JPH06506446A - 腫瘍壊死因子媒介疾患の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍壊死因子媒介疾患の治療方法 発明の背景 本発明は一般には疾患を予防し治療する方法、より特徴的には、腫瘍壊死因子媒 介疾患を予防し治療する方法に関するものである。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦｓ）は、単球とマクロファージを含む多くの細胞型によっ て産生されるサイトカインの一種である。少なくとも２種類のＴＮＦｓ、特にＴ ＮＦアルファーとＴＮＦベータ（リンホトキシン）がこれまでに記述されてきた 。

これらの既知のＴＮＦｓは、炎症性の応答を含む多くの異なった標的細胞に重要 な生理的影響を及ぼす−の蛋白質は、線維芽細胞と滑液細胞の両方に潜伏性のコ ラゲナーゼとプロスタグランジンＥ２を分泌させ、また骨細胞に骨髄の再吸収を するように刺激する。これらの蛋白質は好中球に対する内皮細胞の表面接着性を 増加する。それらはまた、内皮細胞に凝血活性を分泌させ血餅を溶かす能力を減 少させる。さらに、それらは酵素リポ蛋白質リパーゼの発現を阻害することによ って脂肪細胞を脂質の貯蔵から変化させる。

ＴＮＦｓは肝細胞に“急性相反応物質−として知られる蛋白質の１種を合成させ 、それらは視床下部に発熱物質として作用する。これらの活性を通して、感染や 傷害のようないろいろな徴候に対する生物体の応答に重要な役割を演じているこ とが分かってきた。　Ｐ、Ｊ、５ｅｌｂｙ　ｅｔｌによる論文、、　Ｌａｎｃｅ ｔ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２７．１９δδ、　ｐｇ、　４８３：Ｆｌ、Ｆ、５ｔａ ｒｎｅｓ、Ｊｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、、　ｖｏ ｌ、δ２゜ｐｇ、　１３２１　ｆ１９δδ）：＾、　０１ｉｆｆ　ｅｔ　ａｌ、 　Ｃｅ１１．　ｖｏｌ、　Ｓｏ、　ｐｇ５５５　Ｆ１９８７１：及びＡ、　Ｗａ ａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｆｅｂｒｕａ−ｒｙ　１４．１９８ ７．　ｐｇ、　３５５．を参照すること。

もしも自然発生的または実験的疾患が５体液中のまたは体内の疾患または徴候の 病巣に近接した組織内のＴＮＦの濃度の上昇に関係があれば、その疾患は”ＴＮ Ｆ媒介疾患°であると考えられる。

多くの場合、このようなＴＮＦ媒介疾患はまた、次の２つの条件によって認めら れる：　（１）疾患に関係した病理所見は、ＴＮＦを実験的に動物に投与するこ とによって模造することができる。：また（２）実験動物モデルに生じた疾患の 病状は、ＴＮＦの作用を阻害する剤による治療で阻止または無くすことができる 。大部分の“ＴＮＦ媒介疾患゛は、少なくとも３つの条件の内の２つに適合し、 多くの−ＴＮＦ媒介疾患”は３つの条件のすべてに適合する。

これらの基準を満足する疾患のリストは次の通りであるが、それらに限定はされ ない： ｌ）　成人呼吸困難症候群 ２）　肺線維症 ３）ＩｓＩＩ節炎 ４）　炎症性腸疾患 ５）　敗血症シ３ツク これらの５つの疾患は、ＴＮＦ−媒介疾患の証拠がある０敗血症ショック、関節 炎、成人呼吸困難症候群の動物モデルはよく知られており、ＴＮＦ−媒介疾患を 治療するＴＮＦ阻害剤の能力を立証するためにここに用いている。

成人呼吸困難症候群ＣＡＲＤＳ）は、呼吸困難、＊呼吸、チアノーゼ、重度血中 酸素減少、肺の伸展性減少、及び肺動脈管の透過性増加の急速な徴候で特徴づけ られる。ＡＲＤＳによる死亡率は５０％以上である。ＡＲＤＳの進行に関係する リスク要因には、外傷、大量輸血、散在住血管内凝固、酸素毒、毒物の吸入と刺 激物、また敗血症への全身性反応、出血性膵臓炎、火傷、及び腹部手術の合併症 が含まれる。プロスタグランジン、リューニトリ１ン、補体、及びフリーの酸素 ラジカルのような各種の媒体が症幀詳の原因として関わってきた：しかしなが仁 特殊な媒体の作用を阻害するように処方された各種の治療はＡＲＤｓの臨床的経 過を改善しなかった。動物実験の結果は、次のようにＴＮＦがＡＲＤＳの媒体で あるという仮設を支持している： １、ラットへのＴＮＦの注入の症状はＡＲＤＳに似ている。ＴＮＦの注入後、肺 の伸展性が減少し、肺の水分含量と細胞質が増加し１斑点状の出血がひどく目立 つようになり、好中球血栓の組織学的所見と拡散肺胞の損傷が見られる。　Ｅ、 　Ｆｅｒｒａｒｉ−Ｂａｌｉｖｉｅｒａ　ｅｔ　ａｌ　、、　Ａｒｃｈ。

辷Ｕ」、、ｖｏｌ、１２４．　ｐｐ、１４００　−　１４０５　ｔ１９ｇ９１： 　に、１．　Ｔｒａ−ｃｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、２３４ ．　ｐｐ、４７０−４７４　（１９８６１゜を参照すること。

２、抗−ＴＮＦ　抗血清でラットを前処理するとＡＲＤＳの動物モデルの誘発が 阻害された。ＡＲＤＳは、肝臓虚血とそれに続く肝臓の再還流によって誘発され た。

再還流後のＴＮＦの増加した循環濃度は、大量の固定した肝臓マクロファージか ら生ずると推定された。綿毛細血管漏出は、ＴＮＦ−阻止能のない血清を与えら れたラットの値に比較して処理ラットの値は減少した。　Ｌ、Ｍ。

Ｃｏ１１ｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｒａｎｓ　１ａｎｔａｔｉｏｎ、　ｖｏｌ 、　４９．　ｐｐ、　２６♂−２７２ｆ１９９０１　を参昭すること。

３．２つの臨床試験で、ＴＮＦ濃度はＡＲＤＳ患者の気管支線の分泌で測定した 。５人のＡＲＤＳ患者の最初の試験で、ＴＮＦ濃度は１２．５ｎｇ／■Ｌ以上で あった。対照サンプルには、ＴＮＦは検出されなかった。２回目の試験で、ＡＲ ＤＳの４人の患宮の内３人の気管支肺胞の洗浄液に有意なＴＮＦ量が測定された が、対照における検出限界以下であった。　＾、Ｂ、　Ｍｉｌｌａｒ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　ｖｏｌ、　２．　ｐｐ、　７１２−７１４　ｆ１９♂ ９１；　Ｄ、Ｊ、　Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｌａｎｃｅｔ、　ｖｏｌ、　２．　ｐｐ、　１０４３−１０４４　ｆ１９８９１ を参照のこと。

肺線維症は、いろいろな肺疾患の末期段階で発生する。線維症は線維芽細胞の成 長と肺胞壁内のコラーゲン蓄積量の増加の結果である。ＴＮＦは、肺線維症の進 行上明らかにキーの役割を果たしている。ＴＮＦは、ピコモル濃度では、正常な 二倍体線維芽細胞の成長因子である、Ｂ、Ｊ、　Ｓｕｇａｒｓａｎ　ｅｔ　ａユ 、５ｃｉｅｎｃｅ、　ｖｏｌ、　２３０．　ｐｐ、　９４３−９４５　（１９♂ ５）参照、肺損傷を含む動物実験の結果は。

癌の化学療法剤であるプレオマイシンによって誘導され、その提案を支える証拠 を与えた。肺線維症のＴＮＦ−媒介は次の事項によって支持される： １．７ＮＦの静脈内注入は、広汎性の肺胞損傷、特に肺胞上皮と内皮細胞の壊死 及び肺胞膿の著しい肥厚を引き起こす、ラットに対するＴＮＦの皮下注入は、繊 維芽細胞の増殖とコラーゲン蓄積の著しい増加をもたらす。

罠、Ｊ、　Ｔｒａｃｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　ｖｏｌ、　２３４ ．　ｐｐ、４７０−４７４（１９８６１：　Ｐ、Ｆ、Ｐｉｇｕｅｔ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｉｎｔ、＾ｒｃｈ、　Ａ１１ｅｒ　、＾ｏ１、　ｌｓ雪ｕｎｏ１．、　ｖ ｏｌ、δ３．　ｐ、　ｌδＮ９８６）参照すること。

２、ウサギの抗−ＴＮＦ抗体のマウスへの投与は、プレオマイシン誘発の肺胞損 傷、繊維芽細胞の成長、及びコラーゲン蓄積を防止した＊　Ｐｉｅｒｒｅ　Ｆ、 　Ｐｉｇｕｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　ｖｏｌ、　１ ７０．　ｐｐ、　６５５−６６３　ｆ１９８９１　を参照すること。

３、ＡＲＤＳの生き残り患者の通常の後遺症は、肺線維症である。急性のＡＲＤ ｓの期間、ＴＮＦは気管支肺胞液中に有意な量で存在する。

１１１　！Ｉｉ衆は、関節の慢性的炎症によって特徴づけられる種々の徴候を述 べるのに用いられる用語である。関節炎という言葉の定義には次のものが含まれ る。リウマチ様関節炎、骨関節症、強直性を椎炎、紅斑性狼癒、淋菌性関節炎、 Ｒｅ１ｔｅｒ’ｓ疾患間節炎及び痛風、リウマチ様関節炎におけるＴＮＦの媒介 的役割に関する証拠は以下のように説明されている。

リウマチ様関節炎は、関節における関節軟骨の破壊に起因する慢性の自己免疫疾 患である。滑液の内膜は慢性的に炎症を起こし、進行性線維症の成長を受けてい る。

Ｉｎ　ｖｉｔｒｏに、ＴＮＦは、内皮細胞と白血球の両方を活性化し、白血球の 粘着性を高め、再吸収を刺激し、軟骨中のプロテオグリカンの合成を阻害する。

　Ｊ、Ｒ，Ｇａ−ａｂｌ＠ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　ｖｏｌ、　８２．ＧＩｌｌ。

８６６７−δ６フ３　（１９８５１；　Ｊ、５ａｋｌａｔｖａｌａ、　Ｎａｔｕ ｒｅ、ｖｏｌ、３２２゜ｐｐ、　５４７−５５２　ｆ１９８６］　を参照するこ と、　これらの　崩ｖｉｔｒｏの活性は、ＴＮＦがリウマチ様関節炎における関 節病理の媒体であり得ることを強力に示唆する。リウマチ様関節炎のＴＮＦ−媒 介は、次のことによって支持される： １、ウサギの関節にＴＮＦを関節内注入すると白血球リカンのロスは生じない、 ＴＮＦとインターロイキン−１（ＩＬ−１）の最大下の投与量の関節内への注入 は、好中球の共同蓄積を引き起こす＊　Ｂ、　Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ 、。

Ｃ１１ｎ、Ｅｘ　、−ユｓｗｕｎｏ１．．　ｖｎｌ、７５．　ｐｐ、３０Ｇ−： １１０　ｆ１９δ９）。

逆に、ウサギを用いた他の実験シリーズでは、ＴＮＦαの単独関節内注入は細胞 浸潤と軟骨プロテオグリカンのロスの両方を引き起こした８物ｗＰ、炎症神経ペ プチドの濃度は滑液中に増加した。　＾Ｓ、　Ｒｕｂｉｎｎ東ｔ　ａｌ、、　Ａ ｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｓ、　ｖｏｌ、　：］３．　ｐ ｐ、　＋０２３−１０２８　（１９９０）を参照すること。

２、滑液細胞ＩＬ−１の産生に右けるＴＮＦ抗体の影響をリウマチ様患者で測定 し、た、リウマチ様関節の溝膜または滑液から抽出した単核細胞の培養により、 外部からの刺激なしに６日間サイトカインを産生ずる。リウマチｍｒａ＋節炎の 患者の場合、培養における滑液細胞Ｉ　Ｔ−−１の産生け、抗−ＴＮＦ抗体によ り有意に減少した。これらの結果は、リウマチ様関節内のＩＬ−１の誘発にＩＮ Ｆが中枢的役割を果たしていることを示唆している。

Ｆ、Ｍ、　Ｂｒｅｎｎａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　ｖｏｌ、　２　 （８［１５７１，ｐｐ、　２４４−２４７　ｆ１９１１９１を参昭すること。

３、ＴＮＦはリウマチにかかった滑液中に検出できる量で存在する。　Ｆ、Ｓ、 口ｉ　Ｇｉｏｖｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｒｈｅｕｍ、　Ｄｉｓ、　 ｖｏｌ、　４７．　ｐｐ、　７６８−７７［ｉ　（１９δδ）を参照のこと。

ｔ！発性の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、２つの症候群；潰瘍性大腸炎とクローン 病を含む、クローン病は、潰瘍性大腸炎が結腸の粘膜または粘膜上組織に限定し て非特異的炎錠反応を起こしている末端回腸または結腸の壁の全面デ厚を含む肉 芽種性の炎症反応によって特徴づけられる。２つの症候群の病状には違いがあり 、また両方の病因にははっきりしない点が残るが、この２つの疾患は、通常の原 因物質に対するいろいろな組織または免疫性の反応であることは間違いない、ｌ ｌ３Ｄの患者には、各種類の免疫性の疾患が同定された。１つの仮定は、だれも が普通さらされる例えばバクテリア産生物のような抗原に対して患者の免疫シス テムが異常にまたは不適当に反応すると言うことである。腸内でのＴＮＦの高濃 度の合成がＩＢＤにおける炎症性細胞浸潤に関与しているのかも知れない、ＩＢ Ｄに関するＴＮＦ−媒介は以下のことから支持される。

ｌ）ラットによる２つの試験で、ＴＮＦの静脈内ポーラス投与によって胃腸管の 壊死が引き起こされた。ＴＮＦの影響は投与量に関係しているように思われる。

０．６−ｇ／ｋｇ以上の投与量では、肉眼及び顕微鏡で小腸の壊死が見られた。

腸は明らかな出血または壊死の範囲を持ち部分的な虚血症状を示していた。盲腸 は特にＴＮＦに敏感なようであった。非壊死腸管の組織構造部分もまた多形核白 血球の粘膜上組織と粘膜節板への浸潤による炎症的変化を示した。上皮は腸の病 巣分布域で露出していたｅ　Ｘ、ｋｌ、　Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ １ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　ｖｏｌ、δ１．９９゜４７０−４７４１１９８６） を参照すること。

２１　Ｔｒａｃｅｙの試験で、ヒトＴＮＦに対する中和マウスモノクローナル抗 体の４ｍｇをＴＮＦの注入１時間前にラットに注入すると、ＴＮＦの致死用量か ら完全に動物を防護したばかりではなくＴＮＦによって引き起こされる典型的な 病変の進行もまた阻止した。

３）クローン病の子供の生検からの分離物は、スボツトのエリザ検定法で分析し たすべての個体でＴＮＦα分泌細胞の頻度の上昇を示した。正常な子供からの分 離物ではこの増加は見られなかった。潰瘍性大腸炎では、８人の子供の内の４人 がＴＮＦａの産生が増加した。これらの結果はＴＮＦａがヒトの腸内の炎症の重 要な媒体であルコとを示唆している。　Ｔ、Ｔ、　ＭａｃＤｏｎａｌｄ、　ｅｔ 　ａｌ、。

Ｃ１１ｎ、　Ｅｘ　、　Ｉｓｍｕｎｏｌ、、　（ＥＮＧＬＡＮＤＩ　ｖｏｌ、　 ８１．　ｐｐ、　３０１−３０５　（１９９０１を参照すること。

敗血症ショックは大量のバクテリアの浸潤に関係している。ショックは少なくと も一部はバクテリアのエンドトキシン（リポポリサッカライド）の存在によりも たらされるグラム陰性薗感染に起因すると普通信じられている６敗血症ショック は病院環境では比較的普通の死亡原因になっている。現在、敗血症ショックで苦 しむ患者に対する治療の選択は少な（、利用できる治療が実際一般に支持される 。

敗血症シダツクは、平均動脈血圧（ＭＡＰ）の低下。

心臓血液搏出量の減少、＊搏、頻呼吸、乳酸血症及び白面法減少症を含むいろい ろな症状によって特徴づけられる。この病気の特定の原因は１分には理解されて いないけれども、ＴＮＦを含む各種類のサイトカインが敗血症ショックの媒体と して関係してきている。

敗血症ショックの媒介にＴＮＦｓが役割を演じていることを示唆するいくつかの 一連の証拠がある：１．７ＮＦの動物への投与は、ショック様の状態を引き起こ すことが示されてきたａ　Ｅｖｅｒｈａｅｒｄｔ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅ＠、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ＠ｓｕｎ、、ｖｏｌ、１６３． 　ｐｇ、３７８＋１９８９１を参照すること、リポポリサッカライドのマウスへ の投与は、動物の敗血症ショックに似ていることが示された。この処置を受けた 動物は循ｆｆ１ＴＮＦアルファの、、　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔ上、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　ｖｏｌ、　７２．　ｐｐ、　３６６６−３６７０　＋１９７ ５１　をＩＩ照すること。

２、ＴＮＦアルファに対する抗体の投与は、マウスやモンキーにおけるエンドト キシンの高用量の致死効果を減少させることが示された＊　Ｔｒａｃｅｙ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ。

ｖｏｌ、　３３０．　ｐｐ−６６２−６６４＋１９８７１：　Ｂｕｅｔｌｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉ−ｅｎｃｅ、　ｖｏｌ、　２２９．　ｐｐ、δ６９−８ ７１１１９８５１を参照のこと。

３、グラム陰性敗血症の子供の何滴中のＴＮＦアルファ濃度の分析追加試験が行 われた。この試験では、検査した患者の９１％にＴＮＦアルファの濃度の上昇が 示された。さらに、ＴＮＦアルファ血清濃度は、生存者よりもＮｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｊ、ｏｆ　Ｍｅｃｌ、ｖｏｌ、３＋９．　ｐｐ、３９７−４００　（１ ９８δ）。

発明者らは、ここに、ＴＮＦｓの活性を妨げる物質が、これまで定義したような ＴＮＦ媒介の疾患の治療に有効な化合物に成りうることを提案するに至った。

本発明の発明者らは、ＴＮＦ媒介疾患を防ぎまた治療する化合物の種類を明らか にし、ＴＮＦ阻害剤としてここに引用した。　１９９０年７月１９日出願で現在 襄為中のＵ、Ｓ。

特許上線連続番号５５５．２７４に、特にここに関連するものが組み込まれ、自 然に発生する蛋白質様のＴＮＦ阻害剤の好ましい種類と５同じ高純度の実質的な 量を製造する方法について記載しである。特に、前述の　里程　には、３０ＫＤ ａＴＮＦ阻害剤と４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤に関する２つのＴＮＦ阻害剤の部分集 合について詳しく述べられている。全長４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤蛋白質に加えて 、２つの切断された、しかし４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤の生物活性形もまた生産さ れた。全長４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は、ヒトＵ９３７細胞で調整された培地また はヒト尿から分離さね、５ＤＳ−ＰＡＧＥで約４０ＫＤａの分子量をもツＴＮＦ １１！ｌ害剤である。全長４［ＩＫＤａＴＮＦｌｌｌ害剤は、自然発生蛋白質の ように糖蛋白質であるかも知れない：または、バクテリア発現系から組換え型で 発現した蛋白質のような非糖蛋白質であるかも知れない、　５１と５３カルボキ シル末端アミノ酸が全長蛋白質から除かれた切断蛋白質は、それぞれ、４０ＫＤ ａＴＮＦ阻害剤Δ５１及び４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３どして引用されている 。

３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦアルファに対して阻害活性を表わすことが示 された。全長４０ＫＤａＴＮＦ阻宵剤、４０ＫＤａＴＮＦ阻書剤Δ５１及び４０ ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３を含む４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦアルファと ＴＮＦベータの両方に対し阻害活性を表わすことが示された。

１９９１年３月１５日出願で現在１−、　Ａ中のＵ、Ｓ、特許　犬瀬連続番号０ ７／６６９Ｊ６２は、特にこの関連のものが組み込まれており、多くの修飾され たＴＮＦ阻害剤の種類が記載されている０選択したアミノ酸残基をシスティン残 基で置換したＴＮＦ阻害剤のムティンも作られている。このようなムティンは機 能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位と側鎖選択的に反応してＴＮＦ阻害 阻害剤ＰＥ金種造するかも知れない、特に、３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤の位置１０ ５のアスパラギンがシスティンと置換して、ＣｌＯ３として引用される３０ＫＤ ａＴＮＦ阻害剤ムテインカ５記載されている。もう一つの具体例として、ムティ ン蛋白質が二重機能性ＰＥＧ単位と反応して、２つのＴＮＦ阻害剤ムティンが単 −ＰＥＧ鎖を通して結合する二価の一ダンベルーを形成することができる。

ＩＬ立Ｊｌ’ 本発明は、必要とされている治療剤を患者に投与することによりＴＮＦ媒介疾患 の予防と治療を行う方法を開示している。特に、発明は、必要な治療剤を患者に 投与することによりＴＮＦ媒介肺血症ショックを治療する方法を提供している。

また、必要な治療剤を患者に投与することによりＴＮＦ媒介関節炎とＴＮＦ媒介 成人呼吸困難症候群を治療する方法を含んでいる。

本発明に従い、ＴＮＦ媒介疾患、特にＴＮＦ媒介敗血症ショック、ＴＮＦ媒介関 節炎及びＴＮＦ媒介成人呼吸困難症候詳を、ＴＮＦ阻害剤の治療的に適当な量に よって治療し予防する方法を開示している。

本発明の好ましいＴＮＦ阻害剤は、自然に発生する蛋白質と自然に発生する蛋白 質の切断型である。自然に発生する蛋白質は、それによって治療される患者に予 期しない副作用が生ずるリスクが比較的低いように思われるので好ましい０本発 明のいくつかの具体例で、はんのわずかのアミノ酸残基が自然の蛋白質配列と異 なるムティンの蛋白質ＴＮＦ阻害剤もまた好ましいＴＮＦ阻害剤である。

ＴＮＦ阻害剤の好ましい種類は、ヒトＴＮＦ結合蛋白質である。好ましいＴＮＦ 阻害剤はＴＮＦ受容体蛋白質の可溶性フラグメントであるように思われる０本発 明の実用面で好ましいこれらのＴＮＦ阻害剤は、３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤と４０ ＫＤａＴＮＦ阻害剤から成る群から選ばれ、そしてまた、当該４０ＫＤａＴＮＦ 阻害剤はさらに、全長４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤、４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５１ 及び４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３ｂ）も成る群から選ばれる、また、例えば、 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または別の反復ポリマーの添加により循環半 減期を増加するように、また／あるいは免疫原性を減少するように改良された蛋 白質が好ましい、ＴＮＦに対し、受容体拮抗薬のように作用するＴＮＦ阻害剤も また本発明の範囲内に含まれる。

ＴＮＦ阻害剤の生産は、ヒトの尿からの分離によるような自然の利用源からの抽 出によって達成できるけれども、ＴＮＦ阻害剤生産の好ましい方法は岨換えＤＮ Ａ技術によるものである１組換えＤＮＡ技術は、高純度でかなり大量に生産する ことができるので部分的に好ましい。さらに好ましいＴＮＦ阻害剤として、３０ ＫＤａＴＮＦ阻害剤の選択したアミノ酸をシスティンで置換した３０ＫＤａＴＮ Ｆ阻害剤のムティンが含まれる。このようなムティンは、ＴＮＦ阻害剤として用 いられ、またポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させて１分子当たり１個 または２個のＴＮＦ阻害剤を含むＴＮＦ阻害阻害剤ＰＥ金化合物ることもできる 。最も好ましい具体例では、ＴＮＦ阻害剤が、ムティンの３０ＫＤａＴＮＦ阻害 剤と二重機能性ＰＥＧ前駆物質間の反応で形成される二価の種類である。好まし いムティンは、３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤の残基１０５がシスティン残基により置 換されるＣ　１０５３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤である。

これまでの一般的な記述もこれからの詳細な記述も共に単に例示的で説明的なも のであり、発明はこれらに限定されるものではないことが理解されるべきである 。

の 図１は、ヒト組換え腫瘍壊死要因アルファ（ｈｒＴ　Ｎ　Ｆα）の３００　ｕ　 ｇ／ｋｇの一定用量を投与したヒト組換えインターロイキン−１ベータ（ｈｒＩ Ｌ−１β）の投与量の函数としての死亡率を描いている。６匹のマウス群に異な った量のｈｒＩＬ−１６を投与した。サイトカイン混合物の静脈注射後７２時間 目に死亡率を測定した。測定値は３回の実験の平均値上平均の梗準偏差（Ｓ、Ｅ 、Ｍ、ｌである。

図２は、３００　ｕ　ｇ／ｋｇのｈｒＴ　Ｎ　Ｆ　ａとｚ、ｓｏｏ　ｕ　ｇ／ｋ ｇのｈ「ＩＬ−１ｆｌを時間ゼロで静脈に注射で投与した後の時間の函数として の表面温度を描いている。

図３は、−・−・−がサイトカイン混合物の静脈内投与３０分前と３０分後に２ 回、４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３を腹膜内に注射したマウスを表わし１図２と 同様の時間の函数としての表面温度を描いている。　投与し、た全　４０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤Δ５３は２００ｍｇ／ｋｇであった。本は、ＴＮＦ阻害剤処理と無 処理のサイトカイン注射マウスの片側を一検定（ｐ　＜　ｏ、ｏｓ）による統計 的に有意な相違を示している。

図４は図３に示した実験を時間の函数としての死亡率で描かれている。

図５は、−因一凶−がサイトカイン混合物の静脈内投与３０分前と、３０分、３ 時間、６時間、９時間及び１２時間後に、６回、４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３ を腹膜内に注射したマウスを表わし０図２と同様の時間の函数としての表面温度 を描いている。投与した全　４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３は６００ｍｇ／ｋｇ であった。傘は、ＴＮＦ阻害剤処理とＰＢＳ注射マウスの片１１１を一検定（ｐ 　＜　、００１１による統計的に有意な相違を示している。

図６は、図５に示した実験について、時間の函数としての死亡率を描いている。

図７は、−・−・−がサイトカイン混合物の静脈内投与３０分前と、３０分、３ 時間、６時間、９時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間及び２４時間 後に、１０回４０Ｋ　Ｄ　ａＴＮＦ阻害剤Δ５３を腹膜内に注射したマウスを表 わし、図２と同様に時間の函数としての表面温度を描いている、投与した全　４ ０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３は１，０００ｗｇ／ｋｇであった。

図８は、図７に示した実験について、時間の函数とじての死亡率を描いている。

図９は１図７に示した実験について、時間の函数としての体重を描いている。

図１Ｏは１図２と同様に時間の函数としての表面温度を描いており、ここでニー ローローがサイトカイン混合物（全部で２４０　ｍｇ／ｋｇ　）の皮下投与３０ 分前と、３０分、３時間、６時間、９時間、１２時間後に、６回、３０ＫＤａＴ ＮＦ阻害剤を腹膜内に注射したマウスを表わし；−Δ−Δ−がサイトカイン混合 物（全部で４０１１　ｍｇ／ｋｇ　）の皮下投与３０分前と、３０分、３時間、 ６時間、９時間、　１２時間。

１５時間、１８時間、２１時間及び２４時間後に、１０回３０ＫＤａＴＮＦ阻害 剤を腹膜内に注射したマウスを表わしニー０−０−がサイトカイン混合物（全部 で６００　ｍｇ／ｋｇ　）の皮下投与３０分前と、３０分、３時間、６時間、９ 時間、１２時間、１５時間、１８時間、　２１時間、２４時間、２７時間、３０ １ｉ９１１１’１、　３３１１１１１１１−３６Ｗｒ閘及Ｕ　３９時ｍ（ｉ　ｌ ：　、　１５１１　、３（ＩＫ　Ｄ　ａ　Ｔ　ＮＦ阻害剤を腹膜内に注射したマ ウスを表わしている。

図１．１は５図１０に示した実験について１時間の函数としての死亡率を描いて いる。

図１２は７図１０に示す実験について、時間の函数としての体重を描いている。

図１３は、以下にのべる例３の方法１に従い、２１日目のストレプトコツカル細 ｍａｔ　ｃｓｃｗ）による活性化後の＋ｍｓの直径の増加を時間の函数として示 している。

図１４は、図１３に示した実験におけるｓｃｗによる活性化後７２時間間隔に右 ける関節の直径の最大変化を示している。　傘は、片ｌ１ｌｔ検定、ｔ　＝　４ ．３６．９（０，０１１１＋；−ヨ’１、　Ｐ　Ｅ　Ｇ　３４００ｔ４ＩＩ！を 群と比較した統計的に有意な相違ヲ示している。

図１５は、以下の例３方法２に従い、ｓｃｗによる活性化後７２時間間隔におけ る関節の直径の最大変化を示している。

図１６ハ、以下）ｌ！ｌＩＩコ述ヘルように、３０ＫＤａＴＮＦ阻キシンに刺激 された好中球の流入の阻害百分率を描いている。

図１７は１図１６に示す実験４こおいて、エンドトキシンの攻撃に応答して肺胞 空間に移動する好中球の数に対する、３０にＤａＴＮＦ阻害剤の５投与量の気管 内点滴注入の効果を描いている９本は、片側を検定、ｐ　＜　０．０１にょる評 価で、無処理の対照ラットとの統計的に有意な相違を示している。

叱ま」−二見１」Ｌ１且ｍ災ｊ この後の例示とともに、発明の詳細な説明１こ役立つ好ましい具体例について詳 細に論及したい。

先に述べたように、本発明は、患者を苦しめているＴＮＦ媒介疾患を防ぎまた治 療する方法に関するものである。この方法は、ＴＮＦ媒介疾患に苦しむ患者に治 療に有効な量のＴＮＦ阻害剤を投与することからなる０本発明の第一の目的は、 ヒトの疾患を防ぎかつ治療する方法を提供することにあるが、ここに開示した内 容は一般の生理学的使用のための指針を与えており、そのため獣医学的使用もま た本発明の範囲内に含まれる。

もしも自然発生的または実験上の疾患が体内の疾患もしくけ徴候の病巣の近辺の 体液または組織内のＴＮＦの濃度の上昇に関係していれば、その疾患または医学 的徴候はＴＮＦ媒介疾患であると考えるべきである。ＴＮＦ媒介疾患はまた、次 の２つの条件によっても認められるだろう：１）疾患に関係する病理所見は、動 物にＴＮＦを投与することによって実験的に構造することができる、また、２） 疾患の動物実験モデルに発生した病状は、ＴＮＦの作用を阻害する荊による治療 で阻害または消失させることができる。多くのＴＮＦ媒介疾患は、これらの３つ の条件の２つを満足させ、その他は３つの条件のすべてを満足さゼるだろう。Ｔ ＮＦ媒介疾患の非限定的リストには、成人呼吸困難症候群、肺線維症、関節炎、 炎症性囁疾磨及び敗血症ショックが含まれる。

１つの具体例で、本発明の好ましいＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦ結合蛋白質として役 立つ自然に生ずる蛋白質である。自然に生ずる蛋白質は、治療される患者に予期 しないまた望ましくない生理的副作用の生ずるリスクをかなり低くするように見 λ、るので部分的には好ましい。

明細書とクレームの目的のためには、もしもそれ、または実質的に等しい蛋白質 が健康なヒトに正常に存在することが見出せるならば、蛋白質は一自然発生−で あると判断される。“自然発生−蛋白質は、特に、健康なヒトに糖蛋白質の形で 存在する蛋白質の、糖がない形と同じようなカルボキシル末端の先端が一部分切 断された。

健康なヒトにその存在が認められている蛋白質の形で含まれる。″自然発生−蛋 白賓は、通常それらを産生ずる細胞からの分離によるとともに、組換えＤＮＡ法 によって得ることができる。“自然発生゛はまた−　Ｅ、Ｃｏ１１における発現 の結果としてＮ−末端メチオニル基を含む蛋白質を包含１−る。

明細書とクレームを通じて用いられる“実質的に同等”は、同じ様な生物活性を 持つとともに、非常に程度の高いアミノ酸残基の相同間係を持つことを意味する よう泰こ定義される（一般には、　Ｍ、　Ｄａｙｈｏｆｆ、　Ａｔｌ　ｓ　ｏｆ 　ｒｏｔ−ｅｉｎ　Ｓｅ　ｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　ｖｏｌ 、　Ｓ、　ｐ、　１２４　ｆ１９７２１゜Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｓｉ ｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ｌｌａｓｈｉｎ−ｇｔｏｎ 、Ｄ、Ｃ，、を参昭すること、ここに特に文献として取り入れである〕 本発明の好ましいＩＮＦ阻害剤の中には、現在係属中のＵＳ特許出願中に記載さ れているＴＮＦの結合蛋白質として二ニーΔｉｖｏに存在する自然発生蛋白質が ある。

この出願は、　Ｂｒｅｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、にョ１）１９９０年７月ｉ、ｍ出 １ｍされたＵ、Ｓ、特許出願連続番号□７１５５５，２７４であり、標題は、− 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ｔｆｆｌ害剤とそれを得るための方法”である、このｕ ｓ、特許出　願　は、特に文献としてここに取り入れである。

好ましいＴＮＦ阻害剤には２種類の異なった形があり、前述のＢｒｅｗｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、の出願の中にそれぞれ開示されている。これらの１つは３０ＫＤａＴ ＮＦｌｌ］ｉ害剤であり、少なくともヒトＵ９３７細胞によってＩＩＩ！ｌされ た培地からとヒトの尿から分離同定された。３０ＫＤａＴＮＦ阻害ＩＩ　ハ、５ ＤＳ−ＰＡＧＥＩ：Ｊ：’）約３０ＫＤａ　’ｔ’、ＤＥＡＥＣＬ６Ｂカラムか らトリス緩衝液中８０■■ｏｌ塩化ナトリウＮＦアルフアの活性を阻害すること が示され、ＴＮＦベータへの効果は少なかった。自然に生ずる蛋白質は糖鎖形成 されている。非糖鎖形成３０ＫＤａＴＮＦもまたＴＮＦ阻害活性を表わす。

Ｈｔ　Ｌ　ｋ’　Ｔ　Ｎ　Ｆ　Ｎ　害ｉ１ｆ　ノ第２　（ｒ）　ｆｆ５　ｕ　４ ０　Ｋ　Ｄ　ａ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　Ｎｌ害剤であり、これもまた、少な（ともヒトＵ ９３７細胞によりｌＩｍ整された培地とヒトの尿から分離同定された。　４０Ｋ ＤａＴＮＦＩＩｌｌ害剤は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ”ｌ？およ（−４０ＫＤａであり 、トリス緩衝液中１００　＋ｉｍｏｌの塩化ナトリウムｐＨ７，５でＤＥＡＥカ ラムから溶出する。４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦアルファとＴＮＦベータ の両方の活性を阻害することが示された。４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤もま１℃、糖 蛋白質であり、再び、非糖鎖形成蛋白質もＴＮＦ阻害活性を表わす。

３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤と４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤の両方をエンコードする遺伝 子の核酸配列と両蛋白質のアミノｌｔＥ列は、　１ｌｒｅｖｅｒらの出願中に記 載されている０本発明は、以下に述べるような自然発生蛋白質のある種の切断型 と同じような非糖類形成型ＴＮＦｔｌｌｌｌＪ剤も包含する、さらに別の具体例 で、ＴＮＦ阻害剤は、１個またはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ） または他の反復重合部分の付着によって修飾される。

４（ｌＫＤａＴＮＦ阻害剤の３種類の型がＥ、　Ｃｏ１１．における発現で組換 えによって産生じた。これらのそれぞれの形は、全長４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤、 ４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５１及び４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３（糖鎖形成型 及び非糖鎖形成型における、ヒトＵ９３７細胞によりＩＩ！ｉされた培地とヒト 尿から分離したような糖類形成型全長４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤も加久て、ここで はすべて４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤としてまとめられている）で、　Ｂｒｅｗｅｒ 　ｅｔ　ａｌ、の出　願にに！載されている。Δ５１蛋白質は、成熟蛋白質のカ ルボキシル末端における５１アミノＷ１残基が除かれている自然の蛋白質の切断 型の翻訳語である。Δ５３蛋白質は、自然蛋白質のカルボキシル末端の５３アミ ノ酸残基が除かれている成熟蛋白質の切断訳語である。自然発生４０ＫＤａＴＮ Ｆ阻害剤（糖鎖形成された）及び非糖鎖形成阻害剤（自然、Δ５１及びΔ５３） は、実質的に同じＴＮＦ阻害活性をもっている。

Ｂｒｅｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ、の阻害剤を製造する方法もまた、上記の申請書に開 示されている。開示された方法の１つは。

例えば、ヒトの尿やヒトＵ９３７細胞により調整された培地のようないろいろな 利用源から阻害剤を分離することから成っている。開示された第２の方法は、阻 害剤をコードする能力のある遺伝子の分離、適当なベクターや細胞型への遺伝子 のクローニング、及び阻害剤を産生ずる遺伝子の発現を含んでいる。一般には組 換えＤＮＡ法の例がある後の方法は１本発明の好ましい方法である。岨換えＤＮ Ａ法は、高純度でかなり大量に製造できるので幾分好ましい方法である。

本発明の範囲にはまた、ＴＮＦ阻害剤ムティンと、１９９１年３月１５日に出願 した■、Ｓ、特許出諌連続番号０７／６６９、δ６２に記載され、ここにも特に 文献として引用されている修飾されたムティンが含まれている。好ましいムティ ンの１つは、１０５の位置がシスティンの３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤である。好ま しいポリエチレングリコール化ＴＮＦ阻害剤は、２つのＣ１０５３０Ｋ　Ｄ　ａ 　Ｔ　Ｎ　Ｆ阻害剤がポリエチレングリコール（ＰＥ０１部分で付着した“ダン ベル一種である。最も好ましい具体例では、ＰＥＧ鎖が２０．０００の分子量を 持っている。ダンベル化合物の製造は、以下の例５に記載しである。

上記のＴＮＦ阻害剤は１述の方法で“実質的に純粋−な方法で製造されることが 好ましい、−実質的に純粋−により、阻害剤は、修飾されない形で、かなり高い 比活性を持つことを意味する。しかしなが６．ＴＮＦ阻害剤の誘導体は異なった 比活性を持ち得ることを認めるべきである０本発明の好ましい具体例の中で、少 なくとも３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤または４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤からなる治療構 成物の有効量がＴＮＦ媒介疾患に苦しむ患者に投薬されている。

追加のＴＮＦ４害剤は、ＴＮＦ受容体部位でＴＮＦと競合する能力のある化合物 を含んでいる。このような化合物には、受容体拮抗物質が含まれる。その他のＴ ＮＦ阻害剤には、　ｉｎ　ｖｉｖｏでＴＮＦの合成や細胞外放出を妨げる化合物 や蛋白質が含まれる。このような化合物には、ＴＮＦ遺伝子の転写や翻訳あるい はＴＮＦのプレ蛋白質に影響を与える剤が含まれる。

好ましい阻害剤の阻害機能は、１つまたはそれ以上の別個の分離した部分によっ て伝λられることが可能なので１本発明の方法は、活性成分が、ＴＮＦ阻害を制 御する阻害剤のその部分（またはそれらの部分）からなる治療構成物を投与する ことによって実用化できると想像される。

本発明の治療構成物は、非経口的に注射によって投与されることが望ましいが、 関節的注射、吸入ミスト、経口的な活性製剤、経皮性のイオン導入法または坐薬 のような他の有効な投与剤もまた考えられる。好ましい担体の１つは生理的食塩 水であるが、他の薬剤的に許容できる担体もまた用いることができる。１つの好 ましい具体例として、担体とＴＮＦ阻害剤が、生理的−融和性の徐放出製剤を構 成することが想定される。このような担体の第一溶媒は、水性または非水性のど ちらかであろう。

さらに、担体は、ｐＨ１漫透性、粘着性、透明性１色彩、殺菌性、安定性、溶解 速度、または製剤の匂を修飾または維持する他の、薬剤学的に許容できる賦形剤 を含めてもよい、同様に、担体は、ＴＮＦ阻害剤の安定性、溶解速度、放出、ま たは吸着を改良しまたは維持するさらに別の薬剤学的に許容できる賦形剤を含め てもよい、このような賦形剤は、単一薬量でも多重投薬型でも、非経口投与の薬 量の製剤に普通また習慣的に用いられる物質である。

一度、治療構成物が製剤されれば、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、あるいは 脱水または凍結乾燥した粉末として消毒瓶に保管されるだろう、このような製剤 は、使用しやすい形かまたは投与前に迅速に再構成が要求される形で保管されよ う、このような製剤の好ましい保管は、少な（とも４℃以下、望ましくは一７０ ℃である。ＴＮＦＩＩ１１宵剤を含むような製剤は、貯蔵し、生理的なｐＨまた はその近辺で投与することが望ましい、高いｐＨ（すなわち８以上）または低い ｐＨ（すなわち５以下）の製剤の投与は現在望ましくないものと信じられている 。

全身性送出のためＴＮＦ阻害剤を含む製剤を投与する方式は、皮下、筋肉、静脈 内、鼻腔内または腟内または［％Ｉ坐薬経由が好ましい１局所施用のためＴＮＦ 阻害剤を含む製剤を投与する好ましい方式は、関節内、気管内、または点滴注入 または呼吸！への吸入の経由である。

さらに、適当な製剤または装置によるＴＮＦ阻害剤の経口投与かあるいは坐薬ま たは浣腸により、消化管の適当な部分ｅＴＮＦ阻害剤を投与することが望ましい 。

ある具体例では、患者の血流内で、あらかじめ選定されｔ−Ｔ　Ｎ　Ｆ阻害剤の 濃度が作られるように投与が設計されている。血清の０．０１ｎｇ／ｍｌ以下の ＴＮＦ阻害剤の循環濃度の維持は有効な構成とは言えない一方、ｌｏ＋ｚ　ｇ／ ＴＩＪｌを越λる循ＩＩＩｍ度の長期の維持は望ましくない副作用を生ずると信 じられている。

ＴＮＦ媒介疾患の治療とさらに特別にＴＮＦ媒介媒介敗血症シタツク療のために 好ましい投薬量の範囲は、約０、１−２１−２Ｏ０／ｋｇ患者体重／２４時間で 、等量を４−１５回７２４時間投与することが好ましい、さらに好ましい具体例 では、投薬量は約０．１−１００ｍｇ／ｋｇ患者体重７２４時間で１等量ずつ３ 時間ごとに投与する。最も好ましい具体例では、　ＩＳｏｎｇ／ｋｇ患者体重／ ２４時間で、３時間ごとに投与する。

好ましい具体例では、投与は、１２から６０時間継続される、最も好ましい具体 的投与例では、少なくとも２４時間継続される。投薬の頻度と適当な投薬量は、 使用される製剤中のＴＮＦ阻害剤の薬物動態学的パラメーターに依存するだろう 。

ＴＮＦ媒介疾患のため、さらに特別にＴＮＦ媒介敗血症ショックの治療のために 好ましい方式として、最初にＴＮＦの静脈内ポーラス注射で投与し、その後循環 ＴＮＦｌ１度がもはや上昇しなくなるまでＴＮＦ阻害剤を連続的に静脈内に注入 する。血清ＴＮＦアルファ濃度は、市販のイムノアッセイ試験キットで確認出来 るだろう、ＴＮＦ媒介敗血症ショックの治療の開始は、敗血症または敗血症の可 能性が診断された後できるだけ早くどちらかの治療方式で始めるべきである３例 えば、敗血症ショック開始のリスクをもたらす手術、または偶発症候またはその 他の事故に続いて直ちに治療を開始すべきである。

ＴＮＦ媒介疾患の治療のためとさらに特別にＴＮＦ媒介閏節炎の治療のための好 ましい方式には、ｌ）関節炎ＴＮＦ阻害剤の単−関節内注射、２）ＴＮＦ阻害剤 の定期的皮下注射が含まれる。

ＴＮＦ媒介疾患の治療とさらに特別にＴＮＦ媒介成人呼吸困難症候群の治療のた めの好ましい方式には、１）ＴＮＦ阻害剤の単一または複合の気管内投与：　２ ）ＴＮＦ阻害剤のポーラスまたは継続的な静脈内注入が含まれＴ　Ｎ　Ｆ　１１ １１％剤を含むある種の製剤は、経口的に投与されるべきことがまた考えられる 。この方式で投与されるＴＮＩ”阻害剤は、好ましいのはカプセル化されたもの である。カプセル化ＴＮＦ阻害剤は、固形調剤型の調合に習慣Ｉｌｌ　ｉこ用い られる担体によりまたは担体なしで製剤されるだろう、カプセルは、生物学的同 等性が最大になり、浸透前の分解が最小になる胃腸管内のその時点に、製剤の活 性部分が放出されるように設計されることが好ましい、ＴＮＦ阻害剤が吸収され やすくなるように追加の賦形剤が含められてもよい、希釈剤、調味料、低融点ワ ックス、錠剤粉砕剤、及びバインダーもまた使用してもよい。

投与の方式に関係なく、患者のおよその体重にしたが・）で特定の投薬量が計算 される。上記のそれぞれの製剤を含め治療に適した投薬量を決めるのに必要な計 算の見直しは、その分野の専門家によって日常的に行われ、特にここに開示した 投薬情報と解析に照らして、過度の実験を行うことなく日常的な仕事の範囲内で 達成される。

これらの投与量は、適当な投与量−反応データとともに、決められた投薬量のた めに設定された分析法を利用して確認される。

ここに言うＴＮＦ阻害剤製剤は、ヒトへの適用と同様に、獣医用にも使用でき、 −患者−の用胎は、限定した解釈をしないように注意すべきである。獣医用に用 いる場合、投与量の範囲は上に特定しｔ：のと同じにすべきである。

特別な問題または環境への本発明の教示の適用は、ここに含まれる教示内容に照 らして、この分野に普通の技術をもつ人の能力の範囲によることを理解すべきで ある。本発明の代表的な使用例は次の例であると思われる。

次の例は、ここに述べたＴＮＦ媒介疾患の１つに本発明を適用している。ＴＮＦ 媒介敗血症ショックの患者への治療とその他のＴＮＦ媒介疾患の患者への治療の 相違は、たとえあったとしても、この分野の普通の技術者であれば容易にかつ日 常的に舅らかに出来るだろう１次の例で示すように、ＴＮＦ阻害剤の投与により ＴＮＦ媒介敗血症ショックの影響を緩和する能力は、ＴＮＦ阻害剤の投与が、こ こに定義するようなＴＮＦの媒介するすべての疾患の治療に等しく有効であろう ことを示している。

ｌ　サイトカイン　ショックのネズミモデルにおＧるヒト　え４０ＫＤａＴＮＦ 　Δ５３のＬ立ユｊ Ａ、マウスにおける全身性ショックの誘発のための計画敗血症ショックに対する ＴＮＦ阻害剤の治療効果を立証するため、　Ｅｖｅｒａｅｒｄｔ、艷ｔ　ａｌ、 により開発された敗血症ショックの改良ネズミモデルをこの例に利用した。

Ｅｖｅｒａｅｒｄｔ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｂｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒ ｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、。

ｖｎｌ　１６３．　ｐｇ、　３７８　（１９８９１，を特に参考のためにここに 引用した。このモデルでは、サイトカインの組み合わせの共同作用で、ヒト組換 えｍ瘍壊死要因α（ｈｒＴＮＦａ）とヒト組換＾インターロイキン−１β（ｈｒ ｌＬ−１β）が、深い低体温とその後の死亡で特徴づけられるマウスの敗血症シ ョックを発生させる。

致死敗血症ショックは、Ｃ５７Ｂ　ｌ／６匹の雌マウス、ト１２週令１♂−１２ ｇ体重、で、ｈｒＴ　Ｎ　Ｆ　ａとｈｒＩＬ−１βの投与によって誘発された。

ヒト組換え腫瘍壊死要因は、一般に、　５ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔ ｕｒｅ　（１９８５）　ｖｏｌ、　３１３．　ｐｐ、８０３−８０６．に記載の 方法にしたがって作られ、特にこの関係でここに引用した：これもまたＢｒｅｗ ｅｒ、　ｅｔ　ａｌ。

特　許　出　■を参照されたい、ヒト組換えインターロイキン−１６は、一般に 、　Ｋｒｏｎｈｅｉｓ　ｅｔ　ａユ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ！２Ｊｌｆ１９ ８６１　ｖｏｌ、　４．　ｐｐ、　１０７１１−１０８２．に記載される方法に したがって作られ、特にこの関係でここに引用した。

サイトカインは、米国薬局方ＸＸＩＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｏｒｓｕｌａｒｙ ＸＶＩｌ、Ｊａｎｕａｒｙｌ、　１９９Ｇ、ｐｐ、　１４９３−１４９５に記載 される方法μｌ容量で、マウスの背の表面に、単一のポーラスとして皮下注射を 行った。　４０ＫＤａ　Ｔ　Ｎ　Ｆ阻害剤Δ５３は、　Ｂｒｅ−ｖｅｒ　ｅｔ　 ａｌ、出願に記載される組換久ＤＮＡ法にしたがって作られ、注射当たり３００ μｍ以下の容量で、複合層膜内投与で与えられた。

１００％の死亡（図１）を引ぎ起こすに必要なｈｒＴ　Ｎ　Ｆαに対するｈｒＩ Ｌ−１βの別名を決めるための予備実験を行った。投与量はμｇ／ｋｇ体重で表 示した。　ｈｒＴ　Ｎ　Ｆσ投与量を３００　ｕ　ｇ／ｋｇに固定し、ｈｒｌＬ −１βの量を増加させながら注射ポーラスに添加した−　ｕ、ｇ　ｈｒｌ　Ｌ− １（１／ｋｇ＋％死亡率として得られた結果は次のとおりであった、　２５０： ０．５００：ｌｏ、１ｓ００：５０，２０００・６７．２５００：１００．　ｚ ｓｏ。

μｇ／ｋｇ以上のすべての投与量では１００％致死を生じた。

その後のすべての実験で、サイトカイニンは、２５００ｕ　ｇ／ｋｇｈｒＩ　Ｌ 　−ｉ　β及び３００　μｇ／ｋｇｈｒＴ　Ｎ　Ｆ　ａで使用し、背表面に単一 皮下ポーラスで投与した。

ｈｒＴ　Ｎ　ＦαとｈｒＩＬ−１βの組み合わせ投与は、マウスに深刻な低体温 症（図２）と注射後右よそ１８か６３０時間での死亡（図４）をもたらした、こ の例で、体温の低下は、誘発ショックの深刻度の測定指標として用いられた０体 温は、　Ｆｉｒｓｔ　Ｔｅ５ｐ　ｆｎｆｒａｒｅｄ　ｈａｎｄ　ｈｅｌｄ　ｓｃ ａｎｎｅｒｆＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｃａ ｒｌｓｂａｄ、　ＣＡＩの使用で推定した。低体温の程度は、直接他の臨床徴候 （例えば、震え、嗜眠、皮膚弾性の欠如、うず（まり姿勢）の重症度に関係して いた。動物の体温は、注射後およそ１５時間で３９℃の正常値から２８℃まで低 下した。対照的に、どちらかのサイトカインだけの注射は、同程度の低体温（図 ２）を生ぜず、致死効果もなかった。ｈｒＩＬ−１βの２６００ｕ　ｇ／ｋｇの 単一ポーラスの皮下注射は、１２から１６時間後に最低３４℃に達する一時的な 体温低下を生じた。死亡は１１１１１されなかった。ｈｒＴＮＦａの３００　ｕ 　ｇ／ｋｇ投与では、マウスの体温に測定できるような第三響を与えず、死亡も 見られなかった。

Ｂ　サイトカイン誘発ショックに対する４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３の効果 ４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３を、づイトカイン混合剤（上記の量のｈｒＩＬ− １βとｈｒＴ　Ｎ　Ｆ　ａ　）を注射したマウスに投与した。６匹のマウス群を 阻害剤蛋白質（この実験では、４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３）で、さらに長期 間治療する一連の実験を行った。注射当たりの阻害剤蛋白質の量は一定に保った が、全体の注射数を増加させた。

したがって、３種の実験で使用した阻害剤蛋白質の絶対量は治療の継続時間によ って変化した１体温と死亡率をそれぞれの実験で測定した。

最初の実験では、サイトカインボーラスの３０分前と３０分後に、阻害剤蛋白質 を腹膜内に注射した（図３）、阻害剤蛋白質の全量２００ｍｇ／ｋｇの内、各注 射でｌま３００μｌの容量でｌｏＯｓｇ／ｋｇの含量であった。サイトカイ−Ｉ ショック、無処理群に比較してサイトカイン投与後４カ）ら６時間での低体温症 が有意に減少した（図３）、処理群晶こお１ｊる死亡の開始は、約１２時間遅く な一ンた（図４）、し力１しながら１両群とも、注射後４８時間で死亡率６１１ ００％になった。

第２の実験では、注射後の治療は全部で１２時間継続した（図５）サイトカイニ ン射の時間に対する注射時間はニー３０分、＋３０分、３時間、６時間、９時間 、及び１２時間であった。この治療では、阻害剤蛋白質の全投与量は結果的に６ ００　ｍｇ／ｋｇであった。サイトカインの注射後、無処理群には、特徴的な低 体温症が進行し、１５時時間和最低の２６℃になった。３６時間目に最初の死亡 が見られた（図６）、４３時間目までに死亡率が１００％に達した。対照的に、 阻害剤蛋白質による処理群では、サイトカイン混合剤の注射後約２４時間は、重 度の低体温症が起こらなかった１体温は、１２時間目に３５．５℃の最低温度に 達した。

その時間で、阻害剤蛋白質治療は終了した０体温は次の６時間にやや上昇し、そ れから３６時間までに２６℃に急激に低下した。無処理群に対し、処理群では死 亡の開始を遅らせた。注射後４２時間目に最初の死亡が見られ、４４時間目まで に１００％に達した。

第３の実験では、サイトカイン注射後の治療を１２時間から２４時間に延長した （図７）、サイトカイン注射後１５、１１１．２１．及び２４時間目に追加の腹 膜内注射で投与した、結果的に、全投与量は１０００■に／ｋｇであった。ｈｒ ＩＬ−１βとｈｒＴ　Ｎ　Ｆσを投与された無処理群は、第２の実験と同様のコ ースをたどった０体温は１２時間で２７℃の最低１度に達した。死亡は注射後ｌ ♂時時間軸始まり４２時間で１００％に達した（図８）、これに対し、阻害剤蛋 白質を投与された群は１重度の低体温症と致死が防がれた。平均体温は、サイト カイン注射後ｌＯ時間目までにわずか３３．５℃までしか減少せず、その後、阻 害剤蛋白質処理中止の２４時時間表でに正常値近くまで上昇した（図７）、４２ 時間目（処理中止後１８時ＩＳ＋！目）までに５体温は一時的に３４．５℃Ｃ下 がり、サイトカインの注射後９０時間目まで普通よりやや下の温度に保たれた。

この群の死亡は６匹の内１匹であった。１匹の死亡の説明はつかなかった。しか しながら、その動物は実験を通して異常に見え、多分。

腹膜内注射を誤ったためと思われる。これらの動物の体重は、サイトカイン誘発 シ号ツクからの完全回復の評価のために記録された（図９）、阻害剤蛋白質で処 理した群では、６２時間目までに元の体重の７９％まで低下した。

しかしながら、サイトカイン注射後２００時間目までに平均体重は、リン酸緩衝 塩水（ＰＢＳ）を注射した対照群の体重に達した。動物の挙動と外観は正常に見 えた。阻害剤蛋白質による処理を２４時間延長することによって、我々はサイト カインで誘発された敗血症ショックのマウスに見られる重症の低体温症と致死を 逆転させることができた。阻害剤投与の期間と頻度は、敗血症患者に与えられる 集中処理と両立させるべきであろう。

Ｃ流体処理の無効果を示す対昭群と阻害剤のみの無毒性 １配の１！後の３番目の試験で、阻害剤蛋白質（４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３ ）は、注射当たり２００から３００μｌの容量で投与された。阻害剤蛋白質の流 体容量それ自体に処理効果があるかも知れない可縫性があった。その可能性を試 験するために、単にサイトカインのみを受けた１群と、阻害剤蛋白質処理群と容 量も頻度も同じにしたＰＢＳの！１ｕｌｌ内注射をサイトカインに加えた第２群 を比較した（図５）、低体温症または死亡率に有意な差は見られなかった。その 後の実験で、無処理のサイトカインショックのマウスにＰＢＳを腹膜内に投与し た。

阻害剤蛋白質のみの影響を調べるための別の対照試験も含まれていた。すべての 実験で、処理を受けたサイトカインショック群と同じ容量と頻度で、阻害剤蛋白 質のみをマウス群に注射した。阻害剤蛋白質のみの対照群に、いかなる死亡も体 温の変化も見られなかった（図３゜５．７）。

２・サイト力　ン　シラツクの　ズミ　デルに　お　１　ヒ　３０ＫＤａＴＮＦ 　の　のＩ Ａ、ネズミ敗血症ショックの誘発のための計画１に述べた同じ敗血症ショックの ネズミモデルを利用した。致死シーｌ−）りは、Ｃ５７Ｂ　１／６　匹ノ雌？’ ７ス、８−１２週１、体重１８−２１ｇに、　３００　ｕ　ｇ／ｋｇのｈｒＴ　 Ｎ　Ｆ　ａと２，５００ｕ　ｇ／ｋｇのｈｒＩＬ−１βの組み合わせを皮下に投 与することによって誘発させた。これらの投与量で死亡率は１００１であった。

サイトカインは、単一の皮下ポーラスとじて頚の後ろに写えた。

この実験で、体温の減少を誘発ショックの重症度の指標として用いた。低体温症 の程度は、臨床徴候（例えば、罵え、嗜眠、皮膚の弾力性の欠如、うずくまり姿 勢）の重症度と直接的に関連があった。ｈｒＴＮＦａとｈｒＩＬ−１βの組み合 わせ投与の後、注射後右よそ１５時間で体温が正常値の３９℃から２δ℃まで低 下した（図２）、温度は　、　Ｆｉｒｓｔ　Ｔｅ５ｐ■　１ｎｆｒａｒｅｄ　ｈ ａｎｄ　ｈｅｌｄ　ｓｃａｎｎｅｒ（ＩｎｔｅｌｌｉｇｒｎｔＭｅｄｉｃａｌ　 ５ｙｓｔｅ＠ｓ、　Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃ＾）によって推定した、封緘的に、ｈ ｒＴＮＦａまたはｈｒｌＬ−１βだけの注射は、同程度の低体温症を引き起こさ ず、致死効果もなかった（図２）、この実験に利用したヒト組換え３０ＫＤａＴ ＮＦ阻害剤は、Ｂｒｅｗｅｒ色！−」」、特許出　願に記載されている方法にし たがって作成し、た。

Ｂ　サイトカイン誘発敗血症ショックに対する３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤の効果 阻害剤蛋白質（この例では３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤）を、８匹のマウスに、ｈｒ ＴＮＦａとｈｒＩＬ−１βの皮下投与後１２．２４．または３９時間目のどれか の時間に、４０■ｇ／ｋｇ／注射で腹膜内に投与した。１匹のマウスを含む第１ 群は、サイトカインの注射前３０分、注射後３０分、３時間。

６時間、９時間、及び１２時時間和、阻害剤蛋白質を投与した。このマウスは、 ６回の注射で全量２４０１ｇ／ｋｇの阻害剤蛋白質を受けた９次の群は、３時間 間隔の追加注射でさらに１２時間処理を延長した。この群の３匹のマウスは、２ ４時間の間に１０回の注射で、全部で４００ｍｇｋｇの阻害剤蛋白質を受けた０ 次の群は、再び３時間間隔の注射を加えて、処理を１５時間に延長した。この群 の４匹のマウスは、３９時間に１５回の注射で全部で６００ｍｇ／ｋｇの投与を 受けた。

処理と無処理のマウスについて１体２１（図１０１と死亡率（図ｉｔ＋　を追跡 した。無処理のマウスの平均体温は１２時時間和２７℃に低下し、サイトカイン の投与後３６から４２時間の間に死亡するまでその低温のままであった。対照的 に、３種類の処理群のすべてのマウスの体温は、わずかに減少しただけで、サイ トカインショックのすべてのマウスが生き残った。サイトカインの投与後最初の ２４時間の間、３群共体温が１２時間までに２から４℃低下し。

２４時間までに正常に戻った。その後、２４時間または３９時間阻害剤蛋白質の 処理を受けた群は５体温が正常に保たれたが、１２時間だけの処理を受けた１匹 のマウスは、３９℃で３℃低下し、その後、サイトカイン注射後１ｏｏ時間目ま でに正常値に戻った。

体重が、開始時の値に戻るまでに要する時間もまた、サイトカイン誘発ショック 後の回復の指標に用いた（図１２１　、２４時間または３９時間阻害剤蛋白質で 処理されたマウスの体重は、６０時間目までに開始時の体重の８６１に低下した が、１４０時間目までに正常値に戻った。　１２時間阻害剤で処理した１匹のマ ウスの体重は、若干遅く、７５時間口に６１％に低下したが、ほかの２群と同じ く、約１４０時間で最初の体重に戻った。

３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は、サイトカインの混合剤の注射後、　１２．２４．ま たは３９時間の間、３時間間隔で治療を続ければ１ｇイトカイン誘発致死敗血症 ショック症候群からマウスを防護するのに有効であった。同様の治療処方は、集 中治療中の敗血症ショック患者に対し、容易に目的を達成することができる。

３：ラットのｓｃｗ−ｔのストレプトコツカル　ｓｃｗ　−に　る　ヒ　ト　３ ０Ｋ　Ｄ　ａＴＮＦ　の　の この実験には、Ｅｓ５ｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、＾ｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒ ｈｅｕ−ｍａｔｉｓｗ、　２１１４０１−１４１１．　ｆ１９８ｓ１．に：２載 のモデルを用い、特に、文献としてここに引用している。このモデルは簡単に次 のようにまとめられる。ストレプトコツカル細胞壁（ＳＣＷ）を、ルイスラット の足首の関節に関節的注射をする。対照として塩水を反対側の関節に注射する、 初期の炎症が静まった２０日後に、ＳＣＷを再び、今度は静脈内に注射する。こ のＳＣＷ投与量はそれ自身で関節炎症を引き起こすには不十分であり、そのため 、塩水注射の足首にはほとんど影響しない、しかしながら、逆に、この投与量は 、先にＳＣＷを注射した足首については炎症と関節破壊を活性化させることがで きる。第２回目のＳＣＷ投与に続く炎症の広がりを評価するために、足首関節の 寸法を毎日測定する。

ストレプトコツカル細胞壁−誘発関節炎について、Ｒ８Ｌ、Ｗｉｌｄｅｒは、Ｉ ＋ｓｍｕｎｏ　ａｔｈｏ　ｅｎｅｔｉｃ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ａｒｔ ｈｒｉｔｓ９章標題−慢性関節炎の実験動物モデル”に、−実験的な関節疾患の 臨床的、組織学的また放射線医学的特徴は、成人や子供のリウマチ関節炎に非常 によく似ている°とコメントしている。

ＬＬ立１ｊ　第１組の実験において、ＳＣＷ誘発関節炎のモデルを用い、関節炎 のラットに、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳｌ中のＴＮＦ阻害剤を１回問節内に投与し た。

開始０日に各ラットの左足首に５ＣＷ（１４μｇラムノース当量）を注射して関 節炎を誘発させた。右足首には等容量の、発熱物質を含まない塩水を注射した６ 足首の寸法を０．１．２．及び７日目に測定した。ｌ及び２日目の左足首の膨張 （表１）は、ＳＣＷ誘発関節炎の急性相を反映している。関節的注射に関係した 機械的な外傷のため対照として用いた右足首には、有意な膨張を生じなかった（ データは示していない）。

関節炎の急性相が静まった後の２１日目に、ラットを各々９または１０匹ずつの ４群に無作為に分け、麻酔をかけ、以下に述べる計画にしたがって注射した。Ｃ ｌＯ３は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共有結合のための部位を作る目 的でアミノ酸置換を行った３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤である。ＣｌＯ３では、３０ ＫＤａＴＮＦ阻害剤の位置＋０５でアスパラギンがシスティン置換した。　Ｃ１ ０５−ＰＥＧ３４００ダンベル（ｄｂ）分子は、ＣｌＯ３の２つの分子が１分子 量およそ３４００ダルトンの１個のＰＥＧ分子によって架橋している、このダン ベル分子とポリエチレングリコール化法は、１９９１年３月１５日出願の　Ｕ、 Ｓ、特許主脈連続番号　０７／６６９．８６２にさらに子分に説明されており、 標題は一ポリペプチドの部位特異的ＰＥＧ化−で２ある、この出賊は、特に、こ こに文献として引用しである、　Ｃｌ０５−Ｐ　Ｅ　Ｇ　３４００　ｄｂの製造 方法は、以下の例５に示Ｘ−ＰＢＳ　対ＩＩ　ＰＢＳ　ＰＢＳ エニーＰＥＧコ４００対照　ＰＥＧ　３４００　ＰＥＧ　３４００（０，９μ９ ／関節）　（０，９μｑ／関節）エエエーＣ１０５−ＰＥＧ　３４００　ｄｂ　 Ｃ１０５−ＰＥＧ　：１４００ｄｂ　ＰＥＧ　３４００（１０μ９７関節１　（ ０，９μ９７関節）工Ｖ−ＣｌＯ３Ｃ１０５ （２μ９７関節）　（２μｑ／関ａｉｌＩ詳は、Ｃ１０５−処理＋Ｖ群のための 担体対照用として用いｔ：、Ｔ１群は、Ｃｌ０５−Ｐ　Ｅ　Ｇ　３４００　ｄｈ −処理１１１群のための担体群として用いた。関節的注射は、自動ピペッタ−に 取り付けた２５ゲージ針を通して全容量がｌＯμｌであった。いろいろな処方の 関節内注財の後すぐに、それぞれのラットに５ＣＷ（１５０μｇラムノース当量 ）を静脈内に注射して関節炎を活性化させた。それ以外は何もラットに与えなか った０足首間節の寸法は、２１．２２．２３、及び２４日目に測定した。

期待したように、全群のラットの左足首は、　２１日目の（表１と図１３１ｓｃ Ｗの静脈内注射に反応して膨張した、しかしながら、その反応は、処理群の間で 著しく異なっていた。対照の工及びＴ１群のラットの関節が、それぞれ、初期の 寸法の３０％及び３２％膨張したのに対して、Ｃ１０５−Ｐ　Ｅ　Ｇ　３４００ 　ｄｂ−処理のＩＩｌ群の相当する関節の増加はわずか１５％、　ＣｌＯ３−処 理の！Ｖ群では２５％であった、図１４で、５ＣＷ−誘発再活性化の後７２時間 の間の関節直径の最大増加が、１．　Ｔ１．　ＩＩｌ、及びＩｖ群についてグラ フ化されている。　Ｃ１０５−Ｐ　Ｅ　Ｇ　３４００　ｄｂの１回の関節的注射 により、関節炎症の関節の膨張が、統計的に有意に減少した。

Ｗ　第２組の実験では、関節炎の同じＳＣＷモデルを用い、関節炎のラットに、 リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中の３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤を多数回皮下投与を行っ た。１日目に、それぞれのラットの左足首に、５ＣＷ（１，６８ｇラムノース当 量）を注射して関節炎を誘発させ、また、右の足首に等容量の、発熱物質を含ま ない塩水を注射した。

急性関節炎が静まった後の２１日目に、ラットを無作為に４群に分けた。関節炎 を活性化させるために、それぞれのラットに対しＳＣＷの２回目の投与量（１５ ０μｇうムノース当量）を、静脈内に注射した。ＳＣＷの注射後３分以内に、ｊ １１群Ｉの９匹のラットにＰＢＳを与え、また、各ＩＩ、　ＩＩｌ、及びＩｖ群 の５匹のラットに対し、それぞれ、ＰＢＳ中の３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤の１，３ 、及び９　ｍｇ／ｋｇ体重で処理した。１群に対するＰＢＳの皮下注射またはＩ Ｘ、ＩＩｌ、及び　ＩＶ群（それぞれｌ、３．及び９　ｍｇ／ｋｇｌに対する３ ０ＫＤａ丁ＮＦ阻害剤の皮下注射は。

ＳＣＷ投与後２及び６時間口に再び行い、その後４２時間の間、６時間ごとに繰 り返した０足首間節の直径はｓｃＷの静脈内注射後、０　、２４．３９．４８． ６０．及び７２時間間口測定した。

図１５と表２は、４種の実験群で、ｓｃｗで誘発した間！Ｉｌ炎の活性化後７２ 時間の間の関節の直径の最大変化を示す０期待したように、塩水処理群の足首は ｓｃｗの静脈内注射に反応して膨張した。しかしながら、Ｉｌ、　ＩＩｌ、　Ｉ Ｖ群の最大膨張は、それぞれ、５８％、８５％、及び７５％減少した０表２は、 対数変換した平均のｔ−検定法を用い、図１５のデータの統計的解析の結果を示 している。

−一４：　［」Ｌ−ぺＪＬＪ　Ａ　ＲＤ　Ｓ　の　彎−カニｍ−しで、ラットに お番るエンドトキシン　−兄」１」Ｌニーｓｍ１　るヒト　３ＱＫＤａＴＮＦ　 のＬｌ立ユ」本実験は、Ｕｌｉｃｈ、ｅｔ　ａｌ、、　Ａ　ｅｒｉｃａｎ　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａ−□−ロＬＬＺ１３♂　１４８５−１４９６．　口９９ １＋、に開示され、特に。

ここに文献により引用するモデルにしたがって、急性の好中球−媒介の肺損傷を 誘発するために１敗血症刺激エンドトキシンを用いる。このモデルは、簡単に次 のようにまとめられる：麻酔したラットの気管の中央頚部（エンドトキシンを注 射する。６時間の潜伏期間後、肺の策管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）が最終の処置とし て行われる。

全体及び個別の白血球細胞の数をＢＡＬｆｉ体について計算する０発熱物質を含 まない塩水の気管内注射は、少ない数で、肺胞マクロファージが支配的なく約９ ９’！ＩＢ　Ａ　Ｌ流体を生ずる。エンドトキシンの気管内注射は、ＢＡＬ細胞 数の著しい増加をもたらし、また好中球が支配的（なる、肺胞空間への急性好中 球の流入は、６から１２時間がピークで、肺胞空間内に蛋白質含有の水腫状の流 体の蓄積が続いて発生する。ＴＮＦはエンドトキシン誘発肺胞炎の媒体の１つで あると信じられている。ＴＮＦはエンドトキシンによる刺激の後ＢＡＬ流体中に 存在する。

肺胞マクロファージは、その合成の源であると信じられている。さらに、外因性 ＴＮＦの気管内注射は、エンド肺胞内杆中球滲出液を発生させる。

動物モデルは、ヒトの疾患を正値に接写するとは考えられないけれども、特に、 ＡＲＤＳの急性から慣性相の移行に、ＡＲＤＳにおける肺の実質損傷の急性相の 間。

変質した肺浮腫、白血球症の隔離及び血中酸素減少に似通うところの多い多くの 動物モデルが用いられる。Ｊ。

Ｆ、Ｍｕｒｒａｙ　ｅＬ−１，、Ａｓ、Ｒｅｖ、ｏｆ　Ｒｅｓ　１ｒａｔｏｒ　 Ｄｉｓｅａｓｅｖｏｌ、　１３１ｊ、ｐｐ、　７２０−７２３　（１９９１１， Ａ　ＲＤ　Ｓの急性型は、敗血症、吸引肺炎、または多重血液輸注のようなある 種のＩＩｌ認し得るリスク要因の存在で発生する。現在の調査では、ＡＲＤＳの 病理生ＩＩ字における好中球媒介損傷の中心的役割が強調されている（　Ｔａｔ ｅ、　Ｒ，Ｍ、＾ｗｈ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐ、　Ｄｉｓ、　１２！１ａｓｓ’ −５５９，ｔｔｓδ３））＋活性化した好中球により解放された毒性産物が肺胞 毛雪膜を傷付けると信じられている。損傷した膜の浸透性は、血清蛋白質と炎症 細胞の肺胞空間内への移動を著しく刺激する９敗血症由来のＡＲＤＳの実験的な 羊のモデルで、好中球の放血は、肺損傷の進行を防御した　（Ｈｅｆｌｉｎ、＾ 、Ｃ，Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎ−ｖｅｓｔ、　６δ：１２５３−１２６０．１１ ．９８１））。

ＰＢＳ中の３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤の気管内投与により、ラットの好中球肺胞炎 を治療する方法を実施した。肺損傷は、殺菌した全容量０．４＋＋＋ｌのＰＢＳ 中のエンドトキシン／（５ｎｇ／ラット）を２７ゲ一ジｌ／２インチの針を通し て、外科的に開いた気管の中央頚部の電管軟骨の間に投与して引き起こした。ラ ットの呼吸の速度や深さを検査しながら、接種物をゆつくり投与した。６時間後 、肺の洗浄をやりやすくするため開腹術が出来るようにイソフルランで麻酔した 。肺の血液含量を減少するため、尾の大静脈を切断した。洗浄の間、肺が広がる ように横隔膜を開いた。ＢＡＬは、　Ｒａｎｋの平衡塩溶液４０−１を、中央頚 部気管の切開部分に挿入し固定した血管カテーテルを通して気管支肺胞空間に注 入して行った。炎症性の細胞の流入は、ＢＡＬ１体を１５００回転１５分間遠心 分離することによって得られたベレットから取り出された。白血球の全数をコー ルタ−カウンターで数えた。多形核好中球のパーセンテージは、染色した細胞の スライド上で手動の鑑別細胞計算で測定した。

気管支肺胞空間への細胞のエンドトキシン刺激性流入に対する、３０ＫＤａＴＮ Ｆ阻害剤の効果は、エンドトキシンの気管内点滴注入と同時に３０ＫＤａＴＮＦ 阻害剤を投与することによつて観測した。３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は、１からｌ Ｏμｇ／ラットの投与量の範囲で試験した。ｌμｇ／ラットの投与量の３０ＫＤ ａＴＮＦ阻害剤は肺胞空間への好中球の流入を減少させなかった。しかしながら 。

２．５ｎｇからｌＯｕｇ／ラットの間の量の３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤の気管内投 与が、肺胞空間への好中球の流入を最大に減少させた。無処理のラットにおける 好中球の流入に比較して、これらの３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤処理ラツトの細胞流 入阻害パーセントは、およそ３５％（図１６）であった。気管支肺胞空間に存在 する好中球の全数は、２．５から１０μｇ／ラットの３０にＤａＴＮＦ阻害剤で 処理したラットでは有意に減少した（図１７と表３）。

５・Ｃ１０５−Ｐ　Ｅ　Ｇ　３４００　ｄｂＣｌ０５−Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｄｂ化合物 は、３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤ＣｌＯ３のムティンを含むシスティンとＰＥＧ−ビ スーマレイミドとの反応によって製造した。ＰＥＧ−ビス−マレイミドを作るた めに、Ｎｉ１ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍｏ５ｂａｃｈ、　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　 Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　、　ｖｏｌ、＋０４．　ｐｐ、５６−６９．　＾ｃａｄｅｓ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹｆ１９δ４）によ って述べられているように、ＰＥＧ−ビス−ジオールからＰＥＧＩ−レジレート を作った。スルホン化中間体の量は、フッ素の元素分析で測定した。この中間体 を、フタルイミド誘導体に変換した後、ヒドラジンヒトラードによりＰＥＧ−ビ ス−アミン中間体にした。これら２つの反応は、Ｐｉｌｌａｉ、ｅｔａｔ、、　 Ｊ、　Ｏｒ　、　Ｃｈｅｗ、、　ｖｏｌ、　４５　ｐｐ、５３６４−５３７０　 （１９８０１により述べられている方法で行った。各中間体の量は、窒素の元素 分析で推定した。さらに、ＰＥＧ−ビス−アミンの量は、２．４．６−ドリニト ロベンゼンスルホン酸との反応で測定した。ＰＥＧ−ビス−アミン誘導体は、Ｂ ｕｌｔｅｒａｎｄ　Ｈａｒｔｌｅｙ、　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　 ５ｏｌｏ　、ｖｏｌ、ＸＸＶ、ｐｐ、　１９１−１９９．＾ｃａｄｅｓｉｃ　Ｐ ｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　ｆ１９７２）の方法適用 による無水マレイン酸との反応、及び。

曹ｕｎｓｃｈ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、Ｈｏ　ｅ−Ｓｅ　ｌｅｒ、 ｖｏｌ、３６６、　ｐ＋＋、　５６−６１　ｆ１９８ｓ＋により述べられている 方法を用いた中間体の１化によって、相当するビス−マレイミド生産物に変換さ せた。

ムティンＣ１０５３０Ｋ　Ｄ　ａ　Ｔ　Ｎ　Ｆ阻害剤は、　１９９１年３月１５ 日出臓のＵＳ、特許　土隠連続番号０７／６６９．８６２に記載されティるとお りに製造した。　２−３ｍｇ／ｍｌのＣＩＱｓ　３０Ｋ　Ｄ　ａＴＮＦ阻害剤を ４倍モル過剰のジチオスライトール（ＤＴＴＩで２時間室温で処理する。ムティ ンは、次に、ｐＨ７０，４℃で３時間、脱気した５０ｍＭのＨＥＰＥＳに対して 透析される。ダンベル化合物−一ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）架橋ダイマ ーと考えられるｍ−を作るために透析したムティンをＰＥＧ　−ビス−マレイミ ドと反応させる。ムティンのＰＥＧ−ビス−マレイミドに対する割合は、ＰＥＧ 化合物の分子量に依存する。約１９００の分子量をもつＰＥＧ−ビス−マレイミ ドに対しては、】：１分子比率を用いたが、一方、３，４００またはｚｏ、ｏｏ ｏの分子量をもつＰＥＧ化合物に対しては、ムティンのＰＥＧ化合物に対する分 子比率２：１を用いた０反応は、室温で３−１２時間保温する。

保温に続＠、ＰＥＧ−架橋タイマーハ、２６０−Ｍ、　３１０ｍＭ、及び３５０ ｍＭ塩化ナトリウム段階勾配を用い、５０＊ＭＨ。

Ａｃ、ｐＨ４，０のモノ−５高速液体クロマトグラフィーを用いて、非ＰＥＧ化 ムティンとＰＥＧ−ムティンモノマーかも精製した。ダンベル化合物は、３１０ ■閾塩化ナトリウム段階で溶出する。残りの非ＰＥＧ化ムティンは。

スーパーデックスフ５のクロマトグラフィーによって除かれた。　Ｃ１０５−Ｐ 　、Ｅ　Ｇ　３４００　ｄｂは、ＴＮＦ阻害剤が　３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤の０ １０５ムテインであり、ＰＥＧ単位が約３４００ダルトンの分子量を持つダンベ ル化合物に関係している。　本発明は、好ましい具体例に関連して説明したけれ ども、この分野の専門家であれば本発明の範囲または思想からはずれることなく 、修正や変化を加えることができることを理解すべきである。したがって、好ま しい具体例のこれまでの説明は、限定した考え方でとらえるべきではなく１次の クレーム及びそれらと同価値のものによって最もよく定義される。

表２．５ＣＷ−誘発関節炎の活性化後７２時間の間における関節の自得の最大の 変化工（塩水１　０．９６　ｉ　０．２５　９Ｉ工　（ＴＮＦ／ｂｐ　１　ｍｑ ／ｋｑ）　ｏ、残Ｏ±、０．１コ　５エエエ　（丁ＮＦ／ｂｐ　３　ｗａｇ／ｋ ｇ）　０．１４　±、０．Ｏコ舎　５ＩＶ　（ＴＮＴ／ｂｐ　９　ｍｇ／ｋｇ） 　０．２４　５０．０ｇ会　５値は平均値士標？！偏差で表示されている。

０　７．４±０．６８ “片側【検定法肝価により、無処理の文１照君１との統−的暮こ有意な相違を示 す。

μｑ　ＬＬ−ＩＢ　ＩＮＪＥｃＴＥＤ　ＰＥＲＫＩＬＣＫＲＡＭ　Ｂ００ＹＷＥ ＩＧＨＴ兄亡乍　ｒｊｂ、ｋ ＭＯＲＴＡＬＩＴＹ　ＣＵＲＶＥ ＯＩｏ　２０　３０　４０　５０ スト１デ：　コ・・ηル　綿り乙　１Ｌ国際調査報告 フロントベージの続き （８１）指定図　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、Ｍ Ｇ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　５Ｅ （７２）発明者　トンプソン、ロバート、シー。

アメリカ合衆国８０３０３　コロラド州ボウルダー、レハイ　ストリート　１８ ２０ （７２）発明者　ラッセル、デボラ アメリカ合衆国８０３０３　コロラド州ポウルダー、アーマ−ドライブ　３８２ ５ （７２）発明者　コウノ、タダヒコ アメリカ合衆国８００２７　コロラド州ルイスビル、ヘイズ　シーティー、１５ ５７

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．治療的に有効な量のＴＮＦ阻害剤を、それを必要とする患者に投与すること を含む、ＴＮＦ媒介疾患を治療する方法。
2. ２．当該ＴＮＦ阻害剤は蛋白質である、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．当該ＴｒＮＦ阻害剤は３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤である、請求の範囲第２項記 載の方法。
4. ４．当該ＴＮＦ阻害剤は４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤である、請求の範囲第２項記載 の方法。
5. ５．当該４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は、全長４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤、４０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤Δ５１、及び４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３からなる群からの少な くとも１つの化合物を含む、請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．当該４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は全長４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤である、請求の 範囲第４項記載の方法。
7. ７．当該４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５１である、請求 の範囲第４項記載の方法。
8. ８．当該４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３である請求の 範囲第４項記載の方法。
9. ９．当該ＴＮＦ阻害剤は組換えＤＮＡ法により産生される、請求の範囲第２項記 載の方法。
10. １０．当該ＴＮＦ阻害剤は実質的に純粋な形で産生される、請求の範囲第９項記 載の方法。
11. １１．当該ＴＮＦ阻害剤は３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤のムテインである、請求の範 囲第２項記載の方法。
12. １２．当該ＴＮＦ阻害割はＣ１０５３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤である、請求の範囲 第１１項記載の方法。
13. １３．当該ＴＮＦ阻害剤は３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤−ＰＥＧ化合物である、請求 の範囲第２項記載の方法。
14. １４．当該ＴＮＦ阻害剤はＣ１０５−ＰＥＧ　３４００ｄｂである、請求の範囲 第１３項記載の方法。
15. １５．当該ＴＮＦ阻害剤は薬剤学的に許容できる担体で投与される、請求の範囲 第１項記載の方法。
16. １６．当該ＴＮＦ阻害剤は液体の形で投与される、請求の範囲第１項記載の方法 。
17. １７．当該ＴＮＦ阻害剤はＴＮＦ結合蛋白質である、請求の範囲第１項記載の方 法。
18. １８．当該ＴＮＦ阻害剤はＴＮＦ受容体のフラグメントである、請求の範囲第１ 項記載の方法。
19. １９．当該ＴＮＦ媒介疾患は、成人呼吸困難症候群、肺線維症、関節炎、敗血症 ショック及び炎症性腸疾患からなる群から選ばれる、請求の範囲第１項記載の方 法。
20. ２０．当該ＴＮＦ媒介疾患は敗血症ショックである、請求の範囲第１項記載の方 法。
21. ２１．当該ＴＮＦ媒介疾患は関節炎である、請求の範囲第１項記載の方法。
22. ２２．当該ＴＮＦ媒介疾患は成人呼吸困難症候群である請求の範囲第１項記載の 方法。
23. ２３．治療的に有効な量のＴＮＦ阻害剤を、それを必要とする患者に投与するこ と　を含む、ＴＮＦ媒介疾患を予防する方法。
24. ２４．当該ＴＮＦ阻害剤は３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤である請求の範囲第２３項記 載の方法。
25. ２５．当該ＴＮＦ阻害割は４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤である請求の範囲第２３項記 載の方法。
26. ２６．当該４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は、全長４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤、４０ＫＤ ａＴＮＦ阻害剤（Δ５１及び４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３からなる群から選ば れる、請求の範囲第２５項記載の方法。
27. ２７．当該４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は全長４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤である、請求 の範囲第２５項記載の方法。
28. ２８．当該４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５１である、請 求の範囲第２５項記載の方法。
29. ２９．当該４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は４０ＫＤａＴＮＦ阻害剤Δ５３である、請 求の範囲第２５項記載の方法。
30. ３０．当該ＴＮＦ阻害剤はＴＮＦ結合蛋白質である、請求の範囲第２５項記載の 方法。
31. ３１．当該ＴＮＦ阻害剤は組換えＤＮＡ法により産生される、請求の範囲第２５ 項記載の方法。
32. ３２．当該ＴＮＦ媒介疾患は、成人呼吸困難症候群、肺線維症、関節炎．敗血症 ショック及び炎症性腸疾患からなろ群から選ばれる、請求の範囲第２５項記載の 方法。
33. ３３．当該ＴＮＦ媒介疾患は敗血症ショックである、請求の範囲第２５項記載の 方法。
34. ３４．当該ＴＮＦ阻害剤は３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤のムテインである、請求の範 囲第２５項記載の方法。
35. ３５．当該ＴＮＦ阻害剤はＣ１０５３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤である、請求の範囲 第２４項記載の方法。
36. ３６．当該ＴＮＦ阻害割は３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤−ＰＥＧ化合物である、請求 の範囲第２５項記載の方法。
37. ３７．当該ＴＮＦ阻害剤はＣ１０５−ＰＥＧ　３４００ｄｂである、請求の範囲 第３６項記載の方法。
38. ３８．当該ＴＮＦ媒介疾患は関節炎である、請求の範囲第２５項記載の方法。
39. ３９．当該ＴＮＦ媒介疾患は成人呼吸困難症候群である請求の範囲第２５項記載 の方法。