NO328034B1 - Farmasoytiske sammensetninger for kontrollert frigjoring av TNF-alfa - Google Patents

Abstract

Farmasøytisk sammensetning for kontrollert frigjøring innbefattende et biokompatibelt polymert materiale, fortrinnsvis polyetylenvinylacetat eller poly(melkesyreglykolsyre), og som har inkorporert deri en oppløselig reseptor som er i stand til å binde til sin ligand og således påvirke ligandens funksjon. Den oppløselige reseptor er fortrinnsvis den oppløselige form av TNFα-reseptor. Slike sammensetninger er egnet for bruk ved behandling av lidelser hvor nøytralisering av de skadelige effekter av TNFα er nødvendig.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører farmasøytiske sammensetninger for kontrollert avgivning av oppløselige former av TNFa fra en polymer matrise, hvor nevnte farmasøytiske sammensetninger oppviser de trekk som er angitt i krav 1. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av slike sammensetninger som angitt i krav 2 og 4-5.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Kontrollerte frigivningssystemer avleverer et medikament ved en på forhånd bestemt hastighet over en gitt tids-periode, som kan strekke seg fra dager til år. Disse systemer gir fordeler i forhold til konvensjonelle medikamentbehandlinger. Etter inntak eller injeksjon av standard doseringsformer øker for eksempel blodnivået av medikamentet, går over en topp og synker deretter. Da hvert medikament har et terapeutisk område over hvilket det er toksisk og under hvilket det er ineffektivt, kan varierende medikamentnivåer forårsake varierende perioder av ineffektivitet og toksisitet. I motsetning til dette opprettholder et preparat med kontrollert frigjøring medikamentet i det ønskede terapeutiske område ved én enkelt tilførsel. Andre potensielle fordeler med kontrollerte frigjøringssystemer innbefatter: (i) lokalisert avlevering av medikamentet til en spesiell kroppsdel for derved å senke det systemiske medikamentnivå, (ii) bevaring av medikamenter som raskt blir ødelagt i kroppen (dette er spesielt viktig for biologisk sensitive molekyler så som proteiner),

(iii) redusert behov for oppfølging,

(iv) øket komfort og

(v) forbedret tilpasningsdyktighet.

Optimal kontroll av medikamentfrigjøring kan oppnås ved å plassere medikamentet i et polymert materiale. Polymere materialer frigjør generelt medikamenter ved diffusjon, kjemisk reaksjon eller oppløsningsmiddelaktivering.

De vanligste frigjøringsmekanismer er diffusjon, hvor medikamentet migrerer fra sin opprinnelige posisjon i det polymere system til polymerens ytre overflate og deretter til kroppen. Diffusjon kan inntreffe via et reservoar, hvor en medikamentkjerne er omgitt av en polymer film, eller i en matrise hvor medikamentet er jevnt fordelt gjennom det polymere system. Medikamenter kan også bli frigjort ved kjemisk reaksjon, så som nedbrytning av polymeren eller spalting av medikamentet fra en polymer stamme.

Kombinasjoner av de ovennevnte mekanismer er mulig. Frigjø-ringshastigheter fra polymere systemer kan kontrolleres av det polymere materiales natur (f.eks. krystalliniteten eller porestrukturen for diffusjonskontrollerte systemer; bindingenes hydrolytiske labilitet eller monomerenes hydro-fobisitet for kjemisk kontrollerte systemer) og utformingen av systemet (f.eks. tykkelse og form). Fordelene med å ha systemer med forskjellige frigjøringsmekanismer er at hvert av dem kan nå forskjellige mål.

I mange år var kontrollerte frigjøringssystemer kun i stand til langsom frigjøring av medikamenter med lav molekylvekt (<600). Store molekyler, så som proteiner, ble ikke regnet som mulige kandidater, fordi polypeptider ble ansett for å være for store til langsomt å diffundere gjennom de fleste polymere materialer, selv etter svelling av polymeren. Opp-dagelsen at matriser av faste hydrofobe polymerer inneholdende forpulvrede makromolekyler muliggjorde at molekyler av nesten enhver størrelse kunne bli frigjort i løpet av nesten 100 dager, tillot kontrollert avlevering av en rekke forskjellige proteiner, polysakkarider og polynuklelotider. Se Langer, 1990.

Proteinene og polypeptidene som til nå har blitt inkorporert i polymere materialer for kontrollert frigjøring, er i hovedsak effektormolekyler, så som insulin, i motsetning til sammensetninger for kontrollert frigjøring av molekyler som vil binde og nøytralisere effektormolekyler dannet i det menneskelige legeme.

Tumornekrosefaktor-a (TNFa) er et kraftig cytokin som gir et bredt spektrum av biologiske reaksjoner. TNFa er cytoto-ksisk til mange tumorceller og kan brukes ved behandling av kreft. TNFa øker fibroblastvekst og virker som et vevs-remodellerende middel, og er således egnet ved leging av sår. Ytterligere induserer det blødningsnekrose hos trans-planterte svulster i mus, fremmer fagocyttose og cytotoksisitet av polymorfonukleære neutrofiler, og modulerer eks-presjonen av mange proteiner, innbefattende lipoprotein-lipase, klasse I antigener av hoved-histokompatibilitets-komplekset og cytokiner så som interleukin-1 og interleukin-6. TNFa har vist seg å ha en effekt mot virus, bakterier og multicellulære, spesielt intracellulære, parasitter. TNFa synes å være nødvendig for normal immunrespons, mens store mengder gir dramatiske patogene effekter. TNFa har blitt betegnet som "cachectin", siden dette er den dominerende faktor som er ansvarlig for innskrumpningssyndromet (cachexia) assosiert med neoplastiske sykdommer og parasitemia. TNFa er også en hovedmedvirker for toksisitet ved gramnegativ sepsis, siden antistoff mot TNFa kan beskytte infiserte dyr.

Det har blitt vist at TNFa er involvert i flere sykdommer, eksempler på slike er åndedrettssviktsyndrom hos voksne, pulmonær fibrose, malaria, smittsom hepatitt, tuberkulose, inflammatorisk tarmsykdom, septisk sjokk, AIDS, trans-plantat-mot-vertsorganisme reaksjon, autoimmune sykdommer, så som reumatoid artritt, multippel sklerose og diabetes hos barn, samt hypersensitivitet-hudlidelser av forsinket type.

Bevis på at enkelte av effektene av TNFa kan være skadelige for vertsorganismen har ledet oppmerksomheten mot mekanis-mene som regulerer TNFa-funksjonen. De intracellulære signaler for responsen til TNFa blir gitt av celleover-flatereseptorer (nedenfor kalt TNF-R), av to adskilte mole-kyltyper til hvilke TNFa binder seg med høy affinitet.

TNF-R på celleoverflaten blir uttrykt i nesten alle celler i kroppen. De forskjellige effekter av TNFa, den cytotoksi-ske, den vekstfremmende og andre, blir alle signalisert av TNF-reseptoren ved binding av TNFa til disse. To former av disse reseptorer som er forskjellige i molekylstørrelse, 55 og 75 kilodalton, har blitt beskrevet og vil heri bli kalt henholdsvis p55 og p75 TNF-R. Det skal imidlertid bemerkes at det eksisterer publikasjoner som også refererer til disse reseptorer som p60 og p80 TNF-R.

Begge reseptorer for TNFa eksisterer ikke bare i celle-bundne, men også i oppløselige former, som består av de spaltede ekstracellulære domener av de intakte reseptorer, avledet ved proteolytisk spaltning fra celleoverflate-formene. Disse oppløselige TNFa-reseptorer (sTNF-R) kan opprettholde evnen til å binde TNFa og konkurrere om TNFa med celleoverflatereseptorene, og således blokkere TNFa-aktivitet. sTNFa-R virker således som fysiologiske hemmere på aktiviteten av TNFa, noe som sikrer mot dets potensielt skadelige effekter. Det har imidlertid blitt rapportert at sTNF-R påvirker TNFa-funksjonen også ved å stabilisere dens aktivitet, mest sannsynlig ved å forhindre dissosiering av dens bioaktive trimere struktur til inaktive monomere (Aderka et al., 1922). Således kan sTNF-R påvirke TNFa-aktivitet på to forskjellige måter: de kan enten konkurrere om TNFa med celleoverflatereseptorene og blokkere de skadelige effekter av TNFa, eller de kan virke som buffermidler og stabilisere TNFa-aktiviteten.

De to sTNF-R, heretter kalt p55 sTNF-R og p75 sTNF-R, har tidligere blitt betegnet som TNF bindingsproteiner I og II, eller henholdsvis TBPI og TBPII (se f.eks. EP 398327, EP 412486 og EP 433900) . I foreliggende søknad vil begge betegnelser bli brukt: p55 sTNF-R eller TBPI og p75 sTNF-R eller TBPII, hvor proteinene er de samme for begge betegnelser.

sTNF-R er til stede konstituitivt i serum ved konsentrasjoner som øker signifikant både ved inflammatoriske og ikke-inflammatoriske sykdomstilstander. Effekten av disse proteiner kan imidlertid være forskjellig, avhengig av deres konsentrasjoner ved stedet for TNFa-virkning, forholdet mellom deres konsentrasjon og den lokale konsentrasjon av TNFa, og hastigheten hvormed sTNF-R og TNFa blir fjernet fra området med TNFa-virkning i forhold til nedbrytnings-hastigheten av TNFa-aktivitet. Avhengig av disse parametere kan sTNF-R i forskjellige situasjoner påvirke funksjonen av TNFa på en svært ulik måte, enten ved å inhibere effekten av TNFa eller ved å virke som bæremateriale for TNFa eller til og med forsterke effektene av TNFa ved å forlenge dets funksjon (Aderka et al., 1992).

Effektiviteten av sTNF-R som anti-TNFa-medikamenter kan bli påvirket av et antall forskjellige faktorer: Affiniteten hvorved sTNF-R binder til TNFa, sammenlignet med affiniteten av celleoverflatereseptorene tilgjengeligheten av de oppløselige reseptorer til området for TNFa-virkning og fjerningshastigheten av de oppløselige reseptorer og av kompleksene som de danner med TNFa, fra området med TNFa-dannelse. De naturlige former av sTNF-R virker sannsyn-ligvis på den mest fysiologisk relevante måte. Imidlertid er en hovedbegrensning ved deres bruk deres relativt raske fjerning fra blodet. Adskillige forsøk har blitt gjort på å forbedre disse molekyler, og eksempler på dette er de så-kalte chimeriske "immunoadhesiner", hvor sTNF-R er bundet til Fc-delen av immunoglobulin-molekylet (utviklet av Hoffmann-La Roche og Immunex), og "PEGylert" sTNF-R, hvor sTNF-R er kryssbundet via PEG-molekyler (utviklet av Synergen). Begge tilnærmingsmetoder resulterer i dannelse av divalente sTNF-R-molekyler som har lengre fjerningstid og som kan binde mer effektivt til det trivalente TNFa-molekyl. Imidlertid er det mer sannsynlig at de er mer immunogene enn de naturlige oppløselige reseptorer, og fjerningen av deres kompleks med TNFa fra blodomløpet behøver ikke inntreffe med tilstrekkelig effektivitet.

Mange skadelige virkninger av TNFa stammer fra kronisk dannelse av dette cytokin ved forskjellige distinkte områder i kroppen. En forutsett hovedbegrensning ved bruken av oppløselige former at TNF-reseptorer for forsvar mot slike patologiske tilstander, er vanskeligheten med å opprettholde terapeutisk effektive konsentrasjoner av de uoppløselige reseptorer over forlengede tidsperioder ved områder i behov for dem.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Det er en hensikt med foreliggende oppfinnelse å utvikle nye tilnærmingsmåter for terapeutisk tilførsel av oppløse-lige former av TNFa-reseptorer for å påvise funksjonen av deres ligander, f.eks. som beskyttelse mot skadelige virkninger av deres ligander, spesielt systemer som tillater lokal frigjøring av den oppløselige TNFa-reseptor i kroppen ved konstant hastighet og med lang varighet. Disse tilnærmingsmetoder er basert på inkorporering av den oppløselige TNFa-reseptor i biokompatible polymere materialer som blir implantert eller injisert i ønskede kroppsrom. Matriser av polymerer inneholdende den oppløs-elige TNFa-reseptor tillater lokal og kontrollert frigjø-ring av den oppløselige TNFa-reseptor i sin naturlige form.

Enhver oppløselig TNFa-reseptor som er i stand til å binde til og påvirke funksjonen av sin ligand ved enten å nøytralisere de skadelige effekter av sin ligand og/eller stabilisere eller øke dens aktivitet, er omfattet av oppfinnelsen.

Således er det mulig med foreliggende farmasøytiske sammensetning å fremskaffe terapeutisk tilførsel av oppløselige TNFa-reseptorer for å påvirke TNFa-effekter, eksempelvis for å beskytte mot TNF-effekter, og som invol-verer kontrollerte frigjøringssystemer.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer således en farmasøy-tisk sammensetning av en oppløselig TNFa-reseptor, hvor nevnte oppløselige reseptor en inkorporert i en biokompatibel polymer matrise.

Eksempler på biokompatible polymere materialer som kan anvendes ifølge oppfinnelsen innbefatter biokompatible, ikke-nedbrytbare polymerer valgt fra gruppen omfattende etylenvinylacetatkopolymerer (EVAc), silikongummier, polysakkarider, så som cellulose, polyamider, polyakrylater, polyetylener, polyuretaner, polyisobutylen og polyfosfazener, og bionedbrytbare polymerer valgt fra gruppen omfattende polyestere, polyanhydrider, polyortoestere, polycaprolakton, pseudopolyaminosyrer, polypeptider, gelatin, polyeddiksyre, polyglykolsyre og polymelkesyre-glykolsyre (PLGA)-kopolymerer.

I en foretrukket utførelsesform blir en oppløselig TNFa-reseptor (sTNF-R) innlemmet i et passende polymert materiale, så som en polyetylenvinylacetat-matrise eller i poly-melkesyreglykolsyre-mikrosfærer.

Farmasøytiske sammensetninger i henhold til foreliggende oppfinnelse kan inneholde p55 sTNF-R eller p75 sTNF-R. I en foretrukket utførelsesform inneholder sammensetningen p55

sTNF-R (TBPI).

I en utførelsesform er de farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen for bruk ved fremstilling av et medikament til behandling av forstyrrelser hvor beskyttelse mot de skadelige effekter av TNFa, er ønsket. Polymere matriser inneholdende sTNF-R blir plassert i de ønskede kroppshulrom, for således å tillate opprettholdelse av sTNF-R i kroppen konstant og med lang varighet.

I en annen utførelsesform er de farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen for bruk sammen med TNFa, for å stabilisere og/eller forsterke TNFa-aktiviteten, for anvendelse i enhver situasjon hvor den gunstige effekt av TNFa er ønsket. I ett aspekt av denne utførelsesform omfatter sammensetningen et TNFa/sTNF-R-kompleks, som ved tilførsel ved svulststeder kan muliggjøre effektiv lokal antitumorfunksjon og små uønskede systemiske effekter av TNFa. I andre aspekter av denne utførelsesform er sammensetningen omfattende TNFa/TNF-R-komplekset nyttig mot virale, bakterielle og parasittiske infeksjoner, spesielt intracellulære multicellulære parasittiske infeksjoner, og for leging av sår.

I en ytterligere utførelsesform kan medikamentet brukes til behandling av kreft hvor medikamentet omfatter et TNFa/sTNF-R-kompleks i kontrollert frigjøringsform.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 viser partikkelstørrelseseffekt på kumulativ TBPI-frigjøring. Partikler av TBPI + BSA-pulver i tre størrel-sesområder ble innlemmet i etylen-vinylacetatkopolymer (EVAc)-matriser ved 30% mengde: (1) <75 um (lukkede firkanter) ; (ii) 75-250 um 75-250 um (åpne firkanter) og (iii) 250-425 um (lukkede sirkler). Fig. 2 viser innholdseffekt på kumulativ DBPI-frigjøring. EVAc-matriser med mengder TBPI + BSA ble dannet ved å bruke partikkelstørrelsesområde på 75-250 um: (i) 10% mengde (lukkede firkanter), (ii) 30% mengde (åpne firkanter) og (iii) 50% mengde (lukkede sirkler). Fig.3 viser kumulativ prosentvis frigjøring av oppløselig TNFa-reseptor I (TBPI) alene eller innlemmet sammen med bovinserum-albumin (BSA) fra mikrosfærer av: (i) poly-melkesyre-glykolsyre (PLGA) 75:25 (henholdsvis åpne og lukkede sirkler), (ii) PLGA 50:50 (henholdsvis åpne og lukkede firkanter) og (iii) poly-L-melkesyre (PLLA) (henholdsvis åpne og lukkede trekanter). Fig. 4a-c viser in vivo resultater fra nakne Balb-mus inokulert med TNF-produserende hamsterovarie-celler fra kinesisk hamster (CHO/TNF) og behandlet med TBPI eller med muse-anti-TNF monoklonalt antistoff TNF-1(Ab), hvor: Fig. 4a er en grafisk nedtegning av gjennomsnittlig gruppevekt (g) av nakne Balb-mus behandlet med: (i) TBPI i EVAc matrise implantert subkutant (lukkede sirkler); (ii) TBPI i PLGA 75:25 implantat (åpne sirkler); (iii) anti-TNF antistoff injisert én gang fem dager etter museinokulering med CHO/TNF-celler (Ab én gang) (lukkede firkanter); (iv) anti-TNF antistoff injisert to ganger fem dager etter museinokulering med CHO/TNF-celler og en uke senere (Ab to ganger) (åpne firkanter); (v) kontroll, uten noen behandling (lukkede trekanter). Fig. 4b viser resultatene av en in vitro bestemmelse av bioaktive TNFa-nivåer i museserum. Serumet ble samlet opp fra mus som har TNFa-produserende kinesisk hamster ovarie (CHO)-celler, ved de angitte tidsperioder etter implantering av TBPI i EVAc (lukkede sirkler) eller av TBPI i PLGA 75:25 (åpne sirkler), eller injeksjon av anti-TNFa-antistoff injisert én gang (lukkede firkanter) eller to ganger (åpne firkanter) som i fig. 4a, så vel som fra ikke-behandlede mus (lukkede trekanter); TNFa bioaktivitet i sera ble bestemt ved å tilføre dem ved en fortynning på 1:100 til dyrkede MHA2-celler (et derivat av HeLa-celler, 24 timer etter å ha sådd dem ut med 3 x IO<4> celler pr. 9 mM mikro-brønn) i 10 timer, i nærvær av cykloheksimid (25 ug/ml), fulgt av undersøkelse av cellelevedyktighet ved nøytralt rødt opptaksmetoden (Wallach et al., 1984). Fig. 4c representerer overlevelseskurver for mus behandlet med: (i) TBPI i EVAc-implantat (åpne firkanter); TBPI i PLGA 75:25 implantat (lukkede sirkler); (iii) anti-TNF antistoff én gang (åpne trekanter); (iv) anti-TNF antistoff to ganger (lukkede trekanter) og (v) kontroll uten noen behandling (åpne sirkler). Fig. 5 viser effekten av implantering av EVAc-matriser inneholdende TBPI ved forskjellige steder på musekroppen på TBPI konsentrasjonsfrigjøring: hals (lukkede sirkler), rygg (åpne sirkler) og mage (lukkede firkanter). Fig. 6 er en grafisk fremstilling av svellingen av ankelleddene (mm) som viser progresjon av artritt ved forskjellige utviklingstrinn hos transgene Tg 197 artrittiske museavkom behandlet med implantater av EVAc omfattende TNPI (svarte kolonner), EVAc alene (grå kolonner) og ubehandlet (kontroll) (hvite kolonner). Fig. 7 er en grafisk fremstilling av svellingen av ankel-leddet (mm) som viser progresjon av artritt ved forskjellige utviklingstrinn hos transgene Tg 197 artrittisk museavkom behandlet med anti-TNFa antistoff én gang hver uke i løpet av varigheten av forsøket (65 dager) (svarte kolonner) og én gang i uken over to uker (grå kolonner) eller ubehandlet (kontroll) (hvite kolonner). Fig. 8 er en grafisk fremstilling av den gjennomsnittlige gruppevekt (g) av transgene Tg 211-mus som uttrykker human TNFa-mRNA i T-celler, behandlet med implantater av EVAc omfattende TBPI (lukkede sirkler), EVAc alene (åpne sirkler) eller ubehandlet (kontroll) (lukkede firkanter). Fig. 9 er en grafisk fremstilling av den gjennomsnittlige gruppevekt (g) av transgene Tg 211-mus behandlet med anti-

TNFa antistoff én gang hver uke under forsøkets varighet (50 dager) (lukkede trekanter), og én gang pr. uke i to uker (åpne trekanter) eller ubehandlet (kontroll) (lukkede firkanter).

Fig. 10 viser overlevelseskurver for transgene Tg 211-mus behandlet med implantater av Evac omfattende TBPI (lukkede sirkler) og EVAc alene (åpne sirkler) eller ubehandlet (kontroll) (lukkede firkanter).

fig. 11 representerer overlevelseskurver for transgene Tg 211-mus behandlet med anti-TNFa antistoff én gang hver uke i 65 dager (lukkede sirkler) og én gang pr. uke i to uker (åpne sirkler) eller ubehandlet (kontroll) (lukkede firkanter) .

DETALJERT BESKRIVELSE AV FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer et medikament med kontrollert frigjøring av TNFa-reseptor som kan binde til og påvirke aktiviteten av sin ligand, så som nøytralisering av en slik ligand som har skadelige effekter eller stabilisering/forsterking av en ligands aktivitet.

I en foretrukket utførelsesform omfatter sammensetningen ifølge oppfinnelsen sTNF-R som kan være dannet fra naturlige kilder, så som human urin (Engelmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Olson et al. 1989 og Seckinger et al., 1989) eller ved rekombinante teknikker (EP 433900; Nophar et al., 1990; Schall et al., 1990 og Loetscher et al., 1990), og så ytterligere renset som beskrevet for eksempel i EP 308378 og EP 398327.

Som benyttet heri refererer uttrykkene "sTNF-R", "p55 sTNF-R", "p75 sTNF-R" til alle sTNF fra naturlige kilder eller dannet ved rekombinante DNA-teknikker, innbefattende de TNF Bindende Proteiner I og II beskrevet i EP 308378 og EP 309327.

Polymerer som kan benyttes i foreliggende oppfinnelse innbefatter biokompatible, ikke-nedbrytbare polymerer som er valgt fra etylenvinylacetatkopolymerer, silikongummier, polysakkarider så som cellulose, polyamider, polyakrylater, polyetylener, poly-isobutylen, polyuretaner og polyfosfazener, og bionedbrytbare polymerer valgt fra polyestere, polyortoestere, polykaprolakton, polypeptider, pseudo-poly(aminosyrer), gelatin polyanhydrider, poly-L-melkesyre, poly-D-melkesyre, poly-D,L-melkesyre, polyglykolsyre og kopolymerer valgt fra poly-L-melkesyre-glykolsyre, poly-D-melkesyre-glykolsyre, poly-D,L-melkesyre-glykolsyre, poly-L-melkesyre-D-melkesyre og poly-L-melkesyre-D,L-melkesyre.

Polymerene som fortrinnsvis blir brukt i foreliggende oppfinnelse, er polyetylenvinylacetat-kopolymerer (EVAc), poly-melkesyre-glykolsyre-kopolymerer (PLGA) og poly-L-melkesyre (PLLA).

En farmasøytisk sammensetning omfattende sTNF-R innbefattet i en EVAc-matrise kan fremstilles av kommersielt tilgjenge-lig EVAc, etter rensing, om nødvendig f.eks. ved oppløs-ningsmiddelstøpning, som beskrevet av Rhine et al., 1980.

Disse matriser utgjør diffusjonskontrollerte systemer som tillater uniform proteinfordeling, reproduserbar kinetikk og forlenget frigjøring av biologisk aktiv sTNF-R over en periode på uker eller til og med måneder. Da EVAc er en biokompatibel, men ikke-nedbrytbar polymer, er EVAc-matriser egnet for bruk i applikasjoner hvor forlenget medika-mentavlevering er nødvendig eller ønsket.

Når det aktive prinsipp blir frigjort fra ikke-nedbrytbare polymere materialer så som EVAc ved hjelp av diffusjon gjennom kanaler i matrisen, blir diffusjonen øket med høyere proteinmengde. Således blir i en foretrukket utfør-elsesform det aktive protein kombinert med et nøytralt protein som ikke påvirker den biologiske respons overfor det aktive protein for å øke den totale proteinmengde. Eksempler på slike nøytrale proteiner er bovin serum-albumin (dette er riktignok ikke foretrukket for human bruk), human albumin myoglobin, hemoglobin osv.

I en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen, omfattende sTNF-R innbefattet i en bionedbrytbar polymer valgt fra gruppen omfattende poly-L-melkesyre, polyglykolsyre og kopolymerer derav, som er kommersielt tilgjengelige homo-polymerer eller kopolymerer av melkesyre og/eller glykolsyre, er forbindelser i form av mikrosfærer egnet for anvendelse både som implantater eller som injeksjoner. Mikrosfærene kan fremstilles f.eks. ved den modifiserte oppløsningsmiddelinndampningsmetoden ved å bruke en dobbelt emulsjon som beskrevet av Cohem et al., 1991. Da disse polymerer er bionedbrytbare, kan implantatet lett bli injisert, noe som unngår bruk av kirurgiske prosedyrer og behov for å fjerne anordningen etter at den er tømt for medikament. Den aktive bestanddel blir frigjort ved kontrollerbar og forutsigbar frigjøringskinetikk. Systemet muliggjør forlenget frigjøring av den aktive bestanddelen over en periode på uker eller til og med måneder.

Den farmasøytiske sammensetning ifølge oppfinnelsen omfattende et sTNF-R kan bli brukt for å nøytralisere de skadelige effekter av TNFa i akutte sykdommer, så som septisk sjokk, implantat-mot-vertsorganisme-sykdom (GVDH), malaria, smittsom hepatitt, tuberkulose, eller i kroniske lidelser, så som kreftassosiert cachexia, kronisk GVHD eller i autoimmune sykdommer, eksempelvis reumatoid artritt, ungdoms-diabetes, systemisk lupus erythematosus og multippel sklerose, eller hypersensitivtets hudlidelser av forsinket type.

Den farmasøytiske sammensetning ifølge oppfinnelsen kan tilføres på enhver måte som er egnet for kontrollert avlevering av sTNF-R, enten som implantater eller som lokale injeksjoner, f.eks. intra-artikulær injeksjon gitt i syno-vialvæsken i leddhulrom ved behandling av reumatoid artritt, eller intratekal injeksjon gitt i cerebrospinalvæsken ved behandling av multippel sklerose, eller topiske formu-leringer, f.eks. kremer for behandling av hudlidelser. Sammensetningene for behandling av reumatoid artritt kan omfatte andre anti-inflammatoriske midler, og sammensetningene for behandling av multippel sklerose kan omfatte andre midler mot multippel sklerose, f.eks. beta-interferon og Copolymer-1 (Cop-1).

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen omfattende sTNF-R vil bli utformet på en slik måte at den avleverer i kroppen en mengde av sTNF-R som er tilstrekkelig for å blokkere TNFa-virkningen. Når det gjelder autoimmune sykdommer, vil sammensetningen bli utformet slik at den avleverer en mengde sTNF-R som er tilstrekkelig til å påvirke forløpet og alvorligheten av den autoimmune sykdom og å forbedre pasientens tilstand, noe som fører til reduksjon eller remisjon av sykdommen. Den effektive mengde vil avhenge av tilføringsmåten, sykdommen som skal behandles og pasientens tilstand. Bestemmelse av nivået av p55 sTNF-R eller p75 sTNF-R i serum eller andre egnede kroppsvæsker hos pasienten ved kjente metoder (for ELISA, se Aderka et al., 1991), kan hjelpe til med å etablere en passende dose for nevnte pasient i betraktning av at det eksogent tilførte sTNF-R kan komplimentere det endogent dannede sTNF-R ved nøytralisering av skadelig TNFa-aktivitet.

Når etablering av TNFa-aktiviteten er ønsket, vil sammensetningen omfatte et kompleks av TNFa og sTNF-R, f.eks. et 1:1-kompleks, for tilførsel ved tumorstedet.

Oppfinnelsen skal nå illustreres ved de følgende eksempler og de medfølgende tegninger.

EKSEMPLER

MATERIALER OG METODER

Materialer. PLGA, 50:50, inherent viskositet (i.v.) på 0,51 dl/g, og 75:25, i.v. på 0,48 dl/g, og PLLA (poly-L-melkesyre), i.v. på 0,64 dl/g (begge fra PURAC Biochem BV, Nederland), ble anvendt. Etylenvinylacetat kopolymer (EVA-c), (40% vinylacetat) (Dupont), bovin serumalbumin (BSA), (Sigma Chemical Co., USA), polyvinylalkohol (PVA) med gjennomsnittlig molekylvekt 77000-79000, 88% hydrolysert (Aldrich Chemical Co.) og TNPI (p55 sTNF-R) (InterPharm Laboratories Ltd., Israel), ble benyttet som mottatt. Anti-TNFa-antistoffer betegnet TNF-1 er et monoklonalt muse-antistoff fremskaffet mot humant rekombinant TNFa i en av herværende oppfinneres laboratorium (D. Wallach).

Metoder. In vitro frigjøringsprofiler ble fremskaffet ved å plassere medikamentavleveringsmatrisen i fosfatbufret fysiologisk saltvann (PBS, pH 7,4) inneholdt i et beger og omrørt i et ristebad. Prøver ble tatt periodisk og analy-sert for TBPI med enzymtilknyttet immunosorbentassay (ELISA) for TBPI, som beskrevet av Aderka et al., 1991.

In vivo-aktivitet av polymersystemene ble undersøkt på tre modeller: (i) Mus implantert med TNFa-produserende tumorceller (CHO/TNF) som beskrevet av Oliff et al. 1987, og som oppviser alvorlig cachexia som fører til døden, (ii) Transgene Tgl97-mus som forutsigbart utvikler artritt, som beskrevet av Keffer et al., 1991. (iii) Transgene Tg211-mus som uttrykker human TNFa mRNA i T-celler og utvikler markerte histologiske endringer og et dødelig avmagringssyndrom, som beskrevet av Probert et al., 1993.

EKSEMPEL 1. Kontrollert frigjøring av p55 sTNF-R/TBPI fra EVAc-matriser

Etylenvinylacetat-kopolymer (40 vekt% vinylacetat) ble oppløst i metylenklorid for å gi en 10% opppløsning (w/v). TBPI-oppløsning ble tilsatt til bovin serumalbumin (BSA)-pulver oppløst i dobbeltdestillert vann. Blandingen ble frysetørret (24 t, ved 5 mikron Hg og -70°C, Freeze Dryer, Lab Conco) til et pulver. TBPI + BSA-pulver ble siktet for å gi partikler på <75, 75-250 eller 250-425 um. En innveid mengde pulver fra ett enkelt størrelsesområde ble tilsatt til 15 ml av polymeroppløsningen i et glassbeger, og blandingen ble raskt helt inn i sentrum av en vatret Teflonform av skiver (1 cm i diameter og 0,5 cm tykke), som på forhånd hadde blitt avkjølt på tørris i 5 min. I løpet av forkjø-lingen ble formen dekket med en glassplate for å forhindre unødig frostdannelse. Etter at blandingen var helt opp, ble formen holdt på tørris i 10 min, og blandingen frøs. (Formen ble igjen dekket i minst 7 min i dette trinn.) Den frosne plate ble lett pirket løs med en kald spatel, over-ført til en wireskjerm og holdt ved -20°C i 2 dager. Skiven ble så tørket i ytterligere 2 dager ved romtemperatur i en desikkator under et mildt vannvakuum (600 mtorr). Tørking forårsaket at skivene skrumpet til omkring 0,5 cm i diameter og 0,1-0,2 cm i tykkelse.

De polymere avleveringssystemer ble dykket ned i PBS-medi-um. EVAc-matriser ble fremstilt som skiver på 0,5 cm i diameter og en tykkelse på 1-2 mm, inneholdende 22,35 ug TBPI i hver skive for in vivo forsøk. For in vitro forsøk inneholdt skivene 4,47, 13,41 eller 22,35 ug TBPI (10%, 30% og 50% mengde). Frigjøringen av TBPI ble overvåket med ELISA for TBPI som en funksjon av tiden (Aderka et al., 1991).

Figurene 1 og 2 viser effekten av medikamentpartikkel-størrelse og -mengde på frigjøringskinetikk fra EVac-matriser. Partikkelstørrelsen påvirker medikamentfrigjørings-hastighetene signifikant. En økning i partikkelstørrelse øket frigjøringshastigheten (Fig. 1). Økning i medikament-mengde øket medikamentfrigjøringshastigheter jevnt (Fig. 2). Ikke bare økte total medikamentfrigjøring, men også frigjøringshastigheten økte.

Medikamentpartikkelstørrelse og -mengde påvirket frigjø-ringskinetikken av de makromolekylære polymere avleveringssystemer markant. Fordi makromolekyler er for store til å diffundere gjennom polymerfilmen, er det mulig at vedvar-ende frigjøring inntreffer via diffusjon gjennom kanaler i matrisen. Inkorporeringen av makromolekylene i løpet av støpingen kan skape slike kanaler, gjennom hvilke det oppløste medikament kan diffundere. Frigjøringsgraden øker ut fra økning i partikkelstørrelse, og kan stamme fra dan-nelsen av større porekanaler i matrisen. På lignende måte kan øket mengde gi enklere veier (mindre snirkler) og større porøsitet for diffusjon, hvor begge deler ville lette bevegelsen av vann eller PBS inn i og protein ut av matrisen.

EKSEMPEL 2. Kontrollert frigjøring av p55 sTNF-R (TBPI) fra PL6A og PLLA mikrosfærer

Poly-(melkesyre-glykolsyre) (PLGA)- eller poly-L-melkesyre (PLLA)-mikrosfærer ble fremstilt ved en modifisert oppløs-ningsmiddelinndampningsmetode under anvendelse av en emulsjon som beskrevet av Cohen et al., 1991. Kort angitt ble TBPI-oppløsning eller pulver av TBPI og BSA (fremstilt som i eksempel 1 ovenfor), som ble oppløst i dobbeltdestillert vann, helt opp i PLGA eller PLLA oppløst i metylenklorid. Blandingen ble sondeultralydbehandlet (modell VC-250, Sonic & Materials Inc.) i 30 sekunder for å danne den første indre emulsjon (Wl/0). Emulsjonen ble helt opp under kraftig blanding under anvendelse av en magnetisk stav i 2 ml vandig 1% polyvinylalkohol (PVA) mettet med metylenklorid for å danne den andre emulsjon ((W1/0)W2). Den resulte-rende emulsjon ble helt opp i 200 ml 0,1% PVA og konti-nuerlig omrørt i 3 t ved romtemperatur inntil mesteparten av metylenkloridet var inndampet, noe som etterlater faste mikrosfærer. Mikrosfærene ble samlet opp ved sentrifugering (1000 g i 10 min), størrelsessortert ved å bruke sikter med åpninger på 100 um og frysetørket (16 t, Freeze Dryer, Lab Conco) til et pulver. Med mindre annet er angitt, ble for-søk foretatt med PLGA ved et forhold på 75:25 og 50:50 (L/G) og PLLA.

De polymere avleveringssystemer ble neddykket i BBS. 0,04 g PLGA eller PLLA mikrosfærer inneholdende 18,2 ug TBPI ble vurdert i hvert forsøk, og frigjøringen av TBPI ble påvist med ELISA som en funksjon av tiden.

Fig. 3 viser den kumulative prosentvise frigjøring av TBPI fra forskjellige PLGA kopolymerer (50:50 eller 75:25) eller PLLA mikrosfærer. Det kan ses at selv etter 2200 timer hadde kun 10 prosent av TBPI som var inkorporert i mikrosfærene blitt frigjort. Det blir også vist i denne kurve at den kumulative prosentvise frigjøring av TBPI fra polymerer hvor TBPI var tilsatt sammen med BSA (TBP+BSA) (lukkede sirkler, firkanter og trekanter) er høyere enn fra prøver hvor TBPI ble tilsatt uten BSA (åpne sirkler, firkanter og trekanter).

EKSEMPEL 3. TBPI frigjort fra polymermatriser opprettholder sin biologiske aktivitet in vivo i mus inokulert med CHO/TNFct-celler

Som en måte å følge kroniske skadelige effekter av TNFa på, ble en velkjent dyremodell for de cachetiske effekter av TNFa benyttet i forsøket, dvs. nakne Balb-mus implantert med TNFa-produserende svulst (CHO/TNFa)-celler, som beskrevet av Oliff et al., 1987.

Nakne Balb-mus ble inokulert subkutant med CHO/TNFa-celler (Kort et al., 1988) for å oppnå cachexia. Inokuleringene ble utført under anvendelse av ferske trypsiniserte suspen-sjoner av cellelinjer ved en konsentrasjon på 1 x IO<7 >celler/ml (1 ml/mus). Injeksjonene ble utført via 23-gauge nåler på 3 cc piastsprøyter. Cellene ble injisert subkutant i ryggen, halsen og mageområdet. Serumprøver ble tatt flere ganger pr. uke via haletapping. Effekten av polymersystemene, implantert fem dager etter museinokulering med CHO/- TNFa-celler, ble vurdert ved å følge med nivåene av TBPI og TNFa i blodet, vektminkning og mortalitet.

Polymere matriser i henhold til eksempel 1 og 2 ovenfor ble implantert eller injisert i de nakne Balb-mus 5 dager etter museinokulering subkutant med TNFa-produserende CHO-celler for å oppnå cachexia, og deres virkning ble vurdert ved å følge nivåene av TBPI og TNFa i blod (ELISA). De undersøkte parametere var: (1) biologisk aktivitet av TBPI som funksjon av tiden, (2) sammenligning av TBPI-behandling og behandling med muse-antistoff mot human TNFa (fremskaffet i oppfinnernes laboratorier og betegnet TNF-1) injisert én gang (fem dager etter museinokulering med CHO/TNFa-celler, angitt som Ab-én gang) eller to ganger med et intervall på en uke fra hverandre (fem dager etter museinokulering med CHO/TNFa-celler og en uke senere, merket som Ab-to ganger); (3) forløpet av cachexia med hensyn til den gjennomsnittlige musegruppevekt og musemortalitet; og (4) størrelsen av implantat (subkutant i hals, rygg eller mage).

TNFa kan forårsake cachexia og kan indusere progressivt vekttap i tumorbærende dyr. In vivo- effektiviteten av matrisene ble undersøkt i mus implantert med TNFa-produserende tumorceller. Mus injisert med 1 x IO<7> CHO/TNFa-celler som stabilt produserer TNFa ved høye nivåer, oppviste alvorlig cachexia og vekttap, noe som førte til døden. Mus som i tillegg ble implantert med matriser av polymerer inneholdende TBPI, økte sin kroppsvekt uten mortalitet, noe som indikerer at TBPI frigjort fra matrisene ga langtids-beskyttelse mot TNFa.

For å undersøke den biologiske aktivitet av TBPI i de tumorbærende mus ble serumprøver tatt opp ved forskjellige tidspunkter, og bioaktoviteten av TNFa i disse ble vurdert ved å bestemme deres cytotoksisitet overfor MHA2-celler (et derivat av HeLa-celler som er følsomt overfor TNFa). Som vist i fig. 4b, resulterte inokulering av TBPI-inneholdende matriser i forlenget og signifikant reduksjon i serum TNFa-bioaktivitet, noe som indikerer et TBPI frigjort fra matrisene sterkt hemmer bindingen av TNFa til celleoverflate

TNFa-reseptorer på MHA2-cellene.

For sammenligning ble mus injisert med antistoff mot TNFa én gang (fem dager etter museinokulering med CHO/TNFa-celler, merket som Ab-én gang) eller to ganger (fem dager etter museinokulering med CHO/TNFa-celler og en uke senere, angitt som Ab-to ganger). Som vist i fig. 4a, påvirket antistoff musevekt kun i et par dager fra injeksjonstiden (musene opprettholdt sin kroppssvekt), og musene utviklet deretter progressiv avmagring, mens TBPI, når det var inkorporert i polymerer, var til stede i kroppen i lang tid.

Den korte varighet av effekten av injiserte anti TNFa-antistoff (TNF-1) manifesterer seg også i mønsteret for TNFa-aktivitet i serum hos de antistoffinjiserte mus, som vist i fig. 4b.

I fig. 4c kan det observeres at mus behandlet med polymere systemer som tillater kontrollert og lokalisert frigjøring av TBPI, overlevde i mer enn 50 dager, i motsetning til mus behandlet med TNF-1 antistoff, som ikke overlevde og utviklet cachexia når injeksjonene med antistoff ble stoppet.

Disse resultater indikerer at behandling basert på polymer kontrollert avlevering av TBPI forhindrer utvikling av av-magrings syndromet og kan være foretrukket i forhold til injeksjon av antistoff mot TNFa, siden det eliminerer behovet for å injisere hver uke og gir lengre virkende beskyttelse mot TNFa. Videre, da dette er naturlige molekyler, er oppløselige TNFa-reseptorer bedre egnet for forlenget anvendelse. Anti-TNFa-antistoffer vil før eller senere fremskaffe antistoffer mot disse, som vil hindre deres virkning, og er følgelig ikke egnet for forlenget bruk. Dette er også tilfelle for humane eller humaniserte antistoffer, som vil fremskaffe anti-idiotypiske antistoffer som vil blokkere deres funksjon.

Det foreligger ingen signifikant forskjell i TBPI-frigjø-ringskinetikk fra matriser av EVAc implantert i musens hals, rygg eller mage, som funksjon av matrisenes implan-teringssted (Fig. 5). TBPI frigjøringskinetikken er konstant gjennom hele varigheten av frigjøringen.

EKSEMPEL 4. TBPI-frigjøring fra polymermatriser opprettholder sin biologiske aktivitet in vivo i transgene artrittiske Tgl97-mus

Virkningen av EVAc-matriser fremstilt i samsvar med eksempel 1 (implantert subkutant med et mindre kirurgisk inngrep 14 dager etter fødsel) i transgene Tgl97-mus ble vurdert ved å følge svellegraden i ankelleddene. Sykdommen var tydelig ved omkring 4-6 ukers alder med oppsvelling av ankelleddene. Ytterligere oppsvelling av ankelleddene og hemming av benbevegelse fortsatte til fullstendig tap av bevegelse i bakbenene ved omkring 9-10 ukers alder. Videre var progressivt vekttap et fellestrekk hos disse mus. Behandling av disse artrittiske mus med EVAc-matriser inneholdende TBPI forhindret imidlertid fullstendig oppsvelling av ankelleddene (fig. 6). Videre utviklet behandlede dyr seg normalt og viste ingen tegn på artritt eller vekttap, selv etter 10 ukers alder.

Til sammenligning ble mus injisert 14 dager etter fødsel med TNF-l-antistoff én gang pr. uke over hele behandlings-varigheten (65 dager) eller én gang pr. uke i to uker. Som vist i fig. 7, påvirket antistoffene oppsvellingen kun hvis den ble gitt én gang pr. uke over hele forsøksvarigheten (svarte kolonner). Mus som ble injisert hver uke, utviklet seg normalt og viste ingen tegn på artritt eller vekttap, selv etter 10 ukers alder når hemming av bevegelsen er et felles makroskopisk trekk hos disse mus. Imidlertid utviklet mus som ble injisert én gang pr. uke i to uker oppsvelling av ankelleddene, og hemming av benbevegelse utviklet seg til fullstendig bevegelsestap i bakbenene ved omkring 9-10 ukers alder med progressivt vekttap.

Disse resultater indikerer at behandling basert på polymer-kontrollert avlevering av TBPI fullstendig forhindrer utvikling av artritt i mus og kan være foretrukket i forhold til injeksjon av antistoffer mot hTNFa, siden det gir lengrevirkende beskyttelse mot TNFa og fjerner behovet for injeksjon hver uke.

EKSEMPEL 5. TBPI frigjort fra polymere matriser opprettholder sin biologiske aktivitet in vivo i transgene Tg211-mus

Transgene Tg211-mus som uttrykker human TNF mRNA i T-celler, utviklet markerte histologiske endringer og et dødelig avmagringssyndrom. Effekten av de polymere systemer inneholdende TBPI implantert 14 dager etter fødsel, ble vurdert ved å følge vektminkning og dødelighet. De individuelle dyr ble veiet flere ganger hver uke. EVAc-matriser ble implantert subkutant med et mindre kirurgisk inngrep.

Som vist i fig. 8 og 10, utviklet ubehandlede mus (kon-trollgruppe: lukkede firkanter) alvorlig progressivt vekttap som førte til døden, mens mus som var implantert med EVAc-matriser inneholdende TNPI (lukkede sirkler) økte sin kroppsvekt og overlevde over hele forsøksvarigheten.

Til sammenligning ble mus injisert 14 dager etter fødsel med TNF-l-antistoff én gang i uken over hele forsøkets varighet eller én gang pr. uke i to uker. Som vist i fig.

9, forhindret tilføring av anti-TNFa-antistoff fullstendig utvikling av avmagringssyndromet om det ble gitt hver uke fra fødselen. Imidlertid, dersom det ble gitt kun én gang pr. uke i to uker, var det ikke effektivt, og musene utviklet avmagringssyndromet som førte til døden, som vist i fig. 11.

Disse resultater indikerer at behandling basert på polymer kontrollert avlevering av TBPI fullstendig forhindrer utvikling av avmagringssyndromet hos mus og kan være foretrukket i forhold til injeksjon av antistoff mot hTNFa.

In vivo-resultatene indikerer at frigjort TBPI beholder sin biologiske aktivitet, som vist ved den gjennomsnittlige gruppevektendring (fig. 4a) og den høye prosentandel av levende MHA2-celler som er følsomme overfor TNFa (fig. 4b).

Claims (5)

1. Farmasøytisk sammensetning for stabilisering av de gunstige effekter av Tumor Nekrose Faktor a (TNFa) karakterisert ved at den omfatter en biokompatibel polymermatrise som har i seg et kompleks av oppløselig TNFa-reseptor og TNFa, hvor nevnte kompleks er inkorporert i nevnte polymermatrise på en slik måte at det dannes en kontrollert frigjøring av nevnte mengde av nevnte kompleks som er effektiv til å gi de gunstige effekter av TNFa.

2. Anvendelse av farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1 ved fremstilling av et medikament som er egnet til behandling av virale, bakterielle og multicellulære parasitticide infeksjoner.

3. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at den oppløselige TNFa-reseptor og nevnte TNFa er tilstede i nevnte kompleks i et forhold på 1:1.

4. Anvendelse av farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1 ved fremstilling av et medikament med forsinket frigjøring inneholdende den oppløselige form av TNFa-reseptor og TNFa hvor frigjøringen foregår over tid.

5. Anvendelse av farmasøytisk sammensetning ifølge krav 1 ved fremstilling av et medikament som er egnet til heling av sår.