier and Skoog, Physiol. Plant.18:100, 1965), Litvay1S (LM) (Litvay et al. , Plant Cell Rep.4:325, 1985), McCown1S Woody Plant médium (Lloyd and McCown,Proc. Int. Plant Prop. Soe. 30:421, 1981), Murashige andSkoog e várias modificações bem conhecidas destes (Murashigeand Skoog, Physiol. Plant. 15:473, 1962), Nitsch and Nitsch(Nitsch and Nitsch, Science 163:85, 1969), Quoirin andLepoivre (Quoirin et al. , C. R. Res. Sta. Cult. Fruit Mar.,Gembloux 93, 1977), Schenk and Hildebrandt (Schenk andHildebrandt, Can. J. Bot. 50:199, 1972), White1S (White, TheCultivation of Animal and Plant Cells, Ronald Press, NY,1963), etc. Um número deste meio de cultura vegetal estãocomercialmente disponíveis da Sigma (St. Louis, Mo.) eoutros fornecedores como meio seco (em pó) e misturas desais de base secos, por exemplo.

Preferencialmente, a cultura éefetuada com o uso de dispositivo de cultura vegetaldescartável de alta produção, que foi mostrou-se eficaz paraa produção de peptídeos e polipeptídeos biologicamenteativos na cultura (vide PCT IL/2005/00022 8, que é aquiincorporado como referência).

Este dispositivo, enquantoessencialmente descartável, é caracterizado compreendendouma saída de coleta reutilizável para possibilitar acolheita de no mínimo uma porção das células contidas nomeio, assim, possibilitando que o dispositivo seja usado deforma contínua para um ou mais ciclos de cultura/colheitasubseqüentes. Em um ambiente industrial, a esterilidade dasaída de colheita durante e após a colheita, pode serassegurada a um significante alto grau com um custorelativamente baixo, apresentando, por exemplo, uma tampaestéril em que todas as conexões e desconexões necessáriasdos serviços e do dispositivo podem ser realizadas. Quando,eventualmente, o dispositivo torna-se contaminado, ele podeentão ser descartado com uma perda econômica relativamentebaixa. Estes dispositivos podem ser produzidos de formabarata, mesmo para a produção de volumes de 50 ou 100 litros ou mais de cultura. Ainda, a habilidade de realizar umnumero de ciclos de cultura/colheita é economicamentelucrativa, reduzindo até mesmo o custo efetivo pordispositivo.

Uma bateria destes

dispositivos pode ser economicamente arranjada, e o númerode dispositivos na bateria pode ser controlado para combinarbastante a produção com a demanda. Assim, a transição dosbiorreatores da planta pilotos com a produção em grandeescala pode também ser alcançado de uma maneira relativamente simples e econômica através da adição de maisdispositivos à bateria. Ainda, o volume de produçãorelativamente baixo de cada dispositivo, acoplado com afalta de misturadores sólidos, resulta em produçõesrelativamente mais altas como comparado com os típicosbiorreatores em aço inoxidável.

Assim, a cultura das célulasvegetais de acordo com a presente invenção pode serrealizada com o uso de um dispositivo descartável paracultura de modo axênico de células de cultura e colheita emno mínimo um ciclo (como descrito no PCT IL/2005/000228, queé incorporado .aqui por referência). Este dispositivocompreende um recipiente descartável esterilizável tendo umaextremidade superior e uma extremidade inferior, cujorecipiente pode ser, no mínimo, parcialmente preenchido comum meio de cultura celular biológico estéril adequado e/ouinoculante axênico e/ou ar estéril e/ou outros aditivosestéreis necessários, o recipiente compreendendo: (i) umasaída de gás para remover o excesso de ar e/ou gases dorecipiente; (ii) uma entrada de aditivo para introduzir cinóculo e/ou o meio de cultura e/ou os aditivos norecipiente; e caracterizado compreendendo mais (iii) umacolheitadeira reutilizável compreendendo um controlador defluxo para habilitar a colheita de no mínimo uma porçãodesejada do meio contendo as células quando desejado, assim,possibilitando o uso contínuo do dispositivo por no mínimomais um ciclo consecutivo de cultura/colheita, onde umresíduo do meio contendo células, remanescente de um cicloanterior de colheita, pode servir como um inóculo para apróxima cultura e ciclo de colheita, onde o meio de culturae/ou aditivos necessários sejam apresentados.

De modo opcional, o recipientedescartável é transparente e/ou translucente. Também de modoopcional, o dispositivo ainda compreende uma entrada de arpara introdução de gás estéril na forma de bolhas no meio decultura através de uma primeira abertura de entrada, onde aentrada de ar é conectável a um fornecimento de gásadequado. Preferencialmente, a entrada de ar é paraintroduzir gás estéril mais do que uma vez durante acultura. Mais preferencialmente, a entrada de ar é para aintrodução continua de gás estéril. De modo opcional, umapluralidade de gases diferentes é introduzida em tempos e/ouconcentrações diferentes através da entrada de ar.

Preferencialmente, acolheitadeira compreendendo um preventor de contaminaçãopara prevenir de modo substancial a introdução decontaminantes no recipiente através da colheitadeira.

De modo opcional, o recipienteé não rígido. Preferencialmente, o recipiente é feito dematerial plástico não rígido. Mais preferencialmente, omaterial é selecionado de um grupo compreendendopolietileno, policarbonato, a copolímero de polietileno 8nylon, PVC e EVA.

De modo opcional, o recipienteé feito de um laminado de mais de uma camada dos materiais.

De modo opcional, também, orecipiente é formado pela ligação por fusão de duas folhasadequadas do material ao longo das costuras pré-determinadas. Preferencialmente, a entrada de ar compreendeuma tubulação de entrada de ar estendendo-se da abertura deentrada a uma localização dentro do recipiente na suaextremidade inferior ou próxima a ela.

Também preferencialmente, a nomínimo uma entrada de ar compreende uma tubulação de entradade ar menor conectável ao fornecimento de ar adequado e emcomunicação com uma pluralidade de tubulações secundárias deentrada, cada tubulação de entrada secundária estendendo-sea uma localização dentro do recipiente, através de umaabertura de entrada adequada, para a introdução de ar estéril na forma de bolhas no meio de cultura. Maispreferencialmente, o dispositivo compreende uma configuraçãosubstancialmente geométrica em similar a uma caixa, tendo umcomprimento, altura e largura completos. Maispreferencialmente, a razão altura-comprimento fica entre 1 e 3, e preferencialmente em torno de 1.85. De modo opcional, arazão altura para largura fica entre 5 e 30, epreferencialmente 13.

Preferencialmente, odispositivo compreende uma abertura de suportesubstancialmente transpondo a profundidade do dispositivo, aabertura adaptada para possibilitar o dispositivo de serapoiado em um suporte de trave a dequado.

De modo opcional, odispositivo ainda compreende uma estrutura de suporte para apoiar o dispositivo. Preferencialmente, a estrutura desuporte compreende um par de estruturas opostas, cada umadas estruturas compreendendo membros de suporte superior einferior espaçados por uma pluralidade de membros de suportesubstancialmente verticais paralelos adequadamente unidosaos membros de suporte superior e inferior. Maispreferencialmente, a pluralidade de membros verticais desuporte consiste de no mínimo um membro de suporte verticala cada extremidade longitudinal dos membros de suportesuperior e inferior.

Também mais preferencialmente,as estruturas são espaçadas uma da outra por uma pluralidadede barras de espaço de modo liberado ou integral unida àsestruturas.

Também mais preferencialmente,as barras de espaço estão estrategicamente localizadas demodo que o dispositivo pode ser inserido e removido de formarelativa e fácil da estrutura de suporte.

De modo opcional, o membro desuporte inferior de cada estrutura compreende no mínimo umsuporte inferior adaptado para receber e apoiar uma porçãocorrespondente na extremidade inferior do dispositivo.

Preferencialmente, cadasuporte inferior fica em uma forma de placa de formatoadequado projetando de cada um dos membros de suporteinferior na direção da estrutura oposta.

De modo opcional, cadaestrutura compreende no mínimo um interdivisor projetando-sede cada estrutura na direção da estrutura oposta, parapressionar contra a parede lateral do dispositivo em umaposição pré-determinada, de forma que os pares opostos dointerdivisor reduzam de forma eficaz a largura dodispositivo a uma posição pré-determinada.

Preferencialmente, ointerdivisor compreende membros verticais substancialmenteadequados espaçados dos membros de suporte superior einferior em uma direção voltada à estrutura oposta comsuportes adequados superior e inferior.

De modo opcional, a estruturade suporte pode compreender uma pluralidade de rodízios paratransportes dos dispositivos.

De modo opcional, no mínimoalgumas das bolhas de ar compreendem um diâmetro médio deentre 1 mm e 10 mm.

Também, de modo opcional, nomínimo algumas das bolhas de ar compreendem um diâmetromédio de 4 mm.

De modo opcional, o recipientecompreende um filtro adequado montado na saída de gás paraprevenir de modo substancial a introdução dos contaminantesno recipiente através da saída de gás.

Preferencialmente, orecipiente ainda compreende um filtro adequado montado naentrada de aditivos para prevenir de modo substancial aintrodução de contaminantes no recipiente através da entradaaditiva.

Também preferencialmente, háum preventor de contaminação que compreende um recipientepara fluidos em forma de U, onde um braço deste é montado deforma de assepsia a uma saída externa da colheitadeira porum conector desinfetado adequado.

Preferencialmente, acolheitadeira fica localizada na parte inferior daextremidade inferior do recipiente.

Também preferencialmente, acolheitadeira fica localizada perto da parte inferior daextremidade inferior do recipiente, de modo que no final decada ciclo de colheita, o resíduo do meio contendo células,automaticamente permanece na extremidade inferior dorecipiente até o nível abaixo do nível da colheitadeira.

De modo- opcional epreferencialmente, o resíduo do meio contendo células édeterminado no mínimo parcialmente, de acordo com umadistância d2 da parte inferior do recipiente àcolheitadeira.

Preferencialmente, o resíduodo meio contendo células compreende de 0.5% a 4 5% do volumeoriginal do meio de cultura e o inóculo. Maispreferencialmente, o resíduo do meio contendo célulascompreende de 10% a 20% do volume original do meio decultura e o inóculo. Mais preferencialmente, o resíduo domeio contendo células compreende de 0.5%- 2% volume originaldo meio de cultura e o inóculo.

De modo opcional, aextremidade inferior é substancialmente convexa.

Também de modo opcional, aextremidade inferior é substancialmente frusta-conical.

Preferencialmente, orecipiente compreende um volume interno cultivável de entre5 litros e 200 litros, preferencialmente entre 50 litros e150 litros, e preferencialmente 100 litros.

De modo opcional, odispositivo ainda compreende um ligador adequado para ligaro dispositivo a uma estrutura de suporte adequada.Preferencialmente, o ligador compreende um aro de materialadequado preferencialmente ligado de modo integral àextremidade superior do recipiente.

Uma vez que as célulasvegetais expressando proteína recombinante acima mencionadasão obtidas, elas são administradas ao indivíduo.

As células da presenteinvenção podem ser administradas ao indivíduo per se (porexemplo, suspensão ou desidratada) ou em uma composiçãofarmacêutica onde elas sejam misturadas com portadoresadequados ou excipientes.

Conforme usada na presente,uma "composição farmacêutica" refere-se a uma preparação deum ou mais ingredientes ativos aqui descritos com outroscomponentes químicos como portadores e excipientesfisiologicamente adequados. 0 propósito de uma composiçãofarmacêutica é facilitar a administração de um composto a umorganismo.

Conforme usado na presente, otermo "ingrediente ativo" refere-se à proteína recombinanteexpressando células responsáveis pelo efeito biológicopretendido. Como demonstrado no Exemplo 5 da seção dosExemplos que segue, as células da presente invenção podemser desidratadas (por exemplo, compreendem menos de 10% deágua) conforme ainda mantêm a atividade biológica sobdesidratação. Preferencialmente a biomolécula recombinantenão é glicoproteina da zona pelúcida, GnRH, LHRH, LH e LDHem preparações de células desidratadas.

Doravante, as expressões"portador fisiologicamente aceitável" e "portadorfarmaceuticamente aceitável," que podem ser usadas demaneira intercambiável, referem-se a um portador ou umdiluente que não cause irritação significante a um organismoe anulam a atividade biológica e as propriedades do compostoadmi η ι s t r a do. Um adjuvante é incluído sob estas expressões.

Preferencialmente o portador usado é um portador nãoimunogênico e ainda preferencialmente não estimula ointestino associado ao tecido linfático.

Aqui, o termo "excipiente"refere-se a uma substância inerte adicional a uma composiçãofarmacêutica para ainda facilitar a administração de umingrediente ativo. Exemplos, sem limitações, de excipientesincluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, váriosaçúcares, e tipos de amido, derivativos de celulose,gelatina, óleos vegetais, e glicóis de polietileno.

Técnicas para formulação eadministração das drogas podem ser encontradas na últimaedição de "Remington's Pharmaceutical Sciences," MackPublishing Co., Easton, PA, que é aqui totalmenteincorporado por referência.Rotas adequadas da

administração podem, por exemplo, incluir via mucosa ouentéricas.

Conforme utilizada napresente, a expressão "administração entérica" refere-se àadministração através de qualquer parte do tratogastrintestinal, como uma administração retal, administraçãovia cólon, administração intestinal (proximal ou distai) eadministração gástrica. Preferencialmente, administraçãoentérica refere-se à administração oral.

Composições farmacêuticas parauso de acordo com a presente invenção, assim podem serformuladas de modo convencionai com o uso de um ou maisportadores fisiologicamente aceitáveis compreendendoexcipientes e auxiliares, que facilitam o processamento dosingredientes ativos em preparação que possa serfarmaceuticamente usado. Formulação apropriada é dependenteda rota de administração escolhida.

Para administração oral, acomposição farmacêutica pode ser prontamente formulada pelacombinação dos compostos ativos com portadoresfarmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica.Estes portadores possibilitam a composição farmacêutica ' aser formulada como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas,líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões, e similares,para ingestão oral por um paciente. .As- preparaçõesfarmacológicas para uso oral podem ser feitas com o uso deum excipiente sólido. De modo opcional a trituração damistura resultante, e processamento da mistura de grânulos,após adição adequada de auxiliares como desejado, para obtertabletes ou núcleos de drágeas. Excipientes adequados são emparticular, enchimentos como açúcares, incluindo lactose,sucrose, manitol, ou sorbitol; celulose preparação como, perexemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz,amido de batata, gelatina, goma . de tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetil-celulose, e carbometilcelulosede sódio; e/ou polímeros fisiológicos aceitáveis comopolivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentesdesintegrantes, como pirrolidona polivinial de ligaçãotransversal, Agar, ou ácido algínico ou um sal deste, comoalginato de sódio, alginato de sódio, podem ser adicionados.

Confeitos coloridos sãoapresentados com revestimentos adequados. Para este fim,soluções concentradas de açúcar podem ser usadas, o quepode, de modo opcional, conter goma arábica, talco,polivinil pirrolidona, gel de carbopol, glicol polietileno,dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicosadequados. Material corante ou pigmentos podem seradicionados às coberturas de tabletes ou drágeas paraidentificação ou caracterizar diferentes combinações dasdoses de compostos ativos.

Composições farmacêuticas quepodem ser usadas de forma oral incluem cápsulas duras feitasde gelatina, assim como macias, cápsulas lacradas feitas degelatina e piastificante, como glicerol ou sorbitol. Ascápsulas duras podem conter ingredientes ativos na misturacom preenchedor como lactose, ligadores como amidos,lubrificantes como talco ou estearato de magnésio, e, demodo opcional, estabilizadores. Em cápsulas macias, osingredientes ativos podem ser dissolvidos ou suspensos emlíquidos adequados, como óleos graxos, parafina líquida, ouglicóis de polietileno líquido. Ainda, os estabilizadorespodem ser acrescentados. Todas as formulações paraadministração oral devem ser em dosagens adequadas para arota escolhida da administração.

Exemplos de administração viamucosa incluem, mas sem limitações, administração pela boca,administração pela faringe, administração pelo esôfago,administração retal e administração vaginal.

Preferencialmente, o local daadministração via mucosa é pela boca. A administração viamucosa pela boca pode ser realizada por administraçãosublingual, que é administração sistêmica dos agentes ativosatravés das membranas mucosais revestindo a base da boca ouadministração bucal, que é o agente de administraçãoatravés do qual as membranas revestem as bochechas (mucosabucal). A.s formulações que são particularmente úteis para aadministração via mucosa pela boca incluem, mas semlimitações, enxaguatórios bucais, tiras, espumas, gomas demascar, spray oral, pastilha, alimentos, pasta de dente ecápsulas. Uma formulação particularmente preferida é uma goma de mascar.

As formulações, por exemplogomas de mascar podem ser de umidade baixa ou alta, com ousem açúcar, contendo cera ou não, baixa caloria (através debase alta ou agentes de baixa caloria) , e/ou pode conteragentes dentais. Será apreciado que, neste caso, devido àinterrupção da membrana e/ou parede das célulasadministradas, o ingrediente ativo da presente invenção podeser liberado à boca e atuado de forma local (como paratratamento ou diagnóstico das caries dentárias).

Os agentes ativos (i.e.,células vegetais) da presente invenção podem também serencapsulados ou envoltos para dar uma administração tardiadas formulações da mucosa. Qualquer técnica padrão que deencapsulação parcial ou total dos agentes ativos pode serusado. Estas técnicas incluem, mas sem limitações, sprayseco, spray frio, revestimento de leito fluido e acumulação.

Estas técnicas de encapsular podem ser usadas de maneiraindividual em um processo de etapa única ou em qualquercombinação em um processo de etapa múltipla.

Outros métodos de apresentarformulações de administração tardia incluem, mas semlimitações, aglomeração para dar encapsulação parcial,fixação ou absorção que também apresenta encapsulaçãoparcial, e alojamento em um composto retirado.

A quantidade de material derevestimento ou encapsulação no agente ativo também podecontrolar o tempo para sua liberação da goma de mascar.

De modo geral, quanto maior onivel de revestimento, e mais baixo a quantidade de agenteativo, mais lenta a liberação. Métodos e materiais paraformulação de formulações de liberação tardia são conhecidosna técnica. Exemplo, PCT publicação de Ped. Pat. No. WO00/35298 apresenta métodos e materiais para formulação deformulações de liberação tardia em gomas de mascar.

Os agentes ativos da presenteinvenção (i.e. agentes ativos originados de uma culturacelular especifica de fruta) podem ser formulados emdiferentes modos e administrados através do mesmo veiculo.Por exemplo, os agentes ativos poderiam ser encapsulados para liberação rápida, liberação moderada, e liberação lentano mesmo veiculo. Além disso, os agentes ativos da presenteinvenção podem ser acrescentados a um revestimento de gomapara liberação rápida e também acrescentados a um centro degoma com ou sem encapsulação para liberação lenta. Absorção mais rápida pode ser afetada pelo aumento de níveis de saborassim como a adição de outros componentes de sabor, comomentol e derivados de mentol, limoneno, carvona, isomentol,eucaliptol, mentona,' pineno, cânfora e derivados, assim comoprodutos naturais de monoterpeno, derivados de monoterpeno,e sesquaterpenos, incluindo cariofileno e copaeno.

A formulação pode incluiroutros agentes que podem intensificar a penetração dosagentes ativos através da mucosa e no sangue. Exemplosdestes agentes incluem, mas sem limitações éter lauril 23,Aprotinina, Azone, Cloreto de Benzalcônio, Cloreto deCetilpiridinio, Brometo de Cetiltrimetilamonio,Ciclodextrina, Sulfato de Dextrano, Ácido Lauril, ÁcidoLauril/Propileno Glicol, Lisofosfatidilcolina, Mentol,Metoxisalicilato, Metil oleato, Ácido Oléico,Fosfatidilcolina, Polioxietileno, Polisorbato 80, SódioEDTA, Glicocolato de sódio, Glicodeoxicolato de sódio,Lauril Sulfato de Sódio, Salieilato de sódio, Taurocolato desódio, Taurodeoxicolato de sódio, Sulfoxida e váriosglicosados de alquila.

Outras modificações podemtambém afetar a taxa de liberação dos agentes ativos namucosa. Modificadores de textura para amaciar a base podemproporcionar liberação mais rápida onde as bases duras podemproporcionar uma liberação mais lenta. A adição de materiaisalcalinos como bicarbonato de sódio ou hidróxido de sódiopode tornar a saliva levemente alcalina, que pode aumentar aabsorção bucal/Ungueal do medicamento no fluxo sangüíneo.

Liberação dos agentes ativosda presente invenção pode também ser afetada pela forma etamanho da formulação. Por exemplo, lascas planas de gomacom grande área de superfície podem liberar mais rapidamenteativos na saliva a partir da goma quando mascada, ao passoque pedaços em cubos ou arredondados podem liberarmedicamentos e ativos mais lentamente.

Tablete de goma de mascar érevelado na Publicação da Patente U.K. No. 1.489.832; U.S.Patente No. 4.753.805;Publicação de Patente EP No. O 221850; e Publicação de Patente Italiana No. 1.273.487. Estaspatentes revelam agentes ativos adicionados à goma de mascarque é, então, tomada a forma de tabletes. Agentes decoloração podem também ser adicionados às formulações. Osagentes de coloração observados pela presente invençãoincluem os corantes alimentícios. Os moldes de filme,preferencialmente adicionados, ao xarope, incluem metilcelulose, gelatinas, hidroxipropil celulose, etil celulose,hidroxietil celulose, carboximetil celulose e similares ecombinações destes. De acordo com uma configuraçãopreferida, as culturas de células de frutas da presenteinvenção são apresentadas em uma concentração, não colorante.

Deve-se observar que as células vegetais expressando a biomolécula recombinante dapresente invenção podem ser formuladas em uma forma deunidade de dosagem (como uma forma oral de unidade dedosagem).

Determinação de uma quantidade terapeuticaraente eficaz é bem dentro da capacidade dosespecialistas na técnica, especialmente em vista darevelação detalhada aqui apresentada.

Para qualquer preparaçãoutilizada nos métodos da invenção, a dosagem ou a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimulada inicialmente deanálises in vitro e de cultura celular. Por exemplo, umadose pode ser formulada nos modelos animais para alcançaruma concentração desejada ou titragem. Esta informação podeser usada para determinar de forma mais precisa as doses nos humanos.

A toxidade e eficáciaterapêutica dos ingredientes ativos aqui descritos podem serdeterminadas por procedimentos farmacêuticos padrão invitro, em culturas celulares ou experiências com animais. Osdados obtidos destas análises in vitro e de cultura celulare estudos em animais podem ser usados na formulação de umavariação de dosagem para uso em humanos. A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem empregada e a rota deadministração utilizada. A formulação exata, rotas deadministração, e dosagem podem ser escolhidas pelo médico doindivíduo com base na condição do paciente. (Vide, porexemplo, Fingi, E. et al. (1975), "The Pharmacological Basisof Therapeutics," Ch. 1, p.l.).

A quantidade de dosagem eintervalos de administração podem ser ajustados de formaindividual para apresentar plasma suficiente ou níveiscerebrais do ingrediente ativo para induzir ou suprimir o efeito biológico (i.e., concentração minimamente eficaz,MEC) . 0 MEC variará para cada preparação, mas não podeestimar dados in vitro. As dosagens necessárias paraalcançar o MEC devem depender das característicasindividuais e rotas de administração. As análises de detecção podem ser usadas para determinar as concentraçõesde plasma.

Dependendo da severidade ecorrespondência da cond χ c ao a ser tratada, a dosagem podeser de administração única ou plural, com curso de tratamento durando de vários dias a várias semanas, ou atéque a cura seja realizada ou a diminuição de um estado dadoença seja alcançado.

A quantidade de uma composiçãoa ser administrada será, é claro, dependente do indivíduosendo tratado, a severidade da aflição, o modo deadministração, o julgamento da prescrição médica, etc.

Composições da presenteinvenção podem, se desejado, serem apresentadas em um pacoteou dispositivo dispensador, como um kit aprovado pela FDA,que poderá conter uma ou mais formas de unidade de dosagenscontendo o ingrediente ativo. 0 pacote poderá, por exemplo,compreender folha de metal ou plástico, como um pacote emforma de ampola. O pacote ou dispositivo dispensador poderáestar acompanhado por instruções para administração. Opacote ou dispositivo dispensador poderá, também, estaracompanhado por um aviso na forma prescrita por uma agênciagovernamental regulando a fabricação, uso, ou venda defarmacêuticos, cujo alerta é reflexivo de aprovação pelaagência da forma das composições para administração humanaou veterinária. Esta notificação, por exemplo, poderáincluir rótulo de aprovado pela Agência Norte-Americana paraos Medicamentos e Alimentos para prescrição de drogas ou deuma inserção de produtos aprovados. A.s composiçõescompreendendo uma preparação da invenção formulada em umportador farmaceuticamente aceitável poderá também serpreparado, colocado em um recipiente apropriado, e rotuladopara tratamento de uma condição adequada, como maisdetalhada acima.

As proteínas recombinantesadministradas como descrito pode encontrar numerosos usos emterapia, diagnósticos e cosmética.Assim, por exemplo, asinstruções acima descritas podem, ser usadas para tratar dequalquer doença (i.e., crônica ou aguda) ou condições em quea administração da biomolécula da presente invenção possaser terapeuticamente benéfica. Por exemplo, os presentesinventores mostraram um acúmulo de GCD nos fígados doscamundongos alimentados com a enzima sugerindo seu uso notratamento da doença de Gaucher.

Exemplos de outras doenças que podem ser tratadas com o uso de instruções da presenteinvenção incluem, mas sem limitações:

Doenças inflamatórias

incluem, mas sem limitações, doenças inflamatórias crônicase doenças inflamatórias agudas.

Doenças Inflamatóriasassociadas com hipersensibilidade

Exemplos de Hipersensibilidadeincluem, mas ■ sem limitações,' Hipersensibilidade Tipo I,Hipersensibilidade Tipo II, Hipersensibilidade Tipo III,

Hipersensibilidade Tipo IV, Hipersensibilidade imediata,

Hipersensibilidade mediada por anticorpos,

Hipersensibilidade mediada por imuno complexo,

Hipersensibilidade mediada por linfócito T e DTH.

Hipersensibilidade imediata ou

Tipo I, como a asma.

Hipersensibilidade Tipo IIincluem, mas sem limitações, doenças reumatóides, doençasreumatóides auto-imunes, artrite reumatóide (Krenn V. et al,Histol Histopathol Jul/2000;15 (3):791), espondilite,espondilite anquilosante (Jan Voswinkel et al, Arthritis Res2001; 3 (3) : 189), doenças sistêmicas, doenças sistêmicasauto-imune, lúpus eritematoso sistêmico (Erikson J. et al,Immunol Res 1998;17 (1-2):49), escleroses, esclerosessistêmicas (Renaudineau Y. et al, Clin Diagn Lab Immunol.1999 Mar; 6 (2): 156); Chan OT. et al, Immunol RevJun/1999;169:107), doenças glandulares, doenças glandularesauto-imunes, doenças pancreáticas auto-imunes, diabete,diabete Tipo I (Zimrnet P. Diabetes Res Clin PractOut/1996;34 Suppl:S125), doenças da tireóide, doenças auto-imune da tireóide, doença de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol

Metab Clin North Am Jun/2000;29 (2):339), tiroidismo,tiroidismo espontâneo auto-imune (Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol Dez/2000 15;165 (12):7262), tireoidite deHashimoto (Toyoda N. et al, Nippon Rinsho Ago/1999;57 (8):1810), mixedema, mixedema idiopática (Mitsuma T. NipponRinsho. Ago/1999; 57 (8) : 1759); doenças reprodutivas auto-imunes, doenças ovarianas, auto-imunidade ovariana (Garza KM. et al, J Reprod Immunol Fev/1998; 37 (2):87),infertilidade anti-esperma auto-imune (Diekman AB. et al, AmJ Reprod Immunol. Mar/2000; 43 (3): 134)·, perda fetairepetida (Tincani A. et al, Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9),doenças neurodegenerativas, doenças neurológicas, doençasneurológicas auto-imune, esclerose múltipla (Cross AH. etal, J Neuroimmunol Jan/2001 1;112 (1-2): 1), doenças deAlzheimer (Oron L. et al, J Neural Transm Suppl.1997; 49:77) , miastenia grave (Infante AJ. Ajid Kraig E, IntRev Iminunol 1999; 18 (1-2): 83), neuropatias motoras(Kornberg AJ. J Clin Neurosci. Mai/2000;7 (3): 191),sindrome de Guillain-Barre, neuropatias e neuropatiasauto-imunes (Kusunoki S. Am J Med Sei. Abr/2000;319(4) :234), doenças miastênicas, sindrome miastênicas deLambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sei. Abr/2000;319(4) : 2O4 ), doenças neurológicas paraneoplásicas, atrofiacerebelar, atrofia cerebelar paraneoplásicas, sindrome não-paraneoplásicas masculina de rigidez, atrofias cerebelar,atrofias cerebelar, progressiva, encefalite, encefalite deRasmussen, esclerose amiotrófica lateral, coréia deSydenham, sindrome de Gilles de Ia Tourette,poliendocrinopatias, poliendocrinopatias auto-imune (AntoineJC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) Jan/ 2000;156(1) : 23); neuropatias, neuropatias De Simone (Nobile-OrazioE. et al, Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl1999;50:419); neuromiotonia, neuromiotonia adquirida,artrogripose múltipla congênita (Vincent A. et al, Ann N YAcad Sei. Mai/1998 13; 841:482), doenças cardiovasculares,cardiovascular auto-imune doenças, aterosclerose (MatsuuraΞ. et al, Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135), infarto do miocárdio(Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132), trombose (TincaniA. et al, Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9), granulomatose,granulomatose de Wegener, arterite, arterite de Takayasu esindrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al, Wien KlinWochenschr Ago/2000 25; 112 (15-16) : 660) ; doenças auto-imunede anti-fator VIII (Lacroix-Desmazes S. et al, Semin ThrombHemost.2000;26 (2): 157); vasculite, vasculite denecrotização de pequenos vasos sangüíneos, poliangitemicroscópica, síndrome de Churg and Strauss,glomerulonefrite, glomerulonefrite de necrotização focaipouco-imune, glomeronefrite crescente (Noel LH. Ann MedInterne (Paris). Mai/ 2000;151 (3): 178); síndrome deantifosfolípide (Flamholz R. et al, J Clin Apheresis 1999;14 (4): 171); insuficiência cardíaca, anticorpos beta-adrenoceptor do Tipo agonista na insuficiência cardíaca(Wallukat G. et al, Am J Cardiol. Jun/1999 17;83 (12A):75H),púrpura trombocitopênica (Moccia F. Ann Ital Med Int.Abr/1999 -Jun;14 (2):114); anemia hemolítica, anemiahemolítica auto-imune (Efremov DG. et al, Leuk LymphomaJan/1998;28 (3-4):285), doença gastrointestinal, doençasauto-imunes do trato intestinal, doença intestinal, doençaintestinal inflamatória crônica (Garcia Herola A. et al. ,Gastroenterol Hepatol. Jan/2000;23 (1):16), doença celíaca(Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah Jan/2000 16;138(2):122), doenças auto-imunes da musculatura, miosites,miosites auto-imunes, síndrome de Sjogren (Feist E. et al,Int Arch Allergy Immunol Set/2000; 123 (1) :92) ; doenças auto-imunes da musculatura lisa (Zauli D. et al, BiomedPharmacother Jun/1999; 53 (5-6) :2 3 4), doenças hepáticas,doenças hepáticas auto-imunes, hepatite auto-imune (MannsMP. J Hepatol Ago/2000;33 (2):326) e cirrose biliar primária(Strassburg CP. et al, Eur J Gastroenterol Hepatol.Jun/1999; 11 (6) :595) .

Tipo IV ou hipersensibilidademediada por célula T incluem, mas sem limitações, doençasreumatóides, artrite reumatóide (Tisch R, McDevitt HO. ProcNatl Acaci Sci U S A Jan/1994 13; 91 (2) : 437) , doençassistêmicas, doenças sistêmicas auto-imune doenças, lúpuseritematoso sistêmico(Datta SK., Lupus 1998;7 (9):591), doenças glandulares, doenças glandulares auto-imunes,doenças pancreáticas, doenças pancreáticas auto-imunes,diabete Tipo 1 (Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev.Immunol. 8:647); doenças da tireóide, doenças auto-imunes datireóide, doenças de Graves (Sakata S. et al, MoI Cell Endocrinol Mar/1993; 92 (1) : 7 7) ; doenças ovarianas (Garza KM.et al, J Reprod Immunol Fev/1998;37 (2):87), prostatite,prostatite auto-imune (Alexander RB. et al, UrologvDez/1997;50 (6):893), sindrome poliglandular, ,síndromepoliglandular auto-imune, sindrome poliglandular auto-imune do Tipo I (Hara T. et al, Blood. Mar/1991 1;77 (5): 1127),doenças neurológicas, doenças neurológicas auto-imunes,esclerose múltiplas, neurite, neurite ótica (Soderstrom M.et al, J Neurol Neurosurg Psychiatry Mai 1994 ; 57 (5) :544),miastenia grave (Oshima M. et al, Eur J Immunol Dez/1990;20 (12):2563), sindrome de rigidez masculina (Hiemstra HS. etal, Proc Natl Acad Sci U S A Mar/2001 27; 98 (7): 3988),doenças cardiovasculares, auto-imunidade cardíaca na doençade Chagas (Cunha-Neto E. et al, J Clin Invest Out/1996 15;98(8):1709), púrpura trombocitopênica auto-imune (Semple JW.et al, Blood Mai/1996 15;87 (10):4245), auto-imunidades doslinfócitos T anti- ajudante T (Caporossi AP. et al, ViralImmunol 1998;11 (1):9), anemia hemolítica (Sallah S. et al,Ann Hematol Mar/1997;74 (3): 139), doenças hepáticas,doenças hepáticas auto-imunes, hepatite, hepatite crônicaativa (Franco A. et al, Clin Immunol Imm.unopatholMar/1990; 54 (3) :3 82), cirrose biliar, cirrose biliarprimária (Jones DE. Clin Sci (Colch) Nov/1996 ;91 (5) : 5 51) ,doenças néfricas, doenças néfricas auto-imune doenças,nefrite, nefrite intersticial (Kelly CJ. J Am Soc NephrolAgol/1990; (2) : 140), doenças do tecido conectivo, doençasauditivas, doenças auto-imune do tecido conectivo, doençasauditivas auto-imune (Yoo TJ. et al, Cell ImmunolAgo/1994;157 (1):249), doenças do ouvido interno (Gloddek B.et al, Ann N Y Acad Sci 29 Dez/1997 ; 830:266), doenças depele, doenças cutâneas, doenças dermatológicas, doençasbolhosas da pele, pênfigo vulgar, pênfigo bolhoso e pênfigofoliáceo.

Exemplos de tipos dehipersensibilidade tardia incluem, mas sem limitações,dermatite de contato e erupção cutânea.

Exemplos de tipos dehipersensibilidade mediante linfócito T incluem, mas semlimitações, linfócitos T auxiliares e linfócitos Tcitotóxicos.

Exemplos de hipersensibilidademediada por linfócitos T auxiliares incluem, mas semlimitações, linfócito ThI e hipersensibilidade mediada porlinfócito Th2.

Doenças auto-imunes

Incluem, mas sem limitações,doenças cardiovasculares, doenças reumatóides, doençasglandulares, doenças gastrointestinais, doenças cutâneas,doenças hepáticas, doenças neurológicas, doenças musculares,doenças néfricas, doenças relacionadas à reprodução, doençasdo tecido conectivo e doenças sistêmicas.

Exemplos de doençascardiovasculares auto-imunes incluem, mas sem limitaçõesaterosclerose (Matsuura E. et al, Lupus. 1998;7 Suppl2:S135), infarto do miocárdio(Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl2:S132) , trombose (Tincani A. et al, Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9), granulomatose de Wegener, arterite de Takayasu,sindrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al, Wien KlinWochenschr Ago/2000 25; 112 (15-16) :660) , doenças auto-imunesdo anti-fator VIII (Lacroix-Desmazes S. et al, Semin ThrombHemost.2 000;26(2): 157), vasculite de necrotização depequenos vasos sangüíneos, poliangiite microscópica,sindrome de Churg and Strauss, glomerulonefrite denecrotização focai pouco-imune e glomeronefrite crescente(Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 Maio; 151 (3): 178),sindrome de antifosfolípide (FlamhoIz R. et al, J Clin Apheresis 1999; 14 (4): 171), insuficiência cardíacainduzidas por anticorpos (Wallukat G. et al, Am J Cardioi.Jun/1999 17;8 3 (12A):75H), púrpura trombocitopênica (MocciaF. Ann Ital Med Int. Abr-Jun/1999; 14 (2) : 114; Semple JW. etal., Blood Mai/1996 15;87 (10):4245), anemia hemolítica auto-imune (Efremov DG. et al, Leuk Lymphoma 1998 Jan;28 (3-4) :285; Sallah S. et al, Ann Hematol Mar/1997; 74 (3): 139),auto-imunidade cardíaca na doença de Chagas (Cunha-Neto E.et al, J Clin Invest Out/1996 15; 98. (8) : 1709) e auto-imunidade de linfócito T anti-auxiliares (Caporossi AP. etal, Viral Immunol 1998;11 (1):9).

Exemplos de doençasreumatóides auto-imunes incluem, mas sem limitações, artritereumatóide (Krenn V. et al, Histol Histopathol 2000 Jul; 15(3) : 791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units S AJan/1994 18;91 (2):437) e espondilite anquilosante (JanVoswinkel et al, Arthritis Res 2001; 3 (3) : 189).

Exemplos de doençasglandulares auto-imunes incluem, mas sem limitações, doençaspancreáticas, diabete Tipo I, doenças da tireóide, doençasde Graves, tireoidite, tireoidite espontânea auto-imune,tireoidite de Hashimoto, mixedema idiopática, ovariana auto-imunidade, infertilidade anti-esperma auto-imune, prostatiteauto-imune e sindrome poliglandular auto-imune do Tipo I.Doenças incluem, mas sem limitações, doenças auto-imune dopâncreas, diabete Tipo 1 (Castano L. and Eisenbarth GS. Ann.Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin PractOut/1996;34 Suppl:S125), doenças auto-imune da tireóide,doenças de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab CIin NorthAm Jun/2000; 29 (2):339; Sakata S. et al, MoI Cell Endocrinol1993 Mar; 92 (1) :77), tireoidite espontânea auto-imune(Braley-MulIen H. and Yu S, J Immunol Dez/2000 15;165(12):7262), tireoidite de Hashimoto (Toyoda N. et al, NipponRinsho Ago/1999;57 (8): 1810), mixedema idiopática (MitsumaT. Nippon Rinsho. Ago/1999;57 (8): 1759), auto-imunidadeovariana (Garza KM. et al, J Reprod Immunol Fev/1998;37(2) :87), infertilidade auto-imune anti-esperma (Diekman AB.et al, Am J Reprod Immunol. Mar/2000;43 (3): 134),prostatite auto-imune (Alexander RB. et al, UrologyDez/1997; 50 (6) :893) e síndrome poliglandular auto-imune doTipo I (Hara T. et al, Blood. Mar/1991 1;77 (5): 1127).

Exemplos de doençasgastrointestinais auto-imunes incluem, mas sem limitações,doenças intestinais inflamatórias crônicas (Garcia Herola A.et al, Gastroenterol Hepatol. Jan/2000; 23 (1):16), doençascelíacas (Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16;138 (2):122), colite, litiase e doenças de Crohn.

Exemplos de doenças cutâneasauto-imunes incluem, mas sem limitações, doenças bolhosas depele auto-imunes, como, mas sem limitações, pênfigo vulgar,pênfigo bolhoso e pênfigo foliáceo.

Exemplos de doenças hepáticasauto-imunes incluem, mas sem limitações, hepatite, hepatitecrônica ativa auto-imune (Franco A. et al, Clin ImmunolImmunopathol Mar/1990; 54 (3):382), cirrose biliar primária(Jones DE. Clin Sci (Colch) Nov/1996; 91 (5) :551; StrassburgCP. et al, Eur J Gastroenterol Hepatol. Jun/1999; 11(6):595) e hepatite auto-imune (Manns MP. J Hepatol 2000Aug; 33 (2) :326) .

Exemplos de doençasneurológicas auto-imunes incluem, mas sem limitações,esclerose múltipla (Cross AH. et al, J Neuroimmunol Jan/20011; 112 (1-2) :1), doenças de Alzheimer (Oron L. . et al, JNeural Transm Suppl. 1997; 49:77), miastenia grave (InfanteAJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2):83; OshimaΜ. et al, Eur J Immunol Dez/1990; 20 (12) : 2 563) ,neuropatias, neuropatias motoras (Kornberg AJ. J ClinNeurosci. Mai/2000;7 ( 3) : 191); sindrome de Guillain-Barré eneuropatias auto-imunes (Kusunoki S. Am J Med Sei. 2000Apr;319 (4):234), miastenia, sindrome miastênicas deLambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sei. Abr/2000;319(4):204); doenças neurológicas paraneoplásicas, atrofiacerebelar, atrofia cerebelar paraneoplásica e sindrome derigidez masculina (Hiemstra HS. et al, Proc Natl A.cad Sciunits S A 2001 Mar 27;98 (7):3988); sindrome de rigidezmasculina não-paraneoplásicas, atrofias cerebellaresprogressivas, encefalite, encefalite de Rasmussen, escleroselateral amiotrófica, coréia de Sydenham, sindrome de Gillesde Ia Tourette e poliendocrinopatias auto-imunes (AntoineJC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) Jan/2000; 156(1):23); neuropatias De Simone (Nobile-Orazio E. et al,Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419);neuromiotonia adquirida, artrogripose múltipla congênita(Vincent A. et al, Ann N Y Acad Sei. Mai/1998 13; 841: 482),neurite, neurite ótica (Soderstrom M. et al, J NeurolNeurosurg Psychiatry Mai/1994;57 (5):544) e doençasneurodegenerativas.

Exemplos de doenças muscularesauto-imunes incluem, mas sem limitações, miosite, miositeauto-imune e sindrome de Sjogren primária (Feist E. et al,Int Arch Allergy Immunol Set/2000; 123 (1) : 92) e doençasauto-imunes da musculatura lisa (Zauli D. et al, BiomedPharmacother Jun/1999;53 (5-6):234).Exemplos de doenças néfricasauto-imunes incluem, mas sem limitações, nefrite e nefriteintersticial auto-imune (Kelly CJ. J Am Soc NephrolAgo/1990; 1 (2) : 140).

Exemplos de doençasrelacionadas à reprodução auto-imune incluem, mas semlimitações, perda fetal repetida (Tincani A. et al, Lupus1998; 7 Suppl 2:S107-9). Exemplos de doenças de tecidoconectivo auto-imune incluem, mas sem limitações, doençasauditivas, doenças auditivas auto-imunes (Yoo TJ. et al,Cell Immunol Ago/1994; 157 (1) : 249) e doenças auto-imunes doouvido interno (Gloddek B. et al, Ann N Y Acad Sci Dez/199729; 830:266).

Exemplos de doenças auto-imunes sistêmicas incluem, mas sem limitações, lúpuseritematoso sistêmico (Erikson J. et al, Immunol Res 1998;17(1-2):49) e esclerose sistêmica (Renaudineau Y. et al, ClinDiagn Lab Immunol . Mar/1999; 6 (2): 156); Chan OT. et al,Immunol Rev Jun /1999;169:107).

Doenças Infecciosas

Exemplos de doençasinfecciosas incluem, mas sem limitações, doenças porinfecção crônica, doenças infecciosas subagudas, doençasinfecciosas agudas, doenças virais, doenças bacterianas,doenças protozoárias, doenças parasiticas, doenças fungais,doenças micoplasma e doenças de proteína.

Doenças por rejeição de transplante de enxerto

Exemplos de doenças associadascom rejeição de transplante de enxertos incluem, mas semlimitações, rejeição de enxerto, rejeição crônica deenxerto, rejeição subaguda de enxerto, rejeição hiperagudade enxerto, rejeição aguda de enxerto e rejeição versusdoenças hospedeiras.

Doenças alérgicas

Exemplos de doenças alérgicasincluem, mas sem limitações, asma, urticária, prurido,alergia a pólen, alergia a ácaro, alergia a veneno, alergiaa cosméticos, alergia a látex, alergia a química, alergia adroga, alergia a picada de inseto, alergia a raiva animal,alergia a plantas espinhosas, alergia a hera venenosa ealergia alimentar.

Doenças Cancerosas

Exemplos de cânceres incluem,mas sem limitações, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, eleucemia. Exemplos particulares de doenças cancerígenas, massem limitações: Leucemia mielóide como leucemia mielóidescrônicas. Leucemia mielóide aguda com maturação. Leucemiapromielocítica aguda, Leucemia não linfócítica aguda combasófilos elevados, leucemia monocítica aguda, leucemiamielomonocítica aguda com eusinofilia; Linfoma maligno, comode Birkitt e não de Hodgkin; Leucemia linfócítica, comoleucemia linfoblástica aguda. Leucemia linfócítica aguda;Doenças mieloproliferativa, como Meningioma tumores SólidosBenignos, Tumores mistos das glândulas salivares, Adenomasno Cólon; Adenocarcinomas, como Células pequenas de câncerde pulmão, Rim, Útero, Próstata, Bexiga, Ovário, Cólon,Sarcomas, Liposarcoma, mixóide, Sarcoma sinovial, sarcoma,Rabdomiosarcoma (alvsolar), Condrossarcoma mixóide extra-esquelético, tumor de Ewing; incluem outros Disgerminomastesticulares e ovarianos, Retinoblastoma, tumor de Wilms, Neuroblastoma, Melanoma maligno, Mesotelioma, seios, pele,próstata, e ovariano.

Outras doenças tratadas comaplicação instantânea incluem hormônio e deficiências dofator de crescimento; nanismo, deficiências (EPO) porinsuficiência de órgão (por exemplo, renal) e outras.

Como mencionado nas instruçõesacima pode, também ser usado para aplicações de diagnóstico.Assim, a proteína recombinante pode ser uma proteína quepode ser capaz de acumular em um órgão alvo e pode ainda compreender um rótulo detectável (por exemplo, GFP),adequado para imagem in vivo.

Um exemplo de umreagente/proteína de diagnóstico de acordo com a invenção éum anticorpo ou fragmento de ligação antígena deste. Os anticorpos podem ser de cadeia dupla ou única.

Objetos adicionais, vantagens,e novas características da presente invenção tornar-se-ãoaparente aos especialistas na técnica sob análise dosseguintes exemplos, que não são limitadores. Adicionalmente, cada uma das várias configurações e aspectos da presenteinvenção como acima delineado e como reivindicado na seçãode reivindicações abaixo, encontra suporte experimental nosseguintes exemplos.EXEMPLOS

A referência é agora feita aosseguintes exemplos, que juntamente com as descrições acima;ilustram a invenção de um modo não limitador.

De modo geral, a nomenclaturaaqui usada e os procedimentos de laboratório utilizados napresente invenção incluem técnicas DNA recombinantesmoleculares, bioquímicas e microbiológicas. Estas técnicassão inteiramente explicadas na literatura. Ver, por exemplo,"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al.,(1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al. , "CurrentProtocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons,Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide toMolecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988);Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books,New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A LaboratoryManual Series", VoIs. 1-4, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York (1998); methodologies as set forth in U.S.Pat. Nos. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols inIipjnunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stiteset al. (eds), "B a s χ c a nd Clinicai Immunology" (8th Edition),Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi(eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H.Freeman and Co., New York (1980); imunoensaios disponíveissão extensivamente descritos na literatura cientifica e depatente , vide, por exemplo, U.S. Pat. Nos. 3.791.932;3.339.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517;3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345;4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984);"Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., e Higgins S. J.,eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D.,and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture"Freshney, R. I, ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317,Aeademic Press; "PCR Protocols : A Guide To Methods AndApplications", Academie Press, San Diego, CA (1990); Marshaket al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press(1996); todos os quais estão incorporados por referênciacomo que totalmente aqui determinado. Outras referênciasgerais são apresentadas por todo este documento. Acredita-seque os procedimentos destas são bem conhecidos na técnica esão apresentados para conveniência do leitor. Todas asinformações neles contidas estão incorporadas aqui porreferência.

EXEMPLO 1

Acúmulo de GCD em fígado decamundongos que receberam de forma oral cultura de célulasde cenoura de mesma expressão.

Animais, Materiais e Procedimentos ExperimentaisCamundongo: camundongos fêmeas3ALB/C de 7-8 semanas.

Preparação celular vegetal

Construção da expressão doplasmido - 0 cDNA codificando GCD (clone ATTC n° 65696, SEQID NOs. 3-4) foi subclonado em um plasmido contendo o sinalde alvo ER do gene endoquitinase básico Arabidopsis thalianae o sinal alvo vacuolar do tabaco quitinase A. Maextremidade 5' da estrutura de leitura aberta, o plasmidoinserido no promotor 35S do elemento intensificadortranslacional oraega do Virus Mosaico da Couve-flor seguidopelo Virus Mosaico do Tabaco (TMV). Na extremidade 3', aseqüência terminadora de sintaxe de octopina doAgrohacterium tumefaciens foi inserida. 0 cartucho foiremovido do vetor intermediário e ligada a um vetor binário.

A resistência Kanamicina foi conferida pelo gene NPTIIguiada pelo promotor nos.

Transformação e isolamento decélulas de cenoura - Culturas de suspensão celular cenouraforam transformados com o uso de Agrobacterium. Em resumo, aAgrobactéria foi transformada com o GCD acima contendo vetorpor eletroporação e selecionado co o uso de 30 mg/ml deparomomicina. As células de cenoura foram transformadas comAgrobactéria, e selecionadas com o uso de 60 mg/ml deparomomicina em meio liquido. As células de cenouratransformadas foram laminadas na meio de seleção sólido, ecalli formaram-se de células individuais. Altas linhas deexpressão de proteína foram identificadas e selecionadas. OsCalli foram ainda expandidos e transferidos ao meio líquidoDeterminação da expressão GCDpor Western blotting - Para Western blotting, os extratos deproteína foram separados por SDS-PAGE, transferidos a umamembrana de nitrocelulose (Amersham Life Science), e o GCD detectado com o uso de anticorpos anti-GCD (diluído 1:6500)e um anticorpo secundário HRP goat anti-rabbit conjugado comperoxidase (diluído 1:15,000, Sigma).

Upscaling em biorreatoresCulturas de suspensão de calli selecionados foram cultivados em meio líquido Murashige e Skoog (MS) contendo 4.4 g/l meioMSD (Duchefa, Holanda), 9.9 mg/l tiamina HCl (Duchefa,Holanda), 30 g/l sucrose, e 0.1 mg/l 2,4-dicloro ácidofenoxiacético (Sigma). Culturas de suspensão celular foramcultivadas para agitar frascos Erlenmeyer usados para inoculação de 10 litros de biorreatores de polietileno,seguidos por up-scaling a 100 litros de biorreatores depolietileno. As células modificadas geneticamente foramcultivadas por ciclos repetidos de cultivo no biorreator.

Administração oral - Os camundongos foram deixados com fome durante a noite (14-16hr) e então receberam material de célula vegetal colocadodentro da jaula do animal. Após duas horas, o materialvegetal foi removido e os animais receberam sua dietanormal. Os animais foram sacrificados após mais 1, 2, 4 e 18horas. 0 fígado de cada animal foi removido e congelado emnitrogênio líquido e armazenado a -70 °C até análise.

Preparação de amostras detecido de fígado: Cada amostra de tecido do fígado foilavada com NaCl a 0.9% e homogeneizada com tampão dehomogeneização (60 mM citrato de fosfato,1.5 % Triton X-100,ImM PMSF). 5ml tampão por grama de tecido usando umhomogeneizador básico IKA-WERKE ULTRA-TURRAK T 25 em baixavelocidade (11,000-13,000 l/min) por 45-60 segundos, nogelo. Amostras foram centrifugadas a 10,000 g por 10 minutosa 4 0C. A nata foi coletada e dividida em alíquotas econgelada a -70 0C para análise futura.

Em análise de atividadeglicosidase: a atividade enzimática do prGCD foi determinadacom o uso de p-nitrofenil-3-D-glucopiranosida (Sigma) comoum substrato. O tampão de análise continha 60 mM de tampãode fosfato-citrato pH=5.5, 0.15 % Triton X-100, 0.125 %taurocolato de sódio. A análise foi realizada em trêsdiluições no volume total de 5.5 ml usando 30, 12, ou 6microlitros da amostra, incubado com tampão de análise esubstrato adicionado à concentração final de 4mM. Cada 15min, 970 microlitros de cada amostra foram removidos e 30microlitros de 5N NaOH foram adicionados a cada amostra. Aatividade foi medida pela taxa da formação do produto (p-nitrof enil; pNP), detectado pela absorção a 401 nm(Friedman, 1999).

Resultados

Culturas de cenoura deexpressão GCD foram usadas para testar o acúmulo em um órgãoalvo de uma proteína recombinante gerada e administrada deacordo com as instruções da presente invenção. Como ficouevidente na Figura 1, o pico da atividade de GCD no fígadofoi visto após 2 horas da alimentação (30% aumento naatividade enzimática) . Esta atividade reverteu aos níveisnormais 4 horas após a alimentação.

EXEMPLO 2

A administração oral dohormônio de cultivo recombinante vegetal (ItGH) em ratoshipofisectomizados

A habilidade das célulasvegetais para sistematicamente administrar hGH recombinanteatravés do trato GI foi examinada em ratoshipofisectomizados que não expressam hormônio do cultivoendógeno, fazendo análise dos níveis hGH mais simples eprecisos.

Procedimentos Experimentais

Preparação celular vegetal

Células BY-2 de tabaco produzindo hGH foram usando umsistema de expressão de célula estável intensificada dePolimerase RNA dependente de RNA induzível. O sistema foiconstruído em dois plasmidos. O primeiro plasmído portava orepressor- o gene LacI sob o controle do promotor 35S e umaseleção de higromicina seguida por um IRES (local interno deintegração do ribossomo). No segundo plasmido, o gene hGHotimizado do códon da planta (SEQ ID MOs. 1-2) ladeado pelolíder nativo e o sinal de retenção ER foi clonado sob ocontrole de um promotor subgenômico de um Poliymerase RNADependente de RNA Induzível. Além do plasmido inserido noPolimerase RNA Dependente de RNA (do vírus TVCV-tobacco veinclearing vírus) um gene marcador seletivo IRES-NPTII e olocal de ligação LacI bloqueando o mecanismo de replicaçãoviral. 2OmM IPTG foi adicionado às células portando ambos osplasmidos, induzindo a expressão GH. Os níveis de expressãovariaram entre 50-700 μς/grama de peso fresco.

A determinação da ingestão dchGH recombinante foi realizada com o uso do ELISA para hGHno soro e órgãos dos ratos alimentados com hGH (Acesso aoGenBank No. P01241) .

Dois grupos de n=4 ratosSprague Dawley hipofisectomizados foram alimentados com (1)células BY2 nativas (- Células de Tabaco BY-2, Editadas porNagata, Toshiyuki; Hasezawa, Seiichiro; Inz% Dirk Springer2004 ); e (2) células BY2 expressando GH (By2 repressorícone (B5.1+21450) GHs Nat ER linha 18 induzido com IPTG.

Os ratos foram alimentadossomente com células vegetais ad-libitum por 24 horas (nenhumrato chow). Após 24 horas os ratos foram anestesiados etiveram seu sangue coletado, após o qual os ratos foramsacrificados e seus órgãos coletados para medição deingestão de hGH. Os órgãos coletados incluíam músculo,fígado, e baço. 0 soro estava separado do sangue. Todos osórgãos foram mantidos a -70° C até a análise. Os níveis dehGH no soro e órgãos foram medidos por ELISA (kit de testede imunoanálise da enzima do hormônio do crescimento humano:BioCheck, Inc. numero do catálogo BC-1033).

Resultados

Um dos 4 ratos alimentados comcélulas BY2 expressando GH exibiu níveis significantementeelevados de hGH no soro. Dois dos 4 ratos alimentados comcélulas BY2 expressando GH tiveram níveis significantementeelevados de GH no seu músculo. Todos os outros ratos(controle, alimentados com células BY2 nalve) não tiveramníveis de GH detectáveis no soro ou músculo, de acordo comseu fenótipo hipofisectomizado. Os resultados são mostradosna figura 2 e resumidos na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

<table>table see original document page 83</column></row><table>

EXEMPLO 3

Administração oral de recombinante vegetal hGCD em ratos

A habilidade das célulasvegetais de administrar hGCD recombinante através do sistemadigestivo para ingestão da proteína recombinante no corpoexaminado no Exemplo 1 acima.Animais, Materiais e Procedimentos Experimentais

Ratos: Doze ratos fêmeasSprague Dawley de 10-11 semanas foram usados.

Administração oral: Os ratosforam deixados com fome1 por toda a noite (14-16 h) e entãoreceberam material celular vegetal (ad-libitum, 10 gr/rato)colocados dentro da jaula do animal. Após duas horas, omaterial vegetal foi removido e os animais voltaram a suadieta normal. Os animais foram sacrificados (3 animais noseu ponto de tempo)· após um adicional de 1, 2, 4 e 24 horas.

0 fígado e o baço de cada animal foram removidos econgelados em nitrogênio líquido e armazenado a -70°C até aanálise.

Preparação do tecido do baço e fígado: Como descrito noExemplo 1.

Resultados

Culturas de cenouraexpressando GCD foram usadas a fim de testar o acúmulo nosórgãos alvos de uma proteína recombinante gerada eadministrada oralmente de acordo com as instruções dapresente invenção. Como é evidente nas Figuras 3 a e 3 b, umaumento na atividade de GCD foi observada nos tecidos dofígado e baço com o pico da atividade de GCD visto após 1hora após a alimentação (Aumento de Baço-2 6%, Fígado-4 4 ^ naatividade enzimática). Esta atividade reverteu aos níveisnormais 4 horas após a alimentação.EXEMPLO 4

Administração oral dorecombinante vegetal FSH aos ratos hipofisectomizados

A habilidade das célulasvegetais para administrar FSH ao sangue através do trato GIfoi examinada seguindo uma administração única (PO) domaterial celular vegetal.

Procedimentos ExperimentaisPreparação da célula vegetal

Construção da expressão doplasmido - 0 DNA codificando FSH α e as cadeias β com seussinais nativos foram subclonados em um plasmido contendo opromotor 35S do Virus Mosaico da Couve-flor seguido peloelemento intensificador translacional ômega do Virus Mosaicode Tabaco (TMV) . No final 3', a seqüência do terminador desintaxe de · octopina do Agrobacterium tumefaciens foiinserida. O cassete foi removido do vetor intermediário eligado no vetor binário. A cadeia FSH β teve a resistênciaKanamycine conferida pelo gene NPTII guiado pelo promotornos, · e a cadeia FSH α teve a resistência Higromicinaconferida pelo gene aphlll guiado pelo promotor nos.

A transformação e isolação dascélulas de cenoura - As culturas de suspensa de células decenoura foram transformadas com o uso de Agrobacterium. Emresumo, as Agrobactérias foram transformadas com o vetor FSHβ acima por eletroporação e selecionado com o uso de 30mg/ml de paromomicina. As células da cenoura foramtransformadas com Agrobactéria, e selecionado com o uso de60 mg/ml de paromomicina em meio liquido. As células decenoura transformadas foram laminadas em meio de seleçãosólida, e os calli formaram-se das células individuais.Altas linhas de expressa de proteína foram identificadas eselecionadas. Os Calli foram ainda expandidos e transferidosao meio líquido. As células foram, então, re-transformadascom o plasmido levando a cadeia FSH a e selecionado como acimasom o uso de lOOmg/ml de hiromicina. A melhor linha deexpressão foi selecionada com o uso de análises westernblots e ELISA para avaliar os níveis de expressão. Estesforam 1-2Ομς /gFW.

Animais e administração oral -três ratos com 11 semanas de idade (200 gr) receberam 10ml/kg de purê de célula de cenoura via engorde oral. Asamostras de sangue foram tomadas antes da dose e aos 10, 20,30, 60, 120 e 240 min, seguindo a administração econcentrações de FSH foram medidas com ELISA, com o uso de umdo BioCheck Inc.

Resultados

Como mostrado na figura 4, osníveis de soro FSH aumentaram em no mínimo 5 a cada 10minutos seguindo a administração após a qual eles voltaram àbasal.

EXEMPLO 5

Expresso de células de cenouras liofilizadas mantém osníveis e atividade de GCD intactos

A habilidade das célulasvegetais da presente invenção para manter a atividade após adesidratação foi determinada.

Procedimentos Experimentais

Uma centena de gramas decélulas de cenoura expressando GCD produzido como descritono Exemplo 1 acima, foram liofilizados e testados paraexpressão e atividade específicas de proteína (vide Exemplos1 e 3 acima).

Preparação lisate - 50 mg decélulas secas foram extraídas com um tampão de extração de 1ml de pH=7.2 (2OmM tampão de fosfato pH=7.2, 2OmM EDTA, 2OmML-ácido ascórbico, 1% Triton X-100).

Determinação da expressão GCDpor Western blotting - Por Western blotting, os extratos deproteína foram separados por SDS-PAGE, transferidas para umamembrana de nitrocelulose (Amersham Life Science), e GCDdetectada com o uso de anticorpos anti-GCD (diluído 1:6500)e um anticorpo secundário goat anti-rabbit conjugado comperoxidase (diluído 1:15,000) (Sigma).

Resultados

A figura 5 mostra a expressãoGCD em células vegetais liofilizadas versus células frescas.

A carga de proteína foi com base na medição da proteínatotal por Bradford. Como mostrado, os níveis da expressãoGCD na preparação seca foram similares aos da preparaçãofresca. A proteína total nas lisates foi medida e aquantidade de GCD ativo nas lisates liofilizadas e dascélulas frescas foi avaliada. Os resultados são mostrados naTabela 2, abaixo.

Tabela 2

<table>table see original document page 87</column></row><table>

Assim, fica evidente que aspreparações secas da presente invenção mantêm suasatividades biológicas.

No geral, os resultados acimademonstram a primeira vez que a habilidade de proteínarecombinante expressada da planta não-isolada move-se pelotrato GI e acumula nos órgãos internos.

É apreciado que determinadascaracteristicas da invenção, que são, para esclarecimentos,descritas no contexto de configurações separadas, podemtambém ser apresentadas em combinação em uma únicaconfiguração. Reciprocamente, as várias características dainvenção, que são por redução, descritas no contexto de umaúnica configuração, podem também ser apresentadas de formaseparada ou em qualquer subcombinação adequada.

Apesar da invenção ter sidodescrita em conjunto com as caracteristicas específicasdesta, fica evidente que muitas alternativas, modificações evariações sejam aparentes aos especialistas na técnica.Conseqüentemente, pretende-se adotar todas estasalternativas, modificações e variações que fiquem dentro doespírito e amplo escopo das reivindicações em anexo. Todasas publicações e aplicações de patente e números de Acesscao GenBank mencionadas nesta especificação estão aquiincorporados na sua totalidade por referência naespecificação, na mesma extensão como se cada publicação,patente ou pedido de patente individual ou número de Acessoao GenBank for, especificamente e individualmente, indicadopara ser incorporado aqui por referência. Ainda, a citaçãoou identificação de qualquer referência nesta aplicação nãoserá consumada construída como uma admissão de que cadareferência esteja disponível como técnica anterior àpresente invenção.'LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA

<110>Protalix Ltd.Shaaltiel, YosephAlmon, Einat

<120> ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSA OU INTESTINO DEMACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS<130> 31681<160> 4

<170> PatentIn versão 3.3<210> 1

<211> 672<212> DNA

<213> Seqüência artificial<22 0>

<223> Construção alterada de códon sintético para codificaro hormônio do crescimento humano<400> 1

atggctactg gatctaggac ttctcttctt cttgctttcg gacttctttg tttgccatgg 60cttcaagaag gatctgcttt cccaactatt ccactttcta ggcttttcga taacgctatg 120ttgagggctc ataggcttca tcaacttgct ttcgatacct atcaagagtt tgaggaggct 180tacattccaa aggagcagaa gtactctttt cttcaaaacc cacaaacctc tctttgtttc 240tctgaatcta ttccaactcc atcaaatagg gaggagaccc aacaaaagtc aaaccttgag 300cttcttagga tctcacttct tcttattcaa tcttggcttg agccagttca attccttaga 360tctgttttcg caaactctct tgtttacgga gcttcagatt caaacgttta cgatcttctt 420aaggatcttg aggagggtat tcaaactctt atgggaaggc ttgaagatgg atvtccaagg 480actggacaaa tcttcaagca gacctactct aagttvgata ccaactctca taacgatgat 540gctcttctta agaactacgg acttttgtac tgtttcagga aggatatgga taaggttgag 600accttcctta ggatcgttca atgtcgttct gttgaaggat cttgcggatt ctcagagaag 6602/6gatgagttgt aa<210> 2<211> 223<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Hormônio sintético do Crescimento Humano

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu1 5 10 15

Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu

20 25 30

Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln

35 40 45

Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys

50 55 60

Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe60 70 75 80

Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp

100 105 110

Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val

115 120 125

Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu

130 135 140

Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg145 150 155 160

Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn SerHis Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe

Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys

Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Glu Lys Asp Glu Leu

<210> 3<211> 1581<212> DNA

<213> Homo Sapiens<400> 3

atgaagacta atctttttct ctttctcatc ttttcacttc tcctatcatt atcctcggcc 60

gaattcgccc gccccrgcat ccctaaaagc ttcggctaca gctcggtggt gtgtgtctgc 120

aatgccacat actgtgactc ctttgacccc ccgacctttc ctgcccttgg taccttcagc 180

cgctatgaga gtacacgcag tgggcgacgg atggagctga gtatggggcc catccaggct 240

aatcacacgg gcacaggcct gctactgacc ctgcagccag aacagaagtt ccagaaagtg 300

aagggatttg gaggggccat gacagatgct gctgctctca acatvvttgc cctgtcaccc 360

cctgcccaaa atttgctact taaatcgtac ttctctgaag aaggaatcgg atataacatc 420

atccgggtac ccatggccag ctgtgacttc tccatccgca cctacaccta tgcagacacc 480

cctgatgatt tccagttgca caacttcagc ctcccagagg aagataccaa gctcaagata 540

cccctgattc accgagccct gcagttggcc cagcgtcccg tttcactcct tgccagcccc 600

tggacatcac ccacttggct caagaccaat ggagcggtga atgggaaggg gtcactcaag 660

ggacagcccg gagacatcta ccaccagacc tgggccagat actttgtgaa gttcctggat 720

gcctatgctg agcacaagtt acagttctgg gcagtgacag ctgaaaatga gccttctgct 780

gggctgttga gtggataccc cttccagtgc ctgggcttca cccctgaaca tcagcgagac 840

ttcattgccc gtgacctagg tcctaccctc gccaacagta ctcaccacaa tgtccgccta 900

ctcatgctgg atgaccaacg cttgctgctg ccccactggg caaaggtggt actgacagac 960ccagaagcag ctaaatatgt tcatggcatt gctgtacatt ggtacctgga ctttctggct 1020

ccagccaaag ccaccctagg ggagacacac cgcctgttcc ccaacaccat gctctttgcc 1080

tcagaggcct gtgtgggctc caagttctgg gagcagagtg tgcggctagg ctcctgggat 1140

cgagggatgc agtacagcca cagcatcatc acgaacctcc tgtaccatgt ggtcggctgg 1200

accgactgga accttgccct gaaccccgaa ggaggaccca attgggtgcg taactttgtc 1260

gacagtccca tcattgtaga catcaccaag gacacgtttt acaaacagcc catgttctac 1320

caccttggcc acttcagcaa gttcattcct gagggctccc agagagtggg gctggttgcc 1380

agtcagaaga acgacctgga cgcagtggca ctgatgcatc ccgatggctc tgctgttgtg 1440

gtcgtgctaa accgctcctc taaggatgtg cctcttacca tcaaggatcc tgctgtgggc 1500

ttcctggaga caatctcacc tggctactcc attcacacct acctgtggca tcgccaagat 1560

cttttagtcg atactatgta a 1581

<210> 4<211> 526<212> PRT<213> Homo Sapiens<400> 4

Met Lys Thr Asn Leu Ohe Leu Phe Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser1 5 10 15

Leu Ser Ser Ala Glu Phe Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly20 20 25 30

Tyr Ser Ser Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe

35 40 45

Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser50 55 60

25 Thr Arg Ser Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala65 70 75 80

Asn His Thr Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys85 90 95Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala

100 105 110

Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys

115 120 125

Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro

130 135 140

Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr145 150 155 160

Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr

165 170 175

Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg

180 185 190

Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys

195 200 205

Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly

210 215 220

Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp225 230 235 240

Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn

245 250 255

Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly

260 265 270

Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro

275 280 285

Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp

290 295 300

Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp305 310 315 320Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu

325 330 335

Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu

340 345 350

Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys

355 360 365

Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Le Ugly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln

370 375 380

Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp385 390 395 400

Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val

405 410 415

Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr

420 425 430

Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe

435 440 445

Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn

450 455 460

Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val465 470 475 480

Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp

485 490 495

Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His

500 505 510

Thr Tyr Leu Trp His Arg Gln Asp Leu Leu Val Asp Thr Met515 520 525

Claims (44)

1. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo o uso de células vegetais expressando umaenzima lisossomal recombinante biologicamente ativa nafabricação de um medicamento para o tratamento ou prevençãode doença de Gaucher ou doença de Fabry em uma pessoa,caracterizado pelo fato de que o medicamento é formuladopara administração oral ou mucosa.

2. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de quea atividade biológica da enzima lisossomal recombinante nãoé a indução de uma resposta imunológica para vacinação.

3. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fatode que a enzima lisossomal recombinante é uma enzimalisossomal Humana.

4. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelofato de que a doença é de Gaucher e a enzima lisossomalrecombinante é a glucocerebrosidase.

5. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de quea proteína eucariótica é uma glucocerebrosidase humana.

6. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 4 e 5, caracterizado pelo fatode que a enzima lisossomal tem uma seqüência de aminoácidocomo apresentada no ID SEQ No: 4

7. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 4, 5 e 6, caracterizado pelofato de que a enzima lisossomal tem atividade catalitica dahidrolase glucocerebrosideo.

8. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7,caracterizado pelo fato de que a enzima lisossomal é umaproteína de alta manose.

9. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8,caracterizado pelo fato de que a enzima lisossomal églicosilada com um resíduo de xilose.

10. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9,caracterizado pelo fato de que a doença é de Gaucher.

11. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelofato de que a doença é de Fabry e a enzima lisossomalé uma alfa-galactosidase humana.

12. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato deque a doença é de Fabry.

13. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,- 11 e 12, caracterizado pelo fato de que as células vegetaisincluem uma parede celular substancialmente intacta.

14. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,- 11 e 12, caracterizado pelo fato de que as células vegetaisincluem uma membrana celular substancialmente intacta.

15. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com quaisquer das reivindicações de 1, 2, 3, 4, 5, 6,- 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14, caracterizado pelo fato de queas células vegetais incluem uma parede celularsubstancialmente intacta e uma membrana celular.

16. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,- 11, 12, 13, 14 e 15, caracterizado pelo fato de que ascélulas vegetais são células isoladas.

17. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,-11, 12, 13, 14, 15 e 16, caracterizado pelo fato de que ascélulas vegetais são células desidratadas.

18. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,-11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17, caracterizado pelo fato de queas células vegetais desidratadas incluem um excipiente.

19. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,-11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18, caracterizado pelo fato deque as células vegetais incluem células de alfafa.

20. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,-10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18, caracterizadopelo fato de que as células vegetais incluem células detabaco.

21. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18, caracterizado pelo fato de que ascélulas vegetais incluem células obtidas da linhagem celulardo tabaco.

22. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,-11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18, caracterizado pelo fato deque as células vegetais incluem células de raízes vegetais.

23. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato deque as células de raízes vegetais são selecionadas do grupocomposto por células de raízes transformadas Agrobacteriumrihzogenes, célula de aipo, célula de gengibre, célula derábano silvestre e célula de cenoura.

24. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato deque as células vegetais são células de cenoura.

25. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,-11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24,caracterizado pelo fato de que a biomolécula recombinantenão é imunogênica na pessoa.

26. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", deacordo com as reivindicações de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,-10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e-25, caracterizado pelo fato de que o tecido é de fígado oude baço.

27. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária para transportede enzima lisossomal recombinante biologicamente ativa paraum tecido de uma pessoa, a forma de dosagem unitária,caracterizada por incluir uma quantidade de células vegetaisterapeuticamente eficazes expressando a enzima lisossomal.

28. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo com areivindicação 27, caracterizada por ser formulada paraadministração oral.

29. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo com areivindicação 27, caracterizada por ser formulada paraadministração mucosa.

30. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo coma reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que célulasvegetais incluem células desidratadas.

31. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo comas reivindicações 27, 28, 29 e 30, caracterizada pelo fatode que a enzima lisossomal é humana.

32. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo com areivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a enzimalisossomal é um glucocerebrosídeo humano.

33. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo com areivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a enzimalisossomal é uma alfa-galactosidase humana.

34. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo com areivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a enzimalisossomal tem uma seqüência de aminoácidos como apresentadano ID SEQ No: 4.

35. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo comas reivindicações de 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34,caracterizada pelo fato de que o tecido é de fígado ou debaço.

36. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária para passagemsistemática de uma biomolécula biologicamente ativa em umapessoa, a forma de dosagem unitária, incluindo umaquantidade de células vegetais terapeuticamente eficazesexpressando recombinantemente a biomolécula biologicamenteativa, caracterizada pelo fato de que atividade biológicanão está induzindo uma resposta imunológica em um hospedeiroingerindo a forma de dosagem unitária.

37. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo com areivindicação 36, caracterizada por ser formulada paraadministração oral.

38. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo coma reivindicação 36, caracterizada por ser formulada paraadministração mucosa.

39. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo comas reivindicações 36, 37, e 38, caracterizada pelofato de que as células vegetais incluem célulasdesidratadas.

40. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo comas reivindicações 36, 37, 38 e 39, caracterizada pelo fatode que a biomolécula é uma enzima e a atividade biológica éuma atividade catalitica.

41. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo comas reivindicações 36, 37, 38 e 39, caracterizada pelo fatode que a biomolécula é um hormônio e a atividade biológica éa de um composto de coordenação.

42. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo a forma de dosagem unitária, de acordo com asreivindicações de 36, 37, 38 e 39, caracterizada pelo fatode que a biomolécula recombinante é selecionada do grupocomposto de um hormônio, um fator de crescimento, umaprotease, uma proteína matriz extra celular, uma enzima, umaproteína quimérica, um oligonucleotídeo anti-sentido, umdsRNA, um anticorpo, uma ribozina e uma DNAzima.

43. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo comas reivindicações 36, 37, 38 e 39, caracterizada pelo fatode que a biomolécula recombinante é um anticorpo.

44. "ADMINISTRAÇÃO VIA MUCOSAOU INTESTINO DE MACROMOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS",compreendendo uma forma de dosagem unitária, de acordo comas reivindicações 36, 37, 38 e 39, caracterizada pelo fatode que a biomolécula recombinante é uma proteína quimérica.