CN103857407A - 心肌营养素-1治疗肾脏疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及心肌营养素-1(CT-1)用于预防和/或治疗急性肾损伤的用途，特别是肾毒性剂（例如造影剂、抗生素、免疫抑制剂或抗肿瘤剂）诱导的急性肾损伤。本发明还涉及包含所述肾毒性剂和心肌营养素-1的组合物。

Description

心肌营养素-1治疗肾脏疾病的用途

技术领域

本发明涉及心肌营养素-1（CT-1）用于预防和/或治疗急性肾损伤的用途，特别是肾毒性剂诱导的急性肾损伤。同样地，本发明还涉及包含所述肾毒性剂和心肌营养素-1的组合物。

背景技术

急性肾损伤（AKI）是各种肾脏结构损伤的复杂过程，其导致全部或部分肾功能突然丧失，在短时间内产生急性肾衰竭（AKF），所述时间范围从几小时到几天（López-Novoa JM.Kidney Int.1999;55:1672-1682;López-Novoa JM等.Kidney Int.2011;79:33-45）。通常，术语AKI用于定义多数肾侵害的可逆性质；而术语AKF被保留以描述患有肾损伤的患者的病情，其包括肾小球滤液及肾脏排泄量的减少，为此需要肾脏替代疗法（KRT），即任何间歇式或常规透析疗法。

AKI的病因涉及许多机理，其中最重要的或研究最好的是（Schrier RW等.J Clin Invest.2004;114:5-14）：血管障碍产生的内皮损伤；由于局部缺血或由于肾毒素的直接管状效应导致的肾小管细胞坏死/凋亡；肾调节失效；炎症；及导致肾小管阻塞的肾小管细胞坏死和凋亡。在多种情况下，这些机制是相互关联的（López-Novoa JM等.Kidney Int.2011;79:33-45）。

肾毒性剂对肾脏的作用是急性肾损伤的最常见原因之一。其中最典型的药理学来源的肾毒性剂为造影剂、抗肿瘤剂和抗生素。

由于对患者进行诊断和治疗干预过程的数量增加，近几年造影剂诱导的肾功能退化的发病率显著增加，还增加了存在风险情况的患者，例如糖尿病（Calvin等,Nature Reviews Nephrology2010;6:679-688）及高龄（Laville和Juillard,J Nephrol.2010;23:387-398）。造影剂引起的肾病，尽管通常是可逆的，但远不是一个良性并发症，因为其需要延长的住院时间，且在某些情况下，尤其是对高风险患者，导致了肾功能的不可逆恶化（Laville和Juillard,J Nephrol.2010;23:387-398）。

造影剂诱导的AKI的治疗，一旦建立，其限于支持护理和透析。到目前为止，已分析多种分子用于预防，所述分子例如心房肽、抑制素、前列腺素/环前列腺素类似物、n-乙酰半胱氨酸或等渗静脉内碳酸氢盐，但这些预防疗法仍无法展示出决定性功效（Weisbord SD,Palevsky PM.Curr OpinNephrol Hypertens.2010;19(6):539-549）。

在患有癌症进行化疗的患者中抗肿瘤剂是急性肾损伤的另一原因。具体地，顺铂是治疗实体肿瘤最有效的抗肿瘤剂之一，具有广泛的作用谱。然而，剂量依赖性的累积肾毒性是这种药物的主要治疗限制，在某些情况下需要减少剂量或不连续治疗。通常，预防由施用顺铂产生的肾损伤的方法是基于盐水输注以诱导溶质利尿，及抗肿瘤剂量的优化调整。尽管已发现氨磷汀有效预防肾衰竭，但用所述药物治疗的患者中已描述了史-约综合征（Stevens-Johnson syndrome）及中毒性表皮坏死松懈症的病例（Darmon M等Critical care.2006;10:211）。

此外，抗生素例如庆大霉素及，通常，氨基糖苷类抗生物素是广泛用于治疗各种感染的有效成分。它们的主要缺点，及使用的主要限制是其肾毒性，因为尽管正确监测并水化患者，但在10-20%的治疗中出现急性肾损伤。目前没有任何药物或治疗方法能预防或最小化由庆大霉素引起的肾损伤，也不能改善治疗停止后的器官恢复。

国际专利申请WO2006/134601A2公开了用于预防或治疗HgCl₂诱导的急性肾衰竭的方法，其包括施用药物组合物，所述组合物含有作为活性剂的由IL-6家族成员与所述成员的可溶性受体连接形成的融合蛋白。然而，施用分离的IL-6多肽，在缺少其受体的情况下，不能预防或治疗肾损伤。

美国专利US7,022,666B1公开了在患有肾衰竭的受试者中诱导从间质前体形成肾上皮细胞的方法，其包括在存在后肾间质生长因子的情况下施用gp130受体的配体。所述后肾间质生长因子是诱导上皮细胞所必需的。

因此，有必要在本领域提供用于治疗和/或预防急性肾损伤的药物，尤其是肾毒性剂导致的急性肾损伤。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及一种用于预防和/或治疗急性肾损伤的诱导心肌营养素-1（CT-1）活性的化合物，其中诱导心肌营养素-1活性的所述化合物选自下列物质的组：

(i)心肌营养素-1（CT-1）或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体，

(ii)编码CT-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体的多核苷酸，

(iii)包含根据(ii)所述的多核苷酸的载体，及

(iv)能够将心肌营养素-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体分泌到培养基中的细胞。

在另一个方面，本发明涉及同时或分别包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和肾毒性剂的组合物。

在另一个方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和用作诊断剂的造影剂的组合物。

甚至在另一个方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和用于预防和/或治疗抗生素相关的肾毒性的抗生素的组合物。

在另一个方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和用于预防和/或治疗免疫抑制剂相关的肾毒性的免疫抑制剂的组合物。

在最后一方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和用于预防和/或治疗抗肿瘤剂相关的肾毒性的抗肿瘤剂的组合物。

附图说明

图1.对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）、泛影葡胺（Gg）、泛影葡胺+庆大霉素（Gg+G）和泛影葡胺+庆大霉素+心肌营养素-1（Gg+G+CT-1）处理的大鼠在实验期间的体重变化，单位为克（g）。数据表示平均值±SEM（4-5只动物/组）。d0：第0天的基本状况；d4：造影后的第4天。

图2.对照组大鼠（C）及用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）、泛影葡胺（Gg）、泛影葡胺+庆大霉素（Gg+G）和泛影葡胺+庆大霉素+心肌营养素-1（Gg+G+CT-1）处理的大鼠的肌酐血浆浓度（Creat.Plasma），单位为mg/dL。施用泛影葡胺后的第二天（d2）和第四天（d4）的数据。数据表示平均值±SEM（4-5只动物/组）。在处理结束时（施用碘化造影剂后4天）对于组C、G、CT-1和Gg，*p<0.05。在处理结束时对于Gg+G组，&p<0.05。d2：造影后的第2天；d4：造影后的第4天。

图3.对照组大鼠（C）及用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）、泛影葡胺（Gg）、泛影葡胺+庆大霉素（Gg+G）和泛影葡胺+庆大霉素+心肌营养素-1（Gg+G+CT-1）处理的大鼠的尿素血浆浓度，单位为mg/dL。施用泛影葡胺后的第二天（d2）和第四天（d4）的数据。数据表示平均值±SEM（4-5只动物/组）。在处理结束时（施用碘化造影剂后4天）对于组C、G、CT-1和Gg，*p<0.05。在处理结束时对于Gg+G组，&p<0.05。d2：造影后的第2天；d4：造影后的第4天。

图4.对照组大鼠（C）及用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）、泛影葡胺（Gg）、泛影葡胺+庆大霉素（Gg+G）和泛影葡胺+庆大霉素+心肌营养素-1（Gg+G+CT-1）处理的大鼠，在处理结束时的肌酐清除率（Creat.Cl），单位为ml/分钟。数据表示平均值±SEM（4-5只动物/组）。对于组C、G、CT-1，*p<0.05。

图5.对照组大鼠（C）及用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）、泛影葡胺（Gg）、泛影葡胺+庆大霉素（Gg+G）和泛影葡胺+庆大霉素+心肌营养素-1（Gg+G+CT-1）处理的大鼠，在处理结束时的蛋白质的尿排泄（Urine Prot.），单位为mg/天（mg/d）。数据表示平均值±SEM（4-5只动物/组）。对于组C、G、CT-1和Gg，*p<0.05。对于组Gg+G，&p<0.05。

图6.对照组大鼠（C）及用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）、泛影葡胺（Gg）、泛影葡胺+庆大霉素（Gg+G）和泛影葡胺+庆大霉素+心肌营养素-1（Gg+G+CT-1）处理的大鼠，在处理结束时的N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶（NAG）的尿排泄，用任意单位每天（AU/d）表示。数据表示平均值±SEM（4-5只动物/组）。对于组C、G、CT-1和Gg，*p<0.05。

图7.表示对照组大鼠（C）及用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）、泛影葡胺（Gg）、泛影葡胺+庆大霉素（Gg+G）和泛影葡胺+庆大霉素+心肌营养素-1（Gg+G+CT-1）处理的大鼠，在处理结束时尿中KIM-1和PAI-1的蛋白质印迹分析的图像。蛋白质印迹表示3组实验单独进行。

图8.对照组大鼠（C）及用泛影葡胺+庆大霉素(Gg+G）和泛影葡胺+庆大霉素+心肌营养素-1（Gg+G+CT-1）处理的大鼠，在处理结束时的肾小球滤过率（GFR），单位为mL/分钟。数据表示平均值±SEM（4只动物/组）。对于组C，*p<0.05。对于组Gg+G，&p<0.05。

图9.对照组大鼠（C）及用泛影葡胺+庆大霉素（Gg+G）和泛影葡胺+庆大霉素+心肌营养素-1（Gg+G+CT-1）处理的大鼠，在处理结束时的肾血浆流量（RPF），单位为mL/分钟。数据表示平均值±SEM（4只动物/组）。对于组C，*p<0.05。对于组Gg+G，&p<0.05。

图10.对照组大鼠（C）及用泛影葡胺+庆大霉素（Gg+G）和泛影葡胺+庆大霉素+心肌营养素-1（Gg+G+CT-1）处理的大鼠，在处理结束时的肾血管阻力（RVR），单位为mmHg·分钟/mL。数据表示平均值±SEM（4只动物/组）。对于组C，*p<0.05。对于组Gg+G，&p<0.05。

图11.载体（对照）；心肌营养素-1（CT-1）；顺铂（顺铂）或心肌营养素-1和顺铂（CT1-P）各组中存活率随时间的变化。数据表示平均值±SEM（n=6只大鼠每组）。

图12.载体（对照）；心肌营养素-1（CT-1）；顺铂（顺铂）或心肌营养素-1和顺铂（CT1-P）各组中体重（克，g）随时间的变化。数据表示平均值±SEM（n=6只大鼠每组）。与对照组相比，*p<0.05。与心肌营养素-1-顺铂组相比，&p<0.05。

图13.载体（对照）；心肌营养素-1（CT-1）；顺铂（顺铂）或心肌营养素-1和顺铂（CT1-P）各组中尿液流量（ml）随时间的变化。数据表示平均值±SEM（n=6只大鼠每组）。与对照组相比，*p<0.05。与心肌营养素-1-顺铂组相比，&p<0.05。

图14.载体（对照）；心肌营养素-1（CT-1）；顺铂（顺铂）或心肌营养素-1和顺铂（CT1-P）各组中血浆肌酐浓度（mg/dl）随时间的变化。数据表示平均值±SEM（n=6只大鼠每组）。与对照组相比，*p<0.05。与心肌营养素-1-顺铂组相比，&p<0.05。

图15.载体（对照）；心肌营养素-1（CT-1）；顺铂（顺铂）或心肌营养素-1和顺铂（CT1-P）各组在实验期结束时的器官重量（相对于体重，与体重相比的百分比）的研究。数据表示平均值±SEM（n=6只大鼠每组）。与对照组相比，*p<0.05，与心肌营养素-1-顺铂组相比，&p<0.05。

图16.对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）或两种化合物（G+CT-1）处理的大鼠在实验期间（d，天）的体重变化，单位为克（g）。数据表示平均值±标准偏差（5-6只动物）。B：基础期（basal）。

图17.对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）或两种化合物（G+CT-1）处理的大鼠在处理开始之前（基础期）和处理结束时（第6天）的收缩压（SBP）（上图），单位为mmHg，及心率（下图），单位为bpm（次每分钟）。数据表示平均值±标准偏差（5-6只动物）。

图18.对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）或两种化合物（G+CT-1）处理的大鼠在处理结束时肝（A）、脾（B）、右肾（C）及心脏（D）的重量（相对于体重的百分比）。数据表示平均值±标准偏差（5-6只动物）。与对照组相比，*p<0.05。与G组相比，&p<0.05。

图19.对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）或两种化合物（G+CT-1）处理的大鼠在实验开始时（基础期）、4天后（第4天）及研究结束时（第6天）的血浆肌酐浓度（Creat.Plasma），单位为mg/dL。数据表示平均值±标准偏差（5-6只动物）。与对照组相比，*p<0.05。

图20.对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）或两种化合物（G+CT-1）处理的大鼠在处理结束时的尿素血浆浓度，单位为mg/dL。数据表示平均值±标准偏差（5-6只动物）。与对照组相比，*p<0.05。

图21.对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）或两种化合物（G+CT-1）处理的大鼠在研究开始时（基础期）、4天后（第4天）及研究结束时（第6天）的肌酐清除率（Creat.Cl.），单位为mL/分钟。数据表示平均值±标准偏差（5-6只动物）。与对照组相比，*p<0.05，与G组相比，&p<0.05。

图22.对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）或两种化合物（G+CT-1）处理的大鼠的蛋白质的尿排泄（蛋白尿），单位为mg/天。数据表示平均值±标准偏差（5-6只动物）。与对照组相比，*p<0.05。与G组相比，&p<0.05。

图23.对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）或两种化合物（G+CT-1）处理的大鼠的尿液流量在整个研究期间（d，天）随时间的变化，单位为mL/天（mL/d）。数据表示平均值±标准偏差（5-6只动物）。

图24.表示对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）或两种化合物（G+CT-1）处理的大鼠在处理结束时用苏木精和曙红染色的肾脏切片的皮质区域的光学显微（1000倍放大）的图像。

图25.对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）或两种化合物（G+CT-1）处理的大鼠在处理后4天（第4天）及研究结束时（第6天）的N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶（NAG）的尿排泄随时间的变化，用任意单位每天（AU/d）表示。数据表示平均值±标准偏差（5-6只动物）。

图26.表示对照组大鼠（C）和用庆大霉素（G）、心肌营养素-1（CT-1）或两种化合物（G+CT-1）处理的大鼠在处理结束时肾组织（t）和尿液（u）的匀浆中KIM-1和NGAL的蛋白质印迹分析的图像。实线箭头表示在所期望的分子量高度获得的条带。虚线箭头（及用问号符号标记的）表示小于预期分子量的反应条带，其可能对应于蛋白质片段。

图27.CT-1疗法对大鼠存活率的影响，以存活的大鼠的百分比表示，经受左肾缺血60分钟及再灌注14天（d）。表示为模拟大鼠（Sim）、接受盐水血清的大鼠（IR C）及CT-1处理的大鼠（IR CT-1）。

图28.对经受左肾缺血24和48小时后再灌注的动物施用CT-1的效果：（A）对肌酐血浆水平（Creat.Plasma），单位为mg/dL，及（B）对肌酐清除率值（Creat.Cl.），单位为mL/分钟。表示为模拟大鼠（Sim）、接受盐水血清的经受左肾缺血的大鼠（对照）及用CT-1处理的经受左肾缺血的大鼠（CT-1）。数据表示平均值±标准偏差（每组5-6只动物）。与IRC相比，（*）P<0.05；与Sim相比，（#）P<0.05。

图29.模拟组（Sim）的动物及两个经受左肾缺血的动物组（缺血对照组（对照组）与用CT-1处理的缺血动物（CT-1）再灌注后4小时的超氧阴离子（SOA）的肾组织水平，表示为nmol/mg蛋白质/分钟。数据表示为平均值±标准偏差（每组5只动物）。

图30.肾I/R后CT-1处理对髓过氧化物酶活性（MA）的影响，表示为单位每克组织（U/g）。髓过氧化物酶活性（MA）在模拟组（Sim）动物及两个经受左肾缺血的动物组（缺血对照组（对照组）与用CT-1处理的缺血动物（CT-1））的肾组织中模拟操作或再灌注后24小时测定。数据表示为平均值±标准偏差（每组5只动物）。

图31.模拟组（Sim）动物及两个经受左肾缺血的动物组（缺血对照组（对照组）与用CT-1处理的缺血动物（CT-1）再灌注后4小时用CT-1处理对促炎细胞因子的血浆水平的影响，单位为pg/mL。A)TNF-α水平。B)IL-1β水平。C)IFN-γ水平。D)IL-6水平。E)IL-10水平。数据表示为平均值±标准偏差（每组5只动物）。

图32.表示经受肾脏缺血未处理（对照）及再灌注后24小时接受心肌营养素-1（CT-1）的大鼠肾脏的苏木精-曙红染色的图像。箭头尖端表示具有大量空泡细胞质的肾小管细胞。箭头表示阻塞的肾小管。

图33.表示经受肾脏缺血未处理（对照）及再灌注后48小时接受心肌营养素-1（CT-1）的大鼠肾脏的苏木精-曙红染色的图像。星号表示完全裸露的肾小管。箭头尖端表示具有炎性浸润的区域。

图34.在经受肾脏缺血-再灌注（I/R）的小鼠中，抗-CT-1抗体对体重的影响，表示为克（g）。缺血损伤通过30分钟左肾蒂的微血管夹紧诱导。实验组为：假手术（n=6）、对照（n=10）、对照IgG（n=10）及抗-CT-1（n=10）。数值表示为n个独立实验的平均值±SEM。统计学显著性差异：*，在抗-CT-1组中与时间0相比p<0.05；#，在对照IgG组中与时间0相比p<0.05。

图35.在经受肾脏缺血-再灌注（I/R）的小鼠中，抗-CT-1抗体对存活率的影响，表示为百分比（%）。实验组为：假手术（n=6）、对照（n=10）、对照IgG（n=10）及抗-CT-1（n=10）。数值表示为n个独立实验的平均值±SEM。

图36.在经受肾脏缺血/再灌注（I/R）的小鼠中，抗-CT-1抗体对血浆尿素的影响，表示为mg/dl。实验组为：假手术（n=6）、对照（n=10）、对照IgG（n=10）及抗-CT-1（n=10）。数值表示为n个独立实验的平均值±SEM。统计学显著性差异：*，不同时间与时间0相比，Z>1.96；按时间，#，各组与假手术组相比，Z>1.96。

图37.在经受肾脏缺血-再灌注（I/R）的小鼠中，抗-CT-1抗体对肾脏丙二醛（MDA）水平的影响，表示为nmol/mg蛋白质。数值表示为n个独立实验的平均值±SEM。实验组为：外科手术后48小时的假手术（n=6）、对照（n=10）、对照IgG（n=10）及抗-CT-1（n=10）。统计学显著性差异：*，与假手术组相比，Z>1.96；#，与对照组相比，Z>1.96。

图38.在经受肾脏缺血-再灌注（I/R）的小鼠中，抗-CT-1抗体对肾脏髓过氧化物酶（MPO）水平的影响，表示为ng/mg蛋白质。数值表示为n个独立实验的平均值±SEM。实验组为：外科手术后48小时的假手术（n=6）、对照（n=10）、对照IgG（n=10）及抗-CT-1（n=10）。统计学显著性差异：*，与假手术组相比，Z>1.96；#，与对照组相比，Z>1.96；&，与对照IgG组相比，Z>1.96。

图39.在经受肾脏缺血-再灌注（I/R）的小鼠中，抗-CT-1抗体对血浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的影响，表示为pg/ml。数值表示为n个独立实验的平均值±SEM。实验组为：外科手术后4小时的假手术（n=4）、对照（n=4）、对照IgG（n=8）及抗-CT-1（n=8）。统计学显著性差异：*，各组与假手术组相比，p<0.05。

图40.在经受肾脏缺血-再灌注（I/R）的小鼠中，抗-CT-1抗体对肾脏心肌营养素-1（CT-1）表达的影响。心肌营养素-1/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（CT-1/GAPDH）的肾表达的光密度分析，以任意单位（AU）表示。数值表示为n个独立实验的平均值±SEM。实验组为：外科手术后48小时的假手术（n=6）、对照（n=10）、对照IgG（n=10）及抗-CT-1（n=10）。统计学显著性差异：*，与假手术组相比，p<0.05；#，与对照组相比，p<0.05；&，与对照IgG组相比，p<0.05。

发明详述

本发明的作者已惊奇地观察到心肌营养素-1（CT-1）对预防和/或治疗急性肾损伤、特别是肾毒性剂诱导的或缺血/再灌注引起的急性肾损伤有用。所述效果取决于CT-1的以下作用：

-减缓肾排泄功能恶化，减缓肌酐清除率的降低（图4、21和28B）；减少血液中代谢产物例如肌酸酐（图2、14、19和28A）、尿素及其衍生物（图3和20）的积累；并减少蛋白尿的出现（图5和22）；

-减少多尿症，其通过尿液流量的变化测得（图13和23）；

-降低肾毒性，其通过肾损伤的尿标记物测得，N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶（NAG）（图6和25）、“肾损伤分子1”（KIM-1）（图7）及纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）（图7）；

-防止血管和肾小球作用涉及肾毒性，避免肾小球滤过率（GFR）（图8）和肾血浆流量（RPF）（图9）降低；并避免肾血管阻力（RVR）增加（图10）；

-减缓由肾毒性剂产生的体重减少（图16）；

-减少组织学研究中观察到的肾组织损伤（图24、32和33）；

-减轻由缺血-再灌注引起的氧化应激，减少氧自由基的产生（图29）；

-减少炎症反应的激活，降低髓过氧化物酶活性（MPO）（图30），减少促炎细胞因子（TNFα、IL-1β、IFN-γ）的产生，并避免IL-6和IL-10血浆水平降低（图31）。

本发明的另一目的在于提供包含肾毒性剂（例如造影剂、抗生素、免疫抑制剂或抗肿瘤剂）和心肌营养素-1的组合物，以使心肌营养素-1和肾毒性剂一起施用以改善毒药学特性（pharmacotoxicological profile）并因此改善其使用和应用。

本发明的治疗用途

在第一个方面，本发明涉及诱导用于预防和/或治疗急性肾损伤的心肌营养素-1（CT-1）活性的化合物，其中诱导心肌营养素-1活性的化合物选自下列物质的组：

(i)心肌营养素-1（CT-1）或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体，

(ii)编码CT-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体的多核苷酸，

(iii)包含根据(ii)所述的多核苷酸的载体，及

(iv)能够将心肌营养素-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体分泌到培养基中的细胞。

另外，本发明涉及诱导制备用于预防和/或治疗急性肾损伤的药剂的心肌营养素-1（CT-1）活性的化合物的用途，其中诱导心肌营养素-1活性的化合物选自下列物质的组：

(i)心肌营养素-1（CT-1）或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体，

(ii)编码CT-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体的多核苷酸，

(iii)包含根据(ii)所述的多核苷酸的载体，及

(iv)能够将心肌营养素-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体分泌到培养基中的细胞。

本发明还涉及一种治疗急性肾损伤的方法，其包括向受试者施用诱导心肌营养素-1活性（CT-1）的化合物，其中诱导心肌营养素-1活性的化合物选自下列物质的组：

(i)心肌营养素-1（CT-1）或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体，

(ii)编码CT-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体的多核苷酸，

(iii)包含根据(ii)所述的多核苷酸的载体，及

(iv)能够将心肌营养素-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体分泌到培养基中的细胞。

如在本文中所使用的，表述“诱导心肌营养素-1活性的化合物”，被理解为任何化合物，其施用引起心肌营养素-1（CT-1）活性的提高，无论所述提高是由预先存在的CT-1的特定活性的提高还是由CT-1或与心肌营养素基本上具有相同功能的类似物的合成的增加引起的。因此，在优选的实施方式中，诱导CT-1活性的试剂是CT-1本身。

如本发明所使用的，术语“心肌营养素1”或“CT-1”，涉及属于白介素6家族的细胞因子，能够连接并激活至少由LIFR受体的复合物介导的信号，所述复合物由异源二聚体gp130/LIFRβ组成。在本发明中，“CT-1”被理解为由NCBI数据库中2011年4月9日递交的登录号为NP_001321.1的序列定义的蛋白质，其对应于序列SEQ ID NO:1，对应于人心肌营养素异构体1；或由NCBI数据库中2011年3月12日递交的登录号为NP_001136016.1的序列定义的蛋白质，其对应于人心肌营养素异构体2。在优选的实施方式中，CT-1是人类来源的CT-1，优选为序列SEQ ID NO:1。

本发明提出了CT-1功能等效变体的用途。如本文中使用的，“CT-1功能等效变体”，被理解为任意的分子，其具有本申请中所述的CT-1的一个或多个功能，包括体内和体外，并且该分子具有最小的氨基酸序列同一性。在本发明中，表述“CT-1功能等效变体”意指排除gp130的其他配体，例如白血病抑制因子（LIF）、IL-11、IL-6、制瘤素M（OSM）、睫状神经营养因子（CNTF）或心肌营养素样细胞因子（CLC）。本发明的“CT-1功能等效变体”必须具有与CT-1至少60%的同一性。

因此，在一个实施方式中，诱导心肌营养素-1活性的化合物是CT-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体。

CT-1的变体可以是天然的及人工的。

表述“天然变体”涉及上述的在其他物种中自然出现的人类CT-1的所有变体，即CT-1的直系同源物。所述天然变体包括，但不限于，小鼠CT-1，其对应于NCBI数据库中2006年11月28日递交的登录号为Q541U3的序列或2011年5月31日递交的序列Q60753或196个氨基酸的异构体，所述氨基酸对应于NCBI数据库中2011年5月31日递交的登录号为P83714的序列；大鼠CT-1，其对应于2011年3月8日递交的登录号为Q63086的序列；猕猴CT-1，其对应于2010年6月1日递交的登录号为XP_001103315的序列；狗CT-1，其对应于2005年8月30日递交的登录号为XP_849072的序列；马CT-1，其对应于2008年7月11日递交的登录号为XP_001915457的序列；及牛来源的CT-1，其对应于2010年11月14日递交的登录号为NP_001179313的序列。适合本发明使用的CT-1的天然变体还可通过对所述序列进行插入、取代或删除一个或多个氨基酸衍生获得，并包括天然等位基因（例如人类CT-1的变体A92T），由可选的加工得到的变体以及看起来天然的分泌和剪切型。

因此，用于本发明的CT-1可以是天然序列，其包含与天然存在的CT-1具有相同氨基酸序列的多肽。所述天然序列的多肽可以是天然分离的或通过重组和/或合成方式产生的。因此，本发明的CT-1可以是通过异源生物中编码CT-1或其功能等效变体的多核苷酸的表达获得的重组蛋白，所述异源生物例如细菌、酵母或昆虫或哺乳动物细胞。所述重组蛋白可以是具有组氨酸氨基末端尾巴的融合蛋白，这利于其后期纯化。所述蛋白质的表达和纯化可根据本领域技术人员已知的及现有技术中描述的方法进行。

在优选的实施方式中，CT-1是人类来源的且对应于序列SEQ ID NO:1。在另一优选实施方式中，CT-1来源于小鼠，优选为具有组氨酸氨基末端尾巴的融合蛋白，更优选为序列SEQ ID NO:2。

可选地，CT-1可以是CT-1的功能等效人工变体，其通过重组和/或合成方法获得。

本发明提出的CT-1的变体示出了，至少CT-1的一些功能，例如，但不限于：

-降低血清肌酐水平并提高肌酐清除率的能力。一种测定这些参数的合适方法在本发明的材料与方法部分详细介绍。

-降低尿素水平及其衍生物的能力。一种测定这些参数的合适方法在本发明的材料与方法部分详细介绍。

-减少蛋白尿的能力。一种测定这些参数的合适方法在本发明的材料与方法部分详细介绍。

-减少多尿症的能力，其通过尿液流量的变化来测定，根据本发明的材料与方法部分所详细介绍的。

-减少肾损伤的尿标记物的产生的能力，所述标记物例如N-乙酰基葡萄糖苷酶（NAG）（根据本发明的材料与方法部分所详细介绍的方法测定），或“肾损伤分子1”（KIM-1）及纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1），其通蛋白质印迹（Western blot）测定，如本发明的材料与方法部分所示出的。

-增加肾小球滤过率（GFR）和肾血浆流量（RPF）并降低肾血管阻力（RVR）的能力，其通过现有技术描述的方法测定，所述方法例如本发明的材料与方法部分所示出的。

-减少肾组织损伤的能力，由肾切片的组织学研究测定，其通过现有技术描述的方法测定，所述方法例如本发明的材料与方法部分所示出的。

-减少氧自由基产生的能力，其通过现有技术描述的方法测定，所述方法例如本发明的材料与方法部分所示出的。

-防止促炎信号传导途径激活的能力，由髓过氧化物酶活性测定，其可通过本发明的材料与方法中详细介绍的方法测定。

-减少促炎细胞因子（TNFα、IL-1β、IFN-γ）的产生并提高IL-6和IL-10的血浆水平的能力，其可通过本发明的材料与方法部分详细介绍的方法测定。

另外，在本发明内容中提到的CT-1功能等效变体包括多肽，所述多肽显示出与上述不同CT-1天然变体至少60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%的相似性或同一性。

两个序列间的同一性的百分比表示两个相互比较的序列共享的相同氨基酸的比例，而相似性的百分比表示相似氨基酸残基的比例（考虑等效氨基酸残基例如精氨酸和赖氨酸或天冬氨酸和谷氨酸）。两个氨基酸序列间的同一性的百分比通过比较特定区域排列的两个序列，测定两个序列都有的相同氨基酸的位置数目，通过所述位置的数目除以比较的片段中总位置数目以获得一致位置的数目，并将结果乘以100来计算。两个多肽之间的同一性和相似性程度由本领域技术人员使用计算机应用算法和众所周知的方法测定。两个氨基酸序列之间的同一性和相似性优选使用BLASTP算法测定（BLASTManual,Altschul,S.等,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.,等,J.,1990,Mol.Biol.215:403-410）。

在本发明的另一个实施方式中，诱导心肌营养素-1活性的化合物是编码CT-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体的多核苷酸。在一个实施方式中，CT-1功能等效变体具有与CT-1至少60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%的同一性。

如本发明中所使用的，术语“多核苷酸”是指任意长度的核苷酸的聚合物形式，其由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸组成。该术语包括单链和双链的多核苷酸，也包括修饰的多核苷酸（甲基化，受保护的等）。

适合用作能够诱导CT-1活性的试剂的多核苷酸包括，但不限于：对应于GenEMBL数据库中描述的2008年10月15日递交的版本9中登录号为BC064416的序列的多核苷酸，对应于人类心肌营养素的转录本变体1；2009年8月12日递交的版本9中的登录号为BC036787的序列，对应于人类心肌营养素的转录本的变体1；GenEMBL数据库中描述的2009年1月12日递交的版本4的登录号为D78591的序列，对应于编码褐家鼠（大鼠）心肌营养素1的多核苷酸；GenEMBL数据库中描述的2009年1月12日递交的版本3的登录号为AY518205的序列，对应于编码褐家鼠（大鼠）心肌营养素2的多核苷酸；GenEMBL数据库中描述的2009年1月12日递交的版本4的登录号为U18366的序列，对应于编码小家鼠（小鼠）心肌营养素1的多核苷酸；GenEMBL数据库中描述的2009年1月12日递交的版本2的登录号为AB125661的序列，对应于编码小家鼠（小鼠）心肌营养素2的多核苷酸。

可选地，能够诱导CT-1活性的试剂包括“编码CT-1功能等效变体的多核苷酸”。所述多核苷酸为通过其特定序列限定的能编码具有CT-1活性的多肽的变体的多核苷酸，所述变体具有与CT-1至少60%的同一性。所述多核苷酸通过在之前所述的序列上插入、缺失或替换一个或多个核苷酸产生。优选地，编码CT-1功能等效变体的多核苷酸是这样的多核苷酸，即，其序列使其能与前述定义的多核苷酸在高限制性条件下进行杂交。典型的高限制性杂交条件包括用6×SSC（1X SSC：0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠）和40%甲酰胺在42°C培养14小时，然后在60°C用0.5X SSC、0.1%SDS洗涤一个或多个循环。可选地，高限制性条件还包括在6×SSC中于约50°C至55°C下进行杂交，以及最后在1-3×SSC中于68° C下进行洗涤。中等限制性杂交条件包括在0.2或0.3M NaCl中于约50° C至65° C的温度下进行杂交，然后在0.2X SSC、0.1%SDS（十二烷基硫酸钠）中于约50°C至55°C下进行洗涤。

优选地，当能够诱导CT-1活性的试剂是多核苷酸时，这可操作地与表达调节区有关。本发明使用的调节序列可以是核启动子序列或可选地增强子序列和/或其他的调节序列，这些序列能够提高异源核酸序列的表达。启动子可以是组成型、组织特异性或诱导型启动子。如果需要对异源核酸序列进行固定的表达，则使用组成型启动子。已知的组成型启动子的例子包括巨细胞病毒（CMV）立即早期启动子，鲁斯氏肉瘤病毒启动子等。许多其他的组成型启动子的例子是本领域技术人员所熟知的并能够用于本发明实践的。如果需要对异源核酸序列的控制表达，则使用诱导型启动子。在非诱导状态下，诱导型启动子处于“沉默”状态。“沉默”是指在没有诱导子的存在下，检测不到或几乎检测不到异源核酸序列的表达，而在诱导子存在的情况下，才会有异源核酸序列的表达。通常，可通过改变诱导子的浓度来控制表达水平。通过控制表达，例如通过改变诱导子的浓度，从而致使诱导型启动子受到更强的或更弱的刺激，来控制异源核酸序列的转录本产物的浓度。在异源核酸序列编码一个基因的情况下，可以控制合成的蛋白质的量。通过这种方法，可以改变治疗产物的浓度。已知的诱导型启动子的例子有：雌激素或雄激素启动子，金属硫蛋白启动子，或蜕皮素响应启动子。许多其他的例子是本领域所熟知的并能够用于本发明实践的。除了组成型和可诱导型启动子（它们在很多细胞或组织中起作用），可以使用组织特异性启动子获得特定的异源核酸序列在细胞或组织中的表达。

在本发明的另一个实施方式中，诱导心肌营养素-1活性的化合物是包含前述的多核苷酸的载体，即其编码CT-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体。在一个实施方式中，CT-1功能等效变体具有与CT-1至少60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%的同一性。适合用于插入所述多核苷酸的载体是源自原核生物的表达载体的载体，例如pUC18、pUC19、pBluescript及其衍生物，mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCRl、RP4，噬菌体和“穿梭”载体如pSA3及pAT28，酵母表达载体如2微米质粒型载体、整合质粒、YEP载体、着丝粒质粒等，昆虫细胞表达载体如pAC和pVL系列载体，植物表达载体如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列等载体，以及高等真核细胞表达载体，其基于病毒载体（腺病毒、与腺病毒相关的病毒以及逆转录病毒，特别是慢病毒）和非病毒载体，如pSilencer4.1-CMV(Ambion)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL、pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDT1。

在另一个实施方式中，诱导心肌营养素-1活性的化合物是能够向培养基分泌心肌营养素-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体的细胞。在一个实施方式中，CT-1功能等效变体具有与CT-1至少60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%的同一性。用于表达心肌营养素-1或其功能等效变体的合适的细胞包括，但不限于，心肌细胞、脂肪细胞、内皮细胞、上皮细胞、淋巴细胞（B细胞和T细胞）、肥大细胞、嗜酸粒细胞、血管内膜细胞、从不同器官，优选从胰岛分离出来的细胞的原代培养物、肝细胞、白细胞，包括单核、间质、脐带或成体白细胞（来自于皮肤、肺、肾脏和肝脏）、破骨细胞、软骨细胞和其他结缔组织细胞。一些已知的细胞系也同样合适，例如Jurkat T细胞、NIH-3T3、CHO、Cos、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3细胞，C2C12成肌细胞和W138细胞。

本领域技术人员将理解的是，可以发现向培养基中分泌心肌营养素-1或其功能等效变体的细胞形成微粒或微囊，以使该细胞在患者中具有较长的使用寿命。适用于本发明形成微粒的材料包括任何生物相容性聚合材料，其允许治疗产物的持续分泌并作为细胞的支持物。因此，所述生物相容性聚合材料可以是，例如热塑性聚合物或水凝胶聚合物。热塑性聚合物包括丙烯酸、丙烯酰胺、2-氨乙基甲基丙烯酸酯、聚（四氟乙烯-六氟丙烯）、甲基丙酸烯-(7-cumaroxy)乙基酯酸、N-异丙基丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚（氨基）-对二甲苯、聚（氯乙基乙烯醚）、聚已内酯、聚（己内酯-共-三亚甲基碳酸酯）、聚（碳酸尿素）氨基甲酸乙酯、聚（碳酸盐）氨基甲酸乙酯、聚乙烯、聚乙烯和丙烯酰胺共聚物、聚乙二醇、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚（乙烯对苯二酸酯）、聚（4-羟基丁基丙烯酸酯）、聚（羟乙基甲基丙烯酸酯）、聚（N-2-羟丙基甲基丙烯酸酯）、聚（乳酸羟基乙酸）、聚（L-乳酸）、聚（γ-甲基，L-谷氨酸）、聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚（丙烯延胡索酸酯）、聚（氧化丙烯）、聚吡咯、聚苯乙烯、聚（四氟乙烯）、聚氨酯、聚乙烯醇、超高分子量聚乙烯、6-（对乙烯基苯甲酰胺）-己酸、N-对乙烯基苯甲基-D-麦芽糖酰胺以及包含一个以上所述聚合物的共聚物。水凝胶型的聚合物包括天然材料的藻酸盐、琼脂糖、胶原、淀粉、透明质酸、牛血清白蛋白、纤维素及其衍生物、胶质、硫酸软骨素、纤维蛋白和蚕丝蛋白以及合成水凝胶如

。

本领域所公知的是，除了相对可渗透外，上述的一些聚合物是相当不稳定的并趋于失去其凝胶性质，这意味着抗体将会进入到它们内部并破坏细胞。为此，任选地，可以用半透膜包围本发明的微粒，这使得颗粒稳定，并形成一道抗体不可渗透的屏障。半透膜是指能够允许维持细胞活力所需的溶质进入并使由包含在微粒中的细胞所产生的治疗性蛋白出去的膜，但是该膜对于抗体来说基本上是不可渗透的，从而使得细胞避免由包围微粒的有机体产生的免疫反应。合适的组成半透膜的材料是不溶于生物体液的材料，优选聚氨基酸、如聚-L-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、聚-L-精氨酸、聚-L-天冬酰胺酸、聚-L-天冬氨酸、聚苯甲基-L-天冬氨酸酯、聚-S-苯甲基-L-半胱氨酸、聚-γ-苯甲基-L-谷氨酸酯、聚-S-CBZ-L-半胱氨酸、聚-ε-CBZ-D-赖氨酸、聚-δ-CBZ-DL-鸟氨酸、聚-O-CBZ-L-丝氨酸、聚-O-CBZ-D-酪氨酸、聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)、聚-D-谷氨酸、聚甘氨酸、聚-γ-N-己基L-谷氨酸酯、聚-L-组氨酸、聚(α,β-[N-(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺)、聚-L-羟基脯氨酸、聚(α,β-[N-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺、聚-L-异亮氨酸、聚-L-亮氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L-苯丙氨酸，聚-L-脯氨酸、聚-L-丝氨酸、聚-L-苏氨酸、聚-DL-色氨酸、聚-D-酪氨酸或它们的组合物。

诱导心肌营养素-1活性的化合物适于制备用于预防和/或治疗急性肾损伤的药剂。

“药剂”理解为包含根据本发明的诱导心肌营养素-1（CT-1）活性的化合物的药物组合物。

“预防”理解为在疾病初期或早期阶段施用根据本发明的诱导心肌营养素-1（CT-1）活性的化合物或含有所述化合物的药剂，或优选地避免疾病发生。在本发明优选的实施方式中，诱导心肌营养素-1活性的化合物用于预防急性肾损伤。

术语“治疗”用来指在临床症状出现之前或之后施用根据本发明的诱导心肌营养素-1(CT-1)活性的化合物或含有所述化合物的药剂以控制疾病进展。控制疾病进展理解为所期望的或临床有益效果，其包括，但不限于，减轻症状、减少疾病持续时间、稳定病理状况（特别是避免进一步恶化）、延迟疾病进展、改善病理状况及缓解（部分及全部）。控制疾病进展还包括延长存活期，与不进行治疗的预期存活期相比。

如在本文中所使用的，术语“急性肾损伤”（AKI），理解为肾脏解剖结构中所有类型的损伤或灌注方式的改变，其导致急性肾衰竭（AKF），即导致肾功能的突然丧失，所述肾功能理解为肾脏能够排泄废物并浓缩尿液而不失去电解液。在一个实施方式中，AKF理解为如Mehta RL,等.Crit Care.2007;11:R31定义的疾病，其中可认为当观察到至少一种肾功能改变时，出现AKF，其导致在48小时或小于48小时内出现：

a)血清肌酐水平提高（绝对的，≥0.3mg/dL；百分比，≥50%；或在基础水平上提高1.5倍），或

b)少尿（在超过6小时期间内<0.5mL/kg/h）

用于定义AKF的另一系统，其基于血清肌酐水平的提高及尿液排泄的减少描述了肾功能不全的严重程度，是RIFLE标准（Bellomo R,等.Crit Care.2004;8:R204-R212;Bellomo R,等.Intensive Care Med.2004;30:33-37;Kellum JA,等.Curr Opin Crit Care.2002;8:509-514）。

根据急性肾损伤的初始原因，其可以分为肾前性、肾性和肾后性急性肾损伤。

在一个实施方式中，急性肾损伤选自肾前性引起的急性肾损伤和肾性引起的急性肾损伤；优选为由肾性引起的急性肾损伤。

“肾前性引起的急性肾损伤”被理解为继发于肾脏内正常灌注减少的肾损伤，其可以通过由于肾或肾外损失的体积消耗，流体的隔离，或继发于心脏衰竭、肝硬化或败血症的不合适的灌注压力而产生。其还可能是由于继发于腹部手术期间或肾脏移植期间主动脉或肾动脉夹紧的肾缺血（由于缺血/再灌注产生的损伤）。如果进行早期干预，所述损伤是可逆的。对肾前性引起的急性肾损伤研究最多的实验模型是由于缺血/再灌注产生损伤的啮齿动物中肾动脉的短夹紧。表1示出了肾前性引起的急性肾损伤的可能原因的非限制性列表。

表1.肾前性引起的急性肾损伤的病因

“肾性引起的急性肾损伤”理解为在肾脏系统解剖结构中的内在肾损伤，其在解剖学上分为管状、间质、肾小球和血管。

管状损伤：急性肾小管坏死（ATN）是由于缺血或中毒机制产生的肾小管损伤，即由于其长时间暴露在肾前介质（缺血）或毒素直接损伤（肾毒素）。最常见的原因是缺血，且其发生在肾前性AKI的原因长时间存在时。当原因为肾毒素时，最常涉及的是抗生素（氨基糖苷类、头孢菌素）、放射性造影剂、NSAID、麻醉剂、内源性毒素（横纹肌溶解引起的肌红蛋白尿、溶血作用引起的血红蛋白尿、高尿酸血症、高钙血症）。ATN典型的“自限性”变化是血清肌酐水平的突然增加（损伤期），然后稳定（平稳期），最后在7至21天之间这些测量降低（恢复期）。这种模式与肾小管细胞的损伤和死亡，其再生和肾小管功能的恢复有关。然而，血清肌酐水平的波动取决于许多变量，且因此并不存在于所有ATN病例中。最广泛应用的ATN实验模型是向大鼠施用肾毒性药物，例如氨基糖苷类或顺铂，或施用化学化合物，例如硝酸铀酰（López-Novoa JM,等.Kidney Int.2011;79:33-45）。

间质损伤：急性间质性肾炎（AIN）是由与肾功能衰退相关的发热、皮疹、白细胞增多和嗜酸性粒细胞增多引起的。急性间质性肾炎典型地由药物诱发，所述药物例如非甾体类抗炎药物（NSAIDs）、抗生素、利尿剂等，尽管某些感染（军团属菌、钩端螺旋体属、巨细胞病毒、念珠菌属）及肿瘤性疾病也与这种疾病相关。最广泛使用的实验模型是向大鼠施用NSAID（吲哚美辛）（Varghese J,等.Eur J Pharmacol.2009;614:114-121）。

肾小球损伤：红细胞、蛋白尿或两者的存在表明肾小球疾病的存在。血尿、红细胞的存在、高血压及中度蛋白尿表明肾病的过程（即急性肾小球肾炎）。肾小球损伤的其他原因有恶性高血压、血管炎、溶血性尿毒症综合症、血栓性血小板减少性紫癜、妊娠毒血症和硬皮病。最广泛研究的急性肾小球肾炎的实验模型是向大鼠施用抗Thy抗体（膜增生性肾炎）或阿霉素。

血管损伤：继发于血管疾病的急性肾损伤很难诊断。这种类型损伤的原因是由动脉粥样硬化斑、血栓形成或栓塞引起的肾动脉阻塞；以及由血栓形成或压迫引起的肾静脉阻塞。这种类型的损伤没有公知的实验模型。

“肾后性引起的急性肾损伤”理解为由尿道阻塞引起的肾损伤，其发生在尿道或肾内（石块、晶体的沉积、凝块、肿瘤）或泌尿系统外或肾外（肿瘤、腹膜后纤维化、结石）且阻止形成的尿液的排出，导致逆向传输的压力增加，损害肾小球滤液。最广泛研究的肾后性引起的急性肾损伤的模型是在大鼠中进行单侧尿道结扎（Grande MT和López-Novoa JM.Nat Rev Nephrol.2009;5:319-328）。在另一个实施方式中，急性肾损伤是肾后性引起的。

在优选的实施方式中，急性肾损伤是肾前性引起的，优选选自暴露受试者至缺血导致的急性肾损伤及缺血后再灌注导致的急性肾损伤。

“暴露受试者至缺血导致的急性肾损伤”理解为受试者的肾组织缺血导致的肾损伤。术语“缺血”参考肾脏内产生的组织伤及炎性反应，其由所述器官中血流的暂时减少及相应的氧气、营养物供应减少及代谢产物的流失导致的。

“缺血后再灌注导致的急性肾损伤”理解为由受试者的器官中血流的暂时减少（缺血）及在缺血期后所述血流在器官中的重建（再灌注）导致的肾损伤。

在本发明的另一优选的实施方式中，急性肾损伤是除了由缺血或缺血/再灌注导致的肾损伤之外的任何急性肾损伤。

在本发明的优选的实施方式中，急性肾损伤是肾性引起的肾损伤，优选地由肾毒性剂导致的。

在本发明的更优选的实施方式中，急性肾损伤是由肾毒性剂导致的。

本发明内容中的“肾毒性剂”，理解为能够在肾脏系统中产生毒性的任何物质，即位于肾脏系统中能够产生其形态学和生理学方面的干扰和不平衡，导致器官病变的任何物质。肾毒性剂包括，但不限于，药理学试剂、诊断剂和毒剂，例如环境化学物质、动物和植物毒素，滥用的药物等。本发明所考虑的肾毒性药理学试剂包括，但不限于，止痛剂（扑热息痛、非那西汀、安乃近）和非甾体类抗炎药物（阿司匹林、吲哚美辛）；抗生素例如头孢菌素（头孢噻啶）、四环素、万古霉素、碳青霉烯类（亚胺培南）、多粘菌素B、利福平和氨基糖苷类、紫霉素和卷曲霉素、磺胺类、戊烷脒；抗真菌剂（两性霉素B）；化疗和抗肿瘤剂例如顺铂、环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶；免疫抑制剂例如环孢霉素A和交互作用的药理学试剂。肾毒性诊断试剂包括，但不限于，放射造影剂或放射性造影剂（碘马尿酸盐、离子造影剂）或图像诊断试剂。影响肾脏系统的毒性试剂包括，但不限于，环境化学物质包括用作除草剂的卤代烃、金属且特别是重金属（汞、镉、铅、铬）、真菌毒素、有机溶剂（汽油、三氯乙烯、四氯化碳、乙二醇）、杀虫剂（百草枯、苯氧基乙酸的衍生物、砷、番木鳖碱、氯酸钾和硼酸钠）、氧化硅；来自蛇亚目的动物毒素（虎蛇、罗素蝰蛇或响尾蛇）、蛛形类的动物毒素（Loxosceles Ruferens或棕色或有角蜘蛛）；有毒蔬菜和植物（欧亚瑞香（Daphne mezereum）、Actanea spicata、欧刺柏（Juniperus communis）、Rhamnus franqula、Rhamnus catharticus、Ricinus commnunis）、真菌（毒鹅膏（Amanita Phalloides））；滥用的药物（海洛因、可卡因）；病毒和原生动物（汉坦病毒、三日疟原虫（Plasmodium malariae）、恶性疟原虫（Plasmodium falciparum））。

在甚至更优选的实施方式中，肾毒性剂选自由造影剂、抗生素、免疫抑制剂和抗肿瘤剂所组成的组。

考虑到需要使用造影剂的大量方法和诊断研究，现今很多人遭受造影剂肾病的风险。

在本发明内容中的表述“造影剂肾病”，是指由施用造影剂产生的肾损伤。这是医院环境中肾损伤的第三个原因，且由施用造影剂72小时内血清肌酐水平提高25%或更高（0.5mg/dl）限定（Solomon R.等.N Engl JMed.1994;331:1416-1420;Briguori C.等.Circulation.2007;115:1211-1217）。相关的风险因素是高龄、糖尿病、慢性肾疾病、多发性骨髓瘤和血容量减少。最广泛研究的造影剂肾病的实验模型是向致敏大鼠施用放射造影剂介质。可通过消耗胞外容量或施用低剂量肾毒素先发生致敏反应。因此，在另一个方面，本发明的方法在致敏患有AKI的受试者中进行。在优选的实施方式中，预先致敏患有AKI的受试者用亚毒性剂量的肾毒性剂处理。在优选的实施方式中，处理受试者的肾毒性剂是抗生素。在优选的实施方式中，所述抗生素选自由氨基糖苷类和头孢菌素组成的组。在甚至更优选的实施方式中，所述的氨基糖苷类抗生素选自由庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素、链霉素、西索霉素、新霉素及其组合所组成的组。

在本发明的一个实施方式中，肾毒性剂是造影剂。

在本发明内容中的术语“造影剂”涉及生物相容性化合物，其可以在施用于个体后检测到并用于体内诊断成像方法。使用所述造影剂改善了体内结构或流体的可视性，有利于区分图像不同部分并增加这些不同区域间的“对比”。因此术语“造影剂”覆盖了用于提高图像质量的试剂，然而，所述图像在没有所述试剂（通常情况，例如，核磁共振中的试剂），及图像形成的先决条件的试剂（通常情况，例如，闪烁扫描术的试剂）时生成。合适的造影剂包括，但不限于，用于闪烁扫描术的造影剂，用于单光子发射计算机断层成像（SPECT）的造影剂，用于正电子发射断层成像（PET）的造影剂，用于拉曼光谱仪的造影剂，用于磁共振诊断成像（MR）的造影剂及用于光学成像诊断的造影剂。所述造影剂被检测时不论其是否消耗，通过其结构最佳分布的路径施用，或在消化道中通过灌肠施用，在呼吸道中通过吸入施用，或注射至血管、器官及组织进行观察。

造影剂包括通常用正电子发射体标记的放射性药物，所述正电子发射体例如¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、⁸²Rb、⁶²Cu和⁶⁸Ga。SPECT主要使用γ发射体，例如¹²³I、^99mTc和¹¹¹In。闪烁扫描术类别（正电子发射断层成像（PET）、单光子发射计算机断层成像（SPECT））是横截面图像诊断技术，其映射用放射性核素标记的放射性示踪剂的位置和浓度。PET和SPECT可用于定位并表征测量代谢活性的放射性核素。PET和SPECT提供关于细胞水平的信息，例如细胞活力。在PET中，患者消耗或注射微量放射正电子的放射性物质，其可随着物质穿过身体。在常见应用中，例如，患者被施用附有正电子发射体的葡萄糖，且随着他们的大脑执行不同任务对其进行控制。因为大脑工作时使用葡萄糖，所以PET图像示出了在什么区域脑活性高。在本发明的某些实施方式中，体外标记的细胞用于体内PET或SPECT图像诊断。与PET高度相关的是单光子发射计算机断层成像或SPECT。这两者之间的主要区别是SPECT使用发射低能量光子放射性示踪剂代替正电子发射物质。

用于CT图像的造影剂包括，例如，碘化或溴化造影剂。这些试剂的例子包括碘酞酸盐、碘海醇、泛影酸盐、碘帕醇、乙碘油或碘番酸盐（iopanoate）。钆试剂也被描述用于CT造影剂（参见，例如，Henson JW等.AJNR Am JNeuroradiol.2004;25:969-72）。例如，钆喷酸盐试剂已用作CT造影剂（Strunk HM和Schild H.Eur Radiol.2004;14:1055-62中所讨论的）。计算机断层成像（CT）被认为是一种图像诊断形式。多角度拍摄一系列X射线，有时超过1000个，然后用计算机将其结合，CT能够构建身体任何部分的三维图像。计算机被编程以显示任何角度和任何深度的二维部分。在进行CT时，静脉注射不透射线的造影剂，例如此处所描述的，当最初CT扫描仪不能诊断时其可帮助鉴定并描绘软组织包块。

用于光学图像的造影剂包括，例如，荧光素、荧光素衍生物、吲哚氰绿、俄勒冈绿、俄勒冈绿衍生物、罗丹明绿、罗丹明绿衍生物、曙红、赤藓红、德克萨斯红、德克萨斯红衍生物、孔雀绿、

单（磺基琥珀酰亚胺酯）、瀑布蓝、香豆素衍生物、萘、吡啶唑衍生物、瀑布黄染料、dapoxyl die及本文公开的其他荧光化合物。

用于磁共振的造影剂包括，但不限于，选自由铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐（III）、镱（III）、钆（III）、钒（II）、铽（III）、镝（III）、钬（III）和铒（III）组成的组中的金属复合物。

本发明尤其是针对那些肾毒性造影剂，且因此，是急性肾损伤的潜在病因。

在优选的实施方式中，所述造影剂选自含碘造影剂、含溴造影剂、含钡造影剂、含钆造影剂及其组合物。

在优选的实施方式中，所述造影剂含有碘。通常，含碘造影剂或碘化造影剂用于放射性检查，例如消除肾盂造影、子宫输卵管造影、静脉造影、CT血管造影、血管CT和关节CT，其中例如静脉注射放射性造影剂。本发明提出的碘化造影剂包括，但不限于，离子单体（泛影酸及其盐、甲泛影酸及其盐、异泛影酸及其盐、碘达酸、碘羟拉酸及其盐、碘番酸及其盐、碘格列酸及其盐、醋碘苯酸及其盐、碘卡明酸及其盐、碘甲磺），离子二聚体（碘克沙酸及其盐、碘托西酸及其盐），非离子单体（碘海醇、碘帕醇、碘佛醇、碘比醇、碘普胺、甲泛葡胺、碘喷托），非离子二聚体（碘克沙醇、碘曲仑、碘昔兰、碘美普尔）和水不溶物（丙碘酮）。本发明还包括所述化合物的组合物和/或其药学上可接受的盐。所述碘化造影剂的合适的盐类为，但不限于，任何形式的药学上可接受的盐，但优选为钠盐或葡甲胺盐。本发明提出的碘化造影剂非限制性盐的例子为泛影酸钠、泛影酸葡甲胺、甲泛影酸钠、甲泛影酸葡甲胺、异泛影酸钠、异泛影酸葡甲胺、碘克沙酸钠、碘克沙酸葡甲胺等。

在本发明优选的实施方式中，含碘造影剂选自泛影酸及其盐，甲泛影酸及其盐、碘克沙酸及其盐、异泛影酸及其盐、碘帕醇、碘海醇、碘昔兰、碘普胺、碘佛醇、碘克沙醇、甲泛葡胺及其组合物；优选地，其为一种或多种泛影酸盐（也称为泛影酸盐）。泛影酸盐广泛用于多种方法，例如尿路造影及胆囊、胆管和脾脏的检测。泛影酸盐的混合物通常是优选的，例如泛影酸钠和泛影酸葡甲胺，从而使不良反应减到最小并提高检测质量。在甚至更优选的实施方式中，含碘造影剂是泛影酸钠和泛影酸葡甲胺的组合物。

在另一实施方式中，造影剂含有溴。本发明包括的含溴造影剂或溴化造影剂为，但不限于，例如专利申请WO93/08122、EP1186305A1、FR2736051A1、EP073715A1、EP074307A1、EP074309A1、EP0118348A1、FR2541272A1中公开的那些造影剂；溴化碳氟化合物例如全氟溴辛烷（C8BrF17）、全氟溴己烷。本发明还考虑到所述含溴造影剂和/或其药学上可接受的盐的混合物。

在另一实施方式中，造影剂含有钡，优选为硫酸钡。硫酸钡是用于限定胃肠道的金属盐。其可用于单一或双重造影试验或计算机辅助的轴向断层成像。

在另一实施方式中，造影剂含有钆。含钆造影剂为，但不限于，钆喷酸、钆双胺、钆特酸、钆特醇、钆喷酸盐、钆双胺、钆贝酸、钆膦维司、钆弗塞胺、钆塞酸、钆布醇、钆考酸及钆登酯。本发明还考虑到所述含钆造影剂的盐，合适的任何类型的药学上可接受的盐，优选为钠盐和葡甲胺盐。

在另一实施方式中，肾毒性剂是抗生素。“抗生素”理解为生物产生的化学物质或其合成衍生物，其能在低浓度杀死敏感微生物的特定种类或阻止其生长，通常为细菌，尽管一些抗生素也用于治疗由真菌或原生动物引起的感染。抗生素用于人类、动物或园艺医学以治疗由微生物引起的感染。本发明包括的抗生素为，但不限于，氨基糖苷类抗生物素、安莎霉素类、carbacefem、碳青霉烯类、头孢菌素、糖肽类、大环内酯类、单胺菌素、青霉素、多肽类、喹诺酮类、磺胺类、四环素及其它例如胂凡纳明、氯霉素、克林霉素、林可霉素、乙胺丁醇、磷霉素、梭链孢酸、呋喃唑酮、异烟肼、利奈唑胺、甲硝唑、莫匹罗星、呋喃妥英、平板霉素、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普汀、利福平、替硝唑、紫霉素和卷曲霉素；优选头孢菌素、四环素、糖肽类、碳青霉烯类、多肽、利福平、氨基糖苷类、磺胺类、紫霉素和卷曲霉素。在优选的实施方式中，抗生素选自氨基糖苷类和头孢菌素。

“氨基糖苷类抗生素”理解为杀菌抗生素，其以细菌中核糖体的30S亚基的水平作用，且因此，在蛋白质合成水平，在细菌细胞壁外膜产生孔隙。本发明包括的氨基糖苷类抗生素为，但不限于，庆大霉素、丁胺卡那霉素、壮观霉素、丙大观霉素、链霉素、新霉素、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、紫苏霉素、巴龙霉素和卡那霉素。本发明还包括所述抗生素药学上可接受的盐。在优选的实施方式中，氨基糖苷类抗生素选自由庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素、链霉素、紫苏霉素、新霉素及其组合物组成的组；其优选为庆大霉素。

“头孢菌素”理解为一类源自7-头孢烷酸的β-内酰胺抗生素，且其作用为干扰细菌细胞壁的肽聚糖合成，并抑制最终的转肽作用（交联必须的），产生杀菌效果。在本发明内容中，术语头孢菌素包括，例如，但不限于，第一代头孢菌素（头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢氨苄）、第二代头孢菌素（头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯，头孢呋辛）、第三代头孢菌素（头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松）、第四代头孢菌素（头孢吡肟）和第五代头孢菌素（头孢吡普）。本发明还包括所述头孢菌素药学上可接受的盐。

在另一实施方式中，肾毒性剂是免疫抑制剂。“免疫抑制剂”理解为产生免疫系统免疫抑制的物质。所述免疫抑制剂用于防止移植器官的排斥反应并用于治疗自身免疫性疾病，可能是自身免疫来源的疾病，例如脉管炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、牛皮癣或系统性红斑狼疮。本发明包括的免疫抑制剂为，但不限于，细胞抑制剂，例如咪唑硫嘌呤、环磷酰胺、甲氨蝶呤、麦考酚酸酯；糖皮质激素，例如强的松；神经钙蛋白酶抑制剂，例如环孢菌素A、他克莫司（FK506）；雷帕霉素或西罗莫司；依维莫司；多克隆抗体，例如球蛋白；单克隆抗体，例如利妥昔单抗、达克珠单抗、依那西普。本发明还包括所述免疫抑制剂药学上可接受的盐。在优选的实施方式中，免疫抑制剂选自环孢菌素A、他克莫司（FK506）和依维莫司；优选为环孢菌素A。

在另一个实施方式中，肾毒性剂是抗肿瘤剂。“抗肿瘤剂”理解为防止恶性肿瘤细胞发育、生长或增殖的物质，且其可以是天然的、合成的或半合成来源的。本发明中提到的抗肿瘤剂包括，但不限限于，DNA烷化剂、铂基化合物；抗代谢物；抗肿瘤抗生素；拓扑异构酶I和II抑制剂；酶，例如左旋天冬酰胺酶；长春花生物碱；紫杉烷类；激素药剂，例如抗-雌激素、芳香酶抑制剂、LH-RH类似物、抗雄激素和糖皮质激素；其它试剂，例如白细胞介素、干扰素、单克隆抗体和卡介苗。

在优选的实施方式中，抗肿瘤剂选自铂基化合物、抗代谢物、DNA烷化剂、拓扑异构酶I或II抑制剂及其组合物的组中。

本文中使用的“铂基化合物”理解为含有铂原子的任何化合物，其能够与DNA结合并嵌入其中，诱导DNA的修复激活并最终引发细胞凋亡。铂基化合物包括，但不限于，卡铂、顺铂[顺式二氨基二氯化铂、(CDDP)]、奥沙利铂、异丙铂、奈达铂、四硝酸三铂、四铂、赛特铂（JM216）、JM118、JM149、JM335、反铂、ZD0473、顺式、反式，顺式-Pt(NH3)(C6H11NH2)(OOCC3H7)2Cl、丙二酸-1，2-二氨基环己烷-铂（II）、5-磺基水杨酸-反式-（1，2-二氨基环己烷）铂（II）（SSP）、聚-[（反式-1，2-二氨基环己烷）铂]-羟基直链淀粉（carboxyamylose）（POLY-PLAT）、4-羟基-磺酰苯乙酸酯（反式-1，2-二氨基环己烷）铂（II）（SAP）及类似物。在优选实施方式中，铂基化合物选自顺铂、卡铂及其组合物的组中；优选顺铂。

如在本文中所使用的术语“抗代谢物”广义上指干扰正常代谢的物质及抑制电子转移系统的物质，以防止富含能量的中间产物产生，这是由于其与代谢物的结构或功能相似性，所述代谢物（例如维生素、辅酶、氨基酸和糖）对于生物体有重要作用。适合于本发明使用的抗代谢物包括，但不限于，叶酸抗代谢物（氨基蝶呤、二甲叶酸、甲氨蝶呤、依达曲沙、三甲曲沙、洛拉曲克、洛美曲索、培美曲塞、雷替曲塞、吡曲克辛、蝶罗呤、甲酰四氢叶酸、10-炔丙基-5,8-二氮杂叶酸（PDDF,CB3717））；核苷酸抑制剂（羟基脲）、嘌呤类似物（克拉屈滨、克罗拉滨、氟达拉滨、巯嘌呤、喷司他丁、硫鸟嘌呤）以及嘧啶类似物（卡培他滨，5-阿扎胞苷、citarabine或阿糖胞苷，地西他滨、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、脱氧氟尿苷、氟尿苷和吉西他滨）。本发明还考虑到所述抗代谢物药学上可接受的盐。在优选的实施方式中，抗代谢物选自甲氨蝶呤、喷司他丁、5-氮杂胞苷、羟基脲及其组合物的组中。

“DNA烷化剂”理解为癌症治疗中使用的烷化剂，其能够将烷基添加到快速分裂的细胞的DNA中，导致复制停止及细胞死亡。

DNA烷化剂为氮芥，亚硝基脲、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐和三氮烯，包括但不限于，环磷酰胺（Cytoxan^TM）、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、哌泊溴烷、美法仑（苯丙氨酸氯芥）、苯丁酸氮芥、氮芥、尿嘧啶氮芥、新恩比兴、苯乙酰胆固醇氮芥、三芥环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀（BCNU）、环己亚硝脲（CCNU）、氯脲霉素、福莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、司莫司汀（甲基-CCNU）、链脲霉素、塞替派、曲他胺、三乙基硫代亚磷酰胺、丝裂霉素C、甲苄肼、六甲蜜胺、达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺。本发明还考虑到所述化合物药学上可接受的盐。在优选的实施方式中，DNA烷化剂选自卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、异环磷酰胺、丝裂霉素C及其组合物的组中。

“拓扑异构酶I或II抑制剂”理解为旨在干扰拓扑异构酶I和II酶作用的试剂。拓扑异构酶I抑制剂包括，但不限于，依立替康、托泊替康、喜树碱、乙酰基喜树碱、9-氨基喜树碱，片螺素D和桦木酸。拓扑异构酶II抑制剂包括，但不限于，安吖啶、依托泊苷、替尼泊苷和多柔比星。本发明还考虑到所述化合物药学上可接受的盐。在优选的实施方式中，拓扑异构酶I或II抑制剂选自依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素及其组合物的组中。

本发明还考虑到所有这些抗肿瘤剂的组合物，例如，但不限于，顺铂-紫杉醇、顺铂-吉西他滨、顺铂--多西他赛、卡铂-紫杉醇、顺铂-依托泊苷，卡铂-依托泊苷，卡铂-吉西他滨、卡铂-多西他赛、顺铂-替尼泊苷、奥沙利铂-吉西他滨、奥沙利铂-紫杉醇、顺铂-紫杉醇-吉西他滨、顺铂-阿霉素-5-氟尿嘧啶（AFP）、环磷酰胺-阿霉素-顺铂（CISCA）和顺铂-氟尿嘧啶（CF）。

如在本文中所使用的“药学上可接受的盐”涉及一种公认的用于动物，更具体地，用于人类的盐，且包括用于形成碱加成盐的盐，无论是无机的，例如，但不限于，锂、钠、钾、钙、镁、锰、铜、锌或铝等，或有机的，例如，但不限于，乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸或哌嗪等，或酸加成盐，可以是有机的，例如，但不限于，乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、苯甲酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、琥珀酸盐、油酸盐、三氟乙酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐或葡糖酸盐等，或者无机的，例如，但不限于，氯化物、硫酸盐、硼酸盐或碳酸盐等。

可在施用肾毒性剂之前、施用期间和/或施用之后施用诱导心肌营养素-1活性的化合物。典型地，在施用肾毒性剂之前（例如一天前）开始施用诱导心肌营养素-1活性的化合物，并持续到施用肾毒性剂结束后几天，例如直到施用结束后4天、5天、6天、7天。

在本发明的优选实施方式中，诱导心肌营养素-1活性化合物与肾毒性剂一起共同施用。共同施用意味着诱导心肌营养素-1活性的化合物和肾毒性剂同时施用，其可以在单独的药物组合物中，也可以在相同的药物组合物中，或当肾毒性剂为环境肾毒性剂时，所述肾毒性剂与治疗的受试者的接触与诱导心肌营养素-1活性的化合物的施用在时间上是共存的。

可在出现缺血或缺血-再灌注之前、在缺血或缺血-再灌注期间或一旦缺血或缺血-再灌注停止时，施用诱导心肌营养素-1活性的化合物。典型地，在确定缺血之后一小段时间施用诱导心肌营养素-1活性的化合物，且保持整个缺血阶段，在再灌注开始之前停止。

施用诱导心肌营养素-1活性的化合物的受试者可以是任何哺乳动物，包括，但不限于，宠物和家畜、灵长类和人类，例如人类、非人灵长类、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物。优选地，受试者是女性或男性及任何种族或年龄的人类。

本领域技术人员可以理解的是，在药物中的活性成分必须是治疗有效量的，且所述活性化合物的剂型将根据施用类型制成。本文中使用的“治疗有效量”理解为化合物的量为，在处于患有急性肾损伤风险的受试者中其允许完全或部分缓解与急性肾损伤相关的症状或防止症状的发展或恶化，或防止急性肾损伤的出现。在本发明优选的实施方式中，以每天100μg/kg剂量施用心肌营养素-1。

在本发明的实施方式中，通过静脉内途径施用诱导心肌营养素-1活性的化合物。

发明人已证明诱导心肌营养素-1活性的化合物能够减缓患有肾损伤的患者的肾脏排泄功能的恶化，如图4、21和28B所示，其显示出减缓肌酐清除率的降低；图2、3、14、19、20和28A显示出减少血液中代谢产物的累积，所述代谢产物例如肌酐、尿素及其衍生物；图5和22显示出减少蛋白尿的出现。因此，在本发明的优选的实施方式中，诱导心肌营养素-1活性的化合物减缓肾脏排泄功能的恶化。

“肾脏排泄功能的恶化”理解为完全或部分失去肾排泄废物及浓缩尿液而不损失电解质的能力，其通过血清肌酐水平的增加，尿液排泄减少，肌酐清除率降低，血清中尿素及其衍生物增加或蛋白尿的出现来测量。适用于测定这些参数的方法如前所述。

本发明的发明人已证明单独施用心肌营养素-1足以预防和/或治疗急性肾损伤。在本发明的优选的实施方式中，不存在IL-6家族成员的可溶性受体或其片段时进行施用诱导心肌营养素-1活性的化合物。在优选的实施方式中，可溶性受体是CT-1受体或其片段。

“IL-6家族成员的可溶性受体”理解为能够与属于白介素6家族的细胞因子结合形成复合物的可溶性形式的受体，所述复合物能够直接与gp130相互作用。所述家族的成员包括，但不限于，白血病抑制因子（LIF）、心肌营养素-1（CT-1）、睫状神经营养因子（CNTF）、白介素-11（IL-11）、抑瘤素M（OSM）、心肌营养素样细胞因子（CLC）和白介素（IL-6）。“IL-6家族成员的可溶性受体片段”理解为IL-6家族成员的可溶性受体的任何片段，其保持与心肌营养素-1结合的能力及与gp130相互作用的能力。

“CT-1可溶性受体”理解为能够与心肌营养素-1结合形成复合物的可溶性形式的受体，所述复合物能够直接与gp130相互作用。“CT-1可溶性受体片段”理解为CT-1可溶性受体的任何片段，其保持与心肌营养素-1结合的能力及与gp130相互作用的能力。

表述“不存在IL-6家族成员的可溶性受体或其片段时进行”是指没有IL-6家族成员的可溶性受体或其片段与心肌营养素-1一起外部施用。

在本发明的另一优选实施方式中，不存在后肾间质生长因子时进行施用诱导心肌营养素-1活性的化合物。

在本发明内容中“后肾间质生长因子”理解为能够刺激后肾间质增殖的任何生长因子，其包括，但不限于，TGFα、FGF-2、FGF-9、TIMP-1和TIMP-2。

表述“不存在后肾间质生长因子时进行”是指没有后肾间质生长因子与心肌营养素-1一起外部施用。

本发明的组合物

本发明的发明人已经证明由肾毒性剂引起的肾脏损伤可以通过施用诱导心肌营养素-1活性的化合物抵消。

因此，本发明的另一方面涉及同时或分别地包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和肾毒性剂的组合物。

表述“诱导心肌营养素-1活性的化合物”已经在本发明的用途的内容中进行了描述，并且，作为本发明的第一方面，包括选自以下组中的化合物：

(i)心肌营养素-1（CT-1）或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体，

(ii)编码CT-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体的多核苷酸，

(iii)包含根据(ii)所述的多核苷酸的载体以及

(iv)能够将心肌营养素-1或其具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体分泌到培养基中的细胞，其中不同的化合物已经在上文中进行了详细描述。

术语“肾毒性剂”已经在前述本发明的用途的内容中进行了限定，并且选自由造影剂、抗生素、免疫抑制剂和抗肿瘤剂组成的组中，这些也在前文中有所描述。

如在本文中所使用的，术语“组合物”指的是由至少两个组分（诱导心肌营养素-1活性的化合物和肾毒性剂）形成的组合物，该肾毒性剂可以使治疗剂或造影剂。所述组分可以制备成单一剂型（例如，片剂或胶囊，每一种组分包含固定的量）或者相反地，可以制备成单独的剂型，以便后续组合以同时、顺序或单独施用。本发明的组合物还涉及作为“部分试剂盒”的剂型，其中，所述组分独立配制的，但是包装在同一个容器中，并且有可能的是在施用之前将这些组分混合。本领域技术人员可以理解的是，本发明组合物的第一组分和第二组分的剂型可以类似，换言之，以类似的剂型（例如，片剂），允许以相同的途径施用。如果本发明的不同组分是单独配制的，两种组分可以在一个泡罩包装中。每一个泡罩容纳整天施用的药剂。如果药剂需要在一天中分若干次施用，可以将对应于一次施用的药剂放置在泡罩包装的不同部分，优选在泡罩包装的每一个单独部分标注一天中需要施用的时间。可替代地，本发明的组合物的组分可以制备成不同的剂型，以便不同组分分别施用。因此，例如，可能的是第一组分可以制备成片剂或胶囊以供口服，且第二组分可以制备成供静脉内施用。

本发明的组合物是通过本领域技术人员公知的方法施用的，包括，但不限于，静脉内、口服、鼻腔、肠胃外、局部、经由皮肤、直肠等途径。

形成本发明的组合物的部分的组分之间的关系将取决于在每种情况中使用的，特别是，根据指示使用的诱导CT-1活性的化合物和肾毒性剂。

当所述肾毒性剂是有治疗活性的药物，本发明的方法的实践中有用的组合物包括治疗有效量的诱导心肌营养素-1活性的化合物和治疗有效量肾毒性剂。并且，当所述肾毒性剂是造影剂时，本发明的方法的实践中有用的组合物包括治疗有效量的诱导心肌营养素-1活性的化合物和适量的肾毒性剂，从而获得在诊断过程中有用的强反差图像。本发明的组合物还包括药学上可接受的载体。

在具体的实施方室中，组合物是同时或单独包括诱导心肌营养素-1活性的化合物、肾毒性剂和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

“治疗有效量的诱导心肌营养素-1活性的化合物”应理解为能够产生一种或多种上述列出的效果并由CT-1引起的量，该量可以基于本说明书中详细描述的方法通过标准技术进行测定。

“治疗有效量的肾毒性剂”应理解为对于产生治疗效果所必须的肾毒性剂的量，该量根据所寻求的治疗效果而有所变化，即，该量根据肾毒性剂是抗生素、抗肿瘤剂或免疫抑制剂而有所不同。

术语“药学上可接受的”表示由联邦政府或州政府的管理机构批准或列于美国药典或其他被普遍认可的药典中用于动物特别是人类中。术语“载体”是指与通过其施用治疗化合物的稀释剂、辅剂、赋形剂或载体。所述药物载体可以是无菌液体，例如水和油类，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以包括微量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以配制为溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等。所述组合物可以与粘合剂和传统载体，例如甘油三酯配制为栓剂。口服制剂可以包括标准的载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等制药级载体。合适的药物载体的例子记载于“Remington’s Pharmaceutical Sciences”.17th edition revised(December1985).Editorial Mack Pub.Co。

当药物组合物适用于静脉内、皮下或肌内施用至人时，根据给药途径配制组合物。必要时，所述组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。当组合物通过输注进行施用时，其可以用含有制药级水或盐溶液的输液瓶配药。当组合物通过注射施用时，可提供注射用水瓶或无菌生理盐水以在施用前将所述成分混合。

对于治疗肾脏损伤有效的诱导CT-1活性的化合物的量可以基于本说明书通过标准临床技术确定。并且，可以任选地使用体外试验确定最佳给药时间间隔。制剂中使用的精确的剂量将取决于给药途径以及疾病的严重程度，并且必须根据医生的意见以及每位受试者的情况来决定。

对于全身施用，能够从体外试验中初步估计出治疗有效剂量。例如，剂量可以配制成在动物模型中达到循环浓度间隔，该间隔包括细胞培养中测定的CI50。可使用这些信息更精确的测定用于人的剂量。初始剂量可以使用本领域已知的技术通过体内数据估计，例如动物模型。本领域技术人员基于动物数据很容易优化施用给人的数据。

因此，根据本发明的预防和/或治疗急性肾损伤的方法考虑了与一种或多种肾毒性化合物同时、顺序或单独施用能够诱导CT-1活性的化合物。因此，在优选的实施方式中，该组合物同时、单独或顺序施用。

本发明用途中的所有具体实施方式也同样适合本发明的组合物。

当以治疗或诊断为目的施用包含诱导心肌营养素-1活性的化合物的本发明的组合物时，可以用于预防由所述组合物的肾毒性组分产生的急性肾损伤。

因此，在另一方面，本发明涉及用作诊断剂的包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和造影剂的组合物。在另一方面，本发明涉及用于制备诊断剂的包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和造影剂的组合物。在另一方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和造影剂的组合物在制备诊断剂中的用途。在另一方面，本发明涉及通过造影施用给所述患者包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和造影剂的组合物的患者，以及观察造影剂的诊断的诊断方法。

术语“造影剂”已经在前述的本发明的用途的内容中进行了描述。在本发明内容中，术语“诊断剂”是指，包含造影剂和诱导心肌营养素-1活性的化合物的制剂，其施用给个体时，可通过造影进行检测。除了本发明的化合物之外，该诊断剂包括，对于其用途或施用所必须的其它组分或赋形剂。

在另一方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和抗生素的组合物，用于预防和/或治疗与抗生素相关的肾毒性。在另一方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和抗生素的组合物在制备预防和/或治疗与抗生素相关的肾毒性的药物中的应用。在另一方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和抗生素的组合物，在制备用于预防和/或治疗与抗生素相关的肾毒性的药物中的用途。在另一方面，本发明涉及一种在与抗生素相关的肾毒性的个体中的治疗或预防方法，该方法包括向所述个体施用包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和抗生素的组合物。

术语“抗生素”已经在本发明的用途的内容中进行了限定。所述抗生素典型地用于治疗感染，该感染是由病原微生物（细菌、真菌或原生动物）侵入宿主个体时产生的疾病，该病原微生物对于宿主的正常功能或生存是有害的。组合物中使用的抗生素将确定本发明组合物治疗的感染是合适的。施用根据本发明组合物是有用的感染包括，但不限于，由大肠杆菌、克雷伯氏杆菌（Klebsiella）、绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、变形杆菌（Proteus）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）、肠杆菌（Enterobacter）、奈瑟氏菌（Neisseria）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、支原体（Mycoplasma）、耶尔森氏菌（Yersinia）、邻单胞菌（Plesiomonas）、气单胞菌（Aeromonas）、不动杆菌（Acinetobacter）、衣原体（Chlamydia）、立克次体（Rickettsia）、链球菌（Streptococcus）、棒状杆菌（Corynebacterium）、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、梭杆菌（Fusobacterium）、艰难梭菌（Clostridium difficile）、梭状芽孢杆菌（Clostridium perfringens）、消化链球菌（Peptostreptococcus）引起的细菌感染。

当抗生素是氨基糖苷类抗生素时，用本发明的组合物治疗的感染，通常是革兰氏阴性菌，例如由大肠杆菌和克雷伯氏杆菌引起的严重感染，以及由绿脓假单胞菌和非兼性厌氧菌引起的感染。该抗生素在手术预防用药中也是有用的。

当抗生素是头孢菌素时，用本发明的组合物治疗的感染，通常是由革兰氏阳性球菌、变形杆菌属，大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、革兰阴性杆菌、流感嗜血杆菌、肠杆菌、假单胞菌、奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌所引起的感染。该抗生素同样用于治疗由生物体抵抗其它β-内酰胺引起的感染，例如脑膜炎的特定现象并在手术之前的预防药物中使用。

在另一方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和免疫抑制剂的组合物，用于预防和/或治疗与免疫抑制剂相关的肾毒性。

在另一方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和免疫抑制剂的组合物在制备用于预防和/或治疗与免疫抑制剂相关的肾毒性的药物中的应用。在另一方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和免疫抑制剂的组合物，在制备用于预防和/或治疗与免疫抑制剂相关的肾毒性的药物中的用途。在另一方面，本发明涉及一种在与免疫抑制剂相关的肾毒性的个体中的治疗或预防方法，该方法包括向所述个体施用包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和免疫抑制剂的组合物。

术语“免疫抑制剂”已经在本发明的用途的内容中进行了限定。本发明的组合物用于罹患或者易于罹患移植排斥反应或自身免疫疾病的患者，该患者必须是使用肾毒性免疫抑制剂治疗的。“移植排斥反应”应理解为由移植体的受体免疫系统产生的反应，其攻击被移植的器官或组织，产生所谓的移植物抗宿主疾病并破坏外源组织。“自身免疫疾病”指的是那些免疫系统攻击有机体细胞的疾病。可以使用本发明的组合物治疗的自身免疫疾病的说明性而非限制性的例子包括：阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、溶血性贫血、恶性贫血、口腔性溃疡、口疮性口炎、关节炎、动脉硬化、骨关节炎、类风湿性关节炎、自身免疫性哮喘、自身免疫性溶血、白塞氏病（Behcet’sdisease）、伯克氏病（Boeck’s disease）、肠炎症性疾病、克罗恩病（Crohn’sdisease）、脉络膜炎、溃疡性结肠炎、乳糜泻、冷球蛋白血症、疱疹样皮炎、皮肌炎、胰岛素依赖型糖尿病、青少年糖尿病、自身免疫性脱髓鞘疾病、脑脊髓炎、过敏性脑脊髓炎、晶状体蛋白过敏性眼内炎（endophthalmia）、过敏性肠炎、自身免疫性肠病综合征、麻风结节性红斑、特发性面瘫、慢性疲劳综合征、风湿热、肾小球肾炎、古德帕斯彻氏综合征（Goodpasturesyndrome）、格雷夫斯氏病（Graves syndrome）、汉-黑氏病（Hamman-Richdisease）、桥本氏病（Hashimoto’s disease）、突发性耳聋、慢性肝炎、何杰金氏病（Hodgkin’s disease）、阵发性血红蛋白尿、性腺功能减退症、局部回肠炎、虹膜炎、白血球减少症、播散性红斑狼疮、系统性红斑狼疮、皮肤性红斑狼疮、淋巴肉芽肿、传染性单核细胞增多症、重症肌无力、横贯性脊髓炎、特发性粘液水肿（idiopathic primary myxedema）、肾病、交感性眼炎、肉芽肿性睾丸炎、胰腺炎、寻常性天疱疮、结节性多动脉炎、慢性多动脉炎、多肌炎、急性多神经根炎、银屑病、紫癜、坏疽性脓皮症、莱特尔氏病（Reiter’s syndrome）、肉样瘤病、共济失调性硬化（ataxic sclerosis）、进行性全身性硬化症、巩膜炎、硬皮病、多发性硬化、散播性硬化、由抗游动精子抗体导致的不育（infertility due to antispermatozoan antibodies）、血小板减少症、胸腺瘤、急性前葡萄膜炎、白癜风、由组织或器官移植导致的移植排斥和移植物抗宿主病。

在另一方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和抗肿瘤剂的组合物，用于预防和/或治疗与抗肿瘤剂相关的肾毒性。在另一方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和抗肿瘤剂的组合物，用于制备预防和/或治疗与抗肿瘤剂相关的肾毒性的药物。在另一方面，本发明涉及包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和抗肿瘤剂的组合物，在制备用于预防和/或治疗与抗肿瘤剂相关的肾毒性的药物中的用途。在另一方面，本发明涉及一种在与抗肿瘤剂剂相关的肾毒性的个体中的治疗或预防方法，该方法包括向所述个体施用包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和抗肿瘤剂的组合物。

术语“抗肿瘤剂”已经在本发明的用途的内容中进行了限定。本发明的组合物用于罹患或者易于罹患癌症的患者，所述癌症必须是使用肾毒性抗肿瘤剂治疗的。术语“癌症”或“肿瘤”被定义为哺乳动物中具有失调的细胞生长的特征的生理学情况。本发明的组合物用于治疗任何癌症或肿瘤，例如，但不限于，乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头部、颈部、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸和肝脏肿瘤。特别地，可以用所述组合物治疗的肿瘤，包括但不限于，腺瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、血管内皮细胞瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。特别地，肿瘤/癌症选自以下组：肢端黑色素瘤、角化病光腺癌、胆囊腺状癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、星形细胞瘤、前庭大腺癌（Bartholin’s gland carcinoma）、基底细胞癌、支气管腺体癌、毛细管良性肿瘤、癌、癌肉瘤、胆管癌、囊腺瘤、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样癌、室管膜瘤、尤因氏肉瘤（Ewing’s sarcoma）、局灶性结节增生、生殖细胞系肿瘤、成胶质细胞瘤、胰高血糖素瘤、血管母细胞瘤、血管内皮细胞瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝细胞腺瘤、肝细胞癌、胰岛瘤、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞癌、浸润性鳞状细胞癌、大细胞癌、平滑肌肉瘤、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、恶性间皮肿瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、粘液表皮样癌、神经母细胞瘤、神经上皮癌、结节性黑色素瘤、骨肉瘤、浆液性乳头状腺癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、肾细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、小细胞癌、软组织癌、生长激素抑制素分泌瘤、鳞状癌、鳞状细胞癌、未分化癌、葡萄膜黑色素瘤、疣状癌、血管活性肠肽瘤、肾母细胞瘤（Wilm’s tumour）。

本发明通过下面的具体实施例进行说明，以下实施例仅是示例性说明并在任何情况下都不限制本发明范围。

具体实施例

A.用抗-CT-1抗体阻断CT-1的影响

材料与方法

试剂和化学品

小鼠抗心肌营养素-1抗体和预免疫的山羊IgG对照由Digna-Biotech公司（潘普洛纳，西班牙）提供，并由R&D Systems公司（明尼阿波里斯，明尼苏达州）制备。两种药剂溶解于0.9%的盐溶液中使终浓度达到5μg/ml。关于麻醉，使用比例为2:2:1的氯胺酮（Ketolar，辉瑞）、苯二氮（Valium，罗氏）和阿托品（Atropina，Braun）混合物。对于手术后期，购买0.3mg/ml的丁丙诺啡（Buprex，先灵葆雅）。

动物

雄性野生型C57BL/6小鼠（Charles River实验室S.L.,UK）在标准动物护理条件下饲养，并在手术前和手术后，提供标准鼠饲料和水，自由进食。使用前述方案进行I/R损伤的诱导（Docherty,N.G.等.2006.Nephrol.Dial.Transplant.(8):2106-19）。缺血选择和获取结果的时间点基于发现肾功能损伤最大限度的再现性并使这些动物死亡率最低的时间。

肾脏缺血/再灌注

以60mg/kg体重的剂量，采用腹腔内注射麻醉混合物（氯胺酮-苯二氮-阿托品）对动物进行麻醉；使用恒温毯使动物核心体温维持在37oC。然后，进行中线剖腹手术。来自I/R组的小鼠经受肾脏缺血30分钟。为此，识别左肾肾动脉和静脉，并用微血管钳夹住。在缺血期结束之前5分钟，移除右肾（右单侧肾切除术）。移除肾钳后，再观察左肾5分钟以确保回流，然后在37°C向腹部注入1ml盐溶液。最后，使用缝合材料3-0采用连续缝合对切口进行两层缝合。预处理的动物组，在缺血期之前15分钟，通过阴茎静脉，静脉注射抗-CT-1抗体或山羊免疫前IgG。假手术的小鼠作为对照，除了不使用微血管钳夹住之外，与I/R小鼠一样经历相同的手术过程（

等2004.Am.J.Transplant,4(10):1605-1613;García-Criado,F.J.等1998.Transplantion,66(8):982-990）。

术后期

手术后，小鼠被送回自己的笼子，在笼子里小鼠从麻醉中苏醒并被观察24小时。以0.01mg/kg体重剂量皮下注射丁丙诺啡进行术后镇痛（Aller,M.A.等2009.Liver Int.29(8):1132-40）。动物可自由采水和进食。在研究过程中检测小鼠体重及体力活动。

样品采集

为了测试肾脏功能，按照如上所述收集血样（Morales,A.I.等2006.Toxicol.Appl.Pharmacol.210:128-135）。在手术开始之时以及缺血24小时之后，使用肝素化毛细管（大约200μl）从小鼠尾端获得血样。血样离心后，边界处的浆细胞对毛细管产生了破坏作用，进而提取出血浆，将血浆存储于-20°C下微量离心管中，以便做进一步分析。

动物处死

基于初步公布的数据（Jerkic,M.等2004.Nephrol.Dial.Transplant,19:83-94;Morales,A.I.等2002.Antiox.Redox Signal,4:893-898），发明人观察到这个外科手术过程引发可逆的急性肾损伤，7天后恢复正常功能。由于本发明人还发现最大损伤度出现在24小时到48小时之间，所以他们选择获取I-R后第48小时的肾脏样品。

小鼠在再灌注后4小时（组1-4）和48小时（组5-8）的指定时间点被处死。再灌注后，使用戊巴比妥钠（40mg/kg体重）腹腔注射使小鼠麻醉，通过心脏穿刺收集血样，并且在骨分差水平，在原位使用冷的等渗盐溶液对小鼠进行整个腹主动脉灌注。离心血样（6000g，3分钟），从而分离血浆，冷冻该血浆并在-80°C储存以用于进一步生化研究。在实验期结束时移除左肾。肾蒂被捆绑并称重。剪下一片组织，固定于4%的甲醛缓冲液中24小时，然后包埋在石蜡里用于组织病理学和免疫组化评价。肾脏的另一部分通过浸没在液氮中快速冷冻并储存在-80°C以用于进一步生化分析（Sánchez-González,P.D.等2010.Nephrol.Dial.Transplant,(11):3484-95）。

血浆尿素的测定

使用自动化方法进行血浆样品中尿素浓度的生化测定（

Roche Diagnostics,巴塞罗那，西班牙），用市售诊断试剂盒（Roche Farma，西班牙）作为肾功能障碍的指标（Grande,M.T.等2010.Kidney Int.,77(6):509-518）。

脂质过氧化物（丙二醛）的测定

如上文所述，使用TBARs分析测定肾脏样品中的丙二醛（MDA）水平，其中MDA作为脂质过氧化作用指标（

等2002.Hypertension,40(5):713-20）。组织在磷酸盐/氯化钠溶液中均化。将等分的匀浆加入到含有20%的三氯乙酸和0.67%的硫代巴比土酸的反应混合物中。然后在100°C将混合物煮沸15分钟，以9,000g离心5分钟。在532nm，通过分光光度法测定上清液的吸光度。

髓过氧化物酶（MPO）活性的测定

使用对前述小鼠酶特异的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，根据制造商（Hycult Biotech，荷兰）的说明和指导，测定肾脏样品中作为多形核细胞（PMN）积累的指标的髓过氧化物酶（MPO）活性。肾脏匀浆样品中MPO的浓度用ng/mg蛋白表示。

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的测定

使用对前述小鼠细胞因子特异的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，根据制造商（R&D Systems，明尼阿波里斯市，明尼苏达州）的说明和指导，定量TNF-α的血清水平。血浆中TNF-α的浓度以pg/ml表示。

CT-1蛋白质印迹

准备肾脏组织提取物，并根据标准实验方案通过蛋白质印迹分析（Suzuki,Y.等2012.Biotech.Histochem.,87(4):241-8）。简言之，含有100μg蛋白的提取样品通过10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转移到PVDF膜上。用5%的BSA封闭后，细胞膜与抗-CT-1抗体（稀释1:500；R&D Systems）在4°C下过夜培养。然后，在用TBST洗涤膜三次之前，用二级HRP-共轭的抗-鼠IgG抗体培养1小时（稀释1:10,000；Bio-Rad Laboratories）。洗涤后，使用图像阅读器（ImageQuant RT ECL,GE Healthcare，西班牙），用电化学发光(ECL)HRP底物检测免疫复合物，并测定条带。再次用鼠单克隆抗-GADPH抗体（1:20,000；Ambion Applied Biosystems）探测细胞膜，以验证蛋白质在每个泳道中的加载量相等。

组织病理学检查

在递增浓度的乙醇（60、80、96、100%）中使甲醛固定的组织样品脱水，并用甲苯冲洗，在二甲苯中清除。然后，在60°C下，将每个样品包埋到融化的石蜡中，形成块，其中每片具有适当定向的组织。借助于切片机，切割4μm的切片并置于载玻片上（Morales,A.I.等2006.Food Chem.Toxicol.,44(12):2092-100）。

苏木精和曙红染色

将石蜡固定的肾切片固定在载玻片上并用苏木精和曙红染色，以用于用光学显微镜检测。每个切片数字化拍摄随机选取的5个图像（放大400倍）并分析光密度（Grande,M.T.等2010.Kidney Int.,77(6):509-518）。

CT-1和ED-1的免疫组织化学染色

用胰蛋白处理切片，用于ED-1染色（CD-68），或进行微波以用于心肌营养素-1染色。然后用单克隆抗-ED-1抗体（1:200）（M0814；DakoCytomation，丹麦）和多克隆抗-CT-1抗体（1:200）（AF438；R&DSystems,明尼阿波里斯市，明尼苏达州）培养肾脏组织。在加湿室内，4℃下，用一级抗体培养过夜，接着用抗体（1:100,Cy3-共轭的兔抗-大鼠，JacksonLaboratories，德国）进行第二反应。核DNA经DAPI染色，并用激光扫描光谱共焦显微镜（TCS SP2,Leica）以400倍放大显现免疫荧光染色（Grande,M.T.等2010.Kidney Int.,77(6):509-518）。

数据统计分析

使用NCSS软件进行统计分析。数值表示为n个独立实验的平均值。来自正态分布的数据值被表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。Scheffe的校正检验用于多重比较。对于不符合正态分布的数据，数值表示为中值并且Kruskal-Wallis检验用于多重比较。通常，在所有之前的试验中假设并认为是统计显著的最大阿尔法误差为p<0.05或Z>1.96。

1.用抗-CT-1抗体阻断的CT-1对单侧肾缺血引起的急性肾功能衰竭的严重程度的影响

在该研究中，研究了在单侧肾缺血的小鼠模型中抗-CT-1抗体阻断的CT-1对急性肾功能衰竭的严重程度的影响。

每只笼子饲养4至5只小鼠，并使动物屋舍的条件保持为室温20±2°C，50%的湿度，12：12小时的昼夜循环。小鼠用标准的颗粒饲料喂养，并自由饮水。经过7天的适应期后，将60只小鼠随机分配到以下8组中：

·组1.对照4小时组（对照-4小时，n=4）；在肾缺血（30分钟）之前15分钟，小鼠接受单剂量推注的盐溶液，接着单肾摘除，并再灌注4小时。

·组2.对照IgG4小时组（对照IgG-4小时，n=8）；在肾缺血（30分钟）之前15分钟，小鼠接受单剂量推注的山羊免疫前IgG，接着单肾摘除，并再灌注4小时。

·组3.抗-CT-14小时组（抗-CT-1-4小时，n=8）；在肾缺血（30分钟）之前15分钟，小鼠接受单剂量推注的抗-CT-1抗体（50μg/kg，静脉注射），接着单肾摘除，并再灌注4小时。

·组4.假手术4h小时组（假手术-4小时，n=4）；在上述外科手术之前15分钟，除了不进行肾I/R之外，小鼠接受单剂量推注的盐溶液。

·组5.对照组（对照，n=10）；在肾缺血（30分钟）之前15分钟，小鼠接受单剂量推注的盐溶液，之后单肾摘除并再灌注48小时。

·组6.对照IgG组（对照IgG，n=10）；在肾缺血（30分钟）之前15分钟，小鼠接受单剂量推注的山羊免疫前IgG，接着单肾摘除，并再灌注48小时。

·组7.抗-CT-1组（抗-CT-1，n=10）；在肾缺血（30分钟）之前15分钟，小鼠接受单剂量推注的抗-CT-1抗体（50μg/kg，静脉注射），接着单肾摘除，并再灌注48小时。

·组8.假手术组（假手术，n=6）；在上述外科手术之前15分钟小鼠接受单剂量推注的盐溶液，接着单肾摘除并再灌注48小时。

抗-CT-1抗体对临床方面和体重的影响

图34示出了研究期间，I/R后48小时，4个实验组中动物的体重。假手术组中的所有小鼠在所有时间点示出了好的方面，正常的运动性和稳定的体重。然而，I/R组示出了差的方面和低的运动性，伴随有再灌注期后明显的体重减轻。在抗-CT-1处理的小鼠中，这些由手术引起的健康恶化略高于对照组（盐溶液或山羊IgG处理的小鼠）。

抗-CT-1抗体对存活率的影响

图35示出了研究期间，I/R后48小时，4个实验组中小鼠的存活率。所有没有进行手术（假手术组）的小鼠示出了正常的存活，并且在该组中没有观察到死亡率。然而，I/R处理后的小鼠在缺血后24小时内示出了轻微的死亡率，存活率约为90%（10只动物活9只）。缺血后48小时，在抗-CT-1组中，存活率下降到70%（10只动物活7只）并且在对照组（盐溶液或山羊IgG处理的小鼠）中的存活率为80%（10只动物活8只）。

抗-CT-1抗体对肾功能的影响

图36示出了研究期间，I/R后48小时，4个实验组中的血浆尿素水平变化。结果表明在假手术组中血浆尿素浓度保持不变。至于接受肾I/R的小鼠，在缺血后24小时，血浆尿素水平增加，达到最大峰值。在抗-CT-1处理的小鼠中，该肾功能损伤的增加高于对照组（盐溶液或山羊IgG处理的小鼠），但是这些组之间没有显著差异。在最后的时间点或者缺血后48小时，所有I/R组中的血浆尿素浓度回到几乎正常水平。

抗-CT-1抗体对肾炎的影响

图37示出了I/R后48小时，在4个实验组中的丙二醛（MDA）的水平。与假手术组相比，来自经受I/R小鼠的肾脏示出了增加的MDA水平，表明肾组织中脂质过氧化作用增加。在抗-CT-1处理的小鼠中观察到的MDA组织水平显著高于在盐溶液对照中观察到的水平。

图38示出了I/R后48小时，在4个实验组中的肾脏的髓过氧化物酶（MPO）的水平。与假手术组相比，来自经受I/R小鼠的肾脏示出了显著增加的MPO水平，表明浸润至肾组织中的中性粒细胞增加。I/R抗-CT-1处理的小鼠的肾脏具有显著高于来自对照组和对照IgG组的MPO活性水平。对照组和对照-IgG小鼠的肾组织之间没有观察到肾脏MPO水平的显著差异。

图39示出了I/R后4小时，在4个实验组中的TNF-α的血浆水平。与假手术组相比，I/R引起血清中的TNF-α水平显著升高。与I/R对照组和对照IgG组相比，抗-CT-1治疗在血清中没有引起TNF-α水平的显著变化。

抗-CT-1抗体对肾脏CT-1表达的影响

图40示出了I/R后48小时，在4个实验组中的通过蛋白质印迹测定的CT-1的肾脏表达。与假手术组相比，在所有I/R组小鼠中CT-1的表达增加。当与其他组相比较时，用抗-CT-1抗体处理，导致这些蛋白表达显著增加。

抗-CT-1抗体对肾脏组织学的影响

I/R后的48小时后，用苏木精-曙红对左肾的切片进行染色，并通过光学显微镜分析。组织学检验表明在假手术组小鼠中，肾构架正常，但是在经历I/R的小鼠中，示出了很大程度的肾损伤。具体地，肾脏表现出管状结构恶化、肾小管扩张、肿胀、肾小管细胞坏死以及管腔充血。在血管周围可见炎症性浸润。在抗-CT-1组中，当与仅经历I/R的肾脏相比，肾脏的切片示出了肾损伤组织学的这些特征的严重程度显著增加。在对照组和对照-IgG小鼠之间测定的上述任何一个组织学参数没有差异（数据未示出）。

抗-CT-1抗体对肾脏巨噬细胞浸润的影响

I/R后48小时获得的左肾切片使用巨噬细胞特异性标记物（抗-CD68抗体）进行染色。I/R（缺血后48小时）两天后，在萎缩性肾小管周围的间质组织中，大多数表达了CD-68阳性细胞（ED-1阳性）。在施用抗-CT-1小鼠的I/R后的CD-68阳性细胞的数量显著高于对照组。在对照组和对照-IgG小鼠之间没有观察到巨噬细胞浸润的显著差异。在假手术组的肾脏中，巨噬细胞的染色是最小的（数据未示出）。

B.CT-1的治疗效果

材料与方法

样品的制备与分析

尿液的获得

将大鼠置于单个代谢笼中，它们自由获取食物和饮料。适应2天后，将24小时尿液收集到量筒中。收集的尿液以2,500rpm离心8分钟，以从残留物中分离干净的尿液，收集干净的尿液，并储存在-80° C用于后续分析。

血液和血浆的获得

通过在尾部末端的小切口，用带有肝素的毛细管获得血样。每只大鼠提取出5个毛细管（200μL），并且将毛细管在离心机中，以11,000rpm离心3分钟。离心后，借助于锉刀，通过细胞浆界限使毛细管破裂。提取血浆并在-80° C下储存在微量离心管中以用于后续分析。

提取并处理肾脏以用于组织学研究和蛋白质印迹

在每个实验结束时，处死动物并提取肾脏进行动物死后的研究。提取之前，用肝素化盐水溶液灌注肾脏，以从血管树去除血液。为此，以10mg/kg重量剂量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠。为了进入腹腔，在腹部切一个切口（剖腹手术）并分离肠道块以将导管插入髂分叉内的主动脉。通过该导管，在37° C下，灌注20mL肝素化盐水溶液。此后，肾脏被切除、提取并切成两半。将一个肾脏和另一个肾脏的一半浸在液氮中迅速冷冻并储存在-80°C下以进行后续的蛋白质印迹研究。另外半个肾脏置于4%的甲醛缓冲溶液（pH7）中，并用甲醇稳定，以用于组织学研究。一旦在甲醛中能够固定，在该甲醛溶液中保持24小时后，使用一系列具有增加梯度浓度的醇类使肾脏脱水，从乙醇开始进行。之后，每个包埋在60°熔融石蜡中的样品在烘箱中干燥1小时，形成块，其中切片具有合适的定向，用切片机（MICRON HM-310）切3μm厚的切片，然后将切片置于载玻片上。用二甲苯使切片脱蜡，并且使样品通过一系列递减浓度的乙醇直到达到100%的蒸馏水再水化。

用于蛋白质印迹的组织匀浆的制备

冷藏在-80°C的肾脏样品通过两个金属板之间的晃动被粉碎，在所有时间都将样品保持在干冰中，以避免样品融化和变质。然后，称重100mg的每种样品的组织粉末，组织提取物由此制成。为此，每40mg的组织粉末用大约400mL的裂解缓冲液（140mM氯化钠、50mM的EDTA、10%的甘油、1%的NP-40、20mM Tris pH=7.5，1mg/ml亮抑酶肽、1mg/ml的抑肽酶、5mmol/l的苯甲基磺酰氟（PMSF）、5mM的NaF和1mmol/l pH=7.5的Na₃VO₄）均化，并且借助于滴定器（Politron），均化样品。然后，在4°C下，以14,000g离心组织裂解物20分钟。最后，收集上清液，并冷冻于–80°C直到使用。使用市售试剂盒，根据Lowry比色法，用一等分来测定样品中的总蛋白（Lowry等J Biol Chem.1951;193:265）。

肾功能分析

肌酐和肌酐清除率的测定

为了测定肾功能，测定了肌酐血浆浓度和肌酐清除率，这两项指标用于测量肾小球滤过率。肌酐清除率（CrCl）根据公式CrCl=UF x CrU/CrP进行计算，其中UF是尿液流量（ml/分钟），CrU是尿液中的肌酐浓度（mg/ml），CrP是血浆中的肌酐浓度（mg/ml）。尿液中的肌酐浓度和血浆中的肌酐浓度由半自动分析仪（Reflotron，罗氏）测定。

血浆尿素的测定

使用半自动分析仪（Reflotron，罗氏），通过市售试剂盒的特异性反应条带测定血浆中尿液的浓度。

蛋白尿的测定

通过布拉德福德比色法（Bradford’s colorimetric method）测定尿液中蛋白质的浓度（蛋白尿）（Anal Biochem.1976;72:248-54）。24小时内的尿蛋白排泄物根据以下公式计算：UE_prot=C_prot x FU_24h，其中C_prot是尿液中的蛋白质浓度（mg/mL），FU_24h是24小时的尿流量（mL/天）。

尿液流量的测定

尿液流量（mL/天）通过带刻度的容器测定，该容器包括在代谢笼中所收集到的24小时的尿液，如尿液的获得中所示。

N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）的测定

为了进行该测试，使用购自罗氏的市售试剂盒，按照制造商的说明书进行，并用KC-Junior软件对结果进行分析。

通过蛋白质印迹测定KIM-1和NGAL

在蛋白质印迹技术中，将100μg的总肾脏组织匀浆的蛋白或每只动物的相应于排泄物组分的尿液体积加载到聚丙烯酰胺凝胶中。通过电泳分离后，这些蛋白被转移到PVDF膜（Inmobilon-P#IPVH00010，马德里，西班牙）上，并使用抗KIM-1（R&D Systems）和NGAL（MBL）的抗体杂交。

脂质过氧化物（丙二醛）的测定

使用分光光度技术，基于2分子硫代巴比妥酸（TBA）与1分子MDA（脂质过氧化的最终产物）在45°C下的反应测定丙二醛，该反应致使稳定的发色团并在532nm处具有最大吸光度（Recknagel RO,Ghoshal AL,1966,Exp Mol Pathol5:413-426）。

用polytron匀浆机，使组织样品在1:5比例（w:v；mg/μL）的匀浆液（20mM磷酸盐/50mM NaCl，pH=7.4）以及70%的高氯1:0.05（w:v；mg/μL）中均匀化。以4,200rpm离心15分钟。取上清液用于测试，并使用Lowry法测定蛋白质。将200μL的上清液加入到96-孔板中。进行反应，并在分光光度计中测定532nm处的吸光度。结果以每升微摩尔表示（μmol/L）。

组织学研究

用苏木精-曙红染色

该技术显示了组织细胞的形态结构，因为它使细胞核，细胞质和基质的酸性区域染成蓝色的，而细胞质及其碱性组分染成粉红色。如上制备的肾脏组织学切片，在苏木精溶液中保持4分钟，然后用流动水洗涤，保持在曙红溶液中3分钟。一旦染色，样品用增加浓度的醇类（70°、90°、100°）再次脱水，用一滴加拿大香脂将其永久固定，其上载玻片用封固剂封固（Tissue-Tec）。使用连接到具有10倍镜头的光学显微镜上的高分辨率摄像机捕获图像。使用绿色滤光器以提高对比度。

免疫组织化学研究

通过消除切片（cuts）的内源信号，以过氧化氢和3%甲醇开始免疫组织化学技术。然后，切片被封闭，之后与第一抗体和第二抗体培养。然后，向样品中加入HRP（辣根过氧化物酶）。紧接着，加入发光团3,3'-二氨基联苯胺（DAB）。将该制品轻轻浸入到苏木精中以用于对比。最后，切片用一系列增加浓度的醇类再次脱水，其上载玻片用封固剂封固(Tissue-Tec)，从而切片能在光学显微镜下观察。

测定超氧阴离子O ₂ ^- (SOA)的产生

为了测定肾脏中SOA产生水平，使用了一种技术，该技术是对Boveris测定线粒体方法的修改[Boveris A.Methods Enzymol.1984;105:429-435]，其基于被O₂ ^–原子团还原的细胞色素C。简言之：

-准备一个用于光谱测定的比色皿（1ml的比色皿），加入100μl的细胞色素C（75μM），20μl的超氧化物歧化酶（SOD；大约264U），25μl的样品和缓冲溶液（0.1M磷酸钾+0.1mM EDTA；pH7.8），直到体积达到1,000μl；

-准备参考比色皿，不添加样品，添加100μl的细胞色素C（75μM），20μl的SOD，和缓冲溶液，直到体积达到1,000μl；

-准备另一个类似的不含有SOD的比色皿，用于研究细胞色素C的非特异性还原；

-根据在2相中的分光光度测定细胞色素C的还原（λ在550nm，pH7.8，并且25°C的温度下，在1分钟内，每隔6秒时，在1ml的比色皿中，用1cm的光路）：1.细胞色素C非特异性的还原（没有SOD）和2.细胞色素C依赖于超氧化物歧化酶的还原（含有SOD）；

-将反应混合物中的吸光度单位的增加转换成具有摩尔消光系数的SOA的nmol：ΔE₅₅₀/ 21.0x10³M^-1cm^-1；考虑到在参考比色皿中的细胞色素C被完全氧化的情况，并且观察到的增加的吸光度仅表示还原产物的吸光度，Δ吸光度：还原-氧化；

-以这种方法，超氧阴离子SOA的产生以nmol/ mg蛋白质/分钟表示。

髓过氧化物酶活性（MPO）的测定

根据以下方法分析肾脏样品中的髓过氧化物酶（一种中性粒细胞的特定的酶，用作评估肾脏的中性粒细胞浸润）的存在（Mullane KM等,J PharmacolMethods 1985,14(3):157-167）：一旦样品获得即在冰中称重，并在液氮中冷冻，之后储存在-80°C下直到进行测定。之后，样品在pH为6.0的溶液中均化，该溶液由用0.5%的十六烷基三甲基溴化铵缓冲的50mM磷酸钾和0.146% 的EDTA组成，比例为1g组织/10ml均化溶液。组织被均化，然后在冰上进行超声处理10次，每次5秒，以这种方式使细胞（其中，中性粒细胞）裂解，使髓过氧化物酶游离于溶液中。该匀浆物以15,000g离心30分钟，离心时的内温维持在3到4℃之间。弃上清，并在50℃下培养2小时，以去除干扰髓过氧化物酶测定的其他类型的过氧化物酶和其他化合物。准备用于试验的pH为6.0的缓冲溶液，其由用0.167 mg/ml的二氯化邻联茴香胺缓冲的50 mM的磷酸钾和0.005%的过氧化氢组成。对照使用试验缓冲液做的空白，在460nm波长（λ）及25℃下，用已知量的MPO绘制标准曲线。髓过氧化物酶活性单位（U）被定义为在25°C下，分解1μmolH₂O₂/分钟的酶的量。

TNFα、IL-1β、IFN-γ、IL-6和IL-10细胞因子的测定

使用DuoSet ELISA开发系统大鼠试剂盒，根据制造商的说明书，通过ELISA测定血浆中的这些细胞因子的水平。在所有情况下，细胞因子的水平以pg/ml表示。试验原理：这是使用多抗体，用“夹心”原则的ELISA试剂盒。首先，使用96孔板，每孔中都附着有抗细胞因子的单克隆抗体以捕获存在于样品中的细胞因子，标准物一式两份与相应的空白对照一起加入到每孔中。洗涤平皿以去除未结合的物质后，加入抗细胞因子多克隆共轭的过氧化物酶。然后，再次洗涤平皿以去除未结合的物质，并加入底物溶液，这开始了过氧化物酶的催化反应。酸化终止了颜色的变化。

用λ为450nm测定吸光度，获得的结果与样品的细胞因子的量成比例，其通过代入标准曲线计算。

1.在造影剂诱导的肾病中心肌营养素-1影响的研究

使用碘化造影剂肾病的实验模型，包括通过静脉施用碘化造影剂泛影葡胺（Bayer C.N.909622EXO）给易患急性肾功能衰竭的大鼠。这种预先的情况是通过之前以毒性剂量的庆大霉素处理而获得的（Quirós等,Kidney Int.2010;78:1006-1015）。

实验在大约重220克的32只雄性Wistar大鼠中进行。动物生活的环境保持恒定：20°C左右的温度，大约60%的湿度以及每日12小时的光照时间（光周期）。

在设计的研究中，有六个实验组：

-对照组（C）：给大鼠施用盐溶液（n=5）。

-庆大霉素组（G）：给大鼠腹膜内施用庆大霉素（50mg/kg/天）连续6天，在开始前6天施用造影剂。我们实验室之前的研究证明这种处理不会引起任何可检测的肾功能改变，也没有肾小管病变，即使使用迄今为止最好的标记物（Quirós等,2010）（n=5）。

-心肌营养素组（CT-1)：在施用造影剂之前1天并在随后的4天，给大鼠静脉内施用心肌营养素（100μg/Kg/天）（n=5）。

-泛影葡胺组（Gg）：对大鼠静脉内施用单剂量的碘化剂（10mL/Kg；3.7mg/Kg）（n=5）。

-泛影葡胺+庆大霉素组（Gg+G）：在用庆大霉素处理结束的下一天给大鼠施用碘化剂（n=6）。

-泛影葡胺+庆大霉素+心肌营养素组（Gg+G+CT-1）：给大鼠施用碘化剂、庆大霉素和心肌营养素（n=6）。

将动物饲养在代谢笼中，以便收集不含粪便的尿液。同样地，每天用肝素化毛细管从尾部获得血样（0.150ml）。

在实验结束时（施用碘化造影剂4天后），麻醉大鼠，随后用肝素化盐溶液进行灌注。从这些动物中获得肾脏，将部分样品引入甲醛中进行组织学研究，而另一部分样品超冷冻用于组织研究。

进行了以下研究：

·血浆肌酐、血浆尿素、蛋白尿、微量白蛋白尿

·代谢笼中的肌酐清除率

·肾小球滤过率（GFR；菊粉清除率）、肾血浆流量（RPF；对-氨基马尿酸清除率），肾血管阻力（RVR）。

·肾毒性尿液标记物：NAG（N-乙酰氨基葡萄糖苷酶）、LDH（乳酸脱氢酶）、GGT（γ谷氨酰转移酶）、KIM-1（肾损伤分子1）、PAI-1（纤溶酶原激活剂抑制剂1）、波形蛋白。

存活情况

在C、G-、Gg和CT-1组中的所有动物都存活下来，直到实验结束。在Gg+G-和Gg+G+CT-1组中，每组有一只动物死亡。

一般状况与体重评价

来自C、G-和CT-1组的动物在整个实验中，显示出了健康的表观以及正常的运动性。然而，用泛影葡胺处理的动物显示出更差的表观，并且双腿肿胀，在施用15-20分钟之后恢复正常。尽管如此，在实验组之间，体重增加没有明显的差异（图1）。

肾功能

Gg+G组产生了下降的肌酐清除率（作为肾小球滤过状态的指标），这意味着排泄减少，并因此，代谢产物，例如肌酐、尿素和其他衍生物在血液中积累（作为尿液血浆浓度的整体进行测量）（图2-4）。同样地，联合施用Gg+G伴随有高蛋白尿出现（图5）。

施用CT-1（Gg+G+CT-1组）部分逆转了肌酐清除率的下降、肌酐、尿素以及蛋白尿血浆浓度的升高（图2-5）。单独施用庆大霉素、泛影葡胺和CT-1不改变任何这些参数（图2-5）。

肾毒性的尿液标志物

NAG是用于诊断和监测肾病的溶酶体酶。它在尿中随着肾损伤而增加，并且被认为是肾小管损伤的标志物。我们的研究结果显示，在动物中用Gg+G处理，NAG增加。CT-1减少这种增加类似于蛋白尿，其证实了相关的肾小管损伤的调查结果（图6）。

KIM-1是一种I型膜蛋白，其被作为比NAG更敏感的早期标记物开发。小管损伤期间，KIM-1的胞外结构域被切割，并且它在尿液中检测到的增加视为损伤的非常早期的标记。如图7中所示，可以观察到如何用Gg+G联合处理引起尿液中的抗KIM-1抗体反应条带明显升高。在与对照相比，庆大霉素、泛影葡胺和CT-1没有产生影响。就其本身而言，CT-1可以极大降低由Gg+G的联合处理产生的KIM-1表达的增加。

纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）是纤维蛋白溶解过程的抑制剂，其参与炎症反应和组织修复。在许多细胞类型中它的表达由于炎症介质被增加。它还由于慢性和急性肾损伤而表达增加。我们的结果表明，在施用造影剂并预先致敏（Gg+G组）的动物尿液中，PAI-1表达明显增加。这些结果表明在该实验组中，发生了损伤，其中似乎涉及作为修复响应损伤的炎性过程。在用庆大霉素、泛影葡胺或CT-1处理的大鼠中，该标志物的水平与对照组没有差异。在Gg+G+CT-1组也没有出现该标记物，其反应了CT-1的保护作用（图7）。

急性肾清除率

在获得的结果中，证明在用庆大霉素和碘化剂造影剂（Gg+G）处理的组中，肾小球滤过率（GFR）中的菊粉清除率下降，这与CT-1的结果相反（图8）。肾血浆流量（RPF）遵循相似的模式：在用庆大霉素和碘化剂造影剂处理的组中下降，在与CT-1共同处理的组中结果相反（图9）。此外，施用庆大霉素和泛影葡胺增加肾血管阻力（RVR）（图10），这可能表明释放血管收缩因子（或抑制血管扩张因子的效果）的参与，其将阻碍血液经肾流通，已经有描述该类型制剂的信息。CT-1和庆大霉素及泛影葡胺的共同施用抵消了RVR的增长。

2.在顺铂引起的急性肾损伤中心肌营养素-1影响的研究

实验在24只大约重220克的雄性Wistar大鼠中进行。动物生活的环境保持恒定：20°C左右的温度，大约60%的湿度以及每日12小时的光照时间（光周期）。

所有涉及动物及其饲养的方法都根据萨拉曼卡大学的公共准则进行管理，并符合西班牙（法条121/000123/2007/西班牙；RD1201/2005/CyL）和国际（指令2003/65/EC）法。

动物被分在4个实验组中，每组包括6只。在用顺铂进行单独处理之前一天开始每天用心肌营养素-1处理，连续7天。该实验设计如下所述进行：

·组I（对照，C，n=6只动物）在7天内，通过静脉注射赋形剂处理动物。

·组II（心肌营养素-1，CT-1，n=6只动物）给在7天内，以100μg/kg体重的日剂量通过静脉注射给动物施用心肌营养素-1。

·组III（顺铂，P，n=6只动物）以6mg/kg体重的单剂量通过腹膜内给动物施用顺铂。

·组IV（心肌营养素-1-顺铂，CT1-P，n=6只动物）动物用相同剂量的心肌营养素-1和顺铂进行处理，给药途径分别根据组II和III。

存活情况

在毒性研究的进展过程中，动物的存活情况表现出显著数据。图11示出了实验期间，4个研究组中动物的存活情况。

与对照组相比，用心肌营养素-1，以6mg/kg剂量施用的顺铂和顺铂-心肌营养素在整个实验期间，没有改变动物的存活情况（图11）。

一般情况和体重

动物的一般情况以及体重是药物效果的肉眼评估中的重要方面。图12示出了整个实验期间，4个研究组中的动物体重。

以6mg/kg剂量顺铂进行的抗肿瘤处理导致动物体重显著下降，该下降在用心肌营养素-1联合处理的动物组中显著减少。这个事实由动物的身体状况的外部评估证实，其中，作为抗肿瘤处理的结果，观察到动物的身体状况显著恶化，而与心肌营养素-1联合施用处理时，动物身体状况有惊人的改善。就其本身而言，心肌营养素-1组在整个研究过程中，体重增加，与对照组相比没有明显的不同（图12）。

尿液流量

尿液流量的变化表示了其他的且甚至发人深省的由药物处理产生的肾损伤的信息。图13示出了动物的尿液流量变化，所述动物为4个实验处理组中进行研究的动物。用6mg/kg剂量的顺铂进行的细胞生长抑制处理导致轻度双向性多尿症（biphasic polyuria）。然而，在实验进行期间，共同施用心肌营养素-1和顺铂显示出恒定变化的尿液流量，与对照组和心肌营养素-1相比没有显著差异。这一事实显示了心肌营养素-1在顺铂相关性肾病中明显的肾脏保护功能（图13）。

基础肾功能

作为肾功能的安全并有效的参数，血浆肌酐的测定是药物肾毒性特有的标志物。图14示出了在研究期间，4个实验组动物的血浆肌酐的变化过程。用6mg/kg剂量的顺铂进行的抗肿瘤治疗诱导了血浆肌酐的显著增加，主要是从抑制细胞处理第2天后，在用心肌营养素-1联合治疗的动物组中，该增加显著减少。这一事实证实了由顺铂引发的可逆性急性肾损伤，其中在连续7天的100μg/kg静脉注射心肌营养素-1能够保护并缓解由这个抗肿瘤药物所诱导的肾毒性。就其本身而言，心肌营养素-1组在所述肾脏参数评估中，与对照组相比没有变化（图14）。

器官的重量

不同器官的重量评价构成了药物毒性活性研究的补充信息。图15反映了在实验结束时，4个研究组中不同器官的重量（相对于动物的体重）。

用6mg/kg剂量的顺铂进行的抗肿瘤处理使最终的肾脏重量显著增加，在用心肌营养素-1联合治疗的动物组中，该增加显著减少（图15，左上图）。这一事实再次证实了在由顺铂导致的急性毒性肾脏损伤中，用心肌营养素-1处理获得了肾脏保护。然而，其他器官（心脏、肺和肝脏）最终重量的评估与对照组相比，没有显著改变，这支持了顺铂的肾毒性特征以及心肌营养素-1保护作用的理论。就其本身而言，与对照组相比，心肌营养素-1组在体重的发展过程中没有变化（图15）。

3.在庆大霉素诱导的急性肾损伤中心肌营养素-1影响的研究

实验组：

a)对照（C）：每天静脉注射一次赋形剂（n=6）。

b)CT-1：CT-1（100μg/kg/天，静脉注射），连续7天（n=6）。

c)G：庆大霉素（150mg/kg/天，腹膜内），连续6天（n=6）。

d)G+CT-1：CT-1（100μg/kg/天，静脉注射）连续7天，并且从第2天开始同时施用庆大霉素（150mg/kg/天，腹膜内）连续6天（n=6）。

存活情况

在对照（C）和CT-1组中的所有动物都存活下来，直到实验结束。在G和G+CT-1组中，每组有一只动物死亡。

一般情况和体重评估

来自对照（C）和CT-1组中的动物在整个实验中，显示出了健康的表观以及正常的运动性。然而，用庆大霉素处理的动物显示出更差的表观，减少活动性并且毛发色浅。这些特征在G+CT-1组的动物中显著降低。如图16所观察到的，与对照组和CT-1组相比，接受G的大鼠的体重显示了轻微的降低。CT-1部分地减缓了由G引发的体重损失。

血压和心率

在对照（C）和G组中，实验的结果是收缩压（SBP）略微升高。在接受CT-1的组中没有观察到这个略微的升高（图17，上图）。在整个实验中，所有组动物的心率同样地略微增加（图17，下图）。

器官重量

处死时，处理的结果是，右肾和心脏的重量（相对于体重）没有发生变化。对于肝脏而言，CT-1诱发了一定的肝肿大，其在用G（G+CT-1）共处理的组中消失。G组本身，另外示出了肝脏相对重量减少的倾向，其抵消了CT-1的肝脏肿大影响。然而，CT-1诱发的显著的脾肿大在与G一起处理时没有发生变化（图18）。

肾功能

G诱发明确的急性肾功能衰竭，其通过代谢产物在血液中的积累和肌酐清除率的大幅度下降（通过肾小球滤过率测量）（图21）而显示，该代谢产物例如尿素及其衍生物（以尿素血浆浓度共同测定）和肌酐（图19和20）。同样地，G诱发了高蛋白尿（图22），根据该抗生素的肾毒性专业文献，其是管状起源的，并且起因于肾间隙损伤和功能改变。CT-1与G的同时施用部分地缓解了肌酐清除率的下降，血浆肌酐以及尿素浓度和蛋白尿的升高（图19-22）。单独施用CT-1没有引起这些参数的任何改变（图19-22）。

与对照组（C）的动物相比，单独施用G或者CT-1都没有改变尿流量。然而，这两种化合物共同施用产生了协同效应，其逐步增加尿流量，直到达到大于其他组的3-4倍体积为止（图23）。

肾脏组织的完整性

通过肾切片的组织学研究测定G和CT-1作用后的肾脏组织情况，通过组织和相关组织损伤和修复的尿液标志物的测定。如图24所示，其具有显示肾皮质的图像，庆大霉素导致肾脏的皮质区的大规模肾小管坏死，其中观察到许多肾小管完全坏死并且其他肾小管部分坏死，这与对药物的肾作用的认识一致。与CT-1的共同处理适度并部分阻止了肾小管损伤的延伸，观察到更少的肾小管完全和部分坏死。然而，即使是与CT-1的共同处理，庆大霉素也产生了显著的肾小管损伤。总体而言，这些结果与肾损伤和修复标志物的生物化学分析一致。因此，如图25所示，在用G处理的动物中，尿液中N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）（溶酶体酶，其标志着，除其他外，肾小管损伤）的排泄量高度增加，与G在肾脏间质中所产生的严重的破坏一致。CT-1降低了NAG排泄量的增加，特别是损伤的第一天所产生的次最大量。CT-1对NAG排泄量影响的曲线几乎与蛋白尿的曲线一致，这更加证实了与肾小管损伤有关的结果。

图26示出了用G处理如何诱导KIM-1的肾脏水平，以及尿液中抗KIM-1抗体的反应条带明显增加。与对照组相比，CT-1没有产生任何影响。然而，可以观察到的是CT-1没有明显的减少G产生的肾脏KIM-1表达的增加。此外，这可以表明再生过程与在用G处理的动物中一样有活性。然而，观察到在尿液中的KIM-1的上部条带（大约90kDa）部分减少，这与部分降低损伤一致。

NGAL（“中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白”）是一种与炎症过程相关的脂质运载蛋白，其被探测到在各种形式的肾损伤中增加，在组织和尿液中都增加，并且NGAL被提议为作为肾损伤的最早和最灵敏的标志物之一。在图26中，可以观察到G和CT-1如何诱导肾脏和尿液NGAL的增加。

4.在肾缺血/再灌注诱导的急性肾损伤中心肌营养素-1影响的研究

肾缺血/再灌注（I/R）是急性肾衰竭的典型病因，并且在肾移植中I/R可能引起急性肾小管坏死或移植物功能初始延迟或延迟肾功能（DRF）。I/R与急性排斥反应的发生率是相互关联的（Matas AJ.等Transplantation.2000;69(1):54-58）并且临床和实验证据也已将由于I/R导致的损伤确定为同种异体移植物的慢性肾功能衰竭的风险因子。

11组动物进行试验，每组由5只大鼠组成，每只大鼠进行60分钟的左肾缺血。

1.IR4小时C。含生理盐水血清。再灌注4小时。

2.IR4小时CT-1。400μg/kg。再灌注4小时。

3.IR24小时C。含生理盐水血清。再灌注24小时。

4.IR24小时CT-1。400μg/kg。再灌注24小时。

5.IR3天C。含生理盐水血清。再灌注3天。

6.IR3天CT-1。400μg/kg。再灌注3天。

7.IR7天C。含生理盐水血清。再灌注7天。

8.IR7天CT-1。400μg/kg。再灌注7天。

9.IR14天C。含生理盐水血清。再灌注14天。

10.IR14天CT-1。400μg/kg。再灌注14天。

11.模拟的大鼠组（Sim）。

建立缺血30分钟后，500μl的含生理盐水血清（IR C组）或含400μg/kg的CT-1的500μl的含生理盐水血清（IR CT-1组）通过阴茎静脉施用给大鼠。接受右肾切除的动物被列为模拟组。

存活情况

进行存活研究，目的在于检测CT-1抵抗由于I/R导致的肾损伤的保护效果。I/R之后14天，未处理的缺血组（IR14天C）示出了40%的死亡率，同时在IR14天CT-1组中，20%的动物死亡（图27）。

肾功能

I/R之后48小时，经受IR的动物中血浆肌酐明显高于模拟组（Sim）的动物，而在IR CT-1组中，血浆肌酐明显低于IR C组，与模拟组（Sim）大鼠相比没有显著差异（图28A）。

I/R之后48小时，IR C组中的肌酐清除率明显低于模拟组，而在IRCT-1组中的大鼠显著高于IR C动物（图28B）。

超氧阴离子O₂ ^-（SOA）产生的测定

血流恢复之后4小时，在缺血对照组（IR C）中的超氧阴离子（SOA）的肾水平显著高于模拟组和IR CT-1组。来自CT-1组的数据显著低于缺血对照组（IR C），但是显著高于模拟组（图29）。由于中性粒细胞和巨噬细胞浸润是I/R-诱导组织炎症的关键阶段，所以测定肾组织中髓过氧化物酶活性（MPO）。缺血对照组（IR C）中肾脏髓过氧化物酶活性（MA）肾水平大于模拟组5倍以上，并且在缺血对照组中也显著高于CT-1组。来自IR CT-1组的动物具有类似于模拟组中获得的数值（图30）。

促炎性细胞因子产生的测定

再灌注之后4小时，缺血再灌注诱导促炎性细胞因子的血浆水平显著增加。IR C组中的TNF-α（图31A）、IL-1β（图31B）和IFN-γ（图31C）的水平分别比模拟组高11、6和4倍。用CT-1处理阻断了这三种由IR诱导的细胞因子的增加。此外，缺血并再灌注之后，IL-6（图31D）和IL-10（图31E）的血浆水平降低。在接受CT-1动物中，没有观察到该减低（图31D和31E）。

肾脏组织的完整性

组织学研究表明，再灌注后24小时，对照的缺血肾脏示出了坏死的肾小管细胞构成的透明残留物以及许多空泡的肾小管细胞堵塞了大量细胞。在用CT-1处理的肾脏中，被阻塞的肾小管以及空泡细胞比对照肾脏中少（图32）。再灌注后48小时，对照的缺血肾脏示出了许多裸露的肾小管以及许多具有炎性浸润的区域。在用CT-1处理的肾脏中，裸露的肾小管以及浸润比对照肾脏少（图33）。

结论

作为CT-1阻断的结果，通过促炎性过程，在经受缺血/再灌注（I/R）的小鼠中，施用抗-CT-1抗体诱导肾损伤的严重程度显著增加。在章节A中获得的结果强化了CT-1在保护肾脏免受I/R诱导的肾损伤中的作用。

获得的结果表明，在动物的造影剂肾病的实验模型中（该动物用庆大霉素致敏），静脉施用重组人CT-1（100μg/kg/天）降低了肾脏排泄功能的恶化以及肾小管的损伤程度。此外，CT-1可以保护涉及造影剂诱导的肾毒性的血管和肾小球影响。

关于由于药物导致的急性肾毒性，特别是由于抗肿瘤药物，例如顺铂导致的急性肾毒性，获得结果允许我们总结如下：

1.在雄性Wistar大鼠中，以6mg/kg单剂量通过腹膜内施用顺铂处理，是合适的用于由于药物诱导的急性肾毒性的研究的体内实验模型。

2.连续7天，以100μg/kg/天的剂量，通过静脉施用大鼠心肌营养素-1，对以6mg/kg剂量施用的顺铂诱导的肾损伤具有保护作用。

关于由庆大霉素诱导的急性肾毒性的研究，结果证明在Wistar大鼠中，通过静脉施用重组人CT-1（连续7天，以100μg/kg/天的剂量，开始用G处理之前的一天以及随后6天）对于庆大霉素产生的急性肾损伤具有保护作用。CT-1减少了肾脏排泄功能的恶化以及由庆大霉素诱导的肾小管的损伤程度。

关于由缺血/再灌注诱导的急性肾损伤模型，施用CT-1防止了急性肾损伤、肾功能衰退、氧化应激和缺血/再灌注诱导的炎症。

Claims (60)

1. 一种用于预防和/或治疗急性肾损伤的诱导心肌营养素-1活性(CT-1)的化合物，其中所述诱导心肌营养素-1活性化合物选自以下组中：

(i) 心肌营养素-1 (CT-1)或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体，

(ii) 编码CT-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体的多核苷酸，

(iii)包含根据 (ii)所述的多核苷酸的载体，及

(iv)能够将心肌营养素-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体分泌到培养基中的细胞。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述急性肾损伤选自由肾前性引起的急性肾损伤和肾性引起急性肾损伤组成的组。

3. 根据权利要求2所述的化合物，其中所述急性肾损伤为肾前性引起的急性肾损伤。

4. 根据权利要求3所述的化合物，其中所述肾前性引起的急性肾损伤选自由通过受试者暴露于缺血状态下引发的急性肾损伤和由缺血后再灌注引发的急性肾损伤组成的组。

5. 根据权利要求2所述的化合物，其中所述急性肾损伤为肾性引起的急性肾损伤。

6. 根据权利要求5所述的化合物，其中所述肾性引起的急性肾损伤是由肾毒性剂引发的。

7. 根据权利要求6所述的化合物，其中所述肾毒性剂选自由造影剂、抗生素、免疫抑制剂和抗肿瘤剂组成的组。

8. 根据权利要求7所述的化合物，其中所述造影剂选自由含碘造影剂、含溴造影剂、含钡造影剂、含钆造影剂及其组合物组成的组。

9. 根据权利要求8所述的化合物，其中所述造影剂含碘。

10. 根据权利要求9所述的化合物，其中所述含碘造影剂选自由泛影酸及其盐，甲泛影酸及其盐、碘克沙酸及其盐、异泛影酸及其盐、碘帕醇、碘海醇、碘昔兰、碘普胺、碘佛醇、碘克沙醇、甲泛葡胺及其组合物组成的组。

11. 根据权利要求10所述的化合物，其中所述含碘造影剂是一种或多种泛影酸盐。

12. 根据权利要求11所述的化合物，其中所述含碘造影剂为泛影酸钠和泛影酸葡甲胺的组合物。

13. 根据权利要求7所述的化合物，其中所述抗生素选自由氨基糖苷类和头孢菌素组成的组。

14. 根据权利要求13所述的化合物，其中所述氨基糖苷类抗生素选自由庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素、链霉素、紫苏霉素、新霉素及其组合物组成的组。

15.根据权利要求14所述的化合物，其中所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素。

16. 根据权利要求7所述的化合物，其中所述免疫抑制剂选自环孢菌素A、他克莫司（FK506）和依维莫司。

17. 根据权利要求7所述的化合物，其中所述抗肿瘤剂选自由铂基化合物、抗代谢物、DNA烷化剂、拓扑异构酶 I或II 抑制剂及其组合物组成的组。

18. 根据权利要求17所述的化合物，其中所述铂基化合物选自由顺铂、卡铂及其组合物组成的组。

19. 根据权利要求18所述的化合物，其中所述化合物为顺铂。

20. 根据权利要求17所述的化合物，其中所述抗代谢物选自由甲氨蝶呤、喷司他丁、5-氮杂胞苷、羟基脲及其组合物组成的组。

21. 根据权利要求17所述的化合物，其中所述DNA烷化剂选自由卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、异环磷酰胺、丝裂霉素C 及其组合物组成的组。

22. 根据权利要求17所述的化合物，其中所述拓扑异构酶 I或II 抑制剂选自由依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素及其组合物组成的组。

23. 根据权利要求6-22任一项所述的化合物，其中所述诱导心肌营养素-1活性的化合物与肾毒性剂共同施用。

24. 根据权利要求1-23任一项所述的化合物，其中所述诱导心肌营养素-1活性的化合物通过静脉途径施用。

25. 根据前述任一项权利要求所述的化合物，其中所述诱导心肌营养素-1活性的化合物为序列为SEQ ID NO：1的人源CT-1。

26. 根据权利要求25所述的化合物，其中以每日100 μg/kg的剂量施用心肌营养素-1。

27. 根据前述任一项权利要求所述的化合物，其中所述诱导心肌营养素-1活性的化合物减缓肾脏排泄功能的恶化。

28.根据前述任一项权利要求所述的化合物，其中在不存在IL-6家族成员的可溶性受体或其片段时进行施用诱导心肌营养素-1活性的化合物。

29.根据权利要求28所述的化合物，其中所述可溶性受体为CT-1受体或其片段。

30. 根据前述任一项权利要求所述的化合物，其中在不存在后肾间质生长因子时进行施用诱导心肌营养素-1活性的化合物。

31. 一种组合物，同时或分别地包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和肾毒性剂。

32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述诱导心肌营养素-1活性的化合物选自以下的组：

 (i) 心肌营养素-1 (CT-1)或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体，

(ii) 编码CT-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体的多核苷酸，

(iii)包含根据 (ii)所述的多核苷酸的载体, 及

(iv)能够将心肌营养素-1或具有与CT-1至少60%同一性的功能等效变体分泌到培养基中的细胞。

33. 根据权利要求31或32所述的组合物，其中所述肾毒性剂选自由造影剂、抗生素、免疫抑制剂和抗肿瘤剂组成的组。

34. 根据权利要求33所述的组合物，其中所述造影剂选自由含碘造影剂、含溴造影剂、含钡造影剂、含钆造影剂及其组合物组成的组。

35. 根据权利要求34所述的组合物，其中所述造影剂含碘。

36. 根据权利要求35所述的组合物，其中所述含碘造影剂含碘造影剂选自由泛影酸及其盐，甲泛影酸及其盐、碘克沙酸及其盐、异泛影酸及其盐、碘帕醇、碘海醇、碘昔兰、碘普胺、碘佛醇、碘克沙醇、甲泛葡胺及其组合物组成的组。

37. 根据权利要求36所述的组合物，其中所述含碘造影剂为一种或多种泛影酸盐。

38. 根据权利要求37所述的组合物，其中所述含碘造影剂为泛影酸钠和泛影酸葡甲胺的组合物。

39.  根据权利要求33所述的组合物，其中所述抗生素选自由氨基糖苷类和头孢菌素组成的组。

40. 根据权利要求39所述的组合物，其中所述氨基糖苷类抗生素选自由庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素、链霉素、紫苏霉素、新霉素及其组合物组成的组。

41. 根据权利要求40所述的组合物，其中所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素。

42.根据权利要求33所述的组合物，其中所述免疫抑制剂选自由环孢菌素A、他克莫司（FK506）和依维莫司组成的组。

43. 根据权利要求33所述的组合物，其中所述抗肿瘤剂选自由铂基化合物、抗代谢物、DNA烷化剂、拓扑异构酶 I或II 抑制剂及其组合物组成的组。

44. 根据权利要求43所述的组合物，其中所述铂基化合物选自由顺铂、卡铂及其组合物组成的组。

45. 根据权利要求44所述的组合物，其中所述化合物为顺铂。

46. 根据权利要求43所述的组合物，其中所述抗代谢物选自由甲氨蝶呤、喷司他丁、5-氮杂胞苷、羟基脲及其组合物组成的组。

47. 根据权利要求43所述的组合物，其中所述DNA烷化剂选自由卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、异环磷酰胺、丝裂霉素C 及其组合物组成的组。

48. 根据权利要求43所述的组合物，其中所述拓扑异构酶 I或II 抑制剂选自依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素及其组合物组成的组。

49. 根据权利要求31-48任一项所述的组合物，其中所述组合物同时、单独或顺序施用。

50. 根据权利要求31-49任一项所述的组合物，其中所述诱导心肌营养素-1活性的化合物通过静脉途径施用。

51.根据权利要求31-50任一项所述的组合物，其中所述诱导心肌营养素-1活性的化合物为序列为SEQ ID NO：1的人源CT-1。

52. 根据权利要求31-51任一项所述的组合物，其中所述诱导心肌营养素-1活性的化合物减缓肾脏排泄功能的恶化。

53. 根据权利要求31-52任一项所述的组合物，不包含IL-6家族成员的可溶性受体或其片段。

54. 根据权利要求53所述的组合物，其中所述可溶性受体为CT-1受体或其片段。

55. 根据权利要求31-54任一项所述的组合物，不包含后肾间质生长因子。

56.一种用作诊断剂的包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和造影剂的组合物。

57. 一种用于预防和/或治疗抗生素相关的肾毒性的包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和抗生素的组合物。

58. 一种用于预防和/或治疗免疫抑制剂相关的肾毒性的包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和免疫抑制剂的组合物。

59. 一种用于预防和/或治疗抗肿瘤剂相关的肾毒性的包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和抗肿瘤的组合物。

60.包含诱导心肌营养素-1活性的化合物和造影剂的组合物的在制备诊断剂中的用途。

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