JP2013530981A - 脂質動員特性を有する糖タンパク質およびその治療的使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(図1B)培養培地および精製されたZAGにおけるZAGの発現を示す、ウェスタンブロットの結果を示す画像図である。
(図1C)体重が減少しているMAC16マウスの脂肪組織および肝組織内のZAG mRNAレベルを示すグラフ図である。P<0.01
(図1D)イソプレナリン(Iso)およびZAGに応答して、非肥満(■)およびob/obマウス(□)から得た精巣上体脂肪細胞における脂肪分解の結果を示すグラフ図である。非肥満マウスとの差は、*p<0.05、**p<0.01、および***p<0.001として示される。
(図1E)無処置(■)であるか、イソプレナリン(10μM)(□)またはZAG(0.46μM)
のいずれかで処置した肥満(ob/ob)および非肥満(非ob)マウスの精巣上体(ep)、皮下(s.c.)、および内臓(vis)沈着物から得た脂肪細胞における脂肪分解の結果を示すグラフ図である。精巣上体脂肪細胞との差は、**p<0.01として示される。
(図1F)方法に記載されるPBS(◆)と比較して、ob/obマウスの体重に対するZAG(■)の効果を示すグラフ図である。ゼロ時間からの体重とPBS対照の体重差は、***p<0.001として示される。
(図1G)PBS対照(■)と比較して、eで示されるマウスの体温に対するZAG(□)の効果を示すグラフ図である。対照との差は、***p<0.001として示される。
(図2A)ZAGで処置されたob/obマウスのグルコース耐性を示すグラフ図である。グルコース(2g/kg)の静脈内投与後、ZAG(■)またはPBS(◆)のいずれかで3日間処置された給餌状態のob/obマウスの血漿グルコース値。PBSの場合p<0.001。グルコース投与後間隔を置いて、血液試料を尾静脈から採取し、グルコースおよびインスリンの測定に使用した。
(図2B)グルコース(1g/kg)の経口投与後のZAGで処置されたob/obマウスの血漿インスリン値を示すグラフ図である。PBSの場合p<0.001。
(図2C)0(■)、1(□)、または10nMインスリン
の存在下で、ZAGで5日間処置されたob/obマウスの精巣上体(ep)、内臓(vis)、および皮下(s.c.)脂肪細胞へのグルコースの取り込みを示すグラフ図である。ZAGの存在の差は、***p<0.001として示される。
(図2D)インスリン(100nM)の非存在または存在下で、ZAGまたはPBSのいずれかで5日間処置されたob/obマウスの腓腹筋への2−デオキシ−D−グルコースの取り込みを示すグラフ図である。インスリンの存在の差は、*p<0.05または**p<0.01として示されるが、ZAGの存在の差は、***p<0.001として示される。
(図2E)ob/obマウスの骨格筋におけるGLUT4グルコース輸送体の発現に対するZAGの効果を示す画像図である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を除去し、GLUT4の発現についてウェスタンブロット分析した。
(図3A)ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するZAGの効果を示すグラフ図である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を除去し、タンパク質合成の測定に使用した。PBS対照または非肥満動物との差は、***p<0.001として示される。
(図3B)ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するZAGの効果を示すグラフ図である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を除去し、タンパク質分解の測定に使用した。PBS対照または非肥満動物との差は、***p<0.001として示される。
(図3C)ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するZAGの効果を示すグラフ図である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を除去し、キモトリプシン様酵素活性の測定に使用した。PBS対照または非肥満動物との差は、***p<0.001として示される。
(図3D)ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するZAGの効果を示すグラフ図である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を除去し、20S−プロテアソームα−サブユニットについてウェスタンブロットを行った。
(図3E)ob/obマウスの骨格筋におけるシグナル伝達経路に対するZAGの効果を示す画像図である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を除去し、p42マウスの発現についてウェスタンブロットを行った。
(図3F)ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するZAGの効果を示す画像図である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を除去し、ミオシンの発現についてウェスタンブロットを行った。
(図3G)ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するZAGの効果を示す画像図である。ob/obマウスを5日間処置した後、骨格筋を除去し、対照としてアクチンの発現についてウェスタンブロットを行った。
(図4A)PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置した後、ob/obマウスの腓腹筋におけるリン酸PKRのウェスタンブロットによって、骨格筋における異化シグナル伝達経路に対するZAGの効果を示す画像図である。タンパク質の全形態がローディングコントロールとして役立つ。PBS対照との差は、***p<0.001として示されるが、非肥満マウスとの差は、#p<0.001として示される。
(図4B)PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置した後、ob/obマウスの腓腹筋におけるリン酸eIF2aのウェスタンブロットによって、骨格筋における異化シグナル伝達経路に対するZAGの効果を示す画像図である。タンパク質の全形態がローディングコントロールとして役立つ。PBS対照との差は、***p<0.001として示されるが、非肥満マウスとの差は、#p<0.001として示される。
(図4C)PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置した後、ob/obマウスの腓腹筋におけるリン酸PLA2のウェスタンブロットによって、骨格筋における異化シグナル伝達経路に対するZAGの効果を示す画像図である。タンパク質の全形態がローディングコントロールとして役立つ。PBS対照との差は、***p<0.001として示されるが、非肥満マウスとの差は、#p<0.001として示される。
(図4D)PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置した後、ob/obマウスの腓腹筋におけるリン酸p38MAPKのウェスタンブロットによって、骨格筋における異化シグナル伝達経路に対するZAGの効果を示す画像図である。タンパク質の全形態がローディングコントロールとして役立つ。PBS対照との差は、***p<0.001として示されるが、非肥満マウスとの差は、#p<0.001として示される。
(図4E)PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置した後、ob/obマウスの腓腹筋におけるカスパーゼ3(■)およびカスパーゼ−8(□)の活性によって、骨格筋の異化シグナル伝達経路に対するZAGの効果を示すグラフ図である。
(図5A)ZAGに応答するHSLの発現を示す画像図である。ウェスタンブロットは、無処置(Con)、イソプレナリン(10μM)もしくはZAG(0.46μM)単独での処置、またはZAGで5日間処置した後、PD98059(25μM)の存在下で3時間後の非肥満マウスの脂肪細胞におけるリン酸HSLの発現を示す。
(図5B)ZAGで5日間処置した後の精巣上体(ep)脂肪細胞におけるHSLの発現を免疫ブロット法によって示す画像図である。
(図5C)ZAGで5日間処置した後の皮下(sc)脂肪細胞におけるHSLの発現を免疫ブロット法によって示す画像図である。
(図5D)ZAGで5日間処置した後の内臓(vis)脂肪細胞におけるHSLの発現を免疫ブロット法によって示す画像図である。
(図5E)ZAGで5日間処置した後の精巣上体脂肪細胞におけるATGLの発現を示す画像図である。
(図5F)ZAGで5日間処置した後の皮下脂肪細胞におけるATGLの発現を示す画像図である。
(図5G)ZAGで5日間処置した後の内臓脂肪細胞におけるATGLの発現を示す画像図である。
(図5H)ZAGで5日間処置した後の精巣上体脂肪細胞におけるpERKの発現を示す画像図である。
(図5I)ZAGで5日間処置した後の皮下脂肪細胞におけるpERKの発現を示す画像図である。
(図5J)ZAGで5日間処置した後の内臓脂肪細胞におけるpERKの発現を示す画像図である。
(図5K)PBSまたはZAGのいずれかで5日間処置したob/obマウスの精巣上体(ep)、皮下(sc)、および内臓(vis)沈着物から得た脂肪細胞のBRL37344の脂肪分解効果に対する応答を示すグラフ図である。PBS対照との差は、***p<0.01として示されるが、PD98059の存在下での差は、#p<0.001として示される。
(図6A)WATにおけるZAGの発現に対する、ZAGで5日間処置したob/obマウスの処置の効果を示す画像図である。ウェスタンブロットは、ep、sc、およびvis脂肪細胞におけるZAGの発現を示す。0日目は、脂肪細胞がマウスから除去された日を表す。
(図6B)方法に記載のとおりRMPI培地に懸濁された精巣上体脂肪細胞におけるZAGの発現を示す画像図である。次いで試料を1日ごとに採取し、ZAG発現についてウェスタンブロットを行った。0日目は、脂肪細胞がマウスから除去された日を表す。
(図6C)方法に記載のとおりRMPI培地に懸濁された精巣上体脂肪細胞におけるHSLの発現を示す画像図である。次いで試料を1日ごとに採取し、HSL発現についてウェスタンブロットを行った。0日目は、脂肪細胞がマウスから除去された日を表す。
(図6D)マウスから除去されたBATにおけるUCP1の発現を示す画像図である。PBSで処置されたマウスとの差は、***p<0.001として示される。
(図6E)マウスから除去されたBATにおけるUCP3の発現を示す画像図である。PBSで処置されたマウスとの差は、***p<0.001として示される。
(図6F)マウスから除去された腓腹筋におけるUCP3の発現を示す画像図である。PBSで処置されたマウスとの差は、***p<0.001として示される。
(図7A)21日研究の間のob/obマウスの体重減少を示すグラフ図である。ZAGは、1、4、5、8、13、16、18、および19日目に注射され、PBSは、同一時点で注射された。
(図7B)ZAGでの処置中のob/obマウス(体重80〜90g)の体重変化(g)を示すグラフ図である。
(図7C)21日研究の間のob/obマウスの体温上昇を示すグラフ図である。ZAGは、1、4、5、8、13、16、18、および19日目に注射され、PBSは、同一時点で注射された。
(図8A)処置の最初の5日間の尿中グルコース分泌の段階的減少を示すグラフ図である。
(図8B)21日研究の間の尿中グルコース分泌の段階的減少を示すグラフ図である。
(図9)ZAGで処置されたobマウスおよびZAGなしで処置されたobマウスから採取し、最長5日間培養されたイソプレナリン(iso)単離された脂肪細胞によって刺激されたグリセロール放出を示すグラフ図である。
(図10)T.Araki et al.(1988)″Complete amino acid sequence of human plasma Zn−α2−glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens″によって公開されるように、ヒト血漿Zn−α2−糖タンパク質の完全アミノ酸配列(配列番号1)を示す画像図である。
(図11)SR59230A(10μM)または抗ZAG抗体(1:1000)(IgG)の非存在または存在下で、イソプレナリン(10μM)と比較して、単離されたラット精巣上体脂肪細胞におけるヒトZAGの脂肪分解活性を示すグラフ図である。それぞれの値は、5つの別個の研究の平均である。対照との差は、b、p<0.01またはc、p<0.001として示されるが、ZAG単独との差は、e、p<0.01またはf、p<0.001として示される。
(図12A)10日間にわたる、雄ウィスターラットの体重に対する、100μL PBS中のZAG(■)(体重100gあたり50μg)またはPBS単独(◆)のいずれかの静脈内連日投与の効果を示すグラフ図である。実験のプロトコルは、方法のセクションで示される。
(図12B)図12Aに示される、ZAG(■)またはPBS(◆)のいずれかを投与した雄ウィスターラットの体温を示すグラフ図である。
(図12C)インスリン(60μU/mL)の非存在または存在下で、図12Aに示される、ZAG(白抜きのボックス)またはPBS(黒塗りのボックス)のいずれかで10日処置した後の雄ウィスターラットの精巣上体脂肪細胞への2−デオキシ−D−グルコースの取り込み(10日間)を示すグラフ図である。
(図12D)インスリン(60μU/mL)の非存在または存在下で、ZAGまたはPBSのいずれかで10日処置した後の雄ウィスターラットの腓腹筋およびBATへのグルコースの取り込みを示すグラフ図である。ZAGで処置された動物とPBSで処置された動物との差は、a、p<0.05、b、p<0.01、またはc、p<0.001として示されるが、インスリンの存在下での差は、f、p<0.001として示される。
(図12E)ZAGを投与したob/obマウスにおける組織Rgを示すグラフ図である。PBSの場合c、p<0.001。
(図13A)図12に示される、PBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットのBAT(図13A)、WAT(図13B)、および腓腹筋(図13C)におけるGLUT4の発現を示すウェスタンブロットの画像図である。ZAGで処置された動物とPBSで処置された動物との差は、c、p<0.001として示される。
(図13B)同上。
(図13C)同上。
(図14)図12に示される、PBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットのBAT(図14A)およびWAT(図14B)におけるUCP1およびUCP3の発現を示すウェスタンブロットの画像図である。ZAGで処置された動物とPBSで処置された動物との差は、c、p<0.001として示される。
(図15)図12に示される、PBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットのATGL(図15A)およびHSL(図15B)の発現を示すウェスタンブロットの画像図である。ZAGで処置された動物とPBSで処置された動物との差は、c、p<0.001として示される。
(図16)腓腹筋(図16A)、WAT(図16B)、およびBAT(図16C)におけるZAGの発現を示すウェスタンブロットの画像図である。図12に示される、PBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットから組織を摘出した。ZAGで処置された動物とPBSで処置された動物との差は、c、p<0.001として示される。
(図17)図12に示される、PBSまたはZAGのいずれかで10日間処置された雄ウィスターラットの腓腹筋におけるpPKR(図17A)およびpeIF2α(図17B)のリン酸化形態および全形態の発現を示すウェスタンブロットの画像図である。濃度測定分析は、リン酸形態対全形態の比であり、PBSで処置したラットの値のパーセンテージとして表される。
(図18)様々な濃度のグルコースの存在下、4時間ZAGの存在および非存在下で処置されたC2C12筋管におけるフェニルアラニン放出(図18A)およびタンパク質合成(図18B)を示すグラフ図である。統計的有意性は、対照の場合c、P<0.001、グルコース単独の場合f、P<0.001である。
(図19)様々な濃度のグルコースの存在下、SR59230Aの存在および非存在下で、ZAGの存在および非存在下で処置されたC2C12筋管におけるフェニルアラニン放出を示すグラフ図である。統計的有意性は、対照の場合b、P<0.01およびc、P<0.001、グルコース単独の場合e、P<0.05およびf、P<0.001である。
(図20)様々な濃度のグルコースの存在下、SR59230Aの存在および非存在下で、ZAGの存在および非存在下で処置されたC2C12筋管におけるタンパク質合成を示すグラフ図である。統計的有意性は、対照の場合b、P<0.01およびc、P<0.001、グルコース単独の場合e、P<0.05およびf、P<0.001、グルコース+SRの場合I、P<0.001である。
(図21)ZAGの存在および非存在下、様々な濃度のグルコースで処置されたC2C12筋管におけるROS活性を示すグラフ図である。統計的有意性は、対照の場合c、P<0.001、グルコース単独の場合f、P<0.001である。
(図22A)ZAGの存在および非存在下、グルコースで処置されたC2C12筋管におけるpPKRを示すウェスタンブロットの画像図である。統計的有意性は、対照の場合c、P<0.001、グルコース単独の場合f、P<0.001である。
(図22B)ZAGの存在および非存在下、グルコースで処置されたC2C12筋管におけるpeIF2αを示すウェスタンブロットの画像図である。統計的有意性は、対照の場合c、P<0.001、グルコース単独の場合f、P<0.001である。
(図23)ZAGの存在および非存在下で処置されたob/obマウスにおけるインスリン耐性試験の結果を示すグラフ図である。統計的有意性は、ZAGの存在下でb、P<0.05およびc、P<0.001である。
(図24)ob/obマウスにおけるD−[U−14Cグルコース]の14CO2への酸化を示すグラフ図である。
(図25)ob/obマウスにおける[14Cカルボキシ]トリオレインからの14CO2の産生を示すグラフ図である。
(図26)BRL37344を投与されたマウス(悪液質モデル)と比較して、抗ZAGを投与されたマウスの体重減少の低減を示すグラフ図である。
(図27)抗ZAG抗体の非存在および存在下で、β3作動薬、BRL37344で処置されたob/obマウスにおけるグルコース耐性を示すグラフ図である。
(図28)イソプレナリン(Iso)、ZAG、および抗ZAG抗体に応答する、マウス精巣上体脂肪細胞における脂肪分解の結果を示すグラフ図である。
(図29)抗ZAGの非存在または存在下で、BRLで処置されたob/obマウスにおける体重変化を示すグラフ図であり、BRLは、抗ZAGから24時間前または同時に付加された。
(図30)ZAG処置されたob/obマウスにおけるタンパク質分解の減少および筋合成の増加を示すグラフ図である。
(図31)ZAGありおよびなしで処置されたob/obマウスにおける体重変化を示すグラフ図である。
(図32)ZAGありおよびなしで処置されたob/obマウスにおける体温を示すグラフ図である。
(図33)ZAGありおよびなしで処置されたob/obマウスにおける尿中グルコース値を示すグラフ図である。
(図34)経口投与後のob/obマウスにおけるZAGを示すウェスタンブロットの画像図である。経口投与されたrhZAGによる処置は、血漿中の内因性発現マウスZAGを増加させる。
(図35)ヒトZAG(経口)の存在および非存在下で処置されたob/obマウスから得たWATにおけるZAG発現を示すウェスタンブロットの画像図である。経口投与されたrhZAGによる処置は、WATにおける内因性発現マウスZAGを増加させる。
(図36)プロプラノロール、一般的なβ−AR拮抗薬の非存在または存在下、ZAG(経口)の存在および非存在下で処置されたob/obマウスの体重変化を示す、グラフ図である。プロパノロールは、3日目に20〜40mg/kg増加し、その後、体重減少の変化は、ZAGで処置された動物の負の傾斜から未処置の動物の正の傾斜に変化した。
(図37)プロプラノロールの非存在または存在下、ZAG(経口)の存在および非存在下で処置されたob/obマウスの体温変化を示すグラフ図である。プロプラノロールは、3日目に20〜40mg/kg増加し、その後、ZAG+Propで処置された動物の体温は、未処置の動物の体温を追跡した。
(図38)プロプラノロールの非存在または存在下、ZAGの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血漿中の抗マウスZAGを使用するZAGを示すウェスタンブロットの画像図である。内因性マウスZAGは、経口投与されたrhZAGによる処置に伴って増加し、そのような増加は、プロプラノロールによって遮断される。
(図39)プロプラノロールの非存在または存在下、ZAGの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血清に対して、抗ヒトZAGを使用するZAGを示すウェスタンブロットの画像図である。ヒトZAGは、プロプラノロールの存在または非存在下、マウス血清において検出されない。
(図40)プロプラノロールの非存在または存在下、ZAG(経口)の存在および非存在下で処置されたob/obマウスにおけるブドウ糖負荷試験中のグルコース値を示すグラフ図である。
(図41)経口投与後のob/obマウスにおけるZAGを示すウェスタンブロットの画像図である。rhZAGの経口投与による処置は、血漿中の内因性発現マウスZAGを増加させる。
(図42)ヒトZAG(経口)の存在および非存在下で処置されたob/obマウスから得たWATにおけるZAG発現を示すウェスタンブロットの画像図である。
(図43)ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するZAGの効果を示す画像図である。
(図44)ob/obマウスの骨格筋におけるシグナル伝達経路に対するZAGの効果を示す画像図である。
(図45)ob/obマウスの骨格筋におけるタンパク質合成および分解に対するZAGの効果を示す画像図である。
(図46)経口処置されたob/obマウスから得たZAGの胃内および血漿内値を示す14C ZAGオートラジオグラフの画像図であり、試料は処置から24時間後に採取した。
(図47)50μg ZAG(経口/強制)の存在および非存在下で処置されたob/obマウスの体重変化を示すグラフ図である。
(図48)50μg ZAG(経口/強制)の存在および非存在下で処置されたob/obマウスの尿中グルコース値を示すグラフ図である。
(図49)ウェスタンブロットの画像図である。抗ZAGは、インビボでBRL37344によってもたらされる作用を低下させる。抗ZAGの非存在または存在下、BRLの存在および非存在下で処置されたob/obマウスのBATにおけるUCP3のウェスタンブロット。BRL37344によるob/obマウスの処置は、BATにおけるUCP3を増加させ、その効果は、抗ZAG抗体の投与によって遮断される。
(図50)ウェスタンブロットの画像図である。ob/obマウスに対するZAGの経口投与は、血漿およびWATにおける内因性マウスZAGの上方調節をもたらす。血漿(上)およびWAT(下)の経口rhZAG投与した試料におけるマウスZAGのウェスタンブロット。
(図51)ウェスタンブロットの画像図である。プロプラノロールは、経口rhZAGによる処置に起因して、マウス血清ZAGの増加を遮断するが、投与されたヒトZAGは、血漿中に認められない。プロプラノロール(上)の非存在または存在下、ZAGの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血清において、抗マウスZAGを使用するZAGのウェスタンブロット。ヒトZAGは、マウス血清において検出されない。プロプラノロール(下)の非存在または存在下、ZAGの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血清において、抗ヒトZAGを使用するZAGのウェスタンブロット。
(図52A)β1−AR(■)、β2−AR(□)、およびβ3−AR(ハッシュ)で形質転換されたCHO細胞におけるサイクリックAMP産生に対するZAG濃度の効果を示すグラフ図である。
(図52B)SR59230A(10μM)の非存在または存在下、β1−(■)、β2−(□)、およびβ3−AR(ハッシュ)で形質転換されたCHO細胞におけるサイクリックAMP産生に対するイソプレナリン(10μM)の効果を示すグラフ図である。サイクリックAMPの基礎値との差は、a、p<0.05またはc、p<0.001のいずれかとして示される。
(図52C)mRNA値を示すグラフ図である。全RNAのβ−AR mRNA分子/μgの絶対数として、それぞれのヒト遺伝子で形質転換されたCHO−K1細胞におけるβ1−、β2−、およびβ3−ARの発現は、同一試料(白抜きのボックス)におけるGAPDHの発現と比較して、RT−リアルタイムPCR(黒塗りのボックス)によって測定された。
(図52D)基礎値(白抜きのボックス)に関して、ホルスコリン(20μM)に応答する、ヒトβ1−、β2−、およびβ3−ARで形質転換されたCHO−K1細胞におけるサイクリックAMP産生(黒塗りのボックス)を示すグラフ図である。
(図52E)100μM 非標識ZAGの非存在(■)または存在(▲)下、ヒトβ1−(図52E)、β2−(図52F)、およびβ3−AR(図52G)で形質転換されたCHO−K1細胞に対するZAGの特異的結合を示すグラフ図である。同様濃度の凍結/解凍されたZAGの結合(X)も示される。
(図52F)同上。
(図52G)同上。
(図52H)マウス精巣上体脂肪細胞におけるイソプレナリン(Iso、10μM)(黒塗り)と比較して、新鮮(白抜き)または一度凍結/解凍された(点線)ZAG(0.58μM)の脂肪分解活性を示すグラフ図である。対照との差は、c、p<0.001として示されるが、SR59230Aの存在下での新鮮なZAGと凍結されたZAGとの間の差は、f、p<0.001として示される。
(図53A)ZAGで処置されたob/obマウスにおける体重(53A)、体温(53B)、および尿グルコース分泌(53C)に対するプロパノロールの効果を示すグラフ図である。動物を4群に分けて(n=5/群)、ZAG(50mg、iv)(■)、ZAG+プロパノロール(40mgkg-1、po)(▲)を連日投与する一方、対照は、PBS(◆)またはPBSおよびプロパノロール(X)のいずれかを受けた。PBSとの差は、c、p<0.001として示されるが、ZAGとの差は、f、p<0.001として示される。
(図53B)同上。
(図53C)同上。
(図53D)対照処置およびZAG処置された試料切片を比較する、60日後の肝組織学の画像図である。
(図54A)PBS(□)と比較して、ZAG(■)の開始から3日後のブドウ糖負荷試験中の任意単位におけるグルコース曲線(AUC)下の総面積および血漿グルコース値を示すグラフ図である。
(図54B)(図54A)に記載されるブドウ糖負荷試験中の血漿インスリンレベルを示すグラフ図である。
(図54C)インスリン(100nM)の非存在または存在下で、ob/obマウスの単離腓腹筋へのグルコースの取り込みを示すグラフ図である。ob/obマウスは、筋肉を摘出する前に7日間、プロパノロールの存在または非存在下、ZAGで処置された。
(図54D)インスリン(10nM)の非存在または存在下で、ob/obマウスの精巣上体脂肪細胞へのグルコース取り込みを示すグラフ図である。動物は、WATを摘出する前に7日間、表示される処置を受けた。
(図54E)プロプラノロールの存在または非存在下で7日間、PBSまたはZAGで処置されたob/obマウスにおけるTG(図54E)およびNEFA(図54F)の値を示すグラフ図である。
(図54F)同上。
(図54G)ZAGもしくはインスリンまたは両方の存在下で、ob/obマウスから得た腓腹筋(54G)およびWAT(54H)におけるGlut4の発現を示すウェスタンブロットの画像図である。対照との差は、b、p<0.01またはc、p<0.001として示されるが、ZAG単独との差は、d、p<0.05またはf、p<0.001として示される。図55Aは、ウェスタンブロットの画像図である。
(図54H)同上。
(図55)ob/obマウスをZAG(35μg、iv、日−1)で5日間処置した後のβ3−ARの発現を示す画像図である。ウェスタンブロットは、PBSまたはZAGのいずれかで処置されたob/obマウスの腓腹筋(54A)、BAT(54B)、およびWAT(54C)におけるβ3−ARの発現を示す。濃度測定分析は、3つの別個のウェスタンブロットの平均である。対照との差は、c、p<0.001として示される。
(図56A)ob/obマウスをZAG(35μg、iv、連日)で5日間処置した後の腓腹筋(56A)、WAT(56B)、および心臓(56C)におけるβ1−およびβ2−ARの発現を示す画像図である。PBS処置された動物との差は、a、p<0.05として示される。図57A、57B、57C、および57Dは、脱共役タンパク質の発現に対するZAGの効果を示す画像図である。ウェスタンブロットは、PBSまたはZAG(35μg、iv、連日)のいずれかで5日間処置した後のob/obマウスのBAT(57A)およびWAT(57B)におけるUCP1の発現、ならびにWAT(57C)におけるUCP3および腓腹筋(57D)におけるAMPKの発現を示す。濃度測定分析は、3つの別個のブロットの平均である。PBS処置された動物との差は、c、p<0.001として示される。
(図56B)同上。
(図56C)同上。
(図57A)脱共役タンパク質の発現に対するZAGの効果を示す画像図である。ウェスタンブロットは、PBSまたはZAG(35μg、iv、連日)のいずれかで5日間処置した後のob/obマウスのBAT(57A)およびWAT(57B)におけるUCP1の発現、ならびにWAT(57C)におけるUCP3および腓腹筋(57D)におけるAMPKの発現を示す。濃度測定分析は、3つの別個のブロットの平均である。PBS処置された動物との差は、c、p<0.001として示される。
(図57B)同上。
(図57C)同上。
(図57D)同上。
亜鉛−α2−糖タンパク質は高血糖を減衰させる
亜鉛−α2−糖タンパク質(ZAG)が肥満および高血糖を減衰させる能力を評価するために、ob/obマウスに投与したところ、体重減少を誘発し、体温が上昇した(エネルギー消費の増加を示唆する)。茶色脂肪組織における非共役タンパク質−1および−3の発現が増加する一方で、脂肪分解の増加を示す、グリセロールの増加にも関わらず、グルコース、トリグリセリド、および非エステル化脂肪酸の血清レベルが減少した。血漿インスリンは減少し、静脈内グルコースに対する応答が改善するとともに、脂肪細胞および骨格筋へのグルコースの取り込みが増加した。精巣上体脂肪細胞におけるホルモン感受性リパーゼの発現が増加した。タンパク質合成の増加および分解の減少に起因して、骨格筋量が増加した。これは、ZAGが高血糖の治療において有効であり得ることを示唆する。
HEK293F細胞は、発現ベクトルpcDNA3.1において、完全長ヒトZAG cDNAで形質転換され、空気中5%CO2の雰囲気下37℃で、FreeStyle培地内で維持された。採取されたZAGを培地に分泌し、最大タンパク質値(16μgmL−1)を培養の14日後に得た。ZAGを精製するために、培地(200mL)を700gで15分間遠心分離して細胞を除去し、10kDaカットオフを有するAmicon Ultra−15遠心分離フィルタを使用して、体積1mLの滅菌PBSに濃縮した。濃度(約2mgタンパク質)を、20mLの10mMトリス(pH8.8)に懸濁された2g DEAEセルロースに添加し、2時間4℃で攪拌した。DEAEセルロースはZAGに結合し、遠心分離(1500gで15分間)によって沈降させて、0.3M NaClを含有する20mL10mMのTris(pH8.8)とともに、30分間4℃で攪拌してZAGを溶出した。溶出液を洗浄し、Amicon遠心分離フィルタを使用して、滅菌PBS中体積1mLに濃縮した。精製されたZAGは、LAL Pyrogent単一試験キット(Lonza,Bucks,UK)を用いて決定されるように、内毒素を含まない。
白色脂肪細胞の単一セル懸濁液を、前述のように95%酸素:5%CO2の雰囲気下、1.5mgmL−1コラゲナーゼおよび4%ウシ血清アルブミンを含有するKrebs−Ringer生物源炭酸塩緩衝液中、37℃で2時間培養することによって、粉砕した脂肪沈着物から調製した。経時的研究の場合、脂肪細胞は、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM中、105細胞mL−1の濃度で懸濁され、大気中10%CO2の雰囲気下、37℃で維持された。プラスミド含有ヒトZAGで形質転換されたヒト293細胞を、105細胞mL−1の濃度で、FreeStyle培地に播種し、大気中5%CO2の雰囲気下、37℃で維持した。最大タンパク質値(16μgmL−1)は、14日間の培養後に得られた。次いで培地(200mL)を700gで15分間遠心分離して細胞を除去し、10kDaカットオフを有するAmicon Ultra−15遠心分離フィルタを使用して、体積1mLの滅菌PBSに濃縮した。試料(約2mg)のタンパク質濃度を測定した後、20mLの10mMトリス(pH8.8)に懸濁した2g DEAEセルロースに加え、4℃で2時間攪拌した。負に電荷されたZAGは、DEAEセルロースに結合し、遠心分離(1500gで15分間)によって沈殿させ、0.3M NaClを含有する20mLの10mMトリス(pH8.8)とともに、4℃で30分間攪拌することによって溶出した。上澄みを洗浄し、Amicon遠心分離フィルタを使用して、滅菌PBS中で体積1mLに濃縮した。
本研究では、アストン大学で維持されたコロニーからの同型肥満(ob/ob)マウスを使用した。アストンob/obマウスの起源および特徴は、以前に説明されている。雄マウス(20〜21週齢、体重90〜100g)を、22±2℃に空調管理された12時間:12時間の明暗周期の部屋において、ケージ当たり3匹に分類し、ラットおよびマウス飼育餌(Special Diet Services,Witham,UK)および水道水を不断給餌した。それらは、PBS(100μL)中のZAG(35μg)を1日2回静脈内投与によってマウスに投与し、体重および食物/水の摂取を連日監視した。対照マウスは、PBSを単独投与された。直腸体温計(RS Components,Northants,UK)を使用することによって、体温を連日測定した。すべての動物実験は、英国動物科学的処置法1986に従って行った。ZAGの投与後に悪影響は認められなかった。
体重540±82.5gの成熟雄ウィスターラット(独自のコロニーから得た1年齢)を個別に収容し、1日1回静脈注射により、PBS(100μL)中のZAG(体重100g当たり50μg)、または対照としてPBS(100μL)で処置した。食餌および水の摂取ならびに体重の両方を連日測定した。動物は、食餌(Special Diet Services,Essex,UK)および水への自由なアクセスを不断で付与した。British Home Officeによって付与された快適な条件下で動物実験を行った。10日間の処置後に、動物を絶命させて身体組成を測定した。一定体重が得られるまで、80〜90℃で7日間、動物を加熱した。次いで湿重量と乾燥重量との差から含水量を測定した。Lundholmら(14)によって記載される、クロロホルム:メタノール(1:1)、エタノール/アセトン(1:1)、およびジエチルエーテル(それぞれ120mL)の配列を使用して、乾燥屠体から脂質を抽出した。溶媒を蒸発させて脂肪を計量した。非脂肪屠体量は、屠体の初期重量と水/脂肪重量との差として計算した。
アッセイされる試料は、1mLのKrebs−Ringer重炭酸緩衝液(pH7.2)中で2時間、105〜2×105脂肪細胞で培養した。放出されたグリセロールの濃度は、Wielandの方法によって酵素的に測定した(Wieland,O.Glycerol UV method.In Methods of Enzymatic Analysis(ed.Bergmeyer,H.U.)(Academic Press,London,UK,pp 1404−1409,1974))。脂肪細胞を単独で含有する対照試料を分析して、同時グリセロール放出を測定した。活性は、放出されたグリセロールμmol/105脂肪細胞/2時間として表した。
非エステル化脂肪酸(NEFA)を、Wako−ASC−ACODキット(Wako Chemical GmbH、Neuss,Germany)を使用して測定した。トリグリセリドは、トリグリセリドキット(Sigma Chemical Co.,Poole,United Kingdom)および3−ヒドロキシブチラートを使用して、定量酵素測定キット(Sigma)によって測定した。グルコースは、グルコースアナライザを使用して測定し(Beckman,Irvine,Calif.)、グリセロールは、″Methods of Enzymatic Analysis″(Ed.Bergmeyer,H.U.)Vol.3,pp1404−1409,published by Academic Press,London(1974)に記載される、Wielandの方法を使用して酵素的に測定した。
典型的な手順において、白色脂肪細胞は、250mMスクロース、2mM エチレングリコールビス(β−アミノエチルエーテル)−N,N,N',N'(EGTA)、10mM トリス−HCl(pH7.4)中で細胞を洗浄したことを除いて、上記のとおりマウスの精巣上体脂肪パッドから単離した。脂肪細胞は、20mLの上記緩衝液中に懸濁し、少なくとも10回、Swinnyフィルタを通して吸引することによって均質化した。次いで、細胞ホモジネートを300gで5分間遠心分離し、脂肪ケーキを表面から除去して、残りのペレットおよび遊泳物を清潔な管に移した。これらを30,000gで1時間、4℃で遠心分離し、形成された膜ペレットをスクロース緩衝液(200〜400μL)中に懸濁した。血漿膜は、自己形成勾配のPERCOLL(商標)コロイドシリカ粒子上の他のオルガネラ膜から分離した。組成は、250mMスクロース、2mM EGTA、10mM トリス−HCl(pH7.4)PERCOLL(商標)、および2Mスクロース、8mM EGTA、80mMトリス−HCl(pH7.4)であり、32:7:1の比で、膜懸濁液と一緒に混合した(総容積8mL)。この混合液を10,000gで30分間、4℃で遠心分離した。勾配を0.75mL部分に分画し、コハク酸デヒドロゲナーゼ、NADH−サイトクロームc還元酵素、乳酸デヒドロゲナーゼ、および5'−ヌクレオチダーゼの存在について各部分を分析し、血漿膜分画を位置付けた。膜分画は、150mM NaCl、1mM EGTA、10mM トリス−HCl(pH7.4)中に再懸濁し、10,000g、4℃で2分間遠心分離した。このプロセスを2回繰り返した。次いで、線状された血漿膜を10mMトリス−HCl(pH7.4)、250mMスクロース、2mM EGTA、および4μMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)中、1〜2mg/mLで希釈し、液体窒素中で急速冷凍して、使用するまで−70℃で保存した。
白色脂肪細胞は、記載されるように、コラゲナーゼ消化を使用して、雄ウィスターラット(400g)の微粉砕された精巣上体脂肪組織から調製した(Beck SA,et al.Production of lipolytic and proteolytic factors by a murine tumor−producing cachexia in the host.Cancer Res 47:5919−5923,1987)。脂肪分解活性は、105−2×105脂肪細胞を2時間、1mL Krebs−Ringer重炭酸緩衝液(pH7.2)を培養することによって測定し、脂肪分解の程度は、放出されたグリセロールを測定することによって決定した(Wieland O.Glycerol UV method.Methods of Enzymatic Analysis,edited by Bergmeyer HU.Academic Press,London,pp 1404−1409,1974)。同時グリセロール放出は、脂肪細胞単独を培養することによって測定した。脂肪分解活性は、放出されたグリセロールμmol/105脂肪細胞/2時間として表した。
ゲルは、Laemmliの方法に従って調製し、一般に5%濃縮ゲルおよび15% SDS−PAGE溶解ゲル(変性もしくは還元状態)、または10% SDS−PAGE溶解ゲル(非変性もしくは非還元状態)で構成される。試料は、1〜5μg/レーンで負荷した。バンドは、クマシーブリリアントブルーR−250またはシルバーのいずれかで洗浄することによって可視化した。試料は、5分間100℃で、0.0625M トリス−HCl(pH6.8)、10%グリセロール、1% SDS、0.01%ブロモフェノールブルー、および5% 2−メルカプトエタノール中で加熱することによって、還元状態のために調製した。
単離した脂肪細胞(5×104)を、1mLのKrebs−Ringer重炭酸緩衝液(pH7.2)(KRBS)中で2回洗浄し、10分間室温で、18.5MBq 2−[1−14C]デオキシ−D−グルコースおよび非放射性2−デオキシ−D−グルコースを含有する0.5mLのKRBS中で、最終濃度0.1mMになるまでさらに培養した。取り込みは、1mLの氷冷された無グルコースKRBSを添加することによって終了させ、細胞を1mLのKRBSで3回洗浄し、0.5mL 1M NaOHの添加によって溶解して、液体シンチレーションカウントによって放射性を測定する前に、少なくとも1時間室温で放置した。
腓腹筋は、Krebs−Henseleit重炭酸緩衝液中で45分間、37℃で培養し、次いでさらに10分間、185MBq 2−[1−14C]デオキシ−D−グルコースおよび非放射性2−デオキシ−D−グルコースを含有する5mLのKrebs−Henseleit緩衝液中で、最終濃度0.1mMになるまで培養した。次いで、筋肉を除去し、0.9% NaCl中で5分間洗浄した後、0.5mL 1M NaOHに溶解し、液体シンチレーションカウントによって放射性を測定した。
ヒラメ筋は、Krebs−Henseleit重炭酸緩衝液中で45分間、37℃で培養した後、さらに10分間、185MBq 2−[1−14C]デオキシ−D−グルコースおよび非放射性2−デオキシ−D−グルコースを含有する5mLのKrebs−Henseleit緩衝液中で、最終濃度0.1mMになるまで培養した。次いで、筋肉を除去し、0.9% NaCl中で5分間洗浄した後、0.5mL 1M NaOHに溶解し、液体シンチレーションカウントによって放射性を測定した。
筋肉におけるタンパク質合成および分解を測定するための方法は、以前に説明されている(Smith,K.L.& Tisdale,M.J.Increased protein degradation and decreased protein synthesis in skeletal muscle during cancer cachexia.Br.J.Cancer 67,680−685(1993))。結紮を使用して腓腹筋を切除し、フェノールレッドを欠失するRPMI1640培地中で30分間、37℃で培養し、O2:CO2(19:1)で飽和させた後、PBSで洗浄した。L−[2,6−3H]フェニルアラニン(640MBq)を酸不溶性材料に組み込むことによって、2時間の期間を使用してタンパク質合成を測定し、筋肉を37℃でRPMI/640中、フェノールレッドの非存在下で培養し、O2:CO2(19:1)で飽和させた。次いで、筋肉を非放射性培地中で洗浄し、ブロットして、2%過塩酸中で均質化した。タンパク質合成率は、タンパク質結合放射能の量を酸可溶性放射能の量で割ることによって計算した。タンパク質分解は、5mMグルコースおよび0.5mMシクロヘキシミドを含有する、3mLの酸化Krebs−Henseleit緩衝液(pH7.4)中で2時間にわたる腓腹筋からのチロシンの放出によって測定した。
プロテアソームの「キモトリプシン様」活性は、筋管に関して以前に説明されるように蛍光発生基質N−スクシニルLys Lys Val Tyr.AMC(配列番号2)からの励起波長360nm、および放出波長460nmにおいて、7−アミド−4−メチルクマリン(AMC)の放出を測定することによって、経口分析的に測定した(Whitehouse,A.S.& Tisdale,M.J.Increased expression of the ubiquitin−proteasome pathway in murine myotubes by proteolysis−inducing factor(PIF)is associated with activation of the transcription factor NF−κB.Br.J.Cancer 89,1116−1122(2003))。腓腹筋は、20mM トリス(pH7.5)2mM ATP、5mM MgCl2、および50mM DTT中、4℃で均質化し、超音波分解して、18,000gで10分間、4℃で遠心分離して、不溶性材料をペレット化し、得られた上澄みを使用して、プロテアソーム阻害剤ラクタシスチン(10μM)の存在または非存在下で「キモトリプシン様」酵素活性を測定した。ラクタシスチン抑制性活性のみが真のプロテアソーム活性であると見なされた。カスパーゼ−3の活性は、AcAsp.Gly.Val.Asp.AMC(配列番号3)の放出によって測定し、カスパーゼ−8の活性は、特定基質Z−Ile Glu Phe Thr Asp−AFC(配列番号4)からの7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン(AFC)の放出によって、上記からの上澄み(50μgタンパク質)、およびカスパーゼ−3または−8基質(10μM)のいずれかを使用して、1時間37℃で、カスパーゼ−3(AcAspGluValAsp−CHO)(配列番号5)またはカスパーゼ−8(Ile Glu Phe Thr Asp−CHO)(配列番号6)阻害剤(100μM)の存在または非存在下で測定した。AFCに起因する蛍光の増加は、上記のとおり測定したが、AFCに起因する蛍光の増加は、励起波長400nmおよび放出波長505nmで測定した。カスパーゼ阻害剤の存在および非存在下での値の差は、活性の測定値であった。
新しく切除された腓腹筋をPBS中で洗浄し、PHOSPHOSAFE(商標)抽出試薬中で5分間、室温で溶解した後、4℃で超音波処理した。溶解物を18,000gで5分間、4℃で遠心分離することによって取り除き、サイトゾルタンパク質(5μg)の試料を12%ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上、180Vで約1時間溶解した。この後、0.45μmのニトロセルロース膜への転移が続き、次いで、トリス緩衝食塩水中の5%Marvel(pH7.5)を用いて、4℃で一晩遮断した。一次および二次抗体の両方を、抗ミオシン(1:250)を除いて、1:1000の希釈で使用した。室温で1時間培養し、ECLによって展開した。ブロットを密度計によって走査して差を定量した。
結果は、少なくとも3回の複製実験の平均±SEMとして示される。群間平均の差は、一元配置分散分析(ANOVA)に続いて、テューキー−クレーマー多重比較試験によって決定した。0.05未満のP値が有意であると見なされた。
ZAGの精製は、95%を超える純度の生成物を生じ(図1A)、免疫ブロットによってZAGとして確認された(図1B)。ZAGは、精巣上体脂肪細胞において脂肪分解を刺激したが(図1D)、脂肪分解効果は、基礎値よりは著しく上昇したが、皮下および内臓沈着物の両方から得た脂肪細胞において大幅に低減した(図1E)。任意の脂肪細胞群において、イソプレナリンとZAGとの間の脂肪分解の刺激の程度に有意な差は認められなかったが、ZAGは、モルベースでイソプレナリンよりも強力に脂肪分解を誘発した。5日間にわたるob/obマウスの体重に対するZAGの効果は、図1Fに示される。対照動物は、体重が安定したままであったが、ZAGで処置された動物は、進行性の体重減少を示し、実験の間に等しい食餌(PBS32±3.1g、ZAG30±2.5g)および水(PBS140±8.2mL、ZAG135±3.2mL)を摂取したにも関わらず、5日後、群間に3.5gの重量差が見られた。ZAG投与から4日後、0.4℃の著しい体温上昇が見られ(図1G)、基礎代謝率の増加を示す。血漿代謝産生物価の測定は、ZAG処置された動物における大社基質の利用の増加を示唆する(表1)。したがって、ZAG処置された動物において、脂肪分解の増加を示すグリセロール濃度の増加が見られたにも関わらず、血漿グルコース、トリグリセリド(TG)および非エステル化脂肪酸(NEFA)が著しく減少した。血漿インスリン値が36%減少したことは、ZAGが糖尿病状態を低減することにおいて有効であることを示唆する。様々な組織におけるZAG mRNA値は図1Cに示される。
イソプレナリンと比較して、ラット精巣上体脂肪細胞に対するヒトZAGの脂肪分解効果は、図11に示される。233〜700nMの濃度で、ZAGはグリセロール放出の用量依存的な増加をもたらしたが、抗ZAGモノクローナル抗体によって減衰され、作用の特異性を示す。ラット脂肪細胞における脂肪分解の程度は、マウスにおいて以前に報告されたものに類似していた。マウスの場合と同様に、ZAGの脂肪分解効果は、β3−アドレナリン受容体(β3−AR)拮抗薬SR59230Aによって完全に減衰され、ZAGの作用がβ3−ARによって媒介されたことを示唆する。これらの結果は、ZAGがラットにおいて脂肪減少を誘発する際に有効であり得ることを示唆する。
PBSで処置された動物との差は、a、p<0.05、b、p<0.01、またはc、p<0.001として示される。
亜鉛−α2−糖タンパク質の間隔投与
ob/obマウスにおけるZAGの長期連日投与は、体重減少の停止をもたらすことが観測された。そのようにして、3〜4日の中断後にZAGを再注入することは、継続的な体重減少および高血糖に関連する症状の改善をもたらすことがわかった。
亜鉛−α2−糖タンパク質はob/obマウスにおける筋委縮を減衰させる
この実施例は、新しく発育されたインビトロモデルを使用して、ZAGがob/obマウスの筋委縮を減衰させる機構を証明する(Russell et al,Exp.Cell Res.315,16−25,2009)。これは、高濃度のグルコース(10または25mM)に供されるマウス筋管を利用する。図18に示されるように、高グルコースは、タンパク質分解の増加を刺激し(図18A)、タンパク質合成を抑制するが(図18B)、これらの効果はいずれもZAG(25μg/mL)によって完全に減衰された。したがって、拮抗薬SR59230Aを使用して、ZAGの効果がβ3−ARによって媒介されるか否かを決定した。しかしながら、SR化合物(すなわち、SR59230A)は、β作動薬としても作動することができ、これらの実験においても同様であると思われた。したがって、10および25mMグルコースによって誘発されるタンパク質分解は、ZAGおよびSR化合物の両方によって減衰され、その組み合わせは、拮抗薬よりも付加的であった(図19)。タンパク質合成の場合(図20)、SR化合物は、ZAGと同様に好転の証拠がないように思われるが、10mMのグルコースを用いると、SR化合物はタンパク質合成の抑制の増加をもたらす。
亜鉛−α2−糖タンパク質はROS形成を減衰させる
活性酸素種(ROS)の製剤は、高い糖負荷によって誘発されるタンパク質分解において重要であることが示された。図21のデータは、ZAGが、タンパク質分解の減少に対応して、グルコースによって産生されるROSの増加を完全に減衰させることを示す(図18A)。高グルコースはまた、ob/obマウスの骨格筋において見られるように、PKRの活性(リン酸化)(図22A)、およびeIF2αの後次リン酸化(図22B)も誘発し、これもZAGによって減衰された。これらの結果は、インビトロモデルが、ZAGが分子レベルで筋肉量に影響する様子を研究に有用となることを示唆する。
亜鉛−α2−糖タンパク質はインスリン抵抗を増加させる
インスリン抵抗試験もまた、ZAGを3日間投与されたob/obマウスにおいて行った(図23)。2つの用量のインスリン(10および20U/kg)を腹腔内注射によって動物に投与し、血糖値を次の60分間に測定した。図23Aに見られるように、ZAGで処置された動物は、PBSを付与された動物よりもインスリン(10U/kg)に対する高い感受性を示した。高濃度のインスリン(20U/kg)において、この差は消失した(図23B)。20U/kg+PBSのグルコース消失曲線は、10U/kg+ZAGとほぼ同一であったが、この用量レベルで、ZAGは、インスリンの必要性を50%低減するが、これは、より多くのインスリンを付与することによって克服することができる。
抗−亜鉛−α2−糖タンパク質抗体は体重減少を低減する
図26〜29に示されるデータは、β3作動薬、BRL37344が単独で、および抗ZAG抗体と併せて、50μg/日で連日投与された研究から得た。投与から24時間以内に、抗体を投与されたマウスは、BRL37344を投与されたマウスと比較して、体重減少の低減を示した。
5日間の亜鉛−α2−糖タンパク質投与
5日間の研究を行い、ZAGを35μg/日で5日間、連日静脈内投与した。実験の終了時に、組織を除去およびブロットするか、または単離された脂肪細胞を用いて機能的アッセイを行った。図6Aに見られるように、ZAG投与は、精巣上体(ep)、皮下(sc)、および内臓(vis)脂肪におけるその発現を約2倍増加させた。ep脂肪細胞を調製し、組織培養(RPMI1640+10% FCS)中で維持したとき、培養培地にZAGが添加されなかった場合でさえも、ZAG発現がさらに3日間維持された(図6B)。さらに、ZAGで処置したマウスから得た脂肪細胞は、イソプレナリン(10μM)に対する反応の増加を示し、これもまたZAGの非存在下、組織培養中で4日間維持された(図9)。イソプレナリンに対する反応の増加は、ZAGによるHSLの発現の増加に起因し、これもまた、ZAGの非存在下で4日間、組織培養において維持された(図6C)。これらの結果は、ZAGが取り除かれ、したがって連日投与する必要がない場合に、ZAGの効果がさらに3日間維持されることを示す。実際に、上述されるように、過剰なZAGは、反応の増加よりもむしろ抵抗をもたらす可能性が高い。
亜鉛−α2−糖タンパク質の抗肥満および抗糖尿病効果におけるβ−アドレナリン受容体の役割
研究の目標は、β−アドレナリン受容体(β−AR)が、亜鉛−α2−糖タンパク質(ZAG)の抗肥満および抗糖尿病効果において役割を果たすか否かを決定することである。これは、ヒトβ1−、β2−、β3−ARで形質転換されたCHO−K1細胞、およびob/obマウスにおいて調査された。β3−ARで形質転換されたCHO−K1細胞において、サイクリックAMP産生を刺激するZAGの最低濃度は、350nMであったが、β2−ARで形質転換された細胞には、より高い濃度(580nM)が必要とされ、β1−ARで形質転換された細胞において、サイクリックAMPの増加は見られなかった。これは、β3−AR(46±4nM)およびβ2−AR(71±2nM)に結合するためのKd値と相関したが、β1−ARへの結合は見られなかった。生物学的活性を破壊するZAGの凍結−解凍は、β2−、およびβ3−ARへの結合を排除した。ZAGによるob/obマウスの処置は、腓腹筋、ならびに白色および茶色脂肪組織においてβ3−ARのタンパク質発現を増加させたが、β1−、およびβ2−ARの発現に対する効果を有しなかった。体重および尿中グルコース分泌の低減、体温の上昇、経口ブドウ糖負荷試験における最適血漿グルコースおよびインスリン値の低減、ならびに骨格筋および脂肪組織へのグルコース輸送の刺激に対するZAGの効果は、非特異的β−AR拮抗薬プロパノロールによって完全に減衰された。これらの結果は、ob/obマウスにおける体重およびインスリン感受性に対するZAGの効果が、β−3ARまたは場合によってはβ2−ARを通して呈されることを証明する。
平均体重71gの肥満(ob/ob)高血糖マウスを飼育した。これらの動物の背景は、以前に説明され(Bailey CJ,et al.Influence of genetic background and age on the expression of the obese hyperglycaemic syndrome in Aston ob/ob mice.Int J Obes 6:11−21,1982)、C57BL/6J ob/obマウスよりも重篤な形態の糖尿病を呈する。雄マウス(約20週齢)は、ケージ当たり3匹に分類され、空調管理された部屋において22±2℃で、ラットおよびマウス飼育食餌(Special Diet Services,Witham,UK)および水道水の不断給餌で維持された。ZAG(50μg、静脈内、100μL PBS中)またはPBSを、プロパノロールの存在または非存在下で(40mgkg−1、po、連日)マウスに連日投与し、体重および食餌/水の摂取、ならびに尿中グルコース分泌を決定し、直腸体温計の使用によって体温を決定した(RS Components,Northants,UK)。ブドウ糖負荷試験は、3日目に行った。グルコース(100μLの体積中1gkg−1)を、12時間断食した動物に経口投与した。グルコース投与から15、30、60、および120分後に、血液試料を尾静脈から採取し、グルコースおよびインスリンの測定に使用した。実験の最後に、動物を頸椎脱臼によって絶命させて、組織を除去し、液体窒素中で急速冷凍して、−80℃で維持した。
ヒトZAGを含有するpcDNA3.1で形質転換されたHEK293F細胞は、ネオマイシン(50μgmL−1)を含有するFreestyle培地内で、大気中5% CO2の雰囲気下で維持された。2週間の増殖後、遠心分離(700gで15分間)によって除去し、培地を10kDaカットオフM.W.を有するAmicon Ultra−15遠心分離フィルタを使用して、体積1mLの滅菌PBSに濃縮した。ZAGは、高い電気陰性度を有するため、説明されるとおり(Russell ST and Tisdale MJ,Antidiabetic properties of zinc−α2−glycoprotein in ob/ob mice.Endocrinol 151:948−957,2010)、DEAEセルロースに結合することによってZAGを精製し、0.3M NaClで溶出した。この方法によって産生されるZAGは、LAL Pyrogent 試験キット(Lonza)によって測定されるように、純度が95%を超え、内毒素を有しない。精製されたZAGは、PBS中4℃で保存した。
洗浄および乾燥した1つのヨードビーズを、PBS中でNa[125I](1mCi/100μg タンパク質)を用いて5分間培養した後、ZAG(100μg タンパク質)を添加し、さらに15分間放置した。ヨードビーズの除去によって反応を終了させる一方で、0.1M NaIで溶出されたSephadex G25を使用して、遊離Na[125I]を除去した。Mr10,000のフィルタカットオフを有するMicroconミクロ濃縮器を使用して、PBSに対して[125I]ZAGを濃縮した。[125I]ZAGの特異的活性は、8Cimgタンパク質1であった。
ヒトβ1−およびβ2−ARで形質転換されたCHO−K1細胞は、ノッティンガム大学(UK)から取得し、一方β3−ARで形質転換されたCHOK1細胞は、Astra Zeneca(Macclesfield,Cheshire,UK)から取得した。遺伝子発現は、ハイグロマイシンの管理下にあり、β−ガルレポーター構成と一緒に、G418に対する抵抗のために選択された。それらは、2mMグルタミン、ハイグロマイシンB(50mgmL−1)、G418(200mgmL−1)、および10%FCSが捕捉されたDMEM中、大気中10% CO2の雰囲気下で維持された。サイクリックAMP産生に対する作動薬の効果を決定するために、1mLの栄養培地を含有する24ウェルプレートにおいて細胞を増殖させた。図51に示される濃度でZAGまたはイソプロテレノールを細胞に添加し、培養を30分間継続した。培地を除去し、0.5mLの20mM HEPES(pH7.5)、5mM EDTAおよび0.1mM イソブチルメチルキサンチンと置換して、プレートを沸騰した湯浴上で5分間加熱し、氷で10分間冷却した。サイクリックAMPの濃度は、ELISAアッセイを用いて測定した。
3つのCHO−K1細胞におけるβ1−、β2−、およびβ3−ARに対するmRNA転写の定量化は、既に説明されている方法論に基づく(Moniotte S,et al.Real−time RT−PCR for the detection of beta−adrenoceptor messanger RNAs in small human endomyocardial biopsies.J Mol Cell Cardiol 33:2121−2133,2001)。全RNAをトリ試薬で抽出し、光度分析によって定量化して、800±34ngの全RNAを、Superscript II逆転写酵素を使用し、43℃で50分間プライマーとして2000pmolランダムヘキサマーと一緒に逆転写した。プローブ配列を選択して、マッチングプライマー対より約10℃低いTmSを得た。PCRは、製造者の指示にしたがって、Easy−A単管RT.PCRシステムを使用して行った。PCR条件は、95℃で10分間の変性、42〜65℃のアニーリングステップ、および68℃で2分間の延長ステップ、および68℃で10分間の最終延長を含んだ。40サイクルの増幅があった。β−AR mRNAの発現は、Stratagenes MxPro,QPCRソフトウェアv3.00を使用して、Δ−CT法によって測定された。
WAT、BAT,心臓、および腓腹筋を解凍し、PBS中で洗浄して、室温で5分間、Phosphasafe(商標)抽出試薬に溶解した後、4℃で超音波処理した。18,000gで5分間、4℃で遠心分離することによって形成された上澄みをウェスタンブロットに使用した。サイトゾルタンパク質(UCPの場合5μg、β−ARの場合20μg)を、180Vで約1時間、電気泳動によって12%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で溶解し、4℃で一晩、トリス緩衝食塩水(pH7.5)中の5%(w/v)非脂肪粉乳(Marvel)で遮断された0.45μmニトロセルロース膜の上に移した。一次抗体を添加する前に、0.1% Tween20緩衝食塩水中で15分間洗浄した。一次抗体および二次抗体の両方は、1:1000の希釈で使用した。室温で1時間培養し、ECLによって発育した。濃度計によってブロットを走査し、差を定量化した。
新たに単離された精巣上体脂肪細胞および腓腹筋への2−[1−14C]デオキシ−D−グルコース(2−DG)の取り込みは、以前に説明されるように測定した(Russell ST and Tisdale MJ,Antidiabetic properties of zinc−α2−glycoprotein in ob/ob mice.Endocrinol 151:948−957,2010)。
結果は、少なくとも3つの複製実験の平均±SEMとして示される。群間の平均の差は、一元配置分散分析(ANOVA)に続いて、テューキー−クレーマー多重比較試験によって決定した。0.05未満のP値が有意であると見なされた。
悪液質の処置に対する骨格筋合成の亜鉛−α2−糖タンパク質
研究の目標は、ZAGで処置されたとき、ob/obマウスにおける正味タンパク質獲得の機構を探索することである。いくつかのZAG処置実験において、ob/obマウスは、大幅に体脂肪が減少するが、同時に(相殺)量の筋肉量をタンパク質として得ることが観測される。
体重減少およびグルコース低減のための亜鉛−α2−糖タンパク質の経口投与
研究の目標は、長期にわたる脂肪減少ならびに血漿および尿中グルコース値の低下を介して、およびZAGの経口投与によって体重減少を生じる、ZAGの能力を探索することである。驚くべきことに、経口投与された組み換えヒトZAGは、組み換えヒトZAGの静脈内投与として同一の反応群を生じることができ、体内の消化空間から血漿空間に進入せずにそれを行うことができた。新規の作用機構は、消化空間に存在する組み換えヒトZAGのシグナルを形質導入するように作動し、図34および35に見られるように、血漿空間、WAT、および他の組織における内因性マウスZAGの生成を引き起こす。
亜鉛−α2−糖タンパク質の投与は、体脂肪の減少および骨格筋の筋肉量の同時獲得を達成する。
いくつかの実験において、ob/obマウスは、大幅に体脂肪が減少するが、(相殺)量の筋肉量をタンパク質として同時に獲得することが観測された。これについて探索したところ、正味タンパク質獲得は、タンパク質分解の減速およびタンパク質合成の同時増加に起因する(図30)。
静脈内投与と比較した亜鉛−α2−糖タンパク質の経口投与
研究の目標は、様々な投与経路を介したZAGの有効性を比較することである。50μgのZAGまたはPBS(対照)をマウスに経口投与した。結果は、図31、32、33(8日間の経口ZAG研究)、図36、37、40(8日間の経口ZAG+プロプラノロール研究)、および図47、48(強制経口ZAG研究)において示される。これらの反復研究で示されるように、ZAGは、予想外に、投与されたZAGの全身吸収を必要とすることなく、単にマウスの飲料水に低用量のZAGを混合することによって経口投与されるとき、体重変化をもたらすことにおいて有効であることが示された。インスリン等のタンパク質の典型的な経口用量は、同一レベルの有効性を達成するために、静脈内用量の最高10倍(またはメガ用量)を必要とする場合があり、そのような制限された有効性は、そのようなタンパク質の全身吸収を必要とする。
(1) 事実上飲料水
(2) 胃に至る消化系経路(口、咽頭、食道)をバイパスして、ZAG用量を胃内に直接強制配置する。
(3) カゼインは、ZAGとともに飲料水中に含まれた。
Claims (145)
- 亜鉛−α2−糖タンパク質(ZAG)、ZAG変異型、修飾されたZAG、またはその機能的断片を含む、製剤。
- 前記ZAGが、哺乳類由来である、請求項1に記載の製剤。
- 前記ZAGが、ヒト由来である、請求項2に記載の製剤。
- 前記ZAGが、配列番号1に記載のアミノ酸配列から成る、請求項3に記載の製剤。
- 前記ZAGが、非タンパク質ポリマーに結合している、請求項4に記載の製剤。
- 前記ZAGが、溶解性または安定性を増加させるように、シアル酸付加、PEG化、または修飾されている、請求項5に記載の製剤。
- 前記ZAGが、組み換えまたは合成である、請求項1に記載の製剤。
- 前記修飾されたZAGが、欠失、付加、または保存的置換から選択される、アミノ酸配列に対する1つまたは複数の変異を有する、野生型ZAGアミノ酸配列から成る、請求項1に記載の製剤。
- 前記ZAGが、リーダー配列および後続配列のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項1に記載の製剤。
- 前記ZAGが、グリコシル化されている、請求項5に記載の製剤。
- 前記ZAGが、翻訳後修飾の結果としてグリコシル化されている、請求項10に記載の製剤。
- 前記機能的断片が、タンパク質分解、化学分解、または折り畳みドメイン保存断片化によって生成される、請求項1に記載の製剤。
- 少なくとも5、10、25、50、100mgのZAGを含む、請求項1に記載の製剤。
- 製薬上許容される担体をさらに含む、請求項1に記載の製剤。
- β3作動薬およびβ−アドレナリン受容体(β−AR)拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項1に記載の製剤。
- 前記β−AR拮抗薬が、β2−アドレナリン受容体(β2−AR)拮抗薬、β1−アドレナリン受容体(β1−AR)拮抗薬、およびβ3−アドレナリン受容体(β3−AR)拮抗薬から成る群から選択される、請求項15に記載の製剤。
- 前記β3作動薬が、エピネフリン(アドレナリン)、ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、[(シアノ)ピンドロール]、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、3'−ヨードトリメトキノロール、3',5'−ヨードトリメトキノロール、アミベグロン(Amibegron)、ソラベグロン(Solabegron)、ネビボロール(Nebivolol)、AD−9677、AJ−9677、AZ−002、CGP−12177、CL−316243、CL−317413、BRL−37344、BRL−35135、BRL−26830、BRL−28410、BRL−33725、BRL−37344、BRL−35113、BMS−194449、BMS−196085、BMS−201620、BMS−210285、BMS−187257、BMS−187413、BMS−187413のSO3HのCONH2置換、BMS−181413のラセミ化合物、CGP−20712A、CGP−12177、CP−114271、CP−331679、CP−331684、CP−209129、FR−165914、FR−149175、ICI−118551、ICI−201651、ICI−198157、ICI−D7114、LY−377604、LY−368842、KTO−7924、LY−362884、LY−750355、LY−749372、LY−79771、LY−104119、L−771047、L−755507、L−749372、L−750355、L−760087、L−766892、L−746646、L−757793、L−770644、L−760081、L−796568、L−748328、L−748337、Ro−16−8714、Ro−40−2148、(−)−RO−363、SB−215691、SB−220648、SB−226552、SB−229432、SB−251023、SB−236923、SB−246982、SR−58894A、SR−58611、SR−58878、SR−59062、SM−11044、SM−350300、ZD−7114、ZD−2079、ZD−9969、ZM−215001、およびZM−215967から成る群から選択される、請求項15に記載の製剤。
- 前記β3−AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項16に記載の製剤。
- 前記β−AR拮抗薬が、プロプラノロール、(−)−プロプラノロール、(+)−プロプラノロール、プラクトロール、(−)−プラクトロール、(+)−プラクトロール、CGP−20712A、ICI−118551、(−)−ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項15に記載の製剤。
- インスリン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、またはその類似体から選択される、血糖降下薬をさらに含む、請求項1に記載の製剤。
- 液体、ペースト、粉末、乳剤、懸濁液、または固形の形態である、請求項1に記載の製剤。
- 噴霧剤、錠剤、凍結乾燥粉末、半固形ゲル、舌下製剤、即時融解型製剤、口腔製剤、液体製剤、トローチ剤、フィルム、咀嚼製剤、矯味製剤、または発泡製剤としての経口投与に好適な形態である、請求項1に記載の製剤。
- 噴霧剤、液体、ペースト、乳剤、懸濁液、凍結乾燥粉末、または半固形ゲルを含む、鼻腔内または肺投与に好適な形態である、請求項1に記載の製剤。
- 噴霧剤、液体、ペースト、乳剤、懸濁液、凍結乾燥粉末、クリーム、軟膏、または半固形ゲルを含む、局所投与に好適な形態である、請求項1に記載の製剤。
- 自己注射器、ポンプ圧送装置、充填済みシリンジ、および無針技術による注射に好適である、請求項1に記載の製剤。
- 前記製剤が押し出される、請求項1に記載の製剤。
- 食物繊維源をさらに含む、請求項1に記載の製剤。
- タンパク質源をさらに含む、請求項1に記載の製剤。
- 微量栄養素、栄養補助食品、栄養素、食用化合物、および香味料のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項1に記載の製剤。
- リン酸塩、トリス、アルギニン、グリシン、Tween80、スクロース、トレハロース、マンニトール、カゼインタンパク質、およびそれらの誘導体から成る群から選択される、1つまたは複数の賦形剤をさらに含む、請求項1に記載の製剤。
- 存在する場合、リン酸塩、トリス、アルギニン、およびグリシンの濃度が、約15mM〜300mMである、請求項30に記載の製剤。
- リン酸塩、トリス、アルギニン、およびグリシンの濃度が、独立して、20mM、150mM、または250mMである、請求項31に記載の製剤。
- 存在する場合、前記Tween80の濃度が、約0.01%〜0.1%である、請求項1に記載の製剤。
- 前記Tween80の濃度が、0.01%、0.05%、または0.1%である、請求項33に記載の製剤。
- 存在する場合、前記スクロース、トレハロース、およびマンニトールの濃度が、約0.1%〜5%である、請求項30に記載の製剤。
- 前記スクロース、トレハロース、およびマンニトールの濃度が、独立して、0.1%、1.0%、または5.0%である、請求項35に記載の製剤。
- 前記1つまたは複数の賦形剤が、カゼインである、請求項30に記載の製剤。
- 前記栄養補助食品が、A1およびA2βカゼインから成る群から選択される、請求項30に記載の製剤。
- 前記ZAG、ZAG変異型、修飾されたZAG、またはその機能的断片が、ポリマーとして存在する、請求項1に記載の製剤。
- 請求項1に記載の製剤を含む、食品添加物または栄養補助食品。
- 請求項1に記載の製剤と併せて、消費可能な担体を含む、食品または栄養補助食品。
- 前記消費可能な担体が、クッキー、ブラウニー、クラッカー、朝食バー、エナジーバー、シリアル、またはケーキである、請求項40に記載の食品添加物または栄養補助食品。
- 前記消費可能な担体が、飲料である、請求項40に記載の食品添加物または栄養補助食品。
- 前記消費可能な担体が、肉製品である、請求項40に記載の食品添加物または栄養補助食品。
- 前記肉製品が、培養肉である、請求項40に記載の食品添加物または栄養補助食品。
- 製剤を哺乳類対象に送達するための方法であって、請求項1〜39または1〜45のいずれか1項に記載の製剤を、前記哺乳類対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項46に記載の方法。
- 前記製剤が、静脈内、経口、頬側、舌下、鼻腔内、経皮、皮下、筋肉内、局所投与されるか、または吸入によって投与される、請求項46に記載の方法。
- 前記製剤が、少なくとも10日間連日投与される、請求項46に記載の方法。
- 前記製剤が、少なくとも21日間連日投与される、請求項46に記載の方法。
- 前記製剤が、1年を超えて連日投与される、請求項46に記載の方法。
- 前記製剤が、2年を超えて連日投与される、請求項51に記載の方法。
- 前記製剤が、1日2回投与される、請求項46に記載の方法。
- 前記製剤が、3日に1回投与される、請求項46に記載の方法。
- 前記製剤が、週1回投与される、請求項46に記載の方法。
- 前記製剤が、月1回投与される、請求項46に記載の方法。
- 前記製剤が、β3作動薬およびβ−アドレナリン受容体(β−AR)拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項46に記載の方法。
- 前記β−AR拮抗薬が、β2−アドレナリン受容体(β2−AR)拮抗薬、β1−アドレナリン受容体(β1−AR)拮抗薬、およびβ3−アドレナリン受容体(β3−AR)拮抗薬から成る群から選択される、請求項57に記載の方法。
- 前記β3作動薬が、エピネフリン(アドレナリン)、ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、[(シアノ)ピンドロール]、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、3'−ヨードトリメトキノロール、3',5'−ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、AD−9677、AJ−9677、AZ−002、CGP−12177、CL−316243、CL−317413、BRL−37344、BRL−35135、BRL−26830、BRL−28410、BRL−33725、BRL−37344、BRL−35113、BMS−194449、BMS−196085、BMS−201620、BMS−210285、BMS−187257、BMS−187413、BMS−187413のSO3HのCONH2置換、BMS−181413のラセミ化合物、CGP−20712A、CGP−12177、CP−114271、CP−331679、CP−331684、CP−209129、FR−165914、FR−149175、ICI−118551、ICI−201651、ICI−198157、ICI−D7114、LY−377604、LY−368842、KTO−7924、LY−362884、LY−750355、LY−749372、LY−79771、LY−104119、L−771047、L−755507、L−749372、L−750355、L−760087、L−766892、L−746646、L−757793、L−770644、L−760081、L−796568、L−748328、L−748337、Ro−16−8714、Ro−40−2148、(−)−RO−363、SB−215691、SB−220648、SB−226552、SB−229432、SB−251023、SB−236923、SB−246982、SR−58894A、SR−58611、SR−58878、SR−59062、SM−11044、SM−350300、ZD−7114、ZD−2079、ZD−9969、ZM−215001、およびZM−215967から成る群から選択される、請求項58に記載の方法。
- 前記β3−AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項58に記載の方法。
- 前記β−AR拮抗薬が、プロプラノロール、(−)−プロプラノロール、(+)−プロプラノロール、プラクトロール、(−)−プラクトロール、(+)−プラクトロール、CGP−20712A、ICI−118551、(−)−ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項57に記載の方法。
- 前記製剤および前記β3−AR作動薬が、同時に投与される、請求項58に記載の方法。
- 前記製剤および前記β3−AR拮抗薬が、同時に投与される、請求項58に記載の方法。
- 前記製剤が、前記β3作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項57に記載の方法。
- 前記製剤が、前記β3−ARの投与前または投与後に投与される、請求項58に記載の方法。
- 前記製剤が、インスリン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に投与される、請求項46に記載の方法。
- 前記対象が、筋委縮、筋肉減弱症、糖尿病、悪液質、筋力低下、リポジストロフィー、または肥満と関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項46に記載の方法。
- 前記対象が、インスリン抵抗、低血糖、血漿中高値の遊離脂肪酸(NEFA)、トリグリセリド、またはグルコースと関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項46に記載の方法。
- 前記対象の代謝が変調している、請求項46に記載の方法。
- 亜鉛−α2−糖タンパク質(ZAG)を哺乳類対象に送達するための方法であって、請求項1〜39または1〜45のいずれか1項に記載の製剤を、経口投与によって前記対象に送達することを含む、方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項70に記載の方法。
- 前記製剤が、少なくとも10日間連日投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記製剤が、少なくとも21日間連日投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記製剤が、1年を超えて連日投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記製剤が、2年を超えて連日投与される、請求項74に記載の方法。
- 前記製剤が、1日2回投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記製剤が、3日に1回投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記製剤が、週1回投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記製剤が、月1回投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記製剤が、β3作動薬およびβ−アドレナリン受容体(β−AR)拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記β−AR拮抗薬が、β2−アドレナリン受容体(β2−AR)拮抗薬、β1−アドレナリン受容体(β1−AR)拮抗薬、およびβ3−アドレナリン受容体(β3−AR)拮抗薬から成る群から選択される、請求項80に記載の方法。
- 前記β3作動薬が、エピネフリン(アドレナリン)、ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、[(シアノ)ピンドロール]、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、3'−ヨードトリメトキノロール、3',5'−ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、AD−9677、AJ−9677、AZ−002、CGP−12177、CL−316243、CL−317413、BRL−37344、BRL−35135、BRL−26830、BRL−28410、BRL−33725、BRL−37344、BRL−35113、BMS−194449、BMS−196085、BMS−201620、BMS−210285、BMS−187257、BMS−187413、BMS−187413のSO3HのCONH2置換、BMS−181413のラセミ化合物、CGP−20712A、CGP−12177、CP−114271、CP−331679、CP−331684、CP−209129、FR−165914、FR−149175、ICI−118551、ICI−201651、ICI−198157、ICI−D7114、LY−377604、LY−368842、KTO−7924、LY−362884、LY−750355、LY−749372、LY−79771、LY−104119、L−771047、L−755507、L−749372、L−750355、L−760087、L−766892、L−746646、L−757793、L−770644、L−760081、L−796568、L−748328、L−748337、Ro−16−8714、Ro−40−2148、(−)−RO−363、SB−215691、SB−220648、SB−226552、SB−229432、SB−251023、SB−236923、SB−246982、SR−58894A、SR−58611、SR−58878、SR−59062、SM−11044、SM−350300、ZD−7114、ZD−2079、ZD−9969、ZM−215001、およびZM−215967から成る群から選択される、請求項81に記載の方法。
- 前記β3−AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項81に記載の方法。
- 前記β−AR拮抗薬が、プロプラノロール、(−)−プロプラノロール、(+)−プロプラノロール、プラクトロール、(−)−プラクトロール、(+)−プラクトロール、CGP−20712A、ICI−118551、(−)−ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項80に記載の方法。
- 前記製剤および前記β3−AR作動薬が、同時に投与される、請求項81に記載の方法。
- 前記製剤および前記β3−AR拮抗薬が、同時に投与される、請求項81に記載の方法。
- 前記製剤が、前記β3作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項80に記載の方法。
- 前記製剤が、前記β3−ARの投与前または投与後に投与される、請求項81に記載の方法。
- 前記製剤が、インスリン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記対象が、筋委縮、筋肉減弱症、糖尿病、悪液質、筋力低下、リポジストロフィー、または肥満と関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項70に記載の方法。
- 前記対象が、インスリン抵抗、低血糖、血漿中高値の遊離脂肪酸(NEFA)、トリグリセリド、またはグルコースと関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項70に記載の方法。
- 前記対象の代謝が変調している、請求項70に記載の方法。
- 対象の内因性亜鉛−α2−糖タンパク質(ZAG)値を増加させるための方法であって、請求項1〜39または1〜45のいずれか1項に記載の前記製剤を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項93に記載の方法。
- 前記製剤が、静脈内、経口、頬側、舌下、鼻腔内、経皮、皮下、筋肉内、局所投与されるか、または吸入によって投与される、請求項93に記載の方法。
- 前記製剤が、少なくとも10日間連日投与される、請求項93に記載の方法。
- 前記製剤が、少なくとも21日間連日投与される、請求項93に記載の方法。
- 前記製剤が、1年を超えて連日投与される、請求項93に記載の方法。
- 前記製剤が、2年を超えて連日投与される、請求項98に記載の方法。
- 前記製剤が、1日2回投与される、請求項93に記載の方法。
- 前記製剤が、3日に1回投与される、請求項93に記載の方法。
- 前記製剤が、週1回投与される、請求項93に記載の方法。
- 前記製剤が、月1回投与される、請求項93に記載の方法。
- 前記製剤が、β3作動薬およびβ−アドレナリン受容体(β−AR)拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項93に記載の方法。
- 前記β−AR拮抗薬が、β2−アドレナリン受容体(β2−AR)拮抗薬、β1−アドレナリン受容体(β1−AR)拮抗薬、およびβ3−アドレナリン受容体(β3−AR)拮抗薬から成る群から選択される、請求項104に記載の方法。
- 前記β3作動薬が、エピネフリン(アドレナリン)、ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、[(シアノ)ピンドロール]、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、3'−ヨードトリメトキノロール、3',5'−ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、AD−9677、AJ−9677、AZ−002、CGP−12177、CL−316243、CL−317413、BRL−37344、BRL−35135、BRL−26830、BRL−28410、BRL−33725、BRL−37344、BRL−35113、BMS−194449、BMS−196085、BMS−201620、BMS−210285、BMS−187257、BMS−187413、BMS−187413のSO3HのCONH2置換、BMS−181413のラセミ化合物、CGP−20712A、CGP−12177、CP−114271、CP−331679、CP−331684、CP−209129、FR−165914、FR−149175、ICI−118551、ICI−201651、ICI−198157、ICI−D7114、LY−377604、LY−368842、KTO−7924、LY−362884、LY−750355、LY−749372、LY−79771、LY−104119、L−771047、L−755507、L−749372、L−750355、L−760087、L−766892、L−746646、L−757793、L−770644、L−760081、L−796568、L−748328、L−748337、Ro−16−8714、Ro−40−2148、(−)−RO−363、SB−215691、SB−220648、SB−226552、SB−229432、SB−251023、SB−236923、SB−246982、SR−58894A、SR−58611、SR−58878、SR−59062、SM−11044、SM−350300、ZD−7114、ZD−2079、ZD−9969、ZM−215001、およびZM−215967から成る群から選択される、請求項104に記載の方法。
- 前記β3−AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項105に記載の方法。
- 前記β−AR拮抗薬が、プロプラノロール、(−)−プロプラノロール、(+)−プロプラノロール、プラクトロール、(−)−プラクトロール、(+)−プラクトロール、CGP−20712A、ICI−118551、(−)−ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項105に記載の方法。
- 前記製剤および前記β3−AR作動薬が、同時に投与される、請求項104に記載の方法。
- 前記製剤および前記β3−AR拮抗薬が、同時に投与される、請求項105に記載の方法。
- 前記製剤が、前記β3作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項104に記載の方法。
- 前記製剤が、前記β3−ARの投与前または投与後に投与される、請求項105に記載の方法。
- 前記製剤が、インスリン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に投与される、請求項93に記載の方法。
- 前記対象が、筋委縮、筋肉減弱症、糖尿病、悪液質、筋力低下、リポジストロフィー、または肥満と関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項93に記載の方法。
- 前記対象が、インスリン抵抗、低血糖、血漿中高値の遊離脂肪酸(NEFA)、トリグリセリド、またはグルコースと関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項93に記載の方法。
- 前記対象の代謝が変調している、請求項93に記載の方法。
- 対象において悪液質の症状を改善する方法であって、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドの阻害剤の治療上有効な薬用量を、そのような治療を必要とする前記対象に投与することを含み、治療後に、悪液質に関連する症状の改善がある、方法。
- 前記症状の改善が、治療前の体重減少と比較して、体重減少の減少または低減を含む、請求項117に記載の方法。
- 前記阻害剤が、連日投与される、請求項117に記載の方法。
- 前記阻害剤が、1日2回投与される、請求項117に記載の方法。
- 前記阻害剤が、週1回投与される、請求項117に記載の方法。
- 前記阻害剤が、月1回投与される、請求項117に記載の方法。
- 前記阻害剤が、静脈内、皮下、舌下、鼻腔内、経口、頬側投与されるか、または吸入によって投与される、請求項117に記載の方法。
- 前記阻害剤が、β3拮抗薬、β2拮抗薬、β1拮抗薬、およびβ3−アドレナリン受容体(β3−AR)拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項117に記載の方法。
- 前記β3−AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項124に記載の方法。
- 前記抗体が、グリコシル化されている、請求項117に記載の方法。
- 前記対象が、癌、AIDS、敗血症、COPD、腎不全、関節炎、鬱血性心不全、筋ジストロフィー、糖尿病、または加齢性筋肉減弱症を有する、請求項117に記載の方法。
- 体重減少の低減をもたらすように対象を治療する方法であって、配列番号1に示される配列を有する前記ポリペプチドの阻害剤の治療上有効な薬用量を、単独で、またはβアドレナリン受容体(β−AR)拮抗薬およびβ3アドレナリン受容体(β3−AR)拮抗薬から成る群から選択される1つまたは複数の薬剤と併せて、そのような治療を必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記β3−AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項128に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、グリコシル化されている、請求項128に記載の方法。
- 哺乳類対象において、糖尿病または肥満の症状を改善する方法であって、請求項1〜39または1〜45のいずれか1項に記載の治療上有効な薬用量の製剤を、インスリン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に、そのような治療を必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象がヒトである、請求項131に記載の方法。
- 前記製剤が、静脈内、経口、頬側、舌下、鼻腔内、経皮、皮下、筋肉内、局所投与されるか、または吸入によって投与される、請求項131に記載の方法。
- 前記製剤が、β3作動薬およびβ−アドレナリン受容体(β−AR)拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項131に記載の方法。
- 前記β−AR拮抗薬が、β2−アドレナリン受容体(β2−AR)拮抗薬、β1−アドレナリン受容体(β1−AR)拮抗薬、およびβ3−アドレナリン受容体(β3−AR)拮抗薬から成る群から選択される、請求項134に記載の方法。
- 前記β3作動薬が、エピネフリン(アドレナリン)、ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、[(シアノ)ピンドロール]、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、3'−ヨードトリメトキノロール、3',5'−ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、AD−9677、AJ−9677、AZ−002、CGP−12177、CL−316243、CL−317413、BRL−37344、BRL−35135、BRL−26830、BRL−28410、BRL−33725、BRL−37344、BRL−35113、BMS−194449、BMS−196085、BMS−201620、BMS−210285、BMS−187257、BMS−187413、BMS−187413のSO3HのCONH2置換、BMS−181413のラセミ化合物、CGP−20712A、CGP−12177、CP−114271、CP−331679、CP−331684、CP−209129、FR−165914、FR−149175、ICI−118551、ICI−201651、ICI−198157、ICI−D7114、LY−377604、LY−368842、KTO−7924、LY−362884、LY−750355、LY−749372、LY−79771、LY−104119、L−771047、L−755507、L−749372、L−750355、L−760087、L−766892、L−746646、L−757793、L−770644、L−760081、L−796568、L−748328、L−748337、Ro−16−8714、Ro−40−2148、(−)−RO−363、SB−215691、SB−220648、SB−226552、SB−229432、SB−251023、SB−236923、SB−246982、SR−58894A、SR−58611、SR−58878、SR−59062、SM−11044、SM−350300、ZD−7114、ZD−2079、ZD−9969、ZM−215001、およびZM−215967から成る群から選択される、請求項134に記載の方法。
- 前記β3−AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項135に記載の方法。
- 前記β−AR拮抗薬が、プロプラノロール、(−)−プロプラノロール、(+)−プロプラノロール、プラクトロール、(−)−プラクトロール、(+)−プラクトロール、CGP−20712A、ICI−118551、(−)−ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項135に記載の方法。
- 前記製剤および前記β3−AR作動薬が同時に投与される、請求項134に記載の方法。
- 前記製剤および前記β3−AR拮抗薬が同時に投与される、請求項135に記載の方法。
- 前記製剤が、前記β3作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項134に記載の方法。
- 前記製剤が、前記β3−ARの投与前または投与後に投与される、請求項135に記載の方法。
- 哺乳類対象において、亜鉛−α2−糖タンパク質(ZAG)活性を監視する方法であって、
a)請求項1〜39または1〜45のいずれか1項に記載の製剤を、前記対象に経口投与することと、
b)ZAG活性のレベルを検出し、
それによって前記対象のZAG活性を監視することと、を含む、方法。 - 前記対象がヒトである、請求項143に記載の方法。
- ZAG活性が、体温、血糖値、尿中グルコース値、および/もしくは血漿ZAG値、またはグリセロール、脂質、トリグリセリド、および/もしくは他の血糖管理パラメータの測定を含む、ZAG活性の他の測定値から成る群から選択される1つまたは複数のパラメータの変化または絶対値を測定することによって検出される、請求項143に記載の方法。
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