PT880970E - Composições farmacêuticas que compreendem uma anticitoquina para a terapia de esclerose múltipla. - Google Patents

Description

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Descrição "Composições farmacêuticas que compreendem uma anticitoquina para a terapia de esclerose múltipla" A presente invenção diz respeito à utilização de uma Proteína de Ligação do Factor de Necrose de Tumor ("Tumor Necrosis Factor" (TNF)), no seguimento designada por TBP, para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de esclerose múltipla. 0 Factor de Necrose de Tumor ("Tumor Necrosis Factor" (TNF)) é uma citoquina multifuncional envolvida na protecção do organismo, mas quando produzida em excesso pode desempenhar um papel patogénico maior em diversas doenças. 0 TNF é conhecido por se encontrar envolvido e processos inflamatórios e como sendo um mediador dos danos dos tecidos em doenças reumáticas (Beutler, B. e Cerami, C. (1987) NEJM 316:379-385) e nos danos observados em reacções de enxerto-versus-hospedeiro (Piguet, P.F. et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1280-89) .

Duas proteínas de ligação do TNF, designadas por TBP-I e TBP-II foram primeiramente descritas nos pedidos de patente de invenção israelitas N.os 83878 e 90339 ou nos pedidos de patentes de invenção europeias correspondentes EP-A-308 378 e EP-A-398 327, respectivamente, da mesma

Requerente, e ilustram como proteger células da toxicidade do TNF e como interferir com a ligação do TNF às células. Estudos posteriores mostraram que estas duas proteínas são estruturalmente afins de duas espécies moleculares dos receptores da superfície da célula do TNF (TNF-R) e que, na verdade, o TBP-I é afim de uma forma solúvel do receptor TNF tipo I, enquanto o TBP-II é afim de uma forma solúvel do receptor do TNF tipo II (Engelmann, H. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:11974-11980; engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1531-1536). Tal como os receptores das 2 superfícies das células para o TNF, as formas solúveis desses receptores ligam especificamente o TNF e podem, deste modo, interferir com as suas ligações às células, funcionando como inibidores fisiológicos da actividade do TNF.

Embora a função principal do sistema imune seja proteger um indivíduo contra infecções por invasores estranhos tais como microrganismos, pode acontecer que o sistema imune ataque os próprios tecidos do indivíduo, conduzindo a estados patológicos conhecidos como doenças auto-imunes, as quais se encontram frequentemente associadas a processos inflamatórios. Exemplos de doenças auto-imunes são artrite reumatóide, ataque juvenil tipo I de diabetes melitus, lúpus eritematoso sistémico, tiroidite e esclerose múltipla. A artrite reumatóide é uma doença marcada por sinais e sintomas de inflamação das articulações. 0 lúpus eritematoso sistémico (SLE) é caracterizado por manchas com escamas vermelhas sobre a pele e por um mau funcionamento dos rins num estádio avançado da doença e encontra-se associado a reacções inflamatórias desencadeadas pela deposição de complexos imunes nos vasos sanguíneos, em particular nos rins. A esclerose múltipla é uma doença dos seres humanos caracterizada por condições inflamatórias de relapso que podem provocar fraqueza, tremuras do corpo e, em casos extremos, paralisia, e encontra-se associada com o ataque do sistema imune do escudo protector mielino que rodeia as células dos nervos periféricos. 0 TNF tem sido associado aos processos inflamatórios em lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatóide e esclerose múltipla.

Nos pedidos de patente de invenção europeia publicados da mesma Requerente N.os 398327 e 412486, descreve-se que em pacientes SLE os níveis de soro tanto de TBP-I como de 3 TBP-II são significativamente elevados e em correlação com a actividade da doença, o que indica que as TBP-I e TBP-II podem ser usadas como marcadores sensíveis da actividade da doença e podem ser úteis no controlo da activação imune relacionada com a actividade da doença em pacientes SLE bem como em pacientes com outras doenças auto-imunes.

Constatou-se agora, de acordo com a presente invenção, que as proteínas de ligação do facto de necrose de tumor são úteis no tratamento de doenças de esclerose múltipla. Julga-se que as TBPs complementam a actividade fisiológica dos receptores endógenos solúveis do TNF, tipos I e II, cuja formação em doenças auto-imunes é sugerida como constituindo um mecanismo de salvaguarda contra a sobre--resposta aos efeitos de danificação do TNF.

Por consequência, a presente invenção proporciona a utilização de uma proteína de ligação do factor de necrose de tumor, no seguimento designada como TBP, um sal, um derivado funcional, um precursor ou uma sua fracção activa, ou combinações dos anteriores, para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de esclerose múltipla.

As TBPs para utilização nas composições de acordo com a presente invenção podem ser obtidas a partir de fontes naturais, tais como urina humana (Engelmann, H. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:11974-11980; Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1531-1536; Olson, I. et al., (1989) Eur. J. Haematol, 42:270-275; Seckinger, P. et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:11966-11973) ou mediante técnicas recombinantes (Nophar, Y. et al., (1990) EMBO J. 9 : 3269--3278; Schall, T. J. Et al. , (1990) Cell. 61 : 361-370; Loetscher, H. et al., (1990) Cell 61 : 351-359) e em seguida purificadas tal como descrito nos referidos pedidos de patente de invenção israelitas N.° 83878 e 90339. 4

Tal como utilizados na presente memória descritiva, os termos "TBPs", "TBP-I" e "TBP-II" referem-se a todas as proteínas de ligação do TNF a partir de fontes naturais ou obtidas por técnicas do ADN recombinante, incluindo, mas sem ficar limitado a estas, as proteínas de ligação TNF I e II descritas nos pedidos de patente de invenção israelitas N.° 83878 e 90339, bem como as formas solúveis das superfícies celulares dos receptores de TNF tipos I e II, e sais, derivados funcionais, precursores e fracções activas dos anteriores, sendo estas últimas definições tal como definidas nos pedidos de patente de invenção israelitas números 83878 e 90339.

Pretende-se que a expressão "aceitável sob o ponto de vista farmacêutico" abranja qualquer veículo que não interfira com a eficácia da actividade biológica do ingrediente activo e que seja não tóxico para o hospedeiro ao qual é administrado. Por exemplo, para administração parentérica, a TBP pode ser formulada sob uma forma unitária de dosagem para injecçâo em veículos tais como soro fisiológico, solução de dextrose, albumina de soro normal e solução de Ringer. Pode ser apropriado qualquer modo de administração parentérica, incluindo administração intravenosa, intramuscular e subcutânea. Contudo, pode preferir-se a administração local, se se pretender tratar uma inflamação local, por exemplo injecçâo local para tratar a inflamação na artrite reumatóide, ou injecçâo no fluido cerebroespinal na esclerose múltipla. Além do veículo sob o ponto de vista farmacêutico, as composições de acordo com a presente invenção compreendem também quantidades menores de aditivos, tais como estabilizantes, excipientes, tampões e conservantes. A expressão "quantidade efectíva" refere-se a uma quantidade de TBP que é suficiente para afectar o curso e a 5 gravidade da doença auto-imune e para melhorar o estado do paciente, levando à redução ou à remissão da doença. A quantidade eficaz dependerá da via de administração, da doença a tratar e do estado do paciente. A determinação do nível de TBP-I e TBP-II no soro ou em outro fluido apropriado do corpo do paciente, pode ajudar a estabelecer a dose apropriada para o referido paciente, tendo em consideração que a TBP administrada exogenamente pode complementar a TBP formada endogenicamente ao neutralizar a actividade deletéria do TNF. A invenção será ilustrada pelos exemplos seguintes. Em alguns dos exemplos, utilizaram-se modelos animais de doenças auto-imunes experimentais (Cohen, I.R. (1985) J. Invest. Dermatol. 85:34a-38s).

Exemplo de Referência 1 : Tratamento de artrite adjuvante em ratos inocularam-se os ratos A artrite adjuvante é uma doença experimental caracterizada por uma inflamação crónica das articulações, susceptivel de ser induzida em determinadas estirpes de ratos mediante imunização com adjuvante completo de Freund ou com fracções de Microbacterium tuberculosis, e é considerada como sendo um modelo de artrite reumatóide (Pearson, C.M. (1964) Arthritis Rheum. 7:80-86). A doença aparece cerca de 11-12 dias após a imunização e é caracterizada por uma infiltração de células mononucleares da sinóvia, mais proeminente nas articulações pequenas das extremidades, com formação de panos, um processo que pode progredir durante meses e do que resulta a destruição dos ossos e anquilose das articulações. Imunizam-se ratos Lewis com M. tuberculosis (1 mg) em óleo para induzir a artrite adjuvante (Pearson, C.M. (1956) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 91:95-101). Alguns dias mais tarde, antes ou após o início de artrite clínica notória, 6 subcutaneamente com diferentes doses de TBP-I ou TBP-II uma vez ou diariamente durante vários dias, e classificaram-se então quanto ao desenvolvimento da artrite numa escala de 0-16 conforme descrito em (Holoshitz, Y. et al., (1983) Science, 29:56-58). As doses que inibem o aparecimento ou produzem uma inibição parcial de doença são doses eficazes. As doses óptimas são as administradas após o inicio da doença que suprimem o curso e provocam uma remissão permanente da doença. As doses apropriadas para os pacientes humanos podem ser calculados a partir destas doses.

Exemplo 2 : Tratamento de encefalomielite auto-imune experimental (EAE) em ratos A encefalomielite auto-imune experimental (EAE) é uma doença experimental susceptivel de ser induzida numa variedade de espécies: ratos, cobaias, murganhos, coelhos, etc. mediante imunização com matéria branca do sistema nervoso central ou com a proteína básica de mielina ou um seu fragmento. É considerada como sendo um modelo de esclerose múltipla e, semelhante a esta perturbação humana neurológica, EAE é uma perturbação auto-imune em que o sistema imune ataca o escudo protector de mielina que rodeia as células nervosas periféricas. A doença é caracterizada clinicamente por paralisia aguda e histologicamente por células mononucleares que se infiltram em torno dos vasos sanguíneos na matéria branca do sistema nervoso central (Cohen, I.R., ver acima). Injectaram-se os ratos com BP de cobaia ou o fragmento principal encefalitogénico de BP (aminoácidos 68-88) num adjuvante apropriado tal como adjuvante completo de Freund para induzir EAE. Um dia antes da inoculação e diariamente durante dez dias, os ratos recebem quer soro fisiológico (controlo) ou diferentes doses de TBP-I ou TBP-II. Os ratos 7 são observados no que toca ao desenvolvimento da paralisia. As doses que inibem a gravidade da doença devem ser consideradas doses eficazes.

Exemplo de Referência 3 : Correlação entre os níveis de soro de TBP-I e TBP-II e anticorpos anti-dsADN em pacientes SLE

Determinou-se os níveis de TBP-I e TBP-II no soro de 38 pacientes SLE e em 140 controlos saudáveis pelo método ELISA descrito nos pedidos de patente de invenção europeia publicados n.°s 398327 e 412486. As concentrações de soro (média + SD) de TBP-I e TBP-II no grupo testemunha foram iguais a 0,77 + 0,19 ng/ml e 3,02 + 0,57 ng/ml, respectivamente. Estes valores eram independentes da idade e do sexo. Nos pacientes SLE, observaram-se concentrações significativamente maiores de TBP-I e TBP-II. As concentrações médias + SD foram, para TBP-I 1,89 + 0,89 ng/ml e para TBP-II 7,25 + 3,89 ng/ml.

Comparou-se os resultados dos niveis de anticorpos anti-dsADN, um parâmetro considerado como sendo um indicador fiável e sensivel da actividade da doença SLE. O exame rigoroso da extensão da correlação das TBPs com os anticorpos anti-dsADN em pacientes individuais revelou três subgrupos distintos de pacientes, tal como ilustrado no Quadro 1:

Grupo 1 - Pacientes com níveis normais de anticorpos anti--dsADN e concentrações normais de TBP-I (9 pacientes) ou TBP-II (11 pacientes).

Grupo 2 - Pacientes com niveis normais de anticorpos anti--dsADN mas concentrações elevadas de TBP-I (18 pacientes) ou TBP-II (16 pacientes).

Grupo 3 - Pacientes com elevação de todos os três parâmetros (11 pacientes).

Embora ambos os grupos 2 e 3 exibam niveis aumentados de TBP, eles diferem significativamente não só pela extensão do aumento de anticorpos para dsADN, mas também para outros parâmetros de actividade da doença (Quadro I), Comparado com o grupo 2, o grupo 3 tinha um índice de doença médio superior (1,7 + 0,6 vs 2,4 + 0,8, p < 0,02), níveis inferiores de complemento C4 (9,4 + 4 vs 30 + 13 mg/dl, p < 0,001) e uma absorção média de prednisona superior (20,7 ξ 17,7 vs 9 + 9 mg/dia, p < 0,05). A formação aumentada de TBP-I e TBP-II, que correspondem aos receptores solúveis de TNF tipo I e de tipo II, respectivamente, pode constituir um mecanismo antagonístico do organismo para antagonizar os efeitos de danificação do TNF nas doenças auto-imunes. A detecção de um subgrupo de pacientes SLE neste estudo, em que existe uma elevação significativa das TBPs, embora apenas um aumento marginal na actividade da doença, é consistente com a noção de que as TBPs podem atenuar a progressão desta doença e uma indicação de que as TBPs podem ser utilizadas como agente terapêutico em SLE.

Exemplo de Referência 4 : Bioactividade das TBPs no soro de pacientes SLE - Inibição da citotoxicidade do TNF A fim de avaliar a bioactividade do soro das TBPs, ensaiaram-se amostras de soro por um ensaio de citotoxicidade do TNF. A actividade citocídica de TNF foi determinada recorrendo a células murinas A9 como alvos. Semearam-se as células em microplacas com 96 cavidades para uma densidade de 20 000 células por cavidade. Decorridas 24 horas, decantaram-se os sobrenadantes. Colocaram-se as células sobre gelo e aplicou-se rhuTNF (5 unidades/ml, 6xl07 unidades/mg de proteína) isoladamente ou em conjunto com amostras de soro com ou sem anticorpos adicionados às TBPs (tal como descrito nos pedidos de patente de invenção 9 europeia publicados 398327 e 412486) ou com amostras de TBPs purificadas isoladas a partir de urina humana. Após incubação adicional sobre gelo durante 90 minutos, decantaram-se as amostras e enxaguaram-se as placas duas vezes com meio frio à temperatura de 4°C. Isto foi seguido pela adição de Meio Essencial Mínimo Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal de vitela e 25 mg/ml de ciclo-heximida. Determinou-se a viabilidade das células 12 horas mais tarde pelo ensaio da absorção de vermelho neutro.

Ensaiaram-se exemplos de roso de pacientes com SLE pelo ensaio anterior e mostrou-se que protegiam as células A9 do efeito citocíico de TNF. A extensão da inibição correlaciona-se com a observada por aplicação das TBPs purificadas a partir de urina em quantidades idênticas às apresentadas no soro. Anti-soros de coelho para as TBPs, que por si sós não tinham qualquer efeito sobre o ensaio de citotoxicidade A9, bloquearam o efeito inibidor dos soros humanos neste ensaio, confirmando assim a ideia de que a inibição da bioactividade do TNF observada era unicamente devida à bioactividade das TBPs presentes no soro. Isto indica que as TBPs podem ser eficazes na neutralização da bioactividade do TNF in vivo, sendo capazes de proteger os pacientes dos danos provocados por TNF em doenças auto--imunes.

Quadro 1

Grupo TBP Anti-dsADN Ab 1 Gama Normal Gama Normal 2 .Al tcl Gama Normal 3 Alta Alta TBP-I N.° de Pacientes 9 18 11 TBP-I íng/ml) 0,94 ± 0,14 2,15 ± 0,89 2,17 ± 0,86 Anti-dsADN Ab% índice de Doença 10,2 ± 6,62 5,58 ± 6,04 53 ± 25 Absorção de Prednisona (mg/dia) 1,33 ± 0,5 0 1,64 ± 0,6 9 ± 9 2,42 ± 0,82 20,7 ± 17,9

Complemento C3 Complemento C4 - 126 ± 34 30 ±13,2 67 ± 36 9 ± 4, 6 TBP-II N.° de Pacientes 11 16 11 TBP-II (ng/ml) 3,54 ± 0,75 8,06 ± 1,98 8,57 ± 2,61 Anti-dsADN Ab% 10,2 ± 7 5,3 ± 5,9 51 ± 25 índi ce de Doença 1,18 ± 0,4 1,78 ± 0,57 2,41 ± 0,79 Absorção de Prednisona (mg/dia) 0 7,6 ± 9,5 20,7 + 18,8 Complemento C3 124,8 + 32 67 + 36 Complemento C4 32,5 ± 12,6 9 ± 4

Lisboa, 23 de Outubro de 2006

Claims (6)

1 Reivindicações 1. Utilização de uma proteína de ligação do factor de necrose de tumor (TBP), um sal, um derivado funcional, um precursor ou uma sua fracção activa, ou associações dos anteriores, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de esclerose múltipla.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o TBP ser TBP-I, TBP-II, ou as suas combinações.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de o TBP ser TBP-I natural.

4. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de o TBP ser TBP-I recombinante.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de o TBP ser TBP-II natural.

6. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de o TBP ser TBP-II recombinante. Lisboa, 23 de Outubro de 2006