WO2013021093A1 - Uso de la cardiotofina-1 para el tratamiento de enfermedades renales - Google Patents

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WO2013021093A1
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cardiotrophin
group
agent
renal
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PCT/ES2012/070624
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French (fr)
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Begoña GARCÍA CENADOR
Javier GARCÍA CRIADO
Francisco Javier LÓPEZ HERNÁNDEZ
Jose Miguel LÓPEZ NOVOA
María Pilar PEREZ DE OBANOS MARTELL
Juan RUIZ ECHEVERRÍA
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Digna Biotech, S.L.
Universidad De Salamanca
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    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons

Definitions

  • the present invention relates to the use of cardiotrophin-1 (CT-1) for the prevention and / or treatment of acute renal damage, especially acute renal damage induced by nephrotoxic agents.
  • CT-1 cardiotrophin-1
  • the invention also relates to compositions comprising said nephrotoxic agents and cardiotrophin-1.
  • Acute kidney damage is a complex process of damage to various renal structures that leads to a sudden loss of complete or partial renal function, resulting in acute renal failure (ARF) in a short period of time. ranging from hours to a few days (López-Novoa JM. Kidney Int. 1999; 55: 1672-1682; López-Novoa JM, et al. Kidney Int. 2011; 79: 33-45).
  • DRA is used to define the reversible nature of most kidney attacks; while the term FRA is reserved to describe the status of those patients with kidney damage that leads to a decrease in the glomerular filtration rate and the excretory capacity of the kidney, so they require renal replacement therapy (RRT), it is that is, any intermittent or conventional dialysis method.
  • RRT renal replacement therapy
  • Contrast nephropathy although usually reversible, is far from being a benign complication, since it is a prolongation of hospital stay and in some cases, particularly in high-risk patients, leads to irreversible deterioration of renal function (Laville and Juillard, J Nephrol. 2010; 23: 387-398).
  • DRA induced by contrast agents is limited to supportive care and dialysis.
  • multiple molecules have been tested for prevention, such as atrial natriuretic peptide, statins, prostaglandin / prostacyclin analogs, N-acetylcysteine or isotonic intravenous bicarbonate, but these preventive therapies have failed to demonstrate conclusive efficacy (Weisbord SD , Palevsky PM. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2010; 19 (6): 539-549).
  • Antineoplastic agents are another cause of acute kidney damage in patients suffering from cancer undergoing chemotherapy.
  • cisplatin is one of the most effective antineoplastic agents in the treatment of solid tumors, with a broad spectrum of action.
  • cumulative dose-dependent nephrotoxicity is the main therapeutic limitation of this drug, in some cases requiring a dose reduction or discontinuity in treatment.
  • strategies for the prevention of renal damage caused by the administration of cisplatin are based on saline infusions to induce diuresis of the solute and an optimal dose adjustment. of the antineoplastic.
  • amifostine has been found to be effective in preventing renal failure, cases of Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis have been reported in patients treated with the drug (Darmon M. et al. Critical care. 2006; 10: 21 1).
  • antibiotics such as gentamicin and, in general, aminoglycoside antibiotics
  • gentamicin and, in general, aminoglycoside antibiotics are active ingredients widely used for the treatment of a wide variety of infections.
  • Its main drawback, and the greatest limitation of its use, is its nephrotoxicity, since despite a correct monitoring and hydration of patients, acute renal damage appears in 10-20% of treatments.
  • drugs or therapeutic strategies to prevent or minimize kidney damage caused by gentamicin, or improve the recovery of the organ after withdrawal from treatment.
  • US Patent 7,022,666 B 1 describes methods to induce the formation of renal epithelium from mesenchymal precursors in subjects suffering from renal insufficiency, which comprises the administration of a gpl30 receptor ligand in the presence of a metanephric mesenchymal growth factor. Said metanephric mesenchymal growth factor is essential for the induction of the epithelium.
  • the invention relates to the use of a compound that induces cardiotrophin-1 activity (CT-1) for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of acute renal damage, wherein the compound which induces cardiotrophin-1 activity is selected from the group of:
  • CT-1 cardiotrophin-1
  • the invention in another aspect, relates to a composition
  • a composition comprising, together or separately, a compound that induces cardiotrophin-1 activity and a nephrotoxic agent.
  • the invention relates to the use of a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and a contrast agent for the preparation of a diagnostic agent.
  • the invention relates to the use of a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and an antibiotic for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of the antibiotic-associated nephrotoxicity.
  • the invention relates to the use of a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and an agent immunosuppressant for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of the nephrotoxicity associated with the immunosuppressive agent.
  • the invention relates to the use of a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and an antineoplastic agent for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of the agent-associated nephrotoxicity.
  • antineoplastic agent for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of the agent-associated nephrotoxicity.
  • Figure 1 Evolution of body weight expressed in grams (g), during the experimental period in control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicin ( Gg + G) and gastrografin + gentamicin + cardiotrophin-1 (Gg + G + CT-1).
  • the data represent the mean ⁇ SEM (4-5 animals / group), d 0: baseline conditions on day 0; d 4: day 4 after contrast.
  • FIG. 1 Plasma creatinine concentration (Creat. Plasma.), Expressed in mg / dL, of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicin (Gg + G) and gastrografin + gentamicin + cardiotrophin-1 (Gg + G + CT-1).
  • Data represent the mean ⁇ SEM of 4-5 animals / group.
  • * P ⁇ 0.05 with respect to group C, G, CT-1 and Gg at the end of treatment fourth day after administration of iodinated contrast).
  • & p ⁇ 0.05 with respect to Gg + G at the end of treatment d 2: day 2 after contrast; d 4: day 4 after contrast.
  • FIG. 1 Urea plasma concentration, expressed in mg / dL, of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicin (Gg + G) and gastrografin + gentamicin + cardiotrophin-1 (Gg + G + CT-1). Data on days 2 (d 2) and 4 (d 4) after administration of the gastrografin. The data represent the mean ⁇ SEM of 4-5 animals.
  • FIG. Creatinine clearance (Cl. Crea), expressed in ml / min, of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicin ( Gg + G) and gastrografin + gentamicin + cardiotrophin-1 (Gg + G + CT-1), at the end of treatments.
  • Data represent the mean ⁇ SEM of 4-5 animals / group. * P ⁇ 0.05 with respect to group C, G, CT-1.
  • Urinary protein excretion (Prot.
  • Urine expressed in mg / day (mg / d), of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1), gastrografin (Gg ), gastrografin + gentamicin (Gg + G) and gastrografin + gentamicin + cardiotrophin-1 (Gg + G + CT-1), at the end of treatments.
  • Data represent the mean ⁇ SEM of 4-5 animals / group. * P ⁇ 0.05 with respect to group C, G, CT-1 and Gg. & p ⁇ 0.05 with respect to the Gg + G group.
  • N-acetyl glucosaminidase N-acetyl glucosaminidase (NAG), expressed in arbitrary units per day (UA / d), of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicin (Gg + G) and gastrografin + gentamicin + cardiotrophin-1 (Gg + G + CT-1), at the end of treatments.
  • Data represent the mean ⁇ SEM of 4-5 animals / group. * P ⁇ 0.05 with respect to group C, G, CT-1 and Gg.
  • Figure 7 Representative images of Western blot analysis of KEVI-1 and PAI-1 in the urine of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicin (Gg + G) and gastrografin + gentamicin + cardiotrophin-1 (Gg + G + CT-1), at the end of treatments.
  • Western blots representative of 3 experiments performed separately.
  • Figure 8. Glomerular filtration rate (GFR), expressed in mL / min of control rats (C) and treated with gastrografin + gentamicin (Gg + G) and gastrografin + gentamicin + cardiotrophin-1 (Gg + G + CT-1) , at the end of the treatments.
  • the data represents the mean ⁇ SEM of 4 animals / group. * p ⁇ 0.05 with respect to the group C. & p ⁇ 0.05 with respect to the group Gg + G.
  • FIG. 9 Renal plasma flow (RPF), expressed in mL / min, of control rats (C) and treated with gastrografin + gentamicin (Gg + G) and with gastrografin + gentamicin + cardiotrophin-l (Gg + G + CT-1 ), at the end of the treatments.
  • the data represent the mean ⁇ SEM of 4 animals / group. * P ⁇ 0.05 with respect to the group C. & p ⁇ 0.05 with respect to the group Gg + G.
  • Renal vascular resistance (RVR), expressed in mmHg-min / mL, of control rats (C) and treated with gastrografin + gentamicin (Gg + G) and gastrografin + gentamicin + cardiotrophin-l (Gg + G + CT-1), at the end of treatments.
  • the data represent the mean ⁇ SEM of 4 animals / group. * P ⁇ 0.05 with respect to the group C. & p ⁇ 0.05 with respect to the group Gg + G.
  • SBP stolic blood pressure
  • C control rats
  • C gentamicin
  • CT-1 cardiotrophin-1
  • Data represent the mean ⁇ standard deviation of 5-6 animals.
  • FIG. 1 Weight (% of body weight) of the liver (A), spleen (B), right kidney (C) and heart (D) of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1) or both compounds (G + CT-1), at the end of treatments.
  • Data represent the mean ⁇ standard deviation of 5-6 animals. * p ⁇ 0.05 vs Control Group, & p ⁇ 0.05 vs Group G.
  • FIG. 19 Plasma creatinine concentration (Creat. Plasma), expressed in mg / dL, of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1) or both compounds (G + CT-1 ), at the beginning of the experiment (Baseline), at 4 days (d 4) and at the end of the study (d 6). Data represent the mean ⁇ standard deviation of 5-6 animals. * p ⁇ 0.05 vs Control Group.
  • Figure 20 Plasma concentration of urea (Urea plasma) expressed in mg / dL, of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1) or both compounds (G + CT-1), At the end of the treatments. Data represent the mean ⁇ standard deviation of 5-6 animals. * p ⁇ 0.05 vs Control Group.
  • FIG. 21 Creatinine clearance (Cl. Creat.), Expressed in mL / min, of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1) or both compounds (G + CT-1 ), at the beginning of the study (Baseline), at 4 days (d 4) and at the end of the study (d 6). Data represent the mean ⁇ standard deviation of 5-6 animals. * p ⁇ 0.05 vs Control Group, & p ⁇ 0.05 vs Group G.
  • FIG. 22 Urinary protein excretion (Proteinuria) expressed in mg / day of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1) or both compounds (G + CT-1). Data represent the mean ⁇ standard deviation of 5-6 animals. * p ⁇ 0.05 vs Control Group, & p ⁇ 0.05 vs Group G.
  • FIG. 23 Temporal evolution throughout the study (d, days) of the urinary flow expressed in mL / day (mL / d) of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1) or both compounds (G + CT-1). Data represent the mean ⁇ standard deviation of 5-6 animals.
  • Figure 24 Representative images of optical microscopy (1,000 magnifications) of the cortical area of renal sections stained with hematoxylin and eosin, from control rats and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1) or both compounds (G + CT-1), at the end of the treatments.
  • FIG. 25 Temporal evolution of the urinary excretion of N-acetyl glucosaminidase (NAG), expressed in arbitrary units per day (UA / d), of control rats (C) and treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT- 1) or both compounds (G + CT-1), at 4 days (d 4) after treatment and at the end of the study (d 6). Data represent the mean ⁇ standard deviation of 5-6 animals.
  • Figure 26 Representative images of Western blot analysis of KEVI-1 and NGAL in homogenates of renal tissue (t) and urine (u) of control rats treated with gentamicin (G), cardiotrophin-1 (CT-1) or both compounds (G + CT-1), at the end of the treatments.
  • FIG. 27 Effect of CT-1 therapy on the survival of rats, expressed as a percentage of rats that survive, subjected to 60 minutes of left renal ischemia and 14 days (d) of reperfusion. Simulated rats (Sim), rats that received saline (IR C) and rats treated with CT-1 (IR CT-1) are represented.
  • Figure 28 Effect of administration of CT-1: (A) on plasma creatinine levels (Creat. Plasma), expressed as mg / dL, and (B) on creatinine clearance values (Cl.
  • FIG 29 Renal tissue levels of superoxide anion (SOA), expressed in nmol / mg protein / min, in animals of the simulated group (Sim) and in two groups of animals undergoing left renal ischemia: ischemic control (control) and animals ischemic treated with CT-1 (CT-1) 4 hours after reperfusion. Data are expressed as the mean ⁇ SD of 5 rats per group.
  • Figure 30 Effect of CT-1 treatment on myeloperoxidase (MA) activity, expressed in units per gram of tissue (U / g), after renal I / R.
  • SOA superoxide anion
  • Myeloperoxidase (MA) activity was measured 24 hours after the simulated operation or reperfusion in renal tissue of animals of the simulated group (Sim) and in two groups of animals undergoing left renal ischemia: ischemic control (control) and animals treated with CT-1 (CT-1). Values are the mean ⁇ SD of 5 rats per group.
  • Figure 31 Effect of CT-1 treatment on plasma levels of proinflammatory cytokines, expressed in pg / mL, in animals of the simulated group (Sim) and in two groups of animals undergoing left renal ischemia: ischemic control (control) and Ischemic animals treated with CT-1 (CT-1) 4 hours after reperfusion.
  • E) IL-10 levels Data are expressed as the mean ⁇ SD of 5 rats per group.
  • FIG 32 Representative images of hematoxylin-eosin staining of kidney kidneys undergoing renal ischemia without treatment (control) and receiving cardiotrophin-1 (CT-1) 24 hours after reperfusion.
  • the arrowheads indicate tubular cells with a lot of vacuolized cytoplasm. Arrows indicate clogged tubules.
  • FIG 33 Representative images of hematoxylin-eosin staining of kidney kidneys undergoing renal ischemia without treatment (control) and receiving cardiotrophin-1 (CT-1) 48 hours after reperfusion.
  • the asterisks indicate tubules completely denuded.
  • the arrowheads indicate areas with inflammatory infiltrate.
  • Figure 34 Effect of an anti-CT-1 antibody on body weight, expressed in grams (g), in mice undergoing renal ischemia-reperfusion (I / R). Ischemic injury was induced by 30 minutes of vascular impingement of the left renal pedicle.
  • * p ⁇ 0.05 in the anti-CT-1 group versus time 0; #, p ⁇ 0.05 in the control IgG group versus time 0.
  • Figure 35 Effect of an anti-CT-1 antibody on the survival rate, expressed as a percentage (%), in mice undergoing renal ischemia-reperfusion (I / R).
  • Figure 36 Effect of an anti-CT-1 antibody on plasma urea, expressed in mg / dl, in mice undergoing renal ischemia-reperfusion (I / R).
  • kidney myeloperoxidase (MPO) levels expressed in ng / mg protein, in mice undergoing ischemia-renal reperfusion (I / R). Values are expressed as mean ⁇ SEM of n independent experiments.
  • FIG 39 Effect of an anti-CT-1 antibody on plasma tumor necrosis factor-alpha (TNF- ⁇ ) levels, expressed in pg / ml, in mice undergoing renal ischemia-reperfusion (I / R). Values are expressed as mean ⁇ SEM of n independent experiments.
  • FIG 40 Effect of an anti-CT-1 antibody on the expression of cardiotrophin-1 (CT-1) in kidney in mice undergoing renal ischemia-reperfusion (I / R).
  • CT-1 / GADPH cardiotrophin-1 / GADPH
  • AU arbitrary units
  • Values are expressed as mean ⁇ SEM of n independent experiments.
  • * p ⁇ 0.05 versus simulated; #, p ⁇ 0.05 versus control; &, p ⁇ 0.05 versus control IgG.
  • CT-1 cardiotrophin-1
  • a nephrotoxic agent such as a contrast agent, an antibiotic, an immunosuppressive agent or an antineoplastic agent
  • the invention relates to a compound that induces cardiotrophin-1 activity (CT-1) for use in the prevention and / or treatment of acute renal damage, wherein the compound that induces cardiotrophin activity.
  • CT-1 cardiotrophin-1 activity
  • 1 is selected from the group of:
  • CT-1 cardiotrophin-1
  • (iii) a vector comprising a polynucleotide according to (ii), and a cell capable of secreting to the cardiotrophin-1 medium or a functionally equivalent variant thereof that has at least 60% identity with CT-1.
  • the invention relates to a compound that induces cardiotrophin-1 activity (CTl) for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of acute renal damage, wherein the compound that induces cardiotrophin-1 activity is select from the group of:
  • CT-1 cardiotrophin-1
  • the invention also relates to a method of treatment of acute renal damage comprising the administration to a subject of a compound that induces cardiotrophin-1 activity (CT-1), wherein the compound that induces cardiotrophin-1 activity is selected from the group of:
  • CT-1 cardiotrophin-1 activity
  • CT-1 cardiotrophin-1
  • the term "compound that induces cardiotrophin-1 activity”, as used herein, is understood as any compound whose administration cause an increase in cardiotrophin-1 activity (CT-1) regardless of whether said increase is caused by an increase in the specific activity of pre-existing CT-1 or by an increase in the synthesis of CT-1 or its analogues that share substantially the same function as cardiotrophin.
  • CT-1 cardiotrophin-1 activity
  • the agent that induces CT-1 activity is the same CT-1.
  • CT-1 refers to a cytokine belonging to the interleukin 6 family, capable of binding and activating signaling mediated at least by the receptor complex LIFR consisting of the gpl30 / LIFRp heterodimer.
  • CT-1 means the protein defined by the sequence of the NCBI database with accession number P 001321.1 dated April 9, 2011 corresponding to the sequence SEQ ID NO: 1, corresponding to isoform 1 of human cardiotrophin; or the protein defined by the sequence of the NCBI database with accession number NP 001136016.1 dated March 12, 2011, corresponding to isoform 2 of the human cardiotrophin.
  • the CT-1 is a CT-1 of human origin, preferably of sequence SEQ ID NO: 1.
  • YREWLS RTEG DLGQLLPGGS A 2 01 The invention contemplates the use of functionally equivalent variants of CT-1.
  • functionally equivalent variant of CT-1 is meant any molecule that shares with CT-1 one or more of the functions described in the present invention associated with CT-1, both in vitro and in vivo , and that has a minimum identity in the amino acid sequence.
  • the expression "functionally equivalent variant of CT-1" is intended to exclude other gpl30 ligands, such as leukemia inhibitor factor (LIF), IL-11, IL-6, oncostatin M (OSM), ciliary neurotrophic factor (CNTF), or cardiotrophin-like cytokine (CTC) also known as “cardiotrophin-like cytokine” (CLC).
  • LIF leukemia inhibitor factor
  • OSM oncostatin M
  • CNTF ciliary neurotrophic factor
  • CTC cardiotrophin-like cytokine
  • CLC cardiotrophin-like cytokine
  • the “functionally equivalent variants of CT-1” of the present invention must have an identity with CT-1 of at least 60%.
  • the compound that induces cardiotrophin-1 activity is CT-1 or a functionally equivalent variant thereof that has at least 60% identity with CT-1.
  • the CT-1 variants can be both natural and artificial.
  • natural variant refers to all those variants of the human CT-1 mentioned above that appear naturally in other species, that is, the orthologs of CT-1.
  • Such natural variants include, without limitation, the mouse CT-1, which corresponds to the sequence with access number Q541U3 dated November 28, 2006 or to the sequence Q60753 dated May 31, 2011 in the NCBI database or the 196 amino acid isoform corresponding to the sequence with accession number P83714 dated May 31, 2011 in the NCBI database; rat CT-1, which corresponds to the sequence with accession number Q63086 dated March 8, 2011; the macaque CT-1, which corresponds to the sequence with access number XP 001103315 dated June 1, 2010; the dog CT-1, which corresponds to the sequence with access number XP 849072 dated August 30, 2005; the horse CT-1, which corresponds to the sequence with access number XP 001915457 dated July 11, 2008; and CT-1 of bovine origin, which corresponds to the sequence with accession number NP_0011793
  • Natural variants of CT-1 suitable for use in the present invention can also be derived from said sequences by insertion, substitution or deletion of one or more amino acids and include natural alleles (such as the A92T variant of human CT-1), variants resulting from alternative processing, and secreted and truncated forms that appear naturally.
  • the CT-1 useful in the present invention can, therefore, be of natural sequence, when it comprises a polypeptide having the same amino acid sequence as the CT-1 that appears in nature.
  • Such natural sequence polypeptides can be isolated from nature or can be produced by recombinant and / or synthetic means.
  • the CT-1 of the invention can be a recombinant protein obtained by the expression of a polynucleotide encoding CT-1 or a functionally equivalent variant thereof in a heterologous organism, such as a bacterium, yeast or insect or mammalian cell.
  • Said recombinant protein can be obtained as a fusion protein with an amino-terminal histidine tail that facilitates its subsequent purification.
  • the expression and purification of said proteins can be carried out according to methods known to those skilled in the art and described in the state of the art.
  • the CT-1 is of human origin and corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the CT-1 is rat, preferably it is a fusion protein with an amino-terminal histidine tail, more preferably SEQ ID NO: 2.
  • CT-1 can be a functionally equivalent artificial variant of CT-1 that can be obtained by recombinant and / or synthetic means.
  • CT-1 contemplated in the present invention show at least some of the functions of CT-1 such as, without limitation:
  • N-acetyl glucosaminidase N-acetyl glucosaminidase (NAG) (determined as detailed in the Materials and Methods section of the present invention), or "Kidney Injury Molecule 1" (KEVI) molecules -1) and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1), which can be determined by Western blot, as shown in the Materials and methods section of the present invention, the ability to increase the glomerular filtration rate (GFR) ) and renal plasma flow (RPF) and decrease renal vascular resistance (RVR), which can be determined by the methods described in the state of the art, as shown in the Materials and Methods section of the present invention.
  • GFR glomerular filtration rate
  • RPF renal plasma flow
  • RVR renal vascular resistance
  • the ability to decrease the production of oxygen free radicals which can be determined by methods described in the state of the art, such as that shown in the Materials and methods section of the present invention, the ability to prevent activation of the pathways proinflammatory signaling, determined by the myeloperoxidase (MPO) activity, which can be determined by the method detailed in the Material and methods section of the present invention.
  • MPO myeloperoxidase
  • T Fa, IL- ⁇ , IFN- ⁇ pro-inflammatory cytokines
  • IFN- ⁇ pro-inflammatory cytokines
  • CT-1 include polypeptides that show at least one 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% similarity or identity with the different natural variants of CT-1 mentioned above.
  • the percentage of identity between two sequences indicates the proportion of identical amino acids shared by the two sequences that are compared, while the percentage of similarity indicates the proportion of similar amino acid residues (considering equivalent to amino acid residues such as arginine and Usina, or well aspartic acid and glutamic acid).
  • the percent identity between two amino acid sequences is calculated by comparing two aligned sequences over a particular region, determining the number of positions in which there are identical amino acids in both sequences to obtain the number of matching positions, dividing the number of such positions by Total number of positions in the segment being compared and multiplying the result by 100.
  • the degree of identity and similarity between two polypeptides is determined using computer-implemented algorithms and methods that are widely known to those skilled in the art.
  • the identity and similarity between two amino acid sequences is preferably determined using the BLASTP algorithm (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J., 1990 , Mol. Biol. 215: 403-410).
  • the compound that induces cardiotrophin-1 activity is a polynucleotide encoding CT-1 or a functionally equivalent variant of CT-1 that has at least 60% identity with CT-1 .
  • the functionally equivalent variant of CT-1 has at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% identity with CT-1
  • polynucleotide refers to a polymeric form of nucleotides of any length and formed by ribonucleotides and / or deoxyribonucleotides.
  • the term includes both single chain and double chain polynucleotides, as well as modified polynucleotides (methylated, protected and the like).
  • Polynucleotides suitable for use as agents capable of inducing CT-1 activity include, without limitation, polynucleotides whose sequences correspond to those described in the GenEMBL database with access numbers BC064416 in version 9 dated 15.10.2008, corresponding to variant 1 of the human cardiotrophin transcript, BC036787 in version 9 dated 12.08.2009, corresponding to variant 1 of the human cardiotrophin transcript, the sequence described in the GenEMBL database with accession number D78591, in its version 4 of 12.01.2009, corresponding to the polynucleotide encoding cardiotrophin 1 of Rattus norvegicus (rat), the sequence described in the GenEMBL database with accession number AY518205, in its version 3 of 12.01.2009, corresponding to the polynucleotide encoding cardiotrophin 2 from Rattus norvegicus (rat), the sequence described in the GenEMBL database with accession number U18366, in its version 4 d on 12.01.2009, corresponding to the polynucleotide
  • agents capable of inducing CT-1 activity include "polynucleotides encoding a functionally equivalent variant of CT-1".
  • Said polynucleotides are all those polynucleotides capable of encoding a variant of the polypeptides with CT-1 activity, as defined above by means of their specific sequences, said variant having at least 60% identity with CT-1.
  • Said polynucleotides result from the polynucleotides defined above by insertion, deletion or substitution of one or more nucleotides with respect to the sequences defined above.
  • the polynucleotides encoding functionally equivalent variants of CT-1 are polynucleotides whose sequence allows them to hybridize under highly restrictive conditions with the polynucleotides defined above.
  • Typical highly restrictive hybridization conditions include incubation in 6 X SSC (1 X SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate) and 40% formamide at 42 ° C for 14 hours, followed by one or more cycles of washed using 0.5 X SSC, 0.1% SDS at 60 ° C.
  • highly restrictive conditions include those that comprise a hybridization at a temperature of approximately 50 ° -55 ° C in 6 X SSC and a final wash at a temperature of 68 ° C in 1-3 X SSC.
  • Moderate restrictive conditions include hybridization at a temperature of about 50 ° C to about 65 ° C in 0.2 or 0.3 M NaCl, followed by washing at about 50 ° C to about 55 ° C in 0.2 X SSC , 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate).
  • the agent that is capable of inducing CT-1 activity when it is a polynucleotide, it is operatively associated with a regulatory region of expression.
  • the regulatory sequences useful for the present invention may be nuclear promoter sequences or, alternatively, enhancer sequences and / or other regulatory sequences that increase the expression of the heterologous nucleic acid sequence.
  • the promoter can be constitutive, tissue specific or inducible. If constant expression of the heterologous nucleic acid sequence is desired, then a constitutive promoter is used. Examples of well known constitutive promoters include the immediate early cytomegalovirus (CMV) promoter, Rous sarcoma virus promoter, and the like.
  • CMV immediate early cytomegalovirus
  • constitutive promoters are well known in the art and can be employed in the practice of the invention. If controlled expression of the heterologous nucleic acid sequence is desired, then an inducible promoter must be used. In an uninduced state, the inducible promoter is "silent.” By “silent” it is meant that in the absence of an inductor little or no expression of the heterologous nucleic acid sequence is detected; in the presence of an inducer, however, the expression of the heterologous nucleic acid sequence occurs. Frequently, the level of expression can be controlled by varying the concentration of the inductor.
  • the concentration of the transcribed product of the heterologous nucleic acid sequence can be affected.
  • the amount of protein that is synthesized can be controlled. In this way, it is possible to vary the concentration of the therapeutic product.
  • inducible promoters are: an estrogen or androgen promoter, an otionein metal promoter, or an ecdysone-responsive promoter. Other numerous examples are well known in the art and can be used in the practice of the invention.
  • tissue specific promoters can be used to achieve expression of the specific nucleic acid heterologous sequence in cells or tissues.
  • the compound that induces cardiotrophin-1 activity is a vector comprising a polynucleotide as defined above, that is, encoding CT-1 or a functionally equivalent variant of CT-1. which has at least 60% identity with CT-1.
  • the functionally equivalent variant of CT-1 has at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% identity with CT-1
  • Suitable vectors for the insertion of said polynucleotides are vectors derived from prokaryotic expression vectors such as pUC18, pUC19, pBluescript and its derivatives, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl, RP4, phage and shuttle vectors such as pSA3 and pAT28, yeast expression vectors such as 2 micron plasmid type vectors, integration plasmids, YEP vectors, centromeric plasmids and the like, insect cell expression vectors such as pAC series vectors and pVL series, plant expression vectors such as pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pM
  • the compound that induces cardiotrophin-1 activity is a cell capable of secreting to the cardiotrophin-1 medium or a functionally equivalent variant thereof that has at least 60% identity with CT-1.
  • the functionally equivalent variant of CT-1 has at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% identity with CT-1 Suitable cells for the expression of cardiotrophin-1 or the functionally equivalent variant thereof include, without limitation, cardiomyocytes, adipocytes, endothelial cells, epithelial cells, lymphocytes (B and T cells), mast cells, eosinophils, vascular intimal cells , primary cultures of cells isolated from different organs, preferably from cells isolated from the islets of Langerhans, hepatocytes, leukocytes, including mononuclear, mesenchymal, umbilical cord or adult leukocytes (skin, lung, kidney and liver), osteoclasts, chondrocytes and other connective tissue cells.
  • cardiomyocytes
  • the cells capable of secreting to the cardiotrophin-1 medium or a functionally equivalent variant thereof can be found forming microparticles or microcapsules so that the cells have a longer useful life before being used in patients.
  • Suitable materials for the formation of the microparticles object of the invention include any biocompatible polymeric material that allows the continuous secretion of the therapeutic products and that acts as a support for the cells.
  • said biocompatible polymeric material can be, for example, thermoplastic polymers or hydrogel polymers.
  • thermoplastic polymers are acrylic acid, acrylamide, 2-aminoethyl methacrylate, poly (tetrafluoroethylene-cohexafluorpropylene), methacrylic acid- (7-cumaroxy) ethyl ester, N-isopropyl acrylamide, polyacrylic acid, polyacrylamide, polyamidoamine -p-xylylene, poly (chloroethyl vinyl ether), polycaprolactone, poly (caprolactone-co-trimethylene carbonate), poly (carbonate urea) urethane, poly (carbonate) urethane, polyethylene, polyethylene and acrylamide copolymer, polyethylene glycol, polyethylene glycol, methacrylene glycol ethylene terephthalate), poly (4-hydroxybutyl acrylate), poly (hydroxyethyl methacrylate), poly (N-2-hydroxypropyl methacrylate), poly (lactic acid-glycolic acid), poly (L-lactic acid), poly (
  • Hydrogel-type polymers include natural materials such as alginate, agarose, collagen, starch, hyaluronic acid, bovine serum albumin, cellulose and its derivatives, pectin, chondroitin sulfate, fibrin and fibroin, as well as synthetic hydrogels such as sepharose and sephadex.
  • the microparticle of the invention may be surrounded by a semipermeable membrane that confers stability to the particles and forms a barrier impermeable to antibodies.
  • Semi-permeable membrane means a membrane that allows the entry of all those solutes necessary for cell viability and that allows the therapeutic proteins produced by the cells contained within the microparticle to be exited, but which is substantially impermeable to antibodies, so that the cells are protected from the immune response produced by the organism that hosts the microparticle.
  • Suitable materials for forming the semipermeable membrane are materials insoluble in biological fluids, preferably polyamino acids, such as poly-L-lysine, poly-L-ornithine, poly-L-arginine, poly-L-asparagine, poly-L-aspartic , poly-benzyl-L-aspartate, poly-S-benzyl-L-cysteine, poly-gamma-benzyl-L-glutamate, poly-S-CBZ-L-cysteine, ⁇ - ⁇ -CBZ-D-lysine, poly -5-CBZ-DL-ornithine, poly-O-CBZ-L-serine, poly-O-CBZ-D-tyrosine, poly (Y-ethyl-L-glutamate), poly-D-glutamic, polyglycine, ⁇ - ⁇ - ⁇ -hexyl-L-glutamate, poly-L-histidine, poly (a
  • Compounds that induce cardiotrophin-1 activity are suitable for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of acute renal damage.
  • medicament is meant a pharmaceutical composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity (CT-1) according to the invention.
  • prevention is meant the administration of a compound that induces cardiotrophin-1 activity (CT-1) according to the invention, or of a medicament containing it at an early or early stage of the disease or, preferably, to avoid its appearance
  • the compound that induces cardiotrophin-1 activity is used for the prevention of acute renal damage.
  • treatment is used to designate the administration of a compound that induces cardiotrophin-1 activity (CT-1) according to the invention or of a medicament containing it to control the progression of the disease before or after the signs clinicians have appeared.
  • Controlling disease progression means beneficial or desired clinical outcomes that include, but are not limited to, reduction of symptoms, reduction of disease duration, stabilization of pathological conditions (specifically avoid further deterioration). , delay the progression of the disease, improve the pathological state and remission (both partial and total).
  • the control of disease progression also implies a prolongation of survival, compared to the expected survival if the treatment were not applied.
  • ARD acute renal damage
  • ALF acute renal failure
  • FRA means a disorder as defined by Mehta RL, et al.
  • FRA FRA
  • RIFLE criterion Bomo R, et al. Crit Care . 2004; 8: R204-R212; Bellomo R, et al. Intensive Care Med. 2004; 30:33-37; Kellum JA, et al. Curr Opin Crit Care. 2002; 8: 509-514.
  • acute renal damage Depending on the initial causes of acute renal damage, it can be divided into acute renal damage pre-renal, renal and post-renal.
  • the acute renal damage is selected from the group of acute renal damage of pre-renal cause and acute renal damage of renal cause; preferably it is acute renal damage of renal cause.
  • Acute renal damage of pre-renal cause means renal damage secondary to the reduction of normal perfusion in the kidney, which can be caused by volume depletion due to renal or extrarenal losses, fluid sequestration or perfusion pressures. inadequate secondary to heart failure, cirrhosis or sepsis. It may also be the result of renal ischemia secondary to aortic impingement or renal artery during abdominal surgery or during kidney transplantation (ischemia / reperfusion damage). Such damage is reversible if the causes are acted upon early.
  • the most studied experimental model of acute renal damage of pre-renal cause is the brief clamping of the renal arteries in rodents producing the so-called ischemia / reperfusion damage. Table 1 shows a non-limiting list of possible causes of acute renal damage of pre-renal cause. Table 1. Etiology of acute renal damage of pre-renal cause.
  • HYPOVOLEMIA hemorrhages (gastrointestinal, surgical, postpartum); digestive (vomiting, diarrhea); renal losses (diuretics, diabetic ketoacidosis, diabetes insipidus, adrenal insufficiency); fluid sequestration in the extravascular space (pancreatitis, peritonitis, burns, hypoalbuminemia)
  • REDUCTION OF HEART EXPENSE Acute heart failure (heart attack, tamponade, arrhythmias); massive pulmonary embolism; pulmonary hypertension.
  • PERIPHERAL VASODILATATION Sepsis, anaphylaxis, antihypertensives, anesthesia.
  • RENAL VASOCONSTRICTION hypercalcemia, norepinephrine, cyclosporine, amphotericin B, cirrhosis with ascites (hepatorenal syndrome)
  • NSAIDs angiotensin converting enzyme inhibitors
  • IECAS angiotensin converting enzyme inhibitors
  • acute renal damage of renal cause is meant an intrinsic renal damage, in the anatomical structures of the renal system, which can be anatomically classified as tubular, interstitial, glomerular and vascular.
  • NTA acute tubular necrosis
  • ischemia pre-renal environment
  • nephrotoxins direct toxin damage
  • the most frequent cause is ischemia, and it occurs when the causes of pre-renal ARD are prolonged over time.
  • antibiotics aminoglycosides, cephalosporins
  • radiological contrasts NSAIDs
  • anesthetics endogenous toxins (rhabdomyolysis myoglobinuria, hemolysis hemoglobinuria, hyperuricemia, hypercalcemia).
  • Acute interstitial nephritis is caused by a depressed renal function related to fever, rashes, leukocytosis and eosinophilia.
  • Acute interstitial nephritis is usually induced by drugs such as nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), antibiotics, diuretics, etc.
  • NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory drugs
  • Some infections legionella, leptospira, cytomegalovirus, Candida
  • neoplastic disorders have also been associated with this condition.
  • the most commonly used experimental model is the administration of NSAIDs (indomethacin) to rats (Varghese J, et al. Eur J Pharmacol. 2009; 614: 114-121).
  • Glomerular damage the presence of erythrocytes, proteinuria or both suggest the existence of a glomerular disease. Hematuria, the presence of erythrocytes, hypertension and moderate proteinuria suggest a nephritic process (i.e. acute glomerulonephritis). Other causes of glomerular damage are malignant hypertension, vasculitis, hemolytic-uremic syndrome, thrombocytopenic thrombotic purpura, pregnancy toxemia and scleroderma. The most studied acute glomerulonephritis experimental model is the administration of anti-Thy (mesangioproliferative nephritis) or adriamycin antibodies to rats.
  • Thy meangioproliferative nephritis
  • vascular damage acute renal damage secondary to vascular compromise can be difficult to diagnose.
  • causes of this type of damage are obstructions of renal arteries by atherosclerotic plaque, thrombosis or embolism; and obstruction of renal veins by thrombosis or compression. There are no well-studied experimental models of this type of damage.
  • Acute renal damage of post-renal cause means renal damage as a result of obstructions in the urinary tract that occur inside or intrarenal (stones, crystal deposits, clots, tumors) or outside the urinary or extrarenal system (tumors, retroperitoneal fibrosis, lithiasis) and preventing the exit of the urine formed, causing an increase in pressure that is transmitted retrogradely, compromising glomerular filtration.
  • the most studied model of acute renal damage of post-renal cause is unilateral ureteral ligation in rats (Grande MT and López-Novoa JM. Nat Rev Nephrol. 2009; 5: 319-328). In another embodiment the acute renal damage is of post-renal cause.
  • the acute renal damage is of pre-renal cause, preferably selected from acute renal damage caused by exposure of a subject to ischemia and acute renal damage caused by ischemia followed by reperfusion.
  • acute renal damage caused by exposure of a subject to ischemia means renal damage caused in a subject as a result of ischemia of renal tissue.
  • ischemia refers to tissue damage and inflammatory response caused in the kidney as a result of the transient decrease in blood flow and consequent decrease in the supply of oxygen, nutrients and the elimination of metabolism products in that organ.
  • Acute renal damage caused by ischemia followed by reperfusion means renal damage caused in a subject as a result of the transient decrease in blood flow (ischemia) and the subsequent reestablishment of said blood flow in the organ after the period of ischemia ( reperfusion).
  • acute renal damage is any acute renal damage except for that caused by ischemia or ischemia / reperfusion.
  • acute renal damage is of renal cause, preferably caused by a nephrotoxic agent.
  • acute kidney damage is caused by a nephrotoxic agent.
  • nephrotoxic agent in the context of the present invention, is meant any substance capable of producing toxicity in the renal system, that is, any substance that located in the renal system is capable of producing disturbances and imbalances in its morphological aspects and physiological that lead to organ injury.
  • Nephrotoxic agents include, without limitation, pharmacological agents, diagnostic agents and toxic agents such as environmental chemicals, animal and plant toxins, drugs of abuse, etc.
  • Nephrotoxic pharmacological agents contemplated by the present invention include, without limitation, analgesics (paracetamol, phenacetin, dipyrones) and nonsteroidal anti-inflammatory drugs (aspirin, indomethacin); antibiotics such as cephalosporins (cephaloidin), tetracyclines, vancomycin, carbapenems (imipenem), polymyxin B, rifampicin and aminoglycosides, viomycin and capreomycin, sulfonamides, pentamidine; antifungals (amphotericin B); chemotherapeutic and antineoplastic agents such as cisplatin, cyclophosphamide, methotrexate, 5-fluorouracil; immunosuppressants such as cyclosporine A and drug agent interactions.
  • analgesics paracetamol, phenacetin, dipyrones
  • nonsteroidal anti-inflammatory drugs aspirin, indomethaci
  • Nephrotoxic diagnostic agents include, without limitation, radiocontrast agents or radiological contrasts (iodine hipuramate, ionic contrasts) or diagnostic imaging agents.
  • Toxic agents that affect the renal system include, without limitation, environmental chemicals that include halogenated hydrocarbons used as herbicides, metals and especially heavy metals (mercury, cadmium, lead, chromium), mycotoxins, organic solvents (gasoline , trichlorethylene, carbon tetrachloride, ethylene glycol), pesticides (paraquat, derivatives of phenoxy acetic acid, arsenic, strychnine, potassium chlorate and sodium borate), silicon oxide; animal toxins from ophidians (Tiger Snake venom, Russell's viper or Rattle-Snake), arachnids (Loxosceles Ruferens or brown spider or corners); toxic plants and plants (Daphne mezereum, Actanea spicata, Juniperus communis
  • the nephrotoxic agent is selected from the group of contrast agents, antibiotics, immunosuppressive agents and antineoplastic agents. Given the large number of diagnostic procedures and studies that require the use of contrast media, a large percentage of the population is today at risk of suffering from contrast agent-induced nephropathy.
  • contrast agent-induced nephropathy refers to renal damage caused by the administration of contrast agents. This is the third cause of kidney damage in the hospital environment, and is defined by an increase in serum creatinine levels of 25% or higher (0.5 mg / dl) within 72 hours of administration of a medium of contrast (Solomon R. et al. N Engl J Med. 1994; 331: 1416-1420; Briguori C. et al. Circulation. 2007; 115: 1211-1217). Associated risk factors are advanced age, diabetes, chronic kidney disease, multiple myeloma and volume depletion. The most studied experimental model of contrast-induced nephropathy is the administration of radiocontrast media to sensitized rats.
  • Sensitization can occur previously by extracellular volume depletion or administration of a nephrotoxic at low doses. Therefore, in another aspect, the method of the invention is carried out in subjects who are sensitized to suffer ARD.
  • subjects presensitized to suffer from ARD have been treated with sub-toxic doses of a nephrotoxic agent.
  • the nephrotoxic agent with which the subject has been treated is an antibiotic.
  • the antibiotic is selected from the group of aminoglycosides and cephalosporins.
  • the aminoglycoside antibiotic is selected from the group of gentamicin, tobramycin, amikacin, netilmicin, kanamycin, streptomycin, sisomycin, neomycin and combinations thereof.
  • the nephrotoxic agent is a contrast agent.
  • contrast agent in the context of the present invention, refers to a biocompatible compound that can be detected after being administered to an individual and that can be used in diagnostic methods in vivo by imaging. The use of such contrast agents improves the visibility of structures or fluids within the body, facilitating the differentiation of different parts of the image and increasing the "contrast" between those different regions.
  • contrast agent thus encompasses agents that are used to increase the quality of an image that can be generated, however, in the absence of such an agent (as is the case, for example, on magnetic resonance imaging), as well as agents.
  • contrast agents include, without limitation, contrast agents for scintigraphy, for individual photon emission computed tomography (SPECT), for positron emission tomography (PET), for Raman spectroscopy, for magnetic resonance imaging (MRI) and for diagnostic imaging.
  • SPECT photon emission computed tomography
  • PET positron emission tomography
  • MRI magnetic resonance imaging
  • contrast agents are administered by the routes in which they are best distributed by the structure to be examined, whether ingested or by enema in the case of the digestive tract, inhaled for the respiratory tract or injected to visualize the blood vessels, organs and tissues .
  • Contrast agents include radiopharmaceuticals that are normally labeled with positron emitters such as U C, 13 N, 15 0, 18 F, 82 Rb, 62 Cu and 68 Ga.
  • SPECT mainly uses ⁇ emitters, such as 123 L m Tc and lll ⁇ ⁇ modalities of scintigraphy (positron emission tomography (PET), single photon emission computed tomography (SPECT)) are diagnostic imaging techniques of cross sections that map the location and concentration of radionuclides labeled radiotracers. PET and SPECT can be used to locate and characterize a radionuclide by measuring metabolic activity. PET and SPECT provide information that is related to information at the cellular level such as cell viability.
  • PET positron emission computed tomography
  • SPECT uses a radioactive tracer that emits low-energy photons.
  • Contrast agents for CT images include, for example, iodinated or brominated contrast media.
  • these agents include iotalamate, iohexol, diatrizoate, iopamidol, etiodol or iopanoate.
  • Gadolinium agents have also been described for use as TAC contrast agents (see, for example, Henson JW, et al. ATNR Am J Neuroradiol. 2004; 25: 969-72).
  • gadopentate agents discussed in Strunk HM and Schild H. Eur Radiol. 2004; 14: 1055-62) have been used as TAC contrast agents.
  • Computerized tomography (CAT) is considered as a diagnostic imaging modality.
  • a series of X-rays sometimes more than a thousand, from various angles and then combining them with a TAC computer makes it possible to build a three-dimensional image of any part of the body.
  • a computer is programmed to show two-dimensional sections from any angle and at any depth.
  • intravenous injection of a radiopaque contrast agent such as those described here, can help in the identification and delineation of soft tissue masses when initial CT scans are not diagnostic.
  • Contrast agents for optical images include, for example, fluorescein, a fluorescein derivative, indocyanine green, Oregon green, a derivative of Oregon green, rhodamine green, a derivative of rhodamine green, an eosin, an erythrosine, Texas red, a derived from Texas red, malachite green, nano-sulfosuccinimidyl ester, cascade blue, a coumarin derivative, a naphthalene, a pyridiloxazole derivative, cascade yellow dye, dapoxyl dye and several other fluorescent compounds disclosed herein.
  • Magnetic resonance contrast agents include, without limitation, metal complexes selected from the group consisting of chromium (III), manganese (II), iron (III), iron (II), cobalt (II), nickel (II) , copper (II), neodymium (III), samarium (III), yterbium (III), gadolinium (III), vanadium (II), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III) and erbium (III) .
  • metal complexes selected from the group consisting of chromium (III), manganese (II), iron (III), iron (II), cobalt (II), nickel (II) , copper (II), neodymium (III), samarium (III), yterbium (III), gadolinium (III), vanadium (II), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III) and erbium (III
  • the invention is especially directed to those nephrotoxic contrast agents and, therefore, potential causes of acute renal damage.
  • the contrast agent is selected from the group of a contrast agent containing iodine, a contrast agent containing bromine, a contrast agent containing barium, a contrast agent containing gadolinium and combinations thereof.
  • the contrast agent contains iodine.
  • Contrast agents containing iodine or iodinated contrast agents are generally used for radiological examinations such as elimination pyelography, hysterosalpingography, phlebography, CT angiography, CT angiography and arthro CT, among others, as intravenous radio contrasts.
  • Iodized contrast agents contemplated by the present invention are, without limitation, both ionic monomers (diatrizoic acid or amidotrizoic acid and its salts, metrizoic acid and its salts, iotalamic acid and its salts, iodamide, ioxitalamic acid and its salts, iopanoic acid and its salts, ioglycic acid and its salts, acetrizoic acid and its salts, iocarmic acid and its salts, methiodal), as ionic dimers (ioxagic acid and its salts, iotroxy acid and its salts), nonionic monomers (iohexol, iopamidol, ioversol , iobitridol, iopromide, metrizamide, iopentol), non-ionic dimers (iodixanol, iotrolán, ioxilano, iomeprol
  • Suitable salts for said iodinated contrast agents are, without limitation, any type of pharmaceutically acceptable salt, but preferably sodium salt or meglumine salt.
  • Examples of non-limiting salts of iodinated contrast agents contemplated by the present invention are sodium diatrizoate, diatrizoate meglumine, sodium metrizoate, meglumine metrizoate, sodium iotalamate, meglumine iotalamate, sodium ioxaglate, meglumine ioxaglate, etc.
  • the iodine-containing contrast agent is selected from the group of diatrizoic acid (or amidotrizoic acid) and its salts, metrizoic acid and its salts, ioxagic acid and its salts, iotalamic acid and its salts, iopamidol, iohexol, ioxylan, iopromide, ioversol, iodixanol, metrizamide and combinations thereof; preferably it is one or more diatrizoate salts (also known as amidotrizoate).
  • Amidotrizoates are used in a wide variety of procedures such as urography and exploration of the gallbladder, bile ducts and spleen.
  • a mixture of diatrizoate salts such as sodium amidotrizoate and meglumine amidotrizoate is usually preferred to minimize adverse effects and improve the quality of the examination.
  • the iodine-containing contrast agent is a combination of sodium diatrizoate and meglumine diatrizoate.
  • the contrast agent contains bromine.
  • the bromine-containing contrast agents or brominated contrast agents included in the present invention are, without limitation, contrast agents such as those disclosed in patent applications WO93 / 08122, EP 1186305 Al, FR 2736051 Al, EP 073715 Al, EP 074307 Al, EP 074309 Al, EP 0118348 Al, FR 2541272 Al; brominated fluorocarbons such as perfluorooctyl bromide (C8BrF17), perfluorohexyl bromide.
  • the invention also contemplates mixtures of said contrast agents containing bromine and / or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the contrast agent contains barium, preferably it is barium sulfate.
  • Barium sulfate is a metal salt that is used to define the gastrointestinal tract. It can be used in single or double contrast techniques or in computer-assisted axial tomography.
  • the contrast agent contains gadolinium.
  • Contrast agents containing gadolinium are, without limitation, gadopenthetic acid, gadodiamine, gadoteric acid, gadoteridol, gadopentate, gadodiamide, gadobenic acid, gadofosveset, gadoversetamide, gadoxhetic acid, gadobutrol, gadocodiatico acid and gadodenterate.
  • the salts of said gadolinium-containing contrast agents any type of pharmaceutically acceptable salts, preferably sodium salt and meglumine salt, being suitable.
  • the nephrotoxic agent is an antibiotic.
  • antibiotic is meant a chemical produced by a living being or synthetic derivative of it that at low concentrations kills or prevents the growth of certain classes of sensitive microorganisms, usually bacteria, although some antibiotics are also used for the treatment of infections by fungi or protozoa. Antibiotics are used in human, animal or horticultural medicine to treat infections caused by microorganisms.
  • Antibiotics included in the present invention are, without limitation, aminoglycosides, ansamycins, carbacephem, carbapenems, cephalosporins, glycopeptides, macrolides, monobactams, penicillins, polypeptides, quinolones, sulphonamides, tetracyclines and others such as arsphenamine, chloramphenicol, clindamycin, lincomycin, ethambutol , fosfomycin, fusidic acid, furazolidone, isoniazid, linezolid, metronidazole, mupirocin, nitrofurantoin, platensimycin, pyrazinamide, quinupristin / dalfopristin, rifampin or rifampin, tinidazole, viomycin and capreomycin; preferably cephalosporins, tetracyclines, glycopeptides, carbapenems,
  • aminoglycoside antibiotics are meant bactericidal antibiotics that act at the level of ribosomes in the bacterial 30S subunit and, therefore, at the level of protein synthesis, creating porosities in the outer membrane of the bacterial cell wall.
  • Aminoglycoside antibiotics contemplated by the present invention are, without limitation, gentamicin, amikacin, spectinomycin, trospectomycin, streptomycin, neomycin, gentamicin, tobramycin, amikacin, netilmycin, sisomycin, paromomycin and kanamycin. They are also contemplated by the present invention pharmaceutically acceptable salts of said antibiotics.
  • the aminoglycoside antibiotic is selected from the group of gentamicin, tobramycin, amikacin, netilmicin, kanamycin, streptomycin, sisomycin, neomycin and combinations thereof; preferably it is gentamicin.
  • “Cephalosporins” means a class of beta-lactam antibiotics that are derived from 7-cephalosporic acid and that act by interfering with the synthesis of peptidoglycan in the bacterial cell wall and inhibiting the final transpeptidation, necessary for cross-linking, which generates an effect bactericide.
  • cephalosporins includes, for example and without limitation, first generation cephalosporins (cefadroxil, cefazolin, cephalothin, cephalexin), second generation cephalosporins (cefaclor, cephamandol, cefoxitin, cefprozil, cefuroxime), cephalosporins third generation (cefixime, cefdinir, cefditoren, cefoperazone, cefotaxime, cefpodoxime, ceftazidime, ceftibuten, ceftizoxime, ceftriazone), fourth generation cephalosporins (cefepime) and fifth generation (ceftobiprole).
  • cephalosporins includes, for example and without limitation, first generation cephalosporins (cefadroxil, cefazolin, cephalothin, cephalexin), second generation cephalosporins (cefaclor, cephamandol, cefoxit
  • the nephrotoxic agent is an immunosuppressive agent.
  • immunosuppressive agent is meant a substance that produces immunosuppression of the immune system.
  • Such immunosuppressive agents are useful for preventing rejection of a transplanted organ and for the treatment of an autoimmune disease or diseases that may be of autoimmune origin, such as vasculitis, rheumatoid arthritis, ulcerative colitis, psoriasis or systemic lupus erythematosus.
  • Immunosuppressive agents included in the present invention are, if limited, cytostatic agents such as azathioprine, cyclophosphamide, methotrexate, mycophenolate mofetil; glucocorticoids such as prednisone; calcineurin enzyme inhibitors such as cyclosporine A, tacrolimus (FK506); rapamycin or sirolimus; everolimus; polyclonal antibodies such as thymoglobulin; monoclonal antibodies such as rituximab, daclizumab, etanercept. Also contemplated by the present invention are pharmaceutically acceptable salts of said immunosuppressive agents.
  • the immunosuppressive agent is selected from cyclosporin A, tacrolimus (FK506) and everolimus; preferably cyclosporine A.
  • the nephrotoxic agent is an antineoplastic agent.
  • antineoplastic agent is meant a substance that prevents the development, growth or proliferation of malignant tumor cells, and that may be of natural, synthetic or semi-synthetic origin.
  • Antineoplastic agents contemplated in the present invention include, without limitation, DNA alkylating agents; platinum based compounds; antimetabolites; antitumor antibiotics; topoisomerase I and II inhibitors; enzymes such as L-asparaginase; vinca alkaloids; taxanes; hormonal agents such as antiestrogenic, aromatase inhibitors, LH-RH analogues, antiandrogens and glucocorticoids; other agents such as interleukins, interferons, monoclonal antibodies and the BCG vaccine.
  • the antineoplastic agent is selected from the group of a platinum-based compound, an antimetabolite, a DNA alkylating agent, a topoisomerase I or II inhibitor, and
  • platinum-based compound any compound that contains a platinum atom capable of binding and intercalating in the DNA, inducing the activation of DNA repair and, finally, triggering apoptosis.
  • Platinum-based compounds include, without limitation, carboplatin, cisplatin [cis-diaminodichloroplatin, (CDDP)], oxaliplatin, iproplatin, nedaplatin, triplatin tetranitrate, tetraplatin, satraplatin (JM216), JM118, JM149, JM335, transplatin, cis, ZD0, cisD, ZD03 trans, cis-
  • Pt (NH3) (C6Hl 1NH2) (00CC3H7) 2C1, malanato-l, 2-diaminocyclohexane-platinum (II), 5-sulphosalicylate-trans- (l, 2- diaminocyclohexane) platinum (II) (SSP), poly - [(trans -l, 2- diaminocyclohexane) platinum] - carboxyamylose (POLY-PLAT), 4-hydroxy-sulfonylphenylacetate (trans-1,2-diaminocyclohexane) platinum (II) (SAP) and the like.
  • the platinum-based compound is selected from the group of cisplatin, carboplatin and a combination thereof; preferably it is cisplatin.
  • antimetabolite refers, in its broadest sense, to substances that disrupt normal metabolism and substances that inhibit the electron transfer system to prevent the production of energy-rich intermediates. , due to its structural or functional similarities with metabolites that are important for living organisms (such as vitamins, coenzymes, amino acids and saccharides).
  • Antimetabolites suitable for use in the present invention include, without limitation, folic acid antimetabolites (aminopterin, denopterin, methotrexate, edatrexate, trimetrexate, nolatrexed, lometrexol, pemetrexed, raltitrexed, piritrexim, pteropterin-10, leparvorin, leucovorin -dideazafolate (PDDF, CB3717)), ribonucleotide inhibitors (hydroxyurea), purine analogues (cladribine, clofarabine, fludarabine, mercaptopurine, pentostatin, thioguanine) and pyrimidine analogues (capecitabine, 5-azacytidine, cytarabine oxytaine, cytarabine oxytaine , fluorouracil, 5-fluorouracil, doxifluridine, floxuridine and gemcitabine).
  • the pharmaceutically acceptable salts of said antimetabolites are also contemplated by the present invention.
  • the antimetabolite is selected from the group of methotrexate, pentostatin, 5-azacitidine, hydroxyurea and a combination thereof.
  • DNA alkylating agent is meant an alkylating agent used in the treatment of cancer that is capable of adding an alkyl group to the DNA of rapidly dividing cells, leading to the arrest of replication and cell death.
  • Alkylating agents of DNA are nitrogen mustards, nitrosoureas, ethyleneimine derivatives, alkyl sulfonates and triazenes, including, but not limited to, cyclophosphamide (Cytoxan TM), busulfan, improsulfan, piposulfan, pipobroman, melphalan (L-sarcolucin), chlorachiscil mechlorethamine or mustine, uramustine or uracil mustard, novembichin, phenesterine, trofosfamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), chlorozotocin, fotemustine, nimustine, ranimnustine, semustine (methyl-CCNU), streptozotocin, thiotepa, triethylenemelamine, trietilenetiofosforamina , mitomycin C, procarbazine, altretamine, dacarbazine,
  • the alkylating agent of DNA is selected from the group of carmustine, lomustine, semustine, ifosfamide, mitomycin C and a combination thereof.
  • topoisomerase I or ⁇ inhibitor is meant an agent designed to interfere with the action of topoisomerase I and II enzymes.
  • Topoisomerase I inhibitors include, without limitation, irinotecan, topotecan, camptothecin, acetylcamptothecin, 9-aminocamptothecin, lamelarin D and betulinic acid.
  • Topoisomerase II inhibitors include, without limitation, amsacrine, etoposide, teniposide and doxorubicin.
  • the pharmaceutically acceptable salts of said compounds are also contemplated by the present invention.
  • the topoisomerase I or II inhibitor is selected from the group of etoposide, teniposide, doxorubicin and a combination thereof.
  • the invention also contemplates combinations of all these antineoplastic agents, such as and without limitation, cisplatin-paclitaxel, cisplatin-gemcitabine, cisplatin-docetaxel, carboplatin-paclitaxel, cisplatin-etoposide, carboplatin-etoposide, carboplatin-gemcitabine, carboplatin-docetaxel, cisplatin -tenipposide, oxaliplatin-gemcitabine, oxaliplatin-paclitaxel, cisplatin-paclitaxel-gemcitabine, cisplatin-doxorubicin-5-fluorouracil (AFP), cyclophosphamide-doxorubicin-cisplatin (CISCA) and cisplatin-fluorouracil (CF).
  • antineoplastic agents such as and without limitation, cisplatin-paclitaxel, cisplatin-gemcitabine,
  • salts used to form base addition salts whether inorganic, as for example and without limitation, lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, manganese, copper, zinc or aluminum among others, whether organic or for example and without limitation ethylamine, diethylamine, ethylenediamine, ethanolamine, diethanolamine, arginine, Usine, histidine or piperazine among others, or acid addition salts, whether organic, such as, for example and without limitation, acetate, citrate, lactate, malonate, maleate, tartrate, fumarate, benzoate, aspartate, glutamate, succinate, oleate, trifluoroacetate, oxalate, pamoate or gluconate among others, or inorganic, such as for example and without limitation chloride, sulfate, borate or carbonate among others.
  • inorganic such as for example and without limitation chloride, sulfate, borate or carbonate among others.
  • the administration of the compound that induces cardiotrophin-1 activity can be performed before administration of the nephrotoxic agent, during administration of said agent and / or after administration thereof.
  • administration of the compound that induces cardiotrophin-1 activity begins before administration of the nephrotoxic agent (for example one day before) and continues until a few days after the end of administration of the nephrotoxic agent, for example up to 4 days. , up to 5 days, up to 6 days, up to 7 days after the end of administration.
  • the compound that induces cardiotrophin-1 activity is co-administered together with the nephrotoxic agent.
  • Co-administration implies that both the compound that induces cardiotrophin-1 activity and the nephrotoxic agent are administered at the same time, either in separate pharmaceutical compositions, in the same pharmaceutical composition, or, in the case of environmental nephrotoxic agents, the Contact of said nephrotoxic agents with the treated subject coexists over time with the administration of the compound that induces cardiotrophin-1 activity.
  • the administration of the compound that induces cardiotrophin-1 activity can be performed before the onset of ischemia or ischemia-reperfusion, during the same or once the ischemia or ischemia-reperfusion has ceased. Typically, administration of the compound that induces cardiotrophin-1 activity is performed shortly after the establishment of ischemia and is maintained throughout the ischemic period ceasing shortly before reperfusion begins.
  • the subject to which the compound that induces cardiotrophin-1 activity is administered can be any mammal and includes, but is not limited to, domestic and farm animals, primates and humans, for example humans, nonhuman primates, cows, horses , pigs, sheep, goats, dogs, cats or rodents.
  • the subject is a human being of female or male sex and of any race or age.
  • the active ingredients must be in a therapeutically effective amount, and that the formulation of said active compounds will be carried out depending on the type of administration.
  • cardiotrophin-1 is administered at a dose of 100 ⁇ g / kg per day.
  • the compound that induces cardiotrophin-1 activity is administered intravenously.
  • the compound that induces cardiotrophin-1 activity is capable of reducing the deterioration of renal excretory function in patients undergoing renal damage, as shown in Figures 4, 21 and 28B showing a reduction in the decrease creatinine clearance; Figures 2, 3, 14, 19, 20 and 28A showing a reduction in the accumulation in the blood of metabolism products such as creatinine, urea and its derivatives; Figures 5 and 22, which show a decrease in the appearance of proteinuria. Therefore, in a preferred embodiment of the invention the compound that induces cardiotrophin-1 activity reduces the deterioration of renal excretory function.
  • “Impaired renal excretory function” means the complete or partial loss of the kidneys' ability to eliminate waste and concentrate urine without losing electrolytes measured through an increase in serum creatinine levels, from the decrease in the elimination of urine, the decrease in creatinine clearance, the increase in urea and serum derivatives, or the appearance of proteinuria. Suitable methods for determining these parameters have been described previously. The authors of the present invention have shown that the single administration of cardiotrophin-1 is sufficient to prevent and / or treat acute kidney damage. In a preferred embodiment of the invention the administration of the compound that induces cardiotrophin-1 activity is performed in the absence of a soluble receptor of a member of the IL-6 family or a fragment thereof. In a preferred embodiment the soluble receptor is the CT-1 receptor or a fragment thereof.
  • soluble receptor of a member of the IL-6 family is meant a soluble receptor capable of binding to a cytokine belonging to the interleukin 6 family forming a complex that is capable of directly interacting with gpl30.
  • the members of this family are, without limitation, the leukemia inhibitor factor (LIF), cardiotrophin-1 (CT-1), ciliary neurotrophic factor (CNTF), interleukin-11 (IL-11), oncostatin M (OSM), cardiotrophin-like cytokine (CTC) and interleukin 6 itself (IL-6).
  • fragment of a soluble receptor of a member of the IL-6 family is meant any fragment of a soluble receptor of a member of the IL-6 family that maintains cardiotrophin-1 binding capacity and also the ability of interacting with gpl30.
  • soluble CT-1 receptor is meant a soluble receptor capable of binding to cardiotrophin-1 forming a complex that is capable of directly interacting with gpl30.
  • fragment of a soluble CT-1 receptor is meant any fragment of the soluble CT-1 receptor that maintains the ability to bind to cardiotrophin-1 and also the ability to interact with gpl30.
  • the expression “is performed in the absence of a soluble receptor of a member of the IL-6 family or a fragment thereof” means that together with cardiotrophin-1, no soluble receptor of a family member is exogenously administered of IL-6 nor a fragment thereof.
  • the administration of the compound that induces cardiotrophin-1 activity is performed in the absence of a metanephric mesenchymal growth factor.
  • metanephric mesenchymal growth factor means, in the context of the invention, any growth factor capable of stimulating the proliferation of the metanephric mesenchyme and includes, without limitation, TGFa, FGF-2, FGF-9, TEVIP-1 and TF P-2.
  • metanephric mesenchymal growth factor means that together with the cardiotrophin-1, no metanephric mesenchymal growth factor is exogenously administered.
  • the authors of the present invention have shown that renal damage caused by nephrotoxic agents can be counteracted by administering a compound that induces cardiotrophin-1 activity.
  • another aspect of the invention is a composition comprising, together or separately, a compound that induces cardiotrophin-1 activity and a nephrotoxic agent.
  • CT-1 cardiotrophin-1
  • nephrotoxic agent has been previously defined in the context of the uses of the invention and is selected from the group of contrast agents, antibiotics, immunosuppressive agents and antineoplastic agents, which have also been described above.
  • composition refers to a composition consisting of at least two components: a compound that induces cardiotrophin-1 activity and a nephrotoxic agent, which may be a therapeutic agent or a contrast.
  • Said components may be physically together, constituting a single formulation (for example, as a tablet or capsule comprising a fixed amount of each of the components) or, conversely, may be formulated separately to subsequently combine them for joint administration. , sequential or separate.
  • the compositions of the invention also contemplate the formulation as a "kit of parts” in which the components are formulated separately but packaged in the same container, and allow them to be previously combined before administration.
  • the formulation of the first and second components of the compositions of the invention can be similar, that is, formulated in a similar manner (in tablets or tablets), which allows their administration by the same route.
  • the two components can be presented in blister.
  • Each blister contains the medications that have to be consumed over a day. If the medications have to be administered several times a day, the medications corresponding to each administration can be arranged in different sections of the blister, preferably recording in each section of the blister the moment of the day in which they should be administered.
  • the components of the composition of the invention can be formulated differently so that the different components are administered differently.
  • the first component is formulated as a tablet or capsule for oral administration and that the second component is formulated for intravenous administration.
  • the compositions of the invention are administered by methods known to a person skilled in the art, including, without limitation, intravenously, orally, nasally, parenterally, topically, transdermally, rectally, and the like.
  • the relationship between the components that are part of the compositions of the invention will depend on the compound that induces the CT-1 activity and the nephrotoxic agent used in each particular case, as well as the desired indication.
  • compositions useful in the practice of the method of the invention include a therapeutically effective amount of a compound that induces cardiotrophin-1 activity and a therapeutically effective amount of the nephrotoxic agent, when said agent is a therapeutically active drug.
  • compositions useful in the practice of the method of the invention include a therapeutically effective amount of a compound that induces cardiotrophin-1 activity and an adequate amount of the nephrotoxic agent to obtain a contrast image useful in diagnostic procedures when said agent Nephrotoxic be a contrast agent.
  • the compositions of the invention also include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition is a pharmaceutical composition comprising, together or separately, a compound that induces cardiotrophin-1 activity, a nephrotoxic agent and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • terapéuticaally effective amount of a compound that induces cardiotrophin-1 activity is meant that amount capable of producing one or more of the effects listed above and attributable to CT-1, and can be determined by standard techniques based on the detailed methods in the present description.
  • nephrotoxic agent that amount of nephrotoxic agent necessary to produce a therapeutic effect and which varies depending on the therapeutic effect sought, that is, varies depending on whether the nephrotoxic agent is an antibiotic, an antineoplastic agent or an immunosuppressive agent.
  • pharmaceutically acceptable means approved by a Federal or state government regulatory agency or included in the US Pharmacopoeia. or other generally recognized pharmacopoeia, for use in animals, and more particularly in humans.
  • carrier refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic compound is administered.
  • Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like.
  • Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, crete, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dry skim milk, glycerol, propylene, glycol , water, ethanol and the like.
  • the composition if desired, may also contain smaller amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents.
  • the composition can be formulated according to routine procedures such as a pharmaceutical composition adapted for intravenous, subcutaneous or intramuscular administration to humans.
  • the composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lidocaine to relieve pain at the injection site.
  • a solubilizing agent such as lidocaine to relieve pain at the injection site.
  • the composition can be dispensed with an infiltration bottle containing water or pharmaceutical grade saline.
  • a vial of water for injection or sterile saline can be provided, so that the ingredients can be mixed before administration.
  • the amount of compound that induces CT-1 activity that will be effective in the treatment of renal damage can be determined by standard clinical techniques based on the present description.
  • in vitro assays can optionally be used to help identify the optimum dosage ranges.
  • the precise dose to be used in the formulation will also depend on the route of administration, and the severity of the condition, and should be decided according to the judgment of the doctor and the circumstances of each subject.
  • the methods of prevention and / or treatment of acute renal damage according to the invention contemplate the joint, sequential or separate administration of the compounds capable of inducing CT-1 activity with one or more nephrotoxic compounds. Therefore, in a preferred embodiment the composition is administered simultaneously, separately or sequentially. All particular embodiments of the uses of the present invention are also applicable to the compositions of the invention.
  • contrast agent has been defined above in the context of the uses of the invention.
  • diagnostic agent in the context of the present invention, refers to an agent comprising a contrast agent and a compound that induces cardiotrophin-1 activity and that administered to an individual can be detected by contrast.
  • the diagnostic agent includes, in addition to the compound of the invention, other components or excipients that are necessary for use or administration.
  • the invention relates to a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and an antibiotic for the prevention and / or treatment of the antibiotic-associated nephrotoxicity.
  • the invention relates to the use of a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and an antibiotic for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of the antibiotic-associated nephrotoxicity.
  • the invention relates to a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and an antibiotic for use in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of the antibiotic-associated nephrotoxicity.
  • the invention in another aspect, relates to a method of treatment or prevention in an individual of the nephrotoxicity associated with an antibiotic comprising the administration to said individual of a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and an antibiotic .
  • antibiotic has already been defined in the context of the uses of the invention.
  • Such antibiotics are commonly used in the treatment of infections, which are diseases caused by the colonization of a host individual by a pathogenic microorganism (bacteria, fungus or protozoan) that is detrimental to the normal functioning and survival of the host.
  • the antibiotic used in the composition will determine the infection for which the composition of the invention is suitable for treatment.
  • the infections that are treated with the composition of the invention are generally severe infections caused by Gram-negative bacteria, such as Escherichia coli and Klebsiella, as well as infections by Pseudomonas aeruginosa and non-facultative anaerobic bacteria. They are also useful in surgery prophylaxis.
  • the infections that are treated with the composition of the invention are generally infections by Gram positive cocci, Proteus, Escherichia coli, Klebsiella, Gram negative bacilli, Haemophilus influenzae, Enterobacter, Pseudomonas, Neisseria, Staphylococcus aureus. They are also useful in the treatment of infections by organisms resistant to other beta-lactams, such as certain presentations of meningitis, and in pre-surgery prophylaxis.
  • the invention relates to a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and an immunosuppressive agent for the prevention and / or treatment of nephrotoxicity associated with the immunosuppressive agent.
  • the invention relates to the use of a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and an agent immunosuppressant for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of the nephrotoxicity associated with the immunosuppressive agent.
  • the invention relates to a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and an immunosuppressive agent for use in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of nephrotoxicity associated with the immunosuppressive agent. .
  • compositions of the invention are useful in those patients who suffer or are susceptible to rejection in transplants or an autoimmune disease and must be treated with a nephrotoxic immunosuppressive agent.
  • transplant rejection is meant the reaction produced by the immune system of the recipient of a transplant that attacks the transplanted organ or tissue, leading to what is known as graft versus host disease and destroying foreign tissue.
  • Autoimmune disease means that disease in which the immune system attacks the body's own cells.
  • the invention in another aspect, relates to a method of treatment or prevention in an individual of the nephrotoxicity associated with an antineoplastic agent comprising the administration to said individual of a composition comprising a compound that induces cardiotrophin-1 activity and a antineoplastic agent
  • antineoplastic agent has already been defined in the context of the uses of the invention.
  • the compositions of the invention are useful in those patients who suffer or are susceptible to cancer and must be treated with an agent. Nephrotoxic antineoplastic.
  • cancer or "tumor” is defined as the physiological condition in mammals characterized by deregulated cell growth.
  • mice anti-cardiotrophin-1 antibody and the preimmune goat control IgG were supplied by Digna-Biotech (Pamplona, Spain) and generated by R&D Systems (Minneapolis, MN). Both drugs were dissolved in 0.9% saline solution to a final concentration of 5 ⁇ g / ml.
  • a mixture of ketamine (Ketolar, Pfizer), benzodiazepine (Valium, Roche) and atropine (Atropine, Braun) was used in a 2: 2 ratio: 1.
  • 0.3 mg buprenorphine was acquired / ml (Buprex, Schering-Plow). Animals
  • mice were sacrificed at the time points indicated after reperfusion, 4 hours (groups 1-4) and 48 hours (groups 5-8). After the reperfusion period, the mice were anesthetized intraperitoneally with sodium pentobarbital (40 mg / kg body weight), blood samples were collected through cardiac puncture and the mice were perfused in situ with cold isotonic saline solution. along the abdominal aorta at the level of the iliac bifurcation. Blood samples were centrifuged (6000 g for 3 minutes) to separate the frozen plasma and stored at -80 ° C for additional biochemical studies. The left kidney was removed from the mice at the end of the experimental period. The renal pedicle was tied and weighed.
  • Malonildialdehyde (MDA) levels in kidney samples were determined using TBAR analysis as an indicator of lipid peroxidation, previously described (Rodr ⁇ guez-Pe ⁇ a, A. et al. 2002. Hypertension, 40 (5): 713- twenty).
  • the tissues were homogenized in a phosphate / sodium chloride solution. An aliquot of the homogenate was added to a reaction mixture containing 20% trichloroacetic acid and 0.67% thiobarbituric acid. The mixture was then boiled for 15 minutes at 100 ° C and centrifuged at 9,000 g for 5 minutes. The absorbance in the supernatant was measured by spectrometry at 532 nm.
  • MPO activity in kidney samples was determined as an index of polymorphonuclear cell accumulation (PMN), using an adsorption enzyme immunoassay kit (ELISA) specific for the mouse enzyme mentioned previously according to the manufacturer's instructions and guidelines (Hycult Biotech, The Netherlands).
  • concentration of MPO in kidney homogenate samples was expressed as ng / mg protein.
  • TNF-a tumor necrosis factor-alpha
  • T F- ⁇ The serum level of T F- ⁇ was quantified using an adsorption enzyme immunoassay kit (ELISA) specific for the mouse cytokine mentioned previously according to the manufacturer's instructions and guidelines (R&D Systems, Minneapolis, MN). The concentration of TNF- ⁇ in plasma was expressed as pg / ml.
  • ELISA adsorption enzyme immunoassay kit
  • the immune complexes were detected with chemiluminescent HRP substrate (ECL) using an image reader (ImageQuant RT ECL, GE Healthcare, Spain), and the bands were measured.
  • the membranes were also retested with mouse monoclonal anti-GADPH antibody (1: 20,000, Ambion Applied Biosystems) to verify the same protein load in each lane.
  • the paraffin-fixed tissue sections were mounted on glass slides and stained with H&E for examination with an optical microscope. Five randomly selected images were captured digitally per section (magnification ⁇ 400) and the optical density was analyzed (Grande, M.T. et al. 2010. Kidney Int., 77 (6): 509-518).
  • Figure 34 represents the body weight of the animals in the four experimental groups 48 hours after I / R during the study period. All mice in the simulated group showed good appearance, normal motility and stable maintenance on body weight at all time points. However, the I / R groups showed a poor appearance and less motility accompanied by a significant loss of weight after the reperfusion phase. This deterioration in health caused by the surgical procedure was slightly greater in mice treated with anti-CT-1 compared to that of the control groups (mice treated with saline or goat IgG).
  • Figure 36 represents the evolution of plasma urea levels in the four experimental groups 48 hours after I / R during the study period. The results show that the plasma urea concentration remained unchanged in the simulated group. With respect to mice undergoing renal I / R, plasma urea levels increased 24 hours after ischemia, reaching a peak. This increase in renal dysfunction was greater in the mice treated with anti-CT-1 than in the control groups (mice treated with saline or goat IgG), but there were no significant differences between these groups. At the final time points or 48 after ischemia, plasma urea concentration returned to almost normal levels in all I / R groups.
  • FIG 38 depicts renal myeloperoxidase (MPO) levels in the four experimental groups 48 hours after I / R.
  • MPO myeloperoxidase
  • the kidneys of the I / R mice showed a significant increase in MPO levels compared to simulated operation mice, suggesting an increase in PMN infiltration into renal tissues.
  • the kidneys of I / R mice treated with anti-CT-1 had a significantly higher level of MPO activity than the kidneys of the control and control IgG groups. No significant differences were found in renal MPO levels between the renal tissue of control mice and control IgG.
  • Figure 39 depicts the plasma levels of TNF- ⁇ in the four experimental groups 4 hours after I / R.
  • the I / R produced a significant increase in serum TNF- ⁇ levels compared to those in the simulated group.
  • the anti-CT-1 therapy produced non-significant changes in serum TNF- ⁇ levels compared to the control and control IgG I / R groups.
  • Sections of the left kidneys were stained with hematoxylin-eosin and analyzed by optical microscopy 48 after I / R. Histological examination showed normal renal architecture in mice with simulated operation, but those who experienced I / R showed a significant degree of renal injury. Specifically, the kidneys showed degeneration of the tubular structure, tubular dilation, swelling, tubular cell necrosis and luminal congestion. In the regions Perivascular was an inflammatory infiltrate. In the anti-CT-1 group, the cut sections of the kidneys showed a marked increase in the severity of these histological features of kidney injury when compared to kidneys subjected only to I / R. There were no differences in any of the previous histological parameters measured between control and control IgG mice (data not shown).
  • Sections of the left kidneys obtained 48 hours after I / R were stained with a specific macrophage marker (anti-CD68 antibody). Two days after I / R (48 hours after ischemia), CD-68 positive (ED-1 positive) cells were predominantly expressed in the interstitium around atrophic tubules. The number of CD68 positive cells after I / R was significantly higher in mice that were administered anti-CT-1 than in the control groups. No significant differences were found in macrophage infiltration between control and control IgG mice. Macrophage staining was minimal in kidneys of the simulated group (data not shown).
  • Kidney extraction and processing for histology and Western blot Kidney extraction and processing for histology and Western blot.
  • the animals were sacrificed and the kidneys were removed for post mortem studies. Before extraction, the kidneys were pre-fused with heparinized saline to remove blood from their vascular tree. To do this, the rats were anesthetized with sodium pentobarbital intraperitoneally with a dose of 10 mg / kg. To access the abdominal cavity, an incision was made in the abdomen (laparotomy) and the intestinal mass was separated to proceed to cannulate the aorta, in the iliac bifurcation. 20 mL of heparinized saline solution was perfused through the cannula at 37 ° C.
  • Sections 3 ⁇ thick were cut with a microtome (MICRON HM-310) and then the cuts were deposited on a glass slide. The cuts were dewaxed with xylene and the sample was rehydrated by passing it through a series of decreasing graduations of ethyl alcohol until it reached 100% distilled water.
  • MICRON HM-310 microtome
  • kidney samples stored cold at -80 ° C were sprayed frozen by percussion between two metal plates, keeping them at all times on dry ice to avoid defrosting and deterioration. Next, 100 mg of tissue powder was weighed from each of the samples, with which a tissue extract was made.
  • PMSF phenyl methyl sulfonyl fluoride
  • CLCr FU x CrO / CrP
  • FU urinary flow (ml / min)
  • CrO the concentration of urine creatinine
  • CrP the concentration of plasma creatinine
  • the plasma urea concentration was measured by specific test strips of a commercial kit, using a semi-automatic analyzer (Reflotron, Roche).
  • Urinary flow (mL / day) was measured by measuring the graduated containers containing 24 h urine in the metabolic cages as indicated in the urine collection.
  • Malonildialdehyde was determined using a spectrophotometric technique based on the reaction of two thiobarbituric acid (TBA) molecules with an MDA molecule (final product of lipid peroxidation) at 45 ° C that leads to a stable chromophore with a maximum absorbance at 532nm. (Recknagel RO, Ghoshal AL, 1966, Exp Mol Pathol 5: 413-426).
  • This technique shows the morphological structure of the tissue cells, since it stains the nucleus, the acid areas of the cytoplasm, and the matrix blue, and the cytoplasm and all its basic components pink.
  • the renal histological sections prepared as indicated above, were kept four minutes in a hematoxylin solution and then washed with running water to keep them for three minutes in an eosin solution. Once stained, the samples were dehydrated again using alcohols of increasing concentration (70 °, 90 °, 100 °) to fix them permanently with a drop of Canada Balm on which a coverslip with mounting medium (Tissue) was placed -Tec).
  • the images were captured with a high resolution camcorder connected to the optical microscope that carries a 10X objective. A green optical filter was used to increase the contrast.
  • the immunohistochemical technique was initiated by eliminating the endogenous signal from the cuts, with 3% hydrogen peroxide and methanol. The sections were then blocked, and subsequently incubated with the primary and secondary antibodies. The HRP (horseradish peroxidase) was then added to the samples. Immediately afterwards, the 3,3'-diaminobenzidine chromogen (DAB) was added. The preparations were slightly submerged in hematoxylin to contrast. Finally, the cuts were dehydrated by a battery of alcohols of increasing concentration, on which a coverslip was deposited by means of a mounting means (Tissue-Tek) so that they could be observed in an optical microscope.
  • HRP horseradish peroxidase
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine chromogen
  • cytochrome C 75 ⁇
  • SOD 20 ⁇
  • buffer solution a volume of 1,000 ⁇ was completed
  • MPO myeloperoxidase activity
  • myeloperoxidase a specific neutrophil enzyme used as an index to assess neutrophilic infiltration in the kidney
  • the presence of myeloperoxidase was analyzed in renal samples by the following method (Mullane KM et al, J Pharmacol Methods 1985, 14 (3): 157 -167): once obtained, the samples were weighed between ice and frozen in liquid nitrogen and subsequently stored at -80 ° C until determination. Subsequently, the samples were homogenized in a solution composed of a 50 mM potassium phosphate buffer with 0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide and 0.146% EDTA at a pH of 6.0 and in the proportion of one gram of tissue for 10 ml of homogenization solution.
  • the buffer for the test consisting of 50 mM potassium phosphate buffer with 0.167 mg / ml of O-dianisidine dihydrochloride and 0.005% of hydrogen peroxide at a pH of 6.0 was prepared.
  • the standard curve with known amounts of MPO at 460 nm wavelength ( ⁇ ) and at 25 ° C was performed against a blank with the assay buffer.
  • the unit (U) of myeloperoxidase activity is defined as the amount of enzyme that degrades 1 ⁇ of ⁇ 2 0 2 / minute at 25 ° C. Determination of cytokines T Fa, IL- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-6 and IL-10
  • iodinated contrast nephropathy An experimental model of iodinated contrast nephropathy was used, consisting of intravenous administration of the Gastrografin iodinated contrast (Bayer C.N. 909622 EXO) to rats predisposed to suffer acute renal failure. The predisposition was achieved by prior treatment with gentamicin at sub-toxic doses (Quiros and cois, Kidney Int. 2010; 78: 1006-1015). The experiment was performed on 32 male Wistar rats of about 220 grams in weight. The environmental conditions of the animals remained constant: the temperature of about 20 ° C, the humidity of approximately 60%, and the daily light time (photoperiod) of 12 hours. In the study design six experimental groups were raised:
  • Gg Gastrografin Group
  • the animals were housed in metabolic cages in order to collect urine free of feces.
  • a blood sample (0, 150 ml) was obtained from the tail in heparinized capillaries.
  • the rats were anesthetized and subsequently perfused with heparinized saline.
  • the kidneys of these animals were obtained and a part of the samples was introduced into formalin for histological studies while another part was frozen for tissue studies.
  • GFR Glomerular filtration rate
  • RPF renal plasma flow
  • RVR renal vascular resistance
  • the Gg + G group produced a decrease in creatinine clearance (as an index of the glomerular filtration status), which resulted in a decrease in excretion and, therefore, an accumulation in the blood of metabolism products such as creatinine , urea and its derivatives (measured together as plasma urea concentration) ( Figures 2-4).
  • the joint administration of Gg + G was accompanied by high proteinuria ( Figure 5).
  • CT-1 group Gg + G + CT-1
  • group Gg + G + CT-1 partially reversed the decrease in creatinine clearance, the increase in the plasma concentration of creatinine, urea and proteinuria
  • Figures 2-5 The administration of gentamicin, gastrografin and CT-1 alone did not alter any of these parameters ( Figures 2-5).
  • NAG is a lysosomal enzyme that is used in the diagnosis and monitoring of nephropathies. Its presence in the urine increases as a result of kidney damage and is considered a marker of tubular damage. Our results show that the NAG was increased in animals treated with Gg + G. CT-1 reduced this increase in a similar way to proteinuria, which corroborates the findings related to tubular damage (Figure 6).
  • KTM-1 is a type I membrane protein, which has been developed as a more sensitive early marker than NAG. During tubular damage, the extracellular domain of KTM-1 is cleaved and increased in the urine as a very early marker of damage.
  • Figure 7 it can be seen how the joint treatment of Gg + G induces a clear increase in the bands reactive to the anti-KTM-1 antibody in the urine.
  • Gentamicin, gastrografin and CT-1 have no effect compared to controls.
  • CT-1 significantly decreases the increase in KTM-1 expression produced by the joint treatment of Gg + G.
  • Plasminogen activator inhibitor 1 is an inhibitor of the fibrinolysis process that is involved in inflammatory responses and of tissue repair. Its expression is increased in many cell types as a result of the action of mediators of inflammation. It also increases as a result of chronic and acute kidney damage.
  • Our results indicate that the expression of PAI-1 is clearly increased in the urine of animals that were given the contrast and were previously sensitized (group Gg + G). These results suggest that in this experimental group an injury occurs in which inflammatory processes appear to be involved, perhaps as a reparative response to the damage.
  • the levels of this marker in rats treated with gentamicin, gastrografin or CT-1 are not different from the animals in the control group. The marker does not appear in the Gg + G + CT-1 group, which shows a protective effect of CT-1 ( Figure 7).
  • the experiment was performed on 24 male Wistar rats of about 220 grams in weight.
  • the environmental conditions of the animals remained constant: the temperature of about 20 ° C, the humidity of approximately 60%, and the daily light time (photoperiod) of 12 hours. All procedures related to animals and their care have been governed in accordance with the institutional guidelines of the University of Salamanca, and in compliance with national laws (Law 121/000123/2007 / Spain; RD 1201/2005 / CyL) and international (Directive 2003/65 / EC).
  • the animals were divided into 4 experimental groups, comprising 6 rats per group. Daily treatment for 7 days with cardiotrophin-1 was started one day before single treatment with cisplatin.
  • the experimental design was developed as described below:
  • Figure 12 represents the weight of the animals in the four study groups during the experimental period.
  • the antineoplastic treatment with cisplatin at the dose of 6 mg / kg induces a significant decrease in the body weight of the animals, this reduction being significantly smaller in the group of animals treated together with cardiotrophin-1.
  • This fact is corroborated with the external evaluation of the physical state of the animals, in which a substantial deterioration can be seen as a consequence of the antitumor treatment and a spectacular improvement during the co-administration of cardiotrophin-1.
  • the cardiotrophin-1 group shows an increase in body weight throughout the study period, with no apparent differences from the control group ( Figure 12).
  • FIG. 14 represents the evolution of plasma creatinine in the four experimental groups of animals during the study period.
  • the antineoplastic treatment with cisplatin at the dose of 6 mg / kg induces a marked increase in plasma creatinine, mainly from day 2 after cytostatic treatment, this increase being significantly smaller in the group of treated animals together with cardiotrophin-1.
  • This fact determines a reversible acute renal damage due to cisplatin, in which the intravenous treatment of 100 ⁇ g / kg of cardiotrophin-1 for 7 consecutive days is able to protect and reverse the nephrotoxicity induced by this antitumor drug.
  • the cardiotrophin-1 group does not reflect changes in said renal parameter evaluated, with respect to the control group ( Figure 14).
  • Figure 15 reflects the weight of different organs (with respect to the animal's body weight) in the four study groups, at the end of the experimental period.
  • Control (C): vehicle once a day i.v. (n 6).
  • G gentamicin (150 mg / kg / day, ip) for 6 days.
  • G produced a clear acute renal failure that was evidenced by an accumulation in the blood of metabolic products such as urea and its derivatives (measured together as plasma urea concentration) and creatinine ( Figures 19 and 20) and a drastic decrease in creatinine clearance (as a measure of glomerular filtration rate) ( Figure 21).
  • G produced a high proteinuria ( Figure 22) which, according to the specialized literature on the nephrotoxicity of this antibiotic, is of tubular origin, and results from the damage and functional alterations of this compartment.
  • the administration of CT-1 together with G partially reversed the decrease in creatinine clearance, the increase in plasma creatinine and urea concentration, and proteinuria ( Figures 19-22). CT-1, administered alone, did not alter any of these parameters ( Figures 19-22).
  • NAG N-acetyl glucosaminidase
  • CT-1 reduces this increase in NAG excretion, especially the submaximum that occurs during the first days of damage.
  • the profile of the effect of CT-1 on the excretion of NAG is almost identical to that of proteinuria, which reinforces the results related to tubular damage.
  • Figure 26 shows how treatment with G induces a clear increase in renal levels of KTM-1, as well as bands reactive to the anti-KTM-1 antibody in the urine.
  • CT-1 has no effect compared to controls. However, it can be seen that CT-1 does not appreciably decrease the increase in KTM-1 expression in the kidney that produces G. This could indicate, among other things, that the regeneration process remains as active as in Animals treated with G. However, it is observed that the upper band (approx. 90 kDa) of KTM-1 in the urine is partially decreased, which would be consistent with a partial reduction in damage.
  • NGAL from Neutrophil Ge latinase-Associated Lipocalin
  • NGAL Neutrophil Ge latinase-Associated Lipocalin
  • Ischemia / renal reperfusion is a common cause of acute renal failure and in renal transplantation can cause acute tubular necrosis or initial delay of graft function or delayed renal function (FRR).
  • the I / R has been correlated with the incidence of acute rejection (Matas AJ. Et al. Transplantation. 2000; 69 (1): 54-58) and the evidence Clinical and experimental have also identified I / R damage as a risk factor for chronic renal allograft failure.
  • 500 ⁇ saline serum (IR C groups) or 400 ⁇ g / kg CT-1 in 500 ⁇ saline serum (IR CT- groups) was administered to the rats through the penile vein one). Animals that underwent right nephrectomy were included as a simulated group.
  • renal superoxide anion (SOA) levels were significantly higher in the ischemic control group (IR C) than in the simulated and IR CT-1 groups.
  • Data from the CT-1 group were significantly lower than those from the ischemic control group (IR C), but significantly higher than those from the simulated group ( Figure 29).
  • MPO myeloperoxidase
  • Renal levels of myeloperoxidase (MA) activity were more than 5 times higher in the ischemic control group (IR C) than in the simulated group, and were also significantly higher in the ischemic control group than in the CT-1 group.
  • the animals of the IR group CT-1 had similar values to those obtained in the simulated group ( Figure 30).
  • Ischemic reperfusion induced a large increase in plasma levels of proinflammatory cytokines at 4 hours after reperfusion.
  • the levels of TNF-a ( Figure 31 A), IL- ⁇ (Figure 3 IB) and IFN- ⁇ (Figure 31C) were 11, 6 and 4 times higher, respectively, in the IR C group than in the simulated group.
  • the CT-1 treatment blocked the elevation of these three cytokines induced by IR.
  • plasma levels of IL-6 ( Figure 3 ID) and IL-10 ( Figure 31E) decreased after ischemia and reperfusion. This decrease was not observed in animals that received CT-1 ( Figures 3 ID and 31E).
  • CT-1 administered intravenously (100 ⁇ g / kg / day), in our experimental model of contrast nephropathy in animals sensitized with gentamicin, reduces the deterioration of renal excretory function and intensity of tubular damage.
  • CT-1 could protect against vascular and glomerular effects involved in contrast-induced nephrotoxicity.
  • rat cardiotrophin-1 exerts a protective effect of renal damage induced by cisplatin at the dose of 6 mg / kg.
  • the results demonstrate that the human recombinant CT-1 administered intravenously (100 ⁇ g / kg / day, for 7 days - one day before starting treatment with G and throughout he-) has a protective effect of acute renal damage produced by gentamicin in Wistar rats.
  • CT-1 reduces the deterioration of renal excretory function and the intensity of renal tubular damage induced by gentamicin.
  • CT-1 prevents acute renal damage, decreased renal function, oxidative stress and inflammation induced by ischemia and subsequent reperfusion.

Abstract

La presente invención se relaciona con el uso de cardiotrofina-1 (CT-1) para la prevención y/o el tratamiento del daño renal agudo, especialmente del daño renal agudo inducido por agentes nefrotóxicos, tales como agentes de contraste, antibióticos, agentes inmunosupresores o agentes antineoplásicos. La invención también contempla composiciones que comprenden dichos agentes nefrotóxicos y cardiotrofina-1.

Description

USO DE LA CARDIOTOFINA-1 PARA EL TRATAMIENTO DE
ENFERMEDADES RENALES
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con el uso de la cardiotrofina-1 (CT-1) para la prevención y/o el tratamiento del daño renal agudo, especialmente del daño renal agudo inducido por agentes nefrotóxicos. Asimismo, la invención también se relaciona con composiciones que comprenden dichos agentes nefrotóxicos y cardiotrofina-1.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El daño renal agudo (DRA) [acute kidney injury] es un complejo proceso de daño en diversas estructuras renales que lleva a una pérdida repentina de la función renal completa o parcial, produciendo un fracaso renal agudo (FRA) en un corto período de tiempo que oscila desde horas a unos pocos días (López-Novoa JM. Kidney Int. 1999;55: 1672-1682; López-Novoa JM, et al. Kidney Int. 2011;79:33-45). En general, el término DRA se utiliza para definir la naturaleza reversible de la mayoría de las agresiones al riñon; mientras que el término FRA se reserva para describir el estado de aquellos pacientes con un daño renal que lleva consigo una disminución de la tasa de filtrado glomerular y de la capacidad excretora del riñon, por lo que requieren terapia de reemplazo renal (TRR), es decir, cualquier método de diálisis intermitente o convencional. Existen muchos mecanismos implicados en la etiología del DRA, entre los cuales los más importantes o mejor estudiados son (Schrier RW, et al. J Clin Invest. 2004; 114:5- 14): daño endotelial producido por perturbaciones vasculares; necrosis/apoptosis celular tubular debida a isquemia o al efecto tubular directo de nefrotoxinas; abolición de la regulación renal; inflamación; y necrosis y apoptosis de las células tubulares que conduce a obstrucción tubular. En muchas ocasiones, estos mecanismos están asociados entre ellos (López-Novoa JM, et al. Kidney Int. 2011;79:33-45). La acción de agentes nefrotóxicos sobre el riñon es una de las causas más comunes de daño renal agudo. Entre los agentes nefrotóxicos de origen farmacológico más habituales se encuentran los agentes de contraste, los agentes antineoplásicos y los antibióticos.
La incidencia de deterioro de la función renal inducida por agentes de contraste ha aumentado significativamente en los últimos años a consecuencia del creciente número de procedimientos intervencionistas diagnósticos y terapéuticos realizados en pacientes, y también al aumento de pacientes con situaciones de riesgo, como la diabetes (Calvin y cois, Nature Reviews Nephrology 2010; 6: 679-688) y la edad avanzada (Laville y Juillard, J Nephrol. 2010;23 :387-398). La nefropatía por contraste, si bien suele ser reversible, dista de ser una complicación benigna, ya que supone una prolongación de la estancia hospitalaria y en algunos casos, en particular en pacientes de alto riesgo, conduce al deterioro irreversible de la función renal (Laville y Juillard, J Nephrol. 2010;23 :387-398).
El tratamiento del DRA inducido por agentes de contraste, una vez establecido, está limitado a cuidados de soporte y diálisis. Hasta la fecha, se han ensayado múltiples moléculas para su prevención, tales como el péptido natriurético atrial, estatinas, análogos de prostaglandinas/prostaciclina, N-acetilcisteína o bicarbonato intravenoso isotónico, pero estas terapias preventivas no han logrado demostrar una eficacia concluyente (Weisbord SD, Palevsky PM. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2010; 19(6):539-549). Los agentes antineoplásicos son otra causa de daño renal agudo en pacientes que sufren cáncer sometidos a quimioterapia. Concretamente, el cisplatino es uno de los agentes antineoplásicos más efectivos en el tratamiento de tumores sólidos, con un amplio espectro de acción. Sin embargo, la nefrotoxicidad acumulativa dosis-dependiente, es la principal limitación terapéutica de este fármaco, requiriendo en algunos casos una reducción en la dosis o discontinuidad en el tratamiento. En general, las estrategias para la prevención del daño renal producido por la administración de cisplatino se basan en infusiones salinas para inducir la diuresis del soluto y en un ajuste óptimo de la dosis del antineoplásico. Auque se ha descubierto que la amifostina es efectiva en la prevención del fallo renal, se han descrito casos de síndrome de Stevens-Johnson y necrólisis epidérmica tóxica en pacientes tratados con dicho fármaco (Darmon M. et al. Critical care. 2006; 10:21 1).
Por otra parte, antibióticos como la gentamicina y, en general, los antibióticos aminoglucósidos, son principios activos ampliamente utilizados para el tratamiento de una gran variedad de infecciones. Su principal inconveniente, y la mayor limitación de su uso, es su nefrotoxicidad, ya que a pesar de una correcta monitorización e hidratación de los pacientes, el daño renal agudo aparece en un 10-20% de los tratamientos. Actualmente no existen fármacos ni estrategias terapéuticas que permitan prevenir o minimizar el daño renal causado por la gentamicina, ni mejorar la recuperación del órgano tras la retirada del tratamiento. La solicitud de patente internacional WO 2006/134601 A2 describe métodos para la prevención o el tratamiento de la insuficiencia renal aguda inducida por HgCl2 que comprenden la administración de una composición farmacéutica que contiene como agente activo una proteína de fusión formada por un miembro de la familia de IL-6 unido a un receptor soluble de dicho miembro. Sin embargo, la administración del polipéptido de IL-6 aislado, en ausencia de su receptor, no es capaz de prevenir o tratar el daño renal.
La patente estadounidense US 7,022,666 B l describe métodos para inducir la formación de epitelio renal a partir de precursores mesenquimales en sujetos que padecen insuficiencia renal que comprende la administración de un ligando del receptor gpl30 en presencia de un factor de crecimiento mesenquimal metanéfrico. Dicho factor de crecimiento mesenquimal metanéfrico es imprescindible para la inducción del epitelio.
Por tanto, existe una necesidad en el estado de la técnica de proporcionar agentes útiles para el tratamiento y/o prevención del daño renal agudo, y en particular del daño renal agudo causado por agentes nefrotóxicos. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención se relaciona con el uso de un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 (CT-1) para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del daño renal agudo, en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se selecciona del grupo de:
(i) cardiotrofina-1 (CT-1) o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(ii) un polinucleótido que codifica CT-1 o una variante funcionalmente equivalente de CT-1 que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(iii) un vector que comprende un polinucleótido según (ii), y
(iv) una célula capaz de secretar al medio cardiotrofina-1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende, juntos o separados, un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente nefrotóxico.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente de contraste para la preparación de un agente diagnóstico. Aún en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un antibiótico para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al antibiótico. En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente inmunosupresor para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al agente inmunosupresor.
En un último aspecto, la invención se relaciona con el uso de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente antineoplásico para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al agente antineoplásico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Evolución del peso corporal expresado en gramos (g), durante el periodo experimental en ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT- 1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicina (Gg+G) y gastrografin + gentamicina + cardiotrofina-1 (Gg+G+CT-1). Los datos representan la media ± EEM (4-5 animales/grupo), d 0: condiciones básales en el día 0; d 4: día 4 después del contraste.
Figura 2. Concentración plasmática de creatinina (Creat. Plasma.), expresada en mg/dL, de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicina (Gg+G) y gastrografin + gentamicina + cardiotrofina-1 (Gg+G+CT-1). Datos a los días 2 (d 2) y 4 (d 4) después de la administración del gastrografin. Los datos representan la media ± EEM de 4-5 animales/grupo.* p<0,05 con respecto al grupo C, G, CT-1 y Gg al final del tratamiento (día cuarto después de la administración del contraste yodado). & p<0,05 con respecto al Gg+G al final del tratamiento, d 2: día 2 después del contraste; d 4: día 4 después del contraste.
Figura 3. Concentración plasmática de Urea, expresada en mg/dL, de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicina (Gg+G) y gastrografin + gentamicina + cardiotrofina-1 (Gg+G+CT-1). Datos de los días 2 (d 2) y 4 (d 4) después de la administración del gastrografin. Los datos representan la media ± EEM de 4-5 animales.* p<0,05 con respecto al grupo C, G, CT-1 y Gg al final del tratamiento (día cuarto después de la administración del contraste yodado). & p<0,05 con respecto al Gg+G al final del tratamiento, d 2:día 2 después del contraste; d 4: día 4 después del contraste.
Figura 4. Aclaramiento de creatinina (Cl. Crea ), expresado en ml/min, de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicina (Gg+G) y gastrografin + gentamicina + cardiotrofina-1 (Gg+G+CT-1), al finalizar los tratamientos. Los datos representan la media ± EEM de 4-5 animales/grupo.* p<0,05 con respecto al grupo C, G, CT-1. Figura 5. Excreción urinaria de proteínas (Prot. Orina), expresada en mg/día (mg/d), de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicina (Gg+G) y gastrografin + gentamicina + cardiotrofina- 1 (Gg+G+CT-1), al finalizar los tratamientos. Los datos representan la media ± EEM de 4-5 animales/grupo.* p<0,05 con respecto al grupo C, G, CT-1 y Gg. & p<0,05 con respecto al grupo Gg+G.
Figura 6. Excreción urinaria de N-acetil glucosaminidasa (NAG), expresada en unidades arbitrarias por día (UA/d), de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicina (Gg+G) y gastrografin + gentamicina + cardiotrofina-1 (Gg+G+CT-1), al finalizar los tratamientos. Los datos representan la media ± EEM de 4-5 animales/grupo.* p<0,05 con respecto al grupo C, G, CT-1 y Gg.
Figura 7. Imágenes representativas de análisis por Western blot de KEVI-1 y PAI-1 en la orina de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1), gastrografin (Gg), gastrografin + gentamicina (Gg+G) y gastrografin + gentamicina + cardiotrofina-1 (Gg+G+CT-1), al finalizar los tratamientos. Western Blot representativos de 3 experimentos realizados por separado. Figura 8. Tasa de filtración glomerular (TFG), expresada en mL/min de ratas control (C) y tratadas con gastrografin + gentamicina (Gg+G) y gastrografin + gentamicina + cardiotrofina-1 (Gg+G+CT-1), al finalizar los tratamientos. Los datos representan la media ± EEM de 4 animales/grupo.* p<0,05 con respecto al grupo C. & p<0,05 con respecto al grupo Gg+G.
Figura 9. Flujo plasmático renal (FPR), expresado en mL/min, de ratas control (C) y tratadas con gastrografin + gentamicina (Gg+G) y con gastrografin + gentamicina + cardiotrofina-l (Gg+G+CT-1), al finalizar los tratamientos. Los datos representan la media ± EEM de 4 animales/grupo.* p<0,05 con respecto al grupo C. & p<0,05 con respecto al grupo Gg+ G. Figura 10. Resistencia vascular renal (RVR), expresada en mmHg-min/mL, de ratas control (C) y tratadas con gastrografin + gentamicina (Gg+G) y gastrografin + gentamicina + cardiotrofina-l (Gg+G+CT-1), al finalizar los tratamientos. Los datos representan la media ± EEM de 4 animales/grupo.* p<0,05 con respecto al grupo C. & p<0,05 con respecto al grupo Gg+G.
Figura 11. Evolución temporal de la supervivencia en los grupos vehículo (Control); cardiotrofina-l (CT-1); cisplatino (Cisplatino) o cardiotrofina-l y cisplatino (CT1-P). Los datos representan la media ± EEM (n = 6 ratas por grupo). Figura 12. Evolución temporal del peso corporal (gramos, g) en los grupos vehículo (Control); cardiotrofina-l (CT-1); cisplatino (Cisplatino) o cardiotrofina-l y cisplatino (CT1-P). Los datos representan la media ± EEM (n = 6 ratas por grupo). * p<0,05 vs Grupo Control, & p<0,05 vs Grupo Cardiotrofina-l -Cisplatino. Figura 13. Evolución temporal del flujo urinario (mi) en los grupos vehículo (Control); cardiotrofina-l (CT-1); cisplatino (Cisplatino) o cardiotrofina-l y cisplatino (CT1-P). Los datos representan la media ± EEM (n = 6 ratas por grupo). * p<0,05 vs Grupo Control, & p<0,05 vs Grupo Cardiotrofina-l-Cisplatino. Figura 14. Evolución temporal de la concentración de creatinina plasmática (mg/dl) en los grupos vehículo (Control); cardiotrofina-l (CT-1); cisplatino (Cisplatino) o cardiotrofina-1 y cisplatino (CT1-P). Los datos representan la media ± EEM (n = 6 ratas por grupo). * p<0,05 vs Grupo Control, & p<0,05 vs Grupo Cardiotrofina-1 -Cisplatino.
Figura 15. Peso de los órganos (respecto al peso corporal, % vs peso corporal) al final del periodo experimental del estudio en los grupos vehículo (Control); cardiotrofina-1 (CT-1); cisplatino (Cisplatino) o cardiotrofina-1 y cisplatino (CT1-P). Los datos representan la media ± EEM (n = 6 ratas por grupo). * p<0,05 vs Grupo Control, & p<0,05 vs Grupo Cardiotrofina-1 -Cisplatino. Figura 16. Evolución del peso corporal, expresado en gramos (g), durante el periodo experimental (d, días) en ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina- 1 (CT-1) o ambos compuestos (G + CT-1). Los datos representan la media ± desviación estándar de 5-6 animales. B: basal. Figura 17. Presión arterial sistólica (PAS), panel superior, expresada en mmHg y frecuencia cardíaca (panel inferior), expresada en latidos por minuto (bpm, beats per minute) de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1) o ambos compuestos (G + CT-1), antes de comenzar (Basal) y al finalizar los tratamientos (d 6). Los datos representan la media ± desviación estándar de 5-6 animales.
Figura 18. Peso (% con respecto al peso corporal) del hígado (A), bazo (B), riñon derecho (C) y corazón (D) de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1) o ambos compuestos (G + CT-1), al finalizar los tratamientos. Los datos representan la media ± desviación estándar de 5-6 animales. * p<0,05 vs Grupo Control, & p<0,05 vs Grupo G.
Figura 19. Concentración plasmática de creatinina (Creat. Plasma), expresada en mg/dL, de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1) o ambos compuestos (G + CT-1), al inicio del experimento (Basal), a los 4 días (d 4) y al finalizar el estudio (d 6). Los datos representan la media ± desviación estándar de 5-6 animales. * p<0,05 vs Grupo Control. Figura 20. Concentración plasmática de urea (Urea plasma) expresada en mg/dL, de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1) o ambos compuestos (G + CT-1), al finalizar los tratamientos. Los datos representan la media ± desviación estándar de 5-6 animales. * p<0,05 vs Grupo Control.
Figura 21. Aclaramiento de creatinina (Cl. Creat.), expresado en mL/min, de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1) o ambos compuestos (G + CT-1), al inicio del estudio (Basal), a los 4 días (d 4) y al finalizar el estudio (d 6). Los datos representan la media ± desviación estándar de 5-6 animales. * p<0,05 vs Grupo Control, & p<0,05 vs Grupo G.
Figura 22. Excreción urinaria de proteínas (Proteinuria) expresada en mg/día de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1) o ambos compuestos (G + CT-1). Los datos representan la media ± desviación estándar de 5-6 animales. * p<0,05 vs Grupo Control, & p<0,05 vs Grupo G.
Figura 23. Evolución temporal a lo largo del estudio (d, días) del flujo urinario expresado en mL/día (mL/d) de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1) o ambos compuestos (G + CT-1). Los datos representan la media ± desviación estándar de 5-6 animales.
Figura 24. Imágenes representativas de microscopía óptica (1.000 aumentos) del área cortical de secciones renales teñidas con hematoxilina y eosina, procedentes de de ratas control y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1) o ambos compuestos (G + CT-1), al finalizar los tratamientos.
Figura 25. Evolución temporal de la excreción urinaria de N-acetil glucosaminidasa (NAG), expresada en unidades arbitrarias por día (UA/d), de ratas control (C) y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1) o ambos compuestos (G + CT-1), a los 4 días (d 4) después del tratamiento y al finalizar el estudio (d 6). Los datos representan la media ± desviación estándar de 5-6 animales. Figura 26. Imágenes representativas de análisis por Western blot de KEVI-1 y NGAL en homogenados de tejido renal (t) y orinas (u) de de ratas control y tratadas con gentamicina (G), cardiotrofina-1 (CT-1) o ambos compuestos (G + CT-1), al finalizar los tratamientos. Las flechas continuas indican las bandas obtenidas a la altura de los pesos moleculares esperados. Las flechas de puntos (y marcadas con un símbolo de interrogación) indican bandas reactivas en pesos moleculares inferiores al esperado, que podrían corresponder a fragmentos de la proteína. Figura 27. Efecto de la terapia con CT-1 en la supervivencia de ratas, expresada en porcentaje % de ratas que sobreviven, sometidas a 60 minutos de isquemia renal izquierda y 14 días (d) de reperfusión. Se representan ratas simuladas (Sim), ratas que recibieron suero salino (IR C) y ratas tratadas con CT-1 (IR CT-1). Figura 28. Efecto de la administración de CT-1 : (A) sobre los niveles plasmáticos de creatinina (Creat. Plasma), expresado como mg/dL, y (B) sobre los valores de aclaramiento de creatinina (Cl. Creat.), expresado como mL/min, en animales sometidos a isquemia renal izquierda a las 24 y 48 horas post-reperfusión. Se representan ratas simuladas (Sim), ratas sometidas a isquemia renal izquierda que recibieron suero salino (control) y ratas sometidas a isquemia renal izquierda tratadas con CT-1 (CT-1). Los datos se representan como la media ± SD de 5 ratas por grupo. (*) P<0,05 vs. IR C; (#) P<0,05 vs. Sim.
Figura 29. Niveles tisulares renales de anión superóxido (SOA), expresados en nmol/mg de proteína/min, en animales del grupo simulado (Sim) y en dos grupos de animales sometidos a isquemia renal izquierda: control isquémico (control) y animales isquémicos tratados con CT-1 (CT-1) 4 horas después de la reperfusión. Los datos se expresan como la media ± SD de 5 ratas por grupo. Figura 30. Efecto del tratamiento con CT-1 sobre la actividad mieloperoxidasa (MA), expresada en unidades por gramo de tejido (U/g), tras I/R renal. La actividad mieloperoxidasa (MA) se midió 24 horas después de la operación simulada o de la reperfusión en tejido renal de animales del grupo simulado (Sim) y en dos grupos de animales sometidos a isquemia renal izquierda: control isquémico (control) y animales tratados con CT-1 (CT-1). Los valores son la media ± SD de 5 ratas por grupo. Figura 31. Efecto del tratamiento con CT-1 sobre los niveles plasmáticos de citoquinas proinflamatorias, expresados en pg/mL, en animales del grupo simulado (Sim) y en dos grupos de animales sometidos a isquemia renal izquierda: control isquémico (control) y animales isquémicos tratados con CT-1 (CT-1) 4 horas después de la reperfusión. A) Niveles de TNF-α. B) Niveles de IL-Ιβ. C) Niveles de IFN-γ. D) Niveles de IL-6. E) Niveles de IL-10. Los datos se expresan como la media ± SD de 5 ratas por grupo.
Figura 32. Imágenes representativas de la tinción hematoxilina-eosina de ríñones de ratas sometidas a isquemia renal sin tratamiento (control) y recibiendo cardiotrofina-1 (CT-1) 24 horas tras la reperfusión. Las puntas de flecha señalan células tubulares con mucho citoplasma vacuolizado. Las flechas señalan túbulos obstruidos.
Figura 33. Imágenes representativas de la tinción hematoxilina-eosina de ríñones de ratas sometidas a isquemia renal sin tratamiento (control) y recibiendo cardiotrofina-1 (CT-1) 48 horas tras la reperfusión. Los asteriscos señalan túbulos completamente denudados. Las puntas de flecha señalan áreas con infiltrado inflamatorio.
Figura 34. Efecto de un anticuerpo anti-CT-1 sobre el peso corporal, expresado en gramos (g), en ratones sometidos a isquemia-reperfusión renal (I/R). La lesión isquémica se indujo por 30 minutos de pinzamiento vascular del pedículo renal izquierdo. Los grupos experimentales son: simulado (n = 6), control (n = 10), IgG control (n = 10) y anti-CT-1 (n = 10). Los valores se expresan como media ± EEM de n experimentos independientes. Diferencias estadísticamente significativas: *, p < 0,05 en el grupo anti-CT-1 frente al tiempo 0; #, p < 0,05 en el grupo IgG control frente al tiempo 0.
Figura 35. Efecto de un anticuerpo anti-CT-1 sobre el índice de supervivencia, expresado en porcentaje (%), en ratones sometidos a isquemia-reperfusión renal (I/R). Los grupos experimentales son: simulado (n = 6), control (n = 10), IgG control (n = 10) y anti-CT-1 (n = 10). Los valores se expresan como media ± EEM de n experimentos independientes. Figura 36. Efecto de un anticuerpo anti-CT-1 sobre la urea en plasma, expresada en mg/dl, en ratones sometidos a isquemia-reperfusión renal (I/R). Los grupos experimentales son: simulado (n = 6), control (n = 10), IgG control (n = 10) y anti-CT-1 (n = 10). Los valores se expresan como media ± EEM de n experimentos independientes. Diferencias estadísticamente significativas, *, Z > 1,96, diferentes tiempos frente a tiempo 0; por tiempo, #, Z > 1,96, cada grupo frente a simulado.
Figura 37. Efecto de un anticuerpo anti-CT-1 sobre el malondialdehído (MDA) renal, expresado en nmol/mg de proteína, en ratones sometidos a isquemia-reperfusión renal (I/R). Los valores se expresan como media ± EEM de n experimentos independientes. Los grupos experimentales son: simulado (n = 6), control (n = 10), IgG control (n = 10) y anti-CT-1 (n = 10), 48 horas después de la operación quirúrgica. Diferencias estadísticamente significativas, *, Z > 1,96, frente a simulado; #, Z > 1,96, frente a control. Figura 38. Efecto de un anticuerpo anti-CT-1 sobre los niveles de mieloperoxidasa (MPO) en riñon, expresados en ng/mg de proteína, en ratones sometidos a isquemia- reperfusión renal (I/R). Los valores se expresan como media ± EEM de n experimentos independientes. Los grupos experimentales son: simulado (n = 6), control (n = 10), IgG control (n = 10) y anti-CT-1 (n = 10), 48 horas después de la operación quirúrgica. Diferencias estadísticamente significativas, por grupos, *, Z > 1,96, frente a simulado; #, Z > 1,96, frente a control; &, Z > 1,96 frente a IgG control.
Figura 39. Efecto de un anticuerpo anti-CT-1 sobre los niveles de factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α) en plasma, expresados en pg/ml, en ratones sometidos a isquemia- reperfusión renal (I/R). Los valores se expresan como media ± EEM de n experimentos independientes. Los grupos experimentales son: simulado (n = 4), control (n = 4), IgG control (n = 8) y anti-CT-1 (n = 8), 4 horas después de la operación quirúrgica. Diferencias estadísticamente significativas, por grupos, *, p < 0,05, cada grupo frente a simulado.
Figura 40. Efecto de un anticuerpo anti-CT-1 sobre la expresión de cardiotrofina-1 (CT-1) en riñon en ratones sometidos a isquemia-reperfusión renal (I/R). Análisis densitométrico de la expresión en riñon de cardiotrofina-l/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (CT-l/GADPH), expresadas en unidades arbitrarias (UA). Los valores se expresan como media ± EEM de n experimentos independientes. Los grupos experimentales son: simulado (n = 6), control (n = 10), IgG control (n = 10) y anti-CT-1 (n = 10), 48 horas después de la operación quirúrgica. Diferencias estadísticamente significativas, por grupos, *, p < 0,05 frente a simulado; #, p < 0,05 frente a control; &, p < 0,05 frente a IgG control.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han observado que, de forma sorprendente, la cardiotrofina-1 (CT-1) es útil para la prevención y/o el tratamiento del daño renal agudo, especialmente del daño renal agudo inducido por un agente nefrotóxico o causado por isquemia/reperfusión. Dicho efecto depende de la capacidad de la CT-1 de:
- reducir el deterioro de la función excretora renal reduciendo la disminución del aclaramiento de creatinina (Figuras 4, 21 y 28B); reduciendo la acumulación en la sangre de productos del metabolismo como la creatinina (Figuras 2, 14, 19 y 28A), la urea y sus derivados (Figuras 3 y 20); y disminuyendo la aparición de proteinuria (Figuras 5 y 22);
- reducir la poliuria medida mediante la evolución del flujo urinario (Figuras 13 y 23);
- reducir la nefrotoxicidad, medida mediante los marcadores urinarios de daño renal N-acetil glucosaminidasa (NAG) (Figuras 6 y 25), "Kidney Injury Molecule 1 " (KEVI-l) (Figura 7) y el inhibidor 1 del activador del plasminógeno (PAI-1) (Figura 7);
- proteger de los efectos vasculares y glomerulares implicados en la nefrotoxicidad evitando la disminución de la tasa de filtración glomerular (TFG) (Figura 8) y del flujo plasmático renal (FPR) (Figura 9); y evitando el aumento de la resistencia vascular renal (RVR) (Figura 10);
reducir la pérdida de peso corporal producida por un agente nefrotóxico (Figura 16);
reducir el daño tisular renal que se observa en estudios histológicos (Figuras 24, 32 y 33);
aminorar el estrés oxidativo causado por la isquemia-reperfusión, disminuyendo la producción de radicales libres del oxígeno (Figura 29);
reducir la activación de respuestas inflamatorias, disminuyendo la actividad mieloperoxidasa (MPO) (Figura 30), disminuyendo la producción de citoquinas pro-inflamatorias (T Fa, IL-Ιβ, IFN-γ) y evitando la disminución de los niveles plasmáticos de IL-6 e IL-10 (Figura 31).
Es otro objetivo de la presente invención proporcionar composiciones que comprenden un agente nefrotóxico (tal como un agente de contraste, un antibiótico, un agente inmunosupresor o un agente antineoplásico) y cardiotrofina-1, de manera que la administración de cardiotrofina-1 junto con el agente nefrotóxico permite mejorar el perfil farmacotoxicológico de este y, por lo tanto, permite mejorar su utilidad y aplicación.
USOS TERAPÉUTICOS DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención se relaciona con un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 (CT-1) para su uso en la prevención y/o el tratamiento del daño renal agudo, en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se selecciona del grupo de:
(i) cardiotrofina-1 (CT-1) o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(ii) un polinucleótido que codifica CT-1 o una variante funcionalmente equivalente de CT-1 que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(iii) un vector que comprende un polinucleótido según (ii), y una célula capaz de secretar al medio cardiotrofina-1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1.
Adicionalmente, la invención se relaciona con un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 (CTl) para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del daño renal agudo, en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se selecciona del grupo de:
(i) cardiotrofina-1 (CT-1) o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(ii) un polinucleótido que codifica CT-1 o una variante funcionalmente equivalente de CT-1 que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(iii) un vector que comprende un polinucleótido según (ii), y
(iv) una célula capaz de secretar al medio cardiotrofina-1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1.
La invención también se relaciona con un método de tratamiento del daño renal agudo que comprende la administración a un sujeto de un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 (CT-1), en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se selecciona del grupo de:
(i) cardiotrofina-1 (CT-1) o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(ii) un polinucleótido que codifica CT-1 o una variante funcionalmente equivalente de CT-1 que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(iii) un vector que comprende un polinucleótido según (ii), y
(iv) una célula capaz de secretar al medio cardiotrofina-1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1.
La expresión "compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1", según se utiliza en el presente documento, se entiende por cualquier compuesto cuya administración provoque un aumento en la actividad cardiotrofina-1 (CT-1) independientemente de que dicho aumento sea causado por un aumento de la actividad específica de la CT-1 preexistente o por un aumento en la síntesis de CT-1 o de análogos de ésta que compartan sustancialmente la misma función que cardiotrofina. Así, en una forma preferida de realización, el agente que induce la actividad CT-1 es la misma CT-1.
El término "cardiotrofina 1" o "CT-1", según se usa en la presente invención, se refiere a una citoquina perteneciente a la familia de la interleuquina 6, capaz de unirse y activar la señalización mediada al menos por el complejo del receptor LIFR consistente del heterodímero gpl30/LIFRp. En la presente invención, por "CT-1" se entiende la proteína definida por la secuencia de la base de datos NCBI con número de acceso P 001321.1 de fecha 9 de Abril de 2011 que corresponde a la secuencia SEQ ID NO: 1, correspondiente a la isoforma 1 de la cardiotrofina humana; o la proteína definida por la secuencia de la base de datos NCBI con número de acceso NP 001136016.1 de fecha 12 de Marzo de 2011, correspondiente a la isoforma 2 de la cardiotrofina humana. En una forma preferida de realización, la CT-1 es una CT-1 de origen humano, preferiblemente de secuencia SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 1
MS RREGSLED PQTDS SVSLL PHLEAKI RQT HSLAHLLTKY AEQLLQEYVQ LQGDP FGLP S 60 FS PPRLPVAG LSAPAPSHAG LPVHERLRLD AAALAAL PPL LDAVCRRQAE LNPPAPRLLR 12 0 RLEDAARQAR ALGAAVEALL AALGAANRGP RAE P P AATAS AASATGVFPA KVLGLRVCGL 18 0
YREWLS RTEG DLGQLLPGGS A 2 01 La invención contempla el uso de variantes funcionalmente equivalentes de CT-1. Por "variante funcionalmente equivalente de CT-1", tal como aquí se utiliza, se entiende toda molécula que comparte con CT-1 una o más de las funciones descritas en la presente invención asociadas a CT-1, tanto in vitro como in vivo, y que presenta un mínimo de identidad en la secuencia aminoacídica. En la presente invención, la expresión "variante funcionalmente equivalente de CT-1" pretende excluir a otros ligandos de gpl30, tales como el factor inhibidor de la leucemia (LIF), IL-11, IL-6, oncostatina M (OSM), el factor neurotrófico ciliar (CNTF), o la citoquina parecida a cardiotrofina (CTC) también conocida como "cardiotrophin-like cytokine " (CLC). Las "variantes funcionalmente equivalentes de CT-1" de la presente invención deben tener una identidad con CT-1 de, al menos, el 60%. Así, en una forma de realización, el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 es la CT-1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1.
Las variantes de CT-1 pueden ser tanto naturales como artificiales.
La expresión "variante natural" se refiere a todas aquellas variantes de la CT-1 humana mencionada anteriormente que aparecen de forma natural en otras especies, es decir, los ortólogos de CT-1. Dichas variantes naturales incluyen, sin limitación, la CT-1 de ratón, que corresponde a la secuencia con número de acceso Q541U3 de fecha 28 de Noviembre de 2006 o a la secuencia Q60753 de fecha 31 de Mayo de 2011 en la base de datos NCBI o a la isoforma de 196 aminoácidos que corresponde a la secuencia con número de acceso P83714 de fecha 31 de Mayo de 2011 en la base de datos NCBI; la CT-1 de rata, que corresponde a la secuencia con número de acceso Q63086 de fecha 8 de Marzo de 2011; la CT-1 de macaco, que corresponde a la secuencia con número de acceso XP 001103315 de fecha 1 de Junio de 2010; la CT-1 de perro, que corresponde a la secuencia con número de acceso XP 849072 de fecha 30 de Agosto de 2005; la CT-1 de caballo, que corresponde a la secuencia con número de acceso XP 001915457 de fecha 11 de Julio de 2008; y la CT-1 de origen bovino, que corresponde a la secuencia con número de acceso NP_001179313 de fecha 14 de Noviembre de 2010.. Las variantes naturales de CT-1 adecuadas para su uso en la presente invención también pueden derivar de dichas secuencias mediante inserción, sustitución o deleción de uno o más aminoácidos e incluyen alelos naturales (como la variante A92T de la CT-1 humana), variantes resultantes de procesamiento alternativo y formas secretadas y truncadas que aparecen de forma natural.
La CT-1 útil en la presente invención puede, por lo tanto, ser de secuencia natural, cuando comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la CT-1 que aparece en la naturaleza. Tales polipéptidos de secuencia natural pueden aislarse a partir de la naturaleza o pueden producirse mediante medios recombinantes y/o sintéticos. Así, la CT-1 de la invención puede ser una proteína recombinante obtenida por la expresión de un polinucleótido que codifica CT-1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma en un organismo heterólogo, tal como una bacteria, levadura o célula de insecto o mamífero. Dicha proteína recombinante puede obtenerse como proteína de fusión con una cola amino-terminal de histidinas que facilita su posterior purificación. La expresión y purificación de dichas proteínas puede realizarse según métodos conocidos por el experto en la materia y descritos en el estado de la técnica.
En una forma preferida de realización, la CT-1 es de origen humano y corresponde con la secuencia SEQ ID NO: l . En otra forma preferida de realización, la CT-1 es de rata, preferentemente es una proteína de fusión con una cola amino-terminal de histidinas, más preferentemente de SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO:2
MRGSHHHHHH GMASMTGGQQ MGRDLYDDDD KDRWGSMSQR EGSLEDHQTD S S FS FLPHLE 60
AKI RQTHNLA RLLTKYADQL LEEYVQQQGE P FGLPGFS P P RLPLAGLS GP APSHAGLPVS 12 0
ERLRQDAAAL SALPALLDAV RRRQAELNPR APRLLRS LED AARQVRALGA AVE T VLAAL G 18 0
AAARGPVPEP VAT SALFTSN SAAGVFSAKV LGLHVCGLYG EWVSRTEGDL GQLVPGGVA 23 9 Alternativamente, la CT-1 puede ser una variante artificial funcionalmente equivalente de CT-1 que puede obtenerse mediante medios recombinantes y/o sintéticos.
Las variantes de CT-1 contempladas en la presente invención muestran, al menos, alguna de las funciones de CT-1 tales como, sin limitación:
- la capacidad de reducir los niveles de creatinina sérica y aumentar el aclaramiento de creatinina. Un método adecuado para determinar estos parámetros se detalla en el apartado Materiales y métodos de la presente invención.
la capacidad para reducir los niveles de urea y sus derivados. Un método adecuado para determinar estos parámetros se detalla en el apartado Materiales y métodos de la presente invención.
la capacidad de disminuir la proteinuria. Un método adecuado para determinarla se detalla en el apartado Materiales y métodos de la presente invención. la capacidad de reducir la poliuria, que se puede determinar mediante la evolución del flujo urinario, según se detalla en el apartado Materiales y métodos de la presente invención.
la capacidad de disminuir la producción de marcadores urinarios de daño renal, tales como N-acetil glucosaminidasa (NAG) (determinado según se detalla en el apartado Materiales y métodos de la presente invención), o las moléculas "Kidney Injury Molecule 1 " (KEVI-1) y el inhibidor 1 del activador del plasminógeno (PAI-1), que se pueden determinar por Western blot, como se muestra en el apartado Materiales y métodos de la presente invención, la capacidad de aumentar la tasa de filtración glomerular (TFG) y el flujo plasmático renal (FPR) y de disminuir la resistencia vascular renal (RVR), que se puede determinar mediante los métodos descritos en el estado de la técnica, tal como el mostrado en el apartado Materiales y Métodos de la presente invención.
la capacidad de reducir el daño tisular renal, determinada mediante estudios histológicos de secciones renales, que se puede determinar mediante los métodos descritos en el estado de la técnica, tal como el mostrado en el apartado Materiales y Métodos de la presente invención.
la capacidad de disminuir la producción de radicales libres del oxígeno, que se puede determinar mediante métodos descritos en el estado de la técnica, tal como el mostrado en el apartado Materiales y métodos de la presente invención, la capacidad de impedir la activación de las vías de señalización proinflamatorias, determinada mediante la actividad mieloperoxidasa (MPO), que se puede determinar mediante el método detallado en el apartado Material y métodos de la presente invención.
la capacidad de disminuir la producción de citoquinas pro-inflamatorias (T Fa, IL-Ιβ, IFN-γ) y de aumentar los niveles plasmáticos de IL-6 e IL-10, que se pueden determinar mediante los métodos detallados en el apartado Materiales y métodos de la presente invención.
Adicionalmente, variantes funcionalmente equivalentes de CT-1 contempladas en el contexto de la presente invención, incluyen polipéptidos que muestran al menos un 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% de similitud o identidad con las distintas variantes naturales de CT-1 mencionadas anteriormente.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias indica la proporción de aminoácidos idénticos que comparten las dos secuencias que se comparan, mientras que el porcentaje de similitud indica la proporción de residuos de aminoácidos semejantes (considerando equivalentes a los residuos de aminoácidos como arginina y Usina, o bien ácido aspártico y ácido glutámico). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se calcula comparando dos secuencias alineadas sobre una región particular, determinando el número de posiciones en las que hay aminoácidos idénticos en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de tales posiciones por el número total de posiciones en el segmento que está siendo comparado y multiplicando el resultado por 100. El grado de identidad y similitud entre dos polipéptidos se determina usando algoritmos implementados en ordenador y métodos que son ampliamente conocidos por los expertos en la materia. La identidad y similitud entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente usando el algoritmo BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410). En otra forma de realización de la invención, el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 es un polinucleótido que codifica CT-1 o una variante funcionalmente equivalente de CT-1 que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1. En una realización, la variante funcionalmente equivalente de CT-1 presenta, al menos, un 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% de identidad con CT-1.
El término "polinucleótido", según se usa en la presente invención, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud y formada por ribonucleótidos y/o deoxiribonucleótidos. El término incluye tanto polinucleótidos de cadena sencilla como de cadena doble, así como polinucleótidos modificados (metilados, protegidos y similares). Polinucleótidos adecuados para su uso como agentes capaces de inducir la actividad CT-1 incluyen, sin limitación, los polinucleótidos cuyas secuencias corresponden a las descritas en la base de datos GenEMBL con números de acceso BC064416 en la versión 9 con fecha de 15.10.2008, correspondiente a la variante 1 del transcrito de cardiotrofina humana, BC036787 en la versión 9 con fecha de 12.08.2009, correspondiente a la variante 1 del transcrito de cardiotrofina humana, la secuencia descrita en la base de datos GenEMBL con número de acceso D78591, en su versión 4 del 12.01.2009, correspondiente al polinucleótido que codifica la cardiotrofina 1 de Rattus norvegicus (rata), la secuencia descrita en la base de datos GenEMBL con número de acceso AY518205, en su versión 3 del 12.01.2009, correspondiente al polinucleótido que codifican las cardiotrofina 2 de Rattus norvegicus (rata), la secuencia descrita en la base de datos GenEMBL con número de acceso U18366, en su versión 4 del 12.01.2009, correspondiente al polinucleótido que codifica la cardiotrofina 1 de Mus musculus (ratón), la secuencia descrita en la base de datos GenEMBL con número de acceso AB125661, en su versión 2 del 12.01.2009, correspondiente al polinucleótido que codifica las cardiotrofina 2 de Mus musculus (ratón).
Alternativamente, los agentes capaces de inducir la actividad CT-1 incluyen "polinucleótidos que codifican una variante funcionalmente equivalente de CT-1". Dichos polinucleótidos son todos aquellos polinucleótidos capaces de codificar una variante de los polipéptidos con actividad CT-1, según se han definido anteriormente por medio de sus secuencias específicas, presentando dicha variante al menos un 60% de identidad con CT-1. Dichos polinucleótidos resultan de los polinucleótidos definidos anteriormente por medio de la inserción, deleción o substitución de uno o varios nucleótidos con respecto a las secuencias definidas anteriormente. Preferiblemente, los polinucleótidos que codifican variantes funcionalmente equivalentes de CT-1 son polinucleótidos cuya secuencia les permite hibridar en condiciones altamente restrictivas con los polinucleótidos definidos anteriormente. Condiciones típicas de hibridación altamente restrictivas incluyen la incubación en 6 X SSC (1 X SSC: NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M) y formamida al 40% a 42 °C durante 14 horas, seguido de uno o varios ciclos de lavado usando 0,5 X SSC, SDS al 0,1% a 60°C. Alternativamente, condiciones altamente restrictivas incluyen aquellas que comprenden una hibridación a una temperatura de aproximadamente 50°-55° C en 6 X SSC y un lavado final a una temperatura de 68° C en 1-3 X SSC. Las condiciones restrictivas moderadas comprenden la hibridación a una temperatura de aproximadamente 50° C hasta unos 65° C en NaCl 0,2 o 0,3 M, seguida de lavado a aproximadamente 50° C hasta unos 55° C en 0,2 X SSC, SDS 0, 1% (dodecil sulfato sódico).
Preferiblemente, cuando el agente que es capaz de inducir la actividad CT-1 es un polinucleótido, este se encuentra operativamente asociado a una región reguladora de la expresión. Las secuencias reguladoras de utilidad para la presente invención pueden ser secuencias de promotores nucleares o, alternativamente, secuencias potenciadoras ("enhancer") y/o otras secuencias reguladoras que aumentan la expresión de la secuencia heteróloga de ácido nucleico. El promotor puede ser constitutivo, específico de tejido o inducible. Si se desea expresión constante de la secuencia heteróloga de ácido nucleico, entonces se usa un promotor constitutivo. Ejemplos de promotores constitutivos bien conocidos incluyen el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), promotor del virus del sarcoma de Rous, y similares. Numerosos otros ejemplos de promotores constitutivos son bien conocidos en la técnica y se pueden emplear en la práctica de la invención. Si se desea la expresión controlada de la secuencia heteróloga de ácido nucleico, entonces se debe utilizar un promotor inducible. En un estado no inducido, el promotor inducible está "silencioso". Mediante "silencioso" se quiere decir que en ausencia de un inductor se detecta poca o ninguna expresión de la secuencia heteróloga de ácido nucleico; en presencia de un inductor, sin embargo, se produce la expresión de la secuencia heteróloga de ácido nucleico. Con frecuencia, se puede controlar el nivel de expresión variando la concentración del inductor. Controlando la expresión, por ejemplo variando la concentración del inductor de modo que un promotor inducible se estimula de forma más fuerte o más débil, se puede afectar la concentración del producto transcrito de la secuencia heteróloga de ácido nucleico. En el caso en el que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un gen, se puede controlar la cantidad de proteína que se sintetiza. De esta manera, es posible variar la concentración del producto terapéutico. Ejemplos de promotores inducibles bien conocidos son: un promotor de estrógeno o andrógeno, un promotor de metal otioneína, o un promotor que responde a ecdisona. Otros ejemplos numerosos son bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar en la práctica de la invención. Además de los promotores constitutivos e inducibles (que suelen funcionar en una gran variedad de tipos de células o tejidos), se pueden utilizar promotores específicos de tejido para alcanzar expresión de la secuencia heteróloga de ácido nucleico específica en células o tejidos.
En otra forma de realización de la invención, el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 es un vector que comprende un polinucleótido tal y como se ha definido anteriormente, es decir, que codifica CT-1 o una variante funcionalmente equivalente de CT-1 que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1. En una realización, la variante funcionalmente equivalente de CT-1 presenta, al menos, un 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% de identidad con CT-1. Vectores adecuados para la inserción de dichos polinucleótidos son vectores derivados de vectores de expresión en procariotas tales como pUC18, pUC19, pBluescript y sus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl , RP4, fagos y vectores "shuttle" tales como pSA3 y pAT28, vectores de expresión en levaduras tales como vectores del tipo de plásmidos de 2 mieras, plásmidos de integración, vectores YEP, plásmidos centroméricos y similares, vectores de expresión en células de insectos tales como los vectores de la serie pAC y de la serie pVL, vectores de expresión en plantas tales como vectores de la serie pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y similares y vectores de expresión en células eucariotas superiores bien basados en vectores virales (adenovirus, virus asociados a los adenovirus así como retrovirus y, en particular, lentivirus) así como vectores no virales tales como pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL, pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDTl .
En otra forma de realización, el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 es una célula capaz de secretar al medio cardiotrofina-1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1. En una realización, la variante funcionalmente equivalente de CT-1 presenta, al menos, un 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% de identidad con CT-1. Células adecuadas para la expresión de cardiotrofina-1 o de la variante funcionalmente equivalente de la misma incluyen, sin limitación, cardiomiocitos, adipocitos, células endoteliales, células epiteliales, linfocitos (células B y T), mastocitos, eosinófilos, células de la íntima vascular, cultivos primarios de células aisladas de distintos órganos, preferentemente de células aisladas de los islotes de Langerhans, hepatocitos, leucocitos, incluyendo leucocitos mononucleares, mesenquimales, de cordón umbilical o adultas (de piel, pulmón, riñon e hígado), osteoclastos, condrocitos y otras células del tejido conectivo. También son adecuadas células de líneas establecidas tales como células T de Jurkat, células NIH-3T3, CHO, Cos, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3 T3, mioblastos C2C12 y células W138.
El experto en la materia apreciará que las células capaces de secretar al medio cardiotrofina-1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma pueden encontrarse formando micropartículas o microcápsulas de forma que las células presenten una mayor vida útil antes de ser utilizadas en pacientes. Materiales adecuados para la formación de las micropartículas objeto de la invención incluyen cualquier material polimérico biocompatible que permita la secreción continua de los productos terapéuticos y que actúe como soporte de las células. Así, dicho material polimérico biocompatible puede ser, por ejemplo, los polímeros termoplásticos o los polímeros hidrogeles. Entre los polímeros termoplásticos se encuentran ácido acrílico, acrilamida, 2-aminoetil metacrilato, poli(tetrafluoroetileno-cohexafluorpropileno), ácido metacrílico-(7-cumaroxi) etil éster, N-isopropil acrilamida, ácido poliacrílico, poliacrilamida, poliamidoamina, poli(amino)-p-xilileno, poli(cloroetilvonileter), policaprolactona, poli(caprolactona-co-trimetilen carbonato), poli(carbonato urea) uretano, poli(carbonato) uretano, polietileno, copolímero de polietileno y acrilamida, polietilenglicol, polietilenglicol metacrilato, poli(etileno tereftalato), poli(4-hidroxibutil acrilato), poli(hidroxietil metacrilato), poli(N-2-hidroxipropil metacrilato), poli(ácido láctico-ácido glicólico), poli(ácido-L-láctico), poli(gamma-metil, L-glutamato), poli(metilmetacrilato), polipropileno fumarato), polipropileno óxido), polipirrol, poliestireno, poli(tetrafuoro etileno), poliuretano, polivinil alcohol, polietileno de peso molecular ultraalto, 6-(p-vinilbenzamido)-ácido hexanoico y N-p-vinilbenzil-D- maltonamida y copolímeros que contienen más de uno de dichos polímeros. Entre los polímeros del tipo hidrogel se encuentran materiales naturales del tipo alginato, agarosa, colágeno, almidón, ácido hialurónico, albúmina de suero bovina, celulosa y sus derivados, pectina, condroitin sulfato, fibrina y fibroina, así como hidrogeles sintéticos como sefarosa y sefadex.
Es conocido del estado de la técnica que algunos de los polímeros mencionados anteriormente son poco estables y tienden a perder su carácter de gel, además de ser relativamente porosos, lo que resulta en que los anticuerpos pueden acceder a su interior y dañar las células. Por estos motivos, opcionalmente, la micropartícula de la invención puede estar rodeada de una membrana semipermeable que confiera estabilidad a las partículas y que forme una barrera impermeable a los anticuerpos. Por membrana semipermeable se entiende una membrana que permite la entrada de todos aquellos solutos necesarios para la viabilidad celular y que permite la salida de las proteínas terapéuticas producidas por las células contenidas dentro de la micropartícula, pero que es sustancialmente impermeable a los anticuerpos, de forma que las células quedan protegidas de la respuesta inmune producida por el organismo que alberga la micropartícula. Materiales adecuados para formar la membrana semipermeable son materiales insolubles en fluidos biológicos, preferentemente poliamino ácidos, como por ejemplo poli-L-lisina, poli-L-ornitina, poli-L-arginina, poli-L-asparagina, poli-L- aspártico, poli-benzil-L-aspartato, poli-S-benzil-L-cisteína, poli-gamma-bencil-L- glutamato, poli-S-CBZ-L-cisteína, ροΙί-ε-CBZ-D-lisina, poli-5-CBZ-DL-ornitina, poli- O-CBZ-L-serina, poli-O-CBZ-D-tirosina, poli(Y-etil-L-glutamato), poli-D-glutámico, poliglicina, ροΙί-γ-Ν-hexil-L-glutamato, poli-L-histidina, poli (a,P-[N-(2-hidroxietil)- DL-aspartamida]), poli-L-hidroxiprolina, poli (a,P-[N-(3-hidroxipropil)-DL- aspartamida]), poli-L-isoleucina, poli-L-leucina, poli-D-lisina, poli-L-fenilalanina, poli- L-prolina, poli-L-serina, poli-L-treonina, poli-DL-triptófano, poli-D-tirosina o una combinación de los mismos.
Los compuestos que inducen la actividad cardiotrofina-1 son adecuados para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del daño renal agudo. Por "medicamento" se entiende una composición farmacéutica que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 (CT-1) según la invención.
Por "prevención" se entiende la administración de un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 (CT-1) según la invención, o bien de un medicamento que lo contiene en un estadio inicial o precoz de la enfermedad o, preferiblemente, para evitar su aparición. En una realización preferida de la invención el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se utiliza para la prevención del daño renal agudo. El término "tratamiento" se utiliza para designar la administración de un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 (CT-1) según la invención o de un medicamento que lo contiene para controlar la progresión de la enfermedad antes o después de que los signos clínicos hayan aparecido. Por el control de la progresión de la enfermedad se entiende los resultados clínicos beneficiosos o deseados que incluyen, pero no se limitan a, reducción de los síntomas, reducción de la duración de la enfermedad, estabilización de estados patológicos (específicamente evitar un deterioro adicional), retrasar la progresión de la enfermedad, mejorar el estado patológico y remisión (tanto parcial como total). El control de la progresión de la enfermedad también implica una prolongación de la supervivencia, comparado con la supervivencia esperada si el tratamiento no fuera aplicado.
El término "daño renal agudo" (DRA) según se usa en el presente documento, se entiende por todo tipo de daño en las estructuras anatómicas del riñon o bien la alteración de la perfusión del mismo que conduce a Fracaso renal agudo (FRA), es decir, que ocasiona la pérdida repentina de la función renal, entendiéndose como tal la capacidad de los ríñones para eliminar los residuos y concentrar la orina sin perder electrolitos. En una forma de realización, por FRA se entiende un trastorno tal y como se define por Mehta RL, et al. Crit Care. 2007; 11 :R31, en donde se considera que aparece FRA cuando se observa al menos una alteración de la función renal que da lugar en un tiempo igual o menor de 48 h a a) niveles de creatinina sérica aumentados (absoluto, > 0,3 mg/dL; porcentaje, > 50%; o un aumento de 1,5 veces sobre los niveles básales), o
b) oliguria (< 0,5 mL/kg/h durante más de 6 horas)
Otro sistema también utilizado para definir el FRA, que describe la severidad de la disfunción renal en base a un aumento de los niveles de creatinina sérica y a una disminución de la elimación de orina, es el criterio RIFLE (Bellomo R, et al. Crit Care. 2004;8:R204-R212; Bellomo R, et al. Intensive Care Med. 2004; 30:33 -37; Kellum JA, et al. Curr Opin Crit Care. 2002;8:509 -514).
Según las causas iniciales del daño renal agudo, este puede dividirse en daño renal agudo pre-renal, renal y post-renal. En una forma de realización el daño renal agudo se selecciona del grupo de daño renal agudo de causa pre-renal y daño renal agudo de causa renal; preferiblemente es daño renal agudo de causa renal.
Por "daño renal agudo de causa pre-renal" se entiende un daño renal secundario a la reducción de la perfusión normal en el riñon, que puede producirse por depleción del volumen debido a pérdidas renales o extrarenales, al secuestro de fluidos o a presiones de perfusión inadecuadas secundarias a un fallo cardiaco, cirrosis o sepsis. También puede ser el resultado de isquemia renal secundaria al pinzamiento aórtico o de la arteria renal durante cirugía abdominal o durante el trasplante de riñon (daño por isquemia/reperfusión). Dicho daño es reversible si se actúa sobre las causas de manera precoz. El modelo experimental más estudiado de daño renal agudo de causa pre-renal es el breve pinzamiento de las arterias renales en roedores produciendo el llamado daño por isquemia/reperfusión. La tabla 1 muestra una lista no limitativa de posibles causas del daño renal agudo de causa pre-renal. Tabla 1. Etiología del daño renal agudo de causa pre-renal.
HIPOVOLEMIA: hemorragias (gastrointestinales, quirúrgicas, postparto); digestivas (vómitos, diarreas); pérdidas renales (diuréticos, cetoacidosis diabética, diabetes insípida, insuficiencia suprarrenal); secuestro de líquidos en el espacio extravascular (pancreatitis, peritonitis, quemaduras, hipoalbuminemia)
DISMINUCIÓN DEL GASTO CARDÍACO: Insuficiencia cardíaca aguda (infarto, taponamiento, arritmias); embolia pulmonar masiva; hipertensión pulmonar.
VASODILATACIÓN PERIFÉRICA: Sepsis, anafilaxia, antihipertensivos, anestesia.
VASOCONSTRICCIÓN RENAL: hipercalcemia, norepinefrina, Ciclosporina, anfotericina B, cirrosis con ascitis (síndrome hepatorrenal)
ALTERACIÓN DE LAS RESPUESTAS AUTORREGULADORAS RENALES: Inhibidores de las prostaglandinas, como los antiinflamatorios no esteroides
(AINES); inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (IECAS)
Por "daño renal agudo de causa renal" se entiende un daño renal intrínseco, en las estructuras anatómicas del sistema renal, que puede clasificarse anatómicamente en tubular, intersticial, glomerular y vascular.
- Daño tubular: la necrosis tubular aguda (NTA) es la lesión de los túbulos renales por mecanismos isquémicos o tóxicos, es decir, es el resultado de la prolongada exposición a un medio pre-renal (isquemia) o del daño directo de toxinas (nefrotoxinas). La causa más frecuente es la isquemia, y se produce cuando se mantienen las causas del DRA pre-renal de manera prolongada en el tiempo. Cuando el causante es un nefrotóxico, los más frecuentemente implicados son los antibióticos (aminoglucósidos, cefalosporinas), contrastes radiológicos, AINE, anestésicos, toxinas endógenas (mioglobinuria por rabdomiolisis, hemoglobinuria por hemolisis, hiperuricemia, hipercalcemia). La evolución clásica "autolimitada" de la NTA es un incremento repentino de los niveles de creatinina sérica (etapa de daño), seguida de estabilización (etapa de meseta) y finalmente un descenso en estas medidas durante 7 a 21 días (etapa de recuperación). Este patrón se correlaciona con el daño y la muerte de las células tubulares, su regeneración y la recuperación de la función tubular renal. No obstante, las fluctuaciones en los niveles de creatinina sérica dependen de muchas variables y por lo tanto no están presentes en todos los casos de NTA. Los modelos experimentales de NTA más usados son la administración a ratas de fármacos nefrotóxicos, tales como aminoglucósidos o cisplatino, o bien la administración de compuestos químicos como uranil nitrato (López-Novoa JM, et al. Kidney Int. 2011;79:33-45).
Daño intersticial: la nefritis intersticial aguda (NIA) está causada por una función renal deprimida relacionada con fiebre, erupciones, leucocitosis y eosinofilia. La nefritis intersticial aguda está habitualmente inducida por fármacos tales como antiinflamatorios no esteroides (AINE), antibióticos, diuréticos, etc. aunque algunas infecciones (legionella, leptospira, citomegalovirus, Cándidas) y desórdenes neoplásicos también se han asociado con este estado. El modelo experimental más utilizado es la administración de AINE (indometacina) a ratas (Varghese J, et al. Eur J Pharmacol. 2009; 614: 114-121).
Daño glomerular: la presencia de eritrocitos, proteinuria o ambos sugieren la existencia de una enfermedad glomerular. La hematuria, la presencia de eritrocitos, hipertensión y proteinuria moderada sugieren un proceso nefrítico (es decir, glomerulonefritis aguda). Otras causas del daño glomerular son la hipertensión maligna, vasculitis, síndrome hemolítico-urémico, púrpura trombótica trombocitopénica, toxemia del embarazo y esclerodermia. El modelo experimental de glomerulonefritis aguda más estudiado es la administración de anticuerpos anti-Thy (nefritis mesangioproliferativa) o adriamicina a ratas. Daño vascular: el daño renal agudo secundario a un compromiso vascular puede ser difícil de diagnosticar. Causas de este tipo de daño son obstrucciones de arterias renales por placa aterosclerótica, trombosis o embolia; y obstrucción de venas renales por trombosis o compresión. No existen modelos experimentales bien estudiados de este tipo de daño. Por "daño renal agudo de causa post-renal" se entiende el daño renal como consecuencia de obstrucciones en el tracto urinario que tienen lugar en su interior o intrarenales (piedras, depósito de cristales, coágulos, tumores) o fuera del sistema urinario o extrarenales (tumores, fibrosis retroperitoneal, litiasis) y que impiden la salida de la orina formada, provocando un aumento de presión que se transmite retrógradamente, comprometiendo el filtrado glomerular. El modelo de daño renal agudo de causa post-renal más estudiado es la ligadura ureteral unilateral en ratas (Grande MT y López-Novoa JM. Nat Rev Nephrol. 2009; 5:319-328). En otra realización el daño renal agudo es de causa post-renal.
En una realización preferida el daño renal agudo es de causa pre-renal, preferiblemente seleccionado de daño renal agudo causado por exposición de un sujeto a isquemia y daño renal agudo causado por isquemia seguida de reperfusión. Por "daño renal agudo causado por exposición de un sujeto a isquemia" se entiende el daño renal causado en un sujeto como consecuencia de la isquemia del tejido renal. El término "isquemia" hace referencia a los daños tisulares y respuesta inflamatoria causados en el riñon como consecuencia de la disminución transitoria del flujo sanguíneo y consecuente disminución del aporte de oxígeno, de nutrientes y la eliminación de productos del metabolismo en dicho órgano.
Por "daño renal agudo causado por isquemia seguida de reperfusión" se entiende el daño renal causado en un sujeto como consecuencia de la disminución transitoria del flujo sanguíneo (isquemia) y del posterior restablecimiento de dicho flujo sanguíneo en el órgano tras el período de isquemia (reperfusión).
En otra realización preferida de la invención el daño renal agudo es cualquier daño renal agudo a excepción del causado por isquemia o por isquemia/reperfusión. En una realización preferida de la invención el daño renal agudo es de causa renal, preferiblemente causado por un agente nefrotóxico. En una realización aún más preferida de la invención el daño renal agudo está causado por un agente nefrotóxico.
Por "agente nefrotóxico", en el contexto de la presente invención, se entiende cualquier sustancia capaz de producir toxicidad en el sistema renal, es decir, cualquier sustancia que situada en el sistema renal es capaz de producir perturbaciones y desequilibrios en sus aspectos morfológicos y fisiológicos que conducen a la lesión del órgano. Los agentes nefrotóxicos incluyen, sin limitación, agentes farmacológicos, agentes diagnósticos y agentes tóxicos tales como sustancias químicas ambientales, toxinas animales y vegetales, drogas de abuso, etc. Entre los agentes farmacológicos nefrotóxicos contemplados por la presente invención se incluyen, sin limitación, analgésicos (paracetamol, fenacetina, dipironas) y antiinflamatorios no esteroideos (aspirina, indometacina); antibióticos tales como las cefalosporinas (cefaloridina), tetraciclinas, vancomicina, carbapenems (imipenem), polimixina B, rifampicina y aminoglucósidos, viomicina y capreomicina, sulfonamidas, pentamidina; antifúngicos (anfotericina B); agentes quimioterapéuticos y antineoplásicos tales como el cisplatino, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo; inmunosupresores tales como la ciclosporina A e interacciones de agentes farmacológicos. Entre los agentes diagnósticos nefrotóxicos se incluyen, sin limitación, agentes de radiocontraste o contrastes radiológicos (yodo hipuramato, contrastes iónicos) o agentes de diagnóstico por imagen. Entre los agentes tóxicos que afectan al sistema renal se incluyen, sin limitación, sustancias químicas ambientales entre las que se encuentran hidrocarburos halogenados usados como herbicidas, metales y especialmente metales pesados (mercurio, cadmio, plomo, cromo), micotoxinas, disolventes orgánicos (gasolina, tricloroetileno, tetracloruro de carbono, etilenglicol), pesticidas (paraquat, derivados del ácido fenoxi acético, arsénico, estricnina, clorato de potasio y borato de sodio), óxido de silicio; toxinas animales procedentes de ofidios (veneno de la Serpiente Tigre, la víbora de Russell o la Rattle-Snake), arácnidos (Loxosceles Ruferens o araña marrón o de los rincones); tóxicos vegetales y plantas (Daphne mezereum, Actanea spicata, Juniperus communis, Rhamnus franquía, Rhamnus catharticus, Ricinus commnunis), hongos {Amonita Phalloides) drogas de abuso (heroína, cocaína); virus y protozoos (hantavirus, Plasmodium malariae, Plasmodium falciparum). En una realización aún más preferida el agente nefrotóxico se selecciona del grupo de agentes de contraste, antibióticos, agentes inmunosupresores y agentes antineoplásicos. Dado el gran número de procedimientos y estudios diagnósticos que requieren el uso de medios de contraste, un gran porcentaje de la población está hoy en día en riesgo de sufrir nefropatía inducida por agentes de contraste.
La expresión "nefropatía inducida por agentes de contraste", en el contexto de esta invención, se refiere al daño renal producido por la administración de agentes de contraste. Esta es la tercera causa de daño renal en el entorno hospitalario, y se define por un aumento en los niveles de creatinina sérica del 25% o superior (0,5 mg/dl) dentro de las 72 horas de la administración de un medio de contraste (Solomon R. et al. N Engl J Med. 1994; 331 : 1416-1420; Briguori C. et al. Circulation. 2007; 115: 1211-1217). Factores de riesgo asociados son la edad avanzada, la diabetes, enfermedad renal crónica, mieloma múltiple y depleción del volumen. El modelo experimental más estudiado de nefropatía inducida por contraste es la administración de medios de radiocontraste a ratas sensibilizadas. La sensibilización puede producirse previamente mediante depleción del volumen extracelular o la administración de un nefrotóxico a dosis bajas. Por tanto, en otro aspecto, el método de la invención se lleva a cabo en sujetos que se encuentran sensibilizados a sufrir DRA. En una forma preferida de realización, los sujetos presensibilizados a sufrir DRA han sido tratados con dosis subtóxicas de un agente nefrotóxico. En una forma preferida de realización, el agente nefrotóxico con el que ha sido tratado el sujeto se es un antibiótico. En una forma preferida de realización, el antibiótico se selecciona del grupo de aminoglucósidos y cefalosporinas. en una forma de realización aún más preferida, el antibiótico aminoglucósido se selecciona del grupo de gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, kanamicina, estreptomicina, sisomicina, neomicina y combinaciones de los mismos.
En una forma de realización de la invención el agente nefrotóxico es un agente de contraste. El término "agente de contraste", en el contexto de la presente invención, se refiere a un compuesto biocompatible que puede ser detectado tras ser administrado a un individuo y que puede utilizarse en métodos diagnósticos in vivo por la imagen. El uso de dichos agentes de contraste mejora la visibilidad de estructuras o fluidos dentro del cuerpo, facilitando la diferenciación de distintas partes de la imagen y aumentando el "contraste" entre esas regiones diferentes. El término "agente de contraste" abarca así agentes que se usan para aumentar la calidad de una imagen que se puede generar, no obstante, en ausencia de tal agente (como es el caso, por ejemplo, en resonancia magnética), así como agentes que son prerrequi sitos para la generación de una imagen (como es el caso, por ejemplo, en gammagrafía). Los agentes de contraste adecuados incluyen, sin limitación, agentes de contraste para gammagrafía, para tomografía computerizada por emisión de fotones individuales (SPECT), para tomografía de emisión de positrones (PET), para espectroscopia Raman, para diagnóstico por imágenes de resonancia magnética (RM) y para diagnostico por imágenes ópticas. Dichos agentes de contraste se administran por las vías en que mejor se distribuyen por la estructura a ser examinada, ya sean ingeridos o por enema en el caso del tracto digestivo, inhalados para las vías respiratorias o inyectados para visualizar los vasos sanguíneos, órganos y tejidos.
Los agentes de contraste incluyen radiofármacos que se marcan normalmente con emisores de positrones tales como UC, 13N, 150, 18F, 82Rb, 62Cu y 68Ga. SPECT utiliza principalmente emisores γ, tales como 123L mTc y lll^ ^ modalidades de gammagrafía (tomografía de emisión de positrones (PET), tomografía computerizada de emisión de fotón único (SPECT)) son técnicas de diagnóstico por imágenes de secciones transversales que mapean la localización y concentración de radiotrazadores marcados con radionúclidos. Se pueden usar PET y SPECT para localizar y caracterizar un radionúclido midiendo la actividad metabólica. PET y SPECT proporcionan información que está relacionada con información a nivel celular tal como viabilidad celular. En PET, un paciente ingiere o se le inyecta una sustancia ligeramente radioactiva que emite positrones, que se puede seguir a medida que la sustancia se mueve a través del cuerpo. En una aplicación común, por ejemplo, a los pacientes se les administra glucosa con emisores de positrones unidos, y se controlan sus cerebros según realizan varias tareas. Puesto que el cerebro usa glucosa cuando trabaja, una imagen PET muestra en qué zonas es alta la actividad cerebral. En ciertas formas de realización de la invención, se marca una célula ex vivo para diagnóstico por imagen de PET o SPECT in vivo. Muy relacionada con PET es la tomografía computerizada de emisión de fotón único o SPECT. La diferencia principal entre las dos es que en lugar de una sustancia emisora de positrones, SPECT usa un trazador radioactivo que emite fotones de baja energía. Los agentes de contraste para imágenes de TAC incluyen, por ejemplo, medios de contraste yodados o bromados. Los ejemplos de estos agentes incluyen iotalamato, iohexol, diatrizoato, iopamidol, etiodol o iopanoato. También se han descrito agentes de gadolinio para su uso como agentes de contraste de TAC (véase, por ejemplo, Henson JW, et al. ATNR Am J Neuroradiol. 2004; 25: 969-72). Por ejemplo, se han usado como agentes de contraste de TAC agentes de gadopentato (discutido en Strunk HM y Schild H. Eur Radiol. 2004; 14: 1055-62). Se contempla la tomografía computerizada (TAC) como una modalidad de diagnóstico por imágenes. Tomando una serie de rayos X, algunas veces más de mil, desde varios ángulos y después combinándolas con un ordenador TAC hace posible construir una imagen tridimensional de cualquier parte del cuerpo. Se programa un ordenador para que muestre secciones bidimensionales desde cualquier ángulo y a cualquier profundidad. En TAC, la inyección intravenosa de un agente de contraste radioopaco, tal como los descritos aquí, puede ayudar en la identificación y delineación de masas de tejido blando cuando los escáneres iniciales de TAC no son diagnósticos.
Los agentes de contraste para imágenes ópticas incluyen, por ejemplo, fluoresceína, un derivado de fluoresceína, verde indocianina, verde Oregón, un derivado de verde Oregón, verde rodamina, un derivado de verde rodamina, una eosina, una eritrosina, rojo Texas, un derivado de rojo Texas, verde malaquita, éster sulfosuccinimidílico de nanooro, azul cascada, un derivado de cumarina, un naftaleno, un derivado de piridiloxazol, colorante amarillo cascada, colorante dapoxilo y varios otros compuestos fluorescentes divulgados aquí. Los agentes de contraste para resonancia magnética incluyen, sin limitación, complejos de metales seleccionados del grupo que consiste en cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), yterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y erbio (III).
La invención se dirige especialmente a aquellos agentes de contraste nefrotóxicos y, por lo tanto, potenciales causantes de daño renal agudo. En una realización preferida el agente de contraste se selecciona del grupo de un agente de contraste que contiene yodo, un agente de contraste que contiene bromo, un agente de contraste que contiene bario, un agente de contraste que contiene gadolinio y combinaciones de los mismos. En una realización preferida el agente de contraste contiene yodo. Los agentes de contraste que contienen yodo o agentes de contraste yodados se utilizan, en general, para exámenes radiológicos tales como pielografía de eliminación, histerosalpingografía, flebografía, angiografía TAC, angioTAC y artro TAC, entre otros, como radiocontrastes intravenosos. Son agentes de contraste yodados contemplados por la presente invención, sin limitación, tanto monómeros iónicos (ácido diatrizoico o ácido amidotrizoico y sus sales, ácido metrizoico y sus sales, ácido iotalámico y sus sales, iodamida, ácido ioxitalámico y sus sales, ácido iopanoico y sus sales, ácido ioglícico y sus sales, ácido acetrizoico y sus sales, ácido iocármico y sus sales, metiodal), como dímeros iónicos (ácido ioxáglico y sus sales, ácido iotróxico y sus sales), monómeros no iónicos (iohexol, iopamidol, ioversol, iobitridol, iopromida, metrizamida, iopentol), dímeros no iónicos (iodixanol, iotrolán, ioxilano, iomeprol) e insolubles en agua (propiliodona). También quedan contempladas por la presente invención las combinaciones de dichos compuestos y/o sus sales farmacéuticamente aceptables. Son sales adecuadas para dichos agentes de contraste yodados, sin limitación, cualquier tipo de sal farmacéuticamente aceptable, pero preferiblemente sal sódica o sal de meglumina. Ejemplos de sales no limitativos de agentes de contraste yodados contempladas por la presente invención son, diatrizoato de sodio, diatrizoato de meglumina, metrizoato de sodio, metrizoato de meglumina, iotalamato de sodio, iotalamato de meglumina, ioxaglato de sodio, ioxaglato de meglumina, etc.
En una realización preferida de la invención el agente de contraste que contiene yodo se selecciona del grupo de ácido diatrizoico (o ácido amidotrizoico) y sus sales, ácido metrizoico y sus sales, ácido ioxáglico y sus sales, ácido iotalámico y sus sales, iopamidol, iohexol, ioxilano, iopromida, ioversol, iodixanol, metrizamida y combinaciones de los mismos; preferiblemente es una o más sales de diatrizoato (también conocido como amidotrizoato). Los amidotrizoatos se utilizan en una amplia variedad de procedimientos como la urografía y la exploración de la vesícula biliar, conductos biliares y el bazo. Se suele preferir una mezcla de sales de diatrizoato tales como amidotrizoato sódico y amidotrizoato de meglumina para minimizar los efectos adversos y mejorar la calidad de la exploración. En una realización aún más preferida el agente de contraste que contiene yodo es una combinación de diatrizoato sódico y diatrizoato de meglumina.
En otra forma de realización el agente de contraste contiene bromo. Los agentes de contraste que contienen bromo o agentes de contraste bromados incluidos en la presente invención son, sin limitación, agentes de contraste como los divulgados en las solicitudes de patente WO93/08122, EP 1186305 Al, FR 2736051 Al, EP 073715 Al, EP 074307 Al, EP 074309 Al, EP 0118348 Al, FR 2541272 Al; fluorocarbonos bromados tales como bromuro de perfluorooctilo (C8BrF17), bromuro de perfluorohexilo. La invención contempla también mezclas de dichos agentes de contraste que contienen bromo y/o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
En otra forma de realización el agente de contraste contiene bario, preferiblemente es sulfato de bario. El sulfato de bario es una sal metálica que se utiliza para definir el tubo gastrointestinal. Se puede utilizar en técnicas de simple o doble contraste o en tomografía axial asistida por ordenador.
En otra forma de realización el agente de contraste contiene gadolinio. Los agentes de contraste que contienen gadolinio son, sin limitación, ácido gadopentético, gadodiamina, ácido gadotérico, gadoteridol, gadopentato, gadodiamida, ácido gadobénico, gadofosveset, gadoversetamida, ácido gadoxético, gadobutrol, ácido gadocolético y gadodenterato. También quedan contempladas por la presente invención las sales de dichos agentes de contraste que contienen gadolinio, siendo adecuadas cualquier tipo de sales farmacéuticamente aceptables, preferiblemente sal sódica y sal de meglumina.
En otra forma de realización el agente nefrotóxico es un antibiótico. Por "antibiótico" se entiende una sustancia química producida por un ser vivo o derivada sintética de ella que a bajas concentraciones mata o impide el crecimiento de ciertas clases de microorganismos sensibles, generalmente bacterias, aunque algunos antibióticos se utilizan también para el tratamiento de infecciones por hongos o protozoos. Los antibióticos se utilizan en medicina humana, animal u horticultura para tratar infecciones provocadas por microorganismos. Antibióticos incluidos en la presente invención son, sin limitación, antibióticos aminoglucósidos, ansamicinas, carbacefem, carbapenems, cefalosporinas, glicopéptidos, macrólidos, monobactámicos, penicilinas, polipéptidos, quinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas y otros tales como arsfenamina, cloranfenicol, clindamicina, lincomicina, etambutol, fosfomicina, ácido fusídico, furazolidona, isoniazida, linezolid, metronidazol, mupirocina, nitrofurantoína, platensimicina, pirazinamida, quinupristin/dalfopristin, rifampina o rifampicina, tinidazol, viomicina y capreomicina; preferiblemente cefalosporinas, tetraciclinas, glicopéptidos, carbapenems, polipéptidos, rifampicina, aminoglucósidos, sulfonamidas, viomicina y capreomicina. En una realización preferida el antibiótico se selecciona del grupo de aminoglucósidos y cefalosporinas.
Por "antibióticos aminoglucósidos" se entienden antibióticos bactericidas que actúan a nivel de ribosomas en la subunidad 30S bacteriana y, por ende, a nivel de la síntesis de proteínas, creando porosidades en la membrana externa de la pared celular bacteriana. Antibióticos aminoglucósidos contemplados por la presente invención son, sin limitación, gentamicina, amikacina, espectinomicina, trospectomicina, estreptomicina, neomicina, gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, sisomicina, paromomicina y kanamicina. También quedan contempladas por la presente invención las sales farmacéuticamente aceptables de dichos antibióticos. En una realización preferida el antibiótico aminoglucósido se selecciona del grupo de gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, kanamicina, estreptomicina, sisomicina, neomicina y combinaciones de los mismos; preferiblemente es gentamicina.
Por "cefalosporinas" se entienden una clase de antibióticos beta-lactámicos que derivan del ácido 7-cefalosporánico y que actúan interfiriendo en la síntesis de peptidoglucano de la pared celular bacteriana e inhibiendo la transpeptidación final, necesaria para la reticulación, lo que genera un efecto bactericida. En el contexto de la presente invención el término cefalosporinas incluye, por ejemplo y sin limitación, a cefalosporinas de primera generación (cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefalexina), cefalosporinas de segunda generación (cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima), cefalosporinas de tercera generación (cefixima, cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriazona), cefalosporinas de cuarta generación (cefepime) y de quinta generación (ceftobiprole). También quedan contempladas por la presente invención las sales farmacéuticamente aceptables de dichas cefalosporinas.
En otra forma de realización el agente nefrotóxico es un agente inmunosupresor. Por "agente inmunosupresor" se entiende una sustancia que produce la inmunosupresión del sistema inmunitario. Dichos agentes inmunosupresores tienen utilidad para prevenir el rechazo de un órgano trasplantado y para el tratamiento de una enfermedad autoinmune o enfermedades que pueden ser de origen autoinmune, tales como vasculitis, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, psoriasis o lupus eritematoso sistémico. Agentes inmunosupresores incluidos en la presente invención son, si limitación, agentes citostáticos tales como azatioprina, ciclofosfamida, metotrexato, micofenolato mofetilo; glucocorticoides tales como prednisona; inhibidores de la enzima calcineurina tales como ciclosporina A, tacrolimus (FK506); rapamicina o sirolimus; everolimus; anticuerpos policlonales tales como la timoglobulina; anticuerpos monoclonales tales como rituximab, daclizumab, etanercept. También quedan contempladas por la presente invención las sales farmacéuticamente aceptables de dichos agentes inmunosupresores. En una realización preferida el agente inmunosupresor se selecciona de ciclosporina A, tacrolimus (FK506) y everolimus; preferiblemente ciclosporina A.
En otra forma de realización el agente nefrotóxico es un agente antineoplásico. Por "agente antineoplásico" se entiende una sustancia que impide el desarrollo, crecimiento o proliferación de células tumorales malignas, y que puede ser de origen natural, sintético o semisintético. Agentes antineoplásicos contemplados en la presente invención incluyen, sin limitación, agentes alquilantes de ADN; compuestos basados en platino; antimetabolitos; antibióticos antitumorales; inhibidores de topoisomerasas I y II; enzimas como L-asparaginasa; alcaloides de la vinca; taxanos; agentes hormonales tales como antiestrogénicos, inhibidores de la aromatasa, análogos de LH-RH, antiandrogénicos y glucocorticoides; otros agentes como interleucinas, interferones, anticuerpos monoclonales y la vacuna de la BCG. En una realización preferida el agente antineoplásico se selecciona del grupo de un compuesto basado en platino, un antimetabolito, un agente alquilante de ADN, un inhibidor de topoisomerasa I o II, y una combinación de los mismos.
Por "compuesto basado en platino", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende cualquier compuesto que contiene un átomo de platino capaz de unirse e intercalarse en el ADN, induciendo la activación de la reparación del ADN y, finalmente, desencadenando apoptosis. Compuestos basados en platino incluyen, sin limitación, carboplatino, cisplatino [cis-diaminodicloroplatino, (CDDP)], oxaliplatino, iproplatino, nedaplatino, triplatino tetranitrato, tetraplatino, satraplatino (JM216), JM118, JM149, JM335, transplatino, ZD0473, cis, trans, cis-
Pt(NH3)(C6Hl 1NH2)(00CC3H7)2C1, malanato-l,2-diaminociclohexanoplatino (II), 5-sulfosalicilato-trans-(l,2- diaminociclohexano)platino (II) (SSP), poli-[(trans-l,2- diaminociclohexano)platino]- carboxiamilosa (POLY-PLAT), 4-hidroxi- sulfonilfenilacetato (trans- 1,2- diaminociclohexano) platino (II) (SAP) y similares. En una realización preferida el compuesto basado en platino se selecciona del grupo de cisplatino, carboplatino y una combinación de los mismos; preferiblemente es cisplatino. El término "antimetabolito", tal como se usa en el presente documento, se refiere, en su sentido más amplio, a sustancias que perturban el metabolismo normal y a sustancias que inhiben el sistema de transferencia de electrones para prevenir la producción de intermediarios ricos en energía, debido a sus similitudes estructurales o funcionales con metabolitos que son importantes para los organismos vivos (tales como vitaminas, coenzimas, aminoácidos y sacáridos). Antimetabolitos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, sin limitación, antimetabolitos del ácido fólico (aminopterina, denopterina, metotrexato, edatrexato, trimetrexato, nolatrexed, lometrexol, pemetrexed, raltitrexed, piritrexim, pteropterina, leucovorina, 10-propargil- 5,8-dideazafolato (PDDF, CB3717)), inhibidores de ribonucleótidos (hidroxiurea), análogos de purina (cladribina, clofarabina, fludarabina, mercaptopurina, pentostatina, tioguanina) y análogos de pirimidina (capecitabina, 5-azacitidina, citarabina o ara-C, decitabina, fluorouracilo, 5-fluorouracilo, doxifluridina, floxuridina y gemcitabina). También quedan contempladas por la presente invención las sales farmacéuticamente aceptables de dichos antimetabolitos. En una realización preferida el antimetabolito se selecciona del grupo de metotrexato, pentostatina, 5-azacitidina, hidroxiurea y una combinación de los mismos. Por "agente alquilante de ADN", se entiende un agente alquilante utilizado en el tratamiento del cáncer que es capaz de añadir un grupo alquilo al ADN de células que se dividen rápidamente, conduciendo a la detención de la replicación y a la muerte celular. Agentes alquilantes de ADN son mostazas nitrogenadas, nitrosoureas, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo y triazenos, incluyendo, pero sin limitarse a, ciclofosfamida (Cytoxan™), busulfano, improsulfano, piposulfano, pipobromán, melfalán (L-sarcolisina), clorambucilo, mecloretamina o mustina, uramustina o mostaza de uracilo, novembiquina, fenesterina, trofosfamida, ifosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), clorozotocina, fotemustina, nimustina, ranimnustina, semustina (metil-CCNU), estreptozotocina, tiotepa, trietilenemelamina, trietilenetiofosforamina, mitomicina C, procarbazina, altretamina, dacarbazina, mitozolomida y temozolomida. También quedan contempladas por la presente invención las sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos. En una realización preferida el agente alquilante de ADN se selecciona del grupo de carmustina, lomustina, semustina, ifosfamida, mitomicina C y una combinación de los mismos.
Por "inhibidor de topoisomerasa I o Π" se entiende un agente diseñado para interferir con la acción de los enzimas topoisomerasa I y II. Los inhibidores de topoisomerasa I incluyen, sin limitación, irinotecan, topotecan, camptotecina, acetilcamptotecina, 9- aminocamptotecina, lamelarina D y ácido betulínico. Inhibidores de topoisomerasa II incluyen, sin limitación, amsacrina, etopósido, tenipósido y doxorubicina. También quedan contempladas por la presente invención las sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos. En una realización preferida el inhibidor de topoisomerasa I o II se selecciona del grupo de etopósido, tenipósido, doxorubicina y una combinación de los mismos.
La invención también contempla combinaciones de todos estos antineoplásicos, como por ejemplo y sin limitación, cisplatino-paclitaxel, cisplatino-gemcitabina, cisplatino- docetaxel, carboplatino-paclitaxel, cisplatino-etopósido, carboplatino-etopósido, carboplatino-gemcitabina, carboplatino-docetaxel, cisplatino-tenipósido, oxaliplatino- gemcitabina, oxaliplatino-paclitaxel, cisplatino-paclitaxel-gemcitabina, cisplatino- doxorubicina-5-fluorouracilo (AFP), ciclofosfamida-doxorubicina-cisplatino (CISCA) y cisplatino-fluorouracilo (CF).
Por "sal farmacéuticamente aceptable", según se utiliza en el presente documento, se refiere a una sal reconocida para su uso en animales y más particularmente en seres humanos, e incluye las sales utilizadas para formar sales de adición de bases, bien sean inorgánicas, como por ejemplo y sin sentido limitativo, litio, sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso, cobre, zinc o aluminio entre otras, bien sean orgánicas como por ejemplo y sin sentido limitativo etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, arginina, Usina, histidina o piperazina entre otras, o sales de adición de ácidos, bien sean orgánicos, como por ejemplo y sin sentido limitativo acetato, citrato, lactato, malonato, maleato, tartrato, fumarato, benzoato, aspartato, glutamato, succinato, oleato, trifluoroacetato, oxalato, pamoato o gluconato entre otros, o inorgánicos, como por ejemplo y sin sentido limitativo cloruro, sulfato, borato o carbonato entre otros. La administración del compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 puede realizarse antes de la administración del agente nefrotóxico, durante la administración de dicho agente y/o después de la administración del mismo. Típicamente, la administración del compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se inicia antes de la administración del agente nefrotóxico (por ejemplo un día antes) y continúa hasta unos días después de la finalización de la administración del agente nefrotóxico, por ejemplo hasta 4 días, hasta 5 días, hasta 6 días, hasta 7 días despúes de la finalización de la administración.
En una realización preferida de la invención el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se co-administra junto con el agente nefrotóxico. La co-administración implica que tanto el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 como el agente nefrotóxico se administran al mismo tiempo, bien sea en composiciones farmacéuticas separadas, en la misma composición farmacéutica, o, cuando se trate de agentes nefrotóxicos ambientales, el contacto de dichos agentes nefrotóxicos con el sujeto tratado coexiste en el tiempo con la administración del compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1. La administración del compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 puede realizarse antes de la aparición de isquemia o isquemia-reperfusión, durante la misma o una vez ya ha cesado la isquemia o isquemia-reperfusión. Típicamente, la administración del compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se realiza poco después del establecimiento de la isquemia y se mantiene durante todo el período isquémico cesando poco antes de que se inicie la reperfusión.
El sujeto al que se administra el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 puede ser cualquier mamífero e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano de sexo femenino o masculino y de cualquier raza o edad. El experto en la materia apreciará que en el medicamento los principios activos deben estar en una cantidad terapéuticamente efectiva, y que la formulación de dichos compuestos activos se llevará a cabo dependiendo del tipo de administración. Por "cantidad terapéuticamente efectiva", según se usa aquí, se entiende la cantidad de compuesto que permite aliviar total o parcialmente los síntomas asociados con el daño renal agudo o que impide la progresión o el empeoramiento de los síntomas, o que previene la aparición del daño renal agudo en un sujeto en riesgo de sufrirlo. En una realización preferida de la invención la cardiotrofina-1 se administra en una dosis de 100 μg/kg al día.
En una realización de la invención el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se administra por vía intravenosa.
Los inventores han demostrado que el compuesto que induce la actividad cardiotrofina- 1 es capaz de reducir el deterioro de la función excretora renal en pacientes sometidos a daño renal, tal como lo demuestran las Figuras 4, 21 y 28B que muestran una reducción en la disminución del aclaramiento de creatinina; las Figuras 2, 3, 14, 19, 20 y 28A que muestran una reducción en la acumulación en la sangre de productos del metabolismo como la creatinina, la urea y sus derivados; las Figuras 5 y 22, que muestran una disminución en la aparición de proteinuria. Por lo tanto, en una realización preferida de la invención el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 reduce el deterioro de la función excretora renal.
Por "deterioro de la función excretora renal" se entiende la pérdida completa o parcial de la capacidad de los ríñones para eliminar los residuos y concentrar la orina sin perder electrolitos medida a través de un aumento en los niveles de creatinina sérica, de la disminución en la eliminación de orina, de la disminución del aclaramiento de creatinina, del aumento de urea y derivados en suero, o bien de la aparición de proteinuria. Métodos adecuados para determinar estos parámetros han sido descritos con anterioridad. Los autores de la presente invención han demostrado que la sola administración de cardiotrofina-1 es suficiente para prevenir y/o tratar el daño renal agudo. En una realización preferida de la invención la administración del compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se realiza en ausencia de un receptor soluble de un miembro de la familia de IL-6 o un fragmento del mismo. En una realización preferida el receptor soluble es el receptor de CT-1 o un fragmento del mismo.
Por "receptor soluble de un miembro de la familia de IL-6" se entiende un receptor en forma soluble capaz de unirse a una citoquina perteneciente a la familia de la interleuquina 6 formando un complejo que es capaz de interaccionar directamente con gpl30. Entre los miembros de dicha familia se encuentran, sin limitación, el factor inhibidor de la leucemia (LIF), la cardiotrofina-1 (CT-1), el factor neurotrófico ciliar (CNTF), la interleuquina- 11 (IL-11), la oncostatina M (OSM), la citoquina similar a cardiotrofina (CTC) y la propia interleuquina 6 (IL-6). Por "fragmento de un receptor soluble de un miembro de la familia de IL-6" se entiende cualquier fragmento de un receptor soluble de un miembro de la familia de IL-6 que mantiene la capacidad de unión a cardiotrofina- 1 y también la capacidad de interaccionar con gpl30.
Por "receptor soluble de CT-1" se entiende un receptor en forma soluble capaz de unirse a cardiotrofina-1 formando un complejo que es capaz de interaccionar directamente con gpl30. Por "fragmento de un receptor soluble de CT-1" se entiende cualquier fragmento del receptor soluble de CT-1 que mantiene la capacidad de unión a cardiotrofina-1 y también la capacidad de interacción con gpl30. La expresión "se realiza en ausencia de un receptor soluble de un miembro de la familia de IL-6 o un fragmento del mismo" significa que junto con la cardiotrofina-1 no se administra de forma exógena ningún receptor soluble de un miembro de la familia de IL-6 ni tampoco un fragmento del mismo. En otra realización preferida de la invención la administración del compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se realiza en ausencia de un factor de crecimiento mesenquimal metanéfrico. Por "factor de crecimiento mesenquimal metanéfrico" se entiende, en el contexto de la invención, cualquier factor de crecimiento capaz de estimular la proliferación del mesénquima metanéfrico e incluye, sin limitación, TGFa, FGF-2, FGF-9, TEVIP-1 y TF P-2.
La expresión "se realiza en ausencia de un factor de crecimiento mesenquimal metanéfrico" significa que junto con la cardiotrofina-1 no se administra de forma exógena ningún factor de crecimiento mesenquimal metanéfrico.
COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han demostrado que el daño renal producido por agentes nefrotóxicos puede ser contrarrestado mediante la administración de un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1.
Por tanto, otro aspecto de la invención es una composición que comprende, juntos o separados, un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente nefrotóxico.
La expresión "compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1" ha sido descrito con anterioridad en el contexto de los usos de la invención y comprende, como en el primer aspecto de la invención, un compuesto seleccionado del grupo de:
(i) cardiotrofina-1 (CT-1) o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(ii) un polinucleótido que codifica CT-1 o una variante funcionalmente equivalente de CT-1 que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(iii) un vector que comprende un polinucleótido según (ii) y
(iv) una célula capaz de secretar al medio cardiotrofina-1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1.
en donde los distintos compuestos han sido descritos en detalle anteriormente. El término "agente nefrotóxico" ha sido definido con anterioridad en el contexto de los usos de la invención y se selecciona del grupo de agentes de contraste, antibióticos, agentes inmunosupresores y agentes antineoplásicos, que también han sido descritos anteriormente.
El término "composición", según se utiliza en el presente documento, se refiere a una composición formada al menos por dos componentes: un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente nefrotóxico, que puede ser un agente terapéutico o un agente de contraste. Dichos componentes pueden estar físicamente juntos, constituyendo una única formulación (por ejemplo, como un comprimido o cápsula que comprende una cantidad fija de cada uno de los componentes) o, por el contrario, pueden estar formulados por separado para posteriormente combinarlos para su administración conjunta, secuencial o separada. Las composiciones de la invención también contemplan la formulación como un "kit de partes" en donde los componentes se formulan separadamente pero se empaquetan en un mismo contenedor, y permiten combinarlos previamente antes de su administración. El experto en la materia apreciará que la formulación del primer y segundo componente de las composiciones de la invención puede ser similar, es decir, formulados de manera semejante (en comprimidos o en tabletas), lo que permite su administración por la misma vía. En el caso en que los distintos componentes de la composición de la invención se formulan separadamente, los dos componentes se pueden presentar en blíster. Cada blíster contiene los medicamentes que tienen que ser consumidos a lo largo de un día. Si los medicamentos tienen que ser administrados varias veces al día, se pueden disponer los medicamentes correspondientes a cada administración en distintas secciones del blíster, preferiblemente anotando en cada sección del blíster el momento del día en el que deben ser administrados. Alternativamente, los componentes de la composición de la invención pueden ser formulados de forma distinta de manera que los distintos componentes se administren de diferente forma. Así, es posible por ejemplo que el primer componente se formule como comprimido o cápsula para su administración oral y que el segundo componente se formule para su administración intravenosa. Las composiciones de la invención se administran mediante los métodos conocidos para un experto en la materia, incluyendo, sin limitación, por vía intravenosa, oral, nasal, parenteral, tópica, transdérmica, rectal y similares. La relación entre los componentes que forman parte de las composiciones de la invención dependerá del compuesto inductor de la actividad CT-1 y del agente nefrotóxico usado en cada caso en particular, así como de la indicación deseada.
Las composiciones útiles en la práctica del método de la invención incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que induce la actividad cardiotrofina- 1 y una cantidad terapéuticamente eficaz del agente nefrotóxico, cuando dicho agente sea un fármaco terapéuticamente activo. Por otra parte, las composiciones útiles en la práctica del método de la invención incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y una cantidad adecuada del agente nefrotóxico para obtener una imagen por contraste útil en procedimientos diagnósticos cuando dicho agente nefrotóxico sea un agente de contraste. Las composiciones de la invención incluyen también un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización particular la composición es una composición farmacéutica que comprende, juntos o separados, un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1, un agente nefrotóxico y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Por "cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1" se entiende aquella cantidad capaz de producir uno o más de los efectos listados anteriormente y atribuibles a la CT-1, y puede determinarse por técnicas estándar basadas en los métodos detallados en la presente descripción.
Por "cantidad terapéuticamente eficaz del agente nefrotóxico" se entiende aquella cantidad de agente nefrotóxico necesaria para producir un efecto terapéútico y que varía en función del efecto terapéutico buscado, es decir, varía en función de si el agente nefrotóxico es un antibiótico, un agente antineoplásico o un agente inmunosupresor. El término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o de estado o incluido en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida, para usar en animales, y más particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se administra el compuesto terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede contener también cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglomerantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores estándar tales como tipos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences". 17a edición revisada (Diciembre 1985). Editorial Mack Pub. Co.
La composición se puede formular conforme a procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa, subcutánea o intramuscular a seres humanos. Cuando sea necesario, la composición puede incluir también un agente de solubilización y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Cuando la composición vaya a administrarse por infiltración, puede dispensarse con un frasco de infiltración que contenga agua o solución salina de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua para inyección o solución salina estéril, de tal forma que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración. La cantidad de compuesto inductor de la actividad CT-1 que será eficaz en el tratamiento del daño renal puede determinarse por técnicas clínicas estándar basadas en la presente descripción. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a emplear en la formulación dependerá también de la vía de administración, y la gravedad de la afección, y debe decidirse conforme al juicio del médico y las circunstancias de cada sujeto.
Para la administración sistémica, una dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración circulante que incluya la IC50 que se haya determinado en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar de manera más precisa las dosis útiles en humanos. Las dosificaciones iniciales pueden estimarse también a partir de datos in vivo, p.ej ., modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Alguien con una experiencia normal en la técnica podrá optimizar fácilmente la administración a humanos basada en los datos en animales.
Así, los métodos de prevención y/o tratamiento del daño renal agudo de acuerdo a la invención contemplan la administración conjunta, secuencial o separada de los compuestos con capacidad de inducir la actividad CT-1 con uno o varios compuestos nefrotóxicos. Por tanto, en una realización preferida la composición se administra de forma simultánea, separada o secuencial. Todas las realizaciones particulares de los usos de la presente invención son aplicables también a las composiciones de la invención.
Las composiciones de la invención, que contienen un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1, pueden ser utilizadas para prevenir el daño renal agudo producido por el componente nefrotóxico de dicha composición cuando este se administra con una finalidad terapéutica o diagnóstica. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente de contraste para la preparación de un agente diagnóstico. En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente de contraste para la preparación de un agente diagnóstico. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método diagnóstico por contraste en un paciente que comprende la administración a dicho paciente de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente de contraste, y el diagnóstico mediante la visualización del agente de contraste.
El término "agente de contraste" ha sido definido anteriormente en el contexto de los usos de la invención. El término "agente diagnóstico", en el contexto de la presente invención, se refiere a un agente que comprende un agente de contraste y un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y que administrado a un individuo permite ser detectado por contraste. El agente diagnóstico incluye, además del compuesto de la invención, otros componentes o excipientes que sean necesarios para su uso o administración.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un antibiótico para la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al antibiótico. En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un antibiótico para la preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al antibiótico. En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un antibiótico para su uso en la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al antibiótico. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de tratamiento o la prevención en un individuo de la nefrotoxicidad asociada a un antibiótico que comprende la administración a dicho individuo de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un antibiótico. El término "antibiótico" ya ha sido definido en el contexto de los usos de la invención. Dichos antibióticos se utilizan habitualmente en el tratamiento de infecciones, que son enfermedades producidas por la colonización de un individuo huésped por un microorganismo patógeno (bacteria, hongo o protozoo) que es perjudicial para el funcionamiento normal y supervivencia del huésped. El antibiótico utilizado en la composición determinará la infección para cuyo tratamiento es apta la composición de la invención. Infecciones en las que puede ser útil la administración de una composición según la invención son, sin limitación, infecciones bacterianas causadas por E.coli, Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa, Proteus, Haemophilus influenzae, Enterobacter, Neisseria, Staphylococcus aureus, Mycoplasma, Yersinia, Plesiomonas, Aeromonas, Acinetobacter, Chlamydia, Rickettsia, Streptococcus, Corynebacterium, Bacteroides fragilis, Fusobacterium, Clostridium diffwile, Clostridium perfringens, Peptostreptococcus . Cuando el antibiótico sea un antibiótico aminoglucósido las infecciones que se tratan con la composición de la invención son, generalmente, infecciones severas causadas por bacterias Gram negativas, tales como Escherichia coli y Klebsiella, así como infecciones por Pseudomonas aeruginosa y bacterias anaeróbicas no facultativas. También son útiles en profilaxis de cirugía.
Cuando el antibiótico sea una cefalosporina las infecciones que se tratan con la composición de la invención son, generalmente, infecciones por cocos Gram positivos, Proteus, Escherichia coli, Klebsiella, bacilos Gram negativos, Haemophilus influenzae, Enterobacter, Pseudomonas, Neisseria, Staphylococcus aureus. También son útiles en el tratamiento de infecciones por organismos resistentes a otros betalactámicos, como ciertas presentaciones de meningitis, y en la profilaxis previa a cirugía.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente inmunosupresor para la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al agente inmunosupresor. En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente inmunosupresor para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al agente inmunosupresor. En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente inmunosupresor para su uso en la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al agente inmunosupresor. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de tratamiento o la prevención en un individuo de la nefrotoxicidad asociada a un agente inmunosupresor que comprende la administración a dicho individuo de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente inmunosupresor.
El término "agente inmunosupresor" ya ha sido definido anteriormente en el contexto de los usos de la invención. Las composiciones de la invención son de utilidad en aquellos pacientes que sufren o son susceptibles de sufrir rechazo en trasplantes o una enfermedad autoinmune y que deben ser tratados con un agente inmunosupresor nefrotóxico. Por "rechazo en trasplantes" se entiende la reacción producida por el sistema inmune del receptor de un trasplante que ataca al órgano o tejido trasplantado llegando a causar la conocida como enfermedad de injerto contra huésped y destruyendo el tejido extraño. Por "enfermedad autoinmune" se entiende aquella enfermedad en la que el sistema inmunitario ataca a las células del propio organismo. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de enfermedades autoinmunes que pueden ser tratadas con las composiciones de la invención incluyen, la enfermedad de Addison, alopecia areata, espondilitis anquilosante, anemia hemolítica, anemia perniciosa, aftas, estomatitis aftosa, artritis, arterieesclerosis, osteoartritis, artritis reumatoide, asma autoinmune, hemolisis autoinmune, enfermedad de Bechet, enfermedad de Boeck, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, corioiditis, colitis ulcerosa, enfermedad celiaca, crioglobulinemia, dermatitis herpetiformis, dermatomiositis, diabetes dependiente de insulina, diabetes juvenil, enfermedades desmielinizantes autoinmunes, encefalomielitis, encefalomielitis alérgica, endoftalmia, enteritis alérgica, síndrome enteropatía autoinmune, eritema nodoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, síndrome de Graves, enfermedad de Harnman-Rich, enfermedad de Hashimoto, pérdida repentina de audición, hepatitis crónica, enfermedad de Hodgkin, hemoglobinuria paroxística, hipogonadismo, ileítis regionales, iritis, leucopenia, lupus eritematoso diseminado, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo, linfogranuloma, mononucleosis infecciosa, miastenia gravis, mielitis transversa, mixedema idiopático primario, nefrosis, oftalmía simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, pénfigo vulgar, poliarteritis nodosa, poliartritis crónica, polimiositis, poliradicultis aguda, psoriasis, púrpura, pioderma gangrenoso, síndrome de Reiter, sarcoidosis, esclerosis atáxica, esclerosis sistémica progresiva, escleritis, esclerodermia, esclerosis múltiple, esclerosis diseminada, infertilidad debida a anticuerpos anti- espermatozoides, trombocitopenia, timoma, uveítis anterior aguda, vitíligo, el rechazo de trasplante a consecuencia del trasplante de un tejido u órgano y la enfermedad de injerto contra huésped.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente antineoplásico para la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al agente antineoplásico. En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente antineoplásico para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al agente antineoplásico. En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente antineoplásico para su uso en la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al agente antineoplásico. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de tratamiento o la prevención en un individuo de la nefrotoxicidad asociada a un agente antineoplásico que comprende la administración a dicho individuo de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente antineoplásico. El término "agente antineoplásico" ya ha sido definido en el contexto de los usos de la invención. Las composiciones de la invención son de utilidad en aquellos pacientes que sufren o son susceptibles de sufrir cáncer y que deben ser tratados con un agente antineoplásico nefrotóxico. El término "cáncer" o "tumor" se define como la condición fisiológica en mamíferos caracterizada por el crecimiento celular desregulado. Las composiciones de la invención tienen utilidad en el tratamiento de cualquier cáncer o tumor, tales como, sin limitación, tumores de mama, corazón, pulmón, intestino delgado, colon, bazo, riñon, vejiga, cabeza, cuello, ovario, próstata, cerebro, páncreas, piel, hueso, médula ósea, sangre, timo, útero, testículos e hígado. En particular, tumores que pueden ser tratados con dichas composiciones incluyen, sin limitación, adenoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma epitelial, germinoma, glioblastoma, glioma, hemangioendotelioma, hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma, leucemia, linfoma, meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma y teratoma. En particular, el tumor/cáncer se selecciona del grupo de melanoma acral lentiginoso, queratosis actínica adenocarcinoma, carcinoma adenoidal cística, adenomas, adenosarcoma, carcinoma adenoescamoso, tumores astrocíticos, carcinoma de la glándula de Bartolino, carcinoma de células básales, carcinoma de glándulas bronquiales, carcinoide capilar, carcinoma, carcinosarcoma, colangiocarcinoma, cistadenoma, tumor del seno endodermal, hiperplasia endometrial, sarcoma del estroma endometrial, adenocarcinoma endometroide, sarcoma ependial, sarcoma de Swing, hiperplasia nodular focal, tumores de la línea germinal, glioblastoma, glucagonoma, hemangioblastoma, hemangioendotelioma, hemangioma, adenoma hepático, adenomatosis hepática, carcinoma hepatocelular, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia de células escamosas interepiteliales, carcinoma de células escamosas invasivas, carcinoma de células grandes, leiomiosarcoma, melanoma, melanoma maligno, tumor mesotelial maligno, meduloblastoma, meduloepitelioma, carcinoma mucoepidermoide, neuroblastoma, adenocarcinoma neuroepitelial, melanoma nodular, osteosarcoma, adenocarcinoma seroso papilar, tumores pituitarios, plasmacitoma, pseudosarcoma, blastema pulmonar, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, carcinoma de células pequeñas, carcinoma de tejidos blandos, tumor secretor de somatostatina, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma no diferenciado, melanoma uveal, carcinoma verrugoso, vipoma, tumor de Wilm. La invención se describe a continuación mediante los siguientes ejemplos, que deben ser considerados como meramente ilustrativos y en ningún caso limitativos del ámbito de la presente invención. EJEMPLOS
A. EFECTO DEL BLOQUEO DE CT-1 CON ANTICUERPOS ANTI-CT-1 MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos y productos químicos
El anticuerpo anti-cardiotrofina-1 de ratón y la IgG control de cabra preinmune fueron suministrados por Digna-Biotech (Pamplona, España) y generadas por R&D Systems (Minneapolis, MN). Ambos fármacos se disolvieron en solución salina al 0,9% hasta una concentración final de 5 μg/ml. Para la anestesia, se usó una mezcla de ketamina (Ketolar, Pfizer), benzodiacepina (Valium, Roche) y atropina (Atropina, Braun) en una proporción 2:2: 1. Para el periodo posoperatorio, se adquirió buprenorfina 0,3 mg/ml (Buprex, Schering-Plough). Animales
Se enjaularon ratones C57BL/6 de tipo salvaje macho (Charles River Laboratories S.L., UK) en condiciones de cuidado animal estándar y se alimentaron con pienso para ratón estándar y se suministró agua ad libitum antes y después de la operación. La inducción de la lesión por I/R se estableció usando un protocolo previamente descrito (Docherty, N.G. et al, 2006. Nephrol. Dial. Transplant. (8): 2106-19). El tiempo de isquemia elegido y el desenlace se basaron en el encontrado para maximizar la reproducibilidad de la alteración de la función renal al tiempo que se minimiza la mortalidad en estos animales (Chatterjee P.K. et al, 2003. Kidney Int. 63 : 853-865). Isquemia/reperfusión renal
Los animales se anestesiaron usando la inyección intraperitoneal de la mezcla anestésica (ketamina-benzodiacepina-atropina) a una dosis de 60 mg/kg de peso corporal; la temperatura central del cuerpo de mantuvo a 37°C usando una manta homeotérmica. Después de ello, se realizó una laparotomía en la línea media. Los ratones de los grupos de I/R se sometieron a isquemia renal durante 30 minutos. Para este fin, la arteria y vena renales del riñon izquierdo se identificaron y pinzaron usando pinzas microvasculares. El riñon derecho se eliminó 5 minutos antes del final del periodo de isquemia (nefrectomía unilateral derecha). Después de eliminar las pinzas renales, el riñon izquierdo se observó durante 5 minutos adicionales para asegurar el reflujo, y después se inyectó en el abdomen 1 mi de solución salina a 37°C. Por último, la incisión se suturó en dos capas con suturas continuas usando Vicryl 3-0. A los grupos de animales pretratados se les dio por vía intravenosa anticuerpo anti-CT-1 o IgG preinmune de cabra, a través de la vena del pene, 15 minutos antes del periodo de isquemia. Los ratones con operaciones simuladas usados como controles, experimentaron procedimientos quirúrgicos idénticos que los ratones LR, con la excepción de que no se aplicaron las pinzas microvasculares (Rodríguez -Peña, A. et al, 2004. Am. J. Transplant, 4(10): 1605-1613; García-Criado, FJ. et al., 1998. Transplantation, 66(8): 982-990).
Periodo posoperatorio
Después de la cirugía los ratones fueron devueltos a sus jaulas, donde se les dejó recuperarse de la anestesia y se observaron durante 24 horas. La analgesia posoperatoria se alcanzó por la inyección subcutánea de buprenorfina a una dosis de 0,01 mg/kg de peso corporal (Aller, M.A. et al, 2009. Liver Int. 29(8): 1132-40). Los animales tuvieron acceso libre a agua y dieta de ratón ad libitum. Se siguieron el peso corporal y la actividad física durante el estudio.
Recogida de muestras
Para probar la función renal, se recogieron muestras de sangre como se ha descrito previamente (Morales, A.I. et al 2006. Toxicol. Appl. Pharmacol. 210: 128-135). Se obtuvieron de la punta de la cola usando capilares heparinizados (aproximadamente 200 μΐ), tanto al principio del procedimiento como 24 horas después de la isquemia. Después de centrifugar la sangre, los capilares se rompieron por el límite plasma-células para proceder a la extracción del plasma que se almacenó en tubos eppendorf a -20°C para análisis adicionales.
Sacrificio animal
Basándose en datos preliminares y publicados (Jerkic, M. et al. 2004. Nephrol. Dial. Transplant, 19:83-94; Morales, A.I. et al. 2002. Antiox. Redox Signal, 4: 893-898), los inventores han observado que este procedimiento quirúrgico provoca daño renal agudo reversible con una recuperación de la función normal después de 7 días. Puesto que los inventores han encontrado consistentemente daño máximo entre 24 y 48 horas, eligieron obtener muestras renales 48 horas después de la I-R.
Los ratones se sacrificaron en los puntos temporales indicados tras la reperfusión, 4 horas (grupos 1-4) y 48 horas (grupos 5-8). Después del periodo de reperfusión, los ratones se anestesiaron por vía intraperitoneal con pentobarbital sódico (40 mg/kg de peso corporal), se recogieron muestras de sangre a través de punción cardiaca y los ratones se perfundieron in situ con solución salina isotónica fría a lo largo de la aorta abdominal a nivel de la bifurcación iliaca. Se centrifugaron las muestras de sangre (6000 g durante 3 minutos) para separar el plasma que se congeló y almacenó a -80°C para estudios bioquímicos adicionales. El riñon izquierdo se retiró de los ratones al final del periodo experimental. El pedículo renal se ató y pesó. Se cortó un trozo de tejido, se fijó en formaldehído tamponado al 4% durante 24 horas y se embebió en parafina para la evaluación histopatológica e inmunohistoquímica. Otra parte del riñon se congeló rápidamente mediante inmersión en nitrógeno líquido y se almacenó a -80°C para análisis bioquímicos adicionales (Sánchez-González, P.D. et al. 2010. Nephrol. Dial. Transplant, (11): 3484-95).
Determinación de urea en plasma
La determinación bioquímica de las concentraciones de urea en muestras de plasma se realizó usando un método automatizado (Reflotron Plus®; Roche Diagnostics, Barcelona, España) con kits diagnósticos comerciales (Roche Farma, España) como indicadores de disfunción renal (Grande, M.T. et al. 2010. Kidney Int., 77(6): 509-518). Determinación de peróxidos de lípidos (malonildialdehído)
Los niveles de malonildialdehído (MDA) en muestras de riñon se determinaron usando el análisis de TBAR como un indicador de la peroxidación de lípidos, previamente descrito (Rodríguez-Peña, A. et al. 2002. Hypertension, 40(5): 713-20). Los tejidos se homogenizaron en una solución de fosfato/cloruro de sodio. Se añadió una alícuota del homogenizado a una mezcla de reacción que contenía ácido tricloroacético al 20% y ácido tiobarbitúrico al 0,67%. La mezcla se hirvió después durante 15 minutos a 100°C y se centrifugó a 9.000 g durante 5 minutos. Se midió la absorbancia en el sobrenadante por espectrometría a 532 nm.
Determinación de la actividad mieloperoxidasa (MPO)
Se determinó la actividad de mieloperoxidasa (MPO) en muestras de riñon como un índice de acumulación de células polimorfonucleares (PMN), usando un kit de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) específico para la enzima de ratón mencionada previamente según las instrucciones y directrices del fabricante (Hycult Biotech, Países Bajos). La concentración de MPO en muestras de homogenizado de riñon se expresó como ng/mg de proteína.
Determinación de los niveles de factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a)
Se cuantificó el nivel en suero de T F-α usando un kit de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) específico para la citoquina de ratón mencionada previamente según las instrucciones y directrices del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). La concentración de TNF-α en plasma se expresó como pg/ml. Inmunotransferencia de CT-1
Se prepararon extractos de tejido renal y se analizaron por inmunotransferencia según protocolos estándar (Suzuki, Y. et al. 2012. Biotech. Histochem., 87(4): 241-8). Brevemente, se separaron muestras de extractos que contenían 100 μg de proteínas mediante electroforesis en gel de SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de PVDF. Después de ser bloqueadas con BSA al 5%, las membranas se incubaron a 4°C durante la noche con el anticuerpo anti-CT-1 (dilución 1 :500, R&D Systems). A continuación, previamente a tres lavados con TBST, las membranas se incubaron con anti-IgG de ratón conjugado a HRP secundario durante 1 hora (dilución 1 : 10.000, Bio- Rad Laboratories). Después de lavar, los complejos inmunes se detectaron con sustrato de HRP quimioluminiscente (ECL) usando un lector de imágenes (ImageQuant RT ECL, GE Healthcare, España), y las bandas se midieron. Las membranas también se volvieron a probar con anticuerpo anti-GADPH monoclonal de ratón (1 :20.000, Ambion Applied Biosystems) para verificar la igual carga de proteína en cada carril.
Exámenes histopatológicos
Las muestras de tejido fijadas en formaldehido se deshidrataron en una serie ascendente de etanol (60, 80, 96, 100%), se enjuagaron con tolueno y aclararon en xileno. A continuación, cada muestra se incluyó en parafina fundida a 60°C, formando bloques en los que la pieza es tejido correctamente orientado. Con la ayuda de un micrótomo, se cortaron secciones de 4 μιη y se depositaron sobre portaobjetos de vidrio (Morales, A.I. et al. 2006. Food Chem. Toxicol., 44(12): 2092-100).
Tinción con hematoxilina & eosina
Las secciones de tejido fijadas en parafina se montaron en portaobjetos de vidrio y se tiñeron con H&E para examinarlas con un microscopio óptico. Se capturaron digitalmente cinco imágenes seleccionadas al azar por sección (aumento χ 400) y se analizó la densidad óptica (Grande, M.T. et al. 2010. Kidney Int., 77(6): 509-518).
Tinción inmunohistoquímica de CT-1 y ED-1
Se trataron secciones con tripsina para la tinción de ED-1 (CD-68), o con microondas para la tinción de cardiotrofina-1. El tejido renal se incubó después con un anticuerpo monoclonal anti-ED-1 (1 :200) (M0814; DakoCytomation, Dinamarca) y un anticuerpo policlonal anti-CT-1 (1 :200) (AF438; R&D Systems, Minneapolis, MN). La incubación con los anticuerpos primarios se llevó a cabo durante la noche a 4°C en una cámara humidificada, seguido por una segunda reacción con anticuerpo (1 : 100, anti-rata de conejo conjugado a Cy3, Jackson Laboratories, Alemania). El ADN nuclear se contratiñó con DAPI y la tinción de inmunofluorescencia se visualizó usando un microscopio confocal espectral de barrido con láser (TCS SP2, Leica) a un aumento de x 400 (Grande, M.T. et al. 2010. Kidney Int., 77(6): 509-518). Análisis estadístico de los datos
El análisis estadístico se realizó usando el software NCSS. Los valores se expresaron como la media de n experimentos independientes. Los valores de los datos con una distribución normal se expresaron como media ± error estándar de la media (EEM). Se usó la prueba de corrección de Scheffe para comparaciones múltiples. Para los datos que no se ajustan a una distribución normal, los valores se expresaron como mediana y se usó la prueba de Kruskal-Wallis para comparaciones múltiples. En general, el error alfa máximo asumido y considerado estadísticamente significativo en todas las pruebas anteriores fue p<0,05 o Z>1,96.
1. Efecto del bloqueo de CT-1 con anticuerpo anti-CT-1 sobre la gravedad de insuficiencia renal aguda inducida por isquemia renal unilateral En este estudio se investigó el efecto del bloqueo de CT-1 con anticuerpos anti-CT-1 sobre la gravedad de la lesión renal aguda inducida en un modelo de ratón de isquemia renal unilateral.
Los ratones se enjaularon 4-5/jaula y se mantuvieron en el animalario con una temperatura ambiente de 20 ± 2°C, humedad del 50% y ciclos de 12: 12 horas de luz- oscuridad. Se alimentaron con una dieta en pellas estándar, y se les administró agua corriente ad libitum. Después de un periodo de aclimatación de 7 días, un total de 60 ratones se distribuyeron al azar en los siguientes ocho grupos: - GRUPO 1. Grupo control de 4 horas (control -4h, n = 4); ratones que recibieron una dosis única embolada de solución salina 15 minutos antes de la isquemia renal (30 minutos), seguida por uninefrectomia y reperfusión durante 4 horas. - GRUPO 2. Grupo IgG control de 4 horas (IgG control-4h, n = 8); ratones que recibieron una dosis única embolada de IgG preinmune de cabra 15 minutos antes de la isquemia renal (30 minutos), seguida por uninefrectomia y reperfusión durante 4 horas. GRUPO 3. Grupo anti-CT-1 de 4 horas (Anti-CT-l-4h, n = 8); ratones que recibieron una dosis única embolada de anticuerpo anti-CT-1 (50 μg/kg, i.v.) 15 minutos antes de la isquemia renal (30 minutos), seguida por uninefrectomia y reperfusión durante 4 horas.
GRUPO 4. Grupo simulado de 4 horas (Sim-4h, n = 4); ratones que recibieron una dosis única embolada de solución salina 15 minutos antes de los procedimientos quirúrgicos descritos anteriormente, con la excepción que la I/R renal no se aplicó.
GRUPO 5. Grupo control (control, n = 10); ratones que recibieron una dosis única embolada de solución salina 15 minutos antes de la isquemia renal (30 minutos), seguida por uninefrectomia y reperfusión durante 48 horas.
GRUPO 6. Grupo IgG control (IgG control, n = 10); ratones que recibieron una dosis única embolada de IgG preinmune de cabra 15 minutos antes de la isquemia renal (30 minutos), seguida por uninefrectomia y reperfusión durante 48 horas.
GRUPO 7. Grupo anti-CT-1 (Anti-CT-1, n = 10); ratones que recibieron una dosis única embolada de anticuerpo anti-CT-1 (50 μg/kg, i.v.) 15 minutos antes de la isquemia renal (30 minutos), seguida por uninefrectomia y reperfusión durante 48 horas.
GRUPO 8. Grupo simulado (Sim, n = 6); ratones que recibieron una dosis única embolada de solución salina 15 minutos antes de los procedimientos quirúrgicos descritos anteriormente, seguida por uninefrectomia y reperfusión durante 48 horas. Efecto del anticuerpo anti-CT-1 sobre aspectos clínicos y el peso corporal.
La figura 34 representa el peso corporal de los animales en los cuatro grupos experimentales 48 horas después de la I/R durante el periodo de estudio. Todos los ratones en el grupo simulado mostraron un buen aspecto, motilidad normal y un mantenimiento estable en el peso corporal en todos los puntos temporales. Sin embargo, los grupos de I/R mostraron un mal aspecto y motilidad menor acompañados por una pérdida significativa de peso después de la fase de reperfusión. Este deterioro de la salud producido por el procedimiento quirúrgico fue ligeramente mayor en ratones tratados con anti-CT-1 comparado con el de los grupos control (ratones tratados con solución salina o IgG de cabra).
Efecto del anticuerpo anti-CT-1 sobre el índice de supervivencia
La figura 35 representa el índice de supervivencia de ratones en los cuatro grupos experimentales 48 horas después de la I/R durante el periodo de estudio. Todos los ratones sin procedimiento quirúrgico (grupo simulado) presentaron una supervivencia normal y no se observó mortalidad en este grupo. Sin embargo, los animales con I/R mostraron una ligera mortalidad con una supervivencia de aproximadamente el 90% (9 de 10 animales) a las 24 horas después de la isquemia. El índice de supervivencia descendió al 70% (7 de 10 animales) en el grupo anti-CT-1 y al 80% (8 de 10 animales) en los grupos control (ratones tratados con solución salina o IgG de cabra) 48 horas después de la isquemia. Efecto del anticuerpo anti-CT-1 sobre la función renal
La figura 36 representa la evolución de los niveles de urea en plasma en los cuatro grupos experimentales 48 horas después de la I/R durante el periodo de estudio. Los resultados muestran que la concentración de urea en plasma se mantuvo sin cambios en el grupo simulado. Respecto a los ratones sometidos a I/R renal, los niveles de urea en plasma aumentaron a las 24 horas después de la isquemia, alcanzando un pico máximo. Este aumento en la disfunción renal fue mayor en los ratones tratados con anti-CT-1 que en los grupos control (ratones tratados con solución salina o IgG de cabra), pero no hubo diferencias significativas entre estos grupos. En los puntos temporales finales o 48 después de la isquemia, la concentración de urea en plasma volvió a niveles casi normales en todos los grupos de I/R.
Efecto del anticuerpo anti-CT-1 sobre la inflamación renal
La figura 37 representa los niveles de malondialdehído (MDA) renal en los cuatro grupos experimentales 48 horas después de la I/R. Comparados con el grupo simulado, los ríñones de los ratones sometidos a I/R demostraron un aumento en los niveles de MDA, lo que sugiere un aumento en la peroxidación de lípidos en tejidos renales. Los niveles tisulares de MDA observados en ratones tratados con anti-CT-1 eran significativamente mayores que los observados en el control de solución salina.
La figura 38 representa los niveles de mieloperoxidasa (MPO) renal en los cuatro grupos experimentales 48 horas después de la I/R. Los ríñones de los ratones sometidos a I/R demostraron un aumento significativo en los niveles de MPO comparados con los ratones de operación simulada, lo que sugiere un aumento en la infiltración de PMN en los tejidos renales. Los ríñones de ratones con I/R tratados con anti-CT-1 tenían un nivel significativamente mayor de actividad MPO que los ríñones de los grupos control e IgG control. No se encontraron diferencias significativas en los niveles de MPO renal entre el tejido renal de los ratones control e IgG control.
La figura 39 representa los niveles en plasma de TNF-α en los cuatro grupos experimentales 4 horas después de la I/R. La I/R produjo un aumento significativo de los niveles de TNF-α en suero comparados con los del grupo simulado. La terapia anti- CT-1 produjo cambios no significativos en los niveles de TNF-α en suero comparados con los grupos control e IgG control de I/R.
Efecto del anticuerpo anti-CT-1 sobre la expresión renal de CT-1
La figura 40 representa la expresión renal de CT-1, evaluada por inmunotransferencia en los cuatro grupos experimentales 48 horas después de la I/R. La expresión de CT-1 aumentó en ratones en todos los grupos de I/R comparados con el grupo simulado. El tratamiento con anticuerpo anti-CT-1, produjo un aumento significativo de la expresión de esta proteína cuando se compara con los otros grupos.
Efecto del anticuerpo anti-CT-1 sobre la histología renal
Se tiñeron secciones de los ríñones izquierdos con hematoxilina-eosina y se analizaron por microscopía óptica 48 después de la I/R. El examen histológico demostró arquitectura renal normal en los ratones con operación simulada, pero los que experimentaron I/R mostraron un grado significativo de lesión renal. Específicamente, los ríñones mostraron degeneración de la estructura tubular, dilatación tubular, hinchazón, necrosis de células tubulares y congestión luminal. En las regiones perivasculares era visible un infiltrado inflamatorio. En el grupo anti-CT-1, las secciones cortadas de los ríñones mostraron un marcado aumento en la gravedad de estas características histológicas de lesión renal cuando se comparan con ríñones sometidos solo a I/R. No hubo diferencias en ninguno de los parámetros histológicos anteriores medidos entre los ratones control e IgG control (datos no mostrados).
Efectos del anticuerpo anti-CT-1 sobre la infiltración renal de macrófagos
Se tiñeron secciones de los ríñones izquierdos obtenidos 48 horas después de la I/R con un marcador específico de macrófagos (anticuerpo anti-CD68). Dos días después de la I/R (48 horas tras la isquemia), las células positivas para CD-68 (positivas para ED-1) se expresaban predominantemente en el intersticio alrededor de los túbulos atrofíeos. El número de células positivas para CD68 tras la I/R era significativamente mayor en ratones a los que se administró anti-CT-1 que en los grupos control. No se encontraron diferencias significativas en la infiltración de macrófagos entre los ratones control e IgG control. La tinción de macrófagos era mínima en ríñones del grupo simulado (datos no mostrados).
B. EFECTOS TERAPÉUTICOS DE CT-1 MATERIALES Y MÉTODOS
PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS
Obtención de orina.
Las ratas se colocaron en jaulas metabólicas individuales en las que tenían libre acceso a la comida y a la bebida. Tras dos días de acostumbramiento, se recogió la orina de 24 horas, en probetas graduadas. La orina recogida se centrifugó durante 8 minutos a 2.500 rpm, para limpiarla de restos ajenos a ella, se recogió la orina limpia y se guardó a -80° C para su análisis posterior.
Obtención de sangre y plasma.
Las muestras de sangre se obtuvieron en capilares con heparina mediante un pequeño corte en el extremo de la cola. Se extrajeron cinco capilares por cada rata (200 μΕ), y se centrifugaron los capilares en una microcentrífuga a 11.000 rpm durante tres minutos. Una vez centrifugados, se rompieron los capilares con la ayuda de una lima, por el límite células-plasma. Se extrajo el plasma y se guardó en tubos eppendorf a -80° C para su posterior análisis.
Extracción y procesamiento de los ríñones para histología y Western blot.
Al final de cada experimento, los animales se sacrificaron y se extrajeron los ríñones para estudios post mortem. Antes de la extracción, los ríñones se prefundieron con solución salina heparinizada para retirar la sangre de su árbol vascular. Para ello, las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico por vía intraperitoneal con una dosis de 10 mg/kg de peso. Para acceder a la cavidad abdominal, se hizo una incisión en el abdomen (laparotomía) y se separó la masa intestinal para proceder a canular la aorta, en la bifurcación ilíaca. A través de la cánula se perfundieron 20 mL de solución salina heparinizada a 37° C. Tras esto, los ríñones se desencapsularon, se extrajeron y se seccionaron sagitalmente en dos mitades. Un riñon y la mitad del otro se congelaron instantáneamente por inmersión en nitrógeno líquido, y se conservaron a -80°C para realizar estudios posteriores de Western blot. La otra mitad se introdujo en formaldehído al 4 % tamponado a pH 7 y estabilizado con metanol, para estudios de histología. Una vez fijados en formaldehído, tras permanecer en esta solución durante 24 horas, los ríñones se deshidrataron pasando por una batería de alcoholes de graduación creciente, comenzando con etanol. Posteriormente, cada muestra se incluyó en parafina fundida a 60° en una estufa durante 1 hora, formando bloques en los que se orienta adecuadamente la pieza. Se cortaron secciones de 3 μιη de grosor con un micrótomo (MICRON HM-310) y seguidamente se depositaron los cortes sobre un portaobjetos de vidrio. Los cortes se desparafinaron con xileno y la muestra se rehidrató haciéndola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a 100% de agua destilada.
Preparación del homogenado de tejido para Western blot.
Las muestras de riñon almacenadas en frío a -80°C, se pulverizaron congeladas por percusión entre dos planchas metálicas, manteniéndolas en todo momento en hielo seco para evitar su descongelación y deterioro. A continuación, se pesaron 100 mg de polvo del tejido de cada una de las muestras, con los que se hizo un extracto tisular. Para ello, se homogeneizaron con unos 400 mL de tampón de lisis (NaC1140 mM, EDTA50 mM, gliceroll0%, P-401 %, Tris pH=7,520 mM, leupeptina lmg/ml, aprotinina lmg/ml, fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) 5mmol/l, NaF 5mM y Na3V04 lmmol/1 pH=7,5) por cada 40 mg de polvo de tejido, y con la ayuda de una trituradora (Politrón), se procedió a la homogeneización de las muestras. A continuación, el Usado tisular se centrifugó durante 20 minutos a 14.000 g a 4°C. Finalmente, se recogió el sobrenadante y se congeló a -80°C hasta el momento de su utilización. Una alícuota se utilizó para la determinación de proteínas totales de las muestras utilizando un kit comercial basado en el método colorimétrico de Lowry (Lowry y cois. J Biol Chem. 1951; 193 :265).
ANÁLISIS DE FUNCIÓN RENAL
Determinación de la creatinina y aclaramiento de creatinina
Para medir la función renal se determinaron las concentraciones plasmáticas de creatinina y el aclaramiento de creatinina, que es una medida de la tasa de filtrado glomerular. El aclaramiento de creatinina (CLCr) se calculó a partir de la fórmula CLCr = FU x CrO/CrP, donde FU es el flujo urinario (ml/min), CrO la concentración de creatinina en orina (mg/ml) y CrP la concentración de creatinina en plasma (mg/ml). La concentración de creatinina en orina y en plasma se midió mediante un analizador semiautomático (Reflotron, Roche).
Determinación de la urea plasmática
La concentración de urea en plasma se midió mediante tiras reactivas especificas de un kit comercial, utilizando un analizador semiautomático (Reflotron, Roche).
Determinación de la proteinuria
La concentración de proteínas en orina (proteinuria) se midió por el método colorimétrico de Bradford (Anal Biochem. 1976; 72:248-54). La excreción urinaria de proteínas (EUprot) en 24 horas se calculó mediante la fórmula: EUprot = Cprot x FU24 h, donde Cprot es la concentración de proteínas en orina (mg/mL) y FU24 h el flujo urinario de 24 horas (mL/día). Determinación del flujo urinario
El flujo urinario (mL/día), se valoró midiendo los recipientes graduados que contienen la orina de 24 h en las jaulas metabólicas como se indica en la obtención de orina.
Determinación de la N-acetil glucosaminidasa (NAG)
Para su determinación se utilizó un kit comercial de Roche siguiendo las especificaciones del fabricante, y los resultados se analizaron con el programa informático KC-Junior.
Determinaciones por Western blot de KIM-1 y NGAL.
En la técnica de Western Blot, se cargaron en un gel de poliacrilamida lOC^g de proteína del total del homogenado del tejido renal o un volumen de la orina de cada animal que corresponde a la fracción de excreción. Tras la separación por electroforesis, estas proteínas se transfirieron a una Membrana de PVDF (Inmobilon-P #IPVH00010, Madrid, España), y se hibridaron con anticuerpos contra KIM-1 (R&D Systems) y NGAL (MBL).
Determinación de peróxidos lipidíeos (malonil dialdehído)
La determinación de malonildialdehído se realizó a partir de una técnica espectrofotométrica basada en la reacción de dos moléculas del ácido tiobarbitúrico (TBA) con una molécula de MDA (producto final de la peroxidación lipídica) a 45°C que conduce a un cromóforo estable con un máximo de absorbancia a 532nm. (Recknagel RO, Ghoshal AL, 1966, Exp Mol Pathol 5:413 -426).
Las muestras de tejido se homogeneizaron con un Politrón en solución de homogenado (Fosfato 20mM / NaCl 50mM pH =7,4) en proporción 1 :5 (p:v; mg^L) con perclórico al 70% 1 : 0,05 (p:v; mg/μΕ). Se centrifugó a 4.200 rpm durante 15 minutos. Se tomó el sobrenadante para el ensayo y la determinación de proteínas por el método de Lowry. Se cargaron 200μΕ del sobrenadante en una placa de 96 pocilios. Se realizó la reacción y se midió la absorbancia en el espectrofotómetro a 532 nm. Los resultados se expresaron en micromoles por litro (μιηοΙ/L). Estudios histológicos
Tinción con hematoxilina-eosina.
Esta técnica pone de manifiesto la estructura morfológica de las células del tejido, ya que tiñe de azul el núcleo, las zonas ácidas del citoplasma, y la matriz, y de color rosa el citoplasma y todos sus componentes básicos. Los cortes histológicos renales, preparados como se acaba de indicar, se mantuvieron cuatro minutos en una solución de hematoxilina y seguidamente se lavaron con agua corriente para mantenerlos durante tres minutos en una solución de eosina. Una vez teñidas, las muestras se deshidrataron de nuevo mediante alcoholes de concentración creciente (70°, 90°, 100°) para fijarlas de modo permanente con una gota de Bálsamo de Canadá sobre la que se colocó un cubreobjetos con medio de montaje (Tissue-Tec). Las imágenes se capturaron con una videocámara de alta resolución conectada al microscopio óptico que lleva un objetivo 10X. Se empleó un filtro óptico verde para aumentar el contraste.
Estudios Inmunohistoquímica.
La técnica de inmunohistoquímica se inició al eliminar la señal endógena de los cortes, con peróxido de hidrógeno y metanol al 3%. A continuación, se bloquearon los cortes, y posteriormente se incubaron con los anticuerpos primarios y secundarios. A continuación a las muestras se les añadió el HRP (peroxidasa de rábano picante). Inmediatamente después, se añadió el cromógeno 3,3 '-diaminobenzidina (DAB). Las preparaciones se sumergieron ligeramente en hematoxilina para contrastar. Finalmente, los cortes se deshidrataron mediante una batería de alcoholes de concentración creciente, sobre los que se depositó un cubreobjetos mediante un medio de montaje (Tissue-Tek) para que pudieran observarse en un microscopio óptico.
Determinación de la producción de anión superóxido O?" (SOA)
Para la determinación de los niveles de producción de SOA en el riñon se siguió una técnica modificación de la descrita por Boveris para mitocondrias [Boveris A. Methods Enzymol. 1984; 105: 429-435], basada en la reducción del citocromo C por el radical 02 ". Brevemente: - se preparó una cubeta para espectrometría (cubetas de 1 mi) añadiendolOO μΐ de citocromo C (75 μΜ), 20 μΐ de superóxido dismutasa (SOD; aproximadamente 264 U), 25 μΐ de muestra, y solución tampón (fosfato potásico 0,1 M + EDTA 0, 1 mM; pH 7,8) hasta completar un volumen de 1.000 μΐ;
- se preparó una cubeta de referencia, sin muestra añadida, añadiendo 100 μΐ de citocromo C (75 μΜ), 20 μΐ de SOD, y solución tampón hasta completar un volumen de 1.000 μΐ;
- se preparó otra cubeta similar que no contenía SOD para estudiar la reducción inespecífica del citocromo C;
- la reducción del citocromo C se siguió mediante lecturas espectrofotométricas
[a 550 nm de λ; pH 7,8 y temperatura de 25 °C durante 1 minuto con intervalos cada 6 segundos, en cubetas de 1 mi, con un paso de luz de 1 cm] en 2 fases, 1.- reducción del citocromo C inespecífica (sin SOD), y 2.- reducción del citocromo C dependiente del superóxido (con SOD);
- el incremento de unidades de absorbancia en la mezcla de reacción se convirtió
3 1 1 en nmoles de SOA con el coeficiente de extinción molar: ΔΕ550 / 21,0 x 10 M" cm" ; considerado el supuesto de que el citocromo C en la cubeta de referencia está totalmente oxidado y que el incremento de absorbancia observado representa únicamente la absorbancia del producto reducido, Δ absorbancia: reducido - oxidado;
- de este modo la producción del anión superóxido SOA se expresó en nmol / mg proteína / minuto.
Determinación de la actividad mieloperoxidasa (MPO)
La presencia de mieloperoxidasa, una enzima específica de los neutrófilos utilizada como índice para valorar la infiltración neutrofílica en el riñon, fue analizada en las muestras renales mediante el método siguiente (Mullane KM et al, J Pharmacol Methods 1985, 14(3): 157-167): una vez obtenidas, las muestras fueron pesadas entre hielo y congeladas en nitrógeno líquido siendo posteriormente almacenadas a -80° C hasta su determinación. Posteriormente, las muestras fueron homogeneizadas en una solución compuesta por un tampón de fosfato potásico 50 mM con 0,5% de bromuro de hexadeciltrimetilamonio y 0, 146% de EDTA a un pH de 6,0 y en la proporción de un gramo de tejido por 10 mi de solución de homogeneizado. A continuación fueron homogeneizadas y sometidas a un proceso de sonicación entre hielo 10 veces y cinco segundos cada vez, para de esta forma romper las células, entre ellas los neutrófilos, y dejar la mieloperoxidasa libre en la solución. Este homogeneizado fue centrifugado durante 30 minutos a 15.000 g manteniendo la temperatura en el interior de la centrífuga entre 3 y 4o C. El sobrenadante fue decantado e incubado durante 2 horas a 50° C para eliminar otro tipo de peroxidasas y otros compuestos que interfiriesen en la determinación de la mieloperoxidasa. Se preparó el tampón para el ensayo compuesto por tampón de fosfato potásico 50 mM con 0, 167 mg/ml de diclorhidrato de O- dianisidina y 0,005% de peróxido de hidrógeno a un pH de 6,0. Contra un blanco con el tampón de ensayo se realizó la curva estándar con cantidades conocidas de MPO a 460 nm de longitud de onda (λ) y a 25° C. Se define la unidad (U) de actividad de la mieloperoxidasa como la cantidad de enzima que degrada 1 μπιοΐ de Η202 / minuto a 25° C. Determinación de las citoquinas T Fa, IL-Ιβ, IFN-γ, IL-6 y IL-10
Los niveles de estas citoquinas en plasma, se determinaron mediante ELISA utilizando kits DuoSet ELISA Development System rat conforme a las instrucciones del fabricante. En todos los casos los niveles se expresaron en pg/ml. Principios del ensayo: Es un kit ELISA que emplea múltiples anticuerpos con el principio de "sándwich". En primer lugar se utilizó una placa con 96 pocilios con un anticuerpo monoclonal anti- citoquina adherido en cada uno de ellos para capturar la citoquina presente en las muestras y estándares que se añadieron por duplicado en cada uno de los pocilios junto con los blancos correspondientes. Después de lavar la placa para eliminar el material no adherido, se añadió una peroxidasa conjugada policlonal anti -citoquina A continuación la placa fue lavada de nuevo para eliminar el material no adherido y se agregó la solución sustrato que inició la catalización de la peroxidasa. El cambio de color se detuvo por acidificación.
La absorbancia fue medida a 450 nm λ siendo los resultados obtenidos proporcionales a las cantidades de citoquinas de las muestras, las cuales fueron calculadas por interpolación con la curva estándar. 1. Estudio del efecto de la cardiotrofina-1 en la nefropatía inducida por agentes de contraste
Se utilizó un modelo experimental de nefropatía por contraste yodado, consistente en la administración intravenosa del contraste yodado Gastrografin (Bayer C.N. 909622 EXO) a ratas predispuestas a sufrir un fracaso renal agudo. La predisposición se lograba mediante el tratamiento previo con gentamicina a dosis subtóxicas (Quirós y cois, Kidney Int. 2010; 78: 1006-1015). El experimento se realizó en 32 ratas Wistar macho de alrededor de 220 gramos de peso. Las condiciones ambientales de los animales se mantuvieron constantes: la temperatura de unos 20°C, la humedad del 60% aproximadamente, y el tiempo diario de luz (fotoperiodo) de 12 horas. En el diseño del estudio se plantearon seis grupos experimentales:
- Grupo control (C): ratas a las que se administró solución salina (n= 5).
- Grupo Gentamicina (G): ratas a las que se administró gentamicina i.p. (50 mg/kg/día) durante 6 días, comenzando 6 días antes de la administración del contraste. Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado que este tratamiento no produce ningún cambio detectable en la función renal ni lesión tubular incluso utilizando los marcadores más finos existentes hasta la fecha (Quirós y cois, 2010) (n= 5).
- Grupo Cardiotrofina (CT-1): ratas a las que se administró cardiotrofina i.v. (100 μg/Kg/día) el día antes de la administración del contraste y en los cuatro días posteriores (n= 5).
- Grupo Gastrografin (Gg): ratas a las que se administró una única dosis de agente yodado i.v. (10 mL/Kg; 3,7 mg/Kg) (n= 5).
- Grupo Gastrografin + Gentamicina (Gg+G): ratas a las que se administró el agente yodado al día siguiente de finalizar el tratamiento con gentamicina (n= 6).
- Grupo Gastrografin + Gentamicina + Cardiotrofina (Gg+G+CT-1): ratas a las que se administró el agente yodado, la gentamicina y cardiotrofina (n= 6). Los animales se estabularon en jaulas metabólicas con el fin de recoger la orina libre de heces. Asimismo, cada día se obtuvo una muestra de sangre (0, 150 mi) de la cola en capilares heparinizados. Al final de los experimentos (cuatro días después de la administración del contraste yodado) las ratas se anestesiaron y, posteriormente, se perfundieron con solución salina heparinizada. Se obtuvieron los ríñones de estos animales y una parte de las muestras se introdujo en formol para realizar estudios histológicos mientras que otra parte se ultracongeló para los estudios realizados en tejido.
Los estudios realizados fueron los siguientes:
• Creatinina plasmática, Urea plasmática, proteinuria, microalbuminuria
• Aclaramiento de creatinina enjaulas metabólicas
• Tasa de filtración glomerular (TFG; aclaramiento de inulina), flujo plasmático renal (FPR; aclaramiento de ácido para amino hipúrico), resistencia vascular renal (RVR).
• Marcadores urinarios de nefrotoxicidad: NAG (N-acetil glucosaminidasa), LDH (lactato deshidrogenasa), GGT (gamma glutamiltransferasa), KXM-1 (Kidney Injury Molecule 1), PAI-1 (inhibidor 1 del activador del plasminógeno), Vimentina. Supervivencia
En los grupos C, G-, Gg y CT-1 sobrevivieron todos los animales hasta el final del experimento. En los grupos Gg+G- y Gg+G+CT-1, murió un animal de cada uno.
Estado general y evolución del peso corporal
Los animales de los grupos C, G- y CT-1 presentaron un aspecto saludable y una movilidad normal durante todo el experimento. Sin embargo, los animales tratados con Gastrografin mostraron un aspecto más deteriorado y las patas distendidas, que se recuperaban en 15-20 minutos después de su administración. A pesar de ello, no hubo diferencias importantes en los incrementos de peso entre los grupos experimentales (Figura 1). Función renal
El grupo Gg+G produjo una disminución del aclaramiento de creatinina (como índice del estado de la filtración glomerular), que se tradujo en una disminución de la excreción y, por lo tanto, una acumulación en la sangre de productos del metabolismo como la creatinina, la urea y sus derivados (medidos en conjunto como concentración plasmática de urea) (Figuras 2-4). Así mismo, la administración conjunta de Gg+G se acompañó de una elevada proteinuria (Figura 5).
La administración de CT-1 (grupo Gg+G+CT-1) revirtió parcialmente la disminución del aclaramiento de creatinina, el aumento de la concentración plasmática de creatinina, de urea y la proteinuria (Figuras 2-5). La administración de gentamicina, gastrografin y CT-1 solos, no alteró ninguno de estos parámetros (Figuras 2-5).
Marcadores urinarios de nefrotoxicidad
La NAG es una enzima lisosomal que se utiliza en el diagnóstico y seguimiento de nefropatías. Su presencia en la orina aumenta como consecuencia del daño renal y se considera un marcador de daño tubular. Nuestros resultados muestran que la NAG se incrementó en animales tratados con Gg+G. La CT-1 redujo este incremento de manera similar a la proteinuria, lo que corrobora los hallazgos relacionados con el daño tubular (Figura 6).
KTM-1 es una proteína de membrana tipo I, que se ha desarrollado como un marcador precoz más sensible que la NAG. Durante el daño tubular, el dominio extracelular de KTM-1 es escindido y se detecta aumentado en la orina como marcador muy temprano de daño. En la figura 7 puede observarse como el tratamiento conjunto de Gg+G induce un claro aumento de las bandas reactivas al anticuerpo de anti-KTM-1 en la orina. La gentamicina, el gastrografin y CT-1 no producen ningún efecto en comparación con los controles. Por su parte, la CT-1 disminuye de forma apreciable el aumento de expresión de KTM-1 que produce el tratamiento conjunto de Gg+G.
El inhibidor 1 del activador del plasminógeno (PAI-1, por sus siglas en inglés), es un inhibidor del proceso de fibrinolisis que está involucrado en respuestas inflamatorias y de reparación tisular. Su expresión se ve incrementada en muchos tipos celulares como consecuencia de la acción de mediadores de la inflamación. También aumenta como consecuencia del daño renal crónico y agudo. Nuestros resultados indican que la expresión de PAI-1 está claramente aumentada en la orina de animales a los que se les administró el contraste y estaban previamente sensibilizados (grupo Gg+G). Estos resultados sugieren que en este grupo experimental se produce una lesión en la que parecen estar implicados procesos inflamatorios, tal vez como respuesta reparadora frente al daño. Los niveles de este marcador en las ratas tratadas con gentamicina, gastrografin o CT-1, no son diferentes de los animales del grupo control. En el grupo Gg+G+CT-1 no aparece tampoco el marcador, lo que evidencia un efecto protector de la CT-1 (Figura 7).
Aclaramiento renal agudo
En los resultados obtenidos del aclaramiento de inulina se evidencia una disminución de la tasa de filtración glomerular (TFG) en el grupo tratado con gentamicina y el contraste yodado (Gg+G), que es revertida con CT-1 (Figura 8). El flujo plasmático renal (FPR) sigue un patrón similar: descenso en los grupos tratados con gentamicina y el contraste, y reversión en el cotratamiento con CT-1 (figura 9). Por otra parte, la administración de gentamicina y gastrografin aumentó las resistencias vasculares renales (RVR) (Figura 10), lo que podría sugerir la implicación de liberación de factores vasoconstrictores (o la inhibición del efecto de factores vasodilatadores) que dificultarían el paso de sangre a través del riñon, dato ya descrito para este tipo de agentes. La coadministración de CT-1 con gentamicina y gastrografin contrarrestó el aumento de la RVR. 2. Estudio del efecto de la cardiotrofina-1 en el daño renal agudo producido por el cisplatino
El experimento se realizó en 24 ratas Wistar macho de alrededor de 220 gramos de peso. Las condiciones ambientales de los animales se mantuvieron constantes: la temperatura de unos 20°C, la humedad del 60% aproximadamente, y el tiempo diario de luz (fotoperiodo) de 12 horas. Todos los procedimientos relacionados con los animales y su cuidado se han regido conforme a las directrices institucionales de la Universidad de Salamanca, y en cumplimiento con las leyes nacionales (Ley 121/000123/2007/España; RD 1201/2005/CyL) e internacionales (Directiva 2003/65/CE).
Los animales se dividieron en 4 grupos experimentales, comprendiendo 6 ratas por grupo. El tratamiento diario durante 7 días con cardiotrofina-1 se inició un día antes del tratamiento único con cisplatino. El diseño experimental se desarrolló como se describe a continuación:
- Grupo I {Control, C, n=6 animales) animales tratados con vehículo vía i.v. durante 7 días.
Grupo II (Cardiotrofina-1, CT-1, n=6 animales) animales a los que se les administró una dosis diaria de cardiotrofina-1 de 100 μg/kg peso corporal vía i.v. durante 7 días.
- Grupo III (Cisplatino, P, n=6 animales) animales que recibieron una dosis única de cisplatino de 6 mg/kg peso corporal vía i.p.
Grupo IV (Cardiotrofina-l-Cisplatino, CT1-P, n=6 animales) animales tratados con cardiotrofina-1 y cisplatino a las mismas dosis y vías de administración que los grupos II y III respectivamente.
Supervivencia
La supervivencia de los animales representa un dato significativo en la evolución de un estudio toxicológico. La Figura 11 representa la supervivencia de los animales en los cuatro grupos de estudio durante el periodo experimental.
El tratamiento con cardiotrofina-1, cisplatino a la dosis de 6 mg/kg y cisplatino- cardiotrofina no modifica la supervivencia de los animales durante todo el periodo experimental, respecto al grupo control (Figura 11). Estado general y peso corporal
El estado general, así como el peso corporal de los animales, es un aspecto importante en la valoración visual del efecto de los fármacos. La figura 12 representa el peso corporal de los animales en los cuatro grupos de estudio durante el periodo experimental.
El tratamiento antineoplásico con cisplatino a la dosis de 6 mg/kg induce una disminución significativa en el peso corporal de los animales, siendo esta reducción significativamente menor en el grupo de animales tratados conjuntamente con cardiotrofina-1. Este hecho se corrobora con la evaluación externa del estado físico de los animales, en el que se aprecia un sustancial deterioro como consecuencia del tratamiento antitumoral y una espectacular mejora durante la coadministración de cardiotrofina-1. Por su parte, el grupo cardiotrofina-1 evidencia un incremento en el peso corporal a lo largo de todo el periodo de estudio, sin diferencias aparentes respecto al grupo control (Figura 12).
Flujo urinario
La evolución del flujo urinario representa un dato adicional e incluso revelador del daño renal producido por un tratamiento farmacológico. La figura 13 representa la evolución del flujo urinario de los animales objeto de estudio en los cuatro grupos de tratamiento experimental. El tratamiento citostático con cisplatino a la dosis de 6 mg/kg induce una ligera poliuria bifásica. Sin embargo, la administración conjunta de cardiotrofina-1 y cisplatino muestra una evolución constante en el flujo urinario durante el periodo experimental, sin diferencias significativas respecto a los grupos control y cardiotrofina- 1. Este hecho pone de manifiesto una clara nefroprotección de la cardiotrofina-1 en la nefropatía por cisplatino (Figura 13). Función renal básica
La determinación de la creatinina plasmática, como parámetro seguro y eficaz de funcionalidad renal, representa un marcador característico de nefrotoxicidad por fármacos. La figura 14 representa la evolución de la creatinina plasmática en los cuatro grupos experimentales de animales durante el periodo de estudio. El tratamiento antineoplásico con cisplatino a la dosis de 6 mg/kg induce un marcado incremento en la creatinina plasmática, principalmente a partir del día 2 post-tratamiento citostático, siendo este aumento significativamente menor en el grupo de animales tratados conjuntamente con cardiotrofina-1. Este hecho determina un daño renal agudo reversible por cisplatino, en el que el tratamiento intravenoso de 100 μg/kg de cardiotrofina-1 durante 7 días consecutivos es capaz de proteger y revertir la nefrotoxicidad inducida por este fármaco antitumoral. Por su parte, el grupo cardiotrofina-1 no refleja cambios en dicho parámetro renal evaluado, respecto al grupo control (Figura 14).
Peso de los órganos
La evaluación del peso de diferentes órganos constituye un dato complementario al estudio de la actividad tóxica de un fármaco. La figura 15 refleja el peso de diferentes órganos (respecto al peso corporal del animal) en los cuatro grupos de estudio, al final del periodo experimental.
El tratamiento antitumoral con cisplatino a la dosis de 6 mg/kg produce un significativo incremento en el peso final del riñon, siendo este aumento sustancialmente menor en el grupo de animales tratados conjuntamente con cardiotrofina-1 (Figura 15, panel superior izquierdo). Este hecho corrobora de nuevo la protección renal ejercida por el tratamiento con cardiotrofina-1 en el daño tóxico agudo por cisplatino. No obstante, el peso final del resto de órganos evaluados (corazón, pulmones e hígado) no muestra cambios significativos respecto al grupo control, apoyando la teoría de la nefrotoxicidad característica del cisplatino y el efecto protector de la cardiotrofina-1. Por su parte, el grupo cardiotrofina-1 no evidencia cambios en la evolución del peso corporal, respecto al grupo control (Figura 15). 3. Estudio del efecto de la cardiotrofina-1 en el daño renal agudo producido por la gentamicina
Grupos experimentales:
a) Control (C): vehículo 1 vez al día i.v. (n=6).
b) CT-1 : CT-1 (100 μg/kg/día, i.v.), durante 7 días. (n=6).
c) G: gentamicina (150 mg/kg/día, i.p.) durante 6 días. (n=6). d) G+CT-1 : CT-1 (100 μg/kg/día, i.v.), durante 7 días y, a partir del segundo día, simultáneamente gentamicina (150 mg/kg/día, i.p.) durante 6 días. (n=6).
Supervivencia
En los grupos control (C) y CT-1 sobrevivieron todos los animales hasta el final del experimento. En los grupos G y G+CT-1, murió un animal de cada uno.
Estado general y evolución del peso corporal
Los animales de los grupos control (C) y CT-1 presentaron un aspecto saludable y una movilidad normal durante todo el experimento. Sin embargo, los animales tratados con gentamicina mostraron un aspecto más deteriorado, movilidad reducida y ligera coloración del pelo. Estos síntomas se redujeron significativamente en los animales del grupo G + CT-1. Como se aprecia en la figura 16, el peso corporal de las ratas que recibieron G mostró una ligera disminución con respecto a las de los grupos control y CT-1. La CT-1 mitigó parcialmente la pérdida de peso producida por la G.
Presión arterial y frecuencia cardíaca
En los grupos control (C) y G, la presión arterial sistólica (PAS) aumentó ligeramente como consecuencia de la experimentación. Este ligero aumento no se observó en los grupos que recibieron CT-1 (Figura 17, panel superior). La frecuencia cardíaca se incrementó muy ligeramente y por igual en todos los grupos a lo largo del experimento (Figura 17, panel inferior).
Peso de los órganos
En el momento del sacrificio, el peso del riñon derecho y del corazón (con respecto al peso corporal) no se había modificado como consecuencia de los tratamientos. En el caso del hígado, la CT-1 indujo una cierta hepatomegalia que desapareció en el grupo cotratado con G (G + CT-1). La G per se, también mostró una tendencia a la reducción del peso relativo del hígado que contrarrestó el efecto hipertrófico de la CT-1. Sin embargo, la CT-1 indujo una marcada esplenomegalia que no se modificó por el cotratamiento con G (Figura 18). Función renal
La G produjo un claro fracaso renal agudo que se puso de manifiesto por una acumulación en la sangre de productos del metabolismo como la urea y sus derivados (medidos en conjunto como concentración plasmática de urea) y la creatinina (Figuras 19 y 20) y una drástica disminución del aclaramiento de creatinina (como medida de la tasa de filtración glomerular) (Figura 21). Así mismo, la G produjo una elevada proteinuria (Figura 22) que, de acuerdo con la literatura especializada sobre la nefrotoxicidad de este antibiótico, es de origen tubular, y resulta del daño y las alteraciones funcionales de este compartimiento. La administración de CT-1 junto con la G revirtió parcialmente la disminución del aclaramiento de creatinina, el aumento de la concentración plasmática de creatinina y urea, y la proteinuria (Figuras 19-22). La CT-1, administrada sola, no alteró ninguno de estos parámetros (Figuras 19-22).
Ni la G ni la CT-1, administradas por separado, modificaron el flujo urinario con respecto a los animales del grupo control (C). Sin embargo, la administración conjunta de estos dos compuestos produjo un efecto sinérgico que incrementó progresivamente el flujo urinario, hasta alcanzar valores 3-4 veces superiores a los del resto de los grupos (Figura 23). Integridad tisular renal
El estado del tejido renal como consecuencia de la acción de la G y la CT-1 se determinó mediante estudios histológicos de secciones renales, y mediante la determinación de marcadores tisulares y urinarios asociados a los procesos de daño y reparación tisular. Como se muestra en la Figura 24, que presenta imágenes representativas de la corteza renal, la gentamicina causa una necrosis tubular masiva en la zona cortical del riñon, en el que se observan muchos túbulos completamente necrosados y otros parcialmente necrosados, en coincidencia con el conocimiento sobre el efecto renal de este fármaco. El cotratamiento con CT-1 previene de forma moderada y parcial la extensión del daño tubular, observándose menos túbulos completamente y parcialmente necrosados. Sin embargo, aún con el cotratamiento con CT-1, la gentamicina produce un marcado daño tubular. Estos resultados son, en términos generales, coincidentes con el análisis bioquímico de marcadores de daño y reparación renal. Así, como se aprecia en la Figura 25, la excreción urinaria de N-acetil glucosaminidasa (NAG), una enzima lisosomal que marca entre otras cosas el daño tubular, está muy incrementada en los animales tratados con G, en concordancia con el intenso daño que produce en ese compartimiento. La CT-1 reduce este incremento de excreción de NAG, especialmente el submáximo que se produce durante los primeros días del daño. El perfil del efecto de la CT-1 en la excreción de NAG es casi idéntico al de la proteinuria, lo que refuerza los resultados relacionados con el daño tubular.
En la Figura 26 se observa cómo el tratamiento con G induce un claro aumento de los niveles renales de KTM-1, así como de bandas reactivas al anticuerpo de anti KTM-1 en la orina. La CT-1 no produce ningún efecto en comparación con los controles. Sin embargo, puede apreciarse que la CT-1 no disminuye de forma apreciable el aumento de expresión de KTM-1 en el riñon que produce la G. Esto podría indicar, entre otras cosas, que el proceso de regeneración sigue igual de activo que en los animales tratados con la G. Sin embargo, se observa que disminuye parcialmente la banda superior (aprox. 90 kDa) de KTM-1 en la orina, lo que sería congruente con una reducción parcial del daño.
NGAL (del inglés "Neutrophil Ge latinase -Associated Lipocalin ") es una lipocalina relacionada con los procesos inflamatorios. Se ha detectado aumentada en diversas formas de daño renal, tanto en el tejido como en la orina, y se ha propuesto como uno de los marcadores más tempranos y sensibles del daño renal. En la Figura 26 se puede apreciar que tanto la G como la CT-1 inducen un aumento de la NGAL renal y urinaria. 4. Estudio del efecto de la cardiotrofina-1 en el daño renal agudo producido por isquemia/reperfusión renal
La isquemia/reperfusión renal (LR) es una causa habitual de fracaso renal agudo y en trasplante renal puede causar necrosis tubular aguda o retraso inicial de la función del injerto o función renal retardada (FRR). La I/R se ha correlacionado con la incidencia de rechazo agudo (Matas AJ. et al. Transplantation. 2000; 69(1): 54-58) y las evidencias clínicas y experimentales han identificado también al daño por I/R como un factor de riesgo del fallo renal crónico del aloinjerto.
Se ensayaron 11 grupos de animales, cada uno de ellos formado por 5 ratas que fueron sometidas a 60 minutos de isquemia renal izquierda.
1. IR4h C. Suero salino. 4 horas de reperfusión.
2. IR4h CT-1. 400 μg/kg. 4 horas de reperfusión.
3. IR24h C. Suero salino. 24 horas de reperfusión.
4. IR24h CT-1. 400 μg/kg. 24 horas de reperfusión.
5. IR3d C. Suero salino. 3 días de reperfusión.
6. IR3dCT-l . 400 μg/kg. 3 días de reperfusión.
7. IR7d C. Suero salino. 7 días de reperfusión.
8. IR7d CT-1. 400 μg/kg. 7 días de reperfusión.
9. HU4d C. Suero salino. 14 días de reperfusión.
10. HU4d CT-1. 400 μg/kg. 14 días de reperfusión.
11. Grupo de ratas simulado (Sim).
Treinta minutos después del establecimiento de la isquemia, se administró a las ratas a través de la vena peneana 500 μΐ de suero salino (grupos IR C) o 400 μg/kg de CT-1 en 500 μΐ de suero salino (grupos IR CT-1). Como grupo simulado se incluyeron animales sometidos a nefrectomía derecha.
Supervivencia
Se realizó un estudio de supervivencia con la finalidad de examinar el efecto protector de CT-1 frente al daño renal por I/R. 14 días después de la I/R, el grupo isquémico no tratado (IR14d C) mostró un 40% de mortalidad, mientras que en el grupo IR14d CT-1 murieron el 20% de los animales (Figura 27).
Función renal
48 horas después de la I/R, la creatinina plasmática era marcadamente más elevada en animales con IR que en animales del grupo simulado (Sim), mientras que en el grupo IR CT-1, la creatinina plasmática era marcadamente más baja que en IR C, y sin diferencias significativas con respecto a ratas del grupo simulado (Sim). (Figura 28A). A las 48 horas de la LR, el aclaramiento de creatinina fue marcadamente inferior en el grupo IR C que en los animales del grupo simulado, mientras que en las ratas IR CT-1 fue significativamente superior que en animales IR C (Figure 28 B). Determinación de la producción de anión superóxido 02 ~ (SOA)
Cuatro horas después del restablecimiento del flujo sanguíneo, los niveles renales de anión superóxido (SOA) fueron significativamente superiores en el grupo control isquémico (IR C) que en los grupos simulado e IR CT-1. Los datos del grupo CT-1 fueron significativamente inferiores que los del grupo control isquémico (IR C), pero significativamente mayores que los del grupo simulado (Figura 29). Puesto que la infiltración de neutrófilos y macrófagos es una etapa clave en la inflamación tisular inducida por I/R, se midió la actividad mieloperoxidasa (MPO) en tejido renal. Los niveles renales de la actividad mieloperoxidasa (MA) fueron más de 5 veces superiores en el grupo control isquémico (IR C) que en el grupo simulado, y también fueron significativamente mayores en el grupo control isquémico que en el grupo CT-1. Los animales del grupo IR CT-1 tenían valores similares a los obtenidos en el grupo simulado (Figura 30).
Determinación de la producción de citoquinas proinflamatorias
La reperfusión isquémica indujo un gran aumento en los niveles plasmáticos de citoquinas proinflamatorias a las 4 horas de la reperfusión. Los niveles de TNF-a (Figura 31 A), IL-Ιβ (Figura 3 IB) y IFN-γ (Figura 31C) fueron 11, 6 y 4 veces superiores, respectivamente, en el grupo IR C que en el grupo simulado. El tratamiento con CT-1 bloqueó la elevación de estas tres citoquinas inducida por IR. Por otra parte, los niveles plasmáticos de IL-6 (Figura 3 ID) e IL-10 (Figura 31E) disminuyeron después de la isquemia y reperfusión. Esta disminución no se observó en animales que recibieron CT-1 (Figuras 3 ID y 31E).
Integridad tisular renal
Los estudios histológicos revelaron que, 24 horas después de la reperfusión, los ríñones isquémicos control mostraban abundantes células obstruidas por un residuo hialino formado por células tubulares necróticas, así como por muchas células tubulares vacuolizadas. Los túbulos obstruidos y células vacuolizadas fueron menos abundantes en los ríñones tratados con CT-1 que en los ríñones control (Figura 32). 48 horas después de la reperfusión, los ríñones isquémicos control mostraron muchos túbulos denudados y muchas áreas con infiltrado inflamatorio. Los túbulos denudados y la infiltración fue menos abundante en los ríñones tratados con CT-1 que en los ríñones control (Figura 33).
CONCLUSIONES La administración de un anticuerpo anti-CT-1 induce un aumento significativo en la gravedad del daño renal agudo en ratones sometidos a isquemia/reperfusión (I/R), fomentando procesos inflamatorios, como resultado del bloqueo de CT-1. Los resultados obtenidos en la sección A refuerzan el papel de CT-1 en la protección del riñon del daño renal inducido por I/R.
Los resultados obtenidos nos permiten afirmar que la CT-1 recombinante humana administrada por vía intravenosa (100 μg/kg/día), en nuestro modelo experimental de nefropatía de contraste en animales sensibilizados con gentamicina, reduce el deterioro de la función excretora renal y la intensidad del daño tubular. Además, la CT-1 pudiera proteger de los efectos vasculares y glomerulares implicados en la nefrotoxicidad inducida por el contraste.
Por lo que se refiere al estudio de nefrotoxicidad aguda por fármacos, y concretamente por fármacos antineoplásicos como el cisplatino, los resultados nos permiten concluir que:
1. El tratamiento con cisplatino, a la dosis única de 6 mg/kg por vía intraperitoneal, en ratas Wistar macho es un modelo experimental in vivo adecuado para el estudio de la nefrotoxicidad aguda por fármacos.
2. La administración de cardiotrofina-1 de rata, a la dosis de 100 μg/kg/día por vía intravenosa durante 7 días, ejerce un efecto protector del daño renal inducido por cisplatino a la dosis de 6 mg/kg. En lo referente al estudio de nefrotoxicidad aguda inducida por gentamicina, los resultados demuestran que la CT-1 recombinante humana administrada por vía intravenosa (100 μg/kg/día, durante 7 días -un día antes de empezar el tratamiento con G y durante todo él-) tiene un efecto protector del daño renal agudo que produce la gentamicina en las ratas Wistar. La CT-1 reduce el deterioro de la función excretora renal y la intensidad del daño tubular renal inducidos por gentamicina.
Por lo que se refiere al modelo de daño renal agudo inducido por isquemia/reperfusión la administración de CT-1 previene del daño renal agudo, de la disminución de la función renal, del estrés oxidativo y de la inflamación inducidos por la isquemia y posterior reperfusión.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 (CT-1) para su uso en la prevención y/o el tratamiento del daño renal agudo, en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se selecciona del grupo de:
(i) cardiotrofina-1 (CT-1) o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(ii) un polinucleótido que codifica CT-1 o una variante funcionalmente equivalente de CT-1 que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(iii) un vector que comprende un polinucleótido según (ii), y
(iv) una célula capaz de secretar al medio cardiotrofina-1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1.
Un compuesto para su uso según la reivindicación 1, en donde el daño renal agudo se selecciona del grupo de daño renal agudo de causa pre-renal y daño renal agudo de causa renal.
Un compuesto para su uso según la reivindicación 2 en donde el daño renal agudo es de causa pre-renal.
Un compuesto para su uso según la reivindicación 3 en donde el daño renal agudo de causa pre-renal se selecciona de daño renal agudo causado por exposición de un sujeto a isquemia y daño renal agudo causado por isquemia seguida de reperfusión.
5. Un compuesto para su uso según la reivindicación 2 en donde el daño renal agudo es de causa renal.
6. Un compuesto para su uso según la reivindicación 5 en donde el daño renal agudo de causa renal está causado por un agente nefrotóxico.
7. Un compuesto para su uso según la reivindicación 6 en donde el agente nefrotóxico se selecciona del grupo de agentes de contraste, antibióticos, agentes inmunosupresores y agentes antineoplásicos.
8. Un compuesto para su uso según la reivindicación 7 en donde el agente de contraste se selecciona del grupo de un agente de contraste que contiene yodo, un agente de contraste que contiene bromo, un agente de contraste que contiene bario, un agente de contraste que contiene gadolinio y combinaciones de los mismos.
9. Un compuesto para su uso según la reivindicación 8 en donde el agente de contraste contiene yodo.
10. Un compuesto para su uso según la reivindicación 9 en donde el agente de contraste que contiene yodo se selecciona del grupo de ácido diatrizoico y sus sales, ácido metrizoico y sus sales, ácido ioxáglico y sus sales, ácido iotalámico y sus sales, iopamidol, iohexol, ioxilano, iopromida, ioversol, iodixanol, metrizamida y combinaciones de los mismos.
11. Un compuesto para su uso según la reivindicación 10 en donde el agente de contraste que contiene yodo es una o más sales de diatrizoato.
12. Un compuesto para su uso según la reivindicación 11 en donde el agente de contraste que contiene yodo es una combinación de diatrizoato sódico y diatrizoato de meglumina.
13. Un compuesto para su uso según la reivindicación 7 en donde el antibiótico se selecciona del grupo de aminoglucósidos y cefalosporinas.
14. Un compuesto para su uso según la reivindicación 13 en donde el antibiótico aminoglucósido se selecciona del grupo de gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, kanamicina, estreptomicina, sisomicina, neomicina y combinaciones de los mismos.
15. Un compuesto para su uso según la reivindicación 14 en donde el antibiótico aminoglucósido es gentamicina.
16. Un compuesto para su uso según la reivindicación 7 en donde el agente inmunosupresor se selecciona de ciclosporina A, tacrolimus (FK506) y everolimus.
17. Un compuesto para su uso según la reivindicación 7 en donde el agente antineoplásico se selecciona del grupo de un compuesto basado en platino, un antimetabolito, un agente alquilante de ADN, un inhibidor de topoisomerasa I o II, y una combinación de los mismos.
18. Un compuesto para su uso según la reivindicación 17 en donde el compuesto basado en platino se selecciona del grupo de cisplatino, carboplatino y una combinación de los mismos.
19. Un compuesto para su uso según la reivindicación 18 en donde el compuesto es cisplatino.
20. Un compuesto para su uso según la reivindicación 17 en donde el antimetabolito se selecciona del grupo de metotrexato, pentostatina, 5-azacitidina, hidroxiurea y una combinación de los mismos.
21. Un compuesto para su uso según la reivindicación 17 en donde el agente alquilante de ADN se selecciona del grupo de carmustina, lomustina, semustina, ifosfamida, mitomicina C y una combinación de los mismos.
22. Un compuesto para su uso según la reivindicación 17 en donde el inhibidor de topoisomerasa I o II se selecciona del grupo de etopósido, tenipósido, doxorubicina y una combinación de los mismos.
23. Un compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 22 en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se co-administra junto con el agente nefrotóxico.
24. Un compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se administra por vía intravenosa.
25. Un compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 es la CT-1 de origen humano de SEQ ID NO: 1.
26. Un compuesto para su uso según la reivindicación 25 en donde la cardiotrofina-1 se administra en una dosis de 100 μg/kg al día.
27. Un compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 reduce el deterioro de la función excretora renal.
28. Un compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la administración del compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se realiza en ausencia de un receptor soluble de un miembro de la familia de IL-6 o un fragmento del mismo.
29. Un compuesto para su uso según la reivindicación 28 donde el receptor soluble es el receptor de CT-1 o un fragmento del mismo.
30. Un compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la administración del compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se realiza en ausencia de un factor de crecimiento mesenquimal metanéfrico.
31. Una composición que comprende, juntos o separados, un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente nefrotóxico.
32. Una composición según la reivindicación 31 en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se selecciona del grupo de:
(i) cardiotrofina-1 (CT-1) o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1,
(ii) un polinucleótido que codifica CT-1 o una variante funcionalmente equivalente de CT-1 que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1, (iii) un vector que comprende un polinucleótido según (ii), y
(iv) una célula capaz de secretar al medio cardiotrofina-1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma que presenta, al menos, un 60% de identidad con CT-1.
33. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 31 o 32 en donde el agente nefrotóxico se selecciona del grupo de agentes de contraste, antibióticos, agentes inmunosupresores y agentes antineoplásicos.
34. Una composición según la reivindicación 33 en donde el agente de contraste se selecciona del grupo de un agente de contraste que contiene yodo, un agente de contraste que contiene bromo, un agente de contraste que contiene bario, un agente de contraste que contiene gadolinio y combinaciones de los mismos.
35. Una composición según la reivindicación 34 en donde el agente de contraste contiene yodo.
36. Una composición según la reivindicación 35 en donde el agente de contraste que contiene yodo se selecciona del grupo de ácido diatrizoico y sus sales, ácido metrizoico y sus sales, ácido ioxáglico y sus sales, ácido iotalámico y sus sales, iopamidol, iohexol, ioxilano, iopromida, ioversol, iodixanol, metrizamida y combinaciones de los mismos.
37. Una composición según la reivindicación 36 en donde el agente de contraste que contiene yodo es una o más sales de diatrizoato.
38. Una composición según la reivindicación 37 en donde el agente de contraste que contiene yodo es una combinación de diatrizoato sódico y diatrizoato de meglumina.
39. Una composición según la reivindicación 33 en donde el antibiótico se selecciona del grupo de aminoglucósidos y cefalosporinas.
40. Una composición según la reivindicación 39 en donde el antibiótico aminoglucósido se selecciona del grupo de gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, kanamicina, estreptomicina, sisomicina, neomicina y combinaciones de los mismos.
41. Una composición según la reivindicación 40 en donde el antibiótico aminoglucósido es gentamicina.
42. Una composición según la reivindicación 33 en donde el agente inmunosupresor se selecciona de ciclosporina A, tacrolimus (FK506) y everolimus.
43. Una composición según la reivindicación 33 en donde el agente antineoplásico se selecciona del grupo de un compuesto basado en platino, un antimetabolito, un agente alquilante de ADN, un inhibidor de topoisomerasa I o II, y una combinación de los mismos.
44. Una composición según la reivindicación 43 en donde el compuesto basado en platino se selecciona del grupo de cisplatino, carboplatino y una combinación de los mismos.
45. Una composición según la reivindicación 44 en donde el compuesto es cisplatino.
46. Una composición según la reivindicación 43 en donde el antimetabolito se selecciona del grupo de metotrexato, pentostatina, 5-azacitidina, hidroxiurea y una combinación de los mismos.
47. Una composición según la reivindicación 43 en donde el agente alquilante de ADN se selecciona del grupo de carmustina, lomustina, semustina, ifosfamida, mitomicina C y una combinación de los mismos.
48. Una composición según la reivindicación 43 en donde el inhibidor de topoisomerasa I o II se selecciona del grupo de etopósido, tenipósido, doxorubicina y una combinación de los mismos.
49. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 48 en donde la composición se administra de forma simultánea, separada o secuencial.
50. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 49 en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 se administra por vía intravenosa.
51. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 50 en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 es la CT-1 de origen humano de SEQ ID NO: 1.
52. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 51 en donde el compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 reduce el deterioro de la función excretora renal.
53. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 52 que no comprende un receptor soluble de un miembro de la familia de IL-6 o un fragmento del mismo.
54. Una composición según la reivindicación 53 donde el receptor soluble es el receptor de CT-1 o un fragmento del mismo.
55. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 54 que no comprende un factor de crecimiento mesenquimal metanéfrico.
56. Una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente de contraste para su uso como un agente diagnóstico.
57. Una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un antibiótico para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al antibiótico.
58. Una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente inmunosupresor para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al agente inmunosupresor.
59. Una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente antineoplásico para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la nefrotoxicidad asociada al agente antineoplásico.
60. Uso de una composición que comprende un compuesto que induce la actividad cardiotrofina-1 y un agente de contraste para la preparación de un agente diagnóstico.
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