ES2314040T3 - Anticuerpo anti-osteopontina y su uso. - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo anti-osteopontina producido por el hibridoma depositado como FERM BP-7883.

Description

Anticuerpo anti-osteopontina y su uso.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-osteopontina producido por el hibridoma depositado como FERM BP-7883, y a un agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, reumatismo y artritis reumatoide, que comprende el anticuerpo, así como al uso del anticuerpo para la preparación de un medicamento para tratar dichas enfermedades.
Técnica de base
La osteopontina (que en adelante, en el presente texto, se denominará "OPN") es una glicoproteína ácida que se une al calcio, abundante en los huesos. Se ha sabido que tres tipos de isoformas de OPN humana, que son la osteopontina-a (que en adelante, en el presente texto, se denominará "OPN-a"), osteopontina-b (que en adelante, en el presente texto, se denominará "OPN-b") y osteopontina-c (que en adelante, en el presente texto, se denominará "OPN-c") se generan naturalmente por ayuste alternativo (Y. Saitoh et al., (1995): Laboratory Investigation, 72, 55-63). Se cree que, entre ellas, el precursor de OPN-a tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra más adelante como SEQ ID NO. 1 en la Lista de Secuencias, en donde el péptido señal es segmentado en la secreción, de manera que se prepara la forma madura OPN-a de I17-N314. Adicionalmente, la OPN madura es segmentada con trombina en el lado C-terminal del 168º resto arginina a partir de un organismo biológico en dos fragmentos, N-terminal y C-terminal.
La OPN descrita anteriormente tiene varias funciones fisiológica y patológicamente importantes, por ejemplo la adhesión celular, migración celular, carcinogenia, respuesta inmunitaria e inhibición de la citólisis mediada por el complemento. Varios tipos de receptores en la superficie celular median en las diversas funciones. La OPN contiene la secuencia RDG (por ejemplo, la OPN-a tiene la secuencia desde el resto en la posición 159 hasta el resto en la posición 161). Las especies de integrina que reconocen la secuencia RGD tales como \alphaV\beta3, \alphaV\beta1 y \alphaV\beta5 son importantes receptores de OPN; específicamente, las especies de integrina \alphaV\beta3, \alphaV\beta1 y \alphaV\beta5 median la adhesión de las células en las células de la musculatura lisa vascular. Además, la \alphaV\beta3 está implicada en las migraciones de macrófagos, linfocitos, células endoteliales y células de la musculatura lisa, y similares.
Además, los trabajos de investigación realizados hasta ahora han dejado claro que la OPN se une también a través de la secuencia SVVYGLR a las especies de integrina \alpha9\beta1, \alpha4\beta1 y \alpha4\beta7 y que también se encuentra una diferencia en el modo, de forma que la \alpha4\beta1 se une a ambas OPN, aún no segmentada con trombina (OPN del tipo de no-segmentación) y el fragmento N-terminal de OPN segmentada con trombina (OPN del tipo de segmentación), mientras que \alpha9\beta1 se une solamente a la OPN del tipo de segmentación con trombina (Y. Yokosaki et al., (1999): The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334/ P. M. Green et al., (2001): FEBS Letters 503, 75-79/ S. T. Barry et al., (2000): Experimental Cell Research 258, 342-351). Estas subunidades de integrina \alpha9 y \alpha4 o las subunidades de integrina \beta1 y \beta7 son muy similares entre sí en términos de secuencia de aminoácidos. Adicionalmente, las especies de integrina \alpha4\beta1 y \alpha4\beta7 se encuentran principalmente en linfocitos y monocitos, mientras que en los neutrófilos las especies de integrina se expresan muy ligeramente. Alternativamente, \alpha9\beta1 se expresa selectivamente en gran medida en los neutrófilos y tiene funciones esenciales para la migración de los neutrófilos a través de VCAM-1 y Tenascin-C. Adicionalmente, la integrina se expresa también de forma diversa en células musculares, células epiteliales y células hepáticas. Como se describió antes, los dominios citoplasmáticos de las subunidades de integrina \alpha4 y \alpha9 favorecen cooperativamente la migración de leucocitos hacia los sitios inflamatorios y la agregación en los mismos, mediante rutas de transmisión de señales celulares individuales que difieren sutilmente unas de otras, para potenciar sus actividades de infiltración. De tal manera, las subunidades de integrina están implicadas en varias reacciones infla-
matorias.
Como se describió anteriormente, varios tipos de especies de integrina favorecen la migración de los leucocitos y por tanto están implicadas en las reacciones inflamatorias. Por consiguiente, las sustancias farmacéuticas que inhiben estas actividades de la integrina pueden tener potencialmente una posibilidad como agente antiinflamatorio. Por ejemplo, la integrina \alphaV\beta3 se expresa en células tipo osteoclasto, células endoteliales vasculares y células de la musculatura lisa, y similares. Ahora se está desarrollando un anticuerpo anti-\alphaV\beta3, que trabajará inhibiendo la unión entre la integrina \alphaV\beta3 y varios ligandos de unión de los mismos para ejercer potencialmente, por ejemplo, una acción que suprima las lesiones articulares.
Como los receptores de la familia de la integrina aparecen comúnmente en diversos tejidos proporcionando funciones esenciales para el control de actividades vitales, el uso de anticuerpos contra la integrina para el tratamiento terapéutico de la artritis reumatoide y la osteoartritis puede desencadenar posiblemente la misma inhibición en otros sitios y también puede producir la aparición de efectos secundarios.
Adicionalmente, el documento WO 01/71358 describe un método para el cribado de una sustancia que inhibe la unión entre la integrina \alpha4 y la osteopontina, y un método para tratar terapéuticamente enfermedades inflamatorias, usando la sustancia recuperada por medio de tal cribado.
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El documento WO 01/71358 describe un método para el cribado de inhibidores de osteopontina. Es un documento de acuerdo con el Artículo 54 (3) de la EPC. Describe anticuerpos que reconocen el motivo SVVYGLR o el motivo RGDSVVYGLR de la osteopontina y su uso para la detección de una enfermedad inflamatoria, por ejemplo la artritis.
El documento WO 00/63247 describe el péptido quimiotáctico derivado de la osteopontina y agentes inhibidores. Se describe el anticuerpo anti-osteopontina, que reconoce el sitio LVLPDK en el lado C-terminal de la osteopontina. También describe el uso de agentes inhibidores para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias.
Se ha encontrado que hay varios factores que están implicados en la patogénesis de la artritis reumatoide. Así, se han publicado muchos trabajos relacionados con esto. Sin embargo, no todos ellos son fiables. Además, los métodos terapéuticos actualmente conocidos para la misma son nosotrópicos y no han sido esencialmente satisfactorios.
Por tanto, es muy de desear dilucidar definitivamente la patogénesis de la artritis reumatoide y proporcionar mejores terapias para la misma. Un propósito de la presente invención es resolver tales problemas.
Además, la artritis reumatoide está muy discriminada de la osteoartritis. Por consiguiente, otro propósito de la presente invención es proporcionar un método de diagnóstico para la misma.
Descripción de la invención
Los presentes inventores encontraron que la concentración de OPN en cada uno de los fluidos de las cavidades articulares de pacientes de reumatismo y pacientes de osteoartritis tenía un valor elevado. Adicionalmente, los inventores encontraron el aumento de la relación del fragmento N-terminal del tipo de segmentación por trombina en la OPN total en pacientes de reumatismo por primera vez. Así, los inventores conjeturaron que la OPN podría estar muy implicada en la aparición de estas enfermedades. Como se describe en el Ejemplo de Referencia, entonces, los autores verificaron los hallazgos en experimentos usando ratones genosuprimidos para la OPN.
Además, los inventores prepararon anticuerpos que reconocen individualmente de forma discriminante el fragmento N-terminal y el fragmento C-terminal de la OPN segmentada por trombina. Entonces, los autores encontraron en experimentos con los anticuerpos que el fragmento N-terminal de la OPN segmentada con trombina estaba en una concentración elevada en los fluidos de las cavidades articulares de los pacientes con artritis reumatoide, en particular.
Los inventores enfocaron su atención en la presencia conjunta de la secuencia RGD y la secuencia SVVYGLR, ambas reconocidas por la integrina de tipo humano, en el fragmento N-terminal a las concentraciones elevadas que se observan en los pacientes con artritis reumatoide. Entonces, los inventores anticiparon que un anticuerpo que bloquea simultáneamente ambas secuencias inhibiría ampliamente la unión entre la OPN y la integrina, por lo que el anticuerpo podría ser eficaz para el tratamiento terapéutico de la artritis reumatoide y la osteoartritis.
Además, la OPN se distribuye en los riñones, la placenta, los ovarios, el cerebro, la piel, y similares, pero principalmente se expresa en el tejido óseo. Los inventores consideraron que, para el tratamiento terapéutico de la artritis reumatoide, la unión entre OPN e integrina sería preferentemente bloqueada por un método más específico para el lado de la OPN. Dado que las diversas especies de integrina están implicadas en la inflamación de una manera cooperadora, los inventores consideraron que sería efectivo bloquear más ampliamente la unión a estas diversas especies de integrina.
Por consiguiente, los inventores prepararon un anticuerpo que inhibe la unión entre la secuencia RGD de la OPN humana y la integrina y la unión entre la secuencia SVVYGLR de la OPN humana y la integrina, y después comprobaron los efectos del mismo en experimentos de adhesión celular y migración celular, y similares. Además, los inventores recuperaron un anticuerpo contra péptidos sintéticos correspondientes a tales secuencias internas de la OPN murina, para examinar la eficacia de dicho anticuerpo como agente terapéutico, usando un modelo artrítico en ratones.
Más específicamente, como la OPN murina tiene las secuencias RGD y SLAYGLR reconocibles por la integrina murina, que están situados en posiciones homólogas a la OPN humana en términos de secuencia de aminoácidos, se recuperó un anticuerpo M5 como anticuerpo que bloquea simultáneamente estas secuencias. Se comprobó que la unión del anticuerpo M5 con OPN murina y los productos de la digestión de la misma con trombina, era inhibida por el péptido GRGDSP que incluye el sitio de secuencia RGD, y que el anticuerpo M5 inhibía la migración activada por TNF-\alpha de monocitos derivados del bazo murino. Se observó también que el anticuerpo M5 tenía una acción supresora de la lesión ósea cuando se examina en un sistema de cultivo de órganos de la bóveda craneal murina. Además, se confirmó que el anticuerpo mostraba un claro efecto terapéutico, cuando se administra a un modelo de artritis murina por colágeno.
Los resultados anteriormente mencionados sugieren intensamente que el anticuerpo que bloquea simultáneamente la unión en los sitios de las secuencias RGD y SVVYGLR con integrina de tipo humano, inhibe la unión entre OPN e integrina y es por tanto efectivo para el tratamiento terapéutico de la artritis reumatoide, y que el anticuerpo será posiblemente efectivo no sólo para el reumatismo tal como el reumatismo articular juvenil y el reumatismo crónico, sino también para la artritis soriásica y la soriasis. Adicionalmente, los rechazos crónicos después de un trasplante de órganos implican de forma característica trastornos oclusivos vasculares y bronquiales. El examen histológico sugiere que, dado que la activación de las células T y macrófagos dispara la generación de citocinas y factores de crecimiento y los trastornos de células endoteliales vasculares, y dado que la proliferación de células de la musculatura lisa vascular desencadena la fibrogénesis y similares, posiblemente tendrá lugar la oclusión vascular (P. Freese et al., (2001): Nephrol Dial Transplant, 16, 2401-2406/J. R. Waller et al., (2001): British Journal of Surgery, 88, 1429-1441/S. R. Lehtonen et al., (2001): Transplantation, 72, 1138-1144). Una publicación da cuenta de que la OPN tiene una función como proteína esencial para la activación de los macrófagos y la fibrogénesis de células de musculatura lisa vascular (A. O'Regan et al., (2000): Int J Exp Pathol, 81, 373-390). Así, el anticuerpo inhibidor de la OPN de la presente invención suprime la migración de monocitos y neutrófilos, suprimiendo así posiblemente el curso hacia tal fibrogénesis. Así, el anticuerpo suprime los rechazos crónicos después del transplante de órganos, con las contribuciones resultantes a la adhesión del órgano. Adicionalmente, el anticuerpo será eficaz para el tratamiento terapéutico de enfermedades autoinmunitarias, entre las que se incluyen enfermedades autoinmunitarias sistémicas, eritema, uveitis, enfermedad de Behcet, miositis múltiple, glomerulonefritis proliferativa, sarcoidosis, y similares.
En otras palabras, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-osteopontina producido por el hibridoma FERM BP-7883 y que inhibe la unión entre una integrina que reconoce la secuencia RGD y la OPN o un fragmento de la misma, y también que inhibe ampliamente la unión entre una integrina que reconoce la secuencia SVVYGLR o una secuencia correspondiente, y la osteopontina, o un fragmento de la misma.
Además, la presente invención proporciona un agente terapéutico del reumatismo y un agente terapéutico de la artritis reumatoide, y un agente terapéutico para el tratamiento de la osteoartritis, y estos agentes terapéuticos contienen el anticuerpo anti-osteopontina como ingrediente efectivo.
También, la invención proporciona el uso del anticuerpo para la elaboración de un medicamento para tratar el reumatismo, la artritis reumatoide y la osteoartritis.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra gráficos que representan la inhibición de la adhesión celular dependiente de RGD, a OPN.
La Fig. 2 muestra gráficos que representan la inhibición de la adhesión celular dependiente de RGD e independiente de RGD entre nOPN y células SW480 transformadas con \alpha9 mediante el anticuerpo 2K1.
La Fig. 3a muestra gráficos que representan la migración de células inducida por OPN.
La Fig. 3b muestra gráficos que representan la supresión de la migración de células inducida por OPN, mediante anticuerpos.
La Fig. 4 muestra gráficos que representan el curso del tiempo de los cambios de la puntuación de la artritis cuando el cóctel de anticuerpos artritogénicos/LPS fue administrado individualmente a un ratón deficiente del gen de OPN y a un ratón normal.
La Fig. 5 muestra gráficos que representan la comparación de la hinchazón de la muñeca cuando el cóctel de anticuerpos artritogénicos/LPS fue administrado a ratones deficientes en el gen de OPN y a ratones normales, individualmente.
La Fig. 6 muestra gráficos que representan la adhesión entre OPN murina y NIH3T3 de una manera dependiente de la concentración.
La Fig. 7 muestra gráficos que representan la inhibición de la adhesión entre OPN murina y NIH3T3 mediante el péptido GRGDSP.
La Fig. 8 muestra gráficos que representan la inhibición de la adhesión entre OPN murina y NIH3T3 mediante el anticuerpo M5.
Modo de llevar a cabo la invención
El anticuerpo anti-osteopontina (denominado en adelante en el presente texto "anticuerpo inhibidor de la OPN") que inhibe la unión entre una integrina que reconoce la secuencia RGD y la OPN, o un fragmento de la misma, y que también inhibe la unión entre una integrina que reconoce la secuencia SVVYGLR o una secuencia correspondiente y la OPN o un fragmento de la misma, es un anticuerpo que inhibe la unión de una integrina que reconoce la secuencia RGD, por ejemplo \alphav\beta1, \alphav\beta3 y \alphav\beta5 con OPN-a, o un fragmento N-terminal de la misma, y que también inhibe la unión de una integrina que reconoce la secuencia SVVYGLR, por ejemplo \alpha9\beta1, \alpha4\beta1 y \alpha4\beta7 con OPN-a, o un fragmento N-terminal de la misma. La secuencia SVVYGLR o una secuencia correspondiente de la misma significa las secuencias que se describen más adelante; la secuencia SVVYGLR significa la secuencia desde la serina en posición 162 hasta la arginina en posición 168 en la OPN humana, mientras que la secuencia correspondiente de la misma significa una secuencia correspondiente a SVVYGLR en las OPNs de otros mamíferos, que es, por ejemplo, SVVYGLR de cerdo idéntica a la secuencia en personas, SVAYGLR en el mono, SLAYGLR en ratón y rata, SVAYGLK en animales bovinos y SVAYRLK en el conejo.
El método para preparar el anticuerpo no está limitado específicamente. El anticuerpo inhibidor de la OPN puede prepararse usando por ejemplo OPN-a, o un fragmento N-terminal de la misma, o un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos RGDSVVYGLR o una secuencia correspondiente de la misma (denominada en adelante en el presente texto "péptido relacionado con OPN") como antígeno. El fragmento de OPN que se menciona aquí incluye fragmentos de OPN generados digiriendo OPN con proteinasas y similares, y es por ejemplo un fragmento recuperado por segmentación con trombina.
El anticuerpo inhibidor de la OPN se prepara preferentemente usando un péptido que contiene la secuencia RGDSVVYGLR como antígeno. Más preferentemente, el anticuerpo inhibidor de OPN se prepara, por ejemplo, usando como antígeno el péptido (VDTYDGRGDSVVYGLRS) que contiene las dos secuencias en una secuencia sucesiva, que parte de valina en posición 153 y acaba en serina en posición 169 en el caso de la OPN-a, y a continuación tratando el péptido de acuerdo con un método general. Con el fin de elevar la antigenicidad, preferentemente, se usa un producto del péptido relacionado con la OPN unido a un compuesto biopolímero.
Para trabajos de investigación de enfermedades relacionadas con la OPN, usando ratones como animal experimental, preferentemente, se usa un anticuerpo inhibidor de la OPN contra la OPN murina. Tal anticuerpo se prepara preferentemente usando un péptido que contiene la secuencia RGDSLAYGLR como antígeno.
Los ejemplos de compuesto biopolímero a unir al péptido relacionado con la OPN incluyen, por ejemplo, hemocianina Macroschisma (llamada en adelante en el presente texto "KLH"), ovoalbúmina (llamada en adelante en el presente texto "OVA"), albúmina de suero bovino (llamada en adelante en el presente texto "BSA"), albúmina de suero de conejo (llamada en adelante en el presente texto "RSA"), y tiroglobulina. Entre ellas, la KLH y la tiroglobulina son más preferibles.
El péptido relacionado con la OPN y el compuesto biopolímero se unen por métodos conocidos, por ejemplo el procedimiento de anhídrido de ácido mixto (B. F. Erlanger et al., (1954): J. Biol. Chem. 234, 1090-1094) o el procedimiento del éster activado (A. E. Karu et al., (1994): J. Agric. Food Chem. 42, 301-309).
El anhídrido de ácido mixto para ser usado en el procedimiento del anhídrido de ácido mixto puede ser recuperado sometiendo el péptido relacionado con la OPN a la reacción general de Schotten-Baumann, que después se deja reaccionar con un compuesto biopolímero para preparar el producto unido objetivo del compuesto péptido-polímero. El éster haloformiato para ser usado en el procedimiento del anhídrido de ácido mixto incluye por ejemplo cloroformiato de metilo, bromoformiato de metilo, cloroformiato de etilo, bromoformiato de etilo, cloroformiato de isobutilo, y similares. La relación de péptido, éster haloformiato y compuesto polímero a usar de acuerdo con el método se elige apropiadamente en un amplio margen.
En la presente invención, la reacción de Schotten-Baumann se lleva a cabo en presencia de un compuesto básico. El compuesto básico para ser usado en la reacción incluye compuestos para uso rutinario para la reacción de Schotten-Baumann, por ejemplo bases orgánicas tales como trietilamina, trimetilamina, piridina, dimetilanilina, N-metilmorfolina, diazabiciclononeno (DBN), diazabicicloundeceno (DBU), diazabiciclooctano (DABCO), y similares, y bases inorgánicas tales como carbonato potásico, carbonato sódico, hidrógeno carbonato potásico, hidrógeno carbonato sódico, y similares.
Adicionalmente, la reacción tiene lugar generalmente a una temperatura entre -20ºC y 100ºC, preferentemente de 0ºC a 50ºC. El tiempo de reacción es aproximadamente entre 5 minutos y 10 horas, preferentemente entre 5 minutos y 5 horas.
La reacción entre el anhídrido de ácido mixto resultante y el compuesto biopolímero se lleva a cabo generalmente entre -20ºC y 150ºC, preferentemente entre 0ºC y 100ºC, para un tiempo de reacción de aproximadamente 5 minutos a 10 horas, preferentemente de 5 minutos a 5 horas. El método del anhídrido de ácido mixto se lleva a cabo generalmente en un disolvente. El disolvente incluye, por ejemplo, cualquiera de los disolventes utilizados comúnmente para el método del anhídrido de ácido mixto, incluyendo específicamente hidrocarburos halogenados tales como diclorometano, cloroformo y dicloroetano; hidrocarburos aromáticos tales como benceno, tolueno y xileno; éteres tales como dietil éter, dioxano, tetrahidrofurano y dimetoxietano; ésteres tales como acetato de metilo y acetato de etilo; disolventes polares no protónicos tales como N,N-dimetilformamida, dimetilsulfóxido, haxemetilfosfotriamida; y similares.
Alternativamente, el procedimiento de activación de éster se hace generalmente de la forma que sigue. Disolviendo en primer lugar el péptido relacionado con OPN en un disolvente orgánico, para la reacción con N-hidroxisuccinimida en presencia de un agente de acoplamiento, se produce un éster activado con N-hidroxisuccinimida.
Como agente de acoplamiento, pueden usarse agentes de acoplamiento generales para uso rutinario en reacciones de condensación, incluyendo, por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida, carbonildiimidazol y carbodimida hidrosoluble. Como disolvente orgánico, alternativamente, por ejemplo, puede usarse N,N-dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido y dioxano. La relación molar de péptido y agente de acoplamiento tal como N-hidroxisuccinimida para su uso en la reacción es preferentemente de 1:10 a 10:1, lo más preferentemente 1:1. La temperatura de reacción es de 0ºC a 50ºC, preferentemente de 22ºC a 27ºC, mientras que el tiempo de reacción es de 5 minutos a 24 horas, preferentemente de una hora a 2 horas. Una temperatura de reacción satisfactoria es una temperatura por encima de los puntos de fusión individuales, y por debajo de los puntos de ebullición individuales.
Después de la reacción de acoplamiento, la solución de reacción se añade a una solución que disuelve un compuesto de biopolímero en la misma, para que reaccione. En el caso en el que el compuesto de biopolímero tiene un grupo amino libre, por ejemplo, se forma un enlace ácido-amida entre el grupo amino y el grupo carboxilo del péptido. La temperatura de reacción es de 0ºC a 60ºC, preferentemente de 5ºC a 40ºC, y más preferentemente de 22ºC a 27ºC, mientras que el tiempo de reacción es de 5 minutos a 24 horas, preferentemente de una hora a 16 horas, y más preferentemente de una hora a 2 horas.
El producto de reacción entre el péptido relacionado con OPN y el compuesto de biopolímero que se genera por el método se purifica mediante diálisis o con una columna de desalación y similares, para recuperar el producto del péptido relacionado con la OPN unido al compuesto de biopolímero (denominado en el presente texto en lo sucesivo simplemente como "producto unido").
A continuación, en el presente texto sigue una descripción acerca del método para preparar un anticuerpo usando como antígeno el producto unido así recuperado, y un método de inmunoensayo usando el anticuerpo. Para la preparación del anticuerpo, en la presente invención, pueden utilizarse apropiadamente métodos conocidos, que se describen, por ejemplo, en Zoku Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Lecture Series), y Men-eki Seikagaku Kenkyu Ho (Immuno-Biochemistry Research Method) (Nihon Seikagaku Gakkai hen (Japan Biochemical Association, ed.)).
Para preparar un anticuerpo policlonal usando el producto unido de acuerdo con la presente invención, se inmuniza un animal con el producto unido para recoger el anticuerpo del animal.
Más específicamente, por ejemplo, un producto unido, tal como el producto unido péptido relacionado con OPN-tiroglobulina, se disuelve en primer lugar en tampón de fosfato sódico (denominado en adelante en el presente texto como "PBS"), que después se mezcla con el coadyuvante de Freund completo, o con el coadyuvante de Freund incompleto, o un agente auxiliar tal como alumbre. La mezcla resultante se usa como inmunógeno para la inmunización de un animal mamífero.
Cualquier animal para uso rutinario en el campo puede ser usado como animal para inmunización, incluyendo por ejemplo ratones, ratas, conejos, cabras y caballos. Adicionalmente, el método para dosificar el inmunógeno para la inmunización puede ser cualquier método de inyección subcutánea, inyección intraperitoneal, inyección intravenosa e inyección intramuscular. La inyección subcutánea o la inyección intraperitoneal son preferibles. La inmunización puede hacerse una vez o varias veces en intervalos apropiados, preferentemente en un intervalo de una a 5 semanas.
De acuerdo con un método general, entonces, se recoge la sangre del animal inmunizado, de la cual se separa el suero. Purificando la fracción de anticuerpo policlonal, puede recuperarse el anticuerpo inhibidor de la OPN.
De acuerdo con un método general, adicionalmente, una célula inmunitaria recuperada inmunizando un animal con el producto unido se fusiona con una célula de mieloma para preparar un hibridoma. Recogiendo un anticuerpo a partir de un cultivo del hibridoma, el anticuerpo inhibidor de OPN puede ser recuperado con un anticuerpo monoclonal.
Cuando el anticuerpo de la presente invención está destinado para ser usado en el tratamiento terapéutico de animales, incluyendo personas, se da preferencia al uso de un anticuerpo quimérico (véase la publicación de Patente Europea EP 0125023) preparado mediante una modificación por ingeniería genética tal que el anticuerpo inhibidor de la OPN resultante podría tener la misma región constante que la de tal anticuerpo para un sujeto humano o animal a tratar, o al uso del anticuerpo que ha sido animalizado (véanse las publicaciones de Patente Europea EP 0239400 o EP 045126). De otra forma, preferentemente, se usa un anticuerpo monoclonal (anticuerpo de tipo animal para la especie animal) (véase la publicación de Patente Europea EP 0546073 o el documento WO 97/07671, como se prepara usando un animal transgénico con un gen introducido artificialmente implicado en la generación del anticuerpo en el sujeto humano o animal a tratar.
En el caso en el que el sujeto a tratar es humano y el animal que genera el anticuerpo inhibidor de la OPN es un ratón, preferentemente, se usan anticuerpo quiméricos de ratón humanos o anticuerpo humanizados. Más preferentemente, se usa un animal transgénico tal como un ratón al que se ha introducido un gen humano implicado en la generación del anticuerpo, para preparar un anticuerpo monoclonal de tipo humano, para su uso subsiguiente. Además, puede usarse satisfactoriamente el método de presentación de fago para la generación del anticuerpo.
El anticuerpo inhibidor de la OPN así recuperado puede ser usado en forma de Fv, Fab o F(ab')_{2} con el sitio de reconocimiento del antígeno cortado del anticuerpo inhibidor de la OPN con proteasa y similares.
El anticuerpo inhibidor de la OPN así recuperado se purifica más intensamente, si es necesario, y se formula a continuación en formas de dosificación de acuerdo con un método general, para ser usado en el tratamiento terapéutico de la artritis reumatoide, el reumatismo tal como reumatismo juvenil articular y reumatismo crónico, u osteoartritis.
El anticuerpo inhibidor de la OPN de la presente invención puede usarse preferentemente como agente terapéutico del reumatismo o agente terapéutico de la artritis reumatoide. Los ejemplos de las formas de dosificación de estos agentes terapéuticos del reumatismo, y similares, incluyen formas parenterales tales como inyecciones e infusiones, que se usan preferentemente por inyección intravenosa y inyección subcutánea (para su uso como agente terapéutico de enfermedades autoinmunitarias, deben seguirse los ejemplos descritos anteriormente). Para la formulación, adicionalmente, pueden usarse vehículos y aditivos aceptables farmacéuticamente, dentro de un margen aceptable farmacéuticamente, que dependen de la forma de dosificación.
La cantidad de anticuerpo inhibidor de la OPN a añadir para la formulación varía, dependiendo de la gravedad de los síntomas y la edad del paciente, la forma de dosificación de la formulación a usar o el título de la unión de anticuerpo inhibidor de la OPN, o similares. Por ejemplo, se usa satisfactoriamente una cantidad de aproximadamente 0,1 mg/kg a 100 mg/kg.
Como el anticuerpo inhibidor de la OPN como ingrediente efectivo en el agente terapéutico así recuperado de la presente invención se une firmemente a las secuencias RGD y SVVYGLR en la OPN, el anticuerpo inhibidor de la OPN inhibe posiblemente la unión entre estas regiones de la OPN y la integrina, suprimiendo en consecuencia la exacerbación de los síntomas de reumatismo, y de la artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunitarias.
Dado que el anticuerpo inhibidor de la OPN de la presente invención se une específicamente al lado de la OPN, y no al lado de la integrina, el anticuerpo potencialmente no inhibe nunca otras funciones importantes de la integrina, por lo que es de esperar que puedan evitarse efectos secundarios desventajosos.
Ejemplos
La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes Ejemplos y Ejemplo de Referencia.
Ejemplo 1 Clonación, construcción, purificación y reactivos para la proteína de fusión GST-OPN
La clonación y la purificación de la proteína se hicieron esencialmente de acuerdo con el método descrito en la referencia (S. Kon et al., (2000): J. Cell. Biochem. 77: 487-498).
Los cDNAs de las isoformas de OPN humana, es decir OPN-a y OPN-b, fueron recuperados de la forma que sigue. Usando RNA preparado a partir de células NRC-12 de una línea de células de cáncer de riñón humanas como plantilla, se preparó sintéticamente el cDNA; usando el cDNA como plantilla se realizó la PCR usando los siguientes cebadores OPN-5 y OPN-3 para recuperar cDNAs que codifican la OPN-a y OPN-b humana de longitud completa individualmente incluyendo las correspondientes regiones de péptido señal.
De la manera que se describe en la referencia, entonces, los cDNAS de OPN-a y OPN-b así clonados fueron insertados en el vector pGEX4T (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan) de forma que los cDNAs pudieran estar en el mismo marco de lectura que el del gen de GST (glutation S-transferasa; EC2.5.1.18), para expresión en forma de proteína de fusión con GST, usando Escherichia coli JM109 (las proteínas de fusión GST-OPN así recuperadas se denominan como "GST-OPN-a" y "GST-OPN-b" en lo sucesivo).
OPN-5:
5'-CGGGATCCACTACCATGAGAATTGCAGTGATTTGC-3'
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OPN-3
5'-CCGCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGATGCACTATC-3'
El cDNA que codifica la isoforma OPN-c humana fue preparado mediante PCR en dos etapas usando cDNA de OPN-a como plantilla. En una primera etapa, se hizo individualmente la PCR usando OPN-5 y el siguiente cebador OPNct-3 o el siguiente cebador OPNct-5 y cebador OPN-3; los dos productos de la PCR resultantes se mezclaron, se trataron térmicamente y se enfriaron gradualmente para reasociación, seguida por la adición de una enzima para prolongación. En una segunda etapa, subsiguientemente, se hizo la PCR usando los cebadores OPN-5 y OPN-3, para recuperar el cDNA que codifica la OPN-c humana de longitud completa, que incluye la región del péptido señal. El cDNA de la isoforma c se integró en el vector pGEX4T por el mismo método que para las isoformas a y b, para preparar una proteína de fusión (denominada en el presente texto en adelante "GST-OPN-c").
OPNct-3:
5'-ACACAGCATTCTTTTCCACAGAACTTCCAGAATCAGC-3'
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OPNct-5:
5'-TGAGGAAAAGAATGCTGTGTCCTCTGAAGAAAACC-3'
El cDNA que codifica el resto mitad en el lado amino terminal (M1-R168) a partir del sitio segmentado por trombina de OPN-a, fue recuperado mediante PCR usando el cDNA de OPN-a como plantilla y OPN-5, junto con el siguiente cebador OPNnh-3 que se describe más adelante. Por el mismo método que para las isoformas a y b, el cDNA resultante se integró en el vector pGEX4T para preparar una proteína GST (denominada en adelante en el presente texto "GST-Nhalf").
OPNnh-3:
5'-GCCTCGAGTTACCTCAGTCCATAAACCACACT-3'
La proteína osteopontina (hOPN Chalf) en el lado carboxilo a partir del sitio segmentado por trombina de OPN-a fue preparada mediante PCR en dos etapas usando el cDNA de OPN-a como plantilla. En una primera etapa, la PCR se hizo, individualmente, usando OPN-5, el cebador OPNch-3 que sigue, el OPNch-5 que sigue y el cebador OPN-3. En una segunda etapa, se hizo la PCR usando los cebadores OPN-5 y OPN-3, para preparar la proteína OPN en el lado carboxilo. Por el mismo método que para las isoformas a y b, la recombinación en el vector pGEX4T permitió la preparación de una proteína GST (denominada como "GST-Chalf" en adelante en el presente texto).
OPNch-3:
5'-TCTTAGATTTGGCACAGGTGATGCCTAGGAG-3'
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OPNch-5:
5'-C ACCTGTGCCAAATCTAAGAAGTTTCGCAGA-3'
Varias proteínas de fusión GST-OPN recombinantes fueron preparadas en Escherichia coli por un método general, y después fueron purificadas usando una columna de glutatión-Sepharosa de acuerdo con el método descrito en la referencia. Entre ellos, la proteína GST-Nhalf fue segmentada en el sitio de unión con una proteasa PreScission (PreScission, Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan), para eliminar el resto de proteína GST y recuperar así una proteína (denominada en adelante en el presente texto "nOPN") compuesta por el resto mitad amino terminal (I17-R168) de OPN solo.
Alternativamente, el cDNA que codifica la OPN-a de longitud completa (M1-N314) se insertó en el vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen Corporation), para transfección en células CHO-K1 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (denominadas en adelante en el presente texto "células CHO/OPN-a"). La OPN-a del tipo unido a cadena de azúcar (denominada en adelante en el presente texto "CHO/OPN-a"), como se recupera de la célula, se purificó de la forma que sigue. Específicamente, el sobrenadante del cultivo de las células CHO-OPN-a se sometió a cromatografía en columna de intercambio iónico usando una columna de DEAE-Sepharosa CL-6B (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan) y cromatografía de filtración en gel en una columna ULTROGEL AcA44 (fabricada por BioSepra SA), y continuamente a cromatografía en columna de fase inversa en una columna RESOURCE RPC (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan). De esta manera se completó la purificación.
Varios péptidos adquiridos de Sigma Genosis Japan fueron usados para trabajos de investigación sobre la sensibilización y unión inmunológica; por otra parte, tales péptidos fueron recuperados por síntesis química mediante el procedimiento del Fmoc (N-(9-fluorenil)metoxicarbonilo) con un sintetizador de péptidos (Modelo 432 A; fabricado por Perkin Elmer Life Science, Inc.) y purificación por cromatografía en columna de fase inversa C18.
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Ejemplo 2 Producción de anticuerpo monoclonal
Se prepararon péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias internas de la OPN humana, como se muestra a continuación, que después se usaron para la inmunización.
Péptido 1:
CVDTYDGRGDSVVYGLRS (C + V153 a S169)
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Péptido 2:
CIDSQELSKVSREFHSH (C + I261 a H276)
Específicamente, el Péptido 1 tiene las secuencias RGD y SVVYGLR que reconocen los receptores de integrina \alphav\beta3 \alpha9\beta1, respectivamente.
Estos péptidos se unieron a tiroglobulina, y después se usaron para inmunización murina de acuerdo con un método general. En forma continua, se aislaron del ratón inmunizado los esplenocitos, que después fueron sometidos a fusión celular con una célula de mieloma murina P3-X63-Ag8-653, usando polietilenglicol. De acuerdo con el método descrito en la referencia (M. Kinebuchi et al., (1991): J. Immunol., 146, 3721-3728) se seleccionó un hibridoma que reacciona con cada uno de los péptidos usados para la inmunización.
De los ratones inmunizados con los péptidos 1 y 2 se recuperaron anticuerpos monoclonales designados 2K1 y 4C1, respectivamente. El hibridoma que genera el anticuerpo monoclonal 2K1 fue depositado como FERM BP-7883 en el Patent Organism Depository Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japón) con fecha 20 de Junio de 2001. Adicionalmente, el anticuerpo monoclonal 53 (mAb53) fue recuperado por inmunización con la OPN humana recombinante de longitud completa (D. S. Bautista et al., (1994): J. Biol. Chem., 269, 23280-23285).
Ejemplo 3 Reactividad de la OPN y de productos de digestión de la misma con trombina, con los anticuerpos monoclonales
Las potencias de unión de los anticuerpos monoclonales murinos 2K1 y 4C1 recuperados en el Ejemplo 2 frente a la OPN y los productos de digestión de la misma con trombina, fueron ensayadas mediante el método de transferencia Western. Se encontró que el anticuerpo murino 2K1 reaccionaba con GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c y GST-Nhalf. El anticuerpo 4C1 reaccionaba con GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c y GST-Chalf. Además, estos anticuerpos monoclonales no solo se unían a las OPNs recombinantes del tipo no unido a cadena de azúcar como se generan en Escherichia coli, sino que también reaccionaban con la proteína CHO/OPN-a del tipo unido a cadena de azúcar y los productos de digestión de la misma con trombina (denominado en adelante en el presente texto "OPN segmentada con trombina").
Ejemplo 4 Inhibición de la adhesión celular a OPN mediante los anticuerpos monoclonales
Por el método que sigue se examinó si los anticuerpos monoclonales inhibían o no la adhesión celular a OPN. En primer lugar, se precubrió una placa de 96 pocillos con varias concentraciones de la CHO/OPN-a a 4ºC durante la noche, que después se trataron con BSA al 0,5% en PBS bajo las condiciones de temperatura de 37ºC durante 10 minutos, para bloquear la adhesión no específica. Células de fibroblasto humanas TIG-7 o SW480 transformadas con el cDNA de una subunidad de integrina \alpha9 (denominadas en adelante en el presente texto "células SW480 transformadas con \alpha9") fueron suspendidas en D-MEM que contiene 0,25% de BSA; se inyectaron 200 \mul de la suspensión de células resultante (a una concentración de células de 5 x 10^{4} células por pocillo) en una placa de 96 pocillos precubierta con CHO/OPN-a o nOPN, en presencia o en ausencia de varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales o péptidos sintéticos, para incubación a 37ºC durante una hora.
El medio de cultivo se descargó de la placa y todos los pocillos fueron aclarados dos veces con D-MEM que contiene 0,25% de BSA. Las células adherentes se fijaron y se tiñeron con violeta cristal al 0,5% en metanol al 20% durante 30 minutos.
Todos los pocillos se aclararon tres veces con agua, y las células adherentes se solubilizaron después en ácido acético al 20%. El sobrenadante resultante recuperado de cada pocillo fue analizado con un Immunoreader, para medir la absorbancia a 590 nm para determinar el recuento relativo de las células que se adhieren al pocillo. Todos los ensayos se hicieron por triplicado, y se realizaron al menos tres experimentos independientes. Los valores expuestos representan la media de tres experimentos independientes.
Se ha sabido que TIG-7 se adhiere intensamente a la OPN pero, como se muestra en la Fig. 1A, la adhesión se inhibe claramente por el péptido GRGDSP (100 \mug/ml), pero no se inhibe por un péptido testigo (la región C-terminal de K296-N314 en OPN) (100 \mug/ml). Así pues, la adhesión depende de RGD. Como se muestra en la Fig. 1B, además, el anticuerpo 2K1 a razón de 200 \mug/ml inhibía claramente la adhesión celular a OPN. Como se muestra en la Fig. 1C, también, el efecto de 2K1 sobre la inhibición de la adhesión celular es comparable al efecto ejercido por mAb53 y es dependiente de la concentración. También, ni 2K1 ni mAb53 inhibieron nunca la adhesión de las células TIG-7 a vitronectina (VN) ni fibronectina (FN).
La Fig. 2 representa la inhibición de los anticuerpos monoclonales sobre la adhesión de nOPN y vitronectina a las células SW480 transformadas con \alpha9. Como se muestra en la Fig. 2A, la adhesión entre 1 \mug/ml de vitronectina y las células SW480 transformadas con \alpha9 fue inhibida por 200 \muM del péptido GRGDSP (RGD), de forma que la adhesión es dependiente de la secuencia RGD. La adhesión de las células SW480 transformadas con \alpha9 a 3 \mug/ml de nOPN fue inhibida por una combinación de 200 \muM de GRGDSP y un anticuerpo monoclonal Y9A2 anti-\alpha9\beta1 (A. Wang et al., (1996): Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 15, 664-672), de forma que la adhesión es RGD-dependiente y RGD-independiente. La Fig. 2B muestra adicionalmente el efecto de 2K1 sobre la adhesión de las células SW480 transformadas con \alpha9 a nOPN y vitronectina. La adhesión entre las células SW480 transformadas con \alpha9 y la vitronectina nunca fue inhibida por 2K1, pero la adhesión entre las células SW480 y nOPN fue inhibida por 2K1. En consecuencia, se indica que 2K1 retiene la potencia de inhibir la adhesión dependiente de RGD.
Ejemplo 5 Inhibición de la migración de monocitos inducida por OPN mediante los anticuerpos monoclonales
Se llevó a cabo el ensayo de migración celular usando la célula U937, empleando un sistema ChemoTx101-8 (Neuro Probe Inc.). La célula se ajustó a 2 x 10^{6} células/ml con D-MEM que contiene 0,1% de BSA, que después se aplicó a la capa superior en un filtro (con un tamaño de poro de 8 \mum) mientras que la proteína OPN fue añadida a la capa inferior.
La placa ChemoTx se dejó reposar en presencia de 5% de CO_{2} a 37ºC durante 4 horas. Después de dejar reposar la placa, el filtro se fijó con metanol, y después se tiñó con hematoxilina y eosina (H-E). El número de células que migran a la cara posterior del filtro se contó con un microscopio (400 aumentos). El ensayo se hizo por triplicado y se usó la media como dato. Los resultados se muestran en la Fig. 3.
La Fig. 3a muestra la migración de las células U937 hacia la CHO/OPN-a, la OPN segmentada con trombina y la GST-Nhalf, a las concentraciones que se indican. Adicionalmente, la Fig. 3b muestra los ensayos de inhibición usando las OPNs individuales a la concentración de 10 \mug/ml, en presencia o en ausencia de 50 \mug/ml de 2K1, mAb53 o IgG murina testigo después de purificación específica del antígeno.
Como se muestra en las Figs. 3a y 3b, la CHO/OPN-a, la OPN segmentada por trombina y la GST-Nhalf inducen la migración de los monocitos humanos U937 de una manera dependiente de la concentración (A). El anticuerpo 2K1 inhibe aparentemente la migración de monocitos inducida por CHO/OPN-a, la OPN segmentada por trombina y la GST-Nhalf. En cambio, el mAb53 solamente inhibe la migración de monocitos inducida por la OPN de longitud completa (B).
Ejemplo de Referencia 1
OPN e inducción de la artritis
Con el fin de esclarecer la función de la OPN en la artritis, se preparó artificialmente un ratón carente del gen de la OPN (S. R. Rittling et al., (1998): J. Bone and Mminer. Res., 13 (7), 1101-1111) de acuerdo con un método general, para realizar experimentos comparativos con ratones normales.
Se administró un cóctel de anticuerpo monoclonal artritogénico disponible comercialmente como sustancia desencadenante de artritis (bajo el nombre comercial de un cóctel para artritis, Arthrogen-CIA® mAb, Arthritogenic mAb cocktail; fabricado por Iwai Chemical Pharmaceutical Co., Ltd.) al ratón falte del gen OPN (OPN^{-/-}) y a un ratón normal (OPN^{+/+}), individualmente, de acuerdo con el manual de instrucciones unido al producto, para la inducción de la artritis. Después, se observó la gravedad de la misma. Para los testigos, se administró solución salina fisiológica a los dos tipos de ratones.
La comparación de la gravedad de la artritis se hizo basándose en la puntuación de la artritis de acuerdo con el estándar siguiente y la hinchazón de muñecas el día 10 después de la inyección. Los resultados se muestran en las Figs. 4 y 5.
Como se muestra claramente en la Fig. 4, el ratón normal al que se ha administrado el cóctel de anticuerpos artritogénicos/lipopolisacárido (denominado en adelante en el presente texto "LPS") tenía un aumento de la puntuación de la artritis el día 4 y, después, hasta el día 10, la puntuación alcanzó un máximo (12 o más). Alternativamente, la puntuación de la artritis del ratón carente del gen de OPN aumentó el día 5 y siguientes, pero la puntuación fue solamente 4 o menos como máximo. Adicionalmente, cualquiera de los grupos dosificados con solución salina fisiológica no tuvo aumento de la puntuación de artritis.
Como se muestra en la Fig. 5, además, la hinchazón de la muñeca es aparentemente débil en el ratón falto del gen de OPN, en comparación con el ratón normal, lo que indica claramente la implicación de la OPN en la artritis.
Ejemplo 6 Actividad inhibidora del anticuerpo 2K1 en la migración de leucocitos periféricos humanos
Por el método que sigue, se examinó la actividad inhibidora del anticuerpo 2K1 sobre la migración de los leucocitos periféricos humanos activada por citocina. La Tabla 1 muestra los resultados de la actividad inhibidora sobre la migración de neutrófilos, mientras que la Tabla 2 muestra los resultados de la actividad inhibidora sobre la migración de monocitos.
Método experimental
En el procedimiento de Ficoll, se separaron una fracción de monocitos y una fracción de neutrófilos de la sangre periférica humana normal (P. M. Daftarian et al., (1996): Journal of Immunology, 157, 12-20). La capa intermedia entre la capa de Ficoll y el suero se recogió y se cultivó en un matraz a 37ºC durante una hora. La célula unida resultante se usó como monocito. A la capa de eritrocitos que queda después de la recolección de la fracción de monocitos se añadió cinco veces su volumen de 3% de dextrano-PBS para agregar los eritrocitos, y a continuación se centrifugó a 150 x g y a 4ºC, durante 5 minutos.
Los eritrocitos agregados precipitaron, mientras que, en el sobrenadante resultante, los neutrófilos quedaron en estado suspendido. Después se centrifugó la fracción a 500 x g y temperatura ambiente durante 20 minutos, para recuperar los neutrófilos. Los monocitos y los neutrófilos, recuperados de esta manera, se cultivaron durante la noche con TNF-\alpha humano (20 ng/ml) para activación. Después, los monocitos y neutrófilos activados resultantes se usaron para experimentos de migración.
Los experimentos de migración se hicieron usando una cámara de microquimiotaxis de 48 pocillos (fabricada por Neuro Probe Inc.). Después de añadir varias concentraciones del anticuerpo 2K1 a la OPN segmentada por trombina y de dejarlas reposar preliminarmente a 37ºC durante 15 minutos, las mezclas se añadieron a la cámara inferior (a una concentración final de OPN humana de 10 \mug/mL). Poniendo sobre ella un filtro de policarbonato (tamaño de poro de 5 \mum), después, se añadió una suspensión de células de 50 \muL a la cámara superior (2 x 10^{6} células/mL).
Después de cultivar en presencia de 5% de CO_{2} a 37ºC durante 2 horas, el filtro de policarbonato se retiró para desechar las células de la parte superior del filtro; posteriormente, las células que infiltran en la cara posterior del filtro fueron teñidas con Diff-Quick (fabricado por Baxter, Internacional Inc.). Las células teñidas se contaron a 40 aumentos. Los resultados se muestran como recuentos de células medios (células/mm^{3}) \pm sd en 6 pocillos.
Resultados experimentales
El anticuerpo 2K1 inhibió la migración de monocitos y neutrófilos periféricos humanos activada por el TNF-\alpha, hacia la OPN segmentada por trombina.
Inhibición de la migración de neutrófilos:
TABLA 1
1
Inhibición de la migración de monocitos:
TABLA 2
2
Ejemplo 7 Preparación de anticuerpo M5
Se preparó el siguiente péptido sintético correspondiente a la secuencia interna (C+V138 a R153) de la OPN murina, para ser usado en inmunización.
Péptido M5:
CVDVPNGRGDSLAYGLR
El péptido se unió a tiroglobulina para su uso subsiguiente para inmunizar un conejo de acuerdo con un método general. Se recogió el antisuero del conejo inmunizado para preparar el anticuerpo M5, usando una columna rellena con el péptido M5 de la cisteína N terminal unido a través de un puente disulfuro unido a esferas de Sepharosa tiol (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan).
Ejemplo 8 Reactividad del anticuerpo M5 con OPN y con los productos de digestión de la misma con trombina
La potencia de unión del anticuerpo M5 recuperado en el Ejemplo 7 con OPN y con los productos de digestión de la misma con trombina, se ensayó mediante el método de la transferencia Western. Como OPN se usó OPN murina recombinante de la forma glicosilada como se genera en células CHO. El anticuerpo M5 reaccionó con OPN y con los productos de digestión de la misma con trombina.
Ejemplo 9 Inhibición de la adhesión celular a OPN mediante el anticuerpo M5
Por el método descrito en la referencia (S. Kon et al., (2002): J. Cell. Biochem., 84(2), 420-432), se examinó si el anticuerpo M5 podría inhibir o no la adhesión celular a la OPN. Como OPN se usó la OPN murina de longitud completa, de la que había sido eliminado previamente el resto GST con proteasa PreScission (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan) (denominada en adelante en el presente texto "mOPN/de-GST"). Como células se usaron células NIH3T3 murinas.
Como se muestra en la Fig. 6, las células NIH3T3 se adhieren a mOPN/de-GST de una manera dependiente de la concentración. Como se muestra en la Fig. 7, además, la adhesión se inhibe claramente por el péptido GRGDSP (100 \mug/mL), por lo que la adhesión depende de RGD. Como se muestra en la Fig. 8, el anticuerpo M5 a la concentración de 200 \mug/mL inhibía claramente la adhesión celular a OPN.
Ejemplo 10 Actividad inhibidora del anticuerpo M5 contra la migración de monocitos derivados del bazo murino
La actividad inhibidora del anticuerpo M5 contra la migración de monocitos derivados del bazo murino activada por citosina se examinó por el método que sigue. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Método experimental
Los esplenocitos procedentes de ratones C57BL/6 fueron molidos con un portaobjetos en una célula individual, que después se cultivó en un matraz a 37ºC durante una hora. Las células adherentes resultantes se usaron como monocitos. Los monocitos se cultivaron durante la noche y se activaron con TNF-\alpha humano (20 ng/mL). Los monocitos activados resultantes se usaron en un experimento de migración. El experimento de migración se hizo por el mismo método que para la muestra humana en el Ejemplo 6 anterior.
Resultados experimentales
El anticuerpo M5 inhibió la migración de monocitos activados por TNF-\alpha derivados de bazo murino, hacia la OPN murina de tipo segmentado por trombina, recuperada de la segmentación de la OPN murina de longitud completa (elaborada por Genzyme Corporation) con trombina bovina (elaborada por Sigma).
TABLA 3
3
Ejemplo 11 Acción del anticuerpo M5 sobre la supresión del daño óseo
Por el método que sigue, se examinó la acción del anticuerpo M5 sobre la supresión del daño óseo en un sistema de cultivo de órganos de la bóveda craneal murina. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Método experimental
Se realizó la resección del hueso craneal de un ratón recién nacido, el día 1 después del nacimiento; después de ajustar el tamaño, la mitad fue puesta en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Después se añadió a cada pocillo hormona paratiroides humana (PTH) (1-34) ajustada con la adición de un caldo de cultivo D-MEM (con un 10% de suero bovino añadido) hasta una concentración final de PTH de 10 nM, para inducir el daño óseo. El anticuerpo M5 se añadió a una concentración final de 200 \mug/mL. Después de cultivar a 37ºC durante una semana, se analizó la cantidad de calcio liberado del hueso en el medio de cultivo mediante Calcium E Test WAKO (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Resultados experimentales
Sin la adición de PTH el calcio estaba en un valor de 7,02 mg/mL. Sin embargo, con la adición de PTH el calcio estaba en un valor de 9,11 mg/mL. Por tanto, se señaló que se favorecía la liberación de calcio del hueso. Cuando se añadió el anticuerpo M5 a una concentración de 200 \mug/mL, se comprobó que se inhibía la absorción del hueso en aproximadamente un 70%.
TABLA 4
4
Ejemplo 12 Efecto del anticuerpo M5 sobre el modelo de artritis por colágeno en el ratón
Por el método que sigue, se examinó el efecto del anticuerpo M5 en un modelo de artritis por colágeno en ratones. La Tabla 5 muestra los resultados acerca de la puntuación de la artritis; la Tabla 6 muestra los resultados acerca del edema de la pata; la Tabla 7 muestra los resultados acerca del cambio del peso corporal; y la Tabla 8 muestra los resultados acerca del cambio en la ingesta de alimento.
Método experimental
Para la inducción de la artritis se usó un cóctel de anticuerpos artritogénicos (bajo el nombre comercial de un cóctel para artritis, Arthrogen-CIA® mAb, cóctel Arthritogenic mAb; elaborado por Iwai Chemical Pharmaceutical Co., Ltd.) que reconocen cuatro epítopos específicos para el colágeno. Se administró a un ratón, por vía intravenosa, el cóctel artritogénico; 3 días más tarde, se administró LPS (100 \mug) por vía intraperitoneal para desencadenar la artritis. La artritis fue observada en el día 3 después de la administración de LPS, que alcanzó un máximo el día 6.
Inmediatamente antes de administrar LPS y 3 días más tarde, el anticuerpo M5 fue administrado por vía intravenosa en una dosis 40 \mug, 150 \mug o 400 \mug. Como grupo testigo, se dispuso un grupo tratado con IgG de conejo (a una dosis de 400 \mug). Adicionalmente, el anticuerpo anti-TNF-\alpha de ratón fue administrado por vía intravenosa a una dosis de 200 \mug por ratón inmediatamente antes de la administración de LPS y 3 días más tarde. Como grupo testigo, se dispuso un grupo al que se administra IgG de rata (a una dosis de 200 \mug). Además, se administró oralmente MTX (a una dosis de 3,2 mg/kg) una vez al día el mismo día de la administración de LPS y después de la misma. Después, se usó MTX disuelto en 5 mL de solución de metilcelulosa al 0,5%. Para el grupo testigo, se dispusieron 5 ml de solución de metilcelulosa al 0,5%.
La evaluación se hizo por grupos de cinco animales, relativa a cuatro conceptos, que son la puntuación de la artritis, edema de la pata, cambio de peso corporal e ingesta de alimento.
Resultados experimentales
Como se muestra en las Tablas 5 a 8, el anticuerpo M5 ejerció distintas acciones supresoras sobre la mejora de la puntuación de la artritis, el retraso de la aparición de la enfermedad y la mejora del edema en la pata en el modelo de artritis en ratones (efecto terapéutico). La aparición de la artritis se suprimió de una manera dependiente de la concentración a un nivel tal que el efecto excedía el efecto de anticuerpo anti-TNF \alpha de ratón administrado (a una dosis de 200 \mug por ratón). En cambio, el MTX no ejerció casi eficacia farmacéutica.
En el grupo normal del modelo, además, se observaron distintos descensos del peso corporal en aproximadamente 3 g en los 3 días después de la administración de LPS; y la tendencia prosiguió del día 3 al día 6, aunque la relación de descenso fue más o menos reducida. En los grupos tratados con el anticuerpo M5 (150 \mug, 400 \mug) y el grupo tratado con el anticuerpo anti-TNF \alpha de ratón, alternativamente, se observó una clara mejora del descenso del peso corporal. En cuanto a la ingesta de alimento, además, se observó un rápido descenso del peso corporal para cualquiera de las sustancias farmacéuticas hasta el día 3 después de la administración de LPS; sin embargo, desde el día 3 al día 6 la disminución mejoró en los grupos tratados con el anticuerpo M5 y el grupo tratado con el anticuerpo anti-TNF \alpha de ratón. La Tabla 5 muestra el efecto sobre la puntuación de la artritis; la Tabla 6, el efecto supresor sobre el edema en la pata; y las Tablas 7 y 8 muestran los efectos sobre el cambio de peso corporal y cambio de la ingesta de alimento, respectivamente.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 5
5 
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TABLA 6
6
TABLA 7
7 
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TABLA 8
8
Ejemplo 13 Biodisponibilidad de péptidos fragmento relacionados con OPN
Se adquirieron péptidos fragmento relacionados con OPN en un estado purificado por cromatografía HPLC, de la firma Auspep Inc., Parkiville, Australia. Las secuencias de aminoácidos de los mismos se muestran en (1) a (3):
hOPN5:
CVDTYDGRGDSVVYGLRS (C + V153 a S169) (1) 
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hOPN3:
KSKKFRRPDIQYPDATDEC (K170 a E187 + C) (2) 
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hOPN1:
IPVKQADSGSSEEKQC (117 a Q31 + C) (3)
Ejemplo 14 Preparación de antígenos para inmunización
Se prepararon productos de los péptidos fragmento relacionados con OPN unido a tiroglobulina, por el procedimiento de la EMCS (N-(6-maleimidocaproiloxi)-succinimida), de la forma siguiente. Para la preparación de tales productos, la relación molar de tiroglobulina, un péptido fragmento relacionado con OPN y EMCS fue 1:300:400.
Se disolvieron 4 mg de cada uno de los péptidos fragmento relacionados con OPN del Ejemplo 13 en aproximadamente 1 ml de agua destilada. Alternativamente, se mezclaron 5 mg de tiroglobulina disuelta en 1 ml de tampón de fosfato 0,01 M, pH 7,0, y EMCS disuelto en dimetilformamida a razón de 80 \mug/ml, individualmente en cantidades correspondientes a los moles, para preparar una solución de complejo tiroglobulina-EMCS. La solución de complejo se dividió en tres partes. A cada una de las porciones se le añadió la solución de péptido fragmento relacionado con la OPN en cantidad correspondiente a los moles, para preparar así una solución de un producto entrecruzado con EMCS del péptido fragmento relacionado con la OPN unido a tiroglobulina.
La solución de tal producto unido fue dializada usando PBS, para ajustar la concentración del producto en 10 \mug/\mul. El producto unido del péptido fragmento relacionado con la OPN y tiroglobulina se usó como antígeno para la inmunización.
Ejemplo 15 Preparación de antígenos para el cribado
Como proteínas OPN para cribado, se prepararon proteínas de fusión entre GS e isoformas de OPN humana, como son GST-OPN-a, GST-OPN-b y GST-OPN-c, y proteínas de fusión entre GST y el fragmento de OPN en el lado del grupo amino (GST-Nhalf) del sitio de segmentación por trombina y el fragmento de OPN en el lado del grupo carboxilo (GST-Chalf) del mismo sitio de segmentación por trombina, por el método descrito en el Ejemplo 1, para su uso en la reactividad del antisuero con OPN.
Ejemplo 16 Sensibilización inmunitaria
Se inmunizó un conejo usando como antígenos de inmunización los productos unidos de los péptidos fragmento relacionados con la OPN y tiroglobulina preparados en el Ejemplo 14. La inmunización se hizo inyectando 100 \mul (100 \mug) de una solución del producto unido cada semana o cada dos semanas. Los antígenos se mezclaron con el coadyuvante completo de Freund para una primera inmunización y después se mezclaron con el coadyuvante incompleto de Freund para una segunda inmunización y las inmunizaciones siguientes. Después de inmunizar ocho veces, se separó el suero de la sangre recogida, y después se usó como antisuero.
Ejemplo 17 Reactividad del anticuerpo con la OPN
Los péptidos fragmento relacionados con la OPN preparados en el Ejemplo 13 se diluyeron con tampón de carbonato 0,1 M, pH 9,5 a 10 \mug/ml, y después se inmovilizaron a razón de 50 \mul por pocillo en una placa de 96 pocillos. Después de aclarar con PBS y bloquear con solución 0,1% BSA/PBS/0,05% NaN_{3}, se puso una dilución en serie 1:2 de la dilución 1:100 del anticuerpo recuperado en el Ejemplo 16, a razón de 50 \mul en un pocillo, para reacción a 37ºC durante 30 minutos.
Después de la terminación de la reacción, el pocillo fue aclarado cuatro veces con 0,05% de Tween 20-PBS. Después, se añadieron 50 \mul de cada una de las IgG anti-conejo marcadas con HRP (fabricada por IBL Co., Ltd.) a cada pocillo, para reacción a 37ºC durante 30 minutos. Después de la terminación de la reacción, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de tampón de citrato 0,05 M, pH 4,5, que contiene 0,4 mg/ml de ortofenilendiamina (OPD) y de solución acuosa de peróxido de hidrógeno al 0,03%. Después, la placa se dejó reposar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos, para la reacción cromogénica. Después de la reacción cromogénica, se añadieron 100 \mul de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo para terminar la reacción, para la medida de la absorbancia a 492 nm.
Usando las proteínas OPN preparadas en el Ejemplo 15, alternativamente, se examinó la reactividad del antisuero por el método de transferencia Western. En consecuencia, los antisueros contra los péptidos fragmento relacionados con la OPN hOPN1 y hOPN5 reaccionaron con GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c y GST-Nhalf, pero no reaccionaron nunca con GST-Chalf. Alternativamente, al anti-suero contra el péptido fragmento relacionado con OPN, hOPN3, reaccionó con GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c y GST-Chalf, pero no reaccionó nunca con GST-Nhalf.
Ejemplo 18 Preparación de productos unidos a HRP de anticuerpos anti péptidos fragmento relacionados con OPN
Los productos unidos a HRP de los anticuerpos contra los péptidos fragmento relacionados con la OPN, hOPN3 y hOPN1, se prepararon de la forma que sigue. 20 mg de cada anticuerpo anti péptido fragmento relacionado con la OPN fueron digeridos con pepsina, y a continuación fueron sometidos a filtración en gel para purificar el fragmento F(ab')_{2} del anticuerpo anti péptido fragmento relacionado con la OPN. Después, el fragmento F(ab')_{2} fue reducido a fragmento Fab' usando 2-mercaptoetanol. La HRP reaccionó con EMCS a 37ºC durante 60 minutos, y a continuación se sometió a filtración en gel para preparar un producto unido HRP-EMCS, que reaccionó con el fragmento Fab' del anticuerpo anti péptido fragmento relacionado con la OPN a 4ºC durante la noche, y a continuación se sometió a filtración en gel para preparar un producto entrecruzado con EMCS unido a HRP del anticuerpo anti péptido fragmento relacionado con la OPN.
Ejemplo 19 Construcción de sistemas ELISA tipo sándwich
A partir de combinaciones de una placa de ELISA de tipo sándwich y anticuerpos marcados, se prepararon dos tipos de sistemas, que son 1-3 y 5-1. Específicamente, el sistema 1-3 se preparó de la forma que sigue. El anticuerpo a la concentración de 10 \mug/ml contra el péptido fragmento relacionado con la OPN hOPN1 fue añadido en porciones de 100 \mul a una placa de ELISA de 96 pocillos. Después de reaccionar durante la noche a 4ºC, se hizo el bloqueo con solución al 10% de BSA/PBS/NaN_{3}. La placa resultante en cada estadío se usó como placa de ELISA tipo sándwich. El producto unido a HRP del anticuerpo contra el péptido fragmento relacionado con la OPN hOPN3 preparado en el Ejemplo 18 fue definido como anticuerpo marcado. Como se describió anteriormente, una combinación entre la placa inmovilizada usando el anticuerpo contra hOPN1 y el anticuerpo marcado usando el anticuerpo contra hOPN3 fue definida como sistema 1-3.
De la misma manera, se construyó como sistema 5-1 una combinación de una placa de inmovilización usando el anticuerpo contra hOPN5 y un anticuerpo marcado usando el anticuerpo contra hOPN1.
Ejemplo 20 Ensayo de osteopontina en un sujeto de ensayo mediante sistemas ELISA de tipo sándwich
La proteína OPN fue ensayada de la forma que sigue. Se añaden 100 \mul de una solución que contiene una muestra de plasma o una muestra de fluido de la cavidad articular de un sujeto de ensayo, a las placas de ELISA de tipo sándwich de los sistemas 1-3 y 5-1, para reacción a 37ºC durante una hora. Después de la reacción, las placas se aclararon cuatro veces con 0,05% de Tween20-PBS, seguido por la adición de 100 \mul de cada uno de los anticuerpos marcados específicos para los sistemas individuales, para reacción a 4ºC durante 30 minutos. Después de la reacción, las placas se aclararon seis veces con 0,05% de Tween20-PBS, seguido por la adición de 100 \mul de una solución de TMB (tetrametilbencidina). Después, las placas resultantes se dejaron reposar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se usó ácido sulfúrico 1 N para terminar la reacción, para el ensayo de la absorbancia a 450 nm.
La Tabla 9 muestra los valores de OPN en los fluidos de la cavidad articular de pacientes (13 casos) con reumatismo, medidos por el método; y la Tabla 10 muestra los valores de OPN en los fluidos de la cavidad articular de pacientes (12 casos) con osteoartritis. Adicionalmente, la Tabla 11 muestra los valores de OPN en los plasmas procedentes de pacientes con reumatismo (16 casos); la Tabla 12 muestra los valores de OPN en los plasmas de pacientes de osteoartritis (7 casos); y la Tabla 13 muestra los valores de OPN en los plasmas de sujetos normales (6 casos).
Como se muestra claramente en estos resultados, la comparación con el sistema 1-3 en términos del valor de la OPN en el plasma entre los pacientes con artritis reumatoide, los pacientes con osteoartritis y los sujetos normales, no mostró ninguna diferencia significativa. Sin embargo, la comparación con el sistema 5-1 en términos de valor de OPN en el plasma entre los pacientes con artritis reumatoide, los pacientes con osteoartritis y los sujetos normales, indicó valores de OPN en el plasma en los pacientes con artritis reumatoide y en los pacientes con osteoartritis significativamente más altos que el valor de OPN en los sujetos normales. El nivel de significación fue más elevado en los pacientes con artritis reumatoide. Esto indica que la cantidad total de OPN reflejada con el sistema 5-1 es eficaz para el diagnóstico de la categoría general de la artritis.
Alternativamente, los valores de OPN en los fluidos de la cavidad articular de los pacientes con artritis reumatoide y los pacientes con osteoartritis son mayores que los valores de OPN en sus plasmas, lo que indica claramente la generación local de la OPN.
Adicionalmente, la comparación con los sistemas 1-3 y 5-1 en términos del valor de la OPN en el fluido de la cavidad articular entre los pacientes con artritis reumatoide y los pacientes con osteoartritis indicaron que el valor de la OPN en los pacientes con artritis reumatoide era significativamente mayor que el valor de la OPN en los pacientes con osteoartritis, cuando se usaba cualquiera de los sistemas 1-3 y 5-1.
Como nuevo indicador, se examinó la relación de los valores de OPN con los sistemas 1-3 y 5-1. El indicador puede usarse para la comparación de la relación de la OPN segmentada por trombina. Los valores de la OPN en los plasmas y en los fluidos de las cavidades articulares de pacientes con artritis reumatoide fueron 1 o menos, y los valores de la OPN de pacientes con osteoartritis fueron 2 o más, así que se observó una diferencia significativa. Así, los valores de la OPN con los sistemas 1-3/5-1 pueden usarse para un método diagnóstico para discriminar pacientes con artritis reumatoide de pacientes con osteoartritis en un estadío temprano.
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TABLA 9
9
TABLA 10
10 
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TABLA 11
11
TABLA 12
12 
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TABLA 13
13
<110> Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.
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Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. 
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<120> Anticuerpo anti-osteopontina y uso del mismo
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<130> PF-020002-WO
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<140>
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<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2001-290700
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<151> 25-09-2001
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<150> JP 2001-107578
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<151> 05-04-2001
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<160> 18
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: (1) hOPN5
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<400> 1
14 
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<210> 2
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<211> 19
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: (2) hOPN3
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<400> 2
15 
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<210> 3
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: (3) hOPN1
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<400> 3
16 
\hskip1cm
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<210> 4
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<211> 35
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: OPN-5
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<400> 4
17 
\hskip1cm
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<210> 5
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<211> 36
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: OPN-3
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<400> 5
18 
\hskip1cm
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<210> 6
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<211> 37
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: OPNct-3
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<400> 6
19 
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<210> 7
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<211> 35
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: OPNet-5
\newpage
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<400> 7
20 
\hskip1cm
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<210> 8
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<211> 32
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: OPNnh-3
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<400> 8
21 
\hskip1cm
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<210> 9
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<211> 31
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: OPNch-3
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<400> 9
22 
\hskip1cm
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<210> 10
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<211> 31
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: OPNch-5
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<400> 10
23 
\hskip1cm
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<210> 11
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<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido 1
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido 2
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<400> 12
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<210> 13
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<212> PRT
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido M5
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido fragmento
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<400> 18
31 
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Claims (4)

1. Un anticuerpo anti-osteopontina producido por el hibridoma depositado como FERM BP-7883.
2. Un anticuerpo anti-osteopontina que se produce por humanización del anticuerpo según la reivindicación 1.
3. Un agente terapéutico para el tratamiento del reumatismo, la artritis reumatoide o la osteoartritis, que comprende el anticuerpo anti-osteopontina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 como ingrediente activo.
4. El uso del anticuerpo anti-osteopontina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del reumatismo, la artritis reumatoide o la osteoartritis.
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