JP2012526983A - オステオポンチン抑制剤のスクリーニング方法及びそれによる抑制剤 - Google Patents

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Abstract

オステオポンチンを抑制する物質を探索して見つかった化合物を提供すること。
本発明によって探索されたオステオポンチンを抑制する物質は、優れた骨粗鬆症などの抑制物質として有効性を高めることができる。

Description

本発明は、オステオポンチン抑制剤のスクリーニング方法及びその方法によって得られた抑制剤に関する。
オステオポンチンは、破骨細胞及び骨芽細胞から生成され、骨の代謝に重要な役割を果たしていることが知られている。ネズミにとって、正常な骨の発生には必要でないが、骨の再形成に関与しており、場合によっては、感染と負傷に対する防御メカニズムとして作用したりもする。また、癌細胞の成長や転移を促進する活性を持っているという研究結果も報告されている。オステオポンチンを除去したネズミから、骨密度の減少や骨組職の脆弱化が少なく（Ｈｉｒｏｙｕｋｉ Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａ１．，１９９９，ＰＮＡＳ．，９６：８１５６−８１６０）、リウマチ性関節炎の症状があったネズミからも、オステオポンチンが正常作用している間は症状が次第に悪化し、関節が腫れて軟骨が破壊された。これに対し、オステオポンチンを抑制した際は、関節炎の症状が進行することなく、軟骨も破壊されなかった（Ｋｅｎｊｉ Ｙｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００２ＰＮＡＳ．，９９：４５５６−４５６１）。このような結果から、オステオポンチンの活性を抑制する物質は、骨粗鬆症、リウマチ関節炎及び歯周疾患の予防及び治療に使用できることが考えられる。
オステオポンチンは、糖蛋白質で、４４キロダルトンの質量を有し、セリンとスレオニンにリン酸化されて酸性を呈する。これは、カルシウム結合モチーフを有していて、多くのカルシウムと結合可能な能力があることを特徴とする（Ｇｉａｃｈｅｌｌｉ，Ｃ．Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ３：８８−９５）。骨基質にあるオステオポンチンは、基質結合によって破骨細胞が骨に付着することを促す（Ｒｏｓｓ，Ｆ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６８：９９０１−９９０７）。破骨細胞内にある水溶性オステオポンチンは、カルシウムレベルを調節し、走化性物質として作用し、内皮細胞の死滅を抑制する（Ｋｈａｎ ＳＡ．，ｅｔ ａｌ．，２００２Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ８５：７２８−７３６）。
オステオポンチンは、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）を含むドメインを有していて、細胞表面のインテグリン（αｖβ３、αｖβ１、αｖβ５）と相互作用して細胞の付着に関与し、（ＳＶＶＹＧＬＲ）配列は、インテグリン（α９β１、α４β１）と相互作用してトロンビンによる切断にさらされる。そして、多様なＣＤ４４変形体も、オステオポンチンの受容体として知られている （Ｇｉａｃｈｅｌｌｉ Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２０００Ｍａｔｒｉｘ ｂｉｏｌｏｇｙ１９：６１５−６２２）。
破骨細胞表面の主なインテグリンであるαｖβ３は、通常、小腸や血管筋肉細胞などで低水準で発現されるが、骨、炎症部位、胎盤、浸潤された腫瘍では高水準で発現され、破骨細胞の骨再吸収とマクロファージの活性化、血管新生などに作用する。特に、オステオポンチンは、破骨細胞による骨の再吸収を高める上でインテグリンαｖβ３リガンドとして作用し、破骨細胞の移動を促進し、初期の付着に関与する（Ｉｃｈｉｒｏ Ｎａｋａｍｕｒａ．，ｅｔ ａｌ．，２００７Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｍｅｔａｂ２５：３３７−３４４）。細胞の付着において、オステオポンチンとインテグリンαｖβ３の結合には、オステオポンチンのＲＧＤ配列を媒介とすることが知られており、また、Ｃａ、Ｍｎ、Ｍｇなどのミネラルが重要な役割を果たしていることが知られている（Ｄａｎａ Ｄ．Ｈｕ．，ｅｔ ａｌ．，１９９５ＪＢＣ２８：９９１７−９９２５）。
破骨細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から分化する（Ｂｏｙｌｅ ＷＪ．，ｅｔ ａｌ．，２００３Ｎａｔｕｒｅ４２３：３３７−４２）。破骨細胞の分化でオステオポンチンの発現が抑制されたネズミから破骨細胞は正常に生成されたが、オステオポンチンの発現を低減したヒトの破骨細胞の分化では、ＲＡＮＫＬによる破骨細胞化の初期分化で破骨細胞に分化することを抑制する結果となり、ヒトにおけるオステオポンチンは、破骨細胞に分化するのに重要な要素として提起されている（Ｃａｔｈｙ Ｊ．Ａｉｔｋｅｎ．，ｅｔ ａｌ．，２００４Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ９３：８９６−９０３）。
本発明は、上記の必要性によってなされたものであって、本発明の目的は、オステオポンチン抑制剤をスクリーニングする方法を提供することである。
本発明の他の目的は、オステオポンチン抑制剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、オステオポンチン抑制剤の疾病の治療への用途を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明は、ａ）ライブラリ化合物ファイル全体に対して分子ドッキングシミュレーションを行い、蛋白質チップスクリーニングのための出発物質を探索するステップと、ｂ）前記探索された出発物質をオステオポンチンと蛍光物質標識されたオステオポンチンと混合し、混合物を製造するステップと、ｃ）前記混合物を蛋白質チップに固定されたインテグリンαｖβ３受容体上に添加するステップと、ｄ）前記結合程度を分析するステップとを含むオステオポンチン抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明の前記スクリーニング方法を、「統合新薬スクリーニング基盤（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ；ＩＤＤＰ）技術」と名付ける。
前記統合新薬スクリーニング基盤技術は、（株）イノファーマスクリーン社の独創的な新薬開発システムであり、構造基盤スクリーニング（インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ））、蛋白質チップ基盤スクリーニング（ＨＴＳ）及び／又は細胞基盤アッセイ（インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ））を統合的に利用することにより、ターゲットの発見からリード物質の最適化まで、最も短時間内に、最低限の費用で最も効果的な薬物候補物質を見つけることが可能な新薬開発の標準プラットフォームであり、伝統的な新薬発見システムとは確実に異なるＩＴ／ＢＴ／ＮＴの統合的な新薬発見システムであり、かつて３年以上かかっていたターゲットの分析からリード物質の最適化までの過程を、少なくとも３ヶ月から１年以下に画期的に短縮することができ、キナーゼ、ＧＰＣＲ、プロテアーゼ、ホスファターゼなどの主なターゲットに対するアッセイがセットアップされており、薬理効果を検証するためのターゲット別のアッセイが用意されており、ヒットされたリード物質のＩＣ５０が１μＭ以下と感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が担保され、統合的な新薬発見の各段階を経て、検索された物質の多様なデータが提供され、前臨床及び臨床段階に移るのに非常に効率的であり、構造基盤のスクリーニングから濾過された物質が再度チップ基盤のハイスループットスクリーニング（Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を経ることから、インビトロ上でも検証され、ヒットされた少数の物質は、再度構造基盤の分子シミュルレーションによってその相互作用を正確に調べることができ、また、インシリコとインビトロの同時スクリーニングを行うことにより、新薬の開発にかかる費用を画期的に低減できるという効果がある。
本発明の一具体例において、前記ドッキング計算のための検索アルゴリズムは、アルファトライアングル方法を用いることが好ましいが、これに限定されない。
本発明の一具体例において、前記蛍光物質は、Ｃｙ３（グリーン）、Ｃｙ５（レッド）、ＦＩＴＣ（グリーン）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、ボディピ（ＢＯＤＩＰＹ）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、及びＱ−ドット（ｄｏｔ）からなる群より選択された１種以上の蛍光物質であることが好ましく、前記蛍光物質は、Ｃｙ５であることがさらに好ましいが、これに限定されない。
本発明は、下記の化学式１ないし３からなる群より選択された１種以上の化合物、その誘導体又はその塩を含むオステオポンチン抑制剤を提供する。
また、本発明は、上記化学式１ないし３からなる群より選択された１種以上の化合物、その誘導体又はその塩を有効成分として含む骨粗鬆症、関節炎又は歯周疾患の治療又は予防用組成物を提供する。
本発明における「誘導体」とは、ある化合物の一部を化学的に変化させて得られる類似の化合物を意味するものであり、例えば、化合物中の水素原子又は特定の原子団が他の原子又は原子団によって置換された化合物をいう。
本発明の化合物は、オステオポンチン抑制剤であり、本発明の化合物は、オステオポンチンの活性を抑制するのに使用することができる。
したがって、本発明は、化学式１ないし３の化合物のうちの１種の化合物、その誘導体及び／又はその塩のみならず、当該化合物又はその塩を含む薬剤学的製剤をオステオポンチンの抑制が有用な疾病の治療のために使用することができる。
このような疾病としては、例えば、関節炎及びリウマチ関節炎を含む関節の炎症のみならず、リウマチ脊椎炎及び骨関節炎のようなその他の関節疾患が含まれる。追加の適用の可能性は、骨粗鬆症、歯周疾患などの治療である。
薬物製造の場合、有効量の本発明の化合物又はその塩のほか、通常の助剤、担体及び添加剤を使用する。
活性成分の投与量は、投与される方式、患者の年齢、体重、治療される疾患の性質と重症度及び類似の要因によって異なり得る。
１日の投与量は、１日１回投与される単一の投与量で投与するか、１日２回以上の投与量で投与することができ、通常、０．００１〜１００ｍｇである。
経口、非経口、静脈内、経皮、局所、吸入及び鼻腔内製剤が、好ましい投与形態である。
製剤の通常の薬剤学的形態、例えば、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、分散性散剤、粒剤、水性液剤、水性又は油性懸濁剤、シロップ剤、溶剤又は点滴剤を使用することができる。
固体形態の薬物は、不活性成分及び担体、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、澱粉、マンニトール、アルギネート、ゼラチン、グアーガム、マグネシウム又はアルミニウムステアレート、メチルセルロース、滑石、高分散シリカ、シリコーンオイル、高分子量脂肪酸（例：ステアリン酸）、ゼラチン、寒天（ａｇａｒ ａｇａｒ）、植物性又は動物性脂肪と、オイル及び固形高分子量重合体（例：ポリエチレングリコール）を含むことができ、経口投与に適した製剤は、任意に追加の風味剤及び／又は甘味剤を含むことができる。
液体形態の薬物は、滅菌させるかあるいは滅菌可能であるか、任意に滲透圧の調節、又は緩衝目的の防腐剤、安定化剤、湿潤剤、透過剤、乳化剤、拡散剤、可溶化剤、塩、糖又は糖アルコール、及び／又は粘度調節剤のような助剤を含むことができる。
このような添加剤の例としては、酒石酸及びクエン酸緩衝液、エタノール、錯化剤（例：エチレンジアミンテトラ酢酸及びその非毒性塩）がある。粘度調節のために、液状ポリエチレンオキシド、微晶質セルロース（例：カルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、デキストラン又はゼラチンのような高分子量重合体が考えられる。固体担体物質としては、例えば、澱粉、ラクトース、マンニトール、メチルセルロース、滑石、高分散シリカ、高分子量脂肪酸（例：ステアリン酸）、ゼラチン、寒天、リン酸カルシウム、マグネシウムステアレート、動物性及び植物性脂肪、及び固形高分子量重合体（例：ポリエチレングリコール）がある。
非経口又は局所用油性懸濁剤は、植物性、合成又は半合成オイル、例えば、各々の場合に、１個〜６個の炭素原子を有する１価又は３価のアルコール（例：メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール又はその異性体、グリコール又はグリセロール）でエステル化された脂肪酸（例：パルミチン酸、ラウリン酸、トリデシル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ミリスチン酸、ベヘン酸、ペンタデシル酸、リノール酸、エライジン酸、ブラシジン酸、エルカ酸又はオレイン酸）鎖中、８個〜２２個の炭素原子を有する液状脂肪エステルを含むことができる。このような脂肪エステルとしては、例えば、市販中のミグリオール、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、イソプロピルステアレート、飽和脂肪アルコールのＰＥＧ６−カプリン酸、カプリル酸／カプリン酸エステル、ポリオキシエチレングリセロールトリオレエート、エチルオレエート、ワックス状脂肪エステル（例：合成のあひる臀部腺脂肪ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｕｃｋ ｒｕｍｐ ｇｌａｎｄ ｆａｔ）、ココナッツ油脂肪酸のイソプロピルエステル、オレイルオレエート、デシルオレエート、エチルラクテート、ジブチルフタレート、ジイソプロピルアジペート、ポリオールの脂肪酸エステルなどがある。同様に、異なる粘度のシリコーンオイル又は脂肪アルコール（例：イソトリデシルアルコール、２−オクチルドデカノール、セチルステアリルアルコール又はオレイルアルコール）、脂肪酸（例：オレイン酸）が好適である。また、ヒマシ油、アーモンド油、オリーブ油、胡麻油、綿実油、ピーナッツ油又は大豆油のような植物性オイルを使用することができる。
溶媒としては、ゲル形成剤及び可溶化剤、水又は水と混和性の溶媒が考えられる。例えば、エタノール又はイソプロパノール、ベンジルアルコール、２−オクチルドデカノール、ポリエチレングリコール、フタレート、アジペート、プロピレングリコール、グリセリン、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、ワックス、メチルセロソルブ、セロソルブ、エステル、モルホリン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、シクロヘキサノンなどのようなアルコールが考えられる。
フィルム形成剤としては、水のみならず、有機溶媒（例：ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース又は可溶性澱粉）中に溶解又は膨潤可能なセルロースエーテルを使用することができる。
ゲル形成剤とフィルム形成剤との混合形態も可能である。なかでも、本願では、イオン性巨大分子が使用できるが、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びその塩、ナトリウムアミロペクチンセミグリコレート、アルギン酸又はナトリウム塩としてのプロピレングリコールアルギネート、アラビアゴム、キサンタンゴム、グアーガム又はカラギーナンゴムを使用することができる。
追加の剤形助剤としては、グリセリン、異なる粘度のパラフィン、トリエタノールアミン、コラーゲン、アラントインを使用することができる。ナトリウムラウリルスルフェート、脂肪アルコールエーテルスルフェート、二ナトリウムＮ−ラウリル−β−イミノジプロピオネート、ポリエトキシ化ヒマシ油又はソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート（例：ツイン）、セチルアルコール、レシチン、グリセリンモノステアレート、ポリオキシエチレンステアレート、アルキルフェノールポリグリコールエーテル、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、又はモノアルキル又はジアルキルポリグリコールエーテルオルトリン酸モノエタノールアミン塩のような界面活性剤、乳化剤又は湿潤剤を使用する。目的とする剤形を製造するために、乳液安定化用安定化剤（例：モンモリロナイト又はコロイド性シリカ）、抗酸化剤のような活性物質の分解防止用安定化剤（例：トコフェロール又はブチルヒドロキシアニソール）、又は防腐剤（例：ｐ−ヒドロキシベンゾエートエステル）がさらに使用可能である。
非経口投与用製剤は、アンプル又はバイアルのような個別の投与単位で存在してもよい。好ましくは、活性成分の溶液、特に、水溶液及びなかでも等張性溶液を使用するが、懸濁液も使用する。このような注射形態は、完成した製剤として使用することができ、又は凍結乾燥物のような活性化合物を、任意に他の固体担体物質、目的とする溶媒又は懸濁剤と混合して使用直前に製造することができる。
鼻腔内製剤は、水性又は油性溶液や、水性又は油性懸濁液として存在してもよい。これらは、使用前に好適な溶媒又は懸濁剤で製造する凍結乾燥物として存在してもよい。
製剤を製造して容器内に充填させて密封する工程は、通常の抗菌及び無菌の条件下で行う。
本発明の化合物は、当業界にとって周知の通常の製造方法によって製造可能である。
本発明の一具体例において、本発明の前述した化合物は、ロシアのＩｎｔｅｒＢｉｏＳｃｒｅｅｎ（ＩＢＭ）社（ｗｗｗ．ｉｂｓｃｒｅｅｎ．ｃｏｍ）で販売する Ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ（４０，０００種）でスクリーニングした物質で、前記ロシアのＩｎｔｅｒＢｉｏＳｃｒｅｅｎ（ＩＢＭ）社から入手した。
以下、本発明を説明する。
オステオポンチンは、骨基質に豊富な糖蛋白質で、破骨細胞の分化及び付着移動に関与しており、破骨細胞は、骨粗鬆症、リウマチ関節炎及び歯周疾患など、骨に係る疾病の原因となっている。オステオポンチンの活性を抑制する物質は、前記骨に係る疾患の治療剤及び医薬品の原料として開発できる。オステオポンチン抑制剤をスクリーニングするために、数万個の化合物を迅速かつ容易にスクリーニングする方法が求められている。仮想探索法と蛋白質チップを用いて探索された物質は、オステオポンチン抑制剤として開発できた。
本発明のスクリーニング方法とこれによるオステオポンチンの活性を抑制する物質は、破骨細胞の分化及び移動を抑制することで骨に係る疾患の治療剤及び医薬品の原料として開発できた。
オステオポンチン抑制剤の仮想スクリーニング方法及び表１は、仮想スクリーニングの結果、結合力が最も高い１００個の化合物の結合エネルギー値を示す。 オステオポンチンとインテグリンαｖβ３の相互作用による結合の濃度別の実験結果とそのグラフを示す。 天然物由来の化合物ライブラリからオステオポンチンとインテグリンαｖβ３の相互作用による結合実験を行った代表的な結果とその仮想イメージを示す。 オステオポンチンとインテグリンαｖβ３との結合における競争的阻害剤で、濃度依存的な実験結果と抑制濃度（ＩＣ５０；ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ抑制濃度）を示す。 オステオポンチンを抑制する物質の化学的構造とその名称を示す。 探索したオステオポンチンを抑制物質の生物学的効能分析によって破骨細胞の分化抑制能を分析した結果を示す。 インビボ頭蓋冠（Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｃａｌｖａｒｉａ）の動物モデルを用いた骨破壊の抑制効果を示す。 図７の結果においてインビボ頭蓋冠の動物モデルの破壊された骨面積を数値化したグラフを示す。
以下、非限定的な実施例によって本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を説明するための目的で記載されたものであって、本発明の範囲は、下記の実施例によって制限されるものと受け止められてはならない。
実施例１：インテグリンとオステオポンチンの結合を妨げる物質の仮想探索
図１の仮想スクリーニングのために用いられたソフトウェアは、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ社のＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）プログラムである。探索方法は、分子ドッキングシミュレーションを採用した。具体的な方法は、次のとおりである。まず、４０，０００個のライブラリ化合物ファイル全体に対して、１回目の分子ドッキングシミュレーションを行った。ドッキング計算のための検索アルゴリズムは、アルファトライアングル（Ａｌｐｈａ Ｔｒｉａｎｇｌｅ）方法を用いて、各リガンド化合物あたり最大５００，０００回の構造変化エネルギー計算を行った。この方法は、分子の３つのポイントを三角形に形状化し、受容体蛋白質のさらに他のトライアングルとマッチングするか否かを判断してドッキングするアルゴリズムを用いる。採点方法は、ＬｏｎｄｏｎｄＧ方法を用いて、１リガンドあたり最大１０個のポーズ（ｐｏｓｅ）を計算した。ＭＯＥで支援する採点方法は、ＬｏｎｄｏｎｄＧ、ＡｆｆｉｎｉｔｙｄＧ、ＡｌｐｈａＨＢの３つがあり、本計算に用いられたＬｏｎｄｏｎｄＧは、下記のとおりである。
ＬｏｎｄｏｎｄＧ関数は、結合による回転／転移エントロピー（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｎｔｒｏｐｙ）の変化、リガンドの結合によるフレキシビリティエネルギー（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｅｎｅｒｇｙ）の減少、水素結合エネルギー、金属イオンライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、脱溶媒和エネルギー（ｄｅｓｏｌａｖｔｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）差などがパラメータとして採用される。
４０，０００個の化合物に対する１回目のドッキングシミュレーションの結果、結合力に優れた５，０００個の化合物を選別して、２回目のドッキングシミュレーションを行った。２回目のドッキングシミュレーションに用いられた方法は、基本的に１回目のドッキングシミュレーションの方法と同様であり、エネルギー最小化方法が追加された。ドッキングされたリガンドポーズに対してエネルギー最小化分子力学計算を行い、結合構造から可能な最も安定したリガンドの構造を探索した。その結果、計算された結合エネルギー値を結合力選別のパラメータとして採用した。５，０００個の化合物に対するドッキングシミュレーション及びエネルギー最小化結果スコアであるＬｏｎｄｏｎｄＧ値が最も高い１００個の化合物を選んで、蛋白質チップスクリーニングのための出発物質として提案した（表１）。
表１は、仮想スクリーニングの結果、結合力が最も高い１００個の化合物の結合エネルギー値を示している。
実施例２：基板にインテグリンαｖβ３受容体の固定化
マイクロアレイヤー（ＣＭ−１０００；Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，韓国、ソウル）でインテグリンαｖβ３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｃａｎａｄａ）をＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐＴＭ（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，韓国、ソウル）の表面上にスポットして、インテグリンαｖβ３受容体マイクロアレイ（インテグリン付着蛋白質チップ）を構成した。１０ｍＭのβ−オクチルチオグルコピラノシド（ｏｃｔｙｌｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び３０％のグリセロール溶液を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に、インテグリンαｖβ３を１００μｇ／ｍｌで希釈してスポットし、４℃で、一晩中反応させた後、結合後残留するインテグリンαｖβ３を、０．５％のツイン−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（０．５％のＰＢＳＴ）で洗浄し、使用までに４℃で保管した。
実施例３：ライブラリからインテグリンαｖβ３−ＯＰＮ相互作用拮抗物質の高速大量探索
３−１）インテグリンαｖβ３とオステオポンチンの相互作用
インテグリンαｖβ３−オステオポンチンの相互作用を調べるために、実施例 ２で製造したインテグリンαｖβ３付着蛋白質チップを、１時間、３％のＢＳＡでブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、前記インテグリンマイクロアレイに、１０μｇ／ｍｌ〜１２ｎｇ／ｍｌ範囲の濃度のＣｙ−５蛍光標識されたオステオポンチンを、１０ｍＭのβ−オクチル−チオ−グルコ−ピラノシド（β−ｏｃｔｙｌ−ｔｈｉｏ−ｇｌｕｃｏ−ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＭｎＣｌ２及び３０％のグリセロール溶液を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に希釈してスポットし、反応させた。特に、インテグリンとオステオポンチンの結合において、カルシウム、マンガン、マグネシウムの役割は重要であるとされている。
図２は、インテグリンαｖβ３−オステオポンチンの相互作用を示す蛍光スキャンイメージとインテグリンαｖβ３−オステオポンチンの相互作用の容量−反応曲線を示すグラフである。具体的には、前記図２は、前記オステオポンチンスポットの相対的蛍光強度とＣｙ−５蛍光標識されたフィブロネクチン濃度のログ間の関係を測定して示したグラフである。
前記図２において、インテグリンαｖβ３は、Ｃｙ５標識されたオステオポンチンと作用しやすいことがわかった。なかでも、約１μｇ／ｍｌ以上でオステオポンチンは飽和反応を示した。これにより、前記インテグリンαｖβ３付着蛋白質チップが、前記インテグリンαｖβ３とオステオポンチンの結合抑制剤探索のために有効かつ適切であることがわかる。
３−２）オステオポンチンとライブラリとの混合溶液の製造
オステオポンチン−インテグリンの結合反応実験のために蛍光物質（Ｃｙ−５；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｕｐｐｓａｌａ Ｓｗｅｄｅｎ）でオステオポンチンを標識した後、実施例１から得られた天然物由来の化合物ライブラリ（５０ｍＭ）とオステオポンチン（１μｇ／ｍＬ）とを混合し、各々の混合溶液を製造した。１０ｍＭのβ−オクチル−チオ−グルコ−ピラノシド（β−ｏｃｔｙｌ−ｔｈｉｏ−ｇｌｕｃｏ−ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＭｎＣｌ２及び３０％のグリセロール溶液を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に希釈して使用した。
３−３）オステオポンチン−インテグリンαｖβ３の結合抑制の超高速大量探索
実施例２で製造されたインテグリンαｖβ３付着蛋白質チップを、１時間、３％のＢＳＡでブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、前記製造した各々のライブラリとオステオポンチンとを含む混合溶液を、３０℃、湿度７０％の条件下で、マイクロアレイヤー（ＣＭ−１０００；Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．，韓国、ソウル）を用いて、チップの表面に固定されたインテグリンαｖβ３受容体上にスポットした後、一時間反応させた。洗浄溶液（０．０％ＰＢＳＴ）で洗浄した後、窒素を用いて乾燥させ、蛍光レーザスキャナを用いて、リガンドの結合程度を相対的蛍光強度で分析することにより、ライブラリの抑制能力を測定した。その結果、多数のライブラリで相対的に顕著に低い蛍光強度を示していることがわかり、前記化合物が、インテグリンαｖβ３−オステオポンチンの結合反応を効果的に抑制していることを証明した（図３）。
図３は、ライブラリのインテグリンαｖβ３とオステオポンチンの相互作用を抑制するか否かを調べるために実験した結果である。
前記実験において、正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の対照群は蛍光物質で標識されたオステオポンチンを使用し、負（ｎｅｇａｔｉｖｅ）の対照群は標識されていないＲＧＤペプチッドを使用した。前記ＲＧＤは、自動化ペプチッド合成装置を用いて合成したもので、Ｐｅｐｔｒｏｎ社（韓国、テジョン）からのものを合成して実験を行った。ＲＧＤ（アミノ酸配列：ＧＲＧＤＳＰ）は、インテグリンαｖβ３とオステオポンチンの結合に作用することが報告されており、そのような抑制の役割を果たすことができる。
図３において、蛍光強度は虹色で表現される。本来は赤色又は青色といった１つの色で結果が出るが、この場合、蛍光強度を識別しにくいことから、機器のソフトウェアがこれを蛍光強度に応じて色を変化させるようにした。
通常、蛍光強度が最も強い場合、白色から赤色、橙色、黄色、緑色、青色の順に、蛍光強度を表現する。図２の結果より、蛍光標識されたオステオポンチンのみを反応させたものは、白色又は赤色でインテグリンαｖβ３とオステオポンチンが結合されていることがわかる。ＲＧＤ（ＧＲＧＤＳＰ）塩基配列を含むペプチッドを使用して実験を行った方の場合、インテグリンαｖβ３とオステオポンチンの相互作用を抑制して、インテグリンαｖβ３にオステオポンチンが結合せず、蛍光が最も低い青色で現れている。
ライブラリの一部がインテグリンαｖβ３とオステオポンチンの相互作用を抑制して、インテグリンαｖβ３にオステオポンチンが結合せず、蛍光が最も低い青色で現れている。したがって、この特定の化合物は、インテグリンαｖβ３とオステオポンチンの結合を強く阻害する物質であることを証明する（図３）。
３−４）オステオポンチン−インテグリンαｖβ３の結合抑制剤の評価
実施例３−３で用いた方法を利用して、実施例３−３で見つかった３つの抑制剤（図５）に対し、濃度別に１００ｍＭから２倍に希釈して１ｍＭまで処理し、１００ｍｇ／ｍｌの濃度に固定されたインテグリンαｖβ３と、１ｍｇ／ｍｌの濃度のＣｙ５で標識されたオステオポンチンの結合を抑制するＩＣ５０値を求めた（図４）。
実施例４：蛋白質チップを用いて探索した物質の生物学的活性の探索
生後５週のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）から採取した骨髓細胞を、４８ウェルプレートに入れ、マクロファージの分化因子であるｈＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）を、３０ｎｇ／ｍｌの濃度で含む文化培地（ａ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏ．，）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）で、３日間、４×１０４細胞／ウェルで、３７℃、９５％（ｖ／ｖ）空気、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で培養して、骨髓細胞から派生したマクロファージを得た。これに、前記３０ｎｇ／ｍｌの濃度のｈＭ−ＣＳＦに加え、破骨細胞の分化因子であるマウスＲＡＮＫＬを大膓菌で発現させて純粋分離精製し、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した後、同様の条件で培養し続け、破骨細胞への細胞分化を誘導した。培養４日後、細胞を、３．７％のホルムアルデヒドで、１５分間、室温に固定させ、蒸留水で２回洗浄した後、Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ（ＴＲＡＰ）ｋｉｔＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）のマニュアルに記載された比率で、アセテート、Ｆａｓｔ Ｇａｒｇｎｅｔ ＧＢＣ塩基、ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸、窒化ナトリウム、タルトレートを混合して作った染色液を、２００μｇ／ウェルに入れ、３７分から２０分間反応させて、分化した破骨細胞を染色した。図６は、前記実験を用いて、オステオポンチン抑制剤であるＩＰＳ−０２００１、ＩＰＳ−０２００２、ＩＰＳ−０２００３を１０ｍＭで処理し、破骨細胞の分化抑制能を分析した。その結果、ＩＰＳ−０２００１とＩＰＳ−０２００２では、優れた破骨細胞の分化抑制効能を観察することができたが、ＩＰＳ−０２００３の場合、抑制能が見られなかった。
実施例４：蛋白質チップを用いて探索した物質の生物学的活性の探索
図６は、マウスの破骨細胞（２×１０４／ウェル）を４８ウェルプレートに加え、Ｍ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）とＲＡＮＫＬ（２００ｎｇ／ｍｌ）を同時に添加した後、オステオポンチン抑制剤であるＣ０１、Ｃ０２、Ｇ１０を１０ｍＭで処理し、破骨細胞の分化抑制能を分析した。その結果、Ｃ０１とＣ０２では、優れた破骨細胞の分化抑制効能を観察することができたが、Ｇ１０の場合、抑制能が見られなかった。
実施例５：マウス頭蓋冠モデル（Ｃａｌｖａｒｉａ）
実際に、マウスから、ＲＡＮＫＬあるいはＬＰＳによって誘導される骨破壊作用の抑制効能を調べるために、生後７週のマウスの頭蓋冠（ｃａｌｖａｒｉａ）に ＬＰＳ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）又はＲＡＮＫＬ（２ｍｇ／ｋｇ）処理して骨破壊を誘導し、これに、薬物を２０ｍｇ／ｋｇの濃度で、４日間、毎日処理した。５日目にマウス頭蓋冠を採取してその断面をＨ＆Ｅ染色して観察し、Ｉｍａｇｅ−ｐｒｏ Ｐｌｕｓ４．５（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）を用いて、骨破壊作用の抑制程度を分析した。
骨細胞を破壊する炎症誘発物質であるリポポリサッカリド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（１０ｍｇ／ｋｇ）をマウスの頭骨に処理して骨粗鬆症を人為的に誘発し、これに、ＩＰＳ−０２００１（１０ｍｇ／ｋｇ）を処理して骨細胞の破壊が復旧される過程の実験により、ＩＰＳ−０２００１がＬＰＳによる骨破壊作用を抑制するインビボ効能を確認した（図７）。

Claims (8)

  1. ａ）ライブラリ化合物ファイル全体に対して分子ドッキングシミュレーションを行い、蛋白質チップスクリーニングのための出発物質を探索するステップと、
    ｂ）前記探索された出発物質をオステオポンチンと蛍光物質標識されたオステオポンチンと混合し、混合物を製造するステップと、
    ｃ）前記混合物を蛋白質チップに固定されたインテグリンαｖβ３受容体上に添加するステップと、
    ｄ）前記結合程度を分析するステップとを含むことを特徴とする、オステオポンチン抑制剤のスクリーニング方法。
  2. 前記ドッキング計算のための検索アルゴリズムが、アルファトライアングル方法を用いたことを特徴とする、請求項１に記載のオステオポンチン抑制剤のスクリーニング方法。
  3. 前記蛍光物質が、Ｃｙ３（グリーン）、Ｃｙ５（レッド）、ＦＩＴＣ（グリーン）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、ボディピ（ＢＯＤＩＰＹ）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、及びＱ−ドット（ｄｏｔ）からなる群より選択された１種以上の蛍光物質であることを特徴とする、請求項１に記載のオステオポンチン抑制剤のスクリーニング方法。
  4. 前記蛍光物質が、Ｃｙ５であることを特徴とする、請求項３に記載のオステオポンチン抑制剤のスクリーニング方法。
  5. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって得られた下記の化学式４及び３からなる群より選択された１種以上の化合物、その誘導体又はその塩を含むことを特徴とするオステオポンチン抑制剤。
    （ただし、上記化学式４において、ＲはＨ又はＣｌである。）
  6. 下記の化学式４及び３からなる群より選択された１種以上の化合物、その誘導体又はその塩を含むことを特徴とするオステオポンチン抑制剤。
    （ただし、上記化学式４において、ＲはＨ又はＣｌである。）
  7. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって得られた下記の化学式４ないし３からなる群より選択された１種以上の化合物、その誘導体又はその塩を有効成分として含むことを特徴とする骨粗鬆症、関節炎又は歯周疾患の治療又は予防用組成物。
    （ただし、上記化学式４において、ＲはＨ又はＣｌである。）
  8. 下記の化学式４ないし３からなる群より選択された１種以上の化合物、その誘導体又はその塩を有効成分として含むことを特徴とする骨粗鬆症、関節炎又は歯周疾患の治療又は予防用組成物。
    （ただし、上記化学式４において、ＲはＨ又はＣｌである。）
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