KR20180105711A - 항-tnf 항체, 조성물, 제1형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제I형 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 서열 번호 36을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 (LC)를 갖는 항-TNF 항체를 이용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

항-TNF 항체, 조성물, 제1형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 용도

본 발명은 제I형 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 서열 번호 36을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 (LC)를 갖는 항-TNF 항체를 이용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

TNF 알파는 17 kD 단백질 서브유닛의 가용성 동종삼량체이다. TNF의 막-결합 26 kD 전구체 형태 또한 존재한다.

단핵구 또는 대식세포 이외의 세포 또한 TNF 알파를 생성한다. 예를 들어, 인간 비-단핵구성 종양 세포주는 TNF 알파 및 CD4+ 및 CD8+ 말초 혈액 T 림프구를 생성하고 일부 배양된 T 및 B 세포주가 또한 TNF 알파를 생성한다.

TNF 알파는 전-염증성 작용을 야기하며, 이는 조직 손상, 예를 들어 연골 및 골의 분해, 부착 분자의 유도, 혈관 내피 세포 상의 응혈원 활성의 유도, 호중구 및 림프구의 부착의 증가, 및 대식세포, 호중구, 및 혈관 내피 세포로부터의 혈소판 활성화 인자의 방출의 자극을 유발한다.

TNF 알파는 감염, 면역 장애, 신생물 병리, 자가면역 병리, 및 이식편-대-숙주 병리와 연계되어 왔다. 암 및 감염성 병리와 TNF 알파의 연계는 종종 숙주의 이화 상태에 관련된다. 암 환자는 통상적으로 거식증과 연계된 체중 감소를 겪는다.

암 및 다른 질환과 연계된 심한 소모는 "악액질"로서 공지되어 있다. 악액질은 악성 성장에 반응하는 점진적 체중 감소, 거식증, 및 제지방 체중의 지속적 잠식을 포함한다. 악액질 상태는 많은 암 이환율 및 사망률을 야기한다. TNF 알파가 암, 감염성 병리, 및 다른 이화 상태에서의 악액질에 관여한다는 증거가 존재한다.

TNF 알파는 발열, 병감, 거식증, 및 악액질을 포함하는 그램-음성 패혈증 및 내독소 쇼크에서 중심적 역할을 담당하는 것으로 생각된다. 내독소는 단핵구/대식세포 생성 및 TNF 알파 및 다른 사이토카인의 분비를 강력하게 활성화한다. TNF 알파 및 다른 단핵구-유래 사이토카인은 내독소에 대한 대사작용성 반응 및 신경호르몬 반응을 매개한다. 인간 지원자에 대한 내독소 투여는 발열, 심계항진, 증가된 대사율 및 스트레스 호르몬 방출을 포함하는 감기-유사 증상을 동반하는 급성 질병을 생성한다. 그램-음성 패혈증을 겪는 환자에서는 순환 TNF 알파가 증가한다.

따라서, TNF 알파는 염증성 질환, 자가면역 질환, 바이러스, 박테리아, 및 기생충 감염, 악성종양, 및/또는 신경퇴행성 질환에 연루되어 왔으며, 류머티스 관절염 및 크론병과 같은 질환에서 특이적 생물학적 요법을 위한 유용한 표적이다. TNF 알파 (cA2)에 대한 키메라 단클론 항체를 이용하는 개방-라벨 시험에서 염증의 억제 및 류머티스 관절염 및 크론병의 재발 후의 성공적인 재치료와 관련된 유익한 효과가 보고되었다. cA2를 이용하는 무작위 배정 이중-맹검 위약-대조 시험에서의 유익한 결과 또한 류머티스 관절염에서 염증의 억제와 함께 보고되었다.

다른 연구자들은 시험관내에서 중화 활성을 가진 재조합 인간 TNF에 대해 특이적인 mAb를 기재하였다. 인간 TNF의 에피토프를 맵핑하고 효소 면역검정을 개발하기 위해, 그리고 재조합 TNF의 정제를 지원하기 위해, 이들 mAb 중 일부를 사용하였다. 그러나 이들 연구는, 면역원성, 낮은 특이성 및/또는 약학적 부적합성으로 인해, 인간에서의 생체내 진단 또는 치료 용도로 사용할 수 있는 TNF 중화 항체의 생성을 위한 기반을 제공하지 않는다.

TNF에 대한 중화 항혈청 또는 mAb는 사람 이외의 포유류에서 실험적 내독소혈증 및 균혈증에서 유해한 생리학적 변화를 폐지하고 치명적 공격 후에 사망을 예방하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 설치류 치사 검정 및 영장류 병리 모델 시스템에서 이 효과가 입증되었다.

hTNF의 추정상 수용체 결합 로커스가 개시되었고, TNF의 아미노산 11 내지 13, 37 내지 42, 49 내지 57, 및 155 내지 157로 이루어진 TNF 알파의 수용체 결합 로커스가 개시되었다.

비-인간 포유류, 키메라, 다클론 (예를 들어, 항-혈청) 및/또는 단클론 항체 (Mab) 및 단편 (예를 들어, 단백질 가수분해 또는 그의 융합 단백질 산물)은 소정의 질환을 치료하고자 시도하기 위해 일부 경우에 연구되고 있는 잠재적 치료제이다. 그러나, 이러한 항체 또는 단편은 인간에게 투여될 경우에 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 면역 반응은 혈액 순환으로부터 항체 또는 단편의 면역 복합체-매개 제거를 유발할 수 있으며, 반복 투여가 요법에 부적합하게 함으로써, 환자에 대한 치료 이익을 감소시키고 항체 또는 단편의 재투여를 제한한다. 예를 들어, 비-인간 부분을 포함하는 항체 또는 단편의 반복 투여는 혈청병 및/또는 아나필락시스로 이어질 수 있다. 이들 문제 및 다른 문제를 피하기 위해, 당업계에 잘 공지된 바와 같이, 키메라화 및 인간화를 포함하는, 이러한 항체 및 그의 부분의 면역원성을 감소시키는 다수의 접근법이 채택되었다. 그러나 이들 접근법 및 다른 접근법은 여전히 일부 면역원성, 낮은 친화도, 낮은 결합력(avidity)을 갖거나, 세포 배양, 규모 확대, 생산, 및/또는 낮은 수율에 문제가 있는 항체 또는 단편을 유발할 수 있다. 따라서, 이러한 항체 또는 단편은 치료 단백질로서의 제조 또는 사용에 이상적으로 적합하지 못할 수 있다.

따라서, 이들 문제 중 하나 이상을 극복하는 항-TNF 항체 또는 단편의 제공 뿐만 아니라, 공지된 항체 또는 그의 단편에 대한 개선이 필요하다.

본 발명은, 본 명세서에 기재되고 가능하게 된 바와 같이 당업계에 공지된 것과 조합한, 서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역 전부를 포함하는 단리된 인간, 영장류, 설치류, 포유류, 키메라, 인간화, 및/또는 CDR-이식 항-TNF 항체, 면역글로불린, 그의 절단 산물 및 다른 특정 부분 및 변이체 뿐만 아니라 항-TNF 알파 항체 조성물, 코딩 핵산 또는 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 제형, 장치, 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물, 및 그의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 명세서에 기재된 바와 같이 서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역 전부를 포함하는 하나 이상의 단리된 항-TNF 항체를 제공한다. 본 발명에 따른 항체는, 서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역 전부를 포함하는 본 발명의 항체 내에 도입될 수 있는, 면역글로불린 분자의 적어도 일부, 예를 들어 (이에 한정되지 않음) 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 그의 임의의 부분을 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 항체는 임의의 포유동물, 예를 들어 (이에 한정되지 않음) 인간, 생쥐, 토끼, 쥐, 설치류, 영장류 또는 그의 임의의 조합 등을 포함하거나 그로부터 유래할 수 있다.

본 발명은 일 태양에서, 하나 이상의 특정 서열, 도메인, 그의 부분 또는 변이체를 포함하는, 특이적 항-TNF 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이 폴리뉴클레오티드에 상보적이거나, 이 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 항-TNF 항체 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 핵산 및/또는 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포 뿐만 아니라 이러한 항체 핵산, 벡터, 및/또는 숙주 세포의 제조 및/또는 사용 방법을 제공한다.

본 발명의 하나 이상의 항체는 하나 이상의 TNF 단백질, 서브유닛, 단편, 부분, 또는 이들의 임의의 조합에 특이적인 하나 이상의 특정 에피토프에 결합한다. 적어도 하나의 에피토프는 상기 단백질의 적어도 하나의 일부를 포함하는 적어도 하나의 항체 결합 영역을 포함할 수 있고, 상기 에피토프는 바람직하게는 그의 적어도 하나의 일부, 예를 들어 상기 단백질의 적어도 하나의 기능성, 세포외, 가용성, 친수성, 외부 또는 세포질 도메인 또는 그의 임의의 일부 (이에 한정되지 않음)의 적어도 1-5개의 아미노산으로 이루어진다.

하나 이상의 항체는 선택적으로 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3) 및/또는 하나 이상의 불변 또는 가변 프레임워크 영역 또는 그의 임의의 부분의 하나 이상의 특정 부분을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 항체 아미노산 서열은 본 명세서에 기재되거나, 당업계에 공지된 적어도 하나의 특정 치환, 삽입 또는 결실을 추가로 선택적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 명세서에 기재된 바와 같이 하나 이상의 단리된 항-TNF 항체를 제공하며, 여기서 항체는 하나 이상의 활성, 예를 들어 (이에 한정되지 않음) TNF-유도 세포 부착 분자의 저해, 수용체에 대한 TNF 결합의 저해, 생쥐 모델에서의 관절염 지수 개선을 갖는다(예를 들어, 실시예 3 내지 실시예 7 참조). 따라서, 항-TNF 항체는 공지된 방법에 따른 상응하는 활성, 예를 들어 (이에 한정되지 않음) TNF 단백질에 대한 하나 이상의 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.

본 발명은 추가로, 본 발명의 하나 이상의 TNF 항체에 대한 하나 이상의 TNF 항-개별특이형 항체를 제공한다. 항-개별특이형 항체는 본 발명의 항체 내로 도입될 수 있는 면역글로불린 분자의 적어도 일부, 예를 들어 (이에 한정되지 않음) 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 그의 임의의 부분을 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 항체는 임의의 포유동물, 예를 들어 (이에 한정되지 않음) 인간, 생쥐, 토끼, 쥐, 설치류, 영장류 등의 항체를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있다.

본 발명은 일 태양에서, 하나 이상의 특정 서열, 도메인, 그의 부분 또는 변이체를 포함하는, 하나 이상의 TNF 항-개별특이형 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이 폴리뉴클레오티드에 상보적이거나, 이 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 TNF 항-개별특이형 항체 코딩 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 핵산 및/또는 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포 뿐만 아니라 이러한 항-개별특이형 항체 핵산, 벡터, 및/또는 숙주 세포의 제조 및/또는 사용 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 하나 이상의 항-TNF 항체가 검출가능하고/하거나 회수가능한 양으로 발현되는 조건 하에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 하나 이상의 항-TNF 항체, 또는 TNF 항-개별특이형 항체를 발현시키는 하나 이상의 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 단리된 항-TNF 항체 코딩 핵산 및/또는 항체; 및 (b) 적합한 담체 또는 희석제를 포함하는 하나 이상의 조성물을 제공한다. 담체 또는 희석제는 공지의 담체 또는 희석제에 따라서, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 것일 수 있다. 본 조성물은 적어도 하나의 추가의 화합물, 단백질 또는 조성물을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 추가로, 당업계에 공지되고/되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서, 및/또는 관련 병태 전에, 후에, 또는 그 동안에 하나 이상의 TNF 관련 병태를 조절하거나 치료하기 위해 치료적 유효량을 투여하기 위한 하나 이상의 항-TNF 항체 방법 또는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 하나 이상의 항-TNF 항체의 치료적 유효량 또는 예방적 유효량을 전달하는 하나 이상의 조성물, 장치, 및/또는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, 당업계에 공지되고/되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서, 및/또는 관련 병태 전에, 후에, 또는 그 동안에 하나 이상의 TNF 관련 병태를 진단하기 위한 하나 이상의 항-TNF 항체 방법 또는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 하나 이상의 항-TNF 항체의 진단을 위한 하나 이상의 조성물, 장치, 및/또는 전달 방법을 제공한다.

도 1은 하이브리도마 세포 상등액 내의 TNV mAb가 재조합 TNF 수용체에 대한 TNFα의 결합을 저해하는 능력에 대한 검정을 나타내는 도해적 표현을 나타낸다. 알려진 양의 TNV mAb를 함유하는 변화하는 양의 하이브리도마 세포 상등액을 고정 농도 (5 ng/ml)의 ¹²⁵I-표지 TNFα와 함께 프리인큐베이션하였다. 이전에 p55-sf2, 재조합 TNF 수용체/IgG 융합 단백질로 코팅된 96-웰 Optiplate에 혼합물을 이전하였다. 결합하지 않은 재료를 세척해내고 감마 계수기를 사용하여 계수한 후, mAb의 존재 하에 p55 수용체에 결합한 TNFα의 양을 결정하였다. 이들 실험에서는 8개의 TNV mAb 샘플을 시험하였으나, 단순성을 위해 DNA 서열 분석에 의해 다른 TNV mAb 중 하나와 동일한 것으로 나타난 3개의 mAb (섹션 5.2.2 참조)는 여기에 나타내지 않는다. 각 샘플을 이중실험으로 시험하였다. 나타낸 결과는 2개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 2a 내지 도 2b는 TNV mAb 중쇄 가변 영역의 DNA 서열을 나타낸다. 나타낸 생식세포 유전자는 DP-46 유전자이다. 'TNV'는 나타낸 서열이 TNV14, TNV15, TNV148, 및 TNV196의 서열임을 표시한다. TNV 서열 내의 최초 3개의 뉴클레오티드는 번역 개시 Met 코돈을 정의한다. TNV mAb 유전자 서열 내의 점은 뉴클레오티드가 생식세포 서열에서와 동일함을 표시한다. TNV 서열의 최초 19개의 뉴클레오티드 (밑줄)는 가변 영역을 PCR-증폭하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드에 상응한다. 성숙 mAb로 시작하는 아미노산 번역 (1문자 약어)은 생식세포 유전자에 대해서만 나타낸다. 생식세포 아미노산 번역 내의 3개의 CDR 도메인은 굵은체 및 밑줄로 표시한다. TNV148(B)로 표지된 라인은 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 존재함을 표시한다. 생식세포 DNA 서열 (CDR3) 내의 갭은 공지되어 있지 않거나 생식세포 유전자 내에 존재하지 않는 서열로 인한 것이다. TNV mAb 중쇄는 J6 연결 영역을 사용한다.
도 3은 TNV mAb 경쇄 가변 영역의 DNA 서열을 나타낸다. 나타낸 생식세포 유전자는 인간 카파 생식세포 가변 영역 유전자의 Vg/38K 패밀리의 대표적 구성원이다. TNV mAb 유전자 서열 내의 점은 뉴클레오티드가 생식세포 서열에서와 동일함을 표시한다. TNV 서열의 최초 16개의 뉴클레오티드 (밑줄)는 가변 영역을 PCR-증폭하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드에 상응한다. 성숙 mAb의 아미노산 번역 (1문자 약어)은 생식세포 유전자에 대해서만 나타낸다. 생식세포 아미노산 번역 내의 3개의 CDR 도메인은 굵은체 및 밑줄로 표시한다. TNV148(B)로 표지된 라인은 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 존재함을 표시한다. 생식세포 DNA 서열 (CDR3) 내의 갭은 공지되어 있지 않거나 생식세포 유전자 내에 존재하지 않는 서열로 인한 것이다. TNV mAb 경쇄는 J3 연결 서열을 사용한다.
도 4는 TNV mAb 중쇄 가변 영역의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 나타낸 아미노산 서열(1문자 약어)은 클로닝되지 않은 PCR 산물 및 클로닝된 PCR 산물 둘 모두로부터 결정된 DNA 서열로부터 추론되었다. 아미노 서열은 분비 신호 서열 (신호), 프레임워크 (FW), 및 상보성 결정 영역 (CDR) 도메인으로 분할하여 나타낸다. DP-46 생식세포 유전자에 대한 아미노산 서열은 각각의 도메인에 대해 상부 라인 상에 나타낸다. 점은 TNV mAb 내의 아미노산이 생식세포 유전자와 동일함을 표시한다. TNV148(B)는 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 존재함을 표시한다. 'TNVs'는, 상이한 서열을 나타내지 않는 한, 나타낸 서열이 모든 TNV mAb에 존재함을 표시한다. 생식세포 서열 (CDR3) 내의 점선은 서열이 공지되어 있지 않거나 생식세포 유전자 내에 존재하지 않음을 표시한다.
도 5는 TNV mAb 경쇄 가변 영역의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 나타낸 아미노산 서열(1문자 약어)은 클로닝되지 않은 PCR 산물 및 클로닝된 PCR 산물 둘 모두로부터 결정된 DNA 서열로부터 추론되었다. 아미노 서열은 분비 신호 서열 (신호), 프레임워크 (FW), 및 상보성 결정 영역 (CDR) 도메인으로 분할하여 나타낸다. Vg/38K-유형 경쇄 생식세포 유전자에 대한 아미노산 서열은 각각의 도메인에 대해 상부 라인 상에 나타낸다. 점은 TNV mAb 내의 아미노산이 생식세포 유전자와 동일함을 표시한다. TNV148(B)는 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 존재함을 표시한다. '전부'는 나타낸 서열이 TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B, 및 TNV186에 존재함을 표시한다.
도 6은 rTNV148B-발현 C466 세포를 제조하기 위해 사용된 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드의 개략적 예시를 나타낸다. p1783은 중쇄 플라스미드이고 p1776은 경쇄 플라스미드이다. rTNV148B 가변 영역 및 불변 영역 코딩 도메인은 흑색 박스로 나타낸다. J-C 인트론 내의 면역글로불린 인핸서는 회색 박스로 나타낸다. 관련 제한 부위를 나타낸다. 플라스미드는 Ab 유전자의 전사가 시계 방향으로 진행하도록 배향하여 나타낸다. 플라스미드 p1783은 길이가 19.53 kb이고 플라스미드 p1776은 길이가 15.06 kb이다. 둘 모두의 플라스미드의 완전한 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다. BsiWI/BstBI 제한 단편을 대체함으로써 p1783 내의 가변 영역 코딩 서열을 다른 중쇄 가변 영역 서열로 용이하게 대체할 수 있다. SalI/AflII 제한 단편을 대체함으로써 p1776 내의 가변 영역 코딩 서열을 다른 가변 영역 서열로 대체할 수 있다.
도 7은 5개의 rTNV148B-생성 세포주의 성장 곡선 분석의 도해적 표현을 나타낸다. 30 ml의 부피 내에 1.0 × 10⁵ 세포/ml의 생존가능 세포 밀도를 갖도록 I5Q+MHX 배지 중에 T75 플라스크 내로 세포를 접종함으로써 제0일에 배양을 개시하였다. 이들 연구에 사용된 세포 배양물은 형질감염 및 서브클로닝을 수행한 이후에 계속 배양되었다. 그 후의 날들에는, T 플라스크 내의 세포를 완전히 재현탁하고 0.3 ml 분취량의 배양물을 제거하였다. 세포 계수가 1.5 × 10⁵ 세포/ml 미만으로 하락했을 때 성장 곡선 연구를 종료하였다. 타이판 블루 배제에 의해 분취량 내의 생존 세포의 수를 결정하고 나머지 분취량은 이후의 mAb 농도 결정을 위해 저장하였다. 인간 IgG에 대한 ELISA를 모든 샘플 분취량에 동시에 수행하였다.
도 8은 변화하는 농도의 MHX 선택의 존재 하에 세포 성장 속도를 비교한 도해적 표현을 나타낸다. 세포 서브클론 C466A 및 C466B를 무-MHX 배지 (IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민) 내로 해동시키고 부가적인 2일 동안 배양하였다. 이어서, 둘 모두의 세포 배양물을 MHX를 함유하지 않거나 0.2X MHX 또는 1X MHX를 함유한 3개의 배양물로 분할하였다. 1일 후에, 새로운 T75 플라스크를 1 × 10⁵ 세포/ml의 시작 밀도에서 배양물로 접종하고, 1주 동안 24시간 간격으로 세포를 계수하였다. SOP PD32.025의 수학식을 사용하여 최초 5일 동안 배가 시간을 계산하였으며, 이를 바 위에 나타낸다.
도 9는 2개의 rTNV148B-생성 세포주로부터의 시간 경과에 따른 mAb 생성의 안정성의 도해적 표현을 나타낸다. 형질감염 및 서브클로닝을 수행한 이후에 계속 배양된 세포 서브클론을 사용하여 24-웰 배양 접시 내에서 장기 연속 배양을 시작하였다. MHX 선택의 존재 및 부재 하에 세포를 I5Q 배지 중에 배양하였다. 이전의 배양물이 소진되도록 하는 동안 새로운 생존가능 배양물을 유지하기 위해, 4 내지 6일마다 배양물을 분배함으로써 세포를 계속하여 계대배양하였다. 배양물이 소진된 직후에 소진된 세포 상등액의 분취량을 수집하고 mAb 농도가 결정될 때까지 저장하였다. 인간 IgG에 대한 ELISA를 모든 샘플 분취량에 동시에 수행하였다.
도 10은 실시예 4의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응하는 관절염 생쥐 모델 생쥐 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4주의 주령에 Tg197 연구 생쥐를 성별 및 체중을 기준으로 9개의 치료군 중 하나에 배정하고, 둘베코 PBS (D-PBS) 또는 본 발명의 항-TNF 항체 (TNV14, TNV148, 또는 TNV196) (1 mg/㎏ 또는 10 mg/㎏으로)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다. 투약-전 (pre-dose)으로부터의 변화로서 체중을 분석하는 경우, 연구 전체에 걸쳐 10 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 D-PBS-치료 동물보다 일관적으로 더 높은 체중 증가를 나타냈다. 이 체중 증가는 제3주 내지 제7주에 유의적이었다. 10 mg/㎏ TNV148로 치료한 동물 또한 연구의 제7주에 유의적인 체중 증가를 달성하였다.
도 11a 내지 도 11c는 실시예 4에 제공된 바와 같이 관절염 지수를 기준으로 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 제3주에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 (제7주) 계속하여 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았다. D-PBS-치료군에 비교할 경우, 1 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물 및 1 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 제3주 후에 AI의 유의적인 감소를 나타내지 못하였다. 유사한 용량의 다른 것들에 각각을 비교할 경우 (10 mg/㎏ TNV14, 148, 및 196에 비교한 10 mg/㎏ cA2), 10 mg/㎏ 치료군들 사이에는 유의적인 차이가 없었다. 1 mg/㎏ 치료군들을 비교할 경우, 3, 4, 및 7주에 1 mg/㎏ TNV148은 1 mg/㎏ cA2보다 유의적으로 더 낮은 AI를 나타냈다. 3 및 4주에 1 mg/㎏ TNV148 또한 1 mg/㎏ TNV14-치료군보다 유의적으로 더 낮았다. 연구의 제6주까지 TNV196이 AI의 유의적인 감소를 나타냈지만 (D-PBS-치료군에 비교할 경우), 연구의 결말에서 유의적으로 남은 유일한 1 mg/㎏ 치료는 TNV148이었다.
도 12는 실시예 5의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응하는 관절염 생쥐 모델 생쥐 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4주의 주령에 Tg197 연구 생쥐를 체중을 기준으로 8개의 치료군 중 하나에 배정하고, 대조군 항목 (D-PBS) 또는 항체 (TNV14, TNV148) (3 mg/㎏으로)의 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다 (제0주). 제1주, 제2주, 제3주, 및 제4주에 모든 동물에 주사를 반복하였다. 제1군 내지 제6군을 시험 항목 효능에 대해 평가하였다. 제7군 및 제8군의 동물로부터 얻어진 혈청 샘플을 제2주, 제3주, 및 제4주에 면역 반응 유도 및 TNV14 또는 TNV148의 약동학적 제거에 대해 평가하였다.
도 13a 내지 도 13c는 관절염 지수를 기준으로 실시예 5에서의 질환 중증도의 진행을 나타내는 그래프이다. 제2주에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 (제5주) 계속하여 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 유의적으로 더 낮았다. d-PBS 대조군에 비교할 경우, 1 mg/㎏ 또는 3 mg/㎏의 cA2로 치료한 동물 및 3 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물은 연구 전체에 걸쳐 임의의 시간에 AI의 임의의 유의적인 감소를 달성하지 못하였다. d-PBS-치료군에 비교할 경우, 3 mg/㎏ TNV148로 치료한 동물은 제3주에 시작하여 제5주까지 계속하여 유의적인 감소를 나타냈다. 더 낮은 용량 (1 mg/㎏ 및 3 mg/㎏)의 cA2 둘 모두에 비교할 경우, 10 mg/㎏ cA2-치료 동물은 연구의 제4주 및 제5주에 AI의 유의적인 감소를 나타냈으며, 이는 또한 제3주 내지 제5주에 TNV14-치료 동물보다 유의적으로 더 낮았다. 3 mg/㎏ 치료군들 중 임의의 것 사이에는 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났지만, 3 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물에 대한 AI는 일부 시점에 10 mg/㎏보다 유의적으로 더 높았던 반면에, TNV148로 치료한 동물은 10 mg/㎏의 cA2로 치료한 동물과 유의적으로 상이하지 않았다.
도 14는 실시예 6의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응하는 관절염 생쥐 모델 생쥐 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4주의 주령에 Tg197 연구 생쥐를 성별 및 체중을 기준으로 6개의 치료군 중 하나에 배정하고, 항체 (cA2 또는 TNV148) (3 mg/㎏ 또는 5 mg/㎏)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다. 이 연구는 D-PBS 및 10 mg/㎏ cA2 대조군을 이용하였다.
도 15는 실시예 6에 제공된 바와 같이 관절염 지수를 기준으로 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 모든 치료군은 초기 시점에 일부 보호를 나타냈으며, 5 mg/㎏ cA2 및 5 mg/㎏ TNV148은 제1주 내지 제3주에 AI의 유의적인 감소를 나타냈고 모든 치료군이 제2주에 유의적인 감소를 나타냈다. 연구의 후기에 5 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 일부 보호를 나타냈으며, 제4주, 제6주, 및 제7주에 유의적인 감소가 나타났다. cA2 및 TNV148 둘 모두의 낮은 용량 (3 mg/㎏)은 제6주에 유의적인 감소를 나타냈고, 모든 치료군이 제7주에 유의적인 감소를 나타냈다. 연구의 결말 (제8주)에는 치료군 중 어느 것도 유의적인 감소를 유지할 수 없었다. 임의의 시점에 치료군들 중 임의의 것(식염수 대조군을 배제함) 사이에 유의적인 차이가 없었다.
도 16은 실시예 7의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응하는 관절염 생쥐 모델 생쥐 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. TNV148 (하이브리도마 세포로부터 유래됨) 및 rTNV148B (형질감염된 세포로부터 유래됨)의 단일복강내 용량의 효능을 비교하기 위해. 대략 4주의 주령에 Tg197 연구 생쥐를 성별 및 체중을 기준으로 9개의 치료군 중 하나에 배정하고, 둘베코 PBS (D-PBS) 또는 항체 (TNV148, rTNV148B) (1 mg/㎏)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다.
도 17은 실시예 7에 제공된 바와 같이 관절염 지수를 기준으로 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 제4주에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 (제8주) 계속하여 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았다. TNV148-치료군 및 1 mg/㎏ cA2-치료군 둘 모두는 제4주에 AI의 유의적인 감소를 나타냈다. 이전의 연구 (P-099-017)는 TNV148이 단일 1 mg/㎏ 복강내 볼루스 후에 관절염 지수를 감소시킴에 있어서 약간 더 효과적이었음을 나타냈지만, 본 연구는 둘 모두의 버전의 TNV 항체-치료군으로부터의 AI가 약간 더 높았음을 나타냈다. 10 mg/㎏ cA2 군에 비교할 경우, 1 mg/㎏ cA2―치료군은 유의적으로 증가하지 않았고 (제6주는 제외함) TNV148-치료군은 제7주 및 제8주에 유의적으로 더 높았지만, 연구의 임의의 지점에 1 mg/㎏ cA2, 1 mg/㎏ TNV148, 및 1 mg/㎏ TNV148B 사이에는 AI의 유의적인 차이가 없었다.
도 18은 연구 CNTO148DML2001에 대한 연구 개요를 나타낸다.
도 19는 6세 내지 21세의 가상 환자에서 다양한 투여 요법 (dosing regimen) (MTX 없음)에 대해 제24주까지 시뮬레이션한 골리무맙 농도 (중간 및 95% 예측 구간)를 나타낸다. 패널 A: T1D (적색) 대 JIA (청색) 및 패널 B: T1D (적색) 대 pedUC (녹색).
도 20은 유리 TNFα 억제에 대해 시뮬레이션한 시간 경로를 나타내며, 좌측 패널의 유도 기간 (제1월) 및 우측 패널의 유지 기간 (6개월까지)을 나타낸다.
도 21은 Ultrasafe의 특징부를 나타낸다.
도 22는 SIMPONI® VarioJect™ 특징부의 예시를 나타낸다.
도 23은 VarioJect™ 장치를 사용하는 SIMPONI®의 투여 단계를 나타낸다.
도 24는 VarioJect™ 장치에 대해 제안된 설계 변형을 나타낸다.

본 발명은 서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역 전부를 포함하는 단리된 재조합 및/또는 합성 항-TNF 인간, 영장류, 설치류, 포유류, 키메라, 인간화, 또는 CDR-이식 항체 및 이에 대한 TNF 항-개별특이형 항체 뿐만 아니라 조성물 및 하나 이상의 항-TNF 항체 또는 항-개별특이형 항체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코딩 핵산 분자를 제공한다. 추가로, 본 발명은 진단 및 치료용 조성물, 방법 및 장치를 포함하는, 상기 핵산 및 항체 및 항-개별특이형 항체의 제조 방법 및 사용 방법을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항-종양 괴사 인자 알파 항체 ", "항-TNF 항체 ", "항-TNF 항체 부분" 또는 "항-TNF 항체 단편" 및/또는 "항-TNF 항체 변이체" 등은 면역글로불린 분자의 적어도 일부, 예를 들어 (이에 한정되지 않음) 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 그의 임의의 부분, 또는 TNF 수용체 또는 결합 단백질의 하나 이상의 부분을 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함하며, 이는 본 발명의 항체 내로 도입될 수 있다. 이러한 항체는 선택적으로 특이적 리간드에 추가로 영향을 주는데, 예를 들어 (이에 한정되지 않음) 이러한 항체는 시험관내, 원위치, 및/또는 생체내에서 하나 이상의 TNF 활성 또는 결합, 또는 TNF 수용체 활성 또는 결합을 조절, 감소, 증가, 길항, 작용, 완화, 경감, 차단, 저해, 폐지시키고/시키거나 방해한다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 적합한 항-TNF 항체, 특정 부분 또는 변이체는 하나 이상의 TNF, 또는 그의 특정 부분, 변이체, 또는 도메인과 결합할 수 있다. 적합한 항-TNF 항체, 특정 부분, 또는 변이체는 또한 선택적으로, 하나 이상의 TNF 활성 또는 기능, 예를 들어 (이에 한정되지 않음) RNA, DNA, 또는 단백질 합성, TNF 방출, TNF 수용체 신호전달, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생성 및/또는 합성에 영향을 줄 수 있다. 용어 "항체"는 추가로 항체, 그의 분해 단편, 특정 부분, 및 변이체를 포함하고자 의도되며, 항체 모방체 (mimetic)를 포함하거나, 단일쇄 항체 및 그의 단편을 포함하는 항체 또는 그의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분을 포함한다. 기능성 단편은 포유류 TNF에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, Fab (예를 들어, 파파인 분해에 의해), Fab' (예를 들어, 펩신 분해 및 부분적인 환원에 의해), 및 F(ab')2 (예를 들어, 펩신 분해에 의해), facb (예를 들어, 플라스민 분해에 의해), pFc' (예를 들어, 펩신 또는 플라스민 분해에 의해), Fd (예를 들어, 펩신 분해, 부분적인 환원, 및 재응집에 의해), Fv 또는 scFv (예를 들어, 분자생물학 기술에 의해) 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는, TNF 또는 그의 부분에 결합할 수 있는 항체 단편이 본 발명에 포함된다 (예를 들어, 문헌[Colligan, Immunology, 상기 문헌] 참조).

당업계에 공지되고/되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이러한 단편은 효소적 절단, 합성 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 종결 코돈이 천연적 종결 부위의 업스트림에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 말단절단 형태로 생성될 수 있다 예를 들어, 중쇄의 CH₁ 도메인 및/또는 힌지 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하도록, F(ab')₂ 중쇄 부분을 코딩하는 조합 유전자를 설계할 수 있다. 항체의 다양한 부분은 통상의 기술에 의해 화학적으로 함께 연결될 수 있거나 또는 유전 공학 기술을 사용하여 연속 단백질로서 제조될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 실질적으로 단백질의 모든 부분 (예를 들어, CDR, 프레임워크, C_L, C_H 도메인 (예를 들어 C_H1, C_H2, C_H3), 힌지, (V_L, V_H))이 단지 작은 서열 변화 또는 변이만을 포함하고, 인간에서 실질적으로 비면역원성인 항체를 말한다. 유사하게, 영장류 (원숭이, 개코원숭이, 침팬지 등), 설치류 (생쥐, 쥐, 토끼, 기니아 피그, 햄스터 등) 및 다른 포유동물에 지정된 항체는 상기 종, 아속, 속, 아과, 과 특이적 항체를 지정한다. 추가로, 키메라 항체는 상기의 임의의 조합을 포함한다. 상기 변화 또는 변이는 임의로 그리고 바람직하게는, 변형되지 않은 항체에 비해 인간 또는 다른 종에서의 면역원성을 유지시키거나 감소시킨다. 따라서, 인간 항체는 키메라 또는 인간화 항체와 구별된다. 인간 항체는 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린 (예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현시킬 수 있는 비-인간 동물 또는 원핵 또는 진핵세포에 의해 생산될 수 있다는 점이 주목된다. 추가로, 인간 항체가 단일쇄 항체일 때, 인간 항체는 천연 인간 항체에서는 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 연결시키는 링커 펩티드, 예를 들어 2 내지 약 8개의 글라이신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 링커 펩티드는 인간 기원인 것으로 생각된다.

적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체인 이중특이성(bispecific), 이종특이성 (heterospecific), 이종컨쥬게이트 (heteroconjugate) 또는 유사 항체도 사용할 수 있다. 이 경우에, 결합 특이성 중 하나는 하나 이상의 TNF 단백질에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이성 항체의 재조합 생성은 2개의 중쇄가 상이한 특이성을 갖는, 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시 발현에 기초한다 (문헌[Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (콰드로마 (quadroma))는 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산한다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생성물 수율도 낮다. 유사한 절차는, 예를 들어, 국제특허 공개 WO 93/08829호, 미국 특허 제6210668호, 제6193967호, 제6132992호, 제6106833호, 제6060285호, 제6037453호, 제6010902호, 제5989530호, 제5959084호, 제5959083호, 제5932448호, 제5833985호, 제5821333호, 제5807706호, 제5643759호, 제5601819호, 제5582996호, 제5496549호, 제4676980호, 국제특허 공개 WO 91/00360호, 국제특허 공개 WO 92/00373호, 유럽 특허 제03089호, 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)], 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986)]에 개시되어 있으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항-TNF 항체 (TNF 항체로도 칭함)는 선택적으로 TNF에 대한 고친화도 결합 및 선택적으로 그리고 바람직하게는 낮은 독성을 특징으로 할 수 있다. 특히, 개별적인 성분, 예를 들어 가변 영역, 불변 영역 및 프레임워크가 개별적으로 및/또는 공동으로, 선택적으로 및 바람직하게는 낮은 면역원성을 갖는 본 발명의 항체, 특정 단편 또는 변이체가 본 발명에서 유용하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 선택적으로 측정가능한 정도로 증상을 완화시키면서 낮고/낮거나 허용가능한 독성을 보이면서 장기간 동안 환자를 치료할 수 있는 능력을 특징으로 한다. 낮거나 허용가능한 면역원성 및/또는 높은 친화도 뿐만 아니라 다른 적합한 특성이 달성되는 치료 결과에 기여할 수 있다. 본 명세서에서 "낮은 면역원성"은 약 75% 미만, 또는 바람직하게는 약 50% 미만의 치료되는 환자에서 유의적인 HAHA, HACA, 또는 HAMA 반응을 야기하고/하거나 치료되는 환자에서 낮은 역가 (이중 항원 효소 면역검정으로 측정할 때, 약 300 미만, 바람직하게는 약 100 미만)를 야기하는 것으로서 정의된다 (문헌[Elliott et al., Lancet 344:1125-1127 (1994)], 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨).

유용성: 본 발명의 단리된 핵산은 면역 장애 또는 질환, 심혈관 장애 또는 질환, 감염성, 악성, 및/또는 신경 장애 또는 질환 (이에 한정되지 않음) 중의 하나 이상으로부터 선택되는 하나 이상의 TNF 병태를 진단, 관찰, 조절, 치료, 완화시키거나, 그의 발병의 예방을 돕거나, 그의 증상을 감소시키기 위해 세포, 조직, 기관, 또는 동물 (포유류 및 인간을 포함함)에서 측정하거나 작용하기 위하여 사용될 수 있는 하나 이상의 항-TNF 항체 또는 그의 특정 변이체의 생성을 위해 사용될 수 있다.

이러한 방법은 이러한 증상, 효과, 또는 메카니즘의 조절, 치료, 완화, 예방, 또는 감소를 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 또는 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재되거나 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 공지된 방법을 사용하여 실행되고 결정될 때, 유효량은 단일 (예를 들어, 볼루스), 다중, 또는 연속 투여당 약 0.001 내지 500 mg/㎏의 양, 또는 단일, 다중, 또는 연속 투여당 0.01 내지 5000 ㎍/ml의 혈청 농도를 달성하는 양, 또는 임의의 유효 범위 또는 그 안의 값을 포함할 수 있다. 인용. 본 명세서에서 인용된 모든 간행물 또는 특허는, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되며, 이는 그들이 본 발명의 시점에서의 최신의 기술을 보여주고/주거나 본 발명의 설명 및 용이성을 제공하기 때문이다. 간행물은 임의의 학술 간행물 또는 특허 간행물, 또는 모든 기록 형태, 전자 형태 또는 인쇄 형태를 포함하는 임의의 매체 형태로 이용가능한 임의의 다른 정보를 가리킨다. 하기 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다: 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)].

본 발명의 항체: 서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역 전부를 포함하는 본 발명의 하나 이상의 항-TNF 항체는, 당업계에 잘 공지된 바와 같이, 선택적으로 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포, 또는 불멸화 세포의 클론 개체군에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참조한다.

단리된 및/또는 TNF 단백질 또는 그의 부분 (합성 펩티드와 같은 합성 분자를 포함함)과 같은 적절한 면역원성 항원에 대해 인간 TNF 단백질 또는 그의 단편에 특이적인 인간 항체를 발생시킬 수 있다. 다른 특이적 또는 일반적 포유류 항체를 유사하게 발생시킬 수 있다. 면역원성 항원의 제조 및 단클론 항체 생산은 임의의 적합한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.

한 방법에서, 하이브리도마는 적합한 무한증식 세포주, 예를 들어, 골수종 세포주, 예를 들어 Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A 등 (이에 한정되지 않음), 또는 이종골수종 (heteromyeloma), 그의 융합 산물, 또는 임의의 세포 또는 그로부터 유도된 융합 세포, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 세포주 (예를 들어, www.atcc.org, www.lifetech.com 참조) 등을, 항체 생산 세포, 예를 들어 단리 또는 클로닝된 비장, 말초 혈액, 림프, 편도 또는 다른 면역 또는 B 세포 함유 세포, 또는 내인성 또는 이종 핵산으로서, 재조합 또는 내인성, 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵생물, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유동물, 설치류, 말, 양, 염소, 양, 영장류, 진핵생물, 게놈 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 가닥, 혼성화된 것 등 (이에 한정되지 않음) 또는 그의 조합으로서 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변 또는 프레임워크 또는 CDR 서열을 발현하는 임의의 다른 세포와 융합시켜 생산한다. 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Ausubel, 상기 문헌], 및 문헌[Colligan, Immunology, 상기 문헌, chapter 2]을 참조한다.

항체 생성 세포는 또한, 관심의 대상이 되는 항원으로 면역화된 인간 또는 다른 적합한 동물의 말초 혈액, 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 얻을 수 있다. 임의의 다른 적합한 숙주 세포는 또한 본 발명의 항체, 그의 특정 단편 또는 변이체를 코딩하는 이종 또는 내인성 핵산을 발현시키기 위하여 사용될 수 있다. 융합된 세포 (하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적 배양 조건 또는 다른 적합한 공지 방법을 사용하여 단리될 수 있고, 제한 희석 또는 세포 분류 또는 다른 공지의 방법에 의해 클로닝될 수 있다. 요구되는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 세포는 적합한 분석 (예를 들어, ELISA)에 의해 선별될 수 있다.

펩티드 또는 단백질 라이브러리 (예를 들어 (이에 한정되지 않음), 박테리오파지, 리보좀, 올리고뉴클레오티드, RNA, cDNA 등, 디스플레이 라이브러리; 예를 들어, 영국 캠브리지셔 소재의 캠브리지 안티바디 테크놀로지스(Cambridge antibody Technologies); 독일 마틴스라이드/플라네그 소재의 모포시스 (MorphoSys); 영국 스코틀랜드 아버딘 소재의 바이오베이션 (Biovation); 스웨덴 룬드 소재의 바이오인벤트 (BioInvent); 디악스 코포레이션 (Dyax Corp.), 엔존 (Enzon), 아피맥스 (Affymax)/바이오사이트 (Biosite); 캘리포니아주 버클리 소재의 조마 (Xoma); 아익시스(Ixsys)로부터 입수가능함. 예를 들어, 유럽 특허 제368,684호, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; 미국 특허 출원 제08/350260호(5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); 국제특허 공개 WO90/14443호; 국제특허 공개 WO90/14424호; 국제특허 공개 WO90/14430호; PCT/US94/1234; 국제특허 공개 WO92/18619호; 국제특허 공개 WO96/07754호; (스크립스 (Scripps)); 유럽 특허 제614 989호 (모포시스); 국제특허 공개 WO95/16027호 (바이오인벤트); 국제특허 공개 WO88/06630호; 국제특허 공개 WO90/3809호 (디악스); 미국 특허 제4,704,692호 (엔존); PCT/US91/02989 (아피맥스); 국제특허 공개 WO89/06283호; 유럽 특허 제371 998호; 유럽 특허 제550 400호; (조마); 유럽 특허 제229 046호; PCT/US91/07149 (아익시스) 참조); 또는 확률적으로 생성된 펩티드 또는 단백질 (미국 특허 제5723323호, 제5763192호, 제5814476호, 제5817483호, 제5824514호, 제5976862호, 국제특허 공개 WO 86/05803호, 유럽 특허 제590 689호 (아익시스, 현재 어플라이드 몰레큘라 에볼루션 (Applied Molecular Evolution (AME)), 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨)로부터 재조합 항체를 선택하거나, 당업계에 공지되고/되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, SCID 생쥐, 문헌[Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997)]; 문헌[Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996)]; 문헌[Eren et al., Immunol. 93:154-161 (1998)], 각각은 관련 특허 및 출원과 함께 전체적으로 참고로 포함됨)의 면역화에 의존하는 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 요구되는 특이성의 항체를 생성 또는 단리하는 다른 적합한 방법을 사용할 수 있다. 상기 기술은 리보좀 디스플레이 (문헌[Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (May 1997)]; 문헌[Zhou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)]); 단일 세포 항체 생성 기술 (예를 들어, 선택된 림프구 항체 방법 ("SLAM") (미국 특허 제5,627,052호, 문헌[Wen et al., J. Immunol. 17:887-892 (1987)]); 문헌[Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)]); 겔 미세액적 및 유세포 분석(문헌[Powell et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990)]; 매사추세츠주 캠브리지 소재의 원 셀 시스템즈(One Cell Systems); 문헌[Gray et al., J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995)]; 문헌[Kenny et al., Bio/Technol. 13:787-790 (1995)]); B-세포 선택 (문헌[Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994)]; 문헌[Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands (1988)])을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

또한, 비-인간 또는 인간 항체를 조작 또는 인간화하는 방법이 사용될 수 있고, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화되거나 조작된 항체는 비-인간인 공급원, 예를 들어 생쥐, 쥐, 토끼, 비-인간 영장류 또는 다른 포유동물(이에 한정되지 않음)로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 상기 인간 아미노산 잔기는 주로 "도입" 잔기로 언급되고, 전형적으로 공지된 인간 서열의 "도입" 가변, 불변 또는 기타 도메인으로부터 취해진다. 공지의 인간 Ig 서열은, 예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; www.biotech.ufl.edu/~hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximt1.imt.uni-marburg.de/~rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr_products.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html; 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)]에 개시되어 있으며, 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

상기 도입된 서열은 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화도, 온-레이트 (on-rate), 오프-레이트 (off-rate), 결합력, 특이성, 반감기, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 특성을 감소, 향상, 또는 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 비-인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부가 유지되는 반면에, 가변 및 불변 영역의 비-인간 서열은 인간 또는 다른 아미노산으로 대체된다. 항체는 또한 항원에 대한 고친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 유지하면서 선택적으로 인간화될 수 있다. 상기 목적을 달성하기 위하여 인간화 항체는 선택적으로 모 (parental) 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 (conceptual) 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델이 통상 이용가능하고 당업자에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이를 조사하여, 후보 면역글로불린 서열이 기능할 때 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 그의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 요구되는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가가 달성되도록 컨센서스 및 도입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 줄 때 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다. 본 발명의 항체의 인간화 또는 조작은 임의의 공지된 방법, 예를 들어 (이에 한정되지 않음), 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988))], 문헌[Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)]; 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)], 문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992)]; 문헌[Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)], 미국 특허 제5723323호, 제5976862호, 제5824514호, 제5817483호, 제5814476호, 제5763192호, 제5723323호, 제5,766886호, 제5714352호, 제6204023호, 제6180370호, 제5693762호, 제5530101호, 제5585089호, 제5225539호; 제4816567호, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; 국제특허 공개 WO90/14443호, 국제특허 공개 WO90/14424호, 국제특허 공개 WO90/14430호, 유럽 특허 제229246호, 그 안에 인용된 포함된 참고문헌에 기재된 것들을 사용하여 수행할 수 있다.

또한 항-IL-13 항체는 본 명세서에 기재되고/되거나 당업계에 공지된 바와 같이, 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 비-인간 영장류 등)의 면역화에 의해 선택적으로 생성될 수 있다. 인간 항-TNF 항체를 생성하는 세포는, 본 명세서에 기재된 방법과 같은 적합한 방법을 사용하여 이러한 동물로부터 단리되고 불멸화될 수 있다.

인간 항원에 결합하는 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 생쥐는 공지된 방법 (예를 들어 (이에 한정되지 않음), 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, 론버그 (Lonberg) 등에게 등록된 미국 특허 제5,770,428호, 제5,569,825호, 제5,545,806호, 제5,625,126호, 제5,625,825호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 및 제5,789,650호; 국제특허 공개 WO 98/50433호 (Jakobovits et al.), 국제특허 공개 WO 98/24893호 (Jakobovits et al.), 국제특허 공개 WO 98/24884호 (Lonberg et al.), 국제특허 공개 WO 97/13852호 (Lonberg et al.), 국제특허 공개 WO 94/25585호 (Lonberg et al.), 국제특허 공개 WO 96/34096호 (Kucherlapate et al.), 유럽 특허 제0463 151 B1호 (Kucherlapate et al.), 유럽 특허 제0710 719 A1호 (Kucherlapate et al.), 미국 특허 제5,545,807호 (Surani et al.), 국제특허 공개 WO 90/04036호 (Bruggemann et al.), 유럽 특허 제0438 474 B1호 (Bruggemann et al.), 유럽 특허 제0814 259 A2호 (Lonberg et al.), 영국 특허 제2 272 440 A호 (Lonberg et al.), 문헌[Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994)], 문헌[Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994)], 문헌[Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994)], 문헌[Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997)], 문헌[Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992)], 문헌[Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993)], 문헌[Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995)], 및 문헌[Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996)])에 의해 생성될 수 있다. 일반적으로, 이들 생쥐는 기능적으로 재배열되거나, 기능적으로 재배열될 수 있는 적어도 하나의 인간 면역글로불린 유전자좌로부터의 DNA를 포함하는 적어도 하나의 트랜스유전자(transgene)를 포함한다. 상기 생쥐에서 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴되거나 결실되어, 내인성 유전자에 의해 암호화되는 항체를 생성하는 동물의 능력을 제거할 수 있다.

통상적으로 펩티드 디스플레이 라이브러리를 사용하여 유사한 단백질 또는 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝할 수 있다. 이 방법은 원하는 기능 또는 구조를 갖는 개별적인 구성원에 대해 거대 펩티드 집단을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리의 항체 스크리닝은 당업계에 잘 공지되어 있다. 디스플레이된 펩티드 서열의 길이는 3 내지 5000개 이상의 아미노산, 빈번하게 5 내지 100개의 아미노산, 종종 약 8 내지 25개의 아미노산이다. 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 직접적인 화학적 합성 방법에 부가하여, 몇몇 재조합 DNA 방법이 기재되어 있다. 한 종류는 박테리오파지 또는 세포의 표면 상에 펩티드 서열을 디스플레이하는 것을 포함한다. 각각의 박테리오파지 또는 세포는 특정 디스플레이된 펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 방법은 PCT 특허 공개 91/17271호, 91/18980호, 91/19818호, 및 93/08278호에 기재되어 있다. 펩티드의 라이브러리를 생성하는 다른 시스템은 시험관내에서의 화학적 합성 및 재조합 방법 둘 모두의 태양을 포함한다. PCT 특허 공개 92/05258호, 92/14843호, 및 96/19256호를 참조하라. 또한 미국 특허 제5,658,754호; 및 제5,643,768호를 참조하라. 펩티드 디스플레이 라이브러리, 벡터, 및 스크리닝 키트는 인비트로젠(Invitrogen) (캘리포니아주 칼스바드), 및 캠브리지 안티바디 테크놀로지스 (영국 캠브리지셔)와 같은 공급처로부터 구매가능하다. 예를 들어, 엔존에 양도된 미국 특허 제4704692호, 제4939666호, 제4946778호, 제5260203호, 제5455030호, 제5518889호, 제5534621호, 제5656730호, 제5763733호, 제5767260호, 및 제5856456호; 디악스에 양도된 제5223409호, 제5403484호, 제5571698호, 제5837500호, 아피맥스에 양도된 제5427908호, 제5580717호; 캠브리지 안티바디 테크놀로지스에 양도된 제5885793호; 제넨텍(Genentech)에 양도된 제5750373호, 조마에 양도된 제5618920호, 제5595898호, 제5576195호, 제5698435호, 제5693493호, 제5698417호, 문헌[Colligan, 상기 문헌]; 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조한다(상기 특허 및 간행물 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨).

그들의 우유 내에 이러한 항체를 생성하는 트랜스제닉 동물 또는 포유류, 예를 들어 염소, 소, 말, 양 등을 제공하기 위해 하나 이상의 항-TNF 항체를 코딩하는 핵산을 사용하여 본 발명의 항체를 또한 제조할 수 있다. 상기 동물은 공지된 방법을 사용하여 제공할 수 있다. 예를 들어 (이에 한정되지 않음), 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 제5,827,690호; 제5,849,992호; 제4,873,316호; 제5,849,992호; 제5,994,616호; 제5,565,362호; 제5,304,489호 등을 참조한다.

부가적으로, 본 발명의 항체는 식물 부분, 또는 그로부터 배양된 세포에서 이러한 항체, 특정 부분, 또는 변이체를 생성하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포 (예를 들어 (이에 한정되지 않음), 담배 및 옥수수)를 제공하는 하나 이상의 항-TNF 항체를 코딩하는 핵산을 사용하여 제조할 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 담배 잎이, 예를 들어 유도가능 프로모터를 사용하여 다량의 재조합 단백질을 제공하기 위해 성공적으로 사용되었다 예를 들어, 문헌[Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999)] 및 그 안에 인용된 참고문헌을 참조한다. 또한, 트랜스제닉 옥수수를 사용하여 다른 재조합 시스템에서 생산되거나, 천연 공급원으로부터 정제된 것과 동일한 생물학적 활성을 보유하면서, 상업적 생산 수준으로 포유동물 단백질을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 (1999)] 및 그 안에 인용된 참고문헌을 참조한다. 항체는 또한 항체 단편, 예를 들어 단일쇄 항체 (scFv)를 포함하는, 트랜스제닉 식물 종자, 예를 들어 담배 종자 및 감자 덩이줄기로부터 다량으로 생성되었다. 예를 들어, 문헌[Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998)] 및 그 안에 인용된 참고문헌을 참조한다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 공지된 방법에 따라 트랜스제닉 식물을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Oct., 1999)], 문헌[Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995)]; 문헌[Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995)]; 문헌[Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994)]; 및 그 안에 인용된 참고문헌 또한 참조한다. 또한 일반적으로 항체의 식물 발현에 대해서 참조하지만 이에 한정되지 않고, 상기 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 항체는 광범위한 친화도 (K_D)로 인간 TNF와 결합할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 하나 이상의 인간 mAb는 선택적으로 고친화도로 인간 TNF와 결합할 수 있다. 예를 들어, 인간 mAb는 약 10^-7 M 이하, 예를 들어 (이에 한정되지 않음) 0.1 내지 9.9 (또는 그 안의 임의의 범위 또는 값) × 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값의 K_D로 인간 TNF와 결합할 수 있다.

항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정할 수 있다. (예를 들어, 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984)]; 문헌[Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992)]; 및 본 명세서에 기재된 방법 참조). 상이한 조건 (예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정할 경우, 특정 항체-항원 상호작용의 측정되는 친화도는 다양할 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터 (예를 들어, K_D, K_a, K_d)의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충제, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 완충제로 이루어진다.

핵산 분자. 본 명세서에 제공된 정보를 사용하여, 예를 들어 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 중 하나 이상의 연속된 아미노산의 70 내지 100% 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 그의 특정 단편, 변이체, 또는 컨센서스 서열, 또는 이들 서열 중 하나 이상을 포함하는 기탁된 벡터, 서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역 전부를 포함하는 하나 이상의 항-TNF 항체를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 바와 같은 방법을 사용하여 얻을 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 RNA 형태, 예를 들어 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태 또는 cDNA 및 클로닝에 의해 얻어지거나 합성에 의해 생산된 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 삼중가닥, 이중가닥 또는 단일가닥, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 한 스트랜드의 임의의 부분은 센스 스트랜드로도 공지된 코딩 스트랜드일 수 있거나, 안티-센스 스트랜드로도 언급되는 비-코딩 스트랜드일 수 있다.

본 발명의 단리된 핵산 분자는 선택적으로 하나 이상의 인트론을 가진 개방 해독틀 (ORF)을 포함하는 핵산 분자, 예를 들어 (이에 한정되지 않음), 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 특정 부분, 예를 들어 하나 이상의 중쇄 (예를 들어, 서열 번호 1 내지 3) 또는 경쇄 (예를 들어, 서열 번호 4 내지 6)의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3; 항-TNF 항체 또는 가변 영역 (예를 들어, 서열 번호 7, 8)에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 본 명세서에 기재되고/되거나 당업계에 공지된 바와 같이 상기 기재된 것들과는 실질적으로 상이하지만 유전자 코드의 축퇴로 인해 여전히 하나 이상의 항-TNF 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전자 코드는 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 특이적 항-TNF 항체를 코딩하는 이러한 축퇴 핵산 변이체를 생성하는 것은 당업자에게 일상적일 것이다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., 상기 문헌]을 참조하며, 이러한 핵산 변이체는 본 발명에 포함된다. 본 발명의 단리된 핵산 분자의 비제한적인 예는 각각, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC 가변 영역, 및 LC 가변 영역을 코딩하는 핵산의 비제한적인 예에 상응하는 서열 번호 10, 11, 12, 13, 14, 15를 포함한다.

본 명세서에 표시된 바와 같이, 항-TNF 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는 그 자체로 항체 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 것들; 전체 항체 또는 그의 부분에 대한 코딩 서열; 항체, 단편, 또는 부분에 대한 코딩 서열 뿐만 아니라, 비-코딩 5' 및 3' 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 부가적인 비-코딩 서열, 예를 들어 전사, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 (예를 들어 - mRNA의 리보좀 결합 및 안정성)를 포함하는 mRNA 가공에서 역할을 담당하는 전사되고 비-번역된 서열과 함께, 부가적인 서열, 예를 들어 전술한 부가적인 코딩 서열, 예를 들어 하나 이상의 인트론이 있거나 없는 하나 이상의 신호 리더 (signal leader) 또는 융합 펩티드의 코딩 서열; 부가적인 아미노산, 예를 들어 부가적인 기능성을 제공하는 것들을 코딩하는 부가적인 코딩 서열을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 따라서, 항체를 코딩하는 서열은 항체 단편 또는 일부를 포함하는 융합된 항체의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 코딩하는 서열과 같은 마커 서열에 융합될 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드. 본 발명은 선택적인 혼성화 조건 하에서 본원에서 설명되는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 상기 실시 형태의 폴리뉴클레오티드는 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 단리, 검출, 및/또는 정량하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 기탁된 라이브러리에서 부분적인 또는 전장 클론을 동정, 단리, 또는 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 게놈 또는 cDNA 서열이거나, 또는 그렇지 않으면 인간 또는 포유류 핵산 라이브러리로부터의 cDNA에 상보성이다.

바람직하게는, cDNA 라이브러리는 적어도 80% 전장 서열, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90% 전장 서열, 보다 바람직하게는 적어도 95% 전장 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리는 희귀 서열의 제시를 증가시키도록 정규화될 수 있다. 낮거나 중등 엄격성 혼성화 조건은 전형적으로, 그러나 비배타적으로, 상보성 서열에 비해 감소된 서열 동일성을 갖는 서열과 함께 사용된다. 중등 및 높은 엄격성 조건은 동일성이 더 큰 서열에 대해 선택적으로 사용될 수 있다. 낮은 엄격성 조건은 약 70% 서열 동일성을 갖는 서열의 선택적인 혼성화를 허용하고 동원성 (orthologous) 또는 이원성 (paralogous) 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체의 적어도 일부를 코딩할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하기 위해 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 문헌[Colligan, 상기 문헌]을 참조한다.

핵산의 제조. 본 발명의 단리된 핵산은 당업계에 공지된 바와 같이 (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 또는 이들의 조합을 사용하여 제조될 수 있다.

핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 부가적으로 서열을 편리하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중-클로닝 부위는 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 핵산 내로 삽입될 수 있다. 또한, 번역가능한 서열은 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 발명의 핵산은 선택적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터, 또는 링커이다.

추가의 서열은 클로닝 및/또는 발현에서 그 기능을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕거나 또는 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입을 개선하기 위해 상기 클로닝 및/또는 발현 서열에 부가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터, 및 링커의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조한다).

핵산 제조를 위한 재조합 방법. RNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 본 발명의 단리된 핵산 조성물은 업계의 당업자에게 공지된 임의의 수의 클로닝 방법을 사용하여 생물학적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 엄격한 조건 하에서 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 확인하기 위해 사용된다. RNA의 단리 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 제조는 당업자에게 잘 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조한다).

핵산 스크리닝 및 단리 방법. cDNA 또는 게놈 라이브러리는 본원에 설명된 것과 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열에 기초한 프로브를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 프로브는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화하여 동일하거나 상이한 유기체 내의 상동 유전자를 단리하기 위해 사용될 수 있다. 당업자는 다양한 정도의 혼성화 엄격성이 검정에 사용될 수 있고; 혼성화 배지 또는 세척 배지가 엄격할 수 있음을 인정할 것이다. 혼성화 조건이 보다 더 엄격해지면, 이중체 형성의 발생을 위해 프로브와 표적 사이의 상보성 정도가 보다 커야 한다. 엄격성 정도는 온도, 이온강도, pH 및 포름아미드와 같은 부분 변성 용매의 존재 중 하나 이상에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 혼성화 엄격성은 반응 용액의 극성을 변경함으로써, 예를 들어, 0% 내지 50%의 범위 이내에서 포름아미드 농도의 조정을 통해 편리하게 변동된다. 검출가능한 결합을 위해 필요한 상보성 정도 (서열 동일성)는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격성에 따라 변동될 것이다. 상보성 정도는 최적으로는 100%, 또는 70-100%, 또는 그안의 임의의 범위 또는 값일 것이다. 그러나, 프로브 및 프라이머에서의 작은 서열 변이는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격성을 감소시켜 보상될 수 있음을 이해해야 한다.

RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 당업계에 공지되어 있고 과도한 실험을 실시하지 않으면서, 본 명세서에 제시된 교시 사항 및 지침을 기초로 하여 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

DNA 또는 RNA 증폭의 공지된 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 관련 증폭 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188호(Mullis, et al.); 제4,795,699호 및 제4,921,794호 (Tabor, et al); 제5,142,033호 (Innis); 제5,122,464호 (Wilson, et al.); 제5,091,310호 (Innis); 제5,066,584호 (Gyllensten, et al); 제4,889,818호 (Gelfand, et al); 제4,994,370호 (Silver, et al); 제4,766,067호 (Biswas); 제4,656,134호 (Ringold) 참조), 표적 서열에 대한 안티-센스 RNA를 이중 가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 사용하는 RNA 매개 증폭 (미국 특허 제5,130,238호(Malek, et al.), 상표명 NASBA)을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 이들 참고문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. (예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조한다).

예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 및 관련 유전자를 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 또한, PCR 및 기타 시험관내 증폭 방법은 예를 들어 발현되는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하고, 샘플 내의 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용하는 핵산을 제조하거나, 핵산 서열 결정 또는 기타 목적에 유용할 수 있다. 시험관내 증폭 방법을 통해 당업자에게 지시하기에 충분한 기술의 예는 문헌[Berger, 상기 문헌], 문헌[Sambrook, 상기 문헌], 및 문헌[Ausubel, 상기 문헌] 뿐만 아니라 미국 특허 제4,683,202호(Mullis, et al., 1987); 및 문헌[Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990)]에서 확인된다. 게놈 PCR 증폭을 위해 구매가능한 키트가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 어드밴티지-지씨 게노믹 PCR 키트(Advantage-GC Genomic PCR Kit) (클론테크(Clontech))를 참조한다. 추가로, 예를 들어, T4 유전자 32 단백질 (뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim))은 긴 PCR 생성물의 수율을 개선하기 위해 사용될 수 있다.

핵산 제조를 위한 합성 방법. 본 발명의 단리된 핵산은 또한 공지 방법에 의해 직접적인 화학적 합성으로 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., 상기 문헌] 참조). 화학적 합성은 일반적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하는데, 이는 상보성 서열과의 혼성화, 또는 단일 가닥을 주형으로서 사용하여 DNA 폴리머라제에 의한 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자라면 DNA의 화학적 합성이 약 100개 또는 이보다 많은 염기의 서열로 제한될 수 있는 반면, 보다 긴 서열은 더 짧은 서열의 라이게이션에 의해 얻어질 수 있음을 인식할 것이다.

재조합 발현 카세트. 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 추가로 제공한다. 본 발명의 핵산 서열, 예를 들어 본 발명의 항체를 코딩하는 cDNA 또는 게놈 서열은 적어도 하나의 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트 제조에 사용될 수 있다. 재조합 발현 카세트는 의도하는 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하는 전사 개시 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 일반적으로 포함할 것이다. 이종성 및 비-이종성 (즉, 내인성) 프로모터 모두가 본 발명의 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 프로모터, 인핸서, 또는 기타 요소로서 기능하는 단리된 핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향조절 또는 하향조절하기 위해 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 비-이종성 형태의 적절한 위치 (상류, 하류 또는 인트론 내)에서 도입될 수 있다. 예를 들어, 내인성 프로모터는 돌연변이, 결실, 및/또는 치환에 의해 생체내에서 또는 시험관내에서 변경될 수 있다.

벡터 및 숙주 세포. 본 발명은 또한, 당업계에 잘 공지된 바와 같이, 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터로 유전공학적으로 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 하나 이상의 항-TNF 항체의 생성에 관한 것이다. 예를 들어, 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Sambrook, et al., 상기 문헌]; 문헌[Ausubel, et al., 상기 문헌]을 참조한다.

폴리뉴클레오티드는 숙주 내에서 증식을 위한 선택가능한 마커를 함유하는 벡터에 선택적으로 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예를 들어 인산칼슘 침전물 내에, 또는 하전된 지질과의 복합체 내에 도입된다. 벡터가 바이러스일 경우, 적합한 패키징 (packaging) 세포주를 이용하여 시험관내에서 패키징된 후, 숙주 세포 내로 형질도입된다.

DNA 인서트는 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 발현 구조체는 전사 개시를 위한 부위, 종결을 위한 부위, 및 전사된 영역에서 번역을 위한 리보좀 결합 부위를 추가로 함유할 것이다. 구조체에 의해 발현된 성숙 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 번역되는 mRNA의 말단부에 적절하게 위치한, 처음의 번역 개시 부위 및 종결 코돈 (예를 들어, UAA, UGA, 또는 UAG)을 포함할 것이며, 포유류 또는 진핵세포 발현에는 UAA 및 UAG가 바람직하다.

발현 벡터는 바람직하게는 적어도 하나의 선택가능한 마커를 선택적으로 포함할 것이다. 이러한 마커는, 예를 들어 메토트렉세이트 (MTX), 다이하이드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR, 미국 특허 제4,399,216호; 제4,634,665호; 제4,656,134호; 제4,956,288호; 제5,149,636호; 제5,179,017호), 진핵세포 배양을 위한 암피실린, 네오마이신(G418), 마이코페놀산, 또는 글루타민 신테타아제(GS, 미국 특허 제5,122,464호; 제5,770,359호; 제5,827,739호) 내성 및 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 박테리아 또는 원핵세포에서의 배양을 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 유전자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다 (상기 특허는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨). 상기 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다. 적절한 벡터는 당업자에게 자명하다. 숙주 세포 내로의 벡터 구조체의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온 지질 매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Sambrook, 상기 문헌, Chapters 1-4 및 16-18]; 문헌[Ausubel, 상기 문헌, Chapters 1, 9, 13, 15, 16]과 같이, 당업계에 기재되어 있다.

본 발명의 적어도 하나의 항체는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현되고, 분비 신호뿐만 아니라 추가의 이종성 기능 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역은 정제 동안, 또는 후속 취급 및 저장 동안에 숙주 세포 내에서의 안정성 및 지속성을 개선시키기 위해 항체의 N-말단에 부가될 수 있다. 또한, 펩티드 부분(moiety)은 정제를 용이하게 하기 위해 본 발명의 항체에 부가될 수 있다. 상기 영역은 항체 또는 그의 적어도 하나의 단편의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예를 들어 문헌[Sambrook, 상기 문헌, Chapters 17.29-17.42 및 18.1-18.74]; 문헌[Ausubel, 상기 문헌, Chapters 16, 17 및 18]에 기재되어 있다.

당업자는 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산의 발현에 이용가능한 많은 발현 시스템을 잘 알 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 핵산은 본 발명의 항체를 코딩하는 내인성 DNA를 함유하는 숙주 세포 내에서 (조작에 의한) 턴온 (turn on)에 의해 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다. 그러한 방법은 예를 들어 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,580,734호, 제5,641,670호, 제5,733,746호, 및 제5,733,761호에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.

항체, 그의 특정 부분 또는 변이체의 생산에 유용한 세포 배양물의 예는 포유동물 세포이다. 포유류 세포 시스템은 종종 세포의 단일층 형태일 것이지만, 포유류 세포 현탁액 또는 생물반응기도 사용될 수 있다. 무손상 글리코실화 단백질을 발현할 수 있는 많은 적합한 숙주 세포주가 당업계에 개발되어 있고, COS-1 (예를 들어, ATCC CRL 1650), COS-7 (예를 들어, ATCC CRL1651), HEK293, BHK21 (예를 들어, ATCC CRL-10), CHO (예를 들어, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1 (예를 들어, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하고, 이들은 예를 들어 미국 버지니아주 매나서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection) (www.atcc.org)으로부터 쉽게 입수가능하다. 바람직한 숙주 세포는 림프구 기원의 세포, 예를 들어 골수종 및 림프종 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포 (ATCC 기탁 번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포 (ATCC 기탁 번호 CRL-1851)이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 또는 SP2/0-Ag14 세포이다.

이들 세포에 대한 발현 벡터는 하기 발현 조절 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다: 복제 기점; 프로모터 (예를 들어, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터 (미국 특허 제5,168,062호; 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk (포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터 (미국 특허 제5,266,491호), 하나 이상의 인간 면역글로불린 프로모터; 인핸서, 및/또는 가공 정보 부위, 예를 들어 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 (예를 들어, SV40 대형 T Ag 폴리 A 부가 부위), 및 전사 종결자 서열. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., 상기 문헌]; 문헌[Sambrook, et al., 상기 문헌]을 참조한다. 본 발명의 핵산 또는 단백질 생산에 유용한 다른 세포는 공지되어 있고/있거나, 예를 들어 세포주 및 하이브리도마의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 카탈로그(American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas) (www.atcc.org) 또는 다른 공지의 또는 상업적 공급원으로부터 이용가능하다.

진핵 숙주 세포가 사용될 경우, 폴리아데닐화 또는 전사 종결자 서열은 일반적으로 벡터에 통합된다. 종결자 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열이다. 전사체의 정확한 스플라이싱을 위한 서열도 포함될 수 있다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40으로부터의 VP1 인트론이다 (문헌[Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)]). 추가로, 숙주 세포 내의 복제를 조절하는 유전자 서열은 당업계에 공지된 바와 같이 벡터 내로 통합될 수 있다.

항체의 정제. 항-TNF 항체는 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되지 않는 잘 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")도 정제를 위해 사용될 수 있다 예를 들어, 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Colligan, Current Protocols in Immunology], 또는 문헌[Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), 예를 들어, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조하라.

본 발명의 항체는 천연 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포와 같은 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생성 절차에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 항체는 글리코실화되거나 또는 비-글리코실화될 수 있고, 글리코실화가 바람직하다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예를 들어 문헌[Sambrook, 상기 문헌, Sections 17.37-17.42]; 문헌[Ausubel, 상기 문헌, Chapters 10, 12, 13, 16, 18, 및 20], 문헌[Colligan, Protein Science, 상기 문헌, Chapters 12-14]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

항-TNF 항체

서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역 전부를 포함하는 본 발명의 단리된 항체는, 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 본 명세서에 개시된 항체 아미노산 서열, 또는 임의의 단리되거나 제조된 항체를 포함한다. 바람직하게는, 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 TNF에 결합하고, 이에 의해 부분적으로 또는 실질적으로 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성을 중화시킨다. 하나 이상의 TNF 단백질 또는 단편의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 바람직하게는 실질적으로 중화시키는 항체, 그의 특정 부분, 또는 변이체는 단백질 또는 단편에 결합함으로써, TNF 수용체에 대한 TNF의 결합을 통하거나 다른 TNF-의존성 또는 TNF-매개 메카니즘을 통해 매개되는 활성을 저해할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중화 항체"는 TNF-의존성 활성을 검정에 따라 약 20 내지 120%, 바람직하게는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 이상 저해할 수 있는 항체를 말한다. TNF-의존성 활성을 저해하는 항-TNF 항체의 능력은 바람직하게는 본 명세서에 기재되고/되거나 당업계에 공지된 바와 같이 하나 이상의 적합한 TNF 단백질 또는 수용체 검정에 의해 평가된다. 본 발명의 인간 항체는 임의의 종류 (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 등) 또는 아이소형일 수 있고, 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 인간 항체는 IgG 중쇄 또는 정의된 단편, 예를 들어, 아이소형, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중 하나 이상을 포함한다. 이 유형의 항체는, 본 명세서에 기재되고/되거나 당업계에 공지된 바와 같이 하나 이상의 인간 경쇄 (예를 들어, IgG, IgA) 및 IgM (예를 들어, γ1, γ2, γ3, γ4) 트랜스유전자를 포함하는 트랜스제닉 생쥐 또는 다른 트랜스제닉 비-인간 포유류를 사용함으로써 제조할 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 항-인간 TNF 인간 항체는 IgG1 중쇄 및 IgG1 경쇄를 포함한다.

본 발명의 하나 이상의 항체는 하나 이상의 TNF 단백질, 서브유닛, 단편, 부분, 또는 이들의 임의의 조합에 특이적인 하나 이상의 특정 에피토프에 결합한다. 하나 이상의 에피토프는 상기 단백질의 하나 이상의 부분을 포함하는 하나 이상의 항체 결합 영역을 포함할 수 있으며, 이 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 하나 이상의 세포외, 가용성, 친수성, 외부, 또는 세포질 부분으로 이루어진다. 하나 이상의 특정 에피토프는 서열 번호 9의 연속적인 아미노산의 1 내지 3개 이상의 아미노산 내지 전체 특정 부분의 하나 이상의 아미노산 서열의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 하나의 중쇄 가변 영역의 적어도 하나의 인간 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2 및 CDR3) 또는 변이체 및 적어도 하나의 경쇄 가변 영역의 적어도 하나의 인간 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2 및 CDR3) 또는 변이체를 포함하는 항원-결합 영역을 포함할 것이다. 비제한적인 예로서, 항체 또는 항원-결합 부분 또는 변이체는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 및/또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 상응하는 CDR 1, 2, 및/또는 3의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 번호 1, 2, 및/또는 3)을 갖는 하나 이상의 중쇄 CDR (즉, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3)의 적어도 일부를 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 다른 특정 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 부분 또는 변이체는 상응하는 CDR 1, 2, 및/또는 3의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 번호 4, 5, 및/또는 6)을 갖는 하나 이상의 경쇄 CDR (즉, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3)의 적어도 일부를 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 항체 또는 항원-결합 단편의 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR은 mAb TNV148, TNV14, TNV15, TNV196, TNV118, TNV32, TNV86 중 하나 이상의 상응하는 CDR의 아미노산 서열을 갖는다. 그러한 항체는 통상적인 기술을 사용하여 항체의 다양한 부분 (예를 들어, CDR, 프레임워크)을 함께 화학적으로 연결하거나, 통상의 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 항체를 암호화하는 (즉, 하나 이상의) 핵산 분자를 제조하고 발현시키거나 임의의 다른 적절한 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

항-TNF 항체는 정의된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시 형태에서, 항-TNF 항체는 선택적으로 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 중쇄 가변 영역 및/또는 선택적으로 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 인간 TNF에 결합하고 정의된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체는 적합한 방법, 예를 들어 파지 디스플레이 (문헌Katsube, Y., et al., Int J Mol. Med, 1(5):863-868(1998)]) 또는 당업계에 공지되고/되거나 본 명세서에 기재된 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 트랜스유전자 및 기능적으로 재배열될 수 있는 인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터의 DNA를 포함하는 트랜스유전자를 포함하는 트랜스제닉 생쥐를 인간 TNF 또는 그의 단편으로 면역화하여 항체의 생성을 유도할 수 있다. 필요한 경우, 항체 생산 세포가 단리될 수 있고, 하이브리도마 또는 다른 무한증식 항체-생산 세포는 본 명세서에 기재된 및/또는 당업계에 공지된 바와 같이 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체, 특정 부분 또는 변이체는 적합한 숙주 세포에서 코딩 핵산 또는 그의 일부를 사용하여 발현시킬 수 있다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체, 항원-결합 단편, 면역글로불린 사슬 및 CDR에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 항체 또는 항원-결합 단편 및 이러한 사슬 또는 CDR을 포함하는 항체는 고친화도 (예를 들어 약 10^-9 M 이하의 K_D)로 인간 TNF와 결합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환, 및 아미노산 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 제1 아미노산의 것과 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성 (예를 들어, 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)을 갖는 제2 아미노산에 의한 제1 아미노산의 대체를 말한다. 보존적 치환은 하나의 아미노산의 하기 군 내의 다른 아미노산에 의한 대체를 포함한다: 라이신 (K), 아르기닌 (R), 및 히스티딘 (H); 아스파테이트 (D) 및 글루타메이트 (E); 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 티로신 (Y), K, R, H, D, 및 E; 알라닌 (A), 발린 (V), 류신 (L), 아이소류신 (I), 프롤린 (P), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 메티오닌 (M), 시스테인 (C), 및 글라이신 (G); F, W, 및 Y; C, S, 및 T.

아미노산 코드. 본 발명의 항-TNF 항체를 구성하는 아미노산은 종종 약어로 표시된다. 아미노산 표기는 당업계에서 잘 이해되는 바와 같이 아미노산을 그의 1문자 코드, 그의 3문자 코드, 명칭, 또는 3 뉴클레오티드 코돈(들)에 의해 표시될 수 있다 (문헌[Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc.,New York, 1994] 참조):

본 발명의 항-TNF 항체는 본 명세서에 특정된 바와 같이 천연 돌연변이 또는 인간에 의한 조작으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 포함할 수 있다.

물론, 숙련자에 의해 생성되는 아미노산 치환의 수는 상기 기재된 것을 포함하는 다수의 인자에 따라 달라진다. 일반적으로 말하면, 임의의 주어진 항-TNF 항체, 단편 또는 변이체에 대한 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실의 수는 본 명세서에 특정된 바와 같이 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 이하, 예를 들어 1 내지 30개 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값 이하일 것이다.

기능에 필수적인 본 발명의 항-TNF 항체의 아미노산은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발 (예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌, Chapters 8, 15]; 문헌[Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)])에 의해 동정할 수 있다. 후자의 절차는 분자 내의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이어서, 생성되는 돌연변이 분자를 하나 이상의 TNF 중화 활성과 같지만 이에 한정되지 않는 생물학적 활성에 대해 시험한다. 항체 결합에 결정적인 부위는 또한 결정화, 핵자기 공명, 또는 광친화도 표지화 (문헌[Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)] 및 문헌[de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)])와 같은 구조 분석에 의해 동정될 수 있다.

본 발명의 항-TNF 항체는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 중 하나 이상의 연속된 아미노산 중 1개 내지 전부로부터 선택된 하나 이상의 부분, 서열, 또는 조합을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.

추가로, 항-TNF 항체는 서열 번호 7, 8 중 하나 이상의 연속된 아미노산의 70 내지 100% 중 하나 이상의 폴리펩티드를 선택적으로 포함할 수 있다.

일 실시 형태에서, 면역글로불린 사슬, 또는 그의 부분 (예를 들어 가변 영역, CDR)의 아미노산 서열은 서열 번호 7, 8 중 하나 이상의 상응하는 사슬의 아미노산 서열에 대해 약 70 내지 100%의 동일성 (예를 들어, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)을 갖는다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 8의 서열과 비교할 수 있거나, 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 7과 비교할 수 있다. 바람직하게는, 70 내지 100%의 아미노산 서열 동일성(즉, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)을 당업계에 공지된 바와 같이 적합한 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 결정한다.

예시적인 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열이 서열 번호 7, 8에 제공되어 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 특정 변이체는 본 발명의 항체로부터의 임의의 수의 연속된 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 여기서 그 수는 항-TNF 항체 내의 연속된 잔기의 수의 10 내지 100%로 이루어진 정수의 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 연속된 아미노산의 상기 하위서열(subsequence)의 길이는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250개 이상의 아미노산 또는 그 범위 내의 임의의 범위 또는 값이다. 추가로 상기 하위서열의 수는 1 내지 20, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 또는 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 정수일 수 있다.

당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 항체를 포함한다. 생물학적으로 활성인 항체는 천연 (비-합성) 내인성의 또는 관련된 그리고 공지된 항체의 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 또는 95%-100%의 비활성을 갖는다. 효소 활성 및 기질 특이성을 분석하는 방법 및 정량화하는 수단이 당업자에게 잘 알려져 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 유기 모이어티의 공유 부착에 의해 변형된, 본 명세서에 기재된 인간 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 이러한 변형은 약동학적 특성이 개선된 (예를 들어, 증가된 생체내 혈청 반감기) 항체 또는 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 유기 모이어티는 선형 또는 분지형 친수성 중합체기, 지방산기, 또는 지방산 에스테르기일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 친수성 중합체기는 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있고, 폴리알칸 글리콜 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG)), 탄수화물 중합체, 아미노산 중합체 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르기는 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.

본 발명의 변형된 항체 및 항원-결합 단편은 항체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 하나 이상의 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 결합되는 각각의 유기 모이어티는 독립적으로 친수성 중합체기, 지방산기 또는 지방산 에스테르기일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지방산"은 모노-카르복실산 및 다이-카르복실산을 포함한다. "친수성 중합체기"는 이 용어가 본 명세서에서 사용될 때 옥탄보다 물에 더 가용성인 유기 중합체를 말한다. 예를 들어, 폴리라이신은 옥탄 중에서보다 물 중에서 더 가용성이다. 따라서, 폴리라이신의 공유부착에 의해 변형된 항체가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체의 변형에 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들어 폴리알칸 글리콜 (예를 들어, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜 (mPEG), PPG 등), 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란, 셀룰로오스, 올리고당, 다당류 등), 친수성 아미노산의 중합체 (예를 들어, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트 등), 폴리알칸 옥사이드 (예를 들어, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 변형시키는 친수성 중합체는 별개의 분자 엔티티 (entity)로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들어, PEG₅₀₀₀ 및 PEG_20,000 (여기서, 아래첨자는 중합체의 평균 분자량 (달톤)임)이 사용될 수 있다. 친수성 중합체기는 1 내지 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르기로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르기로 치환된 친수성 중합체를 적합한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 커플링될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트(예를 들어, N,N-카르보닐 다이이미다졸로 활성화됨)는 중합체 상의 히드록실기와 커플링될 수 있다.

본 발명의 항체 변형에 적합한 지방산과 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체 변형에 적합한 지방산은, 예를 들어 n-도데카노에이트 (C₁₂, 라우레이트), n-테트라데카노에이트 (C₁₄, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트 (C₁₈, 스테아레이트), n-에이코사노에이트 (C₂₀, 아라키데이트), n-도코사노에이트 (C₂₂, 베헤네이트), n-트라이아콘타노에이트 (C₃₀), n-테트라콘타노에이트 (C₄₀), 시스-Δ9-옥타데카노에이트 (C₁₈, 올레에이트), 모든 시스-Δ5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트 (C₂₀, 아라키도네이트), 옥탄다이오산, 테트라데칸다이오산, 옥타데칸다이오산, 도코산다이오산 등을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르는 선형 또는 분지형 저급 알킬기 포함하는 다이카르복실산의 모노-에스테르를 포함한다. 저급 알킬기는 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1 내지 약 6개의 탄소원자를 포함할 수 있다.

변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법, 예를 들어 하나 이상의 변형제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. "변형제"는 이 용어가 본 명세서에서 사용될 때, 활성화기를 포함하는 적합한 유기기 (예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)를 말한다. "활성화기"는 적합한 조건 하에 제2 화학기와 반응하여 변형제와 제2 화학기 사이의 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 모이어티 또는 작용기이다. 예를 들어, 아민-반응성 활성화기는 토실레이트, 메실레이트, 할로 (클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-하이드록시석신이미딜 에스테르 (NHS) 등과 같은 친전자성 기를 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화기는 예를 들어 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴롤일, 피리딜 다이설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올 (TNB-티올) 등을 포함한다. 알데히드 작용기는 아민- 또는 히드라지드-함유 분자에 커플링될 수 있고, 아지드기는 3가 인기와 반응하여 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 연결을 형성할 수 있다. 활성화 기를 분자 내로 도입하기에 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)] 참조). 활성화 기는 유기기 (예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접 결합되거나, 링커 모이어티, 예를 들어 2가 C₁ 내지 C₁₂ 기 (여기서, 하나 이상의 탄소 원자는 산소, 질소, 또는 황과 같은 헤테로원자에 의해 대체될 수 있음)를 통해 결합될 수 있다. 적합한 링커 모이어티는, 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, -(CH₂)₃-, -NH-(CH₂)₆-NH-, -(CH₂)₂-NH-, 및 -CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH-NH-를 포함한다. 링커 모이어티를 포함하는 변형제는, 예를 들어 모노-Boc-알킬다이아민 (예를 들어, 모노-Boc-에틸렌다이아민, 모노-Boc-다이아미노헥산)을 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카르보다이이미드 (EDC)의 존재 하에 지방산과 반응시켜 유리 아민과 지방산 카르복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 기재된 바와 같이 다른 카르복실레이트에 커플링될 수 있거나, 말레산 무수물과 반응시키고 생성되는 산물을 환화하여 지방산의 활성화 말레이미도 유도체를 제조할 수 있는 1차 아민을 노출시키기 위해, 트라이플루오로아세트산 (TFA)으로 처리함으로써 산물로부터 Boc 보호기를 제거할 수 있다. (예를 들어, 그 전체 교시 내용이 본 명세서에 참고로 포함되는 국제특허 공개 WO 92/16221호 (Thompson, et al.)를 참조한다.)

본 발명의 변형된 항체는 인간 항체 또는 항원-결합 단편을 변형제와 반응시켜 제조될 수 있다. 예를 들어, 유기 모이어티는 아민-반응성 변형제, 예를 들어 PEG의 NHS 에스테르를 사용함으로써 부위 비-특이적 방식으로 항체에 결합될 수 있다. 변형된 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 항체 또는 항원-결합 단편의 다이설파이드 결합 (예를 들어, 사슬내 다이설파이드 결합)을 환원시킴으로써 제조될 수 있다. 이어서, 환원된 항체 또는 항원-결합 단편을 티올-반응성 변형제와 반응시켜 본 발명의 변형된 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 항체의 특이적인 부위에 결합되는 유기 모이어티를 포함하는 변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법, 예를 들어 역 단백질 분해 (reverse proteolysis) (문헌[Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992)]; 문헌[Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994)]; 문헌[Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997)]; 문헌[Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996)]; 문헌[Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)]), 및 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)]에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

항- Tnf 항체 조성물에 대한 항- 개별특이형 항체. 단클론 또는 키메라 항-TNF 항체에 부가하여, 본 발명은 또한 본 발명의 이러한 항체에 특이적인 항-개별특이형 (항-Id) 항체에 관한 것이다. 항-Id 항체는 일반적으로 다른 항체의 항원-결합 부위에 연관된 특유한 결정자를 인식하는 항체이다. 항-Id는 Id 항체의 공급원으로서 동일한 종 및 유전형 (예를 들어, 생쥐 주)의 동물을 항체 또는 그의 CDR 함유 영역으로 면역화하여 제조할 수 있다. 면역화 동물은 면역화 항체의 개별특이형 결정자를 인식하고 반응하여 항-Id 항체를 생성할 것이다. 항-Id 항체는 또한 소위 항-항-Id 항체를 생산하는, 다른 동물에서의 면역 반응을 유발하도록 "면역원"으로 사용될 수 있다.

항-Tnf 항체 조성물. 본 발명은 또한, 비-자연발생 조성물, 혼합물, 또는 형태로 제공되는, 본 명세서에 기재되고/되거나 당업계에 공지된 바와 같은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 더 많은 항-TNF 항체를 포함하는 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8의 연속된 아미노산의 70 내지 100%, 또는 그의 특정 단편, 도메인, 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 항-TNF 항체 아미노산 서열의 1개 이상 또는 2개의 전장, C- 및/또는 N-말단 결실 변이체, 도메인, 단편, 또는 특정 변이체를 포함하는 비-자연발생 조성물을 포함한다. 바람직한 항-TNF 항체 조성물은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 70 내지 100%의 항-TNF 항체 서열의 부분, 또는 그의 특정 단편, 도메인, 또는 변이체의 하나 이상의 CDR 또는 LBR 함유 부분으로서 1개 이상 또는 2개의 전장, 단편, 도메인, 또는 변이체를 포함한다. 더욱 바람직한 조성물은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 70 내지 100%, 또는 그의 특정 단편, 도메인, 또는 변이체 중 하나 이상의 40 내지 99%를 포함한다. 이러한 조성 백분율은 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 액체 또는 무수 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀젼, 또는 콜로이드로서 중량, 부피, 농도, 몰 농도, 몰랄 농도를 기준으로 한다.

본 발명의 항-TNF 항체 조성물은 이러한 조절, 치료, 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 또는 약학 조성물의 하나 이상의 임의의 적합한 유효량을 추가로 포함할 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 TNF 길항제 (예를 들어 (이에 한정되지 않음), TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 그의 단편, 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류머티즘제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타너셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노마이드, 술파살진), 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제 (예를 들어, 아미노글리코시드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤리드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 다른 항미생물제), 건선치료제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 당뇨병 관련 약제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴 (예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀 (예를 들어, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀 (GM-CSF, Leukine), 면역제, 면역글로불린, 면역억제제 (예를 들어, 바실릭시맙, 사이클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사물질, 유사분열 저해제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조병제, 항정신병약, 불안 완화제, 수면제, 교감신경흥분제, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 저해제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나제 알파 (Pulmozyme), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 사이토카인의 비제한적인 예는 IL-1 내지 IL-23 중 임의의 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 적절한 투여량은 당업계에 공지되어 있다 예를 들어, 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2^nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000)]; 문헌[PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000)]을 참조하며, 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

또한, 상기 항암제 또는 항감염제는 적어도 하나의 본 발명의 항체와 회합, 결합, 공동-제형화 또는 공동 투여되는 독소 분자를 포함할 수 있다. 독소는 선택적으로 병원 세포 또는 조직을 선택적으로 죽이는 작용을 할 수 있다. 병원 세포는 암 또는 다른 세포일 수 있다. 상기 독소는 독소의 적어도 하나의 기능적 세포독성 도메인, 예를 들어 리신, 디프테리아 독소, 뱀독소, 또는 박테리아 독소 중 하나 이상으로부터 선택된 것을 포함하는 정제된 또는 재조합 독소 또는 독소 단편일 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 용어 "독소"는 인간 및 기타 포유동물에서 죽음에 이를 수도 있는 독소 쇼크를 포함하는 임의의 병태를 일으킬 수 있는 임의의 자연 발생, 돌연변이 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스에 의해 생성되는 내독소 및 외독소를 모두 포함한다. 이러한 독소는 장독성 이. 콜라이 열-불안정성 장독소 (LT), 열-안정성 장독소 (ST), 시겔라 (Shigella) 세포독소, 아에로모나스 (Aeromonas) 장독소, 독성 쇼크 증후군 독소-1 (TSST-1), 스타필로코커스 장독소 A (SEA), B (SEB), 또는 C (SEC), 스트렙토코커스 장독소 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 박테리아는 장독성 이. 콜라이 (ETEC), 장출혈성 이. 콜라이 (예를 들어, 혈청형 0157의 균주:H7), 스타필로코커스 종 (예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 파이오젠스 (Staphylococcus pyogenes)), 시겔라 종 (예를 들어, 시겔라 다이센테리아 (Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 시겔라 보이디 (Shigella boydii), 및 시겔라 손네이 (Shigella sonnei), 살모넬라 (Salmonella) 종(예를 들어, 살모넬라 타이피 (Salmonella typhi), 살모넬라 콜레라-수이스 (Salmonella cholera-suis), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis)), 클로스트리디움 (Clostridium) 종 (예를 들어, 클로스트리디움 페르프린젠스 (Clostridium perfringens), 클로스트리디움 디피실 (Clostridium dificile), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)), 캄포박터 (Camphlobacter) 종 (예를 들어, 캄포박터 제주니 (Camphlobacter jejuni), 캄포박터 페투스 (Camphlobacter fetus)), 헬리코박터 (Heliocbacter) 종, (예를 들어, 헬리코박터 파일로리 (Heliocbacter pylori)), 아에로모나스 (Aeromonas) 종 (예를 들어, 아에로모나스 소브리아 (Aeromonas sobria), 아에로모나스 하이드로필라 (Aeromonas hydrophila), 아에로모나스 카비아 (Aeromonas caviae)), 플레이소모나스 시겔로이데스 (Pleisomonas shigelloides), 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 비브리오 (Vibrio) 종 (예를 들어, 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스 (Vibrio parahemolyticus)), 클렙시엘라 (Klebsiella) 종, 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토코키(Streptococci)의 종의 균주를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990)]; 문헌[Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991)]; 문헌[Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, New York (1990)]; 문헌[Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992]; 문헌[Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991)]; 문헌[Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990)]을 참조하며, 이들 참고문헌의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 항-TNF 항체 화합물, 조성물, 또는 조합은 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 어쥬번트 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 보조제 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 보조제가 바람직하다. 이러한 무균 용액의 제조 방법의 비제한적인 예는 문헌[Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990]과 같이 (이에 한정되지 않음) 당업계에 잘 공지되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 잘 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 항-TNF 항체, 단편, 또는 변이체 조성물의 투여 양식, 용해도, 및/또는 안정성에 적합한 것으로 일상적으로 선택될 수 있다.

본 조성물에 유용한 약학적 부형제 및 첨가제는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물 (예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 및 올리고당류를 포함하는 당; 유도체화된 당, 예를 들어 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등; 및 다당류 또는 당 중합체)을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 이는 단독으로 또는 조합하여 중량 또는 부피 기준으로 1 내지 99.99%를 차지하면서 단독으로 또는 조합으로 존재할 수 있다. 예시적인 단백질 부형제는 인간 혈청 알부민 (HSA), 재조합 인간 알부민 (rHA), 젤라틴, 카제인 등과 같은 혈청 알부민을 포함한다. 완충 용량에서도 기능할 수 있는 대표적인 아미노산/항체 성분은 알라닌, 글라이신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 류신, 아이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함한다. 바람직한 아미노산은 글라이신이다.

본 발명에 사용하기에 적합한 탄수화물 부형제는, 예를 들어, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등과 같은 단당류; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로바이오스 등과 같은 이당류; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등과 같은 다당류; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨 (글루시톨), 마이오이노시톨 등과 같은 알디톨을 포함한다. 본 발명에 사용하기 바람직한 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스, 및 라피노스이다.

항-TNF 항체 조성물은 또한 완충제 또는 pH 조절제를 포함할 수 있으며; 전형적으로, 완충제는 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충제는 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 석신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염과 같은 유기산 염; 트리스, 트로메타민 염산, 또는 인산염 완충제를 포함한다. 본 조성물에서 사용하기 바람직한 완충제는 시트레이트와 같은 유기산 염이다.

부가적으로, 본 발명의 항-TNF 항체 조성물은 폴리비닐피롤리돈, 피콜 (중합 당), 덱스트레이트 (예를 들어, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린과 같은 사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향료, 항미생물제, 감미제, 항산화제, 대전방지제, 계면활성제 (예를 들어, "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80"과 같은 폴리소르베이트), 지질 (예를 들어, 인지질, 지방산), 스테로이드 (예를 들어, 콜레스테롤), 및 킬레이팅제 (예를 들어, EDTA)와 같은 중합체 부형제/첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항-TNF 항체, 부분, 또는 변이체 조성물에 사용하기 적합한 이들 및 부가적인 공지의 약학적 부형제 및/또는 첨가제는 예를 들어 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19^th ed., Williams & Williams, (1995)] 및 문헌["Physician's Desk Reference", 52^nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998)]에 열거된 바와 같이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 문헌의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물 (예를 들어, 당류 및 알디톨) 및 완충제 (예를 들어, 시트레이트) 또는 중합체 물질이다.

제형. 상기한 바와 같이, 본 발명은 안정한 제형을 제공하며, 이는 바람직하게는 식염수 또는 선택된 염을 가진 인산염 완충제 뿐만 아니라, 보존된 용액 및 보존제를 함유하는 제형 뿐만 아니라, 약학적 또는 수의학적 용도에 적합한 다용도의 보존된 제형이고, 약학적으로 허용가능한 제형 내에 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함한다. 보존된 제형은 하나 이상의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 페닐머큐릭 니트라이트, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 염화마그네슘 (예를 들어, 육수화물), 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살, 또는 수성 희석제 중의 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택적으로 선택된 하나 이상의 공지된 보존제를 함유한다. 임의의 적합한 농도 또는 혼합물, 예를 들어 0.001-5%, 또는 그 범위 내의 임의의 범위 또는 값, 예를 들어 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 그 범위 내의 임의의 범위 또는 값 (이에 한정되지 않음)이 당업계에 공지된 바대로 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 보존제를 포함하지 않거나, 0.1 내지 2% m-크레졸 (예를 들어, 0.2, 0.3. 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1 내지 3% 벤질 알코올 (예를 들어, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001 내지 0.5% 티메로살 (예를 들어, 0.005, 0.01), 0.001 내지 2.0% 페놀 (예를 들어, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005 내지 1.0% 알킬파라벤(들) (예를 들어, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) 등을 포함한다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 포장 재료, 및 선택적으로 수성 희석제 중의 처방된 완충제 및/또는 보존제와 함께 하나 이상의 항-TNF 항체의 용액을 포함하는 하나 이상의 바이알을 포함하는 제조 물품을 제공하며, 여기서 상기 포장 재료는 이러한 용액이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72시간 이상의 기간에 걸쳐 유지될 수 있음을 표시하는 라벨을 포함한다. 본 발명은 포장 재료, 및 동결건조된 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 제1 바이알, 및 처방된 완충제 또는 보존제의 수성 희석제를 포함하는 제2 바이알을 포함하는 제조 물품을 추가로 포함하고, 상기 포장 재료는 하나 이상의 항-TNF 항체를 수성 희석제 중에 재구성하여 24시간 이상의 기간에 걸쳐 유지될 수 있는 용액을 형성하도록 환자에게 지시하는 라벨을 포함한다.

본 발명에 따라 사용되는 하나 이상의 항-TNF 항체는 포유류 세포 또는 트랜스제닉 제제에 의한 것을 포함하는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있거나, 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 바와 같은 다른 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다.

본 발명의 제품에서 하나 이상의 항-TNF 항체의 범위는 재구성시에, 습윤/건조 시스템의 경우, 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 1000 mg/ml 농도를 생성하는 양을 포함하지만, 더 낮거나 높은 농도가 사용가능하고 의도하는 전달 비히클에 의존적인데, 예를 들어 용액 제형은 경피 패치, 폐, 경점막, 또는 삼투압 또는 마이크로 펌프 방법과는 상이할 것이다.

바람직하게는, 선택적으로 수성 희석제는 약학적으로 허용가능한 보존제를 추가로 포함한다. 바람직한 보존제는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 제형 내에 사용되는 보존제의 농도는 항-미생물 효과를 내기에 충분한 농도이다. 그러한 농도는 선택된 보존제에 따라 결정되고, 당업자에 의해 쉽게 결정된다.

다른 부형제, 예를 들어 등장화제, 완충제, 항산화제, 보존성 증강제는 선택적으로 바람직하게는 희석제에 첨가된다. 글리세린과 같은 등장화제는 공지된 농도에서 통상 사용된다. 생리학상 허용되는 완충제는 바람직하게는 향상된 pH 제어를 제공하기 위해 첨가된다. 제형은 약 pH 4 내지 약 pH 10과 같은 넓은 범위의 pH를 포함할 수 있고, 바람직한 범위는 약 pH 5 내지 약 pH 9이고, 가장 바람직한 범위는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 바람직하게는 본 발명의 제형은 약 6.8 내지 약 7.8의 pH를 갖는다. 바람직한 완충제는 인산염 완충제, 가장 바람직하게는 인산나트륨, 특히 인산 완충 식염수 (PBS)를 포함한다.

약학적으로 허용가능한 가용화제, 예를 들어 Tween 20 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), Tween 40 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트), Tween 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트), Pluronic F68 (폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체), 및 PEG (폴리에틸렌 글리콜) 또는 폴리소르베이트 20 또는 80 또는 폴록사머 184 또는 188, Pluronic® 폴리올과 같은 비이온성 계면활성제, 다른 블록 공중합체, 및 EDTA 및 EGTA 같은 킬레이팅제와 같은 다른 첨가제가 응집을 감소시키기 위해 제형 또는 조성물에 선택적으로 첨가될 수 있다. 이들 첨가제는 펌프 또는 플라스틱 용기가 제형을 투여하기 위해 사용될 경우에 특히 유용하다. 약학적으로 허용가능한 계면활성제의 존재는 단백질 응집 성향을 완화시킨다.

본 발명의 제형은 하나 이상의 항-TNF 항체를, 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살 또는 수성 희석제 중의 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 보존제와 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 중의 보존제와 하나 이상의 항-TNF 항체를 혼합하는 단계는 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 실행한다. 적합한 제형을 제조하기 위해, 예를 들어, 측정된 양의 완충제 용액 내의 하나 이상의 항-TNF 항체를 원하는 농도의 단백질 및 보존제를 제공하기에 충분한 양의 완충제 용액 내의 원하는 보존제와 조합한다. 이 방법의 변형법은 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제 사용 여부, 제형 제조 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 인자이다.

청구되는 제형은 투명한 용액으로서, 또는 물, 보존제, 및/또는 부형제, 바람직하게는 인산염 완충제 및/또는 식염수 및 선택된 염을 수성 희석제 중에 함유하는 제2 바이알로 재구성되는, 동결건조된 하나 이상의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성을 요구하는 이중 바이알은 여러 번 재사용될 수 있고 단일 또는 여러 사이클의 환자 치료에 충분하고 따라서 현재 사용되는 것보다 더 편리한 치료 요법을 제공할 수 있다.

본 발명에서 특허 청구되는 제조 물품은 즉시 내지 24시간 또는 그 이상에 걸쳐 투여하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명에서 특허 청구되는 제조 물품은 환자에 상당한 이점을 준다. 본 발명의 제형은 선택적으로 약 2 내지 약 40℃의 온도에서 안전하게 보관될 수 있고, 연장된 시간 동안 단백질의 생물학적 활성을 유지하고, 따라서 용액이 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 또는 96시간 또는 그 이상에 걸쳐 유지 및/또는 사용될 수 있음을 표시하는 포장 라벨을 사용할 수 있다. 보존된 희석제가 사용된 경우, 상기 라벨은 1-12달, 반년, 1년 반, 및/또는 2년의 사용을 포함할 수 있다.

본 발명에서 하나 이상의 항-TNF 항체의 용액은 수성 희석제에 하나 이상의 항체를 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 혼합은 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행한다. 적합한 희석제를 제조하기 위하여, 예를 들어 물 또는 완충제 중의 측정된 양의 적어도 하나의 항체를 단백질 및 선택적으로 보존제 또는 완충제를 요구되는 농도로 제공하기에 충분한 양으로 배합된다. 이 방법의 변형법은 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제 사용 여부, 제형 제조 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 인자이다.

청구되는 제품은 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는, 동결건조된 하나 이상의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성될 필요가 있는 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고 환자 치료의 단일 또는 여러 사이클을 충족시킬 수 있고 따라서 현재 이용할 수 있는 것보다 더 편리한 치료 요법을 제공하다.

청구되는 제품은 투명한 용액, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는, 동결건조된 하나 이상의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알을 약국, 병원, 또는 다른 기관 및 기구에 제공함으로써 환자에게 간접적으로 제공될 수 있다. 이 경우 투명한 용액은 1리터 이상의 크기일 수 있고, 이는 소량의 바이알에 전달하기 위해 그로부터 소량의 적어도 하나의 항체 용액이 1회 또는 다수회 회수될 수 있고 약국 또는 병원에 의해 고객 및/또는 환자에게 제공될 수 있는 큰 저장고를 제공한다.

이들 단일 바이알 시스템을 포함하는 승인된 장치는 BD Pens, BD Autojector^®, Humaject^®, NovoPen^®, B-D^®Pen, AutoPen^®, 및 OptiPen^®, GenotropinPen^®, Genotronorm Pen^®, Humatro Pen^®, Reco-Pen^®, Roferon Pen^®, Biojector^®, iject^®, J-tip Needle-Free Injector^®, Intraject^®, Medi-Ject^®와 같은 용액의 전달을 위한 펜-인젝터 장치를 포함하며, 예를 들어, 벡톤 디킨슨(Becton Dickensen) (뉴저지주 프랭클린 레이크스, www.bectondickenson.com), 디세트로닉(Disetronic) (스위스 부크크도르프, www.disetronic.com); 오레곤주 포틀랜드 소재의 바이오젝트(Bioject) (www.bioject.com); 내셔날 메디칼 프로덕츠 (National Medical Products), 웨스톤 메디칼(Weston Medical) (영국 피터버러, www.weston-medical.com), 메디-젝트 코포레이션 (Medi-Ject Corp) (미네소타주 미니애폴리스, www.mediject.com)에 의해 제조되거나 개발된 바와 같다. 이중 바이알 시스템을 포함하는 승인된 장치는 HumatroPen^®과 같은 재구성 용액의 전달을 위한 카트리지 내의 동결건조된 약물을 재구성하기 위한 펜-인젝터 시스템을 포함한다.

본 발명에서 특허 청구되는 제품은 패키징 재료를 포함한다. 패키징 재료는 규제 당국에 의해 요구되는 정보 이외에 제품을 사용할 수 있는 조건을 제공한다. 본 발명의 포장 재료는 2개의 바이알, 습윤/건식 제품에 대해 하나 이상의 항-TNF 항체를 수성 희석제에 재구성하여 용액을 형성하고 용액을 2 내지 24시간 이상의 기간에 걸쳐 사용하도록 하는 설명서를 환자에게 제공한다. 단일 바이알, 용액 제품에 대하여, 라벨은 상기 용액을 2-24시간 이상의 기간에 걸쳐 사용할 수 있음을 나타낸다. 본 발명에서 특허 청구되는 제품은 인간의 제약 제조 물품 용도로 유용하다.

본 발명의 제형은 하나 이상의 항-TNF 항체 및 선택된 완충제, 바람직하게는 식염수 또는 선택된 염을 함유하는 인산염 완충제와 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 중에 하나 이상의 항체 및 완충제를 혼합하는 단계는 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 실행된다. 적합한 제형을 제조하기 위하여, 예를 들어 물 또는 완충제 중의 측정된 양의 적어도 하나의 항체를, 요구되는 농도의 단백질 및 완충제를 제공하기 충분한 양의 물 중의 요구되는 완충제와 혼합한다. 이 방법의 변형법은 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제 사용 여부, 제형 제조 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 인자이다.

청구되는 안정하거나 보존된 제형은 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제 중의 보존제 또는 완충제 및 부형제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는, 동결건조된 하나 이상의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성될 필요가 있는 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고 환자 치료의 단일 또는 여러 사이클을 충족시킬 수 있고 따라서 현재 이용할 수 있는 것보다 더 편리한 치료 요법을 제공하다.

본 명세서에 기재된 안정하거나 보존된 제형 또는 용액 중의 하나 이상의 항-TNF 항체는 SC 또는 IM 주사; 경피, 폐, 경점막, 임플란트, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프, 또는 당업계에 잘 공지된 바와 같이 당업자에게 인정되는 다른 수단을 포함하는 다양한 전달 방법을 통해 본 발명에 따라 환자에게 투여될 수 있다.

치료적 응용. 본 발명은 또한, 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 하나 이상의 이중 인테그린 항체를 사용하여 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 하나 이상의 TNF 관련 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 비만, 면역 관련 질환, 심혈관 질환, 감염성 질환, 악성 질환, 또는 신경 질환 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 TNF 관련 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 류머티스 관절염, 연소성, 전신 발현 연소성 류머티스 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염, 위궤양, 혈청 음성 관절병증, 골관절염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 전신 홍반성 루푸스, 항인지질 증후군, 홍채섬모체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐섬유증, 전신 혈관염/베게너 육아종증, 유육종증, 고환염/정관 절제술 역전 절차, 알레르기성/아토피성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 습진, 알레르기 접촉 피부염, 알레르기 결막염, 과민성 폐렴, 이식, 기관이식 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 전신 염증성 반응 증후군, 폐혈증 증후군, 그람 양성 패혈증, 그람 음성 패혈증, 배양 음성 패혈증, 진균성 패혈증, 호중구감소성 열, 요로성 패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 전리방사선 노출, 급성 췌장염, 성인성 호흡곤란 증후군, 알코올-유도성 간염, 만성 염증성 병, 유육종증, 크론 (Crohn) 병, 겸상적혈구성 빈혈, 당뇨, 신증, 아토피성 질환, 과민 반응, 알레르기성 비염, 고초열, 다년성 비염, 결막염, 자궁내막증, 천식, 담마진, 전신성 아나필락시스, 피부염, 악성 빈혈, 용혈성 질환, 혈소판 감소증, 임의의 기관 또는 조직의 이식편 거부반응, 신장 이식 거부반응, 심장 이식 거부반응, 간 이식 거부반응, 췌장 이식 거부반응, 폐 이식 거부반응, 골수이식 (BMT) 거부반응, 피부 동종이식 거부반응, 연골 이식 거부반응, 뼈 이식 거부반응, 소장 이식 거부반응, 태아 흉선 임플란트 거부반응, 부갑상선 이식 거부반응, 임의의 기관 또는 조직의 이종이식 거부반응, 동종이식 거부반응, 항-수용체 과민반응, 그레이브스 (Graves) 병, 레이노 (Raynoud)병, B형 인슐린-내성 당뇨병, 천식, 중증 근무력증, 항체 관련성 세포독성, III형 과민반응, 전신 홍반성 루푸스, POEMS 증후군 (다발성 신경병증, 기관거대증, 내분비병증, 단일클론 감마병증, 및 피부변성 증후군), 다발성 신경병증, 기관거대증, 내분비병증, 단일클론 감마병증, 피부변성 증후군, 항인지질 증후군, 천포창, 피부경화증, 혼재성 결합조직 질환, 특발성 애디슨 (Addison) 병, 당뇨병, 만성 활성 간염, 원발성 담낭 경변증, 백반, 혈관염, MI후 심장절개 증후군, IV형 과민증, 접촉성 피부염, 과민성 폐렴, 동종이식 거부반응, 세포내 유기체에 의한 흑색종, 약물 과민증, 대사성/특발성, 윌슨 (Wilson) 병, 혈색소증, 알파-1-항트립신 결핍증, 당뇨병성 망막병증, 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염, 골다공증, 원발성 담즙성 경화증, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭성 섬유증, 신생아 만성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 가족성 혈구탐식성 림프조직구증, 피부이상, 건선, 탈모증, 신증후군, 신장염, 사구체신염, 급성 신부전증, 혈액투석, 요독증, 독성, 자간전증, okt3 치료법, 항-cd3 치료법, 사이토카인 치료법, 화학요법, 방사선 요법 (예를 들어, 토스트헤니아 (toasthenia), 빈혈, 악액질 등을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 만성 살리실레이트 중독 등 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 면역 관련 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 각각이 전체적으로 참고로 포함된 문헌[Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999)], 문헌[Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000)]을 참조하라.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 심장 기절 (cardiac stun) 증후군, 심근경색증, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 출혈, 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 재협착, 당뇨병성 동맥경화성 질환, 고혈압, 동맥성 고혈압, 신혈관성 고혈압, 실신, 쇼크, 심혈관계 매독, 심부전, 폐심장증, 원발성 폐고혈압, 심부정맥, 이소성 심방 박동, 심방 조동, 심방 세동 (지속성 또는 일과성), 관류후 증후군, 심폐 바이패스 염증 반응, 혼돈성 또는 다소성 심방 빈맥, 규칙적인 좁은 QRS 빈맥, 특정 부정맥, 심실세동, 히스 다발 (His bundle) 부정맥, 방실 차단, 다발 갈래 차단, 심근 허혈 장애, 관상 동맥 질환, 협심증, 심근경색증, 심근병증, 확장형 울혈성 심근병증, 제한성 심근병증, 심장 판막 질환, 심내막염, 심낭 질환, 심종양, 대동맥류 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 배대동맥 및 이의 분지의 폐쇄, 말초 혈관 장애, 동맥 폐쇄성 질환, 말초 아테롬성 동맥경화성 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥 장애, 레이노 현상 및 레이노병, 말단청색증, 피부홍통증, 정맥 질환, 정맥혈전증, 정맥류성 정맥, 동정맥루, 림프부종, 지방부종, 불안정성 협심증, 재관류 손상, 펌프 후 (post pump) 증후군, 허혈-재관류 손상 등 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 심혈관 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 선택적으로 이러한 조절, 치료, 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 유효량의 조성물 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 박테리아, 바이러스, 및 진균 감염, HIV 감염/HIV 신경병증, 뇌막염, 간염 (A, B, 또는 C형 등), 화농성 관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염, 이. 콜라이 0157:h7, 용혈성 요독 증후군/혈전용해성 혈소판감소성 자반증, 말라리아, 뎅기 출혈열, 리슈마니아증, 나병, 독성 쇼크 증후군, 스트렙토코커스 근염, 가스 괴저, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 아비움 인트라셀룰라 (mycobacterium avium intracellulare), 뉴모시스티스 카리니 (pneumocystis carinii) 폐렴, 골반 염증성 질환, 고환염/부고환염, 레지오넬라, 라임병, 인플루엔자 a, 엡스타인-바 바이러스, 바이러스-연관성 혈구탐식 증후군, 활성 뇌염 (vital encephalitis)/무균성 뇌막염 등을 포함하는 급성 또는 만성 박테리아 감염, 급성 및 만성 기생충 또는 감염성 과정 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 감염성 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), B-세포, T-세포, 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프모세포성 백혈병 (CLL), 모발상세포 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 림프종, 호지킨 (Hodgkin) 병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버키트 (Burkitt) 림프종, 다중 흑색종, 카포시 (Kaposi) 육종, 결장직장 암종, 췌장 암종, 비인두 암종, 악성 조직구증, 부신생물 증후군/악성종양의 과칼슘혈증, 고형 종양, 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이 질환, 암 관련 뼈의 재흡수, 암 관련 골 통증 등 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 악성 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 신경 퇴행성 질환, 다발성 경화증, 편두통, AIDS 치매 합병증, 탈수초 질환, 예를 들어 다발성 경화증 및 급성 횡단성 척수염; 추체외로 및 소뇌 질환, 예컨대 피질 척수계 병변; 기저핵 장애 또는 소뇌 장애; 과다운동성 운동 장애, 예컨대 헌팅턴 무도병 및 노인무도병; 약물 유도성 운동 장애, 예컨대 CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 장애; 과소운동성 운동 장애, 예컨대 파킨슨병; 진행성 핵상 마비 (Progressive supra-nucleo Palsy); 소뇌 구조 병변; 척수소뇌 변성증, 예컨대 척수성 운동실조증, 프리이드라이히 운동실조증, 소뇌 피질 변성증, 다발계통 변성증 (멘셀 (Mencel), 데제린-토마스 (Dejerine-Thomas), 샤이-드래거 (Shi-Drager), 및 마카도-조셉 (Machado-Joseph)); 전신성 장애 (레프섬 병, 무베타리포단백혈증, 운동실조, 모세혈관확장증, 및 미토콘드리아 다발계통 장애); 탈수초 코어 장애, 예를 들어 다발성 경화증, 급성 횡단성 척수염; 및 운동단위 장애, 예를 들어 신경성 근위축증 (전각 세포 변성, 예를 들어 근위축성 측삭경화증, 유아 척수성 근위축증 및 소아 척수성 근위축증); 알츠하이머병; 중년기의 다운 증후군; 확장형 루이소체병; 루이소체형 노인성 치매; 베르니케-코르사코프 증후군; 만성 알콜 중독; 크로이츠펠트-야콥병; 아급성 경화성 범뇌염, 할러포르텐-스파츠 병; 및 권투 선수 치매 등 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 신경 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 선택적으로 이러한 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 적어도 하나의 TNF 항체 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 조성물 또는 약학 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Merck Manual, 16^th Edition, Merck & Company, Rahway, NJ (1992)]을 참조한다.

본 발명의 임의의 방법은 이러한 조절, 치료, 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 유효량의 조성물 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 선택적으로 이러한 면역 질환의 치료를 위한 동시-투여 또는 조합 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 상기 항-TNF 항체, 그의 특정 부분, 또는 변이체의 투여는 추가로 하나 이상의 TNF 길항제 (예를 들어 (이에 한정되지 않음), TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 단편, 그의 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류머티즘제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타너셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노마이드, 술파살진), 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제 (예를 들어, 아미노글리코사이드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 다른 항미생물제), 건선치료제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 당뇨병 관련 약제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴 (예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀 (예를 들어, G-CSF, 뉴포겐), 사르그라모스팀 (GM-CSF, 류카인), 면역제, 면역글로불린, 면역억제제 (예를 들어, 바실릭시맙, 사이클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사물질, 유사분열 저해제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조병제, 항정신병약, 불안 완화제, 수면제, 교감신경흥분제, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 저해제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나제 알파 (Pulmozyme), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 하나 이상을 사전에, 동시에, 및/또는 사후에 투여하는 단계를 포함한다. 적절한 투여량은 당업계에 공지되어 있다 예를 들어, 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2^nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000)]; 문헌[PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000)]을 참조하며, 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 조성물, 조합 요법, 동시-투여, 장치, 및/또는 방법에 적합한 TNF 길항제 (본 발명의 하나 이상의 항체, 그의 특정 부분, 및 변이체를 추가로 포함함)는 TNF에 특이적으로 결합하는 항-TNF 항체, 그의 항원-결합 단편, 및 수용체 분자; TNF 합성, TNF 방출, 또는 표적 세포에 대한 그의 작용을 방지 및/또는 저해하는 화합물, 예를 들어 탈리도마이드, 테니답, 포스포다이에스테라제 저해제(예를 들어, 펜톡시필린 및 롤리프람), A2b 아데노신 수용체 작용제 및 A2b 아데노신 수용체 인핸서; TNF 수용체 신호전달을 방지 및/또는 저해하는 화합물, 예를 들어 미토겐 활성화 단백질 (MAP) 키나아제 저해제; 막 TNF 절단을 차단 및/또는 저해하는 화합물, 예를 들어 메탈로프로테이나제 저해제; TNF 활성을 차단 및/또는 저해하는 화합물, 예를 들어 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 저해제 (예를 들어, 캅토프릴); 및 TNF 생성 및/또는 합성을 차단 및/또는 저해하는 화합물, 예를 들어 MAP 키나아제 저해제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "종양 괴사 인자 항체", "TNF 항체", "TNFα 항체", 또는 단편 등은 시험관내, 원위치, 및/또는 바람직하게는 생체내에서 TNFα 활성을 감소, 차단, 저해, 폐지 또는 방해한다. 예를 들어, 본 발명의 적합한 TNF 인간 항체는 TNFα 에 결합할 수 있으며, TNFα에 특이적으로 결합하는 항-TNF 항체, 그의 항원-결합 단편, 및 그의 특정 돌연변이체 또는 도메인을 포함한다. 적합한 TNF 항체 또는 단편은 또한, TNF RNA, DNA, 또는 단백질 합성, TNF 방출, TNF 수용체 신호전달, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생산 및/또는 합성을 감소, 차단, 폐지, 방해, 방지, 및/또는 억제할 수 있다.

키메라 항체 cA2는 A2로 표기되는 고친화도 중화 생쥐 항-인간 TNFα IgG1 항체의 항원 결합 가변 영역 및 카파 면역글로불린인 인간 IgG1의 불변 영역으로 이루어진다. 인간 IgG1 Fc 영역은 동종이계의 항체 이펙터 기능을 개선하고, 혈청 반감기의 순환을 증가시키고, 항체의 면역원성을 감소시킨다. 키메라 항체 cA2의 결합력 및 에피토프 특이성은 쥐과 항체 A2의 가변 영역으로부터 유도된다. 특정 실시 형태에서, 쥐과 항체 A2의 가변 영역을 코딩하는 핵산에 대한 바람직한 공급원은 A2 하이브리도마 세포주이다.

키메라 A2 (cA2)는 용량 의존적 방식으로 천연 및 재조합 인간 TNFα 둘 모두의 세포독성 효과를 중화한다. 키메라 항체 cA2 및 재조합 인간 TNFα의 결합 검정으로부터, 키메라 항체 cA2의 친화도 상수는 1.04×l0¹⁰ M^-1로 계산된다. 경쟁적 저해에 의해 단클론 항체 특이성 및 친화도를 결정하는 바람직한 방법은 문헌[Harlow, et al., antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988]; 문헌[Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York, (1992-2000)]; 문헌[Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72-79 (1983)]; 문헌[Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2000)]; 및 문헌[Muller, Meth. Enzymol., 92:589-601 (1983)]에서 확인할 수 있으며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

특정 실시 형태에서, 쥐의 단클론 항체 A2는 c134A로 명명된 세포주에서 생산된다. 키메라 항체 cA2는 c168A로 명명된 세포주에서 생산된다.

본 발명에 사용될 수 있는 단클론 항-TNF 항체의 부가적인 예는 당업계에 기재되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,231,024호; 문헌[

Cytokine 2(3):162-169 (1990)]; 미국 특허 출원 제07/943,852호 (1992년 9월 11일자로 출원); 국제특허 공개 WO 91/02078호 (Rathjen et al.) (1991년 2월 21일자로 공개); 유럽 특허 공개 제0 218 868호 (Rubin et al.) (1987년 4월 22일자로 공개); 유럽 특허 공개 제0 288 088호 (Yone et al.) (1988년 10월 26일); 문헌[Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986)]; 문헌[Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987)]; 문헌[Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987)]; 문헌[Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987)]; 및 문헌[Hirai, et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987)]을 참조하며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨).

TNF 수용체 분자. 본 발명에 유용한 바람직한 TNF 수용체 분자는 고친화도로 TNFα와 결합하며 (예를 들어, 국제특허 공개 WO 92/07076호 (Feldmann et al.) (1992년 4월 30일자로 공개); 문헌[Schall et al., Cell 61:361-370 (1990)]; 및 문헌[Loetscher et al., Cell 61:351-359 (1990)]을 참조하며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨) 선택적으로 저면역원성을 보유하는 것들이다. 특히, 55 kDa (p55 TNF-R) 및 75 kDa (p75 TNF-R) TNF 세포 표면 수용체가 본 발명에 유용하다. 수용체의 세포외 도메인 (ECD) 또는 그의 기능성 부분을 포함하는, 이들 수용체의 말단절단 형태 (예를 들어, 문헌[Corcoran et al., Eur. J. Biochem. 223:831-840 (1994)] 참조) 또한 본 발명에 유용하다. ECD를 포함하는 TNF 수용체의 말단절단 형태는 소변 및 혈청에서 30 kDa 및 40 kDa TNFα 저해성 결합 단백질로서 검출되었다 (문헌[Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265:1531-1536 (1990)]). TNF 수용체 다량체 분자 및 TNF 면역수용체 융합 분자 및 그의 유도체 및 단편 또는 일부는 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 수용체 분자의 추가의 예이다. 본 발명에 사용할 수 있는 TNF 수용체 분자는 연장되는 기간 동안 증상의 양호 내지 우수한 경감 및 저독성을 보이면서 환자를 치료할 수 있는 능력이라는 특징을 갖는다. 저면역원성 및/또는 고친화도 및 다른 정의되지 않는 특성이 달성되는 치료 결과에 기여할 수 있다.

본 발명의 유용한 TNF 수용체 다량체 분자는 하나 이상 폴리펩티드 링커 또는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 다른 비펩티드 링커를 통해 결합된 두개 이상의 TNF 수용체의 ECD의 전체 또는 기능성 부분을 포함한다. 다량체 분자는 다량체 분자의 발현을 지시하는 분비되는 단백질의 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 이들 다량체 분자 및 그의 생성 방법은 미국 특허 출원 제08/437,533호 (1995년 5월 9일자로 출원)에 기재되어 있고, 그 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 면역수용체 융합 분자는 하나 이상의 면역글로불린 분자의 적어도 하나의 일부 및 하나 이상의 TNF 수용체의 전부 또는 기능성 부분을 포함한다. 상기 면역수용체 융합 분자는 단량체 또는 이종-다량체 또는 동종-다량체로 조립될 수 있다. 상기 면역수용체 융합 분자는 또한 1가 또는 다가일 수 있다. 상기 TNF 면역수용체 융합 분자의 예는 TNF 수용체/IgG 융합 단백질이다. TNF 면역수용체 융합 분자 및 그의 생성 방법은 당업계에 기재되어 있다 (문헌[Lesslauer et al., Eur. 21:2883-2886 (1991)]; 문헌[Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991)]; 문헌[Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)]; 문헌[Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219 (1994)]; 문헌[Butler et al., Cytokine 6(6):616-623 (1994)]; 문헌[Baker et al., Eur. J. Immunol. 24:2040-2048 (1994)]; 미국 특허 제5,447,851호 (Beutler et al.); 및 미국 특허 출원 제08/442,133호 (1995년 5월 16일자로 출원), 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨). 면역수용체 융합 분자의 생성 방법은 또한, 미국 특허 제5,116,964호 (Capon et al.); 미국 특허 제5,225,538호 (Capon et al.); 및 문헌[Capon et al., Nature 337:525-531 (1989)]에서 확인할 수 있으며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

TNF 수용체 분자의 기능성 동등물, 유도체, 단편 또는 영역은 본 발명에서 사용할 수 있는 TNF 수용체 분자와 기능적으로 유사하기에 (예를 들어, 고 친화도로 TNFα에 결합하고 저 면역원성을 보이기에) 충분한 크기 및 서열을 갖는, TNF 수용체 분자의 일부 또는 TNF 수용체 분자를 코딩하는 TNF 수용체 분자 서열의 일부를 말한다. TNF 수용체 분자의 기능성 동등물은 또한, 본 발명에 사용할 수 있는 TNF 수용체 분자와 기능적으로 유사한 (예를 들어, 고친화도로 TNFα와 결합하고 저면역원성을 보유함) 변형된 TNF 수용체 분자를 포함한다. 예를 들어, TNF 수용체 분자의 기능성 동등물은 "사일런트 (SILENT)" 코돈 또는 하나 이상 아미노산 치환, 결실, 또는 부가 (예를 들어, 하나의 산성 아미노산의 다른 산성 아미노산으로의 치환; 또는 동일하거나 상이한 소수성 아미노산을 코딩하는 하나의 코돈의 소수성 아미노산을 코딩하는 다른 코돈으로의 치환)를 함유할 수 있다. 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York (1987-2000)]을 참조한다.

사이토카인은 임의의 공지의 사이토카인을 포함한다 (예를 들어, www.Copewithcytokines.com. 참조) 사이토카인 길항제는 임의의 항체, 단편 또는 모방체, 임의의 가용성 수용체, 단편 또는 모방체, 임의의 소분자 길항제, 또는 그의 모든 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

치료적 처치. 본 발명의 임의의 방법은 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 유효량의 조성물 또는 약학 조성물을 이러한 조절, 치료, 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, TNF 매개 장애를 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 선택적으로 이러한 면역 질환의 치료를 위한 동시-투여 또는 조합 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 상기 항-TNF 항체, 그의 특정 부분, 또는 변이체의 투여는 추가로 하나 이상의 TNF 길항제 (예를 들어 (이에 한정되지 않음), TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 단편, 그의 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류머티즘제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타너셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노마이드, 술파살진), 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제 (예를 들어, 아미노글리코사이드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 다른 항미생물제), 건선치료제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 당뇨병 관련 약제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴 (예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀 (예를 들어, G-CSF, 뉴포겐), 사르그라모스팀 (GM-CSF, 류카인), 면역제, 면역글로불린, 면역억제제 (예를 들어, 바실릭시맙, 사이클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사물질, 유사분열 저해제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조병제, 항정신병약, 불안 완화제, 수면제, 교감신경흥분제, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 저해제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나제 알파 (Pulmozyme), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 하나 이상을 사전에, 동시에, 및/또는 사후에 투여하는 단계를 포함한다.

전형적으로, 조성물에 함유된 비활성에 따라, 평균적으로 투여당 약 0.01 내지 500 밀리그램 이상의 하나 이상의 항-TNF 항체/환자의 킬로그램, 바람직하게는 단일 또는 다중 투여당 약 0.1 내지 100 밀리그램 이상의 항체/환자의 킬로그램으로 합산되는 유효량 또는 유효 투여량의 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물을 투여함으로써 병리학적 병태의 치료가 이루어진다. 대안적으로, 유효 혈청 농도는 단일 또는 다중 투여당 0.1 내지 5000 ㎍/ml 혈청 농도를 포함할 수 있다. 적합한 용량이 의사들에게 공지되어 있고, 물론 특정 질병 상태, 투여되는 조성물의 특정 활성 및 치료할 특정 환자에 따라 달라질 것이다. 일부 경우에는, 원하는 치료량을 달성하기 위해, 반복 투여, 즉 모니터링되거나 계량되는 특정 용량의 반복 개별 투여를 제공하는 것이 필요할 수 있으며, 여기서 개별 투여는 원하는 1일 용량 또는 효과가 달성될 때까지 반복된다.

바람직한 용량은 선택적으로 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 및/또는 100 내지 500 mg/㎏/투여, 또는 그의 임의의 범위, 값, 또는 분율을 포함할 수 있거나, 단일 또는 다중 투여당 혈청 농도 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 20, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 16, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 및/또는 5000 ㎍/ml, 또는 그의 임의의 범위, 값, 또는 분율의 혈청 농도를 달성하도록 하는 양을 포함할 수 있다.

대안적으로, 투여되는 투여량은 공지된 인자, 예를 들어 특정 약제의 약력학적 특징 및 그의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강, 및 체중; 증상의 성질 및 정도, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과에 따라 변동될 수 있다. 통상, 활성 성분의 용량은 체중 1 킬로그램당 약 0.1 내지 100 밀리그램일 수 있다. 통상적으로, 0.1 내지 50, 바람직하게는 0.1 내지 10 밀리그램/킬로그램/투여 또는 지효성 형태가 요구되는 결과를 얻는데 효과적이다.

비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는 본 발명의 하나 이상의 항체 0.1 내지 100 mg/㎏, 예를 들어 1일당 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/㎏의 1회 또는 기간 투여량으로서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40일 중 하나 이상, 또는 대안적으로 또는 부가적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 52주 중 하나 이상, 또는 대안적으로 또는 부가적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20년 중 하나 이상, 또는 이들의 임의의 조합으로 단일, 주입, 또는 반복 용량을 사용하여 제공할 수 있다.

체내 투여에 적합한 투여형 (조성물)은 일반적으로 단위 또는 용기당 약 0.1 밀리그램 내지 약 500 밀리그램의 활성 성분을 함유한다. 이들 약학 조성물에서, 활성 성분은 대체로 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 내지 99.999 중량%의 양으로 존재할 것이다.

비경구 투여의 경우, 항체는 약학적으로 허용가능한 비경구 비히클과 함께 또는 별도로 제공되는 용액, 현탁액, 에멀젼, 또는 동결건조 분말로서 제형화될 수 있다. 그러한 비히클의 예는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 1-10% 인간 혈청 알부민이다. 리포좀 및 비수성 비히클, 예를 들어 고정유가 또한 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결건조 분말은 등장성 (예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성 (예를 들어, 완충제 및 보존제)을 유지하는 첨가제를 함유할 수 있다. 제형을 공지된 기술 또는 적합한 기술에 의해 살균시킨다.

적합한 약학적 담체는 본 분야의 표준 참고문헌인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]의 최신판에 기재되어 있다.

대안적 투여. 약학적 유효량의 본 발명에 따른 하나 이상의 항-TNF 항체의 투여를 위해, 공지되고 개발된 많은 투여 방식이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 폐 투여가 하기 설명에서 이용되며, 다른 투여 방식이 적합한 결과를 보이면서 본 발명에 따라 이용될 수 있다.

본 발명의 TNF 항체는 흡입 또는 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 다른 방식에 의한 투여에 적합한 임의의 다양한 장치 및 방법을 사용하여, 용액, 에멀젼, 콜로이드, 또는 현탁액, 또는 건조 분말로서 담체 중에 전달될 수 있다.

비경구 제형 및 투여. 비경구 투여를 위한 제형은 통상적인 부형제로서 살균수 또는 염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사를 위한 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 방법에 따라 적당한 유화제 또는 습윤화제 및 현탁제를 이용하여 제조될 수 있다. 주사를 위한 제형은 용매 중의 수성 용액 또는 살균 주사용 용액 또는 현탁액과 같은 비-독성, 비-경구 투여가능 희석제일 수 있다. 사용가능한 비히클 또는 용매로서, 물, 링거 용액, 등장성 식염수 등이 허용되며; 통상의 용매 또는 현탁 용매로서, 멸균 비휘발성 오일이 사용될 수 있다. 이 목적을 위해, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노- 또는 다이- 또는 트라이-글리세리드를 포함하는 임의의 종류의 비휘발성 오일 및 지방산이 사용될 수 있다. 비경구적 투여는 당업계에 공지되어 있고, 통상적인 주사 수단, 미국 특허 5,851,198에 기재된 기체 압력 무-바늘 주사 장치, 및 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 5,839,446에 기술된 레이저 천공기 장치를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

대안적 전달. 본 발명은 추가로, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장내, 구강내, 설하, 비강내, 또는 경피 수단에 의한 하나 이상의 항-TNF 항체의 투여에 관한 것이다. 특히 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 비경구 (피하, 근육내, 또는 정맥내) 또는 임의의 다른 투여에 사용하기 위해; 특히 반고체 형태, 예를 들어 (이에 한정되지 않음), 크림 및 좌제로 질내 또는 직장내 투여에 사용하기 위해; 정제 또는 캡슐의 형태와 같으나 이에 한정되지 않는 구강내 또는 설하 투여; 또는, 예를 들어 분말, 점비제 (nasal drop) 또는 에어로졸 또는 소정의 약제의 형태와 같으나 이에 한정되지 않는 비강내 투여; 또는 피부 구조를 변형시키거나 경피 패치 내의 약물 농도를 증가시키기 위한 다이메틸 설폭사이드와 같은 화학적 인핸서를 가지거나(문헌[Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994], 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨), 단백질 및 펩티드를 함유하는 제형의 피부 적용을 가능하게 하는 산화제를 가지거나 (국제특허 공개 WO 98/53847호), 전기천공과 같은 일시적 수송 경로를 생성하거나 이온영동법과 같이 피부를 통한 하전된 약물의 이동성을 증가시키는 전기장의 적용, 또는 초음파영동법과 같은 초음파의 적용을 가진 (미국 특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호) (상기 간행물 및 특허는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨) 겔, 연고, 로션, 현탁액, 또는 패치 전달 시스템과 같으나 이에 한정되지 않는 경피 투여를 위해, 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물을 제조할 수 있다.

폐/비내 투여. 폐 투여의 경우, 바람직하게는 폐 또는 부비강 (sinus)의 하부 기도에 도달하기에 효과적인 입자 크기로 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물이 전달된다. 본 발명에 따라, 하나 이상의 항-TNF 항체는 흡입에 의한 치료제의 투여를 위해 당업계에 공지된 임의의 다양한 흡입 또는 비내 투여 장치에 의해 전달될 수 있다. 환자의 공강 (sinus cavity) 또는 폐포 내에 에어로졸화된 제형을 침적시킬 수 있는 상기 장치는 정량 흡입기, 분무기, 건조 분말 생성기, 스프레이어 등을 포함한다. 항체의 폐 또는 비내 투여를 유도하기에 적합한 다른 장치 또한 당업계에 공지되어 있다. 이러한 모든 장치는 항체를 에어로졸로 분배하기 위해 투여에 적합한 제형을 이용할 수 있다. 그러한 에어로졸은 용액 (수성 및 비수성 모두) 또는 고체 입자로 구성될 수 있다. Ventolin^® 정량 흡입기와 같은 정량 흡입기는 전형적으로 추진제 기체를 이용하며, 흡기 중의 구동 (actuation)을 필요로 한다 (예를 들어, 국제특허 공개 WO 94/16970호, 국제특허 공개 WO 98/35888호 참조). Turbuhaler™ (아스트라(Astra)), Rotahaler^® (글락소(Glaxo)), Diskus^® (글락소), Spiros™ 흡입기 (듀라(Dura)), 인홀 서라퓨틱스(Inhale Therapuetics)에 의해 판매되는 장치, 및 Spinhaler^® 분말 흡입기 (피손스(Fisons))와 같은 건조 분말 흡입기는 혼합된 분말의 호흡-구동을 사용한다 (전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제4668218호 (아스트라), 유럽 특허 제237507호 (아스트라), 국제특허 공개 WO97/25086호 (글락소), 국제특허 공개 WO 94/08552호 (듀라), 미국 특허 제5458135호 (인홀(Inhale)), 국제특허 공개 WO 94/06498호 (피손스)). AERx™ 아라디금(Aradigm), Ultravent^® 분무기 (몰린크로트(Mallinckrodt)), 및 Acorn II^® 분무기 (마퀘스트 메디칼 프로덕츠(Marquest Medical Products)) (미국 특허 제5404871호 (아라디금), 국제특허 공개 WO 97/22376호, 상기 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨)와 같은 분무기는 용액으로부터 에어로졸을 생성하는 반면에, 정량 흡입기, 건조 분말 흡입기 등은 소입자 에어로졸을 생성한다. 상업적으로 이용가능한 흡입 장치의 이러한 특별한 예는 본 발명의 실시를 위해 적합한 특정 장치의 대표적인 것으로 의도되며, 본 발명의 범위가 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물은 건조 분말 흡입기 또는 스프레이어에 의해 전달된다. 본 발명의 하나 이상의 항체를 투여하기 위한 흡입 장치에는 몇몇 바람직한 특징부가 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은 유리하게 신뢰가능하고, 재생산가능하고 정확하다. 양호한 흡입성을 위해, 선택적으로 흡입 장치는, 예를 들어 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 내지 5 μm의 작은 건조 입자를 전달할 수 있다.

스프레이로서 TNF 항체 조성물의 투여. TNF 항체 조성물 단백질을 포함하는 스프레이는 하나 이상의 항-TNF 항체의 현탁액 또는 용액을 압력 하에서 노즐에 통과시킴으로써 생성될 수 있다. 노즐 크기 및 입체형태, 적용되는 압력 및 액체 공급 속도는 요구되는 결과 및 입자 크기를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 전기스프레이는 모세관 또는 노즐 공급부와 연결된 전기장에 의해 생산될 수 있다. 유리하게는, 스프레이어에 의해 전달되는 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm의 범위의 입자 크기를 갖는다.

스프레이어에 의한 사용에 적합한 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 제형은 전형적으로 용액 1 ml 당 또는 g 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값, 예를 들어 (이에 한정되지 않음) 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/ml 또는 mg/g의 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 농도로 수용액 중의 항체 조성물 단백질을 포함한다. 제형은 부형제, 완충제, 등장화제, 보존제, 계면활성제 및 바람직하게는 아연과 같은 시약을 포함할 수 있다. 제형은 또한 완충제, 환원제, 벌크 단백질, 또는 탄수화물과 같은, 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 약제를 포함할 수 있다. 항체 조성물 단백질의 제형화에 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 항체 조성물 단백질 제형화에 유용한 전형적인 탄수화물은 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 항체 조성물 단백질 제형은 또한, 에어로졸을 형성함에 있어서 용액의 연무화 (atomization)에 의해 야기되는 항체 조성물 단백질의 표면-유도된 응집을 감소시키거나 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알코올, 그리고 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르와 같은 다양한 통상적인 계면활성제가 이용될 수 있다. 양은 일반적으로 제형의 0.001 내지 14 중량% 범위일 것이다. 본 발명의 목적을 위해 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. TNF 항체, 또는 특정 부분 또는 변이체와 같은 단백질의 제형화를 위해 당업계에 공지된 부가적인 약제 또한 제형에 포함될 수 있다.

분무기에 의한 TNF 항체 조성물의 투여. 항체 조성물 단백질은 제트 분무기 또는 초음파 분무기와 같은 분무기에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 제트 분무기에서는, 압축된 공기 원료가 구멍을 통해 고속 공기 제트를 형성하기 위해 이용된다. 노즐 너머로 기체가 팽창함에 따라, 저압 영역이 생성되고, 이는 항체 조성물 단백질의 용액을 액체 저장소에 연결된 모세관을 통해 흡인한다. 모세관으로부터의 액체 흐름은 그것이 관을 나감에 따라 불안정한 필라멘트 및 소적으로 전단되어 에어로졸을 생성한다. 일정 범위의 입체형태, 유속 및 배플 유형이 제시된 제트 분무기로부터 요구되는 성능 특성을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 초음파 분무기에서, 고주파 전기에너지가 일반적으로 압전 변환기를 사용하여, 진동성의 기계적 에너지를 형성하기 위해 이용된다. 이 에너지는 직접 또는 커플링 유체 통해 항체 조성물 단백질의 제형에 전달되어 항체 조성물 단백질을 포함하는 에어로졸을 생성한다. 유리하게는, 분무기에 의해 전달되는 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm의 범위의 입자 크기를 갖는다.

제트 또는 초음파 분무기와 함께 사용하기에 적합한 하나 이상의 항-TNF 항체의 제형은 전형적으로 용액 1 ml 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 농도의 하나 이상의 항-TNF 항체 단백질을 포함한다. 제형은 부형제, 완충제, 등장화제, 보존제, 계면활성제 및 바람직하게는 아연과 같은 시약을 포함할 수 있다. 제형은 또한, 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 약제, 예를 들어 완충제, 환원제, 벌크 단백질, 또는 탄수화물을 포함할 수 있다. 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 제형화에 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 하나 이상의 항-TNF 항체의 제형화에 유용한 전형적인 탄수화물은 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 하나 이상의 항-TNF 항체 제형은 또한, 에어로졸 형성시에 용액의 연무화에 의해 야기되는 하나 이상의 항-TNF 항체의 표면-유도된 응집을 감소시키거나 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알코올, 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르와 같은 다양한 통상적인 계면활성제가 이용될 수 있다. 양은 일반적으로 제형의 0.001 내지 4 중량% 범위일 것이다. 본 발명의 목적을 위해 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. 항체 단백질과 같은 단백질의 제형화를 위해 당업계에 공지된 부가적인 약제 또한 제형에 포함될 수 있다.

정량 흡입기에 의한 TNF 항체 조성물의 투여. 정량 흡입기 (MDI)에서는, 추진제, 하나 이상의 항-TNF 항체, 및 임의의 부형제 또는 다른 첨가제가 액화 압축 기체를 포함하는 혼합물로서 캐니스터 (canister) 내에 함유된다. 계량 밸브의 구동은, 바람직하게는 약 10 μm, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm 미만의 크기 범위의 입자를 함유하는 에어로졸로서 혼합물을 방출한다. 제트-밀링, 스프레이 건조, 임계점 응축 등을 포함하는, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 생성된 항체 조성물 단백질의 제형을 사용함으로써 원하는 에어로졸 입자 크기를 얻을 수 있다. 바람직한 정량 흡입기는 3M 또는 글락소에 의해 제조된 것 및 하이드로플루오로카본 추진제를 이용하는 것을 포함한다.

정량 흡입기 장치에 사용하기 위한 하나 이상의 항-TNF 항체의 제형은 일반적으로, 예를 들어 계면 활성제의 도움을 받는 추진제 중에 현탁된 비수성 매질 중의 현탁액으로서 하나 이상의 항-TNF 항체를 함유하는 미분할된 분말을 포함할 것이다. 추진제는 트라이클로로플루오로메탄, 다이클로로다이플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, HFA-134a (하이드로플루오로알칸-134a), HFA-227 (하이드로플루오로알칸-227) 등을 포함하는 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 하이드로카본과 같은 추진제가 상기 목적을 위해 사용되는 임의의 통상적인 물질일 수 있다. 바람직하게는 추진제는 하이드로플루오로카본이다. 계면활성제는 화학적 분해 등에 대해 활성 약제를 보호하기 위해 추진제 중의 현탁액으로서 하나 이상의 항-TNF 항체를 안정화시키도록 선택될 수 있다. 적합한 계면활성제는 소르비탄 트리올레이트, 대두 레시틴, 올레산 등을 포함한다. 일부 경우에서, 용액 에어로졸은 에탄올과 같은 용매를 이용하는 것이 바람직하다. 단백질의 제형화를 위해 당업계에 공지된 추가의 물질이 또한 제형 중에 포함될 수 있다.

당업자는 본 발명의 방법이 본 명세서에 기재되지 않은 장치를 통한 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물의 폐 투여에 의해 달성될 수 있음을 인식할 것이다.

경구 제형 및 투여. 경구용 제형은 장벽의 투과성을 인공적으로 증가시키기 위한 어쥬번트(예를 들어, 레소르시놀 및 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르)의 동시-투여 뿐만 아니라, 효소 분해를 저해하기 위한 효소 저해제(예를 들어, 췌장 트립신 저해제, 다이아이소프로필플루오로포스페이트 (DFF) 및 트라실올)의 동시-투여에 의존한다. 경구 투여를 위한 고체 형태의 투여형의 활성 구성성분 화합물은 수크로스, 락토스, 셀룰로오스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 한천, 아르기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트라가칸트 고무, 아라비아 고무, 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 알부민, 합성 또는 반합성 중합체, 및 글리세리드를 비롯한 적어도 하나의 첨가제와 혼합될 수 있다. 이들 투여형은 또한 다른 유형(들)의 첨가제, 예를 들어, 불활성 희석제, 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 파라벤, 소르브산, 아스코르브산, 알파-토코페롤과 같은 보존제, 시스테인과 같은 항산화제, 붕해제, 결합제, 증점제, 완충제, 감미제, 향미제, 방향제 등을 함유할 수 있다.

정제 및 환제는 장용 코팅된 제형으로 추가로 처리될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 제형은 의학적 용도에 대해 허용가능한 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 현탁액 및 용액 제형을 포함한다. 이러한 제형은 상기 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물을 함유할 수 있다. 인슐린 및 헤파린을 위한 약물 전달 시스템으로서 리포좀 또한 기재된 바 있다 (미국 특허 제4,239,754호). 더 최근에는, 혼합 아미노산 (프로테노이드)의 인공 중합체의 미세구가 의약품을 전달하기 위해 사용된 바 있다 (미국 특허 제4,925,673호). 또한, 생물학적 활성 제형을 경구 전달하기 위해 이용되는, 미국 특허 제5,879,681호 및 미국 특허 제5,871,753호에 기재된 담체 화합물이 당업계에 공지되어 있다.

점막 제형 및 투여. 점막 표면을 통한 흡수를 위해, 하나 이상의 항-TNF 항체를 투여하는 조성물 및 방법은 마이크로미터 미만의 복수의 입자, 점막부착 거대분자, 생물활성 펩티드, 및 수성 연속상을 포함하는 에멀젼을 포함하며, 이는 에멀젼 입자의 점막부착을 달성함으로써 점막 표면을 통한 흡수를 촉진한다 (미국 특허 제5,514,670호). 본 발명의 에멀젼 적용에 적합한 점막 표면은 각막, 결막, 구강내, 설하, 비내, 질내, 폐, 위, 장, 및 직장내 투여 경로를 포함할 수 있다. 질내 또는 직장내 투여를 위한 제형, 예를 들어 좌제는 부형제로서, 예를 들어 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 등을 포함할 수 있다. 비강내 투여를 위한 제형은 고체일 수 있으며, 부형제로서, 예를 들어 락토스를 포함할 수 있거나, 또는 비내 점적제의 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 구강내 투여를 위해, 부형제는 당, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 프리젤리네이틴드 전분 (pregelinatined starch) 등을 포함한다 (미국 특허 제5,849,695호).

경피 제형 및 투여. 경피 투여를 위해, 하나 이상의 항-TNF 항체는 리포좀 또는 중합체 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 또는 미세구 (달리 언급하지 않으면 마이크로입자로서 집합적으로 언급됨)와 같은 전달 장치에 캡슐화된다. 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 그의 공중합체와 같은 폴리하이드록시산과 같은 합성 중합체, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 및 폴리포스파진, 및 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 기타 단백질, 아르기네이트와 같은 천연 중합체, 및 다른 다당류, 및 이들의 조합으로 제조된 마이크로입자를 포함하는 다수의 적합한 장치가 공지되어 있다 (미국 특허 제5,814,599호).

연장된 투여 및 제형. 연장된 기간 동안, 예를 들어, 단일 투여로부터 1주 내지 1년의 기간 동안 대상에게 본 발명의 화합물을 전달하는 것이 종종 바람직할 수 있다. 다양한 서방제, 데포제, 임플란트 형태가 이용될 수 있다. 예를 들어, 투여형은 체액 중의 용해도가 낮은 화합물의 약학적으로 허용가능한 비-독성 염, 예를 들어, (a) 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 다이-설폰산, 폴리갈락투론산 등과 같은 다염기산과의 산 부가 염; (b) 아연, 칼슘, 비스무스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과 같은 다가 금속 양이온과의 염, 또는 예를 들어, N,N'-다이벤질-에틸렌다이아민 또는 에틸렌다이아민으로부터 형성된 유기 양이온과의 염; 또는 (c) (a)와 (b)의 조합, 예를 들어 탄닌산아연 염을 함유할 수 있다. 추가로, 본 발명의 화합물, 바람직하게는 상기 설명된 것과 같은 비교적 불용성의 염은 겔로, 예를 들어, 주사에 적합한, 예를 들어 참깨유를 갖는 알루미늄 모노스테아레이트 겔로 제형화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 탄닌산아연 염, 파모에이트 염 등이다. 주사를 위한 다른 유형의 서방성 데포 제형은, 예를 들어, 미국 특허 제3,773,919호에 기재된 바와 같은 폴리락트산/폴리글리콜산 중합체와 같이 천천히 분해되는 비독성 비항원성 중합체 중에 분산되거나 캡슐화된 화합물 또는 염을 함유할 것이다. 화합물, 또는 바람직하게는 상기 기재된 것들과 같은 상대적으로 불용성인 염은 또한, 특히 동물에 사용하기 위해, 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱 펠렛에 제형화될 수 있다. 부가적인 서방성 데포 또는 임플란트 제형, 예를 들어 기체 또는 액체 리포좀이 문헌에 공지되어 있다 (미국 특허 제5,770,222호 및 문헌["Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978]).

본 발명을 일반적으로 설명하였지만, 본 발명은 예시를 위해 제공되고 본 발명을 제한하는 것으로서 간주되지 않는 하기 실시예를 참고로 하여 보다 쉽게 이해될 것이다.

실시예 1: 포유류 세포에서의 TNF 항체의 클로닝 및 발현.

전형적인 포유류 발현 벡터는 mRNA의 전사의 개시를 매개하는 하나 이상의 프로모터 요소, 항체 코딩 서열, 및 전사의 종결 및 전사체의 폴리아데닐화에 필요한 신호를 함유한다. 추가의 요소는 인핸서, 코작 (Kozak) 서열 및 RNA 스플라이싱의 공여체 및 수용체 부위에 인접하는 중간 서열을 포함한다. 고 효율 전사는 SV40으로부터의 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스, 예를 들어 RSV, HTLVI, HIVI로부터의 긴 말단 반복체 (LTR), 및 사이토메갈로바이러스 (CMV)의 초기 프로모터로 달성될 수 있다. 그러나, 세포성 인자도 사용될 수 있다 (예를 들어, 인간 액틴 프로모터). 본 발명의 실시를 위해 사용하기 적합한 발현 벡터는 예를 들어 pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, 또는 pLNCX (Clontech Labs, 미국 캘리포니아주 팔로 알토), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) 또는 pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL 및 PMSG (Pharmacia, 스웨덴 웁살라), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) 및 pBC12MI (ATCC 67109)와 같은 벡터를 포함한다. 사용될 수 있는 포유류 숙주 세포는 인간 HeLa 293, H9 및 Jurkat 세포, 생쥐 NIH3T3 세포 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV 1, 퀘일 QC1-3 세포, 생쥐 L 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함한다.

별법으로, 유전자는 염색체 내로 통합된 유전자를 함유하는 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 또는 하이그로마이신과 같은 선택가능 마커를 사용한 동시-형질감염을 통해, 형질감염된 세포를 확인 및 분리할 수 있다.

형질감염된 유전자는 또한 대량의 코딩된 항체를 발현하도록 증폭될 수 있다. DHFR (디하이드로폴레이트 환원효소) 마커는 관심 있는 유전자의 수백 또는 수천 개의 카피를 운반하는 세포주를 발생시키는데 유용하다. 다른 유용한 선택 마커는 효소 글루타민 합성효소 (GS)이다 (문헌[Murphy, et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991)]; 문헌[Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)]). 이들 마커를 사용하여, 포유동물 세포를 선택 배지에서 증식시키고 최고의 내성을 갖는 세포를 선택한다. 이들 세포주는 염색체 내로 통합된 증폭된 유전자(들)를 함유한다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 NSO 세포는 항체 생산에 종종 사용된다.

발현 벡터 pC1 및 pC4는 라우스 육종 바이러스의 강력한 프로모터 (LTR) (문헌[Cullen et al., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)])와 CMV-인핸서 (문헌[Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)])의 단편을 함유한다. 예를 들어, 제한효소 절단 부위 BamHⅠ, XbaⅠ 및 Asp718을 갖는 다중 클로닝 부위는 관심 있는 유전자의 클로닝을 용이하게 한다. 벡터는 또한 쥐 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론, 폴리아데닐화 및 종결 신호를 함유한다.

CHO 세포에서의 클로닝 및 발현. 벡터 pC4를 TNF 항체의 발현을 위해 사용한다. 플라스미드 pC4는 플라스미드 pSV2-dhfr (ATCC 기탁 번호 37146)의 유도체이다. 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 조절 하에 생쥐 DHFR 유전자를 포함한다. 이들 플라스미드로 형질감염된, 다하이드로폴레이트 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소- 또는 다른 세포는 화학요법제 메토트렉세이트로 보충된 선택 배지 (예를 들어, 알파 마이너스 MEM, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 메릴랜드주 게이터스버그)에서 세포를 배양하여 선택할 수 있다. 메토트렉세이트 (MTX)에 내성인 세포에서의 DHFR 유전자의 증폭은 문헌에 잘 기록되어 있다 (예를 들어, 문헌[F. W. Alt, et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978)]; 문헌[J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990)]; 및 문헌[M. J. Page and M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)] 참조). 표적 효소인, DHFR 유전자의 증폭 결과물로서의 DHFR을 과다생산함으로써 약물에 내성을 보이는, 증가하는 농도의 MTX에서 세포를 증식시켰다. 제2 유전자가 DHFR 유전자에 연결되면, 일반적으로 동시 증폭 및 과다발현된다. 증식된 유전자(들)의 1,000개 초과의 카피를 운반하는 세포주의 개발을 위해 상기 방법을 사용할 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 이어서, 메토트렉세이트를 제거하면, 숙주 세포의 하나 이상의 염색체(들) 내로 통합된 증폭된 유전자를 포함하는 세포주가 수득된다.

플라스미드 pC4는 관심 있는 유전자를 발현하기 위해 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체 (LTR)의 강력한 프로모터 (문헌[Cullen et al., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)]) 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV)의 최조기 유전자의 인헨서로부터 단리된 단편 (문헌Boshart, et al., Cell 41: 521-530 (1985)])을 포함한다. 프로모터의 하류에는 유전자의 결합을 위한 BamHI, Xbal, 및 Asp718 제한 효소 절단 부위가 존재한다. 상기 클로닝 부위의 뒤에, 플라스미드는 3' 인트론 및 쥐 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 다른 고효율 프로모터, 예를 들어 인간 베타-액틴 프로모터, SV40 초기 또는 후기 프로모터 또는 다른 레트로바이러스, 예를 들어 HIV 및 HTLVI로부터의 긴 말단 반복체 또한 발현에 사용될 수 있다. 클론테크(Clontech)의 Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템 및 유사한 시스템을 포유류 세포에서 조절되는 방식으로 TNF를 발현시키기 위해 사용할 수 있다 (문헌[M. Gossen, and H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)]). mRNA의 폴리아데닐화를 위해, 예를 들어 인간 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 다른 신호가 사용될 수 있다. 염색체 내로 통합된 목적하는 유전자를 운반하는 안정한 세포주는 선택가능 마커, 예를 들어 gpt, G418 또는 하이그로마이신으로 동시 형질감염하여 선택할 수 있다. 초기에 하나 초과의 선택 마커, 예를 들어 G418 플러스 메토트렉세이트를 사용하는 것이 바람직하다.

플라스미드 pC4를 제한 효소로 소화한 후, 공지의 방법으로 송아지 장 포스파타제를 사용하여 탈인산화한다. 이어서, 벡터를 1% 아가로스 겔로부터 단리한다.

이어서, 단리된 가변 및 불변 영역을 코딩하는 DNA 및 탈인산화된 벡터를 T4 DNA 리가제로 라이게이션시켰다. 이어서, 이. 콜라이 HB101 또는 XL-1 블루 세포를 형질전환하고, 예를 들어 제한 효소 분석을 사용하여 플라스미드 pC4가 삽입된 단편을 포함하는 박테리아를 확인하였다.

활성 DHFR 유전자가 결여된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포가 형질감염에 사용된다. 리포펙틴을 사용하여 5 ㎍의 발현 플라스미드 pC4를 0.5 ㎍의 플라스미드 pSV2-네오와 함께 동시형질감염시킨다. 플라스미드 pSV2-네오는 우성 선택가능 마커, G418을 포함하는 항생제의 군에 대한 내성을 부여하는 효소를 코딩하는 Tn5로부터의 네오 유전자를 함유한다. 1 ㎍ /ml의 G418로 보충된 알파 마이너스 MEM에 세포를 접종한다. 2일 후에, 세포를 트립신처리하고 하이브리도마 클로닝 플레이트(독일 소재의 그라이너(Greiner)) 내에서 10, 25, 또는 50 ng/ml의 메토트렉세이트 + 1 ㎍ /ml의 G418로 보충된 알파 마이너스 MEM 중에 접종한다. 약 10 내지 14일 후에 단일 클론을 트립신처리한 후, 상이한 농도의 메토트렉세이트 (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM)를 사용하여 6-웰 페트리 디쉬 또는 10 ml 플라스크에 접종한다. 이어서, 가장 높은 농도의 메토트렉세이트에서 성장하는 클론을 심지어 더 높은 농도의 메토트렉세이트 (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM)를 함유하는 새로운 6-웰 플레이트에 이전하였다. 100-200 mM의 농도에서 성장하는 클론을 수득할 때까지 동일한 절차를 반복하였다. 예를 들어, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 또는 역상 HPLC 분석에 의해 요구되는 유전자 산물의 발현을 분석하였다.

실시예 2: 트랜스제닉 생쥐를 사용하는, 인간 TNF와 반응성인 고친화도 인간 IgG 단클론 항체의 생성.

요약. 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 함유하는 트랜스제닉 생쥐를 사용하여, 하나 이상의 TNF-매개 질환의 치료를 위해 TNF의 작용을 저해하기 위해 치료적으로 사용할 수 있는 고친화도의 완전 인간 단클론 항체를 생성하였다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대한 인간 가변 영역 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 (CBA/J x C57/BL6/J) F₂ 혼성화 생쥐를 인간 재조합 TNF로 면역화한다 (문헌[Taylor et al., Intl. Immunol. 6:579-591 (1993)]; 문헌[Lonberg, et al., Nature 368:856-859 (1994)]; 문헌[Neuberger, M., Nature Biotech. 14:826 (1996)]; 문헌[Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)]). 몇몇 융합은 완전 인간 TNF 반응성 IgG 단클론 항체의 하나 이상의 패널을 생성하였다. 완전 인간 항-TNF 항체를 추가로 특성화한다. 모두 IgG1κ이다. 이러한 항체는 1×10⁹ 내지 9×10¹² 가량의 친화도 상수를 갖는 것으로 확인된다. 이들 전체 인간 단클론 항체의 의외로 높은 친화도는, 그들이 TNF 관련 질환, 병리, 또는 장애에서의 치료적 응용에 적합한 후보가 되게 한다.

약어. BSA - 소 혈청 알부민; CO₂ - 이산화탄소; DMSO -다이메틸 설폭사이드; EIA - 효소 면역검정; FBS - 소 태아 혈청; H₂O₂ - 과산화수소; HRP - 호스래디시 퍼옥시다제; ID ― 피내; Ig ― 면역글로불린; TNF - 조직 괴사 인자 알파; IP ― 복막내; IV ― 정맥내; Mab - 단클론 항체; OD - 광학 밀도; OPD - o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드; PEG - 폴리에틸렌 글리콜; PSA - 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신; RT - 실온; SQ ― 피하; v/v - 부피/부피; w/v - 중량/부피.

재료 및 방법.

동물. 인간 항체를 발현시킬 수 있는 트랜스제닉 생쥐는 당업계에 공지되어 있고 구매가능하며 (예를 들어, 캘리포니아주 산호세 소재의 젠팜 인터내셔날 (GenPharm International); 캘리포니아주 프리몬트 소재의 아브제닉스(Abgenix) 등으로부터), 이는 생쥐 IgM 또는 Igκ가 아니라 인간 면역글로불린을 발현시킨다. 예를 들어, 이러한 트랜스제닉 생쥐는 V(D)J 연결, 중쇄 분류 전환(class switching), 및 체세포 돌연변이를 겪어 인간 서열 면역글로불린의 레퍼토리를 생성하는 인간 서열 트랜스유전자를 함유한다 (문헌[Lonberg, et al., Nature 368:856-859 (1994)]). 경쇄 트랜스유전자는, 예를 들어, 생식세포 인간 Vκ 영역의 거의 절반을 포함하는 효모 인공 염색체 클론으로부터 부분적으로 유래될 수 있다. 부가적으로, 중쇄 트랜스유전자는 인간 μ 및 인간 γ1 (문헌[Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)]) 및/또는 γ3 불변 영역 둘 모두를 코딩할 수 있다. 적절한 유전자형 계통으로부터 유래된 생쥐를 면역화 및 융합 방법에 사용하여 TNF에 대한 전체 인간 단클론 항체를 생성할 수 있다.

면역화. 하나 이상의 면역화 스케쥴을 사용하여 항-TNF 인간 하이브리도마를 생성할 수 있다. 하기 예시적인 면역화 프로토콜에 따라 최초 몇몇 융합을 수행할 수 있지만, 다른 유사한 공지의 프로토콜을 사용할 수 있다. 몇 마리의 14 내지 20 주령 자성 및/또는 수술적으로 거세된 트랜스제닉 웅성 생쥐를 동일한 부피의 TITERMAX 또는 완전 프로인트 어쥬번트와 함께 100 내지 400 μL (예를 들어, 200)의 최종 부피로 유화시킨 1 내지 1000 ㎍의 재조합 인간 TNF로 IP 및/또는 ID 면역화한다. 각각의 생쥐는 또한 선택적으로 2개의 SQ 부위 각각에 100 μL 생리 식염수 중의 1 내지 10 ㎍을 받을 수 있다. 이어서, 1 내지 7, 5 내지 12, 10 내지 18, 17 내지 25, 및/또는 21 내지 34일 후에 동일한 부피의 TITERMAX 또는 완전 프로인트 어쥬번트와 함께 유화시킨 TNF로 생쥐를 IP (1 내지 400 ㎍) 및 SQ (1 내지 400 ㎍ × 2) 면역화할 수 있다. 12 내지 25 및 25 내지 40일 후에 항응고제 없이 후안와 천공에 의해 생쥐를 채혈할 수 있다. 이어서, RT에서 1시간 동안 혈액을 응고시키고, 혈청을 수집하고, 공지의 방법에 따라 TNF EIA 검정을 사용하여 역가를 측정한다. 반복된 주사가 역가의 증가를 야기하지 않을 때 융합을 수행한다. 그 시간에, 100 μL 생리 식염수에 희석된 1 내지 400 ㎍ TNF의 최종 IV 부스터 주사를 생쥐에게 제공할 수 있다. 3일 후에, 경추 탈골에 의해 생쥐를 안락사시키고, 비장을 무균적으로 제거하고, 100 U/mL의 페니실린, 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 0.25 ㎍/mL의 암포테리신 B (PSA)를 함유하는 10 mL의 차가운 인산 완충 식염수 (PBS)에 담글 수 있다. PSA-PBS로 비장을 멸균적으로 관류함으로써 비장세포를 수확한다. 차가운 PSA-PBS 중에 세포를 1회 세척하고, 트리판 블루 염료 배제를 사용하여 계수하고, 25 mM 헤페스를 함유하는 RPMI 1640 배지에 재현탁한다.

세포 융합. 공지의 방법에 따라, 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같이, 1:1 내지 1:10의 쥐과 골수종 세포 대 생존가능 비장 세포의 비에서 융합을 실행할 수 있다. 비제한적인 예로서, 비장 세포와 골수종 세포를 함께 펠렛화할 수 있다. 이어서, 37℃에서 30초에 걸쳐 펠렛을 1 mL의 50% (w/v) PEG/PBS 용액 (PEG 분자량 1,450, 시그마 (Sigma))에 천천히 재현탁할 수 있다. 이어서, 25 mM 헤페스 (37℃)를 함유하는 10.5 mL의 RPMI 1640 배지를 1분에 걸쳐 천천히 첨가함으로써 융합을 정지시킬 수 있다. 융합된 세포를 500 내지 1500 rpm에서 5 분 동안 원심분리한다. 이어서, 세포를 HAT 배지 (25 mM 헤페스, 10% 태아 클론 I (Fetal Clone I) 혈청 (Hyclone), 1 mM 피루브산나트륨, 4 mM L-글루타민, 10 ㎍/mL 겐타마이신, 2.5% Origen 배양 보충제 (피셔 (Fisher)), 10% 653-조건화 RPMI 1640/헤페스 배지, 50 μM 2-메르캅토에탄올, 100 μM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린, 및 16 μM 티미딘을 함유하는 RPMI 1640 배지)에 재현탁한 후, 15개의 96-웰 평면 바닥 조직 배양 플레이트에 200 μL/웰로 플레이팅한다. 이어서, 5% CO₂ 및 95% 공기를 함유하는 가습 37℃ 인큐베이터 내에 플레이트를 7 내지 10일 동안 위치시킨다.

생쥐 혈청 중의 인간 IgG 항- TNF 항체의 검출. 고체상 EIA를 사용하여 인간 TNF에 대해 특이적인 인간 IgG 항체에 대해 생쥐 혈청을 스크리닝할 수 있다. 약술하면, 플레이트를 TNF (PBS 중의 2 ㎍/mL)로 밤새 코팅할 수 있다. 0.02% (v/v) Tween 20을 함유하는 0.15 M 식염수에 세척한 후, PBS 중의 1% (w/v) BSA (200 μL/웰)로 RT에서 1시간 동안 웰을 차단할 수 있다. 플레이트는 즉시 사용하거나 향후 사용을 위해 -20℃에서 냉동시킨다. 생쥐 혈청 희석액을 TNF 코팅된 플레이트 상에서 50 μL/웰로 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 세척한 후, 1% BSA-PBS에 1:30,000으로 희석된 50 μL/웰 Fc 특이적 HRP-표지 염소 항-인간 IgG로 1시간 동안 RT에서 프로빙한다. 플레이트를 다시 세척하고 100 μL/웰의 시트레이트-포스페이트 기질 용액 (0.1 M 시트르산 및 0.2 M 인산나트륨, 0.01% H₂O₂, 및 1 mg/mL OPD)을 15분 동안 RT에서 첨가할 수 있다. 이어서, 정지 용액 (4 N 황산)을 25 μL/웰로 첨가하고, 자동 플레이트 분광광도계를 통해 490 nm에서 OD를 판독한다.

하이브리도마 상등액 중의 완전 인간 면역글로불린의 검출. 전체 인간 면역글로불린을 분비하는 성장 양성(growth positive) 하이브리도마는 적합한 EIA를 사용하여 검출할 수 있다. 약술하면, 96 웰 폽-아웃 플레이트 (pop-out plate) (VWR, 610744)를 탄산나트륨 완충제 중의 10 ㎍/mL 염소 항-인간 IgG Fc로 밤새 4℃에서 코팅할 수 있다. 플레이트를 세척하고, 1% BSA-PBS로 1시간 동안 37℃에서 차단하고, 즉시 사용하거나 -20℃에서 냉동시킨다. 희석하지 않은 하이브리도마 상등액을 플레이트 상에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 플레이트를 세척하고, 1% BSA-PBS에 1:10,000으로 희석된 HRP 표지 염소 항-인간 카파로 1시간 동안 37℃에서 프로빙한다. 이어서, 상기 기재된 바와 같이 플레이트를 기질 용액과 함께 인큐베이션한다.

전체 인간 항- TNF 반응성의 결정. 상기와 같이, 적합한 RIA 또는 다른 검정을 사용하여 TNF에 대한 반응성에 대해 하이브리도마를 동시에 검정할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같이 상등액을 염소 항-인간 IgG Fc 플레이트 상에서 인큐베이션하고 세척한 후, 적절한 계수/웰의 방사능 표지된 TNF로 1시간 동안 RT에서 프로빙한다. 웰을 PBS로 2회 세척하고 적합한 계수기를 사용하여 결합된 방사능 표지된 TNF를 정량화한다.

인간 IgG1κ 항-TNF 분비 하이브리도마를 세포 배양물 내에 확장시키고 제한 희석에 의해 연속하여 서브클로닝할 수 있다. 생성되는 클론 개체군을 확장시키고, 냉동 배지 (95% FBS, 5% DMSO) 중에 동결보존하고, 액체 질소 중에 저장할 수 있다.

아이소형화 ( Isotyping). 생쥐 면역 혈청을 비역가 (specific titer)에 대해 스크리닝하기 위해 사용된 것과 유사한 포맷으로 EIA를 사용하여 항체의 아이소형 결정을 수행할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 96-웰 플레이트 상에 TNF를 코팅하고, 정제된 항체를 2 ㎍/mL로 플레이트 상에 1시간 동안 RT에서 인큐베이션할 수 있다. 플레이트를 세척하고 1% BSA-PBS에 1:4000으로 희석된 HRP 표지 염소 항-인간 IgG₁ 또는 HRP 표지 염소 항-인간 IgG₃으로 1시간 동안 RT에서 프로빙한다. 플레이트를 다시 세척하고 상기 기재된 바와 같이 기질 용액과 함께 인큐베이션한다.

인간 TNF와 인간 항-인간 TNF 항체의 결합 동역학. 예를 들어, TNF 포획 EIA 및 BIAcore 기술을 사용하여 항체에 대한 결합 특징을 적합하게 평가할 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 검정에서 2 ㎍/mL의 TNF로 코팅된 EIA 플레이트에 대한 결합에 대해 등급화된 농도의 정제된 인간 TNF 항체를 평가할 수 있다. 이어서, 상대적 결합 효율을 나타내는 반-대수 플롯으로서 OD를 제공할 수 있다.

예를 들어, 하기와 같이, 또는 임의의 다른 공지된 적합한 방법에 의해 정량적 결합 상수를 얻을 수 있다. BIAcore CM-5 (카르복시메틸) 칩을 BIAcore 2000 단위 내에 위치시킨다. 안정한 기준선이 얻어질 때까지 칩의 플로우 셀 상에 HBS 완충제 (0.01 M 헤페스, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v P20 계면활성제, pH 7.4)를 5 μL/분으로 유동시킨다. 200 μL 물 중의 15 mg EDC (N-에틸-N'-(3-다이메틸-아미노프로필)-카르보다이이미드 하이드로클로라이드)의 용액 (100 μL)을 200 μL 물 중의 2.3 mg NHS (N-하이드록시석신이미드)의 용액 (100 μL)에 첨가한다. 생성되는 용액 40 μL를 칩 상에 주입한다. 인간 TNF의 용액 (10 mM 아세트산나트륨 중의 15 ㎍/mL, pH 4.8) 6 μL를 칩 상에 주입하여 약 500 RU의 증가를 유발한다. 완충제를 TBS/Ca/Mg/BSA 러닝 완충제 (running buffer) (20 mM 트리스, 0.15 M 염화나트륨, 2 mM 염화칼슘, 2 mM 아세트산마그네슘, 0.5% Triton X-100, 25 ㎍/mL BSA, pH 7.4)로 변경하고 칩 상에 밤새 유동시켜 그것을 평형화하고 임의의 미반응 석신이미드 에스테르를 가수분해하거나 캡핑한다.

항체를 33.33, 16.67, 8.33, 및 4.17 nM로 러닝 완충제에 용해시킨다. 유속을 30 μL/min으로 조정하고 기기 온도를 25℃로 조정한다. 동역학적 실행을 위해 2개의 플로우 셀을 사용하며, 하나는 그 위에 TNF가 고정된 것이고 (샘플) 두번째는 유도체화되지 않은 플로우 셀 (블랭크)이다. 각각의 항체 농도 120 μL를 플로우 셀 상에 30 μL/min으로 주입한 후에 (결합 단계) 중단 없이 360초 동안 완충제를 유동시킨다 (해리 단계). 각각 30 μL의 2 M 구아니딘 티오시아네이트를 순차적으로 2회 주입함으로써 칩의 표면을 재생시킨다 (조직 괴사 인자 알파 /항체 복합체가 해리됨).

당업계에 공지된 바와 같이, BIA evaluation 3.0 또는 CLAMP 2.0을 사용하여 데이터 분석을 실행한다. 각각의 항체 농도에 대해 샘플 센소그램으로부터 블랭크 센소그램을 감산한다. 해리 (k_d, sec^-1) 및 결합 (k_a, mol^-1 sec^-1) 둘 모두에 대해 전체적 적합 (global fit)을 실행하고 해리 상수 (K_D, mol)를 계산한다 (k_d/k_a). 포획된 항체의 RU가 100을 초과할 만큼 항체 친화도가 충분히 높은 경우, 항체의 부가적인 희석을 실행한다.

결과 및 토의.

항-인간 TNF 단클론 항체의 생성. 몇몇 융합을 수행하고 각각의 융합을 15개의 플레이트(1440 웰/융합)에 접종하며, 이는 인간 TNF에 특이적인 수십개의 항체를 생성한다. 이들 중에서 일부는 인간 및 생쥐 Ig 사슬의 조합으로 이루어진 것으로 확인된다. 나머지 하이브리도마는 인간 중쇄 및 경쇄로만 이루어진 항-TNF 항체를 분비한다. 인간 하이브리도마 중에서는 모두가 IgG1κ인 것으로 예상된다.

인간 항-인간 TNF 항체의 결합 동역학. ELISA 분석을 통해, 이들 하이브리도마 중의 대부분 또는 전부로부터 정제된 항체가 농도 의존적 방식으로 TNF에 결합함이 확인된다. 도 1 내지 도 2는 이들 항체의 상대적 결합 효율의 결과를 나타낸다. 이 경우, 그의 동족 항원 (에피토프)에 대한 항체의 결합력을 측정하였다. EIA 플레이트에 TNF가 직접 결합하는 것은 단백질의 변성을 야기할 수 있으며 겉보기 결합 친화도 (apparent binding affinity)는 변성되지 않은 단백질의 결합을 반영할 수 없음에 유의해야 한다. 소정 범위의 농도에 걸쳐 50% 결합이 확인된다.

인간 항체의 BIAcore 분석을 사용하여 정량적 결합 상수가 얻어지며, 몇몇 인간 단클론 항체는 K_D가 1×10^-9 내지 7×10^-12 범위인 매우 높은 친화도인 것으로 밝혀진다.

결론

인간 가변 영역 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 혼성화 생쥐로부터의 비장세포를 이용하여 몇몇 융합을 수행하며, 이를 인간 TNF로 면역화한다. IgG1κ 아이소형의 몇몇 완전 인간 TNF 반응성 IgG 단클론 항체의 세트가 생성된다. 완전 인간 항-TNF 항체를 추가로 특성화한다. 몇몇 생성된 항체의 친화도 상수는 1×10⁹ 내지 9×10¹²이다. 이들 전체 인간 단클론 항체의 의외로 높은 친화도는, 그들이 TNF-의존성 질환, 병리, 또는 관련 병태에서의 치료적 응용에 적합하게 한다.

실시예 3: 인간 TNFα에 대해 반응성인 인간 IgG 단클론 항체의 생성.

요약. 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대한 인간 가변 영역 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 (CBA/J × C57BL/6J) F₂ 혼성화 생쥐 (1 내지 4)를 재조합 인간 TNFα로 면역화하였다. GenTNV로 명명된 일 융합은 고정된 재조합 인간 TNFα에 결합하는 8개의 전체적 인간 IgG1κ 단클론 항체를 생성하였다. 동정 직후에, 추가의 특성화를 위해 8개의 세포주를 몰레큘라 바이올로지 (Molecular Biology)에 이전하였다. 이들 Mab는 전체적으로 인간의 서열이므로, 그들은 인간에서 cA2 (Remicade)보다 덜 면역원성일 것으로 예상된다.

약어. BSA - 소 혈청 알부민; CO₂ - 이산화탄소; DMSO -다이메틸 설폭사이드; EIA - 효소 면역검정; FBS - 소 태아 혈청; H₂O₂ - 과산화수소; H - 중쇄; HRP - 호스래디시 퍼옥시다제; ID ― 피내; Ig ― 면역글로불린; TNF - 조직 괴사 인자 알파; IP ― 복막내; IV ― 정맥내; Mab - 단클론 항체; OD - 광학 밀도; OPD - o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드; PEG - 폴리에틸렌 글리콜; PSA - 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신; RT - 실온; SQ ― 피하; TNFα - 종양 괴사 인자 알파; v/v - 부피/부피; w/v - 중량/부피.

서론. 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 함유하는 트랜스제닉 생쥐를 이용하여 재조합 인간 TNFα에 대해 특이적인 전체적 인간 단클론 항체를 생성하였다. 이들 특유한 항체가, cA2 (Remicade)가 사용되듯이, 증가된 혈청 반감기 및 면역원성에 관련된 감소된 부작용의 이익을 동반하여, TNFα-매개 질환에 관여하는 염증 과정을 치료적으로 저해하기 위해 사용될 수 있기를 희망한다.

재료 및 방법.

동물. 생쥐 IgM 또는 Igκ가 아니라 인간 면역글로불린을 발현시키는 트랜스제닉 생쥐는 젠팜 인터내셔날에 의해 개발되었다. 이들 생쥐는 V(D)J 연결, 중쇄 분류 전환, 및 체세포 돌연변이를 겪어 항원-특이적 인간 면역글로불린의 레퍼토리를 생성하는 기능성 인간 항체 트랜스유전자를 함유한다 (1). 경쇄 트랜스유전자는 생식세포 인간 Vκ 로커스의 거의 절반을 포함하는 효모 인공 염색체 클론으로부터 부분적으로 유래된다. 몇몇 VH 유전자에 부가하여, 중쇄 (HC) 트랜스유전자는 인간 μ 및 인간 γ1 (2) 및/또는 γ3 불변 영역 둘 모두를 코딩한다. HCo12/KCo5 유전자형 계통으로부터 유래된 생쥐를 면역화 및 융합 방법에 사용하여 본 명세서에 기재된 단클론 항체를 생성하였다.

인간 TNFα의 정제. Sepharose 4B (파마시아(Pharmacia))에 커플링된 TNFα 수용체-Fc 융합 단백질 (p55-sf2) (5)로 패킹된 컬럼을 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 C237A 세포로부터의 조직 배양 상등액으로부터 인간 TNFα를 정제하였다. 세포 상등액을 그의 1/9 부피의 10x 둘베코 PBS (D-PBS)와 혼합하고 4℃에서 4 mL/min으로 컬럼에 통과시켰다. 이어서, 컬럼을 PBS로 세척하고, 0.1 M 시트르산나트륨 (pH 3.5)로 TNFα를 용출시키고, 2 M 트리스-HCl (pH 8.5)으로 중화시켰다. 정제된 TNFα를 10 mM 트리스, 0.12 M 염화나트륨 (pH 7.5)로 완충제 교환하고 0.2 um 주사기 필터를 통해 여과하였다.

면역화. 대략 16 주령의 자성 젠팜 생쥐를 동일한 부피의 Titermax 어쥬번트와 함께 유화시킨 총 100 ㎍의 TNFα (로트 JG102298 또는 JG102098)로 제0일, 제12일, 및 제28일에 IP (200 μL) 및 ID (꼬리의 기저부에 100 μL) 면역화하였다. 제21일 및 제35일에 생쥐를 항응고제 없이 후안와 천공에 의해 채혈하였다. RT에서 1시간 동안 혈액을 응고시키고, 혈청을 수집하고, TNFα 고체상 EIA 검정을 사용하여 역가를 측정하였다. 제28일의 주사 후에 7주 동안 생쥐를 휴식시킨 후, GenTNV로 명명된 융합을 수행하였다. 이어서, TNFα에 대해 1:160의 특이적 인간 IgG 역가를 가진 생쥐에게, 100 μL 생리 식염수에 희석된 50 ㎍ TNFα의 최종 IV 부스터 주사를 제공하였다. 3일 후에, 경추 탈골에 의해 생쥐를 안락사시키고, 비장을 무균적으로 제거하고, 100 U/mL의 페니실린, 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 0.25 ㎍/mL의 암포테리신 B (PSA)를 함유하는 10 mL의 차가운 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 담갔다. PSA-PBS로 비장을 멸균적으로 관류함으로써 비장세포를 수확하였다. 차가운 PSA-PBS 중에 세포를 1회 세척하고, 쿨터 계수기(Coulter counter)를 사용하여 계수하고, 25 mM 헤페스를 함유하는 RPMI 1640 배지에 재현탁하였다.

세포주. 센토코르 (Centocor)의 제품 개발 그룹으로부터 5-14-97에 비-분비 생쥐 골수종 융합 파트너, 653이 셀 바이올로지 서비시즈 (CBS: Cell Biology Services) 그룹 내로 수용되었다. 10% (v/v) FBS (셀 컬쳐 랩스 (Cell Culture Labs)), 1 mM 피루브산나트륨, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-글루타민 (모두 JRH 바이오사이언시즈로부터)으로 보충된 RPMI 배지 (JRH 바이오사이언시즈 (JRH Biosciences)) 중에 세포주를 확장시키고, 95% FBS 및 5% DMSO (시그마) 중에 동결보존한 후, CBS 중에 증기상 액체 질소 냉동기 내에 저장하였다. 세포 은행은 멸균 상태였으며 (멜버른 소재의 퀄리티 콘트롤 센토코르 (Quality Control Centocor)) 마이코플라즈마가 없었다 (바이오니크 래보러토리즈 (Bionique Laboratories)). 융합될 때까지 세포를 대수 증식기 배양으로 유지하였다. 그들을 PBS에 세척하고, 계수하고, 융합 전에 트리판 블루 염료 배제를 통해 생존력을 결정하였다 (95% 초과).

인간 TNFα는 센토코르의 몰레큘라 바이올로지에서 생성된, C237A로 명명된 재조합 세포주에 의해 생성되었다. 5% (v/v) FBS (셀 컬쳐 랩스), 2 mM L-글루타민 (모두 JRH 바이오사이언시즈로부터), 및 0.5 :g/mL 마이코페놀산으로 보충된 IMDM 배지 (JRH 바이오사이언시즈) 중에 세포주를 확장시키고, 95% FBS 및 5% DMSO (시그마) 중에 동결보존한 후, CBS 중에 증기상 액체 질소 냉동기 내에 저장하였다 (13). 세포 은행은 멸균 상태였으며 (멜버른 소재의 퀄리티 콘트롤 센토코르) 마이코플라즈마가 없었다 (바이오니크 래보러토리즈).

세포 융합. 1:1의 653 쥐과 골수종 세포와 생존가능 쥐과 비장 세포의 비에서 세포 융합을 실행하였다. 약술하면, 비장 세포 및 골수종 세포를 함께 펠렛화하였다. 37℃에서 30초 기간에 걸쳐 펠렛을 1 mL의 50% (w/v) PEG/PBS 용액 (1,450 g/몰의 PEG 분자량, 시그마)에 천천히 재현탁하였다. 10.5 mL의 RPMI 배지 (첨가제 없음) (JRH) (37℃)를 1분에 걸쳐 천천히 첨가함으로써 융합을 정지시켰다. 융합된 세포를 750 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 세포를 HAT 배지 (10% 소 태아 혈청 (JRH), 1 mM 피루브산나트륨, 2 mM L-글루타민, 10 ㎍/mL 겐타마이신, 2.5% Origen 배양 보충제 (피셔), 50 μM 2-메르캅토에탄올, 1% 653-조건화 RPMI 배지, 100 μM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린, 및 16 μM 티미딘을 함유하는 RPMI/헤페스 배지)에 재현탁한 후, 5개의 96-웰 평면 바닥 조직 배양 플레이트에 200 μL/웰로 플레이팅하였다. 이어서, 5% CO₂ 및 95% 공기를 함유하는 가습 37℃ 인큐베이터 내에 플레이트를 7 내지 10일 동안 위치시켰다.

생쥐 혈청 중의 인간 IgG 항-TNFα 항체의 검출. 고체상 EIA를 사용하여 인간 TNFα에 대해 특이적인 인간 IgG 항체에 대해 생쥐 혈청을 스크리닝하였다. 약술하면, 플레이트를 TNFα (PBS 중의 1 ㎍/mL)로 밤새 코팅하였다. 0.02% (v/v) Tween 20을 함유하는 0.15 M 식염수에 세척한 후, PBS 중의 1% (w/v) BSA (200 μL/웰)로 RT에서 1시간 동안 웰을 차단하였다. 플레이트는 즉시 사용하거나 향후 사용을 위해 -20℃에서 냉동시켰다. 생쥐 혈청을 인간 TNFα-코팅된 플레이트 상에서 50 μL/웰로 RT에서 1시간 동안 2-배 연속 희석으로 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, 1% BSA-PBS에 1:30,000으로 희석된 50 μL/웰 Fc 특이적 HRP-표지 염소 항-인간 IgG (정확)로 1시간 동안 RT에서 프로빙하였다. 플레이트를 다시 세척하고 100 μL/웰의 시트레이트-포스페이트 기질 용액 (0.1 M 시트르산 및 0.2 M 인산나트륨, 0.01% H₂O₂ 및 1 mg/mL OPD)을 15분 동안 RT에서 첨가하였다. 이어서, 정지 용액 (4 N 황산)을 25 μL/웰로 첨가하고, 자동 플레이트 분광광도계를 사용하여 490 nm에서 OD를 판독하였다.

하이브리도마 상등액 중의 전체적 인간 면역글로불린의 검출. 젠팜 생쥐는 생쥐 및 인간 면역글로불린 사슬 둘 모두를 생성할 수 있으므로, 별개의 2가지 EIA 검정을 사용하여 인간 경쇄 및 인간 중쇄 둘 모두의 존재에 대해 성장-양성 하이브리도마 클론을 시험하였다. 상기 기재된 바와 같이 플레이트를 코팅하고 희석되지 않은 하이브리도마 상등액을 플레이트 상에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 1% BSA-HBSS에 1:10,000으로 희석된 HRP-접합 염소 항-인간 카파 (서던 바이오텍(Southern Biotech)) 항체 또는 1% BSA-HBSS에 1:30,000으로 희석된 HRP-접합 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 항체로 1시간 동안 37℃에서 프로빙하였다. 이어서, 상기 기재된 바와 같이 플레이트를 기질 용액과 함께 인큐베이션하였다. 항-인간 카파 및 항-인간 IgG Fc EIA 포맷 둘 모두에서 양성 신호를 제공하지 않은 하이브리도마 클론은 폐기하였다.

아이소형화. 생쥐 면역 혈청을 비역가에 대해 스크리닝하기 위해 사용된 것과 유사한 포맷으로 EIA를 사용하여 항체의 아이소형 결정을 수행하였다. EIA 플레이트를 염소 항-인간 IgG (H+L)로 탄산나트륨 완충제 중의 10 :g/mL에서 밤새 4℃에서 코팅하고 상기 기재된 바와 같이 차단하였다. 24 웰 배양으로부터의 순 상등액 (neat supernatant)을 플레이트 상에서 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 1% BSA-PBS에 1:4000으로 희석된 HRP-표지 염소 항-인간 IgG₁, IgG₂, IgG₃, 또는 IgG₄ (결합 부위)로 1시간 동안 RT에서 프로빙하였다. 플레이트를 다시 세척하고 상기 기재된 바와 같이 기질 용액과 함께 인큐베이션하였다.

결과 및 토의. 전체적 인간 항-인간 TNFα 단클론 항체의 생성. 재조합 인간 TNFα 단백질로 면역화한 젠팜 생쥐로부터 GenTNV로 명명된 일 융합을 수행하였다. 이 융합으로부터, 196개의 성장-양성 혼성체를 스크리닝하였다. 인간 TNFα와 반응성인 전체적 인간 IgG 항체를 분비한 8개의 하이브리도마 세포주를 동정하였다. 이들 8개의 세포주는 각각 인간 IgG1κ 아이소형의 면역글로불린을 분비하였으며, 모두 제한 희석에 의해 2회 서브클로닝하여 안정한 세포주를 얻었다 (90% 초과로 동종임). 세포주 명칭 및 각각의 C 코드 표기가 표 1에 열거되어 있다. 각각의 세포주를 액체 질소 중에 저장된 12-바이알 연구 세포 은행에 냉동하였다.

8개의 세포주 각각에 대해 24-웰 배양 디쉬의 웰로부터 수집된 모 세포를, 형질감염 및 추가의 특성화를 위해 2-18-99에 몰레큘라 바이올로지 그룹에 인계하였다.

[표 1]

결론.

인간 가변 영역 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 혼성화 생쥐로부터의 비장세포를 이용하여 GenTNV 융합을 수행하였으며, 이를 센토코르에서 제조된 재조합 인간 TNFα로 면역화하였다. IgG1κ 아이소형의, 8개의 전체적 인간 TNFα-반응성 IgG 단클론 항체가 생성되었다. 추가의 특성화 및 개발을 위해 모 세포주를 몰레큘라 바이올로지 그룹에 이전하였다. 이들 새로운 인간 항체 중 하나는 Remicade와 비교하여 감소된 면역원성 및 알레르기-유형 합병증의 잠재적 이익을 동반하여 항-염증에 유용한 것으로 입증될 수 있다.

참고문헌

Taylor, et al., International Immunology 6:579-591 (1993).

Lonberg, et al., Nature 368:856-859 (1994).

Neuberger, M. Nature Biotechnology 14:826 (1996).

Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996).

Scallon, et al., Cytokine 7:759-770 (1995).

실시예 4: 인간 항-TNFα 항체를 발현시키는 세포주의 클로닝 및 제조.

요약. TNV 표기를 가진 8개의 인간 단클론 항체 (mAbs)의 패널이 분명히 높은 결합력으로 고정된 인간 TNFα와 결합하는 것으로 확인되었다. 8개의 mAb 중 7개는 재조합 TNF 수용체에 대한 huTNFα 결합을 효율적으로 차단하는 것으로 나타났다. 7개의 mAb를 코딩하는 DNA의 서열 분석에 의해 모든 mAb가 인간 V 영역을 가졌음이 확인되었다. DNA 서열에 의해 또한, 8개의 mAb의 원래 패널이 TNV14, TNV15, TNV148, 및 TNV196에 의해 대표되는 단 4개의 구별되는 mAb를 함유하도록, mAb의 3개 쌍이 서로 동일하다는 것이 밝혀졌다. mAb의 추론된 아미노산 서열의 분석 및 시험관내 TNFα 중화 데이터의 결과에 기초하여, mAb TNV148 및 TNV14를 추가의 연구를 위해 선택하였다.

데이터베이스 연구 중에 TNV148 중쇄 내의 위치 75 (프레임워크 3)의 프롤린 잔기는 동일한 하위군의 다른 인간 항체 내의 그 위치에서 확인되지 않았으므로, 그것을 공지의 생식세포 프레임워크 e 서열에 부합시키기 위해, 부위 지정 DNA 돌연변이 유발을 수행하여 그 위치에서 세린 잔기를 코딩하였다. 세린 변형된 mAb는 TNV148B로 표기하였다. TNV148B 및 TNV14의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 PCR-증폭 DNA를 새로 제조한 발현 벡터 내로 클로닝하였으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 국제특허 공개 WO 02/12500호로서 공개된, 제목이 "IL-12 항체, 조성물, 방법, 및 용도 (IL-12 Antibodies, Compositions, Methods and Uses)"인, 2000년 10월 7일자로 출원된 미국 특허 출원 제60/236,827호에 개시된, 최근에 클로닝된 다른 인간 mAb (12B75)의 중쇄 및 경쇄 유전자에 기초하였다.

P3X63Ag8.653 (653) 세포 또는 Sp2/0-Ag14 (Sp2/0) 생쥐 골수종 세포를 각각의 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드로 형질감염시키고, 고수준의 재조합 TNV148B 및 TNV14 (rTNV148B 및 rTNV14) mAb를 생성하는 세포주에 대한 2 라운드의 서브클로닝을 통해 스크리닝하였다. 시간 경과에 따른 mAb 생성의 안정성 및 성장 곡선의 평가는, 소진된 배양에서 653-형질감염체 클론 C466D 및 C466C는 대략 125 ：g/ml의 rTNV148B mAb를 안정적으로 생성한 반면에 Sp2/0 형질감염체 1.73-12-122 (C467A)는 소진된 배양에서 대략 25 ：g/ml의 rTNV148B mAb를 안정적으로 생성했음을 나타냈다. 유사한 분석은 소진된 배양에서 Sp2/0-형질감염체 클론 C476A가 18 ：g/ml의 rTNV14를 생성했음을 나타냈다.

서론. 인간 TNFα-면역화 젠팜/메다렉스 (Medarex) 생쥐 (HCo12/KCo5 유전자형)로부터 유래된 8개의 mAb의 패널은 이전에 인간 TNFα와 결합하고 전체적 인간 IgG1, 카파 아이소형을 갖는 것으로 나타났다. 본 발명의 예시적인 mAb가 TNFα-중화 활성을 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하기 위해, TNFα가 재조합 TNF 수용체에 결합하는 것을 차단하는 그들의 능력을 평가함으로써 단순 결합 검정을 사용하였다. 그러한 결과, DNA 서열 결과, 및 몇몇 mAb의 시험관내 특성화에 기초하여, 추가로 특성화할 mAb로서 TNV148을 선택하였다.

TNV148 mAb를 코딩하는 DNA 서열을 클로닝하고, 적합한 불변 영역을 코딩하는 유전자 발현 벡터 내로 적합되도록 변형하고, 잘 특성화된 653 및 Sp2/0 생쥐 골수종 세포 내로 도입하고, 원래의 하이브리도마 세포주보다 40-배 더 많은 mAb를 생성하는 서브클론이 동정될 때까지 생성되는 형질감염된 세포주를 스크리닝하였다.

재료 및 방법.

시약 및 세포. TRIZOL 시약은 깁코 BRL (Gibco BRL)로부터 구매하였다. 프로테이나제 K는 시그마 케미칼 컴퍼니 (Sigma Chemical Company)로부터 입수하였다. 역전사효소 (Reverse Transcriptase)는 라이프 사이언시즈 인코포레이티드 (Life Sciences, Inc.)로부터 입수하였고, Taq DNA 폴리머라제는 퍼킨 엘머 세투스 (Perkin Elmer Cetus) 또는 깁코 BRL로부터 입수하였다. 제한 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs)로부터 구매하였다. QIAquick PCR 정제 키트는 퀴아젠 (Qiagen)으로부터 입수하였다. QuikChange 부위 지정 돌연변이 유발 키트는 스트라타젠 (Stratagene)으로부터 구매하였다. Wizard 플라스미드 미니프렙 키트 및 RNasin은 프로메가 (Promega)로부터 입수하였다. Optiplate는 패카드 (Packard)로부터 입수하였다. ¹²⁵요오드는 아머샴 (Amersham)으로부터 구매하였다. 주문형 올리고뉴클레오티드는 키스톤 (Keystone)/바이오소스 인터내셔날 (Biosource International)로부터 구매하였다. 본 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드의 명칭, 식별 번호, 및 서열을 표 2에 나타낸다.

표 2. TNV mAb 유전자를 클로닝하거나 조작하거나 서열분석하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드.

올리고뉴클레오티드 5'14s 및 HuH-J6에 의해 코딩되는 아미노산은 서열 위에 나타낸다. 'M' 아미노산 잔기는 번역 시작 코돈을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 5'14s 및 HuH-J6 내의 밑줄로 표시된 서열은 각각 BsiWI 및 BstBI 제한 부위를 표시한다 HuH-J6 내의 사선은 엑손/인트론 경계에 상응한다. 그의 서열이 마이너스 가닥에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 3'-5' 배향으로 작성됨에 유의한다.

653 생쥐 골수종 세포의 단일 냉동 바이알이 얻어졌다. 그 날 바이알을 해동시키고 T 플라스크 내에서 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민 (배지) 중에 확장시켰다. 2 내지 3주 후에 본 명세서에 기재된 항-TNF DNA로 이들 세포가 형질감염될 때까지 그들을 계속 배양하며 유지하였다. 해동일로부터 5일 후에 배양물 중 일부를 수확하고, 원심분리에 의해 펠렛화하고, 95% FBS, 5% DMSO 중에 재현탁하고, 30개의 바이알 내로 분취하고, 향후 사용을 위해 냉동하여 저장하였다. 마찬가지로, Sp2/0 생쥐 골수종 세포의 단일 냉동 바이알이 얻어졌다. 바이알을 해동시키고, 상기 기재된 바와 같이 새로운 냉동물 (freeze-down)을 제조하고, 냉동 바이알을 CBC 냉동기 박스 AA 및 AB에 저장하였다. 이들 세포를 해동시키고 본 명세서에 기재된 모든 Sp2/0 형질감염에 사용하였다.

수용체에 대한 TNF 결합의 저해에 대한 검정. TNV mAb를 함유하는 하이브리도마 세포 상등액을 사용하여 mAb가 재조합 TNF 수용체 융합 단백질, p55-sf2에 대한 ¹²⁵I-표지 TNFα의 결합을 차단하는 능력에 대해 검정하였다 (문헌[Scallon et al. (1995) Cytokine 7:759-770]). 50：l의 p55-sf2 (PBS 중의 0.5 ：g/ml)를 Optiplate에 첨가하여 37℃에서의 1-시간 인큐베이션 중에 웰을 코팅하였다. PBS/ 0.1% BSA를 희석제로 사용하여 8개의 TNV 세포 상등액의 연속 희석액을 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 제조하였다. 항-IL-18 mAb를 함유하는 세포 상등액이 음성 대조군으로서 포함되었고, cA2 (항-TNF 키메라 항체, Remicade, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,770,198호)로 스파이킹된 동일한 항-IL-18 상등액이 양성 대조군으로서 포함되었다. 5 ng/ml의 최종 TNFα 농도를 갖도록 ¹²⁵I-표지 TNFα (58 ：Ci/：g, D. Shealy)를 100 ：l의 세포 상등액에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 RT에서 프리인큐베이션하였다. 코팅된 Optiplate를 세척하여 결합하지 않은 p55-sf2를 제거하고 50 ：l의 ¹²⁵I-TNFα/세포 상등액 혼합물을 Optiplate에 이전하였다. RT에서 2시간 후에, Optiplate를 PBS-Tween으로 3회 세척하였다. 100：l의 Microscint-20을 첨가하고 TopCount 감마 계수기를 사용하여 결합된 cpm을 결정하였다.

V 유전자의 증폭 및 DNA 서열 분석. 하이브리도마 세포를 PBS에 1회 세척한 후 RNA 제조를 위해 TRIZOL 시약을 첨가하였다. 7 × 10⁶ 내지 1.7 × 10⁷개의 세포를 1 ml TRIZOL에 재현탁하였다. 200 μl의 클로로포름의 첨가 후에 시험관을 격렬하게 진탕하였다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 수성상을 새로운 마이크로퓨지 시험관에 이전하고 동일한 부피의 아이소프로판올을 첨가하였다. 시험관을 격렬하게 진탕하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 1 ml의 70% 에탄올로 1회 세척하고 진공 건조기 내에서 짧게 건조시켰다. 40 μl의 DEPC-처리수로 RNA 펠렛을 재현탁하였다. 1% 아가로스 겔에서 0.5 μl를 분획화함으로써 RNA 제제의 품질을 결정하였다. RNA를 사용될 때까지 ―80℃ 냉동기 내에 저장하였다.

중쇄 및 경쇄 cDNA를 제조하기 위해, 11.5 μl의 부피 내에 3 μl의 RNA 및 1 ㎍의 올리고뉴클레오티드 119 (중쇄) 또는 올리고뉴클레오티드 117 (경쇄) (표 1 참조)를 포함한 혼합물을 제조하였다. 수조 내에서 혼합물을 70℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후에 얼음 상에서 10분 동안 냉각시켰다. 2.5 μl의 10X 역전사효소 완충제, 10 μl의 2.5 mM dNTP, 1 μl의 역전사효소 (20 단위), 및 0.4 μl의 리보뉴클레아제 저해제 RNasin (1 단위)으로 이루어진 별개의 혼합물을 제조하였다. 13.5 μl의 이 혼합물을 11.5 μl의 냉각된 RNA/올리고뉴클레오티드 혼합물에 첨가하고 반응 혼합물을 40분 동안 42℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, cDNA 합성 반응 혼합물을 사용될 때까지 ―20℃ 냉동기 내에 저장하였다.

정제되지 않은 중쇄 및 경쇄 cDNA를 주형으로 사용하여 가변 영역 코딩 서열을 PCR-증폭하였다. 5개의 올리고뉴클레오티드 쌍 (366/354, 367/354, 368/354, 369/354, 및 370/354, 표 1)을 중쇄 DNA의 증폭을 프라이밍하는 그들의 능력에 대해 동시에 시험하였다. 2개의 올리고뉴클레오티드 쌍 (362/208 및 363/208)을 경쇄 DNA의 증폭을 프라이밍하는 그들의 능력에 대해 동시에 시험하였다. 50 μl의 총 부피 내에 2 단위의 PLATINUM ™ 고충실도 (HIFI) Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 PCR 반응을 실행하였다. 각각의 반응 혼합물은 2 μl의 cDNA 반응 혼합물, 10 pmole의 각각의 올리고뉴클레오티드, 0.2 mM의 dNTP, 5 μl의 10 X HIFI 완충제, 및 2 mM 황산마그네슘을 포함하였다. 유전자 증폭장치 프로그램은 5분 동안 95℃ 후에 30 사이클의 (30초 동안 94℃, 30초 동안 62℃, 1.5분 동안 68℃)이다. 이어서, 68℃에서 10분 동안의 최종 인큐베이션이 있었다.

직접 DNA 서열분석을 위한 PCR 산물을 제조하기 위해, QIAquick™ PCR 정제 키트를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 그들을 정제하였다. 50 μl의 멸균수를 사용하여 스핀 컬럼으로부터 DNA를 용출시킨 후에 진공 건조기를 사용하여 10 μl의 부피까지 건조시켰다. 이어서, 20 μl의 총 부피에 1 μl의 정제된 PCR 산물, 10 μM의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 4 μl의 BigDye Terminator™ ready reaction mix, 및 14 μl의 멸균수로 DNA 서열분석 반응을 설정하였다. 올리고뉴클레오티드 쌍 367/354로 제조된 중쇄 PCR 산물은 올리고뉴클레오티드 프라이머 159 및 360으로 서열분석하였다. 올리고뉴클레오티드 쌍 363/208로 제조된 경쇄 PCR 산물은 올리고뉴클레오티드 34 및 163으로 서열분석하였다. 서열분석을 위한 유전자 증폭장치 프로그램은 25 사이클의 (30초 동안 96℃, 15초 동안 50℃, 4분 동안 60℃)에 이어서 밤새 4℃였다. 폴리아크릴아미드 겔을 통해 반응 산물을 분획화하고 ABI 377 DNA 서열분석기를 사용하여 검출하였다.

아미노산을 변경하기 위한 부위 지정 돌연변이 유발. TNV148 mAb에서 Pro⁷⁵를 세린 잔기로 대체하기 위해 TNV148 중쇄 가변 영역 DNA 서열 내의 단일 뉴클레오티드를 변경하였다. 제조자에 의해 기재된 바와 같이 QuikChange™ 부위 지정 돌연변이 유발 방법을 사용하여 이 변화를 실행하기 위해 상보적 올리고뉴클레오티드, 399 및 400 (표 1)을 설계하고 주문하였다. 15% 폴리아크릴아미드 겔을 통해 2개의 올리고뉴클레오티드를 먼저 분획화하고 주요 밴드를 정제하였다. 10 ng 또는 50 ng의 TNV148 중쇄 플라스미드 주형 (p1753), 5 μl의 10X 반응 완충제, 1 μl의 dNTP 혼합물, 125 ng의 프라이머 399, 125 ng의 프라이머 400, 및 1 μl의 Pfu DNA 폴리머라제를 사용하여 돌연변이 유발 반응 혼합물을 제조하였다. 멸균수를 첨가하여 총 부피를 50 μl가 되게 하였다. 이어서, 95℃에서 30초 동안 인큐베이션한 후, 30초 동안 95℃, 1분 동안 55℃, 1분 동안 64℃, 및 7분 동안 68℃의 순차적 인큐베이션으로 14회 사이클링하고, 2분 동안 30℃ (1 사이클)가 이어지도록 프로그래밍된 유전자 증폭장치 내에서 반응 혼합물을 인큐베이션하였다. 이들 반응은 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드를, 그 밖에는 동일한 새로 합성된 플라스미드 내로 도입하도록 설계되었다. 원래의 TNV148 플라스미드를 제거하기 위해, 원래의 메틸화된 플라스미드만 절단하는 1 μl의 DpnI 엔도뉴클레아제를 첨가한 후에 샘플을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 1 μl의 반응 혼합물을 사용하여 표준 열-충격 방법에 의해 에피쿠리안 콜라이 (Epicurian Coli) XL1-블루 초적격 (XL1-Blue supercompetent) 이. 콜라이를 형질전환하고 형질전환된 박테리아를 LB-암피실린 아가 플레이트 상에 플레이팅한 후에 동정하였다. Wizard™ 키트를 사용하여 제조자에 의해 기재된 바와 같이 플라스미드 미니프렙을 제조하였다. Wizard™ 컬럼으로부터 샘플을 용출시킨 후에, 플라스미드 DNA를 에탄올로 침전시켜 플라스미드 DNA를 추가로 정제한 후, 20 μl의 멸균수에 재현탁하였다. 이어서, DNA 서열 분석을 수행하여 원하는 염기 변화를 가진 플라스미드 클론을 동정하고 다른 염기 변화가 TNV148 코딩 서열 내로 우연히 도입되지 않았음을 확인하였다. 섹션 4.3에 기재된 동일한 파라미터를 사용하여 1 μl의 플라스미드에 3 μl의 BigDye 혼합물, 1 μl의 pUC19 정방향 프라이머, 및 10 μl의 멸균수로 제조된 사이클 서열분석 반응을 적용하였다.

12B75 유전자로부터의 발현 벡터의 제조. 몇몇 재조합 DNA 단계를 수행하여, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 국제특허 공개 WO 02/12500호로서 공개된, 제목이 "IL-12 항체, 조성물, 방법, 및 용도 (IL-12 Antibodies, Compositions, Methods and Uses)"인, 2000년 10월 7일자로 출원된 미국 특허 출원 제60/236,827호에 개시된 12B75-코딩 중쇄 및 경쇄 유전자의 이전에 클로닝된 게놈 카피로부터 새로운 인간 IgG1 발현 벡터 및 새로운 인간 카파 발현 벡터를 각각 제조하였다. 최종 벡터는 기존의 가변 영역 서열을 임의의 적절하게 설계된 PCR-증폭 가변 영역으로 단순한 1-단계로 대체하는 것을 허용하도록 설계되었다.

플라스미드 p1560 내의 12B75 중쇄 유전자를 변형하기 위해, 프로모터 및 가변 영역을 함유하는 6.85 kb BamHI/HindIII 단편을 p1560으로부터 pUC19로 이전하여 p1743을 제조하였다. p1560에 비교하여 더 작은 이 플라스미드의 크기는, 제조자의 프로토콜에 따라 번역 개시 부위의 바로 업스트림에 특유한 BsiWI 클로닝 부위를 도입하기 위한 QuikChange™ 돌연변이 유발 (올리고뉴클레오티드 BsiWI-1 및 BsiWI-2를 사용함)의 사용을 가능하게 하였다. 생성되는 플라스미드를 p1747로 명명하였다. 가변 영역의 3' 말단부에 BstBI 부위를 도입하기 위해, SalI 및 BstBI 부위를 가진 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다. 이 프라이머를 pUC 역방향 프라이머와 함께 사용하여 p1747로부터 2.75 kb 단편을 증폭하였다. 이어서, 이 단편을 12B75 가변 영역 내의 자연발생 SalI 부위 및 HindIII 부위 내로 다시 클로닝함으로써, 특유한 BstB1 부위를 도입하였다. p1750로 표기된, 생성되는 중간 벡터는 BsiWI 및 BstBI 말단부를 가진 가변 영역 단편을 수용할 수 있었다. 불변 영역 또한 12B75 유전자로부터 유래된 중쇄 벡터의 버전을 제조하기 위해, HindIII 부위의 다운스트림에 EcoRI 부위를 갖도록 p1750 내의 BamHI-HindIII 인서트를 pBR322로 이전하였다. 이어서, 생성되는 플라스미드, p1768을 HindIII 및 EcoRI로 분해하고, 대형 BamHI-BamHI 단편을 p1560으로부터 pBC 내로 클로닝함으로써 유래된 서브클론인 p1744로부터의 5.7 kb HindIII-EcoRI 단편에 라이게이션하였다. 이어서, 생성되는 플라스미드, p1784를 BsiWI 및 BstBI 말단부를 가진 TNV Ab cDNA 단편을 위한 벡터로 사용하였다. 발현 벡터, p1788 및 p1798을 제조하기 위해 부가적인 연구를 실행하였으며, 이는 12B75 유전자로부터의 IgG1 불변 영역을 포함하고 얼마나 많은 12B75 중쇄 J-C 인트론을 그들이 함유하는지에 있어서 서로 상이하다.

플라스미드 p1558 내의 12B75 경쇄 유전자를 변형하기 위해, 12B75 프로모터 및 가변 영역을 함유하는 5.7 kb SalI/AflII 단편을 p1558로부터 플라스미드 L28의 XhoI/AflII 부위 내로 이전하였다. 이 새로운 플라스미드, p1745는 돌연변이 유발 단계를 위한 더 작은 주형을 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 (C340salI 및 C340sal2)를 사용하여 QuikChange™ 돌연변이 유발에 의해 가변 영역의 5' 말단부에 특유한 SalI 제한 부위를 도입하였다. 생성되는 중간 벡터, p1746은 특유한 SalI 및 AflII 제한 부위를 가졌으며, 그 안으로 가변 영역 단편을 클로닝할 수 있었다. p1746 내로 클로닝된 임의의 가변 영역 단편은, 바람직하게는 경쇄 유전자의 3' 절반과 연결될 것이다. 이 목적으로 사용할 수 있는 12B75 경쇄 유전자의 3' 절반으로부터의 제한 단편을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오티드 BAHN-1 및 BAHN-2를 서로 어닐링하여 제한 부위 BsiW1, AflII, HindII, 및 NotI을 함유하는 이중 가닥 링커를 형성하였으며, 이는 KpnI 및 SacI 부위 내로 라이게이션될 수 있는 말단부를 함유하였다. 이 링커를 pBC의 KpnI과 SacI 부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 p1757을 제공하였다. p1558을 AflII로 분해한 후에 HindIII으로 부분적으로 분해함으로써 생성된 12B75 경쇄 불변 영역을 함유하는 7.1 kb 단편을 p1757의 AflII와 HindII 부위 사이에 클로닝하여 p1762를 생성하였다. 이 새로운 플라스미드는 BsiWI 및 AflII를 위한 특유한 부위를 함유하였으며, 그 안으로 프로모터 및 가변 영역을 함유하는 BsiWI/AflII 단편을 이전하여 유전자의 2개의 절반을 통합할 수 있었다.

발현 플라스미드의 cDNA 클로닝 및 조립. DNA 말단부를 추가로 채우기 위해 모든 RT-PCR 반응 혼합물(상기 참조)을 클레나우 효소로 처리하였다. 중쇄 PCR 단편을 제한 효소 BsiWI 및 BstBI로 분해한 후에 플라스미드 L28의 BsiWI과 BstBI 부위 사이에 클로닝하였다 (12B75-기반 중간 벡터 p1750이 아직 제조되지 않았으므로 L28을 사용함). 클로닝된 인서트의 DNA 서열 분석은 생성되는 구조체가 정확했고 PCR 증폭 중에 오류가 도입되지 않았음을 나타냈다. 이들 L28 플라스미드 구조체 (TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B, 및 TNV196의 경우)에 배정된 식별 번호를 표 3에 나타낸다.

TNV14, TNV148, 및 TNV148B 중쇄를 위한 BsiWI/BstBI 인서트를 L28 벡터로부터 새로 제조된 중간 벡터, p1750으로 이전하였다. 이들 중간 플라스미드에 배정된 식별 번호를 표 2에 나타낸다. TNV15 및 TNV196에는 이 클로닝 단계 및 후속 단계를 실행하지 않았다. 이어서, 2개의 상이한 인간 IgG1 발현 벡터 내로 가변 영역을 이전하였다. 제한 효소 EcoRI 및 HindIII을 사용하여 센토코르의 이전에-사용된 IgG1 벡터, p104 내로 가변 영역을 이전하였다. Gm(f+) 동종이형의 IgG1을 코딩하는 생성되는 발현 플라스미드를 p1781 (TNV14), p1782 (TNV148), 및 p1783 (TNV148B)으로 표기하였다 (표 2 참조). 가변 영역을 또한 12B75 (젠팜) 유전자로부터 유래된 IgG1 불변 영역의 업스트림에 클로닝하였다. G1m(z) 동종이형의 IgG1을 코딩하는 그러한 발현 플라스미드 또한 표 3에 열거되어 있다.

표 3. 다양한 중쇄 및 경쇄 플라스미드에 대한 플라스미드 식별 번호.

L28 벡터 또는 pBC 벡터는 초기 Ab cDNA 클론을 대표한다. 그러한 플라스미드 내의 인서트를 불완전 12B75-기반 벡터에 이전하여 중간 플라스미드를 제조하였다. 부가적인 일 이전 단계는 최종 발현 플라스미드를 유발했으며, 이는 선형화된 후에 세포 내로 도입되거나 세포 형질감염 전에 mAb 유전자 인서트를 정제하기 위해 사용되었다. ND: 실행되지 않음

경쇄 PCR 산물을 제한 효소 SalI 및 SacII로 분해한 후에 플라스미드 pBC의 SalI과 SacII 부위 사이에 클로닝하였다. 하나의 아미노산이 상이한 2개의 상이한 경쇄 버전을 p1748 및 p1749로 표기하였다 (표 2). DNA 서열 분석에 의해 이들 구조체가 정확한 서열을 가졌음이 확인되었다. 이어서, p1748 및 p1749 내의 SalI/AflII 단편을 중간 벡터 p1746의 SalI과 AflII 부위 사이에 클로닝하여 각각 p1755 및 p1756을 제조하였다. 이어서, p1755 및 p1756으로부터의 BsiWI/AflII 단편을 새로 제조된 구조체 p1762에 이전함으로써 이들 경쇄 유전자의 5' 절반을 유전자의 3' 절반에 연결하여 각각 최종 발현 플라스미드 p1775 및 p1776을 제조하였다 (표 2).

세포 형질감염, 스크리닝, 및 서브클로닝. 다양한 TNV 발현 플라스미드를 이용하여 총 15개의 생쥐 골수종 세포의 형질감염을 수행하였다 (결과 및 토의 섹션의 표 3 참조). 이들 형질감염은 (1) 숙주 세포가 Sp2/0 또는 653이고; (2) 중쇄 불변 영역이 센토코르의 이전의 IgG1 벡터에 의해 코딩되었거나 12B75 중쇄 불변 영역이며; (3) mAb가 TNV148B, TNV148, TNV14, 또는 새로운 HC/LC 조합이고; (4) DNA가 선형화된 플라스미드 또는 정제된 Ab 유전자 인서트인지 여부; 및 (5) 중쇄 유전자 내의 완전 J-C 인트론 서열의 존재 또는 부재에 의해 구별되었다. 부가적으로, 몇몇 형질감염을 반복하여 많은 수의 클론이 스크리닝될 수 있는 가능성을 증가시켰다.

이전에 기재된 바와 같이 (문헌[Knight DM et al. (1993) Molecular Immunology 30:1443-1453]) 표준 조건 하의 전기천공에 의해 Sp2/0 세포 및 653 세포를 중쇄 및 경쇄 DNA의 혼합물 (각각 8 내지 12 ：g)로 각각 형질감염시켰다. 형질감염 번호 1, 2, 3, 및 16의 경우, 형질감염 전에 제한 효소를 이용한 분해에 의해 적절한 발현 플라스미드를 선형화하였다. 예를 들어, SalI 및 NotI 제한 효소를 사용하여 각각 TNV148B 중쇄 플라스미드 p1783 및 경쇄 플라스미드 p1776을 선형화하였다. 나머지 형질감염의 경우, 중쇄 플라스미드를 BamHI 로 분해하고 경쇄 플라스미드를 BsiWI 및 NotI로 분해함으로써, mAb 유전자만 함유하는 DNA 인서트를 플라스미드 벡터로부터 분리하였다. 이어서, mAb 유전자 인서트를 아가로스 겔 전기영동 및 Qiex 정제 수지에 의해 정제하였다. 정제된 유전자 인서트로 형질감염된 세포를, 선택가능 마커의 공급원으로서 3 내지 5 ：g의 PstI-선형화 pSV2gpt 플라스미드 (p13)로 동시에 형질감염시켰다. 전기천공 후에, 96-웰 조직 배양 디쉬 내에 세포를 IMDM, 15% FBS, 2 mM 글루타민 중에 접종하고 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 내에 인큐베이션하였다. 2일 후에, 동일한 부피의 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민, 2 X MHX 선택 (1 X MHX = 0.5 ：g/ml 마이코페놀산, 2.5 ：g/ml 하이포잔틴, 50 ：g/ml 잔틴)을 첨가하고 콜로니가 형성되는 동안 부가적인 2 내지 3주 동안 플레이트를 인큐베이션하였다.

콜로니를 가진 웰로부터 수집된 세포 상등액을 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 인간 IgG에 대해 검정하였다. 약술하면, 세포 상등액의 변화하는 희석액을 다클론 염소 항-인간 IgG Fc 단편으로 코팅된 96-웰 EIA 플레이트 내에 인큐베이션한 후, 알칼라인 포스파타제-접합 염소 항-인간 IgG(H+L) 및 적절한 발색 기질을 사용하여 결합된 인간 IgG를 검출하였다. 상등액 중의 인간 IgG의 정량화를 가능하게 하기 위해, 세포 상등액에서 측정되는 동일한 정제된 mAb를 표준으로 사용한 표준 곡선이 각각의 EIA 플레이트에 대해 포함되었다. 소진된 배양물 내의 부가적인 생성 결정을 위해, 가장 많은 인간 IgG를 생성하고 있는 것으로 나타난 콜로니 내의 세포를 24-웰 플레이트 내로 계대배양한 후에 최고-생성 모 클론을 동정하였다.

최고-생성 모 클론을 서브클로닝하여 더 많이 생성하는 서브클론을 동정하고 더 많은 동종 세포주를 제조하였다. 96-웰 조직 배양 플레이트를 웰당 1개의 세포 또는 웰당 4개의 세포로 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민, 1 X MHX 중에 접종하고, 콜로니가 분명할 때까지 37 ℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 내에 12 내지 20일 동안 인큐베이션하였다. 웰당 1개의 콜로니를 함유한 웰로부터 세포 상등액을 수집하고 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 선택된 콜로니를 24-웰 플레이트에 계대배양하고, 배양물을 소진시킨 후에 그들의 상등액 중의 인간 IgG 수준을 정량화함으로써 최고-생성 서브클론을 동정하였다. 선택된 제1 라운드 서브클론에 제2 라운드의 서브클로닝을 적용한 경우, 이 방법을 반복하였다. 최상의 제2 라운드 서브클론을 개발을 위한 세포주로서 선택하였다.

세포 서브클론의 특성화. 최상의 제2 라운드 서브클론을 선택하고 성장 곡선을 수행하여 mAb 생성 수준 및 세포 성장 특징을 평가하였다. T75 플라스크를 30 ml IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민, 및 1X MHX (또는 무혈청 배지) 중의 1 × 10⁵ 세포/ml로 접종하였다. 300 μl의 분취량을 24 hr 간격으로 취하고 생존 세포 밀도를 결정하였다. 생존 세포의 수가 1 × 10⁵ 세포/ml 미만일 때까지 분석을 계속하였다. 수집된 세포 상등액의 분취량을 존재하는 항체의 농도에 대해 검정하였다. rTNV148B 또는 rTNV14 JG92399를 표준으로 사용하여 ELISA 검정을 수행하였다. 다클론 염소 항-인간 IgG Fc로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 샘플을 1시간 동안 인큐베이션하고 결합된 mAb를 알칼라인 포스파타제-접합 염소 항-인간 IgG(H+L)로 1:1000 희석에서 검출하였다.

변화하는 양의 MHX 선택의 존재 하에 성장 속도를 비교할 목적으로 2개의 세포주에 대해 상이한 성장 곡선 분석 또한 실행하였다. 세포주 C466A 및 C466B를 무-MHX 배지 (IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민) 내로 해동시키고 부가적인 2일 동안 배양하였다. 이어서, 둘 모두의 세포 배양물을 MHX를 함유하지 않거나 0.2X MHX 또는 1X MHX를 함유한 (1X MHX = 0.5 ：g/ml 마이코페놀산, 2.5 ：g/ml 하이포잔틴, 50 ：g/ml 잔틴) 3개의 배양물로 분할하였다. 1일 후에, 새로운 T75 플라스크를 1 × 10⁵ 세포/ml의 시작 밀도에서 배양물로 접종하고, 1주 동안 24시간 간격으로 세포를 계수하였다. mAb 생성에 대한 분취량은 수집하지 않았다. SOP PD32.025에 제공된 수학식을 사용하여 이들 샘플에 대해 배가 시간을 계산하였다.

시간 경과에 따른 mAb 생성의 안정성을 평가하기 위해 부가적인 연구를 수행하였다. 24-웰 플레이트 내에서 MHX 선택의 존재 또는 부재 하에 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민 중에 배양물을 성장시켰다. 배양물이 포화될 때마다 배양물을 새로운 배양물로 분배한 후 더 오래된 배양물은 소진시켰다. 이 시간에 상등액의 분취량을 취하고 4℃에서 저장하였다. 55 내지 78일의 기간에 걸쳐 분취량을 취하였다. 이 기간의 종점에서, 상기 개관된 바와 같이 항-인간 IgG Fc ELISA에 의해 상등액을 존재하는 항체의 양에 대해 시험하였다.

결과 및 토의.

재조합 수용체에 대한 TNF 결합의 저해.

하이브리도마 세포 상등액 내에 함유된 8개의 TNV mAb가 수용체에 대한 TNFα 결합을 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 단순 결합 검정을 실행하였다. 인간 IgG에 대한 표준 ELISA 분석에 의해 그들의 각각의 세포 상등액 내의 TNV mAb의 농도를 먼저 결정하였다. 이어서, 재조합 p55 TNF 수용체/IgG 융합 단백질, p55-sf2를 EIA 플레이트 상에 코팅하고 ¹²⁵I-표지 TNFα를 변화하는 양의 TNV mAb의 존재 하에 p55 수용체에 결합시켰다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 8개의 TNV mAb 중 하나 (TNV122)를 제외한 전부가 p55 수용체에 대한 TNFα 결합을 효율적으로 차단하였다. 사실상, TNV mAb는 음성 대조군 하이브리도마 상등액 내로 스파이킹된 cA2 양성 대조군 mAb보다 TNFα 결합의 저해에 있어서 더 효과적인 것으로 나타났다. 이들 결과는 TNV mAb가 세포-기반 검정 및 생체내에서 TNFα 생물활성을 차단할 가능성이 매우 높음을 나타내는 것으로 해석되었으며, 따라서 부가적인 분석이 타당하다고 인정되었다.

DNA 서열 분석.

RNA가 인간 mAb를 코딩한다는 것의 확인.

수용체 결합 검정에서 TNFα-차단 활성을 나타낸 7개의 TNV mAb (TNV14, TNV15, TNV32, TNV86, TNV118, TNV148, 및 TNV196)를 특성화하는 제1 단계로서, 이들 mAb를 생성하는 7개의 하이브리도마 세포주로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 각각의 RNA 샘플을 사용하여 각각의 mAb에 대한 완전 신호 서열, 완전 가변 영역 서열, 및 불변 영역 서열의 일부를 포함한 인간 항체 중쇄 또는 경쇄 cDNA를 제조하였다. 이어서, 이들 cDNA 산물을 PCR 반응에서 증폭하고, 단편을 먼저 클로닝하는 단계 없이 PCR-증폭 DNA를 직접 서열분석하였다. 서열분석된 중쇄 cDNA는 생쥐에 존재하는 5개의 인간 생식세포 유전자 중 하나, DP-46과 90% 초과로 동일하였다 (도 2). 마찬가지로, 서열분석된 경쇄 cDNA는 생쥐에 존재하는 인간 생식세포 유전자 중 하나와 100% 또는 98% 동일하였다 (도 3). 이들 서열 결과에 의해 cDNA로 전사되고 서열분석된 RNA 분자가 인간 항체 중쇄 및 인간 항체 경쇄를 코딩했음이 확인되었다. 신호 서열 코딩 서열의 5' 말단부에 맵핑되는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 가변 영역을 PCR-증폭하였으므로, 신호 서열의 최초 몇개의 아미노산은 원래의 TNV 번역 산물의 실제 서열이 아닐 수 있지만, 그들은 재조합 TNV mAb의 실제 서열을 나타낸다는 것에 유의해야 한다.

특유한 중화 mAb.

각각의 mAb에 대한 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 전체 가변 영역에 대한 cDNA 서열의 분석에 의해 TNV32는 TNV15와 동일하고, TNV118은 TNV14와 동일하며, TNV86은 TNV148과 동일하다는 것이 밝혀졌다. 수용체 결합 검정의 결과는 DNA 서열 분석과 일치했으며, 즉, TNV86 및 TNV148 둘 모두가 TNF 결합의 차단에 있어서 TNV118 및 TNV14 둘 모두보다 대략 4-배 더 양호했다. 그러므로 후속 연구는 4개의 특유한 TNV mAb, TNV14, TNV15, TNV148, 및 TNV196에만 집중하였다.

4개의 mAb의 관련성

DNA 서열 결과에 의해 4개의 TNV mAb의 중쇄를 코딩하는 유전자가 모두 서로에 대해 고도로 상동성이었고 모두 동일한 생식세포 유전자, DP-46으로부터 유래된 것으로 나타난다는 것이 밝혀졌다 (도 2). 부가적으로, 각각의 중쇄 CDR3 서열이 그렇게 유사하고 길이가 동일하므로, 그리고 그들이 모두 J6 엑손을 사용하므로, 그들은 분명히 단일 VDJ 유전자 재배열 이벤트로부터 발생하였으며, 그 후에 각각의 mAb를 특유하게 만든 체세포 변화 (somatic change)가 이어졌다. DNA 서열 분석에 의해 4개의 mAb 중에는 단 2개의 구별되는 경쇄 유전자가 있었음이 밝혀졌다 (도 3). TNV14 및 TNV15 내의 경쇄 가변 영역 코딩 서열은 서로 동일하며 인간 카파 사슬의 Vg/38K 패밀리의 대표적인 생식세포 서열과 동일하다. TNV148 및 TNV196 경쇄 코딩 서열은 서로 동일하지만 생식세포 서열과는 2개의 뉴클레오티드 위치에서 상이하다 (도 3).

4개의 mAb의 추론된 아미노산 서열에 의해 실제 mAb의 관련성이 밝혀졌다. 4개의 mAb는 4개의 구별되는 중쇄를 함유하지만 (도 4) 단 2개의 구별되는 경쇄를 함유한다 (도 5). TNV mAb 서열과 생식세포 서열 사이의 차이는 주로 CDR 도메인에 국한되었지만, mAb 중쇄 중 3개는 또한 프레임워크 영역 내의 생식세포 서열과 상이했다 (도 4). DP-46 생식세포-암호화 Ab 프레임워크 영역에 비교하여, TNV14는 동일했고, TNV15는 1개의 아미노산이 상이했으며, TNV148은 2개의 아미노산이 상이했고, TNV196은 3개의 아미노산이 상이했다.

cDNA의 클로닝, 부위-특이적 돌연변이 유발, 및 최종 발현 플라스미드의 조립. cDNA의 클로닝. PCR-증폭 가변 영역의 DNA 서열에 기초하여, 발현 벡터 내로 클로닝할 코딩 서열을 조정하는 목적으로 다른 라운드의 PCR 증폭을 수행하기 위해 새로운 올리고뉴클레오티드를 주문하였다. 중쇄의 경우에는, 이러한 제2 라운드의 PCR의 산물을 제한 효소 BsiWI 및 BstBI로 분해하고 플라스미드 벡터 L28 (플라스미드 식별 번호는 표 2에 나타냄) 내로 클로닝하였다. 경쇄의 경우에는, 제2 라운드 PCR 산물을 SalI 및 AflII로 분해하고 플라스미드 벡터 pBC 내로 클로닝하였다. 이어서, 개별적인 클론을 서열분석하여 그들의 서열이 PCR 산물의 직접 서열분석으로부터 얻어진 이전의 서열과 동일했음을 확인하였으며, 이에 의해 잠재적 이종 개체군의 분자 내의 각각의 위치에서 가장 풍부한 뉴클레오티드가 밝혀진다.

TNV148을 변경하기 위한 부위-특이적 돌연변이 유발. mAbs TNV148 및 TNV196은 TNFα 생물활성의 중화에 있어서 차선의 mAb (TNV14)보다 4-배 더 강력한 것으로 일관되게 관찰되고 있었다. 그러나, 상기 기재된 바와 같이, TNV148 및 TNV196 중쇄 프레임워크 서열은 생식세포 프레임워크 서열과 상이하였다. 다른 인간 항체에 대한 TNV148 중쇄 서열의 비교는, 다수의 다른 인간 mAb가 프레임워크 1 내의 위치 28에 Ile 잔기를 함유한 반면에 (성숙 서열만 계수함) 프레임워크 3 내의 위치 75에서 Pro 잔기는 그 위치에서 통상적이지 않은 아미노산임을 나타냈다.

TNV196 중쇄의 유사한 비교는 프레임워크 3 내의 생식세포 서열과 상이한 3개의 아미노산이 인간 mAb에서 희귀할 수 있음을 시사했다. 이들 차이는 TNV148 및 TNV196이 인간에게 투여될 경우에 면역원성이 되게 할 수 있을 가능성이 존재했다. TNV148은 문제의 아미노산 잔기를 1개만 가졌고 이 잔기는 TNFα 결합에 중요하지 않은 것으로 생각되었으므로, 위치 75에 Pro 잔기 대신에 생식세포 Ser 잔기가 코딩되도록 부위-특이적 돌연변이 유발 기술을 사용하여 TNV148 중쇄 코딩 서열 (플라스미드 p1753 내의) 내의 단일 뉴클레오티드를 변경하였다. 생성되는 플라스미드를 p1760으로 명명하였다 (표 2 참조). 생성되는 유전자 및 mAb를 TNV148B로 명명하여 그것을 원래의 TNV148 유전자 및 mAb와 구별하였다 (도 5 참조).

최종 발현 플라스미드의 조립. 게놈 단편으로서 이전에 클로닝된 12B75 중쇄 및 경쇄 유전자에 기초한 새로운 항체 발현 벡터를 제조하였다. 상이한 TNV 발현 플라스미드가 제조되었지만 (표 2 참조), 각각의 경우에 5' 인접 서열, 프로모터, 및 인트론 인핸서는 각각의 12B75 유전자로부터 유래되었다. 경쇄 발현 플라스미드의 경우, 완전 J-C 인트론, 불변 영역 코딩 서열, 및 3' 인접 서열 또한 12B75 경쇄 유전자로부터 유래되었다. 최종 생성 세포주를 유발한 중쇄 발현 플라스미드의 경우 (p1781 및 p1783, 하기 참조), 인간 IgG1 불변 영역 코딩 서열은 센토코르의 이전에 사용된 발현 벡터 (p104)로부터 유래되었다. 중요하게는, 본 명세서에 보고된 최종 생성 세포주는 원래의 하이브리도마-유래 TNV mAb (G1m(z))와는 상이한 TNV mAb의 동종이형 (Gm(f+))을 발현시킨다. 이는 젠팜 생쥐로부터 유래된 12B75 중쇄 유전자는 CH1 도메인의 C-말단부에 Arg 잔기를 코딩하는 반면에 센토코르의 IgG1 발현 벡터 p104는 그 위치에 Lys 잔기를 코딩하기 때문이다. J-C 인트론, 완전 불변 영역 코딩 서열, 및 3' 인접 서열이 12B75 중쇄 유전자로부터 유래된 다른 중쇄 발현 플라스미드 (예를 들어 p1786 및 p1788)를 제조하였으나, 그러한 유전자로 형질감염된 세포주는 생성 세포주로서 선택되지 않았다. 향후 PCR-증폭 V 영역의 1-단계 클로닝을 허용하도록 벡터를 신중하게 설계하였으며, 이는 최종 발현 플라스미드를 유발할 것이다.

PCR-증폭 가변 영역 cDNA를 L28 또는 pBC 벡터로부터 중간-단계, 12B75-기반 벡터로 이전하였으며 이는 프로모터 영역 및 J-C 인트론의 일부를 제공하였다 (플라스미드 식별 번호에 대해 표 2 참조). 이어서 항체 유전자의 5' 절반을 함유한 제한 단편을 이들 중간-단계 벡터로부터 최종 발현 벡터로 이전하였으며, 이는 각각의 유전자의 3' 절반을 제공하여 최종 발현 플라스미드를 형성하였다 (플라스미드 식별 번호에 대해 표 2 참조).

세포 형질감염 및 서브클로닝. 발현 플라스미드를 제한 분해에 의해 선형화하거나 각각의 플라스미드 내의 항체 유전자 인서트를 플라스미드 골격으로부터 정제해내었다. Sp2/0 및 653 생쥐 골수종 세포를 전기천공에 의해 중쇄 및 경쇄 DNA로 형질감염시켰다. 15개의 상이한 형질감염을 실행하였으며, 그 중의 대부분은 Ab, Ab 유전자의 특이적 특징, 유전자가 선형화된 전체 플라스미드 또는 정제된 유전자 인서트 상에 있는지 여부, 및 숙주 세포주에 의해 정의된 바와 같이 특유하였다 (표 5에 요약됨). 마이코페놀산에 대해 내성인 클론으로부터의 세포 상등액을 ELISA에 의해 인간 IgG의 존재에 대해 검정하고 정제된 rTNV148B를 참조 표준 곡선으로 사용하여 정량화하였다.

최고-생성 rTNV148B 세포주

rTNV148B 형질감염 2로부터의 최상-생성 653 모 세포주 중 10개 (소진된 24-웰 배양물에서 5 내지 10 ：g/ml를 생산함)를 서브클로닝하여 더 많이 생성하는 세포주에 대해 스크리닝하고 더 많은 동종 세포 개체군을 제조하였다. 모 세포주 2.320, 2.320-17, 및 2.320-20의 서브클론 중 2개는 소진된 24-웰 배양물에서 대략 50 ：g/ml를 생성하였으며, 이는 그들의 모 세포주에 비해 5-배의 증가였다. 서브클로닝된 세포주 2.320-17 및 2.320-20의 제2 라운드의 서브클로닝이 이어졌다.

각각의 mAb를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 플라스미드의 식별 번호를 나타낸다. 정제된 mAb 유전자 인서트로 실행한 형질감염의 경우에는, 플라스미드 p13 (pSV2gpt)이 gpt 선택가능 마커의 공급원으로서 포함되었다. Remicade를 코딩하기 위해 사용된 동일한 인간 IgG1 발현 벡터 ('구')에 의해, 또는 12B75 (젠팜/메다렉스) 중쇄 유전자 내에 함유된 불변 영역 ('신')에 의해 중쇄 불변 영역이 코딩되었다. H1/L2는 TNV14 중쇄 및 TNV148 경쇄로 이루어진 "신규" mAb를 말한다. 플라스미드 p1783 및 p1801은 단지 그들의 중쇄 유전자가 얼마나 많은 J-C 인트론을 함유하는지가 상이하다. 세포 클론에 대한 일반명의 최초 번호를 정의하는 형질감염 번호를 우측에 나타낸다. 본 명세서에 기재된 rTNV148B-생성 세포주 C466 (A, B, C, D) 및 C467A는 각각 형질감염 번호 2 및 1로부터 유래되었다. rTNV14-생성 세포주 C476A는 형질감염 번호 3으로부터 유래되었다.

[표 5]

소진된 24-웰 배양물 상등액에 대한 ELISA 검정은 이들 제2 라운드 서브클론 모두가 98 내지 124 ：g/ml를 생성하였으며, 이는 제1 라운드 서브클론에 비해 2-배 이상의 증가하였음을 나타냈다. 표 6에 나타낸 바와 같이 이들 653 세포주에 C 코드 표기를 배정하였다.

rTNV148B 형질감염 1으로부터의 최상-생성 Sp2/0 모 세포주 중 3개를 서브클로닝하였다. 모 세포주 1.73의 2 라운드의 서브클로닝은 소진된 24-웰 배양물에서 25 ：g/ml를 생성한 클론의 동정으로 이어졌다. 이 Sp2/0 세포주를 C467A로 표기하였다 (표 6).

최고-생성 rTNV14 세포주

rTNV14 형질감염 3으로부터의 최상-생성 Sp2/0 모 세포주 중 3개를 1회 서브클로닝하였다. 서브클론 3.27-1은 소진된 24-웰 배양물에서 19 ：g/ml의 생성을 가진 최고-생성자인 것으로 확인되었다. 이 세포주를 C476A로 표기하였다 (표 6).

표 6. 선택된 생성 세포주 및 그들의 C 코드의 요약.

원래의 클론 명칭의 최초 숫자는 그 세포주가 어느 형질감염으로부터 유래되었는지를 표시한다. 본 명세서에 보고된 C-코드화 세포주는 모두 제한 효소로 선형화된 중쇄 및 경쇄 전체 플라스미드를 이용한 형질감염으로부터 유래되었다.

서브클로닝된 세포주의 특성화

세포주 성장 특징을 더 신중하게 특성화하고 대규모로 mAb-생성 수준을 결정하기 위해, T75 배양을 사용하여 성장 곡선 분석을 수행하였다. 결과는 4개의 C466 시리즈의 세포주 각각이 1.0 × 10⁶ 내지 1.25 × 10⁶ 세포/ml의 피크 세포 밀도 및 110 내지 140 ：g/ml의 최대 mAb 축적 수준에 도달했음을 나타냈다 (도 7). 반면에, 최상-생성 Sp2/0 서브클론, C467A는 2.0 × 10⁶ 세포/ml의 피크 세포 밀도 및 25 ：g/ml의 최대 mAb 축적 수준에 도달했다 (도 7). rTNV14-생성 세포주, C476A에 대해서는 성장 곡선 분석을 실행하지 않았다.

부가적인 성장 곡선 분석을 실행하여 상이한 농도의 MHX 선택에서 성장 속도를 비교하였다. MHX의 부재 하에 배양된 C466 세포는 정상적인 양의 MHX (1X)에서 배양된 동일한 세포보다 더 빠르게 성장하고 있는 것으로 보인다는 최근의 관찰사항에 의해 이 비교를 하게 되었다. 마이코페놀산과 같은 화합물의 세포독성 농도는 자릿수에 걸쳐 측정되는 경향이 있으므로, 더 낮은 농도의 MHX의 사용이 mAb 생성의 안정성을 희생시키지 않으면서 유의적으로 더 빠른 세포 배가 시간을 유발할 수 있음이 가능한 것으로 생각되었다. 세포주 C466A 및 C466B를 MHX가 없거나, 0.2X MHX, 또는 1X MHX 중에 배양하였다. 24-시간 간격으로 7일 동안 생존 세포 계수를 취하였다. 결과에 의해 MHX 농도-의존성 세포 성장 속도가 밝혀졌다 (도 8). 세포주 C466A는 1X MHX 중에 25.0시간의 배가 시간을 나타냈으나 MHX가 없는 중에는 단 20.7시간을 나타냈다. 유사하게, 세포주 C466B는 1X MHX 중에 32.4시간의 배가 시간을 나타냈으나 MHX가 없는 중에는 단 22.9시간을 나타냈다. 중요하게는, 0.2X MHX 중의 둘 모두의 세포주에 대한 배가 시간은 1X MHX 중에 관찰된 것보다 MHX가 없는 중에 관찰된 것과 더 유사했다 (도 8). 이 관찰사항은, 배가 시간이 중요한 파라미터인 생물반응기에서의 향상된 세포 성능이, 더 적은 MHX를 사용함으로써 실현될 수 있을 가능성을 제기한다. 그러나, 안정성 시험 결과 (하기 참조)는 세포주 C466D가 심지어 존재하는 MHX 없이 60일 이상 동안 rTNV148B를 안정적으로 생성할 수 있음을 시사하지만, 안정성 시험은 또한 MHX의 부재에 비교하여 MHX의 존재 하에 세포를 배양한 경우에 더 높은 mAb 생성 수준을 나타냈다.

대략 60일의 기간에 걸쳐 다양한 세포주로부터의 mAb 생성을 평가하기 위해, MHX 선택을 함유하거나 함유하지 않은 배양물에 대해 안정성 시험을 수행하였다. 모든 세포주가 높은 mAb 생성을 유지하지는 않았다. 단 2주의 배양 후에, 클론 C466A는 연구의 시작점에서보다 대략 45% 더 적게 생성하고 있었다. 클론 C466B로부터의 생성 또한 유의적으로 하락하는 것으로 나타났다. 그러나, 클론 C466C 및 C466D는 상당히 안정한 생성을 유지했으며, C466D은 최고 절대 생성 수준을 나타냈다 (도 9).

결론

인간 TNFα에 대한 8개의 인간 mAb의 초기 패널로부터, 단백질 서열 및 TNF 중화 효능을 포함한 몇몇 기준에 기초하여 TNV14 뿐만 아니라 TNV148B가 바람직한 것으로 선택되었다. 100 ：g/ml 초과의 rTNV148B 및 19 ：g/ml의 rTNV14를 생성하는 세포주를 제조하였다.

실시예 5: 단일 볼루스 주사를 사용하여 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 생쥐 연구

대략 4주의 주령에 Tg197 연구 생쥐를 성별 및 체중을 기준으로 9개의 치료군 중 하나에 배정하고, 둘베코 PBS (D-PBS) 또는 본 발명의 항-TNF 항체 (TNV14, TNV148, 또는 TNV196) (1 mg/㎏ 또는 10 mg/㎏으로)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다.

결과: 투약-전으로부터의 변화로서 체중을 분석하는 경우, 연구 전체에 걸쳐 10 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 D-PBS-치료 동물보다 일관적으로 더 높은 체중 증가를 나타냈다. 이 체중 증가는 제3주 내지 제7주에 유의적이었다. 10 mg/㎏ TNV148로 치료한 동물 또한 연구의 제7주에 유의적인 체중 증가를 달성하였다. (도 10 참조).

도 11a 내지 도 11c는 관절염 지수를 기준으로 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 제3주에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 (제7주) 계속하여 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았다. D-PBS-치료군에 비교할 경우, 1 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물 및 1 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 제3주 후에 AI의 유의적인 감소를 나타내지 못하였다. 유사한 용량의 다른 것들에 각각을 비교할 경우 (10 mg/㎏ TNV14, 148, 및 196에 비교한 10 mg/㎏ cA2), 10 mg/㎏ 치료군들 사이에는 유의적인 차이가 없었다. 1 mg/㎏ 치료군들을 비교할 경우, 3, 4, 및 7주에 1 mg/㎏ TNV148은 1 mg/㎏ cA2보다 유의적으로 더 낮은 AI를 나타냈다. 3 및 4주에 1 mg/㎏ TNV148은 또한 1 mg/㎏ TNV14-치료군보다 유의적으로 더 낮았다. 연구의 제6주까지 TNV196이 AI의 유의적인 감소를 나타냈지만 (D-PBS-치료군에 비교할 경우), 연구의 결말에서 유의적으로 남은 유일한 1 mg/㎏ 치료는 TNV148이었다.

실시예 6: 다중 볼루스 용량으로서 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 생쥐 연구

대략 4주의 주령에 Tg197 연구 생쥐를 체중을 기준으로 8개의 치료군 중 하나에 배정하고, 대조군 항목 (D-PBS) 또는 항체 (TNV14, TNV148) (3 mg/㎏으로)의 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다 (제0주). 제1주, 제2주, 제3주, 및 제4주에 모든 동물에 주사를 반복하였다. 제1군 내지 제6군을 시험 항목 효능에 대해 평가하였다. 제7군 및 제8군의 동물로부터 얻어진 혈청 샘플을 제2주, 제3주, 및 제4주에 면역 반응 유도 및 TNV14 또는 TNV148의 약동학적 제거에 대해 평가하였다.

결과: 투약-전으로부터의 변화로서 체중을 분석하는 경우, 유의적인 차이가 인식되지 않았다. 연구 전체에 걸쳐 10 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 D-PBS-치료 동물보다 일관적으로 더 높은 체중 증가를 나타냈다. (도 12 참조).

도 13a 내지 도 13c는 관절염 지수를 기준으로 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 제2주에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 (제5주) 계속하여 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 유의적으로 더 낮았다. d-PBS 대조군에 비교할 경우, 1 mg/㎏ 또는 3 mg/㎏의 cA2로 치료한 동물 및 3 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물은 연구 전체에 걸쳐 임의의 시간에 AI의 임의의 유의적인 감소를 달성하지 못하였다. d-PBS-치료군에 비교할 경우, 3 mg/㎏ TNV148로 치료한 동물은 제3주에 시작하여 제5주까지 계속하여 유의적인 감소를 나타냈다. 더 낮은 용량 (1 mg/㎏ 및 3 mg/㎏)의 cA2 둘 모두에 비교할 경우, 10 mg/㎏ cA2-치료 동물은 연구의 제4주 및 제5주에 AI의 유의적인 감소를 나타냈으며, 이는 또한 제3주 내지 제5주에 TNV14-치료 동물보다 유의적으로 더 낮았다. 3 mg/㎏ 치료군들 중 임의의 것 사이에는 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났지만, 3 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물에 대한 AI는 일부 시점에 10 mg/㎏보다 유의적으로 더 높았던 반면에, TNV148로 치료한 동물은 10 mg/㎏의 cA2로 치료한 동물과 유의적으로 상이하지 않았다.

실시예 7: 단일 복강내 볼루스 용량으로서 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 생쥐 연구

대략 4주의 주령에 Tg197 연구 생쥐를 성별 및 체중을 기준으로 6개의 치료군 중 하나에 배정하고, 항체 (cA2 또는 TNV148) (3 mg/㎏ 또는 5 mg/㎏)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다. 이 연구는 D-PBS 및 10 mg/㎏ cA2 대조군을 이용하였다.

투약-전으로부터의 변화로서 체중을 분석하는 경우, 모든 치료가 유사한 체중 증가를 달성하였다. 3 또는 5 mg/㎏ TNV148 또는 5 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 연구 초기에 (제2주 및 제3주에) 유의적인 양의 체중이 증가했다. 이후의 시점에는 TNV148로 치료한 동물만 유의적인 체중 증가를 유지했다. 3 및 5 mg/㎏ TNV148-치료 동물 둘 모두가 7주에 유의성을 나타냈고, 주사 후 8주에 3 mg/㎏ TNV148 동물이 여전히 유의적으로 상승되었다. (도 14 참조).

도 15는 관절염 지수를 기준으로 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 모든 치료군은 초기 시점에 일부 보호를 나타냈으며, 5 mg/㎏ cA2 및 5 mg/㎏ TNV148은 제1주 내지 제3주에 AI의 유의적인 감소를 나타냈고 모든 치료군이 제2주에 유의적인 감소를 나타냈다. 연구의 후기에 5 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 일부 보호를 나타냈으며, 제4주, 제6주, 및 제7주에 유의적인 감소가 나타났다. cA2 및 TNV148 둘 모두의 낮은 용량 (3 mg/㎏)은 제6주에 유의적인 감소를 나타냈고, 모든 치료군이 제7주에 유의적인 감소를 나타냈다. 연구의 결말 (제8주)에는 치료군 중 어느 것도 유의적인 감소를 유지할 수 없었다. 임의의 시점에 치료군들 중 임의의 것(식염수 대조군을 배제함) 사이에 유의적인 차이가 없었다.

실시예 8: 항- TNF 항체와 변형된 항- TNF 항체 사이의 단일 복강내 볼루스 용량으로서 항- TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 생쥐 연구

TNV148 (하이브리도마 세포로부터 유래됨) 및 rTNV148B (형질감염된 세포로부터 유래됨)의 단일복강내 용량의 효능을 비교하기 위해. 대략 4주의 주령에 Tg197 연구 생쥐를 성별 및 체중을 기준으로 9개의 치료군 중 하나에 배정하고, 둘베코〓S PBS (D-PBS) 또는 항체 (TNV148, rTNV148B) (1 mg/㎏)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다.

투약-전으로부터의 변화로서 체중을 분석하는 경우, 연구 전체에 걸쳐 10 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 D-PBS-치료 동물보다 일관적으로 더 높은 체중 증가를 나타냈다. 이 체중 증가는 제1주 및 제3주 내지 제8주에 유의적이었다. 1 mg/㎏ TNV148로 치료한 동물 또한 연구의 제5주, 제6주, 및 제8주에 유의적인 체중 증가를 달성하였다. (도 16 참조).

도 17은 관절염 지수를 기준으로 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 제4주에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 (제8주) 계속하여 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았다. TNV148-치료군 및 1 mg/㎏ cA2-치료군 둘 모두는 제4주에 AI의 유의적인 감소를 나타냈다. 이전의 연구 (P-099-017)는 TNV148이 단일 1 mg/㎏ 복강내 볼루스 후에 관절염 지수를 감소시킴에 있어서 약간 더 효과적이었음을 나타냈지만, 이 연구는 TNV 항체-치료군의 둘 모두의 버전으로부터의 AI가 약간 더 높았음을 나타냈다. 10 mg/㎏ cA2 군에 비교할 경우, 1 mg/㎏ cA2―치료군은 유의적으로 증가하지 않았고 (제6주는 제외함) TNV148-치료군은 제7주 및 제8주에 유의적으로 더 높았지만, 연구의 임의의 지점에서 1 mg/㎏ cA2, 1 mg/㎏ TNV148, 및 1 mg/㎏ TNV148B 사이에는 AI의 유의적인 차이가 없었다.

실시예 9: 제1형 당뇨병 (T1D)의 치료 또는 예방을 위한 항-TNF 항체

서론

2a 상 효능 및 안전성 연구에서 SIMPONI^®를 이용하는 이익이 새로 진단된 T1D 환자에서 확립될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 스폰서가 제1형 당뇨병 (T1D)의 치료에서 피하 (SC) 투여되는 SIMPONI^® (골리무맙)에 대한 개발 계획을 토의하는 전-IND 유형 B 회의를 요구하고 있다. 새로 진단된 개체군에서의 본 연구는 SIMPONI^®가 전-T1D 환자에서 내인성 인슐린 생성을 안정화하여 질환 진행을 방지하거나 지연시키는 이익을 가질 것인지 여부를 이해하기 위한 개발 프로그램의 초기 단계가 될 것이다.

제품명 및 출원 번호

SIMPONI^® (골리무맙)

화학명 및 구조

SIMPONI^® (골리무맙)는 면역글로불린 G (IgG) 1 중쇄 아이소형 (G1m [z] 동종이형) 및 카파 경쇄 아이소형을 가진 인간 단클론 항체 (mAb)이다. 골리무맙은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 (LC)를 갖는다. 골리무맙은 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)의 가용성 형태 및 막관통 형태 둘 모두에 고친화도로 결합하며 TNFα 생물활성을 저해한다. 골리무맙은 해부학적 치료학적 화학적 (ATC: Anatomical Therapeutic Chemical) 분류 시스템에 따라 TNFα 저해제 (ATC 코드: L04AB06)로서 분류된다.

골리무맙은 2015년 10월 6일 현재 미국 (US) 및 전세계 총 89개국에서 SIMPONI^®의 상표명으로 류머티스 관절염 (RA), 건선 관절염 (PsA), 및 강직성 척추염 (AS)의 치료용으로 월 1회 투여되는 50 mg SC 주사로서 뿐만 아니라, 67개국에서 궤양성 대장염 (UC)의 치료용으로 제0주에 200 mg SC 주사, 이어서 제2주 유도 요법에 100 mg, 및 그 후로 4주마다 100 mg의 유지 요법으로서 승인되어 있다.

특이적으로 미국에서는 SIMPONI®가 하기 적응증에 대해 승인되어 있다:

메토트렉세이트 (MTX)와 조합하여 보통 내지 중증으로 활성인 RA를 가진 성인 환자의 치료용

MTX와 조합하거나 단독으로 활성 PsA를 가진 성인 환자의 치료용

활성 AS를 가진 성인 환자의 치료용

궤양성 대장염을 가진 성인 환자의 치료용

투여형, 투여 경로, 및 투여

스폰서는 표적 개체군에 걸쳐 제안된 용량을 지지하기 위한 초기 2a 상 연구에서 2개의 투여형을 사용하고자 의도한다. 이들 2개의 투여형은 하기에 기재되어 있다:

사전충전 주사기

각각 50 mg 단일 용량 사전충전 유리 주사기 (27 게이지 ½ 인치 바늘)가 0.5 mL의 용액당 50 mg의 SIMPONI^®를 함유한다.

VarioJect

VarioJect로서 공지된 새로운 소아과 프리젠테이션 (pediatric presentation)이 체표면적 (BSA)에 의해 투여되는 소아 환자에서 단계식-고정 투여 (tiered-fixed dosing)를 제공하는 다중의 소아 적응증에 대해 의도된 플랫폼 장치로서 스폰서에 의해 개발되고 있다. VarioJect는 10 mg 내지 45 mg의 용량을 5 mg 증분으로 전달할 수 있는 수동 인젝터이다.

부가적인 상세사항은 하기 명세서를 통해, 그리고 도면에 제공되어 있다.

질환 배경

질환 병인론 및 유병률

미국에서, T1D는 유년기의 가장 만연한 3개의 만성 질환 중 하나이며, 대략 3백만명이 이 질환을 갖는다 (문헌[Daneman 2006], 문헌[Stanescu, Lord et al. 2012]). 연간 발생률은 아동 및 청소년에서 최고이며, 20세 미만에서 ~20 사례/100,000/년으로, 매년 거의 15,000 신규 사례를 차지한다 (문헌[Maahs, West et al. 2010], 문헌[Stanescu, Lord et al. 2012]). 미국 및 전세계에서, T1D의 발생률은 대부분의 지역에서 ~3 내지 5%/년의 증가로 상승 중이다(문헌[Daneman 2006], 문헌[Stanescu, Lord et al. 2012]). 미국에서 2001년 내지 2009년에, 아동 및 청소년에서 T1D의 유병률은 23% 만큼 상승하였다 (JDRF 2013). T1D의 진단은 유년기 중에 증가하며 청소년기에 피크를 이룬다: 0 내지 4세, 5 내지 9세, 10 내지 14세, 및 15 내지 19세에서 연간 비율이 각각 14, 22, 26, 및 13 사례/100,000이다 (문헌[Stanescu, Lord et al. 2012]). 비교적으로, 성인에서 T1D 비율은 최대 ~8/100,000에 불과한 발생률로 훨씬 더 낮다 (문헌[Molbak, Christau et al. 1994]). 아동에서는, 진단에 이르는 임상 경로가 상대적으로 전격성이며, 증상 (즉, 조갈증, 다뇨증, 및 체중 감소)이 통상적으로 진단 전 단 수일 또는 수주에 분명해지는 반면에, 성인에서는 경로가 훨씬 더 무통성이며, 더 가벼운 증상이 수개월 이상에 걸쳐 발생한다. 신규 발병 T1D 및 기존의 T1D를 가진 아동은 당뇨병성 케톤산증 (DKA)의 중증 대사 교란을 빈번하게 겪으며, 그 동안 그들은 뇌부종, 헤르니아 형성, 및 사망의 위험이 높다.

지난 40년으로부터의 데이터는 T1D가 췌장 베타 세포에 대한 자가면역 공격으로부터 유발된다는 것을 입증한다 (문헌[Mordes, Bortell et al. 1996], 문헌[Eisenbarth 2004, Han], 문헌[Donelan et al. 2013]). 선천 및 적응 및 세포 및 체액 반응의 전염증성 조합이 T1D의 원인이다 (문헌[Bluestone, Herold et al. 2010]). 다른 자가면역 질환과 유사하게, T1D는 당뇨병유발 환경 촉발자와 조우하는 질병소질이 있는 개체에서 발생한다는 가설이 있다 (문헌[Atkinson, Bluestone et al. 2011]). 다수의 HLA- 및 다른 면역 시스템-연계 유전자가 T1D 감수성에 연결된다 (문헌[van Belle, Coppieters et al. 2011]). T1D를 가진 사람들은 β-세포-반응성 T 세포가 관여하는 중추 및 말초 관용 메카니즘 둘 모두에서 비정상을 갖는 것으로 나타난다 (문헌[Eisenbarth 2004]). 식이 및 감염성 인자 둘 모두가 연루되어 왔지만, T1D와 인과관계로 연계된 것으로 확인된 것은 없다. 일부 환경적 조우가 염증성 반응을 활성화하고, 이는 질병소질이 있는 개체에서 대식세포, 수지상 세포, CD4 및 CD8 T 세포, 및 B 세포의 활성화 및 섬 (islet)으로의 동원을 유발한다는 가설이 있다 (문헌[Bluestone, Herold et al. 2010], 문헌[Atkinson, Bluestone et al. 2011]). 전염증성 사이토카인 및 베타 세포 자가항체를 포함하는 가용성 인자가 이 반응에 참여하여 이 반응을 증폭하며, 최종 결과는 베타 세포의 궁극적 파괴이다.

현재의 치료 패러다임

현재 T1D를 가진 사람들에게 이용가능한 유일한 요법은 외인성 인슐린이며, 이는 다중 피하 주사로서 매일 제공되거나 피하 펌프를 통해 연속 플러스 펄스 (continuous plus pulse) 인슐린에 의해 제공되어야 한다. T1D를 가진 사람들에게는 인슐린 뿐만 아니라 많은 혈당 확인이 매일 필요하며, 둘 모두 생명을 위협할 수 있는 고혈당증과 저혈당증 사이의 신중한 균형을 유지하기 위해 현재 혈당 수준, 식이, 및 운동의 신중한 균형을 모든 인슐린 투여와 함께 고려해야 한다. T1D를 가진 사람들에게 이용가능한 보조 요법 또는 질환-조절 요법은 없으며, 이 질환이 발병한 사람들에게는 생명을 위해 외인성 인슐린을 이용한 혈당 관리가 필요하다. 미세혈관 합병증의 결과에 대한 집중적인 인슐린 치료의 긍정적 효과가 획기적 연구 당뇨병 관리 및 합병증 시험 (DCCT: Diabetes Control and Complications Trial)에 의해 입증되었으며, 여기서 집중적인 치료 코호트에 등록된 대상 (70 내지 120 mg/dL의 공복 및 식전 혈당 수준, 180 mg/dL의 식후 혈당 수준, 및 비-당뇨병 범위의 헤모글로빈 A_1c [HbA_1c; 글리코실화 헤모글로빈]를 목표로 함)은 통상의 치료 코호트에 등록된 대상에 비해 신장병증, 망막병증, 및 신경병증의 발병 및/또는 진행이 감소되었다.

그러나, 구세대 유형의 인슐린 제형에 비교하여 더 바람직한 약동학적 및 약력학적 프로파일을 갖는 단기-작용 및 장기-작용 인슐린 유사체, 및 인슐린 전달 장치에 있어서 개선된 기술의 지난 수십년에 걸친 개발에도 불구하고, 많은 대상이 여전히 7% 미만의 HbA_1c의 권장 목표를 달성하지 못한다. T1DM을 가진 320,000 명 초과의 대상에서 혈당 조절을 비교하는, 유럽, 북아메리카, 및 서호주의 19개국으로부터의 지역별 또는 국가별 등록자로부터의 데이터를 사용하는 최근의 분석은, 전체적으로 환자의 30% 미만의 HbA_1c가 7.5% 미만임을 나타냈다 (문헌[McKnight 2015]). T1DM 치료와 연계된 제한은 저혈당증의 공포, 과도한 글루코스 변동 (glucose fluctuation), 및 체중 증가를 포함한다 (문헌[Cryer 2003], 문헌[Larger 2005]).

보고된 저혈당증의 발생률은 연구들 사이에서 상당히 변동되며, 증상성 및 중증 저혈당증 둘 모두에서의 더 큰 발생률이 대상에서 관찰되었다 (문헌[Cryer 1989]). 추가로, 연장된 기간에 걸친 연속적 혈당 측정을 사용하는 연구에 의해 저혈당증, 특히 야간 저혈당증의 빈도 및 지속기간은 이전에 생각했던 것보다 심지어 더 크다는 것이 일반적으로 확인되었다 (문헌[Guillod 2007], 문헌[Wentholt 2007]). T1DM을 가진 환자가 적당한 혈당을 달성하지 못하게 하는 다른 인자는 바람직하지 않은 체중 증가이며, 이는 종종 집중적인 인슐린 치료의 결과로서 후속적인 당뇨의 감소와 함께 발생한다. 이전의 불량한 혈당 조절로 인해 소변 중에 손실되는 열량은 강화된 인슐린 요법에 의해 혈당 조절이 개선될 경우에 증가되는 체중의 70% 내지 100%를 차지할 수 있는 것으로 추산된다 (문헌[Carlson 1993]). 추가로, 이화작용으로부터 동화작용으로 대사 상태를 역전시킴으로써, 인슐린은 체지방의 증가로 이어지는 지방형성 효과 (문헌[Jacob 2006], 문헌[Nair 1983]),및 제지방 체중의 증가로 이어지는 단백질에 대한 항-이화작용 효과 (문헌[Torbay 1985])를 갖는다.

많은 치료 선택권이 이용가능한 제2형 당뇨병 (T2DM)과는 상이하게, 인슐린은 T1DM을 가진 환자를 위한 요법의 지주로 남아 있다. 1922년에 동물 인슐린의 치료적 용도가 발견된 이래로, 전통적인 인슐린으로부터 더 현대적인 인슐린 유사체에 이르는 범위의 다양한 유형의 인슐린이 개발되어 왔으며, 인슐린 리스프로는 1996년에 FDA에 의해 승인된 최초의 단기 작용 유사체이고, 글라진은 2000년에 승인된 최초의 장기-작용 유사체이다. 그 이후로, 다른 단기 및 장기-작용 유사체가 승인되어 왔으며, 그들의 사용은 점점 통상적이 되어 왔다. 이는 부분적으로 T1DM을 가진 대상에서 거의 정상혈당을 달성할 필요성 및 비-유사체 인슐린을 이용할 때 나타나는 중증 저혈당증에 대한 위험의 현저한 증가로 인한 것이다. 사실상, 그들의 효능 및 관용성을 중성 프로타민 하게도른 (NPH: Neutral Protamine Hagedorn) 인슐린에 비교한 장기-작용 인슐린을 포함하는 대부분의 임상 연구는 일반적으로 그들의 매일 1회 투여 요법이 혈당 조절의 관점에서 NPH와 유사하며 유의적으로 더 낮은 비율의 저혈당증 (특히 야간에), 및 더 적은 글루코스 변동과 연계된다는 것을 나타냈다 (문헌[Ratner 2000], 문헌[Porcellati 2004], 문헌[Hermansen 2004], 문헌[Raskin 2007]). 단기-작용 유사체에 대해, 이들은 HbA_1c의 저감에 있어서 보통의 인슐린과 일반적으로 유사하지만, 그들은 더 양호한 식후 고혈당증의 조절, 개선된 환자간 및 환자내 변동성, 및 감소된 저혈당증의 위험과 같은 다른 중요한 이점을 나타낸다. 중요하게는, 그들의 개선된 약동학적 특성으로 인해 이들 유사체는 더 양호한 순응도와 함께 더 큰 유연성 및 편의를 환자에게 제공하는데, 이는 단기-작용 유사체는 식사 직전 또는 심지어 식사 후에 (보통의 인슐린의 경우에 식전 30분과 비교) 주사될 수 있고 장기-작용 유사체는 매일-1회 (NPH의 경우에 매일 2회에 비교) 주사될 수 있기 때문이다.

프람린타이드가 현재 T1DM에서 보조 요법으로서 승인된 유일한 비-인슐린 약제라는 것과 인슐린 단일요법의 결점을 고려하면, T1DM에서의 신규 요법에 대한 충족되지 않은 필요성이 존재한다.

신규 발병 T1D에서 β-세포 기능을 보존하기 위한 연구의 근거

상기 기재된 바와 같이, DCCT는 장기 합병증의 발생 및 진행에 대한 집중적인 인슐린 요법의 잠재적 이익을 표준 인슐린 요법과 비교하여 평가하기 위해 T1D를 가진 대상에서 수행된 대규모 연구였다 (문헌[DCCT 1993]). 이 연구의 집중적인 치료군으로부터의 중요한 결과 분석에서, 유의적인 잔류 β-세포 기능을 유지한 대상 (0.2 pmol/mL 이상의 C-펩티드에 의해 측정되는 바와 같음)을 유의적인 β-세포 기능을 유지하지 않은 대상 (0.2 pmol/mL 미만의 C-펩티드)과 비교하였다. 잔류 β-세포 기능을 가진 사람들은, 잔류 β-세포 기능이 없는 사람들에 비해, 유의적으로 감소된 중증 저혈당 이벤트의 비율 및 감소된 미세혈관 합병증 진행의 비율을 갖는 것으로 확인되었다 (문헌[DCCT 1987]; 문헌[DCCT 1998]; 문헌[Steffes 2003]; 문헌[Palmer 2004]). 부가적으로, DCCT 연구 (문헌[Lachin et al])으로부터의 데이터의 최근 평가는 0.2 pmol/mL 이상의 자극된 C-펩티드를 가진 사람들에서의 단기 및 장기 임상 이익을 지지하며, 심지어 0.2 pmol/mL 임계값 미만에서도 C-펩티드의 유지의 임상 이익이 있는 것으로 나타난다.

내인성 인슐린 생성을 유지하는 것이 T1D를 가진 사람들에서 중요한 단기 및 장기 이익을 갖는다는 개념은 지난 10 내지 20년간 신규 발병 T1D에서의 다수의 중재적 시험 (interventional trial)에 대한 가장 중요한 타당성의 일부가 되어 왔다. 이 분야에서 궁극적인 목표는 T1D의 "완전" 관해 (및 따라서 인슐린 비의존성)일 수 있지만, 더 현실적이고 더 달성가능할 가능성이 있는 목표는 진단시에 존재하는 β-세포 (종종 기준선 수의 ~10 내지 20%로 간주됨)의 파괴를 방지하는 것이다. 개체가 일부 외인성 인슐린을 여전히 필요로 할 수 있다 하더라도, 대사 조절이 개선될 것이고 T1D-연계 합병증이 경감될 것이다. T1D에서의 최근 데이터는 이 개념을 지지하였다. 특이적으로, 섬 세포 이식을 받는 T1D 대상에서 일부 이식편 기능을 유지함으로써, 심지어 완전한 인슐린 비의존성을 달성하지 못했거나 상실한 사람들에서도, 중증 저혈당 이벤트가 경감되고 혈당 조절이 개선된다 (문헌[Agarwal and Brayman 2012], 문헌[Blau, Abegg et al. 2015]). T1D에서 알레파셉트의 중재적 신규 발병 시험에서, 치료군 내의 개체는 인슐린 비의존성이 달성되지 않았더라도 위약군 내의 사람들보다 더 높은 수준의 C-펩티드 생성을 유지했고, 주요 저혈당증 (55mg/dL 이하의 BG 수준에 의해 정의됨)의 발생률이 대략 절반이었다 (문헌[Rigby, JCI, 2015]). 따라서 일부 내인성 인슐린 생성의 보존이 많은 장기 손상, 특히 T1D-연계 미세혈관 손상에 대해 중요한 이익을 갖는다는 잘-인정된 개념에 부가하여, 이 질환에서 가장 많은 단기 이환율 및 사망률을 제기하는 병태인 T1D에서의 저혈당증을 경감시키는 중요한 중간 이익이 존재한다.

제1형 당뇨병에서의 개발 상황

T1D의 자가면역 기반의 규명 및 설치류 모델에서의 성공적인 후속 연구와 함께, 1980년대 및 '90년대에 몇몇 소규모 임상 시험이 수행되어, 최근에 T1D로 진단된 환자에서 강력한 비-특이적 면역 억제제를 평가하였다 (문헌[Bougneres, Carel et al. 1988], 문헌[Glandt and Herold 2004], 문헌[Herold, Gitelman et al. 2009]). 임상 진단시에, 상당한 수 (아마도 최대 20%)의 β-세포가 남아 있지만 고갈 및 국소 염증으로 인해 기능장애인 것으로 생각된다. 이들 잔류 세포는, "허니문" 기간으로서 공지된 진단 후 수주 내지 수개월에 종종 나타나는 외인성 인슐린의 최저점의 원인일 가능성이 있다. 초기 임상 시험은 사이클로스포린, 아자티오프린, 및/또는 프레드니손을 포함하는 비-선택적 면역 억제제를 사용하였다 (문헌[Harrison, Colman et al. 1985], 문헌[Bougneres, Carel et al. 1988], 문헌[Cook, Hudson et al. 1989], 문헌[Bougneres, Landais et al. 1990]). 일부 시험에서 인슐린 비의존성이 관찰되었지만, 이 효과는 면역 억제가 중단되었을 때 상실되었다. 이들 연구는 β-세포에 대한 염증성 반응 및 면역 공격을 질환 초기에 완화시킬 수 있다면 기능성 베타 세포를 보존할 수 있다는 것을 입증했다.

당뇨병 자가면역을 역전시키기 위한 다른 접근법 (예를 들어, 니코틴아미드, 항산화제)을 사용하는 다수의 시험이 수행되었으며, 종합하면 이는 효능을 나타내지 않았다 (문헌[Chase, Butler-Simon et al. 1990], 문헌[Ludvigsson, Samuelsson et al. 2001]). 따라서, 당뇨병 자가면역을 역전시키기 위한 유일한 일관적인 접근법은, 면역 세포의 활성 또는 그들의 과정에 직접 영향을 주는, 다른 병태에서 증명된 강력한 면역 억제제를 사용하는 연구에 존재했다. 위험 개체군 (즉, 아동) 및 치료적 대안 (즉, 인슐린)으로 인해, 이상적인 요법은 낮은 면역 부작용 내지 비-면역 부작용, 및 바람직하게는 연장된 치료 종료후 (off-therapy) 효과를 가질 것이다.

지난 20년에 걸쳐 특이적 염증성 매개자 및 세포를 표적화하며 다른 인간 자가면역 및 염증성 병태에 유의적인 효능을 갖는 생물학적 약제가 개발되어 왔다. 다수의 이들 약제는 설치류 모델에서 자가면역 질환을 역전시킬 수 있었으며, 이는 임상 시험에서 T1D에서의 평가를 위한 근거를 제공했다. 항-CD3, 항-CD20, LFA-3Ig, 및 CTLA4-Ig를 사용하는 연구는 베타 세포 손실을 지연시키지만 중단시키지는 않는 능력을 나타낸 반면에 (문헌[Pescovitz, Greenbaum et al. 2009], 문헌[Gottlieb, Quinlan et al. 2010], 문헌[Orban, Bundy et al. 2011], 문헌[Sherry, Hagopian et al. 2011], 문헌[Tolerx 2011], 문헌[Gitelman, Gottlieb et al. 2013], 문헌[Moran, Bundy et al. 2013]); IL1-베타 차단, 항-CD25, 및 항-흉선세포 글로불린은 β-세포 손실에 대한 효과가 없다 (문헌[Gottlieb, Quinlan et al. 2010], 문헌[Gitelman, Gottlieb et al. 2013], 문헌[Moran, Bundy et al. 2013]). 하기 더 상세하게 토의된 바와 같이, 단 하나의 부류의 약제, 항-TNFα, 즉 에타너셉트가 소규모 I 상 시험에서 새로 진단된 당뇨병에서 내인성 인슐린 생성을 보존할 뿐만 아니라 그것을 사실상 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서, 대부분의 다른 자가면역 병태에 비교하여, T1D-질환 조절 요법으로부터 가장 많이 이익을 얻어야 하는 개체군인 아동에서의 일상적 사용에 허용가능한 안전성 프로파일을 동반하여 T1D에서 일관적으로 효과적인 것으로 나타난 면역조절제 (생물학적인 것 또는 다른 것)는 없다.

항-종양 괴사 인자 알파 저해제

종양 괴사 인자 알파 (TNFα)는 다양한 자극에 반응하여 주로 대식세포 및 T 세포에 의해 생성되고 광범위한 생물학적 활성을 매개하는 주요 전염증성 사이토카인이다. 그것은 26 킬로달톤 (kDa) 유형 II 막 단백질로서 발현되며, 이는 단백질 분해시에 생물학적으로 활성인 삼량체 형태로 자가-결합하는 가용성 17 kDa 단량체로서 방출된다. 종양 괴사 인자 α는, 발생으로부터 면역 반응에 이르는 범위의 과정에서 세포 증식 및 세포사에 영향을 주는 중첩된 기능을 가진 관련 사이토카인의 군인 TNF 리간드 수퍼패밀리의 일부이다. 그의 명칭에 의해 표시되는 바와 같이, TNFα는 쥐과 종양 세포주와 관련된 세포 자멸의 유도자로서 초기에 기재되었지만, 더 최근의 연구는 TNFα로 인한 만성 염증이 종양 촉진 및 전이로 이어질 수 있음을 시사한다.

TNFα에 의해 조절되는 기능적 활성은 증식, 분화, 사이토카인 및 케모카인 생성의 유도 및 부착 단백질의 유도, 또는 예정 세포사의 개시로 이어지는 세포 활성화를 포함할 수 있다. TNFα에 연루되는 2개의 수용체가 사실상 모든 세포 유형에서 확인된다. TNF 수용체 1 (TNF-R1) (또는 p55)은 세포내 사망 도메인 (death domain)을 함유하며 세포독성 이벤트의 신호를 전달할 수 있는 반면에, TNF 수용체 2 (TNF-R2) (또는 p75)는 림프구에서의 TNFα 신호전달에 관여하는 것으로 나타난다. TNFα 생성에 대한 생리학적 반응의 복잡성에 대한 원인은 다원적이며 존재하는 TNFα의 생물학적 형태 (가용성 또는 막관통), 기능성 수용체 (TNF-R1 및/또는 TNF-R2), 액세서리 단백질, 및 표적 세포에서 이용가능한 신호전달 경로, 그것이 생성되는 조직, 및 발현의 시기 및 지속기간을 포함한다.

TNFα의 제한된 국소 발현은 손상 및 감염성 병원체에 대한 숙주 염증성 반응 및 보호 면역 반응에 있어서 중요하지만, 특이적 기관에서의 TNFα의 만성 발현은 유의적인 병리로 이어질 수 있다. 고수준의 TNFα는 류머티스 관절염 (RA), 건선 관절염 (PsA), 강직성 척추염 (AS), 염증성 장 질환, 및 T1D와 같은 질환의 병태생리에 연루되어 왔다. TNF의 저해는 관절염 및 대장염의 동물 모델에서 질환 활성을 완화시키는 것으로 나타났으며, 이는 RA, 염증성 장 질환, 및 인접 적응증 (adjacent indication)과 같은 면역-매개 염증성 질환의 치료를 위한 단클론 항체 (mAb) 골리무맙, 인플릭시맙, 아달리무맙, 및 세르톨리주맙 페골; 및 가용성 TNF 수용체 p75 단편 결정화가능 (Fc) 융합 단백질, 에타너셉트를 포함하는 항-TNFα 약제의 성공적인 임상 및 상업적 개발로 이어졌다.

제1형 당뇨병에서 TNF 차단의 메카니즘

연구는 TNFα 가 T1D에서 자가면역 과정 및 베타 세포 파괴에 결정적인 전염증성 사이토카인임을 나타냈다 (문헌[Cavallo, Pozzilli et al. 1991], 문헌[Rabinovitch 1998]). 활성화된 대식세포, 수지상 세포, 및 CD4+ T 세포에 의해 생성되는 종양 괴사 인자-α는 급성기 반응에 대한 그의 참여, 전-증식성 효과, 및 선천 및 적응 면역 반응에서의 다른 세포의 활성화 및 동원을 통해 염증을 촉진한다. 종양 괴사 인자-α, 수지상 세포 (DC), 단핵구, 및 CD4+ T 세포는 모두 T1D에서 췌도염 병변 (insulitic lesion)에서 확인되며, 모두 베타 세포 염증 (췌도염) 및 베타 세포 살해에 연루된다(문헌[Cavallo, Pozzilli et al. 1991], 문헌[Rabinovitch 1998]). 전임상 연구에서, 비-비만 당뇨병 (NOD) 생쥐 (자발적 자가면역 당뇨병의 모델)를 생애 초기에 TNFα로 전신 처리하면 당뇨병 발병의 빈도가 증가되고 가속된다. TNFα에 대한 항체를 이용한 치료는 발병을 지연시키고, 빈도를 감소시키며, 일부 경우에는 당뇨병을 완전히 예방한다(문헌[Rabinovitch 1998]). 일부 당뇨병 경향이 없는 생쥐 변종 (예를 들어, C57BL/6)에서, TNFα에 의한 전신 처리는 췌도염을 유발한다(문헌[Rabinovitch 1998]). 생애 초기에 TNFα를 발현시키는 NOD 생쥐 섬에서의 TNFα의 트랜스제닉 발현 (NF-α-NOD)은 질환 진행을 가속한다(문헌[Koulmanda, Bhasin et al. 2012]). T1D의 설치류 모델에서 당뇨병을 예방하거나 역전시키기 위해 TNFα 저해제를 특이적으로 사용한 연구는 없다.

종양 괴사 인자-α는 염증성 세포의 섬에 대한 동원을 향상시키고, 세포를 활성화하고, 자가항원 제시를 향상시킴으로써 당뇨병 자가면역을 촉진하는 것으로 나타난다 (문헌[Rabinovitch 1998], 문헌[Kodama, Davis et al. 2005]). 종양 괴사 인자-α는 혈관 내피를 활성화하여 MHC I 및 부착 분자를 상향조절한다 (문헌[Argiles, Lopez-Soriano et al. 1994]). T1DM의 쥐과 모델에서, 섬을 침윤하는 최초의 세포 중 일부는 수지상 세포 (DC)이다 (문헌[Argiles, Lopez-Soriano et al. 1994], 문헌[Rabinovitch 1998]). T 세포에 대한 β-세포 항원 제시를 위해 결정적인 수지상 세포 및 다른 항원-제시 세포 (APC)는 MHC I 및 II 및 공동자극 분자의 상향 조절에 의해 TNFα에 의해 활성화된다 (문헌[Rabinovitch 1998], 문헌[Kleijwegt, Laban et al. 2010]). 종양 괴사 인자-α는 또한 베타 세포 상에서 MHC I을 직접 증가시키고 IFNγ와 상승작용하여 MHC II를 상향조절하며, 이들 둘 모두는 T 세포 살해에 대한 그들의 감수성을 증가시키는 것으로 나타난다 (문헌[Atkinson, Bluestone et al. 2011]).

부가적으로, TNFα의 중요한 비-면역 효과가 존재하며, 이는 T1D에서 그것을 차단하는 것을 매력적으로 만든다. 종양 괴사 인자-α는 직접적인 세포증식억제 효과를 가지며 인슐린 생성 및 분비를 악화시키고, 그것은 베타 세포를 직접 살해하는 세포파괴 활성을 갖는다 (문헌[Mandrup-Poulsen, Bendtzen et al. 1987], 문헌[Kawahara and Kenney 1991], 문헌[Dunger, Schroder et al. 1995], 문헌[Rabinovitch 1998]). 종양 괴사 인자-α는 또한 인슐린 신호전달을 악화시키고 말초 인슐린 내성을 증가시키며, 이는 실험적 모델에서 TNFα를 차단함으로써 역전시킬 수 있다 (문헌[Rabinovitch 1998], 문헌[Koulmanda, Bhasin et al. 2012]). 신규 발병 T1D를 가진 환자는 장기-지속 질환을 가진 사람들 또는 건강한 대조군과 비교하여 상승된 혈청 TNF® 수준을 갖는다 (문헌[Cavallo, Pozzilli et al. 1991]). 인슐린 민감성의 분명한 증가로 인해 인슐린 요구량이 하락한, 다른 자가면역 질환을 위해 TNF® 차단제를 시작한 T1D를 가진 환자의 사례 보고가 있다 (문헌[Yazdani-Biuki, Stelzl et al. 2004], 문헌[Boulton and Bourne 2007], 문헌[van Eijk, Peters et al. 2007], 문헌[Arif, Cox et al. 2010]). 그러므로, TNFα는 또한, 베타 세포 스트레스 및 사망을 증가시킴으로써 당뇨병에 기여할 수 있는 강력한 대사 효과를 갖는다.

T1D에서의 TNFα의 역할, 및 그것의 차단이 인간에서 질환의 경로를 변형하는 능력을 가질 수 있다는 것을 지지하는 데이터는, 마스트란드리아 (Mastrandrea) 등에 의해 수행된 새로 진단된 T1D에서의 에타너셉트의 소규모 파일럿 임상 시험의 보고로부터 나온다 (문헌[Mastrandrea, Yu et al. 2009]). 자격은 당뇨병 자가항체 (즉, GAD-65 및/또는 섬 세포 항체) 양성이고 정상적인 WBC 및 혈소판 계수 및 정상적인 간 및 신장 기능을 가진, 진단으로부터 약 6주가 된 연령 3 내지 18세의 환자를 포함하였다. 환자는 24주 동안 매주 2회 피하 투여된 에타너셉트 0.4 mg/㎏ (최대 25 mg) 또는 위약을 받았다. 연구는 18명의 대상 (평균 연령 ~12.5세)을 등록시켰으며, 10명은 에타너셉트군 내로 (24주 동안 매주 2회 0.4 mg/㎏ SQ), 그리고 8명은 위약군 내로 등록시켰다. 환자를 6개월 동안 추적하였다. 에타너셉트-치료 참여자는 위약 참여자보다 더 낮은 인슐린 요구량 및 더 낮은 HbA1c를 나타냈으며, 중요하게는, 혼합식 관용 시험 (MMTT: mixed-meal tolerance test)에 반응하여 2-시간 곡선하 면적 (AUC) C-펩티드 수준에 의해 평가된 C-펩티드 생성의 기준선으로부터의 39% 증가가 나타났다. 반면에, 위약군은 C-펩티드 생성이 20% 감소하였다. 어느 군에서도 중증 유해 이벤트가 없었다. 3명의 에타너셉트-치료 환자가 경미한 일시적 감각이상을 보고하였으나, 그 밖에는 유해 이벤트 (모두 경미함)의 빈도가 2개의 군에서 유사하였다. 이들 매우 유망한 초기 관찰사항에 대한 후속 조치는 없었지만, 스폰서는 본 연구에서 생성된 데이터가 T1D에서의 TNFα 차단제의 잠재적 이익에 대한 필수적 근거를 제공하고 이 개체군에서의 추가 연구를 정당화할 것임을 주장한다.

전임상 및 임상 연구로부터의 상기 증거는 TNFα가 T1D 발생 및 진행에서 결정적 역할을 갖는다는 것을 입증한다. TNFα의 직접적으로 독성인 면역 및 대사 효과가 존재하며, 이는 이 사이토카인의 차단이 임상적으로 추가 조사할 매우 매력적인 접근법임을 시사한다. T1D를 가진 사람들에게 이용가능한 질환 조절 요법이 없고, 인슐린을 이용한 최상의 혈당 조절에도 불구하고 심각한 단기 및 장기 이환율 및 사망률이 계속 존재한다는 사실은, T1D를 가진 사람들의 경로, 혈당 조절, 및 삶을 개선할 요법을 찾을 충족되지 않은 유의적인 필요성이 존재한다는 개념을 지지한다.

상기 토의된 바와 같이, 많은 다른 자가면역 장애에서와 같이, T1D에서 TNFα는 질환 개시 및 진행에 있어서 핵심적 역할을 담당하는 것으로 나타난다. 다른 자가면역 장애에서 TNFα 차단의 임상적 유용성은 잘 확립되어 있다. 아달리무맙, 골리무맙, 인플릭시맙, 세르톨리주맙 페골, 및 에타너셉트를 포함하는, TNFα를 차단하는 다수의 FDA-승인된 약제가 존재하며, 이 부류의 생물학적 요법은 가장 광범위하게 평가되고 처방되었으며, 류머티스 관절염, 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염, 및 크론병과 같은 성인 및 아동에서의 자가면역 질환의 스펙트럼의 치료에 있어서 성공적이었다. TNFα 저해제에 대한 다수의 비인가 실험적 용도가 존재한다. 이는 동종이계의 섬 이식 요법을 포함하며, 여기서 TNFα 저해제의 첨가는 이식편 생존을 개선하는 것으로 나타났고, 이는 아마도 이 적응증에서 베타 세포 생존에 대한 TNFα 차단의 유익한 면역학적 효과 및 대사 효과 둘 모두를 반영한다. 골리무맙, 인플릭시맙, 세르톨리주맙 페골, 및 아달리무맙은 TNFα와 결합하는 단클론 항체인 반면에; 에타너셉트는 IgG 꼬리에 결합된 TNF 수용체로 이루어진 융합 단백질이며, 또한 림포톡신 알파 (LTα)와 결합한다. 림포톡신 알파는 설치류 자가면역 당뇨병에서 역할을 갖는 것으로 나타나지만, 인간 T1D에 직접 관여하는 것으로 나타나지는 않았다. 아동에서의 임상적 용도에 대해, 에타너셉트는 1999년 이래로 JIA를 가진 2세 이상의 아동에서 FDA-승인되었고, 인플릭시맙은 각각 2009년 및 2011년에 크론병 및 궤양성 대장염을 가진 6세 이상의 아동에서 승인되었고, 아달리무맙은 2008년에 2세 이상의 아동에서의 JIA 및 2014년에 6세 이상의 아동에서의 크론병에 대해 승인되었다. 골리무맙은 JIA 및 소아 UC를 가진 연령 2세 이상의 200명 초과의 아동에서 연구되었다. 효능에 부가하여, 다수의 적응증에 걸쳐 이들 약제의 아동에서의 안전성 프로파일이 문헌에 잘 기록되어 있으며 성인에서의 안전성 프로파일과 유사하다.

요약하면, T1D의 면역 및 대사 병인에 TNFα를 연루시키고, TNFα의 차단이 당뇨병 자가면역을 방해하고 베타 세포를 보존하는 능력을 갖는다는 강력한 전임상 및 임상 데이터가 존재한다. 2세 만큼 어린 아동에서의 경우를 포함하는, 다양한 인간 자가면역 질환에 대해 TNFα-차단제의 거의 20년의 성공적인 임상 경험이 존재한다. T1D는 계속적으로 개인, 그들의 가족, 및 사회에 유의적인 부담이며, 내인성 베타 세포 기능을 유지하고 이 질환의 단기 및 장기 후유증을 경감시키는 것을 지원할 수 있는 T1D에서의 질환 조절 요법에 대한 충족되지 않은 유의적인 필요성이 존재한다.

골리무맙에 대한 임상 경험

성인 프로그램

적응증에 걸친 전체적인 개발 프로그램의 설명

SC 주사로서 투여되는 SIMPONI^® (골리무맙)는, 이전의 치료에 대한 부적절한 반응 또는 불관용을 갖거나 계속적인 스테로이드 요법이 필요한 환자에서 메토트렉세이트 (MTX)와 조합하여 보통 내지 중증 활성 류머티스 관절염 (RA)의 치료를 위해; 단독으로 또는 MTX와 조합하여 활성 건선 관절염 (PsA); 활성 강직성 척추염 (AS)의 치료를 위해; 그리고 보통 내지 중증 활성 UC의 치료를 위해 현재 미국에서 성인에 대해 승인되어 있다.

성인 류머티스학 적응증에서 승인된 투여량은 SC 주사에 의해 월 1회 투여되는 50 mg이다. UC를 가진 성인에 대해 승인된 투여량은 제0주에 200 mg SC 주사, 이어서 제2주에 유도로서 100 mg SC (200 mg → 100 mg), 이어서 100 mg SC q4w의 유지 요법이다.

확립된 안전성 프로파일

RA, AS, 및 PsA에 대한 연구에서 장기 안전성 (최대 5년 동안의 안전성 연장)을 평가하였고, UC에서 대략 4년의 추적의 장기 연장을 완료하였다. 임상 연구에서 11,000명 초과의 대상이 골리무맙에 노출되었으며, 제품 출시 이래로 2015년 10월 6일 현재 전세계적으로 추산된 다른 393,000명의 환자가 골리무맙에 노출되었다. (프로그램 내의 모든 임상 연구의 목록이 각각의 연구에서 노출된 대상의 수와 함께 표 8에 제공되어 있음).

골리무맙의 안전성 프로파일은 TNFα 저해제 부류 내의 약물 제품과 일치한다.

임상 연구에서 골리무맙에 대해 관찰된 ADR은 표 7에 제공되어 있다.

표 7에서 ADR 빈도는 하기와 같은 2 상 및 3 상 임상 연구에서 5,717명의 골리무맙-치료 대상으로부터의 데이터를 기준으로 한다: RA 연구에서 3,090명의 대상 (C0524T02, C0524T05, C0524T06, C0524T11, C0524T28, C0524T12, 및 CNTO148ART3001), PsA 연구에서 394명의 대상 (C0524T08), AS 연구에서 564명의 대상 (C0524T09, C0524T29), UC 연구에서 1,245명의 대상 (C0524T16, C0524T17, 및 C0524T18), 중증 지속성 천식 연구에서 231명의 대상 (C0524T03), 및 활성 nr-축성 SpA를 가진 193명의 대상 (P07642 [MK-8259-006]).

하기 표에 열거된 ADR은 빈도 및 SOC에 따라 분류되어 있다. 빈도 카테고리는 표의 각주에 매우 통상적임, 통상적임, 통상적이지 않음, 희귀함, 매우 희귀함, 및 미지로서 정의되어 있다.

[표 7]

소아과 프로그램

적응증에 걸친 전체적인 소아과 개발 프로그램의 설명

골리무맙은 소아 환자에서의 사용에 대해 현재 승인되어 있지 않다. 그러나, pJIA를 가진 아동에서 SC 골리무맙의 연구 (CNTO148JIA3001)가 수행되었고 소아 UC에서 피하 투여되는 골리무맙을 이용한 임상 개발 프로그램이 현재 진행 중이다 (CNTO148UCO1001).

CNTO148JIA3001은, 3개월 이상 동안의 메토트렉세이트 (MTX) 요법에도 불구하고 활성 관절염이 있는 5개 이상의 관절에 의해 표출되는 pJIA를 가진 소아 대상 (연령 2 내지 18세 미만)에서 골리무맙의 SC 투여의 임상 효능을 평가하는 주목적을 가진 3 상 다기관 이중-맹검 무작위 배정 중단 연구 (randomized withdrawal study)였다. CNTO148JIA3001 연구는 환자가 SC 골리무맙 30 mg/m² q4w + MTX를 16주 동안 받은 공개 라벨 상 (open label phase)에 이어서, 16주에 미국 류머티스 학회 (ACR: American College of Rheumatology) 소아과 (Ped) 30 반응을 달성한 환자가 48주에 걸쳐 골리무맙 30 mg/m² + MTX 또는 위약 + MTX q4w를 받은 무작위 배정 중단 상으로 이루어졌다. 중간 추적이 대략 2년이었던 장기 연장 또한 있었다. 총 173명의 대상 (75.7% 여성; 24.3% 남성)이 연구에 등록되었고, 154명의 대상이 16주에 무작위 배정 중단 상에 진입하였다. 평균 연령은 11.2세였고 (52.0%는 연령이 12 내지 17세였고; 48.0%는 연령이 2 내지 11세였음) 평균 체중은 43.1 ㎏이었다.

CNTO148UCO1001은 소아 UC를 가진 아동에서 골리무맙의 PK, 안전성, 및 효능을 평가하기 위한 1b 상 다기관 개방-라벨 연구였다. 이 다기관 개방-라벨 연구에는 통상의 요법 (즉, IV 또는 경구 코르티코스테로이드 또는 면역조절제 AZA 또는 6-MP)에 대해 부적절하게 반응했거나, 관용에 실패했거나, 의학적 금기를 나타냈고 항-TNFα 약제에 대해 무경험인 보통 내지 중증 활성 UC를 가진 연령이 2 내지 17세인 소아 대상이 등록되었다. 대상은 하기와 같이 SC 골리무맙의 체중-기준 투여 요법을 받았다:

체중이 45 ㎏ 미만인 대상: 제0주에 90 mg/m² 및 제2주에 45 mg/m², 및 제6주 반응자 중에서 제6주에 시작하는 45 mg/m² q4w

체중이 45 ㎏ 이상인 대상: 제0주에 200 mg 및 제2주에 100 mg, 및 제6주 반응자 중에서 제6주에 시작하는 100 mg q4w

연구는 하기 2개 파트로 분할되었다: 제14주까지의 PK 부분, 및 제126주까지의 연구 연장. 연구 1 (CNTO148UCO1001)의 14-주 PK 부분이 완료되고 연구 연장이 진행중이다. 총 35명의 대상 (51.4% 여성; 48.6% 남성)이 연구에 등록되었다. 평균 연령은 13.4세였고 (71.4%는 연령이 12 내지 17세였고; 28.6%는 연령이 2 내지 11세였음) 평균 체중은 51.7 ㎏이었다.

확립된 안전성 프로파일

골리무맙은 연령이 2 내지 18세 미만인 소아 대상에서 잘 관용되었다. 일반적으로, pJIA 및 소아 UC 연구에서, 나타난 유해 반응의 유형 및 빈도를 포함하는 골리무맙의 안전성 프로파일은 연구된 성인 개체군에 대한 공지된 안전성 프로파일과 일치했고 다른 TNFα 저해제와 일치했다. 새로운 안전성 신호는 관찰되지 않았다.

제안된 2a 상 신규 발병 T1D 연구 ― CNTO148DML2001

내인성 인슐린의 유지를 위한 β-세포의 보존에 대한 SIMPONI^®의 효과를 평가하기 위해, 스폰서는 새로 진단된 T1D 환자에서 2a 상 신규 발병 T1D 연구를 계획하고 있다. 이 연구의 결과는 SIMPONI^®가 TNFα 차단을 통해 T1D 질환 진행에 영향을 주는지 여부에 대한 핵심적 정보를 제공하고 신규 발병 질환에서 뿐만 아니라 증상의 발병 및 외인성 인슐린에 대한 요구 전의 "전-질환" 상태에서의 추가 개발을 지지할 것이다. 본 연구의 핵심적 태양이 하기에 개관되어 있다.

연구 설계

이는 T1D를 가진 대상에서의 골리무맙의 2a 상 무작위 배정 이중-맹검 위약-대조 평행군 다기관 연구이다. 연령이 6 내지 21세인 대략 81명의 대상이 피하 (SC) 투여되는 골리무맙 또는 위약을 받도록 2:1 비로 무작위 배정될 것이다. 골리무맙 치료군에 무작위 배정된 체중이 45 ㎏ 미만인 연구 대상은 제0주 및 제2주에 SC 골리무맙 60 mg/m²의 유도 용량 (induction dose)에 이어서, 제4주 및 제52주까지 q2w로 30 mg/m2의 유지 용량 (maintenance dose)을 받을 것이다. 골리무맙 치료군에 무작위 배정된 체중이 45 ㎏ 이상인 연구 대상은 제0주 및 제2주에 SC 골리무맙 100 mg의 유도 용량에 이어서, 제4주 및 제52주까지 q2w로 SC 골리무맙 50 mg의 유지 용량을 받을 것이다 (섹션 0). 위약 치료군에 무작위 배정된 대상은 제52주까지 SC 위약 주사 q2w를 받을 것이다 (도 18). 대상의 모집 및 유지를 용이하게 하기 위해, 스폰서는 연구 약제의 재택 자가-투여를 허용할 것이다.

연구 중에, 모든 대상은 외인성 인슐린으로 그들의 당뇨병을 집중적으로 관리 받을 것이다. 대상, 및 적용가능한 경우에 그들의 보호자는, 미국 당뇨병 학회 (American Diabetes Association)에 의해 정의된 바와 같은 특이적 HbA1c 표적을 이용하는 엄격한 혈당 조절의 현재 권장사항을 따르는 것에 동의해야 한다. 이들 현재 권장사항은 T1D의 단기 및 장기 후유증 중 일부를 감소시키는 것으로 나타나는 글루코스 수준을 달성하는 것을 의도한다. 본 연구에 특이적으로, 이는 연령이 6 내지 12세인 사람들의 경우에 8% 미만, 연령이 13 내지 18세인 사람들의 경우에 7.5% 미만, 그리고 19세 이상인 사람들의 경우에 7% 미만의 HbA1c 표적을 포함할 것이다. 대상의 혈당 조절은 대상의 주치의가 모니터링할 것이다. 추가로, 스크리닝에서, 그리고 연구 중에, HbA1c 및 혈당 조절의 다른 파라미터를 평가할 것이다.

연구 개체군

새로 진단된 T1D를 가진 연령이 6세 내지 21세인 남성 및 여성이 본 연구에 등록될 것이다. 참여자들은, T1D의 현재 ADA 정의를 충족할 것, 5개의 인식된 T1D 자가항체 중 1개 이상에 대해 양성일 것, 잔류 β-세포 기능의 증거를 나타낼 것 (혼합식 관용 시험에 따라 0.2 pmol/mL 이상의 피크 c-펩티드에 의해 정의됨), 그리고 T1D 진단으로부터 100일 이내에 시험에 무작위 배정될 것을 포함하는 신규 발병 T1D 연구에서의 등록에 인정되는 기준을 충족할 것이다. 배제 기준은, 시험에 포함될 경우에 면역 또는 감염성 위험으로 인해 임의의 특정 위험에 처할 수 있는 개체를 동정하는 데에 집중할 것이다.

연령 범위는 하기 이유로 선택되었다:

연장자 성인 (older adult)에 비교한 아동 및 연소자 성인 (young adult)에서의 TID의 특유한 속성:

최근의 데이터에 의해 아동 및 연소자 성인 (즉, ~21세까지) 및 연장자 성인에서의 T1D 질환에 중요한 차이가 존재한다는 것이 확인되었다. 새로 진단된 T1D를 가진 연소자 및 연장자 개체에는, 연소자군에서 더 공격적인 증상 발현 (즉, 전체적 인슐린 대체에 대한 더 빠른 필요성) 및 초기 경로로서 기재될 수 있는 것을 포함하는, 질환의 증상 발현 및 경로에 있어서 다수의 임상적 차이가 존재한다는 것이 인정된다. 다수의 최근의 신규 발병 T1D 연구의 위약 대상에서 c-펩티드 쇠퇴의 자연 경과의 철저한 평가를 수행한 그린바움 (Greenbaum) 등에 의한 최근의 보고에서, 결과는 21세 초과의 사람들에서보다 더 빠른 쇠퇴와 함께 ~7 내지 21세의 사람들에서의 유사한 속도의 c-펩티드 쇠퇴를 나타냈으며, 이는 이들 "연소자" 및 "연장자" 개체에 상이한 면역병리가 존재함을 강력하게 시사한다. 부가적으로, 일부 T1D에서의 면역치료 시험에서 연소자 및 연장자 개체에 상이한 효능이 존재하여, 이 논쟁을 지지한다. 예를 들어, 알레파셉트 (LFA3-Ig) 및 아바타셉트 (CTLA4-Ig)는 연소자 개체 (연령이 18 내지 21세 미만임)에서 우선적인 효과를 갖는 것으로 나타나는 반면에 티모글로불린은 연장자 개체 (연령이 21세 초과임)에서만 유익한 효과를 갖는 것으로 나타난다 (문헌[Gitelman, Gottlieb et al. 2013], 문헌[Orban, Bundy et al. 2014], 문헌[Rigby, Harris et al. 2015]). T1D의 성질 및 경로 및 이 질환과 연계된 평생 및 누적 이환율 및 사망률로 인해, 질환 진행을 지연시키거나 안정화하는 요법에 의해 가장 긍정적인 영향을 받을 사람들은 아동 및 연소자 성인이다. 연장자 성인 개체와 비교한 이 개체군에서의 질환의 전술한 차이로 인해, 이 질환에서 가장 영향력이 있을 질환 조절 요법을 가장 적절하게 개발하기 위해서는 T1D를 가진 아동 및 연소자 성인의 직접 연구가 필수적이다.

아동에서의 신규 발병 T1D에서 TNFα 차단제의 이익의 가능성을 지지하는 데이터:

스폰서는 소아 개체군에서의 평가 전에 성인 개체군에서의 치료적 중재에 의한 임상적 이익을 입증하는 것이 간혹 바람직하다는 것을 인식한다. 그러나, 버팔로 대학교의 연구자들에 의해 수행된 소규모 에타너셉트 파일럿 연구 (또한 상기 참조됨)로부터, TNFα-차단제 에타너셉트의 24주 경로에 의해 7 내지 18세의 아동 (프로토콜은 연령이 3세인 아동까지 허용했음)에서 c-펩티드 생성, HbA1c, 및 외인성 인슐린 사용에 대한 유익한 효과가 있었던 것으로 나타났다. 이는 소규모 시험이었지만 (총 18명의 참여자, 10명이 에타너셉트를 받음), 결과는 극히 유망했으며, 위약군에서 c-펩티드의 손실이 있었던 시간 동안에, 등록시에 대비하여 24주에 평균적으로 에타너셉트에 의한 내인성 인슐린 생성의 증가가 있었음을 나타냈다. 이들 결과를 고려하여, 그리고 성인 및 소아 적응증 둘 모두에서의 골리무맙 및 다른 TNFα 차단제에 관한 광범위한 경험을 고려하여, 스폰서는 새로 진단된 T1D를 가진 아동에서의 TNFα-차단에 대한 이익의 가능성이 입증되었으므로 이 특정 개체군에서 질환-조절 요법으로서 골리무맙을 평가하는 것이 적절하다고 주장한다.

골리무맙을 포함하는 TNFα 차단제의 광범위한 안전성 및 효능 경험

스폰서는 의도된 연구 개체군 중 일부가 연령의 관점에서 면역 요법을 평가하기에 특히 감수성인 개체군으로 간주될 수 있음을 인식한다. 본 발명자들은 그 자체 및 TNFα-차단제의 부류의 구성원으로서의 골리무맙의 경우에 다른 자가면역 질환에서 2세까지의 아동에서의 강건한 안전성 (및 효능) 경험이 존재한고 생각한다. 에타너셉트는 JIA를 가진 2세 이상의 아동에서 1999년 이래로 FDA-승인되었다. 인플릭시맙은 크론병 및 궤양성 대장염을 가진 6세 이상의 아동에서 각각 2009년 및 2011에 승인되었다. 아달리무맙은 2세 이상의 아동에서 JIA에 대해 2008년에, 그리고 6세 이상의 아동에서 크론병에 대해 2014년에 승인되었다. 골리무맙은 JIA를 가진 연령 2세 이상의 200명 초과의 아동에서 연구되었으며, 현재 유럽에서 이 적응증에 대해 등록 중이다. 부가적으로 상기 약제 전부가 류머티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 및 건선을 포함하는 성인에서의 매우 다양한 자가면역 병태에 대해 승인되어 있다. 따라서, 골리무맙을 포함하는 TNFα-차단제의 안전성 및 부작용 프로파일은, 아마도 T1D에서 평가된 임의의 다른 면역요법보다 훨씬 더 많이, 성인에서 뿐만 아니라, 특이적으로 소아 개체군에서도 잘 확립되어 있다.

종합하면, 신규-발병 T1D에서의 골리무맙 연구를 연소자 개체에 집중하고 6 내지 21세의 아동 및 연소자 성인만 포함할 강력한 근거가 존재한다. 소아 자가면역에서 골리무맙 및 TNFα-차단제의 부류로부터 강건한 특이적 효능 및 안전성 데이터가 있을 뿐만 아니라, 이 연소자 연령 범위에서 TNFα-차단이 새로 진단된 T1D에서의 β-세포의 손실을 역전시키지는 않더라도 지연시키는 능력을 갖는다는 극히 유망한 데이터가 있었으며, 따라서 이 연령군에서 TNFα-차단의 "이익의 가능성"의 결정선 (critical bar)을 충족한다. T1D 당뇨병이 연소자 대 연장자 개체에서 상이하며, 이들 군에서 면역 요법에 대해 유의적으로 상이한 반응이 있을 수 있고, 여기서 일 군에서의 효능 (또는 그의 결여)은 다른 군에 대해 사실상 잘못된 정보를 줄 수 있다는 것이 잘 동의되고 입증되어 있다. 스폰서는 상한 연령 "컷-오프"를 연령 21세로 선택하며, 이는 이들 연구 중 다수가 이 연령에서 "연소자" 및 "연장자" 질환에 구분선 (differentiating break)을 두는 것으로 나타나기 때문이다. 연령 6세는 다른 신규 발병 T1D 연구 (즉, 아바타셉트 및 카나키누맙)에서 허용되는 등록의 하한 연령이었으며, 또한 아동에서 승인된 UC에 대한 연령 컷오프이고 승인된 TNFα-차단제의 부류에 대한 JIA 연령 범위를 포함한다.

용량 선택

본 시험에서 제안된 골리무맙의 투여는 T1D에서의 질환-특이적 고려사항에 관한 지식, T1D를 가진 아동에서의 전술한 파일럿 시험에서의 에타너셉트의 TNFα의 저해의 비교 효능의 이해, 및 골리무맙에 관한 스폰서의 경험을 통합한다. T1D에서, 임상 질환의 발병시에 β-세포의 파괴는 비가역적이고 빠른 것으로 나타난다. 더 많은 염증성 면역-매개 질환의 경우, 크론병 및 궤양성 대장염에 대한 항-TNFα 약제의 사용에서와 같이, 더 높거나 더 빈번한 유도 용량에 이어서 더 낮은 유지 용량이 종종 사용된다. ^7,8,9 T1D의 경우, 연구에 등록할 때 존재하는 β-세포의 추가의 파괴를 방지하기 위해서는 질환 활성을 신속하게 억제할 필요성 또한 존재한다. 골리무맙 정상-상태 농도가 일반적으로 12주 후에 확립된다는 것을 고려하여, 정상-상태 농도를 더 일찍 달성하여 추가의 β-세포 손실을 상쇄하기 위해서는 유도 용량을 사용한 후에 유지 투여 요법이 이어져야 한다. 이전의 성인 및 소아 연구로부터의 데이터를 개체군 PK 및 메카니즘 PK/표적 인게이지먼트 (TE: target engagement) 모델링과 함께 평가하여 이 2a 상 신규 발병 T1D 연구에 제안된 투여 요법을 결정하였다.

T1D에서의 유도 및 유지 투여에 대한 예측되는 필요성을 고려하여, 유리 TNFα 억제를 평가하는 메카니즘 PK/TE 모델 및 개체군 PK 모델을 이용하여 시뮬레이션을 통해 다양한 BSA-조정 투여 요법을 탐색하였다. 골리무맙에 대한 개체군 PK 모델은 모든 대상이 수반되는 메토트렉세이트 (MTX)를 투약하는 확립된 다관절 JIA 모델에 기초하였다. MTX는 이전에 골리무맙 노출에 영향을 주는 것으로 나타났고⁵, T1D를 가진 환자는 메토트렉세이트를 수반하여 치료될 것으로 예상되지 않으므로, 시뮬레이션에서 골리무맙 제거의 36% 증가가 감안되었다 (도 19). 신장 및 체중에 대한 CDC 성장 차트를 사용하는 6 내지 21세의 대상의 분석을 수행하여, 소아 개체군에서 이미 연구된 바 있는 투여 요법을 가진 JIA (도 19 패널 A) 및 ped UC (도 19 패널 B)에 제안된 T1D 투여 요법을 비교하였다. 시뮬레이션은 T1D 개체군에서 MTX의 비-동시-투여로 인해 더 빠른 골리무맙 제거 (36%)를 가진 확립된 JIA 개체군 PK 모델에 기초하였다. 아동의 경우, 골리무맙 30 mg/m² (50 mg/1.67 m²)은 체중 60 ㎏ (1.67 m²의 BSA를 가짐)의 성인 대상에 대한 50 mg 용량과 대략 동등할 것이다. 따라서 30 mg/m² 용량은 성인에서의 50 mg 용량과 유사하도록 설계되고, 60 mg/m² 용량은 성인에서의 100 mg 용량과 유사하도록 설계된다. 이들 시뮬레이션에 기초하여, 제안된 T1D 투여 요법에 대한 PK 노출은 JIA 노출과 ped UC 노출 (둘 모두 MTX 없이 시뮬레이션됨) 사이일 것으로 예상되나, q2w 유지 투여 간격은 약간 더 높은 최저 농도를 유발할 것이다. 성인에서, 골리무맙 50 mg q4w는 RA, PsA, 또는 AS의 치료를 위한 최소 유효 투여 요법이었다. T1D 대상에서 수반되는 MTX의 부재로 인해, 성인 50 mg q4w 용량에 대한 소아 동등물인 30 mg/m² q4w 투여 요법은 TNFα 억제에 충분한 전신 노출을 유발하지 않을 수 있을 것으로 예상되므로; 스폰서는 더 높은 용량 또는 더 빈번한 투여 간격을 연구해야 한다고 주장한다.

표적-매개 약물 처리 (TMDD: target-mediated drug disposition) 모델과 쌍을 이루는 상기 개체군 PK 모델 (수반되는 MTX 없이 36% 더 높은 제거를 가짐)로부터의 PK 노출을 포함하는 메카니즘 PK/TE 모델을 사용하여 약물과 표적 사이의 상호 작용을 평가하고 항-TNFα 투여 후의 TNFα 억제를 시뮬레이션하였다 (도 20). PK/TE 모델은, 이전에 관찰된 긍정적 결과를 고려하여, T1D에서 시험한 에타너셉트 투여 요법이 적절한 TNFα 억제를 유발한다는 가정에 기초하여 개발되었다. ⁶ 전임상 연구 및 상대성장 척도법 (allometric scaling)으로부터 TNFα 동역학 파라미터가 얻어졌으며, 동일한 세트의 TNFα 동역학 파라미터를 사용하여 골리무맙 및 에타너셉트의 효과를 비교하였다. 전신 순환에서의 TNFα 억제는 또한 췌장에서의 TNFα 억제를 대표하는 것으로 가정되었다. 골리무맙과 에타너셉트 사이의 PK 및 TNFα 결합 친화도의 차이를 감안한 후에, 신규 발병 TID를 가진 아동에서의 파일럿 시험에서 에타너셉트 투여 요법 후의 TNFα 억제의 정도를 근사하도록 골리무맙 투여 요법을 설계하였다.⁶ (문헌[Mastrandrea, 2009]). PK/TE 모델은, 30 mg/m² SC q4w 유지 용량과는 대조적으로, 제0주 및 제2주에 60 mg/m² SC (최대 100 mg까지)의 유도 투여 요법에 이어서 30 mg/m² SC (최대 50 mg까지) q2w 또는 60 mg/m² SC (최대 100 mg까지) q4w의 유지 투여 요법이 에타너셉트의 수준에 근사되는 것에 가까운 수준까지 TNFα의 억제를 가능하게 한다는 것을 시사하였다 (도 20). 30 mg/m² q2w 및 60 mg/m² q4w 유지 투여 요법은 동일한 전체적 노출 (AUC) 및 유사한 TNFα 억제를 가질 것이나; 60 mg/m² q4w 요법이 더 높은 피크/최저 농도 변동, 및 따라서 TNFα의 억제에 있어서 더 많은 변동을 가질 것이다. TNFα는 베타 세포에 대한 직접적인 세포증식억제 및 세포파괴 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 더 높지만 덜 빈번한 투여에서 최저 농도 중에 발생할 것으로 예상될 TNFα 상승은 잔류 베타 세포에 손상을 줄 수 있다. 이들 투여 요법의 골리무맙 노출은 동등한 것으로 간주될 수 있으므로, 30 mg/m² SC (최대 50 mg까지) q2w 투여 요법이 바람직했는데, 이는 TNFα의 직접 효과로부터 β-세포를 최적으로 보호하기 위한 시도에서 시뮬레이션에 의해, q2w 유지 투여 간격은 약간 더 높은 최저 농도를 유발하여 더 작은 피크/최저 농도 변동을 유발할 것으로 나타났기 때문이다.

RA, PsA, AS, 및 UC를 가진 대상에서 골리무맙의 안전성 및 효능이 광범위하게 특성화되었다. RA를 가진 대상에서의 2 상 연구에서는, 4개의 상이한 투여 요법을 평가하였으며 (50 mg q2w 또는 q4w 및 100 mg q2w 또는 q4w), 그 중에 시험된 모든 용량이 일반적으로 잘 관용되었고 제52주까지 임상 반응을 유지함에 있어서 효과적이었다. pJIA에서는, 30 mg/m² q4w 투여 요법을 최대 50 mg (승인된 성인 RA 용량)까지 연구하였다. ped UC에서, 45 ㎏ 미만의 대상은 제0주에 90 mg/m² (최대 200 mg까지) 및 제2주에 45 mg/m² (최대 100 mg까지)의 SC 유도 용량에 이어서 45 mg/m² (최대 100 mg까지) SC q4w의 유지 투여 요법을 받은 반면에, 45 ㎏ 이상의 대상은 제0주에 200 mg 및 제2주에 100 mg의 유도 용량에 이어서 100 mg q4w의 유지 용량을 받았다. 지금까지, 연구된 투여 요법은 전체적으로 잘 관용되었으며, 성인 류머티스학 및 IBD 연구에서 관찰된 것들과 유사한 빈도, 유형, 및 중증도로 동정된 새로운 유해 약물 반응이 없었다. 결론적으로, T1D의 질환 특이적 문제, 골리무맙 및 에타너셉트의 약리학적 비교, 및 골리무맙에 대한 특이적 임상 경험을 고려하여, 제0주 및 제2주 유도에서 60 mg/m² SC (최대 100 mg까지)에 이어서 30 mg/m² SC (최대 50 mg까지) q2w를 권장 투여 요법으로서 선택하였다. 체중 컷-오프 초과의 환자가 이미 승인된 성인 PFS 프리젠테이션 (PFS presentation)으로부터 골리무밥을 받도록 체중 컷-오프 (45 ㎏) 또한 연구될 것이다. 이 개념 증명 시험에 최상의 성공 기회를 제공하기 위한 시도에서 스폰서는 질환- 및 요법-특이적 고려사항 둘 모두를 사용하여 이 투여 요법을 개발하였다. 과거에 특이적으로 사용된 요법은 아니지만, 제안된 T1D 투여 요법은 전술한 아동에서의 JIA 및 UC 투여 사이의 관찰된 골리무맙 노출을 달성할 것이므로 (이는 중첩된 연령 범위에서의 연구에 대해 에이전시가 지지함) 이 특이적 접근법에 관한 안전성 우려를 완화한다. 이 시험이 성공적일 경우, 후속 임상 연구에서 용량 범위에 대한 고려가 탐색될 것이다.

치료의 지속기간

대상은 SC 골리무맙 또는 위약을 제52주까지 받을 것이다. 부분적으로, 본 시험의 목표는, TNFα를 중화함으로써 β-세포 보존을 나타낸 T1D에서의 에타너셉트의 24주 파일럿 임상 시험의 결과를 재현하고 연장하는 것이다. 진단 후의 β-세포 손실의 자연 경과로 인해, 합리적인 크기의 시험에서 β-세포 보존제의 통계적으로 유의하고 임상적으로 의미 있는 긍정적 효과를 문헌에 기록하는 것은 대략 1년에 가장 가능하며, 인정되는 주요 (1차를 포함함) 종점은 12개월에 유발된 c-펩티드 생성이다. 승인된 적응증에서, 골리무맙은 장기 요법으로 사용되므로 제안된 치료의 길이는 이 약제의 임상적 사용과 일치한다. 부가적인 치료 종료후 평가와 함께 1년의 치료 중 (on-therapy) 평가를 통해, 본 발명자들은 본 발명자들이 T1D에서의 이 요법의 추가의 임상적 개발을 인도하는 것을 보조할 중요한 효능 및 안전성 데이터를 얻을 것이라고 생각한다.

주요 종점의 근거 및 선택

연구 CNTO148DML2001에서 주요 시험 종점은 선도 T1D 연구 네트워크 (T1D TrialNet 및 면역 관용 네트워크를 포함함)에 의해 사용되고 인정되며 주요 보건 당국 지침 (FDA 및 EMA의 것들을 포함함)에 의해 인용된 것들과 일치할 것이다. 특이적으로, 1차 종점은 내인성 인슐린 생성의 객관적 측정값으로서 제52주에 혼합식 관용 시험에 따라 c-펩티드 반응 (4h AUC)을 자극하는 것이다. 이는 위약-대조 시험일 것이므로, 긍정적 연구는 활성 대 위약 치료군에서 제52주에 c-펩티드 AUC의 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것으로서 정의될 것이다. 대략 제13주, 제26주, 제39주, 제78주, 및 제104주에 2차 종점으로서 유발된 c-펩티드의 평가 또한 수행될 것이다. 이들 평가의 목표는 β-세포 보존에 대한 골리무맙의 효과의 시간 경로 (제12주, 제26주, 및 제38주) 및 치료 종료후 반응의 지속성 (제78주 및 제104주 평가)에 대한 이해를 얻는 것이다. 주요 2차 종점은 혈당 조절 (HbA1c), 인슐린 사용 (U/㎏/일의 단위), 및 저혈당증의 비율 (70, 55, 및 35 mg/dL 이하의 수준을 포함함)에 대한 다른 잠재적인 긍정적 효과를 평가할 것이다.

안전성 모니터링

β-세포 기능의 계속적인 손실을 방지함에 있어서 골리무맙의 효능을 평가하는 것에 부가하여, 광범위한 안전성 평가가 있을 것이다. 면역 조절제로서, 이들 평가의 초점은 감염 위험의 증가 또는 면역 상태에 대한 의외의 효과가 있는지를 결정하는 것이 될 것이다. 이는 연구 방문 중의, 그리고 가정에서의 국소 또는 전신 감염의 징후 또는 증상의 신중한 문헌 기록을 포함할 것이다 (환자 보고 결과를 사용함). 스폰서는 또한, EBV 및 CMV 상태의 정기적 평가를 통해, 백혈구 계수 및 약화된 면역 반응의 적응증에 대해 모니터링할 것이다. 골리무맙 및 다른 TNFα 차단제의 경험으로 인해, 스폰서는 비-면역 부작용이 낮을 가능성을 예견하지만, 본 발명자들은 신장 기능 검사, 간 기능, 및 혈액학적 검사를 포함하는 실험실 평가 및 신체 검사를 통해 이러한 효과의 임의의 임상적 또는 화학적 증거에 대해 모니터링할 것이다. 본 프로젝트의 목표는 T1D의 진행에 대한 유익한 효과가 있는지를 결정하는 것이며, 예상되는 것은 아니지만, 스폰서는 이에 대한 평가를 사용하여 증가된 저혈당증의 비율, 더 불량한 혈당 조절, 또는 더 빠른 내인성 베타 세포 기능의 손실과 같은 내분비학적 유해 효과가 있는지를 결정할 수 있을 것이다.

본 연구에 등록된 대상의 지속적인 안전성을 보장하기 위해 독립적인 외부 데이터 모니터링 위원회 (DMC: Data Monitoring Committee)를 설립하여 진행과정에 따라 데이터를 모니터링할 것이다. 위원회는 중간 데이터를 검토하기 위해 주기적으로 회동할 것이다. 검토 후에, DMC는 연구의 계속에 관한 권장사항을 작성할 것이다. 안전성 검토는 특정 AE, SAE, 및 사망률에 집중할 것이다.

SAE 보고서가 진행과정에 따라 DMC 구성원에게 제공될 것이다. DMC는 비맹검 (unblinded) 데이터 및 검토 일람표로 작성된 안전성 요약 (적절한 경우) 및 연구의 수행 중에 DMC가 요구할 수 있는 임의의 부가적인 데이터에 대한 접근권을 가질 것이다. 계획된 공식적인 통계적 가설 검정은 없다. 부가적으로, 연구 중에, 스폰서의 연구 담당 의사 (또는 지명자)는 현장으로부터의 맹검 안전성 데이터를 정기적으로 검토하고 DMC 및 적절한 스폰서 직원에게 임의의 문제를 신고할 것이다. 임상 시험 계획 승인 신청서 (Investigational New Drug (IND) Application)와 함께 에이전시에 제출될 프로토콜에는, 특이적 중단 규정을 포함하여, 본 연구에서 수행될 모든 안전성 평가 및 모니터링 및 DMC의 구성 및 역할 및 책임이 기재될 것이다.

하나의 중요한 안전성 수단은 또한, 공존하는 장애 또는 요법으로 인한 면역 억제를 갖는 대상의 배재, 및 결핵을 포함하는 유의적인 감염의 존재 또는 이력을 가진 개체의 배제를 포함한다.

투여 방법

2a 상 연구의 유지 부분 중에 q2w 투여의 제안된 요법을 고려하여, 재택 투여에 대한 선택사항은 환자의 일상에 도움이 되고 (즉, 모든 용량을 위해 치료 현장을 방문할 필요가 없음) 또한 연구 등록 및 유지를 증가시킬 것으로 예상된다. 환자 또는 보호자가 재택 투여를 수행하고자 하는 경우, 적절한 투여를 보장하기 위해 그/그녀는 주사 기술을 교육 받아야 하고, 그들의 피하 주사 능력이 평가되어야 한다. 부가적으로, 최초의 자가-주사 또는 보호자 주사는 적격 의료 전문가의 감독 하에 수행할 것이 권장된다.

2a 상 신규 발병 T1D 연구에서의 사용에 대해 제안된 프리젠테이션

Ultrasafe

체중이 45 ㎏ 이상인 소아 대상의 경우, 성인에서의 사용에 대해 이미 승인된 50 mg PFS-U 장치를 사용하여 골리무맙을 피하 투여할 것이다. 부가적인 상세사항에 대해서는 하기 및 도 21을 참조한다.

SIMPONI® UltraSafe Passive® 니들 가드 (Needle Guard) (PFS-U)

UltraSafe는, 사전충전 주사기에 대한 액세서리인 수동으로 작동되는 단일-사용 1회용 니들 가드 시스템이며, 이는 투여 후 및 사용된 사전충전 주사기의 처리 중에 의료 전문가 및 환자 또는 그들의 보호자에 대한 돌발적인 바늘 자상의 발생을 감소시키기 위한 안전성 메카니즘으로서의 용도로 의도된다. UltraSafe는 0.5 mL 또는 1.0 mL PFS를 수용한다. 조립 또는 사용 중에 어떠한 장치와도 약물 제품이 직접 접촉되지 않는다.

장치의 투명한 플라스틱 구조물 및 관찰 슬롯의 설계는 주사기의 가시화를 허용한다. 장치의 수동적 성질은 정상적인 바늘 삽입을 허용하며, 주사기의 플런저 스토퍼 (plunger stopper)가 완전히 전진하고 약물 용량이 전달될 때, 스프링-보조 가드가 해제된다. 가드는 그것이 잠김 위치에 걸릴 때까지 사용자가 그들의 그립을 이완시킴에 따라 주사기 및 바늘 위로 자동적으로 전진한다.

UltraSafe의 특징부가 도 21에 예시되어 있다.

VarioJect

스폰서는 BSA-투여를 용이하게 하기 위해 여러 소아과 프로그램에 걸친 플랫폼 장치로서 VarioJect으로 공지된 소아과 프리젠테이션을 개발하고 있으며, VarioJect 장치를 본 연구에 이용할 계획이다. 스폰서는 SIMPONI^®에 대한 다른 소아과 프로그램에서의 VarioJect 장치의 등록을 지지하기 위해 필요한 데이터를 이전에 토의한 바 있으며, 이는 실제 사용 및 라벨 이해도 평가 (label comprehension assessment), 인적 요인 연구로부터의 데이터, 및 부가적인 장치 성능 데이터를 포함한다.

의료인, 보호자, 및/또는 소아 대상 (적용 가능한 경우)이 상응하는 절대 밀리그램 (mg) 용량 및 사용할 주사 장치의 조합을 결정하는 것을 가능하게 하기 위해 투여량 및 장치 선택 차트 (표 9)가 개발될 것이다.

SIMPONI® VarioJect

VarioJect 장치는 5 mg 증분으로 10 mg 내지 45 mg의 용량 범위의 단일 용량의 약물을 BSA 투여 요법에 기초하여 전달하는 것을 의도할 것이다. VarioJect 장치는 0.5 mL의 SIMPONI® 약물 제품 (PFS)을 함유하는 동일한 1 mL Becton Dickson Hypak 주사기와 조립되도록 설계되어 있으며, 이는 이미 승인된 SIMPONI SmartJect 자동 인젝터 및 PFS-U에 사용되어 왔다. VarioJect 장치는 약물 제품과 접촉되지 않으므로, VarioJect 장치는 약물 제품의 생화학적 특성 또는 안정성에 영향을 갖지 않음에 유의한다.

VarioJect 장치는, 다른 적응증에 대한 사전충전 펜의 경험 많은 공급처인 스위스 소재의 입솜드, 홀딩 AG (Ypsomed, Holding AG)에 의해 플랫폼 기술로서 개발되었다. 장치는 품질 시스템 규정 (Quality System regulation), 21 CFR 파트 820의 설계 관리 요건에 따라 설계되었다.

VarioJect 장치의 전체적인 구성 및 그의 특징부가 도 22에 도시되어 있다.

도 23은 상이한 사용 단계에서의 장치를 나타낸다: 장치를 프라이밍하고, 플런저를 원하는 고정 용량까지 회전시킴으로써 용량 설정을 선택하고, 플런저를 누름으로써 용량을 투여한다.

장치를 사용하기 위해, 사용자는 먼저 캡을 제거하고 (도 24, 단계 B), 이어서 주사기의 상부까지 기포를 탭핑하고 (도 24, 단계 C에 나타낸 바와 같이 관찰 윈도우를 통해 가시화됨) 플런저를 눌러 공기를 제거함으로써 (도 24, 단계 C) VarioJect를 프라이밍한다. 이어서, 사용자는 플런저를 다이얼링하여 적절한 용량을 선택한다 (도 24, 단계 D). 다음 단계에서, 사용자는 대략 90 도의 각도로 장치를 피부에 대고 눌러, 니들 가드가 후퇴하고 바늘이 선택된 SC 주사 부위 내로 삽입되도록 하고 (도 24, 단계 E), 이어서 플런저를 눌러 용량을 전달한다 (도 24, 단계 F). 전달 후에, 사용자는 장치를 제거하고, 니들 가드가 수동적으로 연장되고 바늘 위에 잠기도록 하여, 돌발적인 바늘 자상에 대한 보호를 제공한다 (도 24, 단계 F). 용량이 전달된 후에, 플런저는 하향 위치에 잠기고, 장치의 재사용을 방지한다.

펜은 0.05 mL 증분으로 0.10 mL 내지 0.45 mL를 전달하도록 설계되어 있다. 투여량 정확도에 대한 요건은 문헌[ISO 11608-1 2012 Needle-based injection systems for medical use, Requirements and test methods, Part 1: Needle-based injection systems, and USP 31 General Requirements/Injections]에 기초하여 확립되었다. 전달 정확도에 대한 기술적 설계 요건은 펜이 다이얼링된 용량 -0.00/+0.05 mL을 전달해야 한다는 것이며, 여기서 0.05 mL는 최소 증분이다. 공칭 4.5 mm의 바늘 돌출 거리는 피하 조직에 대한 주사 깊이를 제한한다.

장치는 그것의 적절하고 안전한 사용을 보장하는 데에 도움이 되는 다수의 특징부를 갖는다. 플런저를 눌러야 함을 표시하는 주황색 프라이밍 밴드 및 백색 화살표는 사용 전에 장치를 프라이밍해야 한다는 것을 사용자에게 상기시키는 역할을 한다. 프라이밍 후에는 주황색 프라이밍 밴드가 사라짐으로써 이 단계가 완료되었음을 표시하며, 장치가 프라이밍될 때까지는 용량을 선택할 수 없다. 플런저 상의 그래픽이 용량 선택 노치와 정렬되어, 선택되는 용량을 명확하게 표시하며, 디텐트 (detent)는 장치가 불량하게 정렬되어 있다는 촉감 피드백을 사용자에게 제공한다. 용량 투여 후에, 플런저는 하향 위치에 잠기고, 전달된 용량은 용량 노치 내로 잠기며, 둘 모두는 전달된 용량의 기록을 확인하고 제공한다. 부가적으로, 잠김은 남은 제품의 무단 재사용 가능성에 대해 보호한다. 펜이 주사 부위로부터 제거될 때, 니들 가드는 자동적으로 연장되고 잠긴다. 이 수동 바늘 안전성 특징부는 돌발적인 바늘 자상의 가능성을 감소시키는 데에 도움이 되며, 또한 바늘에 대한 공포를 가질 수 있는 일부 환자 및 보호자에 대한 바늘의 시각적 노출을 최소화한다.

VarioJect의 개발

장치의 설계 및 개발은 문헌[SO 11608-1 2012 Needle-based injection systems for medical use, Requirements and test methods, Part 1: Needle-based injection systems] 뿐만 아니라 문헌[FDA Draft Guidance: Technical Considerations for Pen, Jet, and Related Injectors Intended for Use with Drugs and Biological Products]에 의해 인도되었다.

시험은 약물 제품의 정확한 전달 뿐만 아니라 다른 적합성 및 인적 요인 연구를 보장하는 벤치 시험을 포함할 것이다.

초기 연구는 장치의 형태, 특징부, 및 일반적 편리성에 대해 수행되었다. 1 라운드의 문화기술적 연구를 수행하였으며, 여기서 스폰서는 아동이 인슐린 또는 성장 호르몬 주사를 맞는 경우의 부모 및 아동을 관찰하고 면담하였다. 부가적으로, 소아 대상의 부모, 보호자, 및 아동을 포함하는 5개의 형성적 (formative) 인적 요인 연구를 수행하여 설계를 시험하고 개량하였다. 초안 도면-기반의 IFU (draft picture-based IFU)를 개발하고 장치 개념과 함께 시험하였다. 시험으로부터의 결과는 긍정적이었으며, 선택된 장치 설계 및 IFU의 전체적인 형태가 일반적으로 확인되었다. 사용자 오류를 감소시키기 위해 일부 설계 향상을 도입하고, 개정된 설계를 사용자와 함께 재시험하였다. 예를 들어, 장치가 유지해야 하는 배향을 사용자가 이해하는 것을 돕기 위해 플런저에 엄지 받침대 (thumb rest)를 첨가하였으며, 사용 중에 바람직한 그립을 가능하게 하기 위해 플랜지 기하형태를 조정하였다.

VarioJect의 향후 개발

임상 연구를 위한 준비 중에, 스폰서는 VarioJect 장치의 안전성, 편리성, 및 성능을 평가하기 위한 모든 검증 및 확인 시험을 완료하였다. 스폰서는 임상 연구에 사용되는 장치에 대한 임의의 유의적인 설계 변경을 예측하지 않지만, 스폰서는 일상적인 개발 노력 중의 결과에 기초하여 VarioJect 설계의 강건성을 향상하고자 의도한다. 시뮬레이션된 사용 안전성 (Simulated Use Safety) 연구 중에, 연구가 장치의 주사침 손상 방지 (sharps injury prevention) 특징부의 기능성을 성공적으로 입증했지만, 선택된 사용자가 장치를 프라이밍하고 투여하는 중에 전형적인 전달력 (70 N 초과)을 초과하는 매우 강한 힘을 사용하여 최대 누름 힘 (push-through force)을 이길 수 있는 드문 경우가 있다는 것이 인식되었다. 시뮬레이션된 사용 연구의 참여자는 각각 26 내지 33회의 VarioJect 주사 (18명의 참여자 중에 총 557개 장치)를 빠른 속도로 패드 내로 수행하였으며, 이는 사용자가 그들의 시간을 들이고 과도한 힘을 사용하지 않을, 환자에게 주사하는 경우의 대표적인 사용으로 간주되지 않는다. 이 고장은 장치를 이용하여 수행한 여러 인적 요인 연구 중 임의의 것에서 이전에 관찰된 바가 없음에 유의한다. 환자에게 부정확한 용량을 투여하는 위험을 완화하기 위해 접촉 말단부 정지점 (end stop) 표면 사이의 중첩된 영역을 증가시킴으로써 프라이밍 및 투여 말단부 정지점 특징부를 추가로 강화하는 가벼운 설계 향상을 추구하고자 의도한다.

프라이밍 말단부 정지점에 대한 현재 규격은 46 N이고 투여 말단부 정지점에 대한 규격은 69 N이다. 투여 말단부 정지점의 고장으로부터 유발되는 과잉투여의 위험으로 인해, 투여 말단부 정지점 규격은 프라이밍 말단부 정지점 규격의 1.5배이다. 이들 특징부의 검증 시험은 현재 설계가 프라이밍의 경우에 약 50% 만큼, 그리고 투여의 경우에 35% 만큼 규격을 초과함을 나타낸다. 시뮬레이션된 사용 안전성 연구로부터의 결과에 기초하여, 스폰서는 프라이밍 및 투여 말단부 정지점을 지나 누르기 위해 필요한 힘을 증가시키기 위해 규격을 증가시키고 가벼운 설계 변경을 시행하고 있다. 제안된 변형은 사용자 인터페이스에 영향을 주지 않을 것이므로 (단계들을 작동시키고 사용하기 위한 모든 힘이 변경되지 않고 유지됨), 임상적으로 사용된 장치는 상업적 장치를 대표할 것이다. 장치 성능에 영향이 없음을 확인하고, 규격이 증가하여 사용 중의 잠재적인 과도한 힘에 적절함을 보장하기 위해, 이들 가벼운 변경을 포함하는 상업적 장치를 벤치 시험을 통해 완전히 검증할 것이다. 장치의 외부 특징부에는 가벼운 변경만 실행될 것이다. 변경의 개요는 도 24에 제공되어 있다.

변형을 수용하는 외부 특징부

1 용량 버튼의 직경이 0.5 내지 1.0 mm 만큼 증가할 것이다.

2 말단부 캡의 직경이 0.5 내지 1.0 mm 만큼 증가할 것이다.

개선은 사용자 인터페이스의 변경 없이 환자에 대한 부정확한 투여의 위험을 완화하면서 장치의 성능의 강건성을 증가시킬 것이다. 임상 연구를 위해, 말단부 정지점을 지나 누르는 가능성을 최소화하기 위한 적절한 훈련이 제공될 것이다.

소아 사용을 위한 VarioJect의 적합성

VarioJect의 주사 특징은 주사 깊이 및 지속기간에 있어서 수동으로 피하 주사하는 피하주사침을 사용하여 의료인이 수행하는 것과 유사하다. 부가적으로, 상기 기재된 바와 같이, 이 수동 인젝터는 그것이 소아 환자에 적절하고 안전하게 사용되는 것을 보장하는 데에 도움이 되는 다수의 특징부로 설계되었으며 수동 바늘 안전성 특징부를 포함한다. 이 중요한 안전성 특징부는 돌발적인 바늘 자상의 가능성을 감소시키는 데에 도움이 되며, 또한 바늘에 대한 공포를 가질 수 있는 일부 어린 환자에 대한 바늘의 노출을 최소화한다. 이 장치의 바늘 삽입 깊이는 주사를 소아 환자에서의 피하 조직에 제한하도록 설계된 단 4.5 mm이다. 부가적으로, 인슐린 펜과 유사하게, 이 장치는 자가-투여가 가능한 적절하게 훈련된 소아 환자에 의한 자가-투여를 포함하는, 보호자 및 환자에 의한 재택 투여에 적합하다.

가정내 사용 및 바늘 길이에 관련된 위험 관리 활동의 개요는 하기 토의된다.

가정내 사용

VarioJect 장치의 초기 개발 중에, 스폰서는 주사, 주로 인슐린 및 인간 성장 호르몬이 필요한 아동의 가정에서 문화기술적 연구를 수행하였다. 가정 환경에서의 VarioJect의 안전하고 효과적인 사용을 보장하는 데에 도움이 되는 설계 개선으로 이어진 이해가 이 연구로부터 수집되었으며, 이들 개선은 후속적으로 인적 요인 연구에서 효과적인 것으로 확인되었다.

예는 하기의 것들을 포함한다:

부모 보호자의 주요 관심사인 정확한 용량 선택의 보장을 제공하기 위한, 투명한 용량 라벨링 및 용량 선택 노브 상의 디텐트

사용자가 정확한 용량이 전달되었음을 확인하는 것을 가능하게 하는, 사용 후 용량 선택 노치 내의 용량의 기록

아동의 재택 주사를 위한 통상적 실시인, 부모가 용량을 제조한 후에 그들의 아동에게 가서 주사를 수행하는 것을 가능하게 하는 사용 단계의 순서화

사용자가 절차 중에 중단할 경우, 그들이 주사 과정 중 어디에 있는지를 사용자가 용이하게 확인하는 것을 가능하게 하는 설명서의 구조화

부가적으로, 재택 주사와 연계된 위험이 적절한 완화를 보장하기 위해 응용 FMEA (Application FMEA)에 포착되어 있다.

예는 하기의 것들을 포함한다:

분해된 약물을 유발하는, 사용자에 의한 장치의 부적절한 수송 또는 저장, 또는 기한이 만료된 제품. 적절한 냉장 및 사용 전 제품의 점검을 보장하는 데에 도움을 주기 위해 투명한 라벨링을 첨가하였다.

캡과 연계된 질식 위험. 기도 폐색의 경우에 호흡을 가능하게 하기 위해 캡에 구멍을 첨가하고, 아동의 손이 닿지 않게 하는 경고를 첨가하였다.

아동에 의한 의도되지 않은 장치에 대한 접근. 사용자는 의도되지 않은 접근을 제한하기 위해 가온시에 장치를 포장 내부에 보관하도록 지시했다.

추가로, 가정 환경에서 발생할 수 있는 장치의 오용에 대한 가능성에 대해 분석을 수행했다. 아동에 대해 처방되는 인슐린 전달 펜을 포함하는, 가정 설정에서 사용되는 약물 전달 장치에 대한 전문 기업인 노보 노르디스크 엔지니어링 (Novo Nordisk Engineering)을 스폰서가 고용하여 VarioJect 장치에 대한 오용 가능성을 조사하도록 하였다. 사용자가 장치로부터 주사기를 분리하거나 주사기로부터 제2 용량을 추출하는 것을 어렵게 하는 규격을 포함하는 적절한 완화와 함께, 상이한 오용 시나리오의 분석이 응용 FMEA에 포함되었다.

VarioJect 및 그의 연계된 사용 설명서는 또한, 몇몇 안전성 특징부 뿐만 아니라, 가정내 사용을 용이하게 하는 전체적인 편리성을 개선하기 위한 특징부를 갖는다. 의도된 개체군에서의 가정내 사용에 이 장치가 적절하다는 것을 확인하기 위해, 스폰서는 의도된 사용자 개체군을 대표하는 것으로 간주되는 대상 (소아 대상 및 보호자 둘 모두)에 의한 가정내 사용을 평가하도록 설계된 소아과 인적 요인 확인 연구를 수행할 것이다. 인적 요인 확인 연구 중에, 환자 및 보호자에 대해 가정-유사 설정을 대표하도록 설계된 방에서 모든 주사를 수행할 것이다. 소아에게 자가-주사제를 처방하는 것은 보건의료계에 중대사이며, 보호자가 가정에서 그들의 아동에게 주사할 수 있기 전에, 또는 환자가 자가-주사하는 것을 가능하게 하기 위해, 요건으로서 훈련이 항상 제공된다. 이러한 맥락 내에서 장치 및 IFU가 개발되었다. 추가로, 스폰서는 형성적 시험에서 주사 무경험 환자 개체군을 평가하였다. 이 시험에 기초하여, VarioJect는 사용자에게 합리적으로 직관적인 것으로 간주된다. 스폰서는 이전의 형성적 시험에 기초하여 설계를 개선하기 위한 조치를 취하였다. 예로서, 형성적 시험은 훈련 받지 않은 사용자가 프라이밍 (적절한 장치 배향을 보장하고 기포를 상부로 탭핑함)에 관련된 단계를 생략하는 경향이 있음을 나타냈다. 사용자에 대한 저위험으로서 분류되는 과소 투여를 야기할 수 있는 부적절한 프라이밍의 위험을 완화하기 위해, 스폰서는 장치 상의 채색 그래픽 및 명확한 단계적 설명서를 도입하였다. 장치 및 연계된 IFU의 편리성을 개선하기 위한 유의적인 집중 및 노력이 있어 왔지만, 요구되는 훈련이 적절한 사용을 보장하기 위한 최상의 방법임이 증명되었다. 그러므로, 인적 요인 연구를 위해, 모든 환자 및 가족 보호자에게는 최소한이지만 대표적인 훈련을 제공함으로써 이들 장치가 효율적으로 사용될 실제 상황을 모방할 것이다. 스폰서는 장치가 가정내 사용에 안전하고 이 장치와 연계된 임상적 위험을 다루기에 충분하다는 것을 입증하기 위해서는 시뮬레이션된 인적 요인 연구가 중추적이라고 생각한다. 그러나, 규제 요건을 다루기 위해, 스폰서는 사용 중의 불만사항 및 고장을 포함하여 가정-설정에서 대상 및 보호자에 의해 투여된 주사로부터의 실생활 VarioJect 취급 및 사용 경험 데이터를 포착하고 문헌에 기록하도록 설계된 VarioJect에 대한 실제 사용 연구 (소아 UC 환자에서)를 수행하고자 의도한다. 실제 사용 연구는 중추적인 인적 요인 데이터의 부가적인 지지로서 간주된다.

바늘 길이

아동에서 피하 주사하기 위한 바늘 길이에 관한 공개된 문헌^1,2에 기초하여 VarioJect에 4.5 mm의 바늘 길이를 선택하였다. 근육내 및 피내 전달의 작은 위험을 적절하게 상쇄하기 위해, 이 바늘 길이는 유리 주사기에 대한 제조 공차 뿐만 아니라 VarioJect에서의 주사기의 조립과 연계된 공차 둘 모두를 감안하도록 선택되었다. 공개된 문헌에 제공된 데이터에 기초하여, 7 내지 17세 연령군에서는 근육내 주사의 위험이 낮고, 2 내지 6세 연령군에 대해서는 근육내 주사의 위험이 약간 더 높지만, 그 위험은 여전히 낮다. 마찬가지로, 피내 주사의 위험이 2 내지 6세 연령군에서는 낮고, 7 내지 17세 연령군에 대해서는 약간 더 높지만, 그 위험은 여전히 낮다. VarioJect를 이용한 주사의 깊이를 추가로 평가하기 위해 돼지 생체-분포 연구를 수행하였다. 이 연구는 VarioJect를 사용하는 주사의 깊이가 바늘 및 주사기에 대해 예상되는 범위 내에 들어간다는 것을 입증했다. 이 결론은 바늘 및 주사기를 이용한 주사의 깊이는 주사를 투여하는 사람에 의해 영향을 받으며 삽입의 각도 및 바늘이 얼마나 멀리 삽입되는지에 의존하는 반면에, VarioJect를 이용한 제안된 전달 방법은 고정된 바늘 삽입 각도 및 깊이를 가질 것이므로, 이 결론은 예측된 결과를 지지한다. 유리 주사기에 대한 제조 치수 변동 뿐만 아니라 VarioJect에서의 주사기의 조립과 연계된 변동을 감안하여, 주사의 깊이에 대한 공차는 ±1.25 mm이다. 동일한 BD Hypak 주사기를 사용하는 SIMPONI^® SmartJect 자동 인젝터 (7.4 내지 8.6 mm)를 이용한 역사적인 바늘 돌출 측정에 의해 입증된 바와 같이, 상업적으로 예측되는 공차는 훨씬 더 적다. 추가로, 여러 액체 약물을 피하 투여하기 위해 사용되는 주사기 및 바늘 선택 및 투여 기술에는 일반적으로 광범위한 변동이 있으나, 공개된 연구에서는 피하 주사 변동성에 관련된 유의적인 임상 관계 (clinical concern)가 확인되지 않았다. 그리고, 전체로서는, mAb가 안전하고 효과적이기 위해 피하 공간 내의 특정 위치 내로의 정밀하거나 장치-특이적인 투여를 필요로 하는 것으로 나타나지 않으며, PK의 작은 변동 (예상되지는 않지만)이 효능 성과에 영향을 줄 가능성은 적다. 그럼에도 불구하고, 제안된 연구의 일부로서 안전성 평가가 수집될 것이다.

"전-T1D"의 평가로 이어지는 제1형 당뇨병에서의 개발 목표의 개요

상기한 바와 같이, T1D의 진행은 초기 단계에서의 삶의 질에 대한 유의적인 영향 및 궁극적인 이환율 및 사망률과 연계되어 있다. 지금까지, T1D로 새로 진단된 사람들에서 잔류 베타 세포 기능을 유지하기 위해 다수의 화합물이 탐색되어 왔으며, 이는 다시 혈당 조절을 개선하고 질환의 단기 및 장기 합병증을 감소시킬 것이다. 그러나, 스폰서는 고위험에 처한 사람들에서 T1D를 지연시키거나 예방할 충족되지 않은 의학적 필요성 및 중요한 기회가 존재한다고 생각한다. 자가면역-매개 β-세포 손실은 임상 진단으로부터 여러 해 전에 개시되었다는 것이 잘 확립되어 있다. 임상 진단시에 발생함으로써 "신규 발병" 연구에서 표적화되고 있는 자가면역 과정은 그 전의 수개월 또는 수년에 발생하고 있었던 것들과 매우 유사할 가능성이 있으므로, 새로 진단된 T1D에서 (심지어 보통의) 효능을 나타내는 약제는 T1D 발병 위험이 높은 (즉, "전-T1D") 사람들에서 시험할 후보로 간주될 수 있다. 이는 T1D 자가면역의 혈청학적 증거를 가지고 있지만 아직 당뇨병 임상 기준을 충족하지 않은 사람들에서의 아바타셉트 (NCT01773707) 및 테플리주맙 (NCT01030861)의 연구에 대한 에이전시의 지지/승인을 통해 증명된다. 질환을 향해 진행하는 것으로 동정될 수 있는 고위험 환자 (즉, 자가-항체 양성 및 혈당이상)에서, 질환의 발병을 방해하거나 지연시키기 위해 더 초기에 치료하는 것은 단기 및 장기 이익 둘 모두를 가질 수 있다. 단기적으로, 어린 아동/청소년은 외인성 인슐린의 다중 매일 주사의 필요성을 피할 수 있다. 추가로, 더 어린 연령에 T1D로 진단된 환자는 더 공격적인 질환을 가질 수 있는 것으로 예상된다. 그러므로, 2년 이상 만큼 발병을 지연시키는 것은 β-세포 파괴의 더 빠른 진행을 피할 수 있다. 장기적으로, β-세포 매스의 초기 보존 및 양호한 혈당 조절은 이후의 생애에서 유의적인 이환율 및 사망률, 및 사회경제적 부담과 연계된 심혈관 질환 또는 입원과 같은 중증 합병증을 완화할 수 있다.

스폰서는 T1D에서 질환 진행의 연속성이 있는 것으로 생각하므로, 본 명세서에 개관된 시험에서 긍정적인 결과가 관찰된다면, 신규-발병 질환에서의 요법으로서의 개발에 대한 고려에 부가하여, 스폰서는 T1D 전-질환 또는 "방해"에서의 추가의 평가를 예측할 것이다. 스폰서는 혈당이상을 동반하는 T1D의 경우에 2개 이상의 자가-항체를 가진 아직 인슐린 의존성이 아닌 6 내지 21세 연령의 아동/청소년 환자는 임상 질환으로의 진행에 대해 최고 위험이 있는 환자이며 전-질환 상태에서의 치료로부터 가장 많은 이익을 얻을 것이라고 생각한다. 스폰서는 골리무맙이 상기 기재된 표적 개체군에 이익을 제공하는 효과적인 치료인지 여부를 결정함에 있어서 단계적 접근법을 취할 것을 제안한다.

단계적 접근법에서 스폰서의 제1 단계는 이 브리핑 문서에 기재된 신규 발병 T1D 연구에서 골리무맙의 이익-위험을 확립하는 것이다. 본 연구의 결과는 β-세포 매스의 보존에 대한 골리무맙의 효과 뿐만 아니라 이 환자 개체군에서의 안전성 프로파일에 대한 핵심적 정보를 제공할 것이다. 약간 상승된 HbA1c (즉, 5.6 내지 6.4%)를 동반하는 T1D의 경우에 T1D의 공식적 임상 진단을 아직 충족하지 않았지만 T1D를 가진 직계 가족이 있고 이중 자가-항체 양성인 6 내지 21세에서의 파일럿 연구의 초기 계획 단계에서. 이 파일럿 연구의 목표는 전-질환 상태에서 골리무맙에 의한 이익의 메카니즘을 확립하기 위해 초기 안전성 및 효능 정보를 얻는 것이다. 본 연구는 상기 토의된 신규-발병 개체에서의 연구 후에 시작될 것이다. 이들 2개의 초기 연구는 보완적이며 표적 전-T1D 개체군에서 골리무맙을 이용한 치료의 이익-위험을 평가하는 T1D 개발 연구를 위해 고위험이 있는 사람들에서 더 크고 더 공식적인 "개념 증명" 임상 시험에 대한 계획을 알리는 핵심적 데이터를 제공할 것이다.

스폰서는 전-T1D의 치료에서의 골리무맙에 대한 강건한 개발 계획에 대해 에이전시와 공조하기 위해 T1D에 대한 위험이 있는 사람들에서의 개념 증명 연구를 위한 준비의 맥락에서 이들 2개의 초기 연구로부터의 결과를 전달하고자 의도한다.

표 8: Simponi 소아과 프리젠테이션을 지지하는 연구

이 프리젠테이션은 성인에서의 사용에 대해 이미 승인되었으므로 이전에 제출된 데이터를 상호-참조할 것이다.

약어: FDA=식품의약국; HCP=의료 전문가; HFS=인적 요인 연구; IFU=사용 설명서; PFS=사전충전 주사기; PFS-U=UltraSafe Passive® 니들 가드 내의 사전충전 주사기; PK=약동학 sBLA=보조적 생물학적제제 허가 신청 (Supplemental Biologics License Application); UC=궤양성 대장염.

A - VarioJect 실제 사용 연구

연구:

VarioJect 실제 사용 연구 (라벨링 이해도, 안전성, 장치 내구성/강건성의 평가를 포함함). 본 연구는 CNTO148UCO1002의 하위 연구로서 수행될 것이며, 이는 체중이 45 ㎏ 미만인 소아에서 PK 데이터를 제공하여 소아 UC 적응증에 대한 보외법 기반의 접근법을 지지하고, VarioJect 장치가 의도된 소아 개체군에서 예상되는 약물 노출을 달성할 수 있다는 것을 입증하기 위해 수행될 것이다.

목적:

설계된 바와 같은 VarioJect가 적절한 훈련 및 서면 사용 설명서와 함께 대상 또는 그들의 보호자에 의한 재택 투여에 적합하다는 지지 데이터를 제공하기 위한 것이다. VarioJect가 소아 환자 개체군에 사용하기에 적합하다는 것을 입증하는 안전성 지지 데이터를 제공하기 위한 것이다. VarioJect 내구성 및 강건성 지지 데이터를 제공하기 위한 것이다.

설명: 주사를 수행하는 모든 연구 참여자는 제2 재택 투여 후에 VarioJect를 사용한 그들의 경험에 관한 설문지를 작성할 것을 요청 받을 것이다. 검사를 위한 장치의 회수를 포함하여, 모든 장치 불만사항 및 장치-관련 AE를 포착하여 조사할 것이다. 대략 50 내지 100개의 사용된 VarioJect 장치의 무작위 샘플링의 시각적 평가를 수행하여 장치 내구성 및 강건성을 평가할 것이다.

코멘트: 연구 및 설문지는, 사용 중의 불만사항 및 고장을 포함하는, 가정-설정에서 대상 및 보호자에 의해 투여된 주사로부터의 실생활 VarioJect 취급 및 사용 경험 데이터를 포착하고 문헌에 기록하도록 설계되어 있다.

B - PFS-U 실제 사용 연구

연구:

PFS-U 실제 사용 연구 (라벨링 이해도 및 안전성의 평가를 포함함). 본 연구는 CNTO148UCO1002의 하위 연구로서 수행될 것이다.

목적:

설계된 바와 같은 PFS-U가 적절한 훈련 및 서면 사용 설명서와 함께 소아 대상 또는 그들의 보호자에 의한 재택 투여에 적합하다는 지지 데이터를 제공하기 위한 것이다. PFS-U가 소아 환자 개체군에 사용하기에 적합하다는 것을 입증하는 안전성 지지 데이터를 제공하기 위한 것이다.

설명:

주사를 수행하는 모든 연구 참여자는 제2 재택 투여 후에 PFS-U를 사용한 그들의 경험에 관한 설문지를 작성할 것을 요청 받을 것이다. 검사를 위한 장치의 회수를 포함하여, 모든 장치 불만사항 및 장치-관련 AE를 포착하여 조사할 것이다.

코멘트:

연구 및 설문지는, 사용 중의 불만사항 및 고장을 포함하는, 가정-설정에서 대상 및 보호자에 의해 투여된 주사로부터의 실생활 PFS-U 취급 및 사용 경험 데이터를 포착하고 문헌에 기록하도록 설계되어 있다.

C - 소아과 총괄 인적 요인 연구

연구:

소아과 총괄 인적 요인 (라벨 이해도의 평가를 포함함)

목적:

본 연구의 목적은, 현실적인 조건 하에 VarioJect 및 PFS-U가 의도된 개체군에서 (보호자, 의료 전문가 [HCP], 또는 자가-투여에 의해) 안전하게 사용될 있다는 것을 표시하는 중추적인 장치 편리성 데이터를 제공하고 장치 사용 설명서를 확인하기 위한 것이다.

설명:

문헌[FDA guidance: Applying Human Factors and Usability Engineering to Medical Devices to Optimize Safety and Effectiveness in Design (2011)]에 의해 인도된 바와 같이, 인적 요인 전문가에 의해 수행된 대표적인 사용 환경에서의 표적 개체군에서의 시뮬레이션된 장치 사용 연구. 본 연구에서는, 대략 45명의 대상이 3개의 군으로 분할될 것이다. 제1군은 가족 보호자 및 HCP의 혼합일 것이다 (VarioJect 주사). 제2군은 자가-주사가 가능한 소아 대상일 것이다 (VarioJect 주사). 제3군은 자가-주사가 가능한 소아 대상일 것이다 (PFS-U 주사). 사용자가 심각한 피해를 유발할 수 있는 임의의 사용 오류를 범하지 않으면서 완전한 용량을 전달하는 경우에 전체적인 성능 성공이 달성된다. 제안된 연구는 개별적인 과제 수준에 합격/불합격 기준을 배정하고, 개별적인 과제 수준에 오류, 위기 상황 (close call), 및/또는 난점과 같은 거동이 기록될 것이다. 주관적인 참여자 피드백이 서술형으로 수집될 것이며, 참여자는 절차 및 장치 설계에 대한 개방형 질문을 받을 것이다. 참여자는 그들의 지식 및 IFU에 제공된 설명서의 이해를 평가하기 위한 탐색 질문을 받을 것이다.

코멘트:

검토 및 코멘트를 위해 사용 설명서와 함께 프로토콜이 FDA에 제출되었다 (eCTD IND 100181; Sequence No. 0307). 이 제출에는 형성적 연구에서 지금까지 관찰된 사용자 오류의 요약 및 이들 연구가 제품 설계 및 라벨링을 알린 방법의 토의가 포함되었다. 이 인적 요인 연구의 결과는 최종 HFS 보고서와 함께 sBLA에 요약될 것이며, 새로운 VarioJect의 등록을 지지하고 PFS-U의 사용을 소아 사용에 대해 연장하는 것을 의도한다.

D - VarioJect 성능 시험

연구:

1.) 검증 시험

2.) 기능적 안정성 시험

3.) 장치 성분의 가속 및 실시간 노화

4.) 조립 과정 확인

5.) 시뮬레이션된 사용 (안전성) 연구

6.) 생체적합성 시험

7.) 운송 시험 (shipping testing)

8.) VarioJect 전달 후의 생화학적 시험

목적:

본 연구의 목적은 VarioJect 장치가 그의 설계 요건을 충족한다는 것을 입증하기 위한 것이다.

설명:

1. 검증 시험은 하기에 따라 수행한다:

문헌[IS0 11608:2012 Needle-based injection systems for medical use - Requirements and test methods]. VarioJect는 지정된 D2 ― 통합된 단일 용량의 대체 불가능한 용기이며, 이에 의해 전달가능한 부피의 일부가 배출된다.

문헌[FDA Draft Guidance Technical Considerations for Pen, Jet, and Related Injectors Intended for Use with Drugs and Biological Products].

개발 및 시험 프로그램의 핵심적인 효소는 하기의 것들을 포함한다:

선택되고 다이얼링된 용량이 제품의 저장 수명에 걸쳐 정확도 기준을 충족한다는 설계 및 검증

바늘 연장이 제한되고 피하 투여에 적절하다는 설계 및 검증

예상되는 사용에서의 설계 및 제조 내구성의 검증

돌발적인 바늘 자상에 대한 보호를 의도하는 장치 안전성 특징부가 신뢰성 있게 작동한다는 검증

2. 기능적 안정성 시험은 약물-장치 조합 제품의 노화에 이어서 장치 기능성을 보장하기 위한 장치 시험을 평가한다. 조립된 제품을 2 내지 8℃의 권장 온도 뿐만 아니라 가속 (25℃) 조건에서 저장한다.

3. 가속 노화 시험을 위해, 장치 하위-조립체를 승온 노화에 노출시킨 후에 약물-충전 PFS와 조립하고 장치 기능성을 보장하기 위한 장치 시험을 수행한다. 실온에서 저장된 장치 하위-조립체의 실시간 노화 시험은 가속 노화 데이터를 지지한다.

4. 조립 과정 확인은 상업적 출시를 위한 VarioJect를 조립하기 위해 사용될 장비를 사용하는 약물-장치 조합 제품의 조립에 이어서 장치 시험을 포함한다.

5. 시뮬레이션된 사용 (안전성) 연구는 문헌[ISO 23908:2011 Sharps injury protection -- Requirements and test methods ― Sharps protection features for single-use hypodermic needles, introducers for catheters and needles used for blood sampling] 및 문헌[Guidance for Industry and FDA Staff: Medical Devices with Sharps Injury Prevention Features]에 따라 바늘 안전성 특징부의 성공적인 작동을 입증하는 500+ 모의 주사를 포함할 것이다.

6. 생체적합성 시험은 문헌[ISO-10993-1:2009 Biological evaluation of medical devices -- Part 1: Evaluation and testing within a risk management process]에 따라 접촉 지속기간이 제한된 (24 시간 이하) 피부 접촉 표면 장치에 대해 수행한다.

7. 운송 시험은 문헌[ASTM D4169: Standard Practice for Performance Testing of Shipping Containers and Systems]에 따라 수행하며 용기 밀봉 완전성 (container closure integrity)의 평가를 포함한다.

8. VarioJect 전달 후의 생화학적 시험은 VarioJect를 통한 전달 중에 발생하는 SIMPONI 상의 전단력이 SIMPONI의 생화학적 속성에 유해 효과를 갖는지를 결정하기 위해 수행한다.

[표 9]

규제 고려사항

T1D에 대한 IND의 개설 계획

스폰서는 T1D의 치료를 위한 골리무맙의 연구에 대한 IND를 2016년 2사분기까지 개설할 계획이다. SIMPONI^®는 류머티스 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염, 및 궤양성 대장염의 치료에 대해 미국에서 승인되어 있다.

스폰서는 폐, 알레르기, 및 류머티스학 제품부 (DPARP: Division of Pulmonary, Allergy, and Rheumatology Products) 또는 소화기내과 및 선천성 이상 제품부 (DGIEP: Division of Gastroenterology and In-Born Error Products)와 관련된 하기 활성 BLA를 가지고 있다.

BLA125289: 하기 적응증에 대해 2009년 4월 24일자로 승인된 골리무맙 (SIMPONI^®):

SIMPONI ^® 는 메토트렉세이트와 조합하여, 보통 내지 중증 활성 류머티스 관절염을 가진 성인 환자의 치료를 적응증으로 한다.

SIMPONI ^® 는 단독으로 또는 메토트렉세이트와 조합하여, 활성 건선 관절염을 가진 성인 환자의 치료를 적응증으로 한다.

SIMPONI ^® 는 활성 강직성 척추염을 가진 성인 환자의 치료를 적응증으로 한다.

SIMPONI ^® 는,

임상 반응의 유도 및 유지

유도 중의 점막의 내시경 외양의 개선

임상 관해의 유도

유도 반응자에서의 임상 관해의 달성 및 지속을 위해, 코르티코스테로이드 의존성을 나타냈거나 경구 아미노살리실레이트 , 경구 코르티코스테로이드, 아자티오프린, 또는 6-메르캅토퓨린을 관용하지 못했거나 이에 부적절한 반응을 나타낸, 보통 내지 중증 활성 궤양성 대장염을 가진 성인 환자를 적응증으로 한다.

스폰서는 DPARP 또는 DGIEP와 관련된 골리무맙 개발 프로그램을 지지하는 4개의 활성 IND를 가지고 있다.

보통 내지 중증 활성 류머티스 관절염 (다관절 JIA를 포함함)의 치료를 위한 CNTO148 (골리무맙)의 연구에 대한 IND 09925

활성 건선 관절염의 치료를 위한 CNTO148 (골리무맙)의 연구에 대한 IND 12723

활성 강직성 척추염의 치료를 위한 CNTO148 (골리무맙)의 연구에 대한 IND 12729

궤양성 대장염 (소아 UC를 포함함)의 치료를 위한 CNTO148 (골리무맙)의 연구에 대한 IND 100181

하기 IND 요건표 (표 10)에 언급된 바와 같이, 스폰서는 신규 IND에 항목을 제출하거나 IND 09925 또는 BLA125289를 상호-참조할 것을 제안한다. 이들은 단지 텍스트 상호-참조일 것이다 (전자 하이퍼링크는 아님).

[표 10]

본 발명은 상기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 실시예에서 구체적으로 설명된 것과 다르게 실시할 수 있음이 명백할 것이다.

상기 교시 내용에 비추어 본 발명의 많은 변형 및 변경이 가능하며, 따라서 이들은 첨부된 특허청구범위의 범주 내이다.

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SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. 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Gly Ser Asn Lys Xaa Xaa Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Xaa Arg Phe Thr Xaa Ser Arg Asp Asn Xaa Lys Asn Xaa Leu Xaa 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Xaa Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Xaa Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(108) <223> light chain variable region sequences as presented in original Figure 5 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(23) <223> framework 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(34) <223> complementarity determining region 1 (CDR1). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(49) <223> framework 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(56) <223> complementarity determining region 2 (CDR2). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(88) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(98) <223> complementarity determining region 3 (CDR3). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(108) <223> J3 region <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(157) <223> human TNF alpha monomer sequence <400> 9 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 100 105 110 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys 115 120 125 Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe 130 135 140 Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ttggtccagt cggactgg 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cacctgcact cggtgctt 18 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cactgttttg agtgtgtacg ggcttaagtt 30 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gccgcacgtg tggaaggg 18 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 agtcaaggtc ggactggctt aagtt 25 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gttgtcccct ctcacaatct tcgaattt 28 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ggcggtagac tactcgtc 18 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile 1 5 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tttcgtacgc caccatggac tggacctgga gcatc 35 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tttcgtacgc caccatgggg tttgggctga gctg 34 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tttcgtacgc caccatggag tttgggctga gcatg 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tttcgtacgc caccatgaaa cacctgtggt tcttc 35 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tttcgtacgc caccatgggg tcaaccgcca tcctc 35 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gtgccagtgg cagaggagtc cattcaagct taagtt 36 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Asp Met Arg Val 1 5 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tttgtcgaca ccatggacat gagggtcctc c 31 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 tttgtcgaca ccatggaagc cccagctc 28 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ctggtttcac ctatagtttg cattcagaat tcggcgcctt t 41 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 catctccaga gacaattcca agaacacgct gtatc 35 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gtagaggtct ctgttaaggt tcttgtgcga catag 35 <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Signal sequence for heavy chain variable region sequences as presented in original Figure 4 <400> 32 Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> Signal sequence for light chain variable region sequences as presented in original Figure 5 <400> 33 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly 20 <210> 34 <211> 428 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(421) <223> heavy chain variable region DNA sequences as presented in original Figure 2A-2B <400> 34 atggggtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggttcacc ttcagtagct atgctatgca ctgggtccgc caggctccgg 180 caaggggctg gagtgggtgg cagttatatc atatgatgga aaataaatac tacgcagact 240 ccgtgaaggg ccgattcacc atctagagac aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg 300 aacagccaga gctgaggaca cggctgtgta ttactgtgcg agagatcgag gtatatcagc 360 aggtggaata ctactactac tacggtatgg acgtctgggg gcaagggacc acggtcaccg 420 tctcctca 428 <210> 35 <211> 387 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(387) <223> light chain variable region DNA sequences as presented in original Figure 3 <400> 35 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccatt cactttcggc 360 cctgggacca aagtggatat caaacgt 387 <210> 36 <211> 456 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(456) <223> Golimumab Heavy Chain (HC) <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 37 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(215) <223> Golimumab Light Chain (LC) <400> 37 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (116)

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102. (신규) 제I형 당뇨병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 서열 번호 36을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 (LC)를 갖는 하나 이상의 단리된 포유류 항-TNF 항체.
103. (신규)
     (a) 서열 번호 36을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 (LC)를 갖는 단리된 포유류 항-TNF 항체를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 제1형 당뇨병인 TNF 관련 병태의 치료 또는 예방 방법.
104. (신규) 제103항에 있어서, 상기 항-TNF 항체가, 대상의 체중이 45 ㎏ 미만인 경우에는 제0주 및 제2주에 60 mg/m²의 유도 용량 (induction dose)에 이어서 제4주 및 제52주까지 q2w로 30 mg/m²의 유지 용량 (maintenance dose)으로 대상에게 피하 (SC) 투여되고, 대상의 체중이 45 ㎏ 이상인 경우에는 제0주 및 제2주에 100 mg/m²의 유도 용량에 이어서 제4주 및 제52주까지 q2w로 50 mg/m²의 유지 용량으로 대상에게 투여되는 방법.
105. (신규) 제104항에 있어서, 상기 항-TNF 항체가 자가-투여에 적합한 의료 장치에 의해 투여되며, 여기서 장치는 사전충전 주사기, UltraSafe Passive 니들 가드 (Needle Guard)를 가진 사전충전 주사기, VarioJect, 및 VarioJect와 UltraSafe Passive 니들 가드를 가진 사전충전 주사기의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
106. (신규) 제105항에 있어서, 대상의 체중이 45 ㎏ 이상인 경우에는 UltraSafe Passive 니들 가드를 가진 사전충전 주사기이고, 대상의 체중이 45 ㎏ 미만인 경우에는 VarioJect인 의료 장치.
107. (신규) 제105항에 있어서, 4.5 mm의 바늘 길이를 가진 VarioJect인 의료 장치.
108. (신규) 서열 번호 36을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 (LC)를 갖는 하나 이상의 단리된 포유류 항-TNF 항체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 제I형 당뇨병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
109. (신규)
     (a) 서열 번호 36을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 (LC)를 갖는 단리된 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 제1형 당뇨병인 TNF 관련 병태의 치료 또는 예방 방법.
110. (신규) 제109항에 있어서, 상기 항-TNF 항체가 대상의 체중이 45 ㎏ 미만인 경우에는 제0주 및 제2주에 60 mg/m²의 유도 용량에 이어서 제4주 및 제52주까지 q2w로 30 mg/m²의 유지 용량으로 투여되고 대상의 체중이 45 ㎏ 이상인 경우에는 제0주 및 제2주에 100 mg/m²의 유도 용량에 이어서 제4주 및 제52주까지 q2w로 50 mg/m²의 유지 용량으로 대상에게 투여되도록, 상기 조성물을 대상에게 피하 (SC) 투여하는 방법.
111. (신규) 제110항에 있어서, 상기 조성물이 자가-투여에 적합한 의료 장치에 의해 투여되며, 여기서 장치는 사전충전 주사기, UltraSafe Passive 니들 가드를 가진 사전충전 주사기, VarioJect, 및 VarioJect와 UltraSafe Passive 니들 가드를 가진 사전충전 주사기의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
112. (신규) 대상의 체중이 45 ㎏ 이상인 경우에는 UltraSafe Passive 니들 가드를 가진 사전충전 주사기이고, 대상의 체중이 45 ㎏ 미만인 경우에는 VarioJect인, 제111항에 따른 의료 장치.
113. (신규) 4.5 mm의 바늘 길이를 가진 VarioJect인, 제111항에 따른 의료 장치.
114. (신규) 서열 번호 36을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄 (LC)를 갖는 하나 이상의 단리된 포유류 항-TNF 항체를 포함하며, 상기 하나 이상의 항-TNF 항체를 피하 (SC) 투여하기에 적합한, 제I형 당뇨병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 의료 장치.
115. (신규) 제114항에 있어서, 자가-투여에 적합하며, 사전충전 주사기, UltraSafe Passive 니들 가드를 가진 사전충전 주사기, 및 VarioJect로 이루어진 군으로부터 선택되는 의료 장치.
116. (신규) 제115항에 있어서, 4.5 mm의 바늘 길이를 가진 VarioJect인 의료 장치.

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