PT812208E - Composições farmacêuticas para libertação controlada de receptores solúveis - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS PARA LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE RECEPTORES SOLÚVEIS"

ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas para distribuição controlada de formas solúveis de receptores a partir de uma matriz polimérica.

CONTEXTO DA INVENÇÃO

Os sistemas de libertação controlada distribuem um fármaco a uma velocidade predeterminada durante um período de tempo definido, que pode variar desde dias até anos. Estes sistemas proporcionam vantagens relativamente a terapias com fármacos convencionais. Por exemplo, após a ingestão ou injecção de formas galénicas comuns, o nível no sangue do fármaco aumenta, atinge um máximo e depois diminui. Uma vez que cada fármaco tem uma gama terapêutica acima da qual é tóxico e abaixo da qual é ineficaz, níveis oscilantes do fármaco podem originar períodos alternados de ineficácia e toxicidade. Em contraste, uma preparação de libertação controlada mantém o fármaco na gama terapêutica desejada através de uma única administração. Outras vantagens potenciais de um sistema de libertação controlada incluem: (i) distribuição localizada do fármaco num compartimento particular do corpo, desse modo diminuindo o nível sistémico do fármaco; (ii) conservação de medicações que são rapidamente destruídas pelo corpo (isto é particularmente importante para moléculas biologicamente sensíveis, como proteínas); (iii) necessidade reduzida de cuidados pós-observação; (iv) maior conforto, e (v) maior concordância. 2

Pode obter-se controlo óptimo da libertação de um fármaco colocando o fármaco num material polimérico. Os materiais poliméricos geralmente libertam fármacos por difusão, reacção quimica ou activação de solvente. 0 mecanismo de libertação mais comum é a difusão, pela qual o fármaco migra da sua posição inicial no sistema polimérico para a superfície externa do polimero e depois para o corpo. A difusão pode ocorrer através de um reservatório, no qual um núcleo do fármaco está rodeado por um filme polimérico, ou numa matriz, onde o fármaco está uniformemente distribuído no sistema polimérico. Os fármacos também podem ser libertados por reacção quimica, como degradação do polimero ou clivagem do fármaco a partir de uma coluna vertebral polimérica. São possíveis combinações dos mecanismos acima. As velocidades de libertação a partir de sistemas poliméricos podem ser controladas pela natureza do material polimérico (por exemplo, cristalinidade ou estrutura dos poros para sistemas controlados por difusão; a instabilidade hidrolitica das ligações ou a hidrofobicidade dos monómeros para sistemas controlados quimicamente) e a configuração do sistema (por exemplo, espessura e forma). A vantagem de dispor de sistemas com diferentes mecanismos de libertação é o facto de cada um atingir diferentes objectivos.

Durante muitos anos, os sistemas de libertação controlada eram apenas capazes de libertar lentamente fármacos de baixo peso molecular (< 600) . Moléculas grandes, como proteínas, não eram consideradas candidatos reais, pois considerava-se que os polipéptidos eram demasiado grandes para se difundirem lentamente através da 3 maior parte dos materiais poliméricos, mesmo após dilatação do polimero. A descoberta de que matrizes de polímeros hidrófobos sólidos contendo macromoléculas em pó permitiam a libertação de moléculas de praticamente qualquer dimensão durante mais de 100 dias permitiu a distribuição controlada de uma variedade de proteínas, polissacáridos e polinucleótidos. Ver Langer, 1990.

As proteínas e polipéptidos incorporados até à data em materiais poliméricos para libertação controlada são principalmente moléculas efectoras, como insulina, na forma de composições opostas para a libertação controlada de moléculas que se ligarão e neutralizarão moléculas efectoras produzidas no corpo humano. O factor de necrose tumoral-α (TNFa) é uma citoquina potente que induz um largo espectro de respostas biológicas. O TNFa é citotóxico para muitas células tumorais e pode ser utilizado no tratamento de cancro. O TNFa aumenta o crescimento de fibroblastos e actua como agente de remodelação de tecidos, sendo assim adequado na cura de feridas. Também induz necrose hemorrágica de tumores transplantados em ratinhos, aumenta a fagocitose e citotoxicidade de neutrófilos polimorfonucleares e modula a expressão de muitas proteínas, incluindo lipoproteína lipase, antigenes de classe I do complexo principal de histocompatibilidade e citoquinas, como interleuquina-1 e interleuquina-6. Foi mostrado que o TNFa exerce um efeito contra vírus, bactérias e parasitas multicelulares, particularmente intracelulares. O TNFa aparenta ser necessário para uma resposta imunológica normal, mas grandes quantidades produzem efeitos patogénicos 4 dramáticos. 0 TNFa foi denominado "caquetina", pois é o factor predominante responsável pela síndroma de emaciação (caquexia) associada a doença neoplástica e parasitemia. 0 TNFa também contribui de forma importante para toxicidade em sepsia gram-negativa, pois anticorpos contra o TNFa conseguem proteger animais infectados.

Foi mostrado que o TNFa está envolvido em várias doenças, exemplos dos quais são a síndroma de dificuldade respiratória do adulto, fibrose pulmonar, malária, hepatite infecciosa, tuberculose, doença inflamatória do intestino, choque séptico, SIDA, reacção enxerto-versus-hospedeiro, doenças autoimunes, como artrite reumatóide, esclerose múltipla e diabetes juvenil, e perturbações de hipersensibilidade da pele do tipo retardado.

Evidências de que alguns dos efeitos do TNFa podem ser prejudiciais para o hospedeiro atraíram atenções para os mecanismos que regulam a função do TNFa. Os sinais intracelulares para a resposta ao TNFa são fornecidos por receptores da superfície celular (daqui em diante TNF-R), de duas espécies moleculares distintas, aos quais o TNFa se liga com elevada afinidade.

Os TNF-Rs da superfície celular são expressos em quase todas as células do corpo. Todos os variados efeitos do TNFa, o citotóxico, promotor do crescimento e outros, são sinalizados pelos receptores do TNF por ligação do TNFa àqueles. Foram descritas duas formas destes receptores, que diferem no tamanho molecular, 55 e 75 quiloDalton, e serão aqui denominadas TNF-R p55 e p75, respectivamente. No 5 entanto, deve notar-se que há publicações que também se referem a estes receptores como TNF-R p60 e p80.

Ambos os receptores para o TNFa existem não só em formas ligadas a células mas também em formas solúveis, consistindo nos dominios extracelulares clivados dos receptores intactos, derivados por clivagem proteolítica das formas da superficie celular. Estes receptores solúveis do TNFa (sTNF-Rs) podem manter a capacidade para se ligarem ao TNFa, deste modo competindo para o TNFa com os receptores da superficie celular e, assim, bloquear a actividade do TNFa. Em consequência, os sTNF-Rs funcionam como atenuadores fisiológicos da actividade do TNFa, salvaguardando contra os seus efeitos potencialmente nocivos. Todavia, também foi relatado que os sTNR-Rs também afectam a função do TNFa por estabilização da sua actividade, muito provavelmente ao prevenirem a dissociação da sua estrutura trimérica bioactiva em monómeros inactivos (Aderka et ai., 1992). Assim, os sTNF-Rs podem afectar a actividade do TNFa de dois modos diferentes: ou competem para o TNFa com os receptores da superficie celular e bloqueiam efeitos prejudiciais do TNFa ou actuam como agentes de tamponamento e estabilizam a actividade do TNFa.

Os dois sTNF-Rs, daqui em diante sTNF-R p55 e sTNF-R p75, foram anteriormente designados Proteínas de Ligação ao TNF I e II, ou TBPI e TBPII, respectivamente (ver, por exemplo, EP 398327, EP 412486 e EP 433900). Na presente candidatura utilizaremos ambas as designações: sTNF-R p55 6 ou TBPI e sTNF-R p75 ou TBPII; qualquer uma das designações refere-se às mesmas proteínas.

Os sTNF-Rs estão presentes de forma constitutiva no soro a concentrações que aumentam significativamente em estados de doenças inflamatórias e não inflamatórias. Contudo, o efeito destas proteínas pode diferir, dependendo das suas concentrações no sítio de acção do TNFa, da relação entre a sua concentração e a concentração local do TNFa e das taxas às quais os sTNF-Rs e TNFa são eliminados do sitio de acção do TNFa relativamente à velocidade de decréscimo da actividade do TNFa. Dependendo destes parâmetros, os sTNF-Rs, em diferentes situações, podem afectar a função do TNFa de um modo muito diferente, quer inibindo os efeitos do TNFa quer servindo como transportadores para o TNFa ou mesmo aumentando os efeitos do TNFa ao prolongarem a sua função (Aderka et ai., 1992). A eficácia dos sTNF-Rs como fármacos anti-TNFa pode ser afectada por alguns factores diferentes: a afinidade com a qual os sTNF-Rs se ligam ao TNFa, comparada com a afinidade dos receptores da superfície celular, a acessibilidade dos receptores solúveis para o sítio de acção do TNFa e a taxa de eliminação dos receptores solúveis, e dos complexos que formam com o TNFa, do sítio de formação do TNFa. É provável que as formas naturais dos sTNF-Rs actuem do modo fisiologicamente mais relevante. No entanto, uma limitação importante à sua utilização é a sua eliminação bastante rápida do sangue. Foram feitas várias tentativas para aperfeiçoar estas moléculas, exemplos das quais são as denominadas "imunoadesinas" quiméricas, onde 7 os sTNF-Rs estão ligados à porção Fc da molécula de imunoglobulina (desenvolvidas pela Hoffman La Roche e Immunex), e sTNF-Rs "PEGuilados", onde os sTTIF-Rs estão ligados de forma cruzada através de moléculas de PEG (desenvolvido pela Synergen). Ambas as abordagens resultam na formação de moléculas de sTNF-R divalentes que têm um tempo de eliminação mais longo e que se podem ligar mais eficazmente à molécula trivalente do TNFa. Todavia, é muito provável que sejam mais imunogénicas do que os receptores solúveis naturais, e a eliminação do seu complexo com o TNFa da circulação pode não ocorrer com eficiência suficiente.

Muitos efeitos nocivos do TNFa resultam da formação crónica desta citoquina em certos loci distintos do corpo. Uma grande limitação antecipada à utilização de formas solúveis de receptores do TNF para defesa contra esses estados patológicos é a dificuldade em manter uma concentração terapeuticamente eficaz dos receptores solúveis, durante períodos prolongados, em sítios necessitados. A patente WO 90/05522 refere-se a uma preparação farmacêutica compreendendo uma combinação de um ou vários receptores/proteínas de ligação (que se ligam a factores de crescimento ou hormonas) e ácido hialurónico (ou seus derivados) ou um polímero biodegradável, opcionalmente em combinação com o seu/seus ligandos (factores de crescimento e hormonas). A patente WO 94/06476 revela um método para tratar doenças inflamatórias dependentes do TNF num mamifero por administração de um antagonista do TNF, como TNFR solúvel.

RESUMO DA INVENÇÃO

Um objectivo da presente invenção consiste em desenvolver novas abordagens para aplicações terapêuticas de formas solúveis de receptores com a finalidade de afectar as funções dos seus ligandos, por exemplo, para proteger contra efeitos prejudiciais dos seus ligandos, particularmente sistemas que permitam a libertação local do receptor solúvel no corpo, a uma velocidade constante e durante um periodo longo. Estas abordagens baseiam-se na incorporação do receptor solúvel em materiais poliméricos biocompativeis, que são implantados ou injectados em compartimentos corporais desejados. Matrizes de polímeros contendo o receptor solúvel permitem a libertação local e controlada do receptor solúvel, na sua forma natural. O receptor solúvel é um receptor solúvel do TNFa.

Assim, outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar uma nova abordagem para aplicações terapêuticas de receptores solúveis do TNFa com a finalidade de afectar efeitos do TNFa, por exemplo, para protecção contra efeitos do TNF, envolvendo sistemas de libertação controlada.

Deste modo, a presente invenção proporciona a utilização de uma matriz polimérica biocompatível tendo incorporado um receptor solúvel do TNFa, em que o referido receptor é incorporado no referido material polimérico de 9 modo a permitir a libertação controlada de uma quantidade do receptor solúvel do TNFa eficaz para melhorar os efeitos prejudiciais do TNFa, para a preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento de perturbações onde é requerida uma melhoria dos efeitos prejudiciais do Factor de Necrose Tumoral-a.

Exemplos de materiais poliméricos biocompatíveis que podem ser utilizados nas composições da invenção incluem, mas não se limitam a estes, polímeros biocompatíveis não degradáveis seleccionados do grupo que compreende copolimeros de etileno-acetato de vinilo (EVAc), borrachas de silicone, polissacáridos, como celulose, poliamidas, poliacrilatos, polietilenos, poliuretanos, poliisobutileno e polifosfazenos, e polímeros biodegradáveis seleccionados do grupo que compreende poliésteres, polianidridos, poliortoésteres, policaprolactona, pseudopoliaminoácidos, polipéptidos, gelatina, ácido poliláctico, ácido poliglicólico e copolimeros de poli ácido láctico-glicólico (PLGA).

Numa forma de realização preferida, um receptor solúvel do TNFa (sTNF-R) é incorporado num material polimérico adequado, como uma matriz de polietileno-acetato de vinilo, ou em microesferas de poli(ácido láctico-glicólico) .

As composições farmacêuticas podem conter o sTNF-R p55 ou sTNF-R p75. Numa forma de realização preferida, a composição contém o sTNF-R p55 (TBPI). 10

Numa forma de realização, as composições farmacêuticas destinam-se a ser utilizadas no tratamento de perturbações onde é desejada protecção contra os efeitos prejudiciais do ligando, TNFa. As matrizes poliméricas que contêm os sTNF-Rs são colocadas em compartimentos corporais desejados, deste modo permitindo a manutenção do sTNF-R no corpo de modo constante e durante um periodo longo.

Noutra forma de realização, a invenção compreende o tratamento de um paciente para proteger o referido paciente dos efeitos prejudiciais de um ligando, TNFa, que compreende administrar ao referido paciente a composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do receptor solúvel adequado, sTNF-R, numa forma de libertação controlada.

Noutra forma de realização, a invenção refere-se ao tratamento de cancro, que compreende administrar, no sitio do tumor de um paciente necessitado, a composição farmacêutica compreendendo um complexo TNFa/sTNF-R em forma de libertação controlada.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS A Fig. 1 ilustra o efeito da dimensão das particulas na libertação de TBPI cumulativa. Particulas de TBPI + BSA em pó, em três gamas de dimensões, foram incorporadas em matrizes de copolimero de etileno-acetato de vinilo (EVAc) a uma carga de 30%: (i) < 75 μιη (losangos pretos) ; (ii) 75 - 250 μιη (quadrados brancos) , e (iii) 250 - 425 μιη (circulos pretos) . 11 A Fig. 2 ilustra o efeito da carga na libertação de TBPI cumulativa. Prepararam-se matrizes de EVAc com cargas de TBPI + BSA utilizando a gama de dimensão das partículas de 75 - 250 μιη: (i) carga de 10% (losangos pretos); (ii) carga de 30% (quadrados brancos), e (iii) carga de 50% (círculos pretos) . A Fig. 3 ilustra a libertação percentual cumulativa do receptor solúvel do TNFa I (TBPI), isoladamente ou incorporado juntamente com albumina do soro bovino (BSA), a partir de microesferas de: (i) ácido poli láctico-glicólico (PLGA) 75:25 (círculos brancos e pretos, respectivamente) ; (ii) PLGA 50:50 (quadrados brancos e pretos, respectivamente), e (iii) ácido poli-L-láctico (PLLA) (triângulos brancos e pretos, respectivamente).

As Figs. 4a-c ilustram resultados in vivo de ratinhos nus Balb inoculados com células de ovário de hamster chinês (CHO) produtoras de TNF (CHO/TNF) e tratados com TBPI ou com anticorpo monoclonal anti-TNF de ratinho TNF-1(Ab), em que: A Fig. 4a é uma representação gráfica do peso médio do grupo (g) de ratinhos nus Balb tratados com: (i) TBPI em matriz de EVAc implantada subcutaneamente (círculos pretos); (ii) TBPI em implante de PLGA 75:25 (circulos brancos); (iii) anticorpo anti-TNF injectado uma vez, cinco dias após a inoculação dos ratinhos com células CHO/TNF (Ab uma vez) (quadrados pretos); (iv) anticorpo anti TNF injectado duas vezes, cinco dias após a inoculação dos ratinhos com células CHO/TNF e uma semana mais tarde (Ab duas vezes) (quadrados 12 brancos), e (v) controlo, sem qualquer tratamento (triângulos pretos); A Fig. 4b apresenta os resultados de uma avaliação in vitro dos níveis de TNFa bioactivo em soros de ratinhos. Os soros foram recolhidos de ratinhos com células de ovário de hamster chinês (CHO) produtoras de TNFa, nos períodos de tempo indicados, após implantação de TBPI em EVAc (círculos pretos) ou de TBPI em PLGA 75:25 (círculos brancos), ou injecção de anticorpo anti-TNFa injectado uma vez (quadrados pretos) ou duas vezes (quadrados brancos) tal como na Fig. 4a, bem como de ratinhos não tratados (triângulos pretos). Determinou-se a bioactividade do TNFa nos soros aplicando-os, a uma diluição 1:100, em células MHA2 cultivadas (um derivado de células HeLa, 24 horas após a sua cultura a 3 x 104 células por microcavidade de 9mM) durante 10 horas, na presença de ciclo-heximida (25 μρ/ιτΛ) , seguido da avaliação da viabilidade celular pelo método de captação de vermelho neutro (Wallach et al., 1984), e A Fig. 4c representa curvas de sobrevivência para ratinhos tratados com: (i) TBPI em implante de EVAc (quadrados brancos); (ii) TBPI em implante de PLGA 75:25 (círculos pretos); (iii) anticorpo anti-TNF uma vez (triângulos brancos); (iv) anticorpo anti-TNF duas vezes (triângulos pretos), e (v) controlo, sem qualquer tratamento (círculos brancos). A Fig. 5 ilustra o efeito da implantação de matrizes de EVAc contendo TBPI em diferentes sítios do corpo do ratinho na libertação da concentração de TBPI: pescoço (círculos pretos), dorso (círculos brancos) e estômago (quadrados pretos) . 13 A Fig. 6 é uma representação gráfica do inchaço das articulações do tornozelo (mm) exibindo progressão de artrite em diferentes fases do desenvolvimento da progenitura de ratinhos artríticos Tg 197 transgénicos tratados com implantes de EVAc compreendendo TBPI (colunas pretas), RVAc isoladamente (colunas cinzentas) ou não tratados (controlo) (colunas brancas). A Fig. 7 é uma representação gráfica do inchaço das articulações do tornozelo (mm) exibindo progressão de artrite em diferentes fases do desenvolvimento da progenitura de ratinhos artríticos Tg 197 transgénicos tratados com anticorpos anti-TNFa uma vez por semana durante o período da experiência (65 dias) (colunas pretas) e uma vez por semana durante duas semanas (colunas cinzentas) ou não tratados (controlo) (colunas brancas). A Fig. 8 é uma representação gráfica do peso médio do grupo (g) de ratinhos Tg 211 transgénicos que expressam mRNA de TNFa humano em células T, tratados com implantes de EVAc compreendendo TBPI (círculos pretos), EVAc isoladamente (círculos brancos) ou não tratados (controlo) (quadrados pretos). A Fig. 9 é uma representação gráfica do peso médio do grupo (g) de ratinhos Tg 211 transgénicos tratados com anticorpos anti-TNFa uma vez por semana durante o período da experiência (50 dias) (triângulos pretos) e uma vez por semana durante 2 semanas (triângulos brancos) ou não tratados (controlo) (quadrados pretos) . A Fig. 10 representa curvas de sobrevivência para ratinhos Tg 211 transgénicos tratados com implantes de 14 EVAc compreendendo TBPI (círculos pretos) e EVAc isoladamente (círculos brancos) ou não tratados (controlo) (quadrados pretos). A Fig. 11 representa curvas de sobrevivência para ratinhos Tg 211 transgénicos tratados com anticorpos anti-TNFa uma vez por semana durante 65 dias (círculos pretos) e uma vez por semana durante 2 semanas (círculos brancos) ou não tratados (controlo) (quadrados pretos).

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DE FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS A presente invenção proporciona a libertação controlada de receptores solúveis do TNFa.

Numa forma de realização preferida, as composições da invenção compreendem sTNF-Rs que podem ser obtidos de fontes naturais, como urina humana (Engelmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Olson et al., 1989, e Seckinger et al., 1989), ou por técnicas recombinantes (EP 433900; Nophar et al., 1990; Schall et al., 1990, e Loetscher et al., 1990), e depois podem ser suplementarmente purificados como descrito, por exemplo, em EP 308378 e EP 398327.

Tal como são aqui utilizados, os termos "sTNF-Rs", "sTNF-R p55", "sTNF-R p75" referem-se a todos os sTNFs de fontes naturais ou obtidos por técnicas de DNA recombinante, incluindo mas não se limitando às Proteínas de Ligação do TNF I e II descritas em EP 308378 e EP 398327.

Polímeros que podem ser utilizados na presente invenção incluem, mas não se limitam a estes, polímeros biocompatíveis não degradáveis seleccionados de entre 15 copolímeros de etileno-acetato de vinilo, borrachas de silicone, polissacáridos, como celulose, poliamidas, poliacrilatos, polietilenos, poliisobutileno, poliuretanos e polifosfazenos, e polímeros biodegradáveis seleccionados de entre poliésteres, poliortoésteres, policaprolactona, polipéptidos, pseudo poli(aminoácidos), gelatina, polianidridos, ácido poli-L-láctico, ácido poli-D-láctico, ácido poli-D,L-láctico, ácido poliglicólico, e copolímeros seleccionados de entre ácido poli-L-láctico-ácido glicólico, ácido poli-D-láctico-ácido glicólico, ácido poli-D,L-láctico-ácido glicólico, ácido poli-L-láctico-ácido D-láctico e ácido poli-L-láctico-ácido D,L-láctico.

Os polímeros preferivelmente utilizados na presente invenção são copolímeros de etileno-acetato de vinilo (EVAc), copolímeros de ácido poli láctico-glicólico (PLGA) e ácido poli-L-láctico (PLLA).

Uma composição farmacêutica compreendendo sTNF-R incorporado numa matriz de EVAc pode ser preparada a partir de EVAc comercialmente disponível, após purificação, se necessário, por exemplo, por moldagem do solvente como descrito por Rhine et al., 1980. Estas matrizes constituem sistemas controlados por difusão que permitem uma distribuição uniforme da proteína, cinética reprodutível e libertação prolongada de sTNF-R biologicamente activo durante um período de semanas ou mesmo meses. Uma vez que o EVAc é um polímero biocompatível mas não degradável, matrizes de EVAc são adequadas para utilização em aplicações em que é requerida ou desejada uma distribuição prolongada do fármaco. 16

Uma vez que o princípio activo é libertado de materiais poliméricos não degradáveis, como EVAc, por difusão através de canais da matriz, a difusão é intensificada por uma maior carga proteica. Assim, numa forma de realização preferida, a proteína activa é combinada com uma proteína neutra, que não afecta a resposta biológica à proteína activa, para aumentar a carga proteica total. Exemplos dessas proteínas neutras são albumina do soro bovino (apesar de não ser preferida para utilização humana), albumina humana, mioglobina, hemoglobina, etc.

Numa composição farmacêutica de acordo com a invenção compreendendo sTNF-R incorporado num polímero biodegradável seleccionado do grupo que compreende ácido poli-L-láctico, ácido poliglicólico e respectivos copolímeros, homopolímeros ou copolímeros de ácido láctico e/ou ácido glicólico comercialmente disponíveis são compostos na forma de microesferas, adequadas para aplicação como implantes ou como injecções. As microesferas podem ser preparadas, por exemplo, pelo método de evaporação do solvente modificado utilizando uma emulsão dupla como descrito por Cohen et al., 1991. Uma vez que estes polímeros são biodegradáveis, o implante pode ser facilmente injectado, evitando a utilização de procedimentos cirúrgicos e a necessidade de remover o dispositivo depois de depletado o fármaco. 0 agente activo é libertado com uma cinética de libertação controlável e previsível. 0 sistema permite a libertação prolongada do agente activo durante um período de semanas ou mesmo meses. A composição farmacêutica da invenção compreendendo um sTNF-R pode ser utilizada para neutralizar os efeitos 17 prejudiciais do TNFa em doenças agudas, como choque séptico, doença de enxerto-versus-hospedeiro (GVHD), malária, hepatite infecciosa, tuberculose, ou em doenças crónicas, como caquexia associada a cancro, GVHD crónica, ou em doenças autoimunes, por exemplo, artrite reumatóide, diabetes juvenil, lúpus eritematoso sistémico e esclerose múltipla, ou em perturbações de hipersensibilidade da pele do tipo retardado. A composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por qualquer modo adequado para a distribuição controlada do sTNF-R, quer na forma de implantes quer como injecções locais, por exemplo, injecção intra-articular no fluido sinovial das cavidades da articulação no tratamento de artrite reumatóide, ou injecção intratecal no fluido cerebrospinal no tratamento de esclerose múltipla, ou formulações tópicas, por exemplo, loções, para o tratamento de perturbações da pele. As composições para o tratamento de artrite reumatóide podem compreender outros agentes anti-inflamatórios, e as composições para o tratamento de esclerose múltipla podem compreender outros agentes contra esclerose múltipla, por exemplo, beta-interferão e Copolímero-1 (Cop-1). A composição da invenção compreendendo sTNF-R será concebida de forma a distribuir no corpo uma quantidade de sTNF-R suficiente para bloquear a acção do TNFa. No caso de doenças autoimunes, a composição será concebida de forma a distribuir uma quantidade de sTNF-R suficiente para afectar a progressão e gravidade da doença autoimune e para melhorar o estado do paciente, conduzindo a redução ou remissão da doença. A quantidade eficaz dependerá da via de administração, da doença a ser tratada e do estado do 18 paciente. A determinação do nivel de sTNF-R p55 ou sTNF-R p75 no soro ou outro fluido corporal adequado do paciente, por métodos conhecidos (quanto a ELISA, ver Aderka et ai., 1991) pode ajudar a determinar uma dose adequada para esse paciente, considerando que o sTNF-R administrado de forma exógena pode complementar o sTNF-R formado de modo endógeno na neutralização da actividade prejudicial do TNFa. A invenção será agora ilustrada pelos seguintes exemplos e figuras adjuntas.

EXEMPLOS

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais. Utilizaram-se PLGA, 50:50, viscosidade inerente (v.i.) de 0,51 dL/g, e 75:25, v.i. de 0,48 dL/g, e PLLA (ácido poli-L-láctico) , v.i. de 0,64 dL/g (ambos da PURAC Biochem BV, Holanda). Utilizaram-se como recebidos copolimero de etileno-acetato de vinilo (EVAc), (40% de acetato de vinilo) (Dupont), albumina do soro bovino (BSA) (Sigma Chemical Co., E.U.A.), álcool polivinilico (PVA) de peso molecular médio 77000 - 79000, 88% hidrolisado (Aldrich Chemical Co.) e TBPI (sTNF-R p55) (InterPharm Laboratories Ltd., Israel). O anticorpo anti-TNFa designado TNF-1 é um anticorpo monoclonal de ratinho dirigido contra o TNFa humano recombinante num laboratório dos presentes inventores (D. Wallach). Métodos. Obtiveram-se perfis de libertação in vitro colocando as matrizes de distribuição do fármaco em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) contida num frasco e agitada num banho de agitação. Recolheram-se 19 amostras periodicamente, tendo sido analisadas quanto à TBPI por Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima (ELISA) quanto à TBPI, como descrito por Aderka et al., 1991.

Examinou-se a eficácia in vivo dos sistemas poliméricos em três modelos: (i) Ratinhos implantados com células tumorais produtoras de TNFa (CHO/TNF), como descrito por Oliff et al., 1987, exibindo caquexia grave conducente à morte. (ii) Ratinhos Tgl97 transgénicos que, de forma previsível, desenvolvem artrite, como descrito por Keffer et al., 1991. (iii) Ratinhos Tg211 transgénicos que expressam mRNA de TNFa humano em células T e desenvolvem alterações histológicas acentuadas e uma sindroma de emaciação letal, como descrito por Probert et al., 1993. EXEMPLO 1. Libertação controlada de sTNF-R p55/TBPI a partir de matrizes de EVAc

Dissolveu-se copolímero de etileno-acetato de vinilo (40% de acetato de vinilo por peso) em cloreto de metileno para formar uma solução 10% (p/v). Adicionou-se solução de TBPI a albumina do soro bovino (BSA) em pó dissolvida em água duplamente destilada. A mistura foi liofilizada (24 horas, a 5 micrones de Hg e -70°C, Freeze Dryer, Lab Conco) num pó. O pó de TBPI + BSA foi peneirado para se obterem partículas < 75, 75 - 250 ou 250 - 425 μιη. Uma quantidade pesada do pó de uma única gama de dimensões foi adicionada a 15 mL da solução polimérica num frasco de vidro e a mistura foi rapidamente derramada no centro de um molde de discos de Teflon nivelado (1 cm de diâmetro e 0,5 cm de espessura) que tinha sido previamente arrefecido em gelo seco durante 5 minutos. Durante o pré-arrefecimento, o molde foi coberto com uma placa de vidro para prevenir a 20 formação de gelo em excesso. Depois de derramada a mistura, o molde permaneceu no gelo seco durante 10 minutos e a mistura congelou. (O molde foi novamente coberto durante os últimos 7 minutos desta fase.) A placa congelada foi facilmente separada com uma espátula fria, foi transferida para uma tela metálica e mantida a -20°C durante 2 dias. Em seguida, o disco foi seco durante mais 2 dias à temperatura ambiente num exsicador sob vácuo suave (600 mtorr). A secagem provocou o encolhimento dos discos para * 0,5 cm de diâmetro e 0,1 - 0,2 cm de espessura.

Os sistemas de distribuição poliméricos foram imersos em meio PBS. Prepararam-se matrizes de EVAc na forma de discos de 0,5 cm de diâmetro e 1 - 2 mm de espessura contendo 22,35 μρ de TBPI em cada disco para experiências in vivo. Para experiências in vitro, os discos continham 4,47, 13,41 ou 22,35 μρ de TBPI (carga de 10%, 30% e 50%). A libertação da TBPI foi detectada por ELISA para TBPI em função do tempo (Aderka et al., 1991).

As Figs. 1 e 2 mostram o efeito da dimensão das partículas e carga de fármaco na cinética de libertação a partir de matrizes de EVAc. A dimensão das partículas afectou significativamente as velocidades de libertação do fármaco. Um aumento da dimensão das partículas aumentou as velocidades de libertação (Fig. 1) . O aumento da carga de fármaco aumentou uniformemente as velocidades de libertação do fármaco (Fig. 2). Não só aumentou a quantidade total de fármaco libertado, mas também aumentaram as velocidades de libertação. A dimensão das partículas e carga de fármaco afectaram acentuadamente a cinética de libertação dos sistemas de 21 distribuição poliméricos macromoleculares. Uma vez que as macromoléculas são demasiado grandes para se difundirem através do filme polimérico, é possível que ocorra libertação prolongada via difusão através de canais da matriz. A incorporação das macromoléculas durante a moldagem pode introduzir esses canais através dos quais o fármaco dissolvido se pode difundir. Os aumentos da velocidade de libertação causados por aumentos da dimensão das partículas podem dever-se à formação de canais maiores de poros na matriz polimérica. De modo semelhante, cargas aumentadas podem proporcionar vias mais simples (menor sinuosidade) e maior porosidade para a difusão, ambas as quais podem facilitar o movimento de água ou PBS para o interior da matriz e de proteína para fora da matriz.

EXEMPLO 2. Libertação controlada de sTNF-R p55 (TB-PI) a partir de microesferas de PLGA e PLLA

Prepararam-se microesferas de poli (ácido láctico-glicólico) (PLGA) ou ácido poli-L-láctico (PLLA) por um método de evaporação de solvente modificado utilizando uma emulsão dupla como descrito por Cohen et al., 1991. Em resumo, solução de TBPI ou pó de TBPI e BSA (preparado como descrito no Exemplo 1 acima), que foi dissolvido em água duplamente destilada, foi derramado em PLGA ou PLLA dissolvido em cloreto de metileno. A mistura foi submetida a sonicação com sonda (modelo VC-250, Sonic & Materials Inc.) durante 30 segundos, para formar a primeira emulsão interna (Wl/0). A emulsão foi derramada, com mistura vigorosa utilizando uma barra magnética, em 2 mL de álcool polivinílico (PVA) aquoso a 1% saturado em cloreto de metileno, para formar a segunda emulsão ((W1/0)W2). A emulsão dupla resultante foi derramada em 200 mL de PVA 0,1% e foi continuamente agitada durante 3 horas à 22 temperatura ambiente até a maior parte do cloreto de metileno se ter evaporado, deixando microesferas sólidas. As microesferas foram recolhidas por centrifugação (lOOOg durante 10 minutos) , foram dimensionadas utilizando crivos com aberturas de 100 μιη e foram liofilizadas (16 horas, Freeze Dryer, Lab Conco) num pó. A menos gue especificado em contrário, os estudos foram conduzidos com PLGA com uma razão de 75:25 e 50:50 (L/G) e PLLA.

Os sistemas de distribuição poliméricos foram imersos em PBS. Em cada experiência avaliaram-se 0,04 g de microesferas de PLGA ou PLLA contendo 18,2 μg de TBPI e detectou-se a libertação de TBPI por ELISA em função do tempo. A Fig. 3 mostra a libertação percentual cumulativa de TBPI a partir de diferentes copolímeros de PLGA (50:50 ou 75:25) ou microesferas de PLLA. Pode observar-se que, mesmo após 2200 horas, apenas 10 por cento da TBPI que tinha sido incorporada nas microesferas havia sido libertada. Também é mostrado, neste gráfico, que a libertação percentual cumulativa de TBPI a partir de polímeros aos quais a TBPI foi adicionada juntamente com BSA (TBP+BSA) (circulos, quadrados e triângulos pretos) é mais elevada do que a partir de amostras onde a TBPI foi adicionada sem BSA (circulos, quadrados e triângulos brancos). EXEMPLO 3. TBPI libertada a partir de matrizes poliméricas retém a sua actividade biológica in vivo em ratinhos inoculados com células CHO/TNFa

Como modo de monitorizar os efeitos prejudiciais crónicos do TNFa utilizou-se na experiência um modelo 23 animal bem conhecido quanto ao efeito de caquexia do TNFa, isto é, ratinhos nus balb implantados com células tumorais produtoras de TNFa (CHO/TNFa), como descrito por Oliff et al.r 1987.

Ratinhos nus Balb foram inoculados subcutaneamente com células CHO/TNFa (Korn et al., 1988) para desenvolver caquexia. As inoculações foram efectuadas utilizando suspensões submetidas a tripsinação de fresco de linhas de células a uma concentração de 1 x 107 células/mL (1 mL/ratinho). Administraram-se as injecções via aqulhas de calibre 23 em serinqas de plástico de 3 cc. As células foram injectadas subcutaneamente no dorso, pescoço ou reqião abdominal. Obtiveram-se amostras do soro várias vezes por semana por hemorragia da cauda. Avaliou-se o desempenho dos sistemas poliméricos, implantados cinco dias após a inoculação dos ratinhos com células CHO/TNFa, monitorizando os niveis de TBPI e TNFa no sangue, diminuição do peso e mortalidade.

Matrizes poliméricas de acordo com os Exemplos 1 e 2 acima foram implantadas ou injectadas nos ratinhos nus balb cinco dias após a inoculação subcutânea dos ratinhos com células CHO produtoras de TNFa, para desenvolver caquexia, e avaliou-se o seu desempenho monitorizando os niveis de TBPI e TNFa no sangue (ELISA) . Os parâmetros examinados foram os seguintes: (1) actividade biológica da TBPI em função do tempo; (2) comparação de tratamentos com TBPI com tratamento com anticorpos de ratinho contra o TNFa humano (dirigidos nos laboratórios dos inventores e denominados TNF-1) injectados uma vez (cinco dias após a inoculação dos ratinhos com células CHO/TNFa, marcados Ab-uma vez) ou 24 duas vezes com um intervalo de uma semana (cinco dias após a inoculação dos ratinhos com células CHO/TNFa e uma semana depois, marcados Ab-duas vezes); (3) a progressão de caquexia em termos do peso médio por grupo de ratinhos e mortalidade dos ratinhos, e (4) sitio da implantação (subcutânea no pescoço, dorso ou estômago). 0 TNFa pode causar caquexia e pode induzir perda de peso progressiva em animais com tumores. Examinou-se a eficácia in vivo das matrizes em ratinhos implantados com células tumorais produtoras de TNFa. Os ratinhos injectados com 1 x 107 células CHO/TNFa, que produzem constitutivamente TNFa a niveis elevados, exibiram caquexia grave e perda de peso, conducente à morte. Para os ratinhos que, adicionalmente, foram implantados com matrizes de polímeros contendo TBPI, o seu peso do corpo aumentou sem mortalidade, indicando que a TBPI libertada das matrizes proporcionou protecção de longa duração contra o TNFa.

Para avaliar a actividade biológica da TBPI nos ratinhos com tumores, recolheram- se amostras de soro em vários instantes e estimou-se a bioactividade do TNFa nessas amostras determinando a sua citotoxicidade para células MHA2 (um derivado de células HeLa que são sensíveis ao TNFa) . Como mostrado na Fig. 4b, a inoculação das matrizes contendo TBPI originou redução prolongada e significativa da bioactividade do TNFa no soro, indicando que a TBPI libertada das matrizes inibe fortemente a ligação do TNFa aos receptores do TNFa da superfície celular presentes nas células MHA2. 25

Para fins comparativos, os ratinhos foram injectados com anticorpos para o TNFa uma vez (cinco dias após a inoculação dos ratinhos com células CHO/TNFa, marcados Ab-uma vez) ou duas vezes (cinco dias após a inoculação dos ratinhos com células CHO/TNFa e uma semana depois, marcados Ab-duas vezes) . Como mostrado na Fig. 4a, os anticorpos afectaram o peso dos ratinhos apenas durante alguns dias após o instante da injecção (os ratinhos mantiveram o seu peso corporal) e seguidamente desenvolveram emaciação progressiva, ao passo que a TBPI, quando incorporada em polímeros, permaneceu no corpo durante um longo período de tempo. A curta duração do efeito de anticorpos anti-TNFa (TNF-1) injectados também se manifesta no padrão da bioactividade do TNFa nos soros dos ratinhos injectados com anticorpos, como mostrado na Fig. 4b.

Na Fig. 4c pode observar-se que ratinhos tratados com sistemas poliméricos que permitem a libertação controlada e localizada de TBPI sobreviveram durante mais de 50 dias, em contraste com ratinhos tratados com os anticorpos TNF-1, que não sobreviveram e desenvolveram caquexia quando foram terminadas as injecções de anticorpos.

Estes resultados indicam que o tratamento baseado na distribuição polimérica controlada de TBPI previne o desenvolvimento da síndroma de emaciação e poderá ser preferido à injecção de anticorpos para o TNFa, pois elimina a necessidade de injecções semanais e proporciona protecção de maior duração contra o TNFa. Além disso, sendo moléculas naturais, os receptores solúveis do TNFa 26 são mais adequados para utilização prolongada. Mais cedo ou mais tarde, os anticorpos anti-TNFa dirigirão anticorpos contra eles, o que irá prevenir a sua acção, e, em consequência, não são adequados para utilização prolongada. Isto também se verifica para anticorpos humanos ou humanizados que irão dirigir anticorpos anti-idiotípicos que bloquearão a sua função. Não há diferenças significativas na cinética de libertação de TBPI a partir de matrizes de EVAc implantadas no pescoço, dorso ou estômago de ratinhos em função do sitio de implantação das matrizes (Fig. 5) . A cinética de libertação da TBPI é constante em toda a extensão da libertação. EXEMPLO 4. Libertação de TBPI a partir de matrizes poliméricas retém a sua actividade biológica in vivo em ratinhos Tgl97 artríticos transgénicos

Avaliou-se o desempenho de matrizes de EVAc preparadas de acordo com o Exemplo 1 (implantadas subcutaneamente por pequena cirurgia 14 dias após o nascimento) em ratinhos Tgl97 transgénicos monitorizando os niveis de inchaço das articulações do tornozelo. A doença foi evidente cerca das 4-6 semanas de idade, com inchaço das articulações do tornozelo. Inchaço adicional das articulações do tornozelo e enfraquecimento dos movimentos das pernas progrediram para perda completa dos movimentos das pernas traseiras cerca das 9-10 semanas de idade. Além disso, a perda progressiva de peso foi uma caracteristica comum nestes ratinhos. No entanto, o tratamento destes ratinhos artríticos com matrizes de EVAc contendo TBPI preveniu completamente o inchaço das articulações do tornozelo (Fig. 6) . Além disso, os animais tratados desenvolveram-se 27 normalmente e não exibiram sinais de artrite ou perda de peso mesmo após as 10 semanas de idade.

Para fins comparativos, os ratinhos foram injectados aos 14 dias após o nascimento com anticorpos TNF-1 uma vez por semana durante todo o tratamento (65 dias) ou uma vez por semana durante 2 semanas. Como mostrado na Fig. 7, os anticorpos afectaram o inchaço apenas quando foram administrados uma vez por semana durante toda a experiência (colunas pretas). Os ratinhos que foram injectados semanalmente desenvolveram-se normalmente e não exibiram sinais de artrite ou perda de peso mesmo após as 10 semanas de idade, altura em que o enfraquecimento dos movimentos é uma caracteristica macroscópica comum nestes ratinhos. Contudo, os ratinhos que foram injectados uma vez por semana durante 2 semanas desenvolveram inchaço das articulações do tornozelo, e o enfraquecimento dos movimentos das pernas progrediu para perda completa dos movimentos das pernas traseiras cerca das 9-10 semanas de idade, com perda de peso progressiva.

Estes resultados indicam que o tratamento baseado na distribuição polimérica controlada de TBPI previne completamente o desenvolvimento de artrite em ratinhos e poderá ser preferido à injecção de anticorpos para o hTNFa, pois proporciona protecção de maior duração contra o TNFa e elimina a necessidade de injecções semanais. EXEMPLO 5. TBPI libertada a partir de matrizes poliméricas retém a sua actividade biológica in vivo em ratinhos Tg211 transgénicos

Ratinhos Tg211 transgénicos que expressam mRNA de TNF humano em células T desenvolveram alterações histológicas 28 acentuadas e uma síndroma de emaciação letal. Avaliou-se o desempenho dos sistemas poliméricos contendo TBPI, implantados 14 dias após o nascimento, monitorizando a diminuição de peso e mortalidade. Os animais individuais foram pesados várias vezes por semana. As matrizes de EVAc foram implantadas subcutaneamente por pequena cirurgia.

Como mostrado nas Figs. 8 e 10, os ratinhos não tratados (grupo de controlo: quadrados pretos) desenvolveram perda de peso progressiva grave, conducente a morte, ao passo que, para os ratinhos implantados com matrizes de EVAc contendo TBPI (círculos pretos), o seu peso corporal aumentou e sobreviveram durante toda a experiência.

Para fins comparativos, os ratinhos foram injectados 14 dias após o nascimento com anticorpos TNF-1 uma vez por semana durante toda a experiência ou uma vez por semana durante 2 semanas. Como mostrado na Fig. 9, a administração de anticorpos anti-TNFa preveniu completamente o desenvolvimento da síndroma de emaciação quando administrados semanalmente desde o nascimento. Todavia, quando administrados apenas uma vez por semana durante 2 semanas, não foram eficazes, e os ratinhos desenvolveram a síndroma de emaciação que conduziu à morte, como mostrado na Fig. 11.

Estes resultados indicam que o tratamento baseado na distribuição polimérica controlada de TBPI previne completamente o desenvolvimento da síndroma de emaciação em ratinhos e poderá ser preferido à injecção de anticorpos para o hTNFa. 29

Os resultados in vivo indicam que a TBPI libertada retém a sua actividade biológica, como mostrado pela alteração do peso médio do grupo (Fig. 4a) e a elevada percentagem de células MHA2 vivas que são sensíveis ao TNFa (Fig. 4b).

Referências 1. Aderka D. et al, ., Câncer Res., 51: 5602-5607 (1991) 2. Aderka D. et al. ., J. Exp. Med. , 175 : 323-329 (1992) - 3. Cohen S. et al., Pharm. Res. , 8: 713-720 (1991) . 4. Engelmann H. et al., J. Biol. Chem. ., 264: 11974-80 (1989) . 5. Engelmann H. et ai ., J. Biol. Chem., 265: 1531-36 (1990). 6. Korn J.H. et al., Lymphokine Res., 7: 349-358 (1988). 7. Langer R., Science, 249: 1527- 1533 (1990). 8. Loetscher H. et ai., Cell, 61: 351- 359 (1990). 9. Nophar Y. et al. ., EMBO J., 9: 3269- 78 (1990). 10. . Oliff A. et al, . , Cell, 50: 555-563 (1987). 11, . Olson I. et ai., Eur. J. Haematol., 42: 270-75 (1989) . 12. . Probert L. et al., J. Immunol., 151: 1894-1906 (1993). 13. . Rhine W.D. et al. , J. Pharm. Sei., 69: 265-270 (1980) . 14 , . Schall T.J. et al. , Cell, 61: 361- 370 (1990). 15. Seckinger P. et al. , J. Biol. Chem., 264: 11966-973 (1989). 16. . Wallach D. et ai., J. Immunol ., 132: 2464-69 (1984 ) ·

Lisboa, 26 de Janeiro de 2009

Claims (24)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma matriz polimérica biocompatível tendo incorporado um receptor solúvel do TNFa, em que o referido receptor é incorporado no referido material polimérico de modo a permitir a libertação controlada de uma quantidade do receptor solúvel do TNFa eficaz para melhorar os efeitos prejudiciais do TNFa, para a preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento de perturbações onde é requerida uma melhoria dos efeitos prejudiciais do Factor de Necrose Tumoral-α.

2. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a referida matriz polimérica é um polimero biocompativel não degradável seleccionado do grupo que consiste em copolimeros de etileno-acetato de vinilo (EVAc), borrachas de silicone, polissacáridos, poliamidas, poliacrilatos, polietilenos, poliuretanos, poliisobutileno e polifosfazenos.

3. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a referida matriz polimérica é um polimero biocompativel biodegradável seleccionado do grupo que consiste em poliésteres, polianidridos, poliortoésteres, policaprolactona, pseudopoliaminoácidos, polipéptidos, gelatina, ácido poliláctico, ácido poliglicólico e copolimeros de poli(ácido láctico-glicólico) (PLGA).

4. Utilização de acordo com a Reivindicação 2, em que o polimero é polietileno-acetato de vinilo.

5. Utilização de acordo com a Reivindicação 3, em que o polimero é poli(ácido láctico-glicólico). 2

6. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que o receptor solúvel do TNFa é o receptor solúvel do TNFa p55 (sTNF-R p55).

7. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que o receptor solúvel do TNFa é o receptor solúvel do TNFa p75 (sTNF-R p75).

8. Utilização de acordo com a Reivindicação 1 para 0 tratamento de choque séptico.

9. Utilização de acordo com a Reivindicação 1 para 0 tratamento de caquexia . associada a cancro.

10 . Utilização de acordo com a Reivindicação 1 para 0 tratamento de doenças autoimunes.

11. Utilização de acordo com a Reivindicação 10 para o tratamento de artrite reumatóide.

12 . Utilização de acordo com a Reivindicação 11, que também compreende um aqente anti-inflamatório.

13. Utilização de acordo com a Reivindicação 10 para o tratamento de esclerose múltipla.

14 . Utilização de acordo com a Reivindicação 13, compreendendo outro agente para o tratamento de esclerose múltipla.

15. Utilização de acordo com a Reivindicação 10 para o tratamento de lúpus eritematoso sistémico.

16. Utilização de acordo com a Reivindicação 1 para o tratamento de reacção de enxerto-versus-hospedeiro. 3

17. Utilização de acordo com a Reivindicação 1 para o tratamento de perturbações de hipersensibilidade da pele do tipo retardado.

18. Utilização de acordo com a Reivindicação 4 na forma de implante.

19. Utilização de acordo com a Reivindicação 5 na forma de implante.

20. Utilização de acordo com a Reivindicação 5 na forma de inj ecção.

21. Utilização de acordo com a Reivindicação 18 para injecção local no fluido sinovial para o tratamento de inflamação das articulações em artrite reumatóide.

22. Utilização de acordo com a Reivindicação 18 para injecção intratecal no fluido cerebrospinal para o tratamento de esclerose múltipla.

23. Utilização de acordo com a Reivindicação 17 para aplicação tópica.

24. Utilização de acordo com a Reivindicação 14, em que o referido outro agente é beta interferão ou Copolímero-1. Lisboa, 26 de Janeiro de 2009