CN105121460A

CN105121460A - 表达TNFα多肽抑制的植物细胞在治疗中的用途

Info

Publication number: CN105121460A
Application number: CN201480022537.6A
Authority: CN
Inventors: 亚龙·伊兰; 约瑟夫·沙尔迪尔; 尤里·阿纳尼亚; 塔利·基日涅尔; 塔米·阿里埃勒; 韦斯特兰娜·金吉斯韦利茨基
Original assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co; Protalix Ltd
Current assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co; Protalix Ltd
Priority date: 2013-03-06
Filing date: 2014-03-06
Publication date: 2015-12-02
Also published as: EP2964669B1; US20160017019A1; AU2014224174B2; WO2014136117A1; AU2014224174A1; BR112015021707A2; JP2016510737A; EP2964669A1; US10087232B2; JP6622591B2; CA2902727C; CA2902727A1

Abstract

提供了一种治疗选自肥胖、代谢综合征、糖尿病和肝脏疾病或病症的TNFα相关医疗状况的方法。所述方法包括向有需要的受试者肠内施用治疗有效量的表达TNFα多肽抑制剂的植物细胞，从而治疗所述TNFα相关医疗状况。

Description

表达TNFα多肽抑制的植物细胞在治疗中的用途

技术领域和背景技术

本发明，在其一些实施方案中，涉及表达TNFα多肽抑制的植物细胞在治疗中的用途。

肿瘤坏死因子α(TNFα)是介导对不同炎症、感染和免疫相关过程和疾病的调节的重要促炎性细胞因子，TNFα被视为是造成炎症性病理最重要的介质。

TNF-α为17kD分子量蛋白质，最初作为呈稳定三聚体排列的跨膜蛋白合成，然后受金属蛋白酶-TNFα转化酶(TACE)裂解形成与其泛表达的同源受体(TNFRI、p55和TNFRII、p75)接合的同型三聚体可溶性TNF(sTNF)。泛在TNF受体为多种多样的TNF-α介导的细胞反应提供了基础。

TNF-α诱导了多种多样的细胞反应，其中许多导致有害后果，例如恶病质(脂肪损失及全身蛋白质损耗，导致厌食症，这在癌症和AIDS患者中常见)和败血性休克。TNF-α的分泌提高已经涉及到多种人类疾病包括糖尿病、同种异体移植物排斥、脓毒症、炎症性肠病、骨质疏松症，许多自身免疫性疾病例如多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、超敏反应、免疫复合物疾病，并且甚至涉及到疟疾、癌症和肺部纤维化。

TNFα的生物学效应受两种不同受体介导。TNF-α受体，从单核细胞中流出时，通过“擦洗”并用作天然抑制剂降低TNF-α水平。通过特异性抗体和诱捕受体中和TNFα已经成为调节TNFα介导的毒性的常见策略。

迄今为止，USFDA已经批准了5种蛋白基TNFα拮抗剂供临床使用：Cimzia(聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Certolizumabpegol))，TNFmAbFab片段-PEG偶联物；Remicade(英利昔单抗(Infliximab))，TNFrmAB；Humira(阿达木单抗(Adalimumab))，TNFrmAB；Simponi^TM(戈利木单抗(Golimumab))，抗TNF和依那西普(etanercept)，与人IgG的Fc片段融合的可溶性75kDaTNFα受体的融合蛋白(登记为Enbrel^TM)。

依那西普适用于类风湿性关节炎(RA)和其它关节炎适应症例如幼年特发性关节炎(JIA)、银屑病和强直性脊柱炎(AS)。类风湿性关节炎(RA)是影响全世界约五百万人的一种慢性疾病。全世界有适应症的近500,000名患者用Enbrel治疗。2010年Enbrel销售额为78亿美元并且抗TNF市场总额达240.4亿美元。当前或完成的Enbrel疗法的临床试验包括诸如成人呼吸窘迫综合征、天疱疮、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease)、白塞氏综合征(Behcet’ssyndrome)、HIV、心肌梗塞、膝关节滑膜炎、狼疮性肾炎、扁平苔癣、全身性淀粉样变性病、坐骨神经痛、白癫风、慢性疲劳综合征、厌食、TMJ、哮喘、支气管炎、糖尿病、骨髓增生异常疾病等不同适应症。

然而，生物制药通常带来许多挑战，药物开发人员必须克服才能成功地将这些化合物开发成安全有效的治疗剂。例如，蛋白质和肽倾向于受蛋白水解酶破坏或，在较高分子量蛋白质的情况下，可生成中和抗体。而且，大的复合分子可表现出低溶解性或弱稳定性，导致保存期限短。因此，生物制药治疗剂常常很快失去其有效性或需要频繁给药。这些因素不但影响治疗的成本，而且影响患者接受程度和依从性，从而影响其治疗功效。

口服施用：

最常见的蛋白质和肽基施用模式是通过侵入性药物递送方法，例如注射和输注。虽然对于全身性疾病而言存在施用大分子药物的原始模式，但是其对于患者和医师而言最不理想。这种递送方法的明显缺点是患者接受程度和依从性，将大多数高分子开发限于对使用侵入性施用途径的需要比相关费用和不便更重要的适应症。作为全身递送药物的简单、非侵入性方法，口服施用提供了许多优势：使用简单方便、接近大体积的吸收性表面、高度血管化、相对长的保留时间、自然处理非活性、非代谢成分等。

尽管如此，口服施用大分子药品的研究尚未显示出满意的效率水平以匹配这种途径的潜力。一些障碍是丸剂和其它固体制剂摄入困难，在GI道中生物活性大分子不稳定，生物活性剂在粘膜处富集和GI膜对生物活性大分子的渗透性。

生物活性物质的口服施用途径伴有胃部内高酸性和酶降解，这样可在到达其预期靶组织之前灭活或破坏生物活性大分子。进一步地，难以在GI道中遇到的大体积内达到生物活性大分子的有效浓度。因此，为了有效，必须保护大部分药物免于吸收和/或处于上部GI道内的环境中，然后突然释放到肠管或结肠内。在制药业中正开发各种策略以克服与治疗性大分子诸如蛋白质的口服或肠内施用相关的问题。这些策略包括与载体共价连接，设计为减缓或防止活性成分在恶劣条件诸如胃部和上部GI道中释放的包衣或制剂(pH敏感包衣、聚合物和多层包衣、胶囊化、定时释放制剂、生物胶粘剂系统、渗透控制递送系统等)。然而，此类制剂中生物活性剂的制备需要复杂且昂贵的工艺。还采用了粘膜胶粘剂和穿透增强剂(水杨酸盐、脂质-胆汁盐混合微团、甘油酯、酰基肉碱等)用于增加在粘膜处的吸收量。然而，这些中的一些可引起严重的局部毒性问题，诸如局部刺激、上皮细胞层磨损和组织炎症。改善口服递送的其它策略包括混合生物活性剂与蛋白酶抑制剂，诸如抑肽酶(aprotinin)、大豆胰蛋白酶抑制剂和抑氨肽酶(amastatin)；然而酶抑制剂并非选择性，并且也抑制内源性大分子，引起不良副作用。因此，口服施用生物活性生物药品的当前方法不能确保所需生物活性在靶组织的有效递送。

由于胃部内在达到循环之前灭活或破坏分子的高酸性和酶降解，尝试口服施用TNFR2:Fc(Enbrel)已经失败。详细阐述的复杂机制，包括用于肠胃外自动施用的装置已经进展为确保与给药方案的依从性。

另外的背景技术包括：Finck等的美国专利第7,915,225号，Finck等的美国专利申请第13/021,545和10/853,479号，Li等的美国专利申请第11/906,600号，Warren等的美国专利申请第10/115,625号和Gombotz等的美国专利申请第11/784,538号。

发明内容

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种治疗选自肥胖、代谢综合征、糖尿病和肝脏疾病或病症的TNFα相关医疗状况的方法，所述方法包括向有需要的受试者肠内施用治疗有效量的表达TNFα多肽抑制剂的植物细胞，从而治疗所述TNFα相关医疗状况。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了表达TNFα多肽抑制剂的植物细胞用于选自肥胖、代谢综合征、糖尿病和肝脏疾病或病症的TNFα相关医疗状况的肠内治疗的用途。

根据本发明的一些实施方案，所述肠内为口服施用。

根据本发明的一些实施方案，所述TNFα多肽抑制剂为抗TNFα抗体。

根据本发明的一些实施方案，所述抗TNFα抗体为英利昔单抗、阿达木单抗或戈利木单抗。

根据本发明的一些实施方案，所述TNFα多肽抑制剂为嵌合多肽，其包含：

(i)包含TNF受体的TNFα结合结构域的第一结构域；和

(ii)包含免疫球蛋白的Fc结构域的第二结构域；其中所述第一结构域和所述第二结构域N端与C端分别依次翻译性融合并且其中所述嵌合多肽特异性结合TNFα。

根据本发明的一些实施方案，所述嵌合多肽还包含含内质网滞留信号的第三结构域，其中所述第一结构域、第二结构域和第三结构域N端与C端分别依次翻译性融合。

根据本发明的一些实施方案，所述方法或用途包括编码内质网信号肽，N端与所述第一结构域翻译性融合的附加结构域。

根据本发明的一些实施方案，所述信号肽为植物信号肽。

根据本发明的一些实施方案，所述植物信号肽如SEQIDNO:4中所示。

根据本发明的一些实施方案，所述第一结构域为200-250个氨基酸长。

根据本发明的一些实施方案，所述第一结构域包含氨基酸序列LCAP(SEQIDNO:11)和VFCT(SEQIDNO:12)。

根据本发明的一些实施方案，所述第一结构域还包含氨基酸序列LPAQVAFXPYAPEPGSTC(SEQIDNO:13)。

根据本发明的一些实施方案，所述第一结构域如SEQIDNO:2中所示。

根据本发明的一些实施方案，所述免疫球蛋白为IgG₁。

根据本发明的一些实施方案，所述第二结构域如SEQIDNO:9中所示。

根据本发明的一些实施方案，所述嵌合多肽如SEQIDNO:6中所示。

根据本发明的一些实施方案，所述嵌合多肽如SEQIDNO:7、204或205中所示。

根据本发明的一些实施方案，所述嵌合多肽能够抑制TNFα诱导的凋亡。

根据本发明的一些实施方案，所述TNFα多肽抑制剂包含植物特有的聚糖。

根据本发明的一些实施方案，所述植物特有的聚糖选自核木糖和核α-(1,3)岩藻糖。

根据本发明的一些实施方案，所述植物细胞为烟草植物细胞。

根据本发明的一些实施方案，所述烟草植物细胞为亮黄色(BY-2)细胞。

根据本发明的一些实施方案，所述植物细胞经冻干。

根据本发明的一些实施方案，所述植物细胞悬浮生长。

根据本发明的一些实施方案，所述肝脏疾病或病症选自肝炎、肝硬化、肝癌、肝中毒、慢性肝病、脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

根据本发明的一些实施方案，所述肝中毒由选自醋胺酚、NSAIDS、糖皮质激素、异烟肼(isniazed)、砷、四氯化碳和氯乙烯的化学试剂诱导。

根据本发明的一些实施方案，所述糖尿病选自I型糖尿病、II型糖尿病和LADA病。

根据本发明的一些实施方案，所述植物细胞呈口服营养形式提供。

根据本发明的一些实施方案，所述口服营养形式为全餐、可溶粉末、棒状物、焙烤产品、压块干粮、奶制品条、小吃、早餐谷物食品、牛奶什锦早餐、糖果、药片、曲奇、饼干、梳打饼干、巧克力和奶制品。

除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等效的方法和材料可用于本发明实施方案的实践或试验中，但是下面描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以包括定义在内的专利说明书为准。另外，所述材料、方法和实例仅为说明性而非旨在为必要性限制。

附图说明

本文仅以举例的方式，参考附图描述了本发明的一些实施方案。现详细地具体参考附图，应强调所示细节为举例而言并且是为了说明性讨论本发明实施方案的目的。在这一点上，随图所做的描述使得对于本领域的技术人员而言可以如何实践本发明的实施方案显而易见。

图中：

图1为植物表达的重组人(prh)TNFR2:Fc的氨基酸序列(本文也称为PRX-106，SEQIDNO:6)的示意图。用于在BY2细胞内表达的prhTNFR2:FccDNA装配有信号肽以将由TNF受体的TNF结合部分和FC蛋白组成的融合多肽靶向分泌途径。所述氨基酸序列的色码：黄色：信号肽；黑色：TNF受体部分；蓝色：IgG1的Fc部分；红色：ER滞留信号；

图2A-B示出了通过蛋白质印迹对PRHTNFR2:FC和商用Enbrel的比较。在还原条件(图2A)和非还原条件(图2B)下分别通过12％和8％Tris-甘氨酸SDS-PAGE分析prhTNFR2:Fc(泳道1)和商用Enbrel(泳道2)。膜沾上抗人IgG(抗FC)抗体(上图)和抗TNFR2抗体(下图)。在右侧泳道中示出了分子量。泳道1：PRHTNFR2:FC；泳道2：商用

图3为示出通过对prhTNFR2:Fc结合活性和分子完整性的定量非放射性测定测得的TNFα受prhTNFR2:Fc和商用的结合的图。用TNFα培育预涂有抗TNFα抗体的ELISA板，接着暴露于商用和来自于表达prhTNFR2:Fc的BY2细胞的上清液。X轴上示出了两种制剂的连续稀释度。用山羊抗人IgGFcHRP检测到分子的Fc部分；

图4为示出用抗IgG(抗FC)抗体通过蛋白质印迹分析筛选用于表达prhTNFR2:Fc的单植物细胞系的图像；

图5A-F为示出在prhTNFR2:Fc或商用的存在下通过MTT活力测定测得的A375细胞中的TNFα细胞毒性的图像。图5A-未经处理培养的A375细胞；图5B-经TNFα处理；图5C-经prhTNFR2:Fc(3.125ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图5D-经商用(3.125ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图5E-经prhTNFR2:Fc(100ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图5F-经商用(100ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；

图5G为示出在prhTNFR2:Fc或商用Enbrel的存在下通过MTT活力测定测得的A375细胞中的TNFα细胞毒性的柱状图；

图6A-F为示出在prhTNFR2:Fc或商用的存在下通过MTT活力测定测得的L929细胞中的TNFα细胞毒性的图像。图6A-未经处理培养的L929细胞；图6B-经TNFα处理；图6C-经prhTNFR2:Fc(3.125ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图6D-经商用(3.125ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图6E-经prhTNFR2:Fc(100ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；图6F-经商用(100ng/ml)处理的TNFα暴露细胞；

图6G为示出显示在prhTNFR2:Fc或商用的存在下通过MTT活力测定测得的L929细胞中的TNFα细胞毒性的图像的柱状图；

图7A-C为说明在伴刀豆球蛋白A(ConA)小鼠免疫介导性肝炎模型中表达重组TNFR2:Fc的植物细胞对肝中毒的血清标志物的有效抗炎活性的柱状图。小鼠在静脉施用伴刀豆球蛋白A(ConA)6小时前接受表达重组TNFR2:Fc(植物TNFR2:Fc)的植物细胞、类固醇抗炎治疗(地塞米松)、宿主植物对照细胞(BY2)或不治疗(盐水)。conA施用14小时后测定血清肝酶(丙氨酸转氨酶ALT和天冬氨酸转氨酶AST)以评估肝脏实质性损伤的程度。图7A和7C-柱1-盐水对照；柱2-地塞米松；柱3-相当于5μgTNFR2:Fc蛋白的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞；柱4-等体积宿主植物对照细胞(BY2)。图7B-柱1-盐水对照；柱2-地塞米松；柱3-相当于0.5μgTNFR2:Fc蛋白的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞；柱4-相当于5μgTNFR2:Fc蛋白的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞；柱5-与柱3等体积的宿主植物对照细胞(BY2)；柱6-与柱4等体积的宿主植物对照细胞(BY2)。图7A-n＝6，相对于盐水*p<0.01；**p<0.0005；***p<0.00005和相对于阴性对照p<0.05。图7B-n＝6，相对于盐水*p<0.02；和相对于阴性对照p<0.0005，相对于阴性对照#p<0.03。图7C-n＝6，相对于盐水*p<0.01；**p<0.0005；***p<0.00005和相对于阴性对照p<0.00005；

图8A-8C为说明在伴刀豆球蛋白A(ConA)小鼠免疫介导性肝炎模型中口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞对血清IFN-γ水平的有效抗炎活性的柱状图。如图7A-7C所述，小鼠在施用ConA之前接受口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞、宿主植物对照细胞(BY2)、类固醇或盐水。conA施用14小时后通过ELISA测定血清IFN-γ。图8A和8C-柱1-盐水对照；柱2-地塞米松；柱3-相当于5μgTNFR2:Fc蛋白的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞；柱4-等体积宿主植物对照细胞(BY2)。图8B-柱1-盐水对照；柱2-地塞米松；柱3-相当于0.5μgTNFR2:Fc蛋白的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞；柱4-相当于5μgTNFR2:Fc蛋白的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞；柱5-与柱3等体积的宿主植物对照细胞(BY2)；柱6-与柱4等体积的宿主植物对照细胞(BY2)。图8A-n＝6，相对于盐水*p<0.05；**p<0.00001和相对于阴性对照p<0.0004。图8B-n＝6，相对于盐水*p<0.05；**p<0.00001和相对于阴性对照p<0.004，相对于阴性对照#p<0.02。图8C-n＝6，相对于盐水*p<0.05和相对于阴性对照p<0.09；

图9A-9C为说明在小鼠伴刀豆球蛋白A(ConA)免疫介导性肝炎模型中通过口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞预防肝中毒的示例性肝切片的显微照片。如图6A-6C所述，小鼠在施用ConA之前接受表达重组TNFR2:Fc的植物细胞、宿主植物对照细胞(BY2)或盐水。conA施用14小时后切除肝脏，于甲醛中固定、切片并用苏木精染色并通过光学显微镜术评价。图9A-ConA+盐水(对照)。图9B-ConA+相当于0.5μgTNFR2:Fc蛋白的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞。图9C-ConA+与图9B等量的宿主植物对照BY2细胞(BY2)；及

图10A和10B为说明在伴刀豆球蛋白A(ConA)小鼠免疫介导的肝炎模型中与哺乳动物重组细胞生成的TNFR2:Fc相比，口服施用的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞对血清标志物的有效抗炎活性的柱状图。小鼠在静脉施用伴刀豆球蛋白A(ConA)6小时前接受口服施用的相当于5μgTNFR2:Fc蛋白的表达重组TNFR2:Fc(植物TNFR2:Fc)的植物细胞(图10A，柱2)、腹腔内施用的0.1mg哺乳动物重组TNFR2:Fc(依那西普)(图9B，柱2)或对照处理(图10A和10B，柱1)。conA施用14小时后测定血清肝生物化学标志物丙氨酸转氨酶(ALT)以评估肝脏实质性损伤的程度。图10A-n＝6，相对于盐水*p<0.01；**p<0.0005；***p<0.00005和相对于阴性对照p<0.05。注意到口服施用的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞与腹腔内施用的哺乳动物重组TNFR2:Fc融合蛋白(依那西普)等效的抗炎作用。

图11为示出在高脂饮食小鼠模型中口服施用在植物细胞内的重组TNFR2:Fc对血清水平的影响的柱状图。

图12A-B为示出在高脂饮食小鼠模型中口服施用在植物细胞内的重组TNFR2:Fc对血清TG的影响的柱状图。与盐水相比，*p<0.0001；和与模拟物相比，p<0.002。

图13为示出HFD小鼠中的增重的图。

图14为示出在HFD小鼠中口服施用在植物细胞内的重组TNFR2:Fc对肝Treg的影响的柱状图。与盐水相比，*p<0.05。

图15为示出在HFD小鼠中口服施用在植物细胞内的重组TNFR2:Fc对肝NK细胞的影响的柱状图。与盐水相比，*p<0.05。

图16为示出口服施用在植物细胞内的重组TNFR2:Fc对脾/肝CD4+CD25+FOXP3+比率的影响的柱状图。

图17为示出口服施用在植物细胞内的重组TNFR2:Fc对脾/肝CD8+CD25+FOXP3+比率的影响的柱状图。

具体实施方式

本发明，在其一些实施方案中，涉及表达TNFα抑制的植物细胞在治疗中的用途。

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明在其应用方面不一定限于以下说明中提出的细节或通过实施例举例说明。本发明能够有其它实施方案或能够以不同方式实践或实施。

生物药品向其靶组织的准确递送带来不但影响治疗成本，而且影响患者接受程度和依从性的挑战，从而影响其治疗功效。口服施用大分子生物药品必须克服障碍诸如丸剂和其它固体制剂的摄入，在GI道中生物活性大分子不稳定，生物活性剂在粘膜处富集和GI膜对生物活性大分子的渗透性。

由于胃部内的酸性和酶降解，先前尝试口服施用TNFR2:Fc已经失败。本发明人已令人惊讶地证实可通过供给表达重组TNFR2:Fc的植物细胞有效地口服施用生物活性TNF结合蛋白(TNFR2:Fc)，并且口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞提供了对免疫介导性炎症性疾病的显著防护。

当烟草BY2细胞经编码重组TNFR2:Fc的核酸构建体转化并培养时，证实所得TNF结合蛋白准确表达(参见实施例1)，具有与商用、哺乳动物细胞表达的重组TNFR2:Fc类似的电泳迁移率、免疫交叉反应性和TNFα结合特征(参见图2-3)。植物细胞表达的重组TNFR2:Fc的生物功能的体外测定使用两种不同类型的靶细胞，(参见图5A-F和图6A-6G)提供了比得上的免于TNF介导性凋亡的细胞保护的更多证据。

令人惊讶的是，在诱导伴刀豆球蛋白A免疫介导性肝中毒之前为小鼠饲喂培养的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞时，观察到肝损伤和炎症细胞因子标志物血清水平显著的剂量依赖性降低(实施例3、图7-9)。对口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞和腹腔内施用的比较显示几乎相同的血清肝酶水平降低，表明对conA肝中毒模型的免疫相关性炎性损伤特征的有效防护。

在进一步减少本发明的一些实施方案以实践的同时，本发明人已经发现口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞引起用高脂饮食小鼠建模的脂肪酸疾病的某些临床表现的改善(参见图11-17)。因此，口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞在脂肪性肝病的动物模型中引起血清酶和甘油三酯减少。所述药物还改变了不同T细胞和NK细胞群的脾脏和肝脏分布，表明所述药物起NAFLD和代谢综合征的免疫调节剂的作用。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种治疗选自肥胖、代谢综合征、糖尿病、高脂血症和肝脏疾病或病症的TNFα相关医疗状况的方法，所述方法包括向有需要的受试者肠内施用治疗有效量的表达TNFα多肽抑制剂的植物细胞，从而治疗所述TNFα相关医疗状况。

可选地或另外，提供了表达TNFα多肽抑制剂的植物细胞用于治疗与肥胖、代谢综合征、糖尿病和肝脏疾病或病症直接相关的TNFα相关医疗状况的用途。

术语“治疗”指抑制、预防或阻止病理(疾病、病症或病状)的发展和/或引起病理的减少、减轻或消退。本领域中的技术人员将理解可使用不同方法论和测定法评估病理的发展，并且类似地，可使用不同方法论和测定法评估病理的减少、减轻或消退。

如本文中所用，术语“预防”指阻止疾病、病症或病状在可能有疾病风险，但尚未诊断为患病的受试者中发生。

如本文中所用，术语“受试者”包括任何年龄，遭受病理的哺乳动物，例如人。根据一个特定实施方案，该术语涵盖有发展病理的风险的个体。

因此本教导针对治疗或预防与肥胖、代谢综合征、糖尿病和肝脏疾病或病症直接相关的医疗状况。根据本发明一些方面的一些实施方案，包含表达重组TNFα多肽抑制剂的植物细胞的本发明组合物可用于预防、治疗和控制疾病和病状，包括肥胖、代谢综合征和糖尿病。一般而言，术语‘预防’、‘控制’和‘治疗’涵盖预防疾病或症状从可能具有所述疾病或所述症状的素因但尚未诊断为具有所述疾病或所述症状的患者中发展；抑制疾病的症状，即抑制或阻滞其进展；和缓和疾病的症状，即所述疾病或所述症状消退，或逆转所述症状的进展。

可根据本发明控制或治疗所有类型的肥胖，包括内源性肥胖、外源性肥胖、胰岛机能亢进性肥胖、增生性肥大型肥胖、肥大型肥胖、甲状腺机能减退性肥胖和病态性肥胖。然而，炎症介导的肥胖可根据本发明受到特别有效的治疗。用预防’或‘控制’或‘治疗’意指减缓、终止或逆转体重增加，特别是体脂增加，导致体重维持或降低。重量或体脂降低可通过降低血压、总胆固醇、LDL胆固醇和甘油三酯防御心血管疾病，并且可减轻与慢性病状诸如高血压、冠心病、2型糖尿病、高脂血症、骨关节炎、睡眠性呼吸暂停和退行性关节病相关的症状。

代谢综合征或综合征X是一种复杂的多因素病状，伴有各种各样的异常包括高血压、高甘油三酯血症、高血糖症、低HDL-C水平和腹部肥胖。具有这些特征的个体通常表现出血栓前和前炎症状态。可用数据表明代谢综合征真的是一种综合征(一组风险因素)。

根据世界卫生组织(WHO)指导方针，如果个体表现出：a)高血压(收缩压>140mmHg或舒张压>90mm)；(b)血脂异常，定义为血浆甘油三酯升高(150mg/dL)，和/或低密度脂蛋白(HDL)胆固醇(男性<35mg/dL，女性<39mg/dL)；3)内脏型肥胖，定义为体重指数(BMI)(30kg/m2)和/或高腰臀比(男性>0.90，女性>0.85)；及4)微量白蛋白尿(尿白蛋白排泄率为20g/min)，则存在代谢综合征。参见WHO-InternationalSocietyofHypertensionGuidelinesfortheManagementofHypertension.GuidelinesSubcommittee.J.Hypertens.17:151-183,1999。

根据国家胆固醇教育计划(NCEPATPIII研究)，如果存在以下五(5)种风险因素中的三(3)种或更多种：(1)对于男性而言腰围>102cm(40英寸)或对于女性而言>88cm(37英寸)；(2)甘油三酯水平为150mg/dL；(3)对于男性而言HDL胆固醇水平<40mg/dL或对于女性而言<50mg/dL；(4)血压>130/85mmHg；或(5)空腹血糖>110mg/dL，则诊断为代谢综合征。JAMA285:2486-2497,2001。

每种与代谢综合征相关的病症对其自身而言是风险因素，并且可促进动脉粥样硬化、心血管疾病、中风和其它不良健康后果。然而，当一起存在时，这些因素预示心血管疾病和中风风险增加。

用‘控制’或‘治疗’意指在个体中显示的代谢综合征的症状在严重程度和/或数量上降低。此类症状可包括血糖升高、葡萄糖耐受不良、胰岛素抗性、甘油三酯升高、LDL-胆固醇升高、低密度脂蛋白(HDL)胆固醇、血压升高、腹部肥胖、前炎性状态和血栓前状态。用‘预防’或‘控制’或‘治疗’另外或可选地意指降低发展相关疾病的风险和/或延迟此类疾病的发作。此类相关疾病包括心血管疾病、冠心病和其它与动脉壁成斑有关的其它疾病和糖尿病病状。

糖尿病病状包括，例如1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病、前体糖尿病、缓慢起病自身免疫性1型糖尿病(LADA)、高血糖症和代谢综合征。为了治疗的目的，糖尿病可为明显的诊出糖尿病，例如2型糖尿病或前期糖尿病病状。

糖尿症(本文通称为“糖尿病”)是一种特征在于葡萄糖调节受损的疾病。糖尿病是在胰腺不能生成足够胰岛素时或在身体无法有效地使用生成的胰岛素时出现的慢性疾病，导致血液中葡萄糖的浓度增加(高血糖症)。糖尿病可分类为1型糖尿病(胰岛素依赖型、青少年或儿童期发作型糖尿病)、2型糖尿病(非胰岛素依赖型或成年发作型糖尿病)、LADA糖尿病(成人隐匿性自身免疫性糖尿病)或妊娠糖尿病。另外，将中间状态诸如葡萄糖耐量受损和空腹血糖受损视为显示进展为2型糖尿病的高风险的病状。

在1型糖尿病中，由于胰腺β细胞的自身免疫性破坏而缺乏胰岛素生成。存在这种自身免疫性破坏的几种标志物，在体液和组织中可检，包括岛细胞自体抗体、胰岛素自体抗体、谷氨酸脱羧酶自体抗体和酪氨酸磷酸酶ICA512/IA-2自体抗体。在包括全世界90％的糖尿病的2型糖尿病中，胰岛素分泌可能不足，但是认为外周胰岛素抗性是主要缺陷。2型糖尿病虽然并非总是，但常常与胰岛素抗性的起因，肥胖相关。

前期糖尿病常常先于2型糖尿病，其中血糖水平高于正常但是尚不足以诊断为糖尿病。术语“前期糖尿病”，如本文中所用，可与术语“葡萄糖耐量受损”或“空腹血糖受损”交换，其是指用于测量血糖水平的试验的术语。

糖尿病中的慢性高血糖症与影响微脉管和/或大脉管的多种、主要血管并发症相关。这些长期并发症包括视网膜病(导致焦点模糊、视网膜脱离和部分或全部失明)、肾病(导致肾衰竭)、神经病(导致肢体疼痛、麻木和失去知觉，并且可能导致足部溃疡和/或截肢)、心肌病(导致心力衰竭)和感染风险增加。2型或非胰岛素依赖型糖尿症(NIDDM)与利用葡萄糖的组织如脂肪组织、肌肉和肝脏对胰岛素生理作用的抗性相关。与NIDDM相关长期居高不下的血糖可导致危重并发症，包括肾病，常常需要透析或肾移植；周围神经病；导致失明的视网膜病；导致截肢的下肢溃疡和坏死；可进展为硬化的脂肪性肝病；和对冠状动脉病和心肌梗塞的易感性。用‘预防’意指降低糖尿病发展的风险或延迟糖尿病的发作。用‘控制’或‘治疗’意指降低发展相关并发症的风险和/或延迟此类并发症的发作。

根据本发明的方法经受用表达重组TNFα多肽抑制剂的植物细胞治疗的糖尿病性病状可使用本领域中已知的许多测定法中的任一种诊断或监测。诊断或将个体分类为糖尿病患者或前期糖尿病患者或监测所述个体的测定法的实例包括但不限于糖基化血红蛋白(HbA1c)试验、连接肽(C-肽)试验、空腹血糖(FPG)试验、口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和随机血糖试验。

HbA1c是测量血液中糖基化血红蛋白的量的生物标志物。HbA1c指血红蛋白的稳定小糖化亚组分。其是过去6-8周期间平均血糖水平的反映，并且表示为总血红蛋白的百分比(％)。可选地，可使用本领域中几种已知试验中的任一种，包括空腹血糖试验或口服葡萄糖耐量试验，通过测量血糖水平诊断糖尿病或前期糖尿病。使用空腹血糖(FPG)试验，如果患者的阈值FPG高于125mg/dl，则将患者分类为糖尿病患者并且根据本发明的方法经受治疗，并且如果患者的阈值FPG高于100mg/dl但低于或等于125mg/dl，则将患者分类为前期糖尿病患者并且根据本发明的方法经受治疗。使用口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，如果患者的2小时OGTT葡萄糖水平阈值高于200mg/dl，则将患者分类为糖尿病患者并且根据本发明的方法经受治疗。如果患者的2小时OGTT葡萄糖水平阈值高于140mg/dl但低于200mg/dl，则将患者分类为前期糖尿病患者并且根据本发明的方法经受治疗。

由胰岛素原分子生成的C-肽按与胰岛素的等摩尔比从岛细胞分泌到血液中，并且用作β细胞功能和胰岛素分泌的生物标志物。空腹C-肽测量高于2.0ng/ml指示高胰岛素水平，而空腹C-肽测量低于0.5ng/ml指示胰岛素生成不足。

可通过测量本文所述的任何生物标志物和/或血糖指标，包括但不限于糖基化血红蛋白水平、C-肽水平、空腹血糖水平和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)水平，监测已经分类为具有糖尿病病状并且根据本发明的方法经受用表达重组TNFα多肽抑制剂的植物细胞治疗的受试者的治疗功效。对于本文所述的生物标志物和/或血糖指标，可通过量化来自于受试者的样品中的生物标志物或血糖指标和确定生物标志物或血糖指标的水平是否达到或接近阈值水平，测定治疗功效。在一些实施方案中，阈值水平可与根据本领域中已知的标准为“正常”(即，非糖尿病)值的生物标志物或血糖指标水平相对应，或阈值水平可与根据本领域中已知的标准为前期糖尿病或糖尿病值的生物标志物或血糖指标水平相对应。

在一些实施方案中，通过在治疗开始之前进行受试者中一种或多种生物标志物和/或血糖指标的首次测量，并且将首次测量与治疗开始后一个或多个时间点受试者中相同生物标志物和/或血糖指标的二次测量做比较测定治疗功效，其中已经达到或超过阈值(根据测量的生物标志物，高于或低于)或比接近阈值的首次测量更接近阈值的二次测量，表明治疗有效。

可选地或另外，可通过确定与糖尿病病状相关的继发性病状和症状是否已经改善监测治疗功效。例如，监测通过本发明的方法治疗的受试者在视网膜病(例如，视力提高)、肾病(例如，肾脏结构或功能改善)、神经病(例如，神经功能改善)和/或心血管疾病(例如，血压降低或脂质水平更低)症状上的改善或减轻。

高脂血症：

根据本发明一些方面的一些实施方案，包含表达重组TNFα多肽抑制剂的植物细胞的本发明组合物可用于预防、治疗和控制涉及血液中的任何或所有脂质和/或脂蛋白水平异常升高的高脂血症(也称为高脂蛋白血症或血脂过多症)。^[1]它是血脂异常最常见的形式(其包括任何异常的脂质水平)。高脂血症也根据升高的脂质类型分类，即高胆固醇血症、高甘油三酯血症或呈混合型高脂血症。脂蛋白(a)的水平升高也可分类为高脂血症的形式。在所述术语下还包括I型高脂蛋白血症、II型高脂蛋白血症、III型高脂蛋白血症、IV型高脂蛋白血症和V型型高脂蛋白血症。和未分类的高脂血症家族形式和获得形式一样。

肝病：

根据本发明一些方面的一些实施方案，包含表达重组TNFα多肽抑制剂的植物细胞的本发明组合物可用于预防、治疗和控制肝脏疾病和病症，包括肝炎、硬化和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)(也称为非酒精性脂肪性肝病-NAFLD)、肝中毒和慢性肝病。一般而言，术语预防’、‘控制’和‘治疗’涵盖预防疾病或症状从可能具有所述疾病或所述症状的素因但尚未诊断为具有所述疾病或所述症状的患者中发展；抑制疾病的症状，即抑制或阻滞其进展；和缓和疾病的症状，即所述疾病或所述症状消退，或逆转所述症状的进展。

术语“肝病”适用于致使肝脏作用不正常或停止起作用的许多疾病和病症，并且这种肝功能的损失表示有肝病。因此，频繁使用肝功能试验以诊断肝病。此类试验的实例包括但不限于以下：

(1)测定血清酶诸如乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的测定法，其中酶水平增加表示有肝病。本领域中的技术人员将合理地理解这些酶测定法仅表示肝脏已经受损。它们未评估肝脏起作用的能力。可使用其它试验测定肝脏起作用的能力。

(2)测定血清胆红素水平的测定法。将血清胆红素水平报告为总胆红素和直接胆红素。总血清胆红素的正常值为0.1-1.0mgdl(例如，约2-18mmol/L)。直接胆红素的正常值为0.0-0.2mg/dl(0-4mmol/L)。血清胆红素增加表示有肝病。

(3)测定血清蛋白水平，例如白蛋白和球蛋白(例如，α、β、γ)的测定法。总血清蛋白的正常值为6.0-8.0g/dl(60-80g/L)。血清白蛋白减少表示有肝病。球蛋白增加表示有肝病。

其它试验包括凝血酶原时间、国际标准化比率、活化凝血时间(ACT)、部分促凝血活酶时间(PTT)、凝血酶原消耗时间(PCT)、纤维蛋白原、凝血因子、α-胎蛋白和α-胎蛋白-L3(百分比)。

肝病的一种临床重要类型为肝炎。肝炎是可由病毒(例如，甲型、乙型和丙型肝炎病毒(分别为HAV、HBV和HCV))、化学药品、药物、酒精、遗传病或患者自身的免疫系统(自身免疫性肝炎)引起的肝脏炎症。这种炎症可为急性并且在几周至几个月内消退，或为慢性并且持续多年。慢性肝炎可在产生明显症状，例如硬化(瘢疤形成和功能丧失)、肝癌或死亡之前持续几十年。术语“肝病”涵盖并且适于使用本发明的组合物和方法治疗或预防或控制的不同疾病和病症的其它重要实例包括但不限于阿米巴肝脓肿、胆道闭锁、纤维化、硬化、球孢子菌病、肝炎δ-病毒、肝细胞癌(HCC)、酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬变、化脓性肝脓肿、雷尔氏综合征(Reye'ssyndrome)、硬化性胆管炎和威尔逊氏病(Wilson'sdisease)。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法适于治疗特征在于肝实质细胞损失或损伤的肝病。在一些方面，这种的病因可为局部或全身性炎症反应。

当大部分肝脏变得受损并且肝脏不再能够执行其正常生理功能时出现肝衰竭。在一些方面，可使用上述肝功能的测定法或通过受试者的症状诊断肝衰竭。与肝衰竭相关的症状包括，例如以下的一种或多种：恶心、食欲不振、疲劳、腹泻、黄疸、异常/大量出血(例如，凝血病)、腹水病、精神定向障碍或混乱(例如，肝性脑病)、瞌睡和昏迷。

慢性肝衰竭在数月至数年内发生并且最常由病毒(例如，HBV和HCV)、长期/过量饮酒、硬化、血色素沉着病和营养不良引起。急性肝衰竭是在肝病的首个病征(例如，黄疸)后出现的严重并发症并且包括许多病状，其全部涉及严重的肝细胞损伤或坏死。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法特别适于治疗过急性、急性和亚急性肝衰竭、暴发性肝衰竭和晚发型暴发性肝衰竭，本文中全部称为“急性肝衰竭”。急性肝衰竭的常见原因包括，例如病毒性肝炎、暴露于某些药物和毒素(例如，氟化烃(例如，三氯乙烯和四氯乙烷)、伞形毒菌(例如，常常在“死帽菇”中发现的伞形毒菌)、醋氨酚(扑热息痛(paracetamol))、氟烷、磺胺、苯妥英)、心脏相关肝缺血(例如，心肌梗塞、心搏停止、心肌病和肺栓塞)、肾衰竭、肝静脉流出道梗阻(例如，布加氏综合征(Budd-Chiarisyndrome))、威尔逊氏病、妊娠急性脂肪肝、阿米巴脓肿和播散性结核。

术语“肝炎”用于描述暗示对肝脏的损伤，特征在于在器官组织内存在炎症细胞的肝脏病状。所述病状可自限、自愈，或可进展为肝脏瘢痕形成。肝炎在持续少于6个月时为急性并且在持续长于6个月时为慢性。已知为肝炎病毒的一类病毒在全世界导致大多数的肝损伤情况。肝炎也可归因于毒素(特别是酒精)、其它感染或由于自身免疫过程。肝炎包括由于病毒感染的肝炎，包括A至E型肝炎(A、B、C、D和E-超过95％的病毒性原因)、单纯性疱疹、细胞巨化病毒、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(Epstein-Barrvirus)、黄热病毒、腺病毒；非病毒感染，包括弓形体、钩端螺旋体、Q热、落矶山斑疹热、酒精、毒素(其中包括蘑菇中的鹅膏毒素、四氯化碳、阿魏胶(asafetida))、药物(包括扑热息痛、羟氨苄青霉素(amoxycillin)、抗结核药、米诺环素(minocycline)和本文所述许多其它药物)；缺血性肝炎(循环功能不全)；妊娠；自身免疫性病状，包括全身性红斑狼疮(SLE)；和非酒精性脂肪性肝炎。

“无菌性炎症”用于描述从已经失去其质膜完整性的垂死细胞释放的胞内分子引发的肝脏炎症。这种炎症在没有致病物诸如病毒或细菌和酒精时发生。已经鉴定许多胞内分子可以刺激其它细胞生成促炎性细胞因子和趋化因子。认为此类促炎性细胞分子通过使受体接合在生成细胞因子的细胞上起作用。如果不加治疗，无菌性炎症可进展为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或硬化、

“非酒精性脂肪性肝炎”或“NASH”是其中由肝脏内脂肪累积引起炎症的肝脏病状。NASH是称为非酒精性脂肪性肝病的一类肝病的一部分，其中脂肪在肝脏内累积并且有时引起随时间推移恶化的肝损伤(进行性肝损伤)。“非酒精性脂肪性肝病”(NAFLD)是并非由于过度饮酒的脂肪性肝脏炎症。其与胰岛素抗性和代谢综合征、肥胖、高胆固醇和甘油三酯及糖尿病有关，并且可响应于最初对其它胰岛素抗性状态(例如，2型糖尿症)开发的治疗，诸如减重、二甲双胍和噻唑烷二酮。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是最常见的NAFLD极端形式，其被视为原因不明的肝硬化的主要原因。

已知促成NASH的其它因素包括：缩短肠道、胃部或二者的手术，诸如空肠搭桥手术或胆胰转流术；长期使用饲管或接收营养的其它方法；某些药物，包括胺碘酮、糖皮质激素、合成雌激素和它莫西芬(tamoxifen)。

NASH是可能随时间推移恶化的病状(称为进行性病状)并且可引起肝脏瘢痕形成(纤维化)，这导致硬化。“硬化”描述肝细胞已经被瘢痕组织取代的病状。术语“肝硬化”或“硬化”用于描述特征在于肝组织被纤维瘢痕组织以及再生结节取代，导致肝功能逐渐丧失的慢性肝病。硬化最常由脂肪性肝病引起，包括NASH以及酒精中毒和乙型和丙型肝炎，但是也可具有未知原因。可能威胁生命的硬化并发症为肝性脑病(混乱和昏迷)和因食管静脉曲张出血。历来认为硬化一旦发生通常就不可逆，并且过去的治疗集中于预防进展和并发症。在硬化晚期，唯一的选择是肝移植。表达重组TNFα多肽抑制剂的植物细胞和本发明的方法可用于限制、抑制、降低肝硬化的可能性或治疗肝硬化，无需考虑其病因。

表达重组TNFα多肽抑制剂的植物细胞和本发明的方法可用于治疗、预防或控制化学性肝创伤和肝中毒。“化学性创伤”或“急性化学性创伤”指作为化学毒性，包括药物诱导的毒性或创伤的后果，在短时间内对患者发生的严重损伤。药物诱导的急性肝创伤，包括醋氨酚诱导的急性肝创伤，是作为暴露于药物(例如，药物过量)，尤其是醋氨酚毒性的结果或后果发生的急性肝损伤。根据本发明所述的化合物用于减少由于物理和化学性创伤，尤其包括药物诱导的(药物过量)和醋氨酚诱导的急性肝创伤发生的对肝脏的损伤。

肝中毒是由肝毒剂或肝中毒诱导性生物活性剂引起的化学性肝创伤。术语“肝毒剂”和“肝中毒诱导性生物活性剂”在上下文中同义地用于描述常常在施用此类试剂的患者中引起肝中毒的化合物。肝毒剂的实例包括，例如麻醉剂、抗病毒剂、抗逆转录病毒剂(核苷逆转录酶抑制剂和非核苷逆转录酶抑制剂)，尤其是抗HIV剂、抗癌剂、器官移植药物(环孢菌素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、OKT3)、抗微生物剂(抗TB剂、抗真菌剂、抗生素)、抗糖尿病药物、维生素A衍生物、类固醇试剂(尤其包括口服避孕药、促蛋白合成类固醇、雄性激素)、非类固醇抗炎剂、抗抑郁剂(尤其是三环抗抑郁剂)、糖皮质激素、天然产品及草药和替代疗法，尤其包括圣约翰草(St.John'swort)。

肝中毒可表现为甘油三酯积聚，导致小滴(微泡型)或大滴(大泡型)脂肪肝。存在独立类型的脂肪变性，其中磷脂积聚导致与具有遗传磷脂代谢缺陷的疾病(例如，病戴萨克斯症(Tay-Sachsdisease))类似的模型。

根据一个特定实施方案，肝病为脂肪性肝病(例如，非酒精性)。在这种情况下并且根据一些实施方案，与相同疾病阶段的未治疗受试者相比，TNFα抑制剂(例如，口服施用的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞)引起血清酶(例如，AST或ALT或二者)和/甘油三酯减少并且可替代地或另外改变肝脏和脾脏中T细胞和NK细胞的分布。

表达重组TNFα多肽抑制剂的植物细胞和本发明的方法可用于治疗、预防或控制慢性肝病。慢性肝病的标志为随时间推移肝组织逐渐破坏。几种肝病属于这种类别，包括硬化和纤维化，后者常常是硬化的先兆。硬化是急性和慢性肝病的结果并且特征在于肝组织被纤维瘢痕组织和再生结节取代，导致肝功能逐渐丧失。纤维化和结节再生导致正常的微观肝小叶结构损失。纤维化表示由于，例如感染、炎症、损伤和甚至愈合引起的瘢痕组织生长。随时间推移，纤维化瘢痕组织慢慢地取代起正常作用的肝组织，导致进入肝脏的血流量减少，让肝脏不能够充分加工血流中存在的营养素、激素、药物和毒物。硬化更常见的原因包括酒精中毒、丙型肝炎病毒感染、毒素摄入和脂肪肝，但是也存在许多其它可能的原因。慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是美国估计会影响3-5百万人的慢性肝病的两大主要原因。越来越关注的是有肥胖和代谢综合征的患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的美国公民的数量不断增加，当前数量超过3千万，约10％的人最终将发展NASH。其它身体并发症是肝功能丧失的结果。最常见的硬化并发症是称为腹水的病状，液体在腹腔内积聚，可导致自发性细菌性腹膜炎的风险增加，可能导致患者过早死亡。

达重组TNFα多肽抑制剂的植物细胞和本发明的方法可用于限制、抑制、降低肝癌的可能性或治疗肝癌。肝癌的风险因素包括2型糖尿病(因肥胖加剧)和代谢综合征。根据糖尿病的持续时间和治疗方案，2型糖尿病中肝癌的风险更高(为非糖尿病风险的约3至7倍)。代谢综合征导致炎症、脂肪变性、纤维化、硬化、凋亡、基因表达改变且最终甚至导致肝癌。另外，加剧肝炎和肝炎向硬化的进展的脂质代谢异常、高血压、高血糖症和代谢综合征，例如通过活化星状细胞可进一步导致肝癌。

各种方法可用于肝癌的筛选和诊断并且在本领域中公知。肝癌的指标包括肿瘤标志诸如α-胎蛋白(AFP)或羧基脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)升高。扫描和成像技术也有帮助，包括超声、CT扫描和MRI。宏观上，肝癌可为结节状或弥漫且边界不清的浸润性肿瘤。

如本文中所用术语“TNFα”指肿瘤坏死因子-α(TNF、cachexin或恶病质素(cachectin)，其为涉及全身性炎症的细胞因子和刺激急性期反应的一类细胞因子的成员。TNFα虽然可由许多其它细胞类型如CD4+淋巴细胞、NK细胞和神经元生成，但主要由活化巨噬细胞(M1)生成。所述蛋白质由TNFA基因编码并且具有Ref_seq编号：NP_000585。已知所述蛋白质刺激炎症反应(促炎性细胞因子)。

如本文中所用的“TNFα多肽抑制剂”指结合TNFα并且正如在TNFα与包括以下任一种在内的TNFα受体(TNFR)的结合中所反映，抑制和/或阻碍TNFα活性的多肽：(a)TNFR，优选内源(即个体或宿主天然的)细胞膜结合型TNFR；(b)TNFR的胞外结构域；和/或(c)TNFR的TNFα结合结构域(其可为胞外结构域的一部分)。根据一个特定实施方案，抑制TNFα与受体的结合至少50％，例如50-100％、50-95％、60-90％或甚至70-90％。

TNFα抑制剂包括但不限于TNFα受体(或如本文所述，其适当部分)和抗TNFα抗体。

如本文中所用，TNFα抑制剂的“生物活性”是与TNFα结合并抑制和/或阻碍TNFα与以下任一种结合：(a)TNFR，优选内源细胞膜结合型TNFR；(b)TNFR的胞外结构域；和/或(c)TNFR的TNFα结合结构域(其可为胞外结构域的一部分)。可使用本领域中已知测量TNFα活性及其抑制的测定法证实TNFα抑制剂表现出生物活性，本文提供了其中一个实例。

如本文中所用，术语“TNF受体多肽”和“TNFR”指源自TNFR(来自于任何物种，例如人)的能够结合TNFα的多肽。已经描述了两种不同的细胞表面TNFR：II型TNFR(或p75TNFR或TNFRII)和I型TNFR(或p55TNFR或TNFRI)。成熟全长人p75TNFR是分子量为约75-80千道尔顿(kD)的糖蛋白。成熟全长人p55TNFR是分子量为约55-60kD的糖蛋白。本发明的优选TNFR多肽源自I型TNFR和/或II型TNFR。下文提供了示例性登记号。根据一个特定实施方案，TNFR能够以特定方式结合TNFα，例如Kd低于10^-5M。

根据一个特定实施方案，TNFα抑制剂为嵌合多肽。

“嵌合多肽”或“融合蛋白”是包含在与自然界中出现的不同位置的区域的多肽。所述区域通常可出现在单独的蛋白质中并且在嵌合或融合多肽中聚集在一起，或其通常可出现在相同蛋白质中但是在嵌合或融合多肽中呈新的排列放置。嵌合或融合多肽也可由TNFR多肽的聚合形式产生，无论是直链还是支链。

如本文中所用，TNFR的“胞外结构域”指在TNFR的氨基端和TNFR跨膜区域的氨基末端之间发现的TNFR的一部分。TNFR的胞外结构域结合TNFα。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可交换用于指任何长度的氨基酸的聚合物。术语还涵盖已经修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化或与标记组分偶联。

TNFα多肽抑制剂的具体实例包括但不限于英夫利昔单抗(Remicade^TM)和阿达木单抗(Humira^TM)，其分别由嵌合人-小鼠抗TNFα单克隆抗体和全人抗TNF-α单克隆抗体组成。可根据本发明教导使用的抗TNFα抗体的另一实例包括戈利木单抗(Simponi^TM)。

在这个定义下还包括嵌合多肽，在其范围内包括商用依那西普(下文有进一步描述)和来那西普(Lenercept)(由p55sTNF-RI-IgG1组成的嵌合多肽)。下文进一步描述了此类嵌合多肽。

因此，根据一个特定实施方案所述TNFα多肽抑制剂为一种嵌合多肽，其包含：

(i)包含TNF受体的TNFα结合结构域的第一结构域和

(ii)包含免疫球蛋白的Fc结构域的第二结构域，其中所述第一结构域和所述第二结构域N端与C端分别依次翻译性融合并且其中所述嵌合多肽特异性结合TNFα。

因此第一结构域至少由TNF受体(TNFR)的TNF结合结构域组成。第一结构域为可溶性蛋白质。因此根据一个特定实施方案，第一结构域和甚至整个嵌合多肽为非膜锚定的可溶性蛋白质。

TNFR的可溶性形式可包括单体、融合蛋白(也称为“嵌合蛋白)、二聚体、三聚体或高级多聚体。在本发明的某些实施方案中，可溶性TNFR衍生物是体内模拟75kDaTNFR或55kDaTNFR并且与TNFα结合的TNFR。本发明的可溶性TNFR模拟物可源自其TNFRp55或p75片段。除p55和p75外的TNFR可用于得到用于治疗本文所述的各种医疗病症的可溶性TNFR，例如WO99/04001中所述的TNFR。用于构建TNFR模拟物的可溶性TNFR分子包括，例如具有至少20个氨基酸，缺乏天然TNFR的跨膜区并且能够结合TNFα的天然TNFR类似物或片段。TNFR的此类可溶性形式与细胞表面上的受体竞争TNFα，从而抑制TNFα与细胞结合，由此防止其表现其生物学活性。可使用ELISA或任何其它方便的测定法测定可溶性TNFR与TNFα的结合。

根据一个特定实施方案，第一结构域源自TNFR2。(例如，AAA36755)。

根据本发明的一个实施方案，第一结构域为200-250个氨基酸长。

根据一个特定实施方案，第一结构域包含氨基酸序列LCAP(SEQIDNO:11)和VFCT(SEQIDNO:12)。

根据一个特定实施方案，第一结构域包含氨基酸序列LPAQVAFXPYAPEPGSTC(SEQIDNO:13)或LPAQVAFTPYAPEPGSTC(SEQIDNO:17)。

根据一个特定实施方案，第一结构域如SEQIDNO:2中所示(由SEQIDNO:1编码)。

如本文中所用“免疫球蛋白的Fc结构域”指抗体重链的一个区域，通常包含重链的至少2个恒定区(例如，CH2和CH3结构域，因为本领域中定义了这些术语)。可通过用木瓜蛋白酶消化抗体，获得(例如)呈二聚体形式的Fc结构域。通过二硫键连接的Fc结构域多肽的二聚体形成抗体的“尾”区。正如本领域中所知，一些类别的抗体的Fc结构域可呈多聚体形式。因此，Fc结构域任选地为单体，任选地为二聚体和任选地为多聚体。任选地，本文所述的多肽呈二聚体形式，包含Fc二聚体的多肽，或呈多聚体形式，包含Fc多聚体的多肽。

Fc结构域可涵盖天然Fc结构域(即，抗体中自然发生的结构域)的修饰形式，例如与天然Fc结构域具有至少90％同源性，任选地至少95％同源性和任选地至少98％同源性的多肽。例如，在国际专利申请WO97/34631和WO96/32478中描述了经修饰的Fc结构域。

任选地，修饰天然Fc以便去除提供本发明的实施方案不需要的结构特征或生物活性的位点。此类位点的实例包括影响或涉及二硫键形成、与所选宿主细胞的不相容性、在所选宿主细胞中表达后N端不均一性、糖基化、与补体的相互作用、与Fc受体(除新生儿Fc受体外)的结合和/或抗体依赖性细胞毒性的残基。

根据本发明实施方案所述的多肽也可包含Fc结构域的片段。任选地，所述片段包含如上文所定义的Fc结构域的至少20％，任选地至少50％和任选地至少80％。

Fc结构域或其片段任选地包括新生儿Fc受体(FcRn)的结合位点。这在经由肠内途径施用嵌合多肽时具有特殊意义。

根据一个实施方案，Fc结构域或其片段与第一结构域的连接产生在体内具有比第一结构域本身更长的半衰期的多肽。这可能是由于Fc结构域的血清半衰期长(可能是由于经由与FcRn结合解救了Fc)和/或由于和第一结构域本身相比多肽的尺寸更大，降低了通过肾小球过滤从血流中的清除率。根据另一实施方案，所得多肽与第一结构域本身相比免疫原性降低。

根据任选实施方案，Fc结构域或其片段为人Fc结构域(例如，源自人抗体)或其片段。

根据示例性实施方案，Fc结构域(或其片段)为IgG(例如，IgG1)Fc结构域(或其片段)。

根据一个特定实施方案，第二结构域如SEQIDNO:9中所示(由SEQIDNO:8编码)。

因此，嵌合多肽的第二结构域包含免疫球蛋白恒定结构域，例如免疫球蛋白重链恒定结构域或免疫球蛋白轻链恒定结构域的至少一部分。优选地，第二结构域包含免疫球蛋白重链恒定结构域的至少一部分。免疫球蛋白重链恒定结构域优选为包含CH2和CH3结构域和，任选地，铰链区的至少一部分的Fc片段。免疫球蛋白结构域可为IgG、IgM、IgD或IgE免疫球蛋白结构域或由其得到的经修饰免疫球蛋白结构域。优选地，第二结构域包含IgG免疫球蛋白恒定结构域的至少一部分。IgG免疫球蛋白结构域可选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4结构域或选自例如美国专利第5,925,734号中描述的修饰结构域。免疫球蛋白结构域可表现出效应功能。然而，在一些实施方案中，可使用效应功能经修饰，例如至少部分缺失的经修饰免疫球蛋白结构域。因此例如，所述受体。

根据本发明的一个实施方案，第一结构域和第二结构域的嵌合融合形成具有SEQIDNO:10的依那西普(Immunex)。

应了解根据受治受试者选择第一结构域和第二结构域的物种起源。因此，根据一个特定实施方案，第一结构域和第二结构域起源于人类或经修饰以致其在施用给人类受试者时不产生免疫原性反应。

如本文中所用“依那西普”和“Enbrel^TM”可交换用于指市场上可买到的ImmunexCorporation的TNFR2:Fc。依那西普是由人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分与人IgG1的Fc部分连接组成的二聚融合多肽。依那西普的Fc组分含有重链2(CH2)恒定结构域、重链3(CH3)恒定结构域和铰链区，但不含人IgG1的重链1(CH1)恒定结构域。表达TNFR2:Fc的植物细胞也称为PRX-106。

根据另一个实施方案，所述嵌合多肽包含：

(i)包含TNF受体的TNFα结合结构域的第一结构域；

(ii)包含免疫球蛋白的Fc结构域的第二结构域；和

(iii)包含内质网滞留信号的第三结构域；

其中所述第一结构域、第二结构域和第三结构域N端与C端分别依次翻译性融合并且其中所述嵌合多肽特异性结合TNFα。

因此，根据本发明的这个方面，表达嵌合蛋白以致其留在内质网中。根据一个特定实施方案，细胞内至少一部分的TNFR2:Fc分子(例如，至少20％)留在ER中。

如本文中所用，术语“内质网滞留信号肽”指存在于多肽的N或C端时，使多肽从高尔基体(Golgiapparatus)恢复并且留在内质网中的肽序列(参见Rayon等JournalofExperimentalBotany，第49卷，第326号，第1463–1472页，1998；和Neumann等AnnalsofBotany,2003；92:167-180)。在一个实施方案中，内质网滞留信号肽为HDEL(SEQIDNO:14)、KDEL(SEQIDNO:15)或SEKDEL(SEQIDNO:16)。

正如所提到的，第一结构域和第二结构域(和第三结构域，当存在时)N端与C端分别依次翻译性融合，这意味着第一结构域位于第二结构域N端(第一结构域的羧基端与第二结构域的N端翻译性融合)，并且第二结构域位于第三结构域N端(第二结构域的羧基端与第三结构域的N端翻译性融合)。因此，第二结构域实际上被N端的第一结构域和C端的第三结构域夹在中间。示意图如下：第一结构域>第二结构域(>第三结构域)从N端到C端有序定向(参见图1)。结构域之间的连接可直接或间接通过使用接头例如肽接头。

分子还可包含编码内质网信号序列，在第一结构域上游定向(N端)并与之翻译性融合的附加结构域。

如本文中所用“内质网(ER)信号肽”指信号序列、前导序列或前导肽，前导肽是存在于大多数新合成的注定朝向分泌途径的蛋白质N端的短(例如，5-30个氨基酸长)肽。

根据一个特定实施方案，ER信号肽源自(取自、截自)植物蛋白。

根据一个特定实施方案，内质网信号肽来自于皱叶烟草(N.plumbaginifolia)钙网蛋白(Calreticulin)。

根据另一个特定实施方案，来自于皱叶烟草钙网蛋白的信号肽如SEQIDNO:4中所示并且由SEQIDNO:3的核酸序列编码。

如本文中所用术语“在N端翻译性融合”或“在C端翻译性融合”指通常由于重组表达所示肽经由肽键与各结构域的N端或C端氨基酸共价连接。

根据一个特定实施方案，嵌合多肽如SEQIDNO:6中所示。

根据一个特定实施方案，嵌合多肽如SEQIDNO:7、204或205中所示。

正如所提到的，本发明的重组嵌合蛋白在植物细胞内生成。

为了表达多肽，将包含编码如本文所述的嵌合多肽的核酸序列的分离多核苷酸连接到“植物核酸表达构建体”中。

如本文中所用术语“植物核酸表达构建体”指包括本发明的一些实施方案的核酸和指导核酸在植物宿主细胞中转录的至少一个启动子的核酸构建体。下文提供了适合转化方法的更多详情。

根据本发明的一些实施方案，提供了一种核酸表达构建体，其包含本发明的核酸序列和指导核酸序列在植物宿主细胞中转录的启动子。

如本文中所用术语“核酸序列”指经分离并且呈RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，以上的组合)的形式提供的单链或双链核酸序列。

如本文中所用短语“互补多核苷酸序列”指使用逆转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶由信使RNA的逆转录产生的序列。随后可使用DNA依赖性DNA聚合酶在体内或体外扩增此类序列。

如本文中所用短语“基因组多核苷酸序列”指源自(分离自)染色体的序列并且因此其代表染色体的一个连续部分。

如本文中所用短语“复合多核苷酸序列”指至少部分互补并且至少部分为基因组的序列。复合序列可包括编码本发明的多肽所需的一些外显子序列，以及之间插入的一些内含子序列。内含子序列可为任何来源，包括其它基因来源，并且通常将包括保守性剪接信号序列。此类内含子序列还可包括顺式作用表达调控元件。

根据本发明的一些实施方案，编码本发明多肽的核酸序列经优化以在植物中表达。此类序列修饰的实例包括但不限于改变G/C含量以更接近通常在目标植物种中发现的G/C含量，和通常称为密码子优化的去除在植物种中不常存在的密码子。在一个实施方案中，为烟草或本氏烟(Nicotianabenthamiana)优化编码嵌合多肽的核酸序列的密码子使用。

短语“密码子优化”指选择适当DNA核苷酸供在接近目标植物内的密码子使用的结构基因或其片段中使用。因此，优化基因或核酸序列指其中为了在植物中利用统计上优选或统计上有利的密码子已经修饰了天然或自然存在的基因的核苷酸序列的基因。通常在DNA水平上检查核苷酸序列并且使用任何适合程序，例如Sardana等(1996,PlantCellReports15:677-681)所述，测定植物种中为表达优化的编码区。在这种方法中，可通过先找出相对于高表达植物基因，天然基因每个密码子使用的平方比例偏差，接着计算平均平方偏差计算密码子使用的标准偏差，这是密码子使用偏好的量度。所用公式为：1SDCU＝n＝1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn指在高表达植物基因中密码子n的使用频率，其中Yn指在目标基因中密码子n的使用频率并且N指目标基因中密码子的总数。已经使用Murray等(1989,NucAcidsRes.17:477-498)的数据编纂了来自于双子叶植物高表达基因的密码子使用表。

依照优选密码子使用为特定植物细胞类型优化核酸序列的一种方法是基于直接使用，无需进行例如通过日本(HypertextTransferProtocol://WorldWideWeb(dot)kazusa(dot)or(dot)jp/codon/)NIAS(国立农业生物科学研究所(NationalInstituteofAgrobiologicalSciences))DNA库在密码子使用数据库在线提供的密码子优化表的任何额外统计计算。密码子使用数据库含有许多不同种的密码子使用表，每个密码子使用表已经基于基因库中存在的数据在统计上确定。

通过使用此类密码子优化表确定特定种(例如，水稻)中每个氨基酸最优选或最有利的密码子，编码目标蛋白的自然存在核苷酸序列可对于该特定植物种经密码子优化。这通过用对于氨基酸在统计上更有利的相应密码子置换特定种中可能具有低统计发生率的密码子实现。然而，可选择一个或多个不大有利的密码子以除去现有限制性位点，以在可能有用的接点处产生新位点(5'和3'末端以添加信号肽或终止盒，可用于切割片段并剪接在一起以生成正确的全长序列的内部位点)，或消除可对mRNA稳定性或表达产生负面影响的核苷酸序列。

所需编码核苷酸序列可能在任何修饰之前，已经含有许多与特定植物种中在统计上有利的密码子相对应的密码子。因此，天然核苷酸序列的密码子优化可包括确定所需核苷酸序列中哪些密码子对于特定植物在统计上不利，并且依照特定植物的密码子使用表修饰这些密码子以生成密码子优化衍生物。经修饰的核苷酸序列可完全或部分优化供植物密码子使用，条件是经修饰的核苷酸序列编码的蛋白质以高于相应自然发生的或天然基因编码的蛋白质的水平生成。通过改变密码子使用构建合成基因在例如PCT专利申请93/07278中有描述。

因此根据一个特定实施方案，提供了一种如SEQIDNO:5中所示的烟草优化序列。

根据本发明的一些实施方案，编码嵌合多肽的核酸序列与植物细胞中有活性的顺式作用调控元件，例如植物启动子序列可操作地连接。

如果调控序列能够对与之连接的编码序列发挥调控作用(例如对编码序列表达的作用)，则编码核酸序列与调控序列(例如，启动子)“可操作地连接”。

任何适合的启动子序列均可由本发明的核酸构建体使用。优选地启动子为组成型启动子、组织特异性或诱导型启动子。

如本文中所用短语“植物可表达”指启动子序列，包括其中添加或其中所含的任何附加调控元件，至少能够诱导、赋予、活化或增强在植物细胞、组织或器官，优选地单子叶或双子叶植物细胞、组织或器官中的表达。此类启动子可为组成型，即能够指导在多种组织中的高水平基因表达，组织特异性，即能够指导在特定组织中的基因表达，诱导型，即能够指导在刺激下的基因表达，或嵌合型，即由至少两种不同启动子的一部分形成。

表I、II、III和IV中呈现了用于本发明一些实施方案的方法的优选启动子的实例。

表I

用于进行本发明一些实施方案的示例性组成型启动子

表II

用于进行本发明一些实施方案的示例性种子优选型启动子

表III

用于进行本发明的示例性花特异性启动子

表IV

用于进行本发明的替代性水稻启动子

本发明一些实施方案的核酸构建体还可包括适当的选择标记和/或复制起点。根据本发明的一些实施方案，利用的核酸构建体为穿梭载体，其可在大肠杆菌(E.coli)中繁殖(其中所述构建体包含适当的选择标记和复制起点)并且与在细胞中的繁殖相容。根据本发明所述的构建体可为，例如质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。

本发明一些实施方案的核酸构建体可用于稳定地或瞬时转化植物细胞。在稳定转化中，核酸整合到植物基因组中并且像这样其表现稳定的遗传性状。在瞬时转化中，外源多核苷酸由转化细胞表达，但是未整合到基因组中并且像这样其表现瞬时性状。

因此，根据本发明的一些方面，提供了一种包含本发明的核酸构建体的离体细胞。

如本文中所用，术语“分离细胞”指至少部分从自然环境，例如植物中分离的细胞。在一些实施方案中，离体细胞为全植物的植物细胞。在一些实施方案中，离体细胞为植物细胞，例如培养中的植物细胞。

如本文中所用术语“植物”涵盖全株植物、植物的祖先和后代及植物部分，包括种子、枝条、茎干、根(包括块茎)，和植物细胞、组织和器官。植物可呈任何形式，包括悬浮培养物、胚芽、分生组织区、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉和小孢子。在本发明的方法中特别有用的植物包括属于绿色植物(Viridiplantae)总科的所有植物，尤其是单子叶和双子叶植物，包括草料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，选自包括以下的列表：相思树属(Acaciaspp.)、槭树属(Acerspp.)、猕猴桃属(Actinidiaspp.)、七叶树属(Aesculusspp.)、澳大利亚贝壳杉(Agathisaustralis)、苦合欢(Albiziaamara)、三色桫椤(Alsophilatricolor)、须芒草(Andropogonspp.)、落花生属(Arachisspp)、槟榔(Arecacatechu)、香桂(Asteliafragrans)、鹰嘴紫云英(Astragaluscicer)、多小叶红苏木(Baikiaeaplurijuga)、桦木属(Betulaspp.)、芸苔属(Brassicaspp.)、木榄(Bruguieragymnorrhiza)、伯克苏木(Burkeaafricana)、紫铆花(Buteafrondosa)、粉质胚乳白花菜(Cadabafarinosa)、朱缨花属(Calliandraspp)、野茶树(Camelliasinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒属(Capsicumspp.)、决明属(Cassiaspp.)、距豌豆(Centroemapubescens)、木瓜属(Chacoomelesspp.)、肉桂(Cinnamomumcassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、可乐豆木(Colophospermummopane)、变异小冠花(Coronilliavaria)、枸子(Cotoneasterserotina)、山楂属(Crataegusspp.)、黄瓜属(Cucumisspp.)、柏木属(Cupressusspp.)、银蕨(Cyatheadealbata)、榅桲(Cydoniaoblonga)、日本柳杉(Cryptomeriajaponica)、香茅属(Cymbopogonspp.)、银蕨(Cyntheadealbata)、榅桲(Cydoniaoblonga)、货贝黄檀(Dalbergiamonetaria)、大叶骨碎补(Davalliadivaricata)、金钱草属(Desmodiumspp.)、新西兰树蕨(Dicksoniasquarosa)、Dibeteropogonamplectens、迪奥豆属(Diocleaspp)、扁豆属(Dolichosspp.)、Dorycniumrectum、金字塔稗(Echinochloapyramidalis)、Ehraffiaspp.、穇子(Eleusinecoracana)、幽眉草属(Eragrestisspp.)、刺桐属(Erythrinaspp.)、桉属(Eucalypfusspp.)、假乌木(Eucleaschimperi)、绒毛状金茅(Eulaliavi/losa)、荞麦属(Pagopyrumspp.)、费约果(Feijoasellowlana)、草莓属(Fragariaspp.)、千斤拔属(Flemingiaspp)、河岸藤露览树(Freycinetiabanksli)、东亚老鹤草(Geraniumthunbergii)、银杏(GinAgobiloba)、野黄豆(Glycinejavanica)、墨西哥丁香属(Gliricidiaspp)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、银禅属(Grevilleaspp.)、鞘杆古夷布提木(Guibourtiacoleosperma)、岩黄蓍属(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemaffhiaaltissima)、黄茅(Heteropogoncontoffus)、大麦(Hordeumvulgare)、红荀茅(Hyparrheniarufa)、小连翅(Hypericumerectum)、Hypeffheliadissolute、异花木蓝(Indigoincamata)、鸢尾属(Irisspp.)、Leptarrhenapyrolifolia、胡枝子属(Lespedizaspp.)、萬苣属(Lettucaspp.)、银合欢(Leucaenaleucocephala)、单罗得草(Loudetiasimplex)、Lotonusbainesli、百脉根属(Lotusspp.)、硬皮豆(Macrotylomaaxillare)、苹果属(Malusspp.)、木薯(Manihotesculenta)、紫苜蓿(Medicagosaliva)、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、香蕉(Musasapientum)、烟草属(Nicotianumspp.)、驴食豆属(Onobrychisspp.)、鸟足豆属(Ornithopusspp.)、稻属(Oryzaspp.)、非洲双翼豆(Peltophorumafricanum)、狼尾草属(Pennisetumspp.)、酪梨(Perseagratissima)、碧冬煎属(Petuniaspp.)、菜豆属(Phaseolusspp.)、模榔竹(Phoenixcanariensis)、新西兰剑麻(Phormiumcookianum)、石楠属(Photiniaspp.)、白云杉(Piceaglauca)、松属(Pinusspp.)、豌豆(Pisumsativam)、新西兰罗汉松(Podocarpustotara)、Pogonarthriafleckii、Pogonaffhriasquarrosa、杨属(Populusspp.)、瓜叶牧豆(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、星状老虎剌(Pterolobiumstellatum)、西洋梨(Pyruscommunis)、栎属(Quercusspp.)、厚叶石斑木(Rhaphiolepsisumbellata)、美味棒花棕(Rhopalostylissapida)、纳塔尔漆树(Rhusnatalensis)、欧洲醋栗(Ribesgrossularia)、荼薦子属(Ribesspp.)、剌槐(Robiniapseudoacacia)、蔷薇属(Rosaspp.)、悬钩子属(Rubusspp.)、柳属(Salixspp.)、红裂稃草(Schyzachyriumsanguineum)、金松(Sciadopitysvefficillata)、北美红杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendrongiganteum)、两色高梁(Sorghumbicolor)、菠菜属(Spinaciaspp.)、流苏状鼠尾粟(Sporobolusfimbriatus)、Stiburusalopecuroides、矮柱花草(Stylosanthoshumilis)、葫芦茶属(Tadehagispp)、落羽杉(Taxodiumdistichum)、阿拉伯黄背草(Themedatriandra)、三叶草属(Trifoliumspp.)、小麦属(Triticumspp.)、异叶铁杉(Tsugaheterophylla)、越桔属(Vacciniumspp.)、蚕豆属(Viciaspp.)、葡萄(Vitisvinifera)、锥穗沃森花(Watsoniapyramidata)、马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zeamays)、苋菜(amaranth)、洋蓟、芦笋、球花甘蓝、抱子甘蓝(Brusselssprouts)、卷心菜、油菜(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、绿叶羽衣甘蓝(collardgreens)、亚麻、散叶甘蓝、小扁豆、油籽油菜(oilseedrape)、秋葵、洋葱、马铃薯、水稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、西红柿、南瓜茶(squashtea)、玉米、小麦、大麦、黑麦、燕麦、花生、豌豆、小扁豆和紫花苜蓿、棉花、油菜籽、油菜、胡椒、向日葵、马铃薯、茄子、桉树、树、观赏性植物、多年生牧草和饲料作物。可选地藻类和其它非绿色植物可用于本发明的方法。

根据本发明的一些实施方案，植物或植物细胞为浮萍植物、细胞或根瘤。可通过许多方法中的任一种，包括土壤杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移、基因枪轰击或电穿孔用含有目标核苷酸序列的表达盒有效地转化浮萍(单子叶植物浮萍科(Lemnaceae)或青萍属(Lemna)的成员)植物或浮萍根瘤培养物。浮萍细胞的分子工程方法和用于多肽商用生产的浮萍表达系统的详细描述在本领域中已知(参见，例如，Stomp等的美国专利第6,040,498和6,815,184号，和Dickey等的第8,022,270号，全部专利通过引用完全并入本文)。

根据本发明的一些实施方案，本发明方法使用的植物或植物细胞为农作物或农作物细胞，例如水稻、玉米、小麦、大麦、花生、马铃薯、芝麻、橄榄树、棕榈油、香蕉、大豆、向日葵、油菜、甘蔗、紫花苜蓿、粟、豆科植物(菜豆、豌豆)、亚麻、羽扇豆、油菜籽、烟草、白杨和棉花。

根据另外的实施方案，植物细胞包括烟草细胞、发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)转化根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。在一个实施方案中烟草细胞来自于烟草细胞系，例如但不限于红花烟草亮黄色(BY-2)细胞。可根据任何类型的适合培养方法培育植物细胞，包括但不限于在固体表面(例如塑料培养皿或板)上或悬浮液中培养。将注意到一些细胞，例如BY-2和胡萝卜细胞可在悬浮液中培养和生长。在悬浮液中培养植物细胞的适合装置和方法在本领域中已知，例如，如国际专利申请PCTIL2008/000614中所述。再一个实施方案中，细胞为全烟草植物或植物组织的细胞，包括但不限于本氏烟。根据再一个实施方案，植物细胞为胡萝卜细胞。

存在将外来基因引入单子叶和双子叶植物中的各种方法(Potrykus,I.，Annu.Rev.Plant.Physiol.，Plant.Mol.Biol.(1991)42:205-225；Shimamoto等，Nature(1989)338:274-276)。

使外源DNA稳定整合到植物基因组DNA中的原理方法包括两种主要方法：

(i)土壤杆菌介导的基因转移：Klee等(1987)Annu.Rev.PlantPhysiol.38:467-486；Klee和Rogers在CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants中，第6卷，MolecularBiologyofPlantNuclearGenes，Schell,J.和Vasil,L.K.编，AcademicPublishers,SanDiego,Calif.(1989)第2-25页；Gatenby，在PlantBiotechnology中，Kung,S.和Arntzen,C.J.编，ButterworthPublishers,Boston,Mass.(1989)第93-112页。

(ii)直接摄入DNA：Paszkowski等，在CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants中，第6卷，MolecularBiologyofPlantNuclearGenesSchell,J.和Vasil,L.K.编，AcademicPublishers,SanDiego,Calif.(1989)第52-68页；包括向原生质体中直接摄入DNA的方法，Toriyama,K.等(1988)Bio/Technology6:1072-1074。通过植物细胞短暂的电击诱导DNA摄入：Zhang等PlantCellRep.(1988)7:379-384。Fromm等Nature(1986)319:791-793。通过粒子轰击将DNA注入植物细胞或组织中，Klein等Bio/Technology(1988)6:559-563；McCabe等Bio/Technology(1988)6:923-926；Sanford，Physiol.Plant.(1990)79:206-209；通过使用微量移液管系统：Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.(1987)75:30-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79:213-217；玻璃纤维或碳化硅晶须转化细胞培养物、胚芽或愈伤组织，美国专利第5,464,765号或通过用萌发花粉直接孵化DNA，DeWet等在ExperimentalManipulationofOvuleTissue中，Chapman,G.P.和Mantell,S.H.和Daniels,W.Longman编辑，London,(1985)第197-209页；和Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715-719。

土壤杆菌系统包括使用整合到植物基因组DNA中的规定DNA片段的质粒载体。植物组织的接种方法根据植物种和土壤杆菌递送系统改变。广泛使用的方法是可用为开始全植物分化提供了良好来源的任何组织外植体进行的叶盘法(leafdiscprocedure)。参见，例如，Horsch等在PlantMolecularBiologyManualA5中，KluwerAcademicPublishers，Dordrecht(1988)第1-9页。补充方法采用与真空渗入相结合的土壤杆菌递送系统。土壤杆菌系统在转基因双子叶植物的创造中尤其可行。

存在向植物细胞中直接转移DNA的各种方法。在电穿孔中，将原生质体短暂地暴露于强电场。在显微注射中，使用极小的微量移液管将DNA直接机械注入细胞中。在微粒攻击中，将DNA吸附在微弹例如硫酸镁晶体或钨粒上，微弹物理加速进入细胞或植物组织。

在稳定转化后进行植物繁殖。最常见的植物繁殖方法是通过种子。然而，通过种子繁殖再生的不足之处在于，因为种子由植物根据受孟德尔定律(Mendelianrule)控制的遗传差异产生，所以由于杂合性在作物中缺乏均一性。基本上，每颗种子在基因上都不同并且每一颗将以其自身的特定性状生长。因此，优选生产转化植物，以致再生植物具有亲本转基因植物的相同性状和特征。因此，优选通过提供转化植物的快速、一致生殖的微繁殖再生转化植物。

微繁殖是由已经从所选亲本植物或栽培品种切除的一片组织生长出新一代植物的工艺。这个过程允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物大量生殖。产生的新一代植物在基因上与原植物相同，并且具有原植物的所有特征。微繁殖允许在短时间内大量生产优质植物材料并且在原转基因或转化植物特征的保持中提供了所选栽培品种的快速增殖。克隆植物的优点是植物增殖的速度及所产植物的质量和均一性。

微繁殖是需要在阶段期间改变培养基或生长条件的多阶段工序。因此，微繁殖工艺涉及4个基本阶段：第1阶段，初始组织培养；第2阶段，组织培养增殖；第3阶段，分化和植株形成；和第4阶段，温室培养和硬化。在第1阶段，初始组织培养期间，建立组织培养并保证无污染物。在第2阶段期间，初始组织培养物增殖直至生成足够量的组织样品以满足生产目标。在第3阶段期间，将第2阶段中生长的组织样品分开并生长成单独的幼苗。在第4阶段，将转化幼苗转移到温室中硬化，在温室中植物对光的耐受性逐渐增强，以致其可以在自然环境中生长。

根据本发明的一些实施方案，通过叶细胞、分生组织细胞或全植物的瞬时转化生成转基因植物。

瞬时转化可通过以上所述任何直接DNA转移法或使用经修饰的植物病毒通过病毒感染实现。

已经证实对植物宿主转化有用的病毒包括CaMV、烟草花叶病毒(TMV)、雀麦草花叶病毒(BMV)和菜豆普通花叶病毒(BV或BCMV)。在美国专利第4,855,237号(菜豆金黄花叶病毒；BGV)、EP-A67,553(TMV)、日本公布申请第63-14693号(TMV)、EPA194,809(BV)、EPA278,667(BV)和Gluzman等，CommunicationsinMolecularBiology:ViralVectors，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork，第172-189页(1988)中描述了使用植物病毒转化植物。在WO87/06261中描述了用于在许多宿主，包括植物中表达外来DNA的假病毒颗粒。

根据本发明的一些实施方案，用于瞬时转化的病毒无毒力并且因此不能造成严重症状例如生长速率降低、嵌合体、环斑、卷叶、变黄、斑纹、痘形成、肿瘤形成和蚀损斑。适合的无毒病毒可为自然存在的无毒病毒或人为减毒病毒。病毒减毒可通过使用本领域中公知的方法实现，包括但不限于亚致死性加热、化学处理或通过定点诱变技术，如由Kurihara和Watanabe(MolecularPlantPathology4:259-269，003)，Gal-on等(1992)，Atreya等(1992)和Huet等(1994)所述。

适合的病毒菌株可从可用来源，例如美国模式培养物保藏所(ATCC)获得或通过从感染植物分离获得。从感染植物组织分离病毒科通过本领域中公知的技术实现，例如Foster和Tatlor编“PlantVirologyProtocols:FromVirusIsolationtoTransgenicResistance(MethodsinMolecularBiology(HumanaPr)，第81卷)”,HumanaPress,1998所述。简言之，将认为含有高浓度的适合病毒的感染植物的组织，优选幼叶和花瓣于缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)中研磨以生成可用于后续接种的病毒感染汁液。

用于在植物中引入和表达非病毒核酸序列的植物RNA病毒的构建由以上参考文献以及Dawson,W.O.等，Virology(1989)172:285-292；Takamatsu等EMBOJ.(1987)6:307-311；French等Science(1986)231:1294-1297；Takamatsu等FEBSLetters(1990)269:73-76；和美国专利第5,316,931号论证。

当病毒为DNA病毒时，可对病毒本身进行适当修饰。可选地，可先将病毒克隆到细菌质粒中以易于构建具有外来DNA的所需病毒载体。然后将病毒从质粒上切除。如果病毒为DNA病毒，则细菌复制起点可与病毒DNA连接，然后由细菌复制。这种DNA的转录和翻译将生成外壳蛋白，外壳蛋白将壳体化DNA病毒。如果病毒为RNA病毒，则病毒通常作为cDNA克隆并插入质粒中。然后用质粒进行所有构建。然后通过转录质粒的病毒序列并翻译病毒基因以生成壳体化病毒RNA的外壳蛋白生成RNA病毒。

在一个实施方案中，提供了一种植物病毒多核苷酸，其中天然外壳蛋白编码序列已经从病毒多核苷酸缺失，已经插入了非天然植物病毒外壳蛋白编码序列和非天然启动子，优选能够在植物宿主中表达，包装重组植物病毒多核苷酸，并确保宿主受重组植物病毒多核苷酸系统性感染的非天然外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子。可选地，可通过在其中插入非天然多核苷酸序列灭活外壳蛋白基因，以致生成蛋白质。重组植物病毒多核苷酸可含有一种或多种附加非天然亚基因组启动子。每个非天然亚基因组启动子均能够在植物宿主中转录或表达相邻基因或多核苷酸序列并且不能相互地和与天然亚基因组启动子重组。非天然(外来)多核苷酸序列可插入天然植物病毒亚基因组启动子附近或者如果包括一个以上多核苷酸序列，则插入天然和非天然植物病毒亚基因组启动子附近。非天然多核苷酸序列在宿主植物中在亚基因组启动子的控制下转录或表达以生成所需产物。

在第二实施方案中，提供了一种重组植物病毒多核苷酸，除天然外壳蛋白编码序列置于非天然外壳蛋白亚基因组启动子之一而不是非天然外壳蛋白编码序列的附近外，与第一实施方案一样。

在第三实施方案中，提供了一种重组植物病毒多核苷酸，其中天然外壳蛋白基因在其亚基因组启动子的附近并且已经向病毒多核苷酸中插入了一个或多个非天然亚基因组启动子。插入的非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达相邻基因并且不能相互地和与天然亚基因组启动子重组。非天然多核苷酸序列可插入非天然亚基因组植物病毒启动子附近，以便在宿主植物中在亚基因组启动子的控制下转录或表达所述序列以生成所需产物。

在第四实施方案中，提供了一种重组植物病毒多核苷酸，除天然外壳蛋白编码序列由非天然外壳蛋白编码序列代替外，与第三实施方案一样。

病毒载体被重组植物病毒多核苷酸编码的外壳蛋白壳体化生成重组植物病毒。重组植物病毒多核苷酸或重组植物病毒用于感染适当的宿主植物。重组植物病毒多核苷酸能够在宿主中复制，在宿主中系统性传播，并且在宿主中转录或表达外来基因(外源多核苷酸)以生成所需产物。

向植物接种病毒的技术可在Foster和Taylor编“PlantVirologyProtocols:FromVirusIsolationtoTransgenicResistance(MethodsinMolecularBiology(HumanaPr)，第81卷)”，HumanaPress，1998；Maramorosh和Koprowski编“MethodsinVirology”7卷，AcademicPress，NewYork1967-1984；Hill,S.A.“MethodsinPlantVirology”，Blackwell,Oxford,1984；Walkey,D.G.A.“AppliedPlantVirology”，Wiley,NewYork,1985；及Kado和Agrawa编“PrinciplesandTechniquesinPlantVirology”,VanNostrand-Reinhold,NewYork中找到。

除以上外，本发明的多核苷酸也可引入叶绿体基因组中，从而激活叶绿体表达。

将外源核酸序列引入叶绿体基因组的技术已知。这种技术涉及以下工序。首先，化学处理植物细胞以便将每个细胞的叶绿体数量减少为约1个。然后，经由粒子轰击将外源多核苷酸引入细胞中，其目的是将至少一个外源多核苷酸分子引入叶绿体中。选择外源多核苷酸，以致其可经由易于用叶绿体固有的酶实现的同源重组整合到叶绿体基因组中。为此，除目标基因外，核酸序列包括源自叶绿体基因组的至少一个多核苷酸段。另外，外源多核苷酸包括选择标记，其通过顺序选择过程用于确定全部或大体上全部的叶绿体基因组拷贝在此类选择后将包括外源多核苷酸。在美国专利第4,945,050和5,693,507中找到关于这种技术的更多详情，所述专利通过引用并入本文。因此多肽可由叶绿体的蛋白质表达系统生成并且变得整合到叶绿体的内膜中。

根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括使表达核酸的植物细胞生长。植物细胞可为所需任何植物细胞。植物细胞可为培养细胞，培养组织或培养器官中的细胞，或植物中的细胞。在一些实施方案中，植物细胞为培养细胞，或培养组织或培养器官中的细胞。在另外的实施方案中，植物细胞为用于基因转移的任何类型的植物。植物细胞可作为全植物的一部分生长，或可选地，在植物细胞培养中生长。

根据本发明的一些方面，植物细胞在植物细胞悬浮培养中生长。如本文中所用，术语“悬浮培养”指与生物体分离的细胞的生长。可经由使用液体培养基(“悬浮培养基”)促进悬浮培养。悬浮培养可指细胞在液体营养培养基中的生长。适合使本发明的植物细胞在植物细胞悬浮培养中生长的方法和装置在例如PCTWO2008/135991、美国专利第6,391,683号、美国专利申请第10/784,295号、国际专利公布PCT第WO2004/091475、WO2005/080544和WO2006/040761号中有详细描述，其全部特此通过引用并入，如同本文完全提出一样。

因此，本发明涵盖表达核酸序列的植物或植物培养物，以便生成本发明的TNFα多肽抑制剂。一旦在植物细胞或整株植物内表达，由核酸序列编码的TNFα抑制剂的水平就可以通过本领域公知的方法测定，例如活性测定、使用能够特异性结合TNFα抑制剂例如嵌合多肽的抗体(抗TNFR2和抗Fc，参见以下的实施例部分)的蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光等。

测定植物中由核酸序列转录的RNA水平的方法在本领域中公知，包括例如，RNA印迹分析、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析(包括定量、半定量或实时RT-PCR)和RNA-原位杂交。

根据本发明的一些实施方案，表达的本发明的重组嵌合多肽在植物细胞中糖基化，产生具有一个或两个或三个或更多个具有植物特有的聚糖残基的聚糖结构的嵌合多肽。因此，根据本发明的一些实施方案，表达本发明的表达载体的细胞生成具有不同量的呈一条、两条、三条或更多条天线排列的聚糖结构的嵌合多肽。所有结构可含有两个GlcNAc和一个甘露糖的核结构，并且除核α-(1,3)岩藻糖、β(1,2)木糖和/或GlcNAc残基外，还含有不同量的甘露糖变化。结构可为除核结构外具有至少一个，任选地至少两个，任选地三个或任选地至少四个或更多个甘露糖残基的高甘露糖类型，或每个聚糖上具有甘露糖和其它聚糖类型的复合类型，或具有高甘露糖和复合天线的混合类型。

在其它实施方案中，表达本发明的表达载体的细胞生成具有至少一个，任选地至少两个，任选地至少三个或任选地至少四个或更多个核木糖残基的TNFα抑制剂。还有其它实施方案中，表达本发明的表达载体的细胞生成具有至少一个，任选地至少两个，任选地至少三个或任选地至少四个或更多个核α-(1,3)岩藻糖残基的TNFα抑制剂。在一个实施方案中表达本发明的表达载体的细胞生成具有至少一个暴露的甘露糖残基、至少一个核木糖残基和至少一个α-(1,3)岩藻糖残基的TNFα抑制剂。还有另外的实施方案中，表达本发明的表达载体的细胞生成在外部甘露糖上具有至少一个、至少两个、至少3个或更多个末端N-乙酰葡糖胺取代的TNFα抑制剂。

根据一个特定实施方案所述TNFα抑制剂例如嵌合多肽缺乏唾液酸残基。进一步根据一个特定实施方案，所述TNFα抑制剂例如嵌合多肽包含至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多的复合聚糖。根据一个特定实施方案，所述嵌合多肽包含40-70％复合聚糖。

表达本发明的TNFα多肽抑制剂的植物细胞用于治疗TNFα相关医疗状况。

在实施例部分的实施例2中已经证实表达TNFα多肽抑制剂(例如，嵌合多肽)的植物细胞，在提供给受试者供肠内施用时，可用作有效的全身性递送系统(参见WO2007/010533)。因此，在一些实施方案中，TNFα多肽抑制剂可配制于供口服或肠内递送的包含表达所述嵌合多肽的转化植物细胞和药学上可接受的载体的药物组合物中。虽然本文也考虑到了使用新鲜(非冻干细胞)、植物组织、植物部分或整株植物，但在一些实施方案中，药物组合物的转化植物细胞为冻干植物细胞。

在冻干之前洗涤细胞以去除可存在于生长培养基中的任何细胞碎片。

在准备细胞进行冻干时，有时在维持培养基中培育细胞以降低细胞的代谢过程是可取的。

可在室温下或在通常培养植物细胞的温度下进行预处理(虽然不必要)。在易于处理的室温附近(20℃)并且当大多数植物细胞在室温下相当稳定时进行预处理。可向培养基中直接添加稳定剂并且在预处理过程中在必要时补充。

预处理还可涉及在一种或多种渗透剂的存在下培育细胞。有用渗透剂的实例包括糖类例如糖和糖衍生物，氨基酸或亚氨基酸例如脯氨酸和脯氨酸衍生物，或这些试剂的组合。一些更有用的糖类和糖类衍生物为果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖。按准备细胞进行后续冻干的浓度利用渗透剂。

冻干旨在通过真空蒸发减少细胞的含水量。真空蒸发涉及将细胞置于气压降低的环境中。根据所需除水率，在介于约-30℃至-50℃之间的温度下工作的环境低压可为100托、1托、0.01托或更低。根据一个特定实施方案，通过冷冻至-40℃，然后施加真空至0.1毫巴的压力过夜冻干细胞。然后将细胞加热至-10℃，这样将全部含冰量将升华并蒸发。在低压条件下，水蒸发速率增加，以致可以去除细胞中高达60-95％的水。

根据一个特定实施方案，冻干从细胞中去除了60％、70％、80％以上或特别地90％、91％、92％、93％、94％、95％或98％以上的水。根据一个特定实施方案，最终含水量为约5-10％、5-8％或6-7％。

如本文中所用短语“肠内施用”指通过胃肠道的任何部分施用，例如直肠施用、结肠施用、肠道施用(近侧或远侧)和胃部施用。在一些实施方案中，肠内施用指口服施用。应了解本发明教导也旨在粘膜施用。

所述细胞可配制成固体，配制成液体或配制成粉末。在一些实施方案中，所述细胞为再悬浮、冻干细胞。

因此，口服剂型可在酒吧里作为口服营养形式(例如，只要蛋白质不暴露于包括37℃以上加热和压缩的变性条件)、作为全部膳食、作为可溶粉末(例如保健饮料)、作为溶液、作为现成饮料，任选低卡路里例如软饮料，包括果汁、奶昔、酸奶饮料、果昔(smoothie)或大豆饮料提供，或分散在任何种类的食物，例如焙烤产品、压块干粮、奶制品条、零食、早餐谷物食品、牛奶什锦早餐、糖果、药片、曲奇、饼干、梳打饼干(例如米饼)、巧克力和奶制品中。

所述细胞本身可施用给受试者，或可选地，本发明的细胞可于其与适合载体或赋形剂混合的药物组合物中施用给受试者。

如本文中所用“药物组合物”指表达TNFα抑制剂的细胞与其它化学组分例如生理上适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是利于化合物向生物体的施用。

如本文中所用，术语“活性成分”指表达负责预期生物学效应的TNFα抑制剂的细胞。

下文，可交换使用的短语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”指不会给生物体带来显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。在这些短语下包括佐剂。优选地所用载体为非免疫原性载体并且进一步优选地不刺激肠相关淋巴组织。

本文中术语“赋形剂”指添加到药物组合物中以进一步利于活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和淀粉类、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

药物的配制和施用技术可在最新版“Remington’sPharmaceuticalSciences,”MackPublishingCo.,Easton,PA中找到，其通过引用完全并入本文。

因此可按常规方式使用包含利于将活性成分加工成在药学上可使用的制剂的赋形剂和助剂的一种或多种生理上可接受的载体配制供依照本发明使用的药物组合物。

对于口服施用，通过合并活性化合物与本领域中公知的药学上可接受的载体易于配制药物组合物。此类载体使得能够将药物组合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等供患者口服摄入。供口服使用的药物制剂可使用固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，根据需要在添加适合助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核制成。适合的赋形剂为，尤其是填料例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羟甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。若需要，可添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。

提供具有合适包衣的糖衣丸核。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carbopolgel)、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可在片剂或糖衣丸包衣中加入染料或色素以用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可口服使用的药物组合物包括由明胶制备的推入适配胶囊(push-fitcapsule)以及由明胶和增塑剂例如甘油和山梨糖醇制备的软密封胶囊。推入适配胶囊可含有与填料(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)及任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可将活性成分溶解或悬浮在适合液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液态聚乙二醇。另外，可添加稳定剂。

所述剂型可包括添加剂例如钙、镁、铁、锌、磷、维生素D和维生素K中的一种或多种。适合的日量为0.1mg至3.6g钙，优选320至530mg。一般而言，本发明营养制剂或药剂中维生素和矿物质的日剂量按卫生当局推荐剂量的重量计为25-100％。膳食纤维也可为本发明组合物的组分。补充物另外的组分可包括已知尤其对提高身体活动能力具有健康效益的任何生物活性化合物或提取物。

通常单位剂型还可包含抗氧化剂(上文提供了示例性实施方案)。在另一个实施方案中，抗氧化剂为药学上可接受的抗氧化剂。在另一个实施方案中，抗氧化剂选自维生素E、超氧化物歧化酶(SOD)、欧米伽-3和β-胡罗卜素。

在另一个实施方案中，单位剂型还包含生物活性蛋白或肽的增强剂。在另一个实施方案中，单位剂型还还包含生物活性蛋白或肽的辅因子。

在另一个实施方案中，本发明的单位剂型还包含药物级表面活性剂。表面活性剂在本领域中公知，并且尤其在药用辅料手册(HandbookofPharmaceuticalExcipients)(RaymondCRowe、PaulJSheskey和SianCOwen编，PharmaceuticalPress版权，2005)中有描述。在另一个实施方案中，表面活性剂为本领域已知的任何其它表面活性剂。

在另一个实施方案中，本发明的单位剂型还包含药物级乳化剂或乳化物质(软化剂)。乳化剂和乳化物质在本领域中公知，并且尤其在药用辅料手册(同上)中有描述。乳化剂和乳化物质的非限制性实例为乳露(eumulgin)，乳露B1PH、乳露B2PH、氢化蓖麻油十八醇十六醇混合物和鲸蜡醇。在另一个实施方案中，乳化剂或乳化物质为本领域已知的任何其它乳化剂或乳化物质。

在另一个实施方案中，本发明的单位剂型还包含药物级稳定剂。稳定剂在本领域中公知，并且尤其在药用辅料手册(同上)中有描述。在另一个实施方案中，稳定剂为本领域已知的任何其它稳定剂。

在另一个实施方案中，本发明的单位剂型还包含选自精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的氨基酸。在另一个实施方案中，精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的类似和变形形式分别包括在术语“精氨酸”、“赖氨酸”、“天冬氨酸”、“谷氨酸”和“组氨酸”中。在另一个实施方案中，氨基酸提供对核糖核酸酶或其它活性分子的附加保护。在另一个实施方案中，氨基酸促进生物活性蛋白或肽与靶细胞的相互作用。在另一个实施方案中，在单位剂型的油组分中含有氨基酸。

在另一个实施方案中，本发明的单位剂型还包含其中混入了基质载体单位剂型的一种或多种药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，赋形剂包括一种或多种附加多糖。在另一个实施方案中，赋形剂包括一种或多种蜡。在另一个实施方案中，赋形剂为所述单位剂型提供所需味道。在另一个实施方案中，赋形剂影响药物一致性和最终剂型例如凝胶胶囊或硬明胶胶囊。

赋形剂的非限制性实例包括：消泡剂(二甲聚硅氧烷、二甲基硅油)；抗菌防腐剂(苯扎氯铵、苄索氯铵、对羟基苯甲酸丁酯、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、氯甲酚、甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、苯酚、苯基乙醇、醋酸苯汞、硝酸苯汞、苯甲酸钾、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钠、苯甲酸钠、去水醋酸钠、丙酸钠、山梨酸、硫柳汞、百里酚)；螯合剂(依地酸二钠、乙二胺四乙酸和盐、依他酸)；包衣剂(羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、乙基纤维素、明胶、药用釉料、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸共聚物、甲基纤维素、聚乙二醇、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫胶、蔗糖、二氧化钛、巴西棕榈蜡、微晶蜡、玉米醇溶蛋白)；着色剂(焦糖、红色氧化铁、黄色氧化铁、黑色氧化铁或掺混物、)；络合剂(乙二胺四乙酸和盐(EDTA)、依他酸、龙胆酸乙醇胺、硫酸羟喹啉)；干燥剂(氯化钙、硫酸钙、二氧化硅)；乳化剂和/或增溶剂(阿拉伯树胶、胆固醇、二乙醇胺(佐剂)、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、甘油一酯、甘油二酯、单乙醇胺(佐剂)、油酸(佐剂)、油醇(稳定剂)、泊洛沙姆(poloxamer)、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚乙二醇35蓖麻油、聚乙二醇40氢化蓖麻油、聚乙二醇10油醚、聚乙二醇20十六烷基十八烷基醚、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇二乙酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单油酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇胺、乳化蜡)；调味剂和香料(茴香脑、安息香醛、乙基香兰素、薄荷醇、水杨酸甲酯、谷氨酸一钠、橙花油、薄荷、薄荷油、薄荷醑、玫瑰油、浓玫瑰水、百里酚、妥卢香脂酊、香草、香草兰酊、香兰素)；湿润剂(甘油、己二醇、丙二醇、山梨糖醇)；聚合物(例如，醋酸纤维素、烷基纤维素、羟烷基纤维素、丙烯酸类聚合物和共聚物)；悬浮剂和/或增黏剂(阿拉伯树胶、琼脂、海藻酸、单硬脂酸铝、膨润土、精制膨润土、膨润土浆、卡波姆934p、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠12、角叉菜胶、微晶和羧甲基纤维素钠纤维素、糊精、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、果胶、聚环氧己烷、聚乙烯醇、聚烯吡酮、藻酸丙二醇酯、二氧化硅、胶态二氧化硅、藻酸钠、黄蓍胶、黄原胶)；甜味剂(天冬甜素、葡萄糖结合剂、右旋糖、赋形剂右旋糖、果糖、甘露糖醇、糖精、糖精钙、糖精钠、山梨糖醇、山梨糖醇溶液、蔗糖、可压缩糖、糖果剂的糖、糖浆)。该列表并非意为排它性，而仅仅是可用于本发明的口服剂量单位剂型中的赋形剂分类及特定赋形剂的代表。

在本发明的组合物中可包括常规添加剂，包括选自防腐剂、螯合剂、泡腾剂、天然或人工甜味剂、调味剂、着色剂、掩味剂、酸化剂、乳化剂、增稠剂、悬浮剂、分散剂或润湿剂、抗氧化剂等的任一种。可向本发明的组合物中添加调味剂以帮助顺应给药方案。典型调味剂包括但不限于菠萝、橘子、柠檬、薄荷、浆果、巧克力、香草和甜瓜的天然或合成香精、油和/或提取物。

当然，待施用的组合物的量将取决于受治疗的受试者、患病的严重程度、施用方式、处方医生的判断等。

在另一个实施方案中，每个成人剂量范围的嵌合多肽有效量为约0.0002mg/kg至2mg/kg、约0.002-2mg/kg、约0.02-2mg/kg、约0.2-2mg/kg、约0.002-0.2mg/kg、约0.0002-1mg/kg、约0.002-0.1mg/kg、约0.002-0.02mg/kg、约0.002-0.01mg/kg、约0.002-0.008mg/kg、约0.02-0.1mg/kg、约0.001-0.05mg/kg、约0.001-0.01mg/kg、约0.01-1mg/kg、约0.01-15mg/kg、约0.005-1mg/kg、约0.01-5mg/kg、约0.005-0.01mg/kg或约0.05-0.1mg/kg。根据一个特定实施方案，每个成人剂量范围的嵌合多肽有效量为约0.002-0.2mg/kg。

根据一个特定实施方案，施用0.01-100mg、0.1-100mg、0.1-50mg、0.1-20mg、0.1-10mg、0.1-5mg的平剂量。

根据一个特定实施方案，平剂量为约0.1-10mg。

根据一个特定实施方案，口服剂量每天施用。所述剂量在当天分成多次施用(即每天2-4次)。所述剂量也可每两天、每周两次、每周三次、两周一次、按周剂量，或分几周施用(例如实施例2至8)。

如本文中所用术语“约”指±10％。

术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”及其变化形式意为“包括但不限于”。

术语“由…组成”意为“包括且限于”。

术语“基本上由…组成”意为组合物、方法或结构可包括附加成份、步骤和/或部分，但是只有在附加成份、步骤和/或部分不实质性改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新特征的情况下。

如本文中所用，除非上下文另外明确指出，则单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括其复数指示物。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物(包括其混合物)。

在整篇申请中，本发明的各种实施方案可呈范围形式呈现。应理解，呈范围形式的描述仅是为了方便和简洁而不应解释为对本发明范围的固定限制。因此，范围的描述应视为已经具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，范围如1至6的描述应视为已经具体公开了子范围例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5、和6。不论范围宽度这都适用。

当在本文中指定数值范围时，这意味着包括指定范围内的任何引用数值(小数或整数)。短语“范围介于”第一指定数值和第二指定数值之间及“范围为”第一指定数值“至”第二指定数值在本文中可交换使用并且意为包括第一和第二指定数值以及之间的所有小数和整数数值。

如本文中所用术语“方法”指用于完成给定任务的方式、方法、技术和程序，包括但不限于，化学、药物、生物、生物化学和医学领域的从业者已知的或者容易从已知的方式、方法、技术和程序开发的方式、方法、技术和程序。

如本文中所用，术语“治疗”指消除、大体上抑制、减缓、或逆转病状的进展，大体上改善病状的临床或美学症状或大体上预防病状的临床或美学症状的出现。

应当理解，为了清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以以单个实施方案呈组合提供。相反，为了简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独或以任何适合的子组合提供或如其所应在描述的本发明的任何其它实施方案中提供。认为在各个实施方案的上下文中描述的某些特征并非那些实施方案的必要特征，除非在没有那些要素的情况下，该实施方案无效。

如上文所述以及如下面的权利要求部分所要求的本发明的各个实施方案和方面可以从以下实施例中得到实验性支持。

实施例

现参考以下实施例，与以上描述一起以非限制性方式说明了本发明的一些实施方案。

通常，本文中所用的命名法和在本发明中利用的实验程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术已在文献中充分解释。参见，例如，"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等，(1989)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology"第I-III卷Ausubel,R.M.编(1994)；Ausubel等，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988)；Watson等，"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork；Birren等(编)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries"，第1-4卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998)；美国专利第4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中提出的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"，第I-III卷，Cellis,J.E.编(1994)；"CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique"byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第3版；"CurrentProtocolsinImmunology"第I-III卷ColiganJ.E.编(1994)；Stites等(编)，"BasicandClinicalImmunology"(第38版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980)；专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定法，参见，例如，美国专利第3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521号；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.编(1984)；“NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.和HigginsS.J.编(1985)；"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.和HigginsS.J.编(1984)；"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.编(1986)；"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986)；"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)和"MethodsinEnzymology"Vol.1-317,AcademicPress；"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990)；Marshak等，"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996)；其全部内容通过引用并入，如同在本文完全阐述一样。在本文件中提供了其它一般参考文献。认为其中的程序在本领域中公知并且是为了方便读者而提供。其中所含的全部信息通过引用并入本文。

实施例1

材料和实验程序

表达构建体和表达

优化表达prhTNFR2:Fc的cDNA并用GENEARTAG(Regensburg,Germany)合成。密码子使用适于烟草基因的密码子偏好。由FcIgG1重链恒定区[智人]登记号AEV43323克隆IgG1部分。

在优化过程中避免以下顺式作用序列基序：内部TATA盒、χ-位点和核糖体进入位点、富AT或富GC序列段、RNA不稳定性元件(“杀伤基序”)、重复序列和RNA二级结构、剪接供体(隐含)和受体位点、分支点。另外，避免极高(>80％)或极低(<30％)GC含量的区域。所得DNA序列如SEQIDNO:1中所示。编码的多肽如SEQIDNO:2中所示。向天然cDNA序列，将来自于皱叶烟草钙网蛋白的信号肽(例如内质网靶信号肽)添加到所述基因的N’端，允许PrhTNFR2:Fc有效靶向分泌途径，然后一旦蛋白质易位到内质网内就由信号肽酶从多肽上裂解掉(SEQIDNO:3、SEQIDNO:4，分别表示ER信号肽的DNA和肽序列)。另外，向所述基因的C’端添加ER滞留信号SEKDEL。该信号允许蛋白质从高尔基体恢复到ER，并且定位于ER中。整个编码序列(信号肽-prhTNFR2:Fc-SEKDEL)由SEQIDNO:5编码并且编码的多肽如SEQIDNO:6中所示。N端信号肽裂解后所得蛋白质如SEQIDNO:7、204或205(prhTNFR2:Fc-SEKDEL)中所示。

在烟草BY2细胞中的稳定表达

土壤杆菌介导的转化广泛地用于将外来基因引入植物细胞基因组中。使用这种方法，将由外来基因及其调控元件组成的T-DNA分子随机引入植物基因组中。因为整合位点以及基因插入的拷贝数不可控制，所以转化过程产生由具有不同转基因表达水平的细胞构成的高度异源性转基因‘库’。转基因‘库’随后用于克隆分离。转化过程导致许多单细胞系的建立，每个单细胞系代表从中选择出外来基因表达水平最高的克隆的独立转化事件。对于prhTNFR2:Fc(PRHTNFR2:FC)而言，用携带prhTNFR2:Fc盒的质粒进行转化(图1SEQIDNO:7和8)。因此，重组蛋白靶向细胞的内质网(ER)。BY2细胞受PRHTNFR2:FC-ER表达载体的转化通过根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefeciens)介导的植物转化程序进行，如下：BY2(亮黄色细胞2)悬浮培养物与携带隐匿prhTNFR2:FC基因和新霉素磷酸转移酶(NPTII)选择基因的载体的根瘤土壤杆菌菌株一起共培养48小时。随后，将细胞保持在补充了50mg/L卡那霉素(Kanamaycin)和250mg/L头孢噻肟(Cefotaxime)的培养基中。NPTII基因赋予了对卡那霉素的抗性，从而仅NPTII阳性BY2细胞在这种选择培养基中存活。使用头孢噻肟选择性地杀死土壤杆菌，植物抗这种抗生素。

筛选最佳表达克隆

为了选择独立细胞系，将高度稀释的细胞悬浮液等分试样涂在固体BY-2培养基上(ToshiyukiNagata和FumiKumagaiMethodsinCellScience21:123–127，1999)。然后使细胞生长直至小的愈伤组织发育。然后将每个愈伤组织重新悬浮在液体培养基中。然后为细胞取样并估计PRHTNFR2:FC。在变性条件下通过蛋白质印迹法筛选出约500个细胞系(图4)。通过相同方法进一步分析具有高表达水平的系以选择生成prhTNFR2:FC的克隆中的最高表达克隆。

凝胶电泳

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在电场上根据其大小分离蛋白质。蛋白质在洗涤剂SDS的存在下呈其分子量对数的线性函数迁移。将PRHTNFR2:FC在SDS-PAGE上的迁移模式和标志与商用分子量标准蛋白(NewEnglandBioLabs；产品目录号P7708S)比较和市场上可买到的在CHO细胞中表达哺乳动物细胞源性Enbrel(Entanercept；Wyeth)比较。通过含有β-巯基乙醇的还原性样品缓冲液或通过天然提取缓冲液从细胞中提取PRHTNFR2:FC。天然提取上清液在分析之前与非还原性样品缓冲液混合。使用Criterion^TM细胞垂直电泳装置(Bio-RadLab.)，用预先混合的电泳Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(Bio-RadLaboratories)进行电泳。电泳后，将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到蛋白质结合硝化纤维素膜(iBlot^TM)上。在室温下用5％含0.1％吐温20(Tween20)的乳剂缓冲液封闭1小时。为了鉴定分子的Fc部分，使用与HRP(产品目录号109-035-098，Jackson.)偶联的山羊抗人IgG。为了检测TNFR2，采用兔抗TNFRII(ID:ab109853,Abcam)，接着采用山羊抗兔HRP(产品目录号111-035-003,Jackson)。用ECL检测试剂盒(Pierce)进行检测。将PRHTNFR2:FC的免疫反应性与商用(Entanercept；Wyeth)比较。使用分子成像仪凝胶DocXR系统(Bio-RadLaboratories)检测条带。

通过质谱法为氨基酸测序

送prhTNFR2:FC到以色列理工学院(Technion-IsraelInstituteofTechnology)(Haifa,Israel)的Smoler蛋白质组学中心(SmolerProteomicsCenter)进行测序分析。从凝胶上提取蛋白质，用2.8mMDTT(60℃，30min)还原，用在100mM重碳酸铵中的8.8mM碘乙酰胺改性(在黑暗中、室温下，30分钟)并且在37℃下按1:50酶:底物比例于含改性胰蛋白酶(Promega)或含胰凝乳蛋白酶的10％ACN和10mM重碳酸铵中消化整夜。在装有Reprosil反相材料(DrMaischGmbH,Germany)的0.075X200-mm熔融石英毛细管(J&W)上通过反相色谱法溶解3％所得到的肽。用60分钟5至45％的线性梯度和15分钟95％乙腈与0.1％甲酸在水中以0.25μl/min的流量洗脱所述肽。用离子阱质谱仪(Orbitrap,Thermo)在正离子模式下重复使用全MS扫描，接着通过选自首次MS扫描的7个最具优势的离子的碰撞诱导解离(CID)进行在线质谱分析。

使用Sequest3.31软件(J.Eng和J.Yates，UniversityofWashingtonandFinnigan,SanJose)与特定序列分析质谱数据。

糖基化分析

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和植物细胞系统中生成的糖蛋白之间的主要差异是糖基化谱型和聚糖结构。已进行了初步分析以表征附于蛋白质上的各种N-联聚糖结构。将这些结果与在商用中发现的N-糖基化谱型的结果比较。确定O-联聚糖和聚糖位点分析的存在。

PRHTNFR2:FC和商用Enbrel的样品经还原、烷基化并且在SDS-PAGE上分离。取～75KDa的蛋白质条带(总共约200μg蛋白质)，使用胰蛋白酶消化，接着对于PRHTNFR2:FC而言使用肽N-糖苷酶A(PNGaseA)或肽N-糖苷酶F(PNGaseF)消化(分别为总蛋白的～80％和～20％)并且对于商用Enbrel而言仅用肽N-糖苷酶F消化，进行聚糖分析。用胰蛋白酶，接着用肽N-糖苷酶A消化释放了全部N-联聚糖并且用肽N-糖苷酶F消化释放了除含有α1-3核岩藻糖外的所有聚糖(存在于植物中)。提取、清洁释放的聚糖，然后用荧光试剂邻氨基苯甲酰胺(2-氨基苯甲酰胺，2AB)标记，接着去除过量2AB。分析方法包括在带有与荧光检测器(激发波长330nm，发射波长420nm)耦合的正相酰胺基柱(TosohTSK酰胺-80柱)的WatersHPLC系统上分离聚糖。经标记的聚糖库的测序通过用各种外切糖苷酶依次消化，接着通过附加HPLC分析实现。使用用各种外切糖苷酶的依次消化提供了关于聚糖结构谱型及其相对量的额外信息。对从PRHTNFR2:FC释放的聚糖进行的外切糖苷酶消化是用去除β1-2,3,4和6N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的JBH(洋刀豆β-N-乙酰氨基己糖苷酶)，用去除甘露糖α1-2,6>3甘露糖的JBM(洋刀豆甘露糖苷酶)和用去除α1-6和α1-3核岩藻糖的BKF(牛睾丸岩藻糖苷酶)。荧光标记使得对总消化聚糖库中各种聚糖结构的分布的半定量分析成为可能。然后根据独特聚糖键并且按照大小递增的顺序使用由甲酸铵和乙腈组成的梯度溶剂流分离聚糖。将独立聚糖的保留时间与部分水解的葡聚糖片段的标准混合物的保留时间比较，得到一系列葡萄糖单元(GU)。根据其GU值，基于标准和与外部数据库(glycobase网站8080)的比较为聚糖分配峰值。由肽N-糖苷酶A消化的色谱图计算最终分配和相对峰面积。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

结合ELISA：TNF结合ELISA是商用TNF检测ELISA试剂盒(人TNF-α；HycultBiotechInc.#HK307)和商用抗人IgG抗体(山羊抗人IgGFC特异性HRP；Sigma)的组合。所述测定是对prhTNFR2:FC结合活性的定量非放射性测定。这种结合ELISA使得能够检测包含TNFR和IgG结构域的功能(能够结合TNF)分子。

预先涂有抗TNF的抗体的ELISA板在室温下用TNF(60ng/ml，Sigma)培养1小时。在每个ELISA步骤期间，用商用洗涤缓冲液洗涤所述板3次。商用Enbrel和来自于表达PRHTNFR2:FC的BY2细胞的上清液(连续稀释液)在室温下在ELISA板上培育2小时。山羊抗人IgGFCHRP经1:10,000稀释并且在室温下在板上培育1小时。TMB用作HRP的底物。用10％HCL终止比色反应并且在450nm下测定吸光度。

A375细胞中TNFα诱导的凋亡的预防

使A375细胞(人黑素瘤细胞)在培养基(ATCC，#30-2002，补充了10％FBS)中悬浮生长。在96孔测定板中接种10⁴个细胞/孔并且在测定培养基(ATCC，#30-2002，补充了5％FBS)中培育过夜。在37℃下在不同浓度(1.562-100ng/ml)的prhTNFR2:FC或商用Enbrel(Entanercept；Wyeth)的存在下培育重组TNFα(2ng/ml，ProSpec,Rehovot,Israel)2小时。培育后，在放线菌素D(0.8μg/ml)的存在下将混合液添加到A375细胞中，在37℃、5％CO₂下加湿培育箱内再培育24小时并且通过MTT测定(Sigma产品目录号M5655)确定凋亡的定量。在570-650nm下读板并且计算对TNF-α诱导的细胞毒性的抑制(％)。

实施例2

蛋白质分析

在还原(图2A)和非还原条件(图2B中天然提取)下分析prhTNFR2:FC。使用抗Fc抗体(上图)和抗TNFR2抗体(下图)检测prhTNFR2:FC(泳道1)和商用Enbrel(泳道2)。两种蛋白质在迁移特征上展示出略微差异，大概是由于植物和哺乳动物细胞表达的酶之间在糖基化模式上的差异。

通过将表达prhTNFR2:Fc(PRX-106)的BY2细胞的溶解产物的连续稀释液与商用Enbrel比较检查TNF受商用Enbrel和prhTNFR2:FC的结合。prhTNFR2:FC连续稀释液展示出与商用蛋白质相似的剂量反应结合模式(参见图3)。根据蛋白质表达选择转基因细胞系通过蛋白质印迹法进行。因此，为了允许选择独立细胞系，将高度稀释的细胞悬浮液等分试样涂在固体BY-2培养基上。然后使细胞生长直至小的愈伤组织发育。然后将每个愈伤组织重新悬浮在液体培养基中。然后为细胞取样并通过在还原条件下提取，接着通过生成的靶蛋白的蛋白质印迹鉴定(抗FC抗体)估计prhTNFR2:FC表达水平(图4)。表达的蛋白质的功能性由其预防TNF诱导的凋亡的能力确立。具体而言，可通过其在转录抑制剂，放线菌素D的存在下诱导某些细胞系的细胞死亡的能力测量TNF活性。用TNFα的中和蛋白预培育防止与受体(TNF-R1和TNF-R2)的结合，从而抑制了细胞因子作用并预防了TNFα诱导的细胞死亡。通过MTT测定量化细胞活力为TNFα细胞毒性提供了细胞内活性测定。关于黑素瘤细胞的结果示于图5A-G中并且关于L929成纤维细胞的结果示于图6A-G中。

实施例3

在ConA免疫介导性肝炎模型中口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞有效地减轻肝中毒

伴刀豆球蛋白A(ConA)模型是非常确实的用于研究T细胞、自然杀伤(NK)T细胞(NKT)和巨噬细胞依赖性肝损伤的动物模型，其精密模拟免疫介导性肝炎特有的发病机理和病理变化在这种免疫介导性肝炎模型中通过口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞对肝中毒的改善为表达重组TNFR2:Fc的植物细胞的有效抗炎能力提供了证据。

材料和方法

动物：在所有实验中均使用11-12周龄雄性C57Bl/6小鼠。每个实验组包括5至8只小鼠。

ConA模型：按20mg/Kg体重的剂量经静脉向尾静脉施用溶于50mMTris(pH7)、150mM氯化钠、4mMCaCl₂中的伴刀豆球蛋白A(MPBiomedicals,OH,USA)。ConA施用14小时后处死小鼠并且通过心脏穿刺收集样品，使其凝结并取出血清以测定血清肝酶(丙氨酸转氨酶ALT和天冬氨酸转氨酶AST)和细胞因子(IFN-γ)水平。切除肝脏并准备进行组织病理学检查。

口服施用重组植物细胞：在施用ConA前6小时开始口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞。小鼠接受通过乳化于盐水中新制备的相当于0.5μg(X1)或5μg(X10)TNFR2:Fc蛋白的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞。阴性对照接受相同口服施用体积的宿主BY2(-)植物细胞，代替表达重组TNFR2:Fc的植物细胞。口服施用在350μl体积中通过强饲进行。

类固醇对照：在施用ConA前6小时，通过每只小鼠口服施用035mg地塞米松(Teva,Israel)提供类固醇治疗。

肝中毒：使用ReflovetPlus临床化学分析仪(RocheDiagnostics,MannheimGermany)估计血清中肝实质损伤的标志物，肝酶(丙氨酸转氨酶ALT和天冬氨酸转氨酶AST)。使用QuantikineColorimetricSandwichELISA试剂盒(R&DSystems,MinneapolisMN,USA)，通过ELISA估计经处理的和对照小鼠血清中的细胞因子(IFN-γ)水平。

病理学：组织于10％甲醛中固定并储存于室温下，石蜡包埋、切片并用苏木精和伊红(H&E)染色以通过光学显微镜术进行形态学和组织学检查之后测定个体肝脏中的组织病理学。

结果：

在三个独立系列的实验中，按低剂量(相当于0.5μgTNFR2:Fc蛋白“X1”)和较高剂量(相当于5μgTNFR2:Fc蛋白“X10”)口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞明显降低了ConA的肝毒性作用。在全部三项实验中在很大程度上防止了肝损伤的血清酶标志物(AST、ALT)升高(参见图7A、7B和7C)，功效接近口服类固醇治疗的功效(图8A、8B和8C，地塞米松)。

ConA施用14小时后对小鼠血清中细胞因子IFN-γ的测定(参见图8A、8B和8C)也显示在接受按低剂量(相当于0.5μgTNFR2:Fc蛋白“X1”)和较高剂量(相当于5μgTNFR2:Fc蛋白“X10”)口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞的组中血清IFN-γ明显减少。

经处理和对照小鼠肝脏的组织病理学检查(苏木精和伊红)(图9A、9B和9C)在对照肝脏中(图9A)显示严重的肝坏死，但是在用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞处理的小鼠的肝脏中(图9B)显示对肝脏结构和正常肝组织结构的保护。

比较口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞(低剂量，相当于0.5μgTNFR2:Fc蛋白)和腹腔内施用100μg商用哺乳动物细胞表达的TNFR2:Fc依那西普(Wyeth)在ConA免疫介导性肝炎模型中对肝中毒的影响。比较相对于未经处理的对照，在经处理的小鼠中血清肝损伤标志物AST和ALT的水平显示，即使是口服施用低剂量的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞在预防肝损伤标志物响应于ConA诱导的免疫介导性肝炎升高中也与腹腔内施用100μg依那西普一样有效(87-85％，图10A和10B)。

实施例4

在用高脂饮食(HFD)建模的脂肪性肝病中口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞有效地改善免疫发病机理

用高脂饮食(HFD)诱导普通接受的脂肪性肝病动物模型。有饮食诱导型肥胖的小鼠特征在于血脂谱升高、肝甘油三酯增加和免疫系统改变。

测定口服施用的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞对饲喂HFD的小鼠的影响。分析包括治疗对疾病临床表现的作用和作为免疫调节剂的作用。

材料和方法

动物：在所有实验中均使用6-7周龄雄性C57Bl/6小鼠。每个实验组包括10只小鼠。小鼠购自HarlanLaboratories,Jerusalem,Israel。从第0天开始所有小鼠饲喂HFD(Harlan，其中42％的热量来自于脂肪的TD88137)，直至在24周后处死。

表1(实验设计)：

口服施用重组植物细胞：开始口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞(批次Ly013+)，每周三次。阴性对照接受相同口服施用剂量的模拟细胞(BY-)。向小鼠的所有口服施用均按35l的总体积。每次施用之前制备新鲜制剂。

每周测量一次的终点：

1.体重

每月测量一次的终点：

1.空腹血糖水平

2.血清ALT、AST水平*

3.血清甘油三酯水平

*血清肝酶和甘油三酯的监测可通过ReflovetPlus临床化学分析仪测量(RocheDiagnostics,GmbH,Mannheim,Germany)。

另外的终点：

1.第1天和第24周的空腹血清胰岛素水平(ELISA)。

2.第8周和第24周葡萄糖耐量试验(GTT).

3.处死后肝脏脂肪含量(甘油三酯)

4.处死后肝脏组织结构

5.处死后血清细胞因子水平(TNF-)(ELISA)。

6.对T细胞和Treg亚类(脾脏和肝脏)的流失细胞术(FACS)

7.CD8-APC/CD4-FITC/CD25-PE/Foxp3-PE-Cy7

8.CD3-FITC/NK1.1-APC

小鼠处死后(在第24周)：

细胞因子分泌：使用QuantikineSandwichELISA试剂盒(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)，通过ELISA测量经处理的和对照小鼠血清中的细胞因子(TNF-)水平。

组织病理学：切除肝脏，然后于10％甲醛中固定，石蜡包埋，切片并用H&E和用曼森氏三色法(Masontrichome)(对于纤维化而言)染色。由不知情的病理学家通过光学显微镜术检查H&E组织的NASH的形态学和组织病理学变化特征并评分。

甘油三酯测定：使用福尔奇方法(Folchmethod)的变型量化肝脏中胞内甘油三酯(TG)的积聚。从速冻肝脏的等分试样中提取TG，然后使用GPO-Trinder试剂盒(Sigma,Rehovot,Israel)测定经分光光度法测定并归一化为匀浆内的蛋白质含量。

对取自脾脏的T细胞和Treg亚类进行FACS分析。

结果

测试口服施用的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞对血清酶的影响。如图11中可见，正如在处死当天所测得(第24周)，口服施用表达抑制剂的细胞引起经处理小鼠中AST水平降低。ALT水平的下降趋势也明显(数据未示出)。

测试口服施用的表达重组TNFR2:Fc的植物细胞对血清甘油三酯(TG)的影响。如图12中可见，在处死当天(第24周)，口服施用表达抑制剂的细胞引起经处理小鼠中TG水平显著降低。重要的是，获得的结果支持TNFR2:Fc的治疗功效，因为尽管在所有试验小组中持续增重但对血清酶和TG的影响明显。

接下来通过组织病理学方法和FACS测试了模型小鼠的肝脏和脾脏中T细胞亚群的分布。图14示出了肝Treg的结果。正如可见，在高剂量治疗小鼠中肝内Treg显著减少。

图15示出了肝NK细胞的结果。正如可见，在高剂量治疗小鼠中肝内NK细胞显著增加。图16示出了口服施用表达重组TNFR2:Fc的植物细胞对脾/肝CD4+CD25+FOXP3+比率的影响的结果。正如可见，注意到对于Tregs(CD4+CD25+FOXP3+)而言脾脏与肝脏的比率增大。与盐水处理的小鼠相比，0.5g的PRX-106使该比率增大10％并且g的PRX-106使该比率增大22％。

图17示出了口服施用在植物细胞中的重组TNFR2:Fc对脾/肝CD8+CD25+FOXP3+比率的影响的结果。正如可见，对于另一亚类的细胞：CD8+CD25+FOXP3+细胞而言，注意到脾脏与肝脏的比率明显增大。与盐水处理的小鼠相比，低剂量的0.5g药物使该比率增大74％。

这些结果表明口服施用在植物细胞中的重组TNFR2:Fc改变了模仿脂肪性肝病的HFD小鼠中影响肝内至外周(脾脏)T细胞功能的T细胞分布。

实施例5

在小鼠中的毒理学研究

方法

动物

在研究开始前8周将雄性和雌性SD大鼠(HarlanLaboratories,Israel)关在标准实验室条件下。研究开始时平均重量对于雄性而言为约6.8g且对于雌性而言为6.3g。动物饲喂商用啮齿动物饮食(Teklad全球认证18％蛋白质饮食产品目录号：2018SC)并且自由接近经高压蒸汽处理和酸化的饮用水(pH介于2.5和3.5之间)。

研究设计

分配4个组，3个给药组，每组含12只大鼠(6只雄性和6只雌性)和1个对照，每组含6只大鼠(3只雄性和3只雌性)。每种性别中，对照组接受稀释缓冲液(0.2M甘露糖醇)并且3个处理组按0.1、0.5和1mgTNFR2:Fc/Kg体重的剂量水平接受表达TNFR2:Fc的细胞。根据要求的表达蛋白量等分细胞。每份等分试样与30克商用啮齿动物饮食粉末和稀释缓冲液混合，以制作球丸。用稀释缓冲液和单独的商用啮齿动物饮食粉末制备对照球丸。所有动物每天口服饲喂所述球丸14天。研究期间，进行死亡率和一般临床观察，每天监测体重。在研究结束时(第15天)，在经二氧化碳吸入浅麻醉后，从所有动物的眼球后总窦抽取3份血样，之后，处死动物，实施病理学检查并收获所选器官。

结果

在14天安全研究期间未记录到不良临床症状。所有血液参数均在正常范围内，无显著偏差。体重增加持续且正常，组间(经处理或对照)无显著差异。细胞表达被发现安全且耐受良好，无不良影响。未发现对生物化学参数或临床症状的影响。总的尸体剖检观察未揭示出病理学发现。未发现动物呈垂死状态或处于严重痛苦条件下。未观察到呈现严重疼痛或体质下降的动物。

实施例6

PRX-106的测序

通过埃德曼降解(Edmandegradation)N端测序

在Alphalyse(Denmark)uainf，一种ABIProcise494测序仪上进行分析。所述程序通过埃德曼降解化学方法确定蛋白质和肽的N端氨基酸序列。埃德曼降解是一个循环过程，其中一次裂解掉一个氨基酸残基并通过色谱法鉴定。在循环过程中有3个步骤。在步骤1中，PITC试剂在碱性条件下与N端氨基偶联。在步骤2中，在酸性介质中裂解N端残基。在步骤3中，将PITC偶联残基转移到烧瓶中，转化为PTH-残基并通过HPLC色谱法鉴定。然后开始下一个循环以鉴定下一个N端残基。

结果：

确定序列为LPAQV(SEQIDNO:18)。

通过与质谱检测仪耦合的反相HPLC验证氨基酸序列

在Smoler蛋白质组学中心(Technion-IsraelInstituteofTechnology,Haifa,Israel)进行测序。使用与质谱检测仪耦合的反相HPLC进行分析。

方法

蛋白水解

分析的样品重新悬浮在8M脲、100mM重碳酸铵(ABC)中，接着用2.8mMDTT还原(60℃，30分钟)并且在黑暗中在环境温度下用在100mMABC中的8.8mM碘乙酰胺再改性30分钟。在37℃下按1:50酶:底物比例于2M脲、25mMABC中消化蛋白质整夜。

质谱分析

使用载物台尖端(国产C18)为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶肽脱盐，蒸发残留缓冲液并使球丸重新悬浮在0.1％(v/v)甲酸中。通过反相液相色谱法在装有Reprosil反相材料(DrMaischGmbH,Germany)的0.075X200-mm熔融二氧化硅毛细管(J和W)上通过反相液相色谱法溶解20ng所得到的肽。用60分钟5至45％的线性梯度，接着是15分钟95％乙腈与0.1％甲酸在水中以0.25μL/min的流量洗脱肽。在离子阱质谱仪(Orbitrap,Thermo)上在正离子模式下重复使用全MS扫描，接着通过选自首次MS扫描的7个最具优势的离子的碰撞诱导解离(CID)进行在线质谱分析。使用Discoverer软件1.3版软件，使用特定蛋白质推导数据库分析质谱数据。

结果

将序列与依那西普序列的肽序列比较。在下面表面V中呈现了鉴定的序列。呈现参考序列84.8％的覆盖率(参见绿色部分，图20).

表V-用胰蛋白酶消化后鉴定的肽(SEQIDNO:19-203，按顺序)

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尽管本发明已经结合其具体实施方案进行了描述，但是显然许多替代、修改和变型对本领域技术人员而言将显而易见。因此，其意图在于包括属于所附权利要求的精神和宽范围内的所有此类替代、修改和变型。

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本说明书中，其程度如同特别地且单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文一样。另外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。至于所使用的章节标题，不应将其解释为必要性限制。

Claims

1.一种治疗选自由肥胖、代谢综合征、糖尿病、高脂血症和肝脏疾病或病症所组成的组中的TNFα相关医疗状况的方法，所述方法包括向有需要的受试者肠内施用治疗有效量的表达TNFα多肽抑制剂的植物细胞，从而治疗所述TNFα相关医疗状况。

2.表达TNFα多肽抑制剂的植物细胞用于选自由肥胖、代谢综合征、糖尿病、高脂血症和肝脏疾病或病症所组成的组中的TNFα相关医疗状况的肠内治疗的用途。

3.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述肠内为口服施用。

4.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述TNFα多肽抑制剂为抗TNFα抗体。

5.根据权利要求4所述的方法或用途，其中所述抗TNFα抗体为英利昔单抗、阿达木单抗或戈利木单抗。

6.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的用途，其中所述TNFα多肽抑制剂为嵌合多肽，其包含：

(i)包含TNF受体的TNFα结合结构域的第一结构域；和

7.根据权利要求6所述的方法或用途，其中所述嵌合多肽还包含含内质网滞留信号的第三结构域，其中所述第一结构域、第二结构域和第三结构域N端与C端分别依次翻译性融合。

8.根据权利要求6-7中任一项所述的方法或用途，其包括编码内质网信号肽、N端与所述第一结构域翻译性融合的附加结构域。

9.根据权利要求8所述的方法或用途，其中所述信号肽为植物信号肽。

10.根据权利要求9所述的方法或用途，其中所述植物信号肽如SEQIDNO:4中所示。

11.根据权利要求6-7中任一项所述的方法或用途，其中所述第一结构域为200-250个氨基酸长。

12.根据权利要求11所述的方法或用途，其中所述第一结构域包含氨基酸序列LCAP(SEQIDNO:11)和VFCT(SEQIDNO:12)。

13.根据权利要求12所述的方法或用途，其中所述第一结构域还包含氨基酸序列LPAQVAFXPYAPEPGSTC(SEQIDNO:13)。

14.根据权利要求13所述的方法或用途，其中所述第一结构域如SEQIDNO:2中所示。

15.根据权利要求6-7中任一项所述的方法或用途，其中所述免疫球蛋白为IgG₁。

16.根据权利要求6-7中任一项所述的方法或用途，其中所述第二结构域如SEQIDNO:9中所示。

17.根据权利要求6-7中任一项所述的方法或用途，其中所述嵌合多肽如SEQIDNO:6中所示。

18.根据权利要求7所述的方法或用途，其中所述嵌合多肽如SEQIDNO:7、204或205中所示。

19.根据权利要求6-7中任一项所述的方法或用途，其中所述嵌合多肽能够抑制TNFα诱导的凋亡。

20.根据权利要求1-2中任一项所述的方法或用途，其中所述TNFα多肽抑制剂包含植物特有的聚糖。

21.根据权利要求20所述的方法或用途，其中所述植物特有的聚糖选自由核木糖和核α-(1,3)岩藻糖所组成的组。

22.根据权利要求1-2中任一项所述的方法或用途，其中所述植物细胞为烟草植物细胞。

23.根据权利要求22所述的方法或用途，其中所述烟草植物细胞为亮黄色(BY-2)细胞。

24.根据权利要求1-2中任一项所述的方法或用途，其中所述植物细胞是经冻干的。

25.根据权利要求1-2中任一项所述的方法或用途，其中所述植物细胞是悬浮生长的。

26.根据权利要求1-2中任一项所述的方法或用途，其中所述肝脏疾病或病症选自由肝炎、肝硬化、肝癌、肝中毒、慢性肝病、脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)所组成的组。

27.根据权利要求26所述的方法或用途，其中所述肝中毒由选自由醋胺酚、NSAIDS、糖皮质激素、异烟肼、砷、四氯化碳和氯乙烯所组成的组中的化学试剂诱导。

28.根据权利要求26所述的方法或用途，其中所述糖尿病选自由I型糖尿病、II型糖尿病和LADA病所组成的组。

29.根据权利要求1-2中任一项所述的方法或用途，其中所述植物细胞呈口服营养形式提供。

30.根据权利要求29所述的方法或用途，其中所述口服营养形式为全餐、可溶粉末、棒状物、焙烤产品、压块干粮、奶制品条、小吃、早餐谷物食品、牛奶什锦早餐、糖果、药片、曲奇、饼干、梳打饼干、巧克力或奶制品。

31.根据权利要求1-27、29、30中任一项所述的方法或用途，其中所述肝脏疾病或病症为脂肪性肝病。

32.根据权利要求30所述的方法或用途，其中所述TNFα多肽抑制改变肝和脾T细胞分布。

33.根据权利要求30所述的方法或用途，其中所述TNFα多肽抑制减少血清酶或代谢产物。

34.根据权利要求30所述的方法或用途，其中所述血清酶为天冬氨酸转氨酶(AST)或丙氨酸转氨酶(ALT)。

35.根据权利要求30所述的方法或用途，其中所述代谢产物为甘油三酯。