CN109072303A - 用于治疗或预防1型糖尿病的抗tnf抗体、组合物、方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用抗TNF抗体的组合物和方法，所述抗体具有包含SEQ ID NO:36的重链(HC)和包含SEQ ID NO:37的轻链(LC)，用于治疗或预防I型糖尿病(T1D)。

Description

用于治疗或预防1型糖尿病的抗TNF抗体、组合物、方法和用途
技术领域
本发明涉及利用抗TNF抗体的组合物和方法，以用于治疗或预防I型糖尿病(T1D)，所述抗TNF抗体具有包含SEQ ID NO:36的重链(HC)和包含SEQ ID NO:37的轻链(LC)。
背景技术
TNFα是17kD蛋白质亚基的可溶性同源三聚体。还存在TNF的膜结合的26kD前体形式。
除单核细胞或巨噬细胞之外的细胞也产生TNFα。例如，人非单核细胞肿瘤细胞系产生TNFα，而CD4+和CD8+外周血T淋巴细胞和某些培养的T和B细胞系也产生TNFα。
TNFα引起促炎作用，从而造成组织损伤如软骨和骨退化，诱导粘附分子，诱导对血管内皮细胞的促凝血活性，增大中性粒和淋巴细胞的黏附作用，并刺激血小板活化因子从巨噬细胞、中性粒和血管内皮细胞释放。
TNFα与感染、免疫障碍、肿瘤病理学、自身免疫病理学和移植物-对抗-宿主病理学相关。TNFα与癌症和感染病理学的相关性通常与宿主的分解代谢状态有关。癌症患者受到通常与厌食症相关的重量减轻的困扰。
与癌症以及其它疾病相关的广泛消瘦被称为“恶病质”。恶病质包括响应于恶性生长的进行性重量减轻、厌食症、以及瘦体质的持续性侵害。恶病质状态引起较大的癌症发病率和死亡率。有证据显示，TNFα涉及癌症恶病质、感染病理学、以及其它分解代谢状态。
据信TNFα在革兰氏阴性脓毒症和内毒素休克(包括发烧、不适、厌食症和恶病质)中发挥中心作用。内毒素强烈激活单核细胞/巨噬细胞的产生以及TNFα和其它细胞因子的分泌。TNFα及其它单核细胞衍生的细胞因子介导对内毒素的代谢和神经激素反应。将内毒素施用于人志愿者产生具有类似流感症状的急性病，这些症状包括发烧、心跳过速、代谢率提高和应激激素的释放。循环TNFα在患有革兰氏阴性脓毒症的患者中有所增加。
因此，TNFα涉及炎性疾病、自身免疫疾病、病毒、细菌和寄生虫感染、恶性肿瘤和/或神经退行性疾病，并且是用于诸如类风湿性关节炎和克隆氏病的疾病的特异性生物疗法的有用靶。已报道开放标签试验中针对TNFα的嵌合单克隆抗体(cA2)的有益效果在于抑制炎症并在类风湿性关节炎和克隆氏病复发后成功的再治疗。还已经报道cA2在随机、双盲、安慰剂对照的试验中的有益结果是在类风湿性关节炎中抑制炎症。
其它研究人员描述了在体外具有中和活性的对重组人TNF特异的mAb。其中一些mAb用于对人TNF的表位作图并开发酶免疫测定法，并有助于纯化重组TNF。然而，这些研究因免疫原性、低特异性和/或药物不适用性而不提供产生可用于人体内诊断或治疗性用途的TNF中和抗体的基础。
已显示，TNF的中和性抗血清或mAb能在非人哺乳动物中终止实验性内毒素血症和菌血症中致命攻击后的不良生理学改变并防止死亡。这种作用已例如在啮齿类致命性试验中和灵长类病理学模型系统中得到证明。
已公开了推测的hTNF受体结合位点，并且公开了如由TNF的氨基酸11-13、37-42、49-57和155-157组成的TNFα受体结合位点。
非人哺乳动物的嵌合、多克隆(例如抗血清)和/或单克隆抗体(Mab)和片段(例如蛋白水解消化或其融合蛋白产物)是在某些情况下被研究用于试图治疗特定癌症的潜在治疗剂。然而，此类抗体或片段可在施用于人时引起免疫应答。此类免疫应答可导致免疫复合物-介导抗体或片段从循环系统中清除，并且使得重复施用不适于治疗，从而降低对患者的治疗益处并限制抗体或片段的再施用。例如，重复施用包含非人部分的抗体或片段可导致血清病和/或过敏症。为了避免这些及其它问题，已采取多种方法来降低此类抗体及其部分(包括嵌合或人源化)的免疫原性，如本领域所公知。然而，这些及其它方法仍可导致抗体或片段具有一些免疫原性、低亲和力、低亲合力，或者细胞培养物规模化产生和/或收率低的问题。因此，此类抗体或片段可能不太理想地适于制造为或用作治疗性蛋白质。
因此，需要提供克服一个或多个这些问题的抗TNF抗体或片段，以及对已知的抗体或其片段的改进。
发明内容
本发明提供了包含SEQ ID NO:1、2和3的所有重链可变CDR区和/或SEQ ID NO:4、5和6的所有轻链可变CDR区的分离的人、灵长类、啮齿类、哺乳动物的嵌合、人源化和/或CDR-移植的抗-TNF抗体，免疫球蛋白，切割产物和其它特定部分和其变体，以及抗-TNFα抗体组合物，编码或互补核酸，载体，宿主细胞，组合物，制剂，装置，转基因动物，转基因植物，以及制备和使用它们的方法，如与本领域已知的那些相结合的本文所述和所实现的。
本发明还提供了如本文所述的至少一种分离的抗TNF抗体，该抗体包含SEQ IDNO:1、2和3的所有重链可变CDR区和/或SEQ ID NO:4、5和6的所有轻链可变CDR区。根据本发明的抗体包括任何这样的包含蛋白质或肽的分子，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于至少一个重链或轻链的互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区、或它们的任何可整合进包含SEQ ID NO:1、2和3的所有重链可变CDR区和/或SEQ ID NO:4、5和6的所有轻链可变CDR区的本发明抗体中的部分。本发明的抗体可包括或来源于任何哺乳动物，例如但不限于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿类动物、灵长类动物或它们的任何组合等等。
在一个方面，本发明提供了包含编码特异性抗TNF抗体的多核苷酸、与该多核苷酸互补或杂交的分离的核酸分子，其包含至少一种特定的序列、结构域、部分或其变体。本发明还提供了包含所述抗TNF抗体核酸分子的重组载体，包含此类核酸和/或重组载体的宿主细胞，以及制备和/或使用此类抗体核酸、载体和/或宿主细胞的方法。
本发明的至少一种抗体结合至少一种特定表位，该表位对至少一种TNF蛋白质、亚基、片段、部分或它们的任何组合是特异性的。所述至少一个表位可包含至少一个包含所述蛋白质的至少一个部分的抗体结合区域，所述表位优选由所述蛋白质的至少一个部分(例如但不限于，所述蛋白质的至少一个功能性结构域、胞外结构域、可溶性结构域、亲水性结构域、外部结构域或细胞质结构域，或它们的任何部分)的至少1-5个氨基酸构成。
所述至少一种抗体可任选包含至少一个互补性决定区(CDR)(例如，重链或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3)的至少一个特定部分，和/或至少一个恒定或可变构架区或其任何部分。所述至少一种抗体氨基酸序列可进一步任选包含如本文所述或本领域已知的至少一个特定置换、插入或缺失。
本发明还提供如本文所述的至少一种分离的抗TNF抗体，其中抗体具有至少一种活性，例如但不限于在小鼠模型中抑制TNF-诱导的细胞粘附分子、抑制TNF结合受体、关节炎指数改善(参见例如实施例3-7)。因此可以根据已知方法针对相应活性筛选抗TNF抗体，例如但不限于，对TNF蛋白的至少一种生物活性。
本发明进一步提供至少一种针对本发明的至少一种TNF抗体的TNF抗独特型抗体。抗独特型抗体包括任何这样的包含蛋白质或肽的分子，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区或它们的任何可整合进本发明的抗体中的部分。本发明的抗体可包括或来源于任何哺乳动物，例如但不限于，人、小鼠、兔、大鼠、啮齿类动物、灵长类动物等。
在一个方面，本发明提供包含编码至少一种TNF抗独特型抗体(包括其至少一个特定序列、结构域、部分或变体)的多核苷酸、与该多核苷酸互补或杂交的分离的核酸分子。本发明进一步提供包含所述TNF抗独特型抗体编码核酸分子的重组载体、包含此类核酸和/或重组载体的宿主细胞以及制备和/或使用此类抗独特型抗体核酸、载体和/或宿主细胞的方法。
本发明还提供了至少一种用于在宿主细胞中表达至少一种抗TNF抗体或TNF抗独特型抗体的方法，其包括如本文所述在其中至少一种抗TNF抗体以可检测和/或可回收的量表达的条件下培养宿主细胞。
本发明还提供至少一种组合物，其包含(a)如本文所述的分离的抗TNF抗体编码核酸和/或抗体；以及(b)合适的载体或稀释剂。根据已知载体或稀释剂，载体或稀释剂可任选为可药用的。该组合物可任选进一步包含至少一种另外的化合物、蛋白质或组合物。
本发明还提供至少一种抗TNF抗体的方法或组合物，其用于在细胞、组织、器官、动物或患者中和/或在如本领域所知和/或如本文所述的关联状况发展之前、之后或期间施用治疗有效量，以调节或治疗至少一种TNF相关病症。
本发明还提供了至少一种递送治疗或预防有效量的至少一种根据本发明的抗TNF抗体的组合物、装置和/或方法。
本发明进一步提供至少一种抗TNF抗体的方法或组合物，其用于在细胞、组织、器官、动物或患者中和/或在如本领域所知和/或如本文所述的关联状况发展之前、之后或期间诊断至少一种TNF相关病症。
本发明还提供至少一种递送至少一种根据本发明的抗TNF抗体的组合物、装置和/或方法，以进行诊断。
附图说明
图1显示示出TNV mAb在杂交瘤细胞上清液中抑制TNFα结合重组TNF受体的能力的测定的图形表示。将各种量的包含已知量TNV mAb的杂交瘤细胞上清液与固定浓度(5ng/mL)的125I-标签的TNFα预温育。将混合物转移至预先涂布有p55-sf2，即重组TNF受体/IgG融合蛋白的96-孔镜板。在洗掉未结合的物质之后，测定在mAb存在下结合p55受体的TNFα的量，并使用γ计数器进行计数。虽然这些实验中测试了八种TNV mAb样品，为简明起见，此处并未示出由DNA序列分析所示的与其它TNV mAb中的一者相同的三种mAb(参见5.2.2部分)。一式两份测试每个样品。显示的结果为两个独立实验的代表。
图2A-B示出TNV mAb重链可变区的DNA序列。所示的种系基因是DP-46基因。“TNV”指出所示的序列是TNV14、TNV15、TNV148和TNV196的序列。TNV序列中的前三个核苷酸定义翻译起始Met密码子。TNV mAb基因序列中的点指示核苷酸与种系序列中的相同。TNV序列的前19个核苷酸(下划线)对应用于PCR-扩增可变区的寡核苷酸。对于种系基因仅示出成熟mAb起始的氨基酸翻译(单字母缩写)。种系氨基酸翻译中的三个CDR结构域以粗体并加下划线标记。行标签的TNV148(B)指示所示的序列涉及TNV148和TNV148B两者。种系DNA序列(CDR3)中的空缺归因于种系基因中未知或不存在的序列。TNV mAb重链使用J6连接区。
图3示出TNV mAb轻链可变区的DNA序列。所示种系基因是人k种系可变区基因的Vg/38K家族的代表性成员。TNV mAb基因序列中的点指示核苷酸与种系序列中的相同。TNV序列的前16个核苷酸(下划线)对应用于PCR-扩增可变区的寡核苷酸。对于种系基因仅示出成熟mAb的氨基酸翻译(单字母缩写)。种系氨基酸翻译中的三个CDR结构域以粗体并加下划线标记。行标签的TNV148(B)指示所示的序列涉及TNV148和TNV148B两者。种系DNA序列(CDR3)中的空缺归因于种系基因中未知或不存在的序列。TNV mAb轻链使用J3连接序列。
图4示出TNV mAb重链可变区的推导氨基酸序列。所示氨基酸序列(单字母缩写)从未克隆PCR产物和克隆PCR产物两者测定的DNA序列推导出。氨基序列示出被划分为分泌信号序列(信号)、框架(FW)、以及互补决定区(CDR)结构域。对于各个结构域，顶行显示DP-46种系基因的氨基酸序列。点指示TNV mAb中的氨基酸与种系基因相同。TNV148(B)指示所示的序列涉及TNV148和TNV148B两者。除非示出不同的序列，“TNV”指示所示序列涉及所有的TNV mAb。种系序列(CDR3)中的短划线指示序列在种系基因中未知或不存在。
图5示出TNV mAb轻链可变区的推导氨基酸序列。所示氨基酸序列(单字母缩写)从未克隆PCR产物和克隆PCR产物两者测定的DNA序列推导出。氨基序列示出被划分为分泌信号序列(信号)、框架(FW)、以及互补决定区(CDR)结构域。对于各个结构域，顶行显示Vg/38K-型轻链种系基因的氨基酸序列。点指示TNV mAb中的氨基酸与种系基因相同。TNV148(B)指示所示的序列涉及TNV148和TNV148B两者。“所有”指示所示序列涉及TNV14、TNV15、TNV148、TNV148B和TNV186。
图6示出用于制备表达rTNV148B的C466细胞的重链和轻链表达质粒的示意图。p1783是重链质粒并且p1776是轻链质粒。rTNV148B可变区和恒定区编码结构域示为黑框。J-C内含子中的免疫球蛋白增强子示为灰框。示出了相关限制性位点。质粒被示出定向成使得Ab基因的转录以顺时针方向进行。质粒p1783的长度为19.53kb，而质粒p1776的长度为15.06kb。这两种质粒的完整核苷酸序列是已知的。可通过替换BsiWI/BstBI限制性片段，将p1783的可变区编码序列容易地用另一个重链可变区序列替换。可通过替换SalI/AflII限制性片段，将p1776的可变区编码序列用另一个可变区序列替换。
图7示出五种产rTNV148B细胞系的生长曲线分析的图形表示。通过将细胞接种到T75烧瓶的I5Q+MHX培养基中以使30mL体积中的活细胞密度为1.0×105个细胞/mL，第0天开始培养。因为进行转染和亚克隆，用于这些研究的细胞培养物在连续培养当中。在随后几天，使T烧瓶中的细胞完全重悬，并移除0.3mL等分试样的培养物。当细胞计数下降到低于1.5×105个细胞/mL时，终止生长曲线研究。通过台盼蓝排斥法测定等分试样中的活细胞数，并且所储存的等分试样的其余部分用于随后mAb浓度测定。同时在所有样品等分试样上对人IgG实施ELISA。
图8示出在不同浓度MHX选择物存在下细胞生长速率比较的图形表示。使细胞亚克隆C466A和C466B解冻到无MHX培养基(IMDM，5％FBS，2mM谷氨酰胺)中并再培养两天。然后将这两种细胞培养物分成不含MHX、含有0.2X MHX、或1X MHX的三种培养物。一天以后，将新鲜的T75烧瓶用培养物以1×105个细胞/mL的起始密度接种，并且在一周内每隔24小时对细胞进行计数。前5天期间的倍增时间使用在SOP PD32.025中的式计算并且示于条柱上方。
图9示出两种产rTNV148B细胞系的mAb产量随时间稳定性的图形表示。因进行转染和亚克隆处于连续培养当中的细胞亚克隆用于在24孔培养皿中开始长期的连续培养。在具有或不具有MHX选择物情况下，将细胞在I5Q培养基中培养。通过每4至6天分传培养物使细胞连续传代，以维持新的活培养物，同时允许先前培养物用尽。在培养物用尽之后不久收集等分试样的用过的细胞上清液并且储存直到测定mAb浓度。同时在所有样品等分试样上对人IgG实施ELISA。
图10示出相比于实施例4的对照，关节炎小鼠模型小鼠Tg 197响应于本发明抗TNF抗体的重量改变。在大约4周岁，基于性别和体重将Tg197研究小鼠分配至9个治疗组之一，并且用单次腹膜内推注剂量的Dulbecco PBS(D-PBS)或本发明抗TNF抗体(TNV14、TNV148或TNV196)以1mg/kg或10mg/kg进行治疗。当重量分析为相对给药前的改变时，用10mg/kg cA2治疗的动物在整个研究中始终示出比经D-PBS治疗的动物更高的重量增加。该重量增加在3-7周是显著的。用10mg/kg TNV148治疗的动物在研究第7周也实现显著的重量增加。
图11A-C表示基于如实施例4所示的关节炎指数的疾病严重程度进展。经10mg/kgcA2治疗的组的关节炎指数在第3周开始低于D-PBS对照组，并在研究的剩余阶段保持(周7)。当相比于D-PBS治疗的组时，用1mg/kg TNV14治疗的动物和用1mg/kg cA2治疗的动物在3周后并未示出AI有显著下降。当各自相比于其它类似剂量时(10mg/kg cA2相比于10mg/kgTNV14、148和196)，在10mg/kg治疗组之间不存在显著的差异。当对1mg/kg治疗组进行比较时，1mg/kg TNV148在第3、4和7周示出比1mg/kg cA2显著更低的AI。1mg/kg TNV148也在第3周和第4周显著低于1mg/kg TNV14治疗的组。虽然TNV196示出AI在多至研究第6周有显著下降(当相比于D-PBS治疗的组时)，TNV148是研究结束时仍然显著的唯一的1mg/kg治疗。
图12示出相比于实施例5的对照，关节炎小鼠模型小鼠Tg 197响应于本发明抗TNF抗体的重量改变。在大约4周岁，基于体重将Tg197研究小鼠分配至8个治疗组之一，并用腹膜内推注剂量的对照制品(D-PBS)或抗体(TNV14，TNV148)以3mg/kg(第0周)治疗。在第1、2、3和4周，在所有动物中重复进行注射。对1-6组评价测试制品功效。在第2、3和4周，对获自7和8组动物的血清样品评价TNV14或TNV148的免疫应答诱导和药代动力学清除率。
图13A-C是表示基于关节炎指数的实施例5中疾病严重程度进展的图表。经10mg/kg cA2治疗的组的关节炎指数在第2周开始显著低于D-PBS对照组，并在研究的剩余阶段保持(周5)。当相比于d-PBS对照组时，用1mg/kg或3mg/kg cA2治疗的动物和用3mg/kg TNV14治疗的动物在整个研究的任何时间均无法实现AI的任何显著下降。当相比于经d-PBS治疗的组时，用3mg/kg TNV148治疗的动物示出在第3周开始显著下降并且持续至第5周。当相比于两种较低剂量(1mg/kg和3mg/kg)的cA2时，经10mg/kg cA2治疗的动物示出在研究第4周和第5周AI有显著下降，并且在第3-5周也显著低于经TNV14治疗的动物。尽管似乎在任何3mg/kg治疗组之间无显著的差异，但经3mg/kg TNV14治疗的动物的AI在某些时间点却比10mg/kg显著更高，而经TNV148治疗的动物并未显著不同于经10mg/kg cA2治疗的动物。
图14示出相比于实施例6的对照，关节炎小鼠模型小鼠Tg 197响应于本发明抗TNF抗体的重量改变。在大约4周岁，基于性别和体重将Tg197研究小鼠分配至6个治疗组之一，并且用单次腹膜内推注剂量的抗体(cA2或TNV148)以3mg/kg或5mg/kg进行治疗。该研究利用D-PBS和10mg/kg cA2对照组。
图15表示基于如实施例6所示的关节炎指数的疾病严重程度的进展。所有治疗组在较早时间点示出一些保护，并且5mg/kg cA2和5mg/kg TNV148示出第1-3周AI有显著下降，并且所有治疗组示出在第2周显著下降。在后来的研究中，用5mg/kg cA2治疗的动物示出一些保护，在第4、6和7周有显著下降。较低剂量(3mg/kg)的cA2和TNV148均示出在第6周显著下降，并且所有治疗组示出在第7周显著下降。没有一个治疗组能够在研究结束时(周8)保持显著的下降。在任何时间点任何治疗组(排除盐水对照组)之间不存在显著的差异。
图16示出相比于实施例7的对照，关节炎小鼠模型小鼠Tg 197响应于本发明抗TNF抗体的重量改变。为了比较单一腹膜内剂量的TNV148(来源于杂交瘤细胞)和rTNV148B(来源于转染细胞)的功效。在大约4周岁，基于性别和体重将Tg197研究小鼠分配至9个治疗组之一，并用单次腹膜内推注剂量的Dulbecco PBS(D-PBS)或抗体(TNV148，rTNV148B)以1mg/kg进行治疗。
图17表示基于如实施例7所示的关节炎指数的疾病严重程度的进展。经10mg/kgcA2治疗的组的关节炎指数在第4周开始低于D-PBS对照组，并在研究的剩余阶段保持(周8)。经TNV148治疗的组和经1mg/kg cA2治疗的组均示出在第4周AI有显著下降。虽然先前研究(P-099-017)示出TNV148在单次1mg/kg腹膜内推注后稍微更有效地降低关节炎指数，但该研究示出两种形式的TNV抗体治疗的组的AI稍微更高。虽然当相比于10mg/kg cA2组时，在第7和8周(除第6周之外)经1mg/kg cA2治疗的组并未显著增大并且经TNV148治疗的组显著更高，但在研究的任何点在1mg/kg cA2、1mg/kg TNV148和1mg/kg TNV148B之间不存在AI的显著差异。
图18示出用于研究CNTO148DML2001的研究方案。
图19示出在6-21岁虚拟患者中各种给药方案(不具有MTX)至第24周的模拟戈利木单抗浓度(中值和95％预测区间)。小组A：T1D(红色)对JIA(蓝色)，以及小组B：T1D(红色)对pedUC(绿色)。
图20示出在左侧小组的诱导期(第1月)和右侧小组的维持期(至第6月)下游离TNFα抑制的模拟时程。
图21示出Ultrasafe的特征部。
图22示出VarioJectTM特征部的例示。
图23示出用VarioJectTM装置施用的步骤。
图24示出所提出的VarioJectTM装置的设计修改形式。
具体实施方式
本发明提供了包含SEQ ID NO:1、2和3的所有重链可变CDR区和/或SEQ ID NO:4、5和6的所有轻链可变CDR区的分离的重组和/或合成抗TNF人、灵长类、啮齿类、哺乳动物的嵌合、人源化或CDR-移植的抗体及其TNF抗独特型抗体，以及组合物和包含编码至少一种抗TNF抗体或抗独特型抗体的至少一种多核苷酸的编码核酸分子。本发明还包括但不限于，制备和使用此类核酸和抗体及抗独特型抗体的方法，包括诊断和治疗组合物、方法和装置。
本文所用的“抗肿瘤坏死因子α抗体”、“抗TNF抗体”“抗TNF抗体部分”或“抗TNF抗体片段”和/或“抗-TNF抗体变体”等包括任何这样的含蛋白质或肽的分子，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于，重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区或它们的任何部分，或TNF受体或结合蛋白的至少一个可整合进本发明抗体中的部分。此类抗体还任选影响特定配体，例如但不限于其中此类抗体体外、原位和/或体内调节、减少、增加、拮抗、激动、缓和、减轻、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种TNF活性或结合，或TNF受体活性或结合。作为非限制性示例，本发明的合适的抗TNF抗体、特定部分或变体可以结合至少一种TNF或其特定部分、变体或结构域。合适的抗TNF抗体、特定部分或变体还可任选影响至少一种TNF活性或功能，例如但不限于RNA、DNA或蛋白质合成、TNF释放、TNF受体信号传导、膜TNF切割、TNF活性、TNF产生和/或合成。术语“抗体”还旨在涵盖抗体、其消化片段、特定部分或变体，包括抗体模拟物或包含模拟抗体或其特定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分，包括单链抗体及其片段。功能片段包括结合哺乳动物TNF的抗原结合片段。例如，本发明涵盖能够结合TNF或其部分的抗体片段，包括但不限于，Fab片段(如通过木瓜蛋白酶消化得到)、Fab’片段(如通过胃蛋白酶消化和部分还原得到)和F(ab’)2片段(如通过胃蛋白酶消化得到)、facb片段(如通过纤溶酶消化得到)、pFc’片段(如通过胃蛋白酶或纤溶酶消化得到)、Fd片段(如通过胃蛋白酶消化、部分还原以及重聚集得到)、Fv或scFv片段(如通过分子生物学技术得到)(参见例如Colligan，Immunology，同上)。
此类片段可通过如本领域已知和/或如本文所述的酶促切割、合成或重组技术来产生。也可使用抗体基因以不同截短形式产生抗体，该基因中一个或多个终止密码子已被引入天然终止位点的上游。例如，可以将编码F(ab')2重链部分的组合基因设计成包括编码重链的CH1结构域和/或铰链区的DNA序列。抗体的各个部分可通过常规技术用化学方法连接在一起，或可使用遗传工程技术制备为连续蛋白质。
本文所用的术语“人抗体”指其中基本上蛋白质的每个部分(如CDR、构架区、CL结构域、CH结构域(如CH1、CH2、CH3)、铰链区(VL、VH))在人中基本上是非免疫原性的，仅具有小的序列改变或变异。类似地，指明属灵长类(猴、狒狒、黑猩猩等)、啮齿类(小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠等)和其它哺乳动物的抗体表示这些种、亚属、属、亚科、科的特异抗体。此外，嵌合抗体包括上述抗体的任何组合。这些改变或变异任选且优选相对于未经修饰的抗体而言保持或减少在人或其它物种中的免疫原性。因此，人抗体不同于嵌合抗体或人源化抗体。应当指出的是，人抗体可由能够表达功能性重排的人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生。此外，当人抗体是单链抗体时，它可包含在天然人抗体中不存在的连接肽。例如，Fv可包含连接重链可变区和轻链可变区的连接肽，例如2至约8个甘氨酸或其它氨基酸残基。此类连接肽被认为是人源的。
还可以使用双特异性抗体、异种特异性抗体、异种缀合抗体或类似抗体，它们是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆的、优选人或人源化的抗体。在本情况中，其中一种结合特异性为针对至少一种TNF蛋白的，另一种结合特异性针对任何其它抗原。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。通常，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生可能的10种不同抗体分子的混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤进行)相当繁琐，并且产物得率低。类似方法例如公开于：WO 93/08829、美国专利号6210668、6193967、6132992、6106833、6060285、6037453、6010902、5989530、5959084、5959083、5932448、5833985、5821333、5807706、5643759、5601819、5582996、5496549、4676980、WO 91/00360、WO 92/00373、EP 03089、Traunecker等人，EMBO J.10:3655(1991)、Suresh等人，Methods in Enzymology 121:210(1986)，其各自全文以引用方式并入本文。
可用于本发明的方法和组合物中的抗TNF抗体(也称作TNF抗体)可任选特征在于与TNF高亲和力结合以及任选且优选具有低毒性。具体地讲，本发明的抗体、特定片段或变体(其中各个组分，例如可变区、恒定区和构架区单独和/或共同地任选并优选具有低免疫原性)可用于本发明中。可用于本发明的抗体任选特征在于它们能长期用于治疗患者，可测量地减轻症状并具有低毒性和/或可接受的毒性。低的或可接受的免疫原性和/或高亲和力以及其它合适的特性，可有助于实现治疗结果。“低免疫原性”在本文中定义为在低于约75％，或优选低于约50％的受治疗的患者中产生显著的HAHA、HACA或HAMA应答，和/或在受治疗的患者中引起低滴度(以双抗原酶免疫测定法测量小于约300，优选小于约100)(Elliott等人，Lancet 344:1125-1127(1994)，其全文以引用方式并入本文)。
实用性：本发明的分离核酸可用于产生至少一种抗TNF抗体或其特定变体，其可以用于在细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人)中测量或实现，以诊断、监控、调节、治疗、减轻、帮助预防至少一种TNF病症的发生或减轻其症状，所述TNF病症选自但不限于免疫障碍或疾病、心血管障碍或疾病、感染性、恶性和/或神经性障碍或疾病中的至少一者。
这种方法可包括向需要对症状、效果或机制进行这种调节、治疗、减轻、预防或减少的细胞、组织、器官、动物或患者施用有效量的含有至少一种抗TNF抗体的组合物或药物组合物。该有效量可包括每单次施用(如快速浓注)、多次施用或连续施用约0.001至500mg/kg的量，或每单次施用、多次施用或连续施用实现0.01-5000g/mL的血清浓度，或其中的任何有效范围或值，该有效量可通过本文所描述的或相关领域中已知的方法来完成和测定。引用：本文引用的所有出版物或专利都以引用方式全文并入本文中，因为它们显示了本发明时的技术发展水平，和/或提供了本发明的描述和实现。出版物是指任何科学出版物或专利公布、或可以任何媒体格式获得的任何其它信息，该媒体格式包括所有记录格式、电子格式或印刷格式。以下参考文献全文以引用方式并入本文：Ausubel等人编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons,Inc.，NY，NY(1987-2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow和Lane，antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan等人编辑，Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons,Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，NY，(1997-2001)。
本发明的抗体：包含SEQ ID NO:1、2和3的所有重链可变CDR区和/或SEQ ID NO:4、5和6的所有轻链可变CDR区的本发明至少一种抗TNF抗体可任选地由如本领域所公知的细胞系、混合细胞系、无限增殖化细胞或无限增殖化细胞的克隆性群体产生。参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons,Inc.，NY，NY(1987-2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow和Lane，antibodies,a Laboratory Manual,ColdSpring Harbor，NY(1989)；Colligan等人编辑，Current Protocols in Immunology，JohnWiley&Sons,Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols in ProteinScience，John Wiley&Sons，NY，NY，(1997-2001)，其各自全文以引用方式并入本文。
可针对合适的免疫原性抗原产生对人TNF或其片段特异的人抗体，所述免疫原性抗原为例如分离的和/或TNF或其部分(包括合成分子，例如合成肽)。可以类似地产生其它特异或一般性的哺乳动物抗体。使用任何合适的技术可进行免疫原性抗原的制备和单克隆抗体的产生。
在一种方法中，杂交瘤是通过合适的无限增殖细胞系(如骨髓瘤细胞系，例如但不限于，Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、>243、P3X63Ag8.653、Sp2SA3、Sp2MAI、Sp2SS1、Sp2SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A等，或异型骨髓瘤(heteromyloma)，其融合产物，或由其衍生的任何细胞或融合细胞，或本领域已知的任何其它合适的细胞系。参见，例如www.atcc.org，www.lifetech.com.等)与产抗体细胞融合来产生，所述产抗体细胞为诸如但不限于分离的或克隆的脾细胞、外周血细胞、淋巴细胞、扁桃体细胞或其它免疫细胞或包含B细胞的细胞，或任何这样的其它细胞，它们将重链或轻链恒定序列或可变序列或构架序列或CDR序列表达为内源的或异源的核酸、为重组或内源的、病毒、细菌、藻类、原核生物、两栖动物、昆虫、爬行动物、鱼、哺乳动物、啮齿类动物、马、绵羊、山羊、羊、灵长类动物、真核生物、基因组DNA、cDNA、rDNA、线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、单链、双链或三链的、杂交的等或它们的任何组合。参见，例如以引用方式全文并入本文中的Ausubel，同上，和Colligan，Immunology，同上，第2章。
产抗体细胞还可从人或已用所关注的抗原免疫过的其它合适动物的外周血，或优选脾或淋巴结获得。任何其它合适的宿主细胞也可用于表达编码本发明的抗体、其特定片段或变体的异源或内源核酸。融合细胞(杂交瘤)或重组细胞可使用选择性培养条件或其它合适的已知方法进行分离，并且可通过有限稀释或细胞分选或其它已知方法进行克隆。产生具有所需特异性的抗体的细胞可通过合适的测定法(例如ELISA)进行选择。
可使用产生或分离所需特异性抗体的其它合适的方法，包括但不限于从肽或蛋白质文库(例如但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA等展示文库；例如，可购自：Cambridge antibody Technologies，Cambridgeshire，UK；MorphoSys，Martinsreid/Planegg，DE；Biovation，Aberdeen，Scotland，UK；BioInvent，Lund，Sweden；Dyax Corp.,Enzon,Affymax/Biosite；Xoma，Berkeley，CA；Ixsys.参见例如EP 368,684、PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755；PCT/GB92/002240；PCT/GB92/00883；PCT/GB93/00605；US 08/350260(5/12/94)；PCT/GB94/01422；PCT/GB94/02662；PCT/GB97/01835；(CAT/MRC)；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；PCT/US94/1234；WO92/18619；WO96/07754；(Scripps)；EP614 989(MorphoSys)；WO95/16027(BioInvent)；WO88/06630；WO90/3809(Dyax)；US 4,704,692(Enzon)；PCT/US91/02989(Affymax)；WO89/06283；EP 371 998；EP 550 400；(Xoma)；EP229 046；PCT/US91/07149(Ixsys)；或随机产生的肽或蛋白质——US 5723323、5763192、5814476、5817483、5824514、5976862、WO 86/05803、EP 590 689(Ixsys，现为AppliedMolecular Evolution(AME)，各自全文以引用方式并入本文)选择重组抗体的方法，或依赖于对能产生全套人抗体的转基因动物(例如SCID小鼠，Nguyen等人，Microbiol.Immunol.，41:901-907(1997)；Sandhu等人，Crit.Rev.Biotechnol.16:95-118(1996)；Eren等人，Immunol.93:154-161(1998)，将它们以及相关专利和申请全文各自以引用的方式并入)进行免疫的方法，如本领域所知和/或如本文所描述的。此类技术包括但不限于核糖体展示(Hanes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94:4937-4942(1997年5月)；Hanes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95:14130-14135(1998年11月))；单细胞抗体生产技术(例如选择的淋巴细胞抗体法(“SLAM”)(美国专利号5,627,052，Wen等人，J.Immunol.17:887-892(1987)；Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843-7848(1996))；凝胶微滴和流式细胞术(Powell等人，Biotechnol.8:333-337(1990)；One Cell Systems，Cambridge，MA；Gray等人，J.Imm.Meth.182:155-163(1995)；Kenny等人，Bio/Technol.13:787-790(1995))；B细胞选择(Steenbakkers等人，Molec.Biol.Reports 19:125-134(1994)；Jonak等人，Progress Biotech，第5卷，In Vitro Immunization in Hybridoma Technology，Borrebaeck编辑，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam，Netherlands(1988))。
还可使用用于将非人或人抗体进行工程化或人源化的方法，这些方法是本领域所熟知的。一般来讲，人源化或工程化的抗体具有一个或多个来自非人来源的氨基酸残基，所述非人来源是例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其它哺乳动物。这些人氨基酸残基通常称为“输入”残基，它们一般取自已知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其它结构域。公开了已知的人Ig序列，例如见www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；www.abcam.com/；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；www.public.iastate.edu/～pedro/research_tools.html；www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm；www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；www.path.cam.ac.uk/～mrc7/mikeimages.html；www.antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/；pathbox.wustl.edu/～hcenter/index.html；www.biotech.ufl.edu/～hcl/；www.pebio.com/pa/340913/340913.html；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；www.m.ehime-u.ac.jp/～yasuhito/Elisa.html；www.biodesign.com/table.asp；www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html；www.biotech.ufl.edu/～fccl/protocol.html；www.isac-net.org/sites_geo.html；aximt1.imt.uni-marburg.de/～rek/AEPStart.html；baserv.uci.kun.nl/～jraats/links1.html；www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html；www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr:8104/；www.biochem.ucl.ac.uk/～martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；www.unizh.ch/～honegger/AHOseminar/Slide01.html；www.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s/；www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；www.path.cam.ac.uk/～mrc7/humanisation/TAHHP.html；www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.cryst.bioc.cam.ac.uk/～fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；www.jerini.de/fr_products.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)，以上网址公开内容和文献全文均以引用方式并入本文中。
如本领域已知的，此类输入序列可用于减少免疫原性，或减少、增强或修饰结合性、亲和力、结合率、解离率、亲和力、特异性、半衰期或任何其它合适的特征。一般来讲，保留部分或所有非人或人CDR序列，而可变区和恒定区的非人序列用人或其它氨基酸置换。抗体也可任选地人源化，以保留其对抗原的高亲和性和其它有利的生物学特性。为了达到这个目标，人源化抗体还可以任选使用亲本和人源化序列的三维模型通过亲本序列和各种概念上的人源化产物的分析过程进行制备。三维免疫球蛋白模型通常是可用的并且是为本领域的技术人员所熟悉的。举例说明且显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可用的。这些展示的检测使得能分析在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中残基的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可以从共有和输入序列中选择和组合FR残基，从而能实现所需抗体特征，例如对靶抗原的增加的亲和力。通常，CDR残基直接且基本上大多数涉及影响抗原结合。本发明抗体的人源化或工程化可使用任何已知方法进行，例如但不限于Winter(Jones等人，Nature 321:522(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323(1988)(《自然》，第332卷，第323页，1988年)；Verhoeyen等人，Science 239:1534(1988)(《科学》，第239卷，第1534页，1988年)；Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901(1987)(《分子生物学杂志》，第196卷，第901页，1987年)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151:2623(1993)，美国专利号：5723323、5976862、5824514、5817483、5814476、5763192、5723323、5,766886、5714352、6204023、6180370、5693762、5530101、5585089、5225539；4816567、PCT/:US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246，每个专利全文，包括其中引用的文献以引用方式并入本文)中描述的那些方法。
如本文所述和/或本领域中已知的，还可以通过对能产生全套人抗体的转基因动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类动物等等)进行免疫来任选地产生抗TNF抗体。可使用合适的方法，例如本文描述的方法，从这些动物分离产生人抗TNF抗体的细胞并使其无限增殖化。
能产生结合人抗原的全套人抗体的转基因小鼠可使用已知方法产生(例如但不限于授予Lonberg等人的美国专利No:5,770,428、5,569,825、5,545,806、5,625,126、5,625,825、5,633,425、5,661,016和5,789,650；Jakobovits等人WO 98/50433，Jakobovits等人WO98/24893，Lonberg等人WO 98/24884，Lonberg等人WO 97/13852，Lonberg等人WO 94/25585，Kucherlapate等人WO 96/34096，Kucherlapate等人EP 0463 151 B1，Kucherlapate等人EP 0710 719 A1，Surani等人美国专利号5,545,807，Bruggemann等人WO 90/04036，Bruggemann等人EP 0438 474 B1，Lonberg等人EP 0814 259 A2，Lonberg等人GB 2 272440 A，Lonberg等人Nature 368:856-859(1994)，Taylor等人，Int.Immunol.6(4)579-591(1994)，Green等人，Nature Genetics 7:13-21(1994)，Mendez等人，Nature Genetics15:146-156(1997)，Taylor等人，Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295(1992)，Tuaillon等人，Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724(1993)，Lonberg等人，Int RevImmunol 13(1):65-93(1995)以及Fishwald等人，Nat Biotechnol 14(7):845-851(1996)，所述专利和参考文献全文各自以引用方式并入本文)。一般来讲，这些小鼠包含至少一种包含来自至少一个发生了功能性重排或可经历功能性重排的人免疫球蛋白基因座的DNA的转基因。此类小鼠中的内源免疫球蛋白基因座可以被破坏或缺失，以消除动物产生由内源基因编码的抗体的能力。
可用肽展示文库方便地实现对与相似蛋白质或片段特异性结合的抗体的筛选。这种方法涉及在大型肽集合中筛选具有所需功能或结构的个别成员。肽展示文库的抗体筛选是本领域熟知的。所展示的肽序列的长度可以为3至5000个或更多个氨基酸，常常长为5-100个氨基酸，通常长为约8-25个氨基酸。除用于产生肽文库的直接化学合成方法之外，有几种重组DNA方法也已得到描述。一种类型涉及在噬菌体或细胞表面上展示肽序列。每个噬菌体或细胞均含有编码具体展示的肽序列的核苷酸序列。这类方法描述于PCT专利申请号91/17271、91/18980、91/19818和93/08278。其它的用于产生肽文库的系统同时具有体外化学合成方法和重组方法的各方面。参见PCT专利公开文本号92/05258、92/14843和96/19256。另参见美国专利号5,658,754；和5,643,768。肽展示文库、载体和筛选试剂盒可从诸如Invitrogen(Carlsbad，CA)和Cambridge antibody Technologies(Cambridgeshire，UK)的供应商市售获得。参见例如转让给Enzon的美国专利号4704692、4939666、4946778、5260203、5455030、5518889、5534621、5656730、5763733、5767260、5856456；转让给Dyax的5223409、5403484、5571698、5837500，转让给Affymax的5427908、5580717；转让给Cambridge antibody Technologies的5885793；转让给Genentech的5750373，转让给Xoma的5618920、5595898、5576195、5698435、5693493、5698417，Colligan(出处同上)；Ausubel(出处同上)；或Sambrook(出处同上)，以上专利和出版物各自全文以引用方式并入本文。
使用至少一种抗TNF抗体编码核酸来提供转基因动物或哺乳动物，如山羊、奶牛、马、绵羊等，也可以制备本发明的抗体，所述转基因动物或哺乳动物能够在它们的奶中产生所述抗体。此类动物可用已知的方法提供。参见例如但不限于美国专利号5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992；5,994,616；5,565,362；5,304,489等，其各自全文以引用方式并入本文。
使用至少一种抗TNF抗体编码核酸来提供转基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草和玉米)，也可以制备本发明的抗体，所述转基因植物和培养的植物细胞在其植物部分或从植物部分培养得到的细胞中产生这种抗体、其特定部分或变体。作为非限制性示例，表达重组蛋白质的转基因烟草叶已成功地用于提供大量重组蛋白质，例如使用诱导型启动子。参见，例如Cramer等人，Curr.Top.Microbol.Immunol.，240:95-118(1999)以及其中引用的参考文献。同样，转基因玉米也已用于以商业生产规模表达哺乳动物蛋白质，其生物活性等同于在其它重组系统中生产或从天然来源纯化的那些哺乳动物蛋白质。参见，例如Hood等人，Adv.Exp.Med.Biol.464:127-147(1999)以及其中引用的参考文献。也可由转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)大量生产抗体，包括抗体片段，例如单链抗体(scFv)。参见，例如Conrad等人，Plant Mol.Biol.38:101-109(1998)以及其中引用的参考文献。因此，本发明的抗体还可使用转基因植物根据已知方法进行生产。还可参见，例如Fischer等人，Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-108(1999年10月)，Ma等人，TrendsBiotechnol.13:522-7(1995)；Ma等人，Plant Physiol.109:341-6(1995)；Whitelam等人，Biochem.Soc.Trans.22:940-944(1994)；以及其中引用的参考文献。关于抗体的植物表达一般还可参见但不限于，上述参考文献各自以引用方式全文并入本文中。
本发明的抗体可以以广泛范围的亲和力(KD)结合人TNF。在一个优选的实施方案中，本发明的至少一种人mAb可任选以高的亲和力结合人TNF。例如，人mAb可以以等于或小于约10-7M，例如但不限于0.1-9.9(或其中的任何范围或数值)×10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13或其中的任何范围或数值的KD结合人TNF。
抗体对抗原的亲和力或亲合力可使用任何合适的方法通过实验确定(参见例如Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions,”In Fundamental Immunology，Paul,W.E编辑，Raven Press:New York，NY(1984)；Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman andCompany：New York，NY(1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同的条件(例如，盐浓度、pH)下测量，则测得的特定抗体-抗原相互作用的亲和力会不同。因此，亲和力和其它抗原结合参数(例如KD、Ka、Kd)的测量优选用抗体和抗原的标准溶液以及标准缓冲液(例如本文所述的缓冲液)来进行。
核酸分子：使用本文提供的信息，例如编码SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8中至少一者的至少70-100％的邻接氨基酸的核苷酸序列、其特定片段、变体或共有序列，或者包含这些序列中的至少一者的经寄存载体，可用本文所述或如本领域已知的方法获得编码包含SEQ ID NO:1、2和3的所有重链可变CDR区和/或SEQ ID NO:4、5和6的所有轻链可变CDR区的至少一种抗TNF抗体的本发明核酸分子。
本发明的核酸分子可以是RNA的形式，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其它形式，或者为DNA的形式，包括但不限于，通过克隆或合成产生的cDNA和基因组DNA，或它们的任何组合。DNA可以为三链的、双链的或单链的或它们的任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以是编码链，也称为有义链，或其可以是非编码链，也称作反义链。
本发明的分离核酸分子可包括具有开放阅读框(ORF)，任选地具有一个或多个内含子的核酸分子，例如但不限于至少一个CDR的至少一个指定部分，如至少一条重链(如SEQID NO:1-3)或轻链(如SEQ ID NO:4-6)的CDR1、CDR2和/或CDR3；包含抗TNF抗体或可变区的编码序列的核酸分子(如SEQ ID NO:7、8)；以及具有基本上不同于上述那些的核苷酸序列，但由于遗传密码的简并性，仍编码至少一种抗TNF抗体的核酸分子，如本文所述和/或如本领域已知的。当然，遗传密码是本领域熟知的。因此，对于本领域技术人员而言，应该可以按常规产生编码本发明的特异性抗TNF抗体的此类简并核酸变体。参见，例如Ausubel等人，同上，并且此类核酸变体包括在本发明中。本发明的分离的核酸分子的非限制性示例包括SEQID NO:10、11、12、13、14、15，对应于分别编码HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LCCDR2、LC CDR3、HC可变区和LC可变区的核酸的非限制性示例。
如本文所指出，本发明核酸分子包含编码抗TNF抗体的核酸，所述核酸可包括但不限于单独编码抗体片段的氨基酸序列的那些核酸；整个抗体或其部分的编码序列；抗体、片段或部分的编码序列以及另外的序列，例如具有或不具有上述另外的编码序列的至少一种信号前导肽或融合肽的编码序列；例如至少一个内含子；还包括另外非编码序列，包括但不限于非编码5'和3'序列，如在转录、mRNA加工(包括剪接和聚腺苷化信号(例如mRNA的核糖体结合和稳定))中发挥作用的转录、非翻译序列；编码另外的氨基酸，例如提供另外的功能的那些氨基酸的另外编码序列。因此，编码抗体的序列可以与标记序列例如编码肽的序列融合，所述肽可促进包含抗体片段或部分的融合抗体纯化。
与如本文所述的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸：本发明提供在选择性杂交条件下与本文所公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因而，该实施方案的多核苷酸可用于分离、检测和/或定量包含此类多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可用于鉴定、分离或扩增寄存文库中的部分或全长克隆。在一些实施方案中，多核苷酸是分离的基因组序列或cDNA序列，或与来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA互补。
优选地，cDNA文库包含至少80％全长序列，优选至少85％或90％全长序列，更优选至少95％全长序列。cDNA文库可以进行标准化以增加罕见序列的表现。低或中等严格杂交条件通常但不是唯一地用于与互补序列的序列同一性较低的序列。中等和高严格条件可任选用于同一性较高的序列。低严格条件可使具有约70％序列同一性的序列进行选择性杂交，并且可用于鉴定直系同源或旁系同源序列。
任选地，本发明的多核苷酸将编码由本文所述多核苷酸编码的抗体的至少一部分。本发明的多核苷酸包含可以用于与编码本发明抗体的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见例如Ausubel(出处同上)；Colligan(出处同上)，各自全文引用方式并入本文。
核酸的构建：可用本领域熟知的(a)重组方法，(b)合成技术，(c)纯化技术或它们的组合来制备本发明的分离的核酸。
所述核酸可方便地包含除了本发明的多核苷酸之外的序列。例如，可以将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入核酸中以帮助该多核苷酸的分离。此外，可以插入可翻译序列以帮助分离翻译出的本发明多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列为纯化本发明的蛋白质提供了便利手段。本发明的核酸(编码序列除外)任选为用于克隆和/或表达本发明多核苷酸的载体、衔接子或接头。
可将额外序列加入这些克隆和/或表达序列来优化它们在克隆和/或表达中的功能，以帮助分离所述多核苷酸，或改进该多核苷酸向细胞中的导入。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域熟知的。(参见例如Ausubel(出处同上)；或Sambrook(出处同上))。
用于构建核酸的重组方法：本发明的分离的核酸组合物，例如RNA、cDNA、基因组DNA或它们的任何组合，可用多种本领域技术人员已知的克隆方法从生物学来源获得。在一些实施例中，将在严格条件下与本发明多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针用于在cDNA或基因组DNA文库中鉴定所需序列。RNA的分离，以及cDNA和基因组文库的构建是本领域普通技术人员熟知的。(参见例如Ausubel(出处同上)；或Sambrook(出处同上))。
核酸筛选和分离方法：cDNA或基因组文库可用基于本发明多核苷酸的序列(例如本文所公开的那些)的探针进行筛选。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离相同或不同生物体中的同源基因。本领域的技术人员将会知道各种严格度的杂交可用于测定；并且杂交或洗涤介质可以是严格的。随着用于杂交的条件变得更严格，在探针和靶之间必须存在更高程度的互补性才能使双链体形成得以发生。严格性的程度可以由温度、离子强度、pH和部分变性溶剂如甲酰胺的存在中的一者或多者加以控制。例如，通过(例如)在0％至50％的范围内操纵甲酰胺的浓度使反应物溶液的极性改变，从而方便地改变杂交的严格性。对于可检测结合所需的互补性程度(序列同一性)将根据杂交介质和/或洗涤介质的严格性而改变。互补性程度将最佳为100％或70-100％或其中的任何范围或数值。然而应当理解，探针和引物中较小的序列变异可以通过减少杂交和/或洗涤介质的严格性进行补偿。
扩增RNA或DNA的方法是本领域熟知的，并且基于本文呈现的教导和指导，无需过度实验即可根据本发明使用。
已知的DNA或RNA扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)和相关的扩增方法(参见例如授予Mullis等人的美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor等人的4,795,699和4,921,794；授予Innis的5,142,033；授予Wilson等人的5,122,464；授予Innis的5,091,310；授予Gyllensten等人的5,066,584；授予Gelfand等人的4,889,818；授予Silver等人的4,994,370；授予Biswas的4,766,067；授予Ringold的4,656,134)以及使用靶序列的反义RNA作为双链DNA合成模板的RNA介导的扩增(授予Malek等人的美国专利号5,130,238，其商品名为NASBA)，这些参考文献的所有内容以引用方式并入本文(参见例如Ausubel(出处同上)；或Sambrook(出处同上))。
例如，可用聚合酶链反应(PCR)技术直接从基因组DNA或cDNA文库扩增本发明的多核苷酸和相关基因的序列。例如PCR和其它体外扩增方法也可用于克隆编码待表达的蛋白质的核酸序列、制备核酸以用作探针来检测样品中所需mRNA的存在，用于核酸测序，或用于其它目的。足以在整个体外扩增方法中指导技术人员的技术的示例可见于Berger(出处同上)、Sambrook(出处同上)和Ausubel(出处同上)，以及Mullis等人的美国专利号4,683,202(1987年)；以及Innis等人，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(编写)，Academic Press Inc.，San Diego，CA(1990)。用于基因组PCR扩增的市售试剂盒是本领域已知的。参见例如，Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech)。另外，例如，T4基因32蛋白质(BoehringerMannheim)可用于提高长PCR产物的得率。
用于构建核酸的合成方法：本发明的分离的核酸还可通过已知方法通过直接化学合成进行制备(参见，例如Ausubel等人，同上)。化学合成一般会产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列杂交，或通过用该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合而转变成双链DNA。本领域技术人员将认识到，虽然DNA的化学合成可能限制于约100个或更多个碱基的序列，但较长的序列可以通过连接较短序列来获得。
重组表达盒：本发明还提供包含本发明核酸的重组表达盒。本发明的核酸序列，例如编码本发明抗体的cDNA或基因组序列，可用于构建可导入至少一种所需宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒通常会包含与转录起始调节序列可操作地连接的本发明多核苷酸，所述转录起始调节序列会引导所述多核苷酸在预定的宿主细胞中的转录。异源和非异源(即內源)启动子两者均可用于引导本发明核酸的表达。
在一些实施例中，可在非异源形式的本发明多核苷酸的合适位置(上游、下游或內含子中)引入作为启动子、增强子或其它元件的分离核酸，以便上调或下调本发明的多核苷酸的表达。例如，可通过突变、缺失和/或替换在体內或体外改变内源启动子。
载体和宿主细胞：本发明还涉及包括本发明的分离的核酸分子的载体、用该重组载体进行遗传工程改造的宿主细胞以及通过本领域熟知的重组技术生产至少一种抗TNF抗体。参见例如Sambrook等人(出处同上)；Ausubel等人(出处同上)，各自全文以引用方式并入本文。
可将所述多核苷酸任选与含有可选择标记的载体连接，以在宿主中增殖。一般来讲，质粒载体在沉淀物例如磷酸钙沉淀物中，或在与带电脂质的复合物中被导入。如果载体是病毒，则它可以使用合适的包装细胞系在体外进行包装且随后转导进宿主细胞内。
应将DNA插入物与合适的启动子可操作地连接。表达构建体还会含有转录起始位点、终止位点以及在转录区中含有用于翻译的核糖体结合位点。该构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选包括在待翻译的mRNA开始处的翻译起始位点和在该mRNA末端合适位置的终止密码子(例如，UAA、UGA或UAG)，对于哺乳动物或真核细胞表达优选UAA和UAG。
表达载体将优选但任选包括至少一个可选择标记。这类标记包括例如但不限于：对于真核细胞培养物，为甲氨喋呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利号4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636；5,179,017)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利号5,122,464；5,770,359；5,827,739)抗性基因，对于大肠杆菌(E.coli)和其它细菌或原核生物培养，为四环素或氨苄青霉素抗性基因(以上专利全文以引用方式并入本文)。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。合适的载体对于技术人员来说将是显而易见的。载体构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知方法来实现。此类方法已在本领域中有所描述，例如Sambrook(出处同上)，第1-4和16-18章；Ausubel(出处同上)，第1、9、13、15、16章。
本发明的至少一种抗体可以以修饰形式(例如融合蛋白)表达，并且可不仅包括分泌信号，而且还可包括额外的异源功能区。例如，可将额外的氨基酸(尤其是带电氨基酸)的区域加至抗体的N-端，以提高纯化期间或随后的处理和保藏期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。同样，可将肽部分加至本发明的抗体以帮助纯化。这些区域可在抗体或其至少一个片段的最终制备前移除。此类方法在许多标准实验室手册中有所描述，例如Sambrook(出处同上)，第17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel(出处同上)，第16、17和18章。
本领域技术人员可认识到许多表达系统可用于表达编码本发明蛋白质的核酸。
或者，本发明的核酸可以在包含编码本发明抗体的内源DNA的宿主细胞中通过开启(通过操纵)在宿主细胞中进行表达。此类方法是本领域熟知的，例如，如美国专利号5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中所述，所述专利以引用方式全文并入本文中。
可用于生产抗体、其特定部分或变体的细胞培养物的示例是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统通常将是细胞单层的形式，但也可使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。在本领域中已经开发了许多能够表达完整糖基化蛋白的合适宿主细胞系，包括COS-1(例如ATCC CRL 1650)、COS-7(例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCC CRL-10)、CHO(例如ATCC CRL 1610)和BSC-1(例如ATCC CRL-26)细胞系，Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等，它们可容易地购自例如美国典型培养物保藏中心(Manassas，Va(www.atcc.org))。优选的宿主细胞包括淋巴样来源的细胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC登记号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登记号CRL-1851)。在尤其优选的实施例中，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。
这些细胞的表达载体可包括以下的表达控制序列中的一者或多者，例如但不限于：复制起点；启动子，例如晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利号5,168,062；5,385,839)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利号5,266,491)、至少一种人免疫球蛋白启动子；增强子和/或加工信息位点例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag聚A添加位点)和转录终止子序列。参见例如Ausubel等人(出处同上)；Sambrook等人(出处同上)。可用于产生本发明的核酸或蛋白质的其它细胞也是已知的和/或可例如从美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(www.atcc.org)或其它已知的来源或商业来源得到。
当使用真核宿主细胞时，通常会将多腺苷酸化或转录终止序列整合进载体内。终止序列的示例是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。还可包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的示例是来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，J.Virol.45:773-781(1983))。此外，如本领域所知，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列整合进载体内。
抗体的纯化：抗TNF抗体可通过熟知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所述方法包括但不限于A蛋白纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱(“HPLC”)也可以用于纯化。参见，例如Colligan,Current Protocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，NY，(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自以引用方式全文并入本文中。
本发明的抗体包括天然纯化的产物、化学合成操作的产物和通过重组技术从真核宿主产生的产物，所述真核宿主包括(例如)酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据重组生产方法中所采用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化的或可以是非糖基化的，糖基化的是优选的。此类方法在许多标准实验室手册中有所描述，例如Sambrook(出处同上)，17.37-17.42部分；Ausubel(出处同上)，第10、12、13、16、18和20章，Colligan,ProteinScience(出处同上)，第12-14章，所有参考文献全文以引用方式并入本文。
抗TNF抗体
包含SEQ ID NO:1、2和3的所有重链可变CDR区和/或SEQ ID NO:4、5和6的所有轻链可变CDR区的本发明分离的抗体包括由任何合适的多核苷酸编码的本文所公开的氨基酸序列，或任何分离或制备的抗体。优选地，人抗体或抗原结合片段结合人TNF，从而部分或基本上中和该蛋白质的至少一种生物学活性。部分或优选基本上中和至少一种TNF或片段的至少一种生物学活性的抗体或其特定部分或变体可结合该蛋白质或片段，从而抑制通过TNF与TNF受体的结合或通过其它TNF依赖性的或介导的机制所介导的活性。本文所用的术语“中和抗体”指取决于测定法，可以使TNF依赖性活性被抑制约20-120％的抗体，优选至少约10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或更多。抗TNF抗体抑制TNF依赖性活性的能力，优选通过至少一种本文所述的和/或本领域已知的合适的TNF或受体测定法来进行评估。本发明的人抗体可以是任何类型(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同种型，并且可包含K或λ轻链。在一个实施方案中，人抗体包含IgG重链或确定的片段，例如，同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的至少一者。这类抗体可如本文所述的和/或如本领域所知通过采用转基因小鼠或其它转基因非人哺乳动物来制备，所述动物包含至少一种人轻链(如IgG、IgA)和IgM(如γ1、γ2、γ3、γ4)转基因。在另一个实施方案中，抗人TNF人抗体包含IgG1重链和IgG1轻链。
本发明的至少一种抗体结合至少一种特定表位，该表位对至少一种TNF蛋白质、亚基、片段、部分或它们的任何组合是特异性的。该至少一个表位可包含至少一个抗体结合区，该抗体结合区包含所述蛋白质的至少一部分，该表位优选由所述蛋白质的至少一个细胞外的、可溶性的、亲水的、外部的或胞质的部分构成。该至少一种特定表位可包含这样的至少一种氨基酸序列的任何组合，所述至少一种氨基酸序列为SEO ID NO：9的邻接氨基酸的至少1-3个氨基酸至整个特定部分。
一般来讲，本发明的人抗体或抗原结合片段将包含这样的抗原结合区，该抗原结合区包含至少一个人互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)或至少一个重链可变区的变体以及至少一个人互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)或至少一个轻链可变区的变体。作为非限制性示例，抗体或抗原结合部分或变体可包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链CDR3和/或具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链CDR3中的至少一者。在一个具体实施方案中，抗体或抗原结合片段可具有这样的抗原结合区，所述抗原结合区包含至少一个重链CDR(即，CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一部分，所述重链CDR具有相应CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1、2和/或3)。在另一具体实施方案中，抗体或抗原结合部分或变体可以具有抗原结合区，所述抗原结合区包含具有相应CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列(例如SEOID NO：4、5和/或6)的至少一个轻链CDR(即CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一部分。在一个优选的实施方案中，抗体或抗原结合片段的三个重链CDR和三个轻链CDR具有本文所述的mAbTNV148、TNV14、TNV15、TNV196、TNV118、TNV32、TNV86中至少一种的相应CDR的氨基酸序列。此类抗体可通过如下方法制备：使用常规技术将抗体的各个部分(CDR和构架区)化学连接在一起，使用重组DNA技术的常规技术或通过使用任何其它合适的方法制备并表达编码该抗体的(一种或多种)核酸分子。
抗TNF抗体可包含具有确定氨基酸序列的重链或轻链可变区中的至少一者。例如，在一个优选的实施方案中，抗TNF抗体包含任选地具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的至少一个重链可变区和/或任选地具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的至少一个轻链可变区。结合人TNF且包含所定义的重链或轻链可变区的抗体可使用如本领域所知和/或如本文所述的合适方法，诸如噬菌体展示库(Katsube,Y.等人，Int J Mol.Med,1(5):863-868(1998))或采用转基因动物的方法制备。例如，可以用人TNF或其片段，对包含功能性重排的人免疫球蛋白重链转基因和包含来自可经历功能性重排的人免疫球蛋白轻链基因座的DNA的转基因的转基因小鼠进行免疫，以引发抗体的产生。如果需要，则可以对产生抗体的细胞进行分离，并且可以如本文所述和/或如本领域所知制备杂交瘤或其它无限增殖化的产生抗体的细胞。或者，可以利用编码核酸或其部分在合适的宿主细胞中表达抗体、特定部分或变体。
本发明还涉及其包含的氨基酸序列基本上与本文所述的氨基酸序列相同的抗体、抗原结合片段、免疫球蛋白链和CDR。优选地，此类抗体或抗原结合片段和包含此类链或CDR的抗体可以高的亲和力(例如小于或等于约10-9M的KD)结合人TNF。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸置换以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸置换指用第二种氨基酸置换第一种氨基酸，所述第二种氨基酸具有的化学和/或物理性质(例如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)与第一种氨基酸相似。保守置换包括一个氨基酸被另一个如下组中的氨基酸置换：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
氨基酸代码：构成本发明的抗TNF抗体的氨基酸通常是缩写的。可通过氨基酸的单字母代码、三字母代码或者三核苷酸密码子来表示氨基酸，由此指示氨基酸名称，这是本领域众所周知的(参见Alberts,B.等人，Molecular Biology of The Cell，第三版，GarlandPublishing,Inc.，New York，1994)；
如文中说明的，本发明的抗TNF抗体可包括一个或多个来自天然突变或得自人工操纵的氨基酸置换、缺失或添加。
当然，技术人员可进行的氨基酸置换数目取决于许多因素，包括上文所述的那些。如文中说明的，一般来讲，任何给定的抗TNF抗体、片段或变体的氨基酸置换、插入或缺失数目将不超过40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个，例如1-30个或其中的任何范围或数值。
可通过本领域已知的方法来鉴定本发明的抗TNF抗体中对于功能而言必需的氨基酸，所述方法例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如Ausubel，出处同上，第8、15章；Cunningham和Wells，Science 244:1081-1085(1989))。后一方法在分子的每个残基处引入单个丙氨酸突变。然后对所产生的突变分子测试生物学活性，例如但不限于至少一种TNF中和活性。抗体结合至关重要的位点也可以通过结构分析进行鉴定，例如结晶、核磁共振或光亲和标签(Smith等人，J.Mol.Biol.224:899-904(1992)以及de Vos等人，Science 255:306-312(1992))。
本发明的抗TNF抗体可包括但不限于选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6中至少一者的1个至所有邻接氨基酸的至少一部分、序列或组合。
抗TNF抗体还可任选包含SEQ ID NO：7、8中至少一者的70-100％的邻接氨基酸中的至少一者所成的多肽。
在一个实施方案中，免疫球蛋白链或其部分(如可变区、CDR)的氨基酸序列与SEQID NO:7、8中至少一者的相应链的氨基酸序列具有约70-100％的同一性(如70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任何范围或值)。例如，轻链可变区的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:8的序列进行比较，或者重链CDR3的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:7进行比较。优选地，用本领域已知的合适计算机算法确定出70-100％氨基酸同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或者其中的任何范围或值)。
在SEQ ID NO:7、8中提供了示例性重链和轻链可变区序列。本发明的抗体，或其特定变体可包含任何数目的来自本发明抗体的邻接氨基酸残基，其中该数目选自抗TNF抗体中邻接残基数目的10-100％的整数。任选地，该邻接氨基酸亚序列长度为至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多个氨基酸，或其中的任何范围或数值。此外，所述亚序列的数目可以为选自1至20的任何整数，例如至少2、3、4或5。
技术人员将会知道，本发明包括本发明的至少一种生物活性抗体。生物活性抗体的比活性为天然(非合成)的、内源性或相关的和已知的抗体比活性的至少20％、30％或40％，并且优选至少50％、60％或70％，并且最优选至少80％、90％或95％-1000％。测定和定量酶促活性和底物特异性的量度的方法是本领域技术人员熟知的。
在另一方面，本发明涉及通过共价连接有机部分进行修饰的、如本文所述的人抗体和抗原结合片段。这种修饰可以产生具有改善的药物代谢动力学性质(例如增加的体内血清半衰期)的抗体或抗原结合片段。有机部分可以是线性或支化的亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在特定实施方案中，亲水聚合基团可以具有约800道尔顿至约120,000道尔顿的分子量，并且可以是聚链烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，并且脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含约8至约40个碳原子。
本发明的经修饰的抗体和抗原结合片段可包含一个或多个与抗体直接或间接共价键合的有机部分。与本发明的抗体或抗原结合片段键合的每个有机部分可独立地是亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文所用，术语“脂肪酸”涵盖单羧酸和二羧酸。“亲水聚合基团”，该术语在本文中使用时是指在水中比在辛烷中更易溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶。因此，通过共价连接聚赖氨酸来修饰的抗体包括在本发明内。适用于修饰本发明抗体的亲水聚合物可以是直链或支链的，并且包括(例如)聚链烷二醇(例如PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水性氨基酸聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚环氧链烷(例如，聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明抗体的亲水聚合物作为单独的分子实体具有约800至约150,000道尔顿的分子量。例如可以使用PEG5000和PEG20,000，其中下标是以道尔顿为单位的聚合物的平均分子量。亲水性聚合物基团可用1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。用脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水性聚合物可通过采用合适的方法制备。例如，可将包含胺基的聚合物与脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸根偶联，并且可将脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧酸根(如用N,N-羰基二咪唑活化)与聚合物上的羟基偶联。
适用于修饰本发明抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的或可含有一个或多个不饱和单位。适用于修饰本发明抗体的脂肪酸包括例如正十二烷酸(C12，月桂酸)、正十四烷酸(C14，肉豆蔻酸)、正十八烷酸(C18，硬脂酸)、正二十烷酸(C20，花生酸)、正二十二烷酸(C22，山嵛酸)、正三十烷酸(C30)、正四十烷酸(C40)、顺式-Δ9-十八烷酸(C18，油酸)、全顺式-Δ5,8,11,14-二十碳四烯酸(C20，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含直链或支链的低级烷基的二羧酸的单酯。低级烷基可包含1至约12个，优选1至约6个碳原子。
修饰的人抗体和抗原结合片段可使用合适的方法制备，例如通过与一种或多种修饰剂反应来制备。本文所用的术语“修饰剂”是指包含活化基团的合适有机基团(例如亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是化学部分或官能团，它们可在合适条件下与第二化学基团反应，由此在修饰剂和第二化学基团之间形成共价键。例如，胺反应性活化基团包括亲电子基团，例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可以与硫醇反应的活化基团包括，例如，马来酰亚胺、碘代乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。可将醛官能团与含胺或酰肼的分子偶联，并且可将叠氮基可与三价磷基团反应以形成磷酰胺酯或磷酰亚胺键。将活化基团引入分子的合适方法是本领域已知的(参见例如Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996))。活化基团可直接或通过连接部分与有机基团(例如亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)键合，所述连接部分例如为其中一个或多个碳原子可由杂原子(例如氧、氮或硫)取代的二价C1-C12基团。合适的连接部分包括例如四甘醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。包含连接部分的修饰剂可(例如)通过如下产生：在存在1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)的情况下，使单-Boc-烷基二胺(如单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应，以在游离胺和脂肪酸羧酸根之间形成酰胺键。可通过用三氟乙酸(TFA)处理从产物移除Boc保护基以暴露出伯胺，后者可偶联到另一羧酸酯(如所描述)，或者可与马来酸酐反应并且所得的产物环化以产生脂肪酸的活化马来酰亚胺基衍生物。(参见例如Thompson等人的WO 92/16221，该专利的所有教导内容以引用方式并入本文。)
本发明的经修饰抗体可通过使人抗体或抗原结合片段与修饰剂反应来产生。例如，有机部分可以通过使用胺反应性改性剂(例如PEG的NHS酯)以非位点特异性方式结合至抗体。经修饰的人抗体或抗原结合片段还可通过使抗体或抗原结合片段的二硫键(例如链内二硫键)还原来制备。还原的抗体或抗原结合片段随后可与硫醇反应性修饰剂反应，以产生本发明的经修饰抗体。包含与本发明抗体特定位点键合的有机部分的修饰的人抗体和抗原结合片段可使用合适的方法制备，所述方法例如为逆向蛋白水解作用(Fisch等人，Bioconjugate Chem.，3:147-153(1992)；Werlen等人，Bioconjugate Chem.，5:411-417(1994)；Kumaran等人，Protein Sci.6(10):2233-2241(1997)；Itoh等人，Bioorg.Chem.，24(1):59-68(1996)；Capellas等人，Biotechnol.Bioeng.，56(4):456-463(1997))，以及Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques，Academic Press:San Diego，CA(1996)中所述的方法。
针对抗Tnf抗体组合物的抗独特型抗体：除了单克隆或嵌合的抗TNF抗体之外，本发明还涉及对本发明的此类抗体有特异性的抗独特型(抗Id)抗体。抗Id抗体是能识别通常与另一抗体的抗原结合区相关的独特决定簇的抗体。抗Id可以通过用该抗体或其包含CDR的区域免疫与Id抗体来源相同的物种和遗传类型(例如小鼠品系)的动物来进行制备。被免疫动物将识别免疫抗体的独特型决定簇且对其应答，从而产生抗Id抗体。抗Id抗体还可以用作“免疫原”以在另一动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗-抗Id抗体。
抗TNF抗体组合物：本发明还提供至少一种抗TNF抗体组合物，其包含如本文所述和/或本领域已知的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或更多种抗TNF抗体，它们以非天然存在的组合物、混合物或形式提供。这些组合物包含非天然存在的组合物，所述非天然存在的组合物包含抗TNF抗体氨基酸序列的至少一个或两个全长序列、C-端和/或N-端缺失的变体、结构域、片段或特定变体，所述抗TNF抗体氨基酸序列选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8的70-100％的邻接氨基酸，或其特定片段、结构域或变体。优选的抗TNF抗体组合物包括至少一个或两个全长序列、片段、结构域或变体作为至少一个含CDR或LBR部分，所述含CDR或LBR部分来自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6的70-100％的抗TNF抗体序列或其特定片段、结构域或变体。更优选的组合物包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6的70-100％或其特定片段、结构域或变体中的至少一者的40-99％。此类组合物百分数按照液体或无水溶液、混合物、悬浮液、乳液或胶体的重量、体积、浓度、摩尔浓度或重量摩尔浓度计算，如本领域已知或本文所描述的。
本发明的抗TNF抗体组合物还可包含任何合适和有效量的组合物或药物组合物的至少一种，该组合物或药物组合物包含至少一种给需要这种调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者的抗TNF抗体，任选地还包含至少一种选自以下的药剂：至少一种TNF拮抗剂(例如但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或片段、它们的融合蛋白质、或者小分子TNF拮抗剂)、抗风湿剂(例如甲氨蝶呤、金诺芬、金硫葡糖、硫唑嘌呤、依那西普、硫代苹果酸金钠、硫酸羟氯喹、来氟米特、柳氮磺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉剂(narcotic)、非甾类抗炎药物(NSAID)、止痛药、麻醉剂(anesthetic)、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂(例如氨基糖苷、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、碳青霉烯类、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺药物、四环素、别的抗微生物剂)、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、糖尿病相关药剂、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙相关激素、止泻剂、镇咳剂、止吐剂、抗溃疡剂、缓泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如红细胞生成素α)、非格司亭(例如G-CSF、优保津)、沙格司亭(GM-CSF、瘤肯)、免疫接种剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环孢霉素、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药物、抗焦虑药物、催眠剂、拟交感神经药物、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、阿法链道酶(百慕时)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。此类细胞因子的非限制性示例包括但不限于IL-1至IL-23中的任何一者。合适的剂量是本领域众所周知的。参见例如Wells等人编辑，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appleton and Lange，Stamford,CT(2000)；PDRPharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，精装版，Tarascon Publishing,Loma Linda,CA(2000)，每个参考文献全文以引用方式并入本文。
此类抗癌药或抗感染药还可包括与本发明的至少一种抗体缔合、结合、共同配制或共同施用的毒素分子。毒素可任选起到选择性杀死病理性细胞或组织的作用。病理性细胞可以是癌细胞或其它细胞。此类毒素可以是但不限于纯化或重组毒素或包含毒素的至少一个功能性细胞毒性结构域的毒素片段，例如选自蓖麻毒素、白喉毒素、毒液毒素或细菌毒素中的至少一种。术语毒素还包括由任何天然存在的、突变型或重组型细菌或病毒产生的内毒素和外毒素，其可在人和其它哺乳动物中引起任何病理状况，包括毒素休克，这可导致死亡。此类毒素可包括但不限于肠产毒性大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、热稳定肠毒素(ST)、志贺氏菌属(Shigella)细胞毒素、气单胞菌属(Aeromonas)肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素A(SEA)、B(SEB)或C(SEC)、链球菌(Streptococcal)肠毒素等。此类细菌包括但不限于下列细菌的菌株：肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠出血性大肠杆菌(例如血清型0157:H7菌株)、葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、化脓性葡萄球菌(Staphylococcus pyogenes))、志贺氏菌属(Shigella)(例如痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)和宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholera-suis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis))、梭菌属(Clostridium)(例如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridiumdificile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum))、弯曲菌属(Camphlobacter)(例如Camphlobacter jejuni、Camphlobacter fetus)、螺杆菌属(Heliocbacter)(例如幽门螺杆菌(Heliocbacter pylori))、气单胞菌属(Aeromonas)(例如温和气单胞菌(Aeromonassobria)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae))、Pleisomonas shigelloides、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、弧菌属(Vibrio)(例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和链球菌属(Streptococci)。参见例如Stein编辑，INTERNAL MEDICINE，第3版，第1-13页，Little,Brown and Co.,Boston,(1990)；Evans等人编辑，Bacterial Infections of Humans:Epidemiology and Control，第2版第239-254页，Plenum Medical Book Co.,New York(1991)；Mandell等人，Principles and Practice of Infectious Diseases，第3版，Churchill Livingstone,New York(1990)；Berkow等人编辑，The Merck Manual，第16版，Merck and Co.,Rahway,N.J.,1992；Wood等人，FEMS Microbiology Immunology,76:121-134(1991)；Marrack等人，Science,248:705-711(1990)，这些参考文献的所有内容以引用方式并入本文。
本发明的抗TNF抗体混合物、组合物或组合还可包含任何合适辅助剂中的至少一种，例如但不限于稀释剂、粘结剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、辅剂等。可药用辅助剂是优选的。制备这类无菌溶液的非限制性示例和方法是本领域公知的，例如但不限于Gennaro编辑，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.(Easton,PA)1990。可按常规方式选择适合于抗TNF抗体、片段或变体组合物的施用方式、溶解性和/或稳定性的药物可接受载体，如本领域所公知或者如本文所述。
用于本发明组合物的药物赋形剂和添加剂包括但不限于：蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和低聚糖；衍生糖例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等等；以及多糖或糖聚合物)，药物赋形剂和添加剂可以单独或组合的方式存在，其单独或组合具有1-99.99重量％或体积％。示例性的蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。还可以在缓冲能力方面起作用的代表性氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括例如单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等等；以及糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、肌醇等等。用于本发明的优选碳水化合物赋形剂是甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
抗TNF抗体组合物还可包含缓冲剂或pH调节剂；通常，缓冲剂是从有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；盐酸三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐缓冲剂。用于本发明组合物的优选缓冲剂是有机酸盐，例如柠檬酸盐。
此外，本发明的抗TNF抗体组合物可包含聚合物赋形剂/添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、ficolls(聚合糖)、葡萄糖结合剂(例如环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯，例如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。
适合在根据本发明的抗TNF抗体、部分或变体组合物中使用的这些和另外已知的药学赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，例如，如在下列文献中列出的：“Remington:TheScience&Practice of Pharmacy”，第19版，Williams&amp；Williams，(1995)，和“Physician’s Desk Reference”，第52版，Medical Economics,Montvale,NJ(1998)，所述参考文献的公开内容以引用方式全文并入本文中。优选的载体或赋形剂材料是碳水化合物(例如糖和醛醇)和缓冲剂(例如柠檬酸盐)或聚合物试剂。
制剂：如上面指出，本发明提供适于药用或兽医用途的稳定制剂，其优选为具有盐水或选定的盐的磷酸缓冲液，以及含有防腐剂的防腐溶液和制剂，以及多用途防腐制剂，所述制剂包含于可药用配方中的至少一种抗TNF抗体。防腐制剂包含至少一种已知的防腐剂或任选地选自由至少一种下列物质组成的组：溶于含水稀释剂的酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、亚硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯代丁醇、氯化镁(如六水合物)、烷基苯甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、烷基苄基二甲基氯化铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠或它们的混合物。可以使用本领域已知的任何合适的浓度或混合物，例如0.001-5％或其中的任何范围或值，例如但不限于：0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、或其中的任何范围或值。非限制性示例包括：无防腐剂、0.1-2％间甲酚(例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.9％、1.0％)、0.1-3％苄醇(例如0.5％、0.9％、1.1％、1.5％、1.9％、2.0％、2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(例如0.005％、0.01％)、0.001-2.0％苯酚(例如0.05％、0.25％、0.28％、0.5％、0.9％、1.0％)、0.0005-1.0％对羟基苯甲酸烷基酯(例如0.00075％、0.0009％、0.001％、0.002％、0.005％、0.0075％、0.009％、0.01％、0.02％、0.05％、0.075％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.75％、0.9％、1.0％)等。
如上文指出的，本发明提供了包括包装材料和至少一个小瓶的制品，所述小瓶包含至少一种抗TNF抗体与规定的缓冲剂和/或防腐剂的溶液(任选溶于水性稀释剂中)，其中所述包装材料包括标签，该标签指示此类溶液可以在1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长时间段内保存。本发明还包括制品，该制品包括包装材料、包含冻干的至少一种抗TNF抗体的第一小瓶和包含规定缓冲剂和/或防腐剂的水性稀释剂的第二小瓶，其中所述包装材料包括标签，该标签指导患者在所述水性稀释剂中重构所述至少一种抗TNF抗体以形成可以在24小时或更长时间段内保存的溶液。
按照本发明来使用的该至少一种抗TNF抗体可通过重组方法生产，包括从哺乳动物细胞或转基因制品生产，或者可从其它生物来源纯化，如本文中所述或者如本领域所知。
如果在湿润/干燥系统中，则本发明产品中的至少一种抗TNF抗体的范围包括重构后产生约1.0μg/mL至约1000mg/mL的浓度的量，但是更低和更高的浓度是可行的并且取决于预期的递送介质，如溶液制剂将不同于透皮贴剂、经肺、跨粘膜或渗透或微量泵方法。
优选的是，水性稀释液还任选包含可药用防腐剂。优选的防腐剂包括选自如下的那些：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基酯、乙基酯、丙基酯、丁基酯等)、烷基苄基二甲基氯化铵、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。在制剂中使用的防腐剂的浓度是足以产生抗微生物作用的浓度。该浓度取决于所选防腐剂且容易由技术人员确定。
其它辅药例如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、增强剂可任选并优选加入稀释剂中。等渗剂例如甘油常常以已知的浓度使用。优选加入生理学耐受的缓冲剂以提供改善的pH控制。制剂可以覆盖宽的pH范围，例如约pH 4至约pH 10，优选的范围是约pH 5至约pH9，最优选的范围是约6.0至约8.0。优选本发明的制剂具有约6.8至约7.8的pH。优选的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂，最优选磷酸钠，特别是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
其它添加剂，如可药用的增溶剂，比如Tween 20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、Tween 40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、Tween 80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)或者非离子型表面活性剂如聚山梨醇酯20或80或者泊洛沙姆184或188、polyls、其它嵌段共聚物，以及螯合物如EDTA和EGTA，可任选地加入配方或组合物中以减少聚集现象。如果使用泵或塑料容器来施用制剂，则这些添加剂是特别有用的。可药用表面活性剂的存在减轻了蛋白质聚集的倾向。
本发明的制剂可通过这样一种方法来制备，该方法包括将至少一种抗TNF抗体和防腐剂在水性稀释剂中混合，该防腐剂选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基酯、乙基酯、丙基酯、丁基酯等)、苯扎氯铵，氯化苄乙氧铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞或它们的混合物。用常规溶解和混合方法将所述至少一种抗TNF抗体和防腐剂在水性稀释剂中混合。为了制备合适的制剂，例如，将缓冲液中的测定量的至少一种抗TNF抗体与所需的防腐剂在缓冲液中以一定量组合，所述量足以提供所需浓度的蛋白质和防腐剂。该方法的变型形式会是本领域普通技术人员认识到的。例如，组分加入的顺序、是否使用另外的添加剂、制剂制备时的温度和pH都是可以为所用的给药浓度和方式进行最优化的因素。
受权利要求书保护的制剂可以澄清溶液或双小瓶的形式提供给患者，所述双小瓶包括一小瓶冻干的至少一种抗TNF抗体，所述抗体用第二小瓶在水性稀释剂中重构，所述第二小瓶装有水、防腐剂和/或赋形剂，优选磷酸盐缓冲液和/或盐水和所选的盐。单个溶液小瓶或需要复水的双小瓶都可以多次再次使用，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，并且因此可以提供比目前可用的治疗方案更方便的治疗方案。
本发明受权利要求书保护的制品对于在24小时或更长时间段内立即施用而言是有用的。因此，本发明受权利要求书保护的制品能给患者提高明显优点。本发明的制剂可以任选安全地贮存于约2℃至约40℃的温度下，并且在长的时间内保持蛋白质的生物活性，从而使包装标签能标明溶液可在6、12、18、24、36、48、72或96小时或更长的时间段内保持和/或使用。如果使用防腐稀释剂，则此类标签可说明使用期可长达1-12个月、半年、一年半和/或两年。
本发明的至少一种抗TNF抗体的溶液可通过包括将至少一种抗体在水性稀释剂中混合的方法来制备。混合是用常规的溶解和混合程序来进行。为了制备合适的稀释液，例如，将水或缓冲液中的测定量的至少一种抗体以一定量合并，所述量足以提供蛋白质和任选的防腐剂或缓冲剂成所需的浓度。该方法的变型形式会是本领域普通技术人员认识到的。例如，组分加入的顺序、是否使用另外的添加剂、制剂制备时的温度和pH都是可以为所用的给药浓度和方式进行最优化的因素。
受权利要求保护的产品可以澄清溶液或双小瓶子的形式提供给患者，所述双小瓶包括一小瓶冻干的至少一种抗TNF抗体，其用装有水性稀释剂的第二瓶子进行重构。单个溶液小瓶或需要复水的双小瓶都可以多次再使用，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，因而提供比目前可用治疗方案的更方便的治疗方案。
所述受权利要求书保护的产品可通过给药房、门诊或其它此类机构和单位提供澄清的溶液或双小瓶来间接地提供给患者，所述双小瓶包括一小瓶冻干的至少一种抗TNF抗体，所述抗体用装有水性稀释剂的第二小瓶进行重构。在这种情况下澄清溶液剂的容积大小可以最多为1升或甚至更大，从而提供大的贮存库，从中可以一次或多次取出较小部分的至少一种抗体溶液用于转移到较小的小瓶内，并且通过药房或门诊提供给它们的顾客和/或患者。
公认的包含这些单小瓶系统的装置包括那些用于递送溶液的笔式注射器装置，诸如BD Pens、BD Pen、以及GenotronormHumatroRoferonJ-tip Needle-Free例如，如由Becton Dickensen(Franklin Lakes,NJ,www.bectondickenson.com)、Disetronic(Burgdorf,Switzerland,www.disetronic.com；Bioject,Portland,Oregon(www.bioject.com)；National Medical Products,Weston Medical(Peterborough,UK,www.weston-medical.com)、Medi-Ject Corp(Minneapolis,MN,www.mediject.com)所制备或开发的。公认的包含双小瓶系统的装置包括那些用于在筒中将经冻干的药物进行复水的笔式注射器系统，而该筒用于递送该复水溶液，如
本发明受权利要求书保护的产品包括包装材料。包装材料除了提供管理机构要求的信息之外，还提供本产品可得以使用的条件。对于双小瓶、湿润/干燥产品，本发明的包装材料提供指导患者在水性稀释剂中重构至少一种抗TNF抗体以形成溶液，以及在2-24小时或更长时间段内使用溶液的说明书。对于单小瓶溶液产品，标签标明此类溶液可以在2-24小时或更长时间段内使用。本发明受权利要求书保护的产品可用于人药物产品用途。
本发明的制剂可通过这样一种方法制备，该方法包括将至少一种抗TNF抗体和所选的缓冲剂混合，所述缓冲剂优选为含有盐水或所选盐的磷酸缓冲液。用常规溶解和混合方法将所述至少一种抗体和缓冲剂在水性稀释剂中混合。例如，为了制备合适的制剂，将水或缓冲液中的测定量的至少一种抗体与所需缓冲剂在一定量的水中混合，所述量足以提供所述蛋白质和缓冲剂成所需浓度。该方法的变型形式会是本领域普通技术人员认识到的。例如，组分加入的顺序、是否使用另外的添加剂、制剂制备时的温度和pH都是可以为所用的给药浓度和方式进行最优化的因素。
可以将受权利要求保护的稳定或防腐的制剂以澄清溶液或双小瓶的形式提供给患者，所述双小瓶包括一小瓶冻干的至少一种抗TNF抗体，其用装有在水性稀释剂中的防腐剂或缓冲剂和赋形剂的第二小瓶重构。单个溶液小瓶或需要复水的双小瓶都可以多次再使用，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，因而提供比目前可用治疗方案的更方便的治疗方案。
在本文所述的稳定或保存制剂或溶液中的至少一种抗TNF抗体可根据本发明经由多种递送方法施用于患者，所述递送方法包括SC或IM注射；经皮、肺部、经粘膜、植入物、渗透泵、药液筒、微型泵、或其它技术人员知道的方式，如本领域众所周知的。
治疗应用：本发明还提供用至少一种本发明的双整联蛋白抗体调节或治疗本领域已知的或本文所述的细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种TNF相关疾病的方法。
本发明还提供用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种TNF相关疾病的方法，所述疾病包括但不限于肥胖症、免疫相关疾病、心血管疾病、传染性疾病、恶性疾病或神经疾病中的至少一者。
本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种免疫相关疾病的方法，所述免疫相关疾病包括但不限于下列疾病中的至少一种：类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、全身性发作的青少年类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、胃溃疡、血清阴性关节病、骨关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、全身性红斑狼疮、抗磷脂综合征、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、特发性肺纤维变性、系统性脉管炎/韦格纳肉芽肿病、结节病、睾丸炎/输精管切除术逆向操作(vasectomy reversalprocedures)、变应性/特应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、湿疹、变应性接触性皮炎、变应性结膜炎、超敏感性肺炎、移植、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身性炎性反应综合征、脓毒病综合征、革兰氏阳性脓毒症、革兰氏阴性脓毒症、培养物阴性脓毒症、真菌性脓毒症、嗜中性白细胞减少性发热、尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、外伤/出血、灼伤、电离射线暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合征、酒精诱导的肝炎、慢性炎性病理状态、结节病、克隆氏病理状态、镰状细胞贫血、糖尿病、肾病、特应性疾病、超敏反应、变应性鼻炎、枯草热、常年性鼻炎、结膜炎、子宫内膜异位、哮喘、荨麻疹、全身性过敏反应、皮炎、恶性贫血、溶血病、血小板减少症、任何器官或组织的移植排斥、肾移植排斥、心脏移植排斥、肝移植排斥、胰移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、皮肤同种异体移植排斥、软骨移植排斥、骨移植排斥、小肠移植排斥、胎儿胸腺植入物排斥、甲状旁腺移植排斥、任何器官或组织的异种移植排斥、同种异体移植排斥、抗受体超敏反应、格雷夫斯病、雷诺病、B型胰岛素抗性糖尿病、哮喘、重症肌无力、抗体介导的细胞毒性、III型超敏反应、全身性红斑狼疮、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变综合征)、多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、皮肤改变综合征、抗磷脂综合征、天疱疮、硬皮病、混合型结缔组织病、特发性艾迪生病、糖尿病、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、白癜风、脉管炎、MI后心切开术综合征、IV型超敏反应、接触性皮炎、超敏感性肺炎、同种异体移植排斥、胞内生物导致的肉芽瘤、药物敏感性、新陈代谢/特发性、威尔逊病、血色素沉着、α-1抗胰蛋白酶缺乏、糖尿病性视网膜病、桥本甲状腺炎、骨质疏松症、原发性胆汁性肝硬变、甲状腺炎、脑脊髓炎、恶病质、囊性纤维变性、新生儿慢性肺疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、家族性噬血细胞淋巴组织细胞增生症、皮肤病症、牛皮癣、秃头、肾病综合征、肾炎、肾小球性肾炎、急性肾衰竭、血液透析、尿毒症、毒性、先兆子痫、okt3疗法、抗cd3疗法、细胞因子疗法、化学疗法、放射疗法(例如包括但不限于无力、贫血、恶病质等)、慢性水杨酸中毒等。参见，例如Merck Manual，第12-17版，Merck&Company,Rahway,NJ(1972、1977、1982、1987、1992、1999)，Pharmacotherapy Handbook,Wells等人(编辑)，第二版，Appleton andLange,Stamford,Conn.(1998、2000)，各自全文以引用方式并入。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种心血管疾病的方法，所述心血管疾病包括但不限于以下疾病中的至少一种：心肌顿抑综合征、心肌梗塞、充血性心脏衰竭、中风、缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病性动脉硬化疾病、高血压、动脉高血压、肾血管性高血压、昏厥、休克、心血管系统的梅毒、心脏衰竭、肺心病、原发性肺高血压、心律失常、心房异位搏动、心房扑动、心房颤动(持续或阵发性)、后灌注综合征、心肺旁路炎症反应、混乱性或多源性房性心动过速、规则窄QRS心动过速、特异性心律失常、心室颤动、希氏束心律失常、房室传导阻滞、束支传导阻滞、心肌缺血性疾病、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张型充血性心肌病、限制型心肌病、心脏瓣膜病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动脉和外周动脉瘤、主动脉剥离、主动脉的炎症、腹主动脉及其分支的闭塞、周围血管疾病、动脉闭塞性疾病、外周动脉硬化性疾病、血栓闭塞性脉管炎、功能外周动脉疾病、雷诺氏现象和疾病、手足发绀、红斑性肢痛病、静脉疾病、静脉血栓、静脉曲张、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定型心绞痛、再灌注损伤、后泵综合征、缺血再灌注损伤等等。这种方法可任选包括将有效量的包含至少一种抗TNF抗体的组合物或药物组合物施用于需要此类调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种传染病的方法，所述传染病包括但不限于以下疾病中的至少一种：急性或慢性细菌性感染、急性和慢性寄生虫或感染过程(包括细菌、病毒和真菌感染)、HIV感染/HIV神经病、脑膜炎、肝炎(甲肝、乙肝或丙肝等)、化脓性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌0157:h7、溶血性尿毒症综合征/溶栓血小板减少性紫癜、疟疾、登革热出血热、利什曼病、麻风病、中毒性休克综合征、链球菌肌炎、气性坏疽、分枝杆菌结核、鸟胞内分枝杆菌、卡氏肺囊虫肺炎、盆腔炎、睾丸炎/附睾炎、军团菌、莱姆病、A型流感、EB病毒、病毒相关性噬血细胞综合征、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎等等。
本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种恶性疾病的方法，所述恶性疾病包括但不限于下列疾病中的至少一种：白血病，急性白血病，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，B-细胞、T细胞或FAB ALL，急性髓细胞样白血病(AML)，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，毛细胞性白血病，骨髓异常增生综合征(MDS)，淋巴瘤，何杰金病，恶性淋巴瘤，非何杰金淋巴瘤，Burkitt氏淋巴瘤，多发性骨髓瘤，卡波西肉瘤，结肠直肠癌，胰腺癌，鼻咽癌，恶性组织细胞增多症，恶性肿瘤的肿瘤相关综合征/高血钙综合征，实体瘤，腺癌，肉瘤，恶性黑素瘤，血管瘤，转移性疾病，癌症相关的骨再吸收，癌症相关的骨痛等。
本发明还提供了用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种神经疾病的方法，所述神经疾病包括但不限于下列疾病中的至少一种：神经退行性疾病、多发性硬化症、偏头痛、艾滋病痴呆复合征、脱髓鞘疾病，诸如多发性硬化症和急性横贯性脊髓炎；锥体束外和小脑失调，例如皮质脊髓系统病灶；基底神经节失调或小脑失调；多动性运动失调，诸如亨廷顿氏舞蹈症和老年性舞蹈症；药源性运动失调，诸如阻断CNS多巴胺受体的药物诱发的失调；运动减少性失调，诸如帕金森氏病；进行性核上性麻痹(Progressivesupra-nucleo Palsy)；小脑结构性病灶；脊髓小脑的退化，诸如脊髓性共济失调、弗里德赖希共济失调(Friedreich's ataxia)、小脑皮层退化、多发性系统退化(Mencel症、Dejerine-Thomas症、Shi-Drager症和Machado-Joseph症)；全身失调(雷弗素姆氏病、无β脂蛋白血症、共济失调、毛细管扩张和线粒体多系统失调)；脱髓鞘核失调，诸如多发性硬化症、急性横向脊髓炎；以及运动单元的失调，诸如神经源性肌萎缩(前角细胞退化，诸如肌萎缩侧索硬化症、婴儿型骨髓性肌萎缩症和幼年型骨髓性肌萎缩症)；阿尔茨海默病；中年唐氏综合症；弥漫性路易体病；莱维体型老年性痴呆；韦尼克-科尔萨科夫综合征；慢性酒精中毒；克雅二氏症；亚急性硬化性全脑炎、哈勒沃登-施帕茨病(Hallerrorden-Spatzdisease)；以及拳击员痴呆等等。此类方法可以任选包括将有效量的包含至少一种TNF抗体或特定部分或变体的组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者。参见例如Merck Manual，第16版，Merck&Company，Rahway，NJ(1992)。
本发明的任何方法都可包括将有效量的包含至少一种抗TNF抗体的组合物或药物组合物施用于需要此类调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。这种方法可任选还包括共同施用或联合疗法以治疗此类免疫性疾病，其中所述至少一种抗TNF抗体、其特定部分或变体的施用还包括在其施用之前、同时和/或之后施用至少一种选自如下的药物：至少一种TNF拮抗剂(例如，但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或其片段、融合蛋白或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药(例如，甲氨蝶呤、金诺芬、硫代葡萄糖金、硫唑嘌呤、依那西普、硫代苹果酸金钠、硫酸羟氯喹、来氟米特、柳氮磺吡啶)、肌肉松弛药、麻醉药、非类固醇消炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部用麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂(如，氨基糖苷类、抗真菌剂、抗寄生物剂、抗病毒剂、碳青霉烯、头孢菌素、氟喹诺酮、大环內酯、青霉素、磺胺药物、四环素、其它抗微生物剂)、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、糖尿病相关剂、矿物质、营养物、甲状腺剂、维生素、钙相关激素、止泻剂、止咳药、止吐剂、抗溃疡药、缓泻药、抗凝剂、促红细胞生成素(例如，阿法依伯汀)、非格司亭(如，G-CSF、Neupogen)、沙莫司亭(GM-CSF、白细胞素)、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂(如，巴利昔单抗、环孢菌素、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节剂、扩瞳剂、睫状肌麻痹药、烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药剂、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β-激动剂、吸入类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、阿法链道酶(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。合适的剂量是本领域众所周知的。参见例如Wells等人编辑，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appleton and Lange,Stamford,CT(2000)；PDRPharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，精装版，Tarascon Publishing,Loma Linda,CA(2000)，每个参考文献全文以引用方式并入本文。
适用于本发明的组合物、联合疗法、共施用、装置和/或方法(还包括本发明的至少一种抗体、其特定部分及变体)的TNF拮抗剂包括但不限于抗TNF抗体、其抗原结合片段、以及特异性结合TNF的受体分子；防止和/或抑制TNF合成、TNF释放或其对靶细胞的作用的化合物，诸如沙利度胺、替尼达普、磷酸二酯酶抑制剂(例如己酮可可碱和咯利普兰)、A2b腺苷受体激动剂和A2b腺苷受体增强剂；防止和/或抑制TNF受体信号转导的化合物，诸如丝裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制剂；阻断和/或抑制膜TNF切割的化合物，诸如金属蛋白酶抑制剂；阻断和/或抑制TNF活性的化合物，诸如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利)；以及阻断和/或抑制TNF产生和/或合成的化合物，诸如MAP激酶抑制剂。
本文所用的“肿瘤坏死因子抗体”、“TNF抗体”、“TNFα抗体”或片段等可降低、阻断、抑制、消除或干扰体外、原位和/或优选体內的TNFα活性。例如，本发明的合适的TNF人抗体可结合TNFα并且包括抗TNF抗体、其抗原结合片段以及其特异性结合TNFα的特定突变体或结构域。合适的TNF抗体或片段也可以降低、阻断、消除、干扰、防止和/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白质合成、TNF释放、TNF受体信号转导、膜TNF切割、TNF活性、TNF产生和/或合成。
嵌合抗体cA2由高亲和力中和小鼠抗人TNFα IgG1抗体的抗原结合可变区(称作A2)和人IgG1 k免疫球蛋白的恒定区组成。人IgG1 Fc区域可改善同种异体抗体效应子功能，增加循环血清半衰期和减小抗体的免疫原性。嵌合抗体cA2的亲合力和表位特异性来源于鼠抗体A2的可变区。在具体实施方案中，编码鼠抗体A2的可变区的核酸的优选来源是A2杂交瘤细胞系。
嵌合A2(cA2)以依赖剂量的方式中和天然的和重组的人TNFα的细胞毒性效应。根据嵌合抗体cA2和重组人TNFα的结合测定，计算出嵌合抗体cA2的亲和力常数为1.04×l010M-1。通过竞争性抑制来测定单克隆抗体特异性和亲和力的优选方法可见于Harlow等人，antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York,1988；Colligan等人编辑，Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,New York,(1992-2000)；Kozbor等人，Immunol.Today,4:72-79(1983)；Ausubel等人编辑Current Protocols in MolecularBiology,Wiley Interscience,New York(1987-2000)；以及Muller,Meth.Enzymol.,92:589-601(1983)，将这些文献全文以引用的方式并入本文。
在一个具体实施方案中，通过标号为c134A的细胞系产生鼠单克隆抗体A2。由标号为c168A的细胞系产生嵌合抗体cA2。
可用于本发明的单克隆抗TNF抗体的附加示例在本领域中有所描述(参见例如美国专利号5,231,024；A等人，Cytokine 2(3):162-169(1990)；美国专利申请号07/943,852(1992年9月11日提交)；Rathjen等人的国际公布号WO 91/02078(1991年2月21日公布)；Rubin等人的EPO专利公布号0 218 868(1987年4月22日公布)；Yone等人的EPO专利公布号0 288 088(1988年10月26日)；Liang等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.137:847-854(1986)；Meager等人，Hybridoma 6:305-311(1987)；Fendly等人，Hybridoma 6:359-369(1987)；Bringman等人，Hybridoma 6:489-507(1987)；以及Hirai等人，J.Immunol.Meth.96:57-62(1987)，将这些文献全文以引用的方式并入本文)。
TNF受体分子：可用于本发明的优选的TNF受体分子是以较高亲和力结合TNF(参见例如Feldmann等人的国际公布号WO 92/07076(1992年4月30日公布)；Schall等人，Cell61:361-370(1990)；以及Loetscher等人，Cell 61:351-359(1990)，将这些文献全文以引用的方式并入本文)并且任选地具有较低免疫原性的那些。具体地讲，55kDa(p55TNF-R)和75kDa(p75TNF-R)TNF细胞表面受体可用于本发明。这些受体的包含受体的细胞外结构域(ECD)或其功能部分的截短形式(参见例如Corcoran等人，Eur.J.Biochem.223:831-840(1994))也可用于本发明。已在尿和血清中检测到TNF受体的含有ECD的截短形式为30kDa和40kDa的TNFα抑制性结合蛋白质(Engelmann,H.等人，J.Biol.Chem.265:1531-1536(1990))。TNF受体多聚体分子和TNF免疫受体融合分子及其衍生物和片段或部分，是可用于本发明的方法和组合物的TNF受体分子的另外的示例。可用于本发明的TNF受体分子的特征在于它们能够长时间治疗患者，能很好地或极好地减轻症状，并且毒性低。低免疫原性和/或高亲和力，以及其它未确定的性质，可有助于所实现的治疗结果。
可用于本发明的TNF受体多聚体分子包含经由一种或多种多肽接头或其它非肽接头(如聚乙二醇(PEG))连接的两个或多个TNF受体的ECD的所有或功能部分。该多聚体分子还可包含分泌蛋白的信号肽以引导该多聚体分子的表达。这些多聚体分子和它们的制备方法已经在美国专利申请号08/437,533(于1995年5月9日提交)中有所描述，将其内容全文以引用的方式并入本文。
可用于本发明方法和组合物的TNF免疫受体融合分子包含一种或多种免疫球蛋白分子的至少一部分和一种或多种TNF受体的所有或功能部分。这些免疫受体融合分子可装配成单体或异型多聚体或同型多聚体。免疫受体融合分子也可以是单价的或多价的。这种TNF免疫受体融合分子的示例是TNF受体/IgG融合蛋白。TNF免疫受体融合分子及它们的产生制备已经在本领域有所描述(Lesslauer等人，Eur.J.Immunol.21:2883-2886(1991)；Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539(1991)；Peppel等人，J.Exp.Med.174:1483-1489(1991)；Kolls等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:215-219(1994)；Butler等人，Cytokine 6(6):616-623(1994)；Baker等人，Eur.J.Immunol.24:2040-2048(1994)；Beutler等人，美国专利号5,447,851；以及美国专利申请号08/442,133(于1995年5月16日提交)，每个参考文献全文以引用方式并入本文)。用于产生免疫受体融合分子的方法也可见于Capon等人的美国专利号5,116,964；Capon等人的美国专利号5,225,538；以及Capon等人，Nature 337:525-531(1989)，将这些文献全文以引用的方式并入本文。
TNF受体分子的功能等价物、衍生物、片段或区域指TNF受体分子的部分或编码TNF受体分子的TNF受体分子序列的部分，其具有足够的大小和序列以在功能上类似于可用于本发明的TNF受体分子(例如，以高亲和力结合TNFα和具有低免疫原性)。TNF受体分子的功能等价物还包括在功能上类似于可用于本发明的TNF受体分子的经修饰TNF受体分子(例如，以高亲和力结合TNFα和具有低免疫原性)。例如，TNF受体分子的功能等价物可含有“沉默”密码子或一个或多个氨基酸替代、缺失或添加(如，用一个酸性氨基酸替代另一个酸性氨基酸；或用一个编码相同或不同疏水氨基酸的密码子替代另一个编码疏水氨基酸的密码子)。参见Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssoc.and Wiley-Interscience,New York(1987-2000)。
细胞因子包括任何已知的细胞因子。参见例如CopewithCytokines.com。细胞因子拮抗剂包括但不限于任何抗体、片段或模拟物、任何可溶受体、片段或模拟物、任何小分子拮抗剂或它们的任何组合。
治疗性治疗：本发明的任何方法可包括用于治疗TNF介导的障碍的方法，包括给需要此类调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者施用有效量的包含至少一种抗TNF抗体的组合物或药物组合物。这种方法可任选还包括共同施用或联合疗法以治疗此类免疫性疾病，其中所述至少一种抗TNF抗体、其特定部分或变体的施用还包括在其施用之前、同时和/或之后施用至少一种选自如下的药物：至少一种TNF拮抗剂(例如，但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或其片段、融合蛋白或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药(例如，甲氨蝶呤、金诺芬、硫代葡萄糖金、硫唑嘌呤、依那西普、硫代苹果酸金钠、硫酸羟氯喹、来氟米特、柳氮磺吡啶)、肌肉松弛药、麻醉药、非类固醇消炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部用麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂(如，氨基糖苷类、抗真菌剂、抗寄生物剂、抗病毒剂、碳青霉烯、头孢菌素、氟喹诺酮、大环內酯、青霉素、磺胺药物、四环素、其它抗微生物剂)、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、糖尿病相关剂、矿物质、营养物、甲状腺剂、维生素、钙相关激素、止泻剂、止咳药、止吐剂、抗溃疡药、缓泻药、抗凝剂、促红细胞生成素(例如，阿法依伯汀)、非格司亭(如，G-CSF、Neupogen)、沙莫司亭(GM-CSF、白细胞素)、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂(如，巴利昔单抗、环孢菌素、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节剂、扩瞳剂、睫状肌麻痹药、烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药剂、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β-激动剂、吸入类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、阿法链道酶(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
通常，对病理性状况的治疗是通过施用有效量或有效剂量的至少一种抗TNF抗体组合物来实现，取决于组合物中包含的比活性，所述组合物总计为平均每剂量每千克患者至少约0.01毫克至500毫克至少一种抗TNF抗体，优选每单次或多次施用每千克患者至少约0.1毫克至100毫克抗体。或者，有效血清浓度可包括0.1-5000g/mL血清浓度/单次或多次施用。合适的剂量是医学从业者已知的，当然要取决于具体疾病状态、待施用组合物的比活性，以及接受治疗的具体患者。在某些情况下，为了达到所需治疗量，可能有必要提供重复施用，即重复单独施用特定的监控剂量或计量剂量，其中单独施用可以重复直至达到所需日剂量或效果。
优选剂量可任选包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和/或100-500mg/kg/施用，或其任何范围、数值或分数，或达到下列血清浓度：0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000g/mL血清浓度/单次或多次施用，或其任何范围、数值或分数。
另选地，所施用的剂量可根据已知因素改变，诸如特定试剂的药效动力学特性，以及其施用方式和途径；受体的年龄、健康状态和重量；症状的性质和程度、当前治疗的种类、治疗频率、以及期望的效果。通常活性成分的剂量可以是约0.1至100毫克/千克体重。通常，每次施用0.1-50毫克/公斤、优选0.1-10毫克/公斤，或者以缓释形式施用该量，能有效获得所需的结果。
作为一个非限制性示例，人或动物的治疗可以在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或者作为另外一种选择或除此之外，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52周中的至少一周，或者作为另外一种选择或除此之外，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年中的至少一年，或其任何组合，使用单次、输注或重复剂量，作为0.1至100mg/kg的一次或定期剂量的至少一种本发明抗体提供，例如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg/天。
适合于内部施用的剂型(组合物)，每单位或容器一般包含约0.1毫克至约500毫克的活性成分。在这些药物组合物中，基于组合物总重量，活性成分一般会以约0.5至99.999重量％的量存在。
对于肠胃外施用，抗体可以配制成溶液剂、混悬剂、乳剂、或冻干粉剂，它们与可药用肠胃外用介质联合或分开提供。此类介质的示例是水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和1-10％的人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水介质，如固定油。介质或冻干粉末可含有维持等渗性的添加剂(例如氯化钠、甘露糖醇)和维持化学稳定性的添加剂(例如缓冲剂和防腐剂)。可通过已知的或合适的技术对制剂进行灭菌。
合适的药学载体在Remington's Pharmaceutical Sciences，A.Osol的最近版本(该领域的标准参考文本)中有描述。
另选的施用方式：可根据本发明使用许多已知的和开发的施用方式来施用药学有效量的至少一种根据本发明的抗TNF抗体。尽管在下文描述中使用的是经肺施用，但其它施用方式也可根据本发明使用，得到合适的结果。
本发明的TNF抗体可用适用于通过吸入方式或本文所述或本领域已知的其它方式施用的多种装置和方法中的任何一种，在载体中作为溶液剂、乳剂、胶体或混悬剂递送或作为干粉剂递送。
肠胃外用制剂及施用：用于肠胃外施用的制剂可含有作为普通赋形剂的无菌水或盐水、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等。注射用水性或油性混悬剂可通过使用合适的乳化剂或湿润剂和悬浮剂根据已知方法来制备。注射用药剂可以是无毒的、非经口施用的稀释剂，例如溶于溶剂的水溶液剂或无菌注射液或混悬剂。作为可用的载体或溶剂，水、林格氏溶液、等渗盐水等是允许的；作为常规溶剂或悬浮溶剂，可使用无菌不挥发性油。为了这些目的，可以使用任何种类的不挥发性油和脂肪酸，包括天然的或合成的或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成单-或二-或三-甘油酯。胃肠外施用是本领域知道的，包括但不限于常规形式的注射、如美国专利号5,851,198中所述的气压式无针注射装置和如美国专利号5,839,446中所述的激光穿孔器装置。
可替代的递送方式。本发明还涉及通过下列方式施用至少一种抗TNF抗体：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速浓注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮方式。至少一种抗TNF抗体组合物可制备成用于肠胃外(皮下注射、肌内注射或静脉注射)施用或任何其它施用，特别是以液体溶液或混悬剂形式；用于阴道或直肠施用，特别是以半固体形式，例如但不限于霜膏和栓剂；用于颊面、或舌下施用，例如但不限于以片剂或胶囊形式；或鼻内施用，例如但不限于散剂、鼻用滴剂或气溶胶剂或特定试剂形式；或鼻内施用，例如但不限于凝胶、软膏剂、洗剂、混悬剂或贴剂递送体系，其含有化学增强剂诸如二甲基亚砜以改变皮肤结构或增大透皮贴剂中的药物浓度(Junginger等人“Drug Permeation Enhancement”；Hsieh,D.S.(编辑)，第59-90页，Marcel Dekker,Inc.New York 1994，以引用方式全文并入本文中)，或含有氧化剂，其使得包含蛋白质和肽的制剂能够应用于皮肤上(WO 98/53847)，或应用电场以产生瞬间转运途径，例如电穿孔，或增加带电药物通过皮肤的运动性，例如离子电渗疗法，或应用超声，例如透皮吸收超声波(美国专利号4,309,989和4,767,402)(以上出版物和专利全文以引用方式并入本文)。
经肺/鼻施用：对于经肺施用，优选至少一种抗TNF抗体组合物以可有效到达肺下部气道或窦的颗粒大小递送。根据本发明，至少一种抗TNF抗体可通过本领域已知用于通过吸入施用治疗剂的多种吸入装置或鼻装置中的任何一种来递送。这些能够在患者的窦腔或肺泡中沉积气溶胶化制剂的装置包括定量吸入器、雾化器、干粉产生器、喷雾器等等。其它适用于引导抗体的经肺或鼻施用的装置也是本领域已知的。所有此类装置都可以使用适合于以气溶胶形式分配抗体进行施用的制剂。此类气溶胶可由溶液(水性或非水性)或固体颗粒构成。定量吸入器如定量吸入器通常利用推进气体并且要求在吸气期间启动(参见，例如WO 94/16970、WO 98/35888)。干粉吸入器如TurbuhalerTM(Astra)、(Glaxo)、(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、由Inhale Ttlerapeutics销售的装置，以及粉末吸入器(Fisons)是使用混合粉末的呼吸启动(US 4668218 Astra、EP 237507 Astra、WO 97/25086 Glaxo、WO 94/08552 Dura、US 5458135 Inhale、WO 94/06498 Fisons，所述专利以引用方式全文并入本文中)。雾化器如AERxTM Aradigm、雾化器(Mallinckrodt)和Acorn雾化器(Marquest Medical Products)(US5404871 Aradigm，WO 97/22376)(上述参考文献以引用方式全文并入本文中)是由溶液产生气溶胶，而定量吸入器、干粉吸入器等是产生小颗粒的气溶胶。市售吸入装置的这些具体示例旨在代表适用于实施本发明的具体装置，并且无意于限制本发明的范围。优选的是，包含至少一种抗TNF抗体的组合物通过干粉吸入器或喷雾器递送。对于施用本发明的至少一种抗体，吸入装置需具有若干期望特性。例如，有利地，通过吸入装置进行的递送是可靠的、可再现的和准确的。吸入装置可任选地递送小的干燥颗粒，例如小于约10μm，优选约1-5μm，以便容易呼吸。
TNF抗体组合物作为喷雾施用：通过施压使至少一种抗TNF抗体的悬浮液或溶液通过喷嘴，可以产生包含TNF抗体组合物蛋白质的喷雾。可以选择喷嘴大小和构造、所施加的压力和液体加料速率来实现所需的输出和粒子大小。例如，通过电场结合毛细管或喷嘴加料，可产生电喷雾。有利地，通过喷雾器递送的至少一种抗TNF抗体组合物蛋白质的颗粒具有小于约10μm的颗粒大小，优选颗粒大小在约1μm至约5μm的范围内，最优选在约2μm至约3μm的范围内。
适合与喷雾器一起使用的至少一种抗TNF抗体组合物蛋白质的制剂通常包括以如下浓度存在于水性溶液中的抗体组合物蛋白质：约0.1mg至约100mg至少一种抗TNF抗体组合物蛋白质/mL溶液或mg/gm，或其中的任何范围或数值，例如但不限于.1、.2.、.3、.4、.5、.6、.7、.8、.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/mL或mg/gm。该制剂可包括如诸如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂之类的试剂，并且优选包括锌。该制剂还可包括用于稳定抗体组合物蛋白质的赋形剂或试剂，例如缓冲剂、还原剂、主体蛋白质(bulkprotein)或碳水化合物。可用于制备抗体组合物蛋白质的主体蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等等。可用于配制抗体组合物蛋白质的常用碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等等。抗体组合物蛋白质制剂还可以包括表面活性剂，其可减小或防止在形成气溶胶过程中因溶液雾化引起的表面诱导的抗体组合物蛋白质聚集。可以采用多种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。以制剂的重量计，用量将通常在0.001至14％之间。对于本发明的目的而言特别优选的表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等等。用于蛋白质，例如TNF抗体，或特定部分或变体的配制的本领域已知的其它试剂也可以包括在所述制剂中。
通过雾化器施用TNF抗体组合物：抗体组合物蛋白质可通过雾化器，例如喷射雾化器或超声雾化器施用。通常，在喷射式雾化器中，用压缩空气源通过孔口产生高速喷气流。在气体通过喷嘴膨胀时，会产生低压区，其通过连接液体贮液器的毛细管吸取抗体组合物蛋白质溶液。来自毛细管的液体流在其离开管时被剪切成不稳定的细丝或小滴，从而产生气溶胶。可以采用一系列构造、流速和挡板类型从给定的喷射式雾化器产生所需性能特征。在超声波雾化器中，用高频率电能产生振动机械能量，通常使用压电转换器。该能量被直接地或通过耦合流体传递至抗体组合物蛋白质的制剂，从而产生包含该抗体组合物蛋白质的气溶胶。有利地，通过喷雾器递送的抗体组合物蛋白质的颗粒具有小于约10μm的颗粒大小，优选颗粒大小在约1μm至约5μm的范围内，最优选在约2μm至约3μm的范围内。
适于与雾化器(喷射雾化器或超声雾化器)一起使用的至少一种抗TNF抗体的制剂通常包括约0.1mg至约100mg至少一种抗TNF抗体蛋白质/mL溶液的浓度。该制剂可包括如诸如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂之类的试剂，并且优选包括锌。该制剂还可包含用于使该至少一种抗TNF抗体组合物蛋白质稳定的赋形剂或物剂，如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或碳水化合物。可用于配制至少一种抗TNF抗体组合物蛋白质的主体蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等等。可用于配制至少一种抗TNF抗体的常用碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等等。至少一种抗TNF抗体制剂还可包含表面活性剂，其可减小或防止在形成气溶胶过程中因溶液雾化引起的表面诱导的所述至少一种抗TNF抗体的聚集。可以采用各种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。以制剂的重量计，用量将通常在0.001至4％之间。对于本发明而言特别优选的表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等等。其它本领域已知的用于蛋白质例如抗体蛋白质的配制的试剂也可以包括在所述制剂中。
通过定量吸入器施用TNF抗体组合物：在定量吸入器(MDI)中，推进剂、至少一种抗TNF抗体以及任何赋形剂或其它添加剂作为包括液化压缩气体的混合物装在罐中。致动的计量阀将混合物释放为优选包含粒度范围小于约10μm，优选约1μm至约5μm，并且最优选约2μm至约3μm的颗粒的气溶胶。期望的气溶胶粒径可通过采用本领域的技术人员已知的各种方法所产生(包括喷射研磨、喷雾干燥、临界点冷凝等)的抗体组合物蛋白质的制剂来获得。优选的定量吸入器包括由3M或Glaxo制造并采用氢氟烃推进剂的那些吸入器。
供用于定量吸入器装置的至少一种抗TNF抗体的制剂通常会包括含有至少一种抗TNF抗体的微细粉末在非水性介质中作为悬浮液，例如，在表面活性剂的帮助下悬浮在推进剂中。推进剂可以是用于该目的的任何常规材料，例如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷烃-134a)、HFA-227(氢氟烷烃-227)在内的烃类。优选的是，推进剂为氢氟烃。可选择表面活性剂来使所述至少一种抗TNF抗体在推进剂中作为悬浮液而得到稳定，保护活性剂免受化学降解等等。合适的表面活性剂包括脱水山梨糖醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等等。在一些情况下，使用诸如乙醇之类的溶剂的溶液气溶胶是优选的。另外的本领域已知用于配制蛋白质的物剂也可包含在该制剂中。
本领域普通技术人员会认识到，本发明的方法可通过用本文中未描述的装置经肺部施用至少一种抗TNF抗体组合物来实现。
口服制剂及施用：口服制剂依赖于共同施用佐剂(如，间苯二酚和非离子型表面活性剂例如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)以人工增加肠壁的渗透性，以及共同施用酶抑制剂(如，胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DFF)和抑肽酶(trasylol))以抑制酶促降解。可将供口服的固体型剂型的活性组分化合物与至少一种添加剂混合，所述添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、藻酸盐、几丁质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成的或半合成的聚合物和甘油酯。这些剂型还可含有其它类型的添加剂，例如无活性稀释剂、润滑剂如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸酯、防腐剂如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚、抗氧化剂如半胱氨酸、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、矫味剂、香味剂等。
片剂和丸剂可进一步加工成肠溶衣包衣制剂。供口服的液体制剂包括可允许用于医学用途的乳剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂和溶液制剂。这些制剂可以含有常用于所述领域的无活性稀释剂，例如水。脂质体作为胰岛素和肝素的药物递送系统已有描述(美国专利号4,239,754)。最近，混合氨基酸的人工聚合物(类蛋白)的微球体已用于递送药物(美国专利号4,925,673)。此外，美国专利号5,879,681和美国专利号5,5,871,753中描述的载体化合物用于经口递送生物活性剂是本领域已知的。
粘膜用制剂及施用：为了透过粘膜表面吸收，施用至少一种抗TNF抗体的组合物和方法包括乳剂，其包含许多亚微米粒子、粘膜粘附性大分子、生物活性肽和水性连续相，其通过实现乳剂粒子的粘膜粘附来促进透过粘膜表面的吸收(美国专利号5,514,670)。适于施用本发明的乳剂的粘膜表面可包括角膜、结膜、口腔、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠施用途径。用于阴道和直肠施用的制剂，如栓剂，可含有例如聚亚烷基二醇、凡士林、可可脂等作为赋形剂。鼻内施用制剂可以是固体并且含有例如乳糖作为赋形剂，或可以是鼻滴剂的水性或油性溶液。对于口腔施用，赋形剂包括糖类、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等(美国专利号5,849,695)。
透皮制剂及施用：对于透皮施用，将该至少一种抗TNF抗体包囊在递送装置例如脂质体或聚合型纳米粒子、微粒、微胶囊或微球体(统称为微粒，除非特别指出)中。有多种合适的装置是已知的，包括由合成聚合物和天然聚合物制成的微颗粒，所述合成聚合物例如聚羟基酸(如聚乳酸、聚乙醇酸以及它们的共聚物)、聚原酸酯、聚酸酐和聚磷腈，所述天然聚合物例如胶原、聚氨基酸、白蛋白和其它蛋白质、海藻酸盐和其它多糖以及它们的组合(美国专利号5,814,599)。
长期施用及制剂：通过一次施用在长时间周期内，例如一周到一年内将本发明化合物递送给受治疗者，有时候可能是期望的。可以利用多种缓释剂型、储库(depot)剂型或植入剂型。例如，剂型可包含在体液中溶解度较低的化合物的药学上可接受的无毒盐，例如(a)与诸如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、丹宁酸、双羟萘酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘单-或二-磺酸、聚半乳糖醛酸等多元酸的酸加成盐；(b)与诸如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等多价金属阳离子的盐，或与由例如N,N'-二苄基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子的盐；或(c)(a)与(b)的组合，例如鞣酸锌盐。此外，可将本发明的化合物或，优选地，相对难溶的盐例如上面所述的那些盐在适于注射的凝胶中，例如，在具有例如芝蔴油的单硬脂酸铝凝胶中配制。尤其优选的盐为锌盐、鞣酸锌盐、双羟萘酸盐等等。用于注射的另一种类型的缓释储库型制剂含有经分散以在缓慢降解、无毒、非抗原性聚合物中包囊的化合物或盐，所述聚合物为例如美国专利号3,773,919中描述的聚乳酸/聚乙醇酸聚合物。还可将化合物或优选地，相对难溶的盐例如上面所述的那些盐配制成胆固醇基质硅橡胶丸，尤其为了用于动物。附加的缓释、储库或植入制剂，例如气体或液体脂质体是文献中已知的(美国专利号5,770,222和“Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker,Inc.，N.Y.，1978)。
已总体地描述了本发明，通过参考下面的实例将更容易理解本发明，所述实例仅以示例的方式给出并且无意于作为限制。
实施例1：TNF抗体在哺乳动物细胞中的克隆和表达：
典型的哺乳动物表达载体含有至少一个启动子元件(其介导mRNA的转录起始)，抗体编码序列，转录物的转录终止和多腺苷酸化所需的信号。附加元件包括增强子、Kozak序列以及侧接用于RNA剪接的供体和受体位点的间隔序列。高效率的转录可以使用下列序列来实现：来自SV40的早期启动子和晚期启动子，来自逆转录病毒例如RSV、HTLVI、HIVI的长末端重复序列(LTRS)，和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子。然而，也可以使用细胞元件(例如人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明的合适表达载体包括例如诸如以下的载体：pIRES1neo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN或pLNCX(Clonetech Labs,Palo Alto,CA)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela 293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos 1、Cos 7和CV 1、quail QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞。
或者，基因可以在含有整合进染色体内的所述基因的稳定细胞系中表达。与选择标记例如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素共转染可使得能鉴定和分离转染的细胞。
还可以扩增所转染的基因以大量表达所编码的抗体。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可用于开发携带几百或甚至几千拷贝的所关注基因的细胞系。另一种可用的选择标记是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等人，Biochem.J.227:277-279(1991)；Bebbington等人，Bio/Technology 10:169-175(1992))。使用这些标记，将哺乳动物细胞在选择培养基中生长，具有最高抗性的细胞得以选择。这些细胞系含有整合至染色体内的扩增基因。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和NSO细胞通常用于生产抗体。
表达载体pC1和pC4含有Rous肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等人，Molec.Cell.Biol.5:438-447(1985))和CMV-增强子的片段(Boshart等人，Cell 41:521-530(1985))。多克隆位点，例如，具有限制性内切酶切割位点BamHI、XbaI和Asp7l8的多克隆位点，有助于所关注基因的克隆。载体另外含有大鼠前胰岛素原基因的3'内含子、多腺苷酸化和终止信号。
在CHO细胞中的克隆和表达：将载体pC4用于表达TNF抗体。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr(ATCC登记号37146)的衍生物。该质粒含有在SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。用这些质粒转染的缺乏二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢细胞或其它细胞，可通过使细胞在补充有化学治疗剂甲氨蝶呤的选择培养基(例如α-MEM，Life Technologies,Gaithersburg,MD)中生长进行选择。DHFR基因在对甲氨蝶呤(MTX)具有抗性的细胞中的扩增已得到充分记载(参见例如F.W.Alt等人，J.Biol.Chem.253:1357-1370(1978)；J.L.Hamlin和C.Ma,Biochem.et Biophys.Acta 1097:107-143(1990)；以及M.J.Page和M.A.Sydenham,Biotechnology 9:64-68(1991))。在浓度渐增的MTX中生长的细胞由于DHFR基因扩增造成超量产生靶酶DHFR而发展出对药物的抗性。如果第二基因与DHFR基因连接，则它通常被共扩增和过表达。本领域已知的是，该方法可用于开发携带超过1,000个拷贝的扩增基因的细胞系。随后，当甲氨蝶呤被取出时，获得含有整合到宿主细胞的一个或多个染色体内的扩增基因的细胞系。
为了表达所关注的基因，质粒pC4含有Rous肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen等人，Molec.Cell.Biol.5:438-447(1985))和从人巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因的增强子分离的片段(Boshart等人，Cell 41:521-530(1985))。启动子的下游是使基因能整合的BamHI、XbaI和Asp718限制性内切酶切割位点。在这些克隆位点之后，该质粒含有大鼠前胰岛素原基因的3'内含子和多腺苷酸化位点。其它高效率的启动子也可以用于表达，例如人β-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或来自其它逆转录病毒例如HIV和HTLVI的长末端重复序列。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表达系统和类似系统可以用于在哺乳动物细胞中以受调控的方式表达TNF(M.Gossen和H.Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551(1992))。对于mRNA的多腺苷酸化，也可以使用(例如)来自人生长激素或珠蛋白基因的其它信号。携带整合至染色体中的所关注基因的稳定细胞系也可以在与选择标记例如gpt、G418或潮霉素共转染时进行选择。有利的是在开始时使用不止一种选择标记，例如，G418加上甲氨蝶呤。
将质粒pC4用限制性内切酶消化，然后通过本领域已知的方法用小牛肠磷酸酶去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶分离载体。
然后将编码所述分离的可变区和恒定区的DNA与该去磷酸化的载体用T4DNA连接酶连接。然后转化大肠杆菌HB101或XL-1Blue细胞，并使用例如限制性内切酶分析来鉴定含有插入质粒pC4中的片段的细菌。
将缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于转染。将5g表达质粒pC4与0.5g质粒pSV2-neo用lipofectin共转染。质粒pSV2-neo含有显性选择标记即来自Tn5的neo基因，其编码赋予对包括G418在内的一组抗生素的抗性的酶。将细胞接种在补充有1g/mLG418的α-MEM中。2天后，将细胞用胰蛋白酶处理并接种在杂交瘤克隆板(Greiner，德国)中的补充有10、25或50ng/mL甲氨蝶呤加1g/mL G418的α-MEM中。约10-14天后，将单一克隆用胰蛋白酶处理并接种在6孔培养皿或10mL瓶中，其中使用不同浓度的甲氨蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)。然后将在最高浓度甲氨蝶呤下生长的克隆转移至含有更高浓度甲氨蝶呤(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)的新的6孔板中。重复相同的步骤直到获得在100-200mM浓度下生长的克隆。例如，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹或通过反相HPLC分析，可对所需基因产物的表达进行分析。
实施例2：用转基因小鼠产生与人TNF反应的高亲和力人IgG单克隆抗体：
总结使用包含人重链和轻链免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生可用于治疗性抑制TNF作用的高亲和力完全人单克隆抗体，从而治疗一种或多种TNF介导的疾病。将包含人重链和轻链可变区和恒定区抗体转基因的(CBA/J×C57/BL6/J)F2杂种小鼠用人重组TNF进行免疫(Taylor等人，Intl.Immunol.6:579-591(1993)；Lonberg等人，Nature 368:856-859(1994)；Neuberger,M.,Nature Biotech.14:826(1996)；Fishwild等人，NatureBiotechnology 14:845-851(1996))。几次融合得到了一组或多组完全人TNF反应性IgG单克隆抗体。还进一步对该完全人抗TNF抗体进行了表征。所有都为IgG1κ。已发现此类抗体具有介于1×109与9×1012之间某处的亲和力常数。这些完全人单克隆抗体的意料不到的高亲和力使得它们为适用于TNF相关疾病、病理或障碍中的治疗应用的候选。
缩写：BSA—牛血清白蛋白；CO2—二氧化碳；DMSO—二甲基亚砜；EIA—酶免疫测定法；FBS—胎牛血清；H2O2—过氧化氢；HRP—辣根过氧化物酶；ID—真皮内；Ig—免疫球蛋白；TNF—组织坏死因子α；IP—腹膜内注射；IV—静脉注射；Mab–单克隆抗体；OD—光密度；OPD—邻苯二胺二盐酸盐；PEG—聚乙二醇；PSA—青霉素，链霉素，两性霉素；RT—室温；SQ—皮下注射；v/v——体积/体积；w/v——重量/体积。
材料和方法。
动物：可表达人抗体的转基因小鼠在本领域中是已知的(并且可商购获得(例如获自GenPharm International,San Jose,CA；Abgenix,Freemont,CA，以及其它)，其表达人免疫球蛋白而非小鼠IgM或Igκ。例如，此类转基因小鼠包含人序列转基因，该转基因经历V(D)J结合、重链类别转换和体细胞突变以产生全套人序列免疫球蛋白(Lonberg等人，Nature368:856-859(1994))。轻链转基因可例如部分地源于包括几乎一半种系人Vκ区的酵母人工染色体克隆。此外，重链转基因可编码人μ和人γ1两者(Fishwild等人，NatureBiotechnology 14:845-851(1996))和/或γ3恒定区。可在免疫和融合过程中使用源于适当基因型谱系的小鼠来产生TNF的全人单克隆抗体。
免疫：可使用一种或多种免疫方案产生抗TNF人杂交瘤。首先，在以下示例性免疫方案后可进行几次融合，但也可使用其它类似的已知方案。用在100-400μL(例如200μL)最终体积中经等体积TITERMAX或完全弗氏佐剂乳化的1-1000μg重组人TNF，经IP和/或ID对几只14-20周龄的雌性和/或外科阉割转基因雄性小鼠进行免疫。每只小鼠也可任选地在两个SQ部位的每一处接受以100μL生理盐水配得的1-10μg。然后，可在1-7、5-12、10-18、17-25和/或21-34天后，用等体积TITERMAX或不完全弗氏佐剂乳化的TNF经IP(1-400μg)和SQ(1-400μg×2)对小鼠进行免疫。在12-25和25-40天后，可通过眼框后穿刺(不用抗凝血剂)对小鼠放血。然后使血液于室温凝固一小时，收集血清并根据已知方法使用TNF EIA测定来滴定。当重复的注射不导致滴度增大时进行融合。此时，可给予小鼠稀释于100μL生理盐水中的1-400μg TNF的最终IV加强注射。三天后，可将小鼠通过颈椎脱位实施安死术，并且将脾无菌取出并浸于含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素B(PSA)的10mL冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。通过用PSA-PBS无菌灌注脾来收集脾细胞。用冷PSA-PBS洗涤细胞一次，用台盼蓝染料排除法计数细胞，并将细胞重悬浮于含有25mM Hepes的RPMI 1640介质中。
细胞融合：可根据例如本领域所知的已知方法，将鼠骨髓瘤细胞与活脾细胞以1:1至1:10的比率进行融合。作为非限制性示例，脾细胞和骨髓瘤细胞可团在一起。然后可于37℃在30秒内将沉淀缓慢重悬在1mL的50％(w/v)PEG/PBS溶液(PEG分子量1,450，Sigma)。随后可通过在1分钟内缓慢加入含有25mM Hepes的10.5mL RPMI 1640培养基(37℃)来终止融合。以500-1500rpm将融合的细胞离心5分钟。然后使细胞重悬于HAT培养基(含有25mMHepes的RPMI 1640培养基、10％胎儿克隆I血清(Hyclone)、1mM丙酮酸钠、4mM L-谷氨酰胺、10μg/mL庆大霉素、2.5％Origen培养补充剂(Fisher)、10％653-调节的RPMI 1640/Hepes培养基、50μM 2-巯基乙醇、100μM次黄嘌呤、0.4μM氨蝶呤和16μM胸腺嘧啶核苷)中，随后以200μL/孔接种于十五个96孔平底组织培养板中。然后将板置于含有5％CO2和95％空气的37℃潮湿培养箱中7-10天。
在小鼠血清中检测人IgG抗TNF抗体：固相EIA可用于筛选小鼠血清的对人TNF特异的人IgG抗体。简而言之，可用PBS配制的2μg/Ml TNF涂布这些板过夜。在用含有0.02％(v/v)吐温20的0.15M盐水洗涤之后，可用1％(w/v)BSA的PBS溶液以200μL/孔在室温下封闭孔1小时。可将板立即使用或于-20℃冷冻以供将来使用。将小鼠血清稀释液于室温以50μL/孔在TNF涂布的板上温育1小时。将板清洗干净，然后用以1:30,000稀释于1％BSA-PBS中的50μL/孔的Fc特异性HRP标签的山羊抗人IgG，在室温下探测1分钟。可再次洗涤这些板，在室温下15分钟内以100μL/孔加入柠檬酸盐-磷酸盐底物溶液(0.1M柠檬酸和0.2M磷酸钠，0.01％H2O2和1mg/mL OPD)。然后以25μL/孔加入终止溶液(4N硫酸)，并经由自动板分光光度计在490nm处读取OD值。
在杂交瘤上清液中检测完全人免疫球蛋白：可使用合适的EIA检测分泌完全人免疫球蛋白的阳性生长杂交瘤。简而言之，可将96气孔(pop-out)板(VWR，610744)在4℃下用碳酸钠缓冲液配制的10μg/mL山羊抗-人IgG Fc涂布过夜。洗涤板，用1％BSA-PBS于37℃封闭一小时，立即使用或于-20℃冷冻。将未稀释的杂交瘤上清液置于板上，并在37℃下温育一小时。洗涤板并于37℃用在1％BSA-PBS中以1:10,000稀释的HRP标签的山羊抗-人k探测1小时。然后，将板与上述底物溶液一起温育。
全人抗TNF反应性的测定：可使用合适的RIA或其它测定来同时测定如上杂交瘤对TNF的反应性。例如，使上清液于如上山羊抗-人IgG Fc板上温育，洗涤，然后在室温下用放射性标记的TNF以适当计数/孔探测1小时。将孔用PBS洗涤两次，并用合适的计数器对结合的放射性标记的TNF定量。
可使分泌人IgG1κ抗TNF的杂交瘤在细胞培养物中扩增，并通过有限稀释进行连续亚克隆。可使所得的克隆群扩增，并冷藏于冷冻的培养基(95％FBS，5％DMSO)中并储存于液氮中。
同种型：可用与筛选特定滴度的小鼠免疫血清所用的类似方式的EIA来实现抗体的同种型测定。可将TNF涂布于上述96-孔板上，并可将2μg/mL纯化的抗体于室温在板上温育一小时。洗涤板并于室温用在1％BSA-PBS中以1:4000稀释的HRP标签的山羊抗-人IgG1或HRP标记的山羊抗-人IgG3探测一小时。再次洗涤板并与上述底物溶液一起温育。
人抗人TNF抗体与人TNF的结合动力学：抗体的结合特征可适当地用例如TNF捕获EIA和BIAcore技术来评估。对纯化的人TNF抗体结合上述测定中经2μg/mL的TNF涂布的EIA板的梯度浓度进行评估。然后，可将OD值表示为显示相对结合效率的半对数曲线。
可例如如下或通过任何其它已知的合适方法来获得定量结合常数。将BIAcoreCM-5(羧甲基)芯片置入BIAcore 2000装置中。使HBS缓冲液(0.01M HEPES，0.15M NaCl，3mMEDTA，0.005％v/v P20表面活性剂，pH 7.4)以5μL/分钟流过芯片的流动池，直至获得稳定的基线。将15mg EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基-氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐)在200μL水中的溶液(100μL)加至2.3mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)在200μL水中的100μL溶液。将四十(40)μL的所得溶液注射到薄片上。6μL的人TNF溶液(15μg/mL溶于10mM醋酸钠中，pH 4.8)注入芯片上，导致增大约500RU。将缓冲液更换成TBS/Ca/Mg/BSA运行缓冲液(20mM Tris,0.15M氯化钠，2mM氯化钙，2mM乙酸镁，0.5％Triton X-100，25μg/mL BSA，pH 7.4)并流过芯片过夜，以使其平衡并水解或封端任何未反应的琥珀酰亚胺酯。
将抗体以33.33nM、16.67nM、8.33nM和4.17nM溶解于运行缓冲液中。将流量调节至30μL/分钟并将器械温度调节至25℃。两个流动池用于动力学运行，TNF固定于一个流动池上(样品)并且第二个为未衍生化的流动池(空白)。将120μL的各抗体浓缩物以30μL/分钟(结合相)注射在流动池上，之后为不间断的360秒缓冲液流(解离相)。通过两次顺序注射各30μL的2M硫氰酸胍使芯片表面再生(组织坏死因子α/抗体复合物解离)。
用如本领域已知的BIA evaluation 3.0或CLAMP 2.0进行数据分析。对各个抗体浓度而言，从样品感应图减去空白感应图。对于解离(kd，sec-1)和缔合(ka，mol-1sec-1)常数进行整体拟合，并计算解离常数(KD，mol)(kd/ka)。在抗体亲和力高到足以使所捕集抗体的RU>100情况下，运行附加的抗体稀释液。
结果与讨论：
抗人TNF单克隆抗体的产生：进行几次融合并将各个融合物接种于产生几十种对人TNF特异的抗体的15块板(1440个孔/融合物)上。在这些之中，一些已被发现由人和小鼠Ig链的组合所组成。剩余的杂交瘤分泌仅由人重链和轻链构成的抗TNF抗体。在人杂交瘤中，所有预期为IgG1κ。
人抗人TNF抗体的结合动力学：ELISA分析证实，从大多数和所有这些杂交瘤纯化的抗体以浓度依赖性方式与TNF结合。图1-2示出这些抗体的相对结合效率结果。在这种情况下，测量抗体对其关连抗原(表位)的亲合力。应当指出的是，TNF直接结合EIA板可导致蛋白质变性，并且表观结合亲和力不能反映与未变性蛋白质结合。在浓度范围内发现百分之五十结合。
定量结合常数是用对该人抗体的BIAcore分析来获得，揭示出几种人单克隆抗体具有非常高的亲和力，KD在1×10-9至7×10-12的范围内。
结论：
使用以人TNF免疫的包含人可变区和恒定区抗体转基因的杂种小鼠的脾细胞进行几次融合。产生一组若干种IgG1κ同种型的完全人TNF反应性IgG单克隆抗体。还进一步对该完全人抗TNF抗体进行了表征。几种所产生的抗体具有1×109至9×1012之间的亲和力常数。这些完全人单克隆抗体的意料不到的高亲和力使得它们适用于在TNF依赖性疾病、病理或相关状况中的治疗应用。
实施例3：与人TNFα反应的人IgG单克隆抗体的产生：
总结将包含人重链和轻链两者的可变区和恒定区抗体转基因的(CBA/J×C57BL/6J)F2杂种小鼠(1-4)用重组人TNFα进行免疫。一次融合(称为GenTNV)得到共八种结合固定的重组人TNFα的人IgG1κ单克隆抗体。在鉴定之后不久，将八种细胞系转移至MolecularBiology以供进一步表征。因为这些Mab是完全人序列，它们预期比人cA2(类克)的免疫原性更小。
缩写：BSA—牛血清白蛋白；CO2—二氧化碳；DMSO—二甲基亚砜；EIA—酶免疫测定法；FBS—胎牛血清；H2O2—过氧化氢；HC—重链；HRP—辣根过氧化物酶；ID—真皮内；Ig—免疫球蛋白；TNF—组织坏死因子α；IP—腹膜内注射；IV—静脉注射；Mab–单克隆抗体；OD—光密度；OPD—o-苯二胺二盐酸盐；PEG—聚乙二醇；PSA—青霉素，链霉素，两性霉素；RT—室温；SQ—皮下注射；TNFα—肿瘤坏死因子α；v/v——体积/体积；w/v—重量/体积。
介绍：利用包含人重链和轻链免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生对重组人TNFα特异的完全人单克隆抗体。希望可使用这些独特的抗体，原因是cA2(类克)用于治疗性地抑制涉及TNFα-介导的疾病的炎性过程，并且有益效果为血清半衰期增大并且与免疫原性相关的副作用减小。
材料和方法：
动物。表达人免疫球蛋白而非小鼠IgM或Igκ的转基因小鼠由GenPharmInternational开发。这些小鼠包含功能性人抗体转基因，该转基因经历V(D)J结合、重链类别转换和体细胞突变以产生全套抗原特异性人免疫球蛋白(1)。轻链转基因部分地源于包括几乎一半种系人Vκ基因座的酵母人工染色体克隆。除几种VH基因之外，重链(HC)转基因编码人μ和人γ1(2)两者和/或γ3恒定区。在免疫和融合过程中使用源于HCo12/KCo5基因型谱系的小鼠来产生此处所述的单克隆抗体。
人TNFα的纯化：使用装有与Sepharose 4B(Pharmacia)偶联的TNFα受体-Fc融合蛋白(p55-sf2)(5)的柱，通过亲和层析从C237A细胞的组织培养上清液纯化人TNFα。使细胞上清液与九分之一其体积的10×Dulbecco PBS(D-PBS)混合，并在4℃下以4mL/分钟通过柱。然后用PBS洗涤柱，并且用0.1M柠檬酸钠(pH 3.5)对TNFα进行洗脱并用2M Tris-HCl pH8.5中和。使纯化的TNFα经缓冲交换到10mM Tris、0.12M氯化钠(pH 7.5)中，并过滤通过0.2um注射过滤器。
免疫：在第0、12和28天，将大约16周龄的雌性GenPharm小鼠用等体积Titermax佐剂乳化的共100μg TNFα(lot JG102298或JG102098)经IP(200μL)和ID(100μL，在尾巴根部)进行免疫。在21和35天，通过眼框后穿刺(不用抗凝血剂)对小鼠放血。使血液于室温凝固一小时，收集血清并使用TNFα固相EIA测定来滴定。允许小鼠在第28天注射后休息七周，然后进行融合(称为GenTNV)。然后，可给予具有针对TNFα的1:160特异性人IgG滴度的小鼠稀释于100μL生理盐水的50μg TNFα的最终IV加强注射。三天后，将小鼠通过颈椎脱位实施安死术，并且将脾无菌取出并浸于含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素B(PSA)的10mL冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。通过用PSA-PBS无菌灌注脾来收集脾细胞。用冷PSA-PBS洗涤细胞一次，用库尔特计数器对细胞计数，并使细胞重悬浮于含有25mM Hepes的RPMI 1640介质中。
细胞系：非分泌性小鼠骨髓瘤融合配偶体653被接纳到细胞生物学服务(CellBiology Services，CBS)科(5-14-97，来自Centocor的产品开发小组)中。使细胞系在补充有10％(v/v)FBS(Cell Culture Labs)、1mM丙酮酸钠、0.1mM NEAA、2mM L-谷氨酰胺(所有得自JRH Biosciences)的RPMI培养基(JRH Biosciences)中扩增并冷藏于95％FBS和5％DMSO(Sigma)中，随后储存于CBS的蒸汽相液氮冷冻机中。细胞库是无菌的(QualityControl Centocor,Malvern)并且不含支原体(Bionique Laboratories)。使细胞维持为对数期培养直至融合。用PBS对其进行洗涤，计数，并在融合前经由台盼蓝染料排除法确定活力(>95％)。
人TNFα由Centocor的分子生物学科产生的重组细胞系(称为C237A)制得。使细胞系在补充有5％(v/v)FBS(Cell Culture Labs)、2mM L-谷氨酰胺(所有得自JRHBiosciences)和0.5g/mL霉酚酸的IMDM培养基(JRH Biosciences)中扩增，并冷藏于95％FBS和5％DMSO(Sigma)中，随后储存于CBS的蒸汽相液氮冷冻机中(13)。细胞库是无菌的(Quality Control Centocor,Malvern)并且不含支原体(Bionique Laboratories)。
细胞融合：使用1:1比率的653鼠源骨髓瘤细胞和活的鼠源脾细胞进行细胞融合。简而言之，脾细胞和骨髓瘤细胞团在一起。使沉淀于37℃在30秒时间内缓慢重悬于1mL的50％(w/v)PEG/PBS溶液(PEG分子量为1,450g/摩尔，Sigma)中。通过在1分钟内缓慢加入10.5mL的RPMI培养基(无添加剂)(JRH)(37℃)来终止融合。以750rpm将融合的细胞离心5分钟。然后，使细胞重悬于HAT培养基(含有10％胎牛血清(JRH)的RPMI/HEPES培养基、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、10μg/mL庆大霉素、2.5％Origen培养补充剂(Fisher)、50μM 2-巯基乙醇、1％653-调节的RPMI培养基、100μM次黄嘌呤、0.4μM氨蝶呤和16μM胸腺嘧啶核苷)中，并随后以200μL/孔接种于五个96孔平底组织培养板中。然后将板置于含有5％CO2和95％空气的37℃潮湿培养箱中7-10天。
在血清小鼠中检测人IgG抗TNFα抗体：固相EIA用于筛选小鼠血清的对人TNFα特异的人IgG抗体。简而言之，可用PBS配制的1μg/mL TNFα涂布这些板过夜。在用含有0.02％(v/v)吐温20的0.15M盐水洗涤之后，用1％(w/v)BSA的PBS溶液以200μL/孔在室温下封闭孔1小时。将板立即使用或于-20℃冷冻以供将来使用。小鼠血清于室温以50μL/孔在人TNFα涂布的板上按两倍系列稀释度温育1小时。将板清洗干净，然后用以1:30,000稀释于1％BSA-PBS中的50μL/孔的Fc特异性HRP标签的山羊抗人IgG(Accurate)，在室温下探测1分钟。再次洗涤这些板，在室温下15分钟内以100μL/孔加入柠檬酸盐-磷酸盐底物溶液(0.1M柠檬酸和0.2M磷酸钠，0.01％H2O2和1mg/mL OPD)。然后以25μL/孔加入终止溶液(4N硫酸)并用自动板分光光度计在490nm处读取OD值。
在杂交瘤上清液中检测完全人免疫球蛋白：因为GenPharm小鼠能够产生小鼠和人免疫球蛋白链两者，对于人轻链和人重链两者的存在，使用两个独立的EIA测定来测试阳性生长杂交瘤克隆。如上所述涂布板，将未稀释的杂交瘤上清液置于板上，并在37℃下温育一小时。洗涤板并于37℃用在1％BSA-HBSS中以1:10,000稀释的HRP-缀合的山羊抗-人k(Southern Biotech)抗体或在1％BSA-HBSS中稀释至1:30,000的HRP-缀合的山羊抗-人IgGFc特异性抗体探测一小时。然后板与上述底物溶液一起温育。弃去在抗-人k和抗-人IgG FcEIA形式中均未给出阳性信号的杂交瘤克隆。
同种型：用与筛选特定滴度的小鼠免疫血清所用的类似方式的EIA来实现抗体的同种型测定。4℃下，将EIA板用碳酸钠缓冲液配制的10g/mL山羊抗-人IgG(H+L)涂布过夜并如上所述进行封闭。在室温下，将来自24孔培养物的纯上清液在板中温育一小时。洗涤板并于室温用在1％BSA-PBS中以1:4000稀释的HRP-标签的山羊抗-人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(结合位点)探测一小时。再次洗涤板并与上述底物溶液一起温育。
结果与讨论：完全人抗-人TNFα单克隆抗体的产生：由经重组人TNFα蛋白质免疫的GenPharm小鼠进行一次融合(称为GenTNV)。从该融合中，筛选出196种阳性生长杂交体。鉴定出分泌与人TNFα反应的完全人IgG抗体的八种杂交瘤细胞系。这八种细胞系各自分泌人IgG1κ同种型免疫球蛋白，并且所有通过有限稀释亚克隆两次，获得稳定的细胞系(>90％同源)。细胞系名称和相应的C代码名称列于表1中。每种细胞系冷冻于液氮中储存的12个小瓶研究细胞库。
将从24孔培养皿的孔所收集的八种细胞系中每者的亲代细胞送至分子生物学组(2-18-99)以供转染和进一步表征。
表1：GenTNV细胞系名称
结论：
利用经Centocor制备的重组人TNFα免疫的包含人可变区和恒定区抗体转基因的杂种小鼠的脾细胞进行GenTNV融合。产生八种完全人IgG1κ同种型TNFα反应性IgG单克隆抗体。将亲代细胞系转移至分子生物学组以供进一步表征和开发。这些新人抗体之一可被证明可用于抗炎，潜在有益效果在于免疫原性和过敏型并发症相比于类克有所降低。
参考文献
Taylor等人，International Immunology 6:579-591(1993)。
Lonberg等人，Nature 368:856-859(1994)。
Neuberger,M.Nature Biotechnology 14:826(1996)。
Fishwild等人，Nature Biotechnology 14:845-851(1996)。
Scallon等人，Cytokine 7:759-770(1995)。
实施例4：表达人抗TNFα抗体的细胞系的克隆和制备：
总结发现具有TNV名称的一组八种人单克隆抗体(mAb)以明显较高亲合力结合固定的人TNFα。八种mAb中有七种示出有效地阻断huTNFα结合重组TNF受体。编码七种mAb的DNA的序列分析证实所有的mAb都具有人V区。DNA序列还显示，三对mAb彼此相同，使得八种mAb的原始小组仅包含由TNV14、TNV15、TNV148和TNV196表示的四种不同的mAb。基于推导的mAb氨基酸序列分析和体外TNFα中和数据结果，mAb TNV148和TNV14被选择用于进一步研究。
因为在数据库搜索期间，TNV148重链中75位处的脯氨酸残基(框架3)并未在同一子组中其它人抗体中该位置处发现，所以进行DNA诱变以在该位置编码丝氨酸残基，从而使其与已知种系框架序列一致。丝氨酸修饰的mAb命名为TNV148B。将编码TNV148B和TNV14的重链和轻链可变区的PCR-扩增的DNA克隆到新制备的表达载体中，该表达载体基于最近克隆的另一人mAb(12B75)的重链和轻链基因，即公开于2000年10月7日提交的标题为IL-12Antibodies,Compositions,Methods and Uses的美国专利申请号60/236,827，公布为WO02/12500(其全文以引用方式并入本文)。
将P3X63Ag8.653(653)细胞或Sp2/0-Ag14(Sp2/0)小鼠骨髓瘤细胞用相应的重链和轻链表达质粒进行转染，并通过对产生高水平重组TNV148B和TNV14(rTNV148B和rTNV14)mAb的细胞系两轮亚克隆来筛选。生长曲线和mAb产生随时间推移的稳定性的评价表明，653-转染子克隆C466D和C466C在用过的培养物中稳定地产生大约125g/ml的rTNV148BmAb，而Sp2/0转染子1.73-12-122(C467A)在用过的培养物中稳定产生大约25g/ml的rTNV148B mAb。类似的分析表明Sp2/0-转染子克隆C476A在用过的培养物中产生18g/ml的rTNV14。
介绍：源于人TNFα-免疫的GenPharm/Medarex小鼠(HCo12/KCo5基因型)的一组八种mAb先前示出结合人TNFα并且具有完全人IgG1，k同种型。通过评价本发明的示例性mAb阻断TNFα结合重组TNF受体的能力，使用简单的结合测定来确定它们是否可能具有TNFα-中和活性。基于那些结果、DNA序列结果、以及几种mAb的体外表征，TNV148作为mAb被选择以供进一步表征。
将编码TNV148mAb的DNA序列克隆，修饰成适合编码合适恒定区的基因表达载体，引入充分表征的653和Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞中，并且筛选的所得转染细胞系，直至鉴定出比初始杂交瘤细胞系产生高40倍的mAb的亚克隆。
材料和方法。
试剂和细胞：TRIZOL试剂购自Gibco BRL.蛋白酶K可购自Sigma ChemicalCompany。逆转录酶可购自Life Sciences,Inc。Taq DNA聚合酶可购自erkin Elmer Cetus或Gibco BRL。限制性酶购自New England Biolabs。QIAquick PCR纯化试剂盒得自Qiagen。QuikChange定点诱变试剂盒购自Stratagene。Wizard plasmid miniprep试剂盒和RNasin得自Promega。Optiplates可购自Packard。125碘购自Amersham。定制的寡核苷酸购自Keystone/Biosource International。该工作中所用的寡核苷酸的名称、标识号和序列示于表2中。
表2：用于克隆、工程化、或定序TNV mAb基因的寡核苷酸：
由寡核苷酸5'14s和HuH-J6编码的氨基酸在序列上方示出。“M”氨基酸残基表示翻译起始密码子。寡核苷酸5'14s和HuH-J6中加下划线的序列分别标记BsiWI和BstBI限制位点。HuH-J6中的斜线对应于外显子/内含子分界。需注意，序列对应于负链的寡核苷酸以3'-5'方向书写。
获得653小鼠骨髓瘤细胞的单个冷冻小瓶。使小瓶在该天解冻，在T烧瓶的IMDM、5％FBS、2mM谷氨酰胺(培养基)中扩增。将这些细胞维持为连续培养直至2至3周后用此处所述的抗TNF DNA对其进行转染。在解冻日期后5天收获得到一部分培养物，通过离心沉淀，并重悬于95％FBS、5％DMSO中，等分到30个小瓶中，冷冻，并保存以供未来使用。相似地，获得Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞的单个冷冻小瓶。使小瓶解冻，如上所述制备新冻结物，并将冷冻小瓶储存于CBC冷冻盒AA和AB。这些细胞解冻并用于此处所述的所有Sp2/0转染。
抑制TNF结合受体的测定：包含TNV mAb的杂交瘤细胞上清液用于mAb阻断125I-标签的TNFα结合重组TNF受体融合蛋白p55-sf2的能力的测定(Scallon等人(1995)Cytokine7:759-770)。在37℃下一小时温育期间，将用PBS以0.5g/ml配制的50L p55-sf2加至Optiplates来涂布孔。使用PBS/0.1％BSA作为稀释剂在96孔圆底板中制备连续稀释的八种TNV细胞上清液。包含抗-IL-18mAb的细胞上清液作为阴性对照包括在内，并且掺加cA2(抗TNF嵌合抗体，类克，美国专利号5,770,198，其全文以引用方式并入本文)的相同抗-IL-18上清液作为阳性对照包括在内。将125I-标签的TNFα(58：Ci/：g，D.Shealy)加入100L的细胞上清液中，以具有5ng/ml的最终TNFα浓度。将混合物在室温下预温育一小时。洗涤经涂布的Optiplates以移除未结合的p55-sf2，将50L的125I-TNFα/细胞上清液混合物转移至Optiplates。在室温下保持2小时之后，用PBS-Tween洗涤Optiplates三次。加入100L的Microscint-20，使用TopCountγ计数器测定cpm结合。
V基因的扩增和DNA序列分析：将杂交瘤细胞用PBS洗涤一次，然后添加TRIZOL试剂以进行RNA制备。使7×106至1.7×107个细胞重悬于1ml TRIZOL中。在添加200μL氯仿之后，剧烈摇动管。将样品在4℃下离心10分钟。将水相转移至新鲜微量离心管中，加入等体积的异丙醇。剧烈摇动管并允许在室温下温育10分钟。然后将样品在4℃下离心10分钟。将沉淀用1ml的70％乙醇洗涤一次并在真空干燥器中简单干燥。用40μL的DEPC处理的水使RNA沉淀重悬。RNA制剂的量通过在1％琼脂糖凝胶中分级分离0.5μL来测定。使RNA储存于–80℃冷冻机中直至使用。
为了制备重链和轻链cDNA，制备如下混合物：在11.5μL体积中，包含3μL的RNA以及1μg的寡核苷酸119(重链)或寡核苷酸117(轻链)(参见表1)。使混合物在水浴中于70℃温育10分钟，然后在冰上冷却10分钟。制备由2.5μL的10X逆转录酶缓冲液、10μL的2.5mM dNTP、1μL的逆转录酶(20单位)和0.4μL的核糖核酸酶抑制剂RNasin(1单位)组成的独立混合物。将13.5μL的该混合物加至11.5μL的冷却的RNA/寡核苷酸混合物，然后使反应物于42℃温育40分钟。然后，将cDNA合成反应物储存于–20℃冷冻机中直至使用。
将未纯化的重链和轻链cDNA用作模板来PCR-扩增可变区编码序列。同时测试五对寡核苷酸(366/354、367/354、368/354、369/354和370/354，表1)引发重链DNA扩增的能力。同时测试两对寡核苷酸(362/208和363/208)引发轻链DNA扩增的能力。使用2单位的PLATINUMTM高保真度(HIFI)Taq DNA聚合酶以50μL的总体积实施PCR反应。各个反应包括2μL的cDNA反应物、10皮摩尔的各寡核苷酸、0.2mM dNTP、5μL的10×HIFI缓冲液和2mM硫酸镁。热循环仪程序为95℃5分钟，之后进行30个循环(94℃30秒，62℃30秒，68℃1.5分钟)。然后在68℃下最终温育10分钟。
为了制备PCR产物以用于直接DNA测序，根据制造商规程用QIAquickTM PCR纯化试剂盒对其进行纯化。使用50μL无菌水从离心柱洗脱DNA，接着用真空干燥器干燥至10μL的体积。然后，DNA测序反应提供有总体积为20μL的1μL纯化PCR产物、10μM寡核苷酸引物、4μLBigDye TerminatorTM备用反应混合物、以及14μL无菌水。用寡核苷酸引物159和360，对寡核苷酸对367/354制得的重链PCR产物进行测序。用寡核苷酸34和163，对寡核苷酸对363/208制得的轻链PCR产物进行测序。测序的热循环仪程序为25个循环(96℃30秒，50℃15秒，60℃4分钟)，之后在4℃下过夜。通过聚丙烯酰胺凝胶使反应产物分级分离，并用ABI 377 DNA测序仪进行检测。
定点诱变更换氨基酸：为了在TNV148mAb中用丝氨酸残基替换Pro75，更换TNV148重链可变区DNA序列中的单核苷酸。使用如制造商所述的QuikChangeTM定点诱变方法，设计和订购互补寡核苷酸399和400(表1)来作出该更换。首先使使两种寡核苷酸分级分离通过15％寡核苷酸凝胶，并纯化主要条带。使用10ng或50ng的TNV148重链质粒模板(p1753)、5μL的10X反应缓冲液、1μL的dNTP混合物、125ng的引物399、125ng的引物400和1μL的Pfu DNA聚合酶进行诱变反应。加入无菌水使总体积达到50μL。然后，在热循环仪中温育反应混合物，其被编程为：95℃下温育30秒；随后循环14次，顺序温育95℃30秒，55℃1分钟，64℃1分钟，以及68℃7分钟；之后为30℃2分钟(1个循环)。这些反应被设计成将诱变的寡核苷酸引入其它方面相同的新合成质粒中。为了移除初始TNV148质粒，在添加1μL的仅切割初始甲基化质粒的DpnI内切核酸酶之后，使样品于37℃温育1小时。随后，经由标准热休克方法使用1μL的反应物转化Epicurian Coli XL1-Blue超能力大肠杆菌，并且在LB-氨苄青霉素琼脂板上接种之后鉴定转化的细菌。使用如制造商所述的WizardTM试剂盒来制备质粒微量制品。在从WizardTM柱洗脱样品之后，用乙醇沉淀质粒DNA以进一步纯化质粒DNA，随后重悬于20μL无菌水中。接着进行DNA序列分析，以鉴定具有期望碱基改变的质粒克隆，并证实并没有其它碱基改变无意地引入TNV148编码序列中。使用4.3部分所述的相同参数，使1μL质粒经受3μL的BigDye混合物、1μL的pUC19正向引物和10μL的无菌水所准备的循环测序反应。
由12B75基因构造表达载体：实施几个重组DNA步骤来分别从12B75-编码重链和轻链基因的先前克隆的基因组拷贝制备新的人IgG1表达载体和新的人k表达载体，其公开于2000年10月7日提交的标题为IL-12Antibodies,Compositions,Methods and Uses的美国专利申请号60/236,827(公布为WO 02/12500，其全文以引用方式并入本文)。最终载体被设计成允许用任何适当设计的PCR-扩增的可变区来简单一步替换现有可变区序列。
为了修饰质粒p1560中的12B75重链基因，将包含启动子和可变区的6.85kbBamHI/HindIII片段从p1560转移至pUC19来制备p1743。相比于p1560而言尺寸较小的该质粒允许根据制造商的规程利用QuikChangeTM诱变(使用寡核苷酸BsiWI-1和BsiWI-2)来引入紧靠翻译起始位点上游的独特BsiWI克隆位点。所得的质粒称为p1747。为了在可变区的3’端引入BstBI位点，5'寡核苷酸引物设计成具有SalI和BstBI位点。该引物与pUC反向引物一起用于从p1747扩增2.75kb片段。然后，将该片段克隆回12B75可变区中天然存在的SalI位点和HindIII位点，从而引入独特的BstB1位点。所得的中间载体(命名为p1750)可接受带有BsiWI和BstBI末端的可变区片段。为了制备恒定区也源于12B75基因的重链载体形式，使p1750中的BamHI-HindIII插入片段转移至pBR322，从而具有HindIII位点的EcoRI位点下游。然后，将所得的质粒p1768用HindIII和EcoRI消化，并连接到p1744(即通过将较大BamHI-BamHI片段从p1560克隆到pBC中而驱动的亚克隆)的5.7kb HindIII-EcoRI片段上。接着，将所得的质粒p1784用作带有BsiWI和BstBI末端的TNV Ab cDNA片段的载体。进行额外的工作来制备表达载体p1788和p1798，它们包括12B75基因的IgG1恒定区并且彼此不同之处在于其含有多少12B75重链J-C内含子。
为了修饰质粒p1558中的12B75轻链基因，将包含12B75启动子和可变区的5.7kbSalI/AflII片段从p1558转移到质粒L28的XhoI/AflII位点中。该新质粒p1745提供用于诱变步骤的较小模板。经由QuikChangeTM诱变，使用寡核苷酸(C340salI和C340sal2)在可变区的5’端引入独特的SalI限制性位点。所得的中间载体p1746具有可变区片段可克隆到其中的独特SalI和AflII限制性位点。克隆到p1746中的任何可变区片段将优选与轻链基因的3’一半连接。为了由可用于该目的的12B75轻链基因的3’一半制备限制性片段，使寡核苷酸BAHN-1和BAHN-2彼此退火形成包含限制性位点BsiW1、AflII、HindII和NotI的双链接头，并且其包含可连接到KpnI和SacI位点中的末端。该接头可在pBC的KpnI和SacI位点之间克隆，以给出质粒p1757。将用AflII消化p1558之后部分地用HindIII消化所产生的包含12B75轻链恒定区的7.1kb片段克隆在p1757的AflII和HindII位点之间，得到p1762。该新质粒包含含有启动子和可变区的BsiWI/AflII片段可转移到其中的BsiWI和AflII的独特位点，从而连接两个半部分基因。
cDNA克隆和表达质粒组装：所有RT-PCR反应物(参见上文)用Klenow酶处理来进一步填充DNA末端。用限制性酶BsiWI和BstBI消化重链PCR片段，然后克隆在质粒L28(使用L28，因为尚未制备基于12B75的中间载体p1750)的BsiWI和BstBI位点之间。克隆的插入片段的DNA序列分析示出，所得的构建体是正确的，并且在PCR扩增期间不存在引入的错误。这些L28质粒构建体(TNV14、TNV15、TNV148、TNV148B和TNV196)的指定标识号示于表3中。
将TNV14、TNV148和TNV148B重链的BsiWI/BstBI插入片段从L28载体转移到新制备的中间载体p1750中。这些中间质粒的指定标识号示于表2中。并未对TNV15和TNV196进行该克隆步骤和后续步骤。随后，将可变区转移到两个不同的人IgG1表达载体中。限制性酶EcoRI和HindIII用于使可变区转移到Centocor此前使用的IgG1载体p104中。编码Gm(f+)同种异型的IgG1的所得表达质粒命名为p1781(TNV14)、p1782(TNV148)和p1783(TNV148B)(参见表2)。可变区也克隆到源于12B75(GenPharm)基因的IgG1恒定区的上游。那些编码G1m(z)同种异型的IgG1的表达质粒也列于表3中。
表3：各种重链和轻链质粒的质粒标识号：
L28载体或pBC载体表示初始Ab cDNA克隆。将那些质粒中的插入片段转移至基于12B75的不完整载体，以制备中间质粒。一个附加转移步骤产生最终表达质粒，其在线性化后引入细胞中或用于在细胞转染之前纯化mAb基因插入片段。(ND)＝未完成
用限制性酶SalI和SacII消化轻链PCR产物，然后克隆在质粒pBC的SalI与SacII位点之间。两种不同轻链形式的差别在于一个氨基酸，命名为p1748和p1749(表2)。DNA序列分析证实了这些构建体具有正确的序列。随后，分别将p1748和p1749中的SalI/AflII片段克隆在中间载体p1746的SalI与AflII位点之间，以制备p1755和p1756。然后，通过将BsiWI/AflII片段从p1755和p1756转移至新制备的构建体p1762，使轻链基因的这些5'半块与基因的3'半块连接，分别制备最终表达质粒p1775和p1776(表2)。
细胞转染、筛选和亚克隆：小鼠骨髓瘤细胞的共15次转染用各种TNV表达质粒进行(参见结果和讨论部分中表3)。这些转染的区别在于是否：(1)宿主细胞为Sp2/0或653；(2)重链恒定区由Centocor的先前IgG1载体编码或为12B75重链恒定区；(3)mAb为TNV148B、TNV148、TNV14、或新HC/LC组合；(4)DNA是否为线性化质粒或纯化Ab基因插入片段；以及(5)重链基因中存在或不存在完整J-C内含子序列。此外，重复数次转染以增大可筛选大量克隆的可能性。
在如先前所述的标准条件下(Knight DM等人(1993)Molecular Immunology 30:1443-1453)，经由电穿孔将Sp2/0细胞和653细胞各自用重链和轻链DNA(各8-12g)的混合物转染。对于转染数1、2、3和16，通过在转染之前用限制性酶消化使适当的表达质粒线性化。例如，SalI和NotI限制性酶用于分别线性化TNV148B重链质粒p1783和轻链质粒p1776。对于剩余的转染，通过用BamHI消化重链质粒并用BsiWI和NotI消化轻链质粒，从质粒载体分离仅包含mAb基因的DNA插入片段。然后，通过琼脂糖凝胶电泳和Qiex纯化树脂来纯化mAb基因插入片段。将经纯化基因插入片段转染的细胞同时用3-5g的PstI-线性化的pSV2gpt质粒(p13)作为选择性标记源进行转染。在电穿孔之后，将细胞接种到96-孔组织培养皿的IMDM、15％FBS、2mM谷氨酰胺中，并于37℃在5％CO2培养箱中温育。两天之后，加入等体积的IMDM、5％FBS、2mM谷氨酰胺、2×MHX选择物(1×MHX＝0.5g/mL霉酚酸、2.5g/mL次黄嘌呤、50g/mL黄嘌呤)，并且将板再温育2至3周，同时形成菌落。
通过如所述的ELISA，测定从具有菌落的孔收集的细胞上清液的人IgG。简而言之，将不同稀释度的细胞上清液在涂布有多克隆山羊抗-人IgG Fc片段的96-孔EIA板中温育，随后用碱性磷酸酶缀合的山羊抗-人IgG(H+L)和适当的颜色底物来检测结合的人IgG。标准曲线(用作细胞上清液中被测定的相同纯化mAb的标准)包括于各个EIA板上，以允许定量上清液中的人IgG。使那些似乎产生最多人IgG的菌落中的细胞传代到24-孔板中，以在用过的培养物中进行附加产量测定，并随后鉴定出最高产的亲代克隆。
对最高产的亲代克隆进行亚克隆，以鉴定最高产的亚克隆并制备更同源的细胞系。在IMDM、5％FBS、2mM谷氨酰胺、1×MHX中，以1个细胞/孔或4个细胞/孔接种96-孔组织培养板，并在5％CO2培养箱中于37℃温育12至20天直至菌落明显。从每孔包含一个菌落的孔收集细胞上清液，并利用如所述的ELISA进行分析。使所选择的菌落传代至24-孔板，并在通过定量其上清液中人IgG的水平来鉴定最高产亚克隆之前，允许培养物用尽。当所选的第一轮亚克隆经受第二轮亚克隆时，对该过程进行重复。将最佳第二轮亚克隆选定为用于开发的细胞系。
细胞亚克隆的表征：选择最佳的第二轮亚克隆，并且生长曲线表现成评价mAb产生水平和细胞生长特征。在30mL IMDM、5％FBS、2mM谷氨酰胺和1X MHX(或无血清培养基)中，以1×105个细胞/mL接种T75烧瓶。以24小时的间隔获取300μL等分试样，并且测定活细胞密度。继续分析直至活细胞数少于1×105个细胞/mL。对所收集等分试样的细胞上清液分析存在抗体的浓度。使用标准rTNV148B或rTNV14 JG92399进行ELISA测定。将样品在涂布有多克隆山羊抗-人IgG Fc的ELISA板上温育1小时，并用碱性磷酸酶缀合的山羊抗-人IgG(H+L)以1:1000稀释度来检测结合的mAb。
出于在不同量的MHX选择物存在下比较生长率的目的，还对两种细胞系进行不同的生长曲线分析。使细胞系C466A和C466B解冻到无MHX培养基(IMDM，5％FBS，2mM谷氨酰胺)中并再培养两天。然后将两种细胞培养物分成不含MHX、含有0.2X MHX、或1X MHX(1X MHX＝0.5g/mL霉酚酸、2.5g/mL次黄嘌呤、50g/mL黄嘌呤)的三种培养物。一天以后，将新鲜的T75烧瓶用培养物以1×105个细胞/mL的起始密度接种，并且在一周内每隔24小时对细胞进行计数。不收集产生的mAb的等分试样。用SOP PD32.025中提供的式，对这些样品的倍增时间进行计算。
进行附加研究来评价mAb产生随时间推移的稳定性。使培养物在24-孔板的IMDM、5％FBS、2mM谷氨酰胺(具有或不具有MHX选择物)中生长。只要它们变得汇合并然后允许旧培养物用尽，将培养物分离成新鲜培养物。此时，获取等分试样的上清液并于4℃储存。在55-78天时间内获取等分试样。在该阶段结束时，通过如上所述的抗-人IgG Fc ELISA，测试上清液存在的抗体的量。
结果与讨论：
对TNF结合重组受体的抑制：
进行简单的结合测定，以确定杂交瘤细胞上清液中所含的八种TNV mAb是否能够阻断TNFα结合受体。对于人IgG，首先通过标准ELISA分析来测定TNV mAb在其相应细胞上清液中的浓度。随后，使重组p55TNF受体/IgG融合蛋白p55-sf2涂布于EIA板上，并允许125I-标签的TNFα在不同量的TNV mAb存在下结合p55受体。如图1所示，八种TNV mAb中除一种(TNV122)之外所有有效地阻断TNFα结合p55受体。事实上，相比于掺入阴性对照杂交瘤上清液中的cA2阳性对照mAb，TNV mAb似乎更有效地抑制TNFα结合。这些结果解释为表明其很有可能TNV mAb在基于细胞的测定中于体内阻断TNFα生物活性，因此附加分析是必要的。
DNA序列分析：
确认RNA编码人mAb：
作为表征在受体结合测定中示出TNFα-阻断活性的七种TNV mAb(TNV14、TNV15、TNV32、TNV86、TNV118、TNV148和TNV196)的第一步，从产生这些mAb的七种杂交瘤细胞系分离总RNA。各个RNA样品随后被用于制备人抗体重链或轻链cDNA，该cDNA对每种mAb而言包括完整信号序列、完整可变区序列、以及恒定区序列一部分。然后，在PCR反应中扩增这些cDNA产物，并且对PCR-扩增的DNA直接测序而无需首先克隆片段。被测序的重链cDNA与小鼠中存在的五种人种系基因之一即DP-46有>90％同一性(图2)。相似地，被测序的轻链cDNA与小鼠中存在的人种系基因之一有100％或98％同一性(图3)。这些序列结果证实了RNA分子转录为cDNA并定序编码的人抗体重链和人抗体轻链。应当指出的是，因为可变区使用安置于信号序列编码序列5'端的寡核苷酸进行PCR-扩增，信号序列的前五个氨基酸可能不为初始TNV翻译产物的实际序列，但它们却代表重组TNV mAb的实际序列。
独特的中和mAb：
对各个mAb的重链和轻链两者的整个可变区的cDNA序列分析显示，TNV32等同于TNV15，TNV118等同于TNV14，并且TNV86等同于TNV148。受体结合测定的结果与DNA序列分析一致，即相比于TNV118和TNV14两者，TNV86和TNV148两者在阻断TNF结合方面高大约4倍。后续工作因此仅致力于四种独特的TNV mAb——TNV14、TNV15、TNV148和TNV196。
四种mAb的关联性
DNA序列结果显示，编码四种TNV mAb的重链的基因都彼此高度同源，并且似乎都源于相同的种系基因DP-46(图2)。此外，因为重链CDR3序列的每者如此类似并且长度相同，并且因为它们都使用J6外显子，它们显然产生于单一VDJ基因重排事件，之后为体细胞改变，使得每种mAb很独特。DNA序列分析显示，在四种mAb中仅存在两种不同的轻链基因(图3)。TNV14和TNV15中的轻链可变区编码序列彼此相同，并且等同于人k链的Vg/38K家族的代表性种系序列。TNV148和TNV196轻链编码序列彼此相同，但在两个核苷酸位置处不同于种系序列(图3)。
四种mAb的推导氨基酸序列显示出实际mAb的关联性。四种mAb包含四种不同的重链(图4)但仅两种不同的轻链(图5)。TNV mAb序列与种系序列之间的差异主要限于CDR结构域，但三种mAb重链在框架区中也不同于种系序列(图4)。相比于DP-46种系编码的Ab框架区，TNV14是相同的，TNV15差异为一个氨基酸，TNV148差异为两个氨基酸，而TNV196差异为三个氨基酸。
cDNA的克隆、位点特异性诱变、以及最终表达质粒的组装：cDNA的克隆：出于使编码序列适于克隆进表达载体的目的，基于PCR-扩增的可变区的DNA序列，布置新寡核苷酸来进行另一轮PCR扩增。就重链而言，将该第二轮PCR的产物用限制性酶BsiWI和BstBI消化并克隆到质粒载体L28中(质粒标识号示于表2)。就轻链而言，将第二轮PCR产物用SalI和AflII消化并克隆到质粒载体pBC中。然后，对单独的克隆测序，以确认它们的序列与获自PCR产物的直接测序的先前序列相同，其显示出在潜在异源分子群体中各个位置处丰度最大的核苷酸。
位点特异性诱变来改变TNV148：始终观察到mAb TNV148和TNV196在中和TNFα生物活性方面效力比次佳mAb(TNV14)高四倍。然而，如上所述，TNV148和TNV196重链框架序列不同于种系框架序列。TNV148重链序列与其它人抗体的比较表明，多种其它人mAb在框架1中位置28处包含Ile残基(仅计成熟序列)，而框架3中位置75处的Pro残基是该位置处的非常规氨基酸。
TNV196重链的类似比较表明，在框架3中不同于种系序列的三个氨基酸可能在人mAb很罕见。可能这些差异可使得TNV148和TNV196在施用于人时产生免疫原性。因为TNV148仅具有一个关注的氨基酸残基并且认为该残基对TNFα的结合不重要，使用位点特异性诱变技术来改变TNV148重链编码序列(质粒p1753中)中的单核苷酸，使得种系Ser残基将代替75位的Pro残基进行编码。所得的质粒称为p1760(参见表2)。所得的基因和mAb称为TNV148B以使其区别于初始TNV148基因和mAb(参见图5)。
最终表达质粒的组装：新抗体表达载体的制备基于先前克隆为基因组片段的12B75重链和轻链基因。虽然制备了不同的TNV表达质粒(参见表2)，在每种情况下5'旁侧序列、启动子、以及内含子、增强子来源于相应的12B75基因。对于轻链表达质粒，完整的J-C内含子、恒定区编码序列和3'旁侧序列也来源于12B75轻链基因。对于导致最终生产细胞系的重链表达质粒(p1781和p1783，参见下文)，人IgG1恒定区编码序列来源于Centocor的先前使用的表达载体(p104)。重要地，此处报道的最终生产细胞系表达TNV mAb的不同同种异型(Gm(f+))而非初始来源杂交瘤的TNV mAb(G1m(z))。这是因为源于GenPharm小鼠的12B75重链基因在CH1结构域的C-末端处编码Arg残基，而Centocor的IgG1表达载体p104在该位置处编码Lys残基。制备其它重链表达质粒(例如p1786和p1788)，其中J-C内含子、完整恒定区编码序列和3'旁侧序列来源于12B75重链基因，但用那些基因转染的细胞系并未被选择为生产细胞系。载体被小心地设计成允许一步克隆未来PCR-扩增的V区，其将导致最终表达质粒。
将PCR-扩增的可变区cDNA从L28或pBC载体转移至中间级，即提供启动子区和J-C内含子的一部分的基于12B75的载体(对于质粒标识号参见表2)。随后，将包含抗体基因5’一半的限制性片段从这些中间级载体转移至提供相应基因的3'一半的最终表达载体，以形成最终表达质粒(对于质粒标识号参见表2)。
细胞转染和亚克隆：利用限制酶切消化来线性化表达质粒，或者从质粒主链纯化得到各个质粒中的抗体基因插入片段。通过电穿孔，用重链和轻链DNA来转染DNASp2/0和653小鼠骨髓瘤细胞。进行十五种不同的转染，它们大多数是独特的，如由以下限定：Ab、Ab基因的特异性特性，基因是否处于线性化的整个质粒上或纯化的基因插入片段上，以及宿主细胞系(汇总于表5)。对于人IgG的存在，通过ELISA测定耐受霉酚酸的克隆的细胞上清液，并且使用纯化的rTNV148(作为参考标准曲线)进行定量。
最高产rTNV148B细胞系
对来自rTNV148B转染2的十种产量最佳的653亲本系(在用过的24-孔培养物中产生5-10g/mL)进行亚克隆，以筛选较高产细胞系并制备更为同源的细胞群。亲本系2.320、2.320-17和2.320-20的亚克隆中有两种在用过的24-孔培养物中产生大约50g/mL，其相对于其亲本系增加5倍。亚克隆的品系2.320-17和2.320-20的第二轮亚克隆导致
示出了编码各个mAb的重链和轻链质粒的标识号。在用纯化的mAb基因插入片段进行转染的情况下，质粒p13(pSV2gpt)作为gpt选择性标记的来源而被包括在内。重链恒定区通过用于编码类克(“旧”)的相同人IgG1表达载体或者通过包含于12B75(GenPharm/Medarex)重链基因(“新”)之内的恒定区进行编码。H1/L2是指由TNV14重链和TNV148轻链组成的“新型”mAb。质粒p1783和p1801的差异仅在于其重链基因包含多少J-C内含子。转染数(定义细胞克隆属名的首数字)示于右侧。此处所述的产rTNV148B细胞系C466(A、B、C、D)和C467A分别来源于转染数2和1。产rTNV14细胞系C476A来源于转染数3。
表5：细胞转染的汇总：
对用过的24-孔培养上清液的ELISA测定表明，这些第二轮亚克隆都产生在98与124g/mL之间，其相比于第一轮亚克隆至少提高2倍。这些653细胞系是如表6所示的指定C代码名称。
对来自rTNV148B转染1的三种产量最佳的Sp2/0亲本系进行亚克隆。亲本系1.73的两轮亚克隆导致鉴定出在用过的24-孔培养物中产生25g/mL的克隆。该Sp2/0细胞系命名为C467A(表6)。
最高产rTNV14细胞系
将来自rTNV14转染3的三种产量最佳的Sp2/0亲本系亚克隆一次。发现亚克隆3.27-1在用过的24-孔培养物中是最高的生产者，产量为19g/mL。该细胞系命名为C476A(表6)。
表6：所选择的生产细胞系及其C代码的汇总
初始克隆名称的首位数指示细胞系所来源的那个转染。此处报道的所有C-代码的细胞系来源于经限制性酶线性化的重链和轻链整个质粒的转染。
亚克隆细胞系的表征
为了更小心地表征细胞系生长特性并大规模地测定mAb-产生水平，使用T75培养物进行生长曲线分析。结果示出四种C466系列的细胞系各自达到1.0×106至1.25×106个细胞/mL的峰值细胞密度以及110至140g/mL的最大mAb累积水平(图7)。相比之下，产量最佳的Sp2/0亚克隆即C467A达到2.0×106个细胞/mL的峰值细胞密度以及25g/mL的最大mAb累积水平(图7)。并没有对产rTNV14细胞系即C476A进行生长曲线分析。
进行附加的生长曲线分析，以比较在不同浓度的MHX选择物中的生长率。该比较由如下最近观察提示：在不存在MHX时培养的C466细胞似乎比在正常量的MHX(1X)中培养的相同细胞更快地生长。因为化合物如霉酚酸的胞毒浓度趋于在若干数量级内测量，认为可能使用较低浓度的MHX可导致显著更快的细胞倍增时间而不牺牲mAb产生的稳定性。细胞系C466A和C466B在以下项中培养：无MHX、0.2X MHX、或1X MHX。以24小时的间隔获取活细胞计数，进行7天。结果并未显示MHX浓度依赖性细胞生长率(图8)。细胞系C466A示出在1X MHX中倍增时间为25.0小时，而在不含MHX时仅为20.7小时。相似地，细胞系C466B示出在1X MHX中倍增时间为32.4小时，而在不含MHX时仅为22.9小时。重要地，相比于1X MHX，两种细胞系在0.2X MHX中的倍增时间更类似于在无MHX时所观察的(图8)。该观察提高了生物反应器中增强的细胞性能(对其倍增时间为重要参数)可用较少的MHX实现的可能性。然而，虽然稳定性测试结果(参见下文)表明细胞系C466D甚至在不存在MHX时也能够稳定地产生rTNV148B至少60天，但稳定性测试还示出相比于不存在MHX，当细胞在MHX存在下培养时mAb的产量水平较高。
为了评价大约60天时段内各种细胞系的mAb产量，对包含或不含MHX选择物的培养物进行稳定性测试。并非所有的细胞系维持较高的mAb产量。在仅培养两周之后，克隆C466A比研究开始产生少大约45％。克隆C466B的产量似乎也显著下降。然而，克隆C466C和C466D维持相当稳定的产量，并且C466D示出最高的绝对产量水平(图9)。
结论
对于初始小组的八种针对人TNFα的人mAb，基于包括蛋白质序列和TNF中和效能，以及TNV14在内的几种判据，TNV148B被选择为优选的。相比于100g/mL的rTNV148B和19g/mLrTNV14，制备的细胞系产生得更多。
实施例5：使用单次弹丸式注射用抗TNF抗体和对照进行关节炎小鼠研究
在大约4周岁，基于性别和体重将Tg197研究小鼠分配至9个治疗组之一，并且用单次腹膜内推注剂量的Dulbecco PBS(D-PBS)或本发明抗TNF抗体(TNV14、TNV148或TNV196)以1mg/kg或10mg/kg进行治疗。
结果：当重量分析为相对给药前的改变时，用10mg/kg cA2治疗的动物在整个研究中始终示出比经D-PBS治疗的动物更高的重量增加。该重量增加在3-7周是显著的。用10mg/kg TNV148治疗的动物在研究第7周也实现显著的重量增加(参见图10)。
图11A-C表示基于关节炎指数的疾病严重程度的进展。经10mg/kg cA2治疗的组的关节炎指数在第3周开始低于D-PBS对照组，并在研究的剩余阶段保持(周7)。当相比于D-PBS治疗的组时，用1mg/kg TNV14治疗的动物和用1mg/kg cA2治疗的动物在3周后并未示出AI有显著下降。当各自相比于其它类似剂量时(10mg/kg cA2相比于10mg/kg TNV14、148和196)，在10mg/kg治疗组之间不存在显著的差异。当对1mg/kg治疗组进行比较时，1mg/kgTNV148在第3、4和7周示出比1mg/kg cA2显著更低的AI。1mg/kg TNV148也在第3周和第4周显著低于1mg/kg TNV14治疗的组。虽然TNV196示出AI在多至研究第6周有显著下降(当相比于D-PBS治疗的组时)，TNV148是研究结束时仍然显著的唯一的1mg/kg治疗。
实施例6：使用抗TNF抗体和对照作为多次推注剂量进行关节炎小鼠研究
在大约4周岁，基于体重将Tg197研究小鼠分配至8个治疗组之一，并用腹膜内推注剂量的对照制品(D-PBS)或抗体(TNV14，TNV148)以3mg/kg(第0周)治疗。在第1、2、3和4周，在所有动物中重复进行注射。对1-6组评价测试制品功效。在第2、3和4周，对获自7和8组动物的血清样品评价TNV14或TNV148的免疫应答诱导和药代动力学清除率。
结果：当重量分析为相对给药前的改变时，并未注意到显著的差异。用10mg/kgcA2治疗的动物在整个研究中始终示出比经D-PBS治疗的动物更高的重量增加(参见图12)。
图13A-C表示基于关节炎指数的疾病严重程度的进展。经10mg/kg cA2治疗的组的关节炎指数在第2周开始显著低于D-PBS对照组，并在研究的剩余阶段保持(周5)。当相比于d-PBS对照组时，用1mg/kg或3mg/kg cA2治疗的动物和用3mg/kg TNV14治疗的动物在整个研究的任何时间均无法实现AI的任何显著下降。当相比于经d-PBS治疗的组时，用3mg/kgTNV148治疗的动物示出在第3周开始显著下降并且持续至第5周。当相比于两种较低剂量(1mg/kg和3mg/kg)的cA2时，经10mg/kg cA2治疗的动物示出在研究第4周和第5周AI有显著下降，并且在第3-5周也显著低于经TNV14治疗的动物。尽管似乎在任何3mg/kg治疗组之间无显著的差异，但经3mg/kg TNV14治疗的动物的AI在某些时间点却比10mg/kg显著更高，而经TNV148治疗的动物并未显著不同于经10mg/kg cA2治疗的动物。
实施例7：使用抗TNF抗体和对照作为单次腹膜内推注剂量进行关节炎小鼠研究
在大约4周岁，基于性别和体重将Tg197研究小鼠分配至6个治疗组之一，并且用单次腹膜内推注剂量的抗体(cA2或TNV148)以3mg/kg或5mg/kg进行治疗。该研究利用D-PBS和10mg/kg cA2对照组。
当重量分析为对于给药前的改变时，所有治疗实现类似的重量增加。在早期的研究中(第2和3周)用3mg/kg或5mg/kg TNV148或者5mg/kg cA2治疗的动物增加了显著量的重量。仅用TNV148治疗的动物在后期时间点维持显著的重量增加。3mg/kg和5mg/kg TNV148两者治疗的动物在第7周示出显著性，并且3mg/kg TNV148动物仍然在注射后8周显著升高(参见图14)。
图15表示基于关节炎指数的疾病严重程度的进展。所有治疗组在较早时间点示出一些保护，并且5mg/kg cA2和5mg/kg TNV148示出第1-3周AI有显著下降，并且所有治疗组示出在第2周显著下降。在后来的研究中，用5mg/kg cA2治疗的动物示出一些保护，在第4、6和7周有显著下降。较低剂量(3mg/kg)的cA2和TNV148均示出在第6周显著下降，并且所有治疗组示出在第7周显著下降。没有一个治疗组能够在研究结束时(周8)保持显著的下降。在任何时间点任何治疗组(排除盐水对照组)之间不存在显著的差异。
实施例8：在抗TNF抗体与修饰的抗TNF抗体之间使用抗TNF抗体和对照作为单次腹 膜内推注剂量进行关节炎小鼠研究
为了比较单一腹膜内剂量的TNV148(来源于杂交瘤细胞)和rTNV148B(来源于转染细胞)的功效。在大约4周岁，基于性别和体重将Tg197研究小鼠分配至9个治疗组之一，并用单次腹膜内推注剂量的Dulbecco PBS(D-PBS)或抗体(TNV148，rTNV148B)以1mg/kg进行治疗。
当重量分析为相对给药前的改变时，用10mg/kg cA2治疗的动物在整个研究中始终示出比经D-PBS治疗的动物更高的重量增加。该重量增加在第1周和3-8周是显著的。用1mg/kg TNV148治疗的动物在研究的第5、6和8周也实现显著的重量增加(参见图16)。
图17表示基于关节炎指数的疾病严重程度的进展。经10mg/kg cA2治疗的组的关节炎指数在第4周开始低于D-PBS对照组，并在研究的剩余阶段保持(周8)。经TNV148治疗的组和经1mg/kg cA2治疗的组均示出在第4周AI有显著下降。虽然先前研究(P-099-017)示出TNV148在单次1mg/kg腹膜内推注后稍微更有效地降低关节炎指数，但该研究示出两种形式的TNV抗体治疗的组的AI稍微更高。虽然当相比于10mg/kg cA2组时，在第7和8周(除第6周之外)经1mg/kg cA2治疗的组并未显著增大并且经TNV148治疗的组显著更高，但在研究的任何点在1mg/kg cA2、1mg/kg TNV148和1mg/kg TNV148B之间不存在AI的显著差异。
实施例9：用于治疗或预防1型糖尿病(T1D)的抗TNF抗体
引言
Sponsor请求申请前B型咨询来讨论经皮下(SC)施用的(戈利木单抗)在治疗1型糖尿病(T1D)中的开发计划，以确定的有益效果是否可在2a期功效和安全性研究中于新诊断的T1D患者中建立。该研究在新近诊断的群体中将为开发方案的初始步骤，以理解是否将在前期T1D患者中具有稳定化内源性胰岛素产生的有益效果，从而防止或延缓疾病发展。
产品名称和申请号
(戈利木单抗)
化学名和结构
(戈利木单抗)是具有免疫球蛋白G(IgG)1重链同种型(G1m[z]同种异型)和k轻链同种型的人单克隆抗体(mAb)。戈利木单抗具有包含SEQ ID NO:36的重链(HC)和包含SEQ ID NO:37的轻链(LC)。戈利木单抗以较高亲和力结合可溶和跨膜形式的肿瘤坏死因子α(TNFα)并且抑制TNFα生物活性。戈利木单抗根据解剖治疗化学(AnatomicalTherapeutic Chemical，ATC)分类系统被归类为TNFα抑制剂(ATC代码：L04AB06)。
戈利木单抗以商品名在美国(US)和全世界共89个国家于2015年10月6日被批准用于治疗类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎(PsA)以及强直性脊柱炎(AS)，以50mg皮下注射，每月施用一次，并且在个67国家用于治疗溃疡性结肠炎(UC)，在第0周以200mg皮下注射，之后在第2周进行100mg的诱导疗法，其后为每4周100mg的维持疗法。
特别是在美国，被批准用于以下适应症：
·与甲氨蝶呤(MTX)联合治疗患有中度至重度活动性RA的成年患者
·单独或与MTX联合治疗患有活动性PsA的成人患者
·治疗患有活动性AS的成人患者
·治疗患有溃疡性结肠炎的成人患者
剂型、施用途径和给药
Sponsor期望在初始2a期研究中使用2种剂型，以支持所提出的跨越目标群体的剂量。这2种剂型描述于下文：
载药注射器
每50mg单剂量载药玻璃注射器(27号1/2英寸针)包含50mg的/0.5mL溶液。
VarioJect
新儿科展示(称为VarioJect)由Sponsor开发为旨在用于多种儿科适应症的平台装置，在经身体表面区域(BSA)给药的儿科患者中提供分级固定给药。VarioJect是一种能够以5mg增量递送10mg至45mg剂量的手动注射器。
附加细节在以下整个说明书和附图中提供。
疾病背景
疾病病因学和患病率
在美国，T1D是儿童中三种最普遍的慢性疾病之一，并且大约3百万人口患有该种疾病(Daneman，2006年，Stanescu,Lord等人，2012年)。年发病率在儿童和青少年中最高，在年龄小于20岁的那些中为约20例/100,000/年，每年导致几乎15,000个新病例(Maahs,West等人，2010年，Stanescu,Lord等人，2012年)。在美国和世界范围内，T1D的发病率正在上升，大部分区域每年增长约3-5％(Daneman，2006年，Stanescu,Lord等人，2012年)。在美国，2001年至2009年，儿童和青少年中的T1D发病率升高23％(JDRF 2013)。诊断的T1D在儿童期增加并且在青少年中达到峰值：在0-4、5-9、10-14和15-19岁的那些中，年速率分别为14、22、26和13例/100,000(Stanescu,Lord等人，2012年)。相比之下，T1D率在成人中较低，发病率仅最多至约8/100,000(Molbak,Christau等人，1994年)。在儿童中，导致诊断的临床病程是相对暴发性的，症状(即烦渴、多尿症和重量减轻)通常仅在诊断前数天至数周变明显，而在成人中，病程通常更为缓慢进展，在数月内或更久出现轻微症状。患有新发和现有T1D的儿童很多情况下遭受糖尿病酮症酸中毒(DKA)的严重代谢紊乱，在此期间他们处于脑水肿、疝形成和死亡的较高风险之中。
过去四十年的数据示出对胰β细胞自体免疫攻击的T1D结果(Mordes,Bortell等人，1996年，Eisenbarth，2004年，Han,Donelan等人，2013年)。先天和适应性和细胞和体液响应的促炎组合是造成T1D的原因(Bluestone,Herold等人，2010年)。类似于其它自身免疫疾病，假设T1D发生于遭遇致糖尿病环境触发的易患病个体中(Atkinson,Bluestone等人，2011年)。多种HLA-及其它免疫系统相关的基因与T1D易感性相关联(van Belle,Coppieters等人，2011年)。患有T1D的那些似乎在涉及β-细胞反应性T细胞的中枢和外周耐受性机制中均具有异常情况(Eisenbarth，2004年)。虽然涉及到膳食和感染因素，但没有发现任一者有原因地与T1D相关。假设一些环境遭遇激活了炎症应答，在易患病个体中导致巨噬细胞、树突状细胞、CD4和CD8T细胞、以及胰岛B细胞的活化和募集(Bluestone,Herold等人，2010年，Atkinson,Bluestone等人，2011年)。包括促炎细胞因子和β细胞自身抗体在内的可溶性因子参与并扩大该应答，并且最终结果是最终破坏了β细胞。
目前治疗范例
目前可用于患有T1D的那些的唯一疗法是外源胰岛素，其必须每天多次皮下注射或经由皮下泵而连续加脉冲胰岛素来给予。在患有T1D的那些中每天需要胰岛素以及多次血糖检查，并且每次胰岛素施用必须考虑目前血糖水平、饮食和锻炼的谨慎平衡来维持可危及生命的高血糖与低血糖之间的谨慎平衡。不存在可用于患有T1D的那些的辅助疗法或病情改善疗法，并且用外源胰岛素的血糖管理是对于发展成该疾病的那些的生命而言所必需的。强化胰岛素治疗对微血管并发症结果的积极效果由界标研究糖尿病控制与并发症试验(Diabetes Control and Complications Trial，DCCT)加以证明，其中参与强化治疗组的受治疗者(旨在禁食以及餐前血糖水平为70mg/dL至120mg/dL，餐后血糖水平为180mg/dL，并且血红蛋白A1c[HbA1c；糖基化血红蛋白]在非糖尿病范围内)相对于参与传统治疗组的受治疗者而言肾病、视网膜病和神经病的发作和/或进展有所下降。
然而，尽管在过去几十年中开发出相比于老一代类型的胰岛素制剂而言药代动力学和药效动力学特征更有利的短效和长效胰岛素类似物，并且在胰岛素递送装置中的技术有所改善，许多受治疗者仍然无法实现小于7％的推荐HbA1c目标。使用来自欧洲、北美和西澳大利亚的19个国家的地区或全国挂号数据比较>320,000名患有T1DM的受治疗者的血糖控制的最近分析示出，总体少于30％的患者的HbA1c<7.5％(McKnight 2015)。与T1DM治疗相关的缺陷包括担心低血糖、过度葡萄糖波动和体重增加(Cryer，2003年，Larger，2005年)。
所报道的低血糖发病率在研究之间有显著的不同，在受治疗者中所观察到的症状性和严重低血糖的发病率较大(Cryer 1989)。此外，长时间内使用连续血糖测量的研究通常发现：低血糖，尤其是夜间低血糖的频率和持续时间甚至大于此前所认为的(Guillod，2007年，Wentholt，2007年)。阻止患有T1DM的患者实现适当血糖的另一个因素是不期望的重量增加，其通常作为强化胰岛素治疗的结果出现，并随后糖尿减少。估计当用强化胰岛素方案改善葡萄糖控制时，归因于先前较差血糖控制的尿液卡路里损失可导致70％至100％的体重增加(Carlson，1993年)。此外，通过逆转从分解代谢到合成代谢的代谢状态，胰岛素具有生脂肪作用，导致体脂增加(Jacob，2006年，Nair，1983年)，以及对蛋白质的抗分解代谢作用，导致瘦体质增加(Torbay 1985)。
不同于多种治疗选项可用于其的2型糖尿病(T2DM)，胰岛素仍然是对患有T1DM的患者进行治疗的主要支持。自1922年发现动物胰岛素的治疗性用途以来，已经开发出传统胰岛素到更新型的胰岛素类似物范围内的各种类型胰岛素，胰岛素优泌乐是1996年首种被FDA批准的短效类似物，并且甘精胰岛素是2000年首种被批准的长效类似物。从此以后，其它短效和长效类似物已得到批准并且其用途变得日益普遍。这部分是由于需要在患有T1DM的受治疗者中实现几乎正常血糖，并且非类似物胰岛素所观察到的严重低血糖的风险明显增加。实际上，涉及将长效胰岛素的功效和耐药性与低精蛋白锌(NPH)胰岛素进行比较的大多数临床研究示出，通常其每天一次的给药方案在血糖控制方面似乎类似于NPH，并且与显著较低的低血糖率(尤其是晚上)，以及较小的葡萄糖波动相关(Ratner，2000年，Porcellati，2004年，Hermansen，2004年，Raskin，2007年)。就长效类似物而言，这些通常在降低HbA1c中类似于普通胰岛素，同时它们示出其它重要的优点，例如更好地控制餐后高血糖，改善患者间和患者内的差异性，以及低血糖风险降低。重要地，由于其药代动力学改善，这些类似物为患者提供更大的灵活性和便利性以及更好的依从性，因为可在餐前或甚至餐后立即(相比于普通胰岛素餐前30分钟)注射短效类似物并且长效类似物注射每天一次(相比于每天两次NPH)。
考虑到普兰林肽是目前唯一被批准为T1DM的辅助疗法的非胰岛素试剂以及胰岛素单药治疗的缺点，存在对T1DM的新型疗法尚未满足的需求。
在新发作T1D中保留β细胞功能的研究基本原理
如上所述，DCCT是在患有T1D的受治疗者中实施的大量研究，以评价强化胰岛素疗法相比于标准胰岛素疗法对长期并发症的发展和进展的潜在有益效果(DCCT 1993)。在该研究的强化治疗组的结果的重要分析中，将保留显著残留的β细胞功能(如由C-肽≥0.2pmol/mL所测)的受治疗者与未保留显著β细胞功能(C-肽<0.2pmol/mL)的受治疗者进行比较。相对于不具有残留β细胞功能的那些，具有残留β细胞功能的那些被发现具有显著减少的严重低血糖事件率以及减少的微血管并发症进展率(DCCT，1987年；DCCT，1998年；Steffes，2003年；Palmer，2004年)。此外，DCCT研究的数据的最近评价(Lachin等人)支持了在具有≥0.2pmol/mL刺激的C-肽的那些中的短期和长期临床益处，并且似乎存在维持甚至低于0.2pmol/mL阈值的C-肽的临床益处。
在过去十年至二十年中，维持内源性胰岛素的产生在患有T1D的那些中具有重要短期和长期有益效果的概念是新发作T1D中大量干预试验的一些最重要支持。虽然该领域的最终目标可能为“完全”缓解T1D(并因此胰岛素非依赖性)，但更实际并可能更能实现的目标是防止诊断时破坏存在的β-细胞(通常认为约10-20％的基线数)。即使个体可能仍然需要一些外源胰岛素，代谢控制将得到改善并且T1D-相关的并发症将减轻。T1D的最近的数据支持了该观念。具体地，在接受胰岛细胞移植的T1D受治疗者中，甚至在未实现或丧失完全胰岛素非依赖性的那些中维持某些移植物功能，使严重低血糖事件减少并且血糖控制得到改善(Agarwal和Brayman，2012年，Blau,Abegg等人，2015年)。在T1D的介入性新开始的阿法赛特试验中，相比于安慰剂组中的那些，治疗组中的个体维持较高的C-肽产量水平，并且为有风险的低血糖发病率大约一半(由≤55mg/dL的BG水平定义)，即使未实现胰岛素非依赖性也是如此(Rigby,JCI，2015年)。因此，除保持一些内源性胰岛素产生对多种长期，尤其是T1D-相关的微血管损伤有重要益处的普遍接受的概念的之外，还存在减轻T1D中的低血糖(在该疾病中具有最短期发病率和死亡率的病症)的重要直接益处。
1型糖尿病的发展前景
在阐明T1D的自体免疫基础和成功的啮齿动物模型研究之后，在二十世纪八、九十年代实施了若干小规模的临床试验以在最近诊断患有T1D的患者中评价有效的非特异性免疫抑制剂(Bougneres,Carel等人，1988年，Glandt和Herold，2004年，Herold,Gitelman等人，2009年)。在临床诊断时，据信大量(可能多至20％)的β-细胞得以保留但因衰竭和局部炎症而功能异常。这些残余的细胞可能导致通常在诊断后数周至数月内所见的外源胰岛素最低点，称为“蜜月”期。早期临床试验使用非选择性免疫抑制剂，包括环胞素、硫唑嘌呤和/或泼尼松(Harrison,Colman等人，1985年，Bougneres,Carel等人，1988年，Cook,Hudson等人，1989年，Bougneres,Landais等人，1990年)。虽然在一些试验中观察到胰岛素非依赖性，但当免疫抑制停止时该效应丧失。这些研究表明，如果对β-细胞的炎症应答和免疫攻击可在疾病早期减轻，则功能性β细胞可免受损害。
已实施了使用逆转糖尿病自身免疫性的其它方法(例如烟酰胺、抗氧化剂)的多个试验，它们合在一起并未显示出功效(Chase,Butler-Simon等人，1990年，Ludvigsson,Samuelsson等人，2001年)。因此，逆转糖尿病自身免疫性的唯一相符方法是使用其它病症中被证实的有效免疫抑制剂研究，该免疫抑制剂直接影响免疫细胞的活性或其过程。由于高危群体(即儿童)和治疗备选(即胰岛素)，理想的疗法将具有对非免疫副作用较低免疫，以及优选延长停药效应。
在过去二十年中，已经开发出在其它人自体免疫和炎性病症中靶向特异性炎症介质和细胞且具有显著功效的生物制剂。大量这些试剂能够在啮齿动物模型中逆转自身免疫疾病，其提供用于在临床试验中T1D评价的基本原理。使用抗-CD3、抗-CD20、LFA-3Ig和CTLA4-Ig的研究示出减缓但非终止β细胞损失的能力(Pescovitz,Greenbaum等人，2009年，Gottlieb,Quinlan等人，2010年，Orban,Bundy等人，2011年，Sherry,Hagopian等人，2011年，Tolerx，2011年，Gitelman,Gottlieb等人，2013年，Moran,Bundy等人，2013年)；而IL1-β阻断物、抗-CD25和抗-胸腺细胞球蛋白对β细胞损失没有影响(Gottlieb,Quinlan等人，2010年，Gitelman,Gottlieb等人，2013年，Moran,Bundy等人，2013年)。如下文更详细讨论，仅一类试剂抗-TNFα(即依那西普)示出在小型I期试验中不仅保持内源性胰岛素产生，而且实际在新诊断出的糖尿病患者中使其升高。因此，相比于大部分其它自体免疫病症，并没有免疫调节剂(生物制剂或其它)示出在T1D中始终有效，在儿童即最大受益于T1D-疾病改善疗法的群体中具有对常规使用可接受的安全特征。
抗-肿瘤坏死因子α抑制剂
肿瘤坏死因子α(TNFα)是主要由巨噬细胞和T细胞响应于各种刺激和介导宽泛范围的生物活性而产生的主要促炎细胞因子。其表示为26千道尔顿(kDa)II型膜蛋白，在蛋白酶解时作为自缔合成生物活性三聚物形式的可溶性17kDa单体释放。肿瘤坏死因子α是TNF配体超级族的成员，从发生到免疫应答范围内的过程中具有影响细胞增殖和细胞死亡的重叠功能的一类相关细胞因子。如由其名称所指示，TNFα初始描述为小鼠肿瘤细胞系细胞凋亡的诱导物，但最近的研究表明归因为TNFα的慢性炎症可导致肿瘤诱发和癌细胞转移。
由TNFα调节的功能活性可包括细胞活化，导致增殖、分化，诱导细胞因子和趋化因子产生以及诱导粘附蛋白，或引发程序性细胞死亡。结合TNFα的2种受体发现于几乎所有细胞类型。TNF受体1(TNF-R1)(或p55)包含细胞内死亡结构域并且可信号传递细胞毒性事件，而TNF受体2(TNF-R2)(或p75)似乎参与淋巴细胞中的TNFα信号转导。对TNFα产生的生理响应的复杂性的原因是多因素的，并且包括存在的生物形式的TNFα(可溶性或跨膜)、功能性受体(TNF-R1和/或TNF-R2)、辅助蛋白、以及可用于靶细胞的信号转导途径、产生其的组织、以及表达的时刻和持续时间。
当TNFα的受限局部表达在对损伤和感染病原体的宿主炎症和保护性免疫应答中很重要时，特异性器官中TNFα的慢性表达可导致显著病变。高水平的TNFα与诸如类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎(PsA)、强直性脊柱炎(AS)、炎性肠疾病和T1D之类疾病的病理生理学相关。TNF的抑制已示出在关节炎和结肠炎的动物模型中减轻疾病活性，这导致成功地临床和商业开发出抗TNFα试剂，包括单克隆抗体(mAb)、戈利木单抗、英夫利昔、阿达木单抗和赛妥珠单抗；以及可溶性TNF受体p75片段可结晶(Fc)融合蛋白、依那西普，以治疗免疫介导的炎性疾病，诸如RA、炎性肠病和邻近适应症。
1型糖尿病中TNF阻断的机制
研究已示出TNF是T1D中自体免疫过程和β细胞破坏中关键的促炎细胞因子(Cavallo,Pozzilli等人，1991年，Rabinovitch，1998年)。活化的巨噬细胞、树突状细胞和CD4+T细胞所产生的肿瘤坏死因子-α经由其参与急性期反应、促增殖效应、以及先天和适应性免疫应答中其它细胞的活化和募集而促进炎症。肿瘤坏死因子-α、树突状细胞(DC)、单核细胞和CD4+T细胞均发现于T1D的胰岛病变中，并且均参与β细胞炎症(胰岛炎)和β细胞杀伤(Cavallo,Pozzilli等人，1991年，Rabinovitch，1998年)。在临床前研究中，在生命早期全身性治疗患有TNF的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(自发性自身免疫性糖尿病模型)增大糖尿病发作的频率并使其加速。用TNFα抗体治疗减缓发作，减小频率，并在一些情况下完全预防糖尿病(Rabinovitch，1998年)。在一些非糖尿病倾向的小鼠品系(例如C57BL/6)中，用TNFα全身性治疗导致胰岛炎(Rabinovitch，1998年)。在生命早期表达TNF的NOD小鼠胰岛(NF-α-NOD)中转基因表达TNFα加速了疾病进展(Koulmanda,Bhasin等人，2012年)。并没有研究特别使用TNF抑制剂来防止或逆转T1D的啮齿动物模型中的糖尿病。
肿瘤坏死因子-α似乎通过增强胰岛的炎性细胞的募集，活化细胞并增强自身抗原呈递来促进糖尿病自身免疫性(Rabinovitch，1998年，Kodama,Davis等人，2005年)。肿瘤坏死因子-α激活血管内皮素，上调MHC I和粘附分子(Argiles,Lopez-Soriano等人，1994年)。在T1DM小鼠模型中，浸润胰岛的一些最初细胞是树突状细胞(DC)(Argiles,Lopez-Soriano等人，1994年，Rabinovitch，1998年)。对β-细胞抗原递呈给T细胞至关重要的树突状细胞及其它抗原递呈细胞(APC)通过上调MHC I和II以及共刺激分子而被TNF活化(Rabinovitch，1998年，Kleijwegt,Laban等人，2010年)。在β细胞上，肿瘤坏死因子-α也直接增加MHC I，并与IFNγ协同上调MHC II，这两者似乎提高了其对T细胞杀伤的敏感性(Atkinson,Bluestone等人，2011年)。
此外，存在TNF的重要非免疫效应，这使在T1D中对其进行阻断颇具吸引力。肿瘤坏死因子-α具有直接的细胞抑制效应并且损害胰岛素产生和分泌，并且其具有间接杀伤β细胞的杀细胞活性(Mandrup-Poulsen,Bendtzen等人，1987年，Kawahara和Kenney，1991年，Dunger,Schroder等人，1995年，Rabinovitch，1998年)。肿瘤坏死因子-α也削弱胰岛素信号转导并增大外周胰岛素抗性，其可在实验模型中通过阻断TNFα得以逆转(Rabinovitch，1998年，Koulmanda,Bhasin等人，2012年)。相比于患有长期疾病的那些或健康对照，患有新发作的T1D的患者具有升高的血清TNF水平(Cavallo,Pozzilli等人，1991年)。存在患有T1D的患者的一些病历报告，这些患者开始用TNF阻滞剂治疗其它自身免疫疾病，因胰岛素敏感性明显增大而胰岛素需要有所下降(Yazdani-Biuki,Stelzl等人，2004年，Boulton和Bourne，2007年，van Eijk,Peters等人，2007年，Arif,Cox等人，2010年)。因此，TNF也具有有效的代谢作用，可通过提高β细胞应激和死亡而促进糖尿病。
支持TNFα在T1D作用并且对其阻断可能能够调节人病程的数据来自于Mastrandrea等人实施的新诊断的T1D中依那西普的小型先导临床试验报告(Mastrandrea,Yu等人，2009年)。合格性包括自诊断起约6周的年龄在3–18岁的患者，其呈糖尿病自身抗体(即GAD-65和/或胰岛细胞抗体)阳性，具有正常的WBC和血小板计数，以及正常的肝和肾功能。患者接受经皮下给药的0.4mg/kg(最大25mg)依那西普，每周两次维持24周，或者接受安慰剂。研究招募18名受治疗者(平均年龄约12.5岁)，10名进入依那西普组(0.4mg/kg SQ，每周两次，×24周)，并且8名进入安慰剂组。随访患者6个月。相比于安慰剂参与者，经依那西普-治疗的参与者示出较低的胰岛素需求和较低的HbA1c，重要地，观察到由响应于混合膳食耐受性测试(MMTT)的2小时曲线下面积(AUC)C-肽水平所评估的C-肽产量相对于基线增加39％。相比之下，安慰剂组的C-肽产量减少20％。在任一组中不存在严重的不良事件。报告显示三名依那西普治疗的患者轻微、短暂的感觉异常，但是不良事件(所有轻微)的频率在两组中类似。虽然并未跟踪这些极具前景的初始观察，Sponsor主张该研究中产生的数据将提供TNF阻断剂在T1D中潜在有益效果的重要理论基础并在该群体中证明进一步研究。
临床前和临床研究的以上证据表明TNF在T1D发展和进展中具有关键作用。存在TNFα的免疫、直接毒性和代谢效应，表明阻断该细胞因子是用于在临床上进一步研究的极具吸引力的方法。不存在可用于患有T1D的那些的病情改善疗法，并甚至在胰岛素的最佳血糖控制下继续存在严重短期和长期发病率和死亡率的事实，支持了对发现改善患有T1D的那些的病程、血糖控制，以及寿命的疗法存在显著尚未满足的需求的观念。
如上所讨论，在T1D(如多种其它自体免疫疾病)中，TNF似乎在疾病发生和发展中发挥关键作用。已良好建立了TNFα阻断在其它自体免疫疾病中的临床实用性。存在阻断TNFα的多种FDA-批准的试剂，包括阿达木单抗、戈利木单抗、英夫利昔、赛妥珠单抗和依那西普，并且该类生物疗法已被广泛地评价，开处方，并已成功地治疗成人和儿童自身免疫疾病谱，诸如类风湿性关节炎、牛皮癣、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。TNF抑制剂存在药品核准标签外用途和实验用途。这包括其中加入TNF抑制剂示出改善移植物存活的同种异体胰岛移植方案，可能反映出在该适应症中阻断TNF对β细胞存活的有利免疫和代谢作用。戈利木单抗、英夫利昔、赛妥珠单抗和阿达木单抗是结合TNFα的单克隆抗体；而依那西普是由与IgG尾结合的TNF受体组成的融合蛋白并且也结合淋巴毒素α(LTα)。淋巴毒素α似乎在啮齿动物自体免疫性糖尿病中发挥作用，但尚未示出直接参与人T1D。就儿童的临床用途而言，依那西普自1999年起已被FDA-批准于患有JIA的2岁及以上儿童，英夫利昔分别在2009年和2011年被批准于患有克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的6岁及以上儿童，并且阿达木单抗在2008年被批准于患有JIA的2岁及以上的那些，并且在2014年被批准于患有克罗恩氏病的6岁及以上的那些。戈利木单抗已在200名患有JIA和儿科UC的2岁及以上儿童中进行研究。除功效之外，这些试剂在儿童中的安全特征已得到充分记载并且在多种适应症中类似于成人中的安全特征。
概括地说，在T1D的免疫和代谢发病机理中存在涉及TNFα的强劲临床前和临床数据，并且阻断TNFα能够干扰糖尿病自体免疫并保护β细胞。存在近二十年对包括在小至2岁的儿童中的多种人自身免疫疾病的TNFα-阻断剂的成功临床经验。T1D对于个体、其家庭和社会一直是重大的负担，对可有助于维持内源性β细胞功能且减轻该疾病的短期和长期后遗症的T1D疾病改善疗法存在显著尚未满足的需求。
戈利木单抗的临床经验
成人方案
跨适应症的总体开发方案的描述
经SC注射施用的(戈利木单抗)目前被美国批准用于成人，从而在对前期治疗应答不足或不耐受或者需要连续类固醇治疗的患者中，与甲氨蝶呤(MTX)联合治疗中度至重度活动性类风湿性关节炎(RA)；单独或与MTX联合治疗活动性银屑病关节炎(PsA)；治疗活动性强直性脊柱炎(AS)；以及治疗中度至重度活动性UC。
在成人风湿病适应症中的批准的剂量是经SC注射施用50mg，每月一次。批准用于患有UC的成人的剂量是在第0周经SC注射200mg，然后在第2周100mg皮下作为诱导(200mg→100mg)，之后为100mg皮下每4周施用一次的维持疗法。
建立的安全特征
已在研究中对RA、AS和PsA评价长期安全性(安全性扩展多至5年)，并且在UC中完成长期延续的大约4年随访。在临床研究中超过11,000名受治疗者暴露于戈利木单抗，自产品发布起，2015年10月06日全世界另外估计的393,000名患者暴露于戈利木单抗(方案中所有临床研究以及各研究中暴露的受治疗者数目的列表提供于表8)。
戈利木单抗的安全特性与TNFα抑制剂类药物一致。
在临床研究中所观察的戈利木单抗的ADR示于表7。
表7中的ADR频率基于2期和3期临床研究中5,717名戈利木单抗-治疗的受治疗者的数据：RA研究中3,090名受治疗者(C0524T02、C0524T05,C0524T06、C0524T11、C0524T28、C0524T12和CNTO148ART3001)、PsA研究中394名受治疗者(C0524T08)、AS研究中564名受治疗者(C0524T09、C0524T29)、UC研究中1,245名受治疗者(C0524T16、C0524T17和C0524T18)、重度持续性哮喘研究中231名受治疗者(C0524T03)、以及患有活动性放射学阴性中轴脊柱关节炎(active nr-axial SpA)的193名受治疗者(P07642[MK-8259-006])。
下表中列出的ADR根据频率和SOC分类。频率类别在表的脚注中定义为极常见、常见、不常见、罕见、极罕见、以及未知。
表7：临床研究中戈利木单抗不良反应的汇总
儿科方案
跨适应症的总体儿科开发方案的描述
戈利木单抗目前未被批准用于儿科患者。然而，在患有pJIA的儿童中实施SC戈利木单抗研究(CNTO148JIA3001)，并且在儿科UC中皮下施用戈利木单抗的临床开发方案当前正在进行中(CNTO148UCO1001)。
CNTO148JIA3001为3期多中心双盲随机化脱瘾研究，尽管甲氨蝶呤(MTX)疗法≥3个月，主要目标是评估在具有活动性关节炎的≥5个关节所显现的pJIA的儿科受治疗者(2岁至小于18岁)中SC施用戈利木单抗的临床功效。CNTO148JIA3001研究由以下组成：开放标签阶段，其中患者接受SC戈利木单抗30mg/m2每4周一次+MTX，保持16周；之后为随机化脱瘾阶段，其中患者实现美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)儿科(Ped)30响应，第16周接受戈利木单抗30mg/m2+MTX，或安慰剂+MTX每4周一次至第48周。还存在长期延续，其中平均随访期为大约2年。共173名受治疗者(75.7％女性；24.3％男性)参与研究，并且154名受治疗者在第16周进入随机化脱瘾期。平均年龄为11.2岁(52.0％年龄为12至17岁；48.0％年龄为2至11岁)并且平均重量为43.1kg。
CNTO148UCO1001为1b期多中心开放标签研究，以评估戈利木单抗在患有儿科UC的儿童中的PK、安全性和功效。该多中心开放标签研究招募患有中度至重度活动性UC的年龄2至17岁的儿科受治疗者，他们示出对常规疗法(即IV或口服皮质类固醇或免疫调节剂AZA或6-MP)响应不足，无法耐受，或有医疗禁忌，并且对抗TNFα试剂首次用药。受治疗者如下接受基于重量的SC戈利木单抗的剂量方案：
·体重<45kg的受治疗者：第0周90mg/m2，第2周45mg/m2，并在6周反应者中第6周起45mg/m2每4周一次
·体重≥45kg的受治疗者：第0周200mg，第2周100mg，并在6周反应者中第6周起100mg每4周一次
研究分为2个部分：PK部分至第14周，并且研究进展至第126周。研究1(CNTO148UCO1001)的14周PK部分已经完成，并且研究进展在进行当中。共35名受治疗者(51.4％女性；48.6％男性)参与研究。平均年龄为13.4岁(71.4％年龄为12至17岁；28.6％年龄为2至11岁)并且平均重量为51.7kg。
建立的安全特征
戈利木单抗在2至<18岁的儿科受治疗者中良好耐受。通常，所观察到的戈利木单抗在pJIA和儿科UC研究中的安全特性(包括不良反应的类型和频率)符合所研究成人群体的已知安全特性并且符合其它TNFα抑制剂。未观察到新的安全性信号。
所提出的2a期新发作T1D研究——CNTO148DML2001
Sponsor规划在新诊断的T1D患者中的2a期新发作T1D研究以评价对β-细胞保护的影响，从而维持内源性胰岛素。该研究的结果将提供关于是否经由TNFα阻断影响T1D疾病进展并支持新发作疾病以及在症状发作和需要外源胰岛素之前“病前”状态的进一步发展的关键信息。该研究的关键方面在下文有所概述。
研究设计
这是在患有T1D的受治疗者中的戈利木单抗的2a期随机化双盲安慰剂对照的平行小组多中心研究。大约81名6至21岁的受治疗者将随机以2:1比率分配来经皮下(SC)施用接受戈利木单抗或安慰剂。随机化至戈利木单抗治疗组的重量<45kg的研究受治疗者将在第0周和第2周接受诱导剂量的SC戈利木单抗60mg/m2，之后在第4周接受维持剂量30mg/m2并且每2周施用一次直至第52周。随机化至戈利木单抗治疗组的重量≥45kg的研究受治疗者将在第0周和第2周接受诱导剂量的SC戈利木单抗100mg，之后在第4周接受维持剂量的SC戈利木单抗50mg并且每2周施用一次直至第52周(0部分)。随机化至安慰剂治疗组的受治疗者将接受SC安慰剂注射每2周施用一次直至第52周(图18)。为了有利于募集和保持受治疗者，Sponsor将允许在家中自行施用研究试剂。
在研究期间，所有受治疗者将接受用外源胰岛素集约管理其糖尿病。受治疗者(且当适用于看护人时)必须同意遵守如由美国糖尿病协会所定义的当前所推荐的利用特异性HbA1c目标进行严格血糖控制。这些当前推荐旨在实现似乎减少T1D的短期和长期后遗症的葡萄糖水平。特异于该研究，这将包括对年龄6至12岁的那些小于8％，对年龄13至18岁的那些小于7.5％，并且对19岁及以上的那些小于7％的HbA1c目标。受治疗者的血糖控制将由受治疗者的初级护理医师进行监测。此外，HbA1c及其它血糖控制参数将在筛选时和研究期间进行评估。
研究群体
患有新诊断的T1D的6至21岁的男性和女性将参与该研究。参与者将满足接受的标准来参与新发T1D研究，包括：满足T1D的当前ADA定义，对至少1至5种识别的T1D自身抗体呈阳性，示出残留β-细胞功能的证据(由混合膳食耐受性测试后至少0.2pmol/mL的峰值c-肽定义)，以及在T1D诊断100天之内于试验中随机化。排除标准将致力于辨别可能因免疫或感染风险而处于任何特定风险的个体(如果包括在试验中)。
出于以下原因选择年龄范围：
相比于年长成人而言儿童和年轻成人TID的独特属性：
最近的数据确认在儿童和年轻成人(即至约21岁)以及年长成人中存在T1D疾病的重要差异。可接受的是在患有新诊断的T1D的年轻和年长个体中存在发展和病程的多种临床差异，包括可在年轻组中描述为更具侵入性发展(即更快需要完全胰岛素替代)和初始病程。在Greenbaum等人在大量最近新发T1D的研究中进行安慰剂受治疗者的c-肽减少自然史的充分评价的最近报告中，发现示出约7-21岁的那些中类似的c-肽减少率，并且比>21岁的那些更快下降，有力地说明在这些“年轻”和“年长”个体中存在不同的免疫病理学。此外，为了支持该论点，在一些T1D的免疫治疗试验中，在年轻和年长个体中存在不同的功效。例如，阿法赛特(LFA3-Ig)和阿巴西普(CTLA4-Ig)似乎在年轻个体(<18至21岁)中具有优先效应，而胸腺球蛋白似乎仅在年长个体(>21岁)中具有有益效果(Gitelman,Gottlieb等人，2013年，Orban,Bundy等人，2014年，Rigby,Harris等人，2015年)。由于T1D的性质和过程以及与该疾病相关的终身和累积发病率和死亡率，被减缓或稳定化疾病进展的疗法最积极影响的那些是儿童和年轻成人。由于该群体相比于年轻成人个体的疾病前述差异，患有T1D的儿童和年轻成人的直接研究对于最适当地开发出将在该疾病中最有效的疾病改善疗法很重要。
支持TNFα阻断剂在儿童新发T1D中有益效果的前景的数据：
Sponsor认识到在儿科群体中评价之前，有时期望展示成人群体中治疗性干预的临床有益效果。然而，从研究人员在水牛大学(University of Buffalo)进行的从小型依那西普预备试验(也如上所述)示出，用24周程的TNFα-阻断剂依那西普对7-18岁儿童(方案允许小至3岁的儿童)中c-肽产生、HbA1c和外源胰岛素使用具有有益效果。虽然这是小型试验(共18名参与者有10名接受依那西普)，结果却是极具前景的，这示出相对于入选时，在24周用依那西普使内源性胰岛素产生平均增加，在该期间安慰剂组的c-肽有损失。给出这些结果，并且考虑在成人和儿科适应症两者中使用戈利木单抗和其它TNFα阻断剂的广泛经验，Sponsor主张在患有新诊断的T1D的儿童中TNFα-阻断的益处前景已得到证明，并因此在该特定群体中将戈利木单抗评价为疾病改善疗法是适当的。
包括戈利木单抗的TNFα阻断剂的广泛安全性和功效经验
Sponsor认识到就年龄而言，一些预期的研究群体可被视为用于评价免疫疗法的特别易感人群。我们认为就戈利木单抗自身而言并作为TNFα-阻断剂类成员，在其它自身免疫病中乃至2岁的儿童存在稳健的安全性(以及功效)体验。自1999年起，依那西普已被FDA-批准于患有JIA的2岁及以上的儿童。英夫利昔分别在2009年和2011年被批准于患有克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的6岁及以上儿童。阿达木单抗在2008年被批准用于2岁及以上的那些的JIA，并在2014年被批准用于6岁那些的克罗恩氏病。戈利木单抗已在200名患有JIA的2岁及以上儿童中进行研究，并且目前在欧洲对该适应症处于注册中。此外，所有以上试剂均被批准用于各种各样的成人自体免疫病症，包括类风湿性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和牛皮癣。因此，TNFα-阻断剂(包括戈利木单抗)的安全性和副作用性质不仅在成人中，而且尤其是在儿科群体得到良好建立，可能超过已在T1D中评价的任何其它免疫治疗。
综上所述，较强基本原理致力于对年轻个体的新发T1D的戈利木单抗研究，并且仅包括儿童和6至21岁年轻成人。不仅存在戈利木单抗和TNFα-阻断剂类在儿科自身免疫性中的稳健特定功效和安全性数据，而且还存在TNFα-阻断能够减缓(如果不逆转)那些新诊断的T1D中的β-细胞损失的该较年轻年龄范围内极具前景的数据，因此满足该年龄组中TNFα-阻断的“有益效果前景”的临界标杆。非常一致地示出，T1D糖尿病在年轻与年长个体中有差异，并且这些组中可存在对免疫疗法的显著不同响应，其中一个组中的功效(或缺乏其)可能实际对另一组信息不准确。Sponsor将上限年龄“截止”选择为21岁，原因是许多这些研究似乎示出该年龄的“年轻”和“年长”疾病的区别性断开。6岁是在其它新发T1D研究(即阿巴西普和康纳单抗)中可接受的较低年龄入选，并且也为批准的儿童UC的年龄截止并且包括所批准的TNFα-阻断剂类的JIA年龄范围。
剂量选择
在该试验中提出的戈利木单抗给药所整合的知识关于：T1D的疾病-特定考虑，了解在患有T1D的儿童的前述先导试验中依那西普的TNF抑制与sponsor的戈利木单抗经验的对比功效。在T1D中，β-细胞的破坏是不可逆的，并且似乎在临床疾病发作时很迅速。对于更多炎症免疫介导的疾病，通常使用更高或更频繁的诱导剂量，之后为较低维持剂量，诸如使用抗TNFα试剂用于克罗恩氏病和溃疡性结肠炎7,8,9。对于T1D，还需要快速抑制疾病活性来防止进一步破坏加入研究时存在的β-细胞。考虑到戈利木单抗稳态浓度通常在12周后建立，应当采用诱导剂量，之后为维持给药方案，从而实现较早稳态浓度以抵消进一步β-细胞损失。对先前成人和儿科研究的数据与群体PK和理论PK/靶结合(TE)建模一起进行评价，以确定所提出的用于该2a期新发T1D研究的给药方案。
考虑到预期需要T1D中的诱导和维持给药，各种BSA-调节的给药方案通过用评估游离TNF抑制的群体PK模型和理论PK/TE模型进行模拟来加以探究。用于戈利木单抗的群体PK模型基于建立的多关节JIA模型，其中所有受治疗者并行施用甲氨蝶呤(MTX)。因为MTX先前已示出影响戈利木单抗暴露5并且不期望患有T1D的患者用甲氨蝶呤并行治疗，在模拟中考虑了戈利木单抗的清除率增大36％(图19)。对所提出的T1D给药方案与已经在儿科群体中研究的给药方案的JIA(图19小组A)和UC(图19小组B)进行比较，利用CDC生长图表对6至21岁受治疗者的身高和重量进行分析。模拟基于建立的JIA群体PK模型，由于T1D群体中未共施用MTX而使戈利木单抗的清除更快(36％)。对于儿童，戈利木单抗30mg/m2(50mg/1.67m2)将大约等于对于重量60kg(BSA为1.67m2)的成人受治疗者的50mg剂量。因此，30mg/m2剂量被设计成类似于成人50mg剂量，并且60mg/m2剂量类似于成人100mg剂量。基于这些模拟，预期所提出的T1D给药方案的PK暴露介于JIA与ped UC暴露(两者均在不用MTX情况下模拟)之间，但每2周一次维持给药间隔将导致稍微较高的谷浓度。在成人中，戈利木单抗50mg每4周一次是用于治疗RA、PsA、或AS的最小有效给药方案。由于在T1D受治疗者中不存在并行的MTX，期望等同于成人50mg每4周一次剂量的儿科30mg/m2每4周一次给药方案可能不导致足以抑制TNFα的全身性暴露；因此，Sponsor主张应当研究较高的剂量或更频繁的给药间隔。
引入来自与靶介导的药物处置(TMDD)模型配对的以上群体PK模型(具有36％较高清除率而不伴有MTX)的PK暴露的理论PK/TE模型用于评估药物和靶标之间的相互作用并模拟施用抗TNF之后的TNFα抑制(图20)。PK/TE模型基于如下假设开发：T1D中所测的依那西普给药方案导致足够的TNFα抑制，给出先前所观察的积极结果6。NFα动力学参数获自临床前研究和类比法，并使用同一组TNFα动力学参数来比较戈利木单抗与依那西普的效应。全身循环中TNFα的抑制也被假设代表胰腺中的那些。在考虑戈利木单抗与依那西普之间的PK和TNFα结合亲和力差异之后，戈利木单抗给药方案被设计成接近依照患有新发TID的儿童的先导试验中的依那西普给药方案的TNFα抑制程度6(Mastrandrea，2009年)。PK/TE模型提出与30mg/m2皮下每4周一次的维持剂量不同，第0周和第2周60mg/m2皮下(至最大100mg)诱导剂量方案，之后为30mg/m2皮下(至最大50mg)每2周一次或60mg/m2皮下(至最大100mg)每4周一次的维持剂量方案，其允许TNF抑制至接近近似于依那西普的水平(图20)。30mg/m2每2周一次和60mg/m2每4周一次维持剂量方案将具有相同的总体暴露(AUC)和类似的TNFα抑制；然而，60mg/m2每4周一次方案将具有较高的峰/谷浓度波动，并因此对TNFα的抑制有更大波动。已知TNF对β细胞具有直接的细胞抑制和杀细胞效应。因此，预期在大剂量但不太频繁给药的谷期间发生的TNF升高可能损伤残余β细胞。因为这些给药方案的戈利木单抗暴露可视为等效的，30mg/m2皮下(至最大50mg)每2周一次的给药方案是优选的，原因是模拟示出每2周一次维持给药间隔将导致稍微较高的谷浓度，从而导致较小的峰/谷波动以试图最佳地使β-细胞免受TNFα直接影响。
戈利木单抗的安全性和功效已在患有RA、PsA、AS和UC的受治疗者中得到充分表征。在患有RA的受治疗者的2期研究中，评价4种不同的给药方案(50mg每2周一次或每4周一次以及100mg每2周一次或每4周一次)，其中测试的所有剂量通常良好耐受并且有效地维持临床响应至第52周。在pJIA中，30mg/m2每4周一次给药方案被研究多至最大50mg(批准的成人RA剂量)。在ped UC中，低于45kg的受治疗者在第0周接受90mg/m2(至最大200mg)的SC诱导剂量且在第2周接受45mg/m2(至最大100mg)，之后为45mg/m2(至最大100mg)SC每4周一次的维持给药方案，而45kg及以上的受治疗者则在第0周接受200mg的诱导剂量且在第2周接受100mg，之后为100mg每4周一次的维持剂量。迄今为止，所研究的给药方案总体良好地耐受，不具有用类似于成人风湿病学和IBD研究中所观察的那些的频率、类型和严重程度所鉴定的新药物不良反应。总之，考虑到T1D的疾病特有问题、戈利木单抗和依那西普的药理学比较以及戈利木单抗的特定临床经验，将在第0周和第2周以60mg/m2皮下(至最大100mg)诱导，之后为30mg/m2皮下(至最大50mg)每2周一次选择为推荐的剂量方案。还研究了重量截取值(45kg)，使得在重量截取值以上的患者将从已批准的成人PFS展示接受戈利木单抗。Sponsor用疾病-和疗法特定注意事项来开发该给药方案，试图给予该概念验证试验最佳成功机会。虽然过去并没有特别使用方案，所提出的T1D给药方案将在儿童(机构所支持以在重叠年龄范围内研究)中实现前述JIA和UC给药之间观察的戈利木单抗暴露，并因此缓解该特定方法的安全问题。如果该试验成功，则将在后续临床研究中探究对剂量范围的考虑。
处理持续时间
受治疗者将接受SC戈利木单抗或安慰剂至第52周。在某种程度上，该试验的目标在于重复和扩展依那西普在T1D中的24周先导临床试验的发现，示出了β-细胞通过中和TNFα得以保留。由于诊断后β-细胞损失的自然史，记载β-细胞减量剂(sparing agent)在适当大小试验中的统计意义上显著且临床上有意义的积极效果最可能在大约1年时，并且可接受的主要(包括第一)端点是第12月诱发c-肽产生。在批准的适应症中，戈利木单抗用作慢性疗法并因此所提出的治疗长度符合该试剂的临床用途。通过一年的治疗评价以及附加的停药评价，我们认为我们将获得重要的功效和安全性数据，以助于指导该疗法在T1D中的进一步临床开发。
基本原理和主要端点的选择
研究CNTO148DML2001中的主要试验端点将符合主导性T1D研究网络(包括T1DTrialNet和免疫耐受网络(Immune Tolerance Network))使用和接受以及主要卫生当局指南(包括FDA和EMA的那些)提出的那些。具体地，主要端点在于第52周的混合膳食耐受性测试后刺激c-肽响应(4h AUC)，作为内源性胰岛素产生的客观测量。因为这将为安慰剂控制的试验，实证研究将定义为显示第52周积极治疗组与安慰剂治疗组中c-肽AUC在统计意义上的显著差异。诱发的c-肽评价将在大约13、26、39、78和104周作为第二端点进行。这些评价的目标在于获得戈利木单抗对β-细胞保护(12、26和38周)效力的时程和应答的停药持久性(78和104周评价)的认识。主要第二端点将评价对血糖控制(HbA1c)、胰岛素使用(以U/kg/天)和低血糖率(包括≤70mg/dL、55mg/dL和35mg/dL的水平)的其它潜在积极效果。
安全性监测
除评价戈利木单抗在防止β-细胞功能的持续损失中的功效之外，还将存在广泛安全性评价。作为免疫调节剂，这些评价将致力于确定感染或副作用是否对免疫状态有增高的风险。这将包括谨慎的文件编制研究访视和在家(使用患者报告的结果)期间局部或全身感染的病征或症状。Sponsor还将经由例行评价EBV和CMV状态来监测白血细胞计数和受抑制免疫应答的适应症。由于戈利木单抗及其它TNFα阻断剂的经验，Sponsor预期非免疫副作用的可能性较低，但我们将经由身体检查和实验室评价(包括肾功能测试、肝功能、以及血液学测试)来监测此类效应的任何临床或化学迹象。该方案的目标在于确定是否对T1D进展存在有益效果，并且虽然不能预期，Sponsor将能够使用对其的评价来确定是否存在内分泌不利影响，诸如增大的低血糖率、较差的血糖控制或更快丧失内源性β细胞功能。
将建立独立的外部数据监测委员会(Data Monitoring Committee，DMC)来在现行基础上监测数据，以确保参与该研究的受治疗者的持续安全性。委员会将满足周期性查看临时数据。在查看之后，DMC将作出关于延续研究的推荐。安全性查看将致力于特定AE、SAE、以及死亡率。
SAE记录将在现行基础上提供给DMC成员。DMC将访问非盲数据并查看表列的安全性汇总(如果适当)和DMC可能在研究进行期间要求的任何附加数据。并未计划正式的统计假设检验。此外，在研究期间，Sponsor的研究责任医师(或指定者)将定期查看站点的盲化安全性数据并通知DMC和适当Sponsor人员任何问题。提交给机构的试验性新药(Investigational New Drug，IND)申请的方案将描述所有安全性评估以及该研究中待进行的监测、DMC的组成以及任务和责任，包括特定终止规则。
一种重要的安全性测量还包括排除因并发疾病或疗法而具有免疫抑制的受治疗者，并且排除具有现存显著感染(包括肺结核)或有显著感染史的个体。
给药的方法
给出在2a期研究的维持部分期间所提出的每2周一次给药方案，在家施用的选项预期有助于患者的日常生活(即对于每种剂量，不需要访诊护理场所)并且也使研究加入和保持增加。如果患者或护理者进行在家施用，则他/她应当被教导注射技术，并且应当评估他们皮下注射的能力以确保正确施用。此外，推荐首次自我注射或护理者注射在有资格的保健专业人员督导下进行。
所提出的用于2a期新发T1D研究的展示
Ultrasafe
对于体重≥45kg的儿科受治疗者，用50mg PFS-U装置经皮下施用戈利木单抗，该装置已被批准用于成人。对于附加细节，参见下文和图21。
UltraSafe 针套(PFS-U)
UltraSafe为手动操作的单次使用的一次性针套系统，是载药注射器的附件并且旨在用作安全机构，以使保健专业人员和患者或其护理者在施用后和处理用过的载药注射器期间意外针刺的发生率降低。UltraSafe容纳0.5mL或1.0mL PFS。无论如何药品与装置在组装或使用期间均无直接接触。
装置的透明塑料构造和观察槽设计允许可视化注射器。装置的被动性允许垂直针插入，并且当注射器的柱塞挡止器完全推进并递送药物剂量时，弹簧辅助的防护件释放。防护件随用户松弛其握持而自动地在注射器和针上前进，直至其闩锁处在锁定位置。
UltraSafe的特征示于图21中。
VarioJect
Sponsor将儿科展示(称为VarioJect)开发为跨多个儿科方案的平台装置，以利于BSA-给药，并且计划利用VarioJect装置用于该研究。Sponsor先前讨论了支持的其它儿科方案中注册VarioJect装置所需的数据，其包括实际使用和标签理解评估、来自人员因素研究的数据、以及附加的装置性能数据。
剂量和装置选择图表(表9)将被开发成使得保健提供方、护理者、和/或儿科受治疗者(如可适用)能够确定对应的绝对毫克(mg)剂量和待使用注射装置的组合。
VarioJect
VarioJect装置将旨在基于以5mg为增量的10mg至45mg剂量范围内的BSA剂量方案来递送单剂量药物。VarioJect装置被设计成与包含0.5mL药品(PFS)的相同1mL Becton Dickson Hypak注射器装配在一起，该药物已经用于已批准的SIMPONISmartJect自我注射器和PFS-U。需注意，VarioJect装置不与药品接触，并因此VarioJect装置对药品的生化特性或稳定性没有影响。
VarioJect装置已由Ypsomed,Holding AG,Switzerland(即用于其它适应症的载药笔的有经验的供应商)开发为平台技术。装置根据质量体系规范21CFR第820部分的设计控制要求进行设计。
VarioJect装置的总体构造及其特征描述于图22中。
图23示出处于不同使用阶段的装置：对装置进行灌注；通过使柱塞转至期望的固定剂量来选择剂量设定；并且通过推动柱塞来施用剂量。
为了使用装置，用户首先移除帽盖(图24，步骤B)，然后通过将气泡轻敲(通过如图24步骤C所示的观察窗口可视)至注射器顶部并按压柱塞移除空气(图24，步骤C)来对VarioJect灌注。用户然后拨动柱塞来选择适当的剂量(图24，步骤D)。在下一步骤，用户以大约90度角抵靠皮肤按压装置，导致针套回缩并且针插入所选定的SC注射部位(图24，步骤E)，随后推动活塞来递送剂量(图24，步骤F)。在递送之后，用户移除装置，使针套被动地伸展并锁定在针上，从而提供防止意外针刺(图24，步骤F)。在施用剂量之后，柱塞锁定于下部位置，防止装置再利用。
笔被设计成以0.05mL增量递送0.10mL至0.45mL。对剂量准确度的需求基于ISO11608-1 2012用于医疗用途的基于针的注射系统、要求和测试方法，第1部分：基于针的注射系统，以及USP 31一般要求/注射(ISO11608-1 2012Needle-based injectionsystemsfor medical use,Requirements and test methods,Part 1:Needle-basedinjection systems,and USP 31General Requirements/Injections)来建立。对递送精度的技术设计要求在于笔必须递送抽取的剂量-0.00/+0.05mL，其中0.05mL是最小增量。标称4.5mm的针突起距离限制对皮下组织的注射深度。
装置具有多个特征以助于确保其正确和安全地使用。指示柱塞应当被推动的橙色灌注带和白色箭头用于提醒用户装置必须在使用前被灌注。橙色灌注带在灌注后消失，指示该步骤已经完成，并且不能选择剂量直至装置被灌注。柱塞上的图形与剂量选择槽口对准，明确指示剂量正被选择，并且止动器提供给用户装置被正确对准的触觉反馈。在剂量施用之后，柱塞锁定于下部位置，并且递送的剂量锁定在剂量槽口中，两者均证实和提供被递送的剂量的记录。另外，锁避免未授权再利用残留产品的可能性。当笔从注射部位移除时，针套自动地伸出并锁定。该被动的针安全性特征有助于降低意外针刺的可能性，并且也使针最小化可见暴露于可能害怕针的某些患者和护理者。
VarioJect的开发
装置的设计和开发由以下指导：ISO 11608-1 2012用于医疗用途的基于针的注射系统、要求和测试方法，第1部分：基于针的注射系统以及FDA准则草案：喷式笔的技术考虑，以及旨在用于药物和生物制品的相关注射器(ISO 11608-1 2012Needle-based injectionsystems for medical use,Requirements and testmethods,Part 1:Needle-basedinjection systems as well as FDA Draft Guidance:Technical Considerations forPen,Jet,and Related Injectors Intendedfor Use with DrugsandBiologicalProducts)。
测试将包括工作台测试，从而确保药品精确递送以及其它适合性和人员因素研究。
已对装置的形式、特征、以及总体可用性进行了早期研究。实施一轮人种志研究，其中在儿童采取胰岛素或生长激注射情况下，Sponsor观察和回访父母和儿童。此外，进行包括儿科受治疗者的父母、护理者、以及儿童的5种形成性人员因素研究，以测试和改进设计。开发出基于草图的IFU并与装置概念一起测试。测试的结果是积极的，通常确认了所选装置设计的总体形式和IFU。引入一些设计增强来降低使用误差，并且用户对更新的设计进行重新测试。例如，将拇指停靠部增加至柱塞，以助于用户理解应当握持装置的取向，并且凸缘几何结构被调节成允许在使用期间优选的握持。
VarioJect的进一步开发
在临床研究准备中，Sponsor完成所有验证和确认测试，以评估VarioJect装置的安全性、可用性和性能。虽然Sponsor未预期用于临床研究的装置的任何显著设计改变，Sponsor却意在基于常规开发尝试期间的发现来增强VarioJect设计的稳健性。在模拟的使用安全性研究中，虽然研究成功地展示装置的尖锐物伤害防止特征的功能，应注意选择使用超过能够克服装置灌注和给药期间的最大推动力的典型递送力(>70N)的极高力的用户的情况很少。模拟使用研究中的参与者各自快速在儿童中实施26至33次VarioJect注射(18参与者中共557个装置)，这在用户将耗费时间且不使用过度力情况下注射患者时不被视为代表性使用。需注意，该失败此前并未在用装置进行的任何多个人员因素研究中观察到。Sponsor意在寻求较小设计增强以通过增大接触末端止动表面之间的重叠区域来进一步强化灌注和给药末端止动特征，从而减轻不正确的剂量施用给患者的风险。
用于灌注末端止动的现行规格是46N，并且用于给药末端止动的规格69N。由于给药末端止动失效所引起的超剂量风险，给药末端止动规格为1.5×灌注末端止动规格。这些特征的验证测试示出当前设计对于灌注超出所述规格约50％并对于给药超出35％。基于模拟安全性研究的结果，Sponsor增大规格并实现微小设计改变，以增大推动通过灌注和给药末端止动所需的力。所提出的修改对用户界面没有影响(用于操作和使用步骤的所有力仍然未改变)，因此，临床使用的装置将为代表性的商业装置。包括这些微小改变的商业装置将经由工作台测试得到充分验证，以证实对装置性能没有影响并且确认规格已增大并且适用于使用期间潜在的过度力。仅对装置的外部特征作出微小改变。图24中示出改变的概观。
容许修改的外部特征
1剂量按钮直径将增大0.5-1.0mm。
2端帽直径将增大0.5-1.0mm。
改进将增大装置性能的稳健性，同时减轻不正确给药给患者的风险而不改变用户界面。对于临床研究，将提供适当的训练来使推动通过末端止动的可能性最小化。
用于儿科用途的VarioJect的适合性
VarioJect的注射特性在注射深度和持续时间方面类似于保健提供方使用手动皮下注射的皮下针实施的那些。另外，如上所述，该手动注射器设计有多个特征，以助于确认其正确且安全地用于儿科患者并且包括被动针安全性特征。该重要的安全性特征有助于降低意外针刺的可能性，并且也使针最小化暴露于可能害怕针的某些年轻患者。该装置的针插入深度仅为4.5mm，被设计成受限注射至儿科患者的皮下组织。另外，类似于胰岛素笔，该装置适用于由护理者和患者在家施用，包括由能够自我施用的经适当训练的儿科患者自我施用。
下文讨论了涉及家中使用和针长度的风险管理活动概述。
家中使用
在VarioJect装置的早期开发中，Sponsor在需要注射(主要是胰岛素和人类生长激素)的儿童家中进行人种志研究。从该导致设计改进的研究获得见解，以助于确保在家庭环境中安全而有效的使用VarioJect，并且这些改进随后在人员因素研究中被证实有效。
示例包括：
·用于提供正确的剂量选择保证的剂量选择旋钮上的清楚的剂量标签和止动器，这是家长护理者的首要考虑因素
·记录使用后剂量选择槽口中的剂量，以允许用户确认递送了正确的剂量
·按顺序排列使用步骤，以允许父母准备剂量，然后使其孩子进行注射，这是用于儿童在家注射的一般实践
·构建说明书，以使用户在他们在程序期间被打断的情况下能够易于发现他们处于注射过程的何位置
此外，在应用FMEA中捕获到与在家注射相关联的风险以确保适当缓和。
示例包括：
·用户不适当的运输或储存装置，或产品过期，从而导致药物降解。添加清楚的标签，以助于确保使用前正确的冷藏和检测产品。
·与帽盖相关的阻塞的风险。对帽盖增加孔，以允许在气道阻塞事件中通气，并且增加警告信息以避免儿童触及。
·儿童无意触及装置。当警告限制无意触及时，用户被指示使装置保持在包装内部。
此外，对可能在家庭环境中发生的滥用装置的可能性进行分析。诺和诺德公司工程师(Novo Nordisk Engineering)即家庭环境中所用的药物递送装置(包括规定的儿童胰岛素递送笔)方面的专家，受聘于Sponsor来探索VarioJect装置的滥用可能性。不同滥用情形的分析包括于应用FMEA中，与适当的缓和措施(包括规格)一起以使得用户难以从装置分离注射器或从注射器提取第二剂量。
VarioJect及其相关的使用说明也具有若干安全性特征，以及用于改善便于家用的总体可用性的特征。为了确认该装置适于在预期群体的家庭使用，Sponsor将进行儿科人员因素验证研究，该研究被设计用于评价视为代表性预期用户群的受治疗者(儿科受治疗者和护理者两者)的家中使用。在人员因素验证研究期间，所有注射将在设计成代表患者和护理者的类似家庭环境的室内进行。规定儿科自我注射对于保健团体是一个严重的问题，并且在护理者可在家对其儿童进行注射或允许患者自我注射之前，训练总是作为必要条件提供。装置和IFU在该背景内开发。此外，Sponsor在形成性测试中评价初次注射的患者群体。基于该测试，认为VarioJect对于用户相当直观。Sponsor采取一些步骤来基于前期形成性测试改进设计。作为一个示例，形成性测试示出未经训练的用户倾向于跳过与灌注相关的步骤(确保适当的装置取向且轻敲气泡至顶部)。为了缓和不适当灌注的风险(可导致剂量不足，对于用户分类为低风险)，Sponsor在装置上引入彩色图形和清楚的分步介绍。虽然大量关注致力于改善装置和相关IFU的可用性，所需训练已被证明是确保正确使用的最佳途径。因此，对于人员因素研究，所有患者和家庭护理者将被提供有代表性的(即使最小限度的)训练，因此模拟了将部署这些装置的现实环境。Sponsor认为模拟人员因素研究是展示装置安全用于家庭用途并足以解决与该装置相关的临床风险的关键。然而，为了解决规则要求，Sponsor意图对VarioJect进行实际使用研究(儿科UC患者中)，该研究被设计成用于采集和记载来自家庭环境中受治疗者和护理者施用的注射的现实VarioJect处理和使用体验数据，包括投诉和使用故障。实际使用研究被视为关键人员因素数据的附加支持。
针长度
关于用于在儿童中皮下注射的针长度，基于公布的文献1,2对VarioJect选择4.5mm的针长度。该针长度被选择适应玻璃注射器的制造公差以及与VarioJect中组装注射器相关的公差两者，从而适当地平衡肌内与真皮内递送的较小风险。基于公布文献中提供的数据，7-17岁组中的肌内注射风险较低，并且虽然肌内注射的风险对于2-6岁组而言稍微较高，但风险仍然很低。同样，2-6岁组中的皮内注射风险较低，并且虽然对于7-17岁组而言稍微较高，但风险仍然很低。进行猪生物分布研究来进一步评价VarioJect的注射深度。该研究表明使用VarioJect的注射深度落入期望的针和注射器范围内。该结论支持了预期结果，因为针和注射器的注射深度受施用注射的人员的影响，并且取决于插入角度以及针插入什么程度，而所提出的VarioJect的递送方法将具有固定的针插入角度和深度。考虑到玻璃注射器的制造尺寸改变以及与VarioJect中装配注射器相关的改变，注射深度的公差是±1.25mm。商业上预期的公差要小得多，如由使用相同BD Hypak注射器的SmartJect自我注射器(7.4-8.6mm)的历史针突起测量所示。此外，通常存在用于皮下施用多种液体药物的注射器和针选择以及施用技术的较宽改变，但所公布的研究并未发现涉及皮下注射波动的显著临床问题。而且作为一类药物，mAb似乎并不需要安全有效的精确或装置-特异性施用到皮下间隙中的特定位置，并且PK的较小改变(虽然不期望)不太可能影响功效结果。尽管如此，安全性评估将作为所提出研究的一部分收集。
导致在“前期T1D”中评价的1型糖尿病的开发目标综述
如上所述，T1D的进展与对早期生命质量以及最终发病率和死亡率的显著影响相关。迄今为止，多种化合物已在新诊断有T1D的那些中进行探究以维持残留β细胞功能，其继而将改善血糖控制并减少疾病短期和长期并发症。然而，Sponsor认为存在尚未满足的医疗需要和重要机会来在处于高风险的那些中延缓或防止T1D。已很好确立的是自体免疫介导的β-细胞损失在临床诊断之前很多年被引发。在临床诊断时发生并因此成为“新发作”研究目标的自体免疫过程可能与前几个月或几年中发生的那些极为类似，因此在新诊断的T1D中示出(甚至适度)功效的试剂可被视为用于在处于发展T1D(即“前期-T1D”)的高风险的那些中检查的候选。这通过支持/批准机构在具有T1D自身免疫性的血清学证据的那些中研究阿巴西普(NCT01773707)和teplizumab(NCT01030861)得到证实，但尚未满足糖尿病临床判据。在可被鉴别为朝疾病进展(即自身抗体阳性和血糖代谢障碍)的高危患者中，较早的治疗以拦截或延缓疾病发作可具有近期和长期益处。在近期，幼儿/青少年可避免每天多次注射外源胰岛素的需要。此外，预计年龄较小的诊断患有T1D的患者可有更具侵略性的疾病。因此，延缓发作2年或更多年可避免β-细胞破坏更迅速进展。长期而言，较早保持β-细胞质量和良好的血糖控制可减轻生命晚期严重的并发症，诸如心血管疾病或与显著发病率或死亡率相关的住院治疗，以及社会经济负担。
因为Sponsor认为在T1D中存在连续的疾病进展，如果在本文概述的试验中观察到积极结果，则除了考虑开发为新发作的疾病的疗法之外，Sponsor将预期进一步评价T1D前驱疾病或“拦截”。Sponsor认为如下6至21岁儿童/青少年患者是进展为临床疾病风险最大的患者并将最大受益于病前状态治疗：具有≥2种自身抗体，患有T1D和血糖代谢障碍，并且尚未依赖于胰岛素。Sponsor提议采取分段方案确定戈利木单抗是否为在上述目标群体中提供有益效果的有效治疗。
Sponsor的在分段方案第一步骤是在该简要文件中所述的新发作T1D研究中建立戈利木单抗的益处-风险。该研究的结果将提供关于该患者群体中戈利木单抗对保持β-细胞质量以及安全性特征的影响的关键信息。在预备试验的早期规划阶段，6至21岁的那些尚未满足T1D正规临床诊断但一级亲属患有T1D，并且对于T1D呈自身抗体双阳性，HbA1c稍微升高(即5.6％至6.4％)。该预备试验的目标在于获得早期安全性和功效信息，以在病前状态建立戈利木单抗的有益效果机制。该试验将在上述新发作个体的研究之后开始。这两个初始研究将为补充性的并且提供关键数据来提供用于高危的那些中较大更正式的“概念验证”临床试验的规划的信息，从而用于T1D发病研究，以评估在目标前期-T1D群体中用戈利木单抗治疗的益处-风险。
Sponsor旨在传送得自T1D风险的那些中准备概念验证研究情况下这两个初始研究的结果，以与治疗前期-T1D的戈利木单抗的稳健开发计划的机构结盟。
表8：支持Simponi儿科表现的研究
对此前提交的数据进行交叉引用，因为该表现已被批准用于成人。
缩写：FDA＝食品和药物管理局；HCP＝健康护理专家；HFS＝人员因素研究；IFU＝使用说明书；PFS＝载药注射器；PFS-U＝UltraSafe 针套中的载药注射器；PK＝药代动力学；sBLA＝补充生物制品许可申请；UC＝溃疡性结肠炎。
A-VarioJect实际使用研究
研究：
VarioJect实际使用研究(包括评估标签理解、安全性、以及装置耐久性/稳健性)。该研究将实施为CNTO148UCO1002的亚试验，其将实施成提供体重<45kg的儿科PK数据，以支持用于儿科UC适应症的基于外推的方法，并展示VarioJect装置可在预期儿科群体中实现期望药物暴露。
目的：
为了提供如所设计的VarioJect连同适当的训练和书面使用说明适用于受治疗者或其护理者在家施用的支持性数据。为了提供展示VarioJect适用于儿科患者群体的支持性安全性数据。为了提供支持性的VarioJect耐久性和稳健性数据。
说明：实施注射的所有研究参与者将被要求完成关于其第二次在家施用之后使用VarioJect的经验的调查表。将采集和研究所有的装置投诉和装置-相关的AE，包括返回装置进行检测。将对随机取样的大约50-100个使用的VarioJect装置进行视觉评估，以评估装置耐久性和稳健性。
评论：研究和调查表被设计成用于采集和记载来自家庭环境中受治疗者和护理者施用的注射的现实VarioJect处理和使用体验数据，包括投诉和使用故障。
B-PFS-U实际使用研究
研究：
PFS-U实际使用研究(包括评估标签理解和安全性)。该研究将被实施为CNTO148UCO1002的亚试验。
目的：
为了提供如所设计的PFS-U连同适当的训练和书面使用说明适用于儿科受治疗者或其护理者在家施用的支持性数据。为了提供展示PFS-U适用于儿科患者群体的支持性安全性数据。
序列描述：
实施注射的所有研究参与者将被要求完成关于其第二次在家施用之后使用PFS-U的经验的调查表。将采集和研究所有的装置投诉和装置-相关的AE，包括返回装置进行检测。
注：
研究和调查表被设计成用于采集和记载来自家庭环境中受治疗者和护理者施用的注射的现实PFS-U处理和使用体验数据，包括投诉和使用故障。
C-儿科总结性人员因素研究
研究：
儿科总结性人员因素(包括评估标签理解)
目的：
该研究的目的是提供关键的装置可用性数据，其指示VarioJect和PFS-U可在现实条件下预期群体中(通过护理者、健康护理专家[HCP]，或自我施用)安全使用并验证装置使用说明。
序列描述：
在人员因素专家所实施的代表性使用环境中目标群体中模拟的使用研究，如由FDA指南所指导：Applying Human Factors and Usability Engineering to MedicalDevices to Optimize Safety and Effectiveness in Design(2011)。在该研究中，将大约45名受治疗者将分为3个组。组1将为家庭护理者和HCP的混合(VarioJect注射)。组2将为能够自我-注射(VarioJect注射)的儿科受治疗者。组3将为能够自我-注射(PFS-U注射)的儿科受治疗者。当用户递送完全剂量而不造成可导致严重损害的任何使用错误时，实现了总体性能成功。所提出的研究按个体任务水平指定合格/失败标准，并且如错误、侥幸脱险和/或困难性之类的行为将以个体任务水平进行记录。主观参与者反馈将以叙事形式采集，并且参与者将被询问关于过程和装置设计的开放式问题。参与者将被询问调查问题来评价其知识和对IFU中提供的说明书的理解。
注：
方案连同使用说明已被提交给FDA进行查看和评论(eCTD IND 100181；序列号0307)。该提交包括迄今在这些研究如何提供产品设计和标签信息的形式研究和讨论中所见的使用错误汇总。人员因素研究的结果将与最终HFS报告一起汇总于sBLA中，并且旨在支持注册新的VarioJect并使PFS-U扩展用于儿科用途。
D-VarioJect性能测试
研究：
1.)验证测试
2.)功能稳定性测试
3.)装置部件的加速和实时老化
4.)组装过程验证
5.)模拟使用(安全性)研究
6.)生物相容性测试
7.)装运测试
8.)VarioJect递送后生化测试
目的：
这些研究的目的在于表明装置满足其设计要求。
序列描述：
1.验证测试根据以下进行。
·IS0 11608:2012用于医学用途的基于针的注射系统——要求和测试方法(IS011608:2012Needle-based injection systems for medical use-Requirements andtest methods)。VarioJect是设计的D2一体化单剂量非可替换容器，由此可递送体积的一部分排出。
·FDA准则草案喷式笔的技术考虑，以及旨在用于药物和生物制品的相关注射器(Technical Considerations for Pen,Jet,and Related Injectors Intended for Usewith Drugs and Biological Products)
开发和测试程序的要素包括：
·设计和验证在产品的整个储存期内所选和抽取的剂量满足精度标准
·设计和验证针伸出受限且适于皮下施用
·验证在预期用途中的设计和制造耐久性
·验证旨在可靠地免受意外针刺操作的装置安全性特征
2.功能稳定性测试评价药物-装置组合产品的老化，之后进行装置测试以确保装置功能性装配的产品储存于推荐的温度2-8℃，以及加速(25℃)条件下。
3.对于加速老化测试，装置子组件暴露于高温老化，之后与药物填充的PFS进行组装，并进行装置测试以确保装置功能性。加速老化数据由储存于室温的装置子组件的实时老化测试支持。
4.组装方法验证涉及使用用于组装VarioJect的设备来组装药物-装置组合产品以进行商业运行，之后进行装置测试。
5.模拟使用(安全性)研究将包括500+模拟注射，示出针安全性特性的成功操作，其根据ISO 23908:2011尖锐物伤害防止——要求和测试方法——单次使用的皮下注射针、取血样所用的导管和针的导引器的尖锐物保护特征，以及用于工业和FDA工作人员的指南：具有尖锐物伤害防止特征的医疗装置(ISO 23908:2011Sharps injury protection--Requirements and test methods–Sharpsprotection features for single-usehypodermic needles,introducers for catheters and needles used for bloodsampling and Guidance for Industry and FDA Staff:Medical Devices with SharpsInjury Prevention Features)。
6.生物相容性测试根据ISO-10993-1:2009医疗装置的生物评价——第1部分：风险管理过程之内的评价和测试(ISO-10993-1:2009Biological evaluation of medicaldevices--Part 1:Evaluation and testing within a risk management process)进行，以用于具有有限接触持续时间(≤24小时)的皮肤接触表面装置。
7.装运测试根据ASTM D4169：用于对装运容器和系统进行性能测试的标准操作(ASTM D4169:Standard Practice for Performance Testing of Shipping Containersand Systems)进行，并且包括评估容器闭合件完整性。
8.VarioJect递送后进行生化测试，以确定通过VarioJect递送期间所产生的SIMPONI上的剪切力是否对SIMPONI的生化属性有不利影响。
表9：体重<45的患有1型糖尿病的儿科受治疗者中研究CNTO148DML2001的剂量图 表
第二诱导剂量(第2周)和维持剂量(每4周一次)
关键
管理考虑
计划公开IND用于T1D
Sponsor计划于2016年第2季度公开IND来研究戈利木单抗对T1D的治疗。已在美国批准用于治疗类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎。
Sponsor具有以肺部、抗过敏和风湿病学产品划分(DPARP)或胃肠学和先天性缺陷产品划分(DGIEP)的以下活动性BLA。
BLA125289：对于2009年4月24日批准的戈利木单抗具有以下适应症：
·与甲氨蝶呤联合用于治疗患有中度至重度活动性类风湿性关节炎的成年患者。
·单独或与甲氨蝶呤联合用于治疗患有活动性银屑病关节炎的成年患者。
·用于治疗患有活动性强直性脊柱炎的成人患者。
·用于具有所示的皮质类固醇依赖性或不足以响应于或无法耐受口服氨基水杨酸盐、口服皮质类固醇、硫唑嘌呤、或6-巯嘌呤的患有中度至重度活动性溃疡性结肠炎的成人患者，以用于：
诱导和维持临床响应
诱导期间改善粘膜的内镜表现
诱导临床缓解
实现和维持诱导应答者的临床缓解
Sponsor在用DPARP或DGIEP支持戈利木单抗的开发方案中具有四种4活性IND
·IND 09925用于研究CNTO148(戈利木单抗)以治疗中度至重度活动性类风湿性关节炎(包括多关节JIA)
·IND 12723用于研究CNTO148(戈利木单抗)以治疗活动性银屑病关节炎
·IND 12729用于研究CNTO148(戈利木单抗)以治疗活动性强直性脊柱炎
·IND 100181用于研究CNTO148(戈利木单抗)以治疗溃疡性结肠炎(包括儿科UC)
如下表(表10)IND要求中所示，Sponsor提出提交项目给新IND或者交叉引用IND09925或BLA125289。这些将仅为文本的交叉引用(无电子超链接)。
表10：IND要求表
显而易见的是，本发明可以不同于前述说明书和实施例中具体描述的其它方式来实践。
根据上面的教导，可以作出本发明的多种修改形式和变型形式，并且这些修改形式和变型形式落入所附权利要求的范围内。
参考文献
Agarwal,A.和K.L.Brayman(2012)。“Update on islet cell transplantationfor type 1 diabetes.”Semin Intervent Radiol 29(2):90-98。
Argiles,J.M.,J.Lopez-Soriano和F.J.Lopez-Soriano(1994)。“Cytokines anddiabetes:the final step？Involvement of TNF-alpha in both type I and IIdiabetes mellitus.”Horm Metab Res 26(10):447-449。
Arif,S.,P.Cox,B.Afzali,G.Lombardi,R.I.Lechler,M.Peakman和V.Mirenda(2010)。“Anti-TNFalpha therapy--killing two birds with one stone？“Lancet 375(9733):2278。
Atkinson,M.A.,J.A.Bluestone,G.S.Eisenbarth,M.Hebrok,K.C.Herold,D.Accili,M.Pietropaolo,P.R.Arvan,M.Von Herrath,D.S.Markel和C.J.Rhodes(2011)。“How does type 1 diabetes develop？:the notion of homicide or beta-cellsuicide revisited.”Diabetes 60(5):1370-1379。
Blau,J.E.,M.R.Abegg,W.A.Flegel,X.Zhao,D.M.Harlan和K.I.Rother(2015)。“Long-term immunosuppression after solitary islet transplantation isassociated with preserved C-peptide secretion for more than a decade.”Am J Transplant 15(11):2995-3001。
Bluestone,J.A.,K.Herold和G.Eisenbarth(2010)。“Genetics,pathogenesisand clinical interventions in type 1 diabetes.”Nature 464(7293):1293-1300。
Bougneres,P.F.,J.C.Carel,L.Castano,C.Boitard,J.P.Gardin,P.Landais,J.Hors,M.J.Mihatsch,M.Paillard,J.L.Chaussain等人(1988)。“Factors associatedwith early remission of type I diabetes in children treated withcyclosporine.”N Engl J Med 318(11):663-670。
Bougneres,P.F.,P.Landais,C.Boisson,J.C.Carel,N.Frament,C.Boitard,J.L.Chaussain和J.F.Bach(1990)。“Limited duration of remission of insulindependency in children with recent overt type I diabetes treated with low-dose cyclosporin.”Diabetes 39(10):1264-1272。
Boulton,J.G.和J.T.Bourne(2007)。“Unstable diabetes in a patientreceiving anti-TNF-alpha for rheumatoid arthritis.”Rheumatology(Oxford)46(1):178-179。
Cavallo,M.G.,P.Pozzilli,C.Bird,M.Wadhwa,A.Meager,N.Visalli,A.J.Gearing,D.Andreani和R.Thorpe(1991)。“Cytokines in sera from insulin-dependent diabetic patients at diagnosis.”Clin Exp Immunol 86(2):256-259。
Chase,H.P.,N.Butler-Simon,S.Garg,M.McDuffie,S.L.Hoops和D.O'Brien(1990)。“A trial of nicotinamide in newly diagnosed patients with type 1(insulin-dependent)diabetes mellitus.”Diabetologia 33(7):444-446。
Cook,J.J.,I.Hudson,L.C.Harrison,B.Dean,P.G.Colman,G.A.Werther,G.L.Warne和J.M.Court(1989)。“Double-blind controlled trial of azathioprine inchildren with newly diagnosed type I diabetes.”Diabetes 38(6):779-783。
Daneman,D.(2006).“Type 1 diabetes.”Lancet 367(9513):847-858。
Dunger,A.,D.Schroder,P.Augstein,T.Witstruck,G.Wachlin,L.Vogt,B.Ziegler和S.Schmidt(1995)。“Impact of metabolic activity of beta cells oncytokine-induced damage and recovery of rat pancreatic islets.”ActaDiabetol32(4):217-224。
Eisenbarth,G.S.(2004).“Type 1 diabetes:molecular,cellular andclinical immunology.”Adv Exp Med Biol 552:306-310。
Gitelman,S.E.,P.A.Gottlieb,M.R.Rigby,E.I.Felner,S.M.Willi,L.K.Fisher,A.Moran,M.Gottschalk,W.V.Moore,A.Pinckney,L.Keyes-Elstein,S.Aggarwal,D.Phippard,P.H.Sayre,L.Ding,J.A.Bluestone,M.R.Ehlers和S.S.Team(2013)。“Antithymocyte globulin treatment for patients with recent-onset type 1diabetes:12-month results of a randomised,placebo-controlled,phase 2trial.”Lancet Diabetes Endocrinol 1(4):306-316。
Gitelman,S.E.,P.A.Gottlieb,M.R.Rigby,E.I.Felner,S.M.Willi,L.K.Fisher,A.Moran,M.Gottschalk,W.V.Moore,A.Pinckney,L.Keyes-Elstein,S.Aggarwal,D.Phippard,P.H.Sayre,L.Ding,J.A.Bluestone,M.R.Ehlers和t.S.S.Team(2013)。“Antithymocyte globulin therapy for patients with recent-onset type 1diabetes:a randomized double-blind phase 2trial.”The Lancet Diabetes and Endocrinology出版中。
Glandt,M.和K.C.Herold(2004)。“Treatment of type 1 diabetes with anti-T-cell agents:from T-cell depletion to T-cell regulation.”Curr Diab Rep 4(4):291-297。
Gottlieb,P.A.,S.Quinlan,H.Krause-Steinrauf,C.J.Greenbaum,D.M.Wilson,H.Rodriguez,D.A.Schatz,A.M.Moran,J.M.Lachin,J.S.Skyler和M.M.F.D.Z.B.S.G.Type1 Diabetes TrialNet(2010)。“Failure to preserve beta-cell function withmycophenolate mofetil and daclizumab combined therapy in patients with new-onset type 1 diabetes.”Diabetes Care 33(4):826-832。
Han,S.,W.Donelan,H.Wang,W.Reeves和L.J.Yang(2013)。“Novel autoantigensin type 1 diabetes.”Am J Transl Res 5(4):379-392。
Harrison,L.C.,P.G.Colman,B.Dean,R.Baxter和F.I.Martin(1985)。“Increasein remission rate in newly diagnosed type I diabetic subjects treated withazathioprine.”Diabetes 34(12):1306-1308。
Herold,K.C.,S.Gitelman,C.Greenbaum,J.Puck,W.Hagopian,P.Gottlieb,P.Sayre,P.Bianchine,E.Wong,V.Seyfert-Margolis,K.Bourcier,J.A.Bluestone和I.T.N.A.I.S.G.Immune Tolerance Network(2009)。“Treatment of patients with newonset Type 1diabetes with a single course of anti-CD3mAb Teplizumab preservesinsulin production for up to 5years.”Clin Immunol 132(2):166-173。
JDRF.(2013).“Type 1 diabetes facts；http://jdrf.org/about-jdrf/fact-sheets/type-1-diabetes-facts/.”2013。
Kawahara,D.J.和J.S.Kenney(1991)。“Species differences in human and ratislet sensitivity to human cytokines.Monoclonal anti-interleukin-1(IL-1)influences on direct and indirect IL-1-mediated islet effects.”Cytokine 3(2):117-124。
Kleijwegt,F.S.,S.Laban,G.Duinkerken,A.M.Joosten,A.Zaldumbide,T.Nikolic和B.O.Roep(2010)。“Critical role for TNF in the induction of humanantigen-specific regulatory T cells by tolerogenic dendritic cells.”J Immunol185(3):1412-1418。
Kodama,S.,M.Davis和D.L.Faustman(2005)。“The therapeutic potential oftumor necrosis factor for autoimmune disease:a mechanistically basedhypothesis.”Cell Mol Life Sci 62(16):1850-1862。
Koulmanda,M.,M.Bhasin,Z.Awdeh,A.Qipo,Z.Fan,D.Hanidziar,P.Putheti,H.Shi,E.Csizuadia,T.A.Libermann和T.B.Strom(2012)。“The role of TNF-alpha inmice with type 1-and 2-diabetes.”PLoS One 7(5):e33254。
Ludvigsson,J.,U.Samuelsson,C.Johansson和L.Stenhammar(2001)。“Treatmentwith antioxidants at onset of type 1 diabetes in children:a randomized,double-blind placebo-controlled study.”Diabetes Metab Res Rev 17(2):131-136。
Maahs,D.M.,N.A.West,J.M.Lawrence和E.J.Mayer-Davis(2010)。“Epidemiologyof type 1 diabetes.”Endocrinol Metab Clin North Am 39(3):481-497。
Mandrup-Poulsen,T.,K.Bendtzen,C.A.Dinarello和J.Nerup(1987)。“Humantumor necrosis factor potentiates human interleukin 1-mediated rat pancreaticbeta-cell cytotoxicity.”J Immunol 139(12):4077-4082。
Mastrandrea,L.,J.Yu,T.Behrens,J.Buchlis,C.Albini,S.Fourtner和T.Quattrin(2009)。“Etanercept treatment in children with new-onset type 1diabetes:pilot randomized,placebo-controlled,double-blind study.”Diabetes Care 32(7):1244-1249。
Molbak,A.G.,B.Christau,B.Marner,K.Borch-Johnsen和J.Nerup(1994)。“Incidence of insulin-dependent diabetes mellitus in age groups over 30yearsin Denmark.”Diabet Med 11(7):650-655。
Moran,A.,B.Bundy,D.J.Becker,L.A.DiMeglio,S.E.Gitelman,R.Goland,C.J.Greenbaum,K.C.Herold,J.B.Marks,P.Raskin,S.Sanda,D.Schatz,D.K.Wherrett,D.M.Wilson,J.P.Krischer,J.S.Skyler,G.Type 1 Diabetes TrialNet CanakinumabStudy,L.Pickersgill,E.de Koning,A.G.Ziegler,B.Boehm,K.Badenhoop,N.Schloot,J.F.Bak,P.Pozzilli,D.Mauricio,M.Y.Donath,L.Castano,A.Wagner,H.H.Lervang,H.Perrild,T.Mandrup-Poulsen,A.S.Group,F.Pociot和C.A.Dinarello(2013)。“Interleukin-1 antagonism in type 1 diabetes of recent onset:two multicentre,randomised,double-blind,placebo-controlled trials.”Lancet 381(9881):1905-1915。
Mordes,J.P.,R.Bortell,J.Doukas,M.Rigby,B.Whalen,D.Zipris,D.L.Greiner和A.A.Rossini(1996)。“The BB/Wor rat and the balance hypothesis ofautoimmunity.”Diabetes Metab Rev 12(2):103-109。
Orban,T.,B.Bundy,D.J.Becker,L.A.Dimeglio,S.E.Gitelman,R.Goland,P.A.Gottlieb,C.J.Greenbaum,J.B.Marks,R.Monzavi,A.Moran,M.Peakman,P.Raskin,W.E.Russell,D.Schatz,D.K.Wherrett,D.M.Wilson,J.P.Krischer,J.S.Skyler和G.Type1 Diabetes TrialNet Abatacept Study(2014)。“Costimulation modulation withabatacept in patients with recent-onset type 1 diabetes:follow-up 1 yearafter cessation of treatment.”Diabetes Care 37(4):1069-1075。
Orban,T.,B.Bundy,D.J.Becker,L.A.DiMeglio,S.E.Gitelman,R.Goland,P.A.Gottlieb,C.J.Greenbaum,J.B.Marks,R.Monzavi,A.Moran,P.Raskin,H.Rodriguez,W.E.Russell,D.Schatz,D.Wherrett,D.M.Wilson,J.P.Krischer,J.S.Skyler和G.Type 1Diabetes TrialNet Abatacept Study(2011)。“Co-stimulation modulation withabatacept in patients with recent-onset type 1 diabetes:a randomised,double-blind,placebo-controlled trial.”Lancet 378(9789):412-419。
Pescovitz,M.D.,C.J.Greenbaum,H.Krause-Steinrauf,D.J.Becker,S.E.Gitelman,R.Goland,P.A.Gottlieb,J.B.Marks,P.F.McGee,A.M.Moran,P.Raskin,H.Rodriguez,D.A.Schatz,D.Wherrett,D.M.Wilson,J.M.Lachin,J.S.Skyler和C.D.S.G.Type 1 Diabetes TrialNet Anti(2009)。“Rituximab,B-lymphocytedepletion,and preservation of beta-cell function.”N Engl J Med 361(22):2143-2152。
Rabinovitch,A.(1998).“An update on cytokines in the pathogenesis ofinsulin-dependent diabetes mellitus.”Diabetes Metab Rev 14(2):129-151。
Rigby,M.R.,K.M.Harris,A.Pinckney,L.A.DiMeglio,M.S.Rendell,E.I.Felner,J.M.Dostou,S.E.Gitelman,K.J.Griffin,E.Tsalikian,P.A.Gottlieb,C.J.Greenbaum,N.A.Sherry,W.V.Moore,R.Monzavi,S.M.Willi,P.Raskin,L.Keyes-Elstein,S.A.Long,S.Kanaparthi,N.Lim,D.Phippard,C.L.Soppe,M.L.Fitzgibbon,J.McNamara,G.T.Nepom和M.R.Ehlers(2015)。“Alefacept provides sustained clinical and immunologicaleffects in new-onset type 1 diabetes patients.”J Clin Invest 125(8):3285-3296。
Sherry,N.,W.Hagopian,J.Ludvigsson,S.M.Jain,J.Wahlen,R.J.Ferry,Jr.,B.Bode,S.Aronoff,C.Holland,D.Carlin,K.L.King,R.L.Wilder,S.Pillemer,E.Bonvini,S.Johnson,K.E.Stein,S.Koenig,K.C.Herold,A.G.Daifotis和I.Protege Trial(2011)。“Teplizumab for treatment of type 1 diabetes(Protege study):1-year resultsfrom a randomised,placebo-controlled trial.”Lancet 378(9790):487-497。
Stanescu,D.E.,K.Lord和T.H.Lipman(2012)。“The epidemiology of type 1diabetes in children.”Endocrinol Metab Clin North Am 41(4):679-694。
Tolerx,G.a.(2011).“GlaxoSmithKline and Tolerx announce phase IIIDEFEND-1study of otelixizumab in type 1 diabetes did not meet its primaryendpoint.”2011年3月11日检索。
van Belle,T.L.,K.T.Coppieters和M.G.von Herrath(2011)。“Type 1diabetes:etiology,immunology,and therapeutic strategies.”Physiol Rev 91(1):79-118。
van Eijk,I.C.,M.J.Peters,M.T.Nurmohamed,A.W.van Deutekom,B.A.Dijkmans和S.Simsek(2007)。“Decrease of fructosamine levels during treatment withadalimumab in patients with both diabetes and rheumatoid arthritis.”Eur J Endocrinol 156(3):291-293。
Yazdani-Biuki,B.,H.Stelzl,H.P.Brezinschek,J.Hermann,T.Mueller,P.Krippl,W.Graninger和T.C.Wascher(2004)。“Improvement of insulin sensitivityin insulin resistant subjects during prolonged treatment with the anti-TNF-alpha antibody infliximab.”Eur J Clin Invest 34(9):641-642。

Claims (15)

1.1-101.(取消)
(新)用于治疗或预防I型糖尿病的至少一种分离的哺乳动物抗TNF抗体，所述哺乳动物抗TNF抗体具有包含SEQ ID NO:36的重链(HC)和包含SEQ ID NO:37的轻链(LC)。
2.(新)一种用于治疗或预防TNF相关的病症的方法，其中所述TNF相关的病症为1型糖尿病，所述方法包括：
(a)向受治疗者施用分离的哺乳动物抗TNF抗体，所述哺乳动物抗TNF抗体具有包含SEQID NO:36的重链(HC)和包含SEQ ID NO:37的轻链(LC)。
3.(新)根据权利要求103所述的方法，其中当所述受治疗者重量<45kg时，将所述抗TNF抗体在第0周和第2周以60mg/m2的诱导剂量皮下(SC)施用于所述受治疗者，之后在第4周以30mg/m2的维持剂量施用并且每2周施用一次直至第52周，并且当所述受治疗者重量≥45kg时，在第0周和第2周以100mg/m2的诱导剂量施用于所述受治疗者，之后在第4周以50mg/m2的维持剂量施用并且每2周施用一次直至第52周。
4.(新)根据权利要求104所述的方法，其中用适于自身施用的医疗装置施用所述抗TNF抗体，并且所述装置选自：载药注射器、带有UltraSafe Passive针套的载药注射器、VarioJect、以及VarioJect和带有UltraSafe Passive针套的载药注射器的组合。
5.(新)根据权利要求105所述的医疗装置，其中如果所述受治疗者重量≥45kg，则所述装置为带有UltraSafe Passive针套的载药注射器，并且如果所述受治疗者重量<45kg，则所述装置为VarioJect。
6.(新)根据权利要求105所述的医疗装置，其中所述装置是针长度为4.5mm的VarioJect。
7.(新)一种用于治疗或预防I型糖尿病的组合物，所述组合物包含至少一种分离的哺乳动物抗TNF抗体以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂，所述哺乳动物抗TNF抗体具有包含SEQ ID NO:36的重链(HC)和包含SEQ ID NO:37的轻链(LC)。
8.(新)一种用于治疗或预防TNF相关的病症的方法，其中所述TNF相关的病症为1型糖尿病，所述方法包括：
(a)向受治疗者施用包含分离的哺乳动物抗TNF抗体的组合物，所述哺乳动物抗TNF抗体具有包含SEQ ID NO:36的重链(HC)和包含SEQ ID NO:37的轻链(LC)。
9.(新)根据权利要求109所述的方法，其中将所述组合物皮下(SC)施用于所述受治疗者，使得当所述受治疗者重量<45kg时，将所述抗TNF抗体在第0周和第2周以60mg/m2的诱导剂量施用，之后在第4周以30mg/m2的维持剂量施用并且每2周施用一次直至第52周，并且当所述受治疗者重量≥45kg时，在第0周和第2周以100mg/m2的诱导剂量施用于所述受治疗者，之后在第4周以50mg/m2的维持剂量施用并且每2周施用一次直至第52周。
10.(新)根据权利要求110所述的方法，其中用适于自身施用的医疗装置施用所述组合物，并且所述装置选自：载药注射器、带有UltraSafe Passive针套的载药注射器、VarioJect、以及VarioJect和带有UltraSafe Passive针套的载药注射器的组合。
11.(新)根据权利要求111所述的医疗装置，其中如果所述受治疗者重量≥45kg，则所述装置为带有UltraSafe Passive针套的载药注射器，并且如果所述受治疗者重量<45kg，则所述装置为VarioJect。
12.(新)根据权利要求111所述的医疗装置，其中所述装置是针长度为4.5mm的VarioJect。
13.(新)一种用于治疗或预防I型糖尿病的医疗装置，所述医疗装置包含至少一种分离的哺乳动物抗TNF抗体，所述哺乳动物抗TNF抗体具有包含SEQ ID NO:36的重链(HC)和包含SEQ ID NO:37的轻链(LC)，其中所述装置适用于皮下(SC)施用所述至少一种抗TNF抗体。
14.(新)根据权利要求114所述的医疗装置，其中所述装置适用于自身施用，并且所述装置选自：载药注射器、带有UltraSafe Passive针套的载药注射器、以及VarioJect。
15.(新)根据权利要求115所述的医疗装置，其中所述装置是针长度为4.5mm的VarioJect。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021164717A1 (zh) * 2020-02-20 2021-08-26 百奥泰生物制药股份有限公司 抗TNF-α的抗体制剂及其制备方法和用途
CN113574066A (zh) * 2019-01-15 2021-10-29 詹森生物科技公司 用于治疗幼年特发性关节炎的抗tnf抗体组合物和方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220153830A1 (en) * 2019-03-14 2022-05-19 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing Methods for Producing Anti-TNF Antibody Compositions
BR112021022682A2 (pt) 2019-05-14 2022-02-22 Provention Bio Inc Métodos e composições para prevenir diabetes do tipo 1
AU2020279987A1 (en) 2019-05-23 2021-11-18 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha
WO2021028752A1 (en) * 2019-08-15 2021-02-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tfn antibodies for treating type i diabetes
CN114828890A (zh) * 2019-10-18 2022-07-29 比奥兹普科德公司 使用了干细胞迁移剂的糖尿病治疗
EP4035679A1 (en) * 2019-10-18 2022-08-03 Biozipcode, Inc. Diabetes therapy targeting abnormal stem cells
EP4153220A1 (en) * 2020-05-21 2023-03-29 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to il-23 and tnf alpha
DE102020129648A1 (de) * 2020-11-10 2022-05-12 Leopold MTX GmbH Pharmazeutische zusammensetzung
WO2022171685A1 (en) * 2021-02-10 2022-08-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Tnf-alpha blocking agent for preventing, suppressing and/or delaying the onset of type 1 diabetes
AU2022225981A1 (en) * 2021-02-26 2023-10-12 BioZipcode, Inc. Novel method and agent for treating, diagnosing and detecting diabetes and complications

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101248087A (zh) * 2005-05-18 2008-08-20 埃博灵克斯股份有限公司 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM
US20090214528A1 (en) * 2005-08-31 2009-08-27 Haimanti Dorai Host cell lines for production of antibody constant region with enhanced effector function
WO2011017294A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-10 Schering Corporation Human anti-rankl antibodies
CN102755646A (zh) * 2002-07-19 2012-10-31 艾博特生物技术有限公司 TNF α相关疾病的治疗
CN103228142A (zh) * 2010-09-28 2013-07-31 加利福尼亚大学董事会 治疗代谢综合征相关疾病的gaba激动剂和治疗或预防i型糖尿病的gaba组合
CN105121460A (zh) * 2013-03-06 2015-12-02 波塔力克斯有限公司 表达TNFα多肽抑制的植物细胞在治疗中的用途

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5700466A (en) 1981-09-08 1997-12-23 The Rockefeller University Method of ameliorating or preventing septic shock using a monoclonal antibody specific to cachectin/tumor necrosis factor
US6309640B1 (en) 1981-09-08 2001-10-30 The Rockefeller University Lipoprotein lipase suppression by endotoxin-induced mediator (shock assay)
US6419927B1 (en) 1981-09-08 2002-07-16 Anthony Cerami Method for reducing adverse effects of a human 70kDa mediator which results from endotoxin stimulation of macrophages
US4822776A (en) 1981-09-08 1989-04-18 The Rockefeller University Lipoprotein lipase suppression by endotoxin-induced mediator (shock assay)
US4603106A (en) 1982-02-22 1986-07-29 The Rockefeller University Lipoprotein lipase suppression by endotoxin-induced mediator (shock assay)
WO1983000930A1 (en) 1981-09-08 1983-03-17 Univ Rockefeller Lipoprotein lipase suppression by endotoxin-induce mediator (shock assay)
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
JPS61100158A (ja) 1984-10-22 1986-05-19 Fukuarare Honpo:Kk 納豆付米菓の製造方法およびその製品
EP0212489B1 (en) 1985-08-16 1994-11-30 The Rockefeller University Anabolic activity modulator and uses thereof
US4870163A (en) 1985-08-29 1989-09-26 New York Blood Center, Inc. Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
EP0288088B1 (en) 1987-04-24 1994-03-09 Teijin Limited Detection of tumor necrosis factor; monoclonal antibody and kit
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
IL83878A (en) 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
IL98078A0 (en) 1991-05-07 1992-06-21 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising an anticytokyne
GB8805792D0 (en) 1988-03-11 1988-04-13 Celltech Ltd Medicaments
DE3823804A1 (de) 1988-07-14 1990-01-18 Basf Ag Neutralisation der in vitro und in vivo toxischen eigenschaften von tnf-(alpha) durch monoklonale antikoerper und den davon abgeleiteten fragmenten
AU626572B2 (en) 1988-07-18 1992-08-06 Chiron Corporation Monoclonal antibodies reactive with cachectin
IL94039A (en) 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
JPH02227095A (ja) 1988-10-24 1990-09-10 Otsuka Pharmaceut Co Ltd モノクローナル抗体
US5360716A (en) 1988-10-24 1994-11-01 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Human tumor necrosis factor αspecific monoclonal antibody and method for detecting human tumor necrosis factor α
US5223395A (en) 1988-12-01 1993-06-29 Centocor, Inc. Immunometric assays for tumor necrosis factor-alpha and methods for preventing the loss of biological activity of tumor necrosis factor-alpha in biological samples
US5342613A (en) 1988-12-27 1994-08-30 Health Research Inc. Pharmaceutical compositions and use thereof in the treatment of psoriasis
PT92900A (pt) 1989-01-24 1990-07-31 Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos
US4936843A (en) 1989-02-16 1990-06-26 Ace Orthopedic Manufacturing Kirschner wire clamp and tensioner
EP0393438B1 (de) 1989-04-21 2005-02-16 Amgen Inc. TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
ATE119942T1 (de) 1989-05-18 1995-04-15 Yeda Res & Dev Tumor-nekrosefaktor-bindungsprotein ii, seine reinigung und spezifische antikörper.
JP3443119B2 (ja) 1989-08-07 2003-09-02 ペプテック リミテッド 腫瘍壊死因子結合リガンド
US5959087A (en) 1989-08-07 1999-09-28 Peptide Technology, Ltd. Tumour necrosis factor binding ligands
GB8921123D0 (en) 1989-09-19 1989-11-08 Millar Ann B Treatment of ards
ATE128184T1 (de) 1989-12-13 1995-10-15 Yeda Res & Dev Expression des rekombinanten tumor-nekrosisfaktor-bindungsproteins i (tbp-i).
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE4037604A1 (de) 1990-04-25 1991-10-31 Bayer Ag Verwendung von anti-tnf-antikoerpern als arzneimittel bei der behandlung von ischaemien und deren folgen
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015908D0 (en) 1990-07-19 1990-09-05 Celltech Ltd Multivalent immunoglobulin
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
US5958413A (en) 1990-11-01 1999-09-28 Celltech Limited Use of antibodies to TNF or fragments derived thereof and xanthine derivatives for combination therapy and compositions therefor
GB9109645D0 (en) 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
GB9028123D0 (en) 1990-12-28 1991-02-13 Erba Carlo Spa Monoclonal antibodies against human tumor necrosis factor alpha
RU2166955C2 (ru) 1991-01-18 2001-05-20 Эмген Инк. Способ лечения и профилактики заболеваний, обусловленных повышением уровня фактора, вызывающего некроз опухолевых клеток
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
DK1097945T3 (da) 1991-03-18 2007-11-05 Univ New York Monoklonale og kimære antistoffer, der er specifikke for human tumornekrosefaktor
US7192584B2 (en) 1991-03-18 2007-03-20 Centocor, Inc. Methods of treating psoriasis with anti-TNF antibodies
US5656272A (en) 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
US5698195A (en) 1991-03-18 1997-12-16 New York University Medical Center Methods of treating rheumatoid arthritis using chimeric anti-TNF antibodies
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
DE69233628T2 (de) 1991-07-25 2007-04-26 Biogen Idec Inc., San Diego Rekombinante Antikörper zur humanen Therapie
EP0525570A3 (en) 1991-07-31 1993-10-06 Miles Inc. Anti-idiotypic antibodies that mimic tnf
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
NO178839C (no) 1991-11-25 1996-06-12 Ottestad Nils T Strömningsregulator for opprettholdelse av en stabil strömningsmengde av et fluidum
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
ATE172880T1 (de) 1992-08-28 1998-11-15 Bayer Ag Verwendung von monoklonalen anti-tnf-antikörpern für die behandlung von bakteriellen meningitiden
CA2146647C (en) 1992-10-08 2009-05-05 Marc Feldmann Treatment of autoimmune and inflammatory disorders
CA2147180A1 (en) 1992-10-15 1994-04-28 Gokhan S. Hotamisligil Treatment of insulin resistance in obesity linked type ii diabetes using antagonists to tnf-.alpha. function
GB9225448D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Erba Carlo Spa Improved synthesis of polymer bioactive conjugates
US5888511A (en) 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
PT614984E (pt) 1993-03-05 2001-12-28 Bayer Ag Anticorpos humanos anti-tnf
SE9302490D0 (sv) 1993-07-26 1993-07-26 Kabi Pharmacia Ab New use of old drugs
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
GB9403909D0 (en) 1994-03-01 1994-04-20 Erba Carlo Spa Ureido derivatives of naphthalenephosphonic acids and process for their preparation
US6190691B1 (en) 1994-04-12 2001-02-20 Adolor Corporation Methods for treating inflammatory conditions
FR2728793A1 (fr) 1994-12-28 1996-07-05 Oreal Utilisation d'un antagoniste d'histamine, d'un antagoniste d'interleukine 1 et/ou d'un antagoniste de tnf-alpha dans une composition cosmetique, pharmaceutique ou dermatologique et composition obtenue
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
BRPI9715219B8 (pt) 1996-02-09 2015-07-07 Abbvie Biotechnology Ltd Vetor recombinante de expressão, e célula hospedeira procariótica.
GB9702088D0 (en) 1997-01-31 1997-03-19 Pharmacia & Upjohn Spa Matrix metalloproteinase inhibitors
JPH11127855A (ja) 1997-10-27 1999-05-18 Japan Energy Corp 組換え型抗ヒトＴＮＦ−αヒトモノクローナル抗体
UA81743C2 (uk) 2000-08-07 2008-02-11 Центокор, Инк. МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЩО СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ФАКТОРОМ НЕКРОЗУ ПУХЛИН АЛЬФА (ФНПα), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РЕВМАТОЇДНОГО АРТРИТУ
TWI327597B (en) 2001-08-01 2010-07-21 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
WO2003083061A2 (en) 2002-03-26 2003-10-09 Centocor, Inc. Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
TW201705980A (zh) * 2004-04-09 2017-02-16 艾伯維生物技術有限責任公司 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102755646A (zh) * 2002-07-19 2012-10-31 艾博特生物技术有限公司 TNF α相关疾病的治疗
CN101248087A (zh) * 2005-05-18 2008-08-20 埃博灵克斯股份有限公司 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM
US20090214528A1 (en) * 2005-08-31 2009-08-27 Haimanti Dorai Host cell lines for production of antibody constant region with enhanced effector function
WO2011017294A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-10 Schering Corporation Human anti-rankl antibodies
CN103228142A (zh) * 2010-09-28 2013-07-31 加利福尼亚大学董事会 治疗代谢综合征相关疾病的gaba激动剂和治疗或预防i型糖尿病的gaba组合
CN105121460A (zh) * 2013-03-06 2015-12-02 波塔力克斯有限公司 表达TNFα多肽抑制的植物细胞在治疗中的用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LUCY MASTRANDREA等: "Etanercept Treatment in Children With New-Onset Type 1 Diabetes", 《DIABETES CARE》 *
TERESA QUATTRIN等: "Golimumab and Beta-Cell Function in Youth with New-Onset Type 1 Diabetes", 《N ENGL J MED》 *
卢世平等: "1型糖尿病疫苗临床研究进展", 《中国药科大学学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113574066A (zh) * 2019-01-15 2021-10-29 詹森生物科技公司 用于治疗幼年特发性关节炎的抗tnf抗体组合物和方法
WO2021164717A1 (zh) * 2020-02-20 2021-08-26 百奥泰生物制药股份有限公司 抗TNF-α的抗体制剂及其制备方法和用途

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