MXPA03009052A

MXPA03009052A - Anticuerpo anti-osteopontina y uso del mismo.

Info

Publication number: MXPA03009052A
Application number: MXPA03009052A
Authority: MX
Inventors: Yamamoto Nobuchika
Original assignee: Immuno Biological Lab Co Ltd
Priority date: 2001-04-05
Filing date: 2002-04-04
Publication date: 2004-10-15
Also published as: EP1375518A4; AU2002244968B2; CA2443330A1; AR033121A1; PL366469A1; DE60229509D1; CN1513000A; CN100469793C; EP1375518A1; ATE412013T1; WO2002081522A1; JPWO2002081522A1; JP4230776B2; US20040234524A1; HUP0401561A2; NO20034405D0; CZ20032697A3; EP1375518B1; KR20030092022A; NO20034405L

Abstract

Un anticuerpo anti-osteopontina que inhibe la union de una integrina a osteopontina o su fragmento, que inhibe la union de la secuencia de RGD que reconoce la integrina a la osteopontina o su fragmento y reconoce la secuencia SVVYGLR o un equivalente de la secuencia al mismo. Este anticuerpo es util en remedios para enfermedades auto- inmunitarias, remedios para reumatismo y remedios para artritis reumatoide. Tambien se proporciona un metodo para tratar enfermedad autoinmunitaria, reumatismo o artritis reumatoide. Este anticuerpo es util en diagnostico y tambien un metodo de diagnostico para reumatismo.

Description

ANTICUERPO NTI-OSTEOPONTINA Y USO DEL MISMO Campo Técnico de la Invención La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-osteopontina humana y un método para tratar de forma terapéutica enfermedades auto-inmunitarias , reumatismo y artritis reumatoide, usando el anticuerpo.

Técnica Antecedente La osteopontina (también referida posteriormente en la presente como "OPN") es una glicoproteina ácida de unión a calcio, abundante en el hueso. Se ha conocido que tres tipos de isoformas de OPN humana, específicamente la osteopontina-a (también referida posteriormente en la presente como "OPN-a"), osteopontina-b (también referida posteriormente en la presente como "OPN-b"), y osteopontina-c (también referida posteriormente en la presente como "OPN-c") , se generan de forma natural por empalme alternativo (Y. Saitoh et al., (1995) : Laboratory Investigation, 72, 55-63) . Se ha creído qué entre éstas, el precursor de OPN-a tiene una secuencia de aminoácidos mostrada como SQ ID NO. 1 posteriormente en el Listado de Secuencias, donde el péptido de señal se escinde en la secreción, de modo que se prepara la forma madura OPN-a de I17-N314. Adicionalmente, la OPN madura se escinde en el lado C-terminal del lS8-ésimo residuo, arginina, con trombina de un organismo biológico en dos fragmentos N-terminal y C-terminal. La OPN descrita anteriormente tiene varias funciones fisiológica y patológicamente significativas, por ejemplo, adhesión celular, migración celular, tumorigénesis , respuesta inmunitaria e inhibición de citólisis mediada por complemento. Varios tipos de receptores en la superficie celular median las varias funciones. La OPN tiene la secuencia de RGD en la presente (por ejemplo, OPN-a tiene la secuencia desde el residuo en la posición 159 al residuo en la posición 161) . Las especies de integrina que reconocen la secuencia de RGD tal como a?ß3 , a?ß? y a?ß5 son los receptores principales de OPN; específicamente, las especies de integrina ?ß3 , cA/ß? y a?ß5 median la adhesión celular en las células del músculo liso vascular. Adicionalmente, la a?ß3 está comprendida en las migraciones de los macrófagos, linfocitos, células endoteliales, células del músculo liso, y similares. Adicionalmente, trabajos de investigación hasta ahora han puesto en claro que la OPN también se une a través de la secuencia SWYGLR a las especies de integrina de 9ß1, a4ß1 y a4ß7 y que también se encuentra una diferencia en el modo tal que tal que a4ß1 se une tanto a OPN aún no escindida con trombina (OPN tipo no escisión) y al fragmento N-terminal de la OPN escindida con trombina (OPN tipo escisión) , en tanto- que la a9ß1 se une sólo a la OPN tipo escisión con trombina. (Y. Yokosaki et al., (1999): The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334/P . M. Green et al., (2001): FEBS Letters 508, 75-79/S. T. Barry et al., (2000) : Experimental Cell Research 258, 342-351) . Estas subunidades c¿9 y a4 de integrina o las subunidades ß? y ß7 de integrina son altamente similares en términos de la secuencia de aminoácidos entre sí. Adicionalmente, las especies de integrina a4ß1 y a4ß7 se encuentran principalmente en linfocitos y monocitos, en tanto que en los neutrófilos, las especies de integrina se expresan muy ligeramente. De manera alternativa, la 9ß1 se expresa altamente de forma selectiva en neutrófilos y tiene funciones esenciales para la migración de los neutrófilos a través de VCAM-1 y Tenascin-C. Adicionalmente, la integrina también se expresa de forma diversa en células musculares, células epiteliales y células hepáticas. Como se describe anteriormente, los dominios citoplasmáticos de las subunidades de integrina a4 y a9 promueven de forma cooperativa la migración de leucocitos hacia los sitios inflamatorios y la agregación en los mismos, vía las rutas individuales de transmisión de señales celulares, que difieren sutilmente entre sí, para mejorar sus actividades de infiltración. De esta manera, las subunidades de integrina están comprendidas en varias reacciones inflamatorias.

Como se describe anteriormente, varios tipos de especies de integrina promueven la migración de leucocitos, y de esta manera, están comprendidas en reacciones inflamatorias. Por lo tanto, las sustancias farmacéuticas que inhiben estas actividades de integrina pueden tener potencialmente una posibilidad como un agente antiinflamatorio. Por ejemplo, la integrina a?ß3 se expresa en células de osteoclastos, células endoteliales vasculares y células del músculo liso, y similares. Un anticuerpo anti-a?ß3 ahora está bajo desarrollo, que trabajará para inhibir la unión entre la integrina a?ß3 y varios ligandos de unión de la misma para ejercer potencialmente, por ejemplo, una acción para suprimir daños articulares . Debido a que los receptores de la familia de integrinas emergen comúnmente en diversos tejidos para proporcionar funciones esenciales para el control de actividades vitales, sin embargo, el uso de anticuerpos contra integrina para el tratamiento terapéutico de artritis reumatoide y osteoartritis puede producir posiblemente la misma inhibición en otros sitios y también puede provocar la aparición de efectos laterales. Adicionalmente, la WO 01/71358 describe un método para detectar una sustancia que inhibe la unión entre la integrina o¡4 y la osteopontina y un método para tratar de forma terapéutica enfermedades inflamatorias, usando la sustancia recuperada por esta detección. Se ha encontrado que varios factores están implicados en la patogénesis de la artritis reumatoide. De esta manera, se han emitido para lo mismo muchos informes. Sin embargo, algunos de ellos no son confiables. Adicionalmente, los métodos terapéuticos actualmente conocidos, de los mismos, son los nosotropicos y no han sido esencialmente satisfactorios. Por lo tanto, se ha deseado fuertemente poner en claro definitivamente la patogénesis' de la artritis reumatoide y proporcionar productos terapéuticos más excelentes de los mismos. Es un propósito de la invención solucionar estos problemas. Adicionalmente, la artritis reumatoide se discrimina severamente de la osteoartritis . Por lo tanto, es otro propósito de la invención proporcionar un método de diagnostico de la misma.

Descripción de la Invención Los inventores encontraron que la concentración de OPN en cada uno de los fluidos de la cavidad articular de los pacientes con reumatismo y los pacientes con osteoartritis estaba a un valor elevado. Adicionalmente, los inventores encontraron por primera vez el incremento de la relación del fragmento N-terminal del tipo escisión con trombina en la OPN total en pacientes con reumatismo. De esta manera, los inventores especularon que la OPN puede estar comprendida a fondo en la aparición de estas enfermedades. Como se describe en el siguiente ejemplo de referencia, entonces, los inventores verificaron los hallazgos en experimentos usando ratones que no producen OPN. Adicionalmente, los inventores prepararon anticuerpos que reconocen de forma individual discriminativamente el fragmento N-terminal y el fragmento C-terminal de la OPN escindida con trombina. Entonces, los inventores encontraron en los experimentos con anticuerpos que el fragmento N-terminal de la OPN escindida con trombina estaba a una alta concentración en particular en los fluidos de la cavidad articular de los pacientes con artritis reumatoide . Los inventores enfocaron su atención a la co-presencia de la secuencia de RGD y la secuencia SWYGLR tanto en la reconocida por la integrina tipo humano, en el fragmento N-terminal a alta concentración como se observa en pacientes con artritis reumatoide. Entonces, los inventores anticiparon que un anticuerpo que bloquee simultáneamente ambas secuencias inhibirá la unión entre la OPN y la integrina, ampliamente, de modo que el anticuerpo puede ser efectivo para el tratamiento terapéutico de artritis reumatoide y osteoartritis . Adicionalmente, la OPN está distribuida en riñon, placenta, ovario, cerebro, piel y similares, pero se expresa principalmente en tejido óseo. Los inventores consideraron que para el tratamiento terapéutico de artritis reumatoide, la unión entre OPN e integrina se bloqueará preferentemente por un método más específico del lado de OPN. Debido a que están comprendidas diversas especies de integrina en la inflamación de una forma cooperativa, entonces, los inventores consideraron que seria efectivo bloquear más ampliamente la unión a estas diversas especies de integrina. Por lo tanto, los inventores prepararon un anticuerpo que inhibe la unión entre la secuencia de RGD de OPN humana e integrina y la unión entre la secuencia SWYGLR de la OPN humana e integrina y luego verificaron los efectos de la misma en experimentos de adhesión celular y migración celular y similares. Además, los inventores recuperaron un anticuerpo contra péptidos sintéticos que corresponden a estas secuencias interiores de OPN murina, para examinar la eficacia de este anticuerpo como un agente terapéutico, usando un modelo de enfermedad de artritis en ratón. De manera más específica, debido a que la OPN murina tiene las secuencias RGD y SLAYGLR reconocibles por integrina murina, se localizan en posiciones homologas a la OPN humana en términos de la secuencia de aminoácidos, se recuperó un anticuerpo M5 como un anticuerpo que bloquea simultáneamente estas secuencias. Se verificó que la unión del anticuerpo M5 con OPN murina y los productos de digestión con trombina de la misma se inhibieron por el péptido GRGDSP que incluye el sitio RGD de secuencia y que el anticuerpo M5 inhibió la migración de monocitos activados con TNF- derivados de bazo murino. También se observó que el anticuerpo M5 tiene una acción para suprimir el daño óseo cuando se examina en un sistema de cultivo de órgano de calvaría murina. Adicionalmente, se confirmó que el anticuerpo exhibió un efecto terapéutico aparente, cuando se administró a un modelo murino de artritis por colágeno. Los resultados mencionados anteriormente sugieren fuertemente que el anticuerpo que bloquea la unión en los sitios RGD y SVVYGLR de secuencia con integrina tipo humana inhibe la unión entre OPN e integrina y por lo tanto es efectiva para el tratamiento terapéutico de artritis reumatoide y que el anticuerpo será posiblemente efectivo no sólo para reumatismo tal como reumatismo articular juvenil y reumatismo crónico, sino también para artritis psoriática y psoriasis. Adicionalmente, los rechazos crónicos después del trasplante de órganos comprenden característicamente trastornos oclusivos vasculares y bronquiales. El examen histológico de los mismos sugiere que, debido a que la activación de células T y macrófagos activa la generación de factores de crecimiento y citocinas y trastornos de células endoteliales vasculares y d bido a q e la proliferación de células del músculo liso vascular produce fibrogénesis y similares, entonces será posible la oclusión vascular (P. Freese et al., (2001): Nephrol Dial Transplant, 16, 2401-2406/J. R. Waller et al., (2001): British Journal of Surgery, 88, 1429-1441/S. R. Lehtonen et al., (2001): Transplantation, 72, 1138-1144) . Un informe se refiere a cerca de que OPN tiene una función como una proteína esencial para la activación de macrofagos y fibrogénesis de las células del músculo liso vascular (A. O'Regan et al., (2001) : Int J. Exp Pathol, 81, 373-390) . De esta manera, el anticuerpo inhibitorio de OPN, inventivo, de la invención, suprime la migración de monocitos y neutrofilos, suprimiendo de este modo posiblemente un transcurso hacia esta fibrogénesis. De esta manera, el anticuerpo suprime rechazos crónicos después del trasplante de órganos, con las contribuciones resultantes a la adhesión del órgano. Adicionalmente , el anticuerpo será efectivo para el tratamiento terapéutico de enfermedades auto-inmunitarias incluyendo enfermedades auto-inmunitarias sistémicas, eritematodes , uveítis, enfermedad de Behcet, miosis múltiple, glomerulonefritis proliferativa, sarcoidosis y similares . En otras palabras, ' la invención proporciona un anticuerpo anti-osteopontina que inhibe la unión entre una integrina que reconoce la secuencia RGD y la OPN o un fragmento de la misma y que también inhibe ampliamente la unión entre una integrina que reconoce la secuencia SWYGLR o una secuencia correspondiente y osteopontina o un fragmento de la misma. Adicionalmente, la invención proporciona un agente terapéutico de enfermedades auto-inmunitarias, un agente terapéutico de reumatismo y un agente terapéutico de artritis reumatoide, y estos agentes terapéuticos contienen el anticuerpo anti-osteopontina como los ingredientes efectivos . Aún además, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente enfermedades auto-inmunitarias, reumatismo y artritis reumatoide, incluyendo la administración del anticuerpo anti-osteopontina a pacientes con reumatismo y artritis reumatoide, para inhibir la unión entre la secuencia RGD de osteopontina e integrina y/o para inhibir la unión entre la secuencia SWYGLR e integrina. ' Aún además, la invención proporciona un agente de diagnóstico de reumatismo y un método de diagnostico del mismo, que utiliza el anticuerpo de osteopontina.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra gráficas que representan la inhibición de la adhesión celular dependiente de RGD a OPN. La Figura 2 muestra gráficas que representan la inhibición de la adhesión celular dependiente de RGD e independiente de RGD entre nOPN y células SW480 «9-transformadas vía el anticuerpo 2K1. La Figura 3a muestra gráficas que representan la migración celular inducida por OPN. La Figura 3b muestra gráficas que representan la supresión de la migración celular inducida por OPN vía anticuerpos. La Figura 4 muestra gráficas que representan el transcurso en el tiempo del cambio de la puntuación de osteoartritis cuando se dosificó individualmente el cóctel de anticuerpo artritogénico/LPS a un ratón defectuoso del gen OPN y a un ratón normal La Figura 5 muestra gráficas que representan la comparación del hinchamiento de muñeca cuando se dosificó el cóctel de anticuerpo artritogénico/LPS al ratón defectuoso del gen OPN y al ratón normal, individualmente. La Figura 6 muestra gráficas que representan la adhesión entre OPN murina y NIH3T3 de una manera dependiente de la concentración. La Figura 7 muestra gráficas que representan la inhibición de la adhesión entre OPN murina y NIH3T3 vía el péptido GRGDSP.

La Figura 8 muestra gráficas que representan la inhibición de la adhesión entre OPN murina y NIH3T3 vía el anticuerpo M5.

Modo para llevar a cabo la Invención El anticuerpo anti-osteopontina (referido posteriormente en la presente como "anticuerpo inhibitorio de OPN") que inhibe la unión entre una integrina que reconoce la secuencia RGD y la OPN o un fragmento de la misma y que también inhibe la unión entre una integrina que reconoce la secuencia SWYGLR o una secuencia correspondiente y la OPN o un fragmento de la misma puede ser cualquiera de los anticuerpos que inhibe la unión de una integrina que reconoce la secuencia RGD, por ejemplo, a?ß?, a?ß3 y a?ß5 con OPN-a, OPN-b, OPN-c, p un fragmento N-terminal del mismo y que también inhibe la unión de una integrina que reconoce la secuencia SWYGLR, por ejemplo, a9ß1, a4ß1 y 4ß7 con OPN-a, OPN-b, OPN-c, o un fragmento N-terminal del mismo. La secuencia SWYGLR o una secuencia correspondiente de la misma significa aquella descrita posteriormente: la secuencia SWYGLR significa la secuencia de serina en la posición 162 a arginina en la posición 168 en OPN humana, en tanto que la secuencia · correspondiente de la misma significa una secuencia que corresponde a SWYGLR en las OPN de otros mamíferos, que es, por ejemplo, SWYGLR de cerdo idéntica a la secuencia en humanos SVAYGLR en mono, SLAYGLR en ratón y rata, SVAYGLK en bovinos, y SVAYRLK en conejo. El anticuerpo inhibitorio de OPN de la invención puede ser cualquiera de los anticuerpos que retengan estas propiedades, y el método para preparar el anticuerpo no se limita de forma específica. El anticuerpo inhibitorio de OPN se puede preparar usando por ejemplo OPNra, OPN-b, OPN-c o un fragmento N-terminal del mismo, o un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos RGDSWYGLR o una secuencia correspondiente de la misma, (referida posteriormente en la presente como "péptido relacionado a OPN") como el antígeno. El fragmento de OPN referido en la presente incluye fragmentos de OPN generados al digerir OPN con proteinasas y similares y es por ejemplo un fragmento recuperado por escisión con trombina. El anticuerpo inhibitorio de OPN se prepara de manera preferente al usar un péptido que contiene la secuencia RGDSWYGLR como un antígeno. De manera más preferente, el anticuerpo inhibitorio de OPN se prepara, por ejemplo, al usar como un antígeno el péptido (VDTYDGRGDSWYGLRS) que contiene ambas secuencias en una secuencia sucesiva, que inicia desde valina en la posición 153 y termina en serina en la posición 169 en el caso de OPN-a, y tratar subsecuentemente el péptido de acuerdo a un método general. ? fin de elevar la antigenicidad, de manera preferente, se usa un producto del péptido relacionado a OPN unido a un compuesto de biopolímero. Para trabajos de investigación de enfermedades relacionadas a OPN, que usan ratón como un animal experimental, de manera preferente, se usa un anticuerpo inhibitorio de OPN contra OPN murina. Este anticuerpo se prepara de manera preferente al usar un péptido que contiene la secuencia RGDSLAYGLR como el antígeno. Los ejemplos del compuesto de biopolímero que se va a unir al péptido relacionado a OPN incluyen, por ejemplo hemocianina de Macroschisma (referida como "KLH" posteriormente en la presente) , ovalbúmina (referida como "OVA" posteriormente en la presente) , albúmina de suero bovino (referida como "BSA" posteriormente en la presente) , albúmina de suero de conejo (referida como "RSA" posteriormente en la presente), y tiroglobulina . Entre éstas, son más preferibles KLH y tiroglobulina. El péptido relacionado a OPN y el compuesto de biopolímero se unen conjuntamente por métodos conocidos, por ejemplo, el proceso de anhídrido ácido mezclado (B.F.

Erlanger et al., (1954); J. Biol . Chem. 234, 1090-1094) o el proceso de éster activado (A. E. Kart et al., (1994): J. Agrie. Food Chem. 42, 301-309) . El anhídrido de ácido mezclado para el uso en el proceso de anhídrido de ácido mezclado se puede recuperar al someter el péptido relacionado a OPN a una reacción de Schotten-Baumann, que entonces se deja reaccionar con un compuesto de biopolímero para preparar el producto unido al objeto del compuesto de péptido-polímero . El éster de haloformiato para el uso en el proceso de anhídrido de ácido mezclado incluye, por ejemplo, cloroformiato de metilo, bromoformiato de metilo, cloroformiato de etilo, bromoformiato de etilo, cloroformiato de isobutilo y similares. La relación del péptido, el éster de haloformiato y el 'compuesto del polímero que se va a usar de acuerdo al método se selecciona de manera apropiada en un intervalo amplio . En la presente, la reacción de Schotten-Baumann se lleva a cabo en la presencia de un compuesto básico. El compuesto básico para el uso en la reacción incluye compuestos para uso de rutina para la reacción de Schotten-Baumann, por ejemplo bases orgánicas tal como trietilamina, trimetilamina, piridina, dimetilanilina, N-metilmorfolina, diazabiciclononeno (DBN) , diazabicicloundeceno (DBU) , diazabiciclooctano (DABCO) y similares, y bases inorgánicas tal como carbonato de potasio, carbonato de sodio, carbonato ácido de potasio, carbonato ácido de sodio y similares. Adicionalmente, la reacción se procesa en general a -20°C a 100°C, de manera preferente de 0°C a 50°C. El tiempo de reacción es de aproximadamente 5 minutos a 10 horas, de manera preferente de 5 minutos a 2 horas. La reacción entre el anhídrido de ácido mezclado resultante y el compuesto de biopolímero se practica en general a -20°C a 150°C, de manera preferente de 0°C a 100 °C, durante un tiempo de reacción de aproximadamente 5 minutos a 10 horas, de manera preferente de 5 minutos a 5 horas. El método de anhídrido de ácido mezclado se lleva a cabo en general en un solvente. El solvente incluye, por ejemplo, cualquiera de los solventes comúnmente usados para el método de anhídrido de ácido mezclado, incluyendo de forma específica hidrocarburos halogenado.s tal como diclorometano, cloroformo y dicloroetano; hidrocarburos aromáticos tal como benceno, tolueno y xileno; éteres tal como dietil-éter, dioxano, tetrahidrofurano y dimetoxietano ; ésteres tal como acetato de metilo y acetato de etilo,-solventes polares no protónicos tal como N,M-dimetilformamida, dimetilsulfóxido y hexametilfosfotriamida, y similares. De manera alternativa, el proceso de éster de activación se realiza en general como sigue. Se disuelve primero el péptido relacionado a OPN en un solvente orgánico, para la reacción con N-hidroxisuccinimida en la presencia de un agente de acoplamiento, se produce un éster activado con N-hidroxisuccinimida. Como el agente de acoplamiento, los agentes de acoplamiento generales para el uso de rutina en la reacción de condensación se pueden usar, incluyendo por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida, carbonildiimidazol y carbodiimida soluble en agua. Como el solvente orgánico, de manera alternativa, por ejemplo, se puede usar ?,?-dimetilformamida (DMF) , dimetilsulfóxido y dioxano . La relación molar del péptido y un agente de acoplamiento tal como N-hidroxisuccinimida para el uso en reacción es de manera preferente 1:10 a 10:1, de manera más preferente 1:1. La temperatura de reacción es de 0°C a 50 °C, de manera preferente de 22 °C a 27°C, en tanto que el tiempo de reacción es de 5 minutos a 24 horas, de manera preferente de 1 a 2 horas. De manera satisfactoria, la temperatura de reacción es una temperatura por arriba de los puntos de fusión individuales y por abajo de los puntos de ebullición individuales . Después de la reacción de acoplamiento, la solución de reacción se adiciona a una solución que disuelve un compuesto de biopolímero en la misma, para la reacción. En el caso que el compuesto de biopolímero tenga un grupo amino libre, por ejemplo, un enlace ácido-amida se forma entre el grupo amino y el grupo carboxilo del péptido. La temperatura de reacción es 0°C a 60°C, de manera preferente de 5°C a 40°C, y de manera más preferente de 22°C a 27°C, en tanto que el tiempo de reacción es de 5 minutos a 24 horas. de manera preferente de una hora a 16 horas, y de manera más preferente una hora a 2 horas . El producto de reacción entre el péptido relacionado a OPN y el compuesto de biopolímero ' como se genera por el método se purifica por diálisis o con una columna de desalación y similares, para recuperar el producto del péptido relacionado a OPN unido al compuesto de biopolímero (referido simplemente posteriormente como "producto unido" ) . Ahora sigue la descripción a continuación acerca del método para preparar un anticuerpo, usando el producto unido recuperado de esta manera como un antígeno, y un método de inmunoensayo que usa el anticuerpo. Para la preparación del anticuerpo, en la presente, se pueden utilizar métodos conocidos, de forma apropiada, que se describen por ejemplo en Zoku Seikagaku Jikken oza (Biochemical Experimental Lectura Series) , y Men-eki Seikagaku kenkyu Ho (Immuno-Biochemistry Research Method) (Nihon Seikagaku Gakkai hen (Japan biochemical Association, ed.) ) A fin de preparar un anticuerpo policlonal usando el producto unido de acuerdo con la invención, se inmuniza un animal con el producto unido para recolectar el anticuerpo del animal . De manera más específica, por ejemplo, un producto unido tal como el producto unido de péptido-tiroglobulina relacionado a OPN se disuelve primero en amortiguador de fosfato de sodio (referido posteriormente como "PBS"), que entonces se mezcla con el adyuvante completo de Freund o el adyuvante incompleto de Freund, o un agente auxiliar tal como alum. La mezcla resultante se usa como el inmunógeno para inmunización de un animal mamífero'. Cualquier animal para el uso de rutina en el campo se puede usar como el animal para inmunización, incluyendo por ejemplo ratón, rata, conejo, cabra y caballo. Adicionalmente, el método para dosificar el inmunógeno para la inmunización puede ser vía cualquiera de inyección subcutánea, inyección intraperitoneal , inyección intravenosa, e inyección intramuscular. Es preferible la inyección subcutánea o la inyección intraperitoneal. La inmunización se puede realizar' una vez o más veces a un intervalo apropiado, de manera preferente a un intervalo de una semana a 5 semanas . De acuerdo a un método general, entonces, se recolecta sangre del animal inmunizado, del cual se separa el suero. Al purificar la fracción de anticuerpo policlonal, se puede recuperar el anticuerpo inhibitorio de OPN. De acuerdo a un método general, adicionalmente, una célula inmunitaria recuperada al inmunizar un animal con el producto unido, se fusiona a la célula de mieloma para preparar un hibridoma. Al recolectar un anticuerpo de un cultivo del hibridoma, se puede recuperar el anticuerpo inhibitorio de OPN como un anticuerpo monoclonal . Cuando el anticuerpo de la invención se propone para el uso en el tratamiento terapéutico en animales incluyendo humanos, se da preferencia el uso de un anticuerpo quimérico (ver, publicación de patente europea EP 012503) preparado a . través de esta modificación por ingeniería genética, tal que el anticuerpo inhibitorio de OPN resultante pueda tener la misma región constante como aquella de ese anticuerpo para un sujeto humano o animal que se va a tratar o el uso del anticuerpo que se ha animalizado (ver, publicación de patente Europea EP 0239400 ó EP 045126) . De otra manera, de manera preferente, se usa un anticuerpo monoclonal (un anticuerpo tipo animal para la especie animal) (ver publicación de patente Europea EP 0546073 ó O 97/07671) , como se prepara al usar un animal transgénico con un gen artificialmente introducido comprendido en la generación del anticuerpo en un sujeto humano o animal que se va a tratar. En el caso que el sujeto que se trate sea humano y el animal que genere el anticuerpo inhibitorio de OPN sea ratón, de manera preferente, se usan anticuerpos quiméricos humano-ratón' o anticuerpos humanizados. De manera más preferente, se usa un animal transgénico tal como un ratón al que se le ha introducido un gen humano comprendido en la generación del anticuerpo, para preparar un anticuerpo monoclonal tipo humano, para el uso subsiguiente. Adicionalmente, el método de exhibición de fagos se puede usar de manera satisfactoria para la generación del anticuerpo . El anticuerpo inhibitorio de OPN recuperado de esta manera se puede usar en la forma de Fv, Fab o F(ab' )2 con el sitio de reconocimiento de antígeno cortado del anticuerpo inhibitorio de OPN con proteasa y similares. El anticuerpo inhibitorio de OPN recuperado de esta manera se purifica adicionalmente, si es necesario, que se formula de manera subsiguiente en formas de dosis de acuerdo a un método general, para el uso en el tratamiento terapéutico de artritis reumatoide, reumatismo tal como reumatismo articular juvenil y reumatismo crónico, artritis psoriática y psoriasis. La supresión de rechazos crónicos después del trasplante de órganos; y el tratamiento terapéutico de enfermedades auto-inmunitarias tal como enfermedades auto-inmunitarias sistémicas, eritematodes , uveítis, enfermedad de Behcet, miosis múltiple, nefritis proliferativa de madeja y sarcoidosis. El anticuerpo inhibitorio de OPN de la invención se puede usar de manera preferente como un agente terapéutico de reumatismo o un agente terapéutico de artritis reumatoide . Los ejemplos de formas de dosis de estos agentes terapéuticos de reumatismo similares incluyen formas parenterales tal como inyecciones e infusiones, que se dosifican de manera preferente via inyección intravenosa e inyección subcutánea (para el uso como un agente terapéutico de enfermedades auto-inmunitarxas , los ejemplos descritos anteriormente se deben seguir) . Para la formulación, adicionalmente, se pueden usar portadores y aditivos farmacéuticamente aceptables dentro de un intervalo farmacéuticamente aceptable, dependiendo de la forma de dosis . La cantidad del anticuerpo inhibitorio de OPN que se va adicionar para la formulación, varía, dependiendo de la severidad sintomática y la edad del paciente, la forma de dosis de la formulación que se va a usar o el título de unión del anticuerpo inhibitorio de OPN o similares. Por ejemplo, se usa de manera satisfactoria una cantidad de aproximadamente 0.1 mg/kg a 100 mg/kg. Debido a que el anticuerpo inhibitorio de OPN como el ingrediente efectivo en el agente terapéutico de la invención, recuperado de esta manera, se une fuertemente a las secuencias RGD y SWYGLR en OPN, el anticuerpo inhibitorio de OPN inhibe posiblemente la unión entre estas regiones de OPN e integrina, para suprimir en forma consecuente la exacerbación de los síntomas de reumatismo, artritis reuraatoide y otras enfermedades auto-inmunitarias. Debido a que el anticuerpo inhibitorio de OPN de la invención se une de manera específica en el lado de OPN, no en el lado de integrina, el anticuerpo no inhibe de forma potencial otras funciones significativas de la integrina, de modo que se espera que se puedan evitar los efectos laterales desventajosos. Además, el anticuerpo inhibitorio de OPN de la invención también se puede usar para el propósito de detectar un agente terapéutico de enfermedades auto-inmunitarias. Como se describe anteriormente, un compuesto que inhibe la unión entre las secuencias de RGD de OPN e integrina y que inhibe la unión entre la secuencia de SWYGLR y la integrina sirve posiblemente como un agente terapéutico de enfermedades auto-inmunitarias. De esta manera, la aplicabilidad de una sustancia que se va a detectar (sustancia de prueba) como un agente terapéutico de enfermedades auto-inmunitarias se puede evaluar en un sistema de reacción preparado al adicionar la sustancia de prueba y el anticuerpo inhibitorio de OPN de una manera competitiva a un sistema de ensayo en la presencia de cantidades dadas de OPN e integrina, para valorar el grado de inhibición de la unión entre la OPN y la integrina con relación a la cantidad usada de anticuerpo inhibitorio de OPN.

De manera similar, un compuesto que inhibe la unión entre la secuencia RGD de OPN y la integrina y que inhibe la unión entre la secuencia SWYGLR y la integrina sirve posiblemente como un agente terapéutico de reumatismo y artritis reumatoide. Cuando se usa el anticuerpo inhibitorio de OPN para componer el mismo sistema de reacción como se describe anteriormente, por lo tanto, el sistema de reacción se puede usar para detectar reumatismo y artritis reumatoide. Además, el anticuerpo inhibitorio de OPN de la invención se puede utilizar como un agente de diagnóstico de reumatismo. Como se describe anteriormente, se demuestra que se encuentra de forma particular una alta concentración del fragmento N-terminal de la OPN escindida por trombina en la artrosis de un paciente con artritis reumatoide. De esta manera, el ensayo de OPN o el fragmento N-terminal de la misma en una muestra usando el anticuerpo inhibitorio de OPN puede servir para la diagnosis de reumatismo. Como un método para el mismo, son aplicables los siguientes métodos para el uso como métodos generales de ensayo inmunoquímico ["Hybridoma Method and Monoclonal Antibody" , emitido por R&D Planning KK. , pp. 30-53, Marzo 5, 1982] : método de radioinmunoensayo (RIA) , ELISA (E. Engvall et al., (1980); Methods in Enzymol . , 70, 419-439), método de anticuerpo fluorescente, método de placa, método de punto, método de agregación, prueba de Ouchterlony y similares . El método se puede se seleccionar de forma apropiada desde varios puntos de vista. En vista de la sensibilidad, simplicidad y similares, es preferible el método de ELISA. El método incluye de manera más preferente inmovilizar el anticuerpo inhibitorio de OPN de la invención en un portador y marcar un anticuerpo que reconozca un sitio de OPN diferente de aquel del anticuerpo inhibitorio de OPN de la invención, para detectar OPN o el fragmento N-terminal de la misma. De esta manera, se puede usar este método de detección para un agente de diagnóstico de artritis reumatoide . La sustancia de marcado para el uso en el marcado de anticuerpo incluye enzimas tal como peroxidasa de rábano (referida posteriormente como "HRP" ) , fosfatasa alcalina (referida posteriormente como "AP") y similares, sustancias fluorescentes tal como isocianato de fluoresceína, y rodamina y similares, sustancias radioactivas tal como 32P, 125I y similares, sustancias quimioluminescentes y similares. El procedimiento del método de intercalación como uno de los métodos de detección más específicos de las isoformas de OPN se describe a continuación. De manera específica, el procedimiento incluye un primer paso (a) de inmovilizar el anticuerpo contra una isoforma de OPN de la invención en un portador, un segundo paso (b) de bloquear la superficie del portador con un anticuerpo no inmovilizado en el mismo con un material que no tenga relación con el antígeno, por ejemplo, una proteina. El procedimiento incluye además un paso (c) de adicionar una muestra que contiene varias concentraciones de la isoforma de OPN a la mezcla resultante, para generar un complejo de isoforma de OPN-anticuerpo, un paso (d) de adicionar de forma subsiguiente un anticuerpo anti-isoforma de OPN, marcado para permitir que el anticuerpo se una al complejo de antígeno-anticuerpo inmovilizado, y un paso final (e) para valorar la cantidad de marca unida al portador para determinar la cantidad de la isoforma de OPN libre en la muestra, en base a la curva normal preliminarmente preparada. El portador usado en el paso (a) para la inmovilización del anticuerpo incluye, pero no se limita de manera específica a, cualquiera de los portadores para el uso de rutina en métodos de ensayo inmunoquímico . El portador puede incluir, por ejemplo, placa de microtítulo de 96 cavidades de poliestireno, o placa de microtítulo del tipo unido a grupo amino. Para la inmovilización adicional de anticuerpo, por ejemplo, se adiciona de forma satisfactoria un amortiguador que contiene el anticuerpo y se incuba con el portador. Se pueden usar amortiguadores conocidos como el amortiguador, que es por ejemplo PBS 10 mM. La concentración del anticuerpo en un amortiguador se puede seleccionar dentro de un amplio intervalo, pero en general, la concentración es apropiadamente cerca de 0.01 a 100 µ9/p?1 y de manera preferente 0.1 a 20 µ9/t?1. De forma adicional, la cantidad del amortiguador es 300 µ?/cavidad o menos de manera preferente aproximadamente 20 a 150 µ?/cavidad, cuando se usa una placa de microtítulo de 96 cavidades como un portador. Además, las condiciones de incubación incluyen de manera enunciativa y sin limitación incubación durante la noche a aproximadamente 4°C, que en general es apropiado. En el paso (b) de bloqueo, además, el bloqueo se realiza para el propósito de prevenir la adsorción no especifica en un portador debido a que una parte posiblemente adsorbible en un portador a pesar de que no hay relación con la reacción antígeno-anticuerpo puede existir de forma potencial en la OPN en una muestra que se va adicionar en el siguiente paso. Como el agente de bloqueo, por ejemplo, se puede usar albúmina de suero bovino (BSA) y solución de leche descremada. De otra manera, se pueden usar agentes de bloqueo comercialmente disponibles tal como Block-Ace (fabricado por Dainxppon Pharmaceutical Co., Ltd.; Código No. UK-25B) . De manera específica y sin limitación, el bloqueo se realizar al adicionar, por ejemplo, un volumen apropiado de Block-Ace a una parte con el antígeno inmovilizado en la misma, para la incubación durante la noche a aproximadamente 4°C y enjuague de la parte resultante con un amortiguador. El amortiguador incluye, por ejemplo, de manera enunciativa y sin limitación un amortiguador de la composición de PBS 10 mM, pH 7.2, NaCl al 0.8% (p/v) , KC1 0.02% (p/v) y Tween 20 al 0.02% (p/v) . En el paso (c) , entonces, se pone una muestra que contiene una isoforma de OPN en contacto al anticuerpo inmovilizado, para permitir que la isoforma de OPN se capture en el anticuerpo inmovilizado y se prepare un complejo de anticuerpo-isoforma de OPN, inmovilizado. Sin limitación, la reacción se realiza a aproximadamente 37°C durante aproximadamente una hora. Después del término de la reacción, el portador se enjuaga con un amortiguador, para descartar la proteína no reactiva, y similares. Un amortiguador de la composición de PBS 10 mM, pH 7.2 y Tween 20 al 0.5% (p/v) es preferible como el amortiguador que se va a usar para la reacción. En el paso (d) , además, se forma un complejo de anticuerpo inmóvilizado-isoforma de OPN- nticuerpo marcado al adicionar un anticuerpo marcado que reconoce otro epitope de la isoforma de OPN capturado en el anticuerpo, inmovilizado. Después del término de la reacción, de manera preferente, el portador se enjuaga con un amortiguador, para descartar la proteína sin reaccionar y similares. El amortiguador descrito para el paso (c) se usa como el amortiguador para la reacción. El anticuerpo marcado que se va a usar en el paso (d) se requiere para reconocer un epitope que difiera del epitope reconocido por el anticuerpo inmovilizado en el paso (a) . Cuando se usa como el anticuerpo inmovilizado un anticuerpo polxclonal que reconoce el medio dominio anterior de la isoforma de OPN, por ejemplo, un anticuerpo policlonal que reconozca el medio dominio posterior de la isoforma de OPN se usa como un anticuerpo marcado con una enzima unida (por ejemplo, HRP o AP o similares) . El uso de estos anticuerpos que reconocen diferentes sitios como se describe anteriormente permite un ensayo específico altamente sensible de una isoforma de OPN generada por empalme alternativo . La cantidad del anticuerpo marcado que se va a usar en el paso (d) es de manera preferente cerca de 5,000 a 10,000 veces la cantidad del anticuerpo inmovilizado unido al portador. De forma deseable, el anticuerpo marcado diluido de manera preferente a un valor final de absorbancia pico de 1.5 a 2.0 en el ensayo final se usa para la reacción. Para esta dilución, se pueden usar, amortiguadores , en tanto que la reacción se realiza de manera preferente a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 30 minutos, seguido por enjuague con amortiguadores después del término de la reacción. Pero la reacción no se limita a estas condiciones. Las reacciones descritas, anteriormente permiten la unión al portador del complejo de anticuerpo-isoforma de OPN-anticuerpo marcado al portador. En el paso (e) , finalmente, una solución de substrato cromogenico que reacciona con la sustancia de marcado en el complejo de anticuerpo inmóvilizado-isoforma de OPN-anticuerpo marcado se adiciona para la medición de absorbancia para calcular la cantidad de OPN en base a curva normal . Cuando se usa una enzima de peroxidasa como la sustancia de marcado para marcar un anticuerpo, por ejemplo, se puede usar una solución de substrato cromogénico que contiene peróxido de hidrógeno y 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -tetrametilbenzina (T B) ó o-fenilendiamina (OPD) . Sin limitación específica, se realiza la reacción cromogénica al adicionar una solución de substrato cromogénico para la reacción a aproximadamente 25 °C durante aproximadamente 20 minutos, y al adicionar de manera subsiguiente ácido sulfúrico 1N para terminar la reacción enzimática. En el caso que se use TMB, el progreso de la reacción cromogénica se valora en base a la absorbancia a 450 nm. En el caso en que se use una enzima AP como una sustancia de marcado, de manera alternativa, un método apropiado incluye la reacción cromogénica usando ácido p-nitrofenilfosfórico (pNPP) como un substrato, la adición de NaOH 2N para terminar la reacción enzimática y la medición de la absorbancia de 415 nm. Al usar una curva normal preliminarmente preparada en base a la absorbancia de una solución de reacción con adición de concentraciones conocidas de una isoforma de OPN, se puede calcular la concentración de la isoforma de OPN en una muestra. El método para detectar la isoforma de OPN de acuerdo con la invención se usa para el esclarecimiento de las funciones de OPN, y la diagnosis y tratamiento terapéutico de enfermedades para las cuales la OPN es responsable. Un ejemplo de uso del método incluye un equipo de detección de anormalidades inflamatorias por las cuales se pueden discriminar reumatismo y artritis reumatoide, a manera de ejemplo, el equipo que trabaja para detectar de manera separada el fragmento N-terminal de la OPN escindida con trombina y la OPN tipo no escisión, detectando de este modo la presencia o ausencia de cualquier anormalidad inflamatoria . Como se describe anteriormente, el fragmento N-terminal de la OPN escindida con trombina se observa de manera similar a una alta concentración en las cavidades articulares de pacientes con artritis reumatoide, en particular. Sin embargo en pacientes con osteoartritis, la tendencia es significativamente baja. Como se describe anteriormente, la relación del fragmento N-terminal que ocupa OPN en la cavidad articular varía en los pacientes individuales. A fin de diagnosticar en forma discriminante reumatismo y osteoartritis , por lo tanto, se puede medir de forma satisfactoria la relación del fragmento N-terminal que ocupa la OPN total . Como un ejemplo más especifico, se deben formular anticuerpos contra péptidos individuales de las siguientes tres secuencias comunes a las tres isoformas de OPN, específicamente CVDTYDGRGDSWYGLRS (C+V153 a S169) (1) KSKKFRRPDIQYPDATDEC (K170 a E187+C) (2) IPVKQADSGSSEEKQC (117 a Q31+C) (3) Entre estas, la secuencia (1·) está presente en el lado N-terminal del sitio escindido por trombina, y está presente comúnmente a la OPN de longitud completa como el tipo sin escisión con trombina y el fragmento N-terminal. De manera alternativa, la secuencia (2) está presente en el lado C-terminal del sitio escindido con trombina y está presente en la OPN de longitud completa del tipo sin escisión con trombina, ni está contenida en el fragmento N-terminal . Además, la secuenci (3) corresponde a los residuos de aminoácido en las posiciones 17 a 31 en el lado N-terminal de OPN y está presente como un OPN de longitud completa como el tipo sin escisión con trombina y el fragmento N-terminal. El equipo de diagnosis para discriminación entre pacientes con reumatismo y pacientes con osteoartritis se puede componer de dos tipos de reactivos de inmunodetección que utilizan anticuerpos que corresponden de forma individual a los tres tipos de secuencias. En otras palabras, un primer reactivo de inmunodetección que usa dos tipos de anticuerpos contra los péptidos representados por las secuencias (3) y (2) trabaja para el ensayo de OPN tipo sin escisión con trombina reconocida comúnmente por ambos anticuerpos en una muestra. Entonces, se puede realizar la detección por el mismo método como el método de intercalación, que incluye inmovilizar, por ejemplo, un anticuerpo contra el péptido de la secuencia (3) en un portador, que permite que el anticuerpo reaccione con una muestra de un paciente, enjuagando el portador, y adicionando subsecuentemente un anticuerpo contra el péptido de la secuencia (2) como un anticuerpo de marcado o marcación. En el caso de un segundo reactivo de inmunodetección, adicionalmente, se usan dos anticuerpos contra los péptidos representados por las secuencias (1) y (3) para valorar el total de la OPN tipo sin escisión con trombina y el fragmento N-terminal generado por la escisión con trombina en una muestra, que se reconocen comúnmente por ambos anticuerpos. En este caso, se puede realizar la detección por el mismo método - como el método de intercalación, que incluye inmovilizar, por ejemplo, un anticuerpo contra el peptido de la secuencia (1) o un portador, que permite que el anticuerpo reaccione con una muestra de un paciente, enjuagando el portador, y adicionando subsecuentemente un anticuerpo contra el péptido de la secuencia (3) como un anticuerpo de marcado. De manera subsiguiente, los resultados del ensayo de la muestra en un paciente con los dos tipos de reactivos de inmunodetección se comparan conjuntamente, para poner en claro la relación del fragmento N-terminal generado por escisión con trombina en la OPN total en el paciente, se permite la discriminación entre reumatismo y osteoartritis .

Ej emplos La invención ahora se describirá en más detalle en los siguientes Ejemplos y Ejemplo de Referencia. Pero la invención no se limita a estos ejemplos.

Ej emplo 1 Clonación, construcción, purificación y reactivos para la proteína de fusión GST-OPN: Se realizó la clonación y purificación de proteína esencialmente de acuerdo al método descrito en la referencia (S. Kon et al., (2000): J. Cell . Biochem. 77: 487-498). Los ADNc de las isoformas humanas de OPN, es decir, OPN-a y OPN-b se recuperaron como sigue. Usando AR preparado a partir de células NRC-12 de una línea de células de cáncer de riñon humano como plantilla, se preparó de forma sintética el ADNc, usando el ADNc como plantilla, se realizó la PCR usando los siguientes cebadores OPN-5 y OPN-3 para recuperar los ADNc que codifican para la OPN-a y OPN-b humanas de longitud completa que incluyen de forma individual las regiones respectivas de péptido de señal. De la manera como se describe en la referencia, entonces, los ADNc clonados de esta manera de la OPN-a y OPN-b se insertaron en el vector pGEX4T (Amersham Phamarcia Biotech, Tokio, Japón) de modo que los ADNc deben estar en -el mismo cuadro de lectura como aquel del gen GST (glutationa-S-transferasa; EC2.5.1.18), para la expresión en la forma de la proteína de fusión de GST, usando Escherichia coli JM109 (las proteínas de fusión de GST-OPN) recuperadas de esta manera se retiren como "GST-OPN-a" y "GST-OPN-b" posteriormente) . OPN-5 : 5 ' -CGGGATCCACTACCATGAGAATTGCAGTGATTTGC-3 ' OPN-3: 5 ' -CCGCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGATGCACTATC-3 ' El ADNc que codifica para la isoforma humana OPN-c se preparó por PCR de dos pasos usando ADNc de OPN-a como plantilla. En un primer paso, se realizó individualmente la PCR usando OPN-5 y el siguiente cebador de OPNct-3 ó el siguiente cebador OPNct-5 y OPN-3; los dos productos de PCR resultantes se mezclaron conjuntamente, se trataron de forma térmica y se enfriaron gradualmente para fijación, seguido por adición de una enzima para extensión. En un segundo paso, de forma subsiguiente, se realizó la PCR usando conservadores OPN-5 y OPN-3, para recuperar el ADNc que codifica para la OPN-c humana de longitud completa que incluye la región de péptido de señal . El ADNc de la isoforma c se integró en el vector pGEX4T por el mismo método como para las isoformas a y b, para preparar una proteína de fusión GST (referida como "GST-OPN-c" posteriormente) . OPNct-3 : 5 ' -ACACAGCATTCTTTTCCACAGAACTTCCAGAATCAGC-3 ' OPNct-5 5 ' -TGAGGAAAAGAATGCTGTGTCCTCTGAAGAAAACC-3 ' El ADNc que codifica para la media porción en el lado amino-terminal (M1-R168) del sitio escindido con trombina de la OPN-c se recuperó por PCR usando el ADNc de OPN-a como plantilla y OPN-5 conjuntamente con el siguiente cebador OPNnh-3 descrito posteriormente. Por el mismo método como para las isoformas a y b, el ADNc resultante se integró en el vector pGEX4T para preparar la proteína de GST (referida como "GST-Nmitad" posteriormente) . OPNnh-3 : 5 ' -GCCTCGAGTTACCTCAGTCCATAAACCACACT-3 ' La proteína de osteopontina (mitad hOPN C) en el lado de carboxilo del sitio escindido con trombina de la OPN-a se preparó por la PCR de dos pasos usando el ADNc de OPN-a como plantilla. En un primer paso, se realizó la PCR, individualmente, usando OPN-5, el siguiente cebador OPNch-3, los siguientes cebadores OPNch-5 y OPN-3. En un segundo paso, se realizó la PCR usando los cebadores. OPN-5 y OPN-3, para preparar la proteína de OPN en el lado de carboxilo. Por el mismo método como para las isoformas a y b, la recombinación en el vector pGEX4T permitió la preparación de una proteína de GST (referida como "GST-C-mitad" posteriormente) . OPNch-3 : 5' -TCTTAGATTTGGCACAGGTGATGCCTAGGAG-3 ' OPNch-5 : 5 ' -CACCTGTGCCAAATCTAAGAAGTTTCGCAGA-3 ' Se prepararon varias proteínas de fusión de GST-OPN recombinantes en Escherichia coli por un método general, y entonces se purificaron, usando una columna de glutationa-Sefarosa de acuerdo al método descrito en la referencia. Entre estas, la proteína de GST-N-mitad se escindió en el sitio de unión con una proteasa de precisión (PreScission; Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japón) , para eliminar la porción de proteína de GST y recuperar de este modo una proteína (referida posteriormente como "nOPN" ) compuesta de la porción de mitad amino-terminal (I17-R168) de la OPN sola . De manera alternativa, el ADNc ' que codifica para la OPN-a de longitud completa (M1-N314) se insertó adicionalmente en el vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen Corporation) , para la transfección en células CH0-K1 (manufacturado por Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (referido como "célula CHO/OPN-a" posteriormente) . La OPN-a del tipo unido a cadena de azúcar (referido posteriormente como "CHO/OPN-a") como se recuperó de la célula se purificó como sigue. De forma específica, el sobrenadante de cultivo de la célula CHO/OPN-a se sometió a cromatografía en columna con intercambio iónico usando una columna de DEAE-Safarosa-CL-6B (Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japón) y cromatografía de filtración en gel en una columna Ultrogel AcA44 (fabricada por BioSepra SA) , y continuamente la cromatografía en columna de fase invertida en una columna RESOURCE RPC (Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japón) . De esta manera, se terminó la purificación. Se usaron varios péptidos comprados de Sigma Genosis Japón para trabajos de investigación en inmuno-sensibilización y unión. De otro modo, estos péptidos se recuperaron por síntesis química por el proceso de Fmoc (N- (9-fluorenil) metoxicarbonilo) con un sintetizador de péptidos (Modelo 432 A; fabricado por PerkinElmer Life Science, Inc.) y purificación por cromatografía en columna de fase invertida C18.

Ejemplo 2 Producción de anticuerpo monoclonal: Se prepararon péptidos sintéticos que corresponden a las secuencias interiores de la OPN humana, como se muestra a continuación, que entonces se usaron para inmunización. Péptido 1 : CVD YDGRGDSWYGLRS (C+V153 a SI69) Péptido 2 : CIDSQELS VSREFHSH (C+I1261 a H276) De manera específica, el péptido 1 tiene la secuencia RGD y SWYGLR que reconoce los receptores de integrina a?ß3 y a9ß1, respectivamente. Estos péptidos se unieron a iroglobulina, que entonces se usaron para inmunización murina de acuerdo a un método general. De forma continua, se aislaron los esplenocitos de los ratones inmunizados, que entonces se sometieron a fusión celular con células de mieloma murino P3-X63-Ag8-653 , usando polietilenglicol . De acuerdo al método descrito en la referencia (M. Kinebuchi et al., (1991): J. Immunol., 146, 3721-3728), se seleccionó un hibridoma que reacciona con cada uno de los péptidos usados para la inmunización. De los ratones inmunizados con los péptidos 1 y 2, se recuperaron anticuerpos monoclonales designados 2K1 y 4C1, respectivamente. El hibridoma que genera el anticuerpo monoclonal 2K1 se depositó como FERM BP-7883 en el Centro Depositario de Organismos de Patentes, el Nacional Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japón) con fecha del 20 de junio del 2001. Adicionalmente, el anticuerpo · monoclonal 53 (mAb53) se recuperó por inmunización por OPN humana recombinante de longitud completa (D. S. Bautista et al., (1994): J. Biol . Chem. , 269, 23280-23285) .

Ejemplo 3 Reactividad de OPN y productos de digestión con trombina de la misma con los anticuerpos monoclonales: Las potencias de unión de los anticuerpos monoclonales 2K1 y 4C1 recuperados en el Ejemplo 2 a la OPN y productos de digestión con trombina de la misma se probaron por método de transferencia Western. Se encontró que el anticuerpo 2K1 reaccionó con GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c y GST-N-mitad. El anticuerpo 4C1 reaccionó con GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c y GST-C-mitad . Además, estos anticuerpos monoclonales no se unieron sólo a las proteínas recombinantes del tipo no unido a cadena de azúcar como se generaron en Escherichia coli sino que también reaccionaron con la proteína CHO/OPN-a del tipo unido a cadena de azúcar y los productos de digestión con trombina de los mismos (referido posteriormente como "OPN escindida con trombina" ) .

E emplo 4 Inhibición de la adhesión celular a la OPN vía los anticuerpos monoclonales: Se examinó por el siguiente método en cuanto a sí o no los anticuerpos monoclonales inhibieron la adhesión celular a OPN. Primero, se revistió una placa de 96 cavidades con varias concentraciones de CHO/OPN-a a 4°C durante la noche, que entonces se trató con BSA al 0.5% en PBS bajo condiciones de 37°C durante 10 minutos, para bloquear la adhesión específica. Un fibroblasto humano TIG-7 o célula SW 80 transformada con el ADNc de una sub-unidad de integrina a9 (referida posteriormente como "célula SW480 OÍ9-transformada" ) se suspendió y dispersó en D-MEM que contiene BSA al 0.25%; 200 µ? de la suspensión celular resultante (a una concentración celular de 5 x 104 células/cavidad) se inyectó en una placa de 96 cavidades pre-revestida con CHO/OPN-a ó nOPN, en la presencia o ausencia de varias concentraciones de anticuerpos monoclonales o péptidos sintéticos, para la incubación a 37°C durante una hora. El medio de cultivo se descartó de la placa, y todas las cavidades se enjuagaron dos veces con D-MEM que contiene BSA al 0.25%. Las células adherentes se filtraron y se tiñeron violeta cristalino al 0.5% en metanol al 20% durante 30 minutos . Todas las cavidades se incubaron tres veces con agua, las células adherentes entonces se solubilizaron en ácido acético al 20%. El sobrenadante resultante recuperado de cada cavidad se analizó con un inmunolector, para medir la absorbancia a 590 nm para determinar la cuenta relativa de las células que se adhieren a la cavidad. Todos los ensayos se realizaron de una manera en triplicado, y se realizaron al menos tres experimentos independientes. Los valores mostrados representan la media de tres experimentos independientes . Se ha mostrado que TIG-7 se adhiere altamente a OPN, pero como se muestra en la Figura 1A, la adhesión se inhibió de forma aparente por el péptido GRGDSP (100 xg/ml) pero no se inhibió por un péptido de control (la región C-terminal de K296-N314 en OPN) (100 µ /t?1) . De esta manera, la adhesión es dependiente de RGD. Como se muestra en la Figura IB, además, el anticuerpo 2K1 a 200 µg/ml inhibió aparentemente la adhesión celular a OPN. Como se muestra en la Figura 1C, aún además, el efecto de 2K1 en la inhibición de la adhesión celular es comparativo al efecto ejercido por mAb53 y es dependiente de la concentración. Aún además, 2K1 y mAb53 nunca inhibieron la adhesión de células TIG-7 a vitronectina (VN) o fibronectina (F ) . La Figura 2 representa la inhibición de los anticuerpos monoclonales en la adhesión de nOPN y vitronectina a la célula SW480 a9-transformada . Como se muestra en la Figura 2A, la adhesión entre 1 ig/ml de vitronectina y la célula SW480 <x9-transformada se inhibió por el péptido GRGDSP 200 µta (RGD) , de modo que la adhesión es dependiente de RGD. La adhesión de la célula SW480 a.9-transformada a 3 µg/ml de nOPN se inhibió por una combinación de GRGDSP 200 µt? y un anticuerpo monoclonal ?9?2 a ti-o^l (A. Wang et al., (1996): Am. J. Respir. Cell Mol. Biol . , 15, 664-672), de modo que la adhesión es dependiente de RGD e independiente de RGD. La Figura 2B muestra adicionalmente el efecto de 2K1 en la adhesión de la célula SW480 a9-transformada a nOPN- y vitronectina. La adhesión entre la célula SW480 a9-transformada y vitronectina nunca se inhibió por 2K1, pero se inhibió por 2 1 la adhesión entre la célula SW480 y nOPN. En consecuencia, se indicó que 2K1 retiene la potencia para inhibir la adhesión dependiente de RGD.

Ejemplo 5 Inhibición de migración de monocitos inducida por OPN via los anticuerpos monoclonales. Se realizó una prueba de migración celular usando la célula U937 al usar un sistema ChemoTxlOl-8 (Neuro Probé Inc.). La célula se ajustó a 2 x 10s células/mL con D-MEM que contiene BSA al 0.1%, que entonces se aplicó a la capa superior en un filtro (con un. tamaño de poro de 8 µt?) , en tanto que la proteína de OPN se adicionó a la capa inferior. La placa ChemoTx se dejó reposar en la presencia de C02 al 5% a 37°C durante 4 horas. Después de que se dejó reposar la placa, el filtro se fijó con metanol , y entonces se tiñó con hematoxilina y eosina (H-E) . El número de células que migran a la superficie posterior del filtro se contó con un microscopio (aumento x 400) . La prueba se realizó en triplicado, y se usó la media como dato. Los resultados se muestran en la Figura- 3. La Figura 3a muestra la migración celular de la célula U937 hacia CHO/OPN-a, la OPN escindida con trombina y la GST-Nmitad a las concentraciones mostradas. Adicionalmente, la Figura 3b muestra los ensayos de inhibición usando las OPN individuales a 10 g/ml, en la presencia o ausencia de 50 /¿g/ml de 2K1, mAb53 ó IgG murina de control después de la purificación específica del antigeno . Como se muestra en las Figuras 3a y 3b, la CHO/OPN-a, la OPN escindida con trombina y la GST-N-mitad inducen la migración del monocito humano U937 de una manera dependiente de la concentración (A) . El anticuerpo 2K1 inhibe aparentemente la migración de monocitos inducida por la CHO/OPN-a, la OPN escindida con trombina y la GST-N-mitad. En contraste, mAb53 sólo inhibe la migración de monocitos inducida por OPN de longitud completa (B) Ejemplo de Referencia 1 OPN e inducción de artritis : A fin de poner en claro la función de OPN en la artritis, se preparó artificialmente un ratón defectuoso en el gen OPN (S.R. Rittling et al., (1998); J. Bone y Mminer. Res., 13 (7), 1101-1111) de acuerdo a un método general, para experimentos comparativos con ratón normal . Un cóctel de anticuerpo monoclonal artritogénico comercialmente disponible como una sustancia que produce artritis (bajo el nombre comercial de un cóctel para artritis, Arthrogen-CIAMR mAb, cóctel mAb Artritogénico; elaborado por Iwai Chemical Pharmaceutical Co., Ltd.) se administró a un ratón defectuoso en el gen OPN (OPN"''") y un ratón normal (OPN+/+) , individualmente, de acuerdo a un manual de instrucciones anexo al producto, para la inducción de la artritis. Entonces, se observó la severidad del mismo. Para los controles, se dosificó una solución salina fisiológica a los dos tipos de ratones. Se realizó la comparación de la severidad de la artritis en base a la puntuación de la artritis de acuerdo a la siguiente hinchazón normal y de muñeca en el día 10 después de la dosificación. Los resultados se muestran en las Figuras 4 y 5. Como se muestra evidentemente en la Figura 4, el ratón normal dosificado con el cóctel de anticuerpo artritogénico/lipopolisacárido (referido posteriormente como "LPS") tiene un incremento de la puntuación de artritis en el día 4 y posteriormente, hasta el día 10, la puntuación máxima alcanzada (12 ó mas) . De manera alternativa, la puntuación de artritis del ratón defectuoso del gen OPN se incrementó en el día 5 y posteriormente, pero la puntuación fue sólo 4 o menos en lo máximo. Adicionalmente, cualquiera de los grupos dosificados con la solución salina no tuvo incremento de la puntuación de la artritis. Como se muestra en la Figuras 5, además, la hinchazón de la muñeca es aparentemente débil en el ratón defectuoso del gen OPN, en comparación con el ratón normal, lo que Índica claramente la implicación de la OPN en la artritis.

E emplo 6 Actividad inhibitoria del anticuerpo 2K1 en migración de leucocitos humanos periféricos : Por el siguiente método, se examinó la actividad inhibitoria del anticuerpo 2 1 en la migración de leucocitos humanos periféricos activados con citocina. La Tabla 1 muestra los resultados de la actividad inhibitoria en la migración de neutrófilos, en tanto que la Tabla 2 muestra los resultados de la actividad inhibitoria en la migración de monocitos.

Método Experimental En el proceso de Ficoll, una fracción de monocitos y una fracción de neutrófilos se separaron en la sangre periférica humana normal (P.M. Daftarian et al., (1996); Journal of Immunology, 157, 12-20) . La capa intermedia entre Ficoll y suero se recolectó y se cultivó en un matraz a 37°C durante una hora. La célula unida resultante se usó como el monocito. A la capa de eritrocitos que permanece después de la recolección de la fracción de monocitos se adicionó un volumen de 5 veces dextran al 3 %-PBS para agregar los eritrocitos, seguido por centrifugación a 150 x g y 4°C durante 5 minutos . El eritrocito agregado se precipitó, en tanto que en el sobrenadante resultante, el neutrófilo existió en el estado suspendido. Entonces, la fracción se centrifugó a 500 x g y temperatura ambiente durante 20 minutos, para recuperar el neutrófilo. El monocito y el neutrófilo como se recuperaron de esta manera se cultivaron durante la noche con TNF-oc humano (20 ng/mL) para activación. Entonces, el monocito activado y neutrófilo resultantes se usaron para experimentos de migración. Los experimentos de migración se realizaron, usando una cámara de micro-quimiotaxis de 48 cavidades (fabricada por Neuro Probé Inc,) . Después de que se adicionaron varias concentraciones del anticuerpo 2K1 a la OPN escindida con trombina y luego se dejaron preliminarmente reposar a 37°C durante 15 minutos, las mezclas se adicionaron a la cámara inferior (a una concentración final de OPN humana de 10 µg/mL) . Colocando en la misma, un filtro de policarbonato (tamaño de poro de 5 µt?) , además, se adicionó una suspensión celular de 50 ?? a la cámara superior (2 x 10s células/mL) . Después del cultivo en la presencia de C02 al 5 % a 37°C durante 2 horas, el filtro de policarbonato se removió para descartar las células en la superficie superior del filtro; subsiguientemente, las células que se filtran en la superficie posterior del filtro se tiñen con Diff-Quick (fabricado por Baxter International Inc.). Las células teñidas se contaron a un aumento de x 40. Los resultados se muestran como cuentas promedio de células (células/mm3) + SD en 6 cavidades .

Resultados Experimentales El anticuerpo 2K1 inhibió la migración de monocitos y neutrofilos periféricos humanos activados con TNF-ct hacia la OPN escindida con trombina.

Inhibición de migración de neutrofilos: Tabla 1 ** P<0.01 (ANOVA unidireccional, prueba de Dunnett) Inhibición de migración de monocitos : Tabla 2 ** P<0.01 (ANOVA unidireccional, prueba de Dunnett) Ej emplo 7 Preparación de anticuerpo M5 : El siguiente péptido sintético que corresponde a la secuencia interior (C+V138 a R153) de OPN murina se preparó para el uso en inmunización. Péptido M5: C DVPNGRGDSLAYGLR El péptido se unió a tiroglobulina, para uso subsiguiente para inmunización de conejos de acuerdo a un método general. Se recolector el anti-suero del conejo inmunizado, para preparar el anticuerpo M5, usando una columna empacada con el péptido M5 de la cisteina N-terminal unida a través de enlace de sulfuro a cuentas de tiol-Sefarosa (Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japón) Ej emplo 8 Reactividad de anticuerpo M5 con OPN y productos de digestión con trombina del mismo: La potencia de unión del anticuerpo M5 recuperado en el Ejemplo 7 con OPN y los productos de digestión con trombina de la misma se probaron por el método de transferencia Western. La OPN murina, recombinante de la forma glicosilada como se generó en células CHO se usó como la OPN. El anticuerpo M5 hecho reaccionar con OPN y los productos de digestión con trombina de la misma.

Ejemplo 9 Inhibición de adición celular a OPN vía el anticuerpo M5 : Se examinó por el método descrito en la referencia (S. Kon et al., (2002): J. Cell . Biochem. , 84(2), 420-432) en cuanto a sí o no el anticuerpo M5 puede inhibir la adhesión celular a OPN. Como la OPN, se usó la OPN murina de longitud completa, de la cual se ha removido preliminarmente la porción de GST con la proteasa PreScission (Amersham Pharmacia Biotech, Tokio, Japón) (referida como "mOPN/de- GST" posteriormente) . Como la célula, se usó la célula NIH3T3 murina. Como se muestra en la Figura 6, la célula NIH3T3 se adhiere a mOPN/de-GST de una manera dependiente de la concentración. Como se muestra en la Figura 7, además, la adhesión se inhibió aparentemente por el peptido GRGDSP (100 µg/mL) , de modo que la adhesión depende de RGD. Como se muestra en la Figura 8, el anticuerpo M5 a 200 µg/mL inhibió aparentemente la adhesión celular a OPN.

Ejemplo 10 Actividad inhibitoria del anticuerpo M5 contra migración de monocitos derivados de bazo murino : Se examinó por el siguiente método la actividad inhibitoria del anticuerpo M5 contra la migración de monocitos derivados de bazo murino, activada por citocina. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Método experimental El esplenocito del ratón C57BL/6 se molió con un portaobjetos en una célula individual, que entonces se cultivó en un matraz a 37°C durante una hora. La célula adherente resultante se usó como monocito. El monocito se cultivó durante la noche y se activó con TNF-a humano (20 ng/mL) . El monocito activado resultante se usó en un experimento de migración. El experimento de migración se realizó por el mismo método como para la muestra humana del Ejemplo 6 anterior.

Resultados experimentales El anticuerpo M5 inhibió la migración del monocito activado con TNF- derivado de bazo murino hacia la OPN murina tipo escisión con trombina recuperada de la escisión de la OPN murina de longitud completa (fabricada por Sigma) .

Tabla 3 ** P<0.01 (ANOVA, unidireccional, prueba de Dunnett) E emplo 11 Acción del anticuerpo M5 de la supresión de daño óseo : Por el siguiente método, se examinó la acción del anticuerpo M5 en la supresión del daño óseo en el sistema de cultivo de órgano de calvaría murina. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Método experimental De un ratón recién nacido en el día 1 después del 5 nacimiento se extrajo el hueso craneal; después del ajuste del tamaño, se colocó la mitad del mismo en cada cavidad de una placa de 24 cavidades. A cada cavidad entonces se adicionó hormona paratiroides humana (PTH) (1-34) ajustada con adición de caldo de cultivo D-MEM (con 10 % de suero 10 bovino adicionado) a una concentración final de PTH de 10 nM, para inducir daño óseo. El anticuerpo M5 se adicionó a una concentración final de 200 µ9/?t?1. Después del cultivo a 37°C durante una semana, se valora la cantidad de calcio liberada del hueso en el caldo de cultivo por la Prueba de -¡_5 Calcio E WAKO (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.).

Resultados Experimentales Sin la adición de PTH, el calcio estaba a un valor de 7.02 mg/mL . Con la adición de PTH, sin embargo, el calcio 20 estaba a un valor de 9.11 mg/mL. Por lo tanto, se índico que la liberación del calcio del hueso se promovió. Cuando se adicionó el anticuerpo M5 a una concentración de 200 µg/mL, se verificó que se · inhibió la absorción de hueso por aproximadamente 70 %. 25 Tabla 4 ** P<0.01 (ANOVA, unidireccional, prueba de Dunnett) Ejemplo 12 Efecto de anticuerpo M5 en modelo de artritis por colágeno en ratón: Por el siguiente método, se examinó el efecto del anticuerpo M5 en un modelo de artritis por colágeno en ratón. La Tabla 5 muestra los resultados a cerca de la puntuación de artritis; la Tabla 6 muestra los resultados a cerca del edema de la pata; la Tabla 7 muestra los resultados a cerca del cambio del peso corporal; y la Tabla 8 muestra los resultados a cerca del cambio de la ingestión de alimento.

Método Experimental Para inducción de artritis, se usó un cóctel de anticuerpo artritogénico (bajo la marca comercial de un cóctel para artritis, Arthrogen-CIAMR cóctel mAb artritogénico; fabricado por Iwai Chemical Pharmaceutical Co., Ltd.) que reconoce cuatro epitopes específicos al colágeno. A un ratón se administró de manera intravenosa el cóctel artritogénico ; 3 días más tarde, se administró de manera intraperitoneal LPS (100 g) para producir de este modo artritis. Se observó la artritis en el día 3 después de la dosificación de LPS, que alcanzó un máximo en el día 6. Inmediatamente antes de la dosificación de LPS y 3 días más tarde, el anticuerpo M5 se administró de manera intravenosa a una dosis de 40 µ , 150 µg ó 400 µg. Como el grupo de control, se arregló un grupo dosificado con IgG de conejo (a una dosis de 400 µg) . Adicionalmente, el anticuerpo anti-TNF-a de ratón se administró intravenosamente a una dosis de 200 µg/ra ón inmediatamente antes de la administración de LPS y 3 días más tarde. Como el grupo de control, se arregló un grupo dosificado con IgG de rata (a una dosis de 200 µ9) . Además, se dio oralmente MTX (a una dosis de 3.2 mg/kg) una vez diariamente a cada día de dosificación de LPS y posteriormente. Entonces, se usó MTX disuelto en 5 mi de solución de metil-celulosa al 0.5 %. Para el grupo de control, se agregaron 5 mi de solución de metil-celulosa al 0.5 %. Se realizó la valoración por un grupo de cinco animales, que se refiere a cuatro puntos, específicamente puntuación de artritis, edema de pata, cambio de peso corporal e ingestión de alimento.

Resultados experimentales Como se muestra en las Tablas 5 a 8, el anticuerpo M5 ejerció distintas acciones supresivas en la mejora de la puntuación de artritis, el reemplazo de comienzo de artritis y la mejora del edema de la pata en el modelo de artritis de ratón (efecto terapéutico) . El comienzo de la artritis se suprimió de una manera dependiente de la concentración a un nivel tal que el efecto excedió al efecto del anticuerpo anti-TNF-oc de ratón dosificado (a una dosis de 200 . En contraste, MTX casi no ejerció eficacia farmacéutica. En el grupo normal del modelo, adicionalmente, se observó una disminución distinta de peso corporal por aproximadamente 3 g en 3 días después de la dosificación de LPS; y la tendencia se continuó en el día 3 al día 6, aunque fue más o menos reducida la relación de disminución. En los grupos dosificados con el anticuerpo M5 (150 µg, 400 µg) y el grupo dosificado con el anticuerpo anti-TNF-a de ratón, alternativamente, se observó mejora aparente de disminución de peso corporal. Con relación a la ingestión de alimento, adicionalmente, se observó una rápida disminución del peso corporal para cualquiera de las sustancias farmacéuticas hasta el día 3 después de la dosificación de LPS; en el día 3 al día 6, sin embargo, se mejoró la disminución de los grupos dosificados con el anticuerpo M5 y el grupo dosificado con el anticuerpo anti-TNF-a de ratón. La Tabla 5 muestra el efecto en la puntuación de artritis; la Tabla 6, el efecto supresor de edema de pata; y las Tablas 7 y 8 muestran los efectos del cambio del peso corporal y el cambio de la ingestión de alimento, respectivamente.

Tabla 5 Días Grupo dosificado con Grupo dosificado con IgG de conejo (dosis; anticuerpos M5 (dosis, 400 g/ratón) pg/ratón) 40 150 400 3 1.2±1.1 2.4±1.7 1.0+1.2 0. 0±0.0 4 1.8±1.3 3.4±1.1 1.4+0.5 0. 2+0.4* 5 5.0+1.6 6.0+2.0 3.0+1.2* 1. 8±0.4** 6 5.4+1.3 7.2+1.3 4.6±1.5 3. 0±1.0* **P<0.0, *P<0.05 (prueba de Mann-Whitney no paramétrica) Días Grupo dosificado Grupo dosificado con IgG de rata (dosis anticuerpo anti-TNF-a de g/ratón) ratón (dosis ,- 200 µg/ra n) 3 0.8+0.4 1.0+0.6 4 2.4±0.2 1.0±0.5 5 5.8±0.4 3.2±0.5* 6 6.6+0.4 5.8+0.5 (prueba de Mann-Whitney no paramétrica) Días Grupo de control Grupo dosificado con MTX (dosis; 3.2 mg/kg) 3 1 .0±0.3 0 .8+0.4 4 1 .8±0.6 1 .8+0.7 5 4 .0+0.9 6 .0+0.6 6 5 .2+0.9 6 .0+0.6 Tabla 6 Volumen de edema de pata (mL) Grupo dosificado con IgG de conejo Sitio Grupo normal (dosis; 400 Grupo dosificado con M5 (dosis, pg/ratón) g/ratón) 40 150 400 Pata delantera 0.041+0.003** 0.051+0.004 0.055+0.004 0.041+0.04** 0 038+0.001** Pata trasera 0.117±0.004** 0.138±0.005 0.140+0.010 0.127±O.OOS 0 121±0.009** **?<0.01, *?<0.05 (AMOVA unidireccional, prueba de Dunnett) Volumen de edema de pata (mL) Sitio Grupo normal Grupo de Grupo dosificado con MTX control (dosis; 3.2 mg/kg) Pata delantera 0.041±0.003** 0.044+0.002 0.047±0.003 Pata trasera 0.117+0.004** 0.129+0.005 0.132+0.003 Tabla 7 Cambio de peso corporal (g) Grupo Grupo dosificado con Grupo dosificado con normal IgG de rata (dosis ; anticuerpo anti- NF- 200 g/ratón) de ratón (dosis,- 200 µg/rató ) El día 0 al 0.1 -2.9 -1.7 día 3 postdosificación El día 3 al 0.5 -1.7 -0.1 día 6 postdosificación Cambio de peso corporal (g) Grupo Grupo de control Grupo dosificado con normal MTX (dosis; 3.2 mg/kg) El día 0 al 0.1 -2.9 -1.5 día 3 postdosificación El día 3 al 0.5 -2.7 -1.8 día 6 postdosificación Tabla 8 Cantidad de ingestión de alimento (g/ratón/día) Grupo Grupo dosificado con Grupo dosificado con normal IgG de conejo M5 (dosis, pg/ratón) (dosis; 400 40 150 400 pg/ratón) El día 0 al 2.7 1.0 0.9 1.4 1.1 día 3 postdosificación El día 3 al 2.9 2.4 2.3 2.4 2.8 día 6 pos't- dosificación Cantidad de ingestión de alimento (g/ratón/día) Grupo Grupo dosificado con Grupo dosificado con normal IgG de rata (dosis; anticuerpo anti-TNF- 200 pg/ratón) a de ratón (dosis; 200 µg/ratón) El día 0 al 2.7 1.0 1.3 día 3 postdosificación El día 3 al 2.9 2.5 2.8 día 6 postdosificación Cantidad de ingestión de alimento (g/ratón/día) Grupo Grupo de control Grupo dosificado con normal MTX (dosis,- 3.2 mg/kg) El día 0 al 2.7 0.9 0.8 día 3 postdosificación El día 3 al 2.9 2.4 2.1 día 6 postdosificación Ejemplo 13 Disponibilidad de peptidos de fragmento relacionados a OPN. Los peptidos de fragmento relacionados a OPN en un estado purificado por cromatografía HPLC se compraron de Auspep Inc. Parkiville, Australia. Las secuencias de aminoácidos de los mismos se muestran en (1) a (3) . hOPN5 : CVDTYDGRGDSWYGLRS (C+V153 a S169) (1) hOPN3 : KSKKFRRPDIQYPDATDEC (K170 a E187+C) (2) hOPNl : IPV QADSGSSEEKQC (117 a Q31+C) (3) Ejemplo 14 Preparación de antigenos para inmunización: Los productos de los péptidos de fragmento relacionados a OPN unidos a tiroglobulina se prepararon por el proceso de EMCS (N- (6-maleimidocaproiloxi) -succinimida, como sigue. Para la preparación de estos productos, la relación molar de tiroglobulina, un péptido de fragmento relacionado a OPN y EMCS fue de 1:300:400. 4 mg de cada uno de los péptidos de fragmento relacionados a OPN en el Ejemplo 13 se disolvió en agua destilada de aproximadamente 1 mi . De manera alternativa, 5 mg de tiroglobulina disuelta en 1 mi de amortiguador fosfato 0.01 M, H 7.0 y E CS disuelta a 80 g/ l en dimetilformamida se mezclaron conjuntamente, de forma individual a cantidades que corresponden a los moles, para preparar una solución de complejo de tiroglobulina-EMCS . La solución de complejo se dividió en tres porciones. A cada una de las porciones se adicionó la solución del péptido de fragmento relacionado a OPN a una cantidad que corresponde al mol, para preparar de este modo una solución de un producto reticulado por EMCS del péptido del fragmento relacionado a OPN unido a tiroglobulin . La solución de este producto unido se dializó, usando PBS, para ajustar la concentración del producto a 10 µg/µl. El producto unido del péptido de fragmento relacionado a OPN y la tiroglobulina se usó como un antígeno para inmunización.

Ejemplo 15 Preparación de antígenos para detección: Como proteínas de OPN para detección, se prepararon por el método descrito en el Ejemplo 1 proteínas de fusión entre GST e isoformas humanas de OPN, específicamente GST-OPN-a, GST-OPN-b y GST-OPN-c, y proteínas de fusión entre GST y el fragmento de OPN en el lado del grupo amino (GST-N-mitad) del sitio de escisión con trombina y el fragmento de OPN en el lado del grupo carboxilo (GST-C-mitad) del mismo sitio de escisión con trombina, para el uso en la reactividad anti-suero con OPN.

Ejemplo 16 Inmuno-sensibilización: Se inmunizaron conejos, usando como antigenos para inmunización, los productos unidos de los péptidos de fragmento relacionados a OPN y la tiroglobulina preparada en el Ejemplo 14. Se realizó una inmunización, al estimular 100 µ?, (100 µg) de una solución de producto unido cada semana o cada dos semanas. Los antigenos se mezclaron con el adyuvante completo de Freund para una -primera inmunización y luego se mezclaron con el adyuvante incompleto de Freund para una segunda inmunización y las siguientes inmunizaciones. Después de ocho veces de inmunización, se separó el suero de la sangre recolectada, que entonces se usa como anti-suero.

Ejemplo 17 Reactividad de anti-suero con OPN: Los péptidos de fragmento relacionados a OPN preparados en el Ejemplo 13 se eluyeron con amortiguador de carbonato 0.1 M, pH 9.5 a 10 µg/ml, que entonces se inmovilizaron a 50 µ?/cavidad en una placa de 96 cavidades. Después del enjuague con PBS y el bloqueo por solución de S7 BSA al 0.1 %/PBS/NaN3 al 0.05 %, una dilución en serie de 2 veces de la dilución de 100 veces del anti-suero recuperado en el Ejemplo 16 se colocó a 50 µ? en una cavidad, para reacción a 37°C durante 30 minutos. Después de la terminación de la reacción, la cavidad se enjuagó cuatro veces con Tween 20 al 0.05 %-PBS. Luego, se adicionaron a cada cavidad 50 µ? de cada una de IgG anti-conejo marcada con HRP (fabricada por IBL Co., Ltd.) para reacción a 37°C durante 30 minutos. Después de la terminación de la reacción, se adicionaron a cada cavidad 100 µ? de cada uno de amortiguador de citrato 0.05 M, pH 4.5 que contiene 0.4 mg/ml de ortofenilendiamina (OPD) y peróxido de hidrógeno acuoso al 0.03 %. Entonces, la placa se dejó reposar a oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos para reacción cromogenica. Después de la reacción cromogénica, se adicionaron 100 µ? de ácido sulfúrico 1N a cada cavidad, para terminar la reacción, para la medición de absorbancia a 492 nm. Usando las proteínas de OPN preparadas en el Ejemplo 15, alternativamente, se examinó la reactividad de anti-suero por el método de transferencia Western. En consecuencia, los anti-sueros contra los péptidos de fragmento hOPNl y hOPN5 relacionados a OPN reaccionaron con GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c y GST-N-mitad, pero nunca reaccionaron con GST-C-mitad. De manera alternativa, un anti-suero contra el péptido de fragmento hOPN3 relacionado a OPN reaccionó con GST-OPN-a, GST-OPN-b, GST-OPN-c y GST-C-mitad, pero nunca reaccionó con GST-N-mitad.

Ejemplo 18 Preparación de productos unidos a HRP de los anticuerpos anti-péptidos de fragmento relacionados a OPN. Productos unidos a HRP de los anticuerpos contra los péptidos de fragmento hOPN3 y hOPNl relacionados a OPN se prepararon como sigue. Se digirieron 20 mg de cada anticuerpo anti-péptido de fragmento relacionado a OPN con pepsina, seguido por filtración en gel para purificar el fragmento F(ab')2 del anticuerpo anti-peptido de fragmento relacionado a OPN. Entonces, el fragmento F(ab')2 se redujo al fragmento Fab' , al usar 2 -mercaptoetanol . HRP reaccionó con EMCS a 37°C durante 60 minutos, seguido por filtración en gel para preparar un producto unido HRP-EMCS, que reaccionó adicionalmente con el fragmento Fab' del anticuerpo anti-péptido de fragmento relacionado a OPN a 4°C durante la noche, seguido por filtración en gel para preparar un producto unido a HRP reticulado con EMCS del anticuerpo anti-péptido de fragmento relacionado a OPN.

Ejemplo 19 Construcción de los sistemas de ELISA de intercalación De las combinaciones de una placa de ELISA de intercalación y anticuerpos marcados, se prepararon dos tipos de sistemas específicamente 1-3 y 5-1. De manera especifica, el sistema 1-3 se preparó como sigue. Los 10 µ^/t? de anticuerpo contra el péptido de fragmento hOPNl relacionado a OPN se adicionaron a porciones de 100 µ? a cada placa de ELISA de 96 cavidades. Después de la reacción durante la noche a 4°C, se realizó el bloqueo con solución de BSA/PBS/NaN3. La placa resultante en ese estado se usó como la placa de ELISA de intercalación. El producto unido a HRP del anticuerpo contra el péptido de fragmento hOPN3 relacionado a OPN preparado en el Ejemplo 18 se definió como el anticuerpo marcado. Como se describe anteriormente, una combinación entre la placa de , inmovilización usando el anticuerpo contra hOPNl y el anticuerpo marcado usando el anticuerpo contra hOPN3 se definió como sistema 1-3. De la misma manera, una combinación de una placa de inmovilización usando el anticuerpo contra hOPN5 y un anticuerpo marcado usando el anticuerpo contra hOPNl se construyó como sistema 5-1.

Ejemplo 20 Ensayo de osteopontina en un sujeto de prueba por sistemas de ELISA de intercalación: La proteina de OPN se valoró como sigue: 100 µ? de una solución que contiene una muestra de plasma o una muestra de fluido de cavidad articular de un sujeto de prueba se adicionó a las placas de ELISA de intercalación de 1-3 y 5-1, para reacción a 37°C durante una hora. Después de la reacción, las placas se enjuagaron cuatro veces con Tween 20 al 0.05 %-PBS, seguido por adición de 100 µ? cada uno de los anticuerpos marcados específicos a los sistemas individuales para la reacción a 4°C durante 30 minutos. Después de la reacción, las placas se enjuagaron seis veces con Tween 20 al 0.05 %-PBS, seguido por adición de 100 µ? de una solución de TMB (tetrametilbenzidina) . Entonces, las placas resultantes se dejaron reposar a oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se usó ácido sulfúrico 1N para terminar la reacción, para el ensayo de la absorbancia 450 nm. La tabla 9 muestra los valores de OPN en los fluidos de la cavidad articular de los pacientes (13 casos) con reumatismo como se mide por el método y la Tabla 10 muestra los valores de OPN en los fluidos de la cavidad articular de pacientes (12 casos) con osteoartritis . Adicionalmente, la Tabla 11 muestra los valores de OPN en los plasmas de pacientes con reumatismo (16 casos) ; la Tabla 12 muestra los valores de OPN en los plasmas de pacientes con osteoartritis (7 casos) ; y la Tabla 13 muestra los valores de OPN en los plasmas de sujetos normales (6 casos) .

Como se muestra de forma aparente en estos resultados, la comparación con el sistema 1-3 en términos del valor de OPN en plasmas entre los pacientes con artritis reumatoide, los pacientes con osteoartritis y los sujetos normales no muestra ninguna diferencia significativa. Sin embargo, la comparación con el sistema 5-1 en términos del valor de OPN en plasma entre los pacientes con artritis reumatoide, los pacientes con osteoartritis, y los sujetos normales mostró valores de OPN en plasma significativamente mayores en los pacientes con artritis reumatoide y los pacientes con osteoartritis que el valor de OPN en los sujetos normales. El valor del significado fue alto en los pacientes con artritis reumatoide. Esto indica que la cantidad total de OPN reflejada con el sistema 5-1 es efectiva para la diagnosis de la categoría general de artritis . Alternativamente, los valores de OPN en los fluidos de la cavidad articular de los pacientes con artritis reumatoide y los pacientes con osteoartritis fue mayor que los valores de OPN en los plasmas de los mismos, que indican fuertemente generación de OPN local . Adicionalmente, la comparación con los sistemas 1-3 y 5-1 en términos del valor de OPN del fluido de la cavidad articular entre los pacientes con artritis reumatoide y los pacientes con osteoartritis mostró que el valor de OPN en los pacientes con artritis reumatoide fue significativamente mayor que el valor de OPN en los pacientes con osteoartritis, cuando se usó cualquiera de los sistemas 1-3 y 5-1. Como un nuevo indicador, la relación de los valores de OPN con los sistemas 1-3 y 5-1 se examinó. El indicador se usó para la comparación de la relación de la OPN escindida con trombina. Los valores de OPN en los plasmas y fluidos de cavidad articular de pacientes con artritis reumatoide fue 1 ó menos, y los valores de OPN de los pacientes con osteoartritis fue de 2 ó más, de modo que se observó una diferencia significativa. De esta manera, los valores de OPN con los sistemas 1-3/5-1 se pueden usar para un método de diagnóstico para discriminar pacientes reumatoides de pacientes de osteoartritis en una etapa temprana .

Tabla 9 Sistema 1-3 Sistema 5-1 Sistema 1-3/ Muestra (ng/ml) (ng/ml) sistema 5-1 RAI 8498 2932 2.898 RA2 22715 26223 0.866 RA3 2659 1905 1.396 RA4 20186 94430 0.214 RA5 1520 2002 0.759 RA6 5870 2238 2.623 RA7 7303 56753 0.129 RA8 2200 6268 0.351 RA9 18344 59873 0.306 RA10 2133 2002 1.065 RA11 26804 33036 0.811 RA12 18868 32824 0.575 RAI3 3633 6067 0.599 Medio 10825.6 25119.5 0.969 Tabla 10 Sistema 1-3 Sistema 5-1 Sistema 1-3/ Muestra (ng/ml) (ng/ml) sistema 5-1 OA1 1520 3471 0.438 OA2 9957 14374 0.693 OA3 6595 2932 2.249 OA4 3523 237 1 .865 OA5 8619 28483 0.303 OA6 1926 896 2.150 OA7 653 850 0.768 OA8 6490 7814 0.831 OA9 4750 1987 2.391 OA10 6830 2932 2.329 OA11 386 181 2.133 OA12 1621 356 4.553 Medio 4405.8 5376.1 2.808 Tabla 11 Sistema 1-3 Sistema 5-1 Sistema 1- 3/ Muestra (ng/ml) (ng/ml) sistema 5 -1 RAI 1621 1379 1 175 RA2 532 845 0 .630 RA3 132 617 0 .214 RA4 142 1758 0 081 RA5 624 2089 0 299 RA6 341 ' 1990 0 171 RA7 152. 845 0 180 RA8 671 224 2 996 RA9 543 557 0 975 RA10 947 431 2 197 RAll 935 1794 0 521 RAI2 1008 1650 0 611 RAI3 636 678 0 938 RA14 464 545 0 851 RAI5 683 488 1 400 RAI6 1057 597 1 771 Medio 6555 1030.4 0 938 Tabla 12 Tabla 13 Sistema 1-3 Sistema 5-1 Sistema 1-3/ Muestra (ng/ml) (ng/ml) sistema 5-1 Normal 1 475 199 2 387 Normal 2 578 249 2 .321 Normal 3 802 232 3 457 Normal 4 983 384 2 560 Normal 5 520 284 1 831 Normal 6 624 215 2 902 Medio 663.7 260.5 2 576

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo anti-osteopontina que puede inhibir la unión entre una integrina que reconoce el sitio de la secuencia de aminoácidos RGD y la osteopontina o un fragmento de la misma, y que también inhibe la unión entre una integrina que reconoce el sitio de la secuencia de aminoácidos SWYGLR o una secuencia equivalente, correspondiente y la osteopontina o un fragmento de la misma.
2. Un anticuerpo anti-osteopontina que puede inhibir la unión entre una integrina que reconoce el sitio de la secuencia de aminoácidos RGD y la osteopontina o un fragmento de la misma, y que también puede inhibir la unión entre una integrina 9ß1 y la osteopontina o un fragmento de la misma.
3. Un anticuerpo anti-osteopontina que puede inhibir la unión entre una integrina que reconoce el sitio de la secuencia de aminoácidos RGD y la osteopontina o un fragmento de la misma, y que también puede inhibir la unión entre la integrina a.4 y la osteopontina o un fragmento de la misma .
4. Un anticuerpo anti-osteopontina que puede inhibir la unión entre una integrina que reconoce el sitio de la secuencia de aminoácidos RGD y la osteopontina o un fragmento de la misma, y que también puede inhibir la unión entre la integrina a9ß? y la osteopontina o un fragmento de la misma, y la unión entre una integrina a4 y la osteopontina o un fragmento de la misma.
5. El anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el fragmento es un fragmento N-terminal de osteopontina.
6. El anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el anticuerpo se formula contra un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos parcial RGDSWYGLR como el antígeno .
7. El anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo se formula contra un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos parcial RGDSWYGLRS como el antígeno .
8. El anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo se formula contra el péptido VDTYDGRGDSWYGLRS como su antígeno.
9. El anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo se formula contra un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos parcial RGDSLAYGLR como su antígeno.
10. El anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo se formula contra un péptido CVDVPNGRGDSLAYGLR como su antígeno.
11. El anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
12. El anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
13. El anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo es un anticuerpo tipo humano.
14. Un agente terapéutico para tratar enfermedades- auto-inmunitarias, que comprende la contención de un anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 como un ingrediente activo.
15. Un agente terapéutico para tratar reumatismo, que comprende la contención de un anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 como un ingrediente activo.
16. Un agente terapéutico para tratar artritis reumatoide, que comprende la contención de un anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 como un ingrediente activo.
17. Un agente terapéutico para tratar osteoartritis reumatoide, que comprende la contención de un anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 como un ingrediente activo.
18. Un agente terapéutico para tratar enfermedades auto-inmunitarias , que comprende administrar un anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 a un paciente con enfermedades auto-inmunitarias .
19. Un método para tratar reumatismo, que comprende administrar un anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 , a un paciente con reumatismo .
20. Un método para tratar artritis reumatoide, que comprende administrar un anticuerpo anti-osteopontin según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 a un paciente con artritis reumatoide.
21. Un método para tratar osteoartritis, que comprende administrar un anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 a un paciente con osteoartritis .
22. Un método para detectar un agente terapéutico de enfermedades auto-inmunitarias, que comprende evaluar un compuesto de prueba en cuanto al grado inhibitorio de la unión entre el sitio de secuencia de GD y osteopontina e integrina y/o la unión entre el sitio de secuencia de SWYGLR e integrina.
23. Un método para detectar un agente terapéutico de reumatismo, que comprende evaluar un compuesto de prueba en cuanto al grado inhibitorio de la unión entre el sitio de secuencia de RGD de osteopontina e integrina y/o la unión entre el sitio de secuencia de SWYGLR y la integrina.
24. Un método para detectar un agente terapéutico de artritis reumatoide, que comprende evaluar un compuesto de prueba en cuanto al grado inhibitorio de la unión entre el sitio de secuencia de RGD de osteopontina e integrina y/o el sitio de secuencia de SWYGLR e integrina.
25. Un método para detectar un agente terapéutico de osteoartritis , que comprende evaluar un compuesto de prueba en cuanto al grado inhibitorio de la unión entre el sitio de secuencia de RGD de osteopontina e integrina y/o el sitio de secuencia de SWYGLR e integrina.
26. Un anticuerpo contra una isoforma de OPN, que se prepara al permitir que un fragmento peptídico que corresponde a la isoforma de OPN se una a un compuesto de biopolímero, inmunizar un animal con el producto unido resultante y recolectar un anticuerpo del animal .
27. Un anticuerpo contra una isoforma de OPN según la reivindicación 26, en donde el fragmento peptídico -que corresponde a la isoforma de OPN es el péptido representado por las siguientes fórmulas (1) , (2) ó (3) : CVDTYDGRGDSWYGLRS ( 1 ) KSK FRRPDIQYPDATDEC (2) IPVKQADSGSSEEKQC (3) .
28. Un método de diagnostico para discriminar anormalidades inflamatorias entre artritis reumatoide y osteoartritis , que comprende detectar un fragmento N-terminal de OPN y un equipo de detección para el mismo.
29. Un método para discriminar anormalidades inflamatorias según la reivindicación 28, en donde el método incluye el uso de fluido o plasma de cavidad articular, y un equipo de detección para lo mismo.
30. Un equipo de detección de anormalidades inflamatorias, que comprende combinar el primer reactivo de inmunodetección utilizando un conjunto de dos de los tres tipos de anticuerpos contra una isoforma de OPN según la reivindicación 27 con el segundo reactivo de inmunodetección que utiliza otro conjunto de dos de los tres tipos de anticuerpos .
31. Un equipo de detección de anormalidades inflamatorias según la reivindicación 29, en donde los dos tipos de anticuerpos para el uso en el primer reactivo de inmunodetección son anticuerpos contra los péptidos representados individualmente por las siguientes fórmulas (3) y (2) : IPVKQADSGSSEE QC (3) KSKKFRRPDIQYPDATDEC (2) ; Y los dos tipos de anticuerpos para el uso en el segundo reactivo de inmunodetección son anticuerpos contra los péptidos representados individualmente por las siguientes fórmulas (1) y (3) ; CVDTYDGRGDSWYGLRS (1) IPVKQADSGSSEEKQC (3) .
32. El uso del anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la elaboración de un medicamento para tratar enfermedades auto-inmunitarias .
33. El uso del anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la elaboración de un medicamento para tratar reumatismo.
34. El uso del anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la elaboración de un -medicamento para tratar artritis reumatoide .
35. El uso del anticuerpo anti-osteopontina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la elaboración de un medicamento para tratar osteoartritis.