JP3320774B2 - 薬剤組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）結合蛋
白（本明細書においてＴＢＰと称する）よりなる、自己
免疫疾患と移植片対宿主反応の治療のための薬剤組成物
に関する。

【０００２】腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、生物の保護に
関与する多機能なサイトカインであるが、過剰に産生さ
れるといくつかの疾患において重大な病原性を示すこと
がある。ＴＮＦは炎症反応に関与しており、リウマチ疾
患において組織への障害のメディエーターであり（ボイ
トラーとセラミ（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｃｅｒ
ａｍｉ，Ｃ．）、エヌ・イー・ジェイ・エム（ＮＥＪ
Ｍ）第３１６巻、３７９−３８５頁（１９８７年））、
移植片対宿主反応で観察される障害のメディエーターで
ある（ピグエット（Ｐｉｇｕｅｔ，Ｐ．Ｆ．）ら、ジェ
イ・エクスプ・メド（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）第１６６
巻、１２８０−８９頁（１９８７年））ことは公知であ
る。

【０００３】２つのＴＮＦ結合蛋白（ＴＢＰ−ＩとＴＢ
Ｐ−ＩＩと称する）は、最初にそれぞれ同じ出願人のイ
スラエル特許出願第８３８７８号と９０３３９号に記載
され、ＴＮＦの毒性から細胞を保護し ＴＮＦの細胞へ
の結合を妨害することが示された。その後の研究でこれ
らの２つの蛋白は、細胞表面のＴＮＦリセプター（ＴＮ
Ｆ−Ｒ）の２つの分子種に構造が類似していることが証
明され、ＴＢＰ−１はＴＮＦ Ｉ型リセプターの可溶性
型に関連しており、ＴＢＰ−ＩＩはＴＮＦ ＩＩ型リセ
プターの可溶性型に関連していることが証明されている
（エンゲルマン（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ Ｈ．）ら、ジェ
イ・ビオル・ケム（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６
４巻、１１９７４−１１９８０頁（１９８９年）：エン
ゲルマン（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ Ｈ．）ら、ジェイ・ビ
オル・ケム（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６５巻、
１５３１−１５３６頁（１９９０年））。ＴＮＦの細胞
表面リセプターのように、これらのリセプターの可溶性
型はＴＮＦに特異的に結合し、従ってその細胞への結合
を妨害して、ＴＮＦ活性の生理的インヒビターとして作
用する。

【０００４】免疫系の主要な機能は、外来の侵入者（例
えば微生物）による感染から個体を守ることであるが、
免疫系が個体の組織を攻撃して自己免疫疾患（これはし
ばしば炎症反応に関連している）として知られている病
状になることがある。自己免疫疾患の例としては、リウ
マチ様関節炎、若年型Ｉ型糖尿病、全身性ループスエリ
テマトーデス 甲状腺炎、および多発性硬化症などがあ
る。リウマチ様関節炎は関節の炎症症状を特徴とする疾
患である。全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）
は、皮膚の赤い鱗状の斑点と、疾患が進行した状態では
腎臓の機能異常が特徴であり、血管（特に腎臓の血管）
中の免疫複合体の沈着により引き起こされる炎症反応に
関係がある。多発性硬化症は脱力、休の震え、そして極
端な場合は痺痲を引き起こす、再発性の炎症状態が特徴
的なヒトの疾患であり、抹消神経細胞を取り囲む防御性
ミエリン鞘の免疫系の攻撃に関係がある。ＴＮＦは全身
性ループスエリテマトーデス、リウマチ様関節炎および
多発性硬化症の炎症反応に関係がある。

【０００５】同じ出願人の公開されたヨーロッパ特許出
願第３９８３２７号と４１２４８６号では、ＳＬＥ患者
においてＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩの血清レベルは、有
意にかつ疾患の活動性に相関して増加しており、これは
ＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩは、疾患の活動性の感受性の
高いマーカーとして使用できるかも知れないことを示し
ており、ＳＬＥ患者や他の自己免疫疾患患者の疾患の活
動性に関連する免疫の活性化を追跡するのに有用である
かも知れないことが開示されている。

【０００６】本発明において、腫瘍壊死因子結合蛋白
（ＴＢＰ）は自己免疫疾患や移植片対宿主反応の治療に
有用であることが見いだされた。ＴＢＰは内因性の可溶
性ＴＮＦリセプターＩ型とＩＩ型の生理活性を補うもの
であり、自己免疫疾患におけるその産生は、ＴＮＦの障
害作用に対して過剰に応答することを防ぐ安全装置であ
ることが示唆されている。

【０００７】従って本発明は、自己免疫疾患や移植片対
宿主反応の治療のための、薬剤として許容される担体
と、有効量の踵瘍壊死因子結合蛋白（本明細書において
ＴＢＰと称する）、その塩、機能性誘導体、前駆体また
は活性画分、またはこれらの組合せよりなる薬剤組成物
を与える。

【０００８】本発明の組成物において使用されるＴＢＰ
は、天然の資源、例えばヒトの尿（エンゲルマン（Ｅｎ
ｇｅｌｍａｎｎ Ｈ．）ら、ジェイ・ビオル・ケム
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６４巻、１１９７４
−１１９８０頁（１９８９年）；エンゲルマン（Ｅｎｇ
ｅｌｍａｎｎ Ｈ．）ら、ジェイ・ビオル・ケム（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６５巻、１５３１−１５３
６頁（１９９０年）；オルソン（Ｏｌｓｏｎ，Ｉ．）
ら、ヨーロ・ジェイ・ヘマトル（Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｈａｅ
ｍａａｔｏｌ．） 第４２巻、２７０−２７５頁（１９
８９年）；セッキンガー（Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ，Ｐ．）
ら、ジェイ・ビオル・ケム（Ｊ・Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．） 第２６４巻、１１９６６−１１９７３頁（１９
８９年））、または組換え法（ノプハー（Ｎｏｐｈａ
ｒ，Ｙ．）ら、イーエムビーオー・ジェイ（ＥＭＢ０
Ｊ）第９巻、３２６９−３２７８頁（１９９０年）；シ
ャル（Ｓｃｈａｌｌ，Ｔ．Ｊ．）ら、セル（Ｃｅｌｌ）
第６１巻、３６１−３７０頁（１９９０年）；レーチャ
ー（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，Ｈ．）ら、セル（Ｃｅｌｌ）
第６１巻 ３５１−３５９頁（１９９０年））により
得られ、次に上記特許出願第８３８７８号と９０３３９
号に記載されたように精製される。

【０００９】本明細書において「ＴＢＰ」、「ＴＢＰ−
Ｉ」および「ＴＢＰ−ＩＩ」という用語は、天然の資源
または組換えＤＮＡ法により得られるすべてのＴＮＦ結
合蛋白を意味し、イスラエル特許出願第８３８７８号と
９０３３９号に記載されたＴＮＦ結合蛋白ＩとＩＩ、お
よび細胞表面ＴＮＦリセプターＩ型とＩＩ型の可溶性
型、その塩、機能性誘導体、前駆体およびこれらの活性
画分（これらの最後の定義はイスラエル特許出願第８３
８７８号と９０３３９号で定義されたものであり、これ
らはそれぞれ特開平２−２００号公報および特開平３−
１９７４９９号公報に対応する）などがあるが、これら
に限定されるものではない。

【００１０】「薬剤として許容される」という用語は、
活性成分の生物活性の有効性は妨害せず、投与される宿
主に対して毒性がない、任意の担体を意味する。例えば
非経口投与用には、ＴＢＰは食塩、ブドウ糖溶液、正常
血清アルブミンおよびレンゲル液などの賦形剤中で、注
射用の単回投与型で製剤化される。どのようなタイプの
非経口投与（例えば静脈、筋肉内および皮下投与）でも
よい。しかし局所の炎症を治療する場合は、局所投与
（例えばリウマチ様関節炎で関節の炎症を治療するため
の局所への注射、または多発性硬化症での脳脊髄液への
注射）が好適である。薬剤として許容される担体以外
に、本発明の組成物はまた、少量の添加剤（例えば安定
剤、賦形剤、緩衝剤および保存剤）も含むであろう。

【００１１】「有効量」という用語は、自己免疫疾患の
経過と重傷度に影響して患者の病状を改善し、疾患の縮
小すなわち緩解に導くのに充分な量のＴＢＰを意味す
る。有効量は、投与経路、治療すべき疾患および患者の
病状に依存する。外から投与したＴＢＰは、ＴＮＦの毒
性を中和するのに内因性に生成されるＴＢＰを補足する
ことを考慮すると、患者の血清または他の適当な体液中
のＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩのレベルを測定すること
は、患者に対して適切な投与量を決めるのに有用であ
る。

【００１２】本発明を以下の実施例で説明する。いくつ
かの例で実験的自己免疫疾患の動物モデルが使用される
（コーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｉ．Ｒ．） ら、ジェイ・イ
ンベスト・デルマトル（Ｊ．ＩＮｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａ
ｕｌ）第８５巻、３４ｓ−３８ｓ頁（１９８５年））。

【００１３】実施例１：ラットのアジュバント関節炎の
治療 アジュバント関節炎は、関節の慢性の炎症と特徴とする
実験的疾患であり、完全フロイントアジュバントまたは
マイコバクテリウムチューバーキュローシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の画
分で免疫することによりいくつかのラットで誘導するこ
とができ、ヒトのリウマチ様関節炎のモデルと見なされ
ている（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．）、アー
スライティス・リューマ（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅ
ｕｍ．）第７巻、８０−８６頁（１９６４年））。この
疾患は免疫後約１１−１２日後に現われ、（最も顕著に
は四肢の小関節で）非関節性リンパ節炎（ｐａｎｕｓ）
のある関節滑液の単核球の浸潤（これは何カ月も進行
して骨の破壊や関節の強直を引き起こす）を特徴とす
る。ルイス（Ｌｅｗｉｓ） ラットを油中のエム・チュ
ーバーキュローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
で免疫する（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．）、
プロク・ソク・エクスプ・ビオル・メド（Ｐｒｏｃ．ｃ
ｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．）第９１巻、９５−
１０１頁（１９５６年））。数日後、臨床的関節炎がは
っきり現れる前または後に、異なる投与量のＴＢＰ−Ｉ
またはＴＢＰ−ＩＩを、１回または数日間にわたって毎
日ラットの皮下に接種し、すでに記載されているように
（ホロシッツ（Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚ，Ｙ．）ら、サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２１９巻、５６−５８頁（１
９８３年））、０−１６のスケールで関節炎の進行のス
コアをつける。疾患の出現を阻害するかまたは部分的阻
害を引き起こす投与量が有効な投与量である。最適の投
与量は、疾患の出現後に投与された時、疾患の進行を阻
害し永久的に緩解させる投与量である。ヒトの患者に最
適な投与量はこれらの投与量から計算される。

【００１４】実施例２：ラットにおける実量的自己免疫
疾患脳脊髄炎（ＥＡＥ）の治療 実験的自己免疫疾患脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、中枢神経系
の白質（ｗｈｉｔｅｍａｔｔｅｒ）、またはミエリンの
塩基性蛋白またはその断片による免疫で、種々の種（ラ
ット、モルモット、マウス、ウサギなど）で誘導するこ
とができる実験的疾患である。これは多発性硬化症のモ
デルと考えられており、ヒトのこの神経疾患に類似して
おり ＥＡＥは免疫系が、抹消神経細胞を取り囲む保護
性ミエリン鞘を攻撃する自己免疫疾患である。この疾患
の特徴は、臨床的には急性の痺痲であり、組織学的には
中枢神経系の白質中の血管のまわりに単核細胞の浸潤が
見られることである（コーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｉ．
Ｒ．）、 前述）。適当なアジュバント（例えば完全フ
ロイントアジュバント）中のモルモットのＢＰ（塩基性
蛋白）またはＢ′Ｐの脳炎誘発性の主要な断片（アミノ
酸６８−８８）をラットに注射してＥＡＥを誘発する。
接種１日前と１０日間毎日、ラットに食塩（対照）また
は異なる投与量のＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩを与える。
ラットに痺痲が現れるか否か観察する。疾患の重症化を
阻害する投与量が有効な投与量であると考えられる。

【００１５】実施例３：ＳＬＥ患者におけるＴＢＰ−Ｉ
とＴＢＰ−ＩＩの血清レベルと抗−ｄｓＤＮＡ抗体との
相関 ヨーロッパ特許出願第３９８３２７号と４１２４８６号
に記載されたＥＬＩＳＡ法により、ＳＬＥ患者３８名と
対照の健常人１４０名の血清中のＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−
ＩＩのレベルを測定した。対照群におけるＴＢＰ−Ｉと
ＴＢＰ−ＩＩの血清濃度（平均±ＳＤ）は、それぞれ
０．７７±０．１９ｎｇ／ｍｌと３．０２±０．５７ｎ
ｇ／ｍｌであった。これらの値は年齢と性には関係はな
かった。ＳＬＥ患者においては、有意の高濃度のＴＢＰ
−ＩとＴＢＰ−ＩＩが観察された。平均±ＳＤは、ＴＢ
Ｐ−Ｉについては１．８９±０．８９ｎｇ／ｍｌでり、
ＴＢＰ−ＩＩについては７．２５±３．８９ｎｇ／ｍｌ
であった。

【００１６】これらの結果を、ＳＬＥの疾患の活動性の
信頼できる感受性の高い指標であると考えられているパ
ラメーターである抗−ｄｓＤＮＡ抗体と比較した。各患
者においてＴＢＰと抗−ｄｓＤＮＡ抗体の相関を注意深
く観察すると、表１に示すように患者は３つの特徴的な
群に分けられた： 第１群 − 抗−ｄｓＤＮＡ抗体が正常レベルであり、
ＴＢＰ−Ｉ（患者９名）またはＴＢＰ−ＩＩ（患者１１
名）が正常濃度である患者。 第２群 − 抗−ｄｓＤＮＡ抗体が正常レベルである
が、ＴＢＰ−Ｉ（患者１８名）またはＴＢＰ−ＩＩ（患
者１６名）濃度が上昇している患者。 第３群 − これらの３つのパラメーターがすべて上昇
している患者（１１名）。

【００１７】第２群および第３群はともにＴＢＰレベル
が上昇していたが、抗−ｄｓＤＮＡ抗体の上昇の程度の
みでなく、これらは疾患活動性の他のパラメーターにも
差があった（表１）。第２群に比較して、第３群は平均
疾患指数が高く（１．７±０．６対２．４±０．８、ｐ
＜０．０２）、補体Ｃ４レベルは低く（９．４±４対３
０±１３ｍｇ／ｄｌ、ｐ＜０．０１）、そして平均プレ
ドニソン摂取は高かった（２０．７±１７．７対９±９
ｍｇ／日、ｐ＜０．０５）。

【００１８】それぞれ可溶性ＴＮＦリセプターＩ型とＩ
Ｉ型に対応するＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩの産生亢進
は、自己免疫疾患においてＴＮＦの障害作用に拮抗する
生物の拮抗作用を構成するかも知れない。本研究におい
て、ＴＢＰは有意に上昇しているが疾患の活動性はあま
り上昇していないＳＬＥ患者の群が検出されることは、
ＴＢＰがこの疾患の進行を減弱化するという理諭と一致
し、ＴＢＰはＳＬＥの治療薬として使うことができるこ
とを示している。

【００１９】実施例４：ＳＬＥ患者の血清中のＴＢＰの
生物活性 − ＴＮＦ細胞毒性の阻害 血清ＴＢＰの生物活性を評価するために、ＴＮＦ細胞毒
性測定法により血清試料を試験した。ＴＮＦの細胞毒性
活性は、マウスのＡ９細胞を標的細胞として用いて求め
た。細胞を２０，０００細胞／ウエルの濃度で９６穴の
マイクロプレート中に植菌した。２４時間後上澄液を移
した。細胞を氷中につけ、ｒｈｕＴＮＦ（５単位／ｍ
ｌ、６×１０^７単位／ｍｇ蛋白）を、単独でまたは血清
試料と一緒に、ＴＢＰに対する抗体（ヨーロッパ特許出
願第３９８３２７号と４１２４８６号に記載）を加えて
または加えないで、またはヒトの尿から単離した精製Ｔ
ＢＰの試料を加えて、適用した。氷上でさらに９０分間
インキュベートした後、試料を移し、プレートを４℃の
冷媒体で２回洗浄した。次に１０％の胎児牛血清と２５
ｍｇ／ｍｌシクロヘキシミドを含有するダルベッコー改
変イーグル最小基本培地（ＤＭＥＭ）を添加した。１２
時間後、中性レッド（ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ）摂取測
定法により、細胞の生存活性を求めた。

【００２０】上記測定法によりＳＬＥ患者の血清例を試
験し、ＳＬＥ患者の血清はＴＮＦの細胞毒性作用からＡ
９細胞を保護することが証明された。阻害の程度は、血
清中に存在するＴＢＰと同じ量で尿からの精製したＴＢ
Ｐを適用した場合に観察された程度と相関した。それ自
身ではＡ９細胞毒性に対して効果がないＴＢＰに対する
ウサギの抗血清は、この測定法でヒトの血清の阻害作用
を阻止し、従って観察されたＴＮＦの生物活性の阻害
は、血清中に存在するＴＢＰの生物活性にのみ起因する
ことが確認された。これはＴＢＰはインビボでＴＮＦの
生物活性を中和するのに有効であり、自己免疫疾患にお
いてＴＮＦにより引き起こされる障害から患者を保護す
ることができる可能性を示している。

【表１】 表１ 群 １ ２ ３ ＴＢＰ 正常範囲 高い 高い抗−ｄｓＤＮＡ抗体 正常範囲 正常範囲 高い ＴＢＰ−Ｉ 患者の数 ９ １８ １１ ＴＢＰ−Ｉ（ng／m1） 0.94±0.14 2.15±0.89 2.17±0.86 抗−ｄｓＤＮＡ抗体％ 10.2±6.62 5.58±6.04 53 ±25 疾患指数 1.33±0.5 1.64±O.6 2.42±0.82 プレドニソン摂取（mg／日） 0 9±9 20.7±17.9 補体Ｃ３ − 126±34 67 ±36補体Ｃ４ − 30±13.2 9 ±4.6 ＴＢＰ−II 患者の数 １１ １６ １１ ＴＢＰ−II（ng／m1） 3.54±0.75 8.06±1.98 8.57±2.61 抗−ｄｓＤＮＡ抗体％ 10.2±7 5.3±5.9 51 ±25 疾患指数 1.18±0.4 1.78±0.57 2.41±0.79 プレドニソン摂取（mg／日） 0 7.6±9.5 20.7±18.8 補体Ｃ３ − 124.8±32 67 ±36補体Ｃ４ − 32.5±12.6 9 ±4

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハルトムット エンゲルマン ドイツ連邦共和国ミュンヘン 70，ジョ セフ ルッツ ベグ 35 (56)参考文献 特開 平２−200（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−169523（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−255623（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−504192（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開398327（ＥＰ，Ａ １) 欧州特許出願公開393438（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/00 - 38/42 A61P 1/00 - 43/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 全身性ループスエリテマトーデスの治療
   用の薬剤組成物において、薬剤として許容される担体
   と、有効量の腫瘍壊死因子結合蛋白（ＴＢＰ）−Ｉまた
   は−ＩＩ、その塩、ＴＢＰ−ＩまたはＴＢＰ−ＩＩのア
   ミノ酸残基の側鎖上またはＮもしくはＣ−末端上に存在
   する官能基から調製される機能性誘導体、動物またはヒ
   トの体の中でＴＢＰ−ＩまたはＴＢＰ−ＩＩに変換され
   る前駆体、またはＴＢＰ−ＩまたはＴＢＰ−ＩＩと同様
   の生物学的活性を有しＴＢＰ−ＩまたはＴＢＰ−ＩＩの
   ポリペプチド鎖の断片である活性画分、またはこれらの
   組合せよりなる、上記組成物。
2. 【請求項２】 天然のＴＢＰ−Ｉよりなる、請求項１に
   記載の薬剤組成物。
3. 【請求項３】 組換えＴＢＰ−Ｉよりなる、請求項１に
   記載の薬剤組成物。
4. 【請求項４】 天然のＴＢＰ−ＩＩよりなる、請求項１
   に記載の薬剤組成物。
5. 【請求項５】 組換えＴＢＰ−ＩＩよりなる、請求項１
   に記載の薬剤組成物。
6. 【請求項６】 ＴＢＰ−ＩとＴＢＰ−ＩＩよりなる、請
   求項１に記載の薬剤組成物。