JP5913372B2 - 植物および植物細胞におけるα−ガラクトシダーゼの発現のための核酸発現構築物 - Google Patents

Description

本発明は、そのいくつかの実施形態では、核酸発現構築物に関し、より詳細には、これらに限らないが、植物細胞におけるα−ガラクトシダーゼの発現のための核酸構築物、核酸構築物を発現する細胞およびヒトα−ガラクトシダーゼ、ならびにそれらの使用に関する。

ファブリー病は、リソソーム酵素であるα−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ Ａ）の活性の欠損により引き起こされる、Ｘ連鎖性のリソソーム貯蔵疾患である。古典的ファブリー病を有する患者は典型的には、１％未満のα−Ｇａｌ Ａ活性を有し、しばしば、四肢における重度の疼痛（先端知覚異常）、発汗低下、角膜およびレンズの変化、皮膚病変（被角血管腫）、腎不全、心血管疾患、肺不全、神経学的症状、ならびに脳卒中を含む症状の完全なスペクトルを示す。非定型ファブリー病においては、残存する酵素活性を有する個体が、中年期以降に症状を示し、症状は通常、１つまたはいくつかの臓器に限定される。女性の保因者における臨床所見は、Ｘ染色体のランダムな不活性化により大幅に変化する。保因者は一般に生涯、無症候状態を維持するが、多くが、臨床症状を示し、それらは、罹患男性の症状と同じように変動し、重度である。Ｄｅ Ｄｕｖｅが最初に、不足しているリソソーム酵素を、外因性の生物学的に活性な酵素を用いて補充することが、リソソーム貯蔵疾患の治療に対する実行可能なアプローチであり得るであろうことを示唆した［Ｆｅｄ Ｐｒｏｃ．２３：１０４５頁（１９６４）］。

酵素代替療法のための組換えα−ガラクトシダーゼＡが、昆虫（ｓｆ９）細胞（特許文献１を参照されたい）、ヒト線維芽細胞（ＵＳ６，３９５，８８４を参照されたい）、ならびに植物細胞（米国特許第６，８４６，９６８号明細書および国際公開第２００８／１３２７４３号を参照されたい）中で産生されている。組換えａ−Ｇａｌ Ａ（アガルシダーゼベータ［Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）］：Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ；アガルシダーゼアルファ［Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）］：Ｓｈｉｒｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ）を用いる臨床試験が実施されており、両方の薬物が、臨床使用の承認を得ている。２００９年の時点で、２０００人超の患者が、これら２つの入手可能な製剤のうちのいずれか１つを用いて治療されており、一般に、両方の安全性および有効性が実証されている（Ｈｏｆｆｍａｎｎ、Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．、２００９年；４：２１頁）。

臨床経験から、これらの入手可能な組換え酵素組成物が、患者の忍容性、免疫原性、投与レジメンおよび臨床的有効性に関して異なることが示されている（Ｈｏｆｆｍａｎｎ、Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．、２００９年；４：２１頁）。現存する組換え酵素に伴う別の欠点は、それらの費用であり、このことは、ヘルスケアシステムに重い経済的負担をかける恐れがある。哺乳動物細胞培養物、バイオリアクターまたは昆虫細胞中で産生する場合の、これらの組換え酵素の高いコストは、複雑な精製および改変のプロトコール、ならびに現存する治療が比較的大きな量の治療剤を必要とすることから生じる。したがって、命を救うこの療法を、それを必要とする全ての患者に、より手頃に提供することができるように、α−ガラクトシダーゼのコストを低下させることが緊急に求められている。

安全性、ウイルス感染、免疫反応、産生の収率およびコストの問題を解決するために、ヒトリソソーム酵素を、トランスジェニック植物中で産生することができる。米国特許第２００２／００８８０２４号明細書は、米アミラーゼＥＲ標的化シグナルペプチド、ならびに効率的な発現および細胞内液中への分泌のためにＣ末端部分において切断されているヒトα−ガラクトシダーゼコード配列を使用する、植物細胞中での組換えヒトα−ガラクトシダーゼの発現を教示している。

国際公開第９７／１０３５３号は、創傷誘導性ＭｅＧＡプロモーターおよび回収のためのＦＬＡＧタグを使用する、植物中でのリソソーム酵素、具体的には、ＩＤＵＡおよびグルコセレブロシダーゼの産生を教示している。国際公開第９７／１０３５３号は、組換えヒトα−ガラクトシダーゼを発現する特定の構築物についての手引きは提供していない。

Ｃｒａｍｅｒら（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｔｒａｎｓ．１９９９ Ｐｌａｎｔｓ、９５〜１１８頁）は、タバコ葉の内膜（ＩＦ）中で行われる国際公開第９７／１０３５３号に類似する様式の、植物中でのグルコセレブロシダーゼおよびＩＤＵＡの発現の方法を検討しており、植物における発現を大まかに記載しているが、ヒト組換えα−ガラクトシダーゼの発現についての手引きは提供していない。

米国特許出願公開第２００６−０２０４４８７号明細書は、効率的なグリコシル化およびグリカンリモデリングのために、組換えポリペプチド（具体的には、グルコセレブロシダーゼ）を標的とするための多様な戦略を利用する、植物中でのヒトリソソーム酵素の発現のための方法を教示している。特定の構築物からの、組換えヒトα−ガラクトシダーゼのクローニングおよび発現は開示されていない。

国際公開第２００７／０１０５３３号は、組換え生理活性分子、例えば、リソソーム酵素、例として、ヒトグルコセレブロシダーゼおよびヒトα−ガラクトシダーゼを発現する植物細胞の投与を教示している。組換えヒトα−ガラクトシダーゼのクローニングおよび発現は開示されていない。

米国特許第７，０１１，８３１号明細書 米国特許第６，３９５，８８４号明細書 米国特許第６，８４６，９６８号明細書 国際公開第２００８／１３２７４３号 米国特許出願公開第２００２／００８８０２４号明細書 国際公開第９７／１０３５３号 米国特許出願公開第２００６−０２０４４８７号明細書 国際公開第２００７／０１０５３３号 国際公開第９３／０７２７８号 国際公開第９８／１３４６９号 国際公開第２００５／０８０５４４号 米国特許第５，４６４，７６５号明細書 米国特許第４，８５５，２３７号明細書 欧州特許第６７，５５３号明細書 特開昭６３−１４６９３号公報 欧州特許第１９４，８０９号明細書 欧州特許第２７８，６６７号明細書 国際公開第８７／０６２６１号 米国特許第５，３１６，９３１号明細書 米国特許第４，９４５，０５０号明細書 米国特許第５，６９３，５０７号明細書 米国特許第６，３９１，６３８号明細書 米国特許第７，９５１，５５７号明細書 国際公開第２００８／１３５９９１号 米国特許第４，６６６，８２８号明細書 米国特許第４，６８３，２０２号明細書 米国特許第４，８０１，５３１号明細書 米国特許第５，１９２，６５９号明細書 米国特許第５，２７２，０５７号明細書 米国特許第３，７９１，９３２号明細書 米国特許第３，８３９，１５３号明細書 米国特許第３，８５０，７５２号明細書 米国特許第３，８５０，５７８号明細書 米国特許第３，８５３，９８７号明細書 米国特許第３，８６７，５１７号明細書 米国特許第３，８７９，２６２号明細書 米国特許第３，９０１，６５４号明細書 米国特許第３，９３５，０７４号明細書 米国特許第３，９８４，５３３号明細書 米国特許第３，９９６，３４５号明細書 米国特許第４，０３４，０７４号明細書 米国特許第４，０９８，８７６号明細書 米国特許第４，８７９，２１９号明細書 米国特許第５，０１１，７７１号明細書 米国特許第５，２８１，５２１号明細書

Ｆｅｄ Ｐｒｏｃ．２３：１０４５頁（１９６４） Ｈｏｆｆｍａｎｎ、Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．、２００９年；４：２１頁 Ｃｒａｍｅｒら（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｔｒａｎｓ．１９９９ Ｐｌａｎｔｓ、９５〜１１８頁） Ｒａｙｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ、Ｖｏｌ．４９、Ｎｏ．３２６、１４６３〜１４７２頁、１９９８年 Ｎｅｕｍａｎｎら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ、２００３年；９２：１６７〜１８０頁 Ｐａｇｎｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ、Ｖｏｌ．５０、１５７〜６４頁 Ｓａｒｄａｎａら（１９９６年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、１５：６７７〜６８１頁） Ｍｕｒｒａｙら（１９８９年、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：４７７〜４９８頁） ＭｃＥｌｒｏｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２：１６３〜１７１頁、１９９０年 Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０〜８１２頁、１９８５年 Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ、１００：４５６〜４６２頁、１９９７年 ｄｅ Ｐａｔｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ Ｎｏｖ；２（６）：８３７〜４４頁、１９９２年 Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８：６７５〜６８９頁、１９９２年 Ｂｕｃｈｏｌｚら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２５（５）：８３７〜４３頁、１９９４年 Ｌｅｐｅｔｉｔら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２３１：２７６〜２８５頁、１９９２年 Ａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１０（１）；１０７〜１２１頁、１９９６年 Ｓｉｍｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５、１９１頁、１９８５年 Ｓｃｏｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：１２２０２頁、１９８７年 Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：６３３頁、１９９０年 Ｐｅａｒｓｏｎ’ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２３５〜２４５頁、１９９２年 Ｅｌｌｉｓら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２０３〜２１４頁、１９８８年 Ｔａｋａｉｗａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２０８：１５〜２２頁、１９８６年 Ｔａｋａｉｗａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．、２２１：４３〜４７頁、１９８７年 Ｍａｔｚｋｅら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１４３）、３２３〜３２頁、１９９０年 Ｓｔａｌｂｅｒｇら、Ｐｌａｎｔａ、１９９：５１５〜５１９頁、１９９６年 Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ、２１６：８１〜９０頁、１９８９年 ＮＡＲ、１７：４６１〜２頁 Ａｌｂａｎｉら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、９：１７１〜１８４頁、１９９７年 ＥＭＢＯ３：１４０９〜１５頁、１９８４年 Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎ、９８：１２５３〜６２頁、１９９９年 Ｐｌａｎｔ Ｊ、４：３４３〜５５頁、１９９３年 Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ、２５０：７５０〜６０頁、１９９６年 Ｍｅｎａら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、１１６（１）：５３〜６２頁、１９９８年 Ｖｉｃｅｎｔｅ−Ｃａｒｂａｊｏｓａら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１３：６２９〜６４０頁、１９９８年 Ｗｕら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、３９（８）、８８５〜８８９頁、１９９８年 Ｗｕら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、３９８）、８８５〜８８９頁、１９９８年 Ｓａｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：８１１７〜８１２２頁 Ｎａｋａｓｅら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３：５１３〜Ｓ２２、１９９７年 Ｔｒａｎｓ Ｒｅｓ、６：１５７〜６８頁、１９９７年 Ｐｌａｎｔ Ｊ、１２：２３５〜４６頁、１９９７年 ＰＭＢ３２：１０２９〜３５頁、１９９６年 Ｐｏｓｔｍａ−Ｈａａｒｓｍａら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９：２５７〜７１頁、１９９９年 Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２３：３８６頁、１９９８年 Ｃｕｍｍｉｎｓら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：８７３〜８７６頁、１９９２年 ｗｗｗ．ｓａｌｕｓ．ｍｅｄｉｕｍ．ｅｄｕ／ｍｍｇ／ｔｉｅｒｎｅｙ／ｈｔｍｌ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５、９５〜１０９頁、１９９０年 Ｔｗｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．、２１７：２４０〜２４５頁（１９８９） Ｎａｇａｔａら、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｙｔｏｌ、１９９２年；１３２：１〜３０頁 Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５〜２２５頁 Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８：２７４〜２７６頁 Ｋｌｅｅら、（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７〜４８６頁 ＫｌｅｅおよびＲｏｇｅｒｓ、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、Ｖｏｌ．６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９）２〜２５頁 Ｇａｔｅｎｂｙ、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｕｎｇ，Ｓ．およびＡｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．（１９８９）９３〜１１２頁 Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、Ｖｏｌ．６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ、Ｓｃｈｅｌｌ、Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９）５２〜６８頁 Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ら、（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１０７２〜１０７４頁 Ｚｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（１９８８）７：３７９〜３８４頁 Ｆｒｏｍｍら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：７９１〜７９３頁 Ｋｌｅｉｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：５５９〜５６３頁 ＭｃＣａｂｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：９２３〜９２６頁 Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２０６〜２０９頁 Ｎｅｕｈａｕｓら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）７５：３０〜３６頁 ＮｅｕｈａｕｓおよびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２１３〜２１７頁 ＤｅＷｅｔら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ、Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．およびＭａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．およびＤａｎｉｅｌｓ，Ｗ．編、Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８５）１９７〜２０９頁 Ｏｈｔａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：７１５〜７１９頁 Ｈｏｒｓｃｈら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８）１〜９頁 Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ら、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７２〜１８９頁（１９８８） ＫｕｒｉｈａｒａおよびＷａｔａｎａｂｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、４：２５９〜２６９頁、２００３年） ＦｏｓｔｅｒおよびＴａｔｌｏｒ編、「Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｆｒｏｍ Ｖｉｒｕｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ）、Ｖｏｌ ８１）」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９８年 Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７２：２８５〜２９２頁 Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８７）６：３０７〜３１１頁 Ｆｒｅｎｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：１２９４〜１２９７頁 Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６９：７３〜７６頁 ＭａｒａｍｏｒｏｓｈおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ編、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、７ ｖｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９６７〜１９８４頁 Ｈｉｌｌ，Ｓ．Ａ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４年 Ｗａｌｋｅｙ，Ｄ．Ｇ．Ａ．、「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５年 ＫａｄｏおよびＡｇｒａｗａ編、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版 Ｆｉｎｇｌら、１９７５年、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｃｈ．１、１頁 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９） 「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ〜ＩＩＩ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編、（１９９４） Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９） Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８） Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｉｒｒｅｎら（編）、「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、Ｖｏｌｓ．１〜４、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８） 「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ〜ＩＩＩ、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編、（１９９４） 「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ 「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ〜ＩＩＩ、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４） Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４） ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０） 「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 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国際公開第２００８／１３２７４３号は、植物発現ベクター中へのヒトα−ガラクトシダーゼコード配列のクローニング、およびタバコ細胞中でのその発現を記載しており、結果として、生物学的に活性な、完全長グリコシル化α−ガラクトシダーゼ酵素が生じ、この酵素は、線維芽細胞中へ取り込まれることが示された。しかし、臨床条件下において薬物動態の改善を示す組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の発現および産生の効率をその上さらに増加させるための、より進んだα−ガラクトシダーゼ発現ベクターが求められている。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、核酸発現構築物であって、構築体は、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする核酸配列を含み、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｎ末端において、シロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドに翻訳時に融合され、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｃ末端において、小胞体保持シグナルペプチドに翻訳時に融合される核酸発現構築物が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、Ｎ末端グリシン残基を有するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質であってし、Ｃ末端において、小胞体保持シグナルペプチドに翻訳時に融合されるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸配列は、配列番号２２を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、シロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドは、配列番号４に記載される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸構築物は、配列番号５に記載される小胞体標的化シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、小胞体保持シグナルペプチドは、配列番号６に記載される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸構築物は、配列番号１９に記載される小胞体保持ペプチドをコードする核酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸配列は、配列番号２に記載される配列を有する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸配列のコドンの使用は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）のために最適化されている。

本発明のいくつかの実施形態のいくつかの態様によれば、本発明の核酸構築物を含む単離細胞が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、ヒトα−ガラクトシダーゼ酵素を組換えにより産生する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ヒトα−ガラクトシダーゼは、Ｎ末端グリシン残基を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、植物細胞である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、植物細胞は、タバコ細胞である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、タバコ細胞は、ＢＹ−２細胞である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、少なくとも１つの露出したマンノース残基を有するように組換えにより産生される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、少なくとも１つのコアβ−（１，２）キシロースもしくは少なくとも１つのコアα−（１，３）フコース、または両方を有するように組換えにより産生される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸構築物は、細胞のゲノム中に安定に組み込まれている。

本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞である。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を製造する方法であって、本発明による細胞を提供するステップと、細胞を成長させて、組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を産生するステップと、細胞から組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を単離するステップとを含む方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、細胞培養培地中で培養した単離細胞である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は、使い捨てのバイオリアクター中で行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を有する。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、活性成分としての本発明のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、活性成分としての本発明の細胞、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、活性成分としての本発明のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の集団、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物であって、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の前記集団の優勢なグリカン構造が、マンノース４−β−（１，２）キシロース（Ｍ４Ｘ）、マンノース３−β−（１，２）キシロース−α−（１，３）フコース［Ｆｃ（３）Ｍ３Ｘ］、およびマンノース８（Ｍ８）である医薬組成物が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、その治療を必要とする対象においてファブリー病を治療する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、３つが露出したマンノース残基である９つのマンノース残基を含むグリカン構造を有する本発明のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物が提供される。３つが露出したマンノース残基である９つのマンノース残基を含むグリカン構造を有するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、組成物のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の集団の０．５％、０．８％、１．０％、１．３％または２％以上であり得る。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、その治療を必要とする対象においてファブリー病を治療する方法であって、本発明の細胞を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、その治療を必要とする対象においてファブリー病を治療するための医薬を製造するための、本発明のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の使用が提供される。

別段に定義しない限り、本明細書において使用する技術用語および／または科学用語は全て、本発明が関係する当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例示的な方法および／または材料を、下記に記載するが、本明細書に記載するものに類似するかまたはそれらと同等である方法および材料を、本発明の実施形態の実行または試験において使用することができる。矛盾する場合には、定義を含めて、特許明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は、例示に過ぎず、限定することを必ずしも意図しない。

本発明のいくつかの実施形態を、付随する図面を参照して、例示の目的に限って本明細書に記載する。ここで、図面の詳細を具体的に参照する場合、示す詳細は、例としてのものであり、本発明の実施形態を例示的に論じるためのものであることを強く主張する。この点に関して、図面を用いて説明することによって、どのように本発明の実施形態を実行することができるかが当業者に明らかになる。

本発明の核酸がコードするα−ガラクトシダーゼ（配列番号１、下部の配列）、および本来のシグナルリーダーペプチド（配列番号３、赤色で強調されている）を含む、本来のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０５７９０、上部の配列）のアミノ酸配列のアラインメントの図である。シロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチド（配列番号４）は、緑色で強調されている。ＳＥＫＤＥＬ小胞体保持シグナルペプチド（配列番号６）は、植物発現タンパク質のＣ末端に位置する。成熟した、本来のα−ガラクトシダーゼ酵素タンパク質の配列（配列番号７）は、黄色で強調されている。 多種多様なヒトα−ガラクトシダーゼ構築物の、植物内での発現レベルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのスキャンの図である。異なるヒトα−ガラクトシダーゼ構築物を浸潤させたベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物から得られた葉の抽出物を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲル上で分離し、クマシーブルーを用いて染色して、タンパク質を可視化した。レーン１＝リンゴペクチナーゼ小胞体標的化シグナルペプチド（リンゴペクチナーゼシグナルペプチド＝配列番号９）を有するα−ガラクトシダーゼをコードする構築物（配列番号８）の発現産物。レーン２＝ＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチド（ＡＢＰＩシグナルペプチド＝配列番号４）を有するα−ガラクトシダーゼをコードする配列番号２の発現産物。レーン３＝リンゴペクチナーゼ小胞体標的化シグナルペプチド（配列番号９）を有する配列番号１２をコードする配列番号１１の発現産物。レーン４＝陰性の（α−ガラクトシダーゼコード配列を有さない）対照。レーン２の顕著なバンド（矢印）が、成熟組換えα−ガラクトシダーゼ単量体（配列番号２１）のサイズに対応する。クーマシー染色されたバンドは、豊富なα−ガラクトシダーゼタンパク質を示す。 多種多様なヒトα−ガラクトシダーゼ構築物を発現する植物の抽出物中の触媒活性のレベルを示すヒストグラムの図である。ベンサミアナタバコ植物から得られた葉を、以下に示す、異なるヒトα−ガラクトシダーゼ構築物に浸潤させた：Ａ＝配列番号８、リンゴペクチナーゼ小胞体標的化シグナルペプチド（リンゴペクチナーゼシグナルペプチド＝配列番号９）を有するα−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする。Ｂ＝配列番号２、ＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチド（ＡＢＰＩシグナルペプチド＝配列番号４）を有するα−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする。Ｃ＝配列番号１３、エンドキチナーゼＢ小胞体標的化シグナルペプチド（エンドキチナーゼシグナルタンパク質＝配列番号１４）を有するα−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする。Ｄ＝配列番号１１、リンゴペクチナーゼ小胞体標的化シグナルペプチド（リンゴペクチナーゼシグナル配列＝配列番号９）を有するα−ガラクトシダーゼタンパク質（配列番号１２）をコードする。それぞれの植物から得られた葉を、活性アッセイ用緩衝液中に抽出し、触媒活性を、ｐ−ニトロフェニルアルファ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＮＰ−アルファ−Ｄ−Ｇａｌ、ＧＢＢ１２９０、ＩＲＩＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を加水分解基質として使用して決定した。ｐ−ニトロフェノラート発色団の発生を、４０５ｎｍにおいてモニターした。 ２つの植物組換えヒトα−ガラクトシダーゼの、残存する触媒活性により測定したヒト血漿中での安定性（３７℃）を比較したグラフの図である。配列番号１１（リンゴペクチナーゼ小胞体標的化シグナルペプチドを有する配列番号１２をコードする）を用いて形質転換したベンサミアナタバコ植物の葉から得られたα−ガラクトシダーゼ（白四角）、および配列番号２（ＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドを有するα−ガラクトシダーゼ（配列番号１）をコードする）を用いて形質転換したベンサミアナタバコ植物の葉から得られたα−ガラクトシダーゼ（黒四角）を、植物の破壊、塩析およびクロマトグラフィーにより精製し、ヒト血漿中、３７℃で、１時間に至るまでの間インキュベートして、ｉｎ−ｖｉｖｏにおける薬物動態をシミュレートした。試料を、α−ガラクトシダーゼ触媒活性について、ＰＮＰ−Ｇアッセイにより、指定した間隔でアッセイした。配列番号１を発現するベンサミアナタバコ植物の葉から得られたα−ガラクトシダーゼのより大きな安定性に注目されたい（黒四角）。 植物細胞が発現したα−ガラクトシダーゼの触媒活性の安定性（黒四角）と、ヒト細胞培養物中で発現させた、市販のヒト組換えα−ガラクトシダーゼ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標））の触媒活性の安定性（白三角）とを比較するグラフの図である。配列番号２（ＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドを有するα−ガラクトシダーゼ（配列番号１）をコードする）を発現するＢＹ２細胞の未精製抽出物（黒四角）、および哺乳動物細胞培養物中で発現させたヒト組換えα−ガラクトシダーゼ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）、白三角）を、血漿中、３７℃で、１時間に至るまでの間インキュベートして、ｉｎ−ｖｉｖｏにおける薬物動態をシミュレートした。試料を、α−ガラクトシダーゼ触媒活性について、ＰＮＰ−Ｇアッセイにより、指定した間隔でアッセイした。植物細胞発現酵素およびヒト細胞発現酵素の安定性が類似することに注目されたい。 植物が発現したα−ガラクトシダーゼの触媒活性の安定性（黒四角）と、ヒト細胞培養物中で発現させた、市販のヒト組換えα−ガラクトシダーゼ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標））の触媒活性の安定性（白三角）とを比較するグラフの図である。配列番号２（ＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドを有するα−ガラクトシダーゼ（配列番号１）をコードする）を発現するＢＹ２細胞の未精製抽出物（黒四角）、および哺乳動物細胞培養物中で発現させたヒト組換えα−ガラクトシダーゼ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）、白三角）を、リソソーム環境をシミュレートする［酸性（ｐＨ４．６）の］条件下、３７℃で、１１日間に至るまでの間インキュベートした。試料を、インキュベートする際に、α−ガラクトシダーゼ触媒活性について、ＰＮＰ−Ｇアッセイにより、指定した間隔でアッセイした。９日間に至るまでの間、植物発現酵素および哺乳動物発現酵素の安定性が類似することに注目されたい。 植物細胞が発現したα−ガラクトシダーゼのグリコシラーゼ消化産物中のグリカン構造の分布を示すクロマトグラムの図である。配列番号２（ＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドを有するα−ガラクトシダーゼ（配列番号１）をコードする）を発現するＢＹ２細胞の抽出物の試料を、還元し、アルキル化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。タンパク質のバンドを採取して、トリプシン消化、続いて、ＰＮＧａｓｅ Ａ消化およびＰＮＧａｓｅ Ｆ消化の両方によるグリカン解析を行った。結果として生じた遊離のグリカンを、抽出し、精製し、蛍光試薬のアントラニルアミド（２ＡＢ）を用いて標識し、ＴＳＫ ｇｅｌ Ａｍｉｄｅ ８０順相ＨＰＬＣを使用して分離し、蛍光検出器を使用して検出した。５．９ＧＵおよび８．９ＧＵ（８４．５５分および１０８．０５分）における主要ピーク、ならびに１１２．３５におけるＭ９の小さなピークに注目されたい。 図７のクロマトグラム中に示されている個々のグリカンのパーセント面積として表す、植物細胞が発現したα−ガラクトシダーゼのグリカンのプロファイルを示す表の図である。それぞれの独立した解析（ＡおよびＢ）の同一のプロファイルに注目されたい。

本発明は、そのいくつかの実施形態では、植物細胞中でヒトα−ガラクトシダーゼを組換え発現するための発現ベクター、植物細胞中で発現ベクターによりα−ガラクトシダーゼを発現させるための方法、およびそれにより産生したヒトα−ガラクトシダーゼに関する。

本発明の適用は、以下の説明に記載するかまたは実施例により例示する詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、その他の実施形態が可能であり、または種々の方法で実行もしくは実施することが可能である。

本発明者らは、植物細胞中でヒトα−ガラクトシダーゼを組換え発現するための発現ベクターを構築し、ベクターを用いて、タバコ植物およびタバコ植物細胞を形質転換し、植物および細胞培養物から、触媒として活性なヒトα−ガラクトシダーゼを単離するに至った。発現した組換えヒトα−ガラクトシダーゼは、ｉｎ−ｖｉｖｏでの投与において通常遭遇する条件をシミュレートする条件下で、好ましい触媒活性を保持し、このことから、シミュレートした薬物動態は、その他の植物由来の組換えヒトα−ガラクトシダーゼと比較して改善されており、哺乳動物が発現した組換えヒトα−ガラクトシダーゼ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標））の薬物動態に類似することが示唆される。

したがって、本発明の一態様によれば、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸発現構築物であって、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｎ末端においてシロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドに翻訳時に融合され、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｃ末端において小胞体保持シグナルペプチドに翻訳時に融合される核酸発現構築物が提供される。

本明細書で使用する場合、用語「ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質」は、ヒトａ−ガラクトシダーゼＡ（ａ−Ｄ−ガラクトシドガラクトヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．２２；ａ−Ｇａｌ Ａ）ポリペプチドを指す。本発明のいくつかの実施形態によれば、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を有する成熟ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質（成熟ヒトＡ−Ｇａｌ）である。ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する、改変ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質であり得ることが理解されるであろう。本発明の発現ベクターがコードする改変ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の１つの非限定的な例は、配列番号１６（Ｇ−Ａ−Ｇａｌ）である。別の非限定的な例では、発現ベクターがコードするヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｎ末端グリシン残基（Ｇ）を有するα−ガラクトシダーゼタンパク質、例として、配列番号１６または配列番号２１と、Ｎ末端グリシン残基が存在しないα−ガラクトシダーゼタンパク質、例として、これらに限定されないが、配列番号７および配列番号２０とを両方含むヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の混合物であり得る。

本発明の別の態様によれば、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｎ末端においてシロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドに翻訳時に融合され、また、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｃ末端において小胞体保持シグナルペプチドにも翻訳時に融合される。

本明細書で使用する場合、用語「Ｎ末端において、翻訳時に融合される」または「Ｃ末端において、翻訳時に融合される」は、指定したペプチドが、典型的には組換え発現の結果として、ペプチド結合を介して、成熟ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質のＮ末端またはＣ末端のアミノ酸に共有結合でつながることを指す。

本明細書で使用する場合、用語「シロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチド」は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のオーキシン結合性タンパク質（Ｕｎｉ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ３３４８７）のリーダーペプチド配列を指し、このペプチドは、発現したタンパク質を植物細胞内の小胞体に導くことが可能である。一実施形態では、シロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドは、配列番号４に記載されるアミノ酸３３個のポリペプチドである。

本明細書で使用する場合、用語「小胞体保持シグナルペプチド」は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に存在して、ポリペプチドのゴルジ体からの回収および小胞体における保持を引き起こすペプチド配列を指す（Ｒａｙｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ、Ｖｏｌ．４９、Ｎｏ．３２６、１４６３〜１４７２頁、１９９８年；およびＮｅｕｍａｎｎら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ、２００３年；９２：１６７〜１８０頁を参照されたい）。一実施形態では、小胞体保持シグナルペプチドは、ＫＤＥＬ（配列番号１７）またはＳＥＫＤＥＬ（配列番号６）である。その他の適切な植物小胞体シグナルが、当技術分野で公知である（Ｐａｇｎｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ、Ｖｏｌ．５０、１５７〜６４頁を参照されたい）。

したがって、本発明のある実施形態によれば、Ｎ末端においてシロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドに翻訳時に融合されるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質であって、かつＣ末端において小胞体保持シグナルペプチドに翻訳時に融合されるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する。

本明細書で使用する場合、用語「核酸配列」は、単離され、ＲＮＡ配列、相補的なポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムのポリヌクレオチド配列、および／または複合のポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組合せ）の形態で提供される一本鎖または二本鎖の核酸配列を指す。

本明細書で使用する場合、句「相補的なポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意のその他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する、メッセンジャーＲＮＡの逆転写から得られる配列を指す。続いて、そのような配列を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅することができる。

本明細書で使用する場合、句「ゲノムのポリヌクレオチド配列」は、染色体から得られる（単離される）配列を指し、したがって、この句は、染色体の近接する部分を示す。

本明細書で使用する場合、句「複合のポリヌクレオチド配列」は、少なくとも部分的に相補的であり、少なくとも部分的にゲノム性である配列を指す。複合の配列は、本発明のポリペプチドをコードするのに必要ないくつかのエクソン配列、およびそれらの間に入るいくつかのイントロン配列を含むことができる。イントロン配列は、その他の遺伝子を含めて、任意の供給源から得ることができ、典型的には、保存されているスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列は、シス作用性の発現調節エレメントをさらに含むことができる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を、発現のために最適化する。そのような配列の改変の例として、これらに限定されないが、Ｇ／Ｃ含有量を変化させて、目的の植物種中に典型的に見出されるＧ／Ｃ含有量により厳密に近づけること、およびコドン最適化と一般に呼ばれる、植物種中に非定型的に見出されるコドンを除去することが挙げられる。一実施形態では、Ｎ末端において、シロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドに翻訳時に融合されるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質であって、かつＣ末端において、小胞体保持シグナルペプチドに翻訳時に融合されるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする核酸配列のコドンの使用を、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）またはベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のために最適化する。

句「コドン最適化」は、目的の植物内でのコドンの使用に近い、構造遺伝子またはその断片内において使用するのに適切なＤＮＡヌクレオチドを選択することを指す。したがって、最適化した遺伝子または核酸配列は、本来のまたは天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列が、統計学的に好ましいかまたは統計学的に際立つコドンを植物内において利用するために改変されている遺伝子を指す。ヌクレオチド配列を典型的には、ＤＮＡレベルで調べ、植物種中での発現のために最適化するコード領域を、任意の適切な手順を使用して、例えば、Ｓａｒｄａｎａら（１９９６年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、１５：６７７〜６８１頁）の記載に従って決定する。この方法では、コドンの使用の標準偏差、すなわち、コドンの使用の偏りの尺度を、最初に、非常に多く発現する植物遺伝子の各コドンの使用と比べた本来の遺伝子の各コドンの使用の比例偏差の二乗を見出し、続いて、偏差の二乗の平均を計算することによって計算することができる。使用する式は、１ＳＤＣＵ＝ｎ＝１Ｎ［（Ｘｎ−Ｙｎ）／Ｙｎ］２／Ｎであり、式中、Ｘｎは、非常に多く発現する植物遺伝子中のコドンｎの使用の頻度を指し、Ｙｎは、目的の遺伝子中のコドンｎの使用の頻度を指し、Ｎは、目的の遺伝子中のコドンの総数を指す。双子葉植物の非常に多く発現する遺伝子から得られたコドンの使用の表が、Ｍｕｒｒａｙらのデータを使用して編さんされている（１９８９年、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：４７７〜４９８頁）。

核酸配列を、特定の植物細胞型に好ましいコドンの使用に従って最適化する１つの方法は、任意の別途の統計学的な計算を実施せずに、コドン最適化の表、例として、日本のＮＩＡＳ（農業生物資源研究所）のＤＮＡバンクから、オンラインのコドンの使用のデータベースにおいて提供されている表の直接的な使用に基づく（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）。コドンの使用のデータベースは、いくつかの異なる種についてのコドンの使用の表を含有し、コドンの使用の表はそれぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ中に存在するデータに基づいて統計学的に決定されている。

上記の表を使用して、特定の種（例えば、米）における各アミノ酸について、最も好ましいかまたは最も際立つコドンを決定することによって、目的のタンパク質をコードする、天然に存在するヌクレオチド配列について、その特定の植物種のためにコドン最適化を行うことができる。これは、アミノ酸に関して、特定の種のゲノムにおいて低い統計学的発生率を示す場合があるコドンを、統計的により際立つ、対応するコドンで置き換えることによって行う。しかし、現存する制限部位を欠失させるため、潜在的に有用な接合部において新しい部位（シグナルペプチドもしくは終結カセットを付加するための５’末端および３’末端；切断し、セグメントを一緒にスプライスして、正しい完全長配列を産生するために使用することができるであろう内部の部位）を生み出すため、またはｍＲＮＡの安定性もしくは発現に負の影響を及ぼす恐れがあるヌクレオチド配列を排除するために、１つまたは複数の際立つ程度がより低いコドンを選択することができる。

所望のコードヌクレオチド配列が、任意の改変に先立って、特定の植物種において統計学的に際立つコドンに対応するいくつかのコドンをすでに含有する場合がある。したがって、本来のヌクレオチド配列のコドン最適化は、所望のヌクレオチド配列内のどのコドンが、特定の植物に関して統計学的に際立っていないかを決定すること、およびこれらのコドンを、特定の植物のコドンの使用の表に従って改変して、コドンが最適化された誘導体を産生することを含むことができる。改変ヌクレオチド配列がコードするタンパク質が、対応する、天然に存在するまたは本来の遺伝子がコードするタンパク質よりも高いレベルで産生されるならば、改変ヌクレオチド配列は、植物コドンの使用のために、完全に最適化してもまたは部分的に最適化してもよい。コドンの使用を変化させることによる合成遺伝子の構築は、例えば、国際公開第９３／０７２７８号に記載されている。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、配列番号１８に記載される核酸配列によりコードされる。本発明のさらなる実施形態によれば、シロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドは、配列番号５に記載される核酸配列によりコードされる。本発明のその上さらなる実施形態によれば、小胞体保持シグナルペプチドは、配列番号１９に記載される核酸配列によりコードされる。本発明のその上さらなる実施形態によれば、Ｎ末端において、シロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドに翻訳時に融合されるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質であって、かつＣ末端において、小胞体保持シグナルペプチドに翻訳時に融合されるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、配列番号２に記載される核酸配列によりコードされる。

本明細書で使用する場合、用語「核酸発現構築物」は、本発明のいくつかの実施形態の核酸（例えば、配列番号２）、および宿主植物細胞中で核酸の転写を導くための少なくとも１つのプロモーターを含む核酸構築物を指す。適切な形質転換のアプローチのさらなる詳細を、下記に提供する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の核酸配列、および植物宿主細胞中で核酸配列の転写を導くためのプロモーターを含む核酸発現構築物が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結されている。

調節配列が、それに連結されているコード配列に対して調節効果を発揮することが可能である場合に、コード核酸配列は、調節配列（例えば、プロモーター）に「作動可能に連結されている」。

本発明の核酸構築物は、任意の適切なプロモーター配列を使用することができる。好ましくは、プロモーターは、構成性プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである。

本明細書で使用する場合、句「植物発現性」は、それに付加したかまたはその中に含有させた任意の追加の調節エレメントを含むプロモーター配列が、植物の細胞、組織または器官、好ましくは、単子葉植物または双子葉植物の細胞、組織または器官において、発現の誘導、付与、活性化または増強が少なくとも可能であることを指す。そのようなプロモーターは、構成性（すなわち、複数の組織において、高いレベルの遺伝子発現を導くことが可能である）、組織特異的（すなわち、特定の組織（複数可）において、遺伝子発現を導くことが可能である）、誘導性（すなわち、刺激下で、遺伝子発現を導くことが可能である）、またはキメラ（すなわち、少なくとも２つの異なるプロモーターの部分から形成される）であり得る。

本発明のいくつかの実施形態の方法に有用である好ましいプロモーターの例を、表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに示す。

特定の実施形態によれば、本発明で利用するプロモーターは、強力に構成的なプロモーターであり、したがって、形質転換に続いて、構築物挿入体の過剰発現が生じる。特定の実施形態では、プロモーターは、シロイヌナズナのアクチン２（ＡＣＴ２）のプロモーターである（受託番号：Ｕ４１９９８、上記の表Ｉを参照されたい）。

本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物は、適切な選択マーカーおよび／または複製開始点をさらに含むことができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、利用する核酸構築物は、シャトルベクターであり、シャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増殖する（この場合、構築物は、適切な選択マーカーおよび複製開始点を含む）こと、ならびに細胞中での増殖に適合することの両方が可能である。本発明による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体であり得る。

本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物を利用して、植物細胞を安定または一過性に形質転換することができる。安定な形質転換の場合、核酸は、植物ゲノム内に組み込まれ、したがって、安定なかつ遺伝する形質を示す。一過性の形質転換の場合、形質転換した細胞が、外因性ポリヌクレオチドを発現するが、このポリヌクレオチドは、ゲノム内には組み込まれず、したがって、一過性の形質を示す。

したがって、本発明のいくつかの態様によれば、本発明の核酸構築物を含む単離細胞が提供される。

本明細書で使用する場合、用語「単離細胞」は、天然の環境、例えば、植物から少なくとも部分的に分離された細胞を指す。いくつかの実施形態では、単離細胞は、植物全体の植物細胞である。いくつかの実施形態では、単離細胞は、植物細胞、例えば、培養中の植物細胞である。

用語「植物」は、本明細書で使用する場合、植物全体、植物の祖先および子孫、ならびに種子、苗条、幹、根（塊茎を含む）を含めた、植物部分、ならびに植物の細胞、組織および器官を網羅する。植物は、懸濁培養物、胚、成長点領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含めた、任意の形態をとることができる。本発明の方法において特に有用である植物として、スーパーファミリー緑色植物に属する全ての植物、特に、飼い葉もしくは飼料となる豆類、鑑賞用植物、食用作物、木または低木を含めた、単子葉植物および双子葉植物が挙げられる。それらは、Ａｃａｃｉａ（アカシア）属種、Ａｃｅｒ（アセル）属種、Ａｃｔｉｎｉｄｉａ（アクチニディア）属種、Ａｅｓｃｕｌｕｓ（アエスクルス）属種、Ａｇａｔｈｉｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ（アガティス アウストラリス）、Ａｌｂｉｚｉａ ａｍａｒａ（アルビジア アマラ）、Ａｌｓｏｐｈｉｌａ ｔｒｉｃｏｌｏｒ（アルソフィラ トリカラー）、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ（アンドロポゴン）属種、Ａｒａｃｈｉｓ（アラキス）属種、Ａｒｅｃａ ｃａｔｅｃｈｕ（アレカ カテチュウ）、Ａｓｔｅｌｉａ ｆｒａｇｒａｎｓ（アステリア フラグランス）、Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｃｉｃｅｒ（アストラガルス キセル）、Ｂａｉｋｉａｅａ ｐｌｕｒｉｊｕｇａ（バイキエア プルリユガ）、Ｂｅｔｕｌａ（ベツラ）属種．、Ｂｒａｓｓｉｃａ（ブラシカ）属種、Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ（ブルグイエラ ジムノルヒザ）、Ｂｕｒｋｅａ ａｆｒｉｃａｎａ（ブルケア アフリカナ）、Ｂｕｔｅａ ｆｒｏｎｄｏｓａ（ブテア フロンドーサ）、Ｃａｄａｂａ ｆａｒｉｎｏｓａ（カダバ ファリノサ）、Ｃａｌｌｉａｎｄｒａ（カリアンドラ）属種、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（カメリア シネンシス）、Ｃａｎｎａ ｉｎｄｉｃａ（カンナ インディカ）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ（カプシクム）属種、Ｃａｓｓｉａ（カシア）属種、Ｃｅｎｔｒｏｅｍａ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ（セントロエマ プベスケンス）、Ｃｈａｃｏｏｍｅｌｅｓ（カクーメレス）属種、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｓｓｉａ（キンナモム カシア）、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ（コヒア アラビカ）、Ｃｏｌｏｐｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｍｏｐａｎｅ（コロフォスペルムム モパネ）、Ｃｏｒｏｎｉｌｌｉａ ｖａｒｉａ（コロニラ ヴァリア）、Ｃｏｔｏｎｅａｓｔｅｒ ｓｅｒｏｔｉｎａ（コトネアステル セロチナ）、Ｃｒａｔａｅｇｕｓ（クラテグス）属種、Ｃｕｃｕｍｉｓ（ククミス）属種、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ（クプレッサス）属種、Ｃｙａｔｈｅａ ｄｅａｌｂａｔａ（シアテア ディアルバータ）、Ｃｙｄｏｎｉａ ｏｂｌｏｎｇａ（シドニア オブロンガ）、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ（クリプトメリア ジャポニカ）、Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ（シンボポゴン）属種、Ｃｙｎｔｈｅａ ｄｅａｌｂａｔａ（シンシア ディアルバータ）、Ｃｙｄｏｎｉａ ｏｂｌｏｎｇａ（シドニア オブロンガ）、Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｍｏｎｅｔａｒｉａ（ダルベルジア モネタリア）、Ｄａｖａｌｌｉａ ｄｉｖａｒｉｃａｔａ（ダバリア ディバリカタ）、Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ（デスモディウム）属種、Ｄｉｃｋｓｏｎｉａ ｓｑｕａｒｏｓａ（ディクソニア スクアローサ）、Ｄｉｂｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ ａｍｐｌｅｃｔｅｎｓ（ジベテロポゴン アンプレクテンス）、Ｄｉｏｃｌｅａ（ジオクレア）属種、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ（ドリコス）属種、Ｄｏｒｙｃｎｉｕｍ ｒｅｃｔｕｍ（ドリクニウム レクタム）、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ（エキノクロア ピラミダリス）、Ｅｈｒａｆｆｉａ（エーラフィア）属種、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ（エレウシン コラカナ）、Ｅｒａｇｒｅｓｔｉｓ（エラグレスティス）属種、Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ（エリトリナ）属種、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ（ユーカリプタス）属種、Ｅｕｃｌｅａ ｓｃｈｉｍｐｅｒｉ（ユークレア シンペリ）、Ｅｕｌａｌｉａ ｖｉｌｌｏｓａ（ユーラリア ビローサ）、Ｐａｇｏｐｙｒｕｍ（パゴピルム）属種、Ｆｅｉｊｏａ ｓｅｌｌｏｗｉａｎａ（フェイジョア セロウィアナ）、Ｆｒａｇａｒｉａ（フラガリア）属種、Ｆｌｅｍｉｎｇｉａ（フレミンギア）属種、Ｆｒｅｙｃｉｎｅｔｉａ ｂａｎｋｓｌｉ（フレイシネチア バンクスリ）、Ｇｅｒａｎｉｕｍ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ（ゲラニウム ツンベルギー）、Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ（ギンコ ビローバ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ（グリシン ジャバニカ）、Ｇｌｉｒｉｃｉｄｉａ（グリリシディア）属種、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ゴシピウム ヒルスツム）、Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ（グレビレア）属種、Ｇｕｉｂｏｕｒｔｉａ ｃｏｌｅｏｓｐｅｒｍａ（グイボウルティア コレスペルマ）、Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ（ヘディサルム）属種、Ｈｅｍａｆｆｈｉａ ａｌｔｉｓｓｉｍａ（ヘマフィア アルチシマ）、Ｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ ｃｏｎｔｏｆｆｕｓ（ヘテロポゴン コントフス）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（ホルデウム ブルガレ）、Ｈｙｐａｒｒｈｅｎｉａ ｒｕｆａ（ヒパーレニア ルファ）、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｅｒｅｃｔｕｍ（ヒペリクム エレクツム）、Ｈｙｐｅｆｆｈｅｌｉａ ｄｉｓｓｏｌｕｔｅ（ヒペフェリア ジソルテ）、Ｉｎｄｉｇｏ ｉｎｃａｍａｔａ（インジゴ インカマタ）、Ｉｒｉｓ（アイリス）属種、Ｌｅｐｔａｒｒｈｅｎａ ｐｙｒｏｌｉｆｏｌｉａ（レプタルレナ ピロリフォリア）、Ｌｅｓｐｅｄｅｚａ（レスペデザ）属種、Ｌｅｔｔｕｃａ（レツカ）属種、Ｌｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ（レウカエナ レウコケファラ）、Ｌｏｕｄｅｔｉａ ｓｉｍｐｌｅｘ（ロウデチア シンプレクス）、Ｌｏｔｏｎｕｓ ｂａｉｎｅｓｌｉ（ロトヌス バイネスリ）、Ｌｏｔｕｓ（ロータス）属種、Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ ａｘｉｌｌａｒｅ（マクロチローマ アキシラレ）、Ｍａｌｕｓ（マルス）属種、Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（マニホット エスクレンタ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ（メジカゴ サチバ）、Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ（メタセコイヤ グリプトストロボイデス）、Ｍｕｓａ ｓａｐｉｅｎｔｕｍ（ムサ サピエンタム）、Ｎｉｃｏｔｉａｎｕｍ（ニコチアヌム）属種、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ（オノブリキス）属種、Ｏｒｎｉｔｈｏｐｕｓ（オルニトプス）属種、Ｏｒｙｚａ（オリザ）属種、Ｐｅｌｔｏｐｈｏｒｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ（ペルトフォルム アフリカヌム）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ（ペニセツム）属種、Ｐｅｒｓｅａ ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ（ペルセア グラチシマ）、Ｐｅｔｕｎｉａ（ペチュニア）属種、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ（ファセオルス）属種、Ｐｈｏｅｎｉｘ ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ（フェニックス カナリエンシス）、Ｐｈｏｒｍｉｕｍ ｃｏｏｋｉａｎｕｍ（フォルミウム クッキアヌム）、Ｐｈｏｔｉｎｉａ（フォティニア）属種、Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ（ピセア グラウカ）、Ｐｉｎｕｓ（ピヌス）属種、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ピスム サティブム）、Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ ｔｏｔａｒａ（ポドカルプス トタラ）、Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ ｆｌｅｃｋｉｉ（ポゴナルトリア フレキイ）、Ｐｏｇｏｎａｆｆｈｒｉａ ｓｑｕａｒｒｏｓａ（ポゴナフリア スクアロサ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ（ポプルス）属種、Ｐｒｏｓｏｐｉｓ ｃｉｎｅｒａｒｉａ（プロソピス シネラリア）、Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ（シュードツガ メンジエシイ）、Ｐｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ ｓｔｅｌｌａｔｕｍ（プテロロビウム ステラツム）、Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ピルス コムニス）、Ｑｕｅｒｃｕｓ（ケルクス）属種、Ｒｈａｐｈｉｏｌｅｐｉｓ ｕｍｂｅｌｌａｔａ（ラフィオレピス ウンベラタ）、Ｒｈｏｐａｌｏｓｔｙｌｉｓ ｓａｐｉｄａ（ロパロスチリス サピダ）、Ｒｈｕｓ ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ（ルス ナタレンシス）、Ｒｉｂｅｓ ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａ（リベス グロッスラリア）、Ｒｉｂｅｓ（リベス）属種、Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ（ロビニア シュードアカシア）、Ｒｏｓａ（ローザ）属種、Ｒｕｂｕｓ（ルブス）属種、Ｓａｌｉｘ（サリクス）属種、Ｓｃｈｙｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｍ（スキザクリウム サングイネウム）、Ｓｃｉａｄｏｐｉｔｙｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ（スシアドピティス ヴァティシラタ）、Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ（セコイア セムペルビレンス）、Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ（セコイアデンドロン ギガンテウム）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（ソルガム バイカラー）、Ｓｐｉｎａｃｉａ（スピナシア）属種、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ（スポロボルス フィムブリアツス）、Ｓｔｉｂｕｒｕｓ ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ（スチブルス アロペクロイデス）、Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｏｓ ｈｕｍｉｌｉｓ（スチロサントス フミリス）、Ｔａｄｅｈａｇｉ（タデハギ）属種、Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ（タキソディウム ディスチクム）、Ｔｈｅｍｅｄａ ｔｒｉａｎｄｒａ（テメダ トリアンドラ）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ（トリフォリウム）属種、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ（トリチカム）属種、Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ（ツガ ヘテロフィラ）、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ（バクシニウム）属種、Ｖｉｃｉａ（ビキア）属種、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ビティス ビニフェラ）、Ｗａｔｓｏｎｉａ ｐｙｒａｍｉｄａｔａ（ワトソニア ピラミダタ）、Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ（ザンテデスキア アエチオピカ）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（ゼア マイス）、アマランス、チョウセンアザミ、アスパラガス、ブロッコリ、芽キャベツ、キャベツ、セイヨウアブラナ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードの葉、亜麻、ケール、レンチル、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、米、大豆、麦わら、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、カボチャ、茶、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、カラスムギ、落花生、エンドウ、レンチルおよびアルファルファ、綿、菜種、セイヨウアブラナ、トウガラシ、ヒマワリ、タバコ、ナスビ、ユーカリ、木、鑑賞用植物、多年生牧草および飼料作物を含むリストから選択される。それに代わって、藻類およびその他の非緑色植物も、本発明の方法のために使用することができる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の方法が使用する植物または植物細胞は、米、トウモロコシ、小麦、大麦、落花生、ジャガイモ、ゴマ、オリーブ、木、パーム油、バナナ、大豆、ヒマワリ、セイヨウアブラナ、サトウキビ、アルファルファ、キビ、マメ科（ソラ豆、エンドウ）、亜麻、ルピナス、菜種、タバコ、ポプラおよび綿等の作物植物または作物植物の細胞である。

さらなる実施形態によれば、植物細胞は、タバコ細胞、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｉｈｚｏｇｅｎｅｓ）形質転換根細胞、セロリ細胞、生姜細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞を含む。一実施形態では、タバコ細胞は、タバコ細胞株、例として、これに限定されないが、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）Ｌ．ｃｖ Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ（ＢＹ−２）細胞に由来する（Ｎａｇａｔａら、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｙｔｏｌ、１９９２年；１３２：１〜３０頁）。これらに限定されないが、固体表面（例えば、プラスチック製の培養槽もしくは培養プレート等の）上での培養または懸濁培養を含めた、任意のタイプの適切な培養方法に従って、植物細胞を成長させることができる。ＢＹ−２細胞およびニンジン細胞等のいくつかの細胞は、懸濁培養し、成長させることができることが注目されるであろう。植物細胞を懸濁培養するための適切なデバイスおよび方法が、当技術分野で公知であり、例えば、国際公開第９８／１３４６９号、国際公開第２００５／０８０５４４号および国際公開第２００７／０１０５３３号に記載されている。さらに別の実施形態では、細胞は、これに限定されないが、ベンサミアナタバコを含めた、タバコの植物全体または植物組織の細胞である。

外来遺伝子を単子葉植物および双子葉植物の両方内に導入する種々の方法がある（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５〜２２５頁；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８：２７４〜２７６頁）。

外因性ＤＮＡの植物ゲノムＤＮＡ内への安定な組込みを引き起こす主要な方法が、２つの主要なアプローチ、すなわち、以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む。

（ｉ）アグロバクテリウム媒介型の遺伝子導入：Ｋｌｅｅら、（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７〜４８６頁；ＫｌｅｅおよびＲｏｇｅｒｓ、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、Ｖｏｌ．６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９）２〜２５頁；Ｇａｔｅｎｂｙ、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｕｎｇ，Ｓ．およびＡｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．（１９８９）９３〜１１２頁。

（ｉｉ）直接的なＤＮＡの取込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、Ｖｏｌ．６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ、Ｓｃｈｅｌｌ、Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９）５２〜６８頁；このアプローチには、ＤＮＡのプロトプラスト内への直接的な取込みのための方法：Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ら、（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１０７２〜１０７４頁；植物細胞の短時間の電気ショックにより誘発されるＤＮＡの取込み：Ｚｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（１９８８）７：３７９〜３８４頁、Ｆｒｏｍｍら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：７９１〜７９３頁；植物の細胞または組織内への微粒子銃によるＤＮＡの注入：Ｋｌｅｉｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：５５９〜５６３頁、ＭｃＣａｂｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：９２３〜９２６頁、Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２０６〜２０９頁；マイクロピペットシステムの使用：Ｎｅｕｈａｕｓら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）７５：３０〜３６頁、ＮｅｕｈａｕｓおよびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２１３〜２１７頁；ガラス繊維もしくは炭化ケイ素の髭結晶による、細胞培養物、胚もしくはカルス組織の形質転換：米国特許第５，４６４，７６５号明細書；または出芽花粉を加えたＤＮＡの直接的なインキュベーション：ＤｅＷｅｔら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ、Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．およびＭａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．およびＤａｎｉｅｌｓ，Ｗ．編、Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８５）１９７〜２０９頁、ならびにＯｈｔａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：７１５〜７１９頁が含まれる。

アグロバクテリウムのシステムは、定義されたＤＮＡセグメントを含有するプラスミドベクターの使用を含み、これらのセグメントは、植物ゲノムＤＮＡ内に組み込まれる。植物組織の接種方法は、植物種、およびアグロバクテリウムによる送達システムに応じて変化する。広く使用されているアプローチが、任意の組織外植片を用いて実施することができるリーフディスクの手順であり、組織外植片は、植物全体の分化を開始するための良好な供給源を提供する。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８）１〜９頁を参照されたい。別のアプローチは、真空浸潤と組み合わせたアグロバクテリウムによる送達システムを利用する。アグロバクテリウムのシステムは、トランスジェニック双子葉植物を生み出す場合に、とりわけ実行可能である。

植物細胞内への直接的なＤＮＡの移入には、種々の方法がある。エレクトロポレーションの場合、プロトプラストを強力な電場に短時間曝す。マイクロインジェクションの場合、非常に小型のマイクロピペットを使用して、ＤＮＡを細胞内に機械的に直接注入する。微小粒子銃の場合、ＤＮＡを、微小発射体、例として、硫酸マグネシウム結晶またはタングステン粒子の上に吸着させ、微小発射体を、細胞または植物組織内に物理的に加速する。

安定な形質転換に続いて、植物の増殖を行う。植物の増殖の最も一般的な方法は、種子による。しかし、種子の増殖による再分化には、ヘテロ接合性に起因して、作物の一様性を欠くという不備がある。これは、種子は、植物により、メンデルの法則により制御される遺伝分散に従って産生されるからである。基本的には、それぞれの種子が、遺伝子的に異なり、それぞれが成長し、それ自体の特有の形質を示す。したがって、再分化した植物が、親のトランスジェニック植物と同一の形質および特徴を示すように、形質転換植物が産生されるのが好ましい。したがって、形質転換植物を、マイクロプロパゲーションにより再分化させるのが好ましく、この方法により、形質転換植物の一貫性のある再生産が迅速に提供される。

マイクロプロパゲーションは、選択した親の植物または栽培品種から切除された組織の単一小片から、新しい世代の植物を成長させるプロセスである。このプロセスにより、融合タンパク質を発現する好ましい組織を有する植物の大量再生産が可能になる。作製される新しい世代の植物は、元々の植物と遺伝子的に同一であり、元々の植物の全ての特徴を示す。マイクロプロパゲーションは、良質の植物材料の、短い期間の大量生産を可能にし、選択した栽培品種の、元々のトランスジェニック植物または形質転換植物の特徴を保存した状態での急速な増殖をもたらす。植物をクローニングする利点は、植物の繁殖のスピード、ならびに作製される植物の品質および一様性である。

マイクロプロパゲーションは、多段階の手順であり、この手順では、培地または増殖条件を段階間で変化させることが必要となる。したがって、マイクロプロパゲーションのプロセスには、４つの基本的な段階、すなわち、段階１：最初の組織培養、段階２：組織培養による増殖、段階３：分化および植物の形成、ならびに段階４：温室栽培および耐性強化が関与する。段階１：最初の組織培養の間に、組織培養物を確立し、混入物を含有しないことを保証する。段階２の間に、十分な数の組織試料を産生して、生産目標を達成するまで、最初の組織培養物を増殖させる。段階３の間に、段階２で成長させた組織試料を分け、個別の小植物に成長させる。段階４では、形質転換小植物を温室に移して、耐性強化を行い、植物の光に対する耐性を徐々に増加させ、その結果、植物は、天然の環境で成長することができる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、トランスジェニック植物を、葉細胞、成長点細胞または植物全体の一過性の形質転換により生成する。

一過性の形質転換は、上記の直接的なＤＮＡ移入の方法、または改変植物ウイルスを使用するウイルス性感染のうちのいずれかにより行うことができる。

植物宿主の形質転換に有用であることが示されているウイルスは、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）、およびインゲンマメモザイクウイルス（ＢＶまたはＢＣＭＶ）を含む。植物ウイルスを使用する植物の形質転換が、米国特許第４，８５５，２３７号明細書（ビーンゴールデンモザイクウイルス；ＢＧＶ）、欧州特許第６７，５５３号明細書（ＴＭＶ）、特開昭６３−１４６９３号公報（ＴＭＶ）、欧州特許第１９４，８０９号明細書（ＢＶ）、欧州特許第２７８，６６７号明細書（ＢＶ）；およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ら、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７２〜１８９頁（１９８８）に記載されている。外来性ＤＮＡを、植物を含めた、多くの宿主中で発現させる場合に使用するための偽ウイルス粒子が、国際公開第８７／０６２６１号に記載されている。

本発明のいくつかの実施形態によれば、一過性の形質転換のために使用するウイルスは、非病原性であり、したがって、成長率の低下、モザイク、環状のスポット、葉まき、黄変、ストリークの発生、ポックスの形成、腫瘍の形成、および穴が開くこと等の重度の症状を引き起こし得ない。適切な非病原性ウイルスは、天然に存在する非病原性ウイルスまたは人工的に弱毒化したウイルスであり得る。ウイルスの減弱化は、これらに限定されないが、致死量を下回る加熱、化学的処理を含めた、当技術分野で周知の方法を使用することによってか、または例えば、ＫｕｒｉｈａｒａおよびＷａｔａｎａｂｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、４：２５９〜２６９頁、２００３年）、Ｇａｌ−ｏｎら（１９９２）、Ａｔｒｅｙａら（１９９２）、ならびにＨｕｅｔら（１９９４）等の記載に従う、定方向突然変異誘発の技法によって行うことができる。

適切なウイルス株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等の利用可能な供給元からか、または感染植物からの単離により得ることができる。感染植物組織からのウイルスの単離は、例えば、ＦｏｓｔｅｒおよびＴａｔｌｏｒ編、「Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｆｒｏｍ Ｖｉｒｕｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ）、Ｖｏｌ ８１）」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９８年に記載されている技法等の当技術分野で周知の技法により行うことができる。手短に述べると、感染植物の組織は、高い濃度の適切なウイルスを含有すると考えられており、好ましくは、若葉および花弁を緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝溶液）中に粉砕して、ウイルスに感染している樹液を生成し、この樹液は、続く接種において使用することができる。

植物中への非ウイルス性の核酸配列の導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築が、上記の参考文献、ならびにＤａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７２：２８５〜２９２頁；Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８７）６：３０７〜３１１頁；Ｆｒｅｎｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：１２９４〜１２９７頁；Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６９：７３〜７６頁；および米国特許第５，３１６，９３１号明細書により示されている。

ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、適切な改変を、ウイルス自体にもたらすことができる。それに代わって、外来性ＤＮＡを有する所望のウイルスベクターを構築しやすくするために、最初に、ウイルスを細菌プラスミド中にクローニングすることもできる。次いで、ウイルスは、プラスミドから切り出され得る。ウイルスが、ＤＮＡウイルスである場合、細菌の複製開始点をウイルスＤＮＡにつなぐことができ、次いで、ウイルスＤＮＡは細菌により複製される。このＤＮＡの転写および翻訳により、コートタンパク質が産生され、コートタンパク質が、ウイルスＤＮＡのキャプシドを形成する。ウイルスが、ＲＮＡウイルスである場合、ウイルスを一般に、ｃＤＮＡとしてクローニングし、プラスミド中に挿入する。次いで、プラスミドを使用して、構築の全てを行う。この際、プラスミドのウイルス配列の転写、およびウイルス遺伝子の翻訳が行われて、コートタンパク質（複数可）が産生され、コートタンパク質が、ウイルスＲＮＡのキャプシドを形成することによって、ＲＮＡウイルスが産生される。

一実施形態では、植物ウイルスのポリヌクレオチドが提供され、この場合、本来のコートタンパク質コード配列は、ウイルスのポリヌクレオチドから欠失しており、組換え植物ウイルスポリヌクレオチドの植物宿主中での発現、パッケージング、および組換え植物ウイルスポリヌクレオチドによる宿主の全身性の感染の確保を可能にする、外から加える植物ウイルスコートタンパク質コード配列と、外から加えるプロモーター、好ましくは、外から加えるコートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーターとが挿入されている。それに代わって、タンパク質が産生されるように、コートタンパク質遺伝子内に、外から加えるポリヌクレオチド配列を挿入することによって、コートタンパク質遺伝子を不活性化することもできる。組換え植物ウイルスポリヌクレオチドは、１つまたは複数の追加の外から加えるサブゲノムプロモーターを含有することもできる。外から加えるサブゲノムプロモーターはそれぞれ、植物宿主中で、隣接する遺伝子またはポリヌクレオチド配列を転写するまたは発現させることが可能であり、相互の組換えおよび本来のサブゲノムプロモーターとの組換えはできない。２つ以上のポリヌクレオチド配列が含まれる場合には、外から加える（外来性の）ポリヌクレオチド配列を、本来の植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接させてか、または本来の植物ウイルスサブゲノムプロモーターおよび外から加える植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接させて挿入することができる。外から加えるポリヌクレオチド配列は、宿主植物において、サブゲノムプロモーターの制御下で転写されまたは発現して、所望の産物を産生する。

第２の実施形態では、組換え植物ウイルスポリヌクレオチドが、第１の実施形態と同様に提供されるようにるが、但し、外から加えるコートタンパク質コード配列の代わりに、本来のコートタンパク質コード配列を、外から加えるコートタンパク質サブゲノムプロモーターのうちの１つに隣接させて置く。

第３の実施形態では、組換え植物ウイルスポリヌクレオチドが提供され、この場合、本来のコートタンパク質遺伝子が、そのサブゲノムプロモーターに隣接しており、１つまたは複数の外から加えるサブゲノムプロモーターが、ウイルスポリヌクレオチド内に挿入されている。挿入された外から加えるサブゲノムプロモーターは、植物宿主中で、隣接する遺伝子を転写するまたは発現させることが可能であり、相互の組換えおよび本来のサブゲノムプロモーターとの組換えはできない。外から加えるポリヌクレオチド配列を、外から加えるサブゲノムの植物ウイルスプロモーターに隣接させて挿入することができ、したがって、この配列は、宿主植物において、サブゲノムプロモーターの制御下で転写されまたは発現して、所望の産物を産生する。

第４の実施形態では、組換え植物ウイルスポリヌクレオチドが、第３の実施形態と同様に提供されるが、但し、本来のコートタンパク質コード配列を、外から加えるコートタンパク質コード配列で置き換える。

組換え植物ウイルスポリヌクレオチドがコードするコートタンパク質によって、ウイルスベクターのキャプシドが形成されて、組換え植物ウイルスが作製される。組換え植物ウイルスポリヌクレオチドまたは組換え植物ウイルスを使用して、適切な宿主植物を感染させる。組換え植物ウイルスポリヌクレオチドは、宿主内で複製すること、宿主内で全身性に広がること、および宿主内で外来遺伝子（複数可）（外因性ポリヌクレオチド）を転写または発現して、所望のタンパク質を産生することが可能である。

ウイルスを植物に接種するための技法を、ＦｏｓｔｅｒおよびＴａｙｌｏｒ編、「Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｆｒｏｍ Ｖｉｒｕｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ）、Ｖｏｌ ８１）」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９８年；ＭａｒａｍｏｒｏｓｈおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ編、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、７ ｖｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９６７〜１９８４頁；Ｈｉｌｌ，Ｓ．Ａ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４年；Ｗａｌｋｅｙ，Ｄ．Ｇ．Ａ．、「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５年；ならびにＫａｄｏおよびＡｇｒａｗａ編、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出すことができる。

上記に加えてまた、本発明のポリヌクレオチドを、葉緑体ゲノム内に導入することもでき、それにより、葉緑体の発現が可能になる。

外因性の核酸配列を葉緑体のゲノムに導入するための技法が公知である。この技法には、以下の手順が関与する。最初に、植物細胞を、細胞１個当たりの葉緑体数が、約１つに低下するように化学的に処理する。次いで、葉緑体内に少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド分子を導入する目的で、微粒子銃を介して外因性ポリヌクレオチドを細胞内に導入する。外因性ポリヌクレオチドが、葉緑体に内在する酵素により容易に行われる相同組換えを介して、葉緑体のゲノム内に組込み可能となるように、外因性ポリヌクレオチドを選択する。この目的のために、核酸配列は、目的の遺伝子に加えて、葉緑体のゲノムに由来する少なくとも１つのポリヌクレオチドのストレッチを含む。さらに、外因性ポリヌクレオチドは、選択マーカーも含み、この選択マーカーは、全てまたは実質的に全ての葉緑体ゲノムのコピーが、そのような選択の後には、外因性ポリヌクレオチドを確実に含むための連続的な選択手順により使われる。この技法に関連するさらなる詳細が、米国特許第４，９４５，０５０号明細書および米国特許第５，６９３，５０７号明細書に見出され、これらは、参照により本明細書に組み込まれている。したがって、ポリペプチドは、葉緑体のタンパク質発現系により産生され得、葉緑体の内膜中に組み込まれる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、核酸を発現する植物細胞を成長させるステップをさらに含む。植物細胞を、植物全体の一部としてか、またはそれに代わって、植物細胞培養物中に成長させることができる。一実施形態では、植物細胞を、バイオリアクター中の、無菌の懸濁培養物中で成長させる。本発明の植物細胞の懸濁液を培養するのに適しているバイオリアクター、および懸濁液中で植物細胞を成長させるための方法が、とりわけ、米国特許第６，３９１，６３８号明細書および米国特許第７，９５１，５５７号明細書、ならびに国際公開第９８／１３４６９号、国際公開第２００５／０８０５４４号、国際公開第２００７／０１０５３３号、国際公開第２００８／１３５９９１号および国際公開第２００８／１３２７４３号に詳細に記載されており、これらの全てが、本明細書に完全に記載されているかのごとく、参照により組み込まれている。

したがって、本発明は、核酸配列を発現し、その結果、本発明の組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を産生する植物または植物培養物を網羅する。核酸配列がコードするヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を、植物細胞または植物全体内で発現させたら、そのレベルを、当技術分野で周知の方法、例として、活性アッセイ、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質に特異的に結合することが可能である抗体を使用するウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学的検査、免疫細胞化学的検査、免疫蛍光法等により決定することができる。

植物中の、核酸配列から転写されたＲＮＡのレベルを決定する方法が、当技術分野で周知であり、それらとして、例えば、ノーザンブロット解析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）解析（定量的、半定量的またはリアルタイムのＲＴ−ＰＣＲを含む）、およびＲＮＡ−ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが挙げられる。

発現した、本発明の組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質のグリカン解析から、ポリペプチドが、植物細胞中でグリコシル化され、結果として、露出したマンノースおよび植物に特異的なグリカン残基を有する、組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質が生じることが示されている（下記の実施例ＩＶを参照されたい）。したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の発現ベクターを発現する細胞は、少なくとも１つ、場合により、少なくとも２つ、場合により、少なくとも３つ、または場合により、少なくとも４つ以上のコアβ−（１，２）キシロース残基を有するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を産生する。さらにその他の実施形態では、本発明の発現ベクターを発現する細胞は、少なくとも１つ、場合により、少なくとも２つ、場合により、少なくとも３つ、または場合により、少なくとも４つ以上のコアα−（１，３）フコース残基を有するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を産生する。その他の実施形態では、本発明の発現ベクターを発現する細胞は、少なくとも１つ、場合により、少なくとも２つ、場合により、少なくとも３つ、または場合により、少なくとも４つ以上の末端β（１−２）Ｎアセチルグルコサミンを有するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を産生する。その他の実施形態では、本発明の発現ベクターを発現する細胞は、少なくとも１つ、場合により、少なくとも２つ、場合により、少なくとも３つ、または場合により、少なくとも４つ以上の露出したマンノース残基を有するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を産生する。１つの特定の実施形態では、本発明の発現ベクターを発現する細胞は、９つのマンノース残基（Ｍ９）を有するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を産生し、それらのうちの少なくとも１つ、場合により、少なくとも２つ、場合により、少なくとも３つが、露出したマンノース残基である。一実施形態では、本発明の発現ベクターを発現する細胞は、少なくとも１つの露出したマンノース残基、少なくとも１つのコアβ−（１，２）キシロース残基、および少なくとも１つのα−（１，３）フコース残基を有するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を産生する。

その上さらに、本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の発現ベクターを発現する細胞が産生するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質分子を複数含む組成物が提供され、複数のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質分子のうちの最も優勢なグリカン構造が、マンノース３−β−（１，２）キシロース−α−（１，３）フコース［Ｆｃ（３）Ｍ３Ｘ］および／またはマンノース４−β−（１，２）キシロース（Ｍ４Ｘ）、ならびにマンノース８（Ｍ８）である。本発明のいくつかの実施形態では、グリカン構造であるマンノース３−β−（１，２）キシロース−α−（１，３）フコース［Ｆｃ（３）Ｍ３Ｘ］および／またはマンノース４−β−（１，２）キシロース（Ｍ４Ｘ）が、複数のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質分子のプロファイルの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％または約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％を構成し、グリカン構造であるマンノース８（Ｍ８）が、複数のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質分子のプロファイルの２０％、約２５％、約３０％、約３５％または約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％を構成する。

本発明のその上さらなる実施形態では、組成物は、本発明の発現ベクターを発現する細胞が産生するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質分子を複数含み、前記複数のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質分子が、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．７５％、約２．０％、約２．５％、約３．０％、約３．５％、約４．０％、約４．５％または約５．０％以上の、９つのマンノース残基のグリカン構造を有するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質分子を含み、それらのうちの少なくとも１つ、場合により、少なくとも２つ、場合により、少なくとも３つが、露出したマンノース残基である。

本発明の発現ベクターを発現する細胞が産生するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、本来のヒトα−ガラクトシダーゼ酵素の触媒活性と同一のα−ガラクトシダーゼ触媒活性を有することが示された。本発明の組換えα−ガラクトシダーゼを、酵素代替療法のために投与する場合のｉｎ−ｖｉｖｏにおける酵素の環境をシミュレートする条件に曝すと、本発明の発現ベクターを発現する細胞が産生するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、哺乳動物細胞が発現した組換えヒトα−ガラクトシダーゼ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標））の薬物動態に類似する薬物動態を有し得るであろうことがさらに示されている（本明細書の実施例３ならびに図２および３を参照されたい）。

したがって、本発明の発現ベクターを発現する細胞が産生するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を使用して、医薬組成物を製造することができる。医薬組成物を、その治療または予防を必要とする対象におけるファブリー病の治療または予防のために使用することができる。いくつかの実施形態では、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を発現する細胞を、その治療または予防を必要とする対象におけるファブリー病の治療または予防のために使用することができる。ヒトタンパク質を組換えにより発現する植物細胞の調製および投与のための方法が、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｈａａｌｔｉｅｌらに対する国際公開第２００７／０１０５３３号がある。

したがって、本発明の別の態様によれば、医薬組成物であって、その活性成分としての、Ｃ末端において、小胞体保持シグナルペプチドに翻訳時に融合されるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物が提供される。本発明のいくつかの実施形態では、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｎ末端グリシン残基を有する。本発明のいくつかの実施形態では、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ末端において、小胞体保持シグナルペプチドに翻訳時に融合されるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、配列番号２１に記載されるアミノ酸を有する。

本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、本明細書に記載する活性成分のうちの１つまたは複数と、その他の化学的構成成分、例として、生理学的に適切な担体および賦形剤との調製物を指す。医薬組成物の目的は、化合物の生物への投与を促進することである。

本明細書においては、用語「活性成分」は、生物学的作用を担う、組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を指す。

以下、句「生理学的に許容できる担体」および「薬学的に許容できる担体」は、互換的に使用することができ、生物に対する顕著な刺激性を引き起こすことも、投与する化合物の生物学的活性および特性を抑止することもない担体または希釈剤を指す。これらの句の下には、アジュバントが含まれる。

本明細書においては、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加する不活性な物質を指す。賦形剤の例として、非限定的に、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、ならびにデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールの複数のタイプが挙げられる。

薬物の製剤化および投与のための技法を、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版に見出すことができ、これは、参照により本明細書に組み込まれている。

適切な投与経路として、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、とりわけ、経鼻送達、腸送達、または筋肉内、皮下および髄内への注射を含めた、非経口送達、ならびにくも膜下腔内注射、直接的な側脳室内への注射、心臓内、例えば、右または左の心室内腔内への注射、一般的な冠状動脈内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を挙げることができる。

中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来のアプローチは、神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）；ＢＢＢの内在性の輸送経路のうちの１つを活用するための試みにおける、薬剤の分子操作（例えば、内皮細胞の表面分子に対して親和性を有する輸送ペプチドを、自体ではＢＢＢを横断するのが不可能である薬剤と組み合わせて含むキメラ融合タンパク質の産生）；薬剤の脂質溶解性を増加させることをねらう薬理学的戦略（例えば、水溶性薬剤の、脂質またはコレステロールの担体へのコンジュゲーション）；および（マンニトール溶液の頚動脈内への注入、または生物学的に活性な薬剤、例として、アンジオテンシンペプチドの使用により生じる）高浸透圧によって破壊することによる、ＢＢＢの完全性の一過性の破壊を含む。しかし、これらの戦略のそれぞれには、制限、例として、侵襲性の外科的手順に伴って内在する固有のリスク；内在輸送系に固有の制限により課されるサイズの制限；ＣＮＳ以外でも活性を示すことができるであろう担体モチーフから構成されるキメラ分子の全身性の投与に伴う、潜在的に望ましくない生物学的副作用；およびＢＢＢが破壊される脳の領域内における脳損傷の、存在するであろうリスクがあり、これらの制限のため、こうした戦略はいずれも、次善の送達方法である。

代替として、全身性ではなく局所性に、例えば、医薬組成物を、患者の組織領域内に直接注射することによって、医薬組成物を投与することができる。

用語「組織」は、ある機能または複数の機能を行うことをねらう細胞からなる、生物の部分を指す。例として、これらに限定されないが、脳組織、網膜、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋肉組織、心臓組織、脳組織、血管組織、腎臓組織、肺組織、性腺組織、造血組織が挙げられる。

本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物を、当技術分野で周知のプロセスにより、例えば、混合、溶解、顆粒化、糖衣錠剤作製、湿式粉砕、乳化、被包、捕捉または凍結乾燥の従来プロセスによって製造することができる。

したがって、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための医薬組成物を、賦形剤および補助剤を含む生理学的に許容できる担体の１つまたは複数を使用して、従来からある様式で製剤化することができ、担体は、活性成分の、薬学的に使用することができる調製物への加工を促進する。適切な製剤化は、選ばれる投与経路に依存する。

注射のためには、医薬組成物の活性成分を、水溶液、好ましくは、生理学的に適合性の緩衝液、例として、ハンクス液、リンゲル液または生理学的塩緩衝液中に製剤化することができる。経粘膜投与のためには、透過させるバリアに適切な浸透剤を、製剤中で使用する。そのような浸透剤は、当技術分野では一般に公知である。

経口投与のためには、場合により、本発明によるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を産生する細胞全体を投与するように、活性成分を製剤化し得る。また、場合により、活性成分および／または細胞と、当技術分野で周知の薬学的に許容できる担体とを組み合わせることによって、活性成分を製剤化し、医薬組成物を製造することもできる。そのような担体により、細胞および／または医薬組成物を、患者が経口摂取するために、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液体、ジェル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として製剤化することが可能になる。経口投与のために使用する場合には、細胞全体または細胞の画分を、新鮮な状態で、または加工（例えば、凍結乾燥、凍結、乾燥等）して使用することができる。

固体の賦形剤を使用し、場合により、結果として生じる混合物を粉砕し、顆粒の混合物を、所望により、適切な補助剤を添加してから加工して、錠剤、または糖衣錠剤のコアを得て、経口使用のための薬理学的調製物を作製することができる。適切な賦形剤は、特に、充填剤、例として、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトールを含めた、糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、ガムトラガント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボメチルセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）等；および／または生理学的に許容できるポリマー、例として、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望により、崩壊剤、例として、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例として、アルギン酸ナトリウムを添加することもできる。

糖衣錠剤のコアに、適切な被覆をもたらす。この目的では、高い濃度の糖溶液を使用することができ、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。同定のため、または異なる組合せの活性化合物の用量を特徴付けるために、染料または色素を、錠剤、または糖衣錠剤の被覆に添加することができる。

経口により使用することができる医薬組成物は、ゼラチンにより作られた、押込み式のカプセル剤、ならびにゼラチン、および可塑剤、例として、グリセロールまたはソルビトールにより作られた、軟質密封カプセル剤を含む。押込み式のカプセル剤は、活性成分を、充填剤、例として、ラクトース；結合剤、例として、デンプン；滑沢剤、例として、タルクまたはステアリン酸マグネシウム；および場合により、安定化剤と混合して含有することができる。軟質カプセル剤の場合には、活性成分を、適切な液体、例として、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を添加してもよい。経口投与のための製剤は全て、選ばれた投与経路に適した投与量を有するべきである。

頬側投与のためには、組成物は、従来からある様式で製剤化した錠剤またはドロップ剤の形態をとることができる。

鼻からの吸入による投与のためには、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための活性成分が、加圧されたパックから、または適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンもしくは二酸化炭素を使用するネブライザーからのエアロゾルスプレーとして提示される形態で好都合に送達される。加圧されたエアロゾルの場合には、投与量単位を、計量した量を送達するためのバルブを設けることによって決定することができる。ディスペンサー中で使用するための、例えば、ゼラチンからなるカプセル剤およびカートリッジを、化合物と、適切な粉末基剤、例として、ラクトースまたはデンプンとの粉末のミックスを含有させて製剤化することができる。

本明細書に記載する医薬組成物は、非経口投与、例えば、ボーラス注射または連続的な注入による投与のために製剤化することができる。注射のための製剤を、単位投与形態として、例えば、アンプル中、または保存剤を場合により添加した多回投与容器中に提示することができる。組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤であり得、製剤化のための薬剤、例として、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤を含有し得る。

非経口投与のための医薬組成物は、水溶性の形態をとる活性な調製物の水溶液を含む。さらに、活性成分の懸濁液を、適切な、油または水に基づいた注射用懸濁剤として調製することもできる。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例として、ゴマ油、または合成の脂肪酸エステル、例として、オレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームを含む。水性の注射用懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加させる物質、例として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有することができる。また、場合により、懸濁剤は、適切な安定化剤、または活性成分の溶解性を増加させて、極めて濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤を含有してもよい。

それに代わって、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌の、発熱性物質を含有しない水に基づいた溶液を用いて構成するための粉末の形態をとることもできる。

また、本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、例えば、従来の坐剤用基剤、例として、カカオバターまたはその他のグリセリドを使用して、直腸用組成物、例として、坐剤または滞留浣腸として製剤化することもできる。

本発明のいくつかの実施形態の状況において使用するのに適している医薬組成物は、活性成分を、意図する目的を達成するのに有効な量で含有する組成物を含む。より具体的には、治療有効量は、障害（例えば、ファブリー病）の症状の予防、軽減もしくは寛解をもたらすか、または治療される対象の生存期間を延長するのに有効な、活性成分（α−ガラクトシダーゼ）の量を意味する。

治療有効量の決定は、とりわけ、本明細書において提供する詳細な開示に照らせば、十分に当業者の能力のうちである。

本発明の方法において使用する任意の調製物について、治療に有効な量または用量を、最初は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、所望の濃度または力価を達成するために、用量を、動物モデルにおいて定式化することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。

本明細書に記載する活性成分の毒性および治療有効性を、標準的な薬学的手順により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細胞培養物中で、または実験動物において決定することができる。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるアッセイ、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトにおいて使用するために、投与量の範囲を定式化する場合に使用することができる。投与量は、利用する投与形態および利用する投与経路に応じて変化し得る。個々の医師が、患者の状態に照らして、正確な製剤、投与経路および投与量を選ぶことができる。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５年、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｃｈ．１、１頁を参照されたい）。

投与量および投与間隔を個々に調節して、生物学的効果を引き起こすかまたは抑制するのに十分である活性成分の血清レベルおよび細胞レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）をもたらすことができる。ＭＥＣは、それぞれの調製物について変化するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個体の特徴および投与経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿濃度を決定することができる。

治療しようとする状態の重症度および応答性に応じて、投与は、単回または複数回の投与であり得、治療コースを、数日〜数週間、または治癒するかもしくは疾患状態の減少が達成されるまで続ける。

もちろん、組成物の投与すべき量は、治療される対象、病気の重症度、投与の様式、処方医師の判断等に依存する。

本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望により、パックまたはディスペンサーデバイス、例として、ＦＤＡの承認を得ているキット中に提示することができ、キットは、活性成分を含有する単位投与形態の１つまたは複数を含有することができる。パックは、例えば、金属製またはプラスチック製の箔、例として、ブリスターパックを含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための指示が伴うことができる。また、パックまたはディスペンサーには、容器に付随させて、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関が規定する書式の通知を伴わせることもでき、この通知は、組成物またはヒトもしくは動物への投与の形態がそうした機関により承認されていることを反映している。そのような通知は、例えば、処方薬についての米国食品医薬品局の承認を得ているラベルであっても、または承認を得ている、製品の添付文書であってもよい。また、適合性の薬学的担体中に製剤化した、本発明の調製物を含む組成物も、上記のさらなる詳述に従って、調製し、適切な容器中に収納し、適応する状態の治療についてラベルに表示することができる。

医薬組成物を、その治療または予防を必要とする対象におけるファブリー病の治療または予防のために使用することができる。したがって、本発明の別の態様によれば、その治療または予防を必要とする対象においてファブリー病を治療または予防するための方法であって、有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、医薬組成物は、その活性成分としての、Ｃ末端において、小胞体保持シグナルペプチドに翻訳時に融合されるヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質、および薬学的に許容できる担体を含む、方法が提供される。本発明のいくつかの実施形態では、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｎ末端グリシン残基を有する。その他の実施形態では、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を有する。

用語「治療」は、病態（疾患、障害もしくは状態）の発生を阻害すること、予防することもしくは停止させること、および／または病態の低下、寛解もしくは退縮を引き起こすことを指す。種々の方法およびアッセイを使用して、病態の発生を評価することができ、同様に、種々の方法およびアッセイを使用して、病態の低下、寛解または退縮も評価することができることを当業者は理解するであろう。

本明細書で使用する場合、用語「予防」は、疾患についてのリスクがある恐れがあるが、まだ、疾患を有するとは診断されていない対象において、疾患、障害もしくは状態を発生させないことを指す。

本明細書で使用する場合、用語「対象」は、病態に罹患する哺乳動物、好ましくは、任意の年齢のヒトを含む。好ましくは、この用語は、病態が発生するリスクがある個体を網羅する。

本明細書で使用する場合、句「治療レジメン」は、治療を必要とする対象（例えば、病態を有すると診断された対象）に提供する治療のタイプ、投与量、治療のスケジュールおよび／または持続期間を特定する治療計画を指す。選択される治療レジメンは、最良の臨床転帰（例えば、病態の完全な治癒）が得られることが予想される侵襲性のものであっても、または病態の症状を和らげることはできるが、病態の不完全な治癒に終わるより中等度ものであってもよい。特定の場合、より積極的な治療レジメンには、対象にとっての何らかの不快感、または有害な副作用（例えば、健常な細胞もしくは組織に対する傷害）を伴う恐れがあることが理解されるであろう。治療のタイプは、外科的介入（例えば、病変、病的な細胞、組織もしくは臓器の除去）、細胞代替療法、局所性もしくは全身性のモードでの治療薬物（例えば、受容体アゴニスト、アンタゴニスト、ホルモン、化学療法剤）の投与、外部供給源（例えば、外部ビーム）および／もしくは内部供給源（例えば、近距離照射療法）を使用する、放射線に対する暴露による療法、ならびに／または任意のそれらの組合せを含むことができる。投与量、治療のスケジュールおよび持続期間を、病態の重症度および選択される治療のタイプに応じて変化させることができ、当業者であれば、治療のタイプを、投与量、治療のスケジュールおよび持続期間に関して調節することが可能である。

本出願の特許権の存在期間が満了するまでに、多くの適切なベクター、プロモーターエレメント、植物細胞および担体が開発されるであろうことが予想され、本明細書において提供する用語の範囲は、そのような新しい技術を全て、先験的に含むことを意図する。

本明細書で使用する場合、用語「約」は、±１０％を指す。

用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「これらに限定されないが、〜を含む」を意味する。

用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「〜を含み、かつ〜に限定される」を意味する。

用語「〜から本質的になる（ｃｏｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物、方法または構造が、追加の成分、ステップおよび／または部分を含むことができるが、但し、これは、追加の成分、ステップおよび／または部分により、請求する組成物、方法および構造の基本的なかつ新規の特徴が実質的に変化しない場合に限られることを意味する。

本明細書で使用する場合、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数形への言及を、そうでないことが、状況から明らかに定まる場合を除いて含む。例えば、用語「ある化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、複数の化合物を、それらの混合物を含めて、含むことができる。

本出願全体を通して、本発明の種々の実施形態を、範囲フォーマットに提示することができる。範囲フォーマット中の記載は、利便性および簡潔性のためのものに過ぎず、これを、本発明の範囲に対する確固たる制限と解釈してはならない。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分的な範囲およびその範囲に属する個々の数値を具体的に開示しているとみなすべきである。例えば、範囲の記載、１〜６は、部分的な範囲、具体的には、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等、ならびにその範囲に属する個々の数、具体的には、１、２、３、４、５および６を開示しているとみなすべきである。このことは、範囲の広さにかかわらず適用される。

本明細書において数値の範囲を表示する場合には、表示する範囲に属する任意の数（分数または整数）の引用を含むことを意味する。句「第１に表示する数と第２に表示する数との「間の範囲に及ぶ」」と句「第１に表示する数「から」、第２に表示する数「までの範囲に及ぶ」」とを、本明細書においては互換的に使用し、これらの句には、第１の表示する数および第２の表示する数、ならびにそれらの間の分数および整数の数値の全てが含まれることを意味する。

本明細書で使用する場合、用語「方法」は、所与のタスクを達成するための様式、手段、技法および手順を指し、それらには、これらに限定されないが、化学的、薬理学的、生物学的、生化学的および医学的な技術の熟練家に公知であるか、または化学的、薬理学的、生物学的、生化学的および医学的な技術の熟練家により、公知の様式、手段、技法および手順から容易に開発される様式、手段、技法および手順が含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「治療」は、状態の進行を抑止すること、実質的に阻害すること、緩慢化することもしくは逆転させること；状態の臨床的もしく審美的な症状を実質的に寛解させること；または状態の臨床的もしく審美的な症状の出現を実質的に予防することを含む。

本発明の特定の特徴は、明確にするために、別個の実施形態の状況として記載されているが、また、これらを、単一の実施形態として組み合わせることができることも理解されたい。逆に、本発明の種々の特徴は、簡潔にするために、単一の実施形態の状況として記載されているが、また、これらは、別個に、または任意の適切なサブコンビネーションとして、または本発明に記載する任意のその他の実施形態において適するものとして提供することもできる。種々の実施形態の状況で記載されている特定の特徴を、実施形態が、それらの要素なしでは作動しない場合を除いて、それらの実施形態の不可欠な特徴であるとみなしてはならない。

上記に記述し、下記の特許請求の範囲のセクションにおいて請求する本発明の種々の実施形態および態様は、以下の実施例における実験により支持されている。

本発明のいくつかの実施形態を非限定的に示す上記の説明に加えて、ここでは、以下の実施例に言及する。

一般に、本明細書において使用する命名法および本発明において利用する実験室手順は、分子的技法、生化学的技法、微生物学的技法および組換えＤＮＡ技法を含む。そのような技法は、文献に十分な説明がある。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ〜ＩＩＩ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編、（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（編）、「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、Ｖｏｌｓ．１〜４、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）を参照されたい。方法論が、米国特許第４，６６６，８２８号明細書；米国特許第４，６８３，２０２号明細書；米国特許第４，８０１，５３１号明細書；米国特許第５，１９２，６５９号明細書および米国特許第５，２７２，０５７号明細書；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ〜ＩＩＩ、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編、（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ〜ＩＩＩ、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）に記載されている。利用可能なイムノアッセイが、特許および科学文献に広範に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；米国特許第３，８３９，１５３号明細書；米国特許第３，８５０，７５２号明細書；米国特許第３，８５０，５７８号明細書；米国特許第３，８５３，９８７号明細書；米国特許第３，８６７，５１７号明細書；米国特許第３，８７９，２６２号明細書；米国特許第３，９０１，６５４号明細書；米国特許第３，９３５，０７４号明細書；米国特許第３，９８４，５３３号明細書；米国特許第３，９９６，３４５号明細書；米国特許第４，０３４，０７４号明細書；米国特許第４，０９８，８７６号明細書；米国特許第４，８７９，２１９号明細書；米国特許第５，０１１，７７１号明細書および米国特許第５，２８１，５２１号明細書；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編、（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編、（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編、（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、（１９８４）、ならびに「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．１、２、３１７頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。これらの全てが、本明細書に完全に記載されているかのごとく、参照により組み込まれている。その他の一般的な参考文献が、本記載全体を通して提供されている。それらの中の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の利便性のために提供している。その中に含有される情報は全て、参照により本明細書に組み込まれている。

α−ガラクトシダーゼの、植物による発現のための構築物の構築
ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質（ＥＣ３．２．１−２２ ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０５７９０）をコードするｃＤＮＡが、ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）により最適化され、合成された。コドンの使用を、リーダーペプチド（小胞体標的シグナルペプチド）を除いて、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）遺伝子のコドンの偏りに適応させた。最適化プロセスの間、以下のシス作用性の配列モチーフは回避した：内部ＴＡＴＡ−ボックス、カイ部位（ｃｈｉ−ｓｉｔｅ）およびリボゾーム進入部位、ＡＴに富むまたはＧＣに富む配列ストレッチ、ＲＮＡ不安定性エレメント（「キラーモチーフ」）、反復配列およびＲＮＡの二次構造、スプライスドナー（陰性（ｃｒｙｐｔｉｃ））およびアクセプター部位、分枝点。さらに、ＧＣ含有量の非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）領域も回避されている。

完全長ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０５７９０）の本来のヒトα−ガラクトシダーゼリーダーペプチド（小胞体標的シグナルペプチド）（図１、赤色で示す、最初の３１個のアミノ酸）のヌクレオチド配列を、シロイヌナズナＡＢＰＩタンパク質の３３個のアミノ酸の小胞体標的化シグナルペプチド（リーダーペプチド）（図１中、緑色で印す、配列番号４）をコードするヌクレオチド配列で交換した。このシグナルペプチドは、α−ガラクトシダーゼの分泌経路に対する効率的な標的化をもたらし、タンパク質が小胞体内にトランスロケーションしてしまったら、このシグナルペプチドは、ポリペプチドからシグナルペプチダーゼにより切断される。小胞体保持シグナルＳＥＫＤＥＬ（配列番号６）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）を、ｃＤＮＡ配列に、３’末端において付加して、小胞体中にタンパク質を有効に維持するゴルジ体からの、発現したタンパク質の回収を可能にする。配列番号２は、Ｎ末端のＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチド、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質、およびＳＥＫＤＥＬ小胞体保持シグナルを含む、発現した組換えヒトα−ガラクトシダーゼ（配列番号１）の完全コード配列を示す。

植物中での、組換えヒトα−ガラクトシダーゼの発現
ベンサミアナタバコ中の一過性の発現システム
成熟した植物全体における、タンパク質の、迅速な、高いレベルの一過性の発現を可能にする、植物ウイルスベクターの使用を、この場合には、トランスジェニック植物の代替物として選んだ。

目的のタンパク質を、強力な、サブゲノムのウイルスコートタンパク質のプロモーターから発現させた。このシステムは、（アグロインフェクション（ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）による）アグロバクテリウムにより植物に送達されたウイルスベクターの一過性の増幅に依存し、この場合、植物の機能性プロモーター、およびｃＤＮＡをコードするウイルスレプリコンを、Ｔ−ＤＮＡとして、アグロバクテリウムから植物細胞内に移入する。Ｔ−ＤＮＡが、植物体内において（ｉｎ−ｐｌａｎｔａ）、植物プロモーターにより転写されて、自己複製を開始する、生物学的に活性なウイルスＲＮＡを生成する。

一過性の発現のために、（Ｇｌｅｂａら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２３、２０４２〜２０４８頁、２００５年）の記載に従う、以前に開発されたシステムに基づく３つのベクターからなる組換えシステムを利用した。α−ガラクトシダーゼのｃＤＮＡを、ベクターのうちの１つ内に挿入し、２つのその他のベクターには、ウイルスレプリコン全体を構築するための遺伝子（ＲｄＲｐおよびインテグラーゼ）を含有させ、したがって、自己複製を開始することが可能である、生物学的に活性なウイルスＲＮＡを生成した。

植物全体のトランスフェクション−
ベンサミアナタバコ植物を、顆粒状の緩徐放出性肥料（Ｓｃｏｔｔ Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ、ＯＨ）を補充した、市販のミックス土壌（Ｇｉｖａａｔ Ａｄａ、ＩＬ）中、長日（１６時間の明所／８時間の暗所）の光の形態下、２４℃〜２５℃で発芽および成長させた。

アグロバクテリアを、ｐＩＣＨ２０８６６−アルファ−ＧＡＬに基づいたレプリコンベクターシステムを用いて、エレクトロポレーション（２５００Ｖ、５ミリ秒）を使用して形質転換した［ｄｅｎ Ｄｕｌｋ−Ｒａ，Ａ．およびＨｏｏｙｋａａｓ、Ｐ．Ｊ．（１９９５）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５５：６３〜７２頁］。当技術分野で公知の標準的な方法を用いて、植物に、３つのＩＣＯＮプラスミドを含有するアグロバクテリアを真空浸潤により浸潤させた。手短に述べると、ベンサミアナタバコ植物、５〜６週齢を、全ての、気中の植物器官を細菌懸濁液中に浸漬することによって浸潤させ、真空チャンバー中に置いた。マイナス（−）０．８バールの真空を、１分間適用し、続いて、大気圧に素早く戻した。植物を温室に戻し、同じ成長条件下にさらに５〜７日間置いた。

タバコ植物の抽出：
ベンサミアナタバコ葉の試料を、浸潤の５日後に収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液、または活性アッセイ用緩衝液（２０ｍＭクエン酸、３０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ＢＳＡおよび０．６７％エタノール、ｐＨ４．６）中に抽出し、植物が発現したタンパク質の触媒活性をアッセイした。

タバコ植物の抽出物の精製：
ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を、植物抽出物から、二段階の硫酸アンモニウム示差沈殿（「塩析」：第１段階：０．５７Ｍ；第２段階：２．２７Ｍ）、続いて、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍ樹脂）およびカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。

タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）ＢＹ２細胞中での安定な発現
外来遺伝子を植物細胞ゲノム内に導入するために、アグロバクテリウム媒介型形質転換が広く使用されている。この技法は、プラスミドＤＮＡセグメント、すなわち、転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）を宿主細胞ゲノム内に移入することによって、植物細胞を形質転換する、アグロバクテリウムの天然の能力に基づく。このアプローチを使用すると、外来遺伝子およびその調節エレメントからなるＴ−ＤＮＡ分子が、植物ゲノム内に無作為に導入される。組込みの部位および遺伝子挿入体のコピー数は制御されず、したがって、形質転換プロセスの結果、導入遺伝子の発現の種々のレベルを有する細胞から構成されるトランスジェニック細胞の「プール」が生じる。続いて、トランスジェニックな「プール」を使用して、クローンの単離を行う。クローンの単離の結果、多くの単一細胞株が確立され、次いで、それらから、外来遺伝子の最も高い発現レベルを有するクローンを選択する。

ＢＹ２の懸濁培養物を、α−ＧＡＬ遺伝子およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）選択遺伝子をもつベクターを担持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株と４８時間同時培養した。

続いて、細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを補充した培地中に保った。ＮＰＴＩＩ遺伝子は、カナマイシンに対する耐性を付与し、したがって、ＮＰＴＩＩ陽性のＢＹ２細胞のみがこの選択培地中に生存する。植物細胞は、セフォタキシムに対して耐性を示し、この抗生物質を使用して、アグロバクテリウムを選択的に死滅させた。順調に成長するトランスジェニック細胞懸濁液を確立したら、それを使用して、個々の細胞株をスクリーニングし、単離した。個々の細胞株の選択を可能にするために、一定分量の高度に希釈した細胞懸濁液を、固体のＢＹ−２培地上に広げた。次いで、細胞を、小さなカルスが発生するまで成長させた。次いで、液体の培地中に、各カルスを再懸濁させた。次いで、細胞試料を採取し、試料を、α−ＧＡＬレベルについて評価した。次いでさらに、α−Ｇａｌを比較的高い活性レベルで発現する株を再分析し、α−ＧＡＬレベルについて比較して、候補のα−ＧＡＬ発現株の最終的な選択で終了した。

タバコ細胞の抽出：
ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を発現する形質転換ＢＹ２細胞１００ｍｇを、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴおよび２ｍＭ ＰＭＳＦを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液０．５Ｍ、ｐＨ＝７．２、２００ｕｌ中で５分間ホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し、組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を含有する上清を収集した［未精製の抽出物］。未精製状態におけるα−ガラクトシダーゼ触媒活性を、ＰＮＰ−Ｇアッセイにより決定した。

ＰＮＰ−Ｇアッセイ
α−ガラクトシダーゼのガラクトシドヒドロラーゼ活性を、ｐ−ニトロフェニルアルファ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＮＰ−アルファ−Ｄ−Ｇａｌ、ＧＢＢ１２９０、ＩＲＩＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を加水分解基質として使用して決定した。アッセイ用緩衝液は、２０ｍＭクエン酸、３０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ＢＳＡおよび０．６７％エタノールをｐＨ４．６で含有した。試料（５０μｌ）を、１５０μｌのアッセイ用緩衝液と共にインキュベートした。基質（ｐＮＰ−アルファ−Ｄ−Ｇａｌ）を添加して（３０μＬ）、８ｍＭの最終濃度のｐ−ＮＰ−アルファ−Ｄ Ｇａｌを得た。反応混合物を、３７℃で９０分間インキュベートした。９０分後に、反応を止め、ｐ−ニトロフェノラート発色団の発生を可能にするために、各ウエルに、１００μｌの炭酸ナトリウム（２Ｍ）を添加することによって、反応をクエンチした。４０５ｎｍにおいて測定した吸光度から、結果を計算した。

植物が発現したヒトα−ガラクトシダーゼの改変：形質転換植物から得られたタンパク質産物の配列決定から、場合によっては、ＡＢＰＩシグナルの切断の際に、組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、シグナルペプチドの最後のアミノ酸のグリシンを、成熟α−ガラクトシダーゼタンパク質のＮ末端において保持することが明らかになった。したがって、組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｎ末端において、シグナルペプチドのグリシンを有さない場合（例えば、配列番号２０；コード配列は、配列番号２２に記載する）、またはＮ末端において、グリシンを含む場合（例えば、配列番号２１；コード配列は、配列番号２３に記載する）のいずれかであり得る。

植物が発現したヒトα−ガラクトシダーゼのグリカン解析：形質転換植物から得られた組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質産物の試料を、ＤＴＴおよびヨードアセトアミドを用いて還元し、アルキル化し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。正しい分子量に対応するバンドを、切除し、タンパク質を抽出し；トリプシン消化、続いて、ＰＮＧａｓｅ Ａ消化およびＰＮＧａｓｅ Ｆ消化の両方からなるグリカン解析に付した。ＰＮＧａｓｅ Ａ消化は、全てのＮ連結型のグリカンを放出し、ＰＮＧａｓｅ Ｆは、α１−３コアフコースを含有するものを除く、全てのグリカンを放出する。

遊離のグリカンを、抽出し、精製し、次いで、蛍光試薬のアントラニルアミド（２ＡＢ）を用いて標識し、続いて、過剰量の２ＡＢを除去した。

グリカンを、ＴＳＫ ｇｅｌ Ａｍｉｄｅ ８０順相ＨＰＬＣを使用して分離し、蛍光検出器を使用して検出した。デキストラン加水分解産物を、グルコース単位（ＧＵ）の値を計算するためのラダーとして使った。ＰＮＧａｓｅ Ａ消化のクロマトグラムから、相対ピーク面積を計算することによって、グリカンのプロファイルを構築した。両方のエンドグリコシド消化において見出されたピークのＧＵ値を計算することにより、さらに、種々のエキソグリコシド消化にも基づいて、グリカンの帰属を確立する。

結果：
異なるα−ガラクトシダーゼ構築物間での比較を行ったところ、リンゴペクチナーゼ小胞体標的化シグナルペプチド（配列番号１０によりコードされるリンゴペクチナーゼＥＲ標的化シグナルペプチド）を用いて発現させたα−ガラクトシダーゼ配列（配列番号８もしくは配列番号１１によりコードされるα−ガラクトシダーゼ−リンゴペクチナーゼＥＲシグナルペプチド−タンパク質）、またはエンドキチナーゼＢ小胞体標的化シグナルペプチド（配列番号１５によりコードされるエンドキチナーゼシグナルタンパク質、配列番号１４）を用いて発現させたα−ガラクトシダーゼタンパク質と比較した場合、ＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチド（配列番号４）の、ヒト組換えα−ガラクトシダーゼポリペプチドへの付加により、一過性発現型のベンサミアナタバコ植物における組換えタンパク質の発現が改善される（図２、レーン２）ことが解明された。触媒活性のアッセイ（上記を参照されたい）により、リンゴペクチナーゼ小胞体標的化シグナルペプチドを用いて発現させたα−ガラクトシダーゼ配列、またはエンドキチナーゼＢ小胞体標的化シグナルペプチド（配列番号１５によりコードされるエンドキチナーゼシグナルタンパク質、配列番号１４）を用いて発現させたα−ガラクトシダーゼタンパク質と比較した場合の、図２に認められるタンパク質の増加は、葉１ｋｇ当たりの酵素活性が同時に増加すること（図３、カラムＢ）に反映されることも確認された。

ＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドを付加したヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質（例えば、配列番号１；配列番号２によりコードされる）を発現する形質転換タバコ細胞から得られた組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質産物のグリカン解析から、高マンノースグリカン構造の主要なグリカン構造（例えば、３〜６、７、８または９つのマンノース残基、末端のマンノースは露出している）、および特徴的な植物に特異的なグリカン、例として、β−（１，２）キシロースおよびα−（１，３）フコースを含むグリカンのプロファイルが明らかになった（図７）。グリカンのプロファイルの高いパーセントを示す優勢なグリカン構造に含まれるものとして、約３０％が、マンノース３−β−（１，２）キシロース−α−（１，３）フコース［Ｆｃ（３）Ｍ３Ｘ］および／またはマンノース４−α−（１，２）キシロース（Ｍ４Ｘ）のグリカンを有し、別の約３０％が、マンノース８（Ｍ８）のグリカンを有した（図８）。図８に、形質転換した細胞から得られたタンパク質の試料に属したグリカン構造の分布を示す表を示す。Ａ−Ｇａｌ ＡおよびＡ−Ｇａｌ−Ｂは、形質転換植物細胞から得られた組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質産物の２つの代表的な分析である。

グリカン構造は、複合体のグリカン中に存在する糖残基に従って、さらなるカテゴリーに分けることができる。下記の表Ｖに、特定の糖に従う、形質転換植物から得られたヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質産物中のグリカン構造の分布を詳述する。

したがって、配列番号２を含む構築物から得られたタバコ細胞培養物中で発現したヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質産物は、顕著なパーセントの（フコース構成成分およびキシロース構成成分を有する）植物に特異的なグリカン構造、および高いマンノースグリコシル化により特徴付けられた。

ｉｎ−ｖｉｖｏにおける条件下の、植物が発現したヒト組換えα−ガラクトシダーゼの安定性
植物が発現したヒト組換えα−ガラクトシダーゼの薬物動態に近づくために、組換え酵素の調製物を、シミュレートしたｉｎ−ｖｉｖｏにおける条件に曝し、触媒活性をモニターした。

血漿中の安定性：
組換え植物抽出物または植物抽出物から精製したα−ガラクトシダーゼを、ヒト血漿に（例えば、１０μｌの抽出物または精製したα−ガラクトシダーゼをく１９０μｌのヒト血漿に）添加して、１μｇ／ｍｌの最終濃度を得、３７℃でインキュベートし、続いて、試料中のα−ガラクトシダーゼ触媒活性を、設定した間隔で１時間にわたり測定することによって、血漿中の酵素活性の安定性を評価した。

配列番号１１（リンゴペクチナーゼ小胞体標的化シグナルペプチドを有するα−ガラクトシダーゼ（配列番号１２）をコードする）を用いて形質転換したベンサミアナタバコ植物から得られたα−ガラクトシダーゼと、配列番号２（ＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドを有するα−ガラクトシダーゼ（配列番号１）をコードする）を用いて形質転換したベンサミアナタバコ植物から得られたα−ガラクトシダーゼとの間の比較（図４）から、ベンサミアナタバコがＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドを有する構築物から発現したα−ガラクトシダーゼ（図４、黒いまたは塗りつぶした四角）の、リンゴペクチナーゼ小胞体標的化シグナルリーダーを有する構築物から発現した組換えα−ガラクトシダーゼ（図４、白四角）と比較した場合の明確な利点が示されている。

結果として、配列番号２１に記載される成熟組換えα−ガラクトシダーゼタンパク質を生じる、配列番号２（ＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドを有するα−ガラクトシダーゼタンパク質（配列番号１）をコードする）を用いて形質転換したタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）植物細胞（ＢＹ２）中で発現させたα−ガラクトシダーゼと、哺乳動物細胞中で発現させたα−ガラクトシダーゼ（ＲＥＰＬＡＧＡＬ（登録商標））との間の比較から、血漿中、３７℃で１時間インキュベートした場合（図５）、およびリソソーム様の条件下で９日にわたりインキュベートした場合（ｐＨ＝４．６および３７℃、図６）、これらの酵素活性の安定性が類似することが明らかになった。シミュレートしたｉｎ−ｖｉｖｏにおける条件下でのこの類似性から、植物細胞が発現する組換えα−ガラクトシダーゼは、哺乳動物細胞に発現させた、臨床的に承認を得ている酵素（ＲＥＰＬＡＧＡＬ（登録商標））の薬物動態に匹敵する薬物動態を有するであろうことが示唆される。

本発明を、その特定の実施形態と共に記載してきたが、多くの代替形態、改変形態および変更形態が当業者に明らかになるであろうことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神およびその広い範囲に属する全てのそのような代替形態、改変形態および変更形態を包含することを意図する。

本明細書中で言及する刊行物、特許および特許出願は全て、それらの全体が、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が、参照により本明細書に組み込まれていることを具体的かつ個々に示すのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。さらに、本出願中の参考文献の引用または同定はいずれも、そのような参考文献が、本発明の先行技術として入手可能であることを認めていると解釈してはならない。セクションの見出しの使用に至っては、これらを、必然的に限定するためのものであると解釈してはならない。

Claims (22)

1. ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸発現構築物であって、
   前記ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｎ末端においてシロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドに翻訳時に融合され、
   前記ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質は、Ｃ末端において小胞体保持シグナルペプチドに翻訳時に融合される、核酸発現構築物。
2. 前記核酸配列が、配列番号２２を含む、請求項１に記載の核酸発現構築物。
3. 前記シロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドが、配列番号４に記載されたものである、請求項１または２に記載の核酸発現構築物。
4. 前記シロイヌナズナＡＢＰＩ小胞体標的化シグナルペプチドをコードする核酸配列が配列番号５に記載されたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸発現構築物。
5. 前記小胞体保持シグナルペプチドが、配列番号６に記載されたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸発現構築物。
6. 前記小胞体保持ペプチドをコードする核酸配列が配列番号１９に記載されたものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸発現構築物。
7. 前記核酸配列が、配列番号２に記載される配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸発現構築物。
8. 前記ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質が、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸発現構築物。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸発現構築物を含む、単離細胞。
10. 前記細胞が、植物細胞である、請求項９に記載の細胞。
11. 前記植物細胞が、タバコ細胞である、請求項１０に記載の細胞。
12. 前記タバコ細胞が、ＢＹ−２細胞である、請求項１１に記載の細胞。
13. 組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を製造する方法であって、
    請求項９〜１２のいずれか一項に記載の細胞を提供するステップと、
    前記細胞を成長させて、前記組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を産生するステップと、
    前記細胞から、前記組換えヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質を単離するステップと
    を含む方法。
14. Ｎ末端グリシン残基を有するヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質であって、Ｃ末端において小胞体保持シグナルペプチドに翻訳時に融合されたヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質。
15. 配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質。
16. 活性成分としての請求項１４または１５に記載のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
17. 前記ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質が、３つが露出したマンノース残基である９つのマンノース残基を含むグリカン構造を有する、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 活性成分として請求項１４もしくは１５または両項に記載のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の集団を含む医薬組成物であって、前記集団の少なくとも０．５％が、３つが露出したマンノース残基である９つのマンノース残基を含むグリカン構造を有する、医薬組成物。
19. 活性成分としての請求項１４もしくは１５または両項に記載のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の集団、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物であって、ヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の前記集団の優勢なグリカン構造が、マンノース４−β−（１，２）キシロース（Ｍ４Ｘ）、マンノース３−β−（１，２）キシロース−α−（１，３）フコース［Ｆｃ（３）Ｍ３Ｘ］、およびマンノース８（Ｍ８）である、医薬組成物。
20. 活性成分としての請求項９〜１２のいずれか一項に記載の細胞、および薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
21. その治療を必要とする対象においてファブリー病を治療するための薬剤を製造するための、請求項１４または１５に記載のヒトα−ガラクトシダーゼタンパク質の使用。
22. その治療を必要とする対象においてファブリー病を治療するための薬剤を製造するための、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の細胞の使用。