ES2145744T5 - Procedimientos para tratar las enfermedades inducidas por el factor de necrosis tumoral. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica consistente en modificar un inhibidor del TNF mediante la adición de un radical polimérico repetitivo de alto peso molecular para formar una formulación fisiológicamente compatible de liberación lenta.

Description

Procedimientos para tratar las enfermedades inducidas por el factor de necrosis tumoral.

Antecedentes de la invención

La presente invención se relaciona, en general, con métodos para prevenir y tratar enfermedades y, más en particular, con un método para prevenir y tratar enfermedades mediadas por los Factores de Necrosis Tumoral.

Los Factores de Necrosis Tumoral (TNFs) son una clase de citokinas producidas por numerosos tipos celulares, incluidos los monocitos y los macrófagos. Se han descrito previamente al menos dos TNFs, concretamente el TNF alfa y el TNF beta (linfotoxina).

Estos conocidos TNFs tienen importantes efectos fisiológicos sobre una serie de diferentes células blanco implicadas en la respuesta inflamatoria. Las proteínas hacen que tanto los fibroblastos como las células sinoviales segreguen colagenasa latente y prostaglandina E2 y hacen que las células osteocíticas estimulen la reabsorción ósea. Estas proteínas aumentan las propiedades adhesivas de la superficie de las células endoteliales para los neutrófilos. También hacen que las células endoteliales segreguen actividad coagulante y reduzcan su capacidad para lisar coágulos. Además, redirigen la actividad de los adipocitos, alejándola del almacenamiento de lípidos mediante inhibición de la expresión de la enzima lipoproteína lipasa.

Los TNFs hacen que los hepatocitos sinteticen una clase de proteínas conocidas como "reactivos de fase aguda" y actúan sobre el hipotálamo como pirógenos. A través de estas actividades, se ha visto que los TNFs tienen una parte importante en la respuesta de un organismo a una variedad de indicaciones, tales como infección y lesión. Véanse, por ejemplo, los artículos de P.J. Selby y col., Lancet, 27 de Febrero de 1988, pg. 483; H.F. Starnes, Jr. Y col., J. Clin. Invest., vol. 82, pg. 1321 (1988); A. Oliff y col., Cell, vol. 50, pg. 555 (1987), y A. Waage y col., Lancet, 14 de Febrero de 1987, pg. 355.

Se considera que una enfermedad es una "enfermedad mediada por TNF" si la enfermedad espontánea o experimental se asocia a elevados niveles de TNF en los fluidos corporales o en los tejidos adyacentes al foco de la enfermedad o indicación dentro del organismo. En muchos casos, dichas enfermedades mediadas por TNF son también reconocidas por las dos siguientes condiciones adicionales: (1) los hallazgos patológicos asociados a la enfermedad pueden ser reproducidos experimentalmente en animales por administración de TNF y (2) la patología inducida en modelos animales experimentales de la enfermedad puede ser inhibida o abolida mediante el tratamiento con agentes que inhiben la acción del TNF. En la mayoría de las "enfermedades mediadas por TNF", se cumplen al menos dos de las tres condiciones y, en muchas "enfermedades mediadas por TNF", se cumplen las tres
condiciones.

Una lista de enfermedades que satisfacen estos criterios incluye, aunque sin limitación, las siguientes:

1)

síndrome de disfunción respiratoria del adulto,

2)

fibrosis pulmonar,

3)

artritis

4)

enfermedad inflamatoria del intestino

5)

shock séptico.

Se presentará evidencia de la mediación del TNF en estas cinco enfermedades. Son bien conocidos los modelos animales de shock séptico, artritis y síndrome de disfunción respiratoria del adulto y son aquí utilizados para demostrar la capacidad de los inhibidores del TNF para tratar la enfermedad mediada por TNF.

El síndrome de disfunción respiratoria del adulto ("ADRS") se caracteriza por la rápida aparición de dispnea, taquipnea, cianosis, hipoxemia grave, menor distensibilidad pulmonar y aumento de la permeabilidad vascular pulmonar. La mortalidad en el ARDS está por encima del 50%. Como factores de riesgo asociados al desarrollo del ARDS se incluyen traumatismos, transfusión masiva de sangre, coagulación intravascular diseminada, toxicidad del oxígeno, inhalación de toxinas e irritantes y reacción sistémica a la sepsis, a la pancreatitis hemorrágica, a las quemaduras y a complicaciones de la cirugía abdominal. Una variedad de mediadores, tales como prostaglandinas, leucotrienos, complemento y radicales de oxígeno libres, han sido implicados en la provocación del síndrome; sin embargo, diversos tratamientos diseñados para inhibir las acciones de mediadores específicos no han mejorado el curso clínico del ARDS. Los resultados de la experimentación animal apoyan la hipótesis de que el TNF es un mediador del ARDS, tal como se indica a continuación:

1. La infusión de TNF en ratas imita al ARDS. Después de la infusión con TNF, se reduce la distensibilidad pulmonar, aumentan el contenido acuoso y la celularidad pulmonar, pueden ser visibles hemorragias puntuales macroscópicamente y hay presencia de evidencia histológica de trombos neutrofílicos y lesión alveolar difusa. Véanse E. Ferrari-Baliviera y col., Arch. Surg., vol. 124, pp. 1400-1405 (1989), y K.J. Tracey y col., Science, vol. 234, pp. 470-474 (1986).

2. El pretratamiento de ratas con antisuero anti-TNF inhibía la inducción de un modelo animal de ARDS. Se indujo ARDS por isquemia hepática, seguido de reperfusión del hígado. Se supone que los elevados niveles circulantes de TNF después de la reperfusión surgen de la gran masa de macrófagos hepáticos fijados. La fuga capilar pulmonar en ratas tratadas era reducida en comparación con valores obtenidos en ratas a las que se dio suero sin propiedades bloqueantes del TNF. Véase L.M. Colletti y col., Transplantation, vol. 49, pp. 268-272 (1990).

3. En dos estudios clínicos, se midieron las concentraciones de TNF en secreciones broncopulmonares de pacientes con ARDS. En el primer estudio de cinco pacientes con ARDS, las concentraciones de TNF estaban por encima de los 12,5 ng/ml. No se detectó TNF en las muestras control. En el segundo estudio, se midieron niveles significativos de TNF en el fluido de lavado broncoalveolar de 3 de 4 pacientes con ARDS, pero estaban por debajo del límite de detección en los controles. Véanse A.B. Millar y col., Lancet, vol. 2, pp. 712-714 (1989); D.J. Roberts y col., Lancet, vol. 2, pp. 1043-1044 (1989).

Se produce fibrosis pulmonar durante la etapa final de varias enfermedades pulmonares. La fibrosis se produce como resultado del crecimiento de fibroblastos y de un aumento de la deposición de colágeno en las paredes alveolares. El TNF tiene aparentemente un papel clave en el desarrollo de la fibrosis pulmonar. El TNF es un factor de crecimiento de los fibroblastos diploides normales a concentraciones picomolares. Véanse B.J. Sugarman y col., Science, vol. 230, pp. 943-945 (1985). Los resultados de experimentación animal que implican lesión pulmonar inducida por bleomicina, un agente quimioterapéutico para el cáncer, proporcionan evidencia que apoya esta proposición. La mediación del TNF en la fibrosis pulmonar está apoyada por lo siguiente:

1. La infusión intravenosa de TNF induce lesión alveolar difusa, notablemente con necrosis de las células epiteliales y endoteliales de los alvéolos y marcado engrosamiento de las membranas alveolares. La infusión subcutánea de TNF en ratas da lugar a un marcado aumento de la proliferación de los fibroblastos y de la deposición de colágeno. Véase K.J. Tracey y col., Science, vol. 234, pp. 470-474 (1986), y P.F. Piguet y col., Int. Arch. Allerg. Apol. Immunol., vol. 83, p. 18 (1986).

2. La administración de anticuerpo anti-TNF de ratón a ratones prevenía la lesión alveolar inducida por bleomicina, el crecimiento de fibroblastos y la deposición de colágeno. Véase Pierre F. Piguet y col., J. Exp. Med., vol. 170, pp. 655-663 (1989).

3. Una secuela común de los pacientes que sobreviven al ARDS es la fibrosis pulmonar. Durante la fase aguda del ARDS, el TNF está presente en cantidades significativas en el fluido broncoalveolar.

La artritis es un término usado para describir una variedad de indicaciones que se caracterizan por inflamación crónica de las articulaciones. Incluidas dentro de la definición del término artritis están las siguientes: artritis reumatoide, osteoartritis, espondilitis anquilosante, lupus eritematosus, artritis gonocócica, artritis de la enfermedad de Reiter y gota. A continuación se presenta evidencia del papel mediador del TNF en la artritis reumatoide.

La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune crónica que produce destrucción del cartílago articular en las articulaciones. El revestimiento sinovial está crónicamente inflamado y sufre un progresivo crecimiento fibrótico. In vitro, el TNF activa tanto al endotelio como a los leucocitos para promover la adhesión de leucocitos y estimula la reabsorción e inhibe la síntesis de proteoglicanos en el cartílago. Véanse J.R. Gamble y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, pp. 8667-8673 (1985); J. Saklatvala, Nature, vol. 322, pp. 547-552 (1986). Estas actividades in vitro sugieren con fuerza que el TNF puede ser un mediador en la patología de las articulaciones en la artritis reumatoide. La mediación del TNF en la artritis reumatoide está apoyada por lo siguiente:

1. La inyección intraarticular de TNF en la articulación de un conejo causa infiltración de leucocitos en la articulación, pero no pérdida de proteoglicanos por el cartílago. La inyección de dosis submáximas de TNF e interleukina-1 (IL-1) en la articulación causaba una acumulación sinérgica de neutrófilos. Véase B. Henderson y col., Clin. Exp. Immunol., vol. 75, pp. 306-310 (1989). Por el contrario, en otra serie de experimentos utilizando conejos, una sola inyección intraarticular de TNF\alpha causaba infiltración celular y pérdida de proteoglicanos del cartílago. Los niveles de substancia P, un neuropéptido de la inflamación, estaban aumentados en el fluido sinovial. Véase A.S. Rubin y col., Arthritis and Rheumatism, vol. 33, pp. 1023-1028 (1990).

2. Los efectos de los anticuerpos TNF sobre la producción de IL-1 por las células sinoviales ha sido determinado en pacientes con artritis reumatoide. Los cultivos de células mononucleares extraídas del sinovio o del fluido sinovial de las articulaciones reumatoides producen citokinas durante hasta 6 días sin estimulación extrínseca. En pacientes con artritis reumatoide, la producción de IL-1 por las células sinoviales en cultivo era significativamente reducida por el anticuerpo anti-TNF. Estos resultados sugieren que el TNF tiene un papel fundamental en la inducción de IL-1 en las articulaciones reumatoides. Véase F.M. Brennan y col., Lancet, vol. 2 (8657), pp. 244-247 (1989).

3. El TNF está presente a niveles detectables en los fluidos sinoviales reumatoides. Véase F.S. Di Giovine y col., Ann. Rheum. Dis., vol. 47, pp. 768-776 (1988).

La enfermedad inflamatoria del intestino ("IBD") idiopática incluye dos síndromes: la colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn. La enfermedad de Crohn se caracteriza por una reacción inflamatoria granulomatosa que implica a todo el grosor de la pared del íleon terminal o del colon, mientras que la colitis ulcerativa es una respuesta inflamatoria no específica limitada a la mucosa y submucosa del colon. Aunque existen diferencias en cuanto a la patología de los dos síndromes y la etiología de ambas permanece obscura, se piensa que las dos enfermedades representan respuestas tisulares o inmunológicas variables a un agente etiológico común. Se ha identificado una variedad de trastornos inmunológicos en pacientes con IBD. Una hipótesis es que el sistema inmune de los pacientes reacciona anormal o inapropiadamente a antígenos, tales como productos bacterianos, a los que todo el mundo está habitualmente expuesto. La síntesis de elevados niveles de TNF en el intestino puede contribuir a la infiltración de células inflamatorias en la IBD. La mediación del TNF en la IBD está respaldada por lo siguiente:

1) en dos estudios con ratas, se indujo necrosis del tracto gastrointestinal por administración de bolo intravenoso de TNF. Los efectos del TNF parecían tener una relación con la dosis. Dosis superiores a 0,6 mg/kg inducían necrosis macroscópica y microscópica del intestino delgado. El intestino exhibía isquemia segmentaria, con regiones de franca hemorragia o necrosis. El ciego parecía particularmente sensible al TNF. Las secciones histológicas de tracto intestinal no necrótico también mostraban cambios inflamatorios con invasiones de la submucosa y de la muscularis mucosae por leucocitos polimorfonucleares. El epitelio había sido denudado en una distribución focal a lo largo del intestino. Véanse X.M. Sun y col., J. Clin. Invest., vol. 81, pp. 1328-1331 (1988), y K.J. Tracey y col., Science, vol. 234, pp. 470-474 (1986).

2) En el estudio de Tracey, la infusión de 4 mg de un anticuerpo monoclonal de ratón neutralizante dirigido contra el TNF humano a ratas una hora antes de la infusión de TNF no sólo protegía a los animales de dosis letales del TNF, sino que también prevenía el desarrollo de las lesiones típicamente inducidas por TNF.

3) Los aislados de biopsias de niños con enfermedad de Crohn mostraron elevadas frecuencias de células secretoras de TNF\alpha en todos los individuos estudiados con una técnica de ELISA en manchas. Los aislados de niños normales no mostraban este aumento. En la colitis ulcerativa, cuatro de ocho niños tenían una mayor producción de TNF\alpha. Estos resultados sugieren que el TNF\alpha es un importante mediador de la inflamación en el intestino humano. Véase T.T. MacDonald y col., Clin. Exp. Immunol. (ENGLAND), vol. 81, pp. 301-305 (1990).

El shock séptico es una condición asociada a invasiones bacterianas masivas. Se cree comúnmente que el shock debido a infecciones Gram negativas es producido, al menos en parte, por la presencia de endotoxinas bacterianas (lipopolisacáridos). El shock séptico es una causa relativamente común de mortalidad en el marco hospitalario. Actualmente, existen pocas opciones de tratamiento para pacientes que sufren de shock séptico y los tratamientos de los que se dispone son generalmente de soporte en cuanto a su naturaleza.

El shock séptico se caracteriza por varios síntomas, incluyendo una caída en la presión sanguínea arterial media ("MAP"), una reducción del gasto cardíaco, taquicardia, taquipnea, lactacidemia y leucopenia. Se ha implicado a diversas citokinas, incluido el TNF, en la mediación del shock séptico, aunque la etiología específica de la enfermedad no está totalmente comprendida.

Hay varias líneas de evidencia que sugieren que los TNFs pueden tener una función en la mediación del shock séptico:

1. Se ha visto que la administración de TNF a animales induce un estado de tipo shock. Véase Everhaerdt y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 163, pg. 378 (1989). Se ha visto que la administración de lipopolisacáridos a ratones reproduce los síntomas del shock séptico en los animales. Se ha visto que los animales así tratados tienen niveles aumentados de TNF alfa circulante. Véanse Parillo y col., Ann. Intern. Med., vol. 9, pp. 28-31 (1988), y Carswell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 72, pp. 3666-3670 (1975).

2. La administración de anticuerpos contra el TNF alfa ha mostrado reducir los efectos letales de altas dosis de endotoxina en ratones y monos. Véanse Tracey y col., Nature, vol. 330, pp. 662-664 (1987), y Buetler y col., Science, vol. 229, pp. 869-871 (1985).

3. Se llevó a cabo un estudio adicional en el que se analizó el suero sanguíneo de niños que padecían de septicemia por Gram negativos en cuanto a la concentración de TNF alfa. Este estudio mostró que se encontraban elevados niveles de TNF alfa en un 91% de los pacientes examinados. Además, los niveles en suero de TNF alfa eran significativamente mayores en los pacientes que murieron con respecto a los de los supervivientes. Firardin y col., New England J. of Med., vol. 319, pp. 397-400 (1988).

Los presentes inventores se vieron conducidos a proponer que las substancias que interfieren con la actividad de los TNFs podrían ser compuestos efectivos para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF, según se ha definido con anterioridad.

Los inventores de la presente invención identificaron una clase de compuestos, a los que se hace aquí referencia como inhibidores del TNF, que previenen y tratan las enfermedades mediadas por el TNF. En la actualmente pendiente solicitud de Patente EE.UU. Nº de Serie 555.274, presentada el 19 de Julio de 1990, se describen una clase preferida de inhibidores proteicos naturales del TNF y un método para la fabricación de una cantidad substancial de los mismos con un alto grado de pureza. Concretamente, la solicitud antes mencionada describe con detalle dos subgrupos de inhibidores del TNF, a los que se hace referencia como inhibidor del TNF de 30 kDa e inhibidor del TNF de 40 kDa. Además de la proteína inhibidora del TNF de 40 kDa de longitud completa, se han producido también dos formas truncadas y aún biológicamente activas del inhibidor del TNF de 40 kDa. El inhibidor del TNF de 40 kDa de longitud completa es el inhibidor del TNF que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kDa en "SDS-PAGE" y que puede ser aislado de medio acondicionado por células U937 humanas o de orina humana. El inhibidor del TNF de 40 kDa de longitud completa puede estar glicosilado, al igual que la proteína natural; o no glicosilado, como la proteína expresada recombinantemente por un sistema de expresión bacteriano. Las proteínas truncadas, en las que se han separado 51 y 53 aminoácidos carboxilo-terminales de la proteína de longitud completa, son denominadas, respectivamente, inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta51 e inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53.

El inhibidor del TNF de 30 kDa ha mostrado exhibir actividad inhibitoria frente al TNF alfa. Los inhibidores del TNF de 40 kDa, incluyendo el inhibidor del TNF de 40 kDa de longitud completa, el inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta51 y el inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53, han mostrado exhibir actividad inhibitoria tanto frente al TNF alfa como frente al TNF beta.

La Solicitud de Patente EE.UU. actualmente pendiente Nº de Serie 07/669.862, presentada el 15 de Marzo de 1991, describe una serie de especies de inhibidores del TNF modificados. Se preparan muteínas de inhibidores del TNF en las que se substituye(n) un residuo(s) de aminoácido seleccionado(s) con residuos de cisteína. Dichas muteínas pueden ser reaccionar entonces selectivamente en cuanto a sitio con unidades de polietilenglicol (PEG) funcionalizadas para crear especies de PEG inhibidoras del TNF. Concretamente, se describe una muteína inhibidora del TNF de 30 kDa, a la que se hace referencia como C105, en la que se substituye la asparagina de la posición 105 del inhibidor del TNF de 30 kDa con cisteína. En otra realización, las proteínas muteína pueden reaccionar con unidades de PEG bifuncionalizadas para formar especies "en forma de pesa" bivalentes, donde dos muteínas inhibidoras del TNF están unidas mediante una sola cadena de PEG.

Resumen de la invención

La presente invención describe métodos para la prevención y el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF mediante administración a los pacientes que lo necesiten de un agente terapéutico. Concretamente, la invención proporciona un método para el tratamiento del shock séptico mediado por TNF mediante administración a los pacientes que lo necesiten de un agente terapéutico. También se incluyen métodos para el tratamiento de la artritis mediada por TNF y del síndrome de disfunción respiratoria del adulto mediada por TNF, mediante administración a los pacientes que lo necesiten de un agente terapéutico.

Según la presente invención, se describen métodos para el tratamiento y la prevención de enfermedades mediadas por TNF, particularmente shock séptico mediado por TNF, artritis mediada por TNF y síndrome de disfunción respiratoria del adulto mediada por TNF, con cantidades terapéuticamente efectivas de inhibidores del TNF.

Los inhibidores del TNF preferidos de la presente invención son proteínas naturales y formas truncadas de proteínas naturales. Se prefieren las proteínas naturales, ya que presentan un riesgo relativamente bajo de producción de efectos colaterales imprevistos en pacientes tratados con ellas. En algunas realizaciones de esta invención, son también inhibidores del TNF preferidos las muteínas de inhibidores proteicos del TNF en las que sólo difiere un pequeño número de residuos de aminoácido de la secuencia proteica natural.

Una clase preferida de inhibidores del TNF son las proteínas de unión a TNF humano. Los inhibidores preferidos del TNF parecen ser fragmentos solubles de proteínas receptoras de TNF. Aquellos inhibidores del TNF que resultan preferidos en la práctica de la presente invención son seleccionados entre el grupo consistente en el inhibidor del TNF de 30 kDa y el inhibidor del TNF de 40 kDa y dicho inhibidor del TNF de 40 kDa es además seleccionado entre el grupo consistente en inhibidor del TNF de 40 kDa de longitud completa, inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta51 e inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53. También se prefieren proteínas que han sido modificadas, por ejemplo, por adición de polietilenglicol (PEG) o cualquier otro polímero de repetición para aumentar su vida media circulante y/o reducir la inmunogenicidad. Los inhibidores del TNF que actúan como antagonistas de los receptores para el TNF quedan también incluidos en el alcance de esta invención.

Aunque se puede conseguir la producción de inhibidores del TNF por extracción de fuentes naturales, tal como por aislamiento de la orina humana, un método preferido de producción de inhibidores del TNF es por tecnología del ADN recombinante. Se prefiere la tecnología del ADN recombinante, en parte, por ser capaz de producir cantidades comparativamente mayores de inhibidores del TNF con purezas superiores.

Como inhibidores preferidos adicionales del TNF se incluyen muteínas de inhibidor del TNF de 30 kDa, donde los aminoácidos seleccionados del inhibidor del TNF de 30 kDa están substituidos con cisteína. Dichas muteínas pueden ser usadas como inhibidores del TNF o pueden reaccionar con polietilenglicol (PEG) para formar compuestos de inhibidor del TNF y PEG, que contienen uno o más inhibidores del TNF por molécula. En la realización más preferida, el inhibidor del TNF es una especie bivalente formada en una reacción entre un inhibidor del TNF de 30 kDa muteína y un precursor de PEG bifuncionalizado. La muteína preferida es el inhibidor de TNF de 30 kDa C105, donde el residuo 105 del inhibidor del TNF de 30 kDa está substituido con un residuo de cisteína.

Hay que entender que tanto la anterior descripción general como la siguiente descripción detallada son solamente ejemplares y explicativas y que no son restrictivas de la invención reivindicada.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 representa las tasas de mortalidad en función de la dosis de interleukina-1 beta recombinante humana (hrIL-1\beta) administrada con una dosis constante de 300 \mug/kg de Factor de Necrosis Tumoral alfa recombinante humano (hrTNF\alpha). Se dosificó a grupos de seis ratones con cantidades diferentes de hr-IL-1\beta. Se determinó la mortalidad a las 72 horas de la inyección subcutánea de la mezcla de citokinas. Los valores dados son las medias \pm el error estándar de la media ("S.E.M") para tres experimentos.

La Fig. 2 representa la temperatura superficial en función del tiempo post-administración de 300 \mug/kg de hrTNF\alpha y 2.500 \mug/kg de hrIL-1\beta inyectados subcutáneamente en el tiempo cero.

La Fig. 3 representa la temperatura superficial en función del tiempo como en la Figura 2, donde -\bullet-\bullet- representa ratones a los que se dio dos inyecciones intraperitoneales de inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53 30 minutos antes y 30 minutos después de la administración subcutánea de la mezcla de citokinas. El inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53 total administrado fue 200 mg/kg. * representa las diferencias estadísticamente significativas entre los ratones inyectados con citokinas tratados con inhibidor del TNF y no tratados, según se determina por la prueba t desemparejada (p<0,05).

La Fig. 4 representa la mortalidad en función del tiempo en el experimento representado en la Fig. 3.

La Fig. 5 representa la temperatura superficial en función del tiempo como en la Fig. 2, donde -\boxtimes-\boxtimes- representa ratones a los que se dio seis inyecciones intraperitoneales de inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53 30 minutos antes y 30 minutos, 3 horas, 6 horas, 9 horas y 12 horas después de la administración de la mezcla de citokinas. El inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53 total administrado fue 600 mg/kg. * representa las diferencias estadísticamente significativas entre los ratones tratados con inhibidor del TNF e inyectados con PBS, según se determina por la prueba t desemparejada (p<0,001).

La Fig. 6 representa la mortalidad en función del tiempo en el experimento representado en la Fig. 5.

La Fig. 7 representa la temperatura superficial en función del tiempo como en la Fig. 2, donde -\bullet-\bullet- representa ratones a los que se dio diez inyecciones intraperitoneales de inhibidor de TNF de 40 kDa \Delta53 30 minutos antes y 30 minutos, 3 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas y 24 horas después de la administración subcutánea de la mezcla de citokinas. El inhibidor de TNF de 40 kDa \Delta53 total administrado fue 1.000 mg/kg.

La Fig. 8 representa la mortalidad en función del tiempo del experimento representado en la Fig. 7.

La Fig. 9 representa los pesos corporales en función del tiempo en el experimento representado en la Fig. 7.

La Fig. 10 representa la temperatura superficial en función del tiempo según se describe en la Fig. 2, donde: -\Box-\Box- representa un ratón al que se dio 6 inyecciones intraperitoneales de inhibidor de TNF de 30 kDa 30 minutos antes y 30 minutos, 3 horas, 6 horas, 9 horas y 12 horas después de la administración subcutánea de la mezcla de citokinas (un total de 240 mg/kg); -\Delta-\Delta- representa ratones a los que se dio 10 inyecciones intraperitoneales de inhibidor de TNF de 30 kDa 30 minutos antes y 3 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas, 21 horas y 24 horas después de la administración subcutánea de la mezcla de citokinas (un total de 400 mg/kg), y -\circ-\circ- representa ratones a los que se dio 15 inyecciones intraperitoneales de inhibidor de TNF de 30 kDa 30 minutos antes y 30 minutos, 3 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas, 15 horas, 18 horas, 21 horas, 24 horas, 27 horas, 30 horas, 33 horas, 36 horas y 39 horas después de la administración subcutánea de la mezcla de citokinas (un total de 600 mg/kg).

La Fig. 11 representa la mortalidad en función del tiempo en el experimento representado en la Fig. 10.

La Fig. 12 representa los pesos corporales en función del tiempo en el experimento representado en la Fig. 10.

La Fig. 13 representa el aumento en el diámetro de las articulaciones en función del tiempo post-reactivación con Pared Celular Estreptocócica ("SCW") el día 21, según el Método 1 del Ejemplo 3 que se dará a continuación.

La Fig. 14 representa el cambio máximo en el diámetro de las articulaciones durante el intervalo de 72 horas tras la reactivación con SCW en el experimento representado en la Fig. 13. * representa las diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo control de PEG 3400 por la prueba t desemparejada, t = 4,36, p < 0,001.

La Fig. 15 representa el cambio máximo en el diámetro de las articulaciones durante el intervalo de 72 horas tras la reactivación con SCW según el Método 2 del Ejemplo 3 siguiente.

La Fig. 16 representa el porcentaje de inhibición del flujo de neutrófilos estimulado por endotoxina hacia el interior de los espacios broncoalveolares de ratas tratadas con inhibidor del TNF de 30 kDa, según se describe en el Ejemplo 4 siguiente.

La Fig. 17 representa los efectos de la instilación intratraqueal de cinco dosis de inhibidor del TNF de 30 kDa sobre el número de neutrófilos que migran a los espacios alveolares en respuesta a una provocación endotóxica en el experimento representado en la Fig. 16. * representa las diferencias estadísticamente significativas con respecto a las ratas control no tratadas, según se determina por la prueba t desemparejada, p < 0,01.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Se hará ahora referencia con detalle a las realizaciones actualmente preferidas de la invención, las cuales, junto con los siguientes ejemplos, sirven para explicar los principios de la invención.

Tal como se ha indicado anteriormente, la presente invención se relaciona con métodos para prevenir y tratar las enfermedades mediadas por el TNF en pacientes que las sufren. Este método consiste en la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor del TNF a un paciente que sufre de una enfermedad mediada por TNF. Aunque el objetivo primario de esta invención es proporcionar métodos para la prevención y el tratamiento de enfermedades humanas, la descripción aquí facilitada da instrucción de un uso fisiológico general y, por lo tanto, también se incluyen los usos veterinarios en el alcance de esta invención.

Una enfermedad o indicación médica deberá ser considerada como enfermedad mediada por TNF si la enfermedad espontánea o experimental se asocia a elevados niveles de TNF en los fluidos corporales o en los tejidos adyacentes al foco de la enfermedad o indicación dentro del organismo. Las enfermedades mediadas por TNF pueden ser también reconocidas por las dos condiciones siguientes: 1) los hallazgos patológicos asociados a una enfermedad pueden ser reproducidos experimentalmente en animales mediante la administración de TNF y 2) la patología inducida en modelos experimentales animales de la enfermedad puede ser inhibida o abolida por tratamiento con agentes que inhiben la acción del TNF. Muchas enfermedades mediadas por TNF satisfacen dos de estas tres condiciones y otras satisfarán las tres condiciones. Una lista no exclusiva de enfermedades mediadas por TNF incluye el síndrome de disfunción respiratoria del adulto, la fibrosis pulmonar, la artritis, la enfermedad inflamatoria del intestino y el shock séptico.

En una realización, los inhibidores preferidos del TNF de la presente invención son proteínas naturales que sirven como proteínas de unión al TNF. Se prefieren las proteínas naturales, en parte, debido a que ofrecen un riesgo comparativamente bajo de producción de efectos colaterales fisiológicos imprevistos y no deseados en pacientes tratados con ellas.

Para los fines de la descripción y de las reivindicaciones, se considera que una proteína es "natural" si ésta, o una proteína substancialmente equivalente puede ser encontrada como normalmente existente en humanos sanos. Las proteínas "naturales" incluyen específicamente formas de proteínas encontradas en humanos sanos que están parcialmente truncadas en el extremo carboxilo de dichas proteínas, así como formas no glicosiladas de proteínas que existen en forma glicosilada en humanos sanos. Las proteínas "naturales" pueden ser obtenidas por métodos de ADN recombinante, así como por aislamiento a partir de células que las producen de forma habitual. "Naturales" también incluye a las proteínas que contienen un grupo metionilo N-terminal como consecuencia de expresión en E. coli.

"Substancialmente equivalente", tal como se utiliza a lo largo de la memoria y las reivindicaciones, significa que posee un muy alto grado de homología de residuos de aminoácido (véase, en general, M. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, p. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., aquí específicamente incorporada a modo de referencia), así como que posee una actividad biológica comparable.

Entre los inhibidores preferidos del TNF de la presente invención están las proteínas naturales que existen in vivo como proteínas de unión de TNF, que han sido previamente descritas en una solicitud de patente Estadounidense actualmente pendiente. Esta solicitud es la Solicitud de Patente EE.UU. Nº de Serie 07/555.274, presentada el 19 de Julio de 1990, de Brewer y col., que se titula "Tumor Necrosis Factor (TNF) Inhibitor and Method for Obtaining the Same".

Hay dos formas distintas de inhibidores preferidos del TNF, cada una expuesta y descrita en la solicitud antes citada de Brewer y col. La primera de éstas es el inhibidor del TNF de 30 kDa, que ha sido identificado y aislado de al menos un medio acondicionado por células U937 humanas y de orina humana. El inhibidor del TNF de 30 kDa es de aproximadamente 30 kDa por SDS-PAGE y eluye de una columna DEAE CL6B a aproximadamente NaCl 80 milimolar en tampón Tris, pH 7,5. El inhibidor del TNF de 30 kDa ha mostrado inhibir la actividad del TNF alfa y tiene poco efecto sobre la actividad del TNF beta. La proteína natural está glicosilada. El inhibidor del TNF de 30 kDa no glicosilado exhibe también actividad inhibitoria del TNF.

La segunda forma de inhibidores del TNF preferidos es el inhibidor del TNF de 40 kDa, que ha sido también identificado y aislado de al menos un medio acondicionado por células U937 humanas y orina humana. El inhibidor del TNF de 40 kDa es de aproximadamente 40 kDa por SDS-PAGE y eluye de una columna DEAE a aproximadamente NaCl 100 milimolar en tampón Tris, pH 7,5. El inhibidor del TNF de 40 kDa ha mostrado inhibir la actividad tanto del TNF alfa como del TNF beta. El inhibidor del TNF de 40 kDa es también una glicoproteína y, una vez más, la proteína no glicosilada exhibe actividad inhibitoria del TNF.

Las secuencias de ácidos nucleicos de los genes codificantes del inhibidor del TNF de 30 kDa y del inhibidor del TNF de 40 kDa y las secuencias de aminoácidos de ambas proteínas son facilitadas en la solicitud de Brewer y col. La presente invención incluye las formas no glicosiladas de los inhibidores del TNF, así como determinadas formas truncadas de las proteínas naturales descritas a continuación. En otra realización, los inhibidores del TNF son modificados por unión de uno o más restos de polietilenglicol (PEG) u otros restos poliméricos repetitivos.

Se han producido recombinantemente tres formas del inhibidor del TNF de 40 kDa por expresión en E. coli. Cada una de estas formas, a las que se hace referencia como inhibidor del TNF de 40 kDa de longitud completa, inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta51 e inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53 (junto con el inhibidor del TNF de 40 kDa de longitud completa glicosilado aislado del medio acondicionado por células U937 humanas y orina humana, en forma glicosilada y no glicosilada, a todas las cuales se hace referencia aquí de modo colectivo como inhibidor del TNF de 40 kDa) están descritas en la solicitud de Brewer y col. La proteína \Delta51 es una versión truncada de la proteína nativa, donde se eliminan 51 residuos de aminoácido en el extremo carboxilo de la proteína madura. La proteína \Delta53 es una versión truncada de la proteína madura, donde se eliminan 53 residuos de aminoácido en el extremo carboxilo de la proteína nativa. El inhibidor del TNF de 40 kDa natural (glicosilado) y los inhibidores no glicosilados (nativo, \Delta51 y \Delta53) tienen substancialmente la misma actividad inhibitoria del TNF.

También se describen en la solicitud antes mencionada métodos para producir los inhibidores de Brewer y col. Un método descrito consiste en aislar los inhibidores de varias fuentes, tales como la orina humana y medio acondicionado por células U937 humanas. Un segundo método descrito implica el aislamiento de los genes responsables de la codificación de los inhibidores, la clonación del gen en vectores y tipos celulares adecuados y la expresión del gen para producir los inhibidores. El segundo método, que es un ejemplo de métodos de ADN recombinante en general, es un método preferido de la presente invención. Se prefieren los métodos de ADN recombinante en parte debido a que son capaces de conseguir cantidades comparativamente mayores con mayores purezas.

También se incluyen en el alcance de esta invención muteínas inhibidoras del TNF y muteínas que han sido modificadas según se describe en la Solicitud de Patente EE.UU. Nº de Serie 07/669.862, presentada el 15 de Marzo de 1991. Una muteína preferida es el inhibidor del TNF de 30 kDa, donde la posición 105 es una cisteína. Un inhibidor del TNF pegilado es una especie "en forma de pesa" en la que dos inhibidores del TNF de 30 kDa C105 están unidos a un resto de polietilenglicol (PEG). En una realización más preferida, la cadena de PEG tiene un peso molecular de 20.000. La preparación del compuesto en forma de pesa está descrita en el siguiente Ejemplo 5.

Preferiblemente, los inhibidores del TNF antes descritos son producidos por el método antes citado en forma "substancialmente pura". Por "substancialmente pura" se entiende que el inhibidor, en forma no modificada, tiene una actividad específica comparativamente elevada. Hay que reconocer, sin embargo, que los derivados de los inhibidores del TNF pueden tener diferentes actividades específicas. En una realización preferida de la presente invención, se administra una composición terapéutica que contiene al menos un inhibidor del TNF de 30 kDa o un inhibidor del TNF de 40 kDa en una cantidad efectiva a pacientes que sufren de enfermedades mediadas por el TNF.

Como inhibidores del TNF adicionales se incluyen compuestos capaces de competir con el TNF por los sitios receptores del TNF. Dichos compuestos incluyen antagonistas de receptores. Otros inhibidores del TNF incluyen compuestos y proteínas que bloquean la síntesis in vivo o la liberación extracelular del TNF. Dichos compuestos incluyen agentes que afectan a la transcripción o traducción de los genes del TNF o al procesamiento de las preproteínas TNF.

Dado que es posible que la función inhibitoria de los inhibidores preferidos sea impartida por una o más porciones discretas y separables, también se contempla que el método de la presente invención podría ser practicado por administración de una composición terapéutica cuyo componente activo consista en aquella porción (o aquellas porciones) de un inhibidor que controla (o controlan) la inhibición del TNF.

La composición terapéutica de la presente invención es preferiblemente administrada parenteralmente por inyección, aunque también se contemplan otras formas de administración efectivas, tales como la inyección intraarticular, nebulizaciones inhalatorias, formulaciones oralmente activas, iontoforesis transdérmica o supositorios. Un vehículo preferido es la solución salina fisiológica,, pero se contempla la utilización también de otros vehículos farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida, se contempla que el vehículo y el inhibidor del TNF constituyan una formulación fisiológicamente compatible de liberación lenta. El solvente primario en dicho vehículo puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Además, el vehículo puede contener otros excipientes farmacológicamente aceptables para modificar o mantener el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o el olor de la formulación. De forma similar, el vehículo puede contener aún otros excipientes farmacológicamente aceptables para modificar o mantener la estabilidad, la velocidad de disolución, la liberación o la absorción del inhibidor del TNF. Dichos excipientes son aquellas substancias normal y habitualmente empleadas para formular dosificaciones para administración parenteral en forma de dosis unitaria o de múltiples dosis.

Una vez que se ha formulado la composición terapéutica, puede ser guardada en viales estériles como solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidrato o liofilizado. Dichas formulaciones pueden ser guardadas en una forma lista para su uso o que requiera reconstitución inmediatamente antes de la administración. El almacenamiento preferido de dichas formulaciones es a temperaturas al menos tan bajas como 4ºC y, preferiblemente, a -70ºC. También se prefiere guardar y administrar dichas formulaciones que contienen inhibidor del TNF a pH fisiológico o próximo a él. Actualmente se piensa que la administración en una formulación a un elevado pH (es decir, mayor de 8) o a un pH bajo (es decir, menor de 5) no es deseable.

Preferiblemente, el modo de administración de las formulaciones que contienen inhibidor del TNF para liberación sistémica es por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal o supositorio vaginal o rectal. Preferiblemente, el modo de administración de las formulaciones que contienen inhibidor del TNF para liberación local es por vía intraarticular, intratraqueal o por instilación o inhalaciones al tracto respiratorio. Además, puede ser deseable administrar el inhibidor del TNF a porciones especificadas del canal alimentario, ya sea por administración oral del inhibidor del TNF en una formulación o dispositivo apropiado o por supositorio o enema.

En determinadas realizaciones, la administración está diseñada para crear un rango de concentración preseleccionado de inhibidor del TNF en el torrente sanguíneo del paciente. Se cree que el mantenimiento de concentraciones circulantes del inhibidor del TNF de menos de 0,01 ng por ml de plasma puede no ser una composición efectiva, mientras que el mantenimiento prolongado de niveles circulantes por encima de 10 \mug por ml puede tener efectos colaterales indeseables.

Un rango preferido de dosificación para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF y, más concretamente, para el tratamiento del shock séptico mediado por TNF, es de entre aproximadamente 0,1 y 200 mg por kg de peso corporal del paciente cada 24 horas, administrados en dosis iguales entre 4 y 15 veces cada 24 horas. En una realización más preferida, la dosificación es de entre aproximadamente 0,1 y 100 mg por kg de peso corporal del paciente cada 24 horas, administrados en dosis iguales cada 3 horas. En la realización más preferida, se administran igualmente 1 a 50 mg por kg de peso corporal del paciente al día cada 3 horas. En una realización preferida, se continuará la administración durante 12 a 60 horas. En una realización más preferida, se continuará la administración durante al menos 24 horas. La frecuencia de dosificación y la dosis óptima dependerán de los parámetros farmacocinéticos del inhibidor del TNF en la formulación utilizada.

En un modo preferido adicional para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF y, más concretamente, para el tratamiento del shock séptico mediado por TNF, se administra una inyección por bolo intravenoso inicial de TNF, seguido de una infusión intravenosa continua de inhibidor de TNF, hasta que los niveles circulantes de TNF ya no estén elevados. Los niveles de TNF alfa en suero pueden ser determinados por kits comerciales para pruebas de inmunoensayo. La iniciación del tratamiento para el shock séptico mediado por TNF debe comenzarse, con cualquiera de los modos de tratamiento, lo antes posible después de diagnosticar la septicemia o la posibilidad de septicemia. Por ejemplo, el tratamiento debe comenzar inmediatamente después de cirugía o de un accidente o de cualquier otro suceso que pueda conllevar el riesgo de iniciación de shock séptico.

Los modos preferidos de tratamiento de las enfermedades mediadas por TNF y, más concretamente, para el tratamiento de la artritis mediada por TNF incluyen: 1) una sola inyección intraarticular de inhibidor del TNF dada periódicamente según sea necesario para evitar o curar la aparición de artritis y 2) inyecciones subcutáneas periódicas del inhibidor del TNF.

Los modos preferidos para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF y, más concretamente, para el tratamiento del síndrome de disfunción respiratoria del adulto mediada por TNF incluyen: 1) administraciones intratraqueales únicas o múltiples de inhibidor del TNF y 2) infusión intravenosa en bolo o continua de inhibidor del TNF.

También se contempla que determinadas formulaciones que contienen inhibidor del TNF sean administradas por vía oral. Preferiblemente, el inhibidor del TNF que se administra de esta forma está encapsulado. El inhibidor del TNF encapsulado puede ser formulado con o sin los vehículos habitualmente empleados en la composición de formas sólidas de dosificación. Preferiblemente, la cápsula está diseñada de tal forma que la porción activa de la formulación se libere en aquel punto del tracto gastrointestinal en que la biodisponibilidad es máxima y la degradación presistémica es mínima. Se pueden incluir excipientes adicionales para facilitar la absorción del inhibidor del TNF. Se pueden emplear también diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes suspensores, agentes desintegrantes de tabletas y ligantes.

Independientemente de la forma de administración, se calcula la dosis específica según el peso corporal aproximado del paciente. Los expertos en la técnica hacen rutinariamente un refinamiento de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para un tratamiento que implique cada una de las formulaciones anteriormente mencionadas y esto queda dentro del ámbito de tareas rutinariamente realizadas por ellos sin experimentación innecesaria, especialmente a la luz de la información de dosificación y de los ensayos aquí descritos. Estas dosificaciones pueden ser determinadas mediante el uso de ensayos establecidos para determinar dosificaciones utilizados junto con datos apropiados de dosis-respuesta.

Habría que observar que las formulaciones de inhibidor del TNF aquí descritas pueden ser usadas para aplicaciones veterinarias, así como humanas, y que el término "paciente" no ha de ser considerado de un modo limitante. En el caso de las aplicaciones veterinarias, los rangos de dosificación serían los mismos que los especificados anteriormente.

Se entiende que la aplicación de las enseñanzas de la presente invención a un problema o ambiente específico estará dentro de las capacidades de alguien con conocimientos ordinarios en la técnica, a la luz de las enseñanzas aquí contenidas. En los siguientes ejemplos aparecen ejemplos de usos representativos de la presente invención.

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Los siguientes ejemplos describen la aplicación de la presente invención a una de las enfermedades mediadas por TNF aquí descritas. Las diferencias, de haberlas, entre el tratamiento de pacientes que sufren de otras enfermedades mediadas por TNF con respecto al tratamiento de pacientes que sufren de shock séptico mediado por TNF serían fácil y rutinariamente identificadas por alguien con conocimientos ordinarios en la técnica. La capacidad para aliviar los efectos del shock séptico mediado por TNF mediante administración de un inhibidor del TNF, según se muestra en los siguientes ejemplos, muestra que la administración de un inhibidor del TNF será igualmente efectiva en el tratamiento de todas las enfermedades que están mediadas por el TNF, según se define aquí.

Ejemplo 1 Demostración de los efectos protectores del inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53 recombinante humano en un modelo murino de shock séptico inducido por citokinas A. Protocolo para la inducción de shock sistémico en ratones

Se ha utilizado una modificación de un modelo murino de shock séptico desarrollado por Everaerdt y col. en este Ejemplo para demostrar la eficacia terapéutica del inhibidor del TNF frente al shock séptico. Everaerdt y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 163, pg. 378 (1989). En este modelo, la acción sinérgica de una combinación de citokinas, Factor de Necrosis Tumoral \alpha recombinante humano ("hrTNF\alpha") e Interleukina-1\beta recombinante humana ("hrIL-1\beta") produce shock séptico en animales, el cual se caracteriza por profunda hipotermia y luego muerte.

Se indujo un shock séptico letal en ratones hembras C57BL/6, de 8-12 semanas de edad, de 18-21 gramos de peso corporal, mediante administración de hrTNF\alpha e IL-1\beta. Se preparó el Factor de Necrosis Tumoral recombinante humano, en general, según el procedimiento descrito por Shirai y col., Nature (1985), vol. 313, p. 803-806; véase también la solicitud de patente de Brewer y col. Se preparó la Interleukina-1\beta recombinante humana, en general, según el procedimiento descrito por Kronheim y col., Biotechnology (1986), vol. 4, pp. 1078-1082. Las citokinas fueron estudiadas en cuanto a LPS según los procedimientos descritos en United States Pharmacopeia XXII, National Formulary XVII, 1 de Enero de 1990, pp. 1493-1495. Se dieron inyecciones de citokinas como un solo bolo, por vía subcutánea, en la superficie dorsal de los ratones, en volúmenes de 100 \mul. Se preparó el inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53 según el método de ADN recombinante descrito en la solicitud de Brewer y col. y se dio en múltiples dosis intraperitoneales, en volúmenes de 300 \mul o menos por inyección.

Se realizaron experimentos preliminares para determinar la razón de hrIL-1\beta a hrTNF\alpha requerida para inducir una mortalidad del 100% (figura 1). Las dosis son expresadas como \mug/kg de peso corporal. Manteniendo la dosis de hrTNF\alpha constante a 300 \mug/kg, se añadieron cantidades crecientes de hrIL-1\beta al bolo de inyección. Los resultados, dados como \mug de hrIL-1\beta/kg:% mortalidad, fueron los siguientes: 250:0, 500:10, 1.500:50, 2.000:67, 2.500:100. Todas las dosis mayores de 2.500 \mug/kg producían una letalidad del 100%. En todos los experimentos posteriores, las citokinas fueron usadas a 2.500 \mug/kg de hrIL-1\beta y 300 \mug/kg de hrTNF\alpha y administradas como un solo bolo subcutáneo en la superficie dorsal.

La administración combinada de hrTNF\alpha y hrIL-1\beta causó en los ratones una profunda hipotermia (figura 2) y luego muerte aproximadamente 18 a 30 horas después de la inyección (figura 4). En este Ejemplo, se usó una disminución de la temperatura corporal como indicador mensurable de la gravedad del shock inducido. Se estimó la temperatura corporal mediante el uso de un escáner manual de infrarrojos First Temp (Intelligent Medical Systems, Carlsbad, CA). El grado de hipotermia tenía una correlación directa con la gravedad de otros signos clínicos (es decir, temblores, letargia, pérdida de la elasticidad de la piel, postura encorvada). La temperatura corporal de los animales cayó desde un valor normal de 39ºC hasta tan sólo 28ºC aproximadamente a las 15 horas de la inyección.

Por el contrario, las inyecciones de cualquiera de las citokinas sola no produjeron un grado similar de hipotermia (figura 2) y no tuvieron efectos letales. Las inyecciones subcutáneas de bolos únicos de hrIL-1\beta a 2.500 \mug/kg produjeron una caída transitoria de la temperatura corporal a 34ºC, alcanzando ese nadir a las 12 a 16 horas de la inyección. No se observó mortalidad. El hrTNF\alpha a 300 \mug/kg no produjo un efecto mensurable sobre la temperatura corporal de los ratones, ni se observó mortalidad.

B. Efectos del inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53 sobre el shock inducido por citokinas

Se administró inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53 a ratones inyectados con la mezcla de citokinas (hrIL-1\beta y hrTNF\alpha en las cantidades antes descritas). Se realizó una serie de experimentos en la cual se trató a grupos de seis ratones con la Proteína Inhibidora (en este experimento, el inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53) durante períodos cada vez más largos. Se mantuvo constante la cantidad de Proteína Inhibidora por inyección, mientras que se aumentó el número total de inyecciones. Por lo tanto, la cantidad absoluta de la Proteína Inhibidora usada en los tres experimentos variaba con la duración del régimen terapéutico. Se determinó la temperatura corporal y la mortalidad para cada experimento.

En el primer experimento, se inyectó Proteína Inhibidora intraperitonealmente 30 minutos antes y 30 minutos después del bolo de citokina (figura 3). Cada inyección contenía 100 mg/kg de Proteína Inhibidora en un volumen de 300 \mul, para un total de 200 mg/kg. De los ratones a los que se indujo el shock por citokina, los del grupo que recibió la Proteína Inhibidora mostraron una reducción significativa de la hipotermia durante un período de 4 a 6 horas después de la administración de las citokinas en comparación con el grupo no tratado (figura 3). La aparición de mortalidad estaba retrasada aproximadamente 12 horas en el grupo tratado (figura 4). En ambos grupos, sin embargo, la mortalidad era del 100% a las 48 horas post-inyección.

En el segundo experimento, se continuó la terapia durante un total de 12 horas post-inyección (figura 5). Los tiempos de inyección en relación al tiempo de la inyección de citokina eran: -30 minutos, +30 minutos, 3 horas, 6 horas, 9 horas y 12 horas. Este régimen dio lugar a una dosis total de Proteína Inhibidora de 600 mg/kg. Después de la inyección de citokina, el grupo no tratado desarrolló la hipotermia característica, con un nadir de 26ºC a las 15 horas. Las primeras muertes fueron observadas a las 36 horas (figura 6). La mortalidad era del 100% hacia las 43 horas. Por el contrario, el grupo tratado con Proteína Inhibidora estuvo protegido frente a la grave hipotermia durante aproximadamente 24 horas después de la inyección de la mezcla de citokinas. La temperatura corporal alcanzó un nadir inicial de 35,5ºC a las 12 horas. En ese momento, la terapia con la Proteína Inhibidora había finalizado. La temperatura corporal subió ligeramente durante las siguientes seis horas y luego cayó de golpe a 26ºC hacia las 36 horas. En relación al grupo no tratado, la aparición de mortalidad estuvo retrasada en el grupo tratado. Las primeras muertes fueron observadas a las 42 horas de la inyección y alcanzaron un 100% hacia las 44 horas.

El tercer experimento prolongó el régimen anterior de 12 horas a 24 horas post-inyección de citokina (figura 7). Las inyecciones intraperitoneales adicionales fueron administradas a las 15, 18, 21 y 24 horas después de la inyección de la mezcla de citokinas. La dosificación total resultante era de 1.000 mg/kg. El grupo no tratado que recibió hrIL-1\beta y hrTNF\alpha siguió el mismo curso que en el segundo experimento. La temperatura corporal alcanzó un nadir de 27ºC a las 12 horas. La mortalidad comenzó a las 18 horas post-inyección y era del 100% hacia las 42 horas (figura 8). Por el contrario, el grupo que recibió Proteína Inhibidora estaba protegido frente a la grave hipotermia y a la letalidad. La temperatura media corporal bajó sólo a 33,5ºC hacia las 10 horas post-inyección de citokina y posteriormente se elevó a casi normal hacia las 24 horas al cesar el tratamiento con Proteína Inhibidora (figura 7). Hacia las 42 horas (18 horas después de cesar la terapia), la temperatura corporal bajó de forma transitoria a 34,5ºC y se mantuvo ligeramente sub-normal hasta 90 horas después de la inyección de las citokinas. La mortalidad en este grupo era de uno por cada seis. La fatalidad única no halló explicación. Sin embargo, el animal parecía anormal a lo largo del experimento, quizá debido a una inyección intraperitoneal mal puesta. Los pesos corporales de estos animales fueron registrados para determinar la recuperación total del shock inducido por citokinas (figura 9). En el grupo tratado con Proteína Inhibidora, el peso medio disminuyó a un 79% del peso original hacia las 62 horas. Sin embargo, hacia las 200 horas post-inyección de citokinas, el peso medio había regresado al del grupo control inyectado con solución salina tamponada con fosfatos ("PBS"). Los animales parecían normales en cuanto a comportamiento y aspecto externo. Prolongando la terapia con Proteína Inhibidora durante 24 horas, pudimos revertir la profunda hipotermia y la letalidad observadas en el modelo inducido con citokinas de shock séptico en ratones. La duración y frecuencia de la administración del inhibidor sería compatible con el cuidado intensivo dado a un paciente con shock séptico.

C. Controles que muestran la ausencia de efectos de la terapia con fluidos y la naturaleza no tóxica del Inhibidor solo

En los tres últimos experimentos descritos anteriormente, se dio Proteína Inhibidora (inhibidor del TNF de 40 kDa \Delta53) en volúmenes de 200 a 300 \mul por inyección. Era posible que el volumen de fluido de la proteína Inhibidora en sí mismo pudiera afectar a la terapia. Para comprobar esta posibilidad, se compararon la hipotermia y la letalidad en un grupo de ratones que sólo recibieron las citokinas y un segundo grupo que recibió citokinas más la inyección intraperitoneal de PBS en volúmenes y frecuencias idénticos al grupo tratado con Proteína Inhibidora (figura 5). No se observaron frecuencias significativas en cuanto a la hipotermia o a la mortalidad. En posteriores experimentos, se administró PBS intraperitonealmente a los ratones con shock inducido por citokinas no tratados.

Se incluyó un control aparte para determinar los efectos de la Proteína Inhibidora sola. En todos los experimentos, se inyectó a un grupo de ratones sólo con la Proteína Inhibidora en volúmenes y frecuencias idénticos a los del grupo con shock inducido por citokinas tratado. No se observó mortalidad o alteraciones de la temperatura corporal en los grupos control de Proteína Inhibidora (figuras 3, 5, 7).

Ejemplo 2 Demostración de los efectos protectores del inhibidor del TNF de 30 kDa recombinante humano en un modelo murino de shock séptico inducido por citokinas A. Protocolo para la inducción de shock séptico murino

Se utilizó el mismo modelo murino de shock séptico descrito en el Ejemplo 1 para demostrar la eficacia terapéutica del inhibidor del TNF de 30 kDa. Se indujo el shock letal en ratones hembras C57BL/6, de 8-12 semanas de edad y 18-21 gramos de peso, mediante la administración subcutánea combinada de hrTNF\alpha a 300 \mug/kg y hrIL-\beta a 2.500 \mug/kg. La mortalidad era del 100% a estas dosis. Las citokinas fueron administradas como un único bolo subcutáneo en el dorso del cuello.

En este ejemplo, se usó una reducción de la temperatura corporal como indicador mensurable de la gravedad del shock inducido. El grado de hipotermia tenía una correlación directa con la gravedad de los signos clínicos (es decir, temblores, letargia, pérdida de la elasticidad de la piel, postura encorvada). Después de la administración combinada de hrTNF\alpha y hrIL-1\beta, la temperatura corporal cayó de un valor normal de 39ºC a tan sólo 28ºC aproximadamente a las 15 horas post-inyección (figura 2). La temperatura fue estimada con un escáner manual de infrarrojos First Temp® (Intelligent Medical Systems, Carlsbad, CA). Por el contrario, las inyecciones de hrTNF\alpha o hrIL-1\beta solos no produjo un grado similar de hipotermia y no tuvieron efectos letales (figura 2). El inhibidor del TNF de 30 kDa recombinante humano utilizado en este Experimento fue preparado según los métodos descritos en la solicitud de patente de Brewer y col.

B. Efectos del inhibidor del TNF de 30 kDa sobre el shock séptico inducido por citokinas

Se dio la Proteína Inhibidora (en este ejemplo, el inhibidor del TNF de 30 kDa) intraperitonealmente a 40 mg/kg por inyección a un grupo de 8 ratones durante períodos de 12, 24 ó 39 horas después de la administración subcutánea de hrTNF\alpha y hrIL-1\beta. El primer grupo, que contenía un ratón, fue tratado con Proteína Inhibidora 30 minutos antes y 30 minutos, 3 horas, 6 horas, 9 horas y 12 horas después de la inyección de las citokinas. Este ratón recibió un total de 240 mg/kg de la Proteína Inhibidora dada en seis inyecciones. En el siguiente grupo, el tratamiento fue prolongado otras 12 horas, dando las inyecciones adicionales a intervalos de 3 horas. Los tres ratones de este grupo recibieron cada uno durante el período de 24 horas un total de 400 mg/kg de Proteína Inhibidora dada en diez inyecciones. En el siguiente grupo, el tratamiento fue prolongado durante 15 horas más, dando de nuevo las inyecciones adicionales a intervalos de 3 horas. Los cuatro ratones de este grupo recibieron cada uno durante el período de 39 horas un total de 600 mg/kg dados en 15 inyecciones.

La temperatura corporal (figura 10) y la mortalidad (figura 11) fueron seguidas en los ratones tratados y no tratados. La temperatura media de los ratones no tratados cayó a 27ºC a las 12 horas y permaneció en ese bajo nivel hasta que los ratones murieron a las 36 a 42 horas después de la administración de las citokinas. Por el contrario, la temperatura corporal de los ratones en los tres grupos de tratamiento estaba sólo moderadamente reducida y todos los ratones sobrevivieron al shock inducido por citokinas. Durante el período de las primeras 24 horas después de la administración de las citokinas, la temperatura corporal cayó 2 a 4ºC hacia las 12 horas en los tres grupos y luego subió a normal hacia las 24 horas. A continuación, la temperatura se mantuvo a niveles normales en los grupos que recibieron 24 horas ó 39 horas de tratamiento con Proteína Inhibidora, mientras que la temperatura del único ratón tratado durante sólo 12 horas cayó 3ºC a 39ºC y posteriormente regresó a un valor normal hacia las 100 horas post-inyección de citokinas.

El tiempo requerido para que el peso corporal regresara a los valores del tiempo cero fue usado también como índice de recuperación después del shock inducido por citokinas (figura 12). Los pesos corporales de los ratones tratados con Proteína Inhibidora durante 24 ó 39 horas disminuyó a un 86% de los valores del tiempo cero hacia las 60 horas y luego regresó a los niveles normales hacia las 140 horas. El peso corporal del único ratón tratado con el inhibidor durante 12 horas alcanzó un bajo valor de un 81% en un tiempo ligeramente posteriormente, 75 horas, pero alcanzó sin embargo el valor del tiempo cero aproximadamente a las 140 horas, el mismo punto que en los otros dos grupos.

El inhibidor del TNF de 30 kDa era efectivo en la protección de ratones frente a un síndrome de shock séptico letal inducido por citokinas cuando se mantuvo la terapia a intervalos de 3 horas durante períodos de 12, 24 ó 39 horas después de la inyección de la mezcla de citokinas. Se puede efectuar fácilmente un régimen terapéutico similar en un paciente con shock séptico en un marco de cuidados intensivos.

Ejemplo 3 Demostración de los efectos del inhibidor del TNF de 30 kDa recombinante humano sobre la reactivación inducida por la pared celular estreptocócica ("SCW") de la artritis inducida por SCW en ratas

Este experimento emplea el modelo descrito por Esser y col., Arthritis and Rheumatism, 28: 1401-1411 (1985). Este modelo es brevemente resumido como sigue: Se inyecta Pared Celular Estreptocócica (SCW) intraarticularmente en la articulación del tobillo de ratas Lewis. Se inyecta suero salino en la articulación contralateral para obtener un control. Después de un período de veinte días, en los cuales desaparece la inflamación inicial, se vuelve a administrar SCW, esta vez por inyección intravenosa. Esta dosis de SCW es insuficiente para causar inflamación de la articulación por sí misma y, por lo tanto, tiene poco efecto sobre el tobillo inyectado con suero salino. Por el contrario, sin embargo, esta dosis es capaz de reactivar la inflamación y la destrucción articular en el tobillo previamente inyectado con SCW. Para valorar el grado de inflamación tras la segunda administración de SCW, se miden diariamente las dimensiones de la articulación del tobillo.

En relación a la artritis inducida por pared celular estreptocócica, R.L. Wilder, en Immunopathogenetic Mechanisms of Arthritis, Capítulo 9, titulado "Experimental Animal Models of Chronic Arthritis", comenta que "las características clínicas, histológicas y radiológicas de la enfermedad articular experimental tienen un estrecho parecido con las observadas en la artritis reumatoide de adultos y juvenil".

Se realizaron dos métodos de tratamiento de la artritis usando el modelo de roedores de artritis inducida por SCW.

Método Uno En un grupo de experimentos, se dio a ratas artríticas una sola administración intraarticular de inhibidor del TNF en solución salina tamponada con fosfatos (PBS) usando el modelo de artritis inducida por SCW. Se indujo artritis inyectando a cada rata el día 0 en el tobillo izquierdo con SCW (1,8 \mug de equivalencia de ramnosa). Se inyectó en el tobillo derecho un volumen igual de solución salina libre de pirógenos. Se midieron las dimensiones de los tobillos los días 0, 1, 2 y 7. La hinchazón del tobillo izquierdo los días 1 y 2 (Tabla 1) refleja la fase aguda de la artritis inducida por SCW. El tobillo derecho, que servía como control para el traumatismo mecánico asociado a la inyección intraarticular no sufrió una hinchazón significativa (datos no mostrados).

El día 21, después de remitir la fase aguda de la artritis, las ratas fueron divididas aleatoriamente en cuatro grupos de 9 ó 10 ratas cada uno, se las anestesió y se las inyectó según el protocolo descrito a continuación. C105 es una muteína del inhibidor del TNF de 30 kDa en la que se llevó a cabo una substitución de aminoácido con el fin de crear un sitio para la unión covalente de polietilenglicol (PEG). En C105, se ha substituido la asparagina con cisteína en la posición 105 del inhibidor del TNF de 30 kDa. En la molécula en forma de peso ("db") C105-PEG 3400, se entrecruzan dos moléculas de C105 por una sola molécula de PEG con una masa molecular aproximada de 3.400 daltons. La molécula en forma de pesa y los procedimientos de pegilación están descritos más ampliamente en la solicitud de Patente EE.UU. Nº de Serie 07/669.862, presentada el 15 de Marzo de 1991 y titulada "Site Specific Pegylation of Polypeptides". El procedimiento para producir db C105-PEG 3400 es facilitado a continuación en el Ejemplo 5.

1

El Grupo I sirvió como control de vehículo para el grupo IV tratado con C105. El Grupo II sirvió como grupo de vehículo para el grupo III tratado con db C105-PEG 3400. Las inyecciones intraarticulares fueron realizadas en un volumen total de 10 \mul mediante una aguja de calibre 25 unida a una pipeta automática. Inmediatamente después de las inyecciones intraarticulares de los diversos tratamientos, cada rata fue inyectada intravenosamente con SCW (150 \mug de equivalencia de ramnosa) para reactivar la artritis. No se administró ningún otro tratamiento a las ratas. Los diámetros de las articulaciones del tobillo fueron medidos los días 21, 22, 23 y 24.

Tal como se esperaba, los tobillos izquierdos de las ratas en todos los grupos se hincharon en respuesta a la inyección intravenosa de SCW el día 21 (Tabla 1 y Figura 13). Sin embargo, la respuesta difería marcadamente entre los grupos de tratamiento. Mientras que las articulaciones de las ratas de los grupos control I y II se hincharon en un 30% y un 32%, respectivamente, de sus dimensiones iniciales, las correspondientes articulaciones en el grupo III tratado con db C105-PEG 3400 aumentaron en sólo un 15% y, en el grupo IV tratado con C105, en un 25%. En la Figura 14, se representan los aumentos máximos en el diámetro de la articulación durante el intervalo de 72 horas tras la reactivación inducida por SCW para los Grupos I, II, III y IV. Una sola inyección intraarticular de db C105-PEG 3400 produjo una reducción estadísticamente significativa en la hinchazón de las articulaciones artríticas.

Método dos En un segundo grupo de experimentos, se dio a las ratas artríticas múltiples administraciones subcutáneas de inhibidor del TNF de 30 kDa en solución salina tamponada con fosfatos (PBS) usando el mismo modelo SCW de artritis. Se indujo la artritis por inyección a cada rata el día 1 en el tobillo izquierdo con SCW (1,8 \mug de equivalencia de ramnosa) y en el tobillo derecho con un volumen igual de solución salina libre de pirógenos).

El día 21 después de remitir la artritis aguda, las ratas fueron divididas aleatoriamente en cuatro grupos. Cada rata fue inyectada intravenosamente con una segunda dosis de SCW (150 \mug de equivalencia de ramnosa) con objeto de reactivar la artritis. En los tres minutos posteriores a la inyección de SCW, las nueve ratas del grupo I control fueron tratadas con PBS y las cinco ratas de cada uno de los Grupos II, III y IV fueron tratadas con 1, 3 y 9 mg por kg de peso corporal, respectivamente, de inhibidor del TNF de 30 kDa en PBS. Se dieron de nuevo inyecciones subcutáneas de PBS al Grupo I o de inhibidor del TNF de 30 kDa a los Grupos II, III y IV (1, 3 y 9 mg/kg, respectivamente) a las dos y seis horas post-administración de SCW y se repitieron cada 6 horas durante el período de las 42 horas siguientes. Se midieron los diámetros de las articulaciones del tobillo a las 0, 24, 39, 48, 60 y 72 horas de la inyección intravenosa de SCW.

La Figura 15 y la Tabla 2 muestran los cambios máximos en los diámetros de las articulaciones durante el período de 72 horas tras la reactivación inducida por SCW de la artritis en los cuatro grupos experimentales. Tal como se esperaba, los tobillos del grupo I tratado con solución salina se hincharon en respuesta a la inyección intravenosa de SCW. Sin embargo, la hinchazón máxima en los grupos II, III y IV se redujo en un 58%, un 85% y un 75%, respectivamente. La Tabla 2 muestra los resultados del análisis estadístico de los datos de la Figura 15 usando la prueba t sobre las medias que han sufrido una transformación logarítmica.

Ejemplo 4 Demostración de los efectos del inhibidor del TNF de 30 kDa recombinante humano sobre la lesión pulmonar aguda inducida por endotoxina en ratas como método de tratamiento del síndrome de disfunción respiratoria del adulto (ARDS)

Este experimento emplea un estímulo séptico, la endotoxina, para inducir una lesión pulmonar aguda mediada por neutrófilos según el modelo descrito en Ulich y col., American Journal of Pathology 138: 1485-1496 (1991). Este modelo es brevemente resumido como sigue: Se inyecta endotoxina intratraquealmente en la porción cervical media de la tráquea de ratas anestesiadas. Después de un período latente de seis horas, se realiza el lavado broncoalveolar ("BAL") de los pulmones como procedimiento terminal. Se realizan recuentos totales y diferenciales de células blancas de la sangre sobre el fluido BAL. La inyección intratraqueal de solución salina libre de pirógenos da un fluido BAL con una predominancia de macrófagos alveolares (aproximadamente un 99%) en bajos números. La inyección intratraqueal de endotoxina causa un gran aumento del número de células del BAL y una predominancia de neutrófilos. La entrada aguda de neutrófilos hacia el espacio alveolar tiene un pico a las 6 a 12 horas y va acompañada de la acumulación de fluido edematoso que contiene proteínas en los espacios alveolares. Se cree que el TNF es uno de los mediadores de la alveolitis inducida por endotoxina, El TNF está presente en el fluido BAL después de la estimulación con endotoxina. Se cree que el macrófago alveolar es la fuente de su síntesis. Más aún, la inyección intratraqueal de TNF exógeno induce un exudado neutrofílico intraalveolar agudo, que es cualitativamente similar al inducido por la endotoxina.

Aunque no se considera que los modelos animales reproduzcan fielmente la enfermedad humana, en particular la transición de la fase aguda a la crónica del ARDS, se usan muchos modelos animales que se aproximan al edema pulmonar alterado, al secuestro de leucocitos y a la hipoxemia que se producen durante la fase aguda de la lesión parenquimal de pulmón durante el ARDS. J.F Murray y col., Am. Rev. Of Respiratory Disease, vol. 138, pp. 720-723 (1991). Las formas agudas del ARDS se producen en presencia de determinados factores de riesgo identificables, tales como sepsis, aspiración o múltiples transfusiones de sangre. Las investigaciones actuales destacan el papel central de la lesión mediada por neutrófilos en la patofisiología del ARDS (Tate, R.M., Am. Rev. Resp. Dis. 128: 552-559, (1983)). Se piensa que los productos tóxicos liberados por el neutrófilo activado dañan la membrana capilar alveolar. La permeabilidad de la membrana dañada está muy aumentada, estimulando el movimiento de las proteínas plasmáticas y de las células inflamatorias hacia los espacios alveolares. En un modelo experimental ovino de ARDS de origen séptico, la depleción de neutrófilos protegía frente al desarrollo de lesión pulmonar (Heflin, A.C., J. Clin. Invest. 68: 1253-1260 (1981)).

Se llevó a cabo un método para el tratamiento de la alveolitis neutrofílica en ratas por administración intratraqueal del inhibidor del TNF de 30 kDa en PBS. Se indujo lesión pulmonar mediante la administración de endotoxina (5 \mug por rata) en un volumen total de 0,5 ml de PBS estéril, a través de una aguja de calibre 27 de ½ pulgada insertada entre los anillos traqueales en la región cervical media quirúrgicamente expuesta de la tráquea. Se administró el inóculo lentamente en la tráquea, al tiempo que se monitorizaba el ritmo y profundidad de respiración de la rata. Seis horas más tarde, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano, de tal forma que pudiera realizar una laparotomía para facilitar el lavado de los pulmones. Se seccionó la vena cava caudal para reducir el contenido de sangre de los pulmones. Se abrió el diafragma para permitir que los pulmones se expandieran durante el lavado. Se realizó el BAL inyectando 40 ml de solución salina equilibrada de Hank en los espacios broncoalveolares por medio de un angiocatéter insertado y asegurado en el sitio de una incisión traqueal cervical media. Se recuperó el influjo celular inflamatorio de la pella obtenida por centrifugación del fluido BAL a 1.500 rpm durante 15 minutos. Se contó el número total de leucocitos en un contador Coulter. Se determinó el porcentaje de neutrófilos polimorfonucleares realizando un recuento diferencial de células manualmente en una preparación de células teñidas.

Se determinaron los efectos del inhibidor del TNF de 30 kDa sobre el influjo estimulado por endotoxina de células a los espacios broncoalveolares administrando inhibidor del TNF de 30 kDa simultáneamente con la instilación intratraqueal de endotoxina. Se estudió el inhibidor del TNF de 30 kDa en dosis que variaban entre 1 y 10 \mug por rata. El inhibidor del TNF de 30 kDa a una dosis de 1 \mug/rata no redujo el influjo de neutrófilos en los espacios alveolares. Sin embargo, la administración intratraqueal de inhibidor del TNF de 30 kDa a dosis de entre 2,5 \mug y 10 \mug por rata produjo una reducción máxima en el influjo de neutrófilos a los espacios alveolares. En comparación con el influjo de neutrófilos en ratas no tratadas, el porcentaje de inhibición del influjo celular en estas ratas tratadas con inhibidor del TNF de 30 kDa era de aproximadamente un 35% (Figura 16). El número total de neutrófilos presente en los espacios broncoalveolares estaba significativamente reducido en ratas tratadas con 2,5 a 10 \mug de inhibidor del TNF de 30 kDa por rata (Figura 17 y Tabla 3).

Ejemplo 5 Preparación de db C105-PEG 3400

Se prepararon compuestos db C105-PEG por reacción de la muteína que contiene cisteína del inhibidor del TNF de 30 kDa C105 con una PEB-bismaleimida. Para preparar la PEG-bismaleimida, se preparó PEG-tresilato a partir de PEG-bisdiol, según describen Nilson y Mosbach en Methods in Enzymology, vol. 104, pp. 56-69, Academic Press, Inc., New York, NY (1984). La cantidad de intermediario sulfonado fue determinada por análisis elemental para el flúor. Este intermediario fue convertido en el derivado ftalimida, el cual fue posteriormente reducido con hidrato de hidrazina al intermediario PEG-bisamina. Estas dos reacciones fueron llevadas a cabo por el procedimiento descrito por Pillai y col., J. Org. Chem., vol. 45, pp. 5364-5370 (1980). La cantidad de cada intermediario fue estimada por análisis elemental para el nitrógeno. Además, la cantidad de PEG-bisamina fue determinada por reacción con ácido 2,4,6-trinitrobencensulfónico. Los derivados PEG-bisamina fueron convertidos en los correspondientes productos bismaleimida por reacción con anhídrido maleico mediante una adaptación del procedimiento de Butler y Hartley, en Methods in Enzymology, vol. XXV, pp. 191-199, Academic Press, Inc., New York, NY (1972), y por ciclación del intermediario usando el método descrito por Wunsch y col., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, vol. 366, pp. 56-61 (1985).

La muteína inhibidor del TNF de 30 kDa C105 es preparada según se describe en la Solicitud de Patente EE.UU. Nº de Serie 07/669.862, presentada el 15 de Marzo de 1991. El inhibidor del TNF de 30 kDa C105, a 2-3 mg/ml, es tratado con un exceso 4 veces molar de ditiotreitol (DTT) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se dializa entonces la muteína frente a HEPES 50 mM, pH 7,0, desgasificado durante 3 horas a 4ºC. para crear el compuesto en forma de pesa -que puede ser considerado como un dímero unido por polietilenglicol (PEG)-, la muteína dializada reacciona con la especie PEG-bismaleimida. La razón de muteína a PEG-bismaleimida varía dependiendo de la masa molecular del compuesto PEG. Para la PEG-bismaleimida con un peso molecular de aproximadamente 1.900, se utilizó una razón molar de 1 a 1, mientras que, para compuestos PEG con un peso molecular de 3.400 ó 20.000, se usó una razón molar de 2 a 1 de muteína a compuesto PEG. Las reacciones son incubadas durante 3-12 horas a temperatura ambiente.

Después de la incubación, los dímeros unidos por PEG fueron purificados a partir de muteína no pegilada y monómeros de PEG-muteína usando "FPLC MONO-S" en HoAc 50 mM, pH 4,0, empleando un gradiente en etapas de NaCl 260 mM, 310 mM y 350 mM. Los compuestos en forma de pesa eluyen en la etapa de NaCl 310 mM. Se extrajo el resto de la muteína no pegilada por cromatografía en superdex 75. Db C105-PEG 3400 se refiere a un compuesto en forma de pesa (un dímero unido por PEG inhibidor del TNF) en el que el inhibidor del TNF es la muteína C105 del inhibidor del TNF de 30 kDa y la unidad de PEG tiene una masa molecular de aproximadamente 3400 daltons.

Aunque la presente invención ha sido descrita en relación a realizaciones preferidas, hay que entender que los expertos en la técnica están capacitados para hacer modificaciones y variaciones sin apartarse del alcance o espíritu de la presente invención. Por lo tanto, la anterior descripción de las realizaciones preferidas no ha de ser tomada en un sentido limitativo y la presente invención resulta mejor definida por las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

TABLA 1 Diámetro de la articulación del tobillo de ratas inyectadas con SCW y tratadas por inyección intraarticular de suero salino, suero salino + PEG 3400, db C105-PEG 3400 ó C105

2

TABLA 2 Cambios máximos en el diámetro de las articulaciones durante el período de 72 horas tras la reactivación de la artritis inducida por SCW

3

Los valores son expresados como media \pm error estándar.

*Diferencia estadísticamente significativa en comparación con el grupo I control determinada por la prueba t desemparejada realizada sobre las medias que han sufrido una transformación logarítmica.

Grupo I frente a Grupo II

t = 1,43 \hskip0.5cm p = 0,177

Grupo I frente a Grupo III

t = 3,20 \hskip0.5cm p = 0,008

Grupo I frente a Grupo IV

t = 2,19 \hskip0.5cm p = 0,049

Grupo I frente a Grupos III y IV

t = 3,19 \hskip0.5cm p = 0,005

Grupo I frente a Grupos II, III y IV.

t = 2,88 \hskip0.5cm p = 0,009

\vskip1.000000\baselineskip

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TABLA 3 Número total de neutrófilos recuperados del fluido broncoalveolar de las ratas inoculadas con endotoxina

4

*Estadísticamente diferente del grupo control no tratado, determinado por la prueba t desemparejada.

Claims (13)

1. Un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica consistente en modificar un inhibidor del TNF mediante la adición de un radical polimérico repetitivo de alto peso molecular para formar una formulación fisiológicamente compatible de liberación lenta.

2. Un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de osteoartritis, espondilitis anquilosante, artritis gonocócica, artritis de la enfermedad de Reiter y gota, consistente en usar un inhibidor del TNF que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en:

(i)

la secuencia de aminoácidos del inhibidor de 30 kDa o un fragmento inhibitorio del TNF del mismo o una muteína del mismo;

(ii)

la secuencia de aminoácidos del inhibidor de 40 kDa o un fragmento inhibitorio del TNF o una muteína del mismo;

(iii)

la secuencia de aminoácidos del inhibidor de 40 kDa \Delta53 o un fragmento inhibitorio del TNF o una muteína del mismo;

(iv)

la secuencia de aminoácidos del inhibidor de 40 kDa \Delta51 o un fragmento inhibitorio del TNF o una muteína del mismo.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, donde dicho inhibidor del TNF tiene un residuo de cisteína no natural.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, donde el residuo de cisteína no natural está en la posición 105 del inhibidor de 30 kDa.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde el inhibidor del TNF está glicosilado o donde el inhibidor del TNF no está glicosilado.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde el inhibidor del TNF tiene un residuo de metionina en el extremo N.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, donde dicho inhibidor del TNF es producido por métodos de ADN recombinante.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde el inhibidor del TNF es substancialmente puro.

9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, donde dicho polipéptido está unido a un radical polimérico repetitivo de alto peso molecular.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, donde el material polimérico de alto peso molecular es polietilenglicol.

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, donde el medicamento contiene una formulación de liberación lenta farmacológicamente compatible.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, donde el medicamento permite la administración intraarticular, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal, oral o tópica del inhibidor del TNF.

13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, donde el medicamento permite una infusión continua.