ES2318849T3 - Composiciones farmaceuticas para el suministro controlado de receptores solubles. - Google Patents

Abstract

UNA COMPOSICION FARMACEUTICA DE LIBERACION CONTROLADA INCLUYE UN MATERIAL POLIMERICO BIOCOMPATIBLE, PREFERENTEMENTE ACETATO DE POLIETILEN EN EL QUE SE HA INCORPORADO UN RECEPTOR SOLUBLE CAPAZ DE UNIRSE A SU LIGANDO Y DE ESTE MODO AFECTAR LA FUNCION DEL LIGANDO. EL RECEPTOR SOLUBLE ES PREFERENTEMENTE LA FORMA SOLUBLE DEL RECEPTOR TNF{AL}. TALES COMPOSICIONES ESTAN DESTINADAS A SER UTILIZADAS EN EL TRATAMIENTO DE TRANSTORNOS EN LOS QUE SE REQUIERE LA NEUTRALIZACION DE LOS EFECTOS DELETEREOS DE TNF{AL}.

Description

Composiciones farmacéuticas para el suministro controlado de receptores solubles.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas para el suministro controlado de formas solubles de receptores desde una matriz polimérica.

Antecedentes de la invención

Los sistemas de desprendimiento controlado suministran un fármaco a una velocidad predeterminada durante un tiempo definido, que puede variar desde días hasta años. Estos sistemas proporcionan ventajas sobre las terapias de fármacos convencionales. Por ejemplo, después de la ingestión o inyección de formas de dosificación estándar, se eleva el nivel en sangre del fármaco, llega a un máximo y después disminuye. Dado que cada fármaco tiene un intervalo terapéutico por encima del cual es tóxico y por debajo del cual no es efectivo, los niveles de fármaco oscilantes pueden provocar periodos alternos de ineficacia y toxicidad. En contraste, una preparación de desprendimiento controlado mantiene el fármaco en el intervalo terapéutico deseado con una única administración. Otras ventajas potenciales del sistema de desprendimiento controlado incluyen: (i) suministro localizado del fármaco a un compartimento del cuerpo en particular, rebajando por ello el nivel sistémico de fármaco; (ii) conservación de los medicamentos que son rápidamente destruidos por el cuerpo (esto es particularmente importante para moléculas biológicamente sensibles tales como proteínas); (iii) necesidad reducida de cuidado posterior; (iv) bienestar incrementado; y (v) cumplimiento mejorado.

El control óptimo del desprendimiento de fármaco se puede conseguir colocando el fármaco en un material polimérico. Los materiales poliméricos generalmente desprenden fármacos por difusión, reacción química, o activación del disolvente.

El mecanismo de desprendimiento más común es la difusión, por lo que el fármaco migra de su posición inicial en el sistema polimérico a la superficie exterior del polímero y a continuación al cuerpo. La difusión puede ocurrir por medio de un depósito, en el que un núcleo de fármaco está rodeado por una película de polímero, o en una matriz, en la que el fármaco está uniformemente distribuido por el sistema polimérico. Los fármacos se pueden desprender también por reacción química tal como degradación del polímero o escisión del fármaco de una cadena principal de polímero.

Son posibles combinaciones de los mecanismos anteriores. Las velocidades de desprendimiento de sistemas poliméricos se pueden controlar por la naturaleza del material polimérico (por ejemplo, cristalinidad o estructura de poros para sistemas controlados por difusión; la labilidad hidrolíltica de los enlaces o la hidrofobicidad de los monómeros para los sistemas químicamente controlados) y el diseño del sistema (por ejemplo, grosor y forma). La ventaja de tener sistemas con diferentes mecanismos de desprendimiento es que cada uno puede conseguir diferentes objetivos.

Durante muchos años, los sistemas de desprendimiento controlado eran solo capaces de desprender lentamente fármacos de bajo peso molecular (<600). Las moléculas grandes, tales como proteínas, no se consideraban candidatos factibles, porque los polipéptidos se consideraban demasiado grandes para difundirse lentamente a través de la mayoría de los materiales poliméricos, incluso después del hinchamiento el polímero. El descubrimiento de que las matrices de polímeros hidrófobos sólidos que contienen macromoléculas en polvo permitían que moléculas de casi cualquier tamaño se desprendieran durante alrededor de 100 días permitió el suministro controlado de varias proteínas, polisacáridos, y polinucleótidos. Véase Langer, 1990.

Las proteínas y polipéptidos incorporados hasta esta fecha en materiales poliméricos para el desprendimiento controlado son principalmente moléculas efectoras, tales como insulina, como composiciones opuestas para el desprendimiento controlado de moléculas que se unirán y neutralizarán las moléculas efectoras producidas en el cuerpo humano.

El factor \alpha de necrosis tumoral (TNF\alpha) es una potente citoquina que provoca un amplio espectro de respuestas biológicas. el TNF\alpha es citotóxico para muchas células tumorales y se puede usar en el tratamiento del cáncer. El TNF\alpha mejora el crecimiento de fibroblastos y actúa como un agente de remodelación del tejido, siendo de este modo apropiado en la cura de heridas. Induce adicionalmente necrosis hemorrágica de tumores transplantados en ratones, mejora la fagocitosis y la citotoxicidad de neutrófilos polimorfonucleares, y modula al expresión de muchas proteínas, incluyendo lipoproteína lipasa, antígenos de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad, y citoquinas tales como interleuquina-1 e interleuquina-6. Se ha mostrado que el TNF\alpha tiene un efecto contra virus, bacterias y parásitos multicelulares, particularmente intracelulares. Parece que el TNF\alpha es necesario para una respuesta inmune normal, pero grandes cantidades producen drásticos efectos patógenos. El TNF\alpha se ha denominado "caquexina" dado que es el factor predominante responsable del síndrome debilitante (caquexia) asociado a la enfermedad neoplástica y parasitemia. El TNF\alpha es también un serio contribuidor a la toxicidad en sepsis gram-negativa, dado que los anticuerpos contra el TNF\alpha pueden proteger los animales infectados.

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Se ha mostrado que el TNF\alpha está implicado en varias enfermedades, ejemplos de las cuales son el síndrome de distrés respiratorio del adulto, fibrosis pulmonar, malaria, hepatitis infecciosa, tuberculosis, enfermedad inflamatoria intestinal, choque séptico, SIDA, reacción del injerto contra el huésped, enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, esclerosis múltiple y diabetes juvenil, y trastornos de hipersensibilidad de tipo retrasado de la piel.

La evidencia de que algunos de los efectos del TNF\alpha pueden ser perjudiciales para el hospedante ha llamado la atención a los mecanismos que regulan la función del TNF\alpha. Las señales intracelulares para la respuesta al TNF\alpha son proporcionadas por receptores de la superficie celular (de aquí en adelante TNF-R), de dos especies moleculares distintas, a los que se une el TNF\alpha con alta afinidad.

Los TNF-Rs de la superficie celular están expresados en casi todas las células del cuerpo. Los distintos efectos del TNF\alpha, el citotóxico, la promoción del crecimiento y otros, son todos señalados por los receptores de TNF al unirse el TNF\alpha a ellos. Se han descrito dos formas de estos receptores, que difieren en tamaño molecular, 55 y 75 kilodalton, y se denominarán aquí TNF-R p55 y p75, respectivamente. Se debe advertir, sin embargo, que existen publicaciones que se refieren a estos receptores también como TNF-R p60 y p80.

Ambos receptores para TNF\alpha existen no solo en formas unidos a células, sino también en formas solubles, que consisten en los dominios extracelulares escindidos de los receptores intactos, derivados por escisión proteolítica de las formas de la superficie celular. Estos receptores de TNF\alpha solubles (sTNF-Rs) pueden mantener la capacidad de unirse a TNF\alpha y de este modo competir por TNF\alpha con los receptores de la superficie celular y de este modo bloquear la actividad de TNF\alpha. Los sTNF-Rs de este modo funcionan como atenuadores fisiológicos de la actividad de TNF\alpha, protegiendo contra sus efectos potencialmente perjudiciales. Se ha publicado también, sin embargo, que los sTNF-Rs afectan a la función del TNF\alpha también estabilizando su actividad, lo más probablemente previniendo la disociación de su estructura trímera bioactiva a monómeros inactivos (Aderka et al., 1992). De este modo, los sTNF-Rs pueden afectar a la actividad del TNF\alpha de dos modos diferentes: compiten por TNF\alpha con los receptores de la superficie celular y bloquean los efectos perjudiciales del TNF\alpha, o actúan como agentes tampón y estabilizan la actividad el TNF\alpha.

Los dos sTNF-Rs, de aquí en adelante sTNF-R p55 y sTNF-R p75, han sido designados antiguamente proteínas I y II de unión a TNF, o TBPI y TBPII, respectivamente (véase, por ejemplo, los documentos EP 398327, EP 414286, y EP 433900). En la presente solicitud usaremos ambas designaciones sTNF-R p55 o TPPI y sTNF-R p75 o TBPII; con ambas designaciones las proteínas son las mismas.

Los sTNF-Rs están presentes constitutivamente en el suero a concentraciones que se incrementan significativamente en estados de enfermedad tanto inflamatoria como no inflamatoria. El efecto de estas proteínas puede diferir, sin embargo, dependiendo de sus concentraciones en el sito de la acción del TNF\alpha, la relación de su concentración a la concentración local de TNF\alpha, y las velocidades a las que se aclaran los sTNF-Rs y TNF\alpha del sitio de acción del TNF\alpha con relación a la velocidad de decaimiento de la actividad del TNF\alpha. Dependiendo de estos parámetros, los sTNF-Rs, pueden, en diferentes situaciones, afectar a las funciones del TNF\alpha de una manera bastante diferente, inhibiendo los efectos del TNF\alpha, o sirviendo como vehículos para el TNF\alpha o incluso aumentando los efectos del TNF\alpha prolongando su función (Aderka et al, 1992).

La efectividad de los sTNF-Rs como fármacos anti-TNF\alpha puede ser afectada por varios factores diferentes: La afinidad a la que los sTNF-Rs se unen a TNF\alpha, comparada con la afinidad de los receptores de la superficie celular, la accesibilidad de los receptores solubles al sitio de acción del TNF\alpha y la velocidad de aclarado de los receptores solubles y de los complejos que forman con TNF\alpha del sitio de formación del TNF\alpha. Es probable que las formas naturales de los sTNF-Rs actúen de la manera más fisiológicamente relevante. Sin embargo, una seria limitación en su uso es su aclarado bastante rápido de la sangre. Se han realizado varios intentos para mejorar estas moléculas, ejemplos de las cuales son las llamadas "inmunoadhesinas" quiméricas, en las que los sTNF-Rs están unidos a la porción Fc de la molécula de inmunoglobulina (desarrolladas por Hoffman La Roche e Immunex), y sTNF-Rs "PEGulated", en los que los sTNF-Rs están reticulados por medio de moléculas PEG (desarrollados por Synergen). Ambos enfoques dan como resultado la formación de moléculas de sTNF-R divalente que tienen tiempo de aclarado más prolongado y se pueden unir más efectivamente a la molécula de TNF\alpha trivalente. Sin embargo, es probable que sean más inmunogénicos que los receptores solubles naturales, y el aclarado de sus complejos con TNF\alpha de la circulación puede que no ocurra con suficiente eficiencia.

Muchos efectos perjudiciales del TNF\alpha son el resultado de la formación crónica de esta citoquina en ciertos lugares distintos en el cuerpo. Una seria limitación prevista del uso de formas solubles de receptores de TNF para la defensa contra tales estados patológicos es la dificultad de mantener una concentración terapéuticamente efectiva de los receptores solubles, durante duraciones prolongadas, en sitios de necesidad.

El documento WO 90/05522 se refiere a una preparación farmacéutica que comprende una combinación de una o varias receptores/proteínas de unión (factores de crecimiento de unión u hormonas) y ácido hialurónico (o sus derivados) o un polímero biodegradable, opcionalmente en combinación con su(s) ligando(s) (factores de crecimiento y hormonas).

El documento WO 94/06476 describe un método para tratar enfermedades inflamatorias dependientes de TNF en un mamífero administrando un antagonista de TNF, tal como TNFR soluble.

Sumario de la invención

Es un objetivo de la presente invención desarrollar nuevos enfoques para aplicaciones terapéuticas de formas solubles de receptores para afectar las funciones de sus ligandos, por ejemplo, para protección contra los efectos perjudiciales de sus ligandos, particularmente sistemas que permiten el desprendimiento local del receptor soluble en el cuerpo, a una velocidad constante y durante larga duración. Estos enfoques están basados en la incorporación del receptor soluble en materiales poliméricos biocompatibles, que son implantados o inyectados en compartimentos corporales deseados. Las matrices de polímeros que contienen el receptor soluble permiten el desprendimiento local y controlado del receptor soluble, en su forma natural.

De este modo, otro objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo enfoque para aplicaciones terapéuticas de receptores de TNF\alpha solubles para afectar a los efectos del TNF\alpha, por ejemplo, para protección contra los efectos del TNF, que implica sistemas de desprendimiento controlado.

La presente invención proporciona de este modo el uso de una matriz polimérica biocompatible que tiene un receptor de TNF\alpha soluble incorporado en ella, en el que dicho receptor se incorpora en dicho material polimérico de tal manera para permitir el desprendimiento controlado de una cantidad de receptor de TNF\alpha soluble efectiva para mejorar los efectos perjudiciales del TNF\alpha para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos en los que se requiere la mejora de los efectos perjudiciales del Factor \alpha de Necrosis Tumoral.

Los ejemplos de materiales poliméricos biocompatibles que se pueden usar en las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a, polímeros no degradables biocompatibles seleccionados del grupo que comprende copolímeros de etileno y acetato de vinilo (EVAc), cauchos de silicona, polisacáridos tales como celulosa, poliamidas, poliacrilatos, polietilenos, poliuretanos, poliisobutileno, y polifosfacenos, y polímeros biodegradables seleccionados del grupo que comprende poliésteres, polianhídridos, poliortoésteres, policaprolactona, pseudopoliaminoácidos, polipéptidos, gelatina, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico (PLGA).

En una realización preferida, se incorpora un receptor de TNF\alpha soluble (sTNF-R) a un material polimérico apropiado, tal como una matriz de poli(etileno-acetato de vinilo), o en microesferas de poli(ácido láctico-glicólico).

Las composiciones farmacéuticas pueden contener el sTNF-R p55 o el sTNF-R p75. En una realización preferida, la composición contiene el sTNF-R p55 (TBPI).

En una realización, las composiciones farmacéuticas son para uso en el tratamiento de trastornos en los que se desea protección contra los efectos perjudiciales del ligando TNF\alpha. Las matrices poliméricas que contienen los sTNF-Rs se colocan en compartimentos corporales deseados, permitiendo de este modo el mantenimiento del sTNF-R en el cuerpo constantemente y durante larga duración.

En otra realización, la invención comprende el tratamiento de un paciente para proteger a dicho paciente de los efectos perjudiciales de un ligando TNF\alpha, que comprende administrar a dicho paciente la composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del receptor soluble apropiado, sTNF-R, en forma de desprendimiento controlado.

En una realización adicional, la invención se refiere al tratamiento del cáncer, que comprende administrar en el sitio del tumor de un paciente que lo necesite, la composición farmacéutica que comprende un complejo TNF\alpha/sTNF-R en una forma de desprendimiento controlado.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra el efecto del tamaño de partícula en el desprendimiento acumulativo de TBPI. Las partículas de polvo de TBPI + BSA de tres intervalos de tamaño se incorporaron en matrices de copolímero de etileno-acetato de vinilo (EVAc) al 30% de carga: (i) <75 \mum (rombos rellenos); (ii) 75-250 \mum (cuadrados vacíos), y (iii) 250-425 \mum (círculos rellenos).

La Fig. 2 muestra el efecto de la carga sobre el desprendimiento acumulativo de TPBI. Las matrices de EVAc con cargas de TBPI + BSA se prepararon usando el intervalo de tamaño de partícula de 75-250 \mum: (i) 10% de carga (rombos rellenos); (ii) 30% de carga (cuadrados vacíos), y (iii) 50% de carga (círculos rellenos).

La Fig. 3 muestra el porcentaje de desprendimiento acumulativo de receptor I de TNF\alpha (TBPI) solo o incorporado conjuntamente con seroalbúmina bovina (BSA) de microesferas de: (i) poli(ácido láctico-glicólico) (PLGA) 75:25 (círculos vacíos y rellenos, respectivamente); (ii) PLGA 50:50 (cuadrados vacíos y rellenos, respectivamente); y (iii) poli(ácido L-láctico) (PLLA) (triángulos vacíos y cerrados, respectivamente).

Las Figs. 4a-c muestran resultados in vivo de ratones Balb sin pelo inoculados con células de ovario de hámster chino (CHO) que producen TNF (CHO/TNF) y tratados con TBPI o con anticuerpo monoclonal anti-TNF de ratón TNF-1 (Ab), en las que:

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La Fig. 4a es una representación gráfica del peso medio del grupo (g) de ratones Balb sin pelo tratados con: (i) TBPI en matriz de EVAc implantada subcutáneamente (círculos rellenos); (ii) TBPI en implante de PLGA 75:25 (círculos rellenos); (iii) anticuerpo anti-TNF inyectado una vez, cinco días después de la inoculación de los ratones con células de CHO/TNF (Ab una vez) (cuadrados rellenos); (iv) anticuerpo anti-TNF inyectado dos veces, cinco días después de la inoculación de ratones con células CHO/TNF y una semana después (Ab dos veces) (cuadrados vacíos); y (v) control sin ningún tratamiento (triángulos rellenos);

La Fig. 4b representa los resultados de una evaluación in vitro de los niveles de TNF\alpha bioactivo en sueros de ratones. Los sueros se recogieron de ratones que tenían células de ovario de hámster chino (CHO) que producen TNF\alpha en los periodos de tiempo indicados después del implante de TBPI en EVAc (círculos rellenos) o de TBPI en PLGA 75:25 (círculos vacíos), o de la inyección de anticuerpo anti-TNF\alpha inyectado una vez (cuadrados rellenos) o dos veces (cuadrados vacíos) como en la figura 4a, así como de ratones no tratados (triángulos rellenos), la bioactividad del TNF\alpha en los sueros se determinó aplicándolos a una dilución de 1:10 a células MHA2 cultivadas (un derivado de células HeLa, 24 horas después de sembrarlas a 3 x 10^{4} células por micropocillo de 9 mM ) durante 10 horas, en presencia de cicloheximida (25 \mug/ml), seguido de la evaluación de la viabilidad celular por el método de captación de rojo neutro (Wallach et al., 1984); y

La Fig. 4c representa las curvas de supervivencia para ratones tratados con: (i) TBPI en implante de EVAc (cuadrados vacíos); (ii) TBPI en implante de PLGA 75:25 (círculos rellenos); (iii) anticuerpo anti-TNF\alpha una vez (triángulos vacíos; (iv) anticuerpo anti-TNF\alpha dos veces (triángulos vacíos; y (v) control, sin ningún tratamiento (círculos vacíos).

La Fig. 5 muestra el efecto del implante de matrices de EVAc que contienen TBPI en diferentes sitios del cuerpo del ratón en el desprendimiento de la concentración de TBPI: cuello (círculos rellenos), espalda (círculos vacíos), y estómago (cuadrados rellenos).

La Fig. 6 es una representación gráfica de la hinchazón de las articulaciones del tobillo (mm) que muestra la progresión de la artritis en diferentes etapas de desarrollo de una progenie de ratones artríticos Tg 197 transgénicos tratados con implantes de EVAc que comprende TBPI (columnas negras), EVAc solo (columnas grises) o sin tratar (control) (columnas blancas).

La Fig. 7 es una representación gráfica de la hinchazón de las articulaciones del tobillo (mm) que muestra la progresión de la artritis en diferentes etapas de desarrollo de una progenie de ratones artríticos Tg 197 transgénicos tratados con anticuerpos anti-TNF\alpha una vez a la semana durante la duración del experimento (65 días) (columnas negras) y una vez a la semana durante dos semanas (columnas grises) o sin tratar (control) (columnas blancas).

La Fig. 8. es una representación gráfica del peso (g) medio del grupo de ratones transgénicos Tg 211 que expresan mRNA de TNF\alpha humano en células T, tratados con implantes de EVAc que comprende TBPI (círculos rellenos), EVAc solo (círculos vacíos) o sin tratar (control) (cuadrados rellenos).

La Fig. 9. es una representación gráfica del peso (g) medio del grupo de ratones transgénicos Tg 211 tratados con anticuerpos anti-TNF\alpha una vez a la semana durante la duración del experimento (50 días) (triángulos rellenos) y una vez a la semana durante 2 semanas (triángulos vacíos) o sin tratar (control) (columnas blancas).

La Fig. 10 representa las curvas de supervivencia para ratones transgénicos Tg 211 tratados con implantes de EVAc que comprende TBPI (círculos rellenos) y EVAc solo (círculos vacíos) o sin tratar (control) (cuadrados rellenos).

La Fig. 11 representa las curvas de supervivencia para ratones transgénicos Tg 211 tratados con anticuerpo anti-TNF\alpha una vez a la semana durante 65 días (círculos rellenos), y una vez a la semana durante 2 semanas (círculos vacíos) o sin tratar (control) (cuadrados rellenos).

Descripción detallada de realizaciones preferidas

La presente invención proporciona desprendimiento controlado de receptores solubles de TNF\alpha.

En una realización preferida, las composiciones de la invención comprenden sTNF-Rs que se pueden obtener de fuentes naturales, tales como orina humana (Engelmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Olson et al., 1988, y Seckinger et al., 1989) o por técnicas recombinantes (documento EP 433900; Nophar et al, 1990; Schall et al., 1990, y Loetscher et al., 1990), y a continuación purificar como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 308378 y EP 398327.

Tal como se usan aquí, los términos "sTNF-Rs", "sTNF-R p55", "sTNF-R p75", se refieren a todos los sTNFs de fuentes naturales u obtenidos por técnicas de ADN recombinante, que incluyen pero no están limitados a las proteínas I y II de unión a TNF descritas en los documentos EP 308378 y EP398327.

Los polímeros que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, polímeros no degradables biocompatibles seleccionados de copolímeros de etileno y acetato de vinilo, cauchos de silicona, polisacáridos tales como celulosa, poliamidas, poliacrilatos, polietilenos, poliisobutileno, poliuretanos y polifosfacenos, y polímeros biodegradables seleccionados de poliésteres, poliortoésteres, policaprolactona, polipéptidos, pseudopoli(aminoácidos), gelatina, polianhídridos, poli(ácido L-láctico), poli(ácido D-láctico), poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido glicólico) y copolímeros seleccionados de poli(ácido L-láctico-ácido glicólico), poli(ácido D-láctico-ácido glicólico), poli(ácido D,L-láctico-ácido glicólico), poli(ácido L-láctico-ácido D-láctico, y poli(ácido L-láctico-ácido D,L-láctico.

Los polímeros preferentemente usados en la presente invención son copolímeros de etileno-acetato de vinilo (EVAc), copolímeros poli(ácido láctico-glicólico) (PLGA) y poli(ácido L-láctico) (PLLA).

Una composición farmacéutica que comprende sTNF-R incorporado en una matriz de EVAc se puede preparar de EVAc comercialmente disponible, después de purificación, si es necesario, por ejemplo, por disolución y colada como se describe por Rhine et al., 1980. Estas matrices constituyen sistemas controlados por difusión que permiten la distribución uniforme de la proteína, cinéticas reproducibles y desprendimiento prolongado de sTNF-R biológicamente activo durante un periodo de semanas o incluso meses. Como el EVAc es un polímero biocompatible pero no degradable, las matrices de EVAc son apropiadas para su uso en aplicaciones en las que se requiere o desea un suministro de fármaco prolongado.

Como el principio activo se desprende de materiales poliméricos no degradables tales como EVAc por medio de difusión a través de canales en la matriz, la difusión se mejora con una más alta carga de proteína. De este modo, en una realización preferida, la proteína activa se combina con una proteína neutra que no afecta a la respuesta biológica a la proteína activa para incrementar la carga de proteína total. Los ejemplos de tales proteínas neutras son seroalbúmina bovina (aunque esta no es preferida para el uso humano), albúmina humana, mioglobina, hemoglobina, etc.

En una composición farmacéutica según la invención que comprende sTNF-R incorporado en un polímero biodegradable seleccionado del grupo que comprende poli(ácido L-láctico), poli(ácido glicólico), y sus copolímeros, se mezclan comercialmente disponibles homopolímeros o copolímeros de ácido láctico y/o ácido glicólico en forma de microesferas, apropiadas tanto para la aplicación como implantes o como inyecciones. Las microesferas se pueden preparar, por ejemplo, por el método de evaporación de disolvente modificado usando una emulsión doble como se describe en Cohen et al., 1991. Como estos polímeros son biodegradables, el implante se puede inyectar fácilmente, evitando el uso de procedimientos quirúrgicos y la necesidad de retirar el dispositivo después de que se ha agotado el fármaco. El agente activo se desprende por cinéticas de desprendimiento controlables y predecibles. El sistema permite el desprendimiento controlado del ingrediente activo durante un periodo de semanas o incluso meses.

La composición farmacéutica de la invención que comprende un sTNF-R se puede usar para neutralizar los efectos perjudiciales del TNF\alpha en enfermedades agudas, tales como choque séptico, enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), malaria, hepatitis infecciosa, tuberculosis, o en enfermedades crónicas, tales como caquexia asociada al cáncer, GVHD crónica, o en enfermedades autoinmunes, por ejemplo, artritis reumatoide, diabetes juvenil, lupus eritomatoso sistémico y esclerosis múltiple, o en trastornos de hipersensibilidad de tipo retrasado de la piel.

La composición farmacéutica de la invención se puede administrar por cualquier modo apropiado para el suministro controlado del sTNF-R, como implantes, o en forma de inyecciones locales, por ejemplo, inyección intra-articular dada en el fluido sinovial de las cavidades de la articulación en el tratamiento de artritis reumatoide, o inyección intratecal dada en el fluido cerebroespinal en el tratamiento de la esclerosis múltiple, o formulaciones tópicas, por ejemplo, lociones, para el tratamiento de trastornos de la piel. Las composiciones para el tratamiento de artritis reumatoide pueden comprender otros agentes antiinflamatorios, y las composiciones para el tratamiento de esclerosis múltiple pueden comprender otros agentes contra esclerosis múltiple, por ejemplo, beta-interferón y Copolímero-1 (Cop-1).

La composición de la invención que comprende sTNF-R estará diseñada de este modo para suministrar en el cuerpo una cantidad de sTNF-R suficiente para bloquear la acción del TNF\alpha. En el caso de las enfermedades autoinmunes, la composición se diseñará de tal modo que suministre una cantidad de sTNF-R que sea suficiente para afectar al curso y severidad de la enfermedad autoinmune y para mejorar el estado del paciente, conduciendo a la reducción o remisión de la enfermedad. La cantidad efectiva dependerá de la ruta de administración, la enfermedad que se va a tratar y el estado del paciente. La determinación del nivel de sTNF-R p55 o sTNF-R p75 en el suero u otro fluido corporal apropiado del paciente por métodos conocidos (para ELISA, véase Aderka et al., 1991), puede ayudar a establecer una dosis apropiada para dicho paciente, considerando que el sTNF-R exógenamente administrado puede complementar el sTNF-R endógenamente formado para neutralizar la actividad perjudicial del TNF\alpha.

La invención se ilustrará ahora por medio de los siguientes ejemplos y los dibujos adjuntos.

Ejemplos Materiales y métodos

Materiales. Se usó PLGA, 50:50, viscosidad inherente (i.v.) de 0,51 dl/g, y 75:25, i.v. de 0,48 dl/g, y PLLA (poli(ácido L-láctico), i.v. de 0,64 dl/g (ambos de PURAC Biochem BV, Holanda). Se usaron tal como se recibieron copolímero de etileno-acetato de vinilo (EVAc), (40% de acetato de vinilo) (Dupont), seroalbúmina bovina (BSA) (Sigma Chemical Col, USA), poli(alcohol vinílico) (PVA) de peso molecular medio 77000-79000, 88% hidrolizado (Aldrich Chemical Co.) y TBPI (sTNF-R p55) (InterPharm Laboratories Ltd., Israel). El anticuerpo anti-TNF\alpha designado TNF-1 es un anticuerpo monoclonal de ratón generado contra TNF\alpha recombinante humano en el laboratorio de uno de los presentes inventores (D. Wallach).

Métodos. Se obtuvieron perfiles de desprendimiento in vitro colocando las matrices de suministro de fármaco en disolución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) contenida en un vial y agitada en un baño agitador. Las muestras se tomaron periódicamente y se analizaron para ver el TBPI por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para TBPI, como se describe por Aderka et al., 1991.

La eficacia in vivo de los sistemas poliméricos se examinó en tres modelos: (i) Ratones implantados con células tumorales que producen TNF\alpha (CHO/TNF) como se describe por Oliff et al., 1987, que exhiben caquexia severa que conduce a la muerte. (ii) Ratones Tg197 transgénicos que previsiblemente desarrollen artritis, tal como se describe por Keffer et al., 1991. (iii) Ratones Tg211 transgénicos que expresan mARN de TNF\alpha humano en células T y desarrollan pronunciados cambios histológicos y un síndrome debilitante letal, como se describe por Probert et al., 1993.

Ejemplo 1 Desprendimiento controlado de sTNF-R p55/TBPI de matrices de EVAc

Se disolvió copolímero de etileno-acetato de vinilo (40% en peso de acetato de vinilo) en cloruro de metileno para dar una disolución al 10% (peso/v). La disolución de TBPI se añadió a polvo de seroalbúmina bovina (BSA) disuelto en agua doblemente destilada. La mezcla se liofilizó (24 h, a 5 micras de Hg y -70ºC, Liofilizador, Lab Conco) en forma de polvo. El polvo de TBPI + BSA se tamizó para dar partículas de <75, 75-250, o 250-425 \mum. Una cantidad pesada de polvo de un único intervalo de tamaños se añadió a 15 ml de la disolución de polímero en un vial de vidrio, y la mezcla se vertió rápidamente en el centro de un molde de teflón nivelado de discos (1 cm de diámetro y 0,5 cm de grosor), que se había enfriado previamente en hielo seco durante 5 minutos. Durante el enfriamiento previo, el molde estaba cubierto con una placa de vidrio para prevenir la formación de exceso de escarcha. Después de que se vertió la mezcla, el molde permaneció sobre el hielo seco durante 10 minutos, y la mezcla se congeló. (El molde se cubrió de nuevo durante los últimos 7 minutos de esta etapa). El pedazo congelado se levantó fácilmente con una espátula fría, se transfirió a un tamiz metálico, y se mantuvo a -20ºC durante 2 días. El disco a continuación se secó durante 2 días más a temperatura ambiente en un desecador bajo una línea de vacío casera suave (600 mtorr). El secado provocó que los discos se encogieran hasta \approx 0,5 cm de diámetro y 0,1-0,2 cm de grosor.

Los sistemas de suministro polimérico se sumergieron en medio de PBS. Se prepararon matrices de EVAc en forma de discos de 0,5 cm de diámetro y grosor de 1-2 mm que contienen 22,35 \mug de TBPI en cada disco para experimentos in vivo. Para experimentos in vitro, los discos contenían 4,47, 13,41 o 22,35 \mug de TBPI (10%, 30% y 50% de carga). El desprendimiento del TBPI se detectó por ELISA para TBPI como función del tiempo (Aderka et al. 1991).

Las Figs. 1 y 2 muestran el efecto del tamaño de partícula del fármaco y la carga sobre la cinética de desprendimiento de matrices de EVAc. El tamaño de partícula afectó significativamente a las velocidades de desprendimiento de fármaco. Un incremento del tamaño de partícula incrementó las velocidades de desprendimiento (Fig. 1). El incremento de carga de fármaco incrementó uniformemente las velocidades de desprendimiento de fármaco (Fig. 2). No solo se incrementó el desprendimiento de fármaco total, sino que también se incrementaron las velocidades de desprendimiento.

El tamaño de partícula del fármaco y la carga afectaron profundamente a la cinética del desprendimiento de los sistemas de suministro polimérico macromolecular. Debido a que las macromoléculas son demasiado grandes para difundirse a través de la película de polímero, es posible que el desprendimiento sostenido ocurra vía difusión a través de canales en la matriz. La incorporación de las macromoléculas durante la colada puede introducir algunos canales a través de los cuales se puede difundir el fármaco disuelto. Los incrementos de la velocidad de desprendimiento provocados por los incrementos de tamaño de partícula pueden ser el resultado de la formación de mayores canales de poros en la matriz polimérica. Similarmente, las cargas incrementadas pueden proporcionar caminos más simples (menor tortuosidad) y mayor porosidad para la difusión, ambos facilitarían el movimiento de agua o PBS dentro, y proteína fuera de, la matriz.

Ejemplo 2 Desprendimiento controlado de sTNF-R p55 (TBPI) de microesferas de PLGA y PLLA

Se prepararon microesferas de poli(ácido láctico-glicólico) (PLGA) o poli(ácido L-láctico) (PLLA) por un método de evaporación de disolvente modificado usando una doble emulsión como se describe por Cohen et al., 1991. Brevemente, la disolución de TBPI o el polvo de TBPI y BSA (preparado como se describe en el Ejemplo 1 anteriormente), que se disolvió en agua doblemente destilada, se vertieron en PLGA o PLLA disuelto en cloruro de metileno. La mezcla se sonicó con sonda (modelo VC-250, Sonic & Materials Inc.) durante 30 s para formar la primera emulsión interna (W1/0). La emulsión se vertió, con mezcla vigorosa usando barra magnética, en 2 ml de poli(alcohol vinílico) al 1% (PVA) saturado con cloruro de metileno para formar la segunda emulsión ((W1/0)W2). La doble emulsión resultante se vertió en 200 ml de PVA al 0,1% y se agitó continuamente durante 3 h a temperatura ambiente hasta que se evaporó la mayor parte del cloruro de metileno, dejando microesferas sólidas. Las microesferas se recogieron por centrifugación (1000 g durante 10 min), se tamizaron usando tamices con aperturas de 100 \mum y se liofilizaron (16 h, Liofilizador, Lab Conco) en forma de un polvo. A menos que se especifique, se realizaron estudios con PLGA con una relación de 75:25 y 50:50 (L/G) y PLLA.

Los sistemas de suministro polimérico se sumergieron en PBS, se evaluaron en cada experimento 0,04 g de microesferas de PLGA o PLLA que contienen 18,2 \mug de TBPI, y se detectó el desprendimiento de TBPI por ELISA como función del tiempo.

La Fig. 3 muestra el porcentaje de desprendimiento acumulativo de TBPI de diferentes copolímeros PLGA (50:50 o 75:25) o microesferas de PLLA. Se puede ver que incluso después de 2.200 horas, se había desprendido solo el 10 por ciento del TBPI que se incorporó en las microesferas. También se muestra en este gráfico que el porcentaje de desprendimiento acumulativo de TBPI de polímeros en los que se añadió TBPI junto con BSA (TBP+BSA) (círculos, cuadrados y triángulos rellenos) es más alto que el de las muestras en las que se añadió TBPI sin BSA (círculos, cuadrados y triángulos vacíos).

Ejemplo 3 El TBPI desprendido de matrices poliméricas retiene su actividad biológica in vivo en ratones inoculados con células CHO/TNF\alpha

Como modo de seguir los efectos perjudiciales crónicos del TNF\alpha, se usó en el experimento un modelo animal bien conocido para el efecto caquéxico del TNF\alpha, es decir, ratones balb sin pelo implantados con células tumorales que producen TNF\alpha (CHO/TNF\alpha), como se describe por Oliff et al., 1987.

Se inocularon células CHO/TNF\alpha a ratones Balb sin pelo subcutáneamente (Kon et al., 1988) para conseguir caquexia. Las inoculaciones se llevaron a cabo usando suspensiones de líneas celulares recientemente tripsinizadas a una concentración de 1 x 10^{7} células/ml (1 ml/ratón). Las inyecciones se realizaron vía agujas de calibre 23 en jeringuillas de plástico de 3 cm^{3}. Las células se inyectaron subcutáneamente en la espalda, cuello o región del abdomen. Se obtuvieron muestras de suero varias veces cada semana por sangrado de la cola. El rendimiento de los sistemas poliméricos, implantados cinco días después de la inoculación de los ratones con células CHO/TNF\alpha, se evaluó siguiendo los niveles de TBPI y TNF\alpha en sangre, la disminución de peso y la mortalidad.

Las matrices poliméricas según los Ejemplos 1 y 2 anteriores se implantaron o inyectaron en los ratones Balb sin pelo cinco días después de la inoculación de los ratones subcutáneamente con células CHO que producen TNF\alpha para conseguir caquexia y se evaluó su rendimiento siguiendo los niveles de TBPI y TNF\alpha en sangre (ELISA). Los parámetros examinados fueron: (1) actividad biológica de TBPI como función del tiempo; (2) comparación de tratamientos de TBPI con el tratamiento con anticuerpos de ratón contra TNF\alpha humano (generados en laboratorios de los inventores y denominados TNF-1) inyectados una vez (cinco días después de la inoculación de ratones con células CHO/TNF\alpha, marcados como Ab-(una vez)) o dos veces por intervalo de una semana entre sí (cinco días después de la inoculación de ratones con células CHO/TNF\alpha y una semana más tarde, marcados como Ab-(dos veces)); (3) el progreso de la caquexia con respecto al peso medio del grupo y la mortalidad de los ratones; y (4) el sitio de implantación (subcutánea en el cuello, espalda o estómago).

El TNF\alpha puede provocar caquexia, y puede inducir pérdida de peso progresiva en animales que tienen tumores. La eficacia in vivo de las matrices se examinó en ratones implantados con células tumorales que producen TNF\alpha. Los ratones inyectados con 1 x 10^{7} células CHO/TNF\alpha que producen constitutivamente TNF\alpha en altos niveles, exhibieron severa caquexia y pérdida de peso, que condujo a la muerte. Los ratones a los que, además, se les implantaron matrices de polímeros que contienen TBPI, incrementaron su peso corporal sin mortalidad, indicando que el TBPI desprendido de las matrices proporcionó protección duradera contra el TNF\alpha.

Para evaluar la actividad biológica del TBPI en los ratones que tienen tumores, se recogieron muestras de suero en varios puntos de tiempo y se estimó la bioactividad del TNF\alpha en ellos determinando su citotoxicidad para células MHA2 (un derivado de células HeLa que son sensibles a TNF\alpha). Como se muestra en la Fig. 4b, la inoculación de las matrices que contienen TBPI dio como resultado una prolongada y significativa reducción de la bioactividad del TNF\alpha en suero, indicando que el TBPI desprendido de las matrices inhibe fuertemente la unión del TNF\alpha a los receptores de TNF\alpha de la superficie celular en las células MHA2.

Para comparación, se inyectaron anticuerpos para TNF\alpha en ratones una vez (cinco días después de la inoculación en los ratones de células CHO/TNF\alpha, marcados como Ab-una vez) o dos veces (cinco días después de la inoculación en los ratones de células CHO/TNF\alpha y una semana más tarde, marcados como Ab-dos veces). Como se muestra en la Fig. 4a, los anticuerpos afectaron al peso de los ratones solo durante unos pocos días desde el momento de la inyección (los ratones mantuvieron su peso corporal), y a continuación desarrollaron un debilitamiento progresivo, aunque el TBPI, cuando se incorpora en polímeros, estaba presente en el cuerpo durante mucho tiempo.

La corta duración del efecto de los anticuerpos anti-TNF\alpha (TNF-1) inyectados se manifiesta también en el patrón de bioactividad del TNF\alpha en el suero de los ratones inyectados con anticuerpos, como se muestra en la Fig. 4b.

En la Fig. 4c se puede ver que los ratones tratados con sistemas poliméricos que permiten el desprendimiento controlado y localizado de TBPI, sobrevivieron durante más de 50 días, en contraste con los ratones tratados con los anticuerpos TNF-1, que no sobrevivieron y desarrollaron caquexia cuando se detuvieron las inyecciones de anticuerpos.

Estos resultados indican que el tratamiento basado en el suministro controlado polimérico de TBPI previene el desarrollo del síndrome debilitante, y puede ser preferido a la inyección de anticuerpos para TNF\alpha, dado que elimina la necesidad de inyectar cada semana y proporciona protección más duradera contra el TNF\alpha. Además, siendo moléculas naturales, los receptores de TNF\alpha solubles son más apropiados para uso prolongado. Los anticuerpos anti-TNF\alpha más tarde o más temprano generarán anticuerpos contra ellos, que evitarán su acción, y por lo tanto no son apropiados para uso prolongado. Esto es cierto también para anticuerpos humanos o humanizados, que generarán anticuerpos anti-idiotípicos que bloquearán su función.

No hay diferencia significativa en la cinética del desprendimiento de TBPI de matrices de EVAc implantadas en el cuello, espalda o estómago de ratones, como función del sitio de implantación de las matrices (Fig. 5). La cinética del desprendimiento de TBPI es constante a lo largo de toda la duración del desprendimiento.

Ejemplo 4 El TBPI desprendido de matrices poliméricas retiene su actividad biológica in vivo en ratones Tg197 artríticos transgénicos

El rendimiento de las matrices de EVAc preparadas según el Ejemplo 1 (implantadas subcutáneamente con cirugía mínima 14 días después del nacimiento) en ratones Tg197 transgénicos se evaluó siguiendo los niveles de hinchazón de las articulaciones del tobillo. La enfermedad era evidente a alrededor de 4-6 semanas de edad con hinchazón de las articulaciones del tobillo. La hinchazón adicional de las articulaciones y el impedimento del movimiento de la pata progresó hasta la pérdida total del movimiento de las patas traseras a alrededor de 9-10 semanas de edad. Además, la pérdida progresiva de peso era una característica común en estos ratones. El tratamiento de estos ratones artríticos con matrices de EVAc que contienen TBPI, sin embargo, previno completamente la hinchazón de las articulaciones del tobillo (Fig. 6). Además, los animales tratados se desarrollaron normalmente y no mostraron signos de artritis o pérdida de peso incluso después de 10 semanas de edad.

Para comparación, se inyectó a ratones 14 días después del nacimiento anticuerpos anti-TNF-1 una vez a la semana para toda la duración del tratamiento (65 días), o una vez a la semana durante 2 semanas. Como se muestra en la Fig. 7, los anticuerpos afectaron a la hinchazón solo si se administraron una vez a la semana durante toda la duración del experimento (columnas negras). Los ratones que fueron inyectados cada semana se desarrollaron normalmente y no mostraron signos de artritis o pérdida de peso incluso pasadas 10 semanas de edad, cuando el impedimento del movimiento es una característica macroscópica común en estos ratones. Sin embargo, los ratones que fueron inyectados una vez a la semana durante 2 semanas desarrollaron hinchazón de las articulaciones del tobillo y el impedimento del movimiento de la pata progresó hasta la pérdida completa del movimiento de las patas traseras a alrededor de 9-10 semanas de edad con pérdida progresiva de peso.

Estos resultados indican que el tratamiento basado en el suministro polimérico controlado de TBPI previene completamente el desarrollo de artritis en ratones, y puede ser preferido a inyecciones de anticuerpos para hTNF\alpha, dado que proporciona protección duradera contra TNF\alpha y elimina la necesidad de inyección cada semana.

Ejemplo 5 El TBPI desprendido de matrices poliméricas retiene su actividad biológica in vivo en ratones Tg211 transgénicos

Los ratones Tg211 transgénicos que expresan mARN de TNF humano en células T desarrollaron pronunciados cambios histológicos y un síndrome debilitante letal. El rendimiento de los sistemas poliméricos que contienen TBPI, implantados 14 días después del nacimiento, se avaluó siguiendo la disminución de peso y la mortalidad. Los animales individuales se pesaron varias veces cada semana. Las matrices de EVAc se implantaron subcutáneamente con cirugía mínima.

Como se muestra en las Figs. 8 y 10, los ratones sin tratar (grupo de control: cuadrados rellenos) desarrollaron una severa pérdida de peso progresiva, que condujo a la muerte, mientras que los ratones que fueron implantados con matrices de EVAc que contienen TBPI (círculos rellenos), incrementaron su peso corporal y sobrevivieron durante toda la duración del experimento.

Para comparación, los ratones fueron inyectados 14 días después del nacimiento con anticuerpos TNF-1 una vez a la semana durante toda la duración del experimento, o una vez a la semana durante 2 semanas. Como se muestra en la Fig. 9, la administración de anticuerpos anti-TNF\alpha previno completamente el desarrollo del síndrome debilitante si se administran desde el nacimiento cada semana. Sin embargo, si se administran solo una vez a la semana durante 2 semanas, no fueron efectivos, y los ratones desarrollaron el síndrome debilitante que condujo a la muerte, como se muestra en la Fig. 11.

Estos resultados indican que el tratamiento basado en el suministro polimérico controlado de TBPI previene completamente el desarrollo del síndrome debilitante en ratones, y puede ser preferido a la inyección de anticuerpos para hTNF\alpha.

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Los resultados in vivo indican que el TBPI desprendido retiene su actividad biológica, como se muestra por el cambio del peso medio del grupo (Fig. 4a) y el alto porcentaje de células MHA2 vivas que son sensibles al TNF\alpha (Fig. 4b).

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Referencias

1. Aderka D. et al., Cancer Res., 51:5602-5607 (1991).

2. Aderka D. et al., J. Exp. Med., 175:323-329 (1992).

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16. Wallach D. et al., J. Immunol., 132:2464-69 (1984).

Claims (24)

1. El uso de una matriz polimérica biocompatible que tiene un receptor de TNF\alpha soluble incorporado en ella, en el que dicho receptor está incorporado en dicho material polimérico de tal manera como para permitir el desprendimiento controlado de una cantidad de receptor de TNF\alpha soluble efectiva para mejorar los efectos perjudiciales del TNF\alpha para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos en los que se requiere la mejora de los efectos perjudiciales del Factor-\alpha de Necrosis Tumoral.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicha matriz polimérica es un polímero no degradable biocompatible seleccionado del grupo que consiste en copolímeros de etileno-acetato de vinilo (EVAc), cauchos de silicona, polisacáridos, poliamidas, poliacrilatos, polietilenos, poliuretanos, poliisobutileno, y polifosfacenos.

3. El uso según la reivindicación 1, en el que dicha matriz polimérica es un polímero no degradable biocompatible seleccionado del grupo que consiste en poliésteres, polianhídridos, poliortoésteres, policaprolactona, pseudopoliaminoácidos, polipéptidos, gelatina, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), y copolímeros poli(ácido láctico-glicólico) (PLGA).

4. El uso según la reivindicación 2, en el que el polímero es poli(etileno-acetato de vinilo).

5. El uso según la reivindicación 3, en el que el polímero es poli(ácido láctico-glicólico).

6. El uso según la reivindicación 1, en el que el receptor de TNF\alpha soluble es el receptor de TNF\alpha p55 soluble (sTNF-R p55).

7. El uso según la reivindicación 1, en el que el receptor de TNF\alpha soluble es el receptor de TNF\alpha p75 soluble (sTNF-R p75).

8. El uso según la reivindicación 1, para el tratamiento del choque séptico.

9. El uso según la reivindicación 1, para el tratamiento de la caquexia asociada al cáncer.

10. El uso según la reivindicación 1, para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

11. El uso según la reivindicación 10, para el tratamiento de artritis reumatoide.

12. El uso según la reivindicación 11, que comprende adicionalmente un agente antiinflamatorio.

13. El uso según la reivindicación 10, para el tratamiento de la esclerosis múltiple.

14. El uso según la reivindicación 13, que comprende un agente adicional para el tratamiento de la esclerosis múltiple.

15. El uso según la reivindicación 10, para el tratamiento del lupus eritomatoso sistémico.

16. El uso según la reivindicación 1, para el tratamiento de la reacción del injerto contra el huésped.

17. El uso según la reivindicación 1, para el tratamiento de trastornos de hipersensibilidad de tipo retrasado de la piel.

18. El uso según la reivindicación 4, en la forma de un implante.

19. El uso según la reivindicación 5, en la forma de un implante.

20. El uso según la reivindicación 5, en la forma de una inyección.

21. El uso según la reivindicación 18, para inyección local en el fluido sinovial para el tratamiento de la inflamación de la articulación en artritis reumatoide.

22. El uso según la reivindicación 18, para la inyección intratecal en el fluido cerebroespinal para el tratamiento de esclerosis múltiple.

23. El uso según la reivindicación 17, para aplicación tópica.

24. El uso según la reivindicación 14, en el que dicho agente adicional es interferón beta o Copolímero-1.