DE69230789T3

DE69230789T3 - Methoden zur behandlung von durch den tumor nekrose faktor ausgelösten krankheiten

Info

Publication number: DE69230789T3
Application number: DE69230789T
Authority: DE
Inventors: F. David Boulder CARMICHAEL; G. Christopher SMITH; C. Robert THOMPSON; Deborah Russell; Tadahiko Kohno
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1991-01-18
Filing date: 1992-01-17
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2012-01-18
Also published as: CA2100329C; NO932610D0; RU2166955C2; AU4228896A; DE69230789D1; EP0567566B1; NO932610L; GR3033327T3; DE69230789T2; EP0567566A4; WO1992013095A1; JP3210629B2; JPH11199505A; JP2864434B2; EP0567566B2; NO316310B1; CA2100329A1; DK0567566T4; ATE190629T1; ES2145744T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen TNF-Inhibitor, der durch die Addition eines aus einer sich wiederholenden Komponente gebildeten polymeren Materials mit hohem Molekulargewicht modifiziert ist, sowie auf die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines TNF-Inhibitors zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Osteoarthritis, Spondylitis ankylosans, Arthritis gonorrhoica, mit der Reiter-Krankheit assoziierter Arthritis und Gicht.
Tumor Nekrose Faktoren (TNFen) bezeichnen eine Klasse von Cytokinen, die durch zahlreiche Zelltypen einschließlich Monozyten und Makrophagen hergestellt werden. Mindestens zwei TNFen sind zuvor beschrieben worden, speziell TNF alpha und TNF beta (Lymphotoxin).
Diese bekannten TNFen üben wichtige physiologische Wirkungen auf eine Anzahl verschiedener Zielzellen aus, die an einer Entzündungsreaktion beteiligt sind. Die Proteine veranlassen sowohl Fibroblasten als auch synoviale Zellen, latente Kollagenase und Prostaglandin E2 zu produzieren, und bringen Osteozytenzellen dazu, die Knochenresorption anzuregen. Diese Proteine verstärken die oberflächenadhesiven Fähigkeiten endothelialer Zellen für Neutrophile. Sie veranlassen ebenso endotheliale Zellen, Koagulansaktivität zu produzieren und reduzieren ihre Fähigkeit, Koagulate aufzulösen. Außerdem steuern sie der Aktivität der Adipozyten zur Lipidanreicherung entgegen, indem sie die Expression des Enzyms Lipoproteinlipase hemmen.
TNFen veranlassen Hepatozyten, eine Klasse von Proteinen zu synthetisieren, die als "acute phase"-Reaktanten bekannt sind, und sie wirken auf den Hypothalamus als Pyrogene. Durch diese Wirkungsaktivitäten sieht man, dass TNFen eine wichtige Rolle in der Reaktion eines Organismus auf eine Vielzahl von Indikationen wie Infektion und Verletzung spielen. Siehe z.B. Artikel von P.J. Selby et al., Lancet, 27. Februar 1988, S. 483; H.F. Starnes, Jr. et al., J. Clin. Invest., Bd. 82, S. 1321 (1988); A. Oliff et al, Cell, Bd. 50, S. 555 (1987); und A. Waage et al., Lancet, 14. Februar 1987, S. 355.
Eine Krankheit gilt als eine "TNF vermittelte Krankheit", wenn die spontane oder experimentelle Krankheit mit erhöhten TNF-Werten in Körperflüssigkeiten oder in Geweben verbunden ist, die an den Krankheitsherd oder ein Krankheitszeichen innerhalb des Körpers angrenzen. In vielen Fällen werden derartige von TNF vermittelte Krankheiten ebenso durch die folgenden zusätzlichen zwei Voraussetzungen erkannt: (1) Pathologische Befunde, die mit der Krankheit verbunden sind, können experimentell in Tieren durch die Verabreichung von TNF nachgeahmt werden; und (2) die Pathologie, die in experimentellen Tiermodellen der Krankheit induziert wurde, kann durch Behandlung mit Mitteln, die die Wirkung von TNF hemmen, gehemmt oder beseitigt werden. Bei den meisten "TNF vermittelten Krankheiten" sind mindestens zwei der drei Bedingungen erfüllt, und bei vielen "TNF vermittelten Krankheiten" sind alle drei Bedingungen erfüllt.
Eine Aufstellung der Krankheiten, die diese Kriterien erfüllen, umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, folgende:

1) Atemnotsyndrom von Erwachsenen
2) Lungenfibrose
3) Arthritis
4) Entzündliche Darmkrankheit
5) Septischer Schock

Der Nachweis für die TNF-Vermittlung dieser fünf Krankheiten wird gezeigt. Tiermodelle des septischen Schocks, der Arthritis und des Atemnotsyndroms von Erwachsenen sind gut bekannt und werden hier verwendet, um die Fähigkeit von TNF-Inhibitoren zu demonstrieren, TNF vermittelte Krankheiten zu behandeln.
Das Atemnotsyndrom von Erwachsenen (ARDS) ist gekennzeichnet durch das sofortige Auftreten von Dyspnoe, Tachypnoe, Zyanose, schwerer Hypoxämie, verminderter Lungencompliance und erhöhter pulmonaler Gefäßpermeabilität. Die Sterblichkeit bei ARDS übersteigt 50%. Mit der Entwicklung von ARDS verbundene Risikofaktoren umfassen Trauma, massive Bluttransfusion, verstreute intravasculäre Gerinnsel, Sauerstofftoxizität, Inhalation von Toxinen und Reizstoffen, und die systemische Reaktion auf Sepsis, hämorrhagische Pankreatitis, Verbrennungen und Komplikationen einer abdominalen Operation. Eine Vielzahl von Mediatoren wie Prostaglandine, Leukotriene, Komplement und freie Sauerstoffradikale sind an der Entstehung des Syndroms beteiligt; verschiedene Behandlungen jedoch, die entwickelt wurden, um die Wirkungen der spezifischen Mediatoren zu hemmen, haben den klinischen Verlauf von ARDS nicht verbessert. Ergebnisse von Tierversuchen stützen die Hypothese, dass TNF ein Mediator von ARDS ist, wie folgt:

1. Die Infusion von TNF in Ratten ahmt ARDS nach. Nach der Infusion mit TNF ist die Lungencompliance reduziert, der Wassergehalt der Lunge und das zelluläre Wachstum sind erhöht, punktförmige Hämorrhagien können makroskopisch sichtbar sein, und der histologische Nachweis von neutrophilen Thrombi und eine diffuse alveoläre Schädigung sind vorhanden. Siehe E. Ferrari-Baliviera et al., Arch. Surg., Bd. 124, S. 1400-1405 (1989); K.J. Tracey et al., Science, Bd. 234, S. 470-474 (1986).
2. Das Vorbehandeln von Ratten mit anti-TNF-Antiserum hemmte die Auslösung eines Tiermodells von ARDS. ARDS wurde durch hepatische Ischämie induziert, gefolgt von der Reperfusion der Leber. Es wurde vermutet, dass erhöhte zirkulierende TNF-Werte nach der Repertusion aus der großen Menge fixierter hepatischer Makrophagen entstehen. Ein Durchsickern in die Lungenkapillaren wurde in behandelten Ratten vermindert, verglichen mit Werten bei Ratten, denen Serum ohne TNF- blockierende Eigenschaften verabreicht wurde. Siehe L.M. Coletti et al., Transplantation, Bd. 49, S. 268-272 (1990).
3. In zwei klinischen Studien wurden TNF-Konzentrationen in bronchopulmonalen Sekreten von Patienten mit ARDS gemessen. In der ersten Studie von fünf ARDS-Patienten überschritten die TNF-Konzentrationen 12,5 ng/ml. In Kontrollproben wurde kein TNF nachgewiesen. In der zweiten Studie wurden bedeutende TNF-Werte in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit bei 3 von 4 Patienten mit ARDS gemessen, waren jedoch in Kontrollen unterhalb der Nachweisgrenze. Siehe A.B. Millar et al., Lancet, Bd. 2, S. 712-714 (1989); D.J. Roberts et al., Lancet, Bd. 2, S. 1043-1044 (1989).

Lungenfibrose tritt während des Endstadiums verschiedener Lungenerkrankungen auf. Die Fibrose entsteht aus dem Wachstum von Fibroblasten und einer vermehrten Kollagenablagerung innerhalb der alveolären Wände. TNF spielt anscheinend eine Schlüsselrolle in der Entwicklung der Lungenfibrose. TNF ist ein Wachstumsfaktor der normalen diploiden Fibroblasten in picomolaren Konzentrationen. Siehe B.J. Sugarman et al., Science, Bd. 230, S. 943-945 (1985). Ergebnisse von Tierexperimenten, die eine durch Bleomycin, einem chemotherapeutischen Krebsmittel, induzierte Lungenschädigung involvieren, liefern diese These stützende Nachweise. Die Vermittlung von Lungenfibrose durch TNF wird durch Folgendes gestützt:

1. Die intravenöse Infusion von TNF induziert eine diffuse alveoläre Schädigung, erkennbar an der Nekrose von Epithel- und Endothelzellen und deutlicher Verdickung der alveolären Membranen. Die subkutane Infusion von TNF in Ratten führt zu einer deutlichem Zunahme der Fibroblasten-Proliferation und Kollagenablagerung. Siehe K.J. Tracey et. al., Science. Bd. 234, S. 470-474 (1986); P.F. Piguet et al., Int. Arch. Allerg. Apol. Immunol., Bd. 83. S. 18 (1986).
2. Die Verabreichung von Kaninchen-anti-TNF-Antikörper an Mäuse beugte der von Bleomycin-induzierten alveolären Schädigung, dem Wachstum von Fibroblasten und der Kollagenablagerung vor. Siehe Pierre F. Piguet et al., J. Exp. Med., Bd. 170, S. 655-663 (1989).
3. Eine allgemeine Folgeerscheinung bei Patienten, die ARDS überleben, ist Lungenfibrose. Während der akuten Phase von ARDS ist TNF in bedeutenden Mengen in der bronchoalveolären Flüssigkeit vorhanden.

Arthritis ist ein Begriff, der verwendet wird, um eine Vielzahl von Indikationen zu beschreiben, die durch eine chronische Entzündung in den Gelenken gekennzeichnet sind. Die Definition des Begriffes Arthritis schließt die Folgenden ein: rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Spondylitis ankylosans, Arthritis gonorrhoica, mit der Reiter-Krankheit assoziierte Arthritis und Gicht. Der Nachweis für die vermittelnde Rolle des TNF bei rheumatoider Arthritis wird unten dargestellt.
Rheumatoide Arthritis ist eine chronische Autoimmunkrankheit, die eine Zerstörung der Gelenkknorpel in den Gelenken verursacht. Die synoviale Schicht ist chronisch, entzündet und erfährt ein fortschreitendes fibrotisches Wachstum. In vitro aktiviert TNF sowohl das Endothelium als auch die Leukozyten, um die Leukozytenadhäsion zu fördern, und stimuliert die Resorption und hemmt die Synthese von Proteoglycanen im Knorpel. Siehe J.R. Gamble et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Bd. 82, S. 8667-8673 (1985); J. Saklatvala, Nature, Bd. 322, S. 547-552 (1986). Diese in vitro-Untersuchungen lassen sehr darauf schließen, dass TNF ein Mediator der Gelenkpathologie bei rheumatoider Arthritis ist. Die Vermittlung von rheumatoider Arthritis durch TNF wird durch das Folgende gestützt:

1. Die intraartikuläre Injektion von TNF in das Gelenk eines Kaninchens verursacht eine Infiltration von Leukozyten in das Gelenk, jedoch keinen Proteoglykanverlust vom Knorpel. Die Injektion submaximaler Dosen von TNF und Interleukin-1 (IL-1) in das Gelenk verursachte eine synergistische Anreicherung von Neutrophilen. Siehe B. Henderson et al., Clin. Exp. Immunol., Bd. 75, S. 306-310 (1989). Im Gegensatz dazu verursachte eine einzelne intraartikuläre Injektion von TNFα bei in anderen Versuchsreihen verwendeten Kaninchen sowohl eine zelluläre Infiltration als auch einen Proteoglycanverlust im Knorpel. Konzentrationen der Substanz P, einem Entzündungsneuropeptid, waren in der synovialen Flüssigkeit erhöht. Siehe A.S. Rubin et al., Arthritis and Rheumatism, Bd. 33, S. 1023-1028 (1990).
2. Die Wirkung von TNF-Antikörpern auf die IL-1-Bildung synovialer Zellen wurde bei Patienten mit rheumatoider Arthritis bestimmt. Mononukleäre Zellkulturen, die aus der Synovialhaut oder synovialen Flüssigkeit rheumatoider Gelenke extrahiert wurden, produzieren bis zu 6 Tage lang Cytokine ohne extrinsische Stimulation. Bei Patienten mit rheumatoider Arthritis war die IL-1-Bildung synovialer Zellen in der Kultur durch anti-TNF-Antikörper bedeutend vermindert. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass TNF eine zentrale Rolle bei der Induktion von IL-1 in rheumatischen Gelenken spielt. Siehe F.M. Brennan et al., Lancet, Bd. 2 (8657), S. 244-247 (1989).
3. TNF ist in nachweisbaren Konzentrationen in rheumatischen synovialen Flüssigkeiten vorhanden. Siehe F.S. Di Giovine et al., Ann. Rheum. Dis., Bd. 47, S. 768-776 (1988).

Idiopathische entzündliche Darmkrankheiten (IBD) umfassen zwei Syndrome, ulzeröse Colitis und die Crohn-Krankheit. Die Crohn-Krankheit ist durch eine granulomatöse Entzündungsreaktion gekennzeichnet, die die gesamte Dicke der Wände des terminalen Ileums oder Colons umfasst, während die ulzeröse Colitis eine nichtspezifische Entzündungsreaktion ist, welche auf die Mucosa und Submucosa des Colons beschränkt ist. Obgleich es Unterschiede in der Pathologie der zwei Syndrome gibt und die Ätiologie beider unklar bleibt, glaubt man, dass die zwei Krankheiten veränderbare Ge webe oder immunologische Reaktionen auf ein gemeinsames ätiologisches Agenz zeigen. Verschiedenartige immunologische Störungen wurden bei Patienten mit IBD nachgewiesen. Eine Hypothese ist, dass das Immunsystem von Patienten abnorm oder unangemessen auf Antigene reagiert, wie bakterielle Produkte, denen jeder allgemein ausgesetzt ist. Die Bildung hoher TNF-Spiegel im Darm kann zur entzündlichen zellulären Infiltration bei IBD beitragen. Die Vermittlung von IBD durch TNF wird durch das Folgende gestützt:

1. In zwei Untersuchungen mit Ratten wurde die Nekrose des Gastrointestinaltraktes durch eine intravenöse Bolus-Verabreichung von TNF induziert. Die Wirkungen von TNF schienen dosisabhängig zu sein. Die Dosen, die 0,6 mg/kg überschritten, induzierten eine grobe und mikroskopisch erkennbare Nekrose des Dünndarms. Der Darm zeigte eine segmentäre Ischämie mit Bereichen offener Hämorrhagie oder Nekrose. Der Blinddarm erschien besonders empfindlich für TNF. Histologische Schnitte des nicht-nekrotischen Intestinaltraktes zeigten ebenso entzündliche Veränderungen mit Befall der Submucosa und der Muscularis mucosae durch polymorphkernige Leukozyten. Das Epithel war in einer herdförmigen Verteilung überall im Darm abgetragen. Siehe X.M. Sun et al., J. Clin. Invest., Bd. 81, S. 1328-1331 (1988); und K.J. Tracey, et al., Science, Bd. 234, S. 470-474 (1986).
2. In der Tracey-Untersuchung schützte die Infusion von 4 mg eines neutralisierenden monoklonalen Antikörpers der Maus, der gegen menschlichen TNF gerichtet war, in Ratten eine Stunde vor der Infusion von TNF die Tiere nicht nur vollkommen vor der letalen Dosis von TNF, sondern beugte ebenso der Entwicklung von Schädigungen vor, die typischerweise durch TNF induziert werden.
3. Isolate aus Biopsien von Kindern mit der Crohn-Krankheit zeigten erhöhte Häufigkeiten von TNFα-bildenden Zellen in allen Individuen, die mit einer Spot-ELISA-Technik untersucht worden waren. Isolate von normalen Kindern zeigten diese Erhöhung nicht. Bei der ulzerösen Colitis hatten vier von acht Kindern eine erhöhte Bildung von TNFα. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass TNFα ein wichtiger Mediator der Entzündung im menschlichen Darm ist. Siehe T.T. Mac-Donald, et al., Clin. Exp. Immunol., (ENGLAND), Bd. 81, S. 301-305 (1990).

Der septische Schock ist ein Zustand, der mit massivem Bakterienbefall verbunden ist. Man glaubt allgemein, dass der durch gramnegative Infektionen verursachte Schock mindestens zum Teil durch die Gegenwart bakterieller Endotoxine (Lipopolysaccharide) herbeigeführt wird. Der septische Schock ist eine relativ häufige Todesursache im Krankenhausbetrieb. Gegenwärtig gibt es wenig Behandlungsmöglichkeiten für Patienten, die an einem septischen Schock leiden, und die vorhandenen Behandlungen sind allgemein von unterstützender Natur.
Der septische Schock ist durch verschiedene Symptome gekennzeichnet, einschließlich eines Abfalls des mittleren arteriellen Blutdrucks (MAP), einer Abnahme des Herzminutenvolumens, einer Tachykardie, Tachypnoe, Laktazidämie und Leukopenie. Verschiedene Cytokine einschließlich TNF wurden mit der Vermittlung des septischen Schocks in Zusammenhang gebracht, obgleich die spezifische Ätiologie der Krankheit nicht völlig verstanden wird.
Es gibt mehrere Nachweismethoden, die darauf schließen lassen, dass TNFen eine Rolle bei der Vermittlung des septischen Schocks spielen:

1. Es wurde gezeigt, dass die Verabreichung von TNF an Tiere einen schockähnlichen Zustand induziert. Siehe Everhaerdt, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 163, S. 378 (1989). Es wurde gezeigt, dass die Verabreichung von Lipopolysacchariden an Mäuse die Symptome eines septischen Schocks in den Tieren nachahmt. Man fand heraus, dass auf diese Weise behandelte Tiere erhöhte Spiegel von zirkulierendem TNF alpha aufwiesen. Siehe Parillo et al., Ann. Intern. Med., Bd. 9, S. 28-31 (1988); und Carswell et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, Bd. 72, S. 3666-3670 (1975).
2. Es wurde gezeigt, dass die Verabreichung von Antikörpern gegen TNF alpha die tödlichen Wirkungen hoher Dosen Endotoxin in Mäusen und Affen reduziert. Siehe Tracey et al., Nature, Bd. 330, S. 662-664 (1987); Beutler et al., Science, Bd. 229, S. 869-871 (1985).
3. Eine zusätzliche Untersuchung wurde durchgeführt, wobei das Blutserum von Kindern, die an gramnegativer Sepsis litten, auf seine TNF alpha-Konzentration analysiert wurde. Diese Untersuchung zeigte, dass bei 91 % der untersuchten Patienten erhöhte Spiegel von TNF alpha gefunden wurden. Außerdem waren die TNF alpha-Serum-Spiegel bedeutend höher bei Patienten, die starben, als bei den Überlebenden. Firardin et al., New England J. of Med., Bd. 319, S. 397-400 (1988).

Dies veranlasste die Erfinder vorzuschlagen, dass Substanzen, die die Aktivität von TNFen beeinflussen, wirksame Verbindungen zur Behandlung von durch TNF vermittelten Krankheiten sein könnten, wie oben erklärt wurde.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung identifizierten eine Verbindungsklasse, hier bezeichnet als TNF-Inhibitoren, die durch TNF vermittelte Krankheiten vorbeugen und sie behandeln. In der zur Zeit anhängigen U.S. Patentanmeldung mit der Seriennr. 555,274, eingereicht am 19. Juli 1990, wird eine bevorzugte Klasse natürlich vorkommender proteinhaltiger TNF-Inhibitoren und ein Verfahren für ihre Herstellung in einer beträchtlichen Menge mit einem hohen Reinheitsgrad beschrieben. Insbesondere beschreibt die oben erwähnte Anmeldung ausführlich zwei Untergruppen von TNF-Inhibitoren, erwähnt als 30kDa-TNF-Inhibitor und 40kDa-TNF- Inhibitor. Zusätzlich zu dem 40kDa-TNF-Inhibitorprotein in voller Länge wurden ebenso zwei verkürzte, noch biologisch aktive Formen des 40kDa-TNF-Inhibitors hergestellt. Der 40kDa-TNF-Inhibitor in voller Länge ist der TNF-Inhibitor mit einem Molekulargewicht von etwa 40kDa auf einem SDS-Gel, der aus einem konditionierten Medium von menschlichen U937-Zellen oder aus menschlichem Urin isoliert werden kann. Der 40kDa-TNF-Inhibitor in voller Länge kann glykosyliert werden, wie es beim natürlich vorkommenden Protein der Fall ist; oder nicht-glykosyliert sein, wie es das in einem bakteriellen Expressionssystem rekombinant exprimierte Protein ist. Die verkürten Proteine, in denen 51 und 53 Carboxy-terminale Aminosäuren von dem Protein mit voller Länge entfernt wurden, werden in dieser Reihenfolge als 40kDa-TNF-Inhibitor Δ51 und 40kDa-TNF-Inhibitor Δ53 bezeichnet.
Es wurde gezeigt, dass der 30kDa-TNF-Inhibitor Inhibierungsaktivität gegen TNF alpha aufweist. Es wurde gezeigt, dass die 40kDa-TNF-Inhibitoren, einschließlich des 40kDa-TNF-Inhibitors in voller Länge, des 40kDa-TNF-Inhibitors Δ51 und 40kDa-TNF-Inhibitors Δ53, Inhibierungsaktivität sowohl gegen TNF alpha als auch TNF beta aufweisen.
Die zur Zeit anhängige U.S. Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/669,862, eingereicht am 15. März 1991, beschreibt eine Anzahl modifizierter TNF-Inhibitorspezies. Muteine von TNF-Inhibitoren werden hergestellt, wobei (ein) ausgewählter) Aminosäurerest(e) durch Cysteinreste ersetzt werden (wird). Derartige Muteine können dann stellenselektiv mit funktionalisierten Polyethylenglykol (PEG)-Einheiten umgesetzt werden, um TNF-Inhibitor-PEG-Spezies herzustellen. Insbesondere wird ein 30kDa-TNF-Inhibitormutein, bezeichnet als C105, beschrieben, in denen das Asparagin an Position 105 des 30kDa-TNF-Inhibitors durch Cystein ersetzt wird. In einer weiteren Ausführungsform können die Mutein-Proteine mit bifunktionalisierten PEG-Einheiten umgesetzt werden, um bivalente "Dumb bell"("Hantel")-Spezies zu bilden, wobei zwei TNF-Inhibitormuteine über eine einzelne PEG-Kette verbunden werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen TNF-Inhibitor, der durch die Addition eines aus einer sich wiederholenden Komponente gebildeten Polymer-Materials mit hohem Molekulargewicht modifiziert ist, um eine physiologisch verträgliche Formulierung zur verzögerten Freigabe zu bilden.
Außerdem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines TNF-Inhibitors zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Osteoarthritis, Spondylitis ankylosans, Arthritis gonorrhoica, mit der Reiter-Krankheit assoziierter Arthritis und Gicht.
Bevorzugte erfindungsgemäße TNF-Inhibitoren sind natürlich vorkommende Proteine und verkürzte Formen natürlich vorkommender Proteine. Die natürlich vorkommenden Proteine werden bevorzugt, weil sie ein relativ niedriges Risiko darstellen, unerwartete Nebenwirkungen bei damit behandelten Patienten zu produzieren. In einigen Ausführungsformen dieser Erfindung sind Muteine von TNF-Inhibitorproteinen, bei denen sich nur eine kleine Zahl Aminosäurereste von der natürlichen Proteinsequenz unterscheiden, ebenso bevorzugte TNF-Inhibitoren.
Eine bevorzugte Klasse von TNF-Inhibitoren sind menschliche TNF-bindende Proteine. Die bevorzugten TNF-Inhibitoren scheinen lösliche Fragmente von TNF-Rezeptorproteinen zu sein. Diese TNF-Inhibitoren, die in der Anwendung der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, werden ausgewählt aus der Gruppe, die aus dem 30kDa-TNF-Inhibitor und dem 40kDa-TNF-Inhibitor besteht, und dieser 40kDa-TNF-Inhibitor ist weiterhin ausgewählt aus der Gruppe, die aus dem 40kDa-TNF-Inhibitor in voller Länge, dem 40kDa-TNF- Inhibitor Δ51 und dem 40kDa-TNF-Inhibitor Δ53 besteht. Ebenso bevorzugt sind Proteine, die modifiziert wurden, zum Beispiel durch die Addition von Polyethylenglykol (PEG) oder irgendeinem anderen wiederholten Polymer, um ihre zirkulierende Halbwertszeit zu erhöhen und/oder ihre immunisierende Eigenschaft zu vermindern. TNF-Inhibitoren, die als Rezeptor-Antagonisten für TNF wirken, sind vom Schutzumfang der Erfindung ebenfalls umfasst.
Während die Herstellung von TNF-Inhibitoren durch Extraktion von natürlich vorhandenen Ausgangsstoffen, wie durch die Isolierung aus menschlichem Urin, erreicht werden kann, ist die DNA-Rekombinationstechnologie ein bevorzugtes Verfahren der TNF-Inhibitor-Herstellung. Die DNA-Rekombinationstechnologie ist teilweise bevorzugt, da sie vergleichsweise höhere Mengen TNF-Inhibitoren mit größeren Reinheiten herstellen kann.
Zusätzlich bevorzugte TNF-Inhibitoren umfassen Muteine des 30kDa-TNF-Inhibitors, wobei ausgewählte Aminosäuren des 30kDa-TNF-Inhibitors durch Cystein ersetzt sind. Derartige Muteine können als TNF-Inhibitoren verwendet werden, oder sie können mit Polyethylenglykol (PEG) umgesetzt werden, um TNF-Inhibitor-PEG-Verbindungen zu bilden, die eine oder zwei TNF-Inhibitoren pro Molekül enthalten. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der TNF-Inhibitor eine bivalente Spezies, die in einer Reaktion zwischen einem Mutein des 30kDa-TNF-Inhibitors und einer bifunktionalisierten PEG-Vorstufe gebildet wird. Das bevorzugte Mutein ist der C105-30kDa-TNF-Inhibitor, wobei der Rest 105 des 30kDa-TNF-Inhibitors durch einen Cysteinrest ersetzt wird.
Es ist davon auszugehen, dass sowohl die vorangehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende ausführliche Beschreibung nur beispielhaft und erläuternd sind und nicht einschränkend auf die beanspruchte Erfindung wirken.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die Sterblichkeitsraten als Funktion der Dosis des menschlichen rekombinanten Interleukin-1 beta (hrIL-1β) dar, die mit einer konstanten Dosis von 300 μg/kg menschlichem rekombinanten Tumornekrosefaktor alpha (hrTNFα) verabreicht wurde. Verschiedene Mengen hrIL-1β wurden an Gruppen von sechs Mäusen gegeben. Die Sterblichkeit wurde 72 Stunden nach subkutaner Injektion der Cytokin-Mischung bestimmt. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ± der Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.) von drei Versuchen.
2 stellt die Oberflächentemperatur als Funktion der Zeit nach Verabreichung von 300 μg/kg hrTNFα und 2500 μg/kg hrIL-1β dar, die subkutan zur Zeit 0 injiziert wurden.
3 stellt die Oberflächentemperatur als Funktion der Zeit wie in 2 dar, wobei – • – • – Mäuse bezeichnet, denen zwei intraperitoneale Injektionen 40kDa-TNF-Inhibitor Δ53 30 Minuten vor und 30 Minuten nach der subkutanen Verabreichung der Cytokin-Mischung gegeben wurden. Der insgesamt verabreichte 40kDa-TNF-Inhibitor Δ53 betrug 200 mg/kg. * bezeichnet statistisch signifikante Unterschiede zwischen den mit TNF-Inhibitor behandelten und unbehandelten, mit Cytokin injizierten Mäusen, wie durch den ungepaarten t-Test (p < 0,05) nachgewiesen wurde.
4 stellt die Sterblichkeit als Funktion der Zeit des in 3 gezeigten Experiments dar.
5 stellt die Oberflächentemperatur als Funktion der Zeit wie in 2 dar, wobei -- ⊠ - ⊠ -- Mäuse bezeichnet, denen sechs intraperitoneale Injektionen des 40kDa-TNF-Inhibitors Δ53 30 Minuten vor und 30 Minuten, 3 Stunden, 6 Stunden, 9 Stunden und 12 Stunden nach Verabreichung der Cytokin- Mischung gegeben wurde. Der insgesamt verabreichte 40kDa-TNF-Inhibitor Δ53 betrug 600 mg/kg. * bezeichnet statistisch signifikante Unterschiede zwischen den mit TNF-Inhibitor behandelten und mit PBS injizierten Mäusen, wie durch den ungepaarten t-Test nachgewiesen wurde (p < 0,001).
6 stellt die Sterblichkeit als Funktion der Zeit des in 5 gezeigten Experiments dar.
7 stellt die Oberflächentemperatur als Funktion der Zeit wie in 2 dar, wobei – • – • – Mäuse bezeichnet, denen zehn intraperitoneale Injektionen des 40kDa-TNF-Inhibitors Δ53 30 Minuten vor und 30 Minuten, 3 Stunden, 6 Stunden, 9 Stunden, 12 Stunden, 15 Stunden, 18 Stunden und 24 Stunden nach subkutaner Verabreichung der Cytokin-Mischung gegeben wurden. Der insgesamt verabreichte 40kDa-TNF-Inhibitor Δ53 betrug 1000 mg/kg.
8 stellt die Sterblichkeit als Funktion der Zeit des in 7 gezeigten Experiments dar.
9 stellt die Körpergewichte als Funktion der Zeit des in 7 gezeigten Experiments dar.
10 stellt die Oberflächentemperatur als Funktion der Zeit dar, wie in 2 beschrieben wird, wobei: -⎕-⎕- eine Maus bezeichnet, der 6 intraperitoneale Injektionen 30kDa-TNF-Inhibitor 30 Minuten vor und 30 Minuten, 3 Stunden, 6 Stunden, 9 Stunden und 12 Stunden nach subkutaner Verabreichung der Cytokinmischung (insgesamt 240 mg/kg) gegeben wurden; --Δ--Δ- bezeichnet Mäuse, denen 10 intraperitoneale Injektionen 30kDa-TNF-Inhibitor 30 Minuten vor und 30 Minuten, 3 Stunden, 6 Stunden, 9 Stunden, 12 Stunden, 15 Stunden, 18 Stunden, 21 Stunden und 24 Stunden nach subkutaner Verabreichung der Cytokinmischung (insgesamt 400 mg/kg) gegeben wurden; und -O--O- bezeichnet Mäuse, denen 15 intraperitoneale Injektionen 30kDa-TNF-Inhibitor 30 Minuten vor und 30 Minuten, 3 Stunden, 6 Stunden, 9 Stunden, 12 Stunden, 15 Stunden, 18 Stunden, 21 Stunden, 24 Stunden, 27 Stunden, 30 Stunden, 33 Stunden, 36 Stunden und 39 Stunden nach subkutaner Verabreichung der Cytokinmischung gegeben wurden (insgesamt 600 mg/kg).
11 stellt die Sterblichkeit als Funktion der Zeit des in 10 gezeigten Experiments dar.
12 stellt die Körpergewichte als Funktion der Zeit des in 10 gezeigten Experiments dar.
13 stellt die Vergrößerung des Gelenkdurchmessers als Funktion der Zeit nach Reaktivierung mit Streptokokkenzellwand (SCW) am 21. Tag gemäß Verfahren 1 in dem nachstehenden Beispiel 3 dar.
14 stellt die maximale Veränderung des Gelenkdurchmessers während des 72 Stunden-Intervalls nach der Reaktivierung mit SCW des in 13 gezeigten Experiments dar. * bezeichnet statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich zu der PEG-3400-Kontrollgruppe durch den ungepaarten t-Test, t – 4,36, p < 0,001.
15 stellt die maximale Veränderung des Gelenkdurchmessers während des 72 Stunden-Intervalls nach Reaktivierung mit SCW gemäß Verfahren 2 in dem nachstehenden Beispiel 3 dar.
16 stellt die prozentuale Hemmung des von Endotoxin stimulierten neutrophilen Eindringens in die Bronchoalveolarräume von mit 30kDa-TNF-Inhibitor behandelten Ratten dar, wie in dem nachstehenden Beispiel 4 beschrieben wird.
17 stellt die Wirkungen der intratrachealen Eintröpfelung von fünf Dosen einer 30kDa-TNF-Hemmung auf die Zahl von Neutrophilen dar, die in die Alveolarräume migrieren, als Reaktion auf eine endotoxische Exposition in dem Experiment, welches in 16 dargestellt wird. * bezeichnet statistisch signifikante Unterschiede bei den unbehandelten Kontrollratten, wie durch den ungepaarten t-Test, p < 0,001 nachgewiesen wird.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN ANWENDUNGDSFORMEN
Ausführlich wird nun Bezug genommen auf die gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die zusammen mit den folgenden Beispielen dazu dienen, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.
Wie oben bemerkt wird, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von therapeutischen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln zur Vorbeugung und Behandlung von durch TNF vermittelten Krankheiten bei Patienten, die daran leiden. Während es das primäre Ziel dieser Erfindung ist, die Verwendung von therapeutischen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln zur Vorbeugung und Behandlung menschlicher Krankheiten bereitzustellen, gibt die hier bereitgestellte Beschreibung eine Anleitung einer allgemeinen physiologischen Verwendung, und tierärztliche Verwendungen sind daher ebenso in den Schutzbereich dieser Erfindung eingeschlossen.
Eine Krankheit oder medizinische Indikation gilt als eine TNF-vermittelte Krankheit, wenn die spontane oder experimentelle Krankheit mit erhöhten TNF-Spiegeln in Körperflüssigkeiten oder in Geweben verbunden ist, die an den Krankheitsherd oder ein Krankheitszeichen innerhalb des Körpers angrenzen. Die TNF-vermittelten Krankheiten können ebenso durch die folgenden zwei Voraussetzungen erkannt werden: 1) mit einer Krankheit verbundene pathologische Befunde können experimentell bei Tieren durch die Verabreichung von TNF nachgeahmt wer den; und 2) die Pathologie, die in experimentellen Tiermodellen der Krankheit induziert wird, kann durch die Behandlung mit Mitteln gehemmt oder aufgehoben werden, die die Wirkung von TNF hemmen. Viele durch TNF vermittelte Krankheiten erfüllen zwei dieser drei Voraussetzungen und andere werden alle drei Voraussetzungen erfüllen. Eine nicht-ausschließliche Aufstellung der TNF-vermittelten Krankheiten umfasst das Atemnotsyndrom von Erwachsenen, Lungenfibrose, Arthritis, entzündliche Darmerkrankungen und den septischen Schock.
In einer Ausführungsform sind bevorzugte erfindungsgemäße TNF-Inhibitoren natürlich vorkommende Proteine, die als TNF-bindende Proteine dienen. Die natürlich vorkommenden Proteine sind teilweise bevorzugt, weil mit ihnen ein vergleichsweise niedriges Risiko verbunden ist, unvorhersehbare und unerwünschte physiologische Nebenwirkungen bei damit behandelten Patienten zu produzieren.
Für die Zwecke der Beschreibung und Ansprüche wird ein Protein als "natürlich vorkommend" betrachtet, wenn festgestellt wird, dass dieses oder ein im Wesentlichen äquivalentes Protein normalerweise in gesunden Menschen existiert. Der Ausdruck "natürlich vorkommende" Proteine umfasst speziell Proteinformen, die in gesunden Menschen gefunden wurden, und welche teilweise am Carboxylende derartiger Proteine verkürzt sind, ebenso wie nicht-glykosylierte Proteinformen, die in glykosylierten Formen bei gesunden Menschen existieren. "Natürlich vorkommende" Proteine können durch DNA-Rekombinationsverfahren ebenso wie durch Isolierung aus Zellen erhalten werden, die sie normalerweise herstellen. "Natürlich vorkommend" umfasst ebenso Proteine, die eine N-terminale Methionylgruppe als Folge der Expression in E. coli enthalten.
"Im Wesentlichen äquivalent", wie es in der Beschreibung und den Ansprüchen hindurch verwendet wird, ist dahingehend definiert, dass ein sehr hoher Grad an Aminosäurerest-Homologie (siehe allgemein M. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, Bd. 5, S. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washing ton, D.C., hier spezifisch durch Hinweis einbezogen), ebenso wie eine vergleichbare biologische Wirksamkeit vorhanden sind.
Unter den bevorzugten TNF-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung befinden sich die natürlich vorkommenden Proteine, die in vivo als TNF-bindende Proteine existieren, welche zuvor in einer derzeitig anhängigen U.S. Patentanmeldung beschrieben wurden. Diese Anmeldung ist die U.S. Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/555,274, eingereicht am 19. Juli 1990 von Brewer et al., mit der Überschrift "Tumor Necrosis Factor (TNF)Inhibitor and Method for Obtaining the Same."
Es gibt zwei verschiedene Formen der bevorzugten TNF-Inhibitoren, deren jede in der zuvor erwähnten Anmeldung von Brewer et al. beschrieben und erläutert wird. Die erste von ihnen ist der 30kDa-TNF-Inhibitor, der aus mindestens einem durch menschliche U937-Zellen konditionierten Medium und aus menschlichem Urin identifiziert und isoliert wurde. Der 30kDa-TNF-Inhibitor beträgt ungefähr 30kDa auf einem SDS-Gel und eluiert aus einer DEAE CL6B-Säule bei etwa 80 millimolarem NaCl in Tris-Puffer, pH 7,5. Es wurde gezeigt, dass der 30kDa-TNF-Inhibitor die Aktivität von TNF alpha hemmt und wenig auf die Aktivität von TNF beta wirkt. Das natürlich vorkommende Protein ist glykosyliert. Nicht-glykosylierter 30kDa-TNF-Inhibitor zeigt ebenso TNF-inhibitorische Aktivität.
Die zweite Form des bevorzugten TNF-Inhibitors ist der 40kDa-TNF-Inhibitor, der ebenso in mindestens einem durch menschliche U937-Zellen konditionierten Medium und menschlichem Urin identifiziert und daraus isoliert wurde. Der 40kDa-TNF-Inhibitor beträgt ungefähr 40kDa auf einem SDS-Gel und eluiert von einer DEAE-Säule bei etwa 100 millimolarem NaCl in Tris-Puffer, pH 7,5. Es wurde gezeigt, dass der 40kDa-TNF-Inhibitor die Aktivität sowohl von TNF alpha als auch TNF beta hemmt. Der 40kDa-TNF-Inhibitor ist ebenso ein Glykoprotein, und das nicht-glykosylierte Protein weist wiederum TNF-inhibitorische Aktivität auf.
Die Nukleinsäuresequenzen der Gene, die sowohl für den 30kDa-TNF-Inhibitor als auch den 40kDa-TNF-Inhibitor kodieren, und die Aminosäuresequenzen beider Proteine sind in der Anmeldung von Brewer et al. angegeben. Die vorliegende Erfindung umfasst nicht-glykosylierte Formen des TNF-Inhibitors ebenso wie bestimmte verkürzte Formen der natürlich vorkommenden Proteine wie unten beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform sind die TNF-Inhibitoren durch Anketten eines oder mehrerer Polyethylenglykol(PEG)-Moleküle oder anderer sich wiederholender polymerer Komponenten modifiziert.
Drei Formen des 40kDa-TNF-Inhibitors wurden rekombinant durch Expression in E. coli hergestellt. Jede dieser Formen, bezeichnet als 40kDa-TNF-Inhibitor mit voller Länge, 40kDa-TNF-Inhibitor Δ51 und 40kDa-TNF-Inhibitor Δ53 (zusammen mit dem glykosylierten 40kDa-TNF-Inhibitor mit voller Länge, wie er aus von menschlichen U937-Zellen konditioniertem Medium und menschlichem Urin isoliert wurde, in glykosylierten und nicht-glykosylierten Formen, die alle zusammen hier als 40kDa-TNF-Inhibitor bezeichnet werden) wird in der Anmeldung von Brewer et al. beschrieben. Das Δ51-Protein ist eine verkürzte Version des nativen Proteins, wobei 51 Aminosäurereste am Carboxylende des reifen Proteins entfernt sind. Das Δ53-Protein ist eine verkürzte Form des reifen Proteins, wobei 53 Aminosäurereste am Carboxylende des nativen Proteins entfernt sind. Der natürlich vorkommende 40kDa-TNF-Inhibitor (glykosyliert) und die nicht-glykosylierten Inhibitoren (nativ, Δ51 und Δ53) haben im Wesentlichen dieselbe TNF-inhibitorische Aktivität.
Verfahren zum Herstellen der Inhibitoren von Brewer et. al. werden in der oben erwähnten Anmeldung ebenso beschrieben. Ein beschriebenes Verfahren besteht darin, die Inhibitoren aus verschiedenen Ausgangsstoffen wie menschlichem Urin und von menschlichen U937-Zellen konditioniertem Medium zu isolieren. Ein zweites beschriebenes Verfahren umfasst das Isolieren der Gene, die verantwortlich sind für die Codierung der Inhibitoren, das Klonieren der Ge ne in geeigneten Vektoren und Zelltypen und das Exprimieren der Gene, um die Inhibitoren herzustellen. Das letztere Verfahren, das für DNA-Rekombinationsverfahren im Allgemeinen beispielhaft ist, ist ein bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung. DNA-Rekombinationsverfahren sind zum Teil bevorzugt, weil sie vergleichsweise höhere Mengen mit größeren Reinheiten erreichen können.
Ebenso eingeschlossen in den Bereich dieser Erfindung sind TNF-Inhibitor-Muteine und Muteine, die modifiziert wurden, wie in der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/669,862, eingereicht am 15. März 1991, beschrieben. Ein bevorzugtes Mutein ist der 30kDa-TNF-Inhibitor, wobei sich an Position 105 ein Cystein befindet. Ein bevorzugter pegylierter TNF-Inhibitor ist eine "Dumbbell"-Spezies, worin zwei C105-30kDa-TNF-Inhibitoren an eine Polyethylenglykol(PEG)-Komponente angeheftet sind. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform hat die PEG-Kette ein Molekulargewicht von 20000. Die Herstellung der Dumbbell-Verbindung wird in dem nachstehenden Beispiel 5 beschrieben.
Vorzugsweise werden die oben beschriebenen TNF-Inhibitoren durch das zuvor erwähnte Verfahren in "im Wesentlichen reiner" Form hergestellt. Mit "im Wesentlichen rein" ist gemeint, dass der Inhibitor in einer nicht-modifizierten Form eine vergleichsweise hohe spezifische Aktivität besitzt. Es ist jedoch erlaubt, dass Derivate von TNF-Inhibitoren verschiedene spezifische Aktivitäten haben können. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine therapeutische Zusammensetzung, die mindestens einen 30kDa-TNF-Inhibitor oder 40kDa-TNF-Inhibitor umfasst, an Patienten, welche an TNF-vermittelten Krankheiten leiden, in einer wirksamen Menge verabreicht.
Zusätzliche TNF-Inhibitoren umfassen Verbindungen, die fähig sind, mit TNF um TNF-Rezeptorstellen zu konkurrieren. Solche Verbindungen schließen Rezeptorantagonisten ein. Andere TNF-Inhibitoren umfassen Verbindungen und Proteine, die die in vivo-Synthese oder extrazelluläre Freisetzung von TNF blockieren. Derartige Verbindungen schließen Mittel ein, die die Transcription oder Translation von TNF-Genen oder die Reifung der TNF-Preproteine beeinträchtigen.
Da es möglich ist, dass die inhibitorische Funktion der bevorzugten Inhibitoren von einem oder mehreren einzelnen und trennbaren Teilen vermittelt wird, ist es ebenso ins Auge zu fassen, dass die TNF-inhibitorischen Fragmente der TNF-Inhibitoren zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden können.
Die therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise parenteral durch Injektion verabreicht, obgleich andere wirksame Darreichungsformen, wie eine intraartikuläre Injektion, Inhalationsdämpfe, oral aktive Formulierungen, transdermale Iontophorese oder Suppositorien ebenso ins Auge gefasst werden. Ein bevorzugter Träger ist physiologische Kochsalzlösung, aber es ist beabsichtigt, dass andere pharmazeutisch annehmbare Träger ebenso verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ins Auge gefasst, dass der Träger und der TNF-Inhibitor eine physiologisch verträgliche Formulierung zur verzögerten Freigabe bilden. Das primäre Lösungsmittel in einem derartigen Träger kann entweder von wässriger oder nicht-wässriger Natur sein. Außerdem kann der Träger andere pharmakologisch annehmbare Träger enthalten, um den pH, die Osmolarität, Viskosität, Klarheit, Farbe, Sterilität, Stabilität, Lösungsgeschwindigkeit oder den Geruch der Formulierung zu verändern oder beizubehalten. Gleichermaßen kann der Träger noch andere pharmakologisch annehmbare Träger enthalten, um die Stabilität, Lösungsgeschwindigkeit, Freigabe oder Absorption des TNF-Inhibitors zu verändern oder beizubehalten. Derartige Träger sind diejenigen Substanzen, die gewöhnlich und üblicherweise angewendet werden, um Dosierungen zur parenteralen Verabreichung entweder in einer Einzeldosis oder in einer Mehrfachdosisform zu formulieren.
Wenn die therapeutische Zusammensetzung erst einmal formuliert wurde, kann sie in sterilen Ampullen als Lösung, Suspension, Gel, Emulsion, Feststoff oder dehydratisiertes oder lyophilisiertes Pulver gelagert werden. Derartige Formulierungen können entweder in einer gebrauchsfertigen Form oder einer Form, die eine Rekonstitution kurz vor der Verabreichung erfordert, aufbewahrt werden. Die bevorzugte Lagerung derartiger Formulierungen findet bei mindestens so niedrigen Temperaturen wie 4°C und vorzugsweise bei –70°C statt. Es ist ebenso bevorzugt, dass derartige TNF-Inhibitor enthaltende Formulierungen bei oder nahe dem physiologischen pH-Wert gelagert und verabreicht werden. Man glaubt gegenwärtig, dass die Verabreichung einer Formulierung bei einem hohen pH-Wert (d.h. größer als 8) oder bei einem niedrigen pH (d.h. kleiner als 5) nicht erwünscht ist.
Vorzugsweise erfolgt die Art der Verabreichung der TNF-Inhibitor enthaltenden Formulierungen für die systemische Abgabe subkutan, intramuskulär, intravenös, über ein intranasales oder vaginales oder rektales Zäpfchen. Vorzugsweise erfolgt die Art der Verabreichung der TNF-Inhibitor enthaltenden Formulierungen für die lokale Abgabe intraartikulär, intratracheal oder über Einträufelung oder Inhalationen in den respiratorischen Trakt. Außerdem kann es wünschenswert sein, den TNF-Inhibitor bestimmten Teilen des Verdauungstraktes entweder durch orale Verabreichung des TNF-Inhibitors in einer geeigneten Formulierung oder Vorrichtung oder durch ein Zäpfchen oder ein Klistier zuzuführen.
In bestimmten Ausführungsformen wird die Verabreichung erprobt, um einen vorgewählten Konzentrationsbereich des TNF-Inhibitors im Blutstrom des Patienten zu schaffen. Man glaubt, dass die Aufrechterhaltung zirkulierender Konzentrationen des TNF-Inhibitors von weniger als 0,01 ng pro ml Plasma keine wirksame Zusammensetzung sein kann, während die verlängerte Aufrechterhaltung zirkulierender Spiegel von mehr als 10 μg pro ml unerwünschte Nebenwirkungen haben kann.
Ein bevorzugter Dosierungsbereich für die Behandlung von TNF-vermittelten Krankheiten und besonders für die Behandlung von TNF-vermitteltem septischen Schock, liegt zwischen etwa 0,1-200 mg pro kg Körpergewicht des Patienten pro 24 Stunden, verabreicht in gleichen Dosen zwischen 4-15 Mal pro 24 Stunden. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform liegt die Dosierung, die in gleichen Dosen alle 3 Stunden verabreicht wird, etwa zwischen 0,1-100 mg pro kg Körpergewicht des Patienten pro 24 Stunden. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform werden 1-50 mg pro kg Körpergewicht des Patienten pro 24 Stunden gleichmäßig alle 3 Stunden verabreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform dauert die Verabreichung 12 bis 60 Stunden. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform dauert die Verabreichung mindestens 24 Stunden. Die Häufigkeit der Dosierung und die optimale Dosis hängen von pharmakokinetischen Parametern des TNF-Inhibitors in der verwendeten Formulierung ab.
In einem weiteren bevorzugten Modus für die Behandlung von TNF-vermittelten Krankheiten und besonders für die Behandlung des durch TNF-vermittelten septischen Schocks wird eine anfängliche intravenöse Bolusinjektion von TNF verabreicht, gefolgt von einer kontinuierlichen intravenösen Infusion eines TNF-Inhibitors, bis die zirkulierenden TNF-Spiegel nicht länger erhöht sind. Serum-TNF-alpha-Spiegel können durch käufliche Immunoassay-Testkits bestimmt werden. Der Behandlungsbeginn für den TNF-vermittelten septischen Schock sollte bei jedem Behandlungsmodus so bald wie möglich nach der Sepsis oder nachdem die Möglichkeit einer Sepsis erkannt wird, beginnen. Zum Beispiel kann die Behandlung sofort im Anschluss an eine Operation oder nach einem Unfall oder einem anderen Ereignis begonnen werden, das das Risiko birgt, einen septischen Schock zu verursachen.
Bevorzugte Modi zur Behandlung von TNF-vermittelten Krankheiten und besonders zur Behandlung von TNF-vermittelter Arthritis umfassen: 1) eine einzelne intraartikuläre Injektion des TNF-Inhibitors, die nach Bedarf wiederholt gegeben wird, um einem Aufflackern von Arthritis vorzubeugen oder es zu beheben; und 2) periodische subkutane Injektionen des TNF-Inhibitors.
Bevorzugte Modi für die Behandlung von TNF-vermittelten Krankheiten und besonders für die Behandlung von TNF-vermitteltem Atemnotsyndrom von Erwachsenen umfassen: einzelne oder mehrfache intratracheale Verabreichungen des TNF-Inhibitors; und 2) eine Bolus- oder kontinuierliche intravenöse Infusion des TNF-Inhibitors.
Es wird ebenso erwogen, dass bestimmte Formulierungen, die einen TNF-Inhibitor enthalten, oral verabreicht werden sollen. Vorzugsweise ist der TNF-Inhibitor, der auf diese Art verabreicht wird, verkapselt. Der verkapselte TNF-Inhibitor kann mit oder ohne diejenigen Träger, die gewöhnlich in der Mischung fester Dosierungsformen verwendet werden, formuliert werden. Vorzugsweise ist die Kapsel dermaßen gestaltet, dass der aktive Teil der Formulierung an der Stelle des Gastrointestinaltraktes freigesetzt wird, wo die Bioverfügbarkeit maximiert ist und der vorsystemische Abbau minimiert ist. Zusätzliche Träger können eingeschlossen sein, um die Absorption des TNF-Inhibitors zu erleichtern. Verdünnungsmittel, Aromastoffe, Wachse mit niedrigem Schmelzpunkt, Pflanzenöle, Gleitmittel, Suspendiermittel, tablettenauflösende Mittel und Bindemittel können ebenso angewendet werden.
Ungeachtet der Art und Weise der Verabreichung wird die spezifische Dosis gemäß dem geschätzten Körpergewicht des Patienten berechnet. Eine weitere Verfeinerung der Berechnungen, die notwendig sind, um die geeignete Dosierung für eine Behandlung mit jeder der oben erwähnten Formulierungen zu bestimmen, wird routinemäßig von Durchschnitts-Fachleuten vorgenommen und befindet sich innerhalb des routinemäßig von ihnen ohne übermäßiges Experimentieren bearbeiteten Aufgabenbereichs, besonders angesichts der Dosierungsanleitung und der hierin beschriebenen Tests. Diese Dosierungen können durch Verwendung der etablierten Tests zur Bestimmung der Dosierungen ermittelt werden, die in Verbindung mit geeigneten Dosis-Wirkungs-Daten verwendet werden.
Es sollte bemerkt werden, dass die hierin beschriebenen TNF-Inhibitor-Formulierungen für tierärztliche ebenso wie für menschliche Anwendungen benutzt werden können und dass der Begriff "Patient" nicht in einer einschränkenden Art ausgelegt werden sollte. Im Falle von tierärztlichen Anwendungen sollten die Dosierungsbereiche dieselben sein, wie sie oben erläutert wurden.
Es versteht sich, dass die Anwendung der Lehre der vorliegenden Erfindung auf ein spezielles Problem oder in einer besonderen Umgebung angesichts der hierin enthaltenden Lehren innerhalb der Fähigkeiten des Durchschnitts-Fachmanns liegen wird. Beispiele für die typischen Verwendungen der vorliegenden Erfindung erscheinen in den folgenden Beispielen.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Anwendung der vorliegenden Erfindung bei einer der TNF-vermittelten Krankheiten, die hierin beschrieben sind. Die Unterschiede, wenn es solche überhaupt gibt, zwischen der Behandlung von Patienten, die an anderen TNF-vermittelten Krankheiten leiden, und der Behandlung von Patienten, die an einem TNF-vermittelten septischen Schock leiden, würden leicht und routinemäßig von einem Durchschnitts-Fachmann identifiziert werden. Die Fähigkeit, die Wirkungen des TNF-vermittelten septischen Schocks zu mildern, indem ein TNF-Inhibitor verabreicht wird, wie es in den folgenden Beispielen gezeigt wird, zeigt, dass die Verabreichung eines TNF-Inhibitors gleich wirksam beim Behandeln aller TNF-vermittelten Krankheiten, wie sie hierin definiert sind, sein wird.
Beispiel 1: Darstellung der protektiven Wirkungen von menschlichem rekombinanten 40kDa-TNF-Inhibitor Δ53 in einem Maus-Modell mit Cytokin-induziertem septischen Schock
A. Protokoll für die Induktion von systemischem Schock in Mäusen
Eine von Everaerdt, et al. entwickelte Modifikation eines Maus-Modells des septischen Schocks wurde in diesem Beispiel verwendet, um die therapeutische Wirksamkeit des TNF-Inhibitors gegen den septischen Schock zu zeigen. Everaerdt et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 163, S. 378 (1989). In diesem Modell verursacht die synergistische Wirkung einer Kombination von Cytokinen, menschlichem rekombinanten Tumor Nekrose Factor α (hrTNFα) und menschlichem rekombinanten Interleukin-1β (hrIL-1β) einen septischen Schock in Mäusen, der durch eine starke Unterkühlung und dann Tod gekennzeichnet ist.
Der letale septische Schock wurde bei 8-12 Wochen alten, weiblichen C57B1/6-Mäusen mit 18-21 Gramm Körpergewicht durch die Verabreichung von hrTNFα und hrIL-1β Induziert, Der menschliche rekombinante Tumor Nekrose Faktor wurde gewöhnlich gemäß dem Verfahren hergestellt, das bei Shirai et al., Nature (1985) Bd. 313, S. 803-806 beschrieben wird, siehe ebenso die Patentanmeldung von Brewer et al.. Menschliches rekombinantes Interleukin-1β wurde gewöhnlich gemäß dem Verfahren hergestellt, das bei Kronheim et al., Biotechnology (1986) Bd. 4, S. 1078-1082 beschrieben wird. Die Cytokine wurden gemäß den Verfahren, die in der Pharmakopia XXII der United States, National Formulary XVII, 1. Januar 1990, S. 1493-1495, beschrieben sind, auf LPS getestet. Die Injektionen der Cytokine wurden als Einzelbolus, subkutan, auf der dorsalen Oberfläche der Mäuse, in 100 μl-Volumina abgegeben. Der 40kDa-TNF-Inhibitor Δ53 wurde gemäß dem DNA-Rekombinationsverfahren, das in der Anmeldung von Brewer et al. beschrieben ist, hergestellt und wurde in mehrfachen intraperitonealen Dosen in Volumina von 300 μl oder weniger pro Injektion verabreicht.
Es wurden Vorversuche durchgeführt, um das Verhältnis von hrIL-1β zu hrTNFα zu bestimmen, das erforderlich ist, um eine Sterblichkeit von 100% (1) zu induzieren. Die Dosen werden ausgedrückt als μg/kg Körpergewicht. Während die hrTNFα-Dosierung konstant bei 300 μg/kg gehalten wurde, wurden zu dem Injektionsbolus steigende Mengen hrIL-1β hinzugefügt. Die Ergebnisse, angegeben als μg hrIL-1(3/kg : % Sterblichkeit, waren wie folgt; 250:0, 500:10, 1500:50, 2000:67, 2500:100. Alle Dosen größer als 2500 μg/kg produzierten 100% Letalität. In allen folgenden Experimenten wurden die Cytokine bei 2500 μg/kg hrIL-1β und 300 μg/kg hrTNFα verwendet und als einzelner subkutaner Bolus an der dorsalen Oberfläche verabreicht.
Die kombinierte Verabreichung von hrTNFα und hrIL-1β verursachte bei Mäusen eine starke Hypothermie (2) und dann den Tod etwa 18 bis 30 Stunden nach der Injektion (4). In diesem Beispiel wurde eine Abnahme der Körpertemperatur als ein messbarer Indikator für die Schwere des induzierten Schocks verwendet. Die Körpertemperatur wurde durch Verwendung eines First Temp-Infrarot-Handscanners (Intelligent Medical Systems, Carlsbad, CA) bestimmt. Der Grad der Hypothermie korrelierte direkt mit der Schwere anderer klinischer Symptome (d.h. Zittern, Lethargie, Verlust der Hautelastizität, gekrümmte Haltung). Die Körpertemperatur der Tiere fiel etwa 15 Stunden nach der Injektion von einem Normalwert von 39°C bis auf 28°C ab.
Im Gegensatz dazu verursachten Injektionen von jedem Cytokin allein keinen ähnlichen Grad der Hypothermie und waren ohne letale Wirkung. Subkutane Injektionen mit einem einzelnen Bolus von hrIL-1β bei 2500 μg/kg verursachten einen vorübergehenden Abfall der Körpertemperatur auf 34°C, wobei dieser Tiefpunkt 12 bis 16 Stunden nach der Injektion erreicht wurde. Es wurde keine Sterblichkeit beobachtet. 300 μg/kg hrTNFα erzeugten keine messbare Wirkung auf die Körpertemperatur von Mäusen, auch wurde keine Sterblichkeit beobachtet.
B. Wirkungen des 40kDa-TNF-Inhibitors Δ53 auf Cytokin induzierten Schock
Der 40kDa-TNF-Inhibitor Δ53 wurde an Mäuse verabreicht, denen die Cytokin-Mischung (hrIL-1β und hrTNFα in den oben beschriebenen Mengen) injiziert wurde. Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, in denen Gruppen von sechs Mäusen mit dem Inhibi torprotein (in diesem Experiment dem 40kDa-TNF-Inhibitor Δ53) über zunehmend längere Zeiträume behandelt wurden. Die Menge des Inhibitorproteins pro Injektion wurde konstant gehalten, während die Gesamtzahl der Injektionen erhöht wurde. Deshalb änderte sich die absolute Menge des verwendeten Inhibitorproteins in den drei Experimenten mit der Dauer der therapeutischen Behandlung. Die Körpertemperatur und die Sterblichkeit wurde für jedes Experiment ermittelt.
Im ersten Experiment wurde das Inhibitorprotein intraperitoneal 30 Minuten vor und 30 Minuten nach dem Cytokinbolus injiziert (3). Jede Injektion enthielt 100 mg/kg Inhibitorprotein in einem 300 μl-Volumen für insgesamt 200 mg/kg. Von den Mäusen mit einem Cytokin-Schock zeigten diejenigen in der Gruppe, die das Inhibitorprotein erhielten, einen deutlichen Rückgang der Hypothermie in einem Zeitraum von 4 bis 6 Stunden nach der Verabreichung der Cytokine im Vergleich zu der unbehandelten Gruppe (3). Der Beginn der Mortalität in der behandelten Gruppe war ungefähr 12 Stunden verzögert (4). 48 Stunden nach der Injektion betrug jedoch die Sterblichkeit in beiden Gruppen 100%.
In dem zweiten Experiment wurde die Therapie für insgesamt 12 Stunden nach der Injektion fortgesetzt: (5). Die Injektionszeiten, bezogen auf die Zeit der Cytokin-Injektion waren: –30 Minuten, + 30 Minuten, 3 Stunden, 6 Stunden, 9 Stunden und 12 Stunden. Diese Therapie führte zu einer Gesamtdosis Inhibitorprotein von 600 mg/kg. Nach der Cytokin-Injektion entwickelte die unbehandelte Gruppe die charakteristische Hypothermie mit einem Tiefpunkt von 26°C nach 15 Stunden. Die ersten Todesfälle wurden nach 36 Stunden (6) beobachtet. Die Sterblichkeit betrug 100% in 43 Stunden. Im Gegensatz dazu war die mit dem Inhibitorprotein behandelte Gruppe gegen die schwere Hypothennie für etwa 24 Stunden nach der Injektion der Cytokin-Mischung geschützt. Die Körpertemperatur erreichte einen anfänglichen Tiefpunkt von 35,5°C nach 12 Stunden. Zu dem Zeitpunkt war die Therapie mit dem Inhibitorprotein beendet. Die Körpertemperatur stieg während der nächsten sechs Stunden leicht an und fiel dann auf 26°C nach 36 Stunden ab. Im Verhältnis zur unbehandelten Gruppe war der Beginn der Mortalität in der behandelten Gruppe verzögert. Die ersten Todesfälle wurden 42 Stunden nach der Injektion beobachtet und erreichten nach 44 Stunden 100%.
Das dritte Experiment verlängerte die obige Therapie von 12 Stunden auf 24 Stunden nach der Cytokin-Injektion (7). Die zusätzlichen intraperitonealen Injektionen wurden 15, 18, 21 und 24 Stunden nach der Injektion der Cytokin-Mischung verabreicht. Die resultierende Gesamtdosis betrug 1000 mg/kg. Die unbehandelte Gruppe, die hrIL-1β und hrTNFα erhielt, folgte demselben Verlauf wie in dem zweiten Experiment. Die Körpertemperatur erreichte einen Tiefpunkt von 27°C nach 12 Stunden. Die Sterblichkeit begann 18 Stunden nach der Injektion und betrug 100% nach 42 Stunden (8). Im Gegensatz dazu wurde die Gruppe, die das Inhibitorprotein erhielt, gegen die schwere Hypothermie und Letalität geschützt. Die durchschnittliche Körpertemperatur fiel innerhalb von 10 Stunden nach der Cytokin-Injektion auf nur 33,5°C und stieg anschließend am Ende der Inhibitorprotein-Behandlung (7) nach 24 Stunden fast auf den Nonnalwert an. Nach 42 Stunden (18 Stunden nach Ende der Therapie) fiel die Körpertemperatur vorübergehend auf 34,5°C und blieb leicht unter normal bis 90 Stunden nach der Injektion der Cytokine. Die Sterblichkeit in dieser Gruppe betraf einen von sechsen. Der einzige Todesfall war unerklärlich. Jedoch schien das Tier durch das Experiment hindurch anomal, vielleicht wegen einer intraperitonealen Fehlinjektion. Die Körpergewichte dieser Tiere wurden aufgezeichnet, um die vollständige Heilung von dem durch Cytokin induzierten Schock festzustellen (9). In der mit dem Inhibitorprotein behandelten Gruppe fiel das Durchschnittsgewicht in 62 Stunden auf 79% des ursprünglichen Gewichtes. 200 Stunden nach der Cytokin-Injektion war jedoch das Durchschnittsgewicht auf das der Kontrollgruppe, der phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) injiziert worden war, zurückgekehrt. Die Tiere schienen normal im Verhalten und in ihrer äußeren Erscheinung. Durch Verlängerung der Therapie mit dem Inhibitorprotein um 24 Stunden waren wir in der Lage, die starke Hypothermie und Letalität, die bei dem mit Cytokin induzierten Modell des septischen Schocks bei Mäusen beobachtet wurde, rückgängig zu machen. Die Dauer und Häufigkeit der Verabreichung des Inhibitors wäre mit einer Intensivpflege für einen Patient mit septischem Schock vereinbar.
C. Kontrollen, die keine Wirkungen der Flüssigkeitstherapie und die nicht-toxische Eigenschaft des Inhibitors allein zeigen.
In den letzten drei oben beschriebenen Experimenten wurde das Inhibitorprotein (40kDa-TNF-Inhibitor Δ53) in Volumina von 200 bis 300 μl pro Injektion verabreicht. Es war möglich, dass das Flüssigkeitsvolumen des Inhibitorproteins selbst eine Therapie beeinträchtigen könnte. Um diese Möglichkeit zu prüfen, wurden die Hypothermie und Letalität in einer Gruppe von Mäusen, die nur die Cytokine erhielt, und einer zweiten Gruppe, die Cytokine plus die intraperitoneale Injektion von PBS in Volumina und Häufigkeiten erhielt, die mit der mit Inhibitor behandelten Gruppe identisch war (5), verglichen. Es wurden keine bedeutenden Unterschiede in Hypothermie oder Sterblichkeit beobachtet. In den folgenden Experimenten wurde PBS intraperitoneal an die unbehandelten Mäuse mit Cytokin-Schock verabreicht.
Eine gesonderte Kontrolle wurde eingeschlossen, um die Wirkungen des Inhibitorproteins allein zu ermitteln. In allen Experimenten wurde einer Gruppe von Mäusen nur das Inhibitorprotein in identischen Volumina und Häufigkeiten injiziert, wie sie der behandelten Gruppe mit Cytokin-Schock verabreicht wurden. Es wurde keine Sterblichkeit oder Veränderungen der Körpertemperatur in den Inhibitorprotein-Kontrollgruppen beobachtet (3,5,7).
Beispiel 2: Darstellung der protektiven Wirkungen des menschlichen rekombinanten 30kDa-TNF-Inhibitors in einem Maus-Modell des Cytokin-induzierten septischen Schocks.
A. Protokoll für die Induktion des septischen Schocks in der Maus
Dasselbe Maus-Modell des in Beispiel 1 beschriebenen septischen Schocks wurde verwendet, um die therapeutische Wirksamkeit des 30kDa-TNF-Inhibitors zu zeigen. Der letale Schock wurde bei weiblichen C57B1/6-Mäusen, die 8-12 Wochen alt waren und 18-21 Gramm wogen, durch die kombinierte subkutane Verabreichung von 300 μg/kg hrTNFα und 2500 μg/kg hrIL-1β induziert. Die Sterblichkeit war bei diesen Dosen 100%. Die Cytokine wurden als einzelner subkutaner Bolus in den Nacken verabreicht.
In diesem Beispiel wurde eine Abnahme der Körpertemperatur als messbarer Indikator für die Schwere des induzierten Schocks verwendet. Der Grad der Hypothermie korrelierte direkt mit der Schwere der klinischen Zeichen (d.h. Zittern, Lethargie, Verlust der Hautelastizität, gekrümmte Haltung). Nach der kombinierten Verabreichung von hrTNFα und hrIL-1β fiel die Körpertemperatur etwa 15 Stunden nach der Injektion von einem normalen Wert von 39°C bis auf 28°C ab (2). Die Temperatur wurde mit einem First Temp^® Infrarot-Handscanner (Intelligent Medical Systems, Carlsbad, CA) bestimmt. Im Gegensatz dazu verursachten Injektionen von entweder hrTNFα oder hrIL-1β allein keinen ähnlichen Grad der Hypothermie und waren ohne letale Wirkungen (2). Der menschliche rekombinante 30kDa-TNF-Inhibitor, der in diesem Experiment verwendet wurde, wurde gemäß den in der Patentanmeldung von Brewer et al. beschriebenen Verfahren hergestellt.
B. Wirkungen des 30kDa-TNF-Inhibitors auf den Cytokininduzierten septischen Schock
Ein Inhibitorprotein (in diesem Beispiel der 30kDa-TNF-Inhibitor) wurde einer Gruppe von 8 Mäusen intraperitoneal mit 40 mg/kg pro Injektion in Zeiträumen von entweder 12, 24 oder 39 Stunden nach der subkutanen Verabreichung von hrTNFα und hrIL-1β appliziert. Die erste Gruppe, die eine Maus enthielt, wurde mit dem Inhibitorprotein 30 Minuten vor und 30 Minuten, 3 Stunden, 6 Stunden, 9 Stunden und 12 Stunden nach der Injektion der Cytokine behandelt. Diese Maus erhielt eine Gesamtdosis von 240 mg/kg des Inhibitorproteins, die in 6 Injektionen verabreicht wurde. In der nächsten Gruppe wurde die Behandlung mit den zusätzlichen, in 3-Stunden-Intervallen gegebenen Injektionen auf weitere 12 Stunden ausgedehnt. Jede der drei Mäuse in dieser Gruppe erhielt während der 24-Stunden-Periode eine Gesamtmenge von 400 mg/kg des Inhibitorproteins, die in zehn Injektionen appliziert wurde. In der nächsten Gruppe wurde die Behandlung mit den verabreichten Injektionen, die wieder in 3-Stunden-Intervallen gegeben wurden, auf zusätzliche 15 Stunden ausgedehnt. Jede der vier Mäuse in dieser Gruppe erhielten während der 39-Stunden-Periode eine Gesamtmenge von 600 mg/kg, die in 15 Injektionen verabreicht wurde.
Die Körpertemperatur (10) und die Sterblichkeit (11) wurden bei den behandelten und unbehandelten Mäusen verfolgt. Die Durchschnittstemperatur der unbehandelten Mäuse fiel nach 12 Stunden auf 27°C und blieb auf diesem niedrigen Wert, bis die Mäuse 36 bis 42 Stunden nach der Verabreichung der Cytokine starben. Im Gegensatz dazu war die Körpertemperatur der Mäuse in allen drei Behandlungsgruppen nur mäßig erniedrigt, und alle Mäuse überlebten den Cytokin-induzierten Schock. Während der ersten 24-Stunden-Periode nach der Verabreichung der Cytokine fiel die Körpertemperatur in allen drei Gruppen 2 bis 4°C in 12 Stunden und kletterte dann in 24 Stunden auf die normale Temperatur. Danach wurde die Temperatur in den Gruppen, die entweder 24 Stunden oder 39 Stunden eine Inhibitorprotein-Behandlung erhielten, auf normalen Werten gehalten, wobei die Temperatur der einzelnen Maus, die nur 12 Stunden lang behandelt wurde, um 3°C auf 39°C fiel und anschließend 100 Stunden nach der Cytokin-Injektion zu einem Normalwert zurückkehrte.
Die Zeit, die nötig war, mit dem Körpergewicht auf die Werte der Zeit 0 zurückzukehren, wurde ebenso als Kennzeichen der Erholung nach einem Cytokin-induzierten Schock verwendet (12).
Die Körpergewichte der Mäuse, die mit dem Inhibitorprotein entweder 24 oder 39 Stunden lang behandelt wurden, fielen nach 60 Stunden auf 86% der Werte zur Zeit 0 und kehrten dann nach 140 Stunden auf normale Werte zurück. Das Körpergewicht der einzelnen Maus, die 12 Stunden lang mit dem Inhibitor behandelt wurde, erreichte einen Tiefpunkt von 81 % zu einer etwas späteren Zeit, nach 75 Stunden, erlangte aber den Wert zur Zeit 0 nach etwa 140 Stunden; zum selben Zeitpunkt wie die anderen zwei Gruppen.
Der 30kDa-TNF-Inhibitor war beim Schutz der Mäuse gegen ein durch Cytokin induziertes letales septisches Schocksyndrom wirksam, wenn die Therapie in 3-Stunden-Intervallen über Zeiträume von entweder 12, 24 oder 39 Stunden nach der Injektion der Cytokin-Mischung beibehalten wurde. Eine ähnliche therapeutische Behandlung kann bei einem Patienten mit einem septischen Schock auf einer Intensivstation leicht durchgeführt werden.
Beispiel 3: Darstellung der Wirkungen des menschlichen rekombinanten 30kDa-TNF-Inhibitors auf die durch Streptokokken-Zellwand (SCW) induzierte Reaktivierung von SCW-induzierter Arthritis in Ratten.
Dieses Experiment verwendet das Modell, das bei Esser et al., Arthritis and Rheumatism, 28: 1401-1411, (1985) beschrieben wird. Dieses Modell wird kurz wie folgt zusammengefasst:
Streptokokken-Zellwand (SCW) wird intraartikulär in das Fußgelenk von Lewis-Ratten injiziert. Um eine Kontrolle bereitzustellen, wird Kochsalz in das kontralaterale Gelenk injiziert. Nach einer Zeitdauer von 20 Tagen, in denen die anfängliche Entzündung aufhört, wird SCW erneut verabreicht, diesmal durch intravenöse Injektion. Diese Dosis von SCW ist nicht ausreichend, eine Gelenkentzündung allein zu verursachen und hat daher wenig Wirkung auf das Gelenk, dem Kochsalz injiziert worden war. Im Gegensatz dazu ist diese Dosis jedoch in der Lage, die Entzündung und die Gelenkzerstörung in dem vorher mit SCW injizierten Fußknöchel zu reaktivieren. Um das Ausmaß der Entzündung zu ermitteln, die der zweiten Verabreichung von SCW folgt, werden täglich die Ausmaße des Fußgelenks gemessen.
Bezüglich der durch Streptokokken-Zellwand induzierten Arthritis erläutert R. L. Wilder in Immunopathogenetic Mechanisms of Arthritis, Kapitel 9 mit der Überschrift "Experimental Animal Models of Chronic Arthritis", dass "die klinischen, histologischen und radiologischen Kennzeichen der experimentellen Gelenkkrankheit sehr denen ähneln, die bei rheumatoider Arthritis von Erwachsenen und Jugendlichen beobachtet wurde".
Zwei Verfahren zum Behandeln von Arthritis wurden unter Verwendung des Nagetiermodells mit SCW-induzierter Arthritis durchgeführt.
Verfahren Eins: In einer Reihe von Experimenten wurde Arthritis-Ratten eine einzelne intraartikuläre Verabreichung von TNF-Inhibitor in Phosphat-gepuffertem Kochsalz (PBS) gegeben, wobei das SCW-induzierte Arthritis-Modell verwendet wurde. Arthritis wurde durch Injektion von SCW (1,8 μg Rhamnose-Äquivalent) in das linke Fußgelenk jeder Ratte am Tag 0 induziert. Dem rechten Fußgelenk wurde ein gleiches Volumen pyrogenfreies Kochsalz injiziert. Die Ausmaße der Fußgelenke wurden an den Tagen 0, 1, 2 und 7 gemessen. Die Schwellung des linken Fußgelenkes an den Tagen 1 und 2 (Tabelle 1) spiegelt die akute Phase der durch SCW induzierten Arthritis wider. Das rechte Fußgelenk, das als Kontrolle für das mechanische Trauma in Verbindung mit der intraartikulären Injektion diente, unterlag keiner bedeutenden Schwellung (Werte nicht gezeigt).
Am Tag 21, nachdem die akute Phase der Arthritis abklang, wurden die Ratten wahllos in vier Gruppen mit jeweils 9 oder 10 Ratten geteilt, betäubt und gemäß dem oben beschriebenen Protokoll injiziert. C105 ist ein Mutein des 30kDa-TNF-Inhibitors, in dem eine Aminosäurensubstitution durchgeführt wurde, um eine Stelle für die kovalente Bindung von Polyethylenglykol (PEG) zu herzustellen. In C105 wurde Asparagin an Position 105 des 30kDa-TNF-Inhibitors durch Cystein ersetzt. In dem C105-PEG 3400-Dumbbell(db)-Molekül werden zwei Moleküle C105 mit einem einzelnen PEG-Molekül mit einer ungefähren Molekülmasse von 3400 Dalton quervernetzt. Das Dumbbell-Molekül und die Pegylierungsverfahren werden ausführlicher in der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/669,862, eingereicht am 15. März 1991 mit der Überschrift "Site Specific Pegylation of Polypeptides", beschrieben. Das Verfahren zur Herstellung von C105-PEG 3400 db wird in dem nachstehenden Beispiel 5 angegeben.
Gruppe Idiente als Trägerkontrolle für die mit C105 behandelte Gruppe IV. Gruppe II diente als Trägerkontrolle für die mit C105-PEG 3400 db behandelte Gruppe III. Die intraartikulären Injektionen wurden in einem Gesamtvolumen von 10 μl über eine 25-Gauge-Nadel, die an einem automatischen Pipettiergerät befestigt war, durchgeführt. Sofort nach den intraartikulären Injektionen der verschiedenen Behandlungsarten wurde jeder Ratte intravenös SCW (150 μg Rhamnose-Äquivalent) injiziert, um die Arthritis zu reaktivieren. Den Ratten wurden keine anderen Behandlungen verabreicht. Die Durchmesser der Fußgelenke wurden an den Tagen 21, 22, 23 und 24 gemessen.
Wie erwartet schwollen die linken Fußknöchel der Ratten in allen Gruppen als Reaktion auf die intravenöse Injektion von SCW am Tag 21 an (Tabelle 1 und 13). Jedoch unterschied sich die Reaktion deutlich zwischen den Behandlungsgruppen. Während die Gelenke der Ratten in den Kontrollgruppen I und II um 30% beziehungsweise 32% ihrer anfänglichen Ausmaße anschwollen, nahmen die entsprechenden Gelenke in der mit C105-PEG-3400-db behandelten Gruppe III nur um 15% und in der mit C105 behandelten Gruppe IV um 25% zu. In 14 ist die maximale Zunahme des Gelenkdurchmessers während des 72-Stundenintervalls nach der mit SCW induzierten Reaktivierung für die Gruppen I, II, III und IV graphisch dargestellt. Eine einzelne intraartikuläre Injektion von C105-PEG 3400 db verursachte eine statistisch signifikante Abnahme der Schwellung der arthritischen Gelenke.
Verfahren Zwei: In einer zweiten Reihe von Experimenten wurde arthritischen Ratten 30kDa-TNF-Inhibitor in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mehrfach subkutan verabreicht, wobei dasselbe SCW-Arthritis-Modell verwendet wurde. Arthritis wurde durch Injektion von SCW in das linke Fußgelenk jeder Ratte am Tag 1 (1,8 μg Rhamnose-Äquivalent) induziert und in das rechte Fußgelenk ein gleiches Volumen pyrogenfreies Kochsalz injiziert.
Am Tag 21, nach Abklingen der akuten Arthritis, wurden die Ratten willkürlich in vier Gruppen aufgeteilt. Jeder Ratte wurde intravenös eine zweite Dosis SCW (150 μg Rhamnose-Äquivalent) injiziert, um die Arthritis zu reaktivieren. Innerhalb von drei Minuten nach der Injektion von SCW wurden die neun Ratten in der Kontrollgruppe I mit PBS behandelt, und die jeweils fünf Ratten in den Gruppen II, III und IV wurden mit 1, 3 beziehungsweise 9 mg pro kg Körpergewicht 30kDa-TNF-Inhibitor in PBS behandelt. Subkutane Injektionen von PBS in Gruppe I oder 30kDa-TNF-Inhibitor in die Gruppen II, III und IV (1, 3 beziehungsweise 9 mg/kg) wurden wieder zwei und sechs Stunden nach SCW-Verabreichung gegeben und während der sich anschließenden 42-Stunden-Periode alle 6 Stunden wiederholt. Die Durchmesser der Fußgelenke wurden 0, 24, 39, 48, 60 und 72 Stunden nach der intravenösen Injektion von SCW gemessen.
15 und Tabelle 2 zeigt die maximalen Änderungen der Gelenkdurchmesser während der 72-Stunden-Periode nach der durch SCW induzierten Reaktivierung von Arthritis in den vier experimentellen Gruppen. Wie erwartet schwollen die Fußgelenke in der mit Kochsalz behandelten Gruppe I als Reaktion auf die intravenöse Injektion von SCW an. Die maximale Schwellung in den Gruppen II, III und IV war jedoch um 58%, 85% beziehungsweise 75% reduziert. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der statistischen Auswertung der Werte von 15 unter Verwendung des t-Testes an Mittelwerten, die einer logarithmischen Transformation unterzogen worden sind.
Beispiel 4: Darstellung der Wirkungen des menschlichen rekombinanten 30kDa-TNF-Inhibitors auf die durch Endotoxin in Ratten induzierte akute Lungenschädigung als Verfahren zur Behandlung des Atemnotsyndroms (ARDS) bei Erwachsenen
Dieses Experiment verwendet einen septischen Stimulus, Endotoxin, um eine akute von Neutrophilen vermittelte Lungenschädigung zu induzieren gemäß dem Modell, das bei Ulich, et al. American Journal of Pathology 138: 1485-1496 (1991) beschrieben ist. Dieses Modell wird kurz wie folgt zusammengefasst: Endotoxin wird intratracheal in den mittleren Halsanteil der Luftröhre betäubter Ratten injiziert. Nach einem Latenzzeitraum von sechs Stunden wird eine bronchoalveolare Spülung (BAL) der Lungen als Abschlussverfahren durchgeführt. Von der BAL-Flüssigkeit wird ein Gesamt- und Differentialblutbild der weißen Blutkörperchen angefertigt. Die intratracheale Injektion von pyrogenfreier Kochsalzlösung ergibt eine BAL-Flüssigkeit mit einer geringen Zahl überwiegend alveolärer Makrophagen (etwa 99%). Die intratracheale Injektion von Endotoxin verursacht eine große Zunahme der Anzahl von BAL-Zellen und ein Vorherrschen der Neutrophilen. Das akute neutrophile Eindringen in die Alveolarräume erreicht seinen höchsten Wert nach 6 bis 12 Stunden und wird von einer Akkumulation proteinhaltiger oedematöser Flüssigkeit in den Alveolarräumen begleitet. TNF wird für einen der Mediatoren von durch Endotoxin induzierter Alveolitis gehalten. TNF ist in der BAL-Flüssigkeit nach der Stimulation mit Endotoxin vorhanden. Der alveoläre Makrophage wird für den Ort seiner Synthese gehalten. Außerdem induziert die intratracheale Injektion des exogenen TNF ein akutes intraalveoläres, neutrophiles Exsudat, das dem durch Endotoxin induzierten qualitativ ähnlich ist.
Obgleich von den Tiermodellen nicht angenommen wird, dass sie die menschlichen Krankheiten exakt widerspiegeln, besonders den Übergang von den akuten in die chronischen Phasen der ARDS, werden viele Tiermodelle verwendet, die dem veränderten Lungenödem, der Sequestrierung von Leukozyten und der Hypoxämie während der akuten Phase der parenchymalen Lungenschädigung im Verlauf des ARDS nahekommen. J. F. Murray et al., Am. Rev. of Respiratory Disease, Bd. 138, S. 720-723 (1991). Die akuten Formen von ARDS treten in Gegenwart bestimmter identifizierbarer Risikofaktoren wie Sepsis, Aspiration oder mehrfache Bluttransfusionen ein. Laufende Untersuchungen unterstreichen die zentrale Rolle der von Neutrophilen ausgelösten Schädigung in der Pathophysiologie von ARDS (Tate, R.M. Am. Rev. Resg. Dis. 128: 552-559 (1983)). Von den toxischen Produkten, die durch die aktivierten Neutrophilen freigesetzt werden, nimmt man an, dass sie die alveoläre Kapillarmembran schädigen. Die Permeabilität der geschädigten Membran ist stark erhöht, wobei die Bewegung der Plasmaproteine und entzündlichen Zellen, in die Alveolarräume stimuliert wird. In einem experimentellen Schaf-Modell für ARDS septischen Ursprungs schützte eine Neutrophilenverarmung vor der Entwicklung einer Lungenschädigung (Heflin, A.C. J. Clin. Invest, 68: 1253-1260 (1981)).
Es wurde ein Verfahren zur Behandlung von neutrophiler Alveolitis in Ratten mittels intratrachealer Verabreichung eines 30kDa-TNF-Inhibitors in PBS durchgeführt. Eine Lungenschädigung wurde durch das Verabreichen von Endotoxin (5 μg pro Ratte) in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml sterilem PBS durch eine 27 Gauge-1/2 Inch- Nadel induziert, die zwischen den Trachealringen in dem chirurgisch freigelegten mittleren Halsbereich der Luftröhre eingeführt wurde. Der Impfstoff wurde langsam in die Luftröhre verabreicht, während die Geschwindigkeit und die Tiefe der Atmung der Ratte überwacht wurden. Sechs Stunden später wurden die Ratten mit Isofluran betäubt, so dass eine Laparotomie durchgeführt werden konnte, um die Spülung der Lungen zu vereinfachen. Die kaudale Hohlvene wurde abgetrennt, um den Blutgehalt der Lungen zu verringern. Das Zwerchfell wurde geöffnet, damit die Lungen während der Spülung expandieren konnten. Eine BAL wurde durch Injektion von 40 ml Hank's im Gleichgewicht befindlicher Salzlösung in die Bronchoalveolarräume über einen Angiocath-Katheter durchgeführt, der an der Stelle eines Luftröhrenschnittes im mittleren Halsbereich eingesetzt und befestigt wurde. Der entzündliche zelluläre Zufluss wurde aus dem Pellet wiedergewonnen, der durch 15-minütige Zentrifugation der BAL-Flüssigkeit bei 1500 Upm erhalten wurde. Die Gesamtzahl der Leukozyten wurden in einem Coulter-Zählapparat gezählt. Der Prozentsatz der polymorphkernigen Neutrophilen wurde bestimmt, indem eine differentielle Zellzählung per Hand auf einem Objektträger mit gefärbten Zellen durchgeführt wurde.
Die Wirkungen des 30kDa-TNF-Inhibitors auf den durch Endotoxin stimulierten Zellzufluss in die Bronchoalveolarräume wurden durch die gleichzeitige Verabreichung des 30kDa-TNF-Inhibitors und die intratracheale Eintröpfelung von Endotoxin bestimmt. Der 30kDa-TNF-Inhibitor wurde in Dosen von 1 bis 10 μg pro Ratte getestet. Der 30kDa-TNF-Inhibitor verminderte bei einer Dosis von 1 μg/Ratte den Zufluss der Neutrophilen in die Alveolarräume nicht. Jedoch verursachte die intratracheale Verabreichung des 30kDa-TNF-Inhibitors bei Dosen zwischen 2,5 μg bis 10 μg pro Ratte einen maximalen Rückgang im Zufluss der Neutrophilen in die Alveolarräume. Verglichen mit dem neutrophilen Zufluss bei unbehandelten Ratten betrug die prozentuale Hemmung des zellulären Zuflusses in diesen mit dem 30kDa-TNF-Inhibitor behandelten Ratten ungefähr 35% (16). Die Gesamtzahl der Neutrophilen, die sich in den Bronchoalveo larräumen befanden, war in Ratten, die mit 2,5 bis 10 μg 30kDa-TNF-Inhibitor pro Ratte behandelt worden waren (17 und Tabelle 3), deutlich vermindert.
Beispiel 5: Herstellung von C105-PEG 3400 db
C105-PEG-db-Verbindungen wurden durch die Reaktion von Cystein-haltigem Mutein des 30kDa-TNF-Inhibitors C105 mit PEG-bis-Maleimid hergestellt. Um das PEG-bis-Maleimid herzustellen, wurde PEG-Tresylat aus PEG-bis-Diol hergestellt, wie es von Nilson und Mosbach in Methods in Enzymology, Bd. 104, S. 56-69, Academic Press, Inc., New York, NY (1984) beschrieben wird. Die Menge des sulfonierten Zwischenproduktes wurde durch Elementaranalyse für Fluor bestimmt. Dieses Zwischenprodukt wurde in das Phthalimid-Derivat überführt, das anschließend mit Hydrazinhydrat zu dem PEG-bis-Amin-Zwischenprodukt reduziert wurde. Diese zwei Reaktionen wurden mit dem Verfahren durchgeführt, das bei Pillai, et al., J. Org. Chem., Bd. 45, S. 5364-5370 (1980) beschrieben wird. Die Menge jedes Zwischenproduktes wurde durch die Elementaranalyse für Stickstoff ermittelt. Außerdem wurde die Menge von PEG-bis-Amin durch die Reaktion mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure bestimmt. Die PEG-bis-Aminderivate wurden durch die Reaktion mit Maleinsäureanhydrid in Abwandlung des Verfahrens von Butler und Hartley, in Methods in Enzymology, Bd. XXV, S. 191-199, Academic Press, Inc., New York, NY (1972), und durch die Cyclisierung des Zwischenproduktes unter Verwendung des Verfahrens, das bei Wunsch, et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Bd. 366, S. 56-61 (1985) beschrieben wird, in die entsprechenden Bis-Maleimidprodukte überführt.
Der Mutein-C105-30kDa-TNF-Inhibitor wird hergestellt, wie in der U.S. Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/669,862, eingereicht am 15. März 1991, beschrieben. 2-3 mg/ml C105-30kDa-TNF-Inhibitor werden 2 Stunden lang mit einem 4-fachen molaren Überschuss Dithiothreitol (DDT) bei Umgebungstemperatur behandelt. Das Mutein wird dann 3 Stunden lang gegen entgastes 50 mM HEPES pH 7,0 bei 4°C dialysiert. Um die Dumbbell-Verbindung herzustellen – die als ein mit Polyethylenglykol (PEG)-vernetztes Dimer betrachtet werden kann – wird das dialysierte Mutein mit der PEG-bis-Maleimid-Spezies umgesetzt. Das Verhältnis von Mutein zu PEG-bis-Maleimid variiert in Abhängigkeit von der Molekularmasse der PEG-Verbindung. Für das PEG-bis-Maleimid mit einem Molekulargewicht von etwa 1900 wurde ein molares Verhältnis von 1 zu 1 verwendet, während für PEG-Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 3400 oder 20000 ein molares Verhältnis von Mutein zu PEG-Verbindung von 2 zu 1 benutzt wurde. Die Reaktionen werden 3-12 Stunden lang bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die mit PEG vernetzten Dimere von unpegyliertem Mutein und PEG-Muteinmonomeren unter Verwendung von MONO-S FPLC in 50 mM HOAc pH 4,0 gereinigt, wobei ein 260 mM, 310 mM und 350 mM NaCl-Stufengradient verwendet wurde. Die Dumbbell-Verbindungen werden an der 310 mM NaCl-Stufe eluiert. Restliches unpegyliertes Mutein wurde durch Chromatographie auf Superdex 75 entfernt. C105-PEG 3400 db bezeichnet eine Dumbbell-Verbindung (ein PEG-vernetzter TNF-Inhibitor-Dimer), wobei der TNF-Inhibitor das C105-Mutein des 30kDa-TNF-Inhibitors ist und die PEG-Einheit eine Molekularmasse von etwa 3400 Dalton hat.
Obgleich die vorliegende Erfindung in Verbindung mit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht sich, dass Fachleute in der Lage sind, Modifikationen und Veränderungen durchzuführen, ohne von dem Anwendungsbereich und Charakter der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Daher soll die vorhergehende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform nicht in einem einschränkenden Sinn verstanden werden, und die vorliegende Erfindung wird am besten durch die folgenden Ansprüche und ihre Äquivalente erläutert.
Tabelle 2. Maximale Veränderungen des Gelenkdurchmessers während der 72-Stunden-Periode nach Reaktivierung der durch SCW induzierten Arthritis

Die Werte sind als Mittelwerte t Standardabweichung angegeben.
(* Statistisch signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe I, wie durch den ungepaarten t-Test nachgewiesen wurde, durchgeführt an Mittelwerten, welche logarithmisch transformiert wurden.)

* deutlich verschieden von der unbehandelten Kontrollgruppe, wie durch den ungepaarten t-Test nachgewiesen wurde.

Claims

Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen TNF-Inhibitor, der durch die Addition eines aus einer sich wiederholenden Komponente gebildeten Polymer-Materials mit hohem Molekulargewicht modifiziert ist, um eine physiologisch verträgliche Formulierung zur verzögerten Freigabe zu bilden.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines TNF-Inhibitors, der eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus folgender Gruppe ausgewählt wird: (i) die Aminosäuresequenz des 30 kDa-Inhibitors oder eines TNF-inhibitorischen Fragments davon oder eines Muteins davon; (ii) die Aminosäuresequenz des 40 kDa-Inhibitors oder eines TNF-inhibitorischen Fragments oder Muteins davon; (iii) die Aminosäuresequenz des 40 kDa-Inhibitors Δ53 oder eines TNF-inhibitorischen Fragments oder Muteins davon; und (iv) die Aminosäuresequenz des 40 kDa-Inhibitors Δ51 oder eines TNF-inhibitorischen Fragments oder Muteins davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Osteoarthritis, Spondylitis ankylosans, Arthritis gonorrhoica, mit der Reiter-Krankheit assoziierter Arthritis und Gicht.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der der TNF-Inhibitor einen natürlich nicht vorkommenden Cystein-Rest aufweist.
Verwendung nach Anspruch 3, bei der der natürlich nicht vorkommende Cystein-Rest an der Position 105 des 30 kDa-Inhibitors sich befindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, bei der der TNF-Inhibitor glycosyliert ist oder bei der der TNF-Inhibitor nicht glycosyliert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, bei der der TNF-Inhibitor am N-Terminus einen Methionin-Rest aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, bei der der TNF-Inhibitor durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, bei der der TNF-Inhibitor im Wesentlichen rein ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 8, bei der das Polypeptid an ein aus einer sich wiederholenden Komponente gebildetes Polymer-Material mit hohem Molekulargewicht gekoppelt ist.
Verwendung nach Anspruch 9, bei der das Polymer-Material mit hohem Molekulargewicht Polyethylenglycol ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, bei der das Arzneimittel eine pharmakologisch verträgliche Formulierung zur verzögerten Freigabe umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 11, bei der das Arzneimittel eine intraartikuläre, subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intranasale, orale oder lokale Verabreichung des TNF-Inhibitors erlaubt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 11, bei der das Arzneimittel eine kontinuierliche Infusion erlaubt.