EA007927B1 - Применение остеопротегерина для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к применению остеопротегерина для лечения и/или профилактики фиброзных заболеваний, в частности склеродермии.

Description

Область изобретения

Данное изобретение относится к области фиброзных заболеваний и заболеваний соединительной ткани. Более конкретно, изобретение относится к применению остеопротегерина для лечения и/или профилактики фиброзных заболеваний, в частности склеродермии. Комбинации остеопротегерина с интерфероном, антагонистом ΤΝΡ или дополнительным противофиброзным агентом, таким как БАКР-1, также входят в объем данного изобретения.

Предпосылки изобретения

Фиброз является состоянием, связанным с сверхпродукцией коллагена, например, во внутренних органах, включая почки, сердце, легкие, желудок и суставы.

Фиброз легких является одним из распространенных фиброзных заболеваний. Идиопатический легочный фиброз (1РЕ) характеризуется хроническим воспалением стенок альвеол с прогрессирующим фиброзом неизвестной этиологии. (РН или криптогенный фиброзирующий альвеолит является причиной 50-60% случаев идиопатической интерстициальной легочной болезни.

Типичная интерстициальная пневмония (ИГР), конкретный гистопатологический пример интерстициальной пневмонии, представляет собой классическую картину, выявляемую в биоптате легкого при 1РЕ. При небольшом увеличении ткань выглядит гетерогенной с чередованием областей нормального легкого, интерстициального воспаления, фиброза и областей с ячеистой структурой. Интерстициальное воспаление состоит из инфильтрата перегородок альвеол лимфоцитами, плазматическими клетками и гистиоцитами, вместе с гиперплазией пневмоцитов типа II. Фиброзные зоны главным образом состоят из плотного внеклеточного коллагена, хотя также могут быть видны отдельные очаги пролиферирующих фибробластов (фибробластные очаги), которые являются местами раннего и активного заболевания, обычно во внутриальвеолярном положении. Области с ячеистой структурой состоят из кистознофиброзных воздушных пространств, часто покрытых бронхиолярным эпителием и заполненных слизью. В слизи может создаваться пул нейтрофилов. В областях фиброза и ячеистой структуры часто возникает гладкомышечная гиперплазия. Подплевральное и парасептальное распределение, неоднородный характер и временная гетерогенность являются наиболее полезными признаками для идентификации ИГР.

Идентичная картина интерстициального воспаления и фиброза имеет место при коллагенозах сосудов (например, РА, СКВ, прогрессирующий системный склероз, смешанное соединительнотканное заболевание, сахарный диабет), пневмокониозе (например, асбестозе), лучевом повреждении и некоторых индуцированных лекарственными средствами заболеваниях легких (например, нитрофурантоином).

Клиническое течение 1РР является прогрессирующим; средняя продолжительность жизни составляет от 4 до 6 лет после постановки диагноза. Обычным лечением в случае 1РР является лечение преднизоном. Реакция на лечение варьирует, но, по-видимому, улучшение у пациентов при кортикостероидной или цитотоксической терапии более вероятно на более ранней стадии заболевания, когда в большей степени преобладает клеточная стадия, чем рубцевание. Поддерживающее и паллиативное лечение включает О₂ в высоких концентрациях, чтобы уменьшить гипоксемию, и в том случае, если имеет место бактериальная инфекция, антибиотики. Трансплантация легкого была успешной у пациентов на конечной стадии легочного заболевания.

Фиброз легкого связан с накоплением в печени соединительной ткани в результате дисбаланса между образованием и деградацией внеклеточного матрикса и обостряется спаданием сосудов и уплотнением предсуществующих волокон.

Фиброз печени является распространенной реакцией на некроз или повреждение клеток печени, которые могут быть индуцированы широким множеством агентов, например, любым процессом, нарушающим гомеостаз печени (особенно воспалением, токсическим повреждением или измененным потоком крови в печени), и инфекциями печени (вирусными, бактериальными, грибковыми и паразитическими). Многочисленные болезни накопления, возникающие в результате врожденных аномалий метаболизма, часто связаны с фиброзом, включая липидные аномалии (болезнь Гаучера); заболевания, связанные с депонированием гликогена (особенно типа III, IV, VI, IX и X); недостаточность αΐ-антитрипсина; депонирование экзогенных веществ, которое наблюдается при синдромах перегрузки железом (гемохроматоз) и заболеваниях, связанных с депонированием меди (болезнь Вильсона); накопление токсичных метаболитов (как в случае тирозинемии, фруктоземии и галактоземии); и нарушения пероксисом (синдром Зельвегера). Многочисленные химические вещества и лекарственные средства вызывают фиброз, особенно спирт, метотрексат, изониазид, оксифенизатин, метилдопа, хлорпромазин, толбутамид и амиодарон. Нарушения циркуляции в печени (например, хроническая сердечная недостаточность, синдром Бадда-Киари, веноокклюзионная болезнь, тромбоз портальной вены) и хроническая обструкция путей желчевыделения могут приводить к фиброзу. Наконец, врожденный фиброз печени является аутосомнорецессивным пороком развития.

Нормальная печень образована из гепатоцитов и синусоидов, распределенных во внеклеточном матриксе, состоящем из коллагена (преимущественно типов I, III и IV) и неколлагеновых белков, включая гликопротеиды (например, фибронектин, ламинин) и несколько протеогликанов (например, сульфат гепарана, хондроитинсульфат, дерматансульфат, гиалуронат). Фибробласты, обычно обнаруживаемые только в портальных трактах, могут продуцировать коллаген, крупные гликопротеиды и протеогликаны.

- 1 007927

Другие клетки печени (в частности, гепатоциты и жиросохраняющие клетки Купфера и эндотелиальные клетки) также могут продуцировать компоненты внеклеточного матрикса. Жиросохраняющие клетки, расположенные под эндотелием синусоидов в пространстве Дисса, являются предшественниками фибробластов, способных к пролиферации и продуцированию избытка внеклеточного матрикса. Развитие фиброза из активного отложения коллагена является следствием повреждения клеток печени, в частности некроза, и воспалительных клеток. Точные факторы, высвобождаемые из указанных клеток, неизвестны, но вероятно это один или несколько цитокинов или продуктов перекисного окисления липидов.

Клетки Купфера и активированные макрофаги продуцируют воспалительные цитокины. Вокруг некротических клеток печени образуются новые фибробласты; повышенный синтез коллагена приводит к рубцеванию. Фиброз может возникать в результате активного фиброгенеза и нарушенной деградации нормального и измененного коллагена. Жиросохраняющие клетки, клетки Купфера и эндотелиальные клетки имеют важное значение в клиренсе коллагена типа I, нескольких протеогликанов и денатурированных коллагенов. Изменения активностей указанных клеток могут модифицировать степень фиброза. Для гистопатолога фиброзная ткань может стать более очевидной на основании пассивного коллапса и уплотнения предсуществующих волокон.

Таким образом, повышенный синтез или сниженная деградация коллагена приводит к активному отложению избыточной соединительной ткани, которое влияет на функционирование печени: (1) перицеллюлярный фиброз ухудшает питание клеток и приводит к гепатоклеточной атрофии; (2) в пространстве Дисса фиброзная ткань накапливается вокруг синусоидов и препятствует свободному прохождению веществ из крови в гепатоциты; (3) фиброз вокруг венул печени и портальных трактов нарушает поток крови в печени. Венозное сопротивление вдоль печени увеличивается от ответвлений портальной вены к синусоидам и, наконец, к печеночным венам. Могут быть вовлечены все три пути.

Фиброзные полосы, которые связывают портальные тракты с центральными венами, также создают условия для анастомозных каналов: артериальная кровь, обходя нормальные гепатоциты, шунтируется к выносящим венам печени, что дополнительно нарушает функционирование печени и может усугублять гепатоклеточный некроз. Степень, в которой проявляются указанные процессы, определяет величину дисфункции печени: например, при врожденном фиброзе печени большие фиброзные полосы преимущественно охватывают портальные области, но обычно скудно представлены в паренхиме печени. Таким образом, врожденный фиброз печени проявляется в виде портальной гипертензии при сохранении гепатоклеточной функции.

Склеродермия является заболеванием соединительной ткани, характеризующимся фиброзом кожи и внутренних органов, приводящим к органной недостаточности и смерти (В1аск с1 а1., 1998; С1сшсп15 апб Ритй, 1996). Склеродермия имеет спектр проявлений и множество терапевтических последствий. Она включает очаговую склеродермию, системный склероз, подобные склеродермии нарушения и «склеродермию без склеродермии» (8тйй, 2000). В то время как очаговая склеродермия является редким дерматологическим заболеванием, связанным с фиброзом, и проявления ограничены кожей, системный склероз является заболеванием, затрагивающим многие системы, с варьирующим риском поражения внутренних органов и варьированием степени кожного заболевания. Системный склероз может быть диффузным или ограниченным. Ограниченный системный склероз также называют СКЕ8Т (кальциноз, дисфункция пищевода Рейно, склеродактилия, телеангиэкстазия). Полагают, что подобные склеродермии нарушения связаны с воздействием производственной среды. При заболевании «без склеродермии» имеет место поражение внутренних органов без изменений кожи.

Основным проявлением склеродермии и, в частности, системного склероза является несоответствующий синтез и отложение избыточного коллагена, дисфункция эндотелия, спазм, коллапс и облитерация в результате фиброза.

Склеродермия является редким заболеванием со стабильной частотой заболеваний примерно 19 случаев на 1 миллион человек. Причина склеродермии неизвестна. Однако важное значение имеет генетическая предрасположенность. Аномалии включают аутоиммунную реакцию и изменение функционирования эндотелиальных клеток и фибробластов. В действительности системный склероз, вероятно, является наиболее тяжелым из аутоиммунных заболеваний, причем сообщалось о 50% смертности в течение 5 лет после постановки диагноза (8бтап, 1991).

Что касается диагноза, то важным клиническим параметром является уплотнение кожи вблизи пястно-фаланговых суставов. Феномен Рейно является частым, почти универсальным компонентом склеродермии. Он диагностируется по изменениям окраски кожи при воздействии холодом. Ишемия и уплотнение кожи являются симптомами болезни Рейно.

Несколько лежащих в основе биологических процессов вовлечены в инициацию, тяжесть и прогрессирование болезни и включают дисфункцию сосудов, активацию и повреждение эндотелиальных клеток, накопление лейкоцитов, продукцию аутоантител и имеющую критическое значение неконтролируемую фиброзную реакцию, которая может привести к смерти (С1стсп15 апб Ритй, 1996). Фибробласты играют основную роль в патогенезе данного заболевания. Первичные фибробласты, полученные от пациентов со склеродермией, проявляют много характерных свойств заболевания, наблюдаемых ш νίνο, особенно увеличенный синтез и отложение внеклеточного матрикса, особенно коллагена и фибронекти

- 2 007927 на, и измененную продукцию фактора роста и цитокинов, таких как ΤΟΡβ и СТСР (8!теЬ1оте апб Когп, 1998 и ЬеКоу, 1974).

Не существует радикального лечения склеродермии. В качестве инновационного, но связанного с высоким риском лечения предлагалась трансплантация аутологичных стволовых клеток (Матйш е! а1., 1999). В частности, в настоящее время не существует способов лечения склеродермии, нацеленных на процесс фиброза (\Уф1еу апб Войпд. 2000).

Идентификация генов, связанных с риском заболевания и прогрессированием склеродермии, может привести к разработке эффективных способов вмешательства на различных стадиях заболевания.

Остеопротегерин (ОРС) впервые идентифицирован в 1997 г. как новый цитокин, секретируемый фибробластами (81шопе! е! а1., 1997). ОРС человека является белком, состоящим из 401 аминокислоты и содержащим сигнальный пептид из 21 аминокислоты, который отщепляется перед глутаминовой кислотой 22, приводя к зрелому белку из 380 аминокислот. Таким образом, ОРС является растворимым белком. Он является членом семейства рецепторов ΤΝΤ (Мотшада е! а1., 1998, Уакиба е! а1., 1998), содержащим четыре богатых цистеином ΤΝΡΒ-подобных домена в своей Ν-концевой части (81шопе! е! а1., 1997). Показано, что ОРС играет роль в развитии костей, и мыши, у которых отсутствовал ген ОРС, имели остеопорозный фенотип и грубые аномалии скелета (Мш е! а1., 2000).

Остеопротегерин, который продуцируется остеобластами и клетками стромы костного мозга, не имеет трансмембранного домена и действует как секретируемый рецептор-ловушка, который не обладает способностью к прямой передаче сигнала. ОРС действует посредством связывания со своим природным лигандом - лигандом остеопротегерина (ОРСЬ), который также известен как ΚΑΝΚΤ (активатор рецептора лиганда ΝΤ-каппаВ). Связывание между ОРС и ОРСЬ препятствует тому, чтобы ОРСЬ активировал свой родственный рецептор ΚΑΝΚ, который является рецептором остеокластов, необходимым для дифференцировки, активации и жизнеспособности остеокластов.

ОРС человека является членом семейства ΤΝΡΚ и представлен однокопийным геном, который состоит из 5 экзонов и охватывает 29 т.п.о. генома (81шопе! е! а1., 1997). Рекомбинантный ОРС существует в мономерной и димерной формах с кажущимися молекулярными массами 55 и 110 кДа, соответственно (81шопе! е! а1., 1997). Укорочение Ν-концевого домена до цистеина 185 вызывает инактивацию, вероятно в результате разрушения дисульфидной связи 883 ΤΝΡΚ-подобного домена, тогда как укорочение Сконцевой части белка до аминокислоты 194 не изменяет биологической активности. Таким образом, Νконцевой ΤΝΡΚ-подобный домен ОРС достаточен для предотвращения остеокластогенеза (81шопе! е! а1., 1997).

Сверхэкспрессия ОРС у трансгенных мышей приводит к глубокому остеопетрозу вторично по отношению к почти полному отсутствию остеокластов. Наоборот, удаление гена ОРС вызывает тяжелый остеопороз у мышей. Удаление ОРСЬ или ΚΑΝΚ также вызывает глубокий остеопетроз, что свидетельствует о важной физиологической роли указанных белков в регуляции резорбции костей. Секреция ОРС и ОРСЬ из остеобластов и клеток стромы регулируется множеством гормонов и цитокинов, часто реципрокным образом. Предполагают, что относительные уровни продукции ОРС и ОРСЬ в конечном счете обусловливают степень резорбции костей. Избыток ОРСЬ увеличивает резорбцию костей, тогда как избыток ОРС подавляет резорбцию. Рекомбинантный ОРС блокирует действие практически всех факторов, которые стимулируют остеокласты, ш уйго и ш νί\Ό. ОРС также ингибирует резорбцию костей во многих моделях заболевания на животных, включая индуцированный овариэктомией остеопороз, гуморальную гиперкальциемию злокачественной опухоли и экспериментальное метастазирование кости. Следовательно, ОРС может представлять собой эффективное альтернативное средство в случае заболеваний, связанных с избыточной активностью остеокластов (Койепшк апб 8йаШоиЬ, 2001).

Однако еще не предполагалось участие остеопротегерина в фиброзных заболеваниях.

Сущность изобретения

Изобретение основано на полученных данных о том, что введение остеопротегерина приводит к значительному ослаблению заболевания в разработанной модели фиброза легкого у животных. Фиброз легкого является одним из проявлений склеродермии.

Таким образом, первой целью данного изобретения является применение остеопротегерина для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзных заболеваний, в частности склеродермии. Второй целью изобретения является применение клетки, экспрессирующей остеопротегерин, или экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность остеопротегерина, для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности системного склероза. Фармацевтические композиции, содержащие остеопротегерин и дополнительные противофиброзные лекарственные средства, такие как галофугинон, и способы лечения, включающие в себя введение остеопротегерина в организм человека, также входят в объем данного изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Экспрессия мРНК ОРС в нормальных (заштриховано) и больных (заштриховано горизонтально) фибробластах 6 пациентов со склеродермией, определенная с помощью анализа на микрочипе генов на фильтрах. Средний уровень экспрессии приведен на фиг. (а) и медиана приведена на фиг. (Ь).

- 3 007927

Фиг. 2. ПЦР-анализ в режиме реального времени мРНК ОРС у 9 пациентов со склеродермией. Для каждого пациента результаты выражены в виде отношения экспрессии мРНК ОРС в поврежденных/неповрежденных фибробластах.

Фиг. 3. Экспрессия мРНК ОРС в биоптатах, взятых из поврежденной и неповрежденной кожи у 5 пациентов со склеродермией, определенная с помощью ПЦР в режиме реального времени. Столбики означают медианное значение экспрессии в каждой группе.

Фиг. 4. Вестерн-блот-анализ экспрессии ОРС в поврежденных и нормальных фибробластах кожи. Поврежденные фибробласты (А1-А4) и нормальные фибробласты (Ν1-Ν4). Стрелки с левой стороны геля указывают положение нативного ОРС (мономер 55 кДа) и его димерной формы (110 кДа). Слитый белок ОРС-Рс (приобретенный из Κ&Ό хуЧспъ) использовали в качестве позитивного контроля для антитела.

Фиг. 5. Влияние ОРС на синтез коллагена в фибробластах человека АС1518. Клетки АС1518 либо совсем не обрабатывали, либо предварительно обрабатывали 10, 20 или 40 нг/мл ОРС в течение 24 ч, или 40 нг ОРС + анти-ОРС нейтрализующее моноклональное антитело (1 мкг/мл), или анти-ОРС нейтрализующим моноклональным антителом отдельно, затем 2 нг/мл ТСР|И в течение 24 ч. Синтез коллагена определяли с помощью ЕЬ18А. Результаты представляют собой среднее из трех определений + 8.Е.М.

Фиг. 6. Влияние трансфекции ОРС на синтез а2-коллагена типа I в первичных фибробластах человека (клетки ОВНС). Клетки ОВНС трансфицировали ρс^NΑ3.1/ОРС (ОРС) или отдельно ροΌΝΑ3.1 (имитация) как описано в способах. Коллаген в кондиционированной среде измеряли через 24 ч после обработки ТСР|И с помощью ЕЫ8А. Результаты представляют собой среднее из трех определений ± 8.Е.М.

Фиг. 7А. Влияние ОРС на активность промотора α2 коллагена типа 1 в фибробластах эмбрионов мышей. Фибробласты эмбрионов мышей (клетки π83) трансфицировали вектором рСЬЗ, содержащим 3,5 т.п.о. промотора 1α2 коллагена, связанного с кДНК люциферазы. После трансфекции клетки переносили в свежую среду и либо не обрабатывали (контроль), либо обрабатывали галофугиноном (10^-10 М) отдельно (НР); ТСР|И (5 нг/мл) (ТСРв1); или ТСР|И (5 нг/мл) + НР (10^-8 М) (НР+ТСРв1) в течение 12 ч с возрастающими концентрациями остеопротегерина. Результаты представляют собой среднее из трех определений. * означает Р<0,05 и ** означает Р<0,01.

Фиг. 7В показывает степень экспрессии репортерного гена под контролем промотора СТСР после инкубации либо с ТСРв отдельно, либо в комбинации с различными количествами ОРС.

Фиг. 8. Анализ ПЦР с обратной транскриптазой мРНК остеопротегерина после обработки ίη νίΐτο поврежденных и неповрежденных фибробластов от пациентов со склеродермией галофугиноном. Однопроцентный агарозный гель, окрашенный бромидом этидия, показывающий продукты реакции ОТ-ПЦР в случае остеопротегерина (верх) и САРЭН (низ) в поврежденных (индекс А) или неповрежденных (индекс Ν) фибробластах.

Фиг. 9. Влияние введения остеопротегерина ίη νίνο на развитие фиброза легкого у мышей, обработанных блеомицином. А: Изменение массы тела мышей после обработки остеопротегерином. Результаты выражены в виде средней массы в г/группу, измеряемой каждый день после внутритрахеальной инстилляции блеомицина. В: Смертность в результате введения блеомицина. Результаты выражены в виде процента количества смертей на группу из 10 животных.

Фиг. 10. Влияние введения остеопротегерина ίη νίνο на развитие фиброза легкого у мышей, обработанных блеомицином. А: степень фиброза в легких, измеренная через 12 дней после введения блеомицина. Легкие красили трихромом. Результаты выражены в виде % характерной доли легкого, пораженной фиброзом, для каждого выжившего животного. В: степень отложения коллагена в легких, измеренная через 12 дней после введения блеомицина. Содержание гидроксипролина измеряли в характерной доли легкого, взятой от каждого выжившего животного.

Описание изобретения

Согласно данному изобретению использовали методику микрочипов ДНК-генов на фильтрах, чтобы идентифицировать дифференциально экспрессируемые гены в фибробластах кожи из фиброзных повреждений, полученных от пациентов с системным склерозом (склеродермией) по сравнению с нормальными фибробластами кожи от тех же пациентов. Одним геном, который одинаковым образом подвергался понижающей регуляции в фибробластах, пораженных склеродермией, был остеопротегерин (ОРС), также называемый ингибирующим фактором остеокластогенеза. Аномальные фибробласты экспрессировали значительно более низкие уровни мРНК ОРС по сравнению с нормальными фибробластами у 7 из 9 тестированных пациентов. Полученные результаты подтвердились анализом ПЦР в режиме реального времени. Кроме того, ОТ-ПЦР-анализ в режиме реального времени суммарной РНК, выделенной из целых образцов биоптат аномальной кожи пациентов со склеродермией, показал более низкие уровни мРНК ОРС по сравнению с клинически нормальными контрольными биопсиями, совпадающими по возрасту, полу и анатомическому положению. Количество белка ОРС в поврежденных фибробластах также снижалось по сравнению с нормальными фибробластами, выделенными у тех же самых пациентов. Ιη νίΐτο ОРС способен снижать опосредованный ТСРв синтез коллагена после трансфекции фибробластов

- 4 007927 кДНК ОРС или после обработки рекомбинантным белком. Дополнительная активность ΟΡΟ ίη νίίτο заключается в ингибировании индуцированной ΤΟΡβ экспрессии фактора роста соединительной ткани (СТОР). СТОР обычно индуцирует синтез компонентов внеклеточного матрикса в фибробластах.

Полученные данные ίη νίίτο далее подтверждены данными ίη νΐνο в разработанной модели на животных. Введение остеопротегерина снижало фиброз легких и уменьшало отложение коллагена в модели индуцированного блеомицином фиброза легких. На гистологическом уровне легкие обработанных остеопротегерином животных были похожи на легкие нативных, не подвергаемых обработке мышей.

Таким образом изобретение относится к применению вещества для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, при этом вещество выбрано из группы, состоящей из:

a) полипептида, содержащего 8ЕО ΙΌ N0:2 или 8Е0 ΙΌ N0:4;

b) полипептида, содержащего аминокислоты 22-401 8Е0 ΙΌ N0:2 или 8Е0 ΙΌ N0:4;

c) полипептида, содержащего один, два, три или четыре богатых цистеином домена остеопротегерина; б) полипептида, содержащего аминокислоты 22-194 8Е0 ΙΌ N0:2 или 8Е0 ΙΌ N0:4;

е) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), в котором аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40% или 50%, или 60%, или 70%, или 80%, или 90% идентичностью по меньшей мере с одной из последовательностей в (а)-(б);

Г) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности ДНК, кодирующей любой из (а)-(б), в условиях умеренной жесткости или в условиях высокой жесткости;

д) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), в котором любые изменения в аминокислотной последовательности являются консервативными аминокислотными заменами в аминокислотных последовательностях (а)-(б);

11) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного, активной фракции или производного с круговыми перестановками любого из (а)-(д).

Специалисту в данной области будет понятно, что согласно данному изобретению вещество, которое стимулирует высвобождение или увеличивает активность эндогенного остеопротегерина, в равной мере можно использовать для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности склеродермии. Указанным веществом может быть сам зрелый остеопротегерин или любой фрагмент остеопротегерина, связывающийся с 0Р0Ь и, следовательно, препятствующий связыванию 0Р0Ь с КАИК и предотвращающий инициацию передачи сигнала через К.АNК. Таким веществом может быть, например, антитело, направленное к 0Р0Ь. Известно, что 0Р0 связывается с 0Р0Ь и что указанное взаимодействие препятствует связыванию 0Р0Ь с его рецептором КА№<. Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что любое вещество, препятствующее связыванию 0Р0Ь с его рецептором КАКК, или любой другой агент, блокирующий активность КА N14 или передачу сигнала, будет обладать такой же активностью, как и остеопротегерин, в случае профилактики и/или лечения фиброзного заболевания, в частности склеродермии. Агентами, блокирующими связывание 0Р0Ь с ΚΆΜΑ могут быть, например, антагонистические антитела, направленные к 0Р0Ь. Кроме того, агентами, блокирующими активность КАПК, например, могут быть антагонистические антитела, направленные к КАПК. Следующими агентами, блокирующими взаимодействие ΟΡ^^/КАNI<. могут быть, например, химические соединения, препятствующие связыванию указанных белков друг с другом, но также любой другой химический или биологический ингибитор передачи сигнала через рецептор КАNК.

Полноразмерная кДНК остеопротегерина человека клонирована и изображена в виде 8Е0 ΙΌ N0:1 в прилагаемом списке последовательностей. Соответствующая аминокислотная последовательность приведена в виде 8Е0 ΙΌ N0:2 в прилагаемом списке последовательностей. Последовательности описаны на сайте \\л\л\'.псЬгп1т.пП1.доу под номером АВ_008821, а также в Моппада еί а1. (1998). Изоформа или полиморфная форма остеопротегерина описана §Μ0№ί еί а1. (1997). кДНК согласно 8ипопе1 еί а1. (1997) изображена в виде 8Е0 ΙΌ N0:3 в прилагаемом списке последовательностей, а соответствующая аминокислотная последовательность приведена в виде 8Е0 ΙΌ N0:4. Обе последовательности, кроме того, доступны из \\л\лу.псЬгп1т.пП1.доу под номером И94332. Единственное различие между белками, обнаруженными Моппада еί а1. и 5>ппопе1 еί а1., касается положения аминокислоты 263, которое может быть представлено аспарагиновой кислотой или аланином соответственно.

Термин «остеопротегерин» в используемом в данном описании смысле относится к веществам, рассматриваемым выше в (а)-(1).

Термин «лечение и/или профилактика» в используемом в данном описании смысле охватывает любое ослабление, снижение или частичное, значительное или полное предотвращение или блокирование возникновения, развития, прогрессирования заболевания или возникновения, развития или прогрессирования любого одного или нескольких или всех симптомов заболевания.

Термин «фиброзное заболевание» в используемом в данном описании смысле относится к заболеваниям, в которые вовлечен фиброз, которые могут быть, например, следствием хронического воспаления или репарации и реорганизации тканей. Фиброз может поражать любой орган в организме человека, такой как, например, кожа, легкое, поджелудочная железа, печень или почка. Таким образом, изобрете

- 5 007927 ние также относится к лечению и/или профилактике фиброзных заболеваний, таких как цирроз печени, интерстициальный легочный фиброз, контрактура Дюпюитрена, келоид и другие аномалии рубцевания/заживления ран, послеоперационные спайки и реактивный фиброз, а также хроническая сердечная недостаточность, в частности после инфаркта миокарда. Следующие заболевания или расстройства, которые можно лечить остеопротегерином, включают заболевания, связанные с заживлением ран, в частности заживлением ран в легком, включая хроническое воспаление легких и конечно фиброз или рубцевание легочных поверхностей. Заболевания, в которые вовлечено воспаление легкого, включают, например, идиопатический легочный фиброз, саркоидоз, бронхолегочную дисплазию, фибропролиферативный ΆΚΌ8, а также легочные проявления или системные заболевания, такие как ревматоидный артрит (Ктеш е1 а1., 2001).

Фиброз обычно включает образование или пролиферацию соединительной ткани, которая замещает функционально специализированную ткань данного органа. Таким образом, в предпочтительном варианте данного изобретения фиброзным заболеванием является заболевание соединительной ткани.

В предпочтительном варианте фиброзным заболеванием является склеродермия.

Термин «склеродермия» в используемом в данном описании смысле относится к заболеванию, также называемому системным склерозом или системной склеродермией. Указанные термины в данной заявке на выдачу патента используются как синонимы. Системный склероз является хроническим заболеванием неизвестной причины, характеризующимся диффузным фиброзом; дегенеративными изменениями; и аномалиями сосудов в коже, структуры суставов и внутренних органов (особенно, например, пищевода, желудочно-кишечного тракта, легкого, сердца и почки). Он может быть очаговым или смешанным, системным, ограниченным или диффузным.

Термин «склеродермия» предпочтительно относится к очаговой, системной, ограниченной и диффузной склеродермии, а также перекрывающимся синдромам.

Очаговая склеродермия главным образом затрагивает кожу, но также может влиять на подлежащие мышцы и кости. Однако обычно она не поражает внутренние органы. Очаговая склеродермия является относительно умеренной и может быть отнесена к системной склеродермии по сходным внешним симптомам, таким как вид биоптата кожи под микроскопом.

Системная склеродермия включает несколько типов симптомов или групп симптомов, такие как СКЕ8Т, ограниченный или диффузный. Заболевание также может быть названо как прогрессирующий системный склероз или семейный прогрессирующий системный склероз. Системная склеродермия может, например, поражать кожу, кровеносные сосуды и/или внутренние органы. В том случае, когда она поражает кожу, это может приводить к тому, что кожа становится твердой, в большинстве случаев на руках и/или лице. При поражении кровеносных сосудов она может вызвать болезнь Рейно. Наиболее серьезные формы системного склероза поражают внутренние органы и могут приводить к нетрудоспособности или даже смерти. Наряду с прочим системный склероз включает в себя: склеродермическое легочное заболевание, склеродермический почечный криз, сердечные проявления, мышечную слабость, включая утомление или ограниченный СКЕ8Т, нарушение моторики и спазм желудочно-кишечного тракта и нарушения в центральной, периферической и автономной нервной системе. Что касается нарушений нервной системы, то наиболее распространен синдром канала запястья с последующей невралгией тройничного нерва.

Ограниченная склеродермия может быть ограничена, например, руками, хотя также могут быть затронуты лицо и шея.

Диффузная склеродермия включает уплотнение кожи и также возникает выше запястья (или локтей). Существует несколько подкатегорий диффузного системного склероза, такие как «склеродермия без склеродермии», при которой имеет место фиброз внутренних органов, но нет уплотнения кожи; и семейный прогрессирующий системный склероз, редкая форма, встречающаяся в семьях.

Перекрывающиеся синдромы указывают в том случае, если у пациента со склеродермией имеется другое аутоиммунное заболевание (такое как волчанка, ревматоидный артрит и т. д.), как, например, при диффузной склеродермии, совмещенной с волчанкой. Склеродермические симптомы также могут быть частью смешанного заболевания соединительной ткани (МСТЭ) или недифференцированного заболевания соединительной ткани (иСТО).

Термин «остеопротегерин» в используемом в данном описании смысле относится к белку, содержащему всю или часть последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 или 4 (обе последовательности человека) из прилагаемого списка последовательностей, а также к его солям, изоформам, мутеинам, активным фракциям, функциональным производным и производным с круговыми перестановками. ОРС вида, отличного от человека, такого как крыса, можно использовать согласно данному изобретению при условии, что имеет место достаточная идентичность между белками, которая позволяет белку проявлять его биологическую активность и не вызывать существенного иммунного ответа у человека.

Предпочтительно термин «остеопротегерин» относится к зрелому белку, в котором отсутствует сигнальный пептид. Сигнальный пептид содержит 21 Ν-концевую аминокислоту ОРС, которые приведены в 8ЕЦ ΙΌ N0:2 или 4, т.е. зрелый белок содержит аминокислоты 22-401 8ЕЦ ΙΌ N0:2 или 4. Термин «остеопротегерин» в используемом в данном описании смысле, кроме того, относится к любому фраг

- 6 007927 менту, части, домену или субдомену 8Е0 ГО N0:2 или 4, проявляющему требуемую активность при склеродермии или других фиброзных заболеваниях. Фрагменты белка, изоформы, дифференциально гликозилированные или сиалированные формы или один или несколько доменов белка можно использовать согласно изобретению при условии, что они проявляют какое-либо целебное действие в случае фиброзного заболевания, предпочтительно действие, которое по меньшей мере сравнимо с действием полноразмерного белка. Целебное действие можно измерить в одном из тестов ίη νίΐτο или ίη νίνο, описанных в примерах ниже, или в любом другом анализе, адекватно демонстрирующем действие на фиброзные заболевания, в частности склеродермию.

Например, остеопротегерин содержит богатый цистеином ΤΝΕΚ-подобный домен в своей Νконцевой части, как описано ΞίιηοηοΙ с1 а1., 1997. Показано, что фрагмент, содержащий указанный домен, сохраняет биологическую активность ОРО в тесте ίη νίΐτο. Следовательно, предпочтительный фрагмент ОРО содержит ΤΝΕΚ-подобный домен ОРО, в частности фрагмент, содержащий аминокислоты 22-194 8ЕО ГО N0:2 или 4.

Согласно данному изобретению остеопротегерин может быть природного происхождения, т. е. нативным белком, или рекомбинантным белком. Получение рекомбинанта можно осуществить в эукариотических клетках, таких как дрожжевые клетки или клетки млекопитающих, предпочтительно в клетках СНО, клетках НЕК (клетки эмбриональной почки человека) или в клетках или клеточных линиях фибробластов человека. Кроме того, его можно получить в прокариотических клетках, таких как Е. οο1ί.

Описано, что остеопротегерин встречается в мономерной и димерной форме (ΞίιηοηοΙ с1 а1., 1997). Таким образом, согласно данному изобретению ОРО может быть мономером, димером или мультимером.

Предпочтительно остеопротегерин гликозилирован в одном или нескольких сайтах. Он также может быть негликозилированным, в зависимости от конкретной потребности и источника получения или выделения белка.

Термин «соли» в данном описании относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотноаддитивным солям аминогрупп молекулы остеопротегерина или его аналогов. Соли карбоксильной группы могут быть образованы способами, известными в данной области, и включают неорганические соли, например, соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и тому подобные, и соли органических оснований, как соли, образованные, например, аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и тому подобные. Кислотно-аддитивные соли включают, например, соли минеральных кислот, таких, например, как хлористоводородная кислота или серная кислота, и соли органических кислот, таких, например, как уксусная кислота или щавелевая кислота. Конечно, любые такие соли должны сохранять биологическую активность остеопротегерина, важную для данного изобретения, т. е. оказывать целебное действие на фиброзные заболевания, в частности склеродермию.

Изоформы или варианты сплайсинга остеопротегерина также можно использовать согласно изобретению при условии, что они способны ингибировать прогрессирование заболевания и/или симптомы данного заболевания.

В используемом в данном описании смысле термин «мутеины» относится к аналогам остеопротегерина, в которых один или несколько аминокислотных остатков природного остеопротегерина заменены другими аминокислотными остатками или делетированы или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к природной последовательности остеопротегерина, обладающим предпочтительно по меньшей мере такой же активностью, что и остеопротегерин дикого типа, или даже обладающим намного более сильной активностью. Биологическую активность ОРО можно, например, измерить с помощью анализа связывания ОРО с его природным лигандом ОРОЬ. Анализы для оценки белок-белковых взаимодействий хорошо известны специалисту в данной области. Примерами таких анализов являются анализы связывания типа ЕЬ18А, анализы иммунопреципитации или измерение в любой другой подходящей системе, такой как система ΒΙΑοογο. Указанные мутеины получают посредством известного синтеза и/или посредством способов сайт-направленного мутагенеза или другим известным подходящим для этого способом.

Предпочтительно любой такой мутеин содержит последовательность аминокислот, в достаточной степени копирующую последовательность зрелого остеопротегерина, так что обладает активностью, по меньшей мере, в значительной степени сходной с активностью остеопротегерина. Активность мутанта остеопротегерина, кроме того, можно тестировать в анализах, которые объясняются в примерах ниже. Например, количественное измерение синтеза коллагена в фибробластах, обработанных ОРО, может быть подходящим тестом для оценки активности мутеинов остеопротегерина.

Мутеины согласно данному изобретению включают белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизуется с ДНК или РНК, которая кодирует остеопротегерин согласно данному изобретению, в жестких условиях. Термин «жесткие условия» относится к условиям гибридизации и последующей промывки, которые специалисты в данной области обычно называют «жесткими». См. Ан5нЬс1 с1 а1., СиггсгИ Γίοίοοοίδ ίη ΜοΙοοιιΕπ Βίοίοβν. кирга, 1п1сг5С1Спсс. Ν.Υ., §§ 6.3 апб 6.4 (1987, 1992), и ЗатЬгсюк οΐ а1. (δηιηΕΓοοΕ 1.С., Етйксй, Е.Е., аиб Машайк, Τ. (1989) МцксиЩ Οοηίη§: А ΕηόοπιΙοίΎ Маша! Сц1б 8ртшд ΗπγΕογ ^аЬο^аΐο^у Ргекк, Сц1б 8ртшд Η-πΕοη ΝΥ).

Без ограничения примеры жестких условий включают условия промывки при температуре на 12

- 7 007927

20°С ниже рассчитанной Тт гибрида при исследовании, например, в 2х88С и 0,5% 8Ό8 в течение 5 мин, 2х88С и 0,1% 8Ό8 в течение 15 мин; 0,1х88С и 0,5% 8Ό8 при 37°С в течение 30-60 мин и затем 0,1х88С и 0,5% 8Э8 при 68°С в течение 30-60 мин. Специалисту в данной области понятно, что условия жесткости также зависят от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных зондов (таких как длиной 1040 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. В случае использования смешанных зондов предпочтительно применение хлорида тетраметиламмония (ТМАС) вместо 88С. См. Аи8иЬе1, выше.

Предпочтительно любой такой мутеин имеет последовательность аминокислот, в достаточной степени копирующую последовательность остеопротегерина, так что обладает в значительной степени сходной или даже лучшей биологической активностью, чем остеопротегерин.

Одной из легко измеряемых активностей остеопротегерина является его способность снижать синтез коллагена. При условии, что мутеин обладает значительной активностью, снижающей синтез коллагена, можно считать, что он обладает активностью в значительной степени сходной с активностью остеопротегерина. Таким образом, можно определить, обладает ли любой данный мутеин по меньшей мере по существу такой же активностью, что и остеопротегерин с помощью стандартного эксперимента, включающего в себя обработку таким мутеином.

В предпочтительном варианте любой такой мутеин обладает по меньшей мере 40% идентичностью или гомологией с последовательностью зрелого остеопротегерина. Более предпочтительно, он обладает по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью или гомологией с указанной последовательностью.

Идентичность отражает родство между двумя или несколькими полипептидными последовательностями или двумя или несколькими полинуклеотидными последовательностями, определяемое при сравнении последовательностей. В общем, идентичность относится к точному соответствию нуклеотида нуклеотиду или аминокислоты аминокислоте двух полинуклеотидных или двух полипептидных последовательностей, соответственно, на протяжении длины сравниваемых последовательностей.

В случае последовательностей, когда нет точного соответствия, можно определит «% идентичности». В общем две последовательности, которые необходимо сравнить, выравнивают, получая максимальную корреляцию между последовательностями. При этом может быть включено встраивание «пробелов» либо в одной, либо в двух последовательностях, чтобы увеличить степень выравнивания. % идентичности можно определить по всей длине каждой из сравниваемых последовательностей (так называемое глобальное выравнивание), что особенно подходит для последовательностей одной и той же или очень сходной длины, или на протяжении более коротких, определенных длин (так называемое локальное выравнивание), что более подходит для последовательностей неравной длины.

Способы сравнения идентичности и гомологии двух или более последовательностей хорошо известны в данной области. Таким образом, можно использовать, например, программы, имеющиеся в пакете программ для анализа последовательностей Χνίδοοηδίη. версия 9.1 (Иеуегеих 1. е! а1., 1984), например, программы ΒΕ8ΤΕΙΤ и ОАР, чтобы определить % идентичности между двумя полинуклеотидами и % идентичности и % гомологии между двумя полипептидными последовательностями. ΒΕ8ΤΡΙΤ использует алгоритм «локальной гомологии» 8ιηί11ι апб Vа!е^таη (1981) и находит наилучшую отдельную область сходства между двумя последовательностями. В данной области также известны другие программы для определения идентичности и/или сходства между последовательностями, например, семейство программ ΒΕΑ8Τ (А118ейи1 8.Е. е! а1., 1990, А118ейи1 8.Е. е! а1., 1997, доступные через домашнюю страницу ИСВ1 на \ν\ν\ν.η<±ί.η1ιη.ηί1ι.§ον) и ΕΑ8ΤΑ (Реагкоп ν.Β., 1990; Реагкоп 1988).

Мутеины остеопротегерина, которые можно использовать согласно данному изобретению, или кодирующие их нуклеиновые кислоты, включают ограниченный набор по существу соответствующих последовательностей, как, например, пептидов или полинуклеотидов с заменами, которые могут быть получены обычными способами специалистом в данной области без большего, чем необходимо экспериментирования на основании указаний и руководств, представленных в данном описании.

Предпочтительными изменениями в случае мутеинов согласно данному изобретению являются изменения, известные как «консервативные» замены. Консервативные аминокислотные замены полипептидов или белков остеопротегерина могут включать синонимичные аминокислоты в пределах группы, которые обладают, по существу, сходными физико-химическими свойствами, так что замена между членами группы будет сохранять биологическую функцию молекулы (Огап1йат, 1974). Понятно, что инсерции и делеции аминокислот также можно осуществить в определенных выше последовательностях без изменения их функции, особенно если инсерции или делеции затрагивают только небольшое количество аминокислот, например, до тридцати и предпочтительно до десяти, и аминокислоты, которые важны для функциональной конформации, например, остатки цистеина, не удаляются и не заменяются. Белки и мутеины, получаемые при таких делециях и/или инсерциях, входят в объем данного изобретения.

Предпочтительными группами синонимичных аминокислот являются группы, определенные в табл. Ι. Более предпочтительно группами синонимичных аминокислот являются группы, определенные в табл. ΙΙ; и наиболее предпочтительно группами синонимичных аминокислот являются группы, определенные в табл. ΙΙΙ.

- 8 007927

Таблица I

Предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминокислота	Синонимичная группа
Зег	Зег, ТЬг, <31у, Азп
Агд	Агд, С1п, Ьуз, <31и, Шз
Ьеи	11е, РЬе, Туг, Мек, Уа1, Ьеи
Рго	С1у, А1а, ТЬг, Рго
Тпг	Рго, Зег, А1а, С1у, Шз, С1п, Тпг
А1а	С1у, ТЬг, Рго, А1а
Уа1	МеЬ, Туг, РЬе, 11е, Ьеи, Уа1
С1у	А1а, ТЬг, Рго, Зег, С1у
Не	Мек, Туг, РЬе, Уа1, Ьеи, Не
РЬе	Тгр, Мек, Туг, Не, Уа1, Ьеи, РЬе
Туг	Тгр, Мек, РЬе, 11е, Уа1, Ьеи, Туг
Суз	Зег, ТЬг, Суз
Н13	С1и, Ьуз, <31п, ТЬг, Агд, Шз
σΐη	С1и, Ьуз, Азп, Шз, ТЬг, Агд, С1п
Азп	С1п, Азр, Зег, Азп
Ьуз	С1и, С1п, Шз, Агд, Ьуз
Азр	(31и, Азп, Азр
С31и	Азр, Ьуз, Азп, С1п, Шз, Агд, С1и
Мек	РЬе, 11е, Уа1, Ьеи, Мек
Тгр	Тгр

Таблица II

Более предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминокислота	Синонимичная группа
Зег	Зег
Агд	Шз, Ьуз, Агд
Ьеи	Ьеи, 11е, РЬе, Мек
Рго	А1а, Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	Рго, А1а
Уа1	Уа1, Мек, 11е
С1у	С1у
Не	11е, Мек, РЬе, Уа1, Ьеи
РЬе	Мек, Туг, Не, Ьеи, РЬе
Туг	РЬе, Туг
Суз	Суз, Зег
Шз	Шз, <31п, Агд
С1п	С1и, С1п, Шз
Азп	Азр, Азп
Ьуз	Ьуз, Агд
Азр	Азр, Азп
С1и	С1и, С1п
Мек	Мек, РЬе, Не, Уа1, Ьеи
Тгр	Тгр

- 9 007927

Таблица III Наиболее предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминокислота	Синонимичная группа
Зег	Зег
Агд	Агд
Ьеи	Ьеи, 11е, МеС
Рго	Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	А1а
Уа1	Уа1
□1у Не РЬе Туг Суз ΗΪ3 С1п Азп Ьуз	О1у 11е, МеЪ, Ьеи РЬе Туг Суз, Зег ΗΪ3 С1п Азп Ьуз
Азр	Азр
(31и	С1и
МеС	МеС, 11е, Ьеи
Тгр	МеС

Примеры получения аминокислотных замен в белках, которые можно использовать для получения мутеинов полипептидов или белков остеопротегерина для применения в данном изобретении включают любые известные методические стадии, такие как представленные в патентах США 4959314, 4588585 и 4737462, Магк е! а1.; 5116943 ΚοίΗδ е! а1., 4965195 Нашей е! а1.; 4879111 Сйопд е! а1.; и 5017691 Бее е! а1.; и замещенные лизином белки, представленные в патенте США № 4904584 е! а1.).

Термин «слитый белок» относится к полипептиду, содержащему остеопротегерин или его мутеин, слитый с другим белком, который, например, имеет более продолжительное время пребывания в жидкостях организма. Слитые белки, содержащие полный белок или функциональную часть остеопротегерина, слитую с полным белком или частью белка, способного повышать биологические активности молекулы, например, подобные времени полужизни в организме человека, являются предпочтительными согласно изобретению. В предпочтительном варианте слитый белок содержит слияние с иммуноглобулином (1д). Слитые белки, содержащие полный белок или часть остеопротегерина, слитого с полным белком или частью иммуноглобулина, являются в высокой степени предпочтительными. Слитые белки могут быть мономерными или мульмерными, гетеро- или гомомультимерными. Преимущественно слитый белок содержит константную область иммуноглобулина, в частности, Те-часть иммуноглобулина. Кроме того, варианты, в которых иммуноглобулин относится к изотипу 1уС1 или 1дС2, являются предпочтительными согласно изобретению. Предпочтительно слияние представляет собой слияние с Тс.

Таким образом, остеопротегерин может быть слит с другим белком, полипептидом и тому подобным, например, с иммуноглобулином или его фрагментом. Слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид, который может составлять до 1-3 аминокислотных остатков в длину или может быть более длинным, например, 13 аминокислотных остатков в длину. Указанный линкер может быть трипептидом, например, с последовательностью Е-Т-М (С1и-Рйе-Ме!), или 13-аминокислотной линкерной последовательностью, содержащей О1и-Рйе-О1у-А1а-О1у-Ееи-Уа1-Ееи-С1у-О1у-О1п-Рйе-Ме!, введенными между последовательностью остеопротегерина и последовательностью иммуноглобулина.

«Функциональные производные» в используемом в данном описании смысле охватывают производные остеопротегерина и их мутеины и слитые белки, которые могут быть получены с использованием функциональных групп, которые встречаются в виде боковых цепей на остатках, или Ν- или С-концевых групп способами, известными в данной области, и которые включены в изобретение при условии, что они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не нарушают активность белка, которая по меньшей мере в значительной степени сходна с активностью остеопротегерина, и не придают токсичные

- 10 007927 свойства содержащим их композициям. Следовательно, в предпочтительном варианте функциональное производное содержит по меньшей мере один остаток, связанный с одной или несколькими функциональными группами, которые встречаются в виде одной или нескольких боковых цепей на аминокислотных остатках.

Согласно данному изобретению высоко предпочтительными остатками являются боковые цепи полиэтиленгликоля (ПЭГ). Боковые цепи ПЭГ могут скрывать антигенные сайты и продлевать время пребывания вещества, с которым они связаны, в жидкостях организма. Другие производные включают алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп в результате реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с остатками ацила (например, алканоильные или карбоциклические ароильные группы) или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, групп остатков серила или треонила), образованные с остатками ацила.

«Активные фракции» остеопротегерина и его мутеинов и слитых белков охватывают любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы отдельно или вместе со связанными молекулами или связанными с ними остатками, например, остатками сахара или фосфата, или агрегатами молекулы белка или остатками сахара непосредственно, при условии, что указанная активная фракция обладает, по меньшей мере, активностью, в значительной степени сходной с активностью остеопротегерина.

Изобретение, кроме того, относится к применению молекулы нуклеиновой кислоты для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики склеродермии, при этом молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

a) полипептида, содержащего БЕО ΙΌ N0:2 или БЕО ΙΌ N0:4;

b) полипептида, содержащего аминокислоты 22-401 БЕО ΙΌ N0:2 или БЕО ΙΌ N0:4;

c) полипептида, содержащего один, два, три или четыре богатых цистеином домена остеопротегерина;

б) полипептида, содержащего аминокислоты 22-194 БЕО ΙΌ N0:2 или БЕО ΙΌ N0:4;

е) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), в котором аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40% или 50%, или 60%, или 70%, или 80%, или 90% идентичностью по меньшей мере с одной из последовательностей (а)-(б);

I) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из (а)-(б), в условиях умеренной жесткости или в условиях высокой жесткости;

д) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), в котором любые изменения в аминокислотной последовательности являются консервативными аминокислотными заменами в аминокислотных последовательностях (а)-(б);

II) изоформы, слитого белка или активной фракции любого из полипептидов (а)-(д).

Изобретение предпочтительно относится к применению указанных молекул нуклеиновых кислот для лечения и/или профилактики заболеваний соединительной ткани, и в частности склеродермии.

Согласно данному изобретению остеопротегерин также можно вводить в организм человека в форме вектора, содержащего указанную молекулу нуклеиновой кислоты. Таким образом, изобретение, кроме того, относится к применению вектора, содержащего указанную молекулу нуклеиновой кислоты, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики склеродермии или другого фиброзного заболевания. Предпочтительно вектор является экспрессирующим вектором, содержащим промотор, оперативно связанный с полной или с частью кодирующей последовательности остеопротегерина. В следующем предпочтительном варианте вектор является вектором для генной терапии. Векторы для генной терапии известны в данной области, большинство из них являются векторами, полученными из вирусов, такие как аденовирусные или лентивирусные векторы.

Согласно изобретению остеопротегерин также можно вводить в организм человека в форме клетки, продуцирующей и/или секретирующей остеопротегерин. Таким образом, изобретение, кроме того, относится к применению клетки, экспрессирующей остеопротегерин, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики склеродермии или любого другого фиброзного заболевания, т. е. к клеточной терапии для лечения и/или профилактики склеродермии или других фиброзных заболеваний. Клетка может быть клеткой, природно продуцирующей остеопротегерин, и/или трансфицированной клеткой, которая продуцирует рекомбинантный остеопротегерин. Предпочтительными являются клетки, экспрессирующие и секретирующие высокие количества белка, такие как сверхэкспрессирующие клетки, несущие большие количества копий экспрессирующего вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую остеопротегерин.

Так как фибробласты представляют механизм фиброза, они являются наиболее подходящими клетками для противофиброзной терапии и терапии склеродермии. Таким образом согласно данному изобретению предпочтительно используют фибробласты, экспрессирующие остеопротегерин.

Изобретение, кроме того, относится к клетке, содержащей вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полный белок или часть остеопротегерина, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности склеродермии. Клет

- 11 007927 ка, которая была генетически модифицирована, так, чтобы она продуцировала полипептид согласно изобретению, также входит в объем данного изобретения.

Применение экспрессирующего вектора для индуцирования и/или усиления эндогенной продукции остеопротегерина в клетке, обычно молчащей или экспрессирующей количества ингибитора, которые недостаточны, также рассматривается в данном изобретении. Таким образом, в изобретении используется способ, известный как активация эндогенных генов (ЕСА), для получения требуемого белка.

Согласно данному изобретению предпочтительны несколько комбинированных способов лечения. Таким образом, предпочтительно лекарственное средство согласно изобретению дополнительно содержит: интерферон, в частности интерферон-β;

антагонист фактора некроза опухолей (ΤΝΕ), в частности растворимые ΤΝΕΒ, такие как растворимый р55 (ΤΒΡΙ) и/или растворимый р75 (ТВР11);

дополнительный противосклеродермический агент;

противосклеродермический агент, выбранный из группы, состоящей из галофугинона, ингибиторов АСЕ, блокаторов кальциевых каналов, ингибиторов протонных насосов, НПВС, ингибиторов ЦОГ, кортикостероидов, тетрациклина, пентоксифиллина, буцилламина, ингибиторов геранилгеранилтрансферазы, роттерлина, ингибиторов пролил-4-гидроксилазы, ингибиторов с-протеиназы, ингибиторов лизилоксидазы, релаксина, простагландинов, простациклинов, эндотелина-1, окиси азота, ингибиторов ангиотензина II, антиоксидантов или 8АРР-1.

Показано, что 8АРР-1 является белком, обладающим целебным действием в случае фиброзных заболеваний, таких как склеродермия (νθ 02/46225). Фрагменты, изоформы, активные фракции, слитые белки или функциональные производные 8АКР-1, которые описаны в νθ 02/46225, также можно использовать в комбинации с остеопротегерином согласно данному изобретению.

Все средства терапии предназначены для одновременного, последовательного или раздельного применения.

Фармацевтические композиции, содержащие одно или несколько из указанных выше веществ вместе с остеопротегерином, входят в объем данного изобретения.

Хотя в настоящее время не существует способов излечения склеродермии, несколько агентов или терапевтических способов используются в настоящее время для лечения симптомов склеродермии. Такие противосклеродермические агенты, которые можно использовать в виде комбинированной терапии согласно изобретению, суммированы, например, в ЕефЫои (2001) или Уф1су апб 8и1е (2001), которые включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме.

Интерфероны преимущественно известны из-за ингибирующего действия на репликацию вирусов и пролиферацию клеток. Интерферон-γ, например, играет важную роль в стимулировании иммунных и воспалительных ответов. Указывается, что интерферон β (ΙΕΝ-β, интерферон типа I), играет противовоспалительную роль.

Еще в одном варианте изобретения остеопротегерин используют в комбинации с антагонистом ΤΝΕ. Антагонисты ΤΝΕ проявляют свою активность несколькими путями. Во-первых, антагонисты могут с достаточной аффинностью и специфичностью связывать или секвестрировать саму молекулу ΤΝΕ, частично или полностью нейтрализуя эпитоп или эпитопы ΤΝΕ, ответственные за связывание с рецептором ΤΝΕ (в дальнейшем называемые «секвестрирующими антагонистами»). Секвестрирующим антагонистом, например, может быть антитело, направленное против ΤΝΕ.

Альтернативно антагонисты ΤΝΕ могут ингибировать путь передачи сигнала ΤΝΕ, активируемый рецептором клеточной поверхности после связывания ΤΝΕ (в дальнейшем называемые «антагонистами передачи сигнала»). Антагонисты ΤΝΕ легко идентифицировать и охарактеризовать с помощью обычного скрининга кандидатов в отношении их влияния на активность нативного ΤΝΕ на чувствительных линиях клеток ίη νίίτο, например, В-клетках человека, в которых ΤΝΕ вызывает пролиферацию и секрецию иммуноглобулина. В анализ включают композиции ΤΝΕ с разными разведениями выбранного для исследования антагониста, например, соответствующими 0,1-100-кратному молярному количеству ΤΝΕ, используемому в анализе, и контроли без ΤΝΕ или только с антагонистом (Τποοί еί а1., 1992).

Секвестрирующие антагонисты являются предпочтительными антагонистами ΤΝΕ, используемыми согласно данному изобретению. Из числа секвестрирующих антагонистов предпочтительны те полипептиды, которые связывают ΤΝΕ с высокой аффинностью и обладают низкой иммуногенностью. Особенно предпочтительны растворимые молекулы рецептора ΤΝΕ и нейтрализующие антитела к ΤΝΕ. Например, в данном изобретении применимы растворимые формы ΤΝΕ-ΚΙ (р55) и ΤΝΕ-РИ (р75). Укороченные формы данных рецепторов, содержащие внеклеточные домены рецепторов или их функциональные части, являются более предпочтительными антагонистами согласно данному изобретению. Укороченные растворимые рецепторы ΤΝΕ типа I и типа II описаны, например, в ЕР 914431.

Укороченные формы рецепторов ΤΝΕ являются растворимыми и были выявлены в моче и сыворотке в виде ингибирующих связывающих ΤΝΕ белков 30 кДа или 40 кДа, которые названы ΤΒΡI и ΤΒΡΠ, соответственно (Епде1шапп еί а1., 1990). Согласно данному изобретению предпочтительно одновременное, последовательное или раздельное применение остеопротегерина с антагонистами ΤΝΕ и/или интерфероном.

- 12 007927

Согласно изобретению ΤΒΡΙ и ΤΒΡΙΙ являются предпочтительными антагонистами ΤΝΡ, используемыми в комбинации с остеопротегерином. Если производные, фрагменты, области и биологически активные части молекул рецепторов функционально сходны с молекулами рецепторов, то они могут быть также использованы в данном изобретении. Такой биологически активный эквивалент или производное молекулы рецептора относится к части полипептида или последовательности, кодирующей молекулу рецептора, которая имеет достаточный размер и способна связывать ΤΝΡ с такой аффинностью, при которой связанный с мембраной рецептор ΤΝΕ ингибируется или блокируется.

В следующем предпочтительном варианте антагонистом ΤΝΡ, используемым согласно изобретению, является растворимый ΤΝΕ-ΚΙ (ΤΒΡΙ) человека. Природные и рекомбинантные растворимые молекулы рецептора ΤΝΕ и способы их получения описаны в европейских патентах ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 433900.

Несмотря на то, что может быть полезным блокирование ΤΝΕ-α на ранних стадиях заболевания, высказывалось мнение, что на более поздних стадиях ΤΝΕ сам по себе может оказывать целебное действие на склеродермию (АЬгайат с1 а1., 2000). Таким образом изобретение, кроме того, относится к комбинации остеопротегерина и ΤΝΕ для лечения или профилактики склеродермии, особенно запущенных стадий болезни. Согласно данному изобретению можно использовать ΤΝΕ-α или ΤΝΕ-β.

Изобретение, кроме того, относится к фармацевтической композиции, содержащей остеопротегерин, необязательно вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или эксципиентами для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности склеродермии.

Фармацевтическая композиция, кроме того, может содержать любой из идентифицированных выше дополнительных компонентов и в частности интерферон, ТВР или ингибитор ЦОГ.

Фармацевтическая композиция согласно изобретению также может включать в себя вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению или клетку, экспрессирующую остеопротегерин.

Активные ингредиенты фармацевтического средства, т.е. полипептиды, нуклеиновые кислоты или клетки согласно изобретению или их комбинации, а также комбинации веществ, указанных выше, можно вводить индивидууму различными способами. Пути введения включают внутрикожный, трансдермальный (например, в препаратах медленного высвобождения), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, местный и интраназальный пути. Можно использовать любой другой терапевтически эффективный путь введения, например, поглощение через эпителиальные или эндотелиальные ткани или с помощью генной терапии, при которой пациенту вводят молекулу ДНК, кодирующую активный агент (например, с помощью вектора), что приводит к экспрессии и секреции активного агента ίη νΐνο. Кроме того, белок(ки) согласно изобретению можно вводить вместе с другими компонентами биологически активных агентов, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, эксципиенты, носители, разбавители и наполнители.

Имеется в виду, что определение «фармацевтически приемлемый» охватывает любой носитель, который не влияет на эффективность биологической активности активного ингредиента и который не является токсичным для хозяина, которому его вводят. Например, в случае парентерального введения активный белок(ки) может быть приготовлен в дозированной лекарственной форме для инъекции в таких наполнителях как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточного альбумина и раствор Рингера.

В случае парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения активный белок(ки) может быть приготовлен в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизованного порошка вместе с фармацевтически приемлемым парентеральным наполнителем (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и добавками, которые поддерживают изотоничность (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферы). Препарат стерилизуют обычно используемыми способами.

Биодоступность активного белка(ков) согласно изобретению также можно улучшить, используя способы конъюгации, которые увеличивают время полужизни молекулы в организме человека, например, связывая молекулу с полиэтиленгликолем, как описано в заявке на выдачу патента РСТ νθ 92/13095.

Терапевтически эффективное количество активного белка(ков) будет представлять собой функцию многих переменных, включая тип рецептора, аффинность вещества согласно изобретению по отношению к его рецептору, какую-либо проявляемую при этом остаточную цитотоксическую активность, путь введения, клиническое состояние пациента.

«Терапевтически эффективное количество» означает такое количество, в результате введения которого вещество согласно изобретению оказывает целебное действие на развитие или прогрессирование заболевания ίη νΐνο. Доза, вводимая индивидууму в виде однократной или многократных доз, будет варьировать в зависимости от множества факторов, включая фармакокинетические свойства ОРС, путь введения, состояния и характеристики пациента (пол, возраст, массу тела, состояние здоровья, рост), степень проявления симптомов, сопутствующее лечение, частоту, с которой проводится лечение, и требуемый эффект. Корректировка и манипулирование доз в установленных пределах находятся в компетенции специалистов в данной области.

- 13 007927

Требуемая доза полипептида согласно изобретению будет варьировать примерно от 0,0001 до 100 мг/кг или примерно от 0,01 до 10 мг/кг или примерно от 0,1 до 5 мг/кг или примерно от 1 до 3 мг/кг, хотя, как указано, выше доза будет во многом зависеть от усмотрения терапевта. Лекарственное средство согласно изобретению можно вводить ежедневно, через день или 3 раза в неделю.

Ежедневные дозы обычно дают дробными дозами или в форме замедленного высвобождения, эффективной для получения требуемых результатов. Второе или последующие введения можно осуществлять в дозе, которая является такой же, меньше или больше, чем начальная или предыдущая доза, вводимая индивидууму. Второе или последующее введение можно проводить во время или до наступления заболевания.

Изобретение, кроме того, относится к способу лечения и/или профилактики фиброзных заболеваний, в частности склеродермии, включающему в себя введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества вещества согласно изобретению необязательно с фармацевтически приемлемым носителем. Альтернативно или дополнительно согласно изобретению можно вводить клетку, продуцирующую остеопротегерин, или молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, необязательно находящуюся в экспрессирующем векторе.

Экспрессирующий вектор можно вводить системно. Предпочтительно экспрессирующий вектор вводят путем внутримышечной инъекции. Следующим предпочтительным путем введения является ингаляция, в частности, если в заболевание вовлечен фиброз легкого. Местное введение экспрессирующего вектора, содержащего последовательности ОРС, или полипептида ОРС согласно изобретению является следующим предпочтительным путем введения, в частности, если имеет место поражение кожи.

Изобретение, кроме того, относится к способу приготовления фармацевтической композиции, содержащей смесь эффективного количества остеопротегерина с фармацевтически приемлемым носителем, и к способу лечения и/или профилактики артрита, включающему в себя введение нуждающемуся в этом хозяину эффективно ингибирующего количества остеопротегерина.

Все публикации, цитированные в данном описании, включая статьи или рефераты в журналах, опубликованные или неопубликованные заявки на выдачу патентов США или иностранные заявки, национальные патенты США или иностранные патенты или любые другие публикации включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, имеющиеся в цитированных публикациях. Кроме того, полное содержание публикаций, цитированных в публикациях, которые цитированы в данном описании, также включены в виде ссылки в полном объеме.

Ссылки на известные методические стадии, традиционные методические стадии, известные способы или обычные способы никоим образом не являются признанием того, что какой-либо аспект, описание или вариант данного изобретения раскрыт, представлен в виде инструкций или предложен в соответствующей области.

Приведенное выше описание конкретных вариантов настолько полно раскроет общую природу изобретения, что другие специалисты, используя знания, имеющиеся в данной области (включая содержание цитированных в данном описании публикаций), смогут без труда осуществить модификации и/или адаптировать такие конкретные варианты для различных применений без большего, чем необходимо экспериментирования, не выходя за рамки общей концепции данного изобретения. Таким образом, подразумевается, что такие адаптации и модификации входят в понятие ряда эквивалентов заявленных вариантов, основанных на приведенных в данном описании инструкциях и руководстве. Должно быть понятно, что используемая в данном описании фразеология и терминология приведена в целях описания, но не ограничения, так что терминология или фразеология данного описания должна быть интерпретирована специалистом в данной области в свете приведенных в данном описании инструкций и руководства в сочетании со знаниями специалиста в данной области.

Теперь после описания изобретения его будет легче понять благодаря ссылкам на следующие примеры, которые приведены с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения данного изобретения. Примеры

Способы.

Образцы тканей пациента.

Пункционные биоптаты объемом 2 мм³ брали из поврежденной или неповрежденной кожи (обычно из кожи предплечья) у девяти совпадающих по возрасту и полу пациентов с диффузным кожным склерозом (88с). Все пациенты удовлетворяли критериям Американского института ревматологии в отношении диагноза 88с.

Культуры фибробластов.

Фибробласты получали из биоптата с помощью культивирования ίη νίίΓΟ, как описано ранее (АЬгаЪат с1 а1., 1991). Коротко, биоптаты нарезали на кусочки и помещали в стерильные пластиковые чашки или флаконы. После 15 мин сушки при комнатной температуре кусочки биоптата прилипали к пластику для культуры ткани, и затем их культивировали в среде роста фибробластов (РСМ), состоящей из модифицированной Дульбекко среды Игла (ИМЕМ), содержащей 10% фетальную сыворотку теленка (РС8), 2 мМ Ь-глутамин, 1 мМ пируват натрия, 100 единиц в мл пенициллина, 100 мкг в мл стрептомицина, 50 мкг в мл гентамицина и 2,5 мкг в 1 мл амфотерицина В. После 2-3 недель инкубации во влажной атмосфере с 5% СО2 в воздухе, выросшие фибробласты открепляли кратковременной обработкой трипсином и по

- 14 007927 вторно культивировали в РСМ без гентамицина и амфотерицина В. В экспериментах использовали фибробласты между 2 и 5 пассажами. Фенотип фибробластов подтверждался типичной морфологией в монослое и культурами в трехмерном коллагеновом геле.

Выделение РНК.

Суммарную РНК выделяли из слившихся склеродермических фибробластов раннего пассажа, используя тризол (ЫГе ТссНпо1о§1С5) согласно протоколу производителя. Конечный осадок РНК ресуспендировали в стерильной обработанной ПЕРС воде в концентрации 1 мкг/мкл и хранили при -80°С.

Синтез кДНК-зондов.

мкг суммарной РНК смешивали с 1,3 мкл специфичных для цитокина праймеров (К&П ууЧепъ. № в каталоге СЛС11) и инкубировали при 70°С в течение 2 мин в пробирке ЕррепйогГ объемом 0.5 мл. Затем пробирки охлаждали до 50°С в течение 2 мин и по истечении указанного времени добавляли реакционную смесь. содержащую 2 мкл 5Х реакционного буфера (250 мМ Трис-НС1 рН 8.3. 375 мМ КС1 и 15 мМ МдС1₂). 1 мкл 10Х смеси άΝΤΡ (5 мМ йСТР. 5 мМ йСТР и 5 мМ йТТР). 3.5 мкл а³²Р-йАТР (3000 кюри/ ммоль. АтегФат. № в каталоге РВ10204). 0.5 мкл ОТТ (100 мМ) и 1 мкл щрсгеспр) II (ЫГе Тсс1то1ощс5). Реакционную смесь недолго перемешивали пипетированием и инкубировали при 50°С в течение 25 мин. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 0.1М БЭТА. рН 8.0. содержащего 1 мг/мл гликогена. Затем меченую кДНК очищали от не включенных дезоксинуклеотидов. используя колонку СЬтота8рш-200 ПЕРС-Н₂О (С1оп1ес11) согласно инструкциям производителя. Фракции. содержащие кДНК. идентифицировали подсчетом в счетчике Черенкова. Фракцию пика (обычно фракция 2 из общего количества собранных 6 фракций) обрабатывали 0.1 объема 1М ΝαΟΗ. содержащего 1 мМ ЕЭТА. в течение 20 мин при 70°С. чтобы гидролизовать РНК. и затем нейтрализовали равным объемом 1М ΝαΗ₂ΡΟ₄. содержащим 2.5 мкг ДНК Со1-1 человека (ЫГе Тес11по1още5). в течение 20 мин при 70°С. Затем подвергнутый тепловой обработке нейтрализованный зонд кДНК добавляли непосредственно к смеси для гибридизации.

Гибридизация с микрочипами генов на фильтре.

Микрочипы генов на фильтрах (матрица экспрессии цитокинов человека. Β&Ό ууЧепъ. номер в каталоге СЛ001) предварительно гибридизовали при 68°С в течение 2 ч в 5 мл раствора для экспрессгибридизации (С1ои1есй). содержащего 0.5 мкг/мл ДНК спермы лосося (ЫГе 1ес1шо1още5). в роллерных флаконах в печи для гибридизации НуЬ;нй (М\СС Вю1ес11). По истечении указанного времени раствор для предгибридизации заменяли свежим раствором для гибридизации. содержащим препарат зонда кДНК с удельной активностью от 0.25 до 1х10⁶ имп./мин/мл. Гибридизация проходила в течение 16-20 ч при 68°С. После гибридизации фильтры 4 раза промывали 2Х 88С/1% 8Ό8 при 68°С по 20 мин на промывку и дважды 0.1Х 88С/0.5% 8Ό8 по 15 мин на промывку. Затем фильтры герметизировали. используя оберточный материал 8атаи «тар'™. и экспонировали с экранами для визуализации на основе люминофора с длительным послесвечением К-типа (Вютай) в течение различных периодов времени (от 4 ч до 4 дней) при комнатной температуре.

Анализ изображения.

Экраны для визуализации сканировали при разрешении 50 мкм. используя устройство для визуализации люминесценции Вютай Регаопа1 РХ. Полученный в результате цифровой файл объемом 16 битов переводили в формат Т1Р и изображение анализировали. используя компьютерную программу Аггаууыоп (1тадшд Векеатсй 1пс.). Для каждого образца авторы измеряли интенсивность пикселей 384 генов. нанесенных пятнами на фильтр в двух повторах. Фоновый сигнал вычитали и выводили среднюю интенсивность пикселя для каждой пары пятен на матрице (= уровень экспрессии).

Подтверждение результатов. полученных на микрочипах. в отношении отдельных генов с помощью ОТ-ПЦР.

мкг суммарной РНК из каждого образца. взятого у пациента. обратно транскрибировали. используя олиго-йТ-праймер (Рготеда). в объеме реакции 20 мкл. содержащем 5 мМ МдС1₂. 10 мМ Трис-НС1. 50 мМ КС1. 0.1% тритон Х-100. 1 мМ каждого из йАТР. йСТР. йСТР. йТТР. 0.5 единиц рекомбинантного ингибитора рибонуклеазы Р№15ш (Рготеда) и 15 единиц обратной транскриптазы АМУ (Рготеда). Реакционную смесь инкубировали при 42°С в течение 60 мин. нагревали при 95°С в течение 5 мин. затем разбавляли до 200 мкл стерильной водой. Затем разбавления реакционной смеси с обратной транскриптазой подвергали ПЦР-анализу в режиме реального времени на Тацтап (РЕ Аррйей ВюууЧепъ 7700). используя специфичные пары праймеров. сконструированные для остеопротегерина с использованием компьютерной программы Рттет Ехртекк (РЕ Аррйей ВюууЧетЦ на основании номера доступа в базе данных. предоставленного производителем фильтра для генов: остеопротегерин-112Р 5' СТС ССС ССТ ССТ СТТ ТСТ (8Е0 ΙΌ ΝΟ:5) и остеопротегерин-185В 5' ААТ САА ССТ АСТ ТТС САС САА АСС (8Е0 ΙΌ ΝΟ:6). Результаты нормализованы по отношению к экспрессии гена «домашнего хозяйства» глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (САРЭН) в каждом образце и выражены в виде кратных изменений. определенных в результате деления значения экспрессии в аномальном образце от пациента на значение в соответствующем нормальном образце от пациента.

Клонирование полноразмерной последовательности кДНК. кодирующей остеопротегерин человека.

Затем полноразмерную кодирующую последовательность кДНК ОРС клонировали с помощью ПЦР

- 15 007927 с обратной транскриптазой, используя следующие праймеры, основанные на последовательности кДНК, доступной в базе данных ЕМВЬ (номер доступа И94332) : ОРС Р 5' ССС ОЛТ ССС ССА ССА ТСА АСА АСТ ТСС ТСТ ССТ (81 А) ГО N0:7) и ОРС В 5' ААС СТС САС ТТА ТАА ССА ССТ ТАТ ТТТ при концентрации 50 пмоль каждого в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 0,3 мМ б№ТР, 1 мМ Мд8О₄, 5 мкл матрицы кДНК нормальных фибробластов кожи (крайней плоти) человека (полученной как описано выше), 5 мкл 10Х буфера для амплификации РГх (МГе Тес11по1од1ек) и 1 мкл ДНК-полимеразы Р1абпит РГх (ЫРе Тсс1то1ощс5). Реакционную смесь нагревали при 94°С в течение 2 мин, затем подвергали 35 циклам ПЦР следующим образом: 94°С в течение 15 с, 55°С в течение 30 с и 68°С в течение 1 мин. Продукты амплификации анализировали в 1% агарозных гелях в 1Х буфере ТАЕ (ЬгТе ТесНпокщеЦ и продукты ПЦР, мигрирующие в области рассчитанной молекулярной массы (1205 п.о.), очищали из геля, используя набор для очистки продуктов ПЦР Χνί/агб (Рготеда).

100 нг очищенной в геле ДНК расщепляли ферментами рестрикции ВатН1 и Х1ю1 (Рбагтааа) согласно условиям производителя, повторно очищали как описано выше и лигировали в расщепленную ВатН1/Х1о1 плазмиду рс^NА3.1(+) (1№Йгодеи), используя ДНК-лигазу Т4 (№\ν Епд1апб Вю1аЬк) согласно стандартным способам молекулярной биологии. Продуктами лигирования трансформировали Е. соб штамма ТОР 10 Р' Ц^гбюдеп) путем электропорации, используя импульсное устройство для электропорации генов Вюгаб. Плазмидную ДНК выделяли из 5 мл культур, выращенных из полученных в результате колоний, и подвергали автоматизированному анализу последовательностей на секвенаторе Аррбеб ВюкукГетк 3700, используя праймеры Т7 и рс^NА3.1А8 Ппх-'Игодеп), чтобы подтвердить последовательность ОРС.

Регистрация остеопротегерина в экстрактах белков, выделенных из поврежденных и нормальных фибробластов кожи.

Поврежденные и нормальные фибробласты пациентов со склеродермией и контрольных субъектов после небольшого числа пассажей, культивированные как описано выше, собирали обработкой монослоев клеток РВ8, содержащим 1 мМ ЕЭТА, в течение 5 мин при 37°С. Открепившиеся клетки извлекали центрифугированием, ресуспендировали в 50 мкл РВ8 и обрабатывали 50 мкл буфера для образцов (20% 8Ό8, 0,2% бромфеноловый синий, 50% глицерин, 1М Трис рН 6,8), замораживали при -80°С и затем размораживали. Содержание белка определяли, используя набор ВСА (Р1егсе) согласно протоколу производителя. Примерно 10 мкг белка обрабатывали 0,1 объема ЭТТ (0,1М) и разгоняли в 4-12% 8Ό8полиакриламидных гелях (Nονеx) согласно инструкциям производителя. Затем полосы белка переносили на нитроцеллюлозные мембраны, используя устройство Nονеx \хе1Ь1о( при 30 В в течение 1 ч. Затем мембраны блокировали в течение ночи при 4°С в РВ8, содержащем 5% обезжиренного порошкового молока, затем промывали в РВ8Т. Мембраны инкубировали с первым антителом (Β&Ό кукГетк, моноклональное антитело против ОРС, № в каталоге МАВ8051) при концентрации 0,5 мкг/мл в РВ8Т/1% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре и встряхивании. По истечении указанного времени мембраны тщательно промывали РВ8Т перед инкубацией со вторым антителом (антимышиное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, 81дта) в разведении 1/3000 в РВ8Т/1% БСА. Наконец мембраны тщательно промывали перед проявлением и визуализацией с использованием реагентов ЕСЬ и Нурегй1т™ производства Атегкбат.

ЕЫ8А для измерения коллагена типа I в надосадках культур клеток фибробластов, обработанных рекомбинантным ОРС, или после трансфекции вектора ОΡС/рс^NА3.1.

Синтез коллагена измеряли ш \бго в культивируемых фибробластах человека, используя систему ЕЫ8А с иммобилизацией, которая описана 81и-Аеп е1 а1., (8Ы-Аеп е1 а1., 1997). Коротко, кожные фибробласты человека АС1518 (приобретенные из АТСС) поддерживали в среде ЭМЕМ, содержащей 5% РС8 и 2 мМ глутамин (ЬгТе Тес11по1од1ек). Клетки собирали с помощью обработки трипсином и высевали при слиянии на 70% в 48-луночные планшеты для культуры ткани (Ра1соп) в среду, содержащую 5% сыворотки, затем спустя 8 ч переносили в бессывороточную среду. Через 24 ч среду удаляли и заменяли свежей бессывороточной средой, содержащей 50 мкМ Ь-аскорбата (Аако Риге Сбет1са1 Лбикбгек) и возрастающие концентрации рекомбинантного остеопротегерина человека (ОРС-Рс, приобретенного из Β&Ό кукГетк). Через 16 ч в среду добавляли ТСР|И (РергоТесб) до конечной концентрации 2 нг/мл, и еще через 24 ч среду извлекали, центрифугировали, чтобы удалить обломки клеток, разбавляли и подвергали ЕЫ8А в отношении коллагена типа I, как описано ниже.

Синтез коллагена также измеряли в первичных фибробластах человека (клетки ОВНС) после трансфекции кДНК ОРС (рс^NА3.1-ОΡС) или после ложной трансфекции (только вектор рс^NА3.1) следующим образом: клетки ОВНС собирали трипсинизацией и высевали при 50% слиянии в 48луночные планшеты в полную среду. Плазмиды трансфицировали в клетки ОВНС, используя реагент для трансфекции Ридепе V (Воске) согласно инструкциям производителя. Через 5 ч после трансфекции среду заменяли свежей бессывороточной средой, содержащей Ь-аскорбат, на ночь, затем обрабатывали ТСР|И (10 нг/мл) в течение 24 ч, как описано выше.

Планшеты Мах18огр (Мшс) покрывали в течение ночи при 4°С 5 мкг/мл антитела козы против коллагена человека типа I (8оШ11егп В^οΐесбиο1οду АккосгаГек. 1пс.) в РВ8 (рН 7,4). Затем раствор антитела

- 16 007927 удаляли и планшеты блокировали РВ8-1% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты 4 раза промывали РВ8/0,05% твин 20 (РВ8Т). Тестировали образцы 100 мкл кондиционированной среды в трех повторах. Образцы инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре (КТ), затем промывали 4Х в РВ8Т. Затем образцы инкубировали с биотинилированным антителом козы против коллагена типа I человека в разведении 1:2000 (8оиШегп Вю1ес11по1оду Л55ОС1а1е5. 1пс.) в течение 1 ч при КТ, затем промывали 4Х в РВ8Т. Затем образцы инкубировали с конъюгированным с НКР-стрептавидином антителом (2утеб) в разведении 1/4000 в течение 1 ч при КТ и встряхивании. Наконец, образцы промывали 4Х в РВ8Т. Добавляли субстрат ОРО (81дта, № в каталоге Р9187) и оставляли на 10 мин для развития окраски. Реакцию останавливали смешиванием с 20% Н₂8О₄ и планшеты считывали при 496 нм на счетчике для нескольких меток У1с1ог² (^а11ас). Результаты нормализовали в отношении количества клеток, используя набор для анализа пролиферации клеток СуОиап) (С-7026) из Мо1еси1аг РгоЬек.

Анализ промотора СТСБ-8ЕАР.

Промоторно-репортерную плазмиду СТСБ-8ЕАР конструировали с помощью ПЦР, проводимой с олигонуклеотидами 5'-АТСТССАСССССАСТССТСССТТСТСС (8 ЕС) ΙΌ N0:9) и 5'АТААССТТССАСТСССАСТСССТСТСТСС (8ЕЦ ΙΌ N0:10), чтобы амплифицировать область промотора гена СТСБ (фактор роста соединительной ткани) человека (788 п.о.). Очищенный в геле продукт амплификации субклонировали в р8ЕАР2-Ьа51С (С1оп1ес11).

Фибробласты МН 3Т3 (АТСС) высевали во флаконы Т-75 и котрансфицировали 5 мкг плазмиды СТСБ-8ЕАР и 1 мкг плазмиды рс^NА3.1 ([пуЦгодеп). Клетки высевали в среду с 800 мкг/мл С 418 (81дта).

Устанавливали клоны со стабильно интегрированным промотором-репортером СТСБ-8ЕАР, клоны анализировали и отбирали наиболее чувствительный клон для разработки анализа на основе клеток.

Клетки из данного клона (СТСБ-8ЕАР) высевали по 10000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты в ЭМЕМ. содержащую 0,5% БС8. На следующий день добавляли свежую среду, содержащую или не содержащую различные концентрации ТСРв и 0РС (остеопротегерин), и клетки инкубировали еще в течение 72 ч до сбора надосадков для анализа 8ЕАР.

Экспрессию 8ЕАР измеряли согласно протоколу производителя (набор С1оп1ес11).

Исследования ίη νί\Ό.

Фиброз легких индуцировали у самцов мышей (20-25 г) посредством внутритрахеального введения блеомицина (0,075 ГО) в физиологическом растворе в день 1. Мышей делили на 3 отдельные группы по 10 животных. Одна группа получала подкожные (п/к) инъекции ОРС по 5 мг/кг (в физиологическом растворе) ежедневно. Вторая группа ежедневно получала 0РС (0,5 мг/кг) п/к. Третья группа ежедневно получала физиологический раствор (п/к). В четвертую группу входили совпадающие по возрасту и полу необработанные нативные мыши. Массу тела измеряли ежедневно и всех мышей забивали на 12 день. Отдельные доли легкого выделяли для определения гидроксипролина (8ιηί11ι е) а1., 1994) или фиксировали формалином и заливали в парафин для гистологии. Срезы легкого красили трихромом или красным красителем рюго ыгшк на коллаген (Вапсгой апб 81еуеп5) и оценивали величину фиброз/легкое.

Полуколичественный анализ ПЦР с обратной транскриптазой мРНК 0РС в фибробластах пациентов со склеродермией, обработанных ίη νίΙΐΌ галофугиноном.

Поврежденные и неповрежденные фибробласты поддерживали в культуре, как описано выше. Монослои клеток (70% слияние) обрабатывали галофугиноном (10^-8 М) (Со11дагб Рйагтасеибсак) в течение 12 ч. После периода обработки клетки собирали и выделяли суммарную РНК, используя метод с тризолом. Затем 1 мкг суммарной РНК подвергали ПЦР с обратной транскриптазой, как описано выше, используя ПЦР-праймеры, специфичные для остеопротегерина (0РС 740 Р 5' АСС ССТ ААС ТСС СТТ АСТ СТ (8ЕС) ΙΌ N0:11) и 0РС 1280 К 5' СТС АТТ ССА ССТ ССТ ТАС СТ 8ЕС) ΙΌ N0:12). После 30 циклов ПЦР продукты реакции разгоняли в 1% агарозных гелях, красили бромидом этидия и фотографировали и анализировали, используя компьютерную программу Кобак ΙΌ 01Ц11а1 8с1епсе. Затем подтверждали, что продукты ПЦР, мигрирующие в области рассчитанной молекулярной массы, являются остеопротегерином, с помощью прямого секвенирования экстрагированной из геля ДНК. В качестве контроля на загрязнение геномной ДНК реакции ПЦР осуществляли на смесях для обратно-транскриптазной реакции, которые содержали соответствующую РНК, но не содержали обратной транскриптазы. Смеси для обратнотранскриптазных реакций также амплифицировали с ПЦР-праймерами, специфичными для САРЭН, в качестве позитивного контроля целостности и количества внесенной РНК в исходной реакции.

Активность промотора α2 коллагена типа Ι.

Фибробласты эмбрионов мышей (клетки π83) поддерживали в среде ЭМЕМ-Р12, содержащей 2% РС8 и 2 мМ глутамин. Клетки собирали трипсинизацией и высевали при 50% слиянии в 48-луночные планшеты для культивирования клеток. На следующий день клетки трансфицировали в бессывороточной среде вектором рСЬ3 (Рготеда), содержащим 3,5 т.п.о. промотора коллагена 1α2, связанного с кДНК люциферазы (любезно предоставленным Όγ. Όηνί6 АЬгайат из Коуа1 Ргее Но^рбак Ьопбоп, Епд1апб), используя реагент Ридепе V (Воске) согласно инструкции производителя. После 5 ч трансфекции клетки переносили в свежую среду, содержащую 2% РС8, и обрабатывали отдельно галофугиноном (10^-10 М), отдельно ТСЕ|Ц (5 нг/мл) или НР (10^-8 М) + ТСРР1 (5 нг/мл) в течение 12 ч в присутствии 0, 1, 10 или

- 17 007927

100 нг/мл рекомбинантного остеопротегерина человека. После периода обработки клетки переносили в полную среду, содержащую 2% РС8 и 2 мМ глутатион и через 48 ч измеряли активность люциферазы в каждой лунке, используя систему анализа Βιϊ§1ιΙ-Ο1ο. приобретенную из Рготеда. Результаты выражали в виде относительных единиц люминесценции и нормализовали в отношении количества клеток/лунку, определенного в параллельном эксперименте с использованием набора СуциаШ (ΜοΚαιΡ-π РгоЬек).

Пример 1. мРНК остеопротегерина подвергается значительной понижающей регуляции в поврежденных фибробластах по сравнению с неповрежденными.

Анализ микрочипов генов на фильтре осуществляли на образцах нормальных и аномальных фибробластов 6 пациентов со склеродермией. Средний уровень экспрессии остеопротегерина (ОРС) показан на фиг. 1а, а для каждого пациента - на фиг. 1Ь.

Результаты, полученные на микрочипах, далее подтверждали анализом ПЦР в режиме реального времени образцов РНК, выделенных от 9 пациентов, используя ПЦР-праймеры, специфичные для ОРС. Результаты показаны на фиг. 2 и выражены в виде кратного изменения уровня экспрессии (поврежденные делили на неповрежденные). У 7 из 9 тестированных пациентов ОРС подвергался понижающей регуляции по меньшей мере в 2 раза в поврежденных фибробластах по сравнению с неповрежденными фибробластами, выделенными от одного и того же пациента.

Маловероятно, что различия в экспрессии, наблюдаемые между неповрежденными и поврежденными фибробластами одного и того же пациента, являются следствием различий в условиях культивирования между двумя популяциями, так как экспрессия мРНК ОРС в первичных культурах нормальных фибробластов кожи человека существенно не изменяется при пересевах клеток (данные не показаны). Кроме того, анализ ОТ-ПЦР в режиме реального времени суммарной РНК, выделенной из целых образцов биоптата аномальной кожи пациентов со склеродермией, показал низкие уровни мРНК остеопротегерина по сравнению с кожей, которая выглядит клинически нормальной, в анатомически совпадающих местах тех же самых пациентов (фиг. 3).

Пример 2. ОРС подвергается понижающей регуляции на уровне белка в поврежденных фибробластах по сравнению с неповрежденными фибробластами пациентов со склеродермией.

Чтобы определить, отражается ли понижающая регуляция мРНК остеопротегерина в изменении белка остеопротегерина, определяли содержание ОРС в совпадающих по анатомическому расположению нормальных и поврежденных фибробластах кожи совпадающих по возрасту и полу субъектов с помощью Вестерн-блот-анализа, используя моноклональные антитела против остеопротегерина человека. Результаты показаны на фиг. 4. Мономер и димер остеопротегерина ясно обнаруживались в 3/4 нормальных фибробластов и слабо экспрессировались в 1 нормальном образце. В аномальных фибробластах полоса мономера слабо видна во всех четырех тестированных образцах. Рекомбинантно экспрессируемый слитый белок ОРС-Рс служил в качестве позитивного контроля для окрашивания.

Пример 3. Клонирование ОРС человека.

Чтобы охарактеризовать активность ОРС ίη νίΐτο и ίη νίνο полноразмерную кодирующую последовательность кДНК клонировали с помощью ПЦР с обратной транскриптазой, используя праймеры, основанные на опубликованной последовательности ОРС, которые фланкировали рассчитанные стартовый и стоп-кодоны. Анализ последовательности полученных в результате клонов кДНК ОРС (в ρс^NΑ3.1) показал 100% идентичность на нуклеотидной уровне последовательности ОРС, опубликованной Μοιϊηαβα еΐ а1., (Μοιϊηαβα еΐ а1., 1998), но отличие по 1 аминокислоте от последовательности, опубликованной δίтοηеΐ еΐ а1. (1997) (см. 8Еф ΙΌ NО:2 и 4).

Пример 4. Влияние ОРС на синтез коллагена типа I в клеточной линии фибробластов кожи человека.

Фибробласты, культивированные в присутствии Ь-аскорбата, секретируют коллаген в культуральную среду, позволяя выявлять коллаген с помощью ЕЬ18А. В фибробластах человека наблюдается повышающая регуляция синтеза коллагена в ответ на стимуляцию профиброзным цитокином ТСР|И. Поэтому авторы тестировали влияние рекомбинантного остеопротегерина (слитый белок остеопротегеринРс) на индуцированный ТСР|И синтез коллагена в фибробластах АС1518С. Остеопротегерин, добавленный к культурам фибробластов перед обработкой ТСРрР был способен ингибировать опосредованное ТСР|11 увеличение синтеза коллагена зависимым от дозы образом (фиг. 5). В том случае, когда эксперимент проводили в присутствии нейтрализующих моноклональных антител против ОРС, не наблюдалось влияния на синтез коллагена. Подобным образом введение отдельно анти-ОРС в отсутствие рекомбинантного ОРС не оказывало влияния на синтез коллагена, что свидетельствует о том, что наблюдаемое снижение синтеза коллагена являлось специфичным действием ОРС.

Сходное действие на синтез коллагена наблюдали при трансфекции первичных фибробластов человека (ОВНС) плазмидой, содержащей полную кодирующую последовательность ОРС (ρс^NΑ3.1/ОРС). В ОВНС, трансфицированных ОРС-плазмидой не наблюдали увеличения синтеза коллагена в ответ на стимуляцию ТСРрР в отличие от ложно (пустой вектор ρс^NΑ3.1) трансфицированных ОВНС (фиг. 6).

Пример 5. Обработка ОРС в значительной степени снижает как базальную, так и индуцированную ТСР|11 активность промотора альфа 2 коллагена типа I в фибробластах эмбрионов мышей.

Чтобы оценить, являлось ли снижение синтеза коллагена при действии ОРС следствием влияния на

- 18 007927 активность промотора коллагена, авторы исследовали влияние обработки 0РС на фибробласты эмбрионов мышей, которые были трансфицированы плазмидой, которая содержала кДНК репортерного гена люциферазы под контролем области размером 3,5 т.п.о. промотора α2 коллагена типа Ι. Стимуляция промотора коллагена в данной конструкции приводит к транскрипционной активации гена люциферазы, активность которого можно измерить в присутствии его субстрата люциферина светляка в анализе люминесценции.

Обработка 0РС от 1 до 100 нг/мл способна значительно снижать базальный уровень активности промотора коллагена (фиг. 7А, контроль). После стимуляции ΤΟΡβ1 имело место по меньшей мере 2-кратное увеличение активности промотора коллагена (фиг. 7А, ΤΟΡβ 1). Данную активность можно было существенно уменьшить, когда клетки одновременно обрабатывали 0РС в концентрации 100 нг/мл (Р<0,05).

Сообщалось, что растительный алкалоид галофугинон является специфичным ингибитором синтеза коллагена типа Ι (Сгапо1 еί а1., 1993). Когда фибробласты обрабатывали низкими концентрациями галофугинона (10^-10 М), авторы наблюдали зависимое от дозы снижение активности промотора коллагена в случае возрастающих концентраций остеопротегерина (от 1 до 100 нг/мл), которое было в высокой степени значимым при самой высокой тестированной дозе 0РО (100 нг/мл, Р<0,01) (фиг. 7А, НР). Галофугинон может ингибировать индуцированную ΤΟΡβ1 активность промотора коллагена (МсОайа еί а1., 2002). 0РС также способен усиливать действие галофугинона посредством ингибирования индуцированного ΤΟΡβ1 увеличения активности промотора коллагена зависимым от дозы образом. Указанное действие было в высокой степени значимым при 100 нг/мл 0РС (Р<0,01), и при данной концентрации активность промотора коллагена почти возвращалась к базальным уровням (фиг. 7, ΗΡ+ΤΟΡβ 1).

Пример 6. Опосредованная ΤΟΡβ трансактивация фактора роста соединительной ткани нейтрализуется 0Р0.

Фактор роста соединительной ткани (СТОР), богатый цистеином белок 38 кДа, стимулирует продукцию элементов внеклеточного матрикса фибробластами. Согласно сообщениям, обнаружена сверхэкспрессия СТОР во многих фиброзных тканях человека, включая легкое, кожу, печень, почку и кровеносные сосуды. Ш У11го ΤΟΕβ активирует транскрипцию гена СТОР в фибробластах легкого человека. Конструировали промотор СТОР-репортер с секретируемой щелочной фосфатазой (8ЕАР) в качестве репортера, экспрессию которого можно измерить в кондиционированной среде вместо клеточного экстракта.

Клетки, экспрессирующие репортерный ген СТСР-8ЕЛР, инкубировали с ΤΟΡβ и 0,46; 1,4 или 4,6 мкг/мл 0РО. Результаты данного эксперимента изображены на фиг. 7В. Инкубация с 0РО подавляла индуцированную ΤΟΡβ экспрессию СТОР, таким образом дополнительно свидетельствуя о противофиброзной активности 0РО.

Пример 7. Экспрессия мРНК 0РО в обработанных галофугиноном фибробластах пациентов со склеродермией.

Механизм, посредством которого галофугинон способен осуществлять понижающую регуляцию синтеза коллагена в фибробластах, полностью не выяснен. Поэтому авторы исследовали влияние галофугинона на экспрессию мРНК 0РО в парных поврежденных и неповрежденных фибробластах пациентов со склеродермией с помощью ПЦР с обратной транскриптазой.

Экспрессия мРНК 0РО в значительной степени повергается повышающей регуляции (по меньшей мере в 3 раза) как в поврежденных, так и в неповрежденных фибробластах во всех тестированных образцах (3 нормальных и 2 аномальных) при измерении через 12 ч после обработки 10^-8 М галофугиноном (фиг. 8). Интересно, что в экспериментах по анализу микрочипов генов на фильтрах 0РО был одним из наиболее подверженных повышающей регуляции генов при обработке фибробластов галофугиноном (данные не показаны).

Пример 8. Введение 0РО т νί\Ό защищает от индуцированного блеомицином фиброза легкого у мышей.

Введение однократной внутритрахеальной инъекции блеомицина мышам С57ВБ/6 приводит к быстрой индукции легочного фиброза в пределах 14 дней, который характеризуется повышенным отложением коллагена в легочном интерстиции (Накои еί а1., 2000). Чтобы определить, оказывает ли введение 0РО какое-либо защитное действие, направленное против развития фиброза, или действительно уменьшает тяжесть заболевания, авторы проверяли действие ежедневной инъекции 0РО у обработанных блеомицином мышей.

Блеомицин вводили путем однократной внутритрахеальной инсталляции в 3 группах по 10 мышей. 0РО вводили подкожной инъекцией, начиная через день после обработки блеомицином. Одна группа получала высокую дозу (5 мг/кг), а вторая группа получала более низкую дозу (0,5 мг/кг). Контрольные мыши ежедневно получали физиологический раствор п/к. Для сравнения в исследование включали 4-ю группу мышей, которая состояла из полностью необработанных, совпадающих по возрасту и полу особей (нативные мыши).

Животные, обработанные блеомицином, сразу же заболевали. Это приводит к быстрой потере массы тела и может привести в смерти, в отличие от необработанных животных, которые остаются счастливыми и здоровыми и показывают нормальный прирост массы (фиг. 9А). У мышей, обработанных низкой дозой 0РО, наблюдали сравнимую с контрольными животными потерю массы тела. В данной группе

- 19 007927 также наблюдалась повышенная смертность (фиг. 9В). Мыши, получавшие высокую дозу ОРС, чувствовали себя намного лучше со снижением массы тела только в течение первых 5 дней обработки. Это также отражалось и в виде низкой смертности (<10%) в данной группе.

Всех выживших мышей забивали через 12 дней после обработки блеомицином. Гистологический анализ легких показал, что у животных, обработанных высокой дозой ОРС, значительно меньшая площадь поверхности легкого была поражена фиброзом по сравнению с контрольными животными, которые имели фиброзные повреждения, покрывающие примерно 70% поверхности легкого (фиг. 10 А). У животных, обработанных высокой дозой ОРС, также наблюдали значительно меньшее содержание гидроксипролина в легких (Р<0,05) по сравнению с контрольными мышами, и его содержание было сравнимо с содержанием гидроксипролина, наблюдаемым у необработанных мышей (нативная группа, фиг. 10В). Сниженное содержание гидроксипролина также наблюдали у мышей, обработанных низкой дозой ОРС, хотя снижение не достигало статистической значимости вследствие малого числа выживших животных, оставшихся в данной группе. Содержание гидроксипролина является мерой отложения коллагена. Полученные в данной работе результаты показывают, что обработка ОРС эффективно приводит к сниженному отложению коллагена в легких.

Ссылки

1. АЬгаЬат Ό., ЬироЬ 8., МсУЫйег А., Р1а!ег-2уЬегк С., Р1е1а Т.Н., Кот ГН., Окей I. а пФ В1аск С. (1991) Ехргеккюп апФ Типсйоп оТ кшТасе апйдепк оп кс1егоФегта ТЬгоЫакк. АйЬгЬк ВЬеит. 34, 1164-1172.

2. АЬгаЬат Ό.Γ, 81и\геп X., В1аск С.М., 8а 8., Хи Υ., Ьеакк АЭ. Вю1. СЬет. 2000 Мау 19; 275(20):15220-5.

3. А1!ксЬи1 8.Р. е! а1., I. Мо1. Вю1., 215, 403-410, 1990.

4. А1!ксЬи1 8.Г. е! а1., Ыискю Ас1Фк Век., 25:389-3402, 1997.

5. Вапсгой Ю. апФ 81еуепк А. ТЬеогу апф Ргасйсе оТ Нк!о1одюа1 ТесЬпк|иек. СЬигсЬШ ЕМпдк!опе, Епд1апФ.

6. В1аск С.М. апф ЭепЮп С.Р. (1998) 8ук1ет1с кс1егокк апф ге1а!еФ ФкогФегк. 1п ОхТогФ 1ех1Ьоок оТ ВЬеита!о1оду (Р.С. МаФФкоп, Э.А. кепЬегд, Р. ХУоо апФ Ό.Ν. С1акк, ЕФк.), рр.771-789, ОхТогФ Ишу. Ргекк, Νονν Υо^к.

7. С1етеп!к Р.1. апФ Ригк! Ό.Ε. (1996) 8ук1ет1с 8с1егокк ХУПЬата апФ ХУПНатк, ВаШтоге.

8. Эеуегеих I. е! а1., №1с1ек Ас1Фк Век, 12, 387-395, 1984.

9. Εиде1таии Н., №\зск Ό., апФ Уа11асЬ Ό., 1990, I. Вю1. СЬет. 265, 1531-1536.

10. Сгапо! I., На1еуу О., ΗιιπνίΙζ 8., Ртек М. (1993) На1оТидтопе: ап шШЬйог оТ со11адеп !уре I куп1Ьеκίκ. ВюсЫт. ВюрЬук. Ас!а 1156, 107-112.

11. СгаШЬат (1974), 8с1епсе, 185, 862-864.

12. Найой Ν., Эедеп ГЬ., 8ккоп Т.Н., Ьш Н., Мооге В.В., РапФгапд1 В.С., 81топ В.Н. апФ Эге\\· А.Р. (2000) В1еотусш шФисеФ ри1топагу йЬгокк ίπ йЬгшодеп пи11 писе. I. С1т. 1пуек1. 106, 1341-135.

13. Кок!епшк Р.Г, 8Ьа1ЬоиЬ У.Сигг. РЬагт. Эек. 2001 Мау; 7(8) :613-35.

14. Кгет, Р.М., Ниапд Υ. апФ ХУткЮп В.ХУ. (2001). Ехрей Орт. ТЬег. Ра!еп!к 11(7):1065-1079.

15. Ее1дЬ!оп, С. Эгидк 2001 61(3), 419-427.

16. ЬеВоу Е.С. (1974) 1псгеакеФ со11адеп кугНЬекк Ьу кс1егоФегта ккш ТЬгоЬ1ак!к ш уйго. I. С1т. 1пуек!. 54, 880-889.

17. Май1ш, Массапо, ВауеШ е! а1., АйЬгйк ВЬеит. 1999, 42, 807-811.

18. МсСаЬа Т.Ь., РЬе1рк В.С., 8р1ега Н., Вопа С. (2002) На1оТидтопе, ап [пЫЬйог оТ Туре-1 Со11адеп 8уп!Ьекк апФ 8кш 8с1егокк, В1оскк Т^аикТо^т^ид-С^оνίЬ-Рас!о^-Ье!а-МеФ^а!еФ 8таФ3 Асйуайоп ш Р1ЬгоЬ1ак!к. I. 1пуек!. ЭегтаЮ1. 118, 461-70.

19. Мт Н. , Могопу 8., 8агок1 I., ЭппкИп С.В., СаррагеШ С. е! а1. (2000) Ок!еорго!едегш геуегкек ок!еорогокк Ьу тЫЬЮпд епФок!еа1 ок!еос1ак!к апФ ргеуеШк уакси1аг са1сШса!юп Ьу Ыосктд а ргосекк гекетЬЬпд ок!еос1ак!одепекк. I. Ехр. МеФ. 192, 463-474.

20. Могшада Т., №1дака\\'а Ν., ΥаκиФа Н., ТкиФа Е. апФ Н1дакЫ К. (1998) С1ошпд апФ сЬа^ас!е^^ζаί^ои оТ Не депе епсоФшд Ьитап ок!еорго!едегш/ок!еос1ак!одепекк 1пЫЬ1!огу Тас!ог. Еиг. I. ВюсЬет. 254, 685-691.

21. Реагкоп У.В., Ме!ЬоФк т Εиζуто1оду, 183, 63-99, 1990.

22. Реагкоп У.В. апФ Ыртап Ό.Γ, Ргос. №11. АсаФ. 8ск И8А, 85, 2444-2448, 1988.

23. 8Фтап АЭ. (1991) Могаййу Тгот кс1егоФегта ш Епд1апФ апФ Уа1ек 1968-1975. Апп. ВЬеи. Эк. 50, 95-96.

24. 81топе! У.8., Ьасеу Ό., ЭипкЮп С.В., Ке11еу М., е! а1. (1997) Ок!еорго!едегш: а поуе1 кесге!еФ рго!ет 1пуо1уеФ ш Не геди1айоп оТ Ьопе Фепкйу. Се11 89, 309-319.

25. 81и-\геп X., Эеп1оп С.Р., МсУЫйег А., Вои-СЬапок С., АЬгаЬат Ό.Γ, Фи Вок В.М. апФ В1аск С.М. (1997) 8с1егоФегта 1ипд ТЬгоЬ1ак!к ехЫЬй е1еуа1еФ апФ Фукгеди1а!еФ со11адеп !уре I Ьюкуп!Ьекк. АйЬгйк ВЬеит. 40, 1237-1244.

26. 8Ы-ХУеп X., ЭепЮп С.Р., МсУЫйег А., Вои-СЬайок С., АЬгаЬат Ό.Γ, Фи Вок В.М., В1аск С.М. (1997) 8с1егоФегта 1ипд ТЬгоЬ1ак!к ехЫЬй е1еуа1еФ апФ Фукгеди1а!еФ !уре I со11адеп Ьюкуп!Ьекк. АйЬгЬк ВЬеит. 40, 1237-1244.

27. 8тйЬ апФ Уа!егтап, I. Мо1. Вю1., 147, 195-197, 1981, АФуапсек т АррЬеФ МаЫетайск, 2, 482- 20 007927

489, 1981.

28. 8шйй К.Е., 8!пе!ег К.М., Р1ап 8.Н., Ьикаск Ν.ν., НиГГпад1е О.В., ^йке С.А, Вигбкк Μ.Ό., Ьшсо1п Р., ЕуапоГГ Н. апб Кипке1 8.Ь. (1994) РгобисЕоп апб ГипсЕоп оГ типпе тасгорйаде 1пЕ1атта!огу рго!еш-1а ш Ыеотусш тбисеб 1ипд ш)игу. б. 1ттипо1. 153, 4704.

29. 81111111, ΤеxιЬоок оГ Не Аи!о1ттипе И1кеакек, Еббеб Ьу Ьаййа, С.’1иогах/1 апб Кееуек, Ырршсо!! \νί11ίηιη5 & ^йктк, РЫ1абе1рЫа 2000.

30. 81ге111о\у Ό. апб Когп б. (1998) Вю1оду оГ Же кс1егобегта йЬгоЫак!. Сигг. Орт. К1еита!о1. 10, 572-578.

31. Τικα, А., батек, Н., СЫсйерогйсйе, К., ВоппеГоу, 6.Υ., Иауег, 6.М., апб 2иЬ1ег, К.Н., 1992, б. 1ттипо1. 148, 2778-2784.

32. Уоп Нерпе О. (1986) №с1е1с Ас1бк Кек. 14, 4683-4690.

33. ^1д1еу Е.М. апб 8и1е 8.Ό. (2001) Ехрей Оршбопк оп 1пуек!1дабопа1 Эгидк 10(1) 31-48.

34. \νίβΚ\' Р.М. апб Во1тд С.Ь. (2000) Τ1κ бгеабтеп! оГ кс1егобегта. 2, 276-292.

35. \νί1ιη М., 8НеусНепко А., Ноибйаеуе Т., Вгей 8., 8с1ете1дегег Ь., Ео!к1к Τ. апб Мапп М. (1996) Еет!ото1е кециепстд оГ рго!етк Ггот ро1уасгу1ат1бе де1к Ьу папо-е1ес!гокргау такк кресбготе!гу. №!иге, 379:466-469.

36. Υакиба Н., 8Ыта Ν., №1дака\\'а Ν., Мос1ихик1 8., Υη^ К. е! а1. (1998). 1бепШу оГ ок!еос1ак!одепекбкбк шЫЬйогу Гас!ог (ОС1Е) апб ок!еорго!едепп (ОРО): а тесйапбкт Ьу ^Ысй ОРО/ОС1Е 1пЫЬНк ок!еос1ак!одепек1к т уйго. Епбосппо1оду 139, 1329-1337.

Claims (41)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение вещества для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, причем вещество выбрано из группы, состоящей из:

   a) полипептида, содержащего 8ЕО ΙΌ NО:2 или 8ЕО ΙΌ NО:4;

   b) полипептида, содержащего аминокислоты 22-401 8ЕО ΙΌ NО:2 или 8Еф ΙΌ NО:4;

   c) полипептида, содержащего один, два, три или четыре богатых цистеином домена остеопротегерина;

   б) полипептида, содержащего аминокислоты 22-194 8ЕО ΙΌ NО:2 или 8ЕО ΙΌ NО:4;

   е) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), в котором аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90% идентичностью по меньшей мере с одной из последовательностей (а)-(б);

   Г) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности ДНК, кодирующей любой из (а)-(б), в условиях умеренной жесткости или в условиях высокой жесткости;

   д) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), в котором любые изменения в аминокислотной последовательности являются консервативными аминокислотными заменами в аминокислотных последовательностях (а)-(б); и

   1) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного, активной фракции или производного с круговыми перестановками любого из полипептидов (а)-(д).
2. 2. Применение по п.1, где фиброзным заболеванием является заболевание соединительной ткани.
3. 3. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является склеродермия.
4. 4. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является фиброз кожи.
5. 5. Применение по п.1, где фиброзным заболеванием является фиброз печени.
6. 6. Применение по п.1, где фиброзным заболеванием является фиброз почки.
7. 7. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является фиброз легкого.
8. 8. Применение по п.1 или 2, где фиброзным заболеванием является фиброз поджелудочной железы.
9. 9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где вещество является мономером или димером.
10. 10. Применение по любому из предшествующих пунктов, где вещество гликозилировано в одном или нескольких положениях.
11. 11. Применение по любому из предшествующих пунктов, где слитый белок содержит слияние с иммуноглобулином Дд).
12. 12. Применение по п.11, где слияние с Ц представляет собой Ес-слияние.
13. 13. Применение по любому из предшествующих пунктов, где функциональное производное содержит по меньшей мере один радикал, связанный с одной или несколькими функциональными группами, которые составляют одну или несколько боковых цепей на аминокислотных остатках.
14. 14. Применение по п.13, где радикал является полиэтиленгликолевым радикалом.
15. 15. Применение молекулы нуклеиновой кислоты для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, причем молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

    а) полипептида, содержащего 8ЕО ΙΌ NО:2 или 8ЕО ΙΌ NО:4;

    - 21 007927

    b) полипептида, содержащего аминокислоты 22-401 8ЕО ГО NО:2 или 8ЕО ГО NО:4;

    c) полипептида, содержащего один, два, три или четыре богатых цистеином домена остеопротегерина;

    б) полипептида, содержащего аминокислоты 22-194 8ЕО ГО NО:2 или 8ЕО ГО NО:4;

    е) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), в котором аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90% идентичностью по меньшей мере с одной из последовательностей (а)-(б);

    ί) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), который кодируется последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из (а)-(б), в условиях умеренной жесткости или в условиях высокой жесткости;

    д) мутеина любого из полипептидов (а)-(б), в котором любые изменения в аминокислотной последовательности являются консервативными аминокислотными заменами в аминокислотных последовательностях (а)-(б); и

    11) изоформы, слитого белка или активной фракции любого из полипептидов (а)-(д).
16. 16. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является заболевание соединительной ткани.
17. 17. Применение по п.15 или 16, где фиброзным заболеванием является склеродермия.
18. 18. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз кожи.
19. 19. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз печени.
20. 20. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз почки.
21. 21. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз легкого.
22. 22. Применение по п.15, где фиброзным заболеванием является фиброз поджелудочной железы.
23. 23. Применение по любому из пп.15-22, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность экспрессирующего вектора.
24. 24. Применение по п.23, где последовательность вектора является последовательностью вектора для генной терапии.
25. 25. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции полипептида, охарактеризованного в п.1, в клетке для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии.
26. 26. Применение клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, охарактеризованную в любом из пп.15, 23 или 24, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии, фиброза кожи, печени, почки, легкого или поджелудочной железы.
27. 27. Применение клетки, экспрессирующей вещество, охарактеризованное в любом из пп.1 или 9-13, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии, фиброза кожи, печени, почки, легкого или поджелудочной железы.
28. 28. Применение клетки, генетически модифицированной таким образом, чтобы продуцировать полипептид, охарактеризованный в любом из пп.1 или 9-13, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, в частности, склеродермии, фиброза кожи, печени, почки, легкого или поджелудочной железы.
29. 29. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит интерферон для одновременного, последовательного или раздельного применения.
30. 30. Применение по п.29, где интерферон является интерфероном-β.
31. 31. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит антагонист фактора некроза опухолей (ΤΝΕ) для одновременного, последовательного или раздельного применения.
32. 32. Применение по п.31, где антагонистом ΤΝΕ является ΤΒРI и/или ΤΒРII.
33. 33. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит средство против склеродермии для одновременного, последовательного или раздельного применения.
34. 34. Применение по п.33, где средство против склеродермии выбрано из группы, состоящей из ингибиторов АСЕ, блокаторов кальциевых каналов, ингибиторов протонных насосов, НПВС, ингибиторов СОХ, кортикостероидов, тетрациклина, пентоксифиллина, буцилламина, ингибиторов геранилгеранилтрансферазы, роттерлина, ингибиторов пролил-4-гидроксилазы, ингибиторов с-протеиназы, ингибиторов лизилоксидазы, релаксина, галофугинона, простагландинов, простациклинов, эндотелина-1, окиси азота, ингибиторов ангиотензина II, антиоксидантов или 8АКР-1.
35. 35. Способ лечения и/или профилактики фиброзного заболевания, предусматривающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества вещества, охарактеризованного в любом из пп.1, 9-15 или 23-34, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
36. 36. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является склеродермия.
37. 37. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз кожи.
38. 38. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз печени.
39. 39. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз почки.

    - 22 007927
40. 40. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз легкого.
41. 41. Способ по п.35, где фиброзным заболеванием является фиброз поджелудочной железы.