NO316310B1 - Anvendelse av en TNF-inhibitor til fremstilling av et medikament - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en tumornekrosefaktor (TNF) inhibitor til fremstilling av et medikament for å behandle eller forebygge et utvalg TNF-medierte sykdommer

Tumornekrosefaktorer (TNF) er en klasse cytokiner produsert av mange celle-typer, inkludert monocyter og makrofager Minst to TNF er tidligere blitt beskrevet, spesielt TNF alfa og TNF beta (lymfotoksin).

Disse kjente TNF har viktige fysiologiske virkninger på et antall forskjellige malsceller som er involvert i betenn-elsesresponsen. Proteinene forårsaker både at fibroblaster og synovialceller utskiller latent kollagenase og prostaglandin E2, og forårsaker at osteocytceller stimulerer ben-resorpsjonen. Disse proteinene øker overflateadhesive egenskaper til endoteliske celler for neutrofiler De forårsaker at endoteliske celler utskiller koagulantaktivitet og reduserer deres evne til å lysere koagler. I tillegg styrer de aktiviteten til adipocyter bort fra lagring av lipidene ved å inhibere ekspresjonen av enzymet lipoprotein lipase

TNF forårsaker at hepatocyter syntetiserer en klasse av proteiner kjent som "akutt fase reaktanter" og de virker på hypothalomus som pyrogener Gjennom disse aktivitetene er det blitt oppdaget at TNF spiller en viktig rolle i en organismes respons overfor forskjellige indikasjoner så som infeksjon og skade Se for eksempel artikkelen til P J Selby et al , Lancet, februar 27, 1988, s 483, H F Starnes, Jr. et al , J Clin Invest , vol. 82, s. 1321 (1988), A Oliff et al. Cell, vol 50 s. 555 (1987), og A Waage et al., Lancet, februar 14, 1987, s 355.

En sykdom antas å være en "TNF formidlet sykdom" dersom den spontane eller eksperimentelle sykdommen er assosiert med forhøyede nivåer av TNF i kroppsvæsker eller i vev ved fokusering på sykdommen eller indikasjon i kroppen. I mange tilfeller er slike TNF medierte sykdommer også kjent for følgende ytterligere to tilstander (1) patologiske funn assosiert med sykdommen kan bli etterlignet eksperimentelt 1 dyr ved administrering av TNF og (2) patologien indusert i eksperimentelle dyremodeller av sykdommen kan bli inhibert eller unngått ved behandling med midler som inhiberer virkningen av TNF I de fleste "TNF medierte sykdommer" blir minst to av de tre betingelsene oppfylt, og i mange "TNF medierte sykdommer" er alle tre betingelsene oppfylt.

En liste med sykdommer som tilfredsstiller disse kriteriene omfatter, men er ikke begrenset til, følgende,

1) respiratonsk distressyndrom i voksne

2 ) lungefibrose

3) artritt

4) inflammatorisk mavesykdom

5) septisk sjokk

Bevis for TNF-medienngen av disse fem sykdommene vil bli presentert Dyremodeller på septisk sjokk, artritt og respiratonsk distress syndrom i voksne er velkjent og blir anvendt heri for å demonstrere evnen som TNF inhibitorer har til å behandle TNF-formidlet sykdom

Respiratonsk distressyndrom (ARDS) i voksne er kjennetegnet ved det hurtige forløpet av dyspnea, tachypnea, cyanosis, alvorlig hypoksemi, redusert lungesamsvar og øket lunge-vaskulær permeabilitet Dødeligheten ved ARDS er mere enn 50%. Risikofaktorer assosiert med utvikling av ARDS omfatter trauma, massiv blostransfusjon, disseminert intravaskulær koagulasjon, oksygentoksisitet, inhalering av toksiner og irriterende midler og systemisk reaksjon overfor sepsis, hemorragic pancreatitis, brannsår og komplikasjoner ved abdominal kirurgi En mengde mediatorer så som prosta-glandiner, leukotriener, komplement og frie oksygenradikaler er blitt implisert i årsaken til syndromet, men forskjellige behandlinger konstruert for å inhibere virkningene til spesifikke mediatorer har ikke forbedret det kliniske forløpet til ARDS Resulatetene fra dyreeksperimenteringen understøtter hypotesen om at TNF er en mediator for ARDS som følger: 1 Infusjon av TNF til rotter etterligner ARDS. Etter infusjon med TNF blir lungesamsvaret redusert, lungevann-mnholdet og cellulariteten blir øket, punkterte blødninger kan stort sett bli synlige og histologiske bevis på neutrofil trombi og diffus alveolar skade er til stede Se E. Ferrari-Baliviera et al , Arch Surg , vol 124, s 1400-1405 (1989), K J Tracey et al , Science, vol. 234, s 470-474 (1986). 2 Forbehandling av rotter med anti-TNF antiserum inhiberer induksjonen av en dyremodell for ARDS ARDS ble indusert ved hepatisk ischemi etterfulgt av reperfusjon av leveren Forhøyede sirkulerende nivåer av TNF etter reper-fusjonen ble antatt å oppstå ut fra den store massen av fikserte hepatiske makrofager Lungekapillær lekkasjer ble redusert i de behandlede rottene sammenlignet med verdiene i rotter som mottok serum uten TNF-blokkerende egenskaper. Se L. M Colletti et al., Transplantation, vol. 49, 2. 268-272

(1990 )

3. I de to kliniske studier ble TNF-konsentrasjoner målt 1 bronkie-lungesekresjoner fra pasienter med ARDS. I den første studien av fem ARDS-pasienter overskred TNF-konsentrasjonene 12,5 ng/ml TNF ble ikke detektert i kontrollprøvene I den andre studien ble betraktelige TNF-nivåer målt i bronchoalveolar utskyllingsvæske fra tre av fire pasienter med ARDS, men var under grensen for detektsjon i kontrollene. Se A B Millar et al , Lancet, vol 2, s 712-714 (1989), D J. Roberts et al , Lancet, vol 2, s 1043-1044 (1989).

Lungefibrose oppstår i løpet av sluttstadiet ved forskjellige lungesykdommer Fibrose er et resultat av veksten av fibroblaster og en økning av kollagen avsetningen innenfor alveolar veggene TNF spiller tydeligvis en hovedrolle ved utvikling av lungefibrose TNF er en vekstfaktor til normale diploide fibroblaster ved picomolare konsentrasjoner. Se B.J. Sugarman rt al., Science, vol 230, s. 943-945 (1985). Resultatene av dyreeksperimentermgen involverer lungeskade indusert av bleomycin, et chemoterapeutisk middel for cancer, som gir bevis for det forslaget. TNF-mediermg av lungefibrose blir understøttet av følgende: 1. Intravenøs infusjon av TNF induserer diffus alveolær skade med nekrose av alveolære epithelial og endothelial celler og markert fortykning av alveolære membraner Subkutan infusjon av TNF til rotter fører til en markert økning av fibroblast prolyferasjon og kollagenavsetnmg. Se K J. Tracey et al., Science vol. 234, s 470-474 (1986); P.F. PIguet et al., Int Arch. Allerg Apol Immunol. , vol. 83, s. 18

(1986) 2. Administrering av kanin anti-TNF antistoff til mus forhindret bleomycm-indusert alveolar skade, vekst av fibroblaster og kollagen avsetning. Se, Pierre F. Piguet et al , J Exp Med , vol 170, s. 655-663 (1989) 3 En vanlig ettersykdom hos pasienter som overlever ARDS er lungefibrose. I løpet av den akutte fasen til ARDS er TNF presentert i betydelige mengder i bronchoalveolar fluidet.

Artritt er en betegnelse anvendt for å beskrive forskjellige indikasjoner som er kjennetegnet ved kronisk betennelse i leddene. Inkludert i definisjonen på betegnelsen artritt er følgende: rheumatoid artritt, osteo artritt, ankyloring spondylitis, lupus erythematosus, gonococcal artritt, Reiters sykdom artritt og urinsyregikt. Bevis er presentert nedenfor for den formidlende rollen til TNF i rheumatoid artritt

Rheumatoid artritt er en kronisk autoimmun sykdom som forårsaker ødeleggelse av artikulær brusk i ledd. Synovial linningen blir kronisk betent og gjennomgår progressiv fibrocytisk vekst. In vitro aktiverer TNF både endotelet og lukocyter for å fremme lekocytadhesjon og stimulerer resorpsjonen og inhiberer syntesen av proteoglycaner i brusket. Se, JR Gamble et al , Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol., 82, s 8667-8673 (1985), J Saklatvala, Nature, vol

322, s 547-552 (1986). Disse in vitro aktivitetene tyder på at TNF kan være en formidler av leddpatologi i rheumatoid artritt. TNF-medieringen av rheumatoid artritt er understøt-tet av følgende.

1. Intra-artikulær injeksjon av TNF inn i leddene til en kanin forårsaker mnflltrermg av lekuocyter i leddene, men ikke noen proteoglycantap fra brusket. Injeksjon av sub-maksimale doser av TNF og interleukm-1 (IL-1) inn i leddet forårsaket en synergistisk akkumulering av neutrofiler Se, B. Henderson et al , Clin Exp. Immunol , vol 75, s. 306-310

(1989). I en annen serie av eksperimenter ved anvendelse av kaniner forårsaket en enkel intra-artikulær injeksjon av TNFa både cellulær innflltrering og tap av proteoglycan i brusk Nivåene av forbindelse P, et inflammatorisk neuropeptid, ble øket i synovial fluidet Se, A S Rubin et al., Arthritis and Rheumatism, vol 33, s. 1023-1028 (1990) 2. Virkningen av TNF-antistoffer på synoviol celle IL-1 produksjonen er blitt bestemt i pasienter med rheumatoid artritt Kulturer av mononukleære celler ekstrahert fra synovium eller synovial væsken til rheumatoid ledd produserer cytokmer i opp til 6 dager uten ytre stimulering I pasienter med rheumatoid artritt ble synovial celle IL-1 produksjonen i kultur betraktelig redusert av anti-TNF antistoff Disse resultatene tyder på at TNF spiller en viktig rolle ved induksjon av IL-1 i rheumatoide ledd. Se, F. M Brennan et al , Lancet vol, 2 (8657), s 244-247 (1989). 3. TNF er til stede i detekterbare nivåer i rheumatoide synovial fluider Se, F S Di Giovme et al., Ann. Rheum Dis., vol. 47, s. 768-776 (1988). Idiopatisk inflammatorisk bowel dlsease (IBD) innbefatter to syndromer ulcerativ kolititt og Chrons sykdom. Chrons sykdom er kjennetegnet ved en granulomatøs inflammatorisk reaksjon som involverer full tykkelse av veggen til terminale tarm eller tynntarm, mens ulcerativ kolititt er en uspesifikk betennelsesrespons begrenset til slimhinnen og subslimhinnen til tarmen Til tross for at det er forskjeller i patologi ved de to syndromene og etiologien til begge forblir utydelig antas det at de to sykdommene representerer variable responser overfor vev eller immunologien til et vanlig etiologisk middel Forskjellige immunologiske forstyrrelser er blitt identifisert i pasienter med IBD. En hypotese går ut på at immunsystemet til pasientene reagerer unormalt eller uhensiktsmessig overfor antigener, så som bakterielle produkter, som alle vanligvis blir utsatt for Syntese av høye nivåer av TNF i tarmen kan bidra til inflammatorisk cellulær mnflltrering i IBD TNF-mediering av IBD er understøttet av følgende 1) I to studier med rotter ble nekrose av mavetarmkanalen indusert ved intravenøs bolusadmlnistrermg av TNF. Virkningene av TNF så ut til å være realtert til dose Doser som overskrider 0,6 mg/kg induserte stor og mikroskopisk nekrose av tynntarmen Tarmen utviser segmental ischemi med regioner med likefrem blødning eller nekrose. Cecum så ut til å være spesielt følsom overfor TNF. Histologiske seksjoner avlkke-nekrotisk tarmkanal viste også inflammatoriske forandringer med invasjoner av subslimhinne og muskularisslimhinnen til polymorfonukleære leukocyter. Epithelet ble denuert i en focal distribusjon i tarmen Se, X M Sun et al , J. Clin. Tracey, et al Science, vol 234, s. 470-474 (1986). 2. I Tracey studien førte infusjon av 4 mg av et nøytral-iserende monoklonalt antistoff fra mus rettet mot humant TNF til rotter 1 time før infusjon av TNF ikke til fullstendig beskyttelse av dyrene fra letale doser av TNF, men forhindret også utvikling av lesjonene som vanligvis blir indusert av

TNF.

3) Isolater fra biopsier fra barn med Chrons sykdom viste forhøyede hyppigheter av TNFoc utskillende celler i alle individer analysert med en flekk ELISA teknikk Isolater fra normale barn viste ikke denne økningen I ulcerativ kolititt hadde fire av åtte barn øket produksjon av TNFa Disse resultatene tyder på at TNFa er en viktig mediator for betennelse i menneskelig tarm. Se, T T. MacDonald, et al. Clim Exp. Immunol., (ENGLAND) vol. 81, s. 301-305 (1990)

Septisk sjokk er en tilstand assosiert med massive bakterielle invasjoner. Det antas at sjokk forårsaket av Gram negative infeksjoner dannes, i det minste delvis, av tilstedeværelsen av bakterielle endotoksiner (lipopolysakkarider) Septisk sjokk er en relativ vanlig årsak til dødelighet i sykehus For tiden er det få behandlingsmulig-heter for pasienter som lider av septisk sjokk og behandlingene som er tilgjengelige er generelt supportive av natur

Septisk sjokk erkarakterisert vedforskjellige symptomer inkludert et fall i gjennomsnittlig arterielt blodtrykk (MAP), en reduksjon i hjerteyteevnen, tachycardia, tachypnea, lacticacidemi og leukopeni Forskjellige cytokiner, inkludert TNF, har vært implikert i formidlingen av septisk sjokk til tross for at den spesifikke etiologien til sykdommen ikke er fullstendig forståelig.

Det er flere bevislinjer som tyder på at TNF kan spille en rolle i formidling av septisk sjokk 1 Administrering av TNF til dyr er blitt vist å indusere en sjokklignende tilstand. Se Everhaerdt et al., Biochem Biophys Res. Commun , vol. 163 s 378 (1989) Det er blitt vist at administrering av lipopolysakkarider til mus etterligner symptomene på septisk sjokk i dyr. Dyrene behandlet på denne måten er blitt vist å ha økte nivåer av sirkulerende TNFa Se Parillo et al., Ann Intern. Med., vol. 9, s 28-31 (1988); og Carswell et al., Proe. NA ti. Acad Sei., USA, vol 72, s 3666-3670 (1975) 2. Administrering av antistoffer mot TNFa er blitt vist å redusere de letale virkningene av høye doser av endotoksln i mus og aper. Se, Tracey et al., Nature, vol. 330, s. 662-664

(1987), Buetler et al , Science, vol. 229, s 869-871 (1985) 3 En ytterligere studie blir utført hvor blodserumet til barn som lider av Gram negativ septicemi ble analyser for TNFa konsentrasjonen Denne studien viste at forhøyede nivåer av TNFa ble funnet i 91% av pasientene som ble undersøkt. I tillegg var serum TNFa serumnivåene betraktelig høyere pasienter som døde enn i de som overlevde. Firardin et al., New England J. of Med , vol. 319, s. 397-400 (1988).

Oppfinnerene antok at forbindelser som interfererer med aktiviteten til TNF kan være effektive forbindelser for behandling av TNF-medierte sykdommer, som definert ovenfor.

Oppfinnerene identifiserte en klasse av forbindelser, referert til som TNF inhibitorer, som forhindret og behandlet TNF-medierte sykdommer I inngitte US-patentsøknad senenr. 555,274 inngitt juli 19, 1990, inkorporert heri som referanse, er en foretrukket klasse av naturlig forekommende protemholdige TNF-inhibitorer og en fremgangsmåte for fremstilling av en vesentlig mengde av den samme med en høy grad av renhet beskrevet. Ovennevnte søknad beskriver spesielt i detalj to undergrupper av TNF-inhibitorer referert til som som 30kDa TNF-inhibitor og 40kDa TNF-inhibitor. I tillegg til full-lengde 40kDa TNF-inhibitorprotelnet er to forkortede, men biologisk aktive former av 40kDa TNF-mhibitor også blitt dannet. Full-lengde 40 kDa TNF-inhibitoren er TNF-inhibitoren som har en molekylvekt på omtrent 40 kDa ifølge SDS-PAGE og som kan bli isolert fra medium kondisjonert med humane U937 celler eller fra menneskelig unn. Full-lengde 40 kDa TNF-inhibitor kan bli glykosylert som det naturlig forekommende proteinet eller ikke glykosylert som proteinet rekombinant uttrykt fra et bakterielt eksperssjonssystem. De forkortede proteinene hvor 51 og 53 karboksyl termini aminosyrer er blitt fjernet fra full-lengde proteinet er referert til som henholdsvis 40kDa TNF-inhibitor A 51 og 40 kDa TNF-inhibitor A 53. 30 kDa TNF-inhibitoren er blitt vist å halnhibisjons-aktivitet overfor TNFa. 40 kDA TNF-inhibitorer, inkludert full-lengde 40 kDa TNF-inhibitor, 40 kDa TNF-mhibitor A 51 og 40 kDa TNF-mhibitor A 53, er blitt vist å ha mhibisjons-aktivitet overfor både TNFa og TNFp.

Inngitte US-patentsøknad serienr. 07/669,862, inngitt mars 15, 1991, inkorporert heri som referanse, beskriver et antall modifiserte TNF-inhibitor arter Mutemer av TNF-inhibitorer blir danner hvor selektert aminosyreresidie(er) blir erstattet med cysteinresidier. Slike muteiner kan deretter bli sete-selektivt omsatt med funksjonaliserte polyetylenglykol (PEG) enheter for å danne TNF inhibitor PEG arter. Spesielt er en 30 kDa TNF-inhibitor mutein referert til som C105 beskrevet hvor asparagin i posisjon 105 til 30 kDa TNF-mhibitoren er erstattet med cystem I en ytterligere utførelsesform kan mutemproteinene bli omsatt med bi-funksjonaliserte PEG enheter for å danne bivalente "dumbbell" arter hvor to TNF-mhibitor muteiner er koblet via en enkelt PEG kjede

Foreliggende oppfinnelse beskriver anvendelse av en terapeu tisk effektiv mengde av en TNF-inhibitor som omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av (i) aminosyresekvensen av 30 kDa-inhlbltoren eller et TNF-mhibitonsk fragment derav eller et muteln derav; (II) aminosyresekvensen av 40 kDa-inhibitoren eller et TNF-inhibitonsk fragment eller mutein derav, (III) aminosyresekvensen av 40 kDa-inhlbltorenA53 eller et TNF-inhibitonsk fragment eller mutein derav, og (iv) aminosyresekvensen av 40 kDa-inhlbitorenA51 eller et TNF-inhibitonsk fragment eller mutein derav.

Fremgangsmåter er beskrevet for behandling og forhindring av TNF-medierte sykdommer, spesielt TNF-formidlet septisk sjokk, TNF-formidlet artritt og TNF-formidlet respiratorlsk dlstress syndrom i voksne med terapeutiske effektive mengder av TNF-mhibitorer

Foretrukne TNF-mhibitorer er naturlig forekommende proteiner og forkortede former av naturlig forekommende proteiner. De naturlig forekommende proteinene er foretrukket på grunn av at de har en relativ lav risiko for å danne uønskede bivirkninger 1 pasienter behandlet dermed. Muteiner av protein TNF-inhibitorer hvor bare et lite antall amlnosyre-residier er forskjellige fra den naturlige proteinsekvensen er også foretrukne TNF-inhibitorer.

En foretrukket klasse av TNF-inhibitorer er humane TNF-bindende proteiner Foretrukne TNF-lnhlbltorer ser ut til å være oppløselige fragmenter av TNF-reseptorproteiner. De TNF-lnhibitorene som er foretrukket ved utførelse av foreliggende oppfinnelse blir valgt fra gruppen bestående av 30 kDa TNF-inhibitor, 40 kDa TNF-mhibitor og nevnte 40 kDa TNF-mhibitor blir videre valgt fra gruppen bestående av full-lengde 40 kDa TNF-inhibitor, 40 kDa TNF-inhibitor A 51 og 40 kDa TNF-inhibitor A 53. Også foretrukket er proteiner som er blitt modifisert, for eksempel, ved tilsetning av poly etylenglykol (PEG) eller en hvilken som helst annen gjentatt polymer for å øke deres sirkulerende halveringstid og/eller økelmmunogenisiteten TNF-inhibitorer som virker som reseptor antagonister overfor TNF er også innbefattet innenfor rammen av denne oppfinnelsen.

På grunn av at produksjonen av TNF-inhibitorer kan bli oppnådd ved ekstrahering fra naturlige tilgjengelige kilder, så som ved isolering fra human urin, utgjør en foretrukket fremgangsmåte for TNF-inhibitor produksjon rekombinant DNA-teknologi. Rekombinant DNA-teknologi er delvis foretrukket på grunn av at det er mulig å danne sammenlignbare høye mengder av TNF-inhibtorer med høyere renheter.

Ytterligere foretrukne TNF-mhibitorer innbefatter muteiner av 30 kDa TNF-inhibitoren der hvor selekterte aminosyrer av 30 kDa TNF-inhibitoren er erstattet med cystem. Slike muteiner kan bli anvendt som TNF-inhibitorer, eller så kan de bli omsatt med polyetylenglykol (PEG) for å danne TNF-mhibitor PEG forbindelser, inneholdende en eller to TNF-mhibitorer pr. molekyl. I den mest foretrukne utførelses-formen er TNF-inhibitoren en bivalent art dannet i en reaksjon mellom en mutein 30 kDa TNF-inhibitor og en bifunksjonalisert PEG forløper Det foretrukne muteinet er C105 30 kDa TNF-inhibitoren, hvor residiet C105 til 30 kDa TNF-inhibitoren er erstattet med et cysteinresidie.

Det er å bemerke at begge foregående generelle beskrivelser og følgende detaljerte beskrivelse skal forklare oppfinnelsen .

Kort beskrivelse av tegningene

Fig 1 angir dødelighetsratene som en funksjon av dosen til human rekombinant mterleukin-1 beta (hrIL-lp) administrert med en konstant dose 300 pg/kg human rekombinant tumornekrosefaktor alfa (hrTNFa) Grupper på 6 mus ble dosert med forskjellige mengder hrlL-lp Dødeligheten ble vurdert 72 timer etter den subkutane injeksjonen av cytokinblandingen. De angitte verdiene er gjennomsnittlige ± standardavvik av gjennomsnittet (S.E M. ) for tre eksperimenter.

Fig 2 angir overflatetemperaturen som en funksjon av tiden etter administrering av 300 pg/kg hrTNFa og 2.500 pg/kg hrlL-lp injisert subkutant ved tiden null. Fig. 3 angir overflatetemperaturen som en funksjon av tiden som i figur 2, hvori - o - o - representerer mus gitt to intraperitoneale injeksjoner av 40 kDa TNF inhibitor A 53 30 minutter før og 30 minutter etter den subkutane administreringen av cytokinblandingen Totalt 40 kDa TNF-inhibitor A 53 som ble administrert var 200 mg/kg. " Angir statistiske signifikante forskjeller mellom TNF-inhibitor behandlede og ubehandlede cytokin-injiserte mus vurdert ifølge den uparrede t-testen (p<0,05). Fig. 4 angir dødeligheten som en funksjon av tiden i eksperimentet angitt i fig 3 Fig 5 angir overflatetemperaturen som en funksjon av tiden som i fig 2, hvor - [x] - |T| — representerer mus gitt seks mtraperetoneale injeksjoner 40 kDa TNF-inhibitor A 53 30 minutter før og 30 minutter, 3 timer, 6 timer, 9 timer og 12 timer etter administrering av cytokinblandingen. Totalt 40 kDa TNF-inhibitor A 53 som ble administrert var 600 mg/kg.<*>Angir statistiske signifikante forskjeller mellom TNF-mhibtor som er behandlet og PBS-injiserte mus vurdert ved den uparrede t-testen (p< 001). Fig 5 angir dødeligheten som en funksjon av tiden i eksperimentet angitt i fig. 5. Fig 7 angir overflatetemperaturen som en funksjon av tiden som i fig. 2, hvor - o - o - representerer mus gitt 10 intraperetoneale injeksjoner av 40 kDa TNF-inhibitor A 53 30 minutter før, og 30 minutter, 3 timer, 6 timer, 9 timer, 12 timer, 15 timer, 18 timer og 24 timer etter den subkutane administreringen av cytokinblandingen. Totalt 40 kDa TNF-mhibitor A 53 som ble administrert var 1,000 mg/kg. Fig. 8 angir dødeligheten som en funksjon av tiden til eksperimentet angitt i fig 7 Fig. 9 angit kroppsvektene som en funksjon av tiden i eksperimentet angitt i fig 7. Fig. 10 angir overflatetemperaturen som en funksjon av tiden som beskrevet i fig.2, hvori: - QJ- angir en mus gitt 6 intraperetonale injeksjoner av 30 kDa TNF-mhibtor 30 minutter før og 30 minutter, 3 timer, 6 timer, 9 timer og 12 timer etter den subkutane administreringen av cytokinblandingen (totalt 240 mg/kg); --a-a — representerer mus gitt 10 mtraperetoneale injeksjoner av 30 kDa TNF-inhibitor 30 minutter før og 30 minutter, 3 timer, 6 timer, 9 timer, 12 timer, 15 timer, 18 timer, 21 timer og 24 timer etter den subkutane administreringen av cytokinblandingen (totalt 400 mg/kg); og --o—o-- representerer mus gitt 15 mtraperetoneale injeksjoner av 30 kDa TNF-mhibitor 30 minutter før og 30 minutter, 3 timer, 6 timer, 9 timer, 12 timer, 15 timer, 18 timer, 21 timer, 24 timer, 27 timer, 30 timer, 33 timer, 36 timer og 39 timer etter subkutan administrering av cytokinblandingen (totalt 600 mg/kg) Fig. 11 angir dødeligheten som en funksjon av tiden i eksperimentet angitt i fig 10 Fig. 12 angir kroppsvekten som en funksjon av tiden i eksperimentet angitt i fig 10 Fig. 13 angir økningen i leddiameteren som en funksjon av tiden etter reaktivermg med streptococcal cellevegg (SCW) på dag 21, ifølge fremgangsmåte 1 i eksempel 3 nedenfor Fig. 14 angir maksimal forandring i leddiamteren i løpet av intervallet på 72 timer etter reaktivering med SCW i eksperimentet angitt i fig 13<*>Angir statistiske signifikante forskjeller sammenlignet med PEG 3400 kontrollgruppen ved uparret t-test, t = 4,36, p < 0,001. Fig. 15 angir maksimal forandring i leddiameteren i løpet av 72 timer intervallet etter reaktivering med SCW ifølge fremgangsmåte 2 i eksempel 3 nedenfor. Fig. 16 angir prosentandel inhibisjon av endotoksin-stimulert neutrofil influks inn i bronchoalveolare områder til 30 kDa TNF-inhibtor-behandlede rotter som beskrevet i eksempel 4 nedenfor Fig. 17 angir virkningene av intratracheal inndrypping av 5 doser av 30 kDa TNF-inhibisjon på antallet neutrofiler som migrerer inn i alveolarområdene i respons til en endotoksisk utsettning i eksperimentet angitt i fig. 16. Angir statistiske signifikante forskjeller i forhold til de ubehandlede kontrollrottene vurdert ved den uparrede t-testen, p < 0,01.

Det vil nå bli referert i detalj til de foretrukne ut-førelsesformene ifølge oppfinnelsen som sammen med følgende eksempler forklarer prinsippene ved foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse beskriver anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en TNF-inhibitor som omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av

(i) aminosyresekvensen av 30 kDa-inhibitoren eller et TNF-inhibitonsk fragment derav eller et mutein derav; (li) aminosyresekvensen av 40 kDa-inhibitoren eller et TNF-inhibitonsk fragment eller mutein derav, (ili) aminosyresekvensen av 40 kDa-InhibitorenA53 eller et TNF-inhibitonsk fragment eller mutein derav; og (iv) aminosyresekvensen av 40 kDa-inhibitorenA51 eller et TNF-inhibitonsk fragment eller mutein derav

En sykdom eller medisinsk indikasjon er betraktet å være en TNF-formidlet sykdom dersom den spontane eller eksperimentelle sykdommen er assosiert med forhøyede nivåer av TNF i kroppsvæsker eller i vev ved siden av fokuset til sykdommen eller indikasjonen i kroppen. TNF-medierte sykdommer kan også bli gjenkjent av følgende to tilstander: 1) patologiske funn assosiert med en sykdom kan bli etterlignet eksperimentelt i dyr ved administrering av TNF og 2) patologien indusert i eksperimentelle dyremodeller av sykdommen kan bli inhibert eller opphevet ved behandling med midler som inhiberer virkningen av TNF Mange TNF-medierte sykdommer tilfredsstiller to av disse tre tilstandene og andre vil tilfredsstille alle tre tilstandene. En ikke-eksklusiv liste av TNF-medierte sykdommer innbefatter respitorisk distress-syndrom i voksne, lungefibrose, artritt, inflammatonsk tarmsykdom og septisk sjokk.

Foretrukne TNF-inhibitorer er naturlig forekommende proteiner som virker som TNF-bmdende proteiner De naturlig forekommende proteinene er delvis foretrukket på grunn av at de utviser en sammenlignbar lav risiko for å produsere ufor-utsatte og uønskede fysiologiske bivirkninger 1 pasienter behandlet dermed.

I beskrivelsen er et protein "naturlig-forekommende" dersom det eller et vesentlig ekvivalent protein kan bli funnet å eksistere normalt i friske mennesker. "Naturlig forekommende" proteiner innbefatter spesielt former av proteiner som eksisterer i friske voksne som er delvis forkortede ved karboksylterminusen til slike proteiner, samt uglukosylerte former av proteinene som eksisterer i glykosylerte former i friske mennesker "Naturlig-forekommende" proteiner kan bli oppnådd ved rekomtiinante DNA-metoder samt ved isolering fra celler som ordinært produserer dem. "Naturlig-forekommende" omfatter også proteiner som inneholder en N-termmal methionylgruppe som en konsekvens av ekspresjon i E coli

"Vesentlig ekvivalent" som anvendt i beskrivelsen er definert å bety at de inneholder en meget høy grad av aminosyreresidie homologi {se generelt M Dayhoff, Atlas of Protein Sequence ans Structure, vol 5, s 124 (1972), national Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., speciflcally in-corporated herein by reference) samt at de har sammenlignbar biologisk aktivitet.

Blant de foretrukne TNF-Inhibitorene ifølge foreliggende oppfinnelse er proteiner som eksisterer in vivo som bindings-proteiner av TNF som tidligere er blitt beskrevet i en inngitt US-patentsøknad. Denne søknaden er US-patentsøknad serienr 07/555,275 inngitt juli 19, 1990, til Brewer et al., med tittelen "Tumor Necrosis Factor (TNF) Inhibitor and Method for Obtainmg the Same" Denne US-patent søknaden er spesifikt inkorporert hen som referanse.

Det er to bestemte former av foretrukne TNF-mhibitorer og hver av disse er beskrevet i ovennevnte Brewer et al søknad. Den første av disse er 30 kDa TNF-inhibitoren som er blitt identifisert i og isolert fra minst et medium kondisjonert av humane U937 celler og fra human unn 30kDa TNF-inhibitoren er på omtrent 30 kDa ifølge SES-PAGE og blir eluert fra en DEAE CL6B kolonne ved omtrent 80 millimolar NaCl i Tris buffer, pH 7,5. 30kDa TNF-inhibitoren er blitt vist å inhibere aktiviteten til TNFa og har liten virkning på aktiviteten til TNF<p>. Det naturlig forekommende proteinet blir glykosylert. Uglykosylert 30 kDa TNF-inhibitoren utviser også TNF-inhibtorisk aktivitet

Den andre formen av foretrukne TNF-inhibitorer er 40 kDa TNF-mhibitoren som også er blitt identifisert og isolert fra minst et medium kondisjonert med humane U937 celler og human urin. 40 kDa TNF-inhibitoren er omtrent 40 kDa på SDS-PAGE og eluerer fra en DEAE-kolonne bed omtrent 100 millimolar NaCl i Tris buffer, pH 7,5 40 kDa TNF-mhibtoren er blitt vist å inhibere aktiviteten til både TNFa og TNF<p>. 40 kDa TNF-mhibitoren er også et glykoprotein og det uglykosylerte proteinet utviser TNF-inhibitonsk aktivitet

Nuklemsyresekvensene til genene kodende for både 30 kDa TNF-mhibitoren og 40 kDa TNF-inhibitoren og aminosyresekvensene til begge proteinene er gitt i søknaden til Brewer et al. Foreliggende oppfinnelse omfatter uglykosylerte former av TNF-inhibitorene samt visse forkortede former av de naturlig forekommende proteinene som beskrevet nedenfor. I en ytterligere utførelsesform er TNF-inhibitorene modifisert ved kobling av en eller flere polyetylenglykol (PEG) eller andre gjentatte polymeriske deler

Tre former av 40 kDa TNF-inhibitoren er blitt produsert rekombinant ved ekspressjon i E coil. Hver av disse formene, referert til som full-lengde 40 kDa TNF-inhibitor, 40 kDa TNF-inhibitor A 51 og 40 kDa TNF-inhibitor A 53 (sammen med glykosylert full-lengde 40 kDa TNF-inhibitor isolert fra medium kondisjonert med humane U937 celler og human urin, i glykosylerte og uglykosylerte former, som alle kollektivt er referert til heri som 40 kDa YNF-inhibitor (er beskrevet i søknaden til Brewer et al. ) A 51 proteinet er en forkortet versjon av det native proteinet hvor 51 aminosyreresidiene ved karboksylterminusen til det modne proteinet er fjernet.

A 53 proteinet er en forkortet versjon av det modne proteinet hvor 53 aminosyreresidier ved karboksylterminusen til det native proteinet er fjernet Naturlig-forekommende 40 kDa TNF-inhibitor (glykosylert) og uglykosylerte inhibitorer (native, A 51 og A 53) har vesentlig samme TNF-Inhibtoriske aktivtet

Fremgangsmåtene for fremstilling av inhibitorene til Brewer et al er også beskrevet i ovennevnte søknad. En beskrevet fremgangsmåte består av isolering av inhibitorer fra forskjellige kilder, sa som human urin og medium kondisjonert med humane U937 celler. En annen beskrevet fremgangsmåte innbefatter isolering av gener som er ansvarlige for koding av inhibitorene, kloning av genet i egnede vektorer og celletyper, og uttrykking av genet for å produsere inhibitorene Den sistnevnte fremgangsmåten som er eksmpler på rekombinante DNA-metoder generelt, er en foretrukket fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse Rekombinante DNA-metoder er delvis foretrukket på grunn av at de kan oppnå sammenlignbare høyere mengder med høyere renheter

Også innbefattet innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er TNF-mhibitor muteiner og muteiner som er blitt modifisert som beskrevet i US-patentsøknad serienr. 07/669,892 inngitt mars 15, 1991 og inkorporert heri som referanse Et foretrukket mutein er 30 kDa TNF-inhibitoren hvor posisjonen 105 er en cystein. En foretrukket pegylert TNF-inhibtor er en "dumbbell" art hvor to C105 30 kDa TNF-inhibtorer er koblet til en polyetylenglykol (PEG) del. Det er mest foretrukket at PEG-kjeden har en molekylvekt på 20.000. Fremstilling av "dumbbell" forbindelsen er beskrevet i eksempel 5 nedenfor.

Ovennevnte TNF-inhibitorer er fortrinnsvis fremstilt ved ovennvente fremgangsmåte i "vesentlig ren" form. Med "vesentlig ren" menes at inhibitoren, i en umodifisert form, har en sammenlignbar høy spesifikk aktivitet Det er derimot å bemerke at derivater av TNF-inhibtorene kan ha forskjellige spesifikke aktiviteter Det er foretrukket at en terapeutisk sammensetning omfatter minst en av 30 kDa TNF-inhibtoren eller 40 kDa TNF-inhibitoren som bli administrert i en effektiv mengde til pasienter som lider av TNF-medierte sykdommer

Ytterligere TNF-inhibtorer omfatter forbindelser som kan konkurrere med TNF for TNF-reseptorsetene. Slike forbindelser omfatter reseptorantagonister. Andre TNF-inhibitorer omfatter forbindelser og proteiner som blokkerer in vivo syntesen eller den ekstracellulære frigjøringen av TNF. Slike forbindelser omfatter midler som påvirker transkriptsjonen eller translasjonen av TNF-gener eller prosessering av TNF-preproteinene.

På grunn av at det er mulig at den inhibitorlske funksjonen til foretrukne mhibtorer er meddelt av en eller flere diskrete og separerbare deler, blir det også betraktet at fremgangsmåten ifølge oppfinnelse kan bli utført ved administrering av en terapeutisk sammensetning hvor den aktive ingrediensen består av den delen (eller de delene) av en inhibtor som kontrollerer TNF-inhibisjonen.

Den terapeutiske sammensetningen blir fortrinnsvis administrert parenteralt ved injeksjon til tross for at andre effektive admmistreringsformer, så som mtraartikulær injeksjon, inhaleringsinnretninger, oralt aktive formuleringer, transdermallontoforese eller suppositorer, kommer også i betraktning En foretrukket bærer er fysiologisk saltvannsoppløsnmg, men andre farmasøytiske akseptable bærere kan også bli anvendt. I en foretrukket utførelsesform blir det betraktet at bæreren og TNF-inhibitoren utgjør en fysiologisk-kompatibel formulering med sakte frigjøring. Det primære oppløsningsmiddelet i en slik bærer kan enten være vandig eller ikke-vandig av natur I tillegg kan bæreren inneholde andre farmakologisk-akseptable eksipienter for modifisering eller opprettholdelse av pH, osmolaritet, viskositet, klarhet, farve, sterilitet, stabilitet, oppløs-nmgsrate eller lukt til formuleringen. Bæreren kan likeledes inneholde ytterligere farmakologisk-akseptable eksipienter for modifisering eller for opprettholdelse av stabiliteten, oppløsningsraten, frigjøringen eller absorpsjonen av TNF-mhibitoren Slike eksipienter er de forbindelsene som vanligvis blir anvendt for å formulere doseringer for parenteral administrasjon i enten enhetsdose eller fler-dose form

Når den terapeutiske sammensetningen er blitt formulert kan den bli lagret i sterile beholdere som en oppløsning, suspensjon, gel, emulsjon, fast stoff eller bli dehydrert eller lyofilisert pulver. Slike formuleringer kan bli lagret enten i en form som er klar til bruk eller kreve å bli rekonstituert rett før administreringen. Den foretrukne lagringen av slike formuleringer er ved temperaturer som er minst så lave som 4°C og fortrinnsvis ved -70°C. Det er også foretrukket at slike formuleringer inneholdende TNF-inhibitor blir lagret og administrert ved eller nære ved fysiologisk pH. Det er for tiden antatt at administreringen i en formulering ved høy pH (dvs. høyere enn 8) eller ved en lav pH (dvs. mindre enn 5) er uønsket

Administreringsmåten til formuleringene inneholdende TNF-mhibitoren for systemisk levering er fortrinnsvis via subkutan, intramuskulær, intravenøs, mtranasal eller vaginal eller rektal suppositorier. Administreringsmåten til formuleringene inneholdende TNF-inhibitor for lokal levering er fortrinnsvis via intraartikulær, mtratracheal eller instillasjon eller inhalasjoner til den respiratoriske kanalen I tillegg kan det være ønskelig a administrere TNF-mhibitoren til spesifiserte deler av fordøyelseskanalen enten ved oral administrering av TNF-inhibitoren i en hensiktsmessig formulering eller innretning eller via suppositorier eller enema.

I visse utførelsesformer blir administreringen utformet for å danne et forvalgt konsentrasjonsområde av TNF-inhibitoren i pasientens blodstrøm. Det antas at opprettholdelse av sirkulerende konsentrasjoner av TNF-mhibtor på mindre enn 0,01 ng pr ml plasma ikke behøver å være en effektiv sammensetning, mens den forlengede opprettholdelsen av sirkulerende nivåer over 10 >jg pr. ml kan ha uønskede bivirkninger.

Et foretrukket doseringsområde for behandling av TNF-medierte sykdommer og spesielt for behandling av TNF-formidlet septisk sjokk er mellom omtrent 0,1-200 mg pr kg av pasientens kroppsvekt pr. 24 timer administrert i like doser mellom omtrent 4-15 ganger pr 24 timer Det er mere foretrukket at doseringen er mellom omtrent 0,1-100 mg pr kg av pasientens kroppsvekt pr. 24 timer administrert I like doser hver 3. time. Det er mest foretrukket at 1-50 mg pr kg av pasientens kroppsvekt pr. 24 timer blir administrert hver 3 time. Administreringen fortsetter i 12-60 timer. I et mest foretrukket regime vil administreringen fortsette i minst 24 timer. Dosermgsfrekvensen og den optimale dosen vil avhenge av farmakokinetiske parametere til TNF-inhibitoren i formuleringen som blir anvendt.

I en ytterligere foretrukket måte for behandling av TNF-medierte sykdommer og spesielt for behandling av TNF-formidlet septisk sjokk, blir en opprinnelig intravenøs bolus injeksjon av TNF administrert etterfulgt av en kontinuerlig intravenøs infusjon av TNF-inhibitoren helt til sirkulerende TNF nivåer ikke lenger er forhøyede. Serum TNFa-nivåene kan bli bekreftet ved kommersielt tilgjengeligelmmunoanalyse-testkit Initiering av behandlingen for TNF-formidlet septisk sjokk bør bli påbegynt under en hvilken som helst behand-lingsmåte, så fort som mulig etter septisemi eller at sjanse for septisemi blir diagnostisert. For eksempel kan behandlingen bli påbegynt rett etter kirurgi eller en ulykke eller en annen hendelsen som kan innbefatte risiko for å initiere septisk sjokk.

Foretrukne metoder for behandling av TNF medierte sykdommer og spesielt for behandling av TNF-formidlet artritt omfatter: 1) en enkelt intraartikulær injeksjon av TNF-inhibitor gitt periodisk etter behov for å forhindre eller behjelpe oppblussing av artritt og 2) periodiske subkutane injeksjoner av TNF-inhibitor.

Foretrukne behandlingsmetoder for TNF-medierte sykdommer og spesielt for behandling av TNF-formidlet respiratorisk distressyndrom i voksne omfatter: enkelte eller flere intratracheale administreringer av TNF-inhibitor og 2) bolus eller kontinuerlig intravenøs infusjon av TNF-inhibitor.

Det er også betraktet at visse formuleringer inneholdende TNF-inhibitor skal bli administrert oralt. TNF-mhibitoren som blir administrert på denne måten er fortrinnsvis innkapslet. Innkapslet TNF-inhibitor kan bli formulert med eller uten de bærerene som vanligvis blir anvendt i sammen-fatning av faste doseringsformer. Kapslen blir fortrinnsvis konstruert slik at den aktive delen av formuleringen blir frigjort ved det tidspunktet i mavetarmkanalen når den biologiske tilgjengeligheten er maksimal og den pre-sys-temiske degraderinger er minimalisert Ytterligere eksipienter kan bli innbefattet for å lette absorpsjonen av TNF-mhibitoren Fortynningsmidler, smaksstoffer, voks med lavt smeltepunkt, vegetabilske oljer, smøremidler, suspenderings-midler, tablettoppløsende midler og bindemidler kan også bli anvendt.

Uansett administrermgsmåte blir den spesifikke dosen beregnet ifølge den omtrentlige kroppsvekten til pasienten Ytterligere tilpasninger av beregningene nødvendig for å bestemme den hensiktsmessige doseringen for behandlingen omfattende hver av ovennevnte formuleringer blir rutinemessig utført av fagfolk innenfor dette området og hører inn under de rutinemessige oppgavene utført av disse uten unødig eksperimentering, spesielt i lys av informasjon om dosering og analyser som er beskrevet heri Disse doseringene kan bli bekreftet gjennom anvendelse av de etablerte analysene for å bestemme doseringer anvendt sammen med hensiktsmessige dose-responsdata.

Det er å bemerke at TNF-inhibitor formuleringene beskrevet heri kan bli anvendt for veterinære anvendelser samt humane anvendelser og at betegnelsen "pasient" bør bli tolket på en begrensende måte Nar det gjelder veterinær anvendelser bør doseringsområdene være som angitt ovenfor.

Det er å bemerke at anvendelsen av det som blir beskrevet i foreliggende oppfinnelse ovefor et spesifikt problem eller miljø hører inn under evnene til fagfolk innenfor dette området i lys av det som blir beskrevet heri. Eksempler på representiative anvendelser av foreliggende oppfinnelse fremgår av følgende eksempler

Følgende eksempler beskriver anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse mot en TNF-formidlet sykdom beskrevet heri Forskjellene, om noen, mellom behandling av pasienter som lider av andre TNF-medierte sykdommer fra behandling av pasienter som lider av TNF-formidlet septisk sjokk kan lett og rutinemessig bli identifisert av fagfolk innenfor dette området. Evnen til å lindre virkningene av TNF-formidlet septisk sjokk ved administrering av en TNF-inhibitor som vist i følgende eksempler viser at administrering av en TNF-lnhibitor vil være like effektivt for behandling av alle sykdommer som blir formidlet av TNF, som definert heri.

Eksempel 1 Demonstrering av de beskyttende virkningene av human rekombinant 40 kDa TNF- inhibitorA53 i en munn modell av cvtokm indusert septisk s. lokk

A Protokoll for induksjon av septisk sjokk i mus.

En modifikasjon av en munn modell av septisk sjokk utviklet av Everaerdt, et al. er blitt anvendt i dette eksempelet for a demonstrere den terapeutiske effektiviteten til TNF-inhibitoren overfor septisk sjokk Everaerdt et al Biochem. biophys Res Commun., vol. 163, s. 378 (1989), er spesifikt inkorporert hen som referanse. I denne modellen er den synergistiske virkningen av en kombinasjon av cytokiner, human rekombinant tumornekrosef aktor ot (hrTNFa) og human rekombinant interleukin-lp (hrIL-l<p>) produserer septisk sjokk i mus som erkarakterisert vedomfattende hypotermi og deretter død.

Letalt septisk sjokk ble indusert i C57B1/6 hunnmus, 8-12 uker gamle, med 18-21 g kroppsvekt, ved administrering av hrTNFa og hrIL-lp. Human rekombinant tumornekrosefaktor ble dannet generelt ifølge fremgangsmåten beskrevet i Shirai et al , Nature (1985) vol 313, s. 803-806, spesifikt inkorporert heri som referanse, se gså patentsøknaden til Brewer et al . Human rekombinant interleukin-lp ble dannet generelt ifølge fremgangsmåten beskrevet i Kronheim et al , Biotechnology (1986) vol. 4, s 1078-1082, spesifikt inkorporert heri som referanse Cytokinene ble testet for LPS ifølge fremgangsmåtene beskrevet i United States Pharmocopia XXII, national Formulary WVII, januar 1, 1990, s. 1493-1495. Injeksjoner av cytokiner ble gitt som en enkelt bolus, subkutant, på den dosale overflaten av musen, i volumer på 100 pl 40 kDa TNF-inhibi toren A 53 ble dannet ifølge den rekombinante DNA metoden beskrevet i søknaden til Brewer et al og ble gitt i multiple intraperitoneale doser, i volumer på 300 pl eller mindre pr. injeksjon

Preliminære eksperimenter ble utført for å bestemme forholdet mellom hrIL-lp og hrTNFa nødvendig for å indusere en dødelighet på 100% (figur 1) Dosene blir uttrykt som pg/kg kroppsvekt. Mens hrTNFa doseringen holdes konstant på 300 pg/kg ble økende mengder hrIL-lp tilsatt til injeksjonsbolus. Resultater gitt som pg hrIL-i<p>/kg % dødelighet var som følger 250 0, 500 10, 1500.50, 2000 67, 2500:100 Alle doser som var høyere enn 2500 pg/kg produserte 100% dødelighet. I alle påfølgende eksperimenter ble cytokinene anvendt ved 2500pg/kg hrIL-lp og 300pg/kg hrTNFa, og ble levert som en enkelt subkutan bolus på den dorsale overflaten.

Den kombinerte administreringen av hrTNFa og hrlL-l<g>forårsaket i mus en betydelig hypotermi (figur 2) og deretter død omtrent 18 til 30 timer etter injeksjonen (figur 4). I dette eksempelet ble en reduksjon i kroppstemperaturen anvendt som en målbar indikator for alvorligheten til det induserte sjokket Kroppstemperatur ble vurdert ved anvendelse av en håndholdt First Temp infrarød scanner (Intelligent medical Systems, Carlsbad, CA) Grad av hypotermi ble direkte korrelert med alvorligheten til andre kliniske tegn (dvs skjelving, lethargy, tap av hudens elastisitet, krokrygget holdning). Kroppstemperaturen til dyrene falt fra en normalverdi på 39* C til så mye som 28° C omtrent 15 timer etter injeksjonen

I kontrast til dette forårsaket injeksjoner av en av cytokinene alene ikke en lignende grad av hypotermi (figur 2) og var uten letal virkning. Enkelt bolus subkutane injeksjoner av hrIL-lp ved 2.500 jjg/kg forårsaket et forbigående fall i kroppstemperaturen til 34°C og nådde dette lavpunktet 12 til 16 timer etter injeksjonen. Ingen dødelighet ble observert hrTNFa ved 300ug/kg produserte ikke en målbar virkning på kroppstemperaturen til mus og en dødelighet ble heller ikke observert.

B. Virkninger av 40 kDa TNF-mhibitor A 53 på cytokin indusert sjokk 40 kDa TNF-inhibitoren A 53 ble administrert til mus injisert med cytokinblandingen (hrlL-lp og hrTNFa i mengdene angitt ovenfor) En serie eksperimenter ble utført hvor grupper på 6 mus ble behandlet med inhibi tor<p>rotem (i dette eksperimentet, 40 kDa TNF-mhibitor A 53) for stadig lengre perioder Mengden av mhibitorprotein pr. injeksjon ble holdt konstant, mens det totale antallet injeksjoner ble øket. Den absolutte mengden av mhibitorprotein som ble anvendt i de tre eksperimentene varierte derfor med varigheten av det terapeutiske regimet. Kroppstemperatur og dødelighet ble vurdert for hvert eksperiment.

I det første eksperimentet ble inhibtorprotein injisert intraperetonealt 30 minutter før og 30 minutter etter cytokin bolusen {figur 3) Hver injeksjon inneholdt 100 ug/kg mhibitorprotein i et 300 pl volum i totalt 200 pg/kg. Av cytonkin-sjokkede mus viste de i gruppen som mottok in-hibitorprotemet en betraktelig reduksjon av hypotermi i en

4-6 timers periode etter administrering av cytokinene sammenlignet med den ubehandlede gruppen (figur 3). Forløpet av dødeligheten ble forsinket omtrent 12 timer i den behandlede gruppen (figur 4) I begge gruppene var dødelig-heten derimot 100% 48 timer etter injeksjon.

I det andre eksperimentet ble terapien fortsatt i totalt 12 timer etter injeksjonen (figur 5) Injeksjonstidene relativt til tiden for cytokininjeksjon var -30 minutter, pluss 30 minutter, 3 timer, 6 timer, 9 timer og 12 timer. Dette regimet resulterte i en total dose av mhibitorprotein på 600 pg/kg Etter cytokin injeksjon utviklet den ubehandlede gruppen karaktertrekkene ved hypotermi med et lavpunkt på 26'C etter 15 timer. De første dødsfallene ble oppdaget etter 36 timer (figur 6) Dødeligheten var 100% etter 43 timer I kontrast til dette var gruppen behandlet med mhibitorprotein beskyttet overfor alvorlig hypertermi i omtrent 24 timer etter injeksjon av cytokinblandingen. Kroppstemperaturen nådde et innledende lavpunkt på 35,5<e>C etter 12 timer Ved dette tidspunktet var terapi med mhibitorprotein avsluttet. Kroppstemperaturen økte noe i løpet av de neste 6 timene og falt deretter til 26° C innen 36 timer. Relativt til den ubehandlede gruppen ble forløpet av dødeligheten forsinket i den behandlede gruppen. De første dødsfallene ble observert 24 timer etter injeksjon og nådde 100% innen 44 timer.

Det tredje eksperimentet økte ovennevnte regime fra 12 timer til 24 timer etter cytokin injeksjon (figur 7). De ytter ligere intraperetonale injeksjonene ble administrert 15, 18, 21 og 24 timer etter injeksjon av cytokinblandingen. Den resulterende totale doseringen var 1000 mg/kg. Den ubehandlede gruppen som mottok hrIL-lp og hrTNFa fulgte samme forløpet som i det andre eksperimentet Kroppstemperaturen nådde et lavpunkt på 27°C etter 12 timer. Dødeligheten begynte 18 timer etter injeksjon og var 100% innen 42 timer (figur 8) I kontrast til dette ble gruppen som mottok mhibitorprotein beskyttet overfor alvorlig hypotermi og dødelighet. Den gjennomsnittlige kroppstemperaturen ble redusert til bare 33,5°C innen 10 timer etter cytokin injeksjon og økte deretter til omtrent normalverdier innen 24 timer ved avslutning av inhibitorproteinbehandlmg (figur 7). Innen 42 timer (18 timer etter avslutning av terapi) ble kroppstemperaturen redusert til 34,5°C og forble til en viss grad under det normale helt til 90 timer etter injeksjon av cytokiner. Dødeligheten i denne gruppen var en 1 av 6. Det ene fatale tilfellet kunne forklares Dyret forble derimot unormal i løpet av eksperimentet og dette kan kanskje være forårsaket av feilplassering av den intraperitoneale injeksjonen Kroppsvektene til disse dyrene ble registrert for å vurdere den fullstendige helbredelsen fra det cytokm-mduserte sjokket (figur 9). I gruppen behandlet med mhibitorprotein ble gjennomsnittsvekten redusert til 39% av den opprinnelige vekten innen 62 timer. Innen 200 timer etter cytokin injeksjon hadde den gjennomsnittlige vekten gått tilbake til den til kontrollgruppen injisert med fosfatbuffret saltvann (PBS). Dyrene så ut til å ha normal adferd og var normale når det gjelder ytre utseende Ved forlenging av terapien med mhibtorprotein i 24 timer ble det mulig å reversere den uttalte hypotermien og dødeligheten som var til stede i den cytokinmduserte modellen av septisk sjokk i mus. Varigheten og frekvensen av administrasjonen av inhibitoren vil være kompatibel med den omfattende behandlingen som blir gitt til en pasient med septisk sjokk.

C Kontroller som utviser manglende virkninger av fluidterapi og den ikke-toksiske naturen til inhibitor alene.

I de siste tre eksperimentene beskrevet ovenfor ble in-hibitorprotem (40 kDa TNF-inhibitor A 53) gitt i volumer på 200 til 300 pl pr. injeksjon Det var mulig at fluldvolumet til inhibitorproteinet selv kan påvirke en terapi. For å undersøke den muligheten ble hypotermi og dødeligheten sammenlignet i en gruppe av mus som bare mottok cytokiner og en annen gruppe som mottok cytokiner pluss den intraperetoneale injeksjonen av PBS i volum og frekvenser som er identiske med den inhibltorproteinbehandlede gruppen (figur 5). Ingen signifikante forskjeller i hypotermi eller dødelighet ble observert I påfølgende eksperimenter ble PBS administrert intraperetonalt til ubehandlede cytokin sjokkbehandlede mus

En separat kontroll ble innbefattet for å vurdere virkningene av inhibtorprotein alene. I alle eksperimentene ble en gruppe mus injisert med kun mhibitorprotein i identiske volumer og frekvenser som de som ble gitt til den behandlede, cytokin-sjokkbehandlede gruppen Ingen dødelighet eller endringer av kroppstemperatur ble observert i inhibtorprotein kontrollgruppene (figurene 3, 5, 7)

Eksempel 2 Demonstrasjon av de beskyttende virkningene av human rekombinant 30 kDa TNF- inhibitorer i en munn modell av cytokin indusert septisk s. iokk

A Protokoll for induksjon av munn septisk sjokk

Den samme munn modellen av septisk sjokk beskrevet 1 eksempel 1 ble anvendt for å demonstrere den terapeutiske effektiviteten av 30 kDa TNF-mhibitoren Letalt sjokk ble indusert i C57B1/6 hunnmus, 8-12 uker gamle, med vekt på 18-21 gram ved den kombinerte subkutane administreringen av hrTNFa ved 300 pg/kg og hrIL-ip ved 2.500 pg/kg. Dødeligheten var 100% ved disse dosene. Cytokinene ble levert som en enkel subkutan bolus på baksiden av halsen

I dette eksempelet ble en reduksjon i kroppstemperaturen anvendt som en målbar Indikator for alvorligheten til det induserte sjokket Hypotermigraden korrelerte direkte med alvorligheten til de kliniske tegnene (dvs. skjelving, lethargy, tap av hudelastisiteten, krokrygget holdning) Etter den kombinerte administreringen av hrTNFa og hrIL-lP falt kroppstemperaturen fra en normalverdi på 39°C til 28<*>C innen 15 timer etter injeksjon (figur 2). Temperaturen ble vurdert med en "First Temp infrared hand held scanner"

(Intelligent Medical Systems, carlsbad, CA) I kontrast forårsaket injeksjoner av enten hrTNFa eller hrIL-lp alene ikke en lignende grad av hypotermi og var uten lethale virkninger (figur 2) Den humane rekombinante 30 kDa TNF-mhibitoren anvendt i dette eksperimentet ble dannet ifølge fremgangsmåtene beskrevet i patentsøknaden til Brewer et al.

B Virkninger av 30 kDa TNF-inhibitoren på cytokin indusert septisk sjokk

Inhibitorproteinet (i dette eksempelet 30 kDa TNF-inhibitoren) ble gitt intraperetonealt ved 40 mg/kg pr. injeksjon til en gruppe på 8 mus i perioder på enten 12, 24 eller 39 timer etter den subkutane administreringen av hrTNFa og hrlL-lp. Den første gruppen som inneholdt en mus ble behandlet med inhibtorprotein 30 minutter før og 30 minutter, 3 timer, 6 timer, 9 timer og 12 timer etter injeksjon av cytokinene. Denne musen mottok totalt 240 mg/kg av inhibitorproteinet gitt i 6 injeksjoner I den neste gruppen ble behandlingen utvidet i ytterligere 12 timer i det de ytterligere injeksjonene ble gitt i intervaller på 3 timer. De tre musene i denne gruppen mottok hver i løpet av 24 timers perioden totalt 400 mg/kg inhibtorprotein gitt i 10 injeksjoner. I den neste gruppen ble behandlingen utvidet i ytterligere 15 timer i det de tilsatte injeksjonen på ny ble gitt i intervaller på

3 timer De fire musene i denne gruppen mottok hver i løpet av perioden på 39 timer totalt 600 mg/kg gitt i 15 injeksjoner . Kroppstemperaturen (figur 10) og dødeligheten (figur 11) ble undersøkt i behandlede og ubehandlede mus Gjennomsnitts-temperaturen til de ubehandlede musene falt til 27 "C innen 12 timer og forble ved dette lave nivået helt til musene døde 36 til 42 timer etter administrering av cytokinene. I kontrast til dette ble kroppstemperaturen til musene i alle tre behandlingsgruppene bare moderat redusert og alle musene overlevde det cytokin induserte sjokket I løpet av de første 24 timene etter administrering av cytokinene falt kroppstemperaturen 2 til 4"C innen 12 timer i alle tre gruppene og ble deretter økt til det normale innen 24 timer. Deretter ble temperaturen opprettholdt ved normale nivåer i gruppene som mottok enten 24 timers eller 39 timers inhibitor protein-behandling, mens temperaturen til enkelt mus bare behandlt i 12 timer falt 3<*>C ved 39<*>C og gikk deretter tilbake til en normal verdi 100 timer etter cytokin injeksjon Tiden nødvendig for at kroppsvekten gikk tilbake til verdier for tid 0 ble også anvendt som en indeks på helbredelse etter cytoindusert sjokk (figur 12). Kroppsvektene til mus behandlet med inhibitor protein i enten 24 eller 39 timer falt til 86% av nulltidsverdiene innen 60 timer og gikk deretter tilbake til normale nivåer innen 140 timer Kroppsvekten til den enkelte musen behandlet med inhibitoren i 12 timer nådde et lavpunkt på 81% noe senere, 75 timer, men oppnådde tid nullverdien ved omtrent 140 timer som er det samme punktet som de andre to gruppene 30 kDa TNF-mhibitoren var effektiv når det gjelder å beskytte mus overfor et cytokinindusert letalt septisk sjokksyndrom når terapien ble opprettholdt ved 3 timers intervaller i perioder på enten 12, 24 eller 34 timer etter injeksjon av cytokinblandingen Et lignende terapeutisk regime kan lett bli oppnådd i en pasient med septisk sjokk ved intensiv behandling

Eksempel 3: Demonstrering av virkningene av human rekombinant 30 kDa TNF- inhibitor på Streptococcellevegg ( SCW )- indusert reaktivering av SCW- indusert artritt i rotter

Dette eksperimentet anvender modellen beskrevet i Esser, et al., Arthritis and Rheumatism, 28:1401-1411, (1985), spesifikt inkorporert heri som referanse. Denne modellen kan kort oppsummeres som følger: Streptococcellevegg (SCW) blir injisert intraartikulaert inn i ankelleddet til Lewis rotter Saltvann blir injisert inn i kontralateral leddet for å oppnå en kontroll. Etter en periode på 20 dager hvor den opprinnelige betennelsen dør hen blir SCW på ny administrert og denne gangen ved intravenøs injeksjon. Denne SCW-dosen er utilstrekkelig når det gjelder å forårsake leddbetennelse i seg selv og har derfor liten virkning på den saltvanns-Injiserte ankelen. Denne dosen kan reaktivere betennelse og leddødeleggelser i ankelen på forhånd injisert med SCW. For a vurdere grad av betennelse etter den andre administreringen av SCW blir dimensjonene av ankelleddet målt daglig.

Når det gjelder Streptococcellevegg-mdusert artritt se R L. Wilder i Immunopathogenetic Mechansims of Arthritis, kap. 9 med tittel "Experimental Animal Models of Chronic Arthritis", comments "the clmical, histological and radiological features of the experimental joint disease closely resemble those observed in adult and juvenlle rheumatoid itis".

To fremgangsmåter for behandling av artritt ble utført ved anvendelse av gnagermodellen til SCW-indusert artritt

Fremgangsmåte 1

I et sett av eksperimenter ble rotter med artritt gitt en enkelt intraartikulær administrasjon av TNF-inhibitor I forfatbuffret saltvann (PBS) ved anvendelse av sen SCW- induserte modellen til artritt. Artritt ble indusert ved injeksjon inn i hver rotte pa dag 0 i venstre ankel med SCW (1,8 pg rhamnose ekvivalens). Den høyre ankelen ble injisert med et likt vilum pyrogen-fritt saltvann. Ankeldimensjonene ble målt på dagene 0, 1, 2 og 7. Svelling av venstre ankel på dagene 1 og 2 (tabell 1) reflekterer den akutte fasen til SCW-indusert artritt Den høyre ankelen som virket som en kontroll for den mekaniske traumen assosiert med den intraartikulære injeksjonen gjennomgikk ingen signifikant svelling (data ikke vist).

På dag 21, etter at den akutte fasen til artritt opphørte ble rottene tilfeldig delt mn i fire grupper som hver inneholdt 9 eller 10 rotter og disse ble bedøvt og injisert ifølge protokollen beskrevet nedenfor C105 er et mutein av 30 kDa TNF-inhibitoren hvor en aminosyresubstitusj on ble utført for å oppnå et sete for kovalent kobling av polyetylenglykol (PEG). I C105 er asparagm blitt erstattet med cystein i posisjon 105 til 30 kDa TNF inhibtoren. I C105-PEG 3400 dumbbell (db) molekylet blir to molekyler av C105 kryssbundet med et enkelt PEG molekyl med en omtrentlig molekylvekt på 3.400 dalton Dumbell molekylet og pegy-lenngsprosedyren er fullstendig beskrevet i US-patentsøknad serienr. 07/669,862 inngitt mars 15, 1991 og har tittelen "Site Specific pegylation og Polypeptides". Denne søknaden er spesifikt inkorporert hen som referanse. Prosedyren for å produsere C105-PEG 3400 db er angitt nedenfor i eksempel 5. Gruppe I virket som bærerkontroll for den Cl05-behandlede gruppen IV Gruppe II virket som bærergruppe for C105-PEG 3400 db-behandlet gruppe III. De mtraartikulære injeksjonene ble utført i et totalvolum på 10 pl via en 25 gauge nål koblet til en automatisk pipetterer. Rett etter de mtraartikulære injeksjonene til de forskjellige behandlingene ble hver rotte injisert intravenøst med SCW (150 pg rhamnose ekvivalens) for å reaktivere artritt. Ingen andre behandlinger ble administrert til rottene Diameterene til ankelleddene ble målt på dagene 21, 22, 23 og 24

Som ventet svellet de venstre anklene til rottene i alle gruppene i respons til den intravenøse injeksjonen av SCW på dag 21 (tabell 1 og figur 13). Responsen varierte derimot betraktelig mellom behandlingsgruppene Leddene til rottene i kontrollgruppene I og II svellet med henholdsvis 30% og 32% i forhold til deres opprinnelige dimensjoner mens de tilsvarende leddene i C105-PEG 3400 db-behandlet gruppe III økte med bare 15% og i C105-behandlet grippe IV med 25%. I figur 14 er de maksimale økningene i leddiameter i løpet av 72 timer intervallet etter SCW-mdusert reaktivering grafisk fremstilt for gruppene I, II, III og IV. En enkelt mtraartikulær injeksjon av Z105-PEG 3400 db forårsaket en statistisk signifikant reduskjon 1 svellingen av artrittiske ledd

Fremgangsmåte 2

I et annet sett av eksperimenter ble artrittiske rotter gitt multiple subkutane administreringer av 30 kDa TNF-inhibitor i fosfatbuffret saltvann (PBS) ved anvendelse av samme SCW-modell for artritt. Artritt ble indusert ved injisering i hver rotte på dag 1 i venstre ankel med SCW (1,8 pg rhamnose ekvivalens) og i høyre ankel med et likt volum pyrogen-fritt saltvann

På dag 21 etter at den akutte artritt opphørte ble rottene tilfeldig delt inn i fire grupper. Hver rotte ble injisert intravenøst med en andre dose av SCW (150 pg rhamnose ekvivalens) for å reaktivere artritt. I løpet av 3 minutter etter injeksjon av SCW ble de ni rottene i kontrollgruppe I behandlet med PBS og de fire rottene i hver av gruppene II, III og IV ble behandlet med 1, 3 og 9 mg pr. kroppsvekt av 30 kDa TNF-inhibitor i PBS Subkutane injeksjoner av PBS til gruppe I eller 30 kDa TNF-mhibitor til gruppene II, III og IV (1, 3 og 9 mg/kg) ble gitt på nytt ved 2 og 6 timer etter SCW-administrermgen og ble gjentatt hver 6. time i løpet av den 42 timer lange perioden der etter. Diameterene til ankelleddene ble målt 0, 24, 39, 48, 60 og 72 timer etter den intravenøse injeksjonen av SCW

Figur 15 og tabell 2 viser de maksimale forandringene i leddiameterene i løpet av den 72 timer lange perioden etter SCW-indusert reaktivering av artritt i de fire eksperimentelle gruppene. Som ventet svellet anklene i den salt-vanns-behandlede gruppen I i respons til den intravenøse injeksjonen av SCW Den maksimale svellingen i gruppene II, III og IV ble derimot redusert med 58%, 85% og 75% Tabell 2 viser resultatene av statistisk analyse av data fra figur 15 ved anvendelse av t-testen som hadde gjennomgått en logarith-misk transformasjon

Eksempel 4 Demonstras. i on av virkningene av human rekombinant 30 kDa TNF- inhibitor på akutt lungeskade indusert av endotoksin i rotter som er fremgangsmåte for behandle respiratonsk distress syndrom i voksne f ARDS)

Dette eksperimentet anvender en septisk stimuli, endotoksin, for å indusere akutt, neutrofil-formidlet lungeskade ifølge modellen beskrevet i Ulich et al , American Journal of Pathology 138. 1485-1496, (1991), og som er spesifikt inkorporert hen som referanse. Denne modellen kan kort oppsummeres som følger endotoksin blir injisert intra-trachealt mn I den midtcervicale delen av luftrøret til bedøvde rotter. Etter en latent periode på 6 timer blir bronchoalveolar lavage (BAL) av lungene utført som en terminal prosedyre Totale og differensiale tellinger av hvite blodceller blir utført på BAL-fluidet. Intratracheal injeksjon av pyrogen-fritt saltvann tilveiebringer BAL-fluid med en hovedvekt av alveolare makrofager (omtrent 99%) i små antall Intratracheal injeksjon av endotoksin forårsaker en stor økning i antall BAL-celler og en hovedvekt av neutrofiler Den akutte neutrofile influks inn i alveolar-området topper seg etter 6-12 timer og blir ledsaget av akkumulering av den protem-inneholdende ødematøse væsken inn i alveloar-områdene. TNF antas å være en av mediatorene til endotoksin-mdusert alveolitis TNF er til stede i BAL-fluidet etter stimulering med endotoksin. Alveolarmakrofagen antas å være kilden for syntesen derav. Intratracheal injeksjon av eksogen TNF induserer et akutt intraalveolart neutrofilisk eksudat som er kvalitativt lik det som blir indusert av endotksin

Til tross for at dyremodeller ikke blir betraktet å fullstendig replikere den humane sykdommen, spesielt overgangen fra akutte til kroniske faser av ARDS, blir mange dyremodeller anvendt som approkimerer det endrere pulmonære ødemet, sekvestrenng av leukocyter og hypoksimilløpet av den akutte fasen av lungeparenchymal skade i løpet av ARDS. J.F. Murray et al., Am. Rev of Respiratory Disease vol. 138, s. 720-723 (1991). De akutte formene av ARDS oppstår 1 nærvær av visse identifiserbare risikofaktorer så som sepsis, aspirasjon eller multiple blodtransfusjoner. Gjeldende undersøkelser betoner den sentrale rollen til neutrofil-formidlet skade i patofysiologien til ARDS (Tate, R.M. Am. Rev Resp. Dis 128 552-559, (1983)). Toksiske produkter frigjort av den aktiverte neutrofilen antas å skade den alveolare kapillærmembranen Permeabiliteten til den skadede membranen blir sterkt øket og dette stimulerer bevegelsen av plasmaproteinene og inflammatoriske celler inn i alveolarområdene. I en eksperimentell ovinmodell av ARDS med septisk opprinnelse beskyttet neutrofil tapping overfor utvikling av lungeskade (Heflm, A.C. J. Clin. Invest. 68:1253-1260, {1981)"

En fremgangsmåte for å behandle neutrofilisk alveolitis i rotter ved intratracheal administrering av 30 kDa TNF-mhibitpr i PBS ble utført. Lungeskade ble indusert ved administrering av endotoksin (5 jjg pr. rotte) i et totalvolum på 0,5 ml sterilt PBS gjennom en 27 gauge 1,27 cm nål satt inn mellom trachealrmgene i den kirurgisk eksponerte midtcervicale regionen av luftrøret. Inokulumet ble administrert sakte inn i luftrøret med registrering av raten og dybden av respirasjonen til rotten. 6 timer senere ble rottene bedøvd med isofluran slik at en laparotomi kunne bli utført for å lette utskylling av lungene. Caudal vena cava ble påvirket for å redusere blodtrykket til lungene Diafragma ble åpnet for å muliggjøre at lungene ble utvidet i løpet av utskyllingen. BAL ble utført vedlnjisering av 40 ml Hanks balanserte saltoppløsning inn i bronchoalveolære områder via et angiocath kateteter som ble skutt inn i og festet ved stedet for et midtcervicalt luftrør innsnitt Inflammatorisk cellulær mfluks ble isolert fra pelleten oppnådd ved sentnfugering av BAL-fluidet ved 1500 rpm i 15 minutter Totale antall leukocyter ble opptelt på en Coulter counter Prosentandel polymorfnukleære neutrofller ble bestemt ved å utføre en differensial celletelling manuelt på et objektglass av farvede celler.

Virkningene av 30 kDa TNF-inhibitoren på endotoksin-stimulert mfluks av cellene inn i de bronchoalveolare områdene ble bestemt ved administrering av 30 kDa TNF-inhibitor samtidig med intratracheal instillasjon av endotoksin 30 kDa TNF-lnhibitor ble testet i doser varierende mellom 1 til 10 pg pr. rotte. 30 kDa TNF-inhibitoren i en dose på 1 jjg/rotte reduserte ikke mfluks til neutrofilene inn i alveolarområdene. Den intratracheale administreringen av 30 kDa TNF-mhibitoren i doser på mellom 2,5 jjg til 10 pg pr. rotte forårsaket en maksimal reduksjon i mfluks av neutrofiler inn i alveolarområdene Sammenlignet med den neutrofile mfluksen i ubehandlede rotter var prosentandel mhibisjon av den cellulære influksen i disse 30 kDa TNF-inhibitorbehandlede rottene omtrent 35% (figur 16). Det totale antallet neutrofiler til stede i bronchoalveolarområdene ble betraktelig redusert i rotter behandlet med 2,5 til 10 ug 30 kDa TNF-lnhibitor pr. rotte (figur 17 og tabell 3)

Eksempel 5: Fremstilling av C105- PEG 3400 db

C105-PEG db forbindelsene ble fremstilt ved omsetning av det cysteminneholdende mutemet av 30 kDa TNF-inhibitor C105 med et PEG-bis maleimid. For å fremstille PEG-bis maleimid ble PEG-tresylat fremstilt fra PEG-bis diol som beskrevet av Nilson og Mosbach i Methods in Enzymology, vol. 104, s. 56-69, Academic Press, Inc , New York, NY (1984) Mengden av sulfonat mellomprodukter ble bestemt ved elementanalyse for fluor Dette mellomproduktet ble omdannet til ftalimid-denvatet som deretter ble redusert med hydrazinhydrat til PEG-bis amin mellomproduktet Disse to reaksjonene ble utført ifølge fremgangsmåten beskrevet av Pillai, et al J, Org. Chem., vol 45 s 5364-5370 (1980). Mengden av hvert mellomprodukt ble vurdert ved elementanalyse for nitrogen. I tillegg ble mengden av PEG-bis-amin bestemt ved omsetning med 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre. PEB-bis-amindenvatene ble omdannet til tilsvarende bis-maleimidprodukter ved omsetning med maleinsyreanhydrider via en tilpasning av prosedyren til Butler og Hartley i methods m Enzymology, vol. XXV, s 191-199, Academic Press, Inc., New York, NY (1972), og ved syklisering av mellomproduktet ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet av wunsch, et al., Biol Chem. Hoppe-Seyler, vol 366, s. 56-61 (1985)

Muteinet C105 30 kDa TNF-inhibitoren blir fremstilt som beskrevet i US-patentsøknad senenr 07/669,862 inngitt mars 15, 1991. C105 30 kDa TNF inhibitoren i 2-3 mg/ml blir behandlet med et 4-ganger molart overskudd av dithiothreitol (DTT) i to timer ved romtemperatur. Muteinet blir deretter dialysert mot avgasset 50 mM HEPES pH 7,0 i 3 timer ved 4'C For å danne dumbbell-forbmdelsen som kan bli betraktet som en polyetylenglykol (PEG) linker dimer, blir det dialyserte muteinet omsatt med PEG-bis-malemidartene. Forholdet mellom mutein og PEG-bis-maleimid varierer avhengig av molekylmassen til PEG-forbindelsen For PEG-bis-maleimid med en molekylvekt på omtrent 1900 ble et 1 til 1 molar forhold anvendt, mens for PEG-forbindelsene med en molekylvekt på 3,400 eller 20 000 ble et 2 til 1 molart forhold av mutein til PEG-forbindelse anvendt Reaksjonene blir inkubert i 3-12 timer ved romtemperatur

Etter inkubasjon ble PEG-koblede dimerer renset fra upegylert mutein og PEG-mutem monomerene ved anvendelse av MONO-S FPLC i 50 mM HoAc pH 4,0 ved anvendelse av en 260 mM, 310mM og 350 mM NaCl trinngradient Dumbbellforbindelsene blir eluert ved 310 mM NaCl trinnet Gjenværende upegylert mutein ble fjernet ved kromatografi på superdex 75 C105-PEG 3400 db refererer til en dumbbell forbindelse (en TNF inhibitor PEG-koblet dimer) hvor TNF-mhibitoren er C105-mutemet av 30 kDa TNF-inhibitoren og PEG-enheten har en molekylvekt på omtrent 3400 dalton

Claims (12)

1 Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av en TNF-inhabitor som omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av (i) aminosyresekvensen av 30 kDa-mhibitoren eller et TNF-inhibitonsk fragment derav eller et mutein derav, (11) aminosyresekvensen Ul 40 kDa-inhibitoren eller et TNF-inhibitonsk fragment eller mutein derav, (ni) aminosyresekvensen til 40 kDa-inhibitoren A53 eller et TNF-inhibitonsk fragment eller mutein derav, og (iv) aminosyresekvensen til 40 kDa-inhibitoren A51 eller et TNF-inhibitonsk fragment eller mutem derav til fremstilling av et medikament for å behandle eller forebygge, osteoarrntt, ankyloserende spondyhtt, gonokokkartntt, Reiters sykdom artntt og unnsyregikt

2 Anvendelsen ifølge krav 1, hvor nevnte TNF-inhibitor har en ikke-naturlig forekommende cysteinrest

3 Anvendelsen ifølge krav 2, hvor den ikke-naturlige forekommende cysteinresten er i posisjon 105 til 30 kDa-inhibitoren

4 Anvendelsen ifølge ethvert av kravene 1 ti I 3, hvor TNF-inhibitoren er glykosylert eller hvor TNF-inhibitoren ikke er glykosylert

5 Anvendelsen ifølge ethvert av kravene 1 til 3, hvor TNF-inhibitoren har en methionin-rest i den N-terminale enden

6 Anvendelsen ifølge ethvert av kravene 1 til 5, hvor nevnte TNF-inhibitor blir produsert ved rekombinante DNA-metoder

7 Anvendelsen ifølge ethvert av kravene 1 Ul 6, hvor TNF-inhibitoren i det vesentlige er ren

8 Anvendelsen ifølge ethvert av kravene 1 til 7, hvor nevnte polypeptid er koblet hl et repeterende polymerenhet-matenale med høy molekylvekt

9 Anvendelsen ifølge krav 8, hvor det høymolekylærvektpolyrnere materialet er polyetylenglykol

10 Anvendelsen ifølge ethvert av kravene 1 til 9, hvor medikamentet omfatter en farmakologisk kompatibel, sakte fhgivende formulering

11 Anvendelsen ifølge ethvert av kravene 1 til 10, hvor medikamentet tillater intra-artikulær, subkutan, intramuskulær, intravenøs, intranasal, oral eller topisk administrering av TNF-inhibitoren

12 Anvendelsen ifølge ethvert av kravene 1 til 10, hvor medikamentet tillater kontinuerlig infusjon