HRP20040877A2 - Use of osteoprotegerin for the treatment and/or prevention of fibrotic disease - Google Patents

Description

Polje izuma

Ovaj izum spada u polje fibrotičkih bolesti te poremećaje vezivnog tkiva. Specifičnije, izum se odnosi na uporabu osteoprotegerina za tretman i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti, posebice skleroderme. Kombinacije osteoprotegerina s interferomon, s antagonistom TNF-a ili s drugim anti-fibrotičkim agensom poput SARP-1 također spadaju u ovom izumu.

Osnova izuma

Fibroza je stanje koje je povezano s prekomjernom sintezom kolagena u unutrašnjim organima, uključujući bubrege, srce, pluća, stomak te zglobove.

Plućna fibroza je najčešća fibrotička bolest. Idiopatska plućna fibroza (IPF) karakterizirana je kroničnom upalom alveolarnih stijenki s progresivnom fibrozom nepoznatog podrijetla. IPF ili kriptogeni fibrotički alveolitis uzrok je 50 do 60% slučajeva idiopatske intersticijske plućne bolesti.

Uobičajena intersticijska pneumonija (UIP), jedan specifičan histopatološki obrazac intersticijske pneumonije, klasičan je obrazac koji se pojavljuje u biopsiji pluća s IPF-om. Kod manjeg povećanja, tkivo se čini heterogenim, s pojedinačnim područjima zdravih pluća, područjima s intersticijskom upalom, fibrozom te područjima koja su prošupljena poput saća. Intersticijska upala se sastoji od alveolarnog septalnog infiltrata limfocita, stanica plazme te histocita povezanih s hiperplazijom pneumocita tipa II. Fibrotičke zone se sastoje uglavnom od gustog acelularnog kolagena, premda raspršena središta proliferirajućih fibroblasta (fibroblastička središta), koja su mjesta rane i aktivne bolesti, također se mogu vidjeti uobičajeno intraalveolarno. Područja koja su prošupljena poput saća se sastoje od zračnih prostora cistične fibroze, često omeđenih s bronhijalnim epitelom te ispunjenih s mukosom. Neutrofili se mogu skupljati unutar mukosa. Hiperplazija glatkog mišićja često se javlja u područjima fibroze te u područjima koja su prošupljena poput saća. Subpleuralna i paraseptalna distribucija, karakterističan obrazac zakrpa te privremena heterogenost su najsigurnije karakteristike za identifikaciju UIP-a.

Identičan obrazac intersticijske upale te fibroze javlja se u kolageno-vaskularnim bolestima (poput RA, SLE, progresivne sistemske skleroze, miješane bolesti vezivnog tkiva, diabetes mellitis), u pneumokoniozama (poput azbestoze), radijacijskim ozljedama te nekim bolestima pluća koje si inducirane drogama (poput nitrofurantiona).

Klinički tijek IPF-a je progresivan; srednje preživljenje je 4 do 6 godina nakon dijagnoze. Prednizon je uobičajeni tretman u slučaju IPF-a. Odgovor na tretman je varijabilan, ali pacijenti s ranijim bolestima baziranima više na staničnoj razini, a prije pojave dominacije ožiljaka, vjerojatnije je da će pokazati poboljšanje s kortikosteroidima ili citotoksičnom terapijom. Potporni i palijativni tretman uključuje O2 u visokim koncentracijama prema relativnoj hipoksemiji te, ukoliko se pojavi bakterijska infekcija, koriste se antibiotici. Transplantacija pluća je uspješna u pacijenata s krajnjim stadijem plućne bolesti.

Fibroza pluća se odnosi na nakupljanje vezivnog tkiva u jetri kao posljedica neuravnoteženosti između proizvodnje i razgradnje izvanstaničnoga matriksa, a naglašeni su kolaps i kondenzacija vlakana koji postoje od ranije.

Fibroza jetre je uobičajeni odgovor na hepatocelularnu nekrozu ili ozljedu, koja može biti inducirana velikim brojem agenasa, poput bilo kojeg procesa koji narušava jetrenu homeostazu (posebice upala, toksična ozljeda ili poremećaj u protoku krvi kroz jetra) te infekcija jetra (viralne, bakterijske, gljivične te parazitske). Brojne bolesti skladištenja koje nastaju zbog urođenih pogrešaka u metabolizmu često su povezani s fibrozom, uključujući i lipidne poremećaje (Gaucherova bolast); bolest skladištenja glikogena (posebice tipovi III, IV, VI, IX i X); nedostatak α1-antitripsina; skladištenje egzogenih tvari poput sindroma suviška željeza (hemokromatoza) te bolest skladištenja bakra (Wilsonova bolest); nakupljanje toksičnih tvari (poput tirozinemije, fruktosemije te galaktosemije) te konačno peroksisomalne poremećaje (Zellwegerov sindrom). Brojne kemikalije i lijekovi mogu uzrokovati fibrozu, a posebice alkohol, metotraksat, isoniazid, oksifenisatin, metildopa, kloropromazin, tolbutamid te amiodaron. Poremećaj u cirkulaciji jetre (kao kroničan zastoj srca, Budd-Chiarijev sindrom, veno-okluzivne bolesti, tromboza portalne vene) te kronične obstrukcije protoka kroz žuč mogu dovesti do fibroze. Konačno, kongenitalna fibroza jetre je autosomalna recesivna malformacija.

Zdrava jetra je ispunjena hepatocitima te sinusoidama koje su raspoređene u izvanstaničnom matriksu koji se sastoji od kolagena (ponajviše tipa I, III i IV) i nekolagenskih proteina, uključujući glikoproteine (kao fibronektin, laminin) te nekoliko proteoglikana (poput heparan sulfat, hondroitin sulfat, dermatan sulfat, hijaluronat). Fibroblasti, koji se uobičajeno nalaze jedino u portalnim traktovima, mogu stvarati kolagen, velike glikoproteine i proteoglikane.

Druge stanice jetre (posebice hepatociti i Kupffer-ove stanice koje skladište masti te endotelne stanice) također mogu producirati komponente izvanstaničnoga matriksa. Stanice koje skladište masti, a koje su locirane ispod sinusoidnog endotela u prostoru po Disse-u, su prekursori fibroblasta sposobni prifilerirati i proizvoditi prekomjernu količinu izvanstaničnoga matriksa. Razvoj fibroze zbog skladištenja kolagena je posljedica ozljeda stanica jetre, posebice nekroze, te stanica upalnog odgovora. Specifični čimbenik koji se luči iz ovih stanica još nije poznat, ali jedan ili više citokina ili produkata peroksidacije masti su vjerojatni kandidati. Kupffer-ove stanice te aktivirani makrofagi proizvode upalne citokine. Novi fibroblasti iz okruženja nekrotičkih stanica jetre; pojačana sinteza kolagena dovodi do pojave ožiljaka. Fibroza se može razviti iz aktivne fibrogeneze te zbog nepotpune degradacije normalnog ili promijenjenog kolagena. Stanice koje skladište masti, Kupffer-ove stanice, te endotelne stanice su vrlo važne za bistrenje kolagena tipa I, nekoliko proteoglikana te denaturiranih kolagena. Kolageni tijekom aktivnosti ovih stanica mogu utjecati na razvoj fibroze te je mogu modificirati. Za histopatologa, fibrozno tkivo može postati očitije zbog pasivnog kolapsa te kondenzacije od ranije postojećih vlakana kolagena.

Tako, povećana sinteza ili smanjena degradacija kolagena rezultira u aktivno skladištenje prekomjernih količina vezivnog tkiva što pak utječe na funkciju jetre: (1) Pericelularna fibroza poremeti staničnu prehranu te rezultira u hepatocelularnu atrofiju. (2) Unutar prostora po Disse-u fibrozno tkivo se nakuplja oko sinusoide te ometa slobodan prolaz tvari koje iz krvi prelaze u hepatocite. (3) Fibroza u okolišu hepatičkih venula te portalnih traktova narušava protok krvi kroz jetra. Venski otpor kroz jetra povećava se od grananja portalnih vena pa prema sinusoidama te konačno do jetrenih vena. Sve tri rute mogu biti uključene.

Fibrozne tetive koje povezuju portalne traktove s središnjim venama također promoviraju anastomozne kanale: Arterijska krv, koja spaja normalne hepatocite, je preusmjerena u eferentne hepatičke vene, koje nadalje narušavaju funkciju te mogu akumulirati hepatocelularne nekroze. Razmjer u kojem su ovi procesi uzeli maha određuje veličinu nefunkcioniranja jetre: tj. u kongenitalnoj jetrenoj fibrozi velike fibrozne tetive uključuju ponajprije portalne regije, ali uobičajeno poštede jetreni parenhim. Kongenitalna jetrena fibroza tako se predstavlja kao portalna hipertenzija s očuvanom funkcijom hepatocita.

Skleroderma je bolest vezivnog tkiva koja je karakterizirana fibrozom kože te unutrašnjih organa, a koja dovodi do otkazivanje organa te smrti (Black i sur., 1998; Clements i Furst, 1996). Skleroderma ima spektar menifestacija te mnoštvo terapeutskih implikacija. Obuhvaća lokaliziranu sklerodermu, sistemsku sklerozu, poremećaje slične sklerodermi te sklerodermu Sine (Smith, 2000). Dok je lokalizirana skleroderma rijetka dermatološka bolest povezana s fibrozom, a manifestacije su ograničene na koži, sistemska skleroza je multisistemska bolest s varijabilnim rizikom za proširivanje na unutrašnje organe te također varijacijama kada je riječ o proširivanju kao kožna bolest. Sistemska skleroza može biti difuzna ili ograničena. Ograničena sistemska skleroza se također naziva CREST (kalcinoza, Raynaud-ova disfunkcija jednjaka, sklerodaktilija, telangiektazija). Poremećaji slični sklerodermi vjeruje se da su povezani s izlaganjem industrijskom okolišu. U bolesti Sine uključeni su i unutrašnji organi, ali bez promjena na koži.

Glavne manifestacije skleroderme te posebice sistemske skleroze su neodgovarajuća masivna sinteza kolagena te njegovo skladištenje, nefunkcioniranje endotela, spazam, kolaps te uništenje zbog fibroze.

Skleroderma je rijetka bolest s postojanom frekvencijom od otprilike 19 slučajeva na 1 milijun osoba. Uzrok skleroderme nije poznat. Međutim, važna je genetička predispozicija. Abnormalnosti uključuju autoimunost, promjenu endotelnih stanica te funkcije fibroblasta. Uistinu, sistemska skleroza je vjerojatno najteža od svih autoiminuh bolesti sa zabilježenim 50% smrtnosti unutar 5 godina nakon dijagnoze (Silman, 1991).

Kada je riječ o dijagnozi, jedan važan klinički parametar je stanjenje kože proksimalno od metakarpophalangealnih zglobova. Raynaud-ov fenomen je česta, gotovo uobičajena komponenta skleroderme. Dijagnosticira se promjenom kože nakon izlaganja hladnoći. Ishemija te stanjenje kože su simptomi Raynaud-ove bolesti.

Nekoliko važnih bioloških procesa je implicirano u inicijaciji, jačini te progresiji bolesti a uključuju vaskularnu disfunkciju, aktivaciju endotelijalnih stanica i oštećenja, nakupljanja leukocta, produkciju auto-protutijela, nekontrolirani fibrotički odgovor koji može voditi u smrt (Clements i Furst, 1996). Fibroblasti imaju središnju ulogu u patogenezi ove bolesti. Primarni fibroblasti koji su uzorkovani od pacijenata sa sklerodermom pokazuju mnoge od ovih karakterističnih svojstava bolesti koji se vide in vivo, kao što je vidno povećana sinteza i skladištenje izvanstaničnoga matriksa i to s obzirom na kolagen i fibronektin te poremećena produkcija čimbenika rasta i citokinina poput TGFβ i CTGF (Strehlow i Korn, 1998 i LeRoy, 1974).

Ne postoji tretman za liječenje skleroderme. Inovativna, ali vrlo riskantna terapija predlaže autolognu transplantaciju matičnih stanica (Martini i sur., 1999). Posebice, trenutno ne postoje tretmani za sklerodermu koji ciljaju fibrotični proces (Wigley i Boling, 2000).

Identifikacija gena koji su povezani s rizikom bolesti te progresijom skleroderme može dovesti do razvoja učinkovitih strategija za intervenciju u različitim fazama bolesti.

Osteoprotegerin (OPG) bio je prvi puta identificiran 1997. kao novi citokin kojeg luče fibroblasti (Simonet i sur., 1997). Ljudski OPG je protein od 401 amino kiseline te sadrži signalni peptid od 21 amino kiseline koji se izreže ispred glutaminske kiseline br. 22 dajući zreli protein od 380 amino kiselina. Tako, OPG je topljivi protein. Pripadnik je familije receptora TNF (Morinaga i sur., 1998, Yasuda i sur., 1998), a na svom N-terminusu sadrži četiri domene slične TNFR-u i bogate cisteinom (Simonet i sur., 1997). Za OPG-a je pokazano da ima ulogu u razvoju kosti, a miševi koji nemaju gen OPG pokazuju osteoporozni fenotip te masivne skeletne abnormalnosti (Min i sur., 2000).

Osteoprotegerin kojeg proizvode osteoblasti te stanice strome koštane srži, nema transmembransku domenu te djeluje kao receptor mamac koji se luči te koji nema izravni signalni kapacitet. OPG djeluje tako da se veže za svoj prirodni osteoprotegerinski ligand (OPGL), koji je također poznat kao RANKL (receptor aktivator NF-kappaB liganda). Spajanje OPG-a i OPGL-a sprječava OPGL da aktivira svoj kognitivni receptor RANK koji je pak osteoklastni receptor važan za diferencijaciju osteoklasta, njihovu aktivaciju i preživljenje.

Ljudski OPG je član familije TNFR te je gen u jednoj kopiji u genomu, a sastoji se od 5 egzona i pokriva 29 kb genoma (Simonet i sur., 1997). Rekombinantni OPG postoji u monomernim i dimernim oblicima navodne molekularne veličine od 55 i 110 kDa (Simonet i sur., 1997). Skraćivanje N-terminalne domene do cisteina br. 185 inaktivira protein, ponajviše prekidanjem SS3 disilfidne veze u domeni sličnoj TNFR-u, dok skraćivanje C-terminalnog dijela proteina do amino kiseline br. 194 ne mijenja biološku aktivnost. Tako, N-terminalna domena OPG-a slična TNFR-u dovoljna je za sprječavanje osteoklastogeneze (Simonet i sur., 1997).

Prekomjerna produkcija OPG-a u transgeničnim miševima dovodi do duboke osteopetroze koja je sekundarna gotovo potpunom nedostatku osteoklasta. Suprotno, uklanjanje gena OPG uzrokuje tešku osteoporozu u miševa. Uklanjanje OPGL-a ili RANK-a također dovodi do duboke osteopetroze, što navodi na vrlo važnu fiziološku ulogu ovih proteina u regulaciji resorpcije kostiju. Sekrecija OPG-a i OPGL-a iz osteoblasta te stromalnih stanica regulirano je brojnim hormonima i citokinima, često na recipročan način. Smatra se da relativna razina produkcije OPG-a i OPGL-a izravno određuje razinu resorpcije kosti. Ukoliko prevladava OPGL-a resorpciju kosti je povećana, dok ukoliko prevladava OPG-a resorpcija je inhibirana. Rekombinantni OPG blokira učinke otprilike svih čimbenika koji stimuliraju osteoklaste i to in vitro i in vivo. OPG također inhibira resorpciju kosti u brojnim životinjskim modelima bolesti uključujući i osteoporozu koja je inducirana odstranjivanjem jajnika, malignu humoralnu hiperkalcemiju te eksperimentalne metastaze kostiju. Stoga, OPG može predstavljati učinkovitu terapeutsku opciju za bolesti koje su povezane s povećanom aktivacijom osteoklasta (Kostenuik i Shalhoub, 2001).

Međutim, za osteoprotegerina još uvijek nije sugerirano da je uključen u fibrotičkim bolestima.

Sažetak izuma

Izum se oslanja na nalaz da davanje osteoprotegerina dovodi do značajne amelioracije bolesti u uspostavljenom životinjskom modelu fibroze pluća. Fibroza pluća je jedna od manifestacija skleroderme.

Stoga je prvi cilj ovoga izuma uporaba osteoprotegerina za pripremu lijeka za tretman i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti, posebice skleroderme. Drugi cilj ovoga izuma je uporaba stanica koje eksprimiraju osteoprotegerin ili ekspresijski čimbenik koji obuhvaća kodirajuću sekvencu osteoprotegerina za priređivanje lijeka za tretman i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti, posebice sistemske skleroze. Farmaceutski pripravci koji sadrže osteoprotegerin i druge protufibrotičke lijekove, poput halofuginona te metode za tretman koje podrazumijevaju unošenje osteoprotegerina u ljudsko tijelo, također spadaju u okvire ovoga izuma.

Kratki opis slika

Sl. 1 Ekspresija mRNA OPG-a u zdravim (kose crte) i oboljelim (horizontalne crte) fibroblastima iz 6 pacijenata sa sklerodermom. Ekspresija je određena pomoću analize gena na mikropločicama s filterom. Glavna razina ekspresije je prikazana u (a), a srednja je prikazana u (b).

Sl. 2 Analiza mRNA gena OPG iz 9 pacijenata sa sklerodermom pomoću PCR reakcije u realnom vremenu (real time PCR analysis). Za svaki pacijent, rezultati su predstavljeni kao omjer ekspresije mRNA gena OPG u lezijskim/ne-lezijskim fibroblastima.

Sl. 3 Ekspresija mRNA gena OPG u biopsijama uzetima iz kože s lezijama te kože bez lezija iz 5 pacijenata sa sklerodermom. Ekspresija je određena pomoću reakcije PCR u realnom vremenu. Horizontalne crte označavaju srednju vrijednost ekspresije za svaku skupinu.

Sl. 4 Analiza ekspresije OPG-a pomoću hibridizacije metodom Western blot u lezijskim te normalnim fibroblastima kože. Lezijski fibroblasti (A1-A4) te normalni fibroblasti (N1-N4). Strelice na lijevoj strani gela pokazuju položaj nativnog OPG-a (monomer od 55 kDa) te njegov dimerni oblik (110 kDa). Fuzijski protein OPG Fc (nabavljen kod R&D systems) korišten je kao pozitivna kontrola za protutijelo.

Sl. 5 Učinak OPG-a na sintezu kolagena u ljudskim fibroblastima AG1518. Stanice AG1518 bile su ili potpuno netretirane ili pretretirane s 10, 20 ili 40 ng/ml OPG-a u trajanju od 24 h, ili s 40 ng OPG-a + protu-OPG neutralizirajuće monoklonsko protutijelo (1 μg/ml), ili samo s protu-OPG neutralizirajuće monoklonsko protutijelo nakon čega je dodano 2 ng/ml TGFβ1 u trajanju od 24 h. Sinteza kolagena je bila određena pomoću testa ELISA. Rezultati su srednja vrijednost trostrukog određivanja + S.E.M.

Sl. 6 Učinak transfekcije OPG-a na α2 sintezu kolagena tipa I u ljudskim primarnim fibroblastima (stanice OBHC). Stanice OBHC su bile transfektirane s pcDNA3.1/OPG (OPG) ili samo s pcDNA3.1 (tobožnji) kako je opisano u metodama. Kolagen u kondicioniranom mediju bio je izmjeren 24 h nakon tretmana s TGFβ1 pomoću testa ELISA. Rezultati su srednja vrijednost trostrukog određivanja + S.E.M.

Sl. 7A: Učinak OPG-a na aktivnost α 2 promotora kolagena tipa 1 u mišjim fibroblastima iz embrija. Fibroblasti iz mišjeg embrija (stanice πS3) su bili transfektirani s vektorom pGL3 koji je sadržavao sekvencu od 3.5 kb u kojoj je bio α2 promotor kolagena 1 koji je bio spojena na cDNA luciferaze. Nakon transfekcije stanice su prebačene u svježi medij te su ostale ili netretirane (kontrola) ili su bile tretirane samo s halofuginonom (10-10 M) (HF); s TGFβ1 (5 ng/ml) (TGFβ1); ili s TGFβ1 (5 ng/ml) + HF (10-8 M) (HF+TGFβ1) u trajanju od 12 h s time da se koncentracija osteoprotegerina povećavala. Rezultati predstavljaju srednju vrijednost trostrukog određivanja. * označava P<0.05, a * označava P<0.01.

Sl. 7B prikazuje razinu ekspresije gena reportera koji je pod kontrolom promotora CTGF nakon inkubacije ili samo s TGFβ ili u kombinaciji s različitim količinama OPG-a.

Sl. 8 PCR analiza s reverznom transkriptazom mRNA iz osteoprotegerina nakon tretmana lezijskih i nelezijskih fibroblasta s halofuginonom u uvjetima in vitro iz pacijenata sa sklerodermom. Jedan % agarozni gel obrađen s etidij bromidom prikazuje produkte RT PCR reakcije za osteoprotegerin (gore) i GAPDH (dolje) u lezijskim (sufiks A), ili nelezijskim (sufiks N) fibroblastima.

Sl. 9 Učinak primjene osteoprotegerina u uvjetima in vivo na razvoj fibroze pluća u miševima koji su bili tretirani s bleomicinom: Promjena u tjelesnoj težini miša nakon tretmana s osteoprotegerinom. Rezultati su prikazani kao srednja masa u g/po skupini koja je mjerena svaki dan nakon intra-trahealnog ulijevanja bleomicina. B: Smrtnost koja je rezultirala nakon davanja bleomicina. Rezultati su prikazani kao postotak broja smrtnih slučajeva po skupini od 10 životinja.

Sl. 10 Učinak primjene osteoprotegerina u uvjetima in vivo na razvoj plućne fibroze u miševima koji su bili tretirani s bleomicinom. A: Razmjer plućne fibroze izmjeren 12 dana nakon davanja bleomicina. Pluća su bila obojana s trikromom. Rezultati su izraženi kao % reprezentativnog plućnog režnja koji je bio zahvaćen fibrozom u svakoj životinji koja je preživjela. B: Razina odlaganja kolagena u plućima izmjerena 12 dana nakon davanja bleomicina. Sadržaj hidroksiprolina bio je izmjeren u reprezentativnom plućnom režnju koji je bio uzet iz svake životinje koja je preživjela.

Opis izuma

Sukladno ovoga izuma, tehnologija analize DNA (gena) na mikropločicama bila je korištena kako bi se identificirali diferencijalno eksprimirani geni u kožnim fibroblastima iz fibrotičkih lezija od pacijenata sa sistemskom sklerozom (skleroderma) u usporedbi s zdravim (normalnim) fibroblastima iz nekih pacijenata. Jedini gen koji je bio postojano negativno reguliran u fibroblastima sa sklerodermom, bio je gen za osteoprotegerin (OPG), koji se također naziva inhibitorni čimbenik osteoklastogeneze. Abnormalni fibroblasti su pokazivali značajno nižu razinu mRNA gena OPG u usporedbi s normalnim fibroblastima u 7 od 9 testiranih pacijenata. Ovi rezultati su bili potvrđeni reakcijom PCR u realnom vremenu. Dodatno, analiza pomoću RT-PCR ukupne RNA izolirane iz cijelog uzorka biopsije abnormalne kože iz pacijenata sa sklerodermom pokazuje nižu razinu mRNA gena OPG u usporedbi s klinički normalnom kontrolnim biopsijama koje odgovaraju starosti, spolu i anatomskom položaju ispitivanih biopsija. Protein OPG pokazivao je također smanjenu razinu u lezijskim fibroblastima u usporedbi s normalnim fibroblastima izoliranim iz istog pacijenta. U uvjetima in vitro, OPG može sniziti sintezu kolagena koja je omogućena pomoću TGFβ nakon traksfekcije fibroblasta s cDNA gena OPG ili nakon tretmana s rekombinantnim proteinom. Daljnja aktivnost u uvjetima in vitro OPG-a je inhibicija ekspresije čimbenika za rast vezivnog tkiva (CTGF) koja je potaknuta pomoću TGFβ. CTGF uobičajeno inducira sintezu komponenti izvanstaničnoga matriksa u fibroblastima.

Ovi podaci za uvijete in vitro bili su poduprti podacima u uvjetima in vivo u ustaljenom životinjskom modelu. Davanje osteoprotegerina smanjuje fibrozu pluća te razinu odlaganja kolagena u eksperimentalnom modelu u kojem je plućna fibroza inducirana bleomicinom. Na histološkoj razini, pluća životinja koje su bile tretirane osteoprotegerinom sličile su onima iz netretiranih miševa.

Stoga, ovaj izum se odnosi na uporabu tvari za proizvodnju lijeka za tretman i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti, gdje je ta tvar izabrana iz skupine koja se sastoji od:

a) Polipeptida koji obuhvaća SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4;

b) Polipeptida koji obuhvaća amino kiseline 22 do 401 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4;

c) Polipeptida koji obuhvaća jednu, dvije, tri ili četiri domene osteoprotegerina bogate cisteinom;

d) Polipeptida koji obuhvaća amino kiseline 22 do 194 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4;

e) Muteina bilo kojeg polipeptida od (a) do (d), gdje sekvenca amino kiselina ima najmanje 40 % ili 50 % ili 60 % ili 70 % ili 80 % ili 90 % identičnosti s najmanje jednom od sekvenci polipeptida od (a) do (d);

f) Muteina bilo kojeg polipeptida od (a) do (d) koji je kodiran sekvencom DNA koja hibridizira s komplementarnom sekvencom DNA koja pak kodira bilo kojeg od polipeptida od (a) do (d) u blago striktnim ili visoko striktnim uvjetima;

g) Muteina bilo kojeg polipeptida od (a) do (d) gdje bilo koja promjena u sekvenci amino kiselina je konzervativna supstitucija amino kiselina u sekvencama od (a) do (d);

h) soli ili izooblika, fuzijskog proteina, funkcionalnog derivata, aktivne frakcije ili cirkularno permutiranog derivat bilo kojeg polipeptida od (a) do (g).

Stručnjak će shvatiti da sukladno ovoga izuma, tvar koja stimulira oslobađanje ili pojačava aktivnost endogenog osteoprotegerina također podjednako može biti korištena za tretman i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti, posebice skleroderme. Spomenuta tvar može biti zreli osteoprotegerin ili bilo koji fragment osteoprotegerina koji se veže na OPGL te time sprječava da se OPGL veže za RANK te time onemogućava inicijacijski signal preko RANK-a. Takva tvar može biti na primjer protutijelo protiv OPGL-a. Poznato je da se OPG veže za OPGL, a ova interakcija sprječava vezanje OPGL-a za svoj receptor RANK. Stoga, stručnjak će shvatiti da svaka tvar koja sprječava vezanje OPGL-a za njegov receptor RANK ili bilo koji drugi agens koji blokira aktivnost RANK-a ili signaliziranje, da će takav agens imati istu aktivnost kao i osteoprotegerin u sprječavanju i/ili tretmanu fibrotičkih bolesti, posebice skleroderme. Agensi koji blokiraju vezanje OPGL-a za RANK mogu biti antagonistička protutijela protiv OPGL-a, na primjer. Agensi koji blokiraju aktivnost RANK-a mogu nadalje biti antagonistička protutijela protiv RANK-a, na primjer. Nadalje agensi koji blokiraju interakciju OPGL/RANK mogu biti kemijski spojevi koji utječu na međusobno spajanje ova dva proteina, na primjer, ali također bilo koji drugi kemijski ili biološki inhibitor prijenosa signala preko receptora RANK.

cDNA ljudskog osteoprotegerina klonirana je a njena sekvenca je predstavljena u dokumentu SEQ ID NO: 1 u popisu sekvenci koji su u privitku ovoga dokumenta. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca dana je u SEQ ID NO: 2 iz sekvenci u privitku. Sekvence su opisane na stranici www.ncbi.nlm.nih.gov u dokumentu AB_008821, ali također i od strane autora Morinaga i sur. (1998). Izooblik ili polimorfan oblik osteoprotegerina opisan je od autora Simonet i sur. (1997). cDNA prema autoru Simonet i sur. (1997) predstavljena je u SEQ ID NO: 3 dokumenata u privitku, a odgovarajuća aminokiselinska sekvenca dana je u SEQ ID NO: 4. Obje sekvence su dostupne na stranici www.ncbi.nlm.nih.gov u dokumentu U94332. Jedina razlika između proteina između autora Morinaga i sur. te Simonet i sur. se odnosi na amino kiselinu na položaju 263, na kojem može biti asparaginska kiselina ili alanin.

Pojam "osteoprotegerin" na način na koji se ovdje koristi, odnosi se na bilo koju tvar s obzirom na zahtjeve iz točaka od (a) do (h).

Pojam "tretman i/ili prevencija" na način na koji se ovdje koristi, obuhvaća usporavanje, smanjenje ili parcijalnu, značajnu ili potpunu prevenciju ili blokiranje nastanka bolesti, njen razvoj, napredovanje ili nastanak, razvoj ili napredovanje bilo kojeg, nekoliko ili svih simptoma bolesti.

Pojam "fibrotička bolest" na način na koji se ovdje koristi odnosi se na bolesti koje uključuju fibrozu, koje mogu na primjer nastati zbog kronične upale ili popravka i reorganizacije tkiva. Fibroza može zahvatiti bilo koji organ ljudskog tijela, poput kože, pluća, gušterače, jetra ili bubrega. Stoga, ovaj izum također se odnosi na tretman i/ili prevenciju fibrotičke bolesti poput ciroze jetre, intersticijske plućne fibroze, Dupuytren-ove kontrakture, keloidnih i drugih abnormalnosti zacjeljivanja ožiljaka/rana, postoperativnih adhezija i reaktivne fibroze, kao i kroničnog zastoja srca, posebice nakon miokardijalnog infarkta. Nadalje bolest ili poremećaji koji se mogu tretirati s osteoprotegerinom obuhvaćaju bolesti zacjeljivanja rana, posebice u plućima, obuhvaćaju kronične upale pluća te konačnu fibrozu ili nastanka ožiljaka na površini pluća. Poremećaji koji uključuju upalu pluća obuhvaćaju na primjer idiopatsku plućnu fibrozu, sarkoidozu, bronhioplućnu displaziju, fibroproliferativni ARDS, kao i plućne manifestacije ili sistemske bolesti poput reumatoidnog artritisa (Krein i sur., 2001).

Fibroza općenito uključuje nastajanje ili proliferaciju vezivnog tkiva koje zamjenjuje funkcionalno diferencirano tkivo pojedinog organa. Stoga, u poželjnoj izvedbi ovoga izuma fibrotička bolest je bolest vezivnog tkiva.

U poželjnoj izvedbi, fibrotička bolest je skleroderma.

Pojam "skleroderma" na način kako se ovdje koristi odnosi se na bolest koja se još zove sistemska skleroza ili sistemska skleroderma. Ovi termini se koriste kao sinonimi u ovoj patentnoj prijavi. Sistemska skleroza je kronična bolest nepoznata uzroka, koja je karakterizirana difuznom fibrozom; degenerativnim promjenama; te vaskularnim abnormalnostima na koži, artikularnim strukturama te unutarnjim organima (posebice jednjaka, gastrointestinalnog trakta, plućima, srcu i bubrezima na primjer). Može biti lokalizirana ili miješana, sistemska, ograničena ili difuzna.

Pojam "skleroderma" najpoželjnije se odnosi na lokaliziranu, sistemsku, ograničenu i difuznu sklerodermu kao i na popratne sindrome.

Lokalizirana skleroderma primarno zahvaća kožu, ali također može zahvatiti potkožne mišiće te kosti. Međutim, u pravilu ne zahvaća unutarnje organe.

Lokalizirana skleroderma je relativno blaga, ali može sličiti sistemskoj sklerodermi u toliko što pokazuje slične površinske simptome kao pojava kožne biopsije pod mikroskopom.

Sistemska skleroderma obuhvaća nekoliko tipova simptoma ili skupina simptoma kao CREST, koji je limitiran ili difuzan. Također se o njoj može govoriti kao o sistemskoj sklerozi ili obiteljskoj progresivnoj sistemskoj sklerozi. Sistemska skleroderma može na primjer zahvatiti kožu, krvne žile, i/ili unutrašnje organe. Kada zahvati kožu, može uzrokovati da koža postane kruta i to najčešće na rukama i/ili licu. Kada zahvati krvne žile, može uzrokovati Raynaud-ovu bolest. Najozbiljniji slučajevi sistemske skleroze zahvaćaju unutrašnje organe te mogu uzrokovati invalidnost pa čak i smrt. Između ostalog, sistemska skleroza obuhvaća: sklerodermu plućnu bolest, sklerodermu bubrežnu krizu, srčane manifestacije, mišićnu slabost uključujući umor ili ograničeni CREST, gastrointestinalnu ljenost i spazam te abnormalnosti u središnjem, perifernom te autosomnom živčanom sustavu. Kada je riječ o abnormalnostima živčanog sustava, najčešći su karpalni tunelni sindrom koji je praćen s trigeminalnom neuralgijom.

Ograničena Skleroderma može na primjer biti ograničena na ruke, premda lice i vrat također mogu biti zahvaćeni.

Difuzna Skleroderma obuhvaća zatezanje kože, a također se javlja iznad ručnih zglobova (ili lakata). Postoji nekoliko potkategorija difuzne sistemske skleroze kao "skleroderma sine skleroderma" gdje postoji fibroza unutrašnjih organa, ali nema zatezanje kože; i obiteljska progresivna sistemska skleroza, jedan rijedak oblik koja se javlja u obiteljima.

Popratni sindromi su oni kada pacijent sa sklerodermom također ima i druge autoimune bolesti (poput lupusa, reumatoidnog artritisa, itd.), kao na primjer u difuznoj sklerodermi koja se javlja skupa s lupusom. Simptomi skleroderme mogu također biti i dio miješane bolesti vezivnog tkiva (MCTD), ili Bolest Nediferenciranog Vezivnog Tkiva (UCTD).

Termin "osteoprotegerin" na način na koji se ovdje koristi, odnosi se na protein koji obuhvaća cijelu, ili dio sekvence iz SEQ ID NO: 2 ili 4 (obje su ljudske) iz privitka na kraju ovoga dokumenta, kao i na soli, izooblike, muteine, aktivne frakcije, funkcionalne derivate i njihove cirkularno permutirane derivate. OPG iz ostalih životinjskih vrsta (ne iz čovjeka), poput miševa ili štakora, može se koristiti sukladno ovoga izuma sve dok postoji dovoljna identičnost između proteina koja omogućava proteinu da ostvari svoju biološku aktivnost, a bez da pokrene značajan imuni odgovor u ljudskom biću.

Najpoželjnije, pojam "osteoprotegerin" odnosi se na zreli protein kojemu nedostaje signalni peptid. Signalni peptid obuhvaća 21 N-terminalnu amino kiselinu OPG-a kako je definirano u SEQ ID NO: 2 ili 4, tj. zreli protein obuhvaća amino kiseline 22 do 401 iz SEQ ID NO: 2 ili 4. Pojam "osteoprotegerin", na način na koji se ovdje koristi, nadalje se odnosi na bilo koji fragment, dio, domenu ili subdomenu iz SEQ ID NO: 2 ili 4 koji pokazuje željenu aktivnost na sklerodermu ili na druge fibrotičke aktivnosti. Proteinski fragmenti, izooblici, diferencijalno glikolizirani ili sializirani oblici ili jedna ili više domena proteina mogu se koristiti sukladno izumu, ali samo ukoliko pokazuju bilo kakav korisni učinak na fibrotičke bolesti, najpoželjnije učinak koji je u najmanju ruku usporediv s proteinima potpune duljine. Korisni učinak može se mjeriti testovima u uvjetima in vitro ili in vivo koji su opisani u kasnijim primjerima, ili u bilo kojem drugom testu koji je prikladan za demonstriranje učinka na fibrotičkim bolestima, posebice na sklerodermu.

Na primjer, osteoprotegerin na svom N-terminalnom kraju sadrži domenu sličnu TNFR-u koja je bogata cisteinom, kako je opisano od autora Simonet i sur., 1997. Fragment koji sadrži ovu domenu pokazalo se da sadrži biološku aktivnost OPG-a u testovima u uvjetima in vitro. Stoga, poželjni fragment OPG-a sadrži domenu iz OPG-a koja je slična TNFR-u, a posebice taj fragment sadrži amino kiseline 22 do 194 iz SEQ ID NO: 2 ili 4.

Sukladno ovom izumu, osteoprotegerin može biti i onaj prirodni tj. nativni protein ili rekombinantni protein. Rekombinantna produkcija može se izvesti u eukariotskoj stanici poput stanice kvasca ili stanice sisavca, najpoželjnije stanice CHO, u stanicama HEK (bubrežne stanice iz ljudskog embrija) ili u ljudskim fibroblastima ili staničnim linijama. Nadalje može se proizvoditi u prokariotskim stanicama poput stanica E. coli.

Poznato je da se osteoprotegerin može javljati u monomernim i dimernim oblicima (Simonet i sur., 1997). Stoga, sukladno s ovim izumom, OPG može biti monomer, dimer ili multimer.

Poželjno je da je osteoprotegerin glikoliziran na jednom ili više položaja. Također, može se dogoditi da nije glikoliziran, u ovisnosti o danom zahtjevu te načinima proizvodnje ili izolacije proteina.

Pojam "soli" ovdje se odnosi na soli karboksline skupine, ali i na adicijske kisele soli amino skupina iz osteoprotegerinske molekule ili na njihove analoge. Soli karboksilne skupine mogu nastati na načine koji su poznati stručnjacima, a uključuju i neorganske soli, na primjer, natrijeve, kalcijeve, amonijeve, željezne ili cinkove soli i sl., dok soli s organskim bazama poput onih koji nastaju u reakciji, na primjer s aminima kao trietanolamin, arginin ili lizin, piperidin, prokain i sl. Adicijske kisele soli uključuju, na primjer soli s mineralnim kiselinama poput klorovodične kiseline ili sumporne kiseline te soli s organskim kiselinama poput na primjer octene kiseline ili oksalne kiseline. Podrazumijeva se da takve soli moraju očuvati biološku aktivnost osteoprotegerina koja je važna za ovaj izum, tj. njegovu sposobnost da pokazuje korisni učinak kod fibrotičkih bolesti, posebice skleroderme.

Izooblici ili izrezane varijante osteoprotegerina mogu se također koristiti sukladno izumu, ali samo ukoliko inhibiraju napredovanje bolesti i/ili njene simptome.

Na način na koji se ovdje koristi, pojam "muteini" odnosi se na analoge osteoprotegerina, u kojima su jedan ili više aminokiselinskih ostataka prirodnog osteoprotegerina zamijenjeni s različitim aminokiselinskim ostacima ili su deletirani ili jedan ili više aminokiselinskih ostataka je dodano prirodnoj sekvenci osteoprotegerina, a koji imaju najmanje istu aktivnost kao i divlji tip osteoprotegerina ili čak imaju i potentniju aktivnost. Biološka aktivnost OPG-a može se izmjeriti praćenjem vezanja OPG-a za njegov prirodni ligand OPGL-a. Testovi za praćenje interakcija protein-protein dobro su poznati stručnjacima. Primjeri takvih testova su ELISA test za vezivanje, imuno-precipitacijski testovi ili mjerenje u bilo kojem drugom odgovarajućem sustavu kao što je BIAcore system. Ovi muteini su pripremljeni poznatom sintezom i/ili pomoću tehnika mjesto-specifične mutageneze ili bilo koje druge poznate tehnike.

Svaki takav mutein ima sekvencu amino kiselina koja je dovoljno slična onoj iz zrelog osteoprotegerina, na način da ima značajno sličnu aktivnost osteoprotegerina. Aktivnost mutiranog osteoprotegerina nadalje se može testirati u testovima koji su objašnjeni u primjerima ispod. Mjerenjem količine sinteze kolagena u fibroblastima tretiranima s OPG-om može biti prikladan test za procjenjivanje aktivnosti muteina osteoprotegerina.

Muteini sukladni ovom izumu uključuju proteine koji su kodirani nukleinskim kiselinama poput DNA ili RNA, a koji hibridiziraju s DNA ili RNA koje kodiraju za osteoprotegerin, sukladno ovom izumu, i to u strogo definiranim uvjetima. Pojam "strogo definirani uvjeti" odnose se na hibridizaciju te uvijete ispiranja, koje stručnjaci uobičajeno opisuju kao "striktni". Vidi Ausubel i sur., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 i 6.4 (1987, 1992), i Sambrook i sur. (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Bez ograničenja, primjeri striktnih uvjeta uključuju uvijete ispiranja od 1220°C ispod izračunate vrijednosti Tm hibrida koji se studira i to u 2 x SSC te 0.5% SDS u trajanju od 5 minuta, 2 x SSC i 0.1% SDS u trajanju od 5 minuta; 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 37°C u trajanju od 3060 minuta, a onda s 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 68°C u trajanju od 3060 minuta. Stručnjaci će shvatiti da striktni uvjeti također ovise o dužini DNA sekvence, oligonukleotidnih proba (na primjer 1040 baza) ili miješanih oligonukleotidnih proba. Ukoliko se koriste miješane probe, poželjno je korištenje tetrametil amonij klorida (TMAC) umjesto SSC-a. Vidi Ausubel, supra.

Bilo koji mutein poželjno je da ima sekvencu amino kiselina koja je dovoljno slična sekvenci osteoprotegerina, na način da pokazuje vrlo sličnu ili čak bolju biološku aktivnost od osteoprotegerina.

Jedna lako mjeriva aktivnost osteoprotegerina je i njegova sposobnost da smanjuje sintezu kolagena. Sve dok mutein pokazuje značajno smanjenje sinteze kolagena, može se smatrati da ima vrlo sličnu aktivnost kao i osteoprotegerin. Tako, može se odrediti da li neki mutein ima najmanje istu aktivnost kao i osteoprotegerin i to pomoću rutinskog eksperimetiranja nad spomenutim muteinom.

U poželjnoj izvedbi, dati mutein ima najmanje 40% identičnosti ili homologije sa sekvencom zrelog. Još poželjnije, mutein ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najpoželjnije najmanje 90% identičnosti ili homologije.

Identičnost odražava srodnost između dviju ili više polipeptidnih sekvenci ili dviju ili više polinukleotidnih sekvenci koja se određuje usporedbom samih sljedova. Općenito, identičnost se odnosi na preciznu podudarnost između nukleotida ili amino kiselina između dvije polinukleotidne ili dvije polipeptidne sekvence preko cijele njihove dužine.

Za sekvence gdje ne postoji precizna podudarnost, može se odrediti "% identičnosti". Općenito, dvije sekvence koje se uspoređuju moraju se sravniti kako bi se dobila maksimalna podudarnost između njih. Sravnjenje može podrazumijevati ubacivanje "jazova" u jednu ili u obje sekvence kako bi se povećao postotak potpune podudarnosti. % identičnosti može se odrediti preko cijele dužine svake od sekvenci koje se uspoređuju (takozvano potpuno sravnjenje), a koje je posebice pogodno za sekvence iste ili vrlo slične duljine ili preko kraćih, definiranih duljina (takozvano lokalno sravnjenje), a koje je pak pogodnije za sekvence nejednakih duljina.

Metode za uspoređivanje identičnosti i homologije dviju ili više sekvenci dobro su poznate stručnjacima u polju. Tako na primjer, to su programi koji su dostupni preko paketa Wisconsin Sequence Analysis Package, verzija 9.1 (Devereux J i sur, 1984), a programi BESTFIT i GAP mogu se koristiti kako bi se odredio % identičnosti između dva polinukleotida te % identičnosti i % homologije između dvije polipeptidne sekvence. Program BESTFIT koristi algoritam za "lokalnu homologiju" autora Smith i Waterman (1981) te pronalazi najbolju pojedinačnu regiju sličnosti između dvije sekvence. Ostali programi za određivanje identičnosti i/ili sličnosti između sekvenci također su poznati stručnjacima u polju, kao na primjer obitelj programa BLAST (Altschul S F i sur, 1990, Altschul S F i sur, 1997, a može ih se dobiti na Internet stranici NCBI na www.ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Muteini osteoprotegerina, koji se koriste sukladno ovoga izuma ili nukleinske kiseline koje kodiraju za njih, uključuju i konačan komplet odgovarajućih sekvenci koje služe kao supstitucijski polipeptidi ili polinukleotidi koji se mogu rutinski dobiti od strane stručnjaka, bez nepotrebnih eksperimenata, a na osnovi tehnika i naputaka koji su ovdje predstavljeni.

Poželjne promjene za muteine sukladne ovoga izuma poznatije su kao "konzervativne" supstitucije. Konzervativne supstitucije amino kiselina u osteoprotegerinskim polipeptidima ili proteinima mogu uključiti sinonimne amino kiseline unutar skupine koja ima vrlo slične fizičko-kemijske karakteristike tako da zamjena sačuva biološku funkciju molekule (Grantham, 1974). Jasno je da insercije ili delecije amino kiselina mogu također biti načinjene i u sekvencama koje su bile ranije definirane bez da se mijenja funkcija, posebice ako insercije ili delecije uključuju svega nekoliko amino kiselina i to manje od trideset, a poželjno je ispod deset bez da se odstranjuju ili premještaju amino kiseline koje su važne za funkcionalnu konformaciju poput cisteinskih ostataka. Proteini i muteini koji su nastali pomoću takvih delecija i/ili insercija također ulaze u okvire ovoga izuma.

Poželjno je da sinonimne aminokiselinske skupine budu one koje su definirane u Tablici I. Još su poželjnije sinonimne aminokiselinske skupine definirane u Tablici II; a najpoželjnije su sinonimne aminokiselinske skupine definirane u Tablici III.

TABLICA I

Poželjne skupine sinonimnih amino kiselina

Amino kiselina Sinonimna skupina

Ser Ser, Thr, Gly, Asn

Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His

Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro Gly, Ala, Thr, Pro

Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Ala Gly, Thr, Pro, Ala

Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Cys Ser, Thr, Cys

His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His

Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln

Asn Gln, Asp, Ser, Asn

Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys

Asp Glu, Asn, Asp

Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Met Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp Trp

TABLICA II

Još poželjnije skupine sinonimnih amino kiselina

Amino kiselina Sinonimna skupina

Ser Ser

Arg His, Lys, Arg

Leu Leu, Ile, Phe, Met

Pro Ala, Pro

Thr Thr

Ala Pro, Ala

Val Val, Met, Ile

Gly Gly

Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu

Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe

Tyr Phe, Tyr

Cys Cys, Ser

His His, Gln, Arg

Gln Glu, Gln, His

Asn Asp, Asn

Lys Lys, Arg

Asp Asp, Asn

Glu Glu, Gln

Met Met, Phe, Ile, Val, Leu

Trp Trp

TABLICA III

Najpoželjnije skupine sinonimnih amino kiselina

Amino kiselina Sinonimna skupina

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu, Ile, Met

Pro Pro

Thr Thr

Ala Ala

Val Val

Gly Gly

Ile Ile, Met, Leu

Phe Phe

Tyr Tyr

Cys Cys, Ser

His His

Gln Gln

Asn Asn

Lys Lys

Asp Asp

Glu Glu

Met Met, Ile, Leu

Trp Met

Primjeri stvaranja supstitucija amino kiselina u proteinima koji se mogu korisititi za dobivanje muteina osteoprotegerinskih polipeptida ili proteina za uporabu u ovom izumu uključuju sve poznate metode poput onih koje su predstavljeni u Američkim patentima 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462 autora Mark i sur; 5,116,943 autora Koths i sur., 4,965,195 autora Namen i sur; 4,879,111 autora Chong i sur i 5,017,691 autora Lee i sur; te još i proteini u kojima je supstituiran lizin predstavljeni u Američkom patentu Br. 4,904,584 (Shaw i sur).

Pojam "fuzijski protein" odnosi se na polipeptide koji obuhvaćaju osteoprotegerin ili njegov mutein koji je fuzioniran za drugi protein, a koji posjeduje produženo vrijeme raspada u tjelesnim tekućinama. Fuzijski proteini koji obuhvaćaju cijeli ili samo funkcionalni dio osteoprotegerina koji je fuzioniran na cijeli ili samo na funkcionalni dio proteina koji je sposoban poboljšati biološku aktivnost molekule, poput poluživota u ljudskom tijelu na primjer, poželjni su prema ovom izumu. U poželjnoj izvedbi, fuzijski protein obuhvaća fuziju s imunoglobulinom (Ig). Fuzijski proteini koji sadrže cijeli protein ili samo dio osteoprotegerina koji je fuzioniran za cijeli protein ili samo na dio imunoglobulina, vrlo su poželjni. Oni mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomultimerni. Prednosti imaju fuzijski proteini koji sadrže konstantnu regiju imunoglobulina, posebice dio Fc iz imunoglobulina. Izvedbe u kojima su imunoglobulini izotipa IgG1 ili IgG2 još su poželjnije prema ovom izumu. Poželjno je da je fuzija tipa Fc fuzija.

Osteoprotegerin može tako biti fuzioniran na drugi protein, polipeptid ili sl., poput imunoglobulina ili njegovog fragmenta. Fuzija može biti izravna ili preko kratkog veznog polipeptida koji može biti duljine svega 1 do 3 aminokiselinskih ostataka ili dulji, na primjer duljine 13 aminokiselinskih ostataka. Spomenuti veznik može biti tripeptid sekvence E-F-M (Glu-Phe-Met) na primjer, ili veznik od 13 amino kiselina sekvence koja obuhvaća Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, a koji je uveden između sekvence osteoprotegerina i sekvence imunoglobulina.

Pojam "funkcionalni derivati" na način na koji se ovdje koristi odnosi se na derivate osteoprotegerina te njihove muteine i fuzijske proteine, koji mogu biti priređeni iz funkcionalnih skupina koje se javljaju u bočnim lancima na ostacima ili na N ili Cterminalnim skupinama, i to sredstvima koji su poznati stručnjacima te su uključeni u izumu sve dok ostaju farmaceutski prihvatljivi, tj. dok ne uništavaju aktivnost proteina koja je u najmanju ruku slična aktivnosti osteoprotegerina, te ne sadrži toksična svojstva ili pripravke koje ih sadrže. Stoga, u poželjnoj izvedbi funkcionalni derivati obuhvaćaju najmanje jedan ostatak koji je spojen na jednu ili više funkcionalnih skupina, koje se javljaju kao jedan ili više lanaca na aminokiselinskim ostacima.

Sukladno ovoga izuma, bočni lanci polietilen glikola (PEG) su vrlo poželjni ostaci. Bočni lanci PEG-a mogu maskirati antigena mjesta te povećati otpornost molekule za koju su vezani na tjelesne tekućine. Drugi derivati uključuju alifatičke estre karboksilnih skupina, amide karboksilnih skupina nastali reakcijom s amoniakom ili s primarnim ili sekundarnim aminima, derivate Nacila sa slobodnim amino skupinama aminokiselinskih ostataka nastalih s acilnim ostacima (poput alkanoila ili karboksinih aroilnih skupina) ili derivate Oacila sa slobodnim hidroksilnim skupinama (na primjer onih od ostataka serila ili treonila) nastalih s acilnim ostacima.

"Aktivne frakcije" osteoprotegerina i njegovih muteina i fuzijskih proteina, pokrivaju sve fragmente ili prekursore polipeptidnog lanca same proteinske molekule ili skupa s spojenom molekulom ili ostataka spojenih na nju poput šećera ili fosfatnih ostataka ili agregate molekula proteina ili samih šećernih ostataka s time da aktivne frakcije imaju aktivnost koja je u najmanju ruku vrlo slična aktivnosti osteoprotegerina.

Izum nadalje se odnosi na uporabu molekula nukleinskih kiselina za proizvodnju lijeka za tretman i/ili prevenciju skleroderme, gdje molekula nukleinske kiseline sadrži sekvencu koja kodira polipeptid koji se sastoji od slijeda amino kiselina koji je izabran iz skupine koja obuhvaća:

a) Polipeptida koji sadrži SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4;

b) Polipeptida koji sadrži amino kiseline 22 do 401 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4;

c) Polipeptida koji sadrži jednu, dvije, tri ili četiri domene osteoprotegerina koje su bogate cisteinom;

d) Polipeptida koji sadrži amino kiseline 22 do 194 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4;

e) Muteina polipeptida iz točaka od (a) do (d), gdje sekvenca amino kiselina ima najmanje 40 % ili 50 % ili 60 % ili 70 % ili 80 % ili 90 % identičnosti s najmanje jednom od sekvenci u točkama od (a) do (d);

f) Muteina iz bilo koje od točaka od (a) do(d) koji je kodiran sekvencom DNA koja hibridizira s komplementarnom nativnom sekvencom DNA koja kodira bilo kojeg polipeptida iz točaka od (a) do (d) i to u striktnim uvjetima ili u visoko striktnim uvjetima;

g) Muteina iz bilo koje točke od (a) do (d) gdje bilo koja promjena u slijedu amino kiselina je konzervativna supstitucija amino kiselina prema amino kiselinama u sekvencama iz točaka od (a) do (d);

h) Izooblika, fuzijskog proteina ili aktivne frakcije bilo kojeg polipeptida od (a) do (g).

za proizvodnju lijeka za tretman i/ili prevenciju od fibrotičkih bolesti. Izum se najviše odnosi na uporabu spomenutih molekula nukleinskih kiselina za tretman i/ili prevenciju bolesti vezivnog tkiva, posebice skleroderme.

Sukladno ovom izumu, osteoprotegerin može se također davati ljudima u obliku vektora koji sadrži molekulu nukleinske kiseline. Stoga, ovaj izum se nadalje odnosi na uporabu vektora koji sadrži spomenutu molekulu nukleinske kiseline za proizvodnju lijeka za tretman i/ili prevenciju skleroderme ili drugih poremećaja vezivnog tkiva. Poželjno je da vektor bude ekspresijski vektor koji sadrži promotor koji je funkcionalno spojen na cijelu sekvencu ili samo na jedan dio kodirajuće sekvence osteoprotegerina. U daljnjoj poželjnoj izvedbi, vektor je vektor za gensku terapiju. Vektori za gensku terapiju poznati su stručnjacima, a najveći broj njih jesu vektori koji su dobiveni iz virusa, poput adenovirusnih ili lentiviralnih vektora.

Sukladno izumu, osteoprotegerin može se također davati ljudima u obliku stanice koja proizvodi i/ili luči osteoprotegerin. Stoga, izum se nadalje odnosi na uporabu stanica koje eksprimiraju osteoprotegerin za proizvodnju lijeka za tretman i/ili prevenciju skleroderme ili bilo koje druge fibrotičke bolesti tj. za staničnu terapiju za tretman i/ili prevenciju skleroderme ili drugih fibrotičkih bolesti. Stanice mogu prirodno producirati osteoprotegerin i/ili mogu biti transfektirane stanice koje proizvode rekombinantni osteoprotegerin. Poželjne su stanice koje eksprimiraju i luče velike količine proteina, poput stanice za prekomjernu ekspresiju koje nose veliki broj ekspresijskih vektora koji se sastoje od molekule nukleinske kiseline koja kodira za osteoprotegerin.

Budući fibroblasti predstavljaju mašineriju fibroze one su najprikladnije stanice za anti-fibrotičku terapiju i terapiju skleroderme. Stoga, poželjno je da se sukladno ovoga izuma koriste fibroblasti koji eksprimiraju osteoprotegerin.

Izum se nadalje odnosi na stanice koje sadrže vektor koji se sastoji od molekule nukleinske kiseline koja kodira cijeli ili dio osteoprotegerina za pripremu lijeka za tretman i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti, posebice skleroderme. Stanica koja je genetički modificirana kako bi producirala polipeptid prema ovom izumu također se nalazi unutar okvira ovoga izuma.

Uporaba ekspresijskog vektora za induciranje i/ili pojačavanje endogene produkcije osteoprotegerina u stanici koja normalno eksprimira nedovoljne količine inhibitora, također je unutar okvira ovoga izuma. Tako, izum iskorištava tehnologiju poznatiju kao tehnologija aktivacije endogenih gena (endogenous gene activation - EGA) za produkciju željenog proteina.

Nekoliko kombiniranih tretmana je poželjno sukladno ovoga izuma. Stoga, poželjno je da lijek iz ovoga izuma nadalje sadrži:

- Interferon, posebice interferon-β

- Antagonist čimbenika tumorske nekroze (TNF), posebice topljivi TNFR, poput topljivog p55 (TBPI) i/ili topljivog p75 (TBP II);

- Dodatni anti-sklerodermatski agens;

- Jedan anti-sclerodermatski agens izabran iz skupine koja se sastoji od Halofuginona, inhibitora ACE, blokera kalcijevih kalana, inhibitora protonskih pumpi, NSAID, inhibitora COX, kortikosteroida, tetraciklina, pentoksifilina, bucilamina, inhibitora geranilgeranil transferaze, roterlina, inhibitora prolil-4-hidroksilaze, inhibitora c-proteinaze, inhibitora lizil-oksidaze, relaksina, halofuginona, prostaglandina, prostaciklina, endotelina-1, dušičnog oksida, inhibitora angiotenzina II, anti-oksidansa, ili SAPR-1.

SARP-1 je protein koji ima koristan učinak na fibrotičke bolesti poput skleroderme (WO02/46225). Fragmenti, izooblici, aktivne frakcije, fuzijski i funkcionalni derivati SARP-1, kako je opisano u WO02/46225, također se mogu koristiti u kombinaciji s osteoprotegerinom i to sukladno ovoga izuma.

Svi tretmani su namijenjeni simultanoj, uzastopnoj ili odvojenoj uporabi.

Farmaceutski pripravci koji sadrže jednu ili više gore spomenutih tvari skupa s osteoprotegerinom također su unutar okvira ovoga izuma.

Premda trenutačno nema lijeka za sklerodermu, nekoliko agenasa ili tretmana se zasada koristi kako bi se tretirali simptomi skleroderme. Takvi anti-sklerodermatski agensi, koji se mogu koristiti kao kombinirane terapije sukladnu izumu, sažeti su u radovima autora Leighton (2001) ili Wigley i Sule (2001), koji su u ovom izumu uključeni referencama.

Interferoni su ponajprije poznati po svojim inhibitornim učincima na viralnu replikaciju i staničnu proliferaciju. Interferon-γ, primjerice ima važnu ulogu u uspostavljanju imunih i upalnih odgovora. Smatra se da interferon β (IFN-β, interferon tipa I) ima anti-upalnu ulogu.

U još jednoj izvedbi ovoga izuma, osteoprotegerin se koristi u kombinaciji s antagonistom TNF-a. Antagonisti TNF izražavaju svoju aktivnost na nekoliko načina. Prvo, antagonisti se mogu vezati ili zarobiti molekulu TNF s dovoljnim afinitetom te specifičnosti da djelomično ili potpuno neutraliziraju epitop TNF ili epitope odgovorne za vezanje receptora TNF (u daljnjem tekstu označeni kao antagonisti zarobitelji). Antagonist zarobitelj može biti primjerice protutijelo protiv TNF-a.

Alternativno, antagonisti TNF mogu inhibirati signalne putove TNF-a koji se aktiviraju pomoću receptora na površini stanice nakon vezanja TNF-a (nadalje označeni kao "signalni antagonisti"). Antagonisti TNF-a se lako identificiraju te evaluiraju pomoću rutinske pretrage učinaka kandidata na aktivnost nativnog TNF-a na prijemčive stanice u uvjetima in vitro, primjerice na ljudskim B stanicama u kojima TNF uzrokuje proliferaciju i lučenje imunoglobulina. Test sadrži pripravak TNF-a u različitim razrjeđenjima antagonista kandidata i to od 0,1 do 100 puta od molarne količine TNF-a koji se koristi u ovom testu, te kontrole bez TNF-a ili bilo kojeg drugog antagonista (Tucci i sur., 1992).

Antagonisti zarobitelji su poželjni antagonisti TNF za uporabu sukladno izumu. Među antagonistima zarobitelja oni polipeptidi koji se vežu na TNF s najvišim afinitetom te imaju najnižu imunogenost, su najpoželjniji. Topljive molekule receptora TNF te neutralizirajuća protutijela protiv TNF-a su posebice poželjna. Primjerice, topljivi oblici TNF-RI (p55) i TNF–RII (p75) su korisni u ovom izumu. Skraćeni oblici ovih receptora, koji sadrže izvanstanične domene receptora ili njihove funkcionalne dijelove, posebice su poželjni antagonisti prema ovom izumu. Skraćeni topljivi receptori TNF tipa-I i tipa-II opisani su u EP914431, na primjer.

Skraćeni oblici receptora TNF su topljivi, a detektirani su u urinu i serumu kao vezni proteini koji inhibiraju TNF veličine otprilike 30 kDa ili 40 kDa, a nazvani su TBPI i TBPII, (Engelmann i sur., 1990). Simultana, uzastopna ili odvojena uporaba osteoprotegerina s antagonistima TNF-a i/ili s Interferonom je poželjna sukladno izumu.

Sukladno izumu, TBPI i TBPII su poželjni antagonisti TNF-a koji se mogu kombinirano koristiti s osteoprotegerinom. Derivati, fragmenti, regije i biološki aktivni dijelovi receptorskih molekula koji funkcionalno sliče receptorskim molekulama također se mogu koristiti u ovom izumu. Takav biološki aktivan ekvivalent ili derivat receptorske molekule odnosi se na dio polipeptida ili na sekvencu koja kodira receptorsku molekulu, a koja je dovoljne duljine te u stanju vezati TNF s takvim afinitetom da je interakcija s receptorom TNF koji je vezan za membranu inhibirana ili blokirana.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ljudski topljivi TNF-RI (TBPI) je antagonist TNF-a koji se može korisititi u ovom izumu. Prirodne ili rekombinantne topljive molekule receptora TNF i metode njihove proizvodnje opisane su u Europskim patentima EP 308 378, EP 398 327 i EP 433 900.

Premda bi bilo vrlo korisno blokirati TNF-α u ranijim fazama bolesti, smatra se da u kasnijim fazama TNF sam za sebe može ostvariti koristan učinak na sklerodermu (Abraham i sur., 2000). Stoga, izum se nadalje odnosi na kombiniranje osteoprotegerina i TNF-a za tretman ili prevenciju skleroderme, posebice u poodmaklim fazama bolesti. TNF-α ili TNF-β mogu se upotrebljavati sukladno s izumom.

Izum se nadalje odnosi na farmaceutski pripravak koji sadrži osteoprotegerin, ponekad skupa s jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razrjeđivač ili ekscipijenat za tretman i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti, posebice skleroderme. Farmaceutski pripravak može nadalje sadržavati bilo koju od ranije identificiranih komponenti, a posebno to vrijedi za interferon, TBP ili inhibitor COX.

Farmaceutski pripravak sukladan izumu također može sadržavati vektor koji se sastoji od molekule nukleinske kiseline prema izumu ili stanicu koja eksprimira osteoprotegerin.

Aktivni sastojci pripravka kao polipeptidi, nukleinske kiseline ili stanice prema izumu ili njihove kombinacije, kao i kombinacije tvari koje su ovdje spomenute, mogu se davati pojedincu na više načina. Rute administracije uključuju intradermalnu, transdermalnu (tj. u formulacijama sa sporim oslobađanjem), intramišićnu, intraperitonealnu, intravenoznu, subkutanu, oralnu, epiduralnu, lokalnu i intranazalnu rutu. Sve ostale terapeutski učinkovite rute administracije također se mogu korisititi, primjerice apsorpcija preko epitelijalnog ili endotelijalnog tkiva ili pomoću genske terapije gdje se molekula DNA koja kodira aktivni agens daje pacijentu (pomoću vektora), koji uzrokuje da se aktivni agens eksprimira i luču in vivo. Dodatno, protein(i) prema izumu mogu se davati skupa s drugim komponentama biološki aktivnih agenasa poput farmaceutski prihvatljivih surfaktanata, ekscipijenata, razrijeđivača i prijenosnika.

Definicija "farmaceutski prihvatljiv" namijenjena je i obuhvaća bilo koji nosač, koji ne interferira s učinkovitošću biološke aktivnosti aktivnog sastojka te da nije toksičan domaćinu (pacijentu) kome se daje. Na primjer za parentalnu administraciju, aktivni protein(i) mogu biti formulirani u jediničnoj doznoj formu za injektiranje pomoću prijenosnika poput slane otopine, otopine dekstroze, serumskog albumina i Ringer-ove otopine.

Za parenteralnu (tj. intravenoznu, subkutanu, intramišićnu) administraciju, aktivni protein(i) mogu se formulirati kao otopina, suspenzija, emulzija ili liofilizirani prah skupa s farmaceutski prihvatljivim paranteralnim prijenosnikom (tj. vode, slane otopine, otopine dekstroze) te aditivima koji održavaju izotoničnost (kao manitol) ili kemijsku stabilnost (kao prezervativi i puferi). Pripravak je steriliziran uobičajenim tehnikama.

Biodostupnost aktivnog(ih) proteina prema izumu također može biti poboljšana konjugacijskim procedurama koje povećavaju polu-život molekule u ljudskom tijelu, na primjer pomoću povezivanja za molekulu polietilenglikola kako je opisano u PCT Patentnoj prijavi WO 92/13095.

Terapeutski aktivne količine aktivnog(ih) proteina ovise o mnogim varijablama, uključujući i tip receptora, afinitet tvari iz izuma za svoj receptor, bilo kojoj zaostaloj citotoksičnoj aktivnost koja se može pojaviti, ruti administracije, kliničkog stanja pacijenta.

"Therapeutski učinkovita količina" je ona koja kada se administrira tvar prema izumu, ostvaruje korisni učinak na razvoj bolesti ili njene progresije in vivo. Doza koja se daje, kao jedinična ili multipna doza pacijentu varira u ovisnosti od više čimbenika, uključujući farmakokinetičke karakteristike OPG-a, rutu administracije, pacijentovo stanje i njegove karakteristike (spol, dob, tjelesna težina, zdravlje, veličinu), razinu simptoma, konkurentske tretmane, učestalost tretmana te željeni učinak. Podešavanje i manipulacija uspostavljenih doznih raspona ovise o sposobnosti stručnjaka.

Doza polipeptida prema izumu varira od otprilike 0,0001 do 100 mg/kg ili od oko 0.01 do 10 mg/kg ili oko 0.1 do 5 mg/kg ili oko 1 do 3 mg/kg, premda kako je naglašeno ranije, ovo ovisi ponajviše o terapeutskoj diskreciji. Lijek iz izuma može se davati dnevno, svaki dan ili tri puta na tjedan.

Dnevne doze se uobičajeno daju u podijeljenim dozama ili formama s produženim ispuštanjem, ali još uvijek učinkovite kako bi se postigao željeni rezultat. Druga ili svaka slijedeća administracija može se izvesti s dozom koja je ista, manja ili veća negoli je početna ili prijašnja doza koja je dana pacijentu. Druga ili svaka slijedeća administracija može se dati tijekom ili prije napadaja bolesti.

Izum se nadalje odnosi na metodu za tretman i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti, posebice skleroderme, koja obuhvaća administraciju učinkovite količine tvari iz izuma pacijentu koji ima potrebu, po mogućnosti skupa s farmaceutski prihvatljivim nosačem. Alternativno, ili dodatno, stanica koja producira osteoprotegerin ili molekula nukleinske kiseline iz izuma, prema potrebi koja obuhvaća ekspresijski vektor, može se dati sukladno ovoga izuma.

Ekspresijski vektor može se davati sistematski. Poželjno je da se ekspresijski vektor daje intramišićno injekcijom. Daljnja preferirana ruta administracije je inhalacija, posebice ukoliko je plućna fibroza uključena u bolesti. Lokalna administracija ekspresijskog vektora koja obuhvaća sekvence OPG-a ili polipeptid OPG-a prema izumu još je poželjnija ruta administracije, posebice ukoliko je zahvaćena i koža.

Izum se nadalje odnosi na metodu za pripremu farmaceutskog pripravka koji obuhvaća miješanje aktivne količine osteoprotegerina s farmaceutski prihvatljivim nosačem, te na metodu za tretman i/ili prevenciju artritisa koja obuhvaća davanje pacijentu učinkovitu inhibitornu količinu osteoprotegerina.

Sve reference koje su ovdje citirane, uključujući i članke iz časopisa ili sažetke, objavljene ili neobjavljene Američke ili strane patentne prijave, izdani Američki ili strani patenti ili bilo koje druge reference, potpuno su uključene ovdje citiranjem, uključujući sve podatke, tablice, slike i tekst koji se nalaze u citiranim referencama. Dodatno, cijeli sadržaj referenci koje su citirane u referencama citiranima ovdje također je u potpunosti uključen citatima.

Reference poznatih koraka u metodama, uobičajenih koraka u metodama, poznatih i uobičajenih metoda nikako nisu priznanje da bilo koji aspekt, opis ili izvedba ovoga izuma je već razotkrivena, naslućena ili sugerirana iz stanja tehnike.

Opisi specifičnih izvedbi iscrpno otkrivaju opću prirodu izuma, primjenom znanja stručnjaka (uključujući sadržaje ovdje citiranih referenci), spremno modificiraju i/ili adaptiraju različite primjene takvih specifičnih izvedbi, bez suvišnih eksperimentiranja, bez odstupanja od osnovnog koncepta ovoga izuma. Stoga, takve adaptacije i modifikacije zamišljeni su da ostanu unutar značenja i raspona razotkrivenih izvedbi, a na osnovi poučavanja i naputaka prezentiranih u ovom radu. Treba se shvatiti da je frazeologija i terminologija uporabljena ovdje isključivo u svrhu opisa te nije na bilo koji način ograničavajuća tako da se terminologija ili frazeologija prezentiranih specifikacija treba interpretirati od strane stručnjaka te u svijetlu tehnika i naputaka koji su ovdje navedeni, a u kombinaciji sa znanjem uobičajenog stručnjaka.

Nakon što je izum sada opisan, lakše će ga se shvatiti pomoću nekoliko slijedećih primjera koji su namijenjeni ilustraciji te na nikoji način ne ograničavaju ovaj izum.

Primjeri

Metode

Uzorci iz pacijenata

Ubodne biopsije od dva mm3 bile su uzete iz lezijske ili ne-lezijske kože (uobičajeno iz kože podlaktice) od devet pacijenata koji su imali istu dob i spol, a bolovali su od difuzne kutane sistemske skleroze (SSc). Svi pacijenti su ispunjavali kriterij Američkog fakulteta za reumatologiju (American College of Rheumatology) za dijagnozu SSc.

Kulture fibroblasta.

Fibroblasti su bili osigurani iz biopsija pomoću stanične kulture in vitro kako je opisano ranije (Abraham i sur., 1991). Ukratko, biopsije su bile razrezane na djeliće te postavljene u sterilnim plastičnim posudama ili bočicama. Nakon 15 minuta sušenja na sobnoj temperaturi komadići biopsije prilijepili su se (adherirali su) za plastiku za tkivnu kulturu, a nakon toga su bili kultivirani u podlozi za rast fibroblasta (FGM) koja se sastajala od Eagle-ove podloge modificirane po Dulbecco-u (DMEM) koja sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FCS), 2 mM L-glutamina, 1 mM natrij piruvata, 100 jedinica po ml penicilina, 100 μg po ml streptomicina, 50 mg po ml gentamicina i 2.5 μg po ml amfotericina B. Nakon 2-3 tjedna inkubacije u vlažnoj atmosferi s 5% CO2 u zraku, fibroblasti koji su prerasli odlijepljeni su pomoću blage tripsinizacije te rekultivirani u FGM-u bez gentamicina i amfotericina B. U eksperimentima, fibroblasti su bili korišteni između pasaža 2 i 5. Fenotip fibroblasta bio je potvrđen njihovom tipičnom morfologijom u monosloju te tri-dimenzionalnim kulturama kolagena u gelu.

Izolacija RNA

Ukupna RNA bila je izolirana iz konfluentnih fibroblasta sa sklerodermom u ranijim pasažama pomoću Trizola (Life Technologies) sukladno naputcima proizvođača. Konačni pelet RNA bio je resuspendiran u sterilnom DEPC-u tretiranim s vodom koncentracije 1μg/μl te spremljen na –80 °C.

Sinteza proba cDNA

Dva μg ukupne RNA bilo je pomiješano s 1.3 μl klica specifičnih za citokin (R&D systems cat. no. GAC11) te inkubirano na 70 °C u trajanju od 2 min u eppendorf tubici od 0.5 ml. Tubice su bile onda ohlađene na 50 °C u trajanju od 2 min nakon kojeg vremena je dodana reakcijska smjesa koja je sadržavala 2 μl reakcijskog pufera 5X (250 mM Tris-HCl pH 8.3, 375 mM KCl i 15 mM MgCl2), 1 μl of 10X mješavine dNTP-a (5 mM dGTP, 5mM dCTP i 5mM dTTP), 3.5 μl of α32P-dATP (3000Ci/mmol, Amersham kat. br. PB10204), 0.5 μl DTT (100 mM) i 1 μl superskripta II (Life Technologies). Reakcijska smjesa je bila nježno promiješana pipetiranjem te inkubirana na 50 °C u trajanju od 25 min. Reakcija je bila zaustavljena dodavanjem 1 μl of 0.1 M EDTA pH 8.0 koja je sadržavala 1 mg/ml glikogena). Označena cDNA bila je tada pročišćena od neugrađenih deoksinukleotida pomoću kolone Chromaspin-200 DEPC-H20 (Clontech) sukladno preporukama proizvođača. Frakcije koje su sadržavale cDNA bile su identificirane pomoću brojanja po Czerenkovu. Frakcija iz šiljak (uobičajeno frakcija br. 2 od ukupno 6 koje su bile sakupljene) bila je tretirana s 0.1 volumena 1 M NaOH koji je sadržavao 1 mM EDTA u trajanju od 20 min na 70 °C kako bi se hidrolizirala RNA, a tada je neutralizirana s istim volumenom 1 M NaH2PO4 koji je sadržavao 2.5 μg ljudske Cot-1 DNA (Life Technologies) u trajanju od 20 min na 70 °C. Neutralizirana cDNA proba koja je bila tretirana toplinom bila je tada izravno dodana hibridizacijskoj smjesi.

Hibridizacija gena na mikropločicama s filterom

Genske mikropločice s filterom (ekspresijske pločice ljudski citokina , R&D systems kat br. GA001) bili su predhibridizirane na 68 °C u trajanju od 2 h u 5 ml otopine Express Hybridization (Clontech) koja sadrži 0.5 μg/ml DNA sperme lososa (Life technologies) u bocama koje se okreću, a koje se nalaze u hibridizacijskoj pećnici tipa Hybaid (MWG Biotech). Nakon ovoga vremena predhibridizacijska otopina bila je zamijenjena sa svježom hibridizacijskom otopinom koja je sadržavala cDNA probe specifične aktivnosti između 0.25 do 1 x 106 cpm/ml. Hibridizacija je bila provedena u trajanju od 16-20 h na 68 °C. Nakon hibridizacije, filteri su bili isprani 4 puta s 2X SSC/1% SDS na 68 °C u trajanju od 20 minuta po ispiranju te dva puta s 0.1X SSC/0.5% SDS u trajanju od 15 min po ispiranju. Filteri su tada bili zatvoreni u vrećicama Saran wrapTM te izloženi sustavu koji se zove K-type storage phosphor imaging screen (Biorad) u vremenima od 4 h do 4 dana na sobnoj temperaturi.

Analiza slika

Slike hibridizacijskih rezultata su bile skenirane kod razlučivanja od 50 μm pomoću aparata Biorad Personal FX phosphoimager. Rezultirajući digitalni kompjutorski dokument od 16 bita bio je pretvoren u kompjutorski format tipa TIF a slika je analizirana pomoću programa Arrayvision (Imaging Research Inc.). Za svaki uzorak izmjeren je intenzitet piksela za 384 gena koji se na filtru nalaze kao duplikati. Pozadinski signal je bio oduzet a prosječni intenzitet piksela generiran je za svaki par točaka na pločici (= ekspresijska razina).

Potvrđivanje rezultata mikropločica za izabrane gene pomoću RT-PCR.

Jedan μg ukupne RNA iz svakog uzorka od pojedinog pacijenta bio je reverzno transkribiran pomoću klice oligo dT (Promega) u reakcijskom volumenu od 20 μl koji sadrži 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 0.1 % Triton X-100, 1 mM za svaki od dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0.5 jedinica rekombinantnog inhibotora ribonulkeaze RNasin (Promega) te 15 jedinica reverzne transkriptaze AMV (Promega). Reakcijska mješavina bila je inkubirana na 42 °C u trajanju od 60 min, uz grijanje od 95 °C u trajanju od 5 min a onda razrijeđena do 200 μl sa sterilnom vodom. Razrjeđenja reakcijske smjese reverzne transkriptaze bile su tada podvrgnute reakciji PCR u realnom vremenu na aparatu Taqman (PE Applied Biosystems 7700) koristeći specifičan par klica dizajniran za osteoprotegerin pomoću programa Primer Express (PE Applied Biosystems), a na osnovu pristupnog broja za bazu podataka (database accession number) koji je određen od strane proizvođača genskih mikropločica s filterom: osteoprotegerin-112F 5’ CTG CGC GCT CGT GTT TCT (SEQ ID NO: 5) i osteoprotegerin-185R 5’ AAT GAA GGT ACT TTG GAG GAA ACG (SEQ ID NO: 6). Rezultati su bili normalizirani s obzirom na ekspresiju takozvanog "housekeeping" gena za gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH) u svakom uzorku te su izraženi kao količina promjene, koja je određena pomoću dijeljenja ekspresijske vrijednosti dobivene iz uzorka oboljelog pacijenta s odgovarajućom vrijednosti uzorka iz zdravog pacijenta.

Kloniranje cjelokupne cDNA kodirajuće sekvence ljudskog osteoprotegerina.

Ukupna duljina cDNA sekvence koja kodira OPG bila je tada klonirana pomoću reakcije PCR s reverznom transkriptazom koristeći se sa slijedećim klicama koji se baziraju na sekvencu cDNA koja je dostupna u bazi podataka EMBL (pristupni broj U94332): OPG F 5’ CGG GAT CCGCCA CCA TGA ACA AGT TGC TGT GCT (SEQ ID NO: 7) i OPG R 5’ AAG CTC GAG TTA TAA GCA GCT TAT TTT 50 pmola od svakog u 50 μl reakcijske mješavine koja sadrži 0.3 mM dNTPs, 1 mM MgSO4, 5 μl cDNA kalupa iz normalnog ljudskog kožnog (prepucij) fibroblasta (pripremljenog kako je ranije opisano) 5 μl 10X amplifikacijskog pufera Pfx (Life Technologies) i 1 μl DNA polimeraze Platinum Pfx (Life Technologies). Reakcijska mješavina je grijana na 94 °C u trajanju od 2 min a tada je podvrgnuta reakciji PCR-a od 35 ciklusa i to kako slijedi: 94 °C 15 s, 55 °C u trajanju od 30 s i na 68 °C u trajanju od 1 min. Amplifikacijski produkti bili su analizirani na 1 % agaroznom gelu u 1 X TAE puferu (Life Technologies) dok su produkti PCR-a koji su migrirali prema predviđanjima njihove molekularne mase (1205 bp) bili pročišćeni iz gela pomoću kompleta kemikalija za pročišćavanje Wizard PCR purification kit (Promega).

Stotinu ng DNA koja je bila pročišćena iz gela bilo je porezano s restrikcijskim endonukleazama BamHI i XhoI (Pharmacia) prema uvjetima proizvođača, ponovno pročišćena kako je ranije opisano te ligirana s plazmidom pcDNA3.1(+) (Invitrogen), koji je bio porezan s enzimima BamHI/XhoI, pomoću T4 DNA ligaze (New England Biolabs) koristeći se standardnim tehnikama molekularne biologije. Ligacijski produkti bili su transformacijom ubačeni u E.coli soja TOP 10 F’ (Invitrogen) pomoću elektroporacije na aparatu Biorad Gene Pulser. Plazmidna DNA bila je izolirana iz 5 ml kulture koja je narasla iz rezultirajućih kolonija te je bila podvrgnuta automatiziranoj analizi sekvence na aparatu Applied Biosystems 3700 sequencer koristeći se klicama T7 i pcDNA3.1AS (Invitrogen) kako bi se potvrdila sekvenca OPG-a.

Detekcija osteoprotegerina u proteinskim ekstraktima izoliranim iz lezijskih te normalnih kožnih fibroblasta.

Lezijski i normalni fibroblasti niskih pasaža iz pacijenata sa sklerodermom te kontrolnih subjekata, kultivirani kako je opisano ranije bili su sakupljeni tretmanom staničnih monoslojeva s PBS-om koji sadrži 1 mM EDTA u trajanju od 5 min na 37 °C. Odvojene stanice bile su sakupljene centrifugiranjem, resuspendirane u 50 μl PBS-a te tretirane s 50 μl pufera za uzorke (20% SDS, 0.2% bromofenol plavo, 50% glicerol, 1M Tris pH 6.8), smrznute na - 80 °C te tada otopljene. Proteinski sadržaj je bio određen koristeći se kompletom kemikalija BCA (Pierce) prema protokolu proizvođača. Otprilike 10 μg proteina bilo je tretirano s 0.1 volumenom DTT-a (0.1M) te provedeno kroz 4 -12% SDS poliakrilamidni gel (Novex) prema instrukcijama proizvođača. Proteinske vrpce bile su tada transferirane na nitrocelulozne membrane pomoću aparata Novex wetblot na 30 V u trajanju od 1 h. Membrane su tada bile blokirane preko noći 4 °C u PBS-u koji sadrži 5% bezmasni mliječni prah, a nakon toga isprane u PBST-u. Membrane su bile inkubirane s primarnim protutijelom (R&D systems, protu-OPG monoklonsko protutijelo, kat br. MAB8051) kod 0.5 μg/ml u PBST/1% BSA u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi uz potresanje. Nakon ovoga vremena membrane su bile isprane ekstenzivno s PBST-om prije inkubacije sa sekundarnim protutijelom (protu-mišje protutijelo s peroksidazom iz hrena, Sigma) uz razrjeđenje od 1/3000, u PBST/1% BSA. Membrane su bile konačno isprane ekstenzivno prije razvoja i vizualizacije pomoću reagenasa ECL te HyperfilmTM nabavljenih kod Amersham-a.

ELISA za mjerenje kolagena tipa I u supernatantima staničnih kultura fibroblasta tretiranih s rekombinantnim OPG-om ili nakon transfekcije s vektorom OPG /pcDNA3.1

Sinteza kolagena bila je izmjerena in vitro u kultiviranim ljudskim fibroblastima koristeći se sustavom ELISA za zarobljavanje kako je opisano od autora Shi-Wen i sur., (Shi-Wen i sur., 1997). Ukratko, ljudski kožni fibroblasti AG1518 (kupljeni kod ATCC) bili su održavani u podlozi DMEM koja sadrži 5% FCS i 2 mM glutamina (Life Technologies). Stanice su sakupljene tripsinizacijom te zasijane uz 70% konfluentnosti u pločicama za kulturu s 48 jažica (Falcon) u podlozi koja je sadržavala 5 % serum, a 8 h kasnije stanice su transferirane u podlozi bez seruma. Nakon 24 h, podloga je odstranjena te zamijenjena sa svježom podlogom koja je sadržavala 50 μM L-askorbata (Wako Pure Chemical Industries) te povećane koncentracije ljudskog rekombinantnog osteoprotegerina (OPG-Fc, nabavljen kod R&D systems). Šesnaest sati kasnije, dodan je TGFβ1 (PeproTech) u podlogu u konačnoj koncentraciji od 2 ng/ml, te nakon daljnjih 24 h podloga je sakupljena, centrifugirana kako bi se odstranili ostaci stanica, razrijeđena te podvrgnuta testu ELISA za kolagen tipa I kako je ranije opisano.

Sinteza kolagena bila je također izmjerena u primarnim ljudskim fibroblastima (OBHC stanice) nakon transfekcije s c DNA OPG-a (pcDNA3.1-OPG) ili nakon tobožnje transfekcije (samo vektor pcDNA3.1) kako slijedi: stanice OBHC bile su sakupljene tripsinizacijom te zasijane s 50% konfluentnosti na kompletnoj podlozi na pločicama s 48 jažica. Plazmidi su transfektirani u stanice OBHC pomoću reagensa za transfekciju Fugene V (Roche) sukladno instrukcijama proizvođača. Pet sati nakon transfekcije, podloga je bila zamijenjena s svježom podlogom bez seruma koja je sadržavala L-askorbat te je ostavljena preko noći, a nakon toga tretirana s TGFβ1 (10 ng/ml) u trajanju od 24 h kako je ranije opisano.

Pločice MaxiSorp (Nunc) bile su presvučene preko noći na 4°C s kozjim protuljudskim protutijelima protiv kolagena tipa-I (Southern Biotechnology Associates. Inc.) koncentracije 5 μg/ml u PBS-u (pH 7.4). Otopina protutijela je tada bila odstranjena a pločice su bile blokirane s PBS-1% BSA u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi. Pločice su tada bile isprane 4 puta s PBS/0.05% Tween 20 (PBST). Trostruki uzorci kondicionirane podloge od po 100 μl bili su testirani. Uzorci su bili inkubirani u trajanju od 2 h na sobnoj temperaturi (RT) a tada isprani 4X s PBST-om. Uzorci su tada bili inkubirani s biotiniliranim kozjim protu-ljudskim protutijelom protiv kolagena tipa-I u razrjeđenju od 1:2000 (Southern Biotechnology Associates. Inc.) u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi, nakon čega su isprani 4X s PBST-om. Uzorci su tada bili inkubirani s protutijelom konjugiranim s HRP-streptavidinom u razrjeđenju od 1/4000 (Zymed) u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi uz potresanje. Konačno, uzorci su bili isprani 4X s PBST-om. Substrat OPD (Sigma kat. br. P9187) bio je dodan te ostavljen 10 minuta za razvoj kolorne reakcije (pojava boje). Reakcija je bila zaustavljena s 20% H2SO4 a pločice su bile očitane na višestrukom brojaču Victor2 multilabel counter (Wallac) pri valnoj duljini od 496 nm. Rezultati su bili normalizirani s obzirom na brojeve stanica pomoću kompleta kemikalija za proliferaciju stanica CyQuant (C-7026) od Molecular Probes.

Test promotora CTGF-SEAP

Plazmid reporter s promotorom CTGF-SEAP bio je konstruiran pomoću reakcije PCR izvedene s oligonukleotidima 5’-ATCTCGAGGGCCACTCGTCCCTTGTCC (SEQ ID NO: 9) i 5’-ATAAGCTTGGAGTCGCACTGGCTGTCTCC (SEQ ID NO: 10) kako bi se umnožila promotorska regija ljudskog gena CTGF (čimbenik rasta vezivnog tkiva) (788 bp). Umnoženi produkt koji je bio pročišćen iz gela bio je sub-kloniran u pSEAP2-basic (Clontech).

Fibroblasti NIH 3T3 (ATCC) bili su zasijani u bočice T-75 te ko-transfektirani s 5 μg plazmida CTGF-SEAP i 1 μg plazmida pcDNA3.1 (Invitrogen). Stanice su bile selekcionirane na podlozi s 800 μg/ml G 418 (Sigma).

Klonovi sa stabilno ugrađenim promotorom reporterom CTGF-SEAP bili su uspostavljeni, analizirani a najosjetljiviji je bio odabran za razvoj staničnog testa.

Stanice ovoga klona (CTGF-SEAP) bili su uzgajane tako da je zasijano 10000 stanica po jažici u pločicama s 96 jažica u DMEM-u koji je sadržavao0,5% FCS-a. Slijedeći dan dodana je svježa podloga koja je imala istu ili različitu koncentraciju TGFβ i OPG (osteoprotegerin) a stanice su bile inkubirane dodatna 72 sata prije sakupljanja supernatanta za test SEAP.

Ekspresija u testu SEAP bila je izmjerena sukladno protokolu proizvođača (Clontech kit).

Studije in vivo

Plućna fibroza bila je inducirana u mišjim mužjacima (20–25 g) pomoću intra-trahealnu administraciju bleomicina (0.075 IU) u slanoj otopini i to prvog dana (dan 1). Miševi su bili podijeljeni u 3 zasebne skupine od po 10 životinja. Jedna skupina je dobila potkožne (s.c) injekcije OPG-a koncentracije 5 mg/kg (u slanoj otopini) dnevno. Druga skupina je na isti način dobila dnevnu dozu OPG-a (0.5 mg/kg). Treća skupina je na isti način dnevno dobila samo slanu otopinu. Četvrta skupina se sastojala od netretiranih životinja kojima su se dob i spol podudarali. Tjelesna težina je bila mjerena dnevno, a svi miševi su žrtvovani 12. dana. Pojedinačni plućni režnjevi bili su izolirani za određivanje hidroksiprolina (Smith i sur., 1994) ili su bili fiksirani formalinom te uklopljeni u parafin za histologiju. Dijelovi pluća su bili obojani s bojama za kolagen poput tri-krom ili pikro sirius crveno (Bancroft i Stevens), nakon čega je procijenjena razina fibroze u plućima.

Polu kvantitativna analiza pomoći reakcije PCR s reverznom transkriptazom mRNA OPG-a u fibroblastima iz pacijenta sa sklerodermom tretiranima s halofuginonom in vitro.

Lezijski i ne-lezijski fibroblasti bili su održavani u kulturi kako je ranije opisano. Monoslojevi stanica (70% konfluentnosti) bili su tretirani s halofuginonom (10-8 M) (Collgard Pharmaceuticals) u trajanju od 12 h. Nakon razdoblja tretmana, stanice su bile sakupljene a ukupna RNA je izolirana pomoću metode Trizol. Jedan μg ukupne RNA bio je podvrgnut reakciji PCR s reverznom transkriptazom kako je ranije opisano koristeći se PCR klicama koje su specifične za osteoprotegerin (OPG 740 F 5’ ACG CCT AAC TGG CTT AGT GT (SEQ ID NO: 11) i OPG 1280R 5’ CTG ATT GGA CCT GGT TAC CT SEQ ID NO: 12). Nakon 30 ciklusa PCR-a, reakcijski produkti su razdvojeni na 1% agaroznim gelom, obojani s etidij bromidom, fotografirani te analizirani koristeći se programom Kodak 1D Digital Science. Za produkte PCR-a koji su migrirali prema predviđenoj molekularnoj masi, izravnim sekvenciranjem DNA koja je bila pročišćena iz gela bilo je potvrđeno da su osteoprotegerin. Kao kontrola protiv kontaminacije s genomskom DNA, PCR reakcije su bile izvedene u reakcijskim mješavinama za reverznu transkriptazu koje su sadržavale odgovarajuću RNA, ali ne i reverznu transkriptazu. Reakcije reverzne transkriptaze također su bile izvedene i sa PCR klicama specifičnima za GAPDH kao pozitivna kontrola integriteta i kvalitete kalupa RNA u inicijacijskoj reakciji.

Aktivnost promotora α 2 kolagena tipa I.

Fibroblasti iz embrija miša (πS3 stanice) bili su održavani u podlozi DMEM-F12 koja sadrži 2% FCS-a i 2 mM glutamina. Stanice su bile sakupljene tripsinizacijom i nacijepljene uz 50% konfluentnosti u pločicama za kulturu s 48 jažica. Slijedeći dan (u podlozi bez seruma) stanice su bile transfektirane s vektorom pGL3 (Promega) koji je sadržavao promotor 1α2 iz kolagena od 3.5 kb koji je bio spojen na cDNA luciferaze (bubreg je nabavljen zahvaljujući Dr. David Abraham iz Royal Free Hospital, London, Engleska) koristeči se s reagensom Fugene V (Roche) prema uputama proizvođača. Nakon 5 h transfekcije, stanice su bile prenešene u svježu podlogu koja je sadržavala 2% FCS te su bile tretirane samo s halofuginonom (10-10 M), samo s TGFβ1 (5 ng/ml) ili s HF (10-8 M) + TGFβ1 (5 ng/ml) u trajanju od 12 h u prisutnosti 0, 1, 10 ili 100 ng/ml rekombinantnog ljudskog osteoprotegerina. Nakon razdoblja tretmana, stanice su bile prenešene u kompletnu podlogu koja je sadržavala 2 % FCS i 2 mM glutamina, a aktivnost luciferaze je bila izmjerena u svakoj jažici nakon 48 h koristeći se testnim sustavom Bright-Glo koji je bio nabavljen kod Promega. Rezultati su izraženi u jedinicama relativne luminiscencije te su bili normalizirani na broj stanica/po jažici određenim u paralelnom eksperimentu pomoću kompleta kemikalija Cyquant (Molecular Probes).

Primjer 1

razina mRNA osteoprotegerina je značajno smanjena u fibroblastima iz lezija naspram istih iz područja bez lezija

Analiza gena na mikropločicama s filterom bila je provedena na uzorcima normalnih i abnormalnih fibroblasta iz uzoraka sakupljenih od 6 pacijenata sa sklerodermom. Srednja razina ekspresije osteoprotegerina (OPG) prikazana je na Sl. 1a, a za svaki pacijent na Sl. 1b.

Rezultati dobiveni na mikropločicama bili su nadalje potvrđeni reakcijom PCR u realnom vremenu u kojoj su bili analizirani RNA uzorci iz 9 pacijenata koristeći se PCR klicama specifičnima za OPG. Rezultati su prikazani na Sl. 2, a izraženi su kao količina promjene u ekspresijskoj razini (lezijske podijeljene s ne-lezijskim). U 7 od 9 testiranih pacijenata, razina OPG-a je bila snižena najmanje za 2 puta u lezijskim fibroblastima u usporedbi s ne-lezijskim fibroblastima izoliranima iz istog pacijenta.

Malo je vjerojatno da su razlike u ekspresiji koje su bile uočene između ne-lezijskih i lezijskih fibroblasta iz istog pacijenta nastupile zbog razlika u uvjetima kulture između dvije populacije jer se ekspresijska razina za mRNA OPG-a u primarnim kulturama normalnih kožnih fibroblasta ne mijenja značajno kako se pasažiranje stanica nastavlja (podaci nisu prikazani). Dodatno, analiza pomoću RT-PCR u realnom vremenu ukupne RNA izolirane iz cijelog uzorka biopsije abnormalne kože od pacijenata sa sklerodermom ukazuje na nižu razinu osteoprotegerinske mRNA u usporedbi s kožom iz odgovarajućeg anatomskog mjesta iz istih pacijenata, a koje klinički izgleda normalno (Figure 3).

Primjer 2

Razina OPG-a je snižena na proteinskoj razini u lezijskim naspram ne-lezijskih fibroblasta od pacijenata sa sklerodermom

Kako bi se odredilo da li je niža razina mRNA osteoprotegerina utjecala na promjene u razini proteina osteoprotegerina, sadržaj OPG-a iz normalnih i lezijskih kožnih fibroblasta iz anatomski podudarne lokacije od pacijenata iste dobi i spola bio je određen pomoću hibridizacije Western Blot koristeći se protu-ljudskim monoklonskim protutijelom protiv osteoprotegerina. Rezultati su prikazani na Slici 4. Monomeri i dimeri osteoprotegrina mogli su se jasno detektirati u 3/4 normalnih fibroblasta, a slabo su bili eksprimirani u 1 normalnom uzorku. U abnormalnim fibroblastima vrpca monomera je bila slabo vidljiva u sva četiri testirana uzorka. Ekspresija rekombinantnog fuzijskog proteina OPG-Fc služila je kao pozitivna kontrola tijekom bojanja.

Primjer 3

Kloniranje ljudskog gena za OPG

Kako bi se karakterizirala aktivnost OPG-a u uvjetima in vitro i in vivo ukupna cDNA kodirajuća sekvenca bila je klonirana pomoću PCR-a s reverznom transkriptazom pomoću klica načinjenih na osnovu objavljene sekvence OPG-a, a koje su omeđivale predviđene kodone za start i stop. Analiza sekvence rezultirajućih klonova cDNA OPG-a (u pcDNA3.1) pokazala je 100% identičnost na razini nukleotida prema sekvenci OPG-a koja je bila objavljena od Morinaga i sur., (Morianga i sur., 1998), ali se razlikovala u jednoj amino kiselini od sekvence koja je bila objavljena od Simonet i sur. (1997) (vidi SEQ ID NO: 2 and 4).

Primjer 4

Učinak sinteze OPG kolagena tipa I u staničnoj liniji ljudskih kožnih fibroblasta

Fibroblasti kultivirani u prisutnosti L-askorbata luče kolagen u podlogu za kultiviranje koji se može detektirati testom ELISA. Ljudski fibroblasti pojačavaju sintezu kolagena kao odgovor na stimulaciju profibrotičkog citokina TGFβ1. Stoga smo testirali učinak rekombinantnog osteoprotegerina (osteoprotegerin-Fc fuzijski protein) na sintezu kolagena u fibroblastima AG1518C koja je inducirana pomoću TGFβ1. Osteoprotegerin dodan u kulture fibroblasta prije tretmana s TGFβ1 inhibirao je porast sinteze kolagena koja je bila rezultat prisutnosti TGFβ1 na način da je inhibicija ovisila o dozi osteoprotegerina (Slika 5). Kada je eksperiment bio izveden u prisutnosti neutralizirajućeg monoklonskog protutijela protiv OPG-a nije bilo učinka na sintezu kolagena. Slično, davanje samo protu-OPG protutijela u odsutnosti rekombinantnog OPG nije imalo učinka na sintezu kolagena što sugerira da je primijećeni pad razine sinteze kolagena bio specifični učinak OPG-a.

Sličan učinak na sintezu kolagena bio je primijećen nakon transfekcije primarnih ljudskih fibroblasta (OBHC) s plazmidom koji sadrži cijelu kodirajuću sekvencu OPG-a (pcDNA3.1/OPG). U stanicama OBHC transfektiranima s plazmidom OPG, nije bio primijećen porast sinteze kolagena kao reakcija na stimulaciju s TGFβ1 što je suprotno stanicama OBHC koje su bile tobože transfektirane (pcDNA3.1 prazan vektor) (Slika 6).

Primjer 5

Tretman s OPG-om značajno smanjuje bazalnu aktivnost alfa 2 promotora iz kolagena tipa I te njegovu aktivnost kada je stimuliran s TGFβ1 u fibroblastima mišjeg embrija

Kako bi se procijenilo da li je smanjenje sinteze kolagena pomoću OPG-a povezano s učinkom na aktivnost promotora kolagena istražili smo učinak tretmana s OPG-om u fibroblastima mišjeg embrija koji su bili transfektirani s plazmidom koji je sadržavao cDNA gena reportera, luciferazu, a koji je pod kontrolom α2 promotora iz kolagena tipa I u duljini od 3.5 kb. Stimulacija promotora kolagena u ovom konstruktu dovodi do aktivacije transkripcije gena luciferaze, a to se može mjeriti u prisutnosti supstrata luciferina iz krijesnica i to testom određivanja luminiscencije.

Tretman s OPG-om od 1 ng/ml do 100 ng/ml značajno je smanjio bazičnu razinu aktivnosti kolagenskog promotora (Slika 7A, kontrola). Nakon stimulacije s TGFβ1 aktivnost kolagenskog promotora porasla je za najmanje 2 puta (Slika 7A, TGFβ1). Ova aktivnost se značajno može smanjiti kada se stanice tretiraju s OPG-om koncentracije od 100 ng/ml (P< 0.05).

Biljni alkohol halofuginon poznat je kao specifični inhibitor sinteze kolagena tipa I (Granot i sur., 1993). Kada su fibroblasti bili tretirani s niskim koncentracijama halofuginona (10-10 M) primijetili smo smanjenje aktivnosti kolagenskog promotora koje je ovisilo o porastu koncentracije osteoprotegerina (od 1 ng/ml do 100 ng/ml) koje je bilo vrlo značajno kod najveće doze testiranog OPG-a (100 ng/ml, P< 0.01) (Slika 7A, HF). Halofuginon može inhibirati aktivnost kolagenskog promotora koji je bio induciran s TGFβ1 (McGaha i sur., 2002). OPG je također mogao potencirati učinke halofuginona pomoću inhibiranja povećane aktivnosti kolagenskog promotora koja je inducirana pomoću TGFβ1 i to na način koji je ovisan o dozi. Ovaj učinak je bio visoko signifikantan kod koncentracije od 100 ng/ml OPG-a (P< 0.01) kada je aktivnost kolagenskog promotora bila gotovo vraćena na bazalnu razinu (Figure 7, HF+TGFβ1).

Primjer 6

Transaktivacija čimbenika rasta vezivnog tkiva koja je potaknuta pomoću TGFβ može se negativno regulirati pomoću OPG-a

Čimbenik rasta vezivnog tkiva (CTGF), koji je protein od 38-kD bogat cisteinom, stimulira proizvodnju elemenata izvanstaničnoga matriksa u fibroblastima. Prekomjerna ekspresija CTGF-a bila je pronađena u mnogim fibrotičnim ljudskim tkivima, uključujući pluća, kožu, jetra, bubrege i krvne žile. In vitro, TGFb aktivira transkripciju gena CTGF u ljudskim plućnim fibroblastima. Promotor-reprter CTGF bio je konstruiran s alkalnom fosfatazom koja se luči (SEAP) kao gen reporter čija se ekspresija može mjeriti u kondicioniranoj podlozi umjesto u staničnom ekstraktu.

Stanice koje eksprimiraju gen reporter CTGF-SEAP bile su inkubirane s TGFβ te OPG-om u koncentraciji od 0.46, 1.4 ili 4.6 μg/ml. Rezultati ovoga eksperimenta prikazani su na Sl. 7B. Inkubacija s TGFβ koji je suprimiran s OPG-om inducira ekspresiju CTGF što dodatno potvrđuje protu-fibrotičku aktivnost OPG-a.

Primjer 7

Ekspresija mRNA OPG-a u fibroblastima tretiranim s halofuginonom iz pacijenata sa sklerodermom

Mehanizam po kojemu halofuginon negativno regulira (smanjuje) sintezu kolagena u fibroblastima nije potpuno razjašnjen. Mi smo stoga ispitali učinak halofuginona na ekspresiju mRNA OPG-a u sparenim lezijskim i ne-lezijskim fibroblastima iz pacijenata sa sklerozom pomoću reakcije PCR s reverznom transkriptazom.

Ekspresija mRNA OPG-a je vrlo povišena (najmanje 3 puta) i u lezijskim i u ne-lezijskim fibroblastima u svim testiranim uzorcima (3 normalna i 2 abnormalna) izmjerena 12 h nakon tretmana s 10–8 M halofuginona (Slika 8). Interesantno, u analizama gena na mikropločica s filterom OPG je bio jedan od gena s najpovišenijom ekspresijom nakon tretmana fibroblasta s halofuginonom (podaci nisu prikazani).

Primjer 8

Davanje OPG-a in vivo štiti miševe od plućne fibroze inducirane bleomicinom

Davanje jedne intra-trahealne injekcije bleomicina miševima C57BL/6 rezultira u brzu indukciju plućne fibroze unutar 14 dana, koja je karakterizirana povećanim skladištenjem kolagena unutar plućnog intersticija (Hattori i sur., 2000). Kako bi se odredilo da li davanje OPG-a može pokazivati bilo kakav zaštitan učinak protiv razvoja fibroze ili da li uistinu smanjuje jačinu bolesti, mi smo testirali učinak dnevne injekcije OPG-a u miševima tretiranim s bleomicinom.

Bleomicin je bio administriran pomoću jednog intra-trahealnog ulijevanja trima (3) skupinama od po 10 miševa. OPG je bio administriran pomoću subkutane injekcije počinjući dan nakon tretmana bleomicinom. Jedna skupina je primila visoku dozu (5 mg/kg) a druga skupina nižu dozu (0.5 mg/kg). Kontrolni miševi dnevno su subkutano primali slanu otopinu. Radi usporedbe, 4. skupina miševa bila je uključena u studiju bez da se tretira, a sadržavala je jedinke podudarne u dobi i spolu (naivni miševi).

Životinje tretirane s bleomicinom odmah su oboljeli. Ovo je rezultiralo brzim gubitkom tjelesne mase, a može dovesti i do smrti za razliku od netretiranih životinja koje su ostale zdrave i vesele pokazujući normalnu tjelesnu težinu (Slika 9A). Miševi koji su bili tretirani s niskom dozom OPG-a pokazivale su usporedivi gubitak tjelesne težine u usporedbi s kontrolnim životinjama. Također se smrtnost povećala i u ovoj skupini (Slika 9B). Miševi koji su dobili visoku dozu OPG-a osjećali su se puno bolje, s primijećenim padom tjelesne težine jedino u prvih 5 dana tretmana. Ovo se također odrazilo na nisku smrtnost (<10%) u ovoj skupini.

Svi preživjeli miševi bili su žrtvovani 12 dana nakon tretmana s bleomicinom. Histološka analiza pluća otkrila je da je u životinjama tretiranima s velikom dozom OPG-a postojao značajno manji plućni površinski areal koji je bio zahvaćen fibrozom uspoređeno s kontrolnim životinjama koji su imali fibrotičkih lezija koje su pokrivale otprilike 70% plućne površine (Sl. 10A). Miševi tretiranih s visokom dozom OPG-a također su pokazivali značajno manji sadržaj hidroksiprolina u plućima (P<0.05) uspoređeno s kontrolnim miševima, a usporedivo je i s onim što je bilo viđeno u netretiranim miševima (naivna skupina, Sl. 10 B). Smanjeni sadržaj hidroksiprolina bio je također primijećen u miševima koji su bili tretirani s manjom dozom OPG-a, premda ovo nije statistički značajno zbog broja preživjelih u ovoj skupini. Sadržaj hidroksiprolina je mjera odlaganja kolagena. Rezultati navode na to da tretman s OPG-a učinkovito vodi prema smanjenom odlaganju kolagena u plućima.

Reference

1. Abraham D., Lupoli S., McWhirter A., Plater-Zyberk C., Piela T.H., Korn J.H., Olsen I. i Black C. (1991) Expression and function of surface antigens on scleroderma fibroblasts. Arthritis Rheum. 34, 1164-1172.

2. Abraham DJ, Shiwen X, Black CM, Sa S, Xu Y, Leask A.J Biol Chem. 2000 May 19;275(20):15220-5.

3. Altschul S F i sur, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990

4. Altschul S F i sur, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997

5. Bancroft J.D. i Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques. Churchill Livingstone, England.

6. Black C.M i Denton C.P. (1998) Systemic sclerosis and related disorders. U “Oxford textbook of Rheumatology” (P.G. Maddison, D.A. Isenberg, P.Woo i D.N. Glass, Ur.) pp 771-789, Oxford Univ. Press, New York.

7. Clements P.J. i Furst D.E. (1996) “Systemic Sclerosis” Williama and Williams, Baltimore.

8. Devereux J i sur, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.

9. Engelmann, H., Novick, D., i Wallach, D., 1990, J.Biol.Chem. 265, 1531-1536.

10. Granot I, Halevy O, Hurwitz S, Pines M. (1993) Halofuginone: an inhibitor of collagen type I synthesis. Biochim Biophys Acta 1156, 107-112

11. Grantham (1974), Science, 185. 862-864.

12. Hattori N., Degen J.L., Sisson T.H., Liu H., Moore B.B., Pandrangi R.G., Simon R.H. i Drew A.F. (2000) Bleomycin induced pulmonary fibrosis in fibrinogen null mice. J. Clin. Invest. 106, 1341-135

13. Kostenuik PJ, Shalhoub V.Curr Pharm Des 2001 May;7(8):613-35

14. Krein, PM, Huang Y i Winston BW (2001). Expert Opin. Ther. Patents 11(7): 1065-1079.

15. Leighton, C. Drugs 2001 61(3), 419-427.

16. LeRoy E.C. (1974) Increased collagen synthesis by scleroderma skin fibroblasts in vitro. J. Clin. Invest. 54, 880-889.

17. Martini, Maccario, Ravelli i sur., Arthritis Rheum. 1999, 42, 807-811.

18. McGaha TL, Phelps RG, Spiera H, Bona C. (2002) Halofuginone, an Inhibitor of Type-I Collagen Synthesis and Skin Sclerosis, Blocks Transforming-Growth-Factor-beta-Mediated Smad3 Activation in Fibroblasts. J Invest Dermatol. 118,461-70.

19. Min H., Morony S., Sarosi I., Dunstan C.R., Capparelli C. i sur (2000) Osteoprotegerin reverses osteoporosis by inhibiting endosteal osteoclasts and prevents vascular calcification by blocking a process resembling osteoclastogenesis. J.Exp. Med. 192, 463-474.

20. Morinaga T., Nagakawa N., Yasuda H., Tsuda E. i Higashi K. (1998) Cloning and characterization of the gene encoding human osteoprotegerin/ osteoclastogenesis inhibitory factor. Eur. J. Biochem. 254, 685-691.

21. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990

22. Pearson W R i Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448,1988

23. Silman A.J. (1991) Moratlity from scleroderma in England and Wales 1968-1975. Ann. Rheu. Dis. 50, 95-96.

24. Simonet W.S., Lacey D.:., Dunstan C.R., Kelley M., i sur. (1997) Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone densit y. Cell 89, 309-319.

25. Shi-wen X., Denton C.P., McWhirter A., Bou-Gharios G., Abraham D.J., du Bois R.M. i Black C.M. (1997) Scleroderma lung fibroblasts exhibit elevated and dysregulated collagen type I biosynthesis. Arthritis Rheum. 40, 1237-1244.

26. Shi-Wen X, Denton CP, McWhirter A, Bou-Gharios G, Abraham DJ, du Bois RM, Black CM. (1997) Scleroderma lung fibroblasts exhibit elevated and dysregulated type I collagen biosynthesis. Arthritis Rheum. 40, 1237-1244

27. Smith i Waterman J Mol Biol, 147,195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981.

28. Smith R.E., Strieter R.M., Phan S.H., Lukacs N.W., Huffnagle G.B., Wilke C.A., Burdick M.D., Lincoln P., Evanoff H. i Kunkel S.L. (1994) Production and function of murine macrophage inflammatory protein-1α in bleomycin induced lung injury. J. Immunol. 153, 4704.

29. Smith, Textbook of the Autoimmune Diseases, Edited by Lahita, Chiorazzi and Reeves, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia 2000.

30. Strehlow D. i Korn J (1998) Biology of the scleroderma fibroblast. Curr. Opin. Rheumatol. 10, 572-578.

31. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., and Zubler, R.H., 1992, J.Immunol. 148, 2778-2784.

32. Von Heijne G. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 4683-4690.

33. Wigley F. M. i Sule S. D. (2001) Expert Opinions on Investigational Drugs 10(1) 31-48.

34. Wigley F.M. i Boling C.L. (2000) The treatment of scleroderma. 2, 276-292.

35. Wilm M., Shevchenko A., Houthaeve T., Breit S., Schweigerer L., Fotsis T. i Mann M. (1996) Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano- electrospray mass spectrometry. Nature, 379:466-469

36. Yasuda H., Shima N., Nagakawa N., Mochizuki S., Yano K. i sur (1998) Identity of osteoclastogenesisis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro. Endocrinology 139, 1329-1337.

IZLISTAVANJE SEKVENCE

<110> Applied Research Systems ARS Holding N.V.

<120> Uporaba osteoprotegerina za liječenje i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti

<130> WO 550

<150> EP02100364.5

<151> 2002-04-10

<160> 12

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1681

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ctggagacat ataacttgaa cacttggccc tgatggggaa gcagctctgc agggactttt 60

tcagccatct gtaaacaatt tcagtggcaa cccgcgaact gtaatccatg aatgggacca 120

cactttacaa gtcatcaagt ctaacttcta gaccagggaa ttaatggggg agacagcgaa 180

ccctagagca aagtgccaaa cttctgtcga tagcttgagg ctagtggaaa gacctcgagg 240

aggctactcc agaagttcag cgcgtaggaa gctccgatac caatagccct ttgatgatgg 300

tggggttggt gaagggaaca gtgctccgca aggttatccc tgccccaggc agtccaattt 360

tcactctgca gattctctct ggctctaact accccagata acaaggagtg aatgcagaat 420

agcacgggct ttagggccaa tcagacatta gttagaaaaa ttcctactac atggtttatg 480

taaacttgaa gatgaatgat tgcgaactcc ccgaaaaggg ctcagacaat gccatgcata 540

aagaggggcc ctgtaatttg aggtttcaga acccgaagtg aaggggtcag gcagccgggt 600

acggcggaaa ctcacagctt tcgcccagcg agaggacaaa ggtctgggac acactccaac 660

tgcgtccgga tcttggctgg atcggactct cagggtggag gagacacaag cacagcagct 720

gcccagcgtg tgcccagccc tcccaccgct ggtcccggct gccaggaggc tggccgctgg 780

cgggaagggg ccgggaaacc tcagagcccc gcggagacag cagccgcctt gttcctcagc 840

ccggtggctt ttttttcccc tgctctccca ggggacagac accaccgccc cacccctcac 900

gccccacctc cctgggggat cctttccgcc ccagccctga aagcgttaat cctggagctt 960

tctgcacacc ccccgaccgc tcccgcccaa gcttcctaaa aaagaaaggt gcaaagtttg 1020

gtccaggata gaaaaatgac tgatcaaagg caggcgatac ttcctgttgc cgggacgcta 1080

tatataacgt gatgagcgca cgggctgcgg agacgcaccg gagcgctcgc ccagccgccg 1140

cctccaagcc cctgaggttt ccggggacca caatgaacaa gttgctgtgc tgcgcgctcg 1200

tggtaagtcc ctgggccagc cgacgggtgc ccggcgcctg gggaggctgc tgccacctgg 1260

tctcccaacc tcccagcgga ccggcgggga gaaggctcca ctcgctccct cccaggagag 1320

gcttggggtt aggctggagc aggaaaccgc tttcaagtta tgccatgctt cccctagggt 1380

gtccttttac gctgcaaagt tcctgctgac tttatggaag acagcaagag agagacagac 1440

agcgagagag agggagagag agagagagag aaacttgttt gaaagtttta gtcattaacc 1500

ttctgtcttc atctcagaat attaacgccc tcatgtagtc catactatct ttgcttaatg 1560

aacttgaact tttattatta gtggcaaaga agtggtccct tagattcaga gtaagttgga 1620

agaagacgtt agtcttctta aaaccattat aattagaata tgacatgata gatttttcta 1680

a 1681

<210> 2

<211> 401

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile

1 5 10 15

Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp

20 25 30

Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr

35 40 45

Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro

50 55 60

Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys

65 70 75 80

Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu

85 90 95

Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr

100 105 110

Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe

115 120 125

Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg

130 135 140

Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys

145 150 155 160

Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys

165 170 175

Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr

180 185 190

Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg

195 200 205

Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val

210 215 220

Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile

225 230 235 240

Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu

245 250 255

Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln

260 265 270

Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala

275 280 285

Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly

290 295 300

Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys

305 310 315 320

Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn

325 330 335

Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser

340 345 350

Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr

355 360 365

Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu

370 375 380

Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys

385 390 395 400

Leu

<210> 3

<211> 1356

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gtatatataa cgtgatgagc gtacgggtgc ggagacgcac cggagcgctc gcccagccgc 60

cgyctccaag cccctgaggt ttccggggac cacaatgaac aagttgctgt gctgcgcgct 120

cgtgtttctg gacatctcca ttaagtggac cacccaggaa acgtttcctc caaagtacct 180

tcattatgac gaagaaacct ctcatcagct gttgtgtgac aaatgtcctc ctggtaccta 240

cctaaaacaa cactgtacag caaagtggaa gaccgtgtgc gccccttgcc ctgaccacta 300

ctacacagac agctggcaca ccagtgacga gtgtctatac tgcagccccg tgtgcaagga 360

gctgcagtac gtcaagcagg agtgcaatcg cacccacaac cgcgtgtgcg aatgcaagga 420

agggcgctac cttgagatag agttctgctt gaaacatagg agctgccctc ctggatttgg 480

agtggtgcaa gctggaaccc cagagcgaaa tacagtttgc aaaagatgtc cagatgggtt 540

cttctcaaat gagacgtcat ctaaagcacc ctgtagaaaa cacacaaatt gcagtgtctt 600

tggtctcctg ctaactcaga aaggaaatgc aacacacgac aacatatgtt ccggaaacag 660

tgaatcaact caaaaatgtg gaatagatgt taccctgtgt gaggaggcat tcttcaggtt 720

tgctgttcct acaaagttta cgcctaactg gcttagtgtc ttggtagaca atttgcctgg 780

caccaaagta aacgcagaga gtgtagagag gataaaacgg caacacagct cacaagaaca 840

gactttccag ctgctgaagt tatggaaaca tcaaaacaaa gcccaagata tagtcaagaa 900

gatcatccaa gatattgacc tctgtgaaaa cagcgtgcag cggcacattg gacatgctaa 960

cctcaccttc gagcagcttc gtagcttgat ggaaagctta ccgggaaaga aagtgggagc 1020

agaagacatt gaaaaaacaa taaaggcatg caaacccagt gaccagatcc tgaagctgct 1080

cagtttgtgg cgaataaaaa atggcgacca agacaccttg aagggcctaa tgcacgcact 1140

aaagcactca aagacgtacc actttcccaa aactgtcact cagagtctaa agaagaccat 1200

caggttcctt cacagcttca caatgtacaa attgtatcag aagttatttt tagaaatgat 1260

aggtaaccag gtccaatcag taaaaataag ctgcttataa ctggaaatgg ccattgagct 1320

gtttcctcac aattggcgag atcccatgga tgataa 1356

<210> 4

<211> 401

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile

1 5 10 15

Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp

20 25 30

Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr

35 40 45

Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro

50 55 60

Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys

65 70 75 80

Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu

85 90 95

Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr

100 105 110

Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe

115 120 125

Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg

130 135 140

Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys

145 150 155 160

Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys

165 170 175

Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr

180 185 190

Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg

195 200 205

Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val

210 215 220

Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile

225 230 235 240

Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu

245 250 255

Trp Lys His Gln Asn Lys Ala Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln

260 265 270

Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala

275 280 285

Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly

290 295 300

Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys

305 310 315 320

Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn

325 330 335

Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser

340 345 350

Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr

355 360 365

Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu

370 375 380

Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys

385 390 395 400

Leu

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 5

ctgcgcgctc gtgtttct 18

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 6

aatgaaggta ctttggagga aacg 24

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 7

cgggatccgc caccatgaac aagttgctgt gct 33

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 8

aagctcgagt tataagcagc ttatttt 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 9

atctcgaggg ccactcgtcc cttgtcc 27

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 10

ataagcttgg agtcgcactg gctgtctcc 29

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 11

acgcctaact ggcttagtgt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 12

ctgattggac ctggttacct 20

Claims (25)

1. Uporaba tvari za proizvodnju lijeka za tretman i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti, naznačena time, da je spomenuta tvar izabrana iz skupine koja je sastoji od: a) Polipeptida koji obuhvaća SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; b) Polipeptida koji obuhvaća amino kiseline 22 do 401 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; c) Polipeptida koji obuhvaća jednu, dvije, tri ili četiri domene osteoprotegerina koje su bogate cisteinom; d) Polipeptida koji obuhvaća amino kiseline 22 do 194 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; e) Muteina polipeptida iz bilo koje točke od (a) do (d), gdje sekvenca amino kiselina ima najmanje 40 % ili 50 % ili 60 % ili 70 % ili 80 % ili 90 % identičnosti s najmanje jednom od sekvenci iz dokumenata u (a) do (d); f) Muteina polipeptida iz bilo koje točke od (a) do (d) koji je kodiran sekvencom DNA koja hibridizira s komplementarnom sekvencom DNA koja kodira bilo koji polipeptid iz dokumenata u (a) do (d) i to u blago striktnim uvjetima ili u visoko striktnim uvjetima; g) Muteina polipeptida iz bilo koje točke od (a) do (d) gdje bilo koja promjena u sekvenci amino kiselina je konzervativna supstitucija amino kiselina prema sekvencama amino kiselina u polipeptidima iz dokumenata od (a) do (d); h) Soli ili izooblika, fuzijskog proteina, funkcionalnog derivata, aktivne frakcije ili cirkularno permutiranog derivata bilo kojeg polipeptida iz dokumenata od (a) do (g).

2. Uporaba prema zahtjevu 1, naznačena time, da je fibrotička bolest zapravo bolest vezivnog tkiva.

3. Uporaba prema zahtjevima 1 ili 2, naznačena time, da je fibrotička bolest skleroderma.

4. Uporaba prema bilo kojemu od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da je tvar monomer ili dimer.

5. Uporaba prema bilo kojemu od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da je tvar glikolozirana na jednom ili više mjesta.

6. Uporaba prema bilo kojemu od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da fuzijski protein obuhvaća fuziju s imunoglobulinom (Ig).

7. Uporaba prema zahtjevu 6, naznačena time, da je Ig fuzija zapravo Fc fuzija.

8. Uporaba prema bilo kojemu od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da funkcionalni derivat sadrži najmanje jedan ostatak na jednoj ili više funkcionalnih skupina koje se javljaju kao bočni lanci na amino kiselinskim ostacima.

9. Uporaba prema zahtjevu 8, naznačena time, da je ostatak jedan polietilenski ostatak.

10. Uporaba molekule nukleinske kiseline za proizvodnju lijeka za tretman i/ili prevenciju fibrotičke bolesti, naznačena time, da molekula nukleinske kiseline ima sekvencu nukleotida koja kodira polipeptid koji ima sekvencu amino kiselina koja je izabrana iz skupine koja se sastoji od: a) Polipeptida koji obuhvaća SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; b) Polipeptida koji obuhvaća amino kiseline 22 do 401 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; c) Polipeptida koji obuhvaća jednu, dvije, tri ili četiri domene osteoprotegerina bogate cisteinom; d) Polipeptida koji obuhvaća amino kiseline 22 do 194 iz SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4; e) Muteina od bilo kojeg polipeptida iz sekvenci od (a) do (d), gdje sekvenca amino kiselina ima najmanje 40 % ili 50 % ili 60 % ili 70 % ili 80 % ili 90 % identičnosti s najmanje jednom od sekvenci u (a) do (d); f) Muteina od bilo kojeg polipeptida iz sekvenci od (a) do (d) koji je kodiran sekvencom DNA koja hibridizira s komplementarnom nativnom sekvencom DNA koja kodira bilo koji od polipeptida u (a) do (d) u uvjetima blago striktnim ili u uvjetima visoko striktnim; g) Muteina od bilo kojeg polipeptida iz sekvenci od (a) do (d) gdje bilo koja promjena u sekvenci amino kiselina je konzervativna supstitucija amino kiselina s amino kiselinama iz sekvenci u (a) do (d); h) Izooblika, fuzijskog proteina ili aktivne frakcije bilo kojeg od polipeptida u (a) do (g).

11. Uporaba prema zahtjevu 10, naznačena time, da je fibrotička bolest zapravo bolest vezivnog tkiva.

12. Uporaba prema zahtjevu 10 ili 11, naznačena time, da je fibrotička bolest skleroderma.

13. Uporaba prema bilo kojemu od zahtjeva od 10 do 12, naznačena time, da molekula nukleinske kiseline obuhvaća sekvencu ekspresijskog vektora.

14. Uporaba prema zahtjevu 13, naznačena time, da je sekvenca vektora zapravo sekvenca vektora za gensku terapiju.

15. Uporaba vektora, naznačena time, da se uporabljuje za induciranje i/ili pojačavanje endogene produkcije polipeptida prema zahtjevu 1 u stanici za pripremanje lijeka za tretman i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti, posebice skleroderme.

16. Uporaba stanice koja sadrži molekulu nukleinske kiseline prema bilo kojeg od zahtjeva od 10 do 15, naznačena time, da se uporabljuje za priređivanje lijeka za tretman i/ili prevenciju fibrotičkih bolesti, posebice skleroderme.

17. Uporaba stanice koja eksprimira tvar prema zahtjeva od 1 do 9, naznačena time, da se uporabljuje za proizvodnju lijeka za tretman i/ili prevenciju fibrotičke bolesti, posebice skleroderme.

18. Uporaba stanice koja je genetički promijenjena tako da proizvodi polipeptid prema zahtjevu 1 do 9, naznačena time, da se koristi za proizvodnju lijeka za tretman i/ili prevencije fibrotičke bolesti, posebice skleroderme.

19. Uporaba prema bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da lijek nadalje sadrži interferon za simultanu, uzastopnu ili zasebnu uporabu.

20. Uporaba prema zahtjevu 19, naznačena time, da je interferon zapravo interferon-β.

21. Uporaba prema bilo kojemu od prethodnih zahtjeva, naznačena time, da lijek nadalje sadrži antagonist čimbenika nekroze tumora (TNF) za simultanu, uzastopnu ili zasebnu uporabu.

22. Uporaba prema zahtjevu 21, naznačena time, da je antagonist TNF-a TBPI i/ili TBPII.

23. Uporaba prema bilo kojemu od prethodnih zahtjeva, naznačenu time, da lijek nadalje sadrži agens protiv skleroderme za simultanu, uzastopnu ili zasebnu uporabu.

24. Uporaba prema zahtjevu 25, naznačena time, da je agens protiv skleroderme izabran iz skupine koja obuhvaća halofuginon, inhibitore ACE, blokatore kalcijevih kanala, inhibitore protonskih pumpi, NSAID, inhibitore COX, kortikosteroide, tetraciklin, pentoksifilin, bucilamin, inhibitore geranilgeranil transferaze, roterlin, inhibitore prolil-4-hidroksilaze, inhibitore c-proteinaze, inhibitore lizil-oksidaze, relaksin, halofuginon, prostaglandine, prostacikline, endotelin-1, dušićni oksid, inhibitore angiotenzina II, antioksidanse ili SARP-1.

25. Metoda za tretman i/ili prevenciju fibrotičke bolesti, posebice skleroderme, naznačena time, da podrazumijeva davanje pacijentu kojemu treba učinkovitu količinu tvari prema bilo kojemu od zahtjeva od 1 do 24 po potrebi skupa s farmaceutski prihvatljivim nosačem.