ES2270479T3 - Utilizacion de composiciones farmaceuticas que contienen una anticitoquina para el tratamiento de esclerosis multiple. - Google Patents

Abstract

LAS PROTEINAS DE UNION AL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL (TBP) RESULTAN UTILES EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES Y REACCIONES DEL HUESPED FRENTE AL INJERTO.

Description

Utilización de composiciones farmacéuticas que contienen una anticitoquina para el tratamiento de esclerosis múltiple.

La presente invención se refiere al uso de una proteína de unión a factor de necrosis de tumor (TNF), en el presente documento denominada TBP, para la fabricación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de esclerosis múltiple.

El factor de necrosis de tumor (TNF) es una citoquina multifuncional que participa en la protección del organismo, pero que cuando se produce en exceso, puede desempeñar una función mayor patógena en diversas enfermedades. Se sabe que TNF participa en procesos inflamatorios y que es un mediador del daño de tejidos en enfermedades reumáticas (Beutler, B., y Cerami, C. (1987) NEJM 316:379-385) y del daño observado en reacciones de injerto frente a huésped (Piguet, P.F. y cols., (1987) J. Exp. Med. 166:1280-89).

En las solicitudes de patente de Israel Nº 83878 y 90339, o las solicitudes de patente europea correspondientes EP-A-308.378 y EP-A-398327, respectivamente, del mismo autor de la solicitud, se describieron por primera vez dos proteínas de unión a TNF, designadas TBP-I y TBP-II, y se demostró que protegían a las células de la toxicidad de TNF y que interferían con la unión de TNF a células. Estudios posteriores han demostrado que estas dos proteínas están relacionadas estructuralmente con dos especies moleculares de los receptores de TNF de superficie celular (TNF-R) y que, de hecho, TBP-I está relacionada con una forma soluble del receptor tipo I de TNF, mientras que TBP-II está relacionada con una forma soluble del receptor tipo II de TNF (Engelmann, H. y cols. (1989) J. Biol. Chem. 264:11974-11980; Engelmann H. y cols., (1990) J. Biol. Chem. 265:1531-1536). Al igual que los receptores de superficie celular para TNF, las formas solubles de estos receptores se unen específicamente a TNF y pueden interferir de este modo con su unión a células, funcionando como inhibidores fisiológicos de la actividad de TNF.

Si bien la función primaria del sistema inmune consiste en proteger a un individuo frente a la infección de invasores extraños, como por ejemplo microorganismos, puede suceder que el sistema inmune ataque a los tejidos del propio individuo, conduciendo a estados patológicos conocidos como enfermedades autoinmunes, que están asociadas frecuentemente con procesos inflamatorios. Entre los ejemplos de enfermedades autoinmunes se incluyen artritis reumatoide, diabetes melitus tipo I de inicio en la juventud, lupus sistémico eritomatoso, tiroiditis y esclerosis múltiple. La artritis reumatoide es una enfermedad marcada por los signos y síntomas de inflamación de las articulaciones. El lupus sistémico eritematoso (SLE) se caracteriza por parches escamosos rojizos en la piel y por una disfunción renal en el estadio avanzado de la enfermedad y está asociado con reacciones inflamatorias disparadas por el depósito de complejos inmunes en los vasos sanguíneos, en particular, en los riñones. La esclerosis múltiple es una enfermedad humana caracterizada por estados patológicos recurrentes inflamatorios que pueden causar debilidad, temblores del cuerpo y, en los casos extremos, parálisis, y que está asociada con el ataque del sistema inmune de la envoltura de mielina protectora que rodea las células nerviosas periféricas. Se ha asociado TNF con procesos inflamatorios en lupus sistémico eritematoso, artiritis reumatoide y esclerosis múltiple.

En las solicitudes de patente europea publicadas del mismo autor de la solicitud, Nº 398327 y 412486, se describe que en los pacientes con SLE, los niveles en suero tanto de TBP-I como TBP-II son significativamente elevados y en correlación con la actividad de la enfermedad, lo que indica que TBP-I y TBP-II se pueden utilizar como marcadores sensibles de la actividad de la enfermedad y pueden ser útiles para llevar un seguimiento de la activación inmune en relación con la actividad de la enfermedad en pacientes con SLE así como en pacientes con otras enfermedades autoinmunes.

Se ha observado ahora, con arreglo a la presente invención, que las proteínas de unión a factor de necrosis de tumor son útiles en el tratamiento de esclerosis múltiple. Se cree que las TBPs complementan la actividad fisiológica de los receptores de TNF solubles endógenos, tipos I y II, cuya formación en enfermedades autoinmunes, como esclerosis múltiple, según se sugiere, constituye un mecanismo de salvaguarda contra la respuesta excesiva a los efectos dañinos de TNF.

Por consiguiente, la presente invención proporciona el uso de una proteína de unión a factor de necrosis de tumor, aquí designada TBP, una sal, un derivado funcional, un precursor o una fracción activa del mismo o, combinaciones de ellos, para su uso en la fabricación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de esclerosis múltiple.

Las TBPs para su uso en las composiciones de la presente invención pueden obtenerse de fuentes naturales, como por ejemplo, orina humana (Engelmann. H. y cols., (1989) J. Biol. Chem. 264:11974-11980; Engelmann, H. y cols., (1990) J. Biol. Chem. 265:1531-1536; Olson, I. y cols. (1989) Eur. J. Haematol. 42:270-275; Seckinger, P. y cols. (1989) J. Biol. Chem. 264: 11966-11973) o por técnicas de recombinación (Nophar, Y. y cols. (1990) EMBO J. 9: 3269-3278; Schall, T.J. y cols. (1990) Cell. 61:361-370; Loetscher, H. y cols., (1990) Cell 61:351-359) y purificarse después tal como se describe en las solicitudes de patente de Israel antes mencionadas, Nº 83878 y
90339.

Tal como se utiliza aquí, las expresiones "TBPs" y "TBP-I" y "TBP-II" se refieren a todas las proteínas de unión a TNF de fuentes naturales o las obtenidas a través de técnicas de ADN recombinante, incluyendo, sin limitarse sólo a ellas, las proteínas de unión a TNF I y II descritas en las solicitudes de patente de Israel 83878 y 90339, así como las formas solubles de los receptores de TNF de superficie celular tipos I y II, y sales, derivados funcionales, precursores y fracciones activas de los mismos, definiéndose estos últimos en las solicitudes de patente de Israel 83878 y 90339.

Se pretende que la expresión "farmacéuticamente aceptable" abarque cualquier vehículo que no interfiera con la actividad biológica del ingrediente activo y que no sea tóxico para el huésped al que se administra. Por ejemplo, para administración parenteral, se puede formular TBP en una forma de dosis unitaria para inyección en vehículos como solución salina, solución de dextrosa, albúmina de suero normal y solución de Ringer. Cualquier modo de administración parenteral puede ser adecuado, incluyendo administración intravenosa, intramuscular y subcutánea. Puede ser preferible la administración local, sin embargo, si se va a tratar una inflamación local, v.g., inyección local para tratar inflamación articular en artritis reumatoide, o inyección en el fluido cerebroespinal en esclerosis múltiple. Además del vehículo farmacéuticamente aceptable, las composiciones de la presente invención, también comprenderán cantidades menores de aditivos, como estabilizantes, excipientes, tampones y conservantes.

La expresión "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de TBP que es suficiente para afectar al curso y severidad de la enfermedad autoinmune y para mejorar el estado del paciente, llevando a una reducción o remisión de la enfermedad. La cantidad efectiva dependerá de la ruta de administración, la enfermedad que se va a tratar y el estado del paciente. La determinación del nivel de TBP-I y TBP-II en suero y otros fluidos corporales adecuados del paciente, puede ayudar a establecer una dosis adecuada para dicho paciente, considerando que la TBP administrada exógenamente puede complementar la TBP formada endógenamente para neutralizar la actividad negativa del TNF.

La invención quedará mejor ilustrada con los siguientes ejemplos. En algunos de los ejemplos, se emplean modelos animales de enfermedades autoinmunes experimentales (Cohen, I.R. (1985) J. Invest. Dermatol. 85:34s-38s).

Ejemplo de referencia 1

Tratamiento de artritis adyuvante en ratas

La artritis adyuvante es una enfermedad experimental caracterizada por una inflamación crónica de las articulaciones, que se puede inducir en determinadas cepas de ratas por inmunización con adyuvante de Freund completo o con fracciones de tuberculosis de Micobacterium, y se considera como modelo de artritis reumatoide humana (Pearson, C.M. (1964) Arthritis Rheum. 7:80-86). La enfermedad aparece aproximadamente 11-12 días después de la inmunización, y se caracteriza por una infiltración celular mononuclear en la sinovia, siendo sobre todo prominente en las articulaciones pequeñas de las extremidades, con formación de panus, un proceso que puede progresar durante meses con el resultado de la destrucción de los huesos y anquilosis de las articulaciones. Se inmunizan ratas de Lewis con M. tuberculosis (1 mg) en aceite para inducir artritis adyuvante (Pearson, C.M. (1956) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 91:95-101). Algunos días después, antes o después del inicio de la artritis clínica abierta, se inocula a las ratas subcutáneamente con diferentes dosis de TBP-I o TBP-II una vez al día durante varios días y después se les hace la evaluación sobre el desarrollo de artritis en una escala de 0 a 16, tal como se describe (Holoshitz, Y. y cols. (1983) Science, 219:56-58). Las dosis que inhiben la aparición o producen una inhibición parcial de la enfermedad son dosis efectivas. Las dosis óptimas son aquellas que se administran tras el inicio de la enfermedad, que suprimen su curso y causan una remisión permanente de la enfermedad. Las dosis adecuadas para pacientes humanos se pueden calcular a partir de estas dosis.

Ejemplo 2 Tratamiento de encefalomielities autoinmune experimental (EAE) en ratas

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es una enfermedad experimental que se puede inducir en diversas especies: ratas, cobayas, ratones, conejos, etc. por inmunización con la sustancia blanca del sistema nervioso central o con la proteína básica de mielina o un fragmento de la misma. Se considera que es un modelo de esclerosis múltiple y, de modo similar a este trastorno humano neurológico, EAE es un trastorno autoinmune en el que el sistema inmune ataca a la envoltura de mielina protectora que rodea las células nerviosas periféricas. La enfermedad se caracteriza clínicamente por una parálisis aguda e histológicamente por infiltrados celulares mononucleares alrededor de los vasos sanguíneos en la sustancia blanca del sistema nervioso central (Cohen, I.R., ver anterior). Se inyecta a las ratas con BP de cobaya o el fragmento ecefalitogenético principal de BP (amino ácidos 68-88) en un adyuvante adecuado como por ejemplo adyuvante de Freund completo para inducir EAE. Un día antes de la inoculación y diariamente durante diez días, las ratas reciben o bien solución salina (control) o bien diferentes dosis de TBP-I o TBP-II. Se observa a las ratas para determinar el desarrollo de parálisis. Las dosis que inhiben la severidad de la enfermedad han de considerarse como dosis efectivas.

Ejemplo 3 Correlación entre los niveles en suero de TBP-1 y TBP-II y anticuerpos anti-dsADN en pacientes SLE

Se determinaron los niveles de TBP-I y TBP-II en los sueros de 38 pacientes con SLE y 140 controles sanos a través del método ELISA descrito en las solicitudes de patente europea publicadas Nº 398327 y 412486. Las concentraciones en suero (media \pm desviación típica) de TBP-I y TBP-II en el grupo de control fueron 0,77 \pm 0,19 ng/ml y 3,02 \pm 0,57 ng/ml, respectivamente. Estos valores fueron independientes de la edad y el sexo. En los pacientes con SLE, se observaron concentraciones significativamente mayores de TBP-I y TBP-II. Las concentraciones medias \pm desviación típica fueron para TBP-I, 1,89 \pm 0,89 ng/ml y, para TBP-II, 7,25 \pm 3,89 ng/ml.

Se compararon los resultados con los niveles de anticuerpos anti-dsADN, un parámetro considerado como un indicador fiable y sensible de la actividad de enfermedad SLE. Un examen más detenido del grado de correlación de las TBP con los anticuerpos anti-dsADN en los pacientes individuales reveló 3 subgrupos diferenciados de pacientes, tal como se muestra en la tabla 1:

Grupo 1

- Pacientes con niveles normales de anticuerpos anti-dsADN y concentraciones normales de TBP-I {}\hskip0.2cm (9 pacientes) o TBP-II (11 pacientes).

Grupo 2

- Pacientes con niveles normales de anticuerpos anti-dsADN pero con concentraciones elevadas de {}\hskip0.2cm TBP-I (18 pacientes) o TBP-II (16 pacientes).

Grupo 3

- Pacientes con elevación de los tres parámetros (11 pacientes).

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Si bien los dos grupos 2 y 3 presentaron mayores niveles de TBP, se diferenciaron significativamente no sólo en el grado de aumento de anticuerpos para dsADN, sino también en otros parámetros de actividad de enfermedad (Tabla 1). En comparación con el grupo 2, el grupo 3 presentó un índice de enfermedad medio más alto (1,7 \pm 0,6 frente a 2,4 \pm 0,8, p <0,02), niveles de complemento C4 más bajos (9,4 \pm 4 frente a 30 \pm 13 mg/dl p < 0,001) y un consumo de prednisona medio más alto (20,7 \equiv 17,7 frente a 9\pm9 mg/día p < 0,05).

La mayor formación de TBP-I y TBP-II, que corresponde a los receptores de TNF solubles tipo I y tipo II, respectivamente pueden constituir un mecanismo antagonista del organismo para antagonizar los efectos dañinos del TNF en enfermedades autoinmunes. La detección de un subgrupo de pacientes SLE en este estudio, en el que existe una significativa elevación de la TBP, aun siendo sólo marginal el aumento de la actividad de la enfermedad, se corresponde con la noción de que las TBPs pueden atenuar la progresión de esta enfermedad, así como una indicación de que se pueden utilizar las TBPs como agente terapéutico en SLE.

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Ejemplo de referencia 4

Bioactividad de TBPs en los sueros de pacientes con SLE - Inhibición en la citotoxicidad de TNF

Con el propósito de evaluar la bioactividad de las TBPs en suero, se sometieron a ensayo muestras de suero por ensayo de citotoxicidad de TNF. Se determinó la actividad citocida de TNF utilizando células A9 murínicas como dianas. Se sembraron las células en microplacas de 96-pocillos a una densidad de 20.000 células/pocillo. Al cabo de 24 horas, se decantaron los sobrenadantes. Se colocaron las células sobre hielo y se aplicó rhuTNF (5 unidades /ml, 6 x 10^{7} unidades/mg proteína) en solitario o en combinación con muestras de suero con o sin añadir anticuerpos a las TBPs (descrito en las solicitudes de patente europea publicadas 398327 y 412486) o con muestras de TBPs purificadas aisladas de orina humana. Tras la incubación adicional en hielo durante 90 minutos, se decantaron las muestras y se enjuagaron las placas dos veces con medio frió a 4ºC. Esto fue seguido de la adición de medio esencial mínimo de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) que contenía 10% de suero de becerro fatal y 25 mg/ml de cicloheximida. Se determinó la viabilidad celular 12 horas más tarde por ensayo de absorción de rojo
neutro.

Se sometieron a ensayo ejemplos de suero de pacientes con SLE a través del ensayo mencionado y se demostró que protegían células A9 del efecto citocida de TNF. El grado de inhibición se correspondió con el observado tras la aplicación de las TBPs purificadas de orina en cantidades idénticas a las presentes en los sueros. Los antisueros de conejo para los TBPs, que por sí mismos no tuvieron efecto en el ensayo de citotoxicidad A9, bloquearon el efecto inhibidor de los sueros humanos en este ensayo, confirmando así la suposición de que la inhibición de la bioactividad de TNF observada se debió únicamente a la bioactividad de las TBPs presentes en los sueros. Esto indica que las TBPs pueden ser efectivas para neutralizar la bioactividad del TBP in vivo, siendo capaces de proteger a los pacientes de los daños causados por TNF en enfermedades autoinmunes.

TABLA 1

1

Claims (6)

1. Uso de proteína de unión a factor de necrosis de tumor (TBP), una sal, un derivado funcional, un precursor o una fracción activa de la misma, o combinaciones de los anteriores, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de esclerosis múltiple.

2. Uso según la reivindicación 1, siendo la TBP, TBP-I, TBP-II o combinaciones de ellas.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, siendo la TBP, TBP-I natural.

4. Uso según la reivindicación 1 ó 2, siendo la TBP, TBP-I recombinante.

5. Uso según la reivindicación 1 ó 2, siendo la TBP, TBP-II natural.

6. Uso según la reivindicación 1 ó 2, siendo la TBP, TBP-II recombinante.