JP3693671B2 - ポリペプチドのｐｅｇ化 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、メトキシポリエチレングリコールのような長鎖のポリマーに共有結合したポリペプチドに関する。本発明は、種々の生物学的に重要なポリペプチドと、活性化されたポリマー分子との反応に関する方法と試薬も記述する。
本発明の背景
ヒト及び動物の資源から同定され、単離された多くの蛋白質は、有望な医薬的、または治療的潜在性を示すことが見出されている。このような蛋白質を、比較的純粋な形で、そして比較的多量に生産する方法に加えて、このような蛋白質を同定し、特徴づけるための方法に大幅な進歩がみられた。開発の過程は、このような潜在的に価値ある物質の利用と関連して進歩するにつれて、臨床的モデルにおいて使用するために、これらの化合物を製剤化する上で多くの障害が生じている。
例えば、多くのこのような蛋白質は、血清中において半減期が極めて短いことが見出されている。その大部分について、蛋白質は、腎臓を通って血清からクリアーされる。比較的多量の蛋白質、特にヒトのシステムに対して、外来の蛋白質の体系的導入により、他の問題の外に、免疫複合体による蛋白質の体内からの急速な除去につながると思われる免疫反応を生じ得る。他の蛋白質については、溶解性と凝集の問題も該蛋白質の最適製剤化を妨げている。
これらの問題に取組む最も有望な技術の１つは、１つ以上の不活性ポリマー鎖を問題となっているポリペプチド類に共有結合させることであった。最も普通に使用されるポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または、モノメトキシルポリエチレングリコール（ｍＰＧＥ）である。例えば、Davisら,Biomedical polymers：Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use，４４１−４５１頁（１９８０）を参照。ＰＥＧは、その無毒性が証明されているために、これらの目的には理想的である。他の研究者は、同様な目的のために、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）を利用している。Knaufら、J.of Biolog.Chem. vol. ２６３，１５０６４頁（１９８８）を参照。
ポリエチレングリコールで蛋白質を共役結合によって修飾（“ＰＥＧ化”）したため、該蛋白質に対して望ましい特性が付加された数多くの結果が記載されている。例えば、ＩＬ−２のＰＥＧ化は、そのサイトカインの活性に有意に影響することなく、ＩＬ−２のクリアランスを減少させることが示されている。クリアランスの減少は、ＰＥＧと結合していない物質よりも効率が増加することにつながる。Katreら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol. ８４，１４８７頁（１９８７）。
スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）の血清中の半減期を増加させることは、種々の症状を治療するためのＳＯＤの使用にとって決定的な障壁となっている。ＳＯＤのＰＥＧ化がクリアランス速度の減少を生ずることが、多くの研究によって示されている。例えば、Confortiら、Pharm. Research Commun. vol. １９，２８７頁（１９８７）参照。
イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の凝集は、静脈内にＩｇＧが投与される患者に対する深刻な副作用につながる要因として仮定されている。ＩｇＧのＰＥＧ化によって蛋白質の凝集が減少し、この問題を妨げることが示された。Suzukiら、Biochem. Biophys. Acta vol. ７８８，２４８頁（１９８４）。
ＰＥＧ化の技術によって、蛋白質の免疫原性に影響することができることも示された。Abuchouskiと共同研究者が、ＰＥＧ化ウシ肝臓カタラーゼの免疫性と循環ライフを研究している。Abuchowskiら、J. Biol. Chem. vol. ２５２，３５８２頁（１９７７）。
これら、種々の蛋白質にＰＥＧ基を付加すると、ＰＥＧ化蛋白質の分子量の大きさが増加するため、クリアランスが減少する。ある大きさまでは、蛋白質の糸球体濾過速度は、蛋白質の大きさに逆比例している。したがって、ＰＥＧ化のクリアランスを減少する能力は、蛋白質にいくつのＰＥＧ基がついているかの関数ではなく、変化した蛋白質の全体の分子量の関数である。このことは、ＰＥＧ側鎖の大きさによってもＩＬ−２に結合したＰＥＧの数によっても、変動したクリアランスの検討によって支持されている。Katre,上記。
クリアランス、免疫原性、凝集及び物理的性質に関連したＰＥＧ化蛋白質の種々の研究によって、すべて、ＰＥＧが該蛋白質の周りにフレキシブルで親水性の殻を形成していることが示唆されている。ＰＥＧ鎖は、高度に加水されており、ＰＥＧ化蛋白質に予測されるであろうよりも高い見かけ上の分子量を与え、蛋白質上の荷電を遮蔽するように作用する。
この分野においてみられた多くの有望な結果のために、ＰＥＧユニットのポリペプチドへの結合のための手順の便覧が開発されている。これらの手順における鍵となる要素は、ポリエチレングリコールの末端−ＯＨ基の“活性化”である。このような活性化が、ＰＥＧ基とポリペプチドとの間に結合を創製する上で必要である。結合手順の大多数は、ポリペプチドの遊離の一級アミノ基と反応させるため、ＰＥＧ部分を活性化する。これらの遊離アミンの大部分は、リジンアミノ酸残基中に見出される。
一般的実行においては、複数のＰＥＧ部分が蛋白質につなげられる。例えば、Davisらの米国特許第Ｎｏ．４，１７９，３３７において、免疫原性を抑制するためには、ポリペプチドのモルあたり１５と５０モルの間のポリマーを使用することが望ましいことが見出された。
複数ＰＥＧ鎖が、一般的に各ポリペプチドに結合され、各蛋白質には、典型的には多数のリジン残基が存在するために、均質性の反応成績物を生じさせるために、蛋白質をＰＥＧ化する努力は殆ど払われていない。Goodsonら、Biotechnology, vol. ８，３４３頁（１９９０）；Shawの米国特許Ｎｏ．４，９０４，５８４参照。この反応の特異性の欠除によって、無数の複雑性が生ずる。これらの中には、ＰＥＧ化の結果、しばしば蛋白質の重大な活性の喪失を生ずることが挙げられる。決定的に重要なリジン酸基への結合が、おそらく蛋白質の活性部位を変化させ、それを不活性化するのであろう。
ＰＥＧ化が立体的に障害された活性部位に導くことができることが、少なくとも１つの系において示されている。言い換えれば、比較的小さい基質は蛋白質に近づくことができると思われるが、より大きな基質と反応する蛋白質の活性は、ランダムＰＥＧ化によって劇的に影響されることができる。Davisら、上記。このような蛋白質の部位選択的にＰＥＧ化により、活性の喪失なしにＰＥＧ化の望ましい特性を獲得する修飾された物質につながることが可能であろう。その上、もしＰＥＧ化蛋白質の治療的使用が意図されるならば、非特異的ＰＥＧ化から生ずる複数の分子種の混合物は再現性があり、特徴付けができる特性を有する生成物を調整する上での困難につながる。このことによって、治療剤を評価し、有効性と投与情報を確立することは極度に困難になる。
ある場合においては、２つ以上の生物学的ペプチド、または薬物を含む複合多量体の投与が、相乗効果の利点につながることがあり得る。例えば、２つの同一の結合ポリペプチドを含む複合体は、それが単量体ポリペプチドに比較して、それが結合するリガンド、または活性部位への親和性が少なからず増強されることがある。この理由から、蛋白質の複合多量体は、複合体の分子量を増加する外に該蛋白質の親和性を増加するために望ましいことがあり得る。
蛋白質は、それらの生物学的効果を、他の蛋白質との相互作用を通して達成することが多い。２つの蛋白質の単純な複合体が、生物学的効果を達成するのに十分である場合には、外因性蛋白質を投与することによって、内因性蛋白質の生物学的効果を模倣することが可能であることが証明された。しかし、生物学的効果が、３つ以上の蛋白質を含む複合体の集合を必要とする場合では、より高次の複合体は不安定なことが多いので、遺伝子組換えの技術によって生産された外因性等価物で、内因性蛋白質の機能を模倣することはもっと困難である。このような場合には、生物学的に活性な複合体を模倣するために、複合体の２つの成分を含む架橋分子種を使用することが有益なことがある。
本明細において記述された発明に続いて、少くとも３つの研究グループが、架橋結合を有する蛋白質の産生を記述した。その蛋白質では、ＴＮＦ受容体の１つの細胞外部分が、ヒトまたはマウスのＩｇＧの重鎖に結合されている。それは、次に、ジスルフィド結合を通じて架橋される。Peppelら、J. Exp. Med. vol. １７４，１４８３頁（１９９１）；Ashkenaziら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. ８８，１０５３５頁（１９９１）；及びLoetscherら、J. Biol. Chem. vol. ２６６，１８３２４頁（１９９１）。各々の場合において、蛋白質は、動物細胞の発現システムにおいて発現された。そして、ＴＮＦを阻害することにおいて、単量体の可溶性受容体単独よりも少なからずより効果があった。同様な手順が、ＣＤ４蛋白質，（Ｂｙｒｎら、Nature（London）vol. ３４４，６６７頁（１９９０））ＣＲ１蛋白質、（Kalliら、J.Exp. Med. vol. １７４，１４５１頁（１９９１）；Hebellら、ＷＯ ９１／１６４３７（１９９１））及びＣＲ２蛋白質。（Hebellら、Science, vol. ２５４，１０２頁（１９９１））の同様な架橋蛋白質を産生するためにも使用された。
−−２のポリペプチド単位とＩｇＧ抗体の一部から構築された−−これらの架橋蛋白質は、治療剤として有望であることが示された。架橋結合した蛋白質は、分子量が増加しており、それは、それらの蛋白質のリガンドへの親和性を明らかに増強することの外に、身体からの複合体のクリアランス速度を減少するように働く。しかし、このやり方で架橋結合した蛋白質は、これまで融合遺伝子の発現によって、動物細胞の発現系による発現によってのみ調製された。これは、発現後、該蛋白質のＩｇＧ部分が適切に折りたためられるためには必要であった。その上、ポリペプチド単位の間のスペーサー、またはリンカーとして作用するＩｇＧ抗体の同定された重鎖の部分は、該スペーサーの長さ、大きさ、または幾何学を変化する能力を許容しない。二重体蛋白質によって達成される明らかな相乗作用を考慮すると、ポリペプチドの空間的方向性を変化させることによって相乗効果的利益が最適化されることはありそうである。そして最後に、該架橋結合蛋白質は、抗原性があることがあり、そして／または、溶解性が減少している。抗体の重鎖は、生物学的に不活性ではない。
他の二重性、または“二価性”の複合体が記載されている。二重体化合物のこのようなグループ標識されたヒルログであった。これらの化合物は、短かいポリグリシンスペーサー、またはリンカーによって結合されている極めて短かいポリペプチドから成っている。ポリペプチド単位の１つは、トロンビン阻害剤であり−−６５アミノ酸からなる蛋白質であるヒルジンから取った５つのアミノ酸配列−−そして、他のポリペプチドは、陰イオン結合エキソサイト（ＡＢＥ）認識の阻害剤である。Margnoreら、Biochemistry, vol. ２９，７０８５頁、（１９９０）；Bourdonら、ＦＥＢＳ vol. ２９４，１６３頁（１９９１）。
Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）は、五つの同一の２３ＫＤａのサブユニットからなった急性期の血清蛋白質である。ＣＲＰは、沈澱および凝集の反応を誘発し、古典的な補体の経路を活性化合物するためのＣｌｇと反応することもできる。架橋結合したＣＲＰのオリゴマーが、ビス（スルホサクシニミジル）ズベレート、または３，３′−ジチオ（スルホサクシニミジルプロピオネート）を架橋結合剤として使用し、生成された。Jiangら、Immunology vol. ７４，７２５頁（１９９１）。
オポイド受容体を標的とする二量体、または二価のリガンドの生成も検討された。非ペプチド性のβ−ナルトレキサミン、またはオキシモルファミンファルマコフォアは、短かいエチレンオキサイド、またはグリシンスペーサーによって結合された。Erezら、J. Med. Chem. vol. ２５，８４７頁（１９８２）；Portogheseら、J. Med. Chen. vol. ２９，１８５５頁（１９８６）。短かいメチレン架橋結合されたテトラペプチドエンケファリンもオポイドを標的としてデザインされ、元のデルターリガンドよりもデルター受容体に対してより大きな選択性と親和性を有することが示された。Shimohigashiら、Nature vol. １９７，３３３頁（１９８２）。
細胞表面の糖蛋白であるＣＤ４も、糖をベースとした架橋政策によって、多量体の形で産生された。利用された架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン（ＢＨＭ）であった。Chenら、J. Biol. Chm. vol. ２６６，１８２３７頁（１９９１）。
リンパ球機能関連アンチゲン−３（ＬＦＡ−３）は、Ｔリンパ球ＣＤ２に対するリガンドである広く分布している細胞表面の糖蛋白である。ＬＦＡ−３は、その随伴リピッドとともに、８つの単量体の蛋白質ミセルを形成し、それは、細胞表面上のＣＤ２をもつ細胞と結合する能力が増加した。Dustinら、J. Exp. Med., vol. １６９，５０３頁（１９８９）。
幾分関係のある技術において、１つのグループが、ペンタペプチジル単位の反復からなる合成ポリペプチドの阻害効果を検討した。本ポリマーは、ジフェニルホスフォリルアシドでの重合手順によって、約１０，０００ドルトンの大きさへと合成された。重合したペンタペプチドは、いくつかの生物学的応答の必須の構造の１つである。Morataら、Inst. J.Biol. Macromol. vol. １１，９７頁（１９８９）。
内因物質を増強するか拮抗するために効果的な蛋白質を開発する上でのさらなる障害物は、外因性蛋白質は適切な場所に局在させるのではなく、体系的に投与しなければならないということである。これは、低い有効性と副作用の増加へとつながり得る。いくつかのグループは、生物活性蛋白質を、これらの部位に自然に帰ってくる他の蛋白質に結合させることによって、適切な標的部位に配送することを報告している。このような結合は、活性及び標的蛋白質間の遺伝子融合を通じて作られることが多い。
ポリエチレングリコールスペーサー、またはリンカー単位が、本発明の日付けの後に、抗体を標的とした超抗原を創製するのに用いられた。結腸の癌腫細胞に対して反応性の抗体が、細菌の超抗原ブドウ球菌のエンテロトキシンにつなげられた。他の二価性の複合体と関連した利益を活用する（例えば、より高い分子量；二価性の相乗効果）ようにデザインされたのではなく、これらの複合体は超抗原を特定の部位に配達するようにデザインされる。これらの標的に運ばれる超抗原を形成するために記述されたＰＥＧ化の手順は、物質の大きな混合物を含む複合体を創製する。抗体と超抗原との結合は、Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネートと、２４−原子の長さのＰＥＧに基づいた親水性スペースによって成就された。この手順によれば、７から１８のスペーサーが、各抗体の単位につなげられ、超抗原の各々の上の一つか二つのリジンが反応させられた。Dohlstenら、Proc. Natl. Acad. Sci USA vol. ８８，９２８７頁（１９９１年１０月）。この手順を使用すると、成績物、または手順を最適にするために、単一の分子種を単離することは不可能であろう。
広い範囲の医学的適応性に対して有意な適用を有する２つのグループの蛋白様物質には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤とインターロイキン−１受容体のアンタゴニスト（Ｉｌ−１ｒａ）がある。これらの物質は、それぞれ、ＴＮＦ及びＩＬ−１媒介疾患の治療において有益な効果があることが示された。それぞれ、ＴＮＦによって媒介されているか、ＩＬ−１によって媒介されているかのいずれかとして確認された適応症のなかには、成人呼吸窮迫症候群、肺線維症、慢性リュウマチ、炎症性腸疾患、及び細菌性ショックがある。
特に参照によってここに組込まれた１９９０年７月１９日に出願された同時係属米国特許出願Ｎｏ．５５５，２７４には、天然に存在する一群の蛋白様ＴＮＦ阻害剤、及び高い純度をもった同じものを、少なからぬ量だけ製造する方法が記述されている。特に、上に述べた出願には、３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤と、４０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤と呼ばれるＴＮＦ阻害剤の２つのサブセットが詳述されている。全長の４０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤の外に、４０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤の２つの、先端が切られた、けれどもなお活性を有する形も産生された。全長の蛋白質から５１番目と５３番目のカルボキシ末端アミノ酸が除去されているこれらの蛋白質は：それぞれ４０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤△５１と４０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤△５３と呼ばれる。
特に参照によって組み込まれている１９９０年４月６日に出願された同時系属米国特許出願Ｎｏ．０７／５０６，５２２には、好ましいクラスの天然に存在する蛋白様Ｉｌ−１阻害剤と、高純度の同じものの少なからぬ量を製造する方法が記載されている。特に該出願は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト
（ＩＬ−１ｒａ’ｓ）すなわち、ＩＬ−１ｒａα、ＩＬ−１ｒａβ、及びＩＬ−１ｒａｘである３つのこのようなインターロイキン−１の阻害剤が、詳細に記述されている。
様々な医学的適応症の治療に潜在的に有用であるさらなる２つのクラスの物質は、インターロイキン−２阻害剤と補体の阻害剤である。インターロイキン−２の潜在的に有力な阻害剤には、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−２受容体の細胞外部分、インターロイキン−２受容体アンタゴニスト、インターロイキン−２を認識する抗体、およびＩＬ−２結合機能を含むこのような種のいずれかの断片が含まれる。補体系の潜在能力のある阻害剤には、受容体ＣＲ１、ＣＲ１の細胞外部分、及び補体結合機能を含むＣＲ１の断片がある。
インターロイキン−２受容体は記載され、その単離法は、Urdalらの米国特許Ｎｏ．４，５７８，３３５、及びHonjoらの米国特許Ｎｏ．４，８１６，５６５において開示されている。インターロイキン−２受容体をコードしている遺伝子とその組み換え技術による産生の方法も開示されている。Taniguchiらの欧州特許Ｎｏ．８９１０４０２３．０；Taniguchiらの欧州特許Ｎｏ．９０１０４２４６．６。Honjoら、Nature vol. ３１１，６３１頁（１９８４）；Taniguchiら、Science vol. ２４４，５５１頁（１９８９）も参照。
いずれかのインターロイキン−２受容体の細胞外の可溶領域は、サイトカインであるインターロイキン−２の作用に対する阻害剤として、ある程度作用すると推定できるであろう。インターロイキン−２は、Ｔリンパ球の抗原特異的なクローナル増殖において、極めて重要な役割を演ずることが知られている最もよく特徴付けられたサイトカインの一つである。インターロイキン−２は、免疫系における様々な他の細胞に対して作用することも知られている。
ＩＬ−２ｒα、及びＩＬ−２ｒβと命名された二つの区別できる受容体分子からなるインターロイキン受容体の３つの別個の形がある。
最高親和性ＩＬ−２受容体は、２つの区別できるＩＬ−２受容体からなる。これら受容体の両方ともクローニングされ、特徴付けられている。低親和性ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２ｒα）は、１９８４年にクローニングが行われ、十分特徴付けられている。Nikaidoら、
Nature vol. ３１１，６３１頁（１９８４）。分子の細胞外領域は、２４，８２５の分子量を有し、２つのＮ−結合グリコシル化の部位を有している。該分子は１１このシステイン残基を有し、その中１０こは分子内ジスルフィド結合に関与している。分子上の推定上のＩＬ−２結合領域は、突然変異誘発とエピトープマッピングによってマッピングが行われた。中程度の親和性のＩＬ−２受容体（ＩＬ−２ｒβ）は、１９８９年にクローニングされたが、ＩＬ−２ｒαほど完全には特徴付けられていない。Hatakayamaら、Science vol. ２４４，５５１頁（１９８９）。ＩＬ−２ｒβの細胞外領域は、分子量が２４，６９３である。該分子は、８このシステイン残基を有し、４このＮ−結合グリコシル化部位を含んでいる。分子中のジスルフィド結合は分っていない。ＩＬ−２ｒβは、２８６アミノ酸からなる原形質領域を有している。
ＩＬ−２受容体類に対する解離定数（Ｋａ′ｓ）が定量された。それらは、ＩＬ−２ｒαに対しては１０^-8Ｍ，ＩＬ−２ｒβに対しては１０^-9Ｍ、そして、ＩＬ−２ｒα、ＩＬ−２ｒβ、及びＩＬ−２の複合体からなる高親和性の受容体に対しては、１０^-11Ｍである。現在のモデルからは、高親和性複合体の形成は、第１にＩＬ−２ｒαに対してＩＬ−２が結合し、そして次にＩＬ−２ｒβに結合することによって形成されることが示唆されている。Oguraら、Mol. Biol. Med. vol. ５，１２３頁（１９８８）。
ＩＬ−２の阻害剤は、移植拒絶、ならびに自己免疫疾患の防止に役立つものと考えられる。現在では、
ＩＬ−２結合を防ぐＩＬ−２ｒαに対するモノクローナル抗体が、ヒト腎臓移植において試験されつつある。
Hiesseら、La Presse Mediocle vol. ２０，２０３６頁（１９９１）。１５人の患者の試験において、免疫抑制剤と併用した抗体は、同種異系移植の拒絶を防ぐ上で、より高濃度の免疫抑制剤を受けた対照群と同程度に効果的であることが示された。高水準の可溶ＩＬ−２ｒαの循環が、多数の疾患、ある感染、ならびに移植と拒絶において検出された。これは、これらの疾患にＩＬ−２が関与していることを示唆している。
ＣＲ１は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体とも呼ばれる蛋白質である。ＣＲ１は、赤血球と種々の他の細胞系上に存在し、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、及びｉＣ３ｂに特異的に結合する。ＣＲ１はまた、古典的な代替系路であるＣ３／Ｃ５変換酵素を阻害し、ファクター１によるＣ３ｂとＣ４ｂの開裂のためのコファクターとして作用することができる。Fearonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. ７５，５８６７頁（１９７９）。ＣＲ１は、単一ポリペプチド鎖からなる糖蛋白質であり、４つのアロタイプ型がある。ＣＲ１は、反復されたコーディング配列を含むことが知られており、この事実を使用して、多数のアロタイプの存在が説明されている。Kricksteinら、Complement vol. ２，４４頁（要旨）（１９８５）。
赤血球上のＣＲ１の発現の減少は、全身性エリマトーデスと結びつけられている。そして、ＣＲ１数は、免疫複合体の血清水準と逆の相関を示すことが見出された。ＣＲ１蛋白質、ＣＲ１の遺伝子とＣＲ１遺伝子の産生のための方法は、FearonらのＷＯ９１／０５０４７とＷＯ８９／０９２２０に記述されている。上述の如く、ＣＲ１と抗体の１部を含む二量体の分子も開示されている。HebellらのＷＯ９１／１６４３７。
本発明の要約
本発明は、ポリペプチドを修飾する方法とその結果得られた修飾ポリペプチドに関する。
本発明は、Ｒ₁とＲ₂が生物学的に活性な基であり、そして、Ｘは非ペプチドポリマーのスペーサーである一般式Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂からなる実質的に精製された化合物を包含する。Ｒ₁とＲ₂は、同じか、あるいは異なる基であってよく、Ｒ₁とＲ₂の少なくとも１つはポリペプチドである。より好ましい態様においては、Ｒ₁とＲ₂は、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト；３０ＫＤａ腫瘍壊死因子ファクターの阻害剤；インターロイキン−２受容体とＣＲ１からなる基から選ばれ、そしてＸは、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチル化グリセロール、デキストラン、コロニック酸、ポリβ−アミノ酸、及び炭水化物ポリマーからなる基から選ばれる。また、医薬として受容できる担体中の、このように実質的に精製された化合物からなる医薬的組成物も含まれる。本発明には、さらにその必要がある患者を、このような医薬組成物で治療する方法も含まれる。図１９に描かれている一般式Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂の化合物は、“亜鈴”と呼ばれる。
本発明にはまた、共有結合を形成することができる少くとも２つの反応性基を有する非ペプチド性ポリマー基を、生活活性基Ｒと反応させ：そして、該化合物を単離することからなる一般式Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂からなる実質的に精製された治療的に価値ある化合物の調製のための方法も含まれる。
代替的態様においては、本発明は、Ｒ₁とＲ₂が異なっている一般式Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂からなる実質的に精製された価値ある化合物の調製のための方法が含まれる；この方法は、生物学的活性の基Ｒ₁と反応させたとき、共有結合を形成することができる非−ペプチド性ポリマー基を反応させ、複合体Ｒ₁−Ｘを形成し；複合体Ｒ₁−Ｘを生物活性基Ｒ₂と反応させ、該化合物を形成し；そして、該化合物を分離し、精製することからなる。
１つの態様においては、この発明は、ＴＮＦ阻害剤とＩＬ−１阻害剤蛋白質の部位特異性ＰＥＧ化に関する。
ＰＥＧ化の部位特異性を維持するために、ポリペプチドのシステイン残基中の遊離−ＳＨ基とのみ、ほとんど例外なく反応するＰＥＧ試薬が選ばれる。ほとんど例外なくシステインの−ＳＨ基に共有結合するＰＥＧ化の試薬の例は、Ｏ−（２−マレイミドエチル）−Ｏ´メチルポリエチレングリコールである。
部位特異的ＰＥＧ化は、与えられたポリペプチドの天然に存在する“遊離”システイン残基においてか、または天然に存在するポリペプチドのムテイン上に含まれる遊離システインのいずれかにおいて行うことができる。システインは、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列中に付加されるか、挿入されるか、または選ばれた部位において、他のアミノ酸残基の代わりに置換されてよい。
この発明の１つの態様においては、ＰＥＧ化されるべきポリペプチドは、細菌宿主細胞からの組換えＤＮＡ技術を経て産生される。多くの場合においては、細菌によって発現されたポリペプチドは、ＰＥＧ化の段階の前に、生物学的活性を得るためには、たたみ直されなければなならない。本発明のある適用においては、自然のポリペプチドは、遊離のシステイン残基を含まないが、変更されたポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドにおいて、少くとも１この遊離システインを含むように産生される。この方法によれば、細菌によって発現されたポリペプチドのたたみ直しは、順番に、システインのようなスルフヒドリル基を含む化合物、そして、シスチンのようなジスルフィドを含む化合物を添加することによって容易になる。たたみ直しと精製後、ポリペプチドは限られた量のジチオトレイトール“ＤＴＴ”のような穏やかな還元剤で処理され、変更されたポリペプチドの新規なシステイン残基のスルフヒドリル基を再生する。酸化を防ぐためにデザインされた条件下での透析の後、ポリペプチドは、部位特異的に共有結合によって修飾されたポリペプチドを形成するために、システイン特異性ＰＥＧ化試薬と反応させることができる。
本発明のより好ましいＰＥＧ化ポリペプチドは、位置特異的にＰＥＧ化されたＴＮＦ−阻害剤とＩＬ−１阻害剤である。さらに具体的には、本発明は、ＰＥＧ化３０ＫＤａのＴＮＦ阻害剤と、ＰＥＧ化ＩＬ−１受容体アンタゴニストを記述している。最も好ましいＰＥＧ化ＴＮＦ阻害剤は、自然のヒト蛋白質の１０５番目の位置におけるアスパラギンのアミノ酸残基が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を使用して、システインに変化し、ＰＥＧ化が１０５の位置における遊離システインにおいて起こっている３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤を含んでいる。変異した３０ＫＤａのＴＮＦ阻害剤の他のＰＥＧ化誘導体には、システインが１位、１４位、１１１位と１６１位において添加されている突然変異を含む。１つだけＰＥＧ化されたムテインに加えて、種々の変位のいずれか、及びすべての組合せが、単一のムテイン内に包含され、ＰＥＧ化されることができる２こ以上のシステイン残基をもつ変更された３０ＫＤａのＴＮＦを創生することができる。
最も好ましいＰＥＧ化ＩＬ−１ｒαには、４この遊離システインを含む、天然の、すなわち天然に存在するＩＬ−１ｒａが含まれる。ＩＬ−１ｒａのモノＰＥＧ化は、１１６位のシステインの位置に、位置特異的ＰＥＧ化を生ずる。変位したＩＬ−１ｒａの他のＰＥＧ化誘導体には、システインがポリペプチドのアミノ末端に加えられ、システインが、６，８，９，８４または１４１の位置に加わり、及び１１６位におけるシステインが、セリンで置換されているムテインが含まれる。１こだけＰＥＧ化されたムテインに加えて、種々の変異のいずれか、またはすべての組合せが含まれ、ＰＥＧ化され得る２こ以上の遊離システインをもつ修飾ＩＬ−１ｒａが創製される。
本発明の他の面と有利な点は、発明の実施の図解例をはじめとする以下の詳細な記述を考察する際明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、天然のＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列を描いている。
図２は、天然の３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤のアミノ酸配列を描いている。
図３は、ＰＥＧ化していないＩＬ−１ｒａとムテインｃ８４ｓ１１６ＩＬ−１ｒａのＰＥＧ化していない、およびＰＥＧ化した形のクーマシー−ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を示す。レーン２，３，５，および６は、ＰＥＧ化反応混合物を含む。レーン１と４は無修飾の蛋白である。
レーン１ ＩＬ−１ｒａ
レーン２

レーン３

レーン４

レーン５

ＩＬ−１ｒａ
レーン６

ＩＬ−１ｒａ
図４は、モノＳイオン交換クロマトグラフィーを描いている：クロマトグラムＡ，

の反応混合物、ピーク１は修飾された、そして、ピーク２は、修飾されなかったＩＬ−１ｒａであり；そして、クロマトグラムＢは、精製された

を示す。
図５は、サイズ排除、クロマトグラムを描き、いくつかのサイズ標準と

（画分７）、及びＩＬ−１ｒａ（画分１３）の溶出プロファイルを示す。
図６は、遊離のシステインを標識するため、トリチル化したヨード酢酸と反応させたアルキル化ｍ

のトリプシン消化物の逆相ＨＰＬＣ分画を描いている。分離はBrownlee Ｃ８（２．１×２２０ｍｍ）カラムで環境温度で、１，０００μｌ／ｍｉｎの流速で線形グレーディエントをかけて行った。溶剤Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液で、溶剤Ｂはアセトニトリル８０％と水２０％の混液中０．０８５％のアセトニトリルであった。
図７は、図６中のペプチド１８のキモトリプシン消化物の逆相ＨＰＬＣ分画を描いている。条件は、図６におけるそれと同一であった。ペプチド５と８は、トリチウムカウントを含み、ペプチド５はアミノ酸配列ＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬを有していた。システインは、カルボキシメチルシステイン誘導体として同定された。このサイクルは、バックグラウンドを越えたカウントを含む唯一のものであった。ペプチド８のアミノ酸配列は、ＩＬ−１ｒａの１０３位のセリンで始まった。このペプチドをキモトリプシンで再消化することによって本ペプチドのすべてのトリチウムカウントの分画が可能となった。
図８は、血漿中ＩＬ−１ｒａ濃度対成熟ＩＬ−１ｒａ，ＰＥＧ化ＩＬ−１ｒａ、及びＩＬ−１ｒａのいくつかのＰＥＧ化のムティンの経時プロファイルを描いている。
図９は、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤とｍＰＥＧを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、ｍＰＥＧ ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤から、サイズ排除クロマトグラフィーによる未反応３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤の分離を示している。
図１０は、多数の１こだけＰＥＧ化したＩＬ−１ｒａ分子種、二重にＰＥＧ化したＩＬ−１ｒａの分子種、及びＩＬ−１ｒａＰＥＧ亜鈴分子種についての静脈内血漿中ＩＬ−１ｒａ濃度の経時曲線を含むプロットを示す。
図１１は、図１０におけるように、多数のＩＬ−１ｒａ分子種についての皮下血漿ＩＬ−１ｒａ濃度の経時曲線を含むプロットを示す。
図１２は、マウスにｈｒＴＮＦを注射した後の血漿中ＩＬ−６水準のプロットを示す。
図１３は、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤対ＴＮＦ（Ａ）の５種の比率、及びｃ１０５ ３０ＫＤａのＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ２０００ｄｂ対ＴＮＦ（Ｂ）の５種の比率の混合率物によってマウスに誘発されたＩＬ−６水準を比較している。
図１４は、ＴＮＦ単独、及びＴＮＦ対ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ３５００とＰＥＧ１０，０００亜鈴との１：１の比率の混合物によってマウスに誘発された血漿中ＩＬ−６水準を描いている。
図１５は、ＴＮＦ対ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤（Ａ），ＴＮＦ対ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ₃₅₀₀ｄｂ（Ｂ）；ＴＮＦ対ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ_10,000ｄｂ（Ｃ）：そして、ＴＮＦ対ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ_20,000ｄｂ（Ｄ）の様々な比率の混合物によって誘発された好中球の百分率を描いている。
図１６は、天然３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤₈₅₀₀及びＰＥＧ_10,000そして３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ₃₅₀₀、ＰＥＧ_10,000及びＰＥＧ_20,000亜鈴についての静脈血漿中３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤濃度の経時曲線を含むプロットを示す。
図１７は、図１６におけるように、多数の３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤分子種についての皮下血漿中３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤濃度経時曲線を含むプロットを示す。
図１８は、ＯＤ４０５対時間をプロットすることによって、天然のＩＬ−１ｒａとｃ８４ＩＬ−１ｒａ ＰＥＧ₈₅₀₀の３溶液の溶解度を表している。
図１９は、亜鈴化合物と呼ばれる一般式Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂を有する本発明の化合物の基本的構造を描いている。
本発明の詳細な説明
本発明は、医薬的に有用なポリペプチド、特に腫瘍壊子因子（“ＴＮＦ”）阻害剤、及びインターロイキン（“ＩＬ−１”）の阻害剤の選択的修飾を内容としている。より具体的には、本発明は、３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤とＩＬ−１受容体アンタゴニスト（“ＩＬ−１ｒａ”）の選択的修飾を記述している。該選択的修飾はポリペプチド類の薬物動態学的性質を強化し、ならびに、ヒトの治療のための使用に対して均質な組成物を提供するのに役立つ。
本発明の手順によって、選択的に修飾されるさらなるポリペプチドには、インターロイキン−２受容体（“ＩＬ−２ｒ”）及びＣＲ１が含まれる。インターロイキン−２受容体への引用のすべては、特にことわりがなければ、ＩＬ−２ｒのαとβ鎖の両方を含むものと解釈しよう。
本発明のより好ましい態様においては、修飾したポリペプチドとＤＮＡ配列は、ヒトのものである。しかし、動物ＤＮＡとペプチド配列とヒトの形との間に十分な相同性がある程度まで、それらは、本発明の範囲内に含められるであろう。
１つの態様においては、本発明の修飾の方法には、問題のポリペプチド類に対して、長鎖ポリマーを位置異的に共有結合させることが含まれる。選ばれたポリペプチドは、問題とされる天然の、すなわち天然に存在するポリペプチドであるが、または本発明中に記述された修飾過程を強化するために産生された生物学的に活性なムテインであってよい。本発明の方法には、本発明の目的に適った望ましいムティンの選択、産生、及びスクリーニングが含まれる。本発明の他の態様においては、ポリペプチドを修飾する方法は、結果として生ずる成績物を、実質的に精製された、本発明において定義されている様な形で手に入るように行われることが要求される。
或る態様においては、本発明の修飾ポリペプチドは、アミノ酸配列の特定の位置で長鎖のポリマーに結合される。本発明の修飾されたポリペプチドは、それらの生物活性の実質的な部分を保持する。より好ましい態様においては、修飾されたポリペプチドは天然のポリペプチドの生物活性の少なくとも１／５を保持し、最も好ましい態様においては、活性の少なくとも１／４が保持される。その上、修飾ポリペプチドは、以下の領域の少くとも１つにおいて、薬物動態学的性能の改善に役立つ：
１） 天然のポリペプチドのみかけの分子量を増加し、皮下、または全身性投与の後のクリアランス速度を現象させること。
２） 天然のポリペプチドの水溶液の溶解度を増加させること；または、
３） 天然のポリペプチドの抗原性を減少させること。
本発明の多くの態様においては、これらの目的のそれぞれが達成される。本発明のより好ましい態様においては、長鎖のポリマーはポリエチレングリコール、またはモノメトキシポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコール単位は、ここではＰＥＧと呼ばれ、モノメトキシポリエチレン単位はｍＰＥＧと呼ばれる。ポリマー単位のおおよその分子量は、下つき記号で与えれている。例えば、分子量が約５、０００のモノメトキシポリエチレングリコール単位は、ｍＰＥＧ₅₀₀₀と書かれる。本発明の範囲内に含まれる他の長鎖のポリマーは、ポリプロピレングリコール（“ＰＥＧ”）、ポリオキシエチル化グリセロール（“ＰＯＧ”）、デキストラン、コロニック酸、または他の炭水化物に基づくポリマーとβ−アミノ酸、及びビオチン誘導体のポリマーである。
本発明の代替的態様においては、長鎖ポリマー単位は、ジヒドロキシポリエチレングリコール、すなわち、ＨＯ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−Ｈである。下に記すようなポリペプチド、または他の生物学的に活性な化合物と共有結合するために活性化されるとき、ジヒドロキシ物質は、２つの反応性部位をもつ。
本発明のより好ましい態様においては、長鎖ポリマー単位は、システイン残基のスルフヒドリル基（−ＳＨ）への共有結合を経てポリペプチドへ結合される。反応の選択性と均質な反応混合物を得るためには、スルフヒドリル基と特異的に反応する官能化ポリマーを利用することが有用である。長鎖ポリマーに結合した官能性、または反応性基は、ここでは活性化基と呼ばれる。活性化基には、マレイミド基、スルフヒドリル基、チオール基、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、及び５−ピリジル基が含まれる。より好ましい活性化基は、マレイミドである。
活性化ジヒドロキシポリエチレングリコールは、ポリマー鎖の両端の間が物理的に離れているため、分子の各端において殆ど同等に反応性である。反応条件とポリペプチドの適切な選択によって、活性化ジヒドロキシポリエチレングリコール--または他の多重活性化長鎖ポリマー単位は、ポリペプチドと反応して２このポリペプチドが長鎖のポリマー単位によって結合した“亜鈴”の形をした複合体を形成する。
活性化ポリマーに結合した基と異なるシステイン含有ポリペプチドの間に見出されるであろう異なる反応速度を利用することによって、及び反応の速度論によって、また、２つの異なるペプチド基を含むか、または１このポリペプチドと異なる生物活性基を含む実質的に精製された化合物が形成され得る亜鈴型複合体を産生することは、容易にこの技術分野の人々の熟練の範囲内である。このようなヘテロ亜鈴型化合物の例は、下に与えられている。
システインの反応の程度と利用性は、ポリペプチドからポリペプチドへと劇的に変動する。そのため、その生物学的活性型においては、多くのペプチドが、“遊離”のシステイン、すなわち別のシステインに結合していないシステインをもっていない。その上、遊離のシステインの存在は、システインが反応性試薬と結合するために接近できることを意味しない。修飾は、通常、活性な、つまり三次元的に折りたたまれたポリペプチド上で起こるので、遊離のシステインが折りたたまれた構造の“内部”で見出されるときには、反応は殆ど、あるいは全く起こらない。
ポリペプチド修飾する場合のさらなる制約は、修飾が、ポリペプチドの活性部位上に及ぼすかもしれない潜在効果である。活性部位に対する近位関係を有するシステインの修飾は、ポリペプチドを効果的に不活性化することがある。選ばれたポリペプチドについて多くが知られている場合でさえ、いずれのシステイン残基が効果的に修飾できるかを正確に予知することは、不可能ではないにしても、困難である。
同じ要因は、さらにシステイン残基を含む変異したポリペプチドが産生されるときにも存在する。ポリペプチドが細菌での発現を経て、組み換え技術によって産生されるときに、非天然システインは、ポリペプチドの適切な再折りたたみを妨害する可能性がある。その上、システインは、ＰＥＧ化試薬に近づくことができなければならない。そして、ＰＥＧ化システインは、ポリペプチドの活性部位を有意に妨害してはならない。
非天然システイン導入のための一定のポリペプチド内の選択は種々の源の情報に基づいて影響され得る。例えば、グリコシルの部位は、遊離のシステインを導入するよい部位であると考えられる。ポリペプチドの結合、または活性部位について知られている程に、その情報も、潜在ムテインを選ぶのに使用することができる。ポリペプチドのアミノ末端に、またはカルボキシル末端における付加、または置換も、その位置のために有望に思われる。そして最後に、システインへのリジン残基の変異は、リジンが一般的に生物活性ポリペプチド上で見出されるという仮説に基づいて考慮することができる。
種々の潜在性ムテインが、望ましい特徴に適う、一定のペプチドとして選択されることができるが、いずれが本発明の目的に適うかが知られるのは、このようなムテインの合成、ＰＥＧ化、及び試験を通じてのみである。本発明、及びこの技術分野に熟達している人々の熟練度と知識に照らすと、このような合成、ＰＥＧ化、及び試験は、過度な実験を行うことなく遂行することができる。たとえあるポリペプチドのＰＥＧ化、ポリペプチドの生物活性をある程度減少させるように作用しても、該ポリペプチドの薬物動態学的性能の改善は、種々の治療適用において、天然ポリペプチドの価値を著しく増加させることがあることに注意すべきである。
標的ムテインの選択にあたっては、該ムテインの産生のためのより好ましい方法は、ムテインをコードしている遺伝子を遺伝子組み換え技術によって発現することによる。天然ポリペプチドをコードしている遺伝子が知られていると想定するならば、変更された遺伝子は、自然の遺伝子上での標準的部位特異的突然変異誘発手順によるか、標準遺伝子合成手順による変更遺伝子の構築のいずれかによって創製することができる。これらの技術は、本技術分野において、普通の熟練度をもった人々によって十分よく知られている。
標的ムテインをコードしている遺伝子は、動物、昆虫、及び細菌のシステムをはじめとする種々の発現系において発現することができる。発現系が天然ポリペプチドの発現のために遂行された程度によって、同じ系が標的ムテインのために使用され得る。本発明のより好ましい態様においては、標的ムテインをコードする遺伝子は、天然遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって産生され、ムテインをコードする遺伝子は、細菌の発現システムから発現される。天然のＩＬ−１ｒａをコードしている遺伝子と該遺伝子をE.coliにおいて発現する方法は、１９９１年１２月２４日に公示されたHannumらの米国特許Ｎｏ．５，０７５，２２２に詳細に記述されている。天然３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤コードしている遺伝子とE.coli中における該遺伝子の発現の方法は、１９９０年７月１９日に出願された米国特許出願０７／５５５，２７４に詳細に記述されている。これらの出願の各々は、この参照によって本発明に組み込まれる。
本発明のムテインとＰＥＧ化物質は、蛋白質の配列中に対立遺伝子を含み（個人から個人の天然の変異性による配列の変異）、そして、実質的に等価の蛋白質を含んでいる。明細書と請求を通じて使用される“実質的に等価”はアミノ酸残基の極めて高度の相同（一般的には、本発明中に参照により特別に組み込まれているM. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Stracture, vol. ５, ｐ. １２４（１９７２）, National Biochemical Research Foundation, Washington, Ｄ. Ｃ. を参照）、ならびに、同等な生物活性を有することを意味するように定義されている。やはり、本発明の範囲内に含まれているのは、自然のポリペプチドの先端が部分的に短くなった型であるムテインとＰＥＧ化ポリペプチドである。
本発明の方法のより好ましい１つの態様においては、標的ムテインが、細菌の発現系において組み換えＤＮＡ技術を経て産生されるときには、以下の段階が遂行される：
１） 標的ムテインをコードする遺伝子は、自然のポリペプチドをコードする遺伝子の位置志向性突然変異誘発によって創製される；
２） 標的ムテインをコードする遺伝子は、バクテリアの発現系において発現される；
３） 標的ムテインはバクテリアから分離され、精製される；
４） 標的ムテインはシステイン、または別のスルフヒドリル含有化合物の存在下においてたたみ直される；
５） たたみ直された標的ムテインを分離し精製する；
６） 精製され、たたみ直されたムテインは緩和な還元剤で処理される；
７） 反応混合物は、無酸素下で透析される；そして、
８） 透析された反応混合物は、活性化基を含む長鎖のポリマーで処理される。
３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤のＰＥＧ化ムテイン産生のためのより好ましい態様においては、穏やかな還元剤は、ジチオトレイトール（“ＤＴＴ”）である。１つの代替的態様においては、修飾は、発現蛋白質またはムテインのたたみ直しの前に起こることがある。
本発明のより好ましい態様においては、ＰＥＧ化ムテインとＰＥＧ化天然ポリペプチドは、精製され、従来法によって医薬組成物へ製剤化することができる。代替の態様においては、精製ムテインも医薬組成物に製剤化することができる。
不活性化された長鎖のポリマー単位の反応によって形成される本発明のＰＥＧ化ポリペプチドは、さらなる有益な性質をもっている。これらの亜鈴型の分子は、ただ１本のポリマー単位によってつながれた関心のある２つのポリペプチドを含むことができる。本構造は、ポリマー分子にある程度の直線性を与え、ポリエチレングリコールのような大きな水和性のポリマーの使用に内在する立体障害を若干減少させる。高生物活性を保持しつつ、増加したみかけの分子量をもった分子を得るという目標が達成される。本発明の範囲内に、特に含められるのは、２つのＩＬ−１ｒａ分子、または２つのＴＮＦ阻害剤が、共有結合でただ一本のポリマー鎖につながれているか、２つの異なるポリペプチドがただ一本のポリマーにつながれている歯状突起が２つある分子、すなわちＴＮＦ阻害剤とＩＬ−１ｒａ分子の両方を含む歯状突起が２つあるただ一本の分子である。
天然のＩＬ−１ｒａ（図１）とＩＬ−１ｒａの種々のムテインが、本発明にしたがってＰＥＧ化された。下の例において記述された方法によって、遊離のスルフヒドリル基における野生型のＩＬ−１ｒａのＰＥＧ化の結果、ＩＬ−１ｒａ（Ｃ１１６）の１１６単位のシステイン残基において、ｍＰＥＧの付加を生ずる。完全に天然の分子においては、他の３つのシステインは、ＰＥＧ化のために接近することができない。ＩＬ−１ｒａの異なる部位に、ｍＰＥＧ分子を付加させるために、そして、２こ以上のｍＰＥＧを有するｍＰＥＧ結合体を作るためには、ＩＬ−１ｒａ中の天然のアミノ酸が、システインで置換されたか、さらなるシステインが該蛋白質のアミノ末端に付加されているＩＬ−１ｒａ。１１６位の残基が、ＰＥＧ化されていない結合体を調整するためには、Ｃ１１６は、多数のムテインにおいてセリンに変化された。下記は、ｍＰＥＧとの反応のために生成されたムテイン類のリストである（残基のナンバーリングは、図１に与えられた配列に基づいており；Ｃはシステイン、そして、Ｓはセリンを指している）：
ｃ０ｓ１１６ ｃ０ｃ１１６
ｃ８４ｓ１１６ ｃ８４ｃ１１６
ｃ６ｓ１１６ ｃ６ｃ１１６
ｃ８ｓ１１６ ｃ８ｃ１１６
ｃ９ｓ１１６ ｃ９ｃ１１６
ｃ１４１ｓ１１６ ｃ１４１ｃ１１６
天然の３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤（図２）は、遊離のシステイン残基を含んでいない。以下の３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤のムテインが調整された（残基のナンバーリングは図２において与えられた配列に基づいており；Ｃはシステインをさす）；
ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤
ｃ１ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤
ｃ１４ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤
ｃ１１１ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤
ｃ１６１ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤
本発明の範囲内に含まれているのは、一般式Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂によって表することができる図１９に描かれているような全クラスの化合物である。式中；Ｒ₁とＲ₂は生物学的に活性な基であり、Ｒ₁とＲ₂のうち少なくとも１つはポリペプチドであり、Ｘは非ペプチド性ポリマースペーサーかリンカー基である。Ｒ₁とＲ₂は、同じ基か異なる基であってよい。Ｒ₁とＲ₂が異なる基である場合、Ｒ₁とＲ₂は、両者ともポリペプチド性であってよく、またはＲ₁はポリペプチド性であってよく、そして、Ｒ₂はいかなる生物学的に活性な基であってよい。“亜鈴”型化合物と呼ばれている本構造をもった化合物は、実質的に精製されることによって特徴付けられている。この意味合いにおける“実質的に精製されている”は、均質な組成物であるとして定義されている。
均質な組成物は、１分子のリンカーＸと１分子のＲ₁及び１分子のＲ₂からなっている。均質な組成物には、生物学的活性基は、Ｒ₁とＲ₂が化合物のそれぞれの分子の基上の正確に同じ位置におけるリンカーに付加されていることが含まれるが、要求されはしない。本発明のある態様においては、生物学的に活性な基は、位置特異的にリンカーに付加されている。例えば、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤 ＰＥＧ３０００ｄｂ化合物において、２つのｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤基が、１０５位のシステイン残基において、ＰＥＧ３０００リンカーに結合されている。
“均質性組成物”について言う場合には、分子による分子に基づいて、亜鈴化合物も、スペーサー基の正確な長さに関して均質ではないことが理解されるべきである。与えられた分子量の範囲のＰＥＧまたは他の高分子量のポリマーを利用するいずれの生産過程も、“平均”分子量を含む溶液で始まるということが、この技術分野において熟達した人々によって理解されている。したがって、二反応性ＰＥＧ単位をポリペプチド基と反応させる場合には、ＰＥＧ単位は、定義によって多分数であり、そして結果として生ずる亜鈴化合物は、リンカーの長さが本技術分野の熟達した人々によって存在することが知られている変動を受ける程度に不均質である。
要約すると、この意味合いにおける“実質的に精製された”は、１）Ｒ₁とＲ₂の組成において逸脱している；２）または、２つ以上のリンカーによって統合されている化合物が、実質上含まれていないことである。
Ｒ₁とＲ₂は、生物学的に活性な基として定義されている。生物学的活性基は、天然の生物学的に分子と反応して、生物学的作用を誘発することができるいずれの化合物をも含む。生物学的活性基には、蛋白質、ポリペプチド、ステロイド、炭水化物、ヘパリン、金属含有剤、ビタミン類、または、他のどのような生物学的に活性な分子種のような有機分子種を含む。Ｒ₁とＲ₂基の少なくとも１つは、ポリペプチド性である。より好ましい態様においては、Ｒ₁とＲ₂の両者がポリペプチドである。
ポリペプチド性は、本質において、実質的に蛋白質様である化合物のすべてと定義される。しかし、ポリペプチド性基は、若干の非ペプチド性要素を含むことがある。例えば、グリコシル化ポリペプチド、または合成的に修飾された蛋白質は、定義の中に含まれる。
生物学的に活性な基、Ｒ₁とＲ₂は、結合基と標的へ配送する基を含む。結合基は、与えられた生物学的リガンドに対する親和性によって定義される。標的へ配送する基は、複合体を生物学的システム内に配送する能力によって定義される。Ｒ₁とＲ₂は、同じリガンドに対して親和性を有することがあり、その場合には、その亜鈴は、そのリガンドに対して親和性が増強されることがある。Ｒ₁とＲ₂は、異なるリガンドに対して親和性を有することがあり、そのときは、Ｒ₁はＲ₂に対するリガンドが優先する位置に複合体を配送するのに役立つ。
より好ましいポリペプチド性基は、受容体、受容体の細胞外部分、細胞表面の分子、及び細胞外基質分子、結合蛋白質、及び受容体拮抗剤である。Ｒ₁またはＲ₂として使用することができるポリペプチド性基の中には、以下のポリペプチドとそれらのいかなる断片も含まれる：ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤、ＩＬ−２受容体、ＣＲ１（ＣＲ１）に対するすべての参照は、ＣＲＩのただ１本の、またはコンセンサス反復配列のいかなる組合せをも含む。），ＰＤＧＦ受容体，ＩＬ−２，ＭＣＳＦ受容体，ＥＧＦ受容体、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭＣＳＦ受容体、Ｔ−細胞受容体、ＨＬＡ−Ｉ，ＩＬＡ−II，ＮＧＦ受容体、ＩｇＧ（Ｖ_H、Ｖ₁），ＣＤ４０，ＣＤ２７，ＩＬ−６受容体，インテグリンズＣＲ３，ＶＬＡ₄，ＩＣＡＭ，及びＶＣＡＭ，ＣＲ２，ＧＭＰ１４０Ｌｅｃドメイン，ラミニン結合蛋白質，ラミニン断片，マンノース結合蛋白質、ＰＤＧＦのエキソン６ペプチド、及びプロテアーゼ（２つの触媒的ドメイン、または標的配送ドメインと触媒ドメインをもった）。受容体に対する参照すべては、２つ以上の形が存在するときは、いつでも受容体のすべての形を含む。より好ましい態様においては、Ｒ₁とＲ₂の基は、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤、ＣＲ１及びＩＬ−２受容体（αとβ鎖の両方）からなる基から選ばれる。
より好ましい態様においては、非−ペプチド性ポリマースペーサーを、さらに以下の如く定義することができる：
Ｘ＝−Ｙ₁−（Ｚ）_n−Ｙ₂−中、Ｙ₁とＹ₂は、Ｒ₁とＲ₂と反応し、Ｒ₁基とＲ₂基に対して、スペーサーを結合させる活性基の残基を表し、（Ｚ）_nは、ベースのポリマー基を表している。本発明によれば、ｎは６より大きく、より望ましくは１０よりも大きい。
非ペプチド性は、本質的には、実質的にペプチド性でないポリマー基として定義される。Ｙ₁、Ｙ₂、及びＺのアミノ酸残基の重量による５０％未満の包含は、事実上実質的に非ペプチド性と考えられ、そして、非ペプチド性と考えられるであろう。より好ましい態様においては、非ペプチド性スペーサーは抗原性がなく、生物学的に不活性で親水性である。その上、より好ましいリンカーは、与えられたＲ₁またはＲ₂基のそのリガンドに対する親和性を有意に減少することなく、免疫原性の減少、溶解性の増加、または身体からのクリアランス速度の減少のような望ましい性質を、生物学的に活性なポリペプチド性の基に与えることができる。最も好ましい態様においては、化合物Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂（式中、Ｒ₁＝Ｒ₂で、Ｒ₁とＲ₂は結合基である）は、誘導化されていない結合基が、リガンドに対してもつ親和性を陵駕するそのリガンドに対する親和性を有している。例えば、実質的に、精製されたｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ３４００ｄｂは、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤がＴＮＦに対してもっている阻害活性の２０倍を越える阻害活性をＴＮＦに対してもっている。
ポリマースペーサーＸの一部である活性化基Ｙ₁とＹ₂は、マレイミド基、スルフヒドリル基、チオール，トリフレート，トレシレート，アジリジン、オキシラン、及び５−ピリジルを始めとする上に記述したような活性基のいずれかからなっていてよい。より好ましい活性基は、マレイミドである。
ポリマー基（Ｚ）_nは、好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリプロングリコール、ポリオキシエチル化グリセロール、デキストラン、ポリβ−アミノ酸、コロニック酸、または他の炭水化物ポリマー及びピオチン誘導体からなる基から選ばれる。より好ましい態様においては、ポリマー基は、ポリエチレン基である。本発明において記述された機能に役立つであろういずれの非ペプチド性ポリマー基も、本発明の範囲内に包含されるであろう。
本発明の利点の１つは、２つの結合基を結ぶポリマー基の長さを変化させることによって、Ｒ₁基とＲ₂基の距離を変化させることができることである。理論によって特定されてはいないが、本発明の多量性化合物についてみられた生物活性の増加は、in vivoにおける細胞の受容体とリガンドの多量性的性質が原因と考えられることが提案されている。この理由から、Ｒ₁とＲ₂の一単位間の至適距離（一般的にはポリマー単位（Ｚ）_nの長さに直接比例するであろう）は、スペーサーＸの大きさを変えることによって、本技術分野に熟練した者によって容易に決定できると考えられる。
本発明の１つの態様においては、Ｒ₁基とＲ₂基は同一である。しかし、代替的態様においては、Ｒ₁とＲ₂は異なる分子種である。このような化合物は、Ｒ₁とＲ₂が、同じ一般的生物学的系の中で作用するヘテロダイマーを創製するようデザインすることができる。例えば、ＩＬ−１受容体アンタゴニストとＴＮＦ阻害剤はともに炎症のカスケードを破壊すると考えられる。Ｒ₁またはＲ₂が複合体を特定の基質に対するその結合親和性によって、特定の位置に“さしむける”“標的への配送”のための分子種、そして、向い側の結合基は、局在化された部位において望ましい活性を有する二機能的複合体もデザインすることができる。
首尾よいＩＬ−２阻害剤として大きな潜在性を有するヘテロダイマーの例は、Ｒ₁がＩＬ−２ｒαであり、Ｒ₂が、ＩＬ−２ｒβであるダイマーである。このようなヘテロダイマーは、ＩＬ−２に対して最高の親和性を有する受容体複合体を模倣する。例ＸVIIを参照。補体の阻害剤として作用することができるさらなるヘテロダイマーは、Ｒ₁が、ＣＲ１からのＣ３ｂ結合ドメインであり、Ｒ₂が、ＣＲ１からのＣ４ｂ結合ドメインであるヘテロダイマーである。例ＸＶIIIを参照。さらなるヘテロダイマーにおいては、Ｒ₁がＰＤＧＦのエキソン６ペプチドであり、Ｒ₂がＩＬ−１ｒａである。例ＸIXを参照のこと。
本発明のより好ましい態様においては、二機能性Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂を産生する手順は、上述したように、ポリペプチドの部位選択的反応のために使用されたものと本質的には同じである。ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ３４００の合成は下記の例１３において記述される。二反応性ポリマー基は、システイン含有ポリペプチドと反応し、その場合、二反応性ポリマー基上の活性化基は、選ばれた遊離システイン残基とチオエーテル結合を形成する。上述されたように、このシステインは、ポリペプチド基上に天然に存在している遊離のシステイン、または自然の配列中に付加されたか、あるいは置換された非天然のシステインであってよい。
本発明のより好ましいビス反応性ポリマー化合物は、α−（２−マレイミド）ω−マレイミドポリ（オキシエチレン）、または、ビスマレイミドＰＥＧである。ビス−マレイミドＰＥＧの合成は、例１２において記述されている。より好ましい方法によれば、ビス−マレイミド化合物は、ビス−アミノ中間体を経てビス−ハイドロキシルＰＥＧから調整される。
ＰＥＧの末端水酸基の相当するアミノ基への変換のためのいくつかの方法は、Harrisらによって総説されている。Harrisら、J. Pofymer Sci. vol.２２，３４１頁（１９８４）；Hariss, Rev. Macromol. Chem. vol. Ｃ２５（３），３２５頁（１９８５）。これは、スルフオン化、ハロゲン化、または水酸基の参加のいずれかを経て、反応性の中間体を生成させ、続いて活性化末端を求核試薬によって置換することによって達成される。
例１２において与えられているビス−マレイミドＰＥＧの合成に対する実際的な代替法も存在する。水酸基のアミンへの置換の反応性中間体は、続いてアンモニアで直接置換されるハロゲン化誘導体（例えば、α−ブロモエチル）−ω−ブロモポリ（オキシエチレン）中間体（Johannson,Biochim. et Biophy. vol. ２２２，３８１頁（１９７０））であり、（Buckmannら，Makromol. Chem. vol.１８２，１３７９頁（１９８１））またはアルデヒド中間体である（Harris, 上記）。ビスマレイミドＰＥＧは、使用されうる唯一のスルフヒドリル特異性試薬ではない。Glassと協同研究者は、ＰＥＧのスルフヒドリル基への付加の別の方法を開発した。Glassら、J. Biopolymers. vol.１８，３８３頁（１９７９）。しかし、本反応は、チオールに関して可逆的である。ＰＥＧのシステイニルスルフビドリルへの付加の別の方法は、ビス−４−ビニルピリジンＰＥＧ誘導体である。
Harris（上記）はまた、蛋白質を修飾するために試薬として使用することができるＰＥＧの種々求電子性誘導体の合成も総説している。これらの試薬には、クロロカーボナート、イソシアナート、エポキシド、スクシニミジルスクシナート、シアヌリッククロリド、混合無水物、カルボジイミド、及びスルホナートが含まれる。後者のグループには、トレシレート、トシレート、及びメシレートが含まれる。これら試薬のあるものは、アミンと選択的に反応する（例えば、シアヌリッククロリドとカルボジイミド）が、他の試薬は、スルフヒドリルとアミンの両方と反応する（例えば、エポキシドとトシレート）。これらの試薬の若干は蛋白質を修飾するために使用され、その結果種々の程度に活性の喪失を招くことがある。
Ｒ₁とＲ₂が重なるＲ₁−Ｘ−Ｒ₂複合体のより好ましい調整においては、ビス−反応性のポリマー基を連続的にＲ₁と反応させ、次にＲ₂と反応させる２つの段階が必要となる。このようなヘテロダイマーの調整は、この技術に普通に熟練した人々によって、過度な実験をすることなく達成されると考えられる。ある場合には、中間体のＲ₁−Ｘは、Ｒ₂との反応の前に、まず分離精製されなければならない。そして、他の状況においては、中間体の精製は必要でないことがある。
ＩＬ−２ｒαとＩＬ−２ｒβの細胞外ドメインは、ＰＣＲを利用してクローニングされ、E.coliにおいて発現を行うことができるベクター中にクローニングすることができる。蛋白質は、E.coliからたたみ直され、精製され、それらのＩＬ−２活性を阻害する活性をバイオアッセイで測定することができる。ＰＥＧの位置志向性付加ができるように、分子中の天然の残査をシステインで置換するために、In vitro突然変異誘発を使用することができる。ＰＥＧ化されたとき、活性を失わない効果的な付加ができるようにするＩＬ−２ｒαとＩＬ−２ｒβの両者のムテインを、次に同定することができる。ＰＥＧに結合したヘテロダイマーは、ビス−マレイミドＰＥＧの過剰の存在において、最初にＩＬ−２ｒαをＰＥＧ化することによって形成することができる。１つだけＰＥＧ化されたＩＬ−２ｒαは、精製され、ＩＬ−２ｒβを加えて、活性マレイミド基と反応させ、ヘテロダイマーを形成する。この分子を精製し、そして、その活性を測定することができる。この分子は、細胞表面上に見出される高度親和性ＩＬ−２の受容体を模倣する筈である。
Ｒ₁がＩＬ−２であり、Ｒ₂がＩＬ−２ｒβである亜鈴複合体も、ＩＬ−２の受容体アンタゴニストとして有用である。
例Ｉ．ポリエチレングリコール化試薬の合成
ポリペプチドの誘導体をつくるために使用できる様々な手段を示すために、３つの試薬を記述する。以下に記述される中間体と試薬の構造については、例１に対する付録を参照のこと。以下に提供される参照は、すべて本発明にこの参照によって特別に組み込まれている。
Ａ．試薬１の合成：ｍＰＥＧ_X−エステル−マレイミド
ｍＰＥＧ_Xのスクシナートエステル誘導体は、Wieら、Int. Archs. Allergy App. Immun. vol.６４，８４−９９頁（１９８１）によって記述されたように調整された。その結果得られた成績物を秤量し、最小限の乾燥ジオキサンに６０℃で溶解した。溶液を環境温度まで冷却した後、トリ−ｎ−ブチルアミンとイソブチルクロロホルマートの両方の等モル量を加えた。反応は、攪拌下３０分間進行した。この間に、０．５Ｍホウ酸溶液を、１．６−ヘキサンジアミンで滴定することによって、ｐＨ８．８のホウ酸緩衝液を作った。混合無水物を含む溶液を、混合無水物の１０倍モル過剰の１．６ヘキサアミジンを含むホウ酸緩衝液の部分量に滴下した。反応混合物を４℃で脱イオン水に対して徹底的に透析し、凍結乾燥した。このポリマー中間体（中間体２）を５０ｍＭリン酸またはＨＥＰＥＳ緩衝液，ｐＨ７．６１中の２５：１モル過剰のスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドエチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ Pierce Chemical Co., Rockford Ill.）と室温で２時間反応させた。その結果得られたポリマーを、５０ｍＭリン酸ナトリウム（またはＨＥＰＥＳ）緩衝液ｐＨ７．０を４０℃で溶出に用い、反応混合物を、セファデックスＧ−２５上のサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。マレイミド−ポリマー（試薬１）は、カラムのボイド容積において溶出し、２６０ｎｍにおけるその吸光度によって検出された。試薬は、その精製後１時間以内に、ポリペプチドをアルキル化するのに使用した。この反応からのｍＰＥＧは、塩基による加水分解によって除去できるので、この試薬は、蛋白質に対するｍＰＥＧの付加の部位を同定するのに有用である。
Ｂ．試薬２の合成：ｍＰＥＧ_X−アミドマレイミド
ｍＰＥＧ−トシラート（中間体３）は、Pillaiら、J. Org. Chem. vol.４５，５３６４−５３７０頁（１９８０）によって記述されたように調整された。スルホン化された中間体の量は、Method of Enzymology, vol.１０４，５６−６９頁，Academic Pres.Inc., Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８４）におけるNilsonとMosbachによって記述されたように、分光光度法によって測定した。この中間体はフタルイミド誘導体（中間体４）に変換され、引き続いてPillaiら、上記の手順によってｍＰＥＧ_X−ＮＨ₂中間体（中間体５）ヘヒドラジンヒドラートで還元した。成績物のグラムのあたりの等量におけるアミノ基の容量は、塩酸でのミクロ滴定によって定量された。ｍＰＥＧ_X−ＮＨ₂をＨＥＰＥＳ，またはリン酸緩衝液ｐＨ７．２中のスルホ−ＳＭＣＣと室温で２時間反応させた。ｍＰＥＧ_X−アミンのスルホ−ＳＭＣＣに対する量は、５：１から１：５のモル比において試験した。
最適条件を決定するために、最終試薬（試薬２）をＰＥＧ化反応に使用し、これらの反応から得られたｍＰＥＧ_X ^*ＩＬ−１ｒａ（我々は試薬２と反応したＩＬ−１ｒａのＰＥＧ化成績物に対してこの名称を、以下に記述される試薬３との反応からのＰＥＧ化ＩＬ−１ｒａに対しては、ｍＰＥＧ_XＩＬ−１ｒａを使用するであろう。）の量と質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＥＧ）によって評価した。最適の結果は、ｍＰＥＧ_X−ＮＨ₂に対するＳＭＣＣの比が１：１のときにみられた。スルホ−ＳＭＣＣの比率がもっと大きくなると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で複数のより分子量が高い誘導体、及び分析用イオン交換クロマトグラフィー上に、複数のピークを生成した。そしてより低い比率は、ＰＥＧ蛋白質の収率が減少する結果となった。試薬２をＧ２５セファデックスレジンを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
Ｃ．試薬３の合成：ｍＰＥＧ_X−マレイミド
ｍＰＥＧ_X−ＮＨ₂（中間体５）は、さらに修飾して異なるマレイミド−誘導体（試薬３）を産生することができる。後者は、Method of Enzymology vol. ＸＸＶ １９１−１９９頁，Academic Press, Inc., Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．におけるBulterとHartleyの手順の適応を経て、ｍＰＥＧ_X−ＮＨ₂をマレイン酸無水物と反応させ、そして、この中間体（中間体６）をWunschら、Biol. Chem. Hoppe-Seyler, vol.３６６，５３−６１頁（１９８５）によって記述された方法を使用して、相当するＯ−（２−マレイミドエチル）−Ｏ′−メチルプロピルエチレングリコールへ閉環することによって達成された。
例１に対する付録
試薬１の合成
合成１からの出発物質、中間体、及び試薬の構造
出発物質：
モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ_X）に対する一般式：
ＣＨ₃Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−Ｈ
式中、Ｘは該ポリマーのキロドルトンにおける平均分子量を表し、ｎは反復するオキシエチレン基の平均数である。
中間体１：

中間体２：

試薬１：

試薬２の合成
合成２からの出発物質、中間体、及び試薬の構造
出発物質：
モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ_X）に対する一般式：
ＣＨ₃Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−Ｈ
式中、Ｘは該ポリマーのキロドルトンにおける平均分子量を表し、ｎは反復するオキシエチレン基の平均数である。
中間体３：

中間体４：

中間体５：

試薬２：

試薬３の合成
合成３からの出発物質、中間体、及び試薬の構造
出発物質：
中間体５：

中間体６：

試薬３：

例II．ＰＥＧ化天然ＩＬ−１ｒａのＩＬ−１ｒａの調整
天然のＩＬ−１ｒａのＰＥＧ化反応を最適化するために、種々のパラメーターを試験した。ＰＥＧ化の成功は、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＥＧ上２９キロドルトンにおける目視検査で単一のしっかりしたピークを与えること、及び分析イオン交換クロマトグラフによる単一な鋭いピークによってアッセイされた。特に断りがない限り、ＰＥＧ化反応は、ＩＬ−１ｒａに対するｍＰＥＧ試薬の比が２：１でｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ緩衝液中１mg／mlの天然ＩＬ−１ｒａで室温において行われた。これらの検討において使用された試薬は、ｍＰＥＧ−アミド−マレイミド（試薬２）であり、成績物は、ｍＰＥＧ_X ^*ＩＬ−１ｒａと呼ばれるが、結果は、３つの試薬すべてに対して適用できた。
Ａ．時間
質温におけるＰＥＧ化反応は、０．５時間から２４時間まで分析された。ＩＬ−１ｒａのＰＥＧ化型への変換は、２乃至４時間で完了（８０％−９０％）し、ｍＰＥＧ^*ＩＬ−１ｒａの質は、さらに長時間インキュベーションを行った後、増加も減少もしない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイされたｍＰＥＧ^*ＩＬ−１ｒａの質は、さらにバンドが現れることと、染色ゲル上のより高い分子量のスミアが生ずるために長時間において低下する。
Ｂ．温度
ＰＥＧ化反応を４°，２５°，３７°，及び５０°でインキュベートし、次に、０．５，１，２，４及び１７時間後に分析した。２５°と３７℃における反応は、１乃至２時間以内に多量（約５０％−８０％）のＰＥＧ化蛋白質を生成したが、４℃と５０℃における反応は、長時間においてさえ、はるかに低収率（１０％−２０％）の結果となった。ｍＰＥＧ^*ＩＬ−１ｒａの質は、温度とともに有意に変化しないようである。
Ｃ．蛋白質濃度
ＰＥＧ化反応は、５０μｇ／mlと１０mg／mlの間の蛋白質濃度（天然のままのＩＬ−１ｒａ）で行った。試験した濃度のすべてはよい結果を与え、ｍＰＥＧ^*ＩＬ−１ｒａの質には差がなかった。
Ｄ．ｐＨ
天然のままのＩＬ−１ｒａを、上述のｐＨ５．５と７．５の間の反応条件下でＰＥＧ化した。ｍＰＥＧ^*ＩＬ−１ｒａの品質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとイオン交換によると、低いｐＨ（５．５）において僅かによいが、交換の百分率は同じである。
Ｅ．天然のままのＩＬ−１ｒａに対するｍＰＥＧ−アミド−マレイミドの比率
我々は、天然のままのＩＬ−１ｒａに対するｍＰＥＧ−アミド−マレイミドの０．５：１から２０：１の間の比を試験した。約２：１より高い比率、ＩＬ−１ｒａのｍＰＥＧ化の形への効率的な変換（５０％−９０％）を生じた。しかし、５：１より大きな比は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での余分な高分子量バンドの増加、及びイオン交換クロマトグラフィーより、複数のピークを示す低質のｍＰＥＧ^*ＩＬ−１ｒａを生成する。
使用されたパラメーター内で得られたｍＰＥＧ^*ＩＬ−１ｒａの量と物質の質の両者についての最適反応条件は、ｍＰＥＧ−アミンに対するスルホ−ＳＭαの１：１比で生成したｍＰＥＧ−アミド−マレイミドを使用して、２：１ｍＰＥＧ−アミド−マレイミド／ＩＬ−１ｒａを２５℃で２−４時間であった。これらの条件でＩＬ−１ｒａの８０％−９０％は、ｍＰＥＧ５０００、またはｍＰＥＧ８５００のいずれかを出発物として合成された試薬を用いて、ＰＥＧ化した形に変換される（図３）。
Ｆ．ＩＬ−１ｒａＰＥＧ亜鈴の調整
ＩＬ−１ｒａを含む亜鈴複合体は、他のＰＥＧ化ＩＬ−１ｒａの分子種と同じ手順で作られる。ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０中のＩＬ−１ｒａに対する２−４モル過剰のビスマレイミドＰＥＧが使用される。ＩＬ−１ｒａについては、使用された分子量は、遊離で利用できるシステイン残基をもつ野生型であってよく、または本発明中に記述されたように調整されたムテインであってよい。ＩＬ−１ｒａは、２−５mg／mlの濃度においてである。反応は、４から６時間環境温度においてインキューベートされる。ＩＬ−１ｒａＰＥＧ亜鈴化合物は、０から１０００ｍＭ食塩へのグレーデイエントを使用し、２０−５０ｍＭＭＥＳ緩衝液中ｐＨ５．５におけるＭｏｎｏＳ陽イオン交換によってＰＥＧ化されていない、及び１つだけＰＥＧ化された分子種から精製される。それ以上の精製は、下記のように、BioRad ＴＳＫ２５０、またはSuperdex７５カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーによって達成することができる。
例III．ＰＥＧ化天然ＩＬ−１ｒａの精製
ｍＰＥＧ_X ^*ＩＬ−１ｒａの精製は、陽イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって達成することができる。これらの手順は、上述の３つの試薬すべてから誘導されたＰＥＧ化ＩＬ−Ｉｒａに適用できる。
Ａ．陽イオン交換クロマトグラフィー
ｍＰＥＧ_X ^*ＩＬ−１ｒａはＭｏｎｏＳ（ファルマシア）カラムを使用して、２０ｍＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．５で精製することができる。蛋白質は、同じ緩衝液中０から５００ｍＭ食塩の塩のグレーデイエントを使用して、カラムから溶出された。例えば、修飾されていないＩＬ−１ｒａは、２２０ｍＭＮａＣｌにおいて溶出し、一方純度は、分析用イオン交換クロマトグラフィー、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥをはじめとする種々の技術によって評価される。ｍＰＥＧ₅₀₀₀ＩＬ−１ｒａは、１６０ｍＭで溶出する（図４）。
Ｂ．サイズ排除クロマトグラフィー
約５２ｋｄとして挙動するｍＰＥＧ₅₀₀₀ ^*ＩＬ−１ｒａ、及び約６８ｋｄ（サイズ既知の標準品でのカラムの較正に基づく）として挙動するｍＰＥＧ₈₅₀₀ ^*ＩＬ−１ｒａは、未修飾のＩＬ−１ｒａ（１７ｋｄ）からSuperdex７５（ファルマシア）カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーによって、標準的なクロマトグラフィーの技術を用いて容易に分離することができる（図５）。
例IV：ｍＰＥＧ _X ^* ＩＬ−１ｒａの特徴付け
精製したｍＰＥＧ_X ^*ＩＬ−１ｒａはＭｏｎｏＳ上での再クロマトグラフィーを行うとき、単一の対称的ピークを与え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとサイズ排除クロマトグラフィー（図３と４）によって純粋のようであった。Ｉｌ−１ｒａと

のトリプシンマップを比較すると、ｃ１１６とｃ１２２を含むペプチドに相当する１つのピークを示し、これは結合体のマップには存在せず、新しい幅広いピークが現れた。この新しいピークをキモトリプシンでさらに消化し、そして、それに続くアミノ酸を分析することによって、ｃ１１６は、使用された条件下でＰＥＧ化されていたことが示された（図６）。
例Ｖ．ＩＬ−１ｒａムテインの調整
突然変異誘発は、バクテリオファージＭ１３にクローニングされたＩＬ−１ｒａの遺伝子からの一本鎖ＤＮＡ上で遂行された。Kunkelら、Method in Enzymology vol. １５４，３６７−３８２頁（１９８７）によって記述された手順を使用しているBioRadのMutagenキットが使用れさた。手短かに述べると、一本鎖ＤＮＡのテンプレートがdut とung 突然変位を含むE.coli．株を使用して生成され、その結果、チミジンの代りに、ウラシルを含むテンプレートを生じた。長さが２０と３０の塩基対の間の突然変異誘発オリゴヌクレオチドを、テンプレートに対してアニールし、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼを使用して、２番目のストランドが再合成された。反応混合物を使用して、その中では、ウラシルを含むストランドが、ＤＮＡ修復によって分解され、変異ストランドが複製できるようになっている、野生株E.coli．菌株を形質転換した。変異ファージをスクリーニングし、標準技術によって配列を決定した。変異遺伝子を含む断片を、次に、発現ベクターｐＴ５Ｔ（Eisenbergら、Naturevol.３４３，３４１−３４６頁（１９８９））中にサブクローンし、そしてＴ７発現システム菌株（E.coli．Ｂ１２１ＤＥ３）へと形質転換した。他のE.coli．発現システムも使用することができる。
発現クローンを、１５μｇ／mlテトラサイクリンを補添したLuria Broth中で、３７℃で生育させた。培養物が６００ｎｍで吸光度０．８に達したとき、３０℃に移行させ、ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭの濃度になるように加え、ＩＬ−１ｒａ遺伝子の発現を誘発した。ＩＬ−１ｒａの蛋白質の全蓄積量は、４−６時間後に最大となり、誘発後１２時間までは、有意に変化しなかった。
例VI：ＩＬ−１ｒａムテインの精製
上に記述したように、誘発された細胞培養物を、１００００ｇで１０分間遠心分離することによって収穫した。細胞を２０−５０mlｓのｐＨ５．２の３０ｍＭのナトリウムアセテート緩衝液中に再懸濁させた。溶菌は、１８０００ｐｓｉにおけるFrench Pressure cellを２回通過させることによって達成した。細胞溶解物を１００００ｇで１０分間遠心分離した。可溶部分をＳ−セフアロースカラム上にのせ、７５ｍＭのＮａＣｌを含む同じ緩衝液で洗浄した。ＩＬ−１ｒａムテインは、２００ｍＭＮａＣｌを含む同じ緩衝液で溶出した。イオン交換樹脂上を、ただ１回通過させると、ＰＥＧ化の検討には十分な純度（＞９５％）の成績物を生じた。それ以上の精製はＱ−セフアロースやＭｏｎｏＱのような他のイオン交換樹脂を使用して達成することができる。この手順は、いくつかのＩＬ−１ｒａムテインについて同様に首尾よく用いられた。ある場合には、アミノ酸配列の変化により、蛋白質の荷電に小さい変化が生じているムテイン類を精製するためにｐＨそして／または、食塩の濃度を僅かに変更することが必要であった。この技術分野に普通に熟達した人々において、容易に操作されるであろうこれらの僅かな変更とともに、この手順は、検討されたすべてのムテインに一般的に適用できる。
例VII：ＩＬ−１ｒａムテインのＰＥＧ化
天然のままのＩＬ−１ｒａの外に、ｃ８４ｓ１１６，ｃ８４ｃ１１６，ｃ０ｓ１１６，及びｃ９ｓ１１６のムテインがＰＥＧ化された。天然のままのＩＬ−１ｒａのために使用されたのと同じ条件を使用して、ｃ８４ｓ１１６とｃ８４ｃ１１６のＰＥＧ化形が産生され、精製された。ｃ８４ｃ１１６は、２つの反応生システインを含むので、ＰＥＧ化の結果、ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で、約４０ｋｄにおけるより高い分子量の蛋白質を生ずる。この蛋白質は、陽イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製されることができ、ＰＥＧ５０００を使用したときには、後者で約６８ｋｄの期待された分子量で溶出する。
例VIII：ｍＰＥＧ ^* ＩＬ−１ｒａの有効性
ＰＥＧ化さた自然のままのＩＬ−１ｒａ分子の有効性は、Ｓ³⁵−ＩＬ−１ｒａをリガンドとして使用する標準拮抗的受容体結合アッセイによって試験された。マウス１型ＩＬ−１ｒａ受容体を含むマウス細胞（ＥＬ４）、またはクローンド遺伝子からヒトタイプ１受容体を発現するハムスター細胞（ＣＨＯ）が、９６−ウエルミクロリッターディッシュ中で、それぞれ、ウエルあたり１×１０⁶細胞と、ウエルあたり１×１０⁵細胞で使用された。比放射能が、４０００Ｃｉ／ｍｍｏｌのＳ³⁵−ＩＬ−１ｒａを、１５０ｐＭの最終濃度になるように加えた。非放射性リガンドを２８ｍＭから１３ｐＭの連続希釈において加え、４℃で４時間インキュベートさせた。細胞は次に、ミリリッターフィルタープレート（Millipore，．５ミクロンポーアサイズDurapore filter）を通して濾過し、洗浄して非特異的に結合したカウントを取出し、フィルターを除去し、Ambis Radioanalytical Imaging System上でカウントした。平衡解離定数（ＫＤｓ）を計算し、そして、ＰＥＧ化された、及び修飾されていないＩＬ−１ｒａの型を比較するのに使用した。修飾されていない野生型のＩＬ−１ｒａとｃ８４ｓ１１６は、我々のアッセイにおいて、１５０−３００Ｍのタイプ１マウス受容体について等しいＫＤ′ｓを有していた。ＩＬ−１ｒａのＰＥＧ化形についてのＫＤは約４００−８０００ｐＭであり、ＰＥＧ化ｃ８４ｓ１１６に対しては、５００−１０００ｐＭであり、それぞれ、非修飾蛋白質のそれより２．５倍、及び３．５倍高い。１つ（ｃ６ｓ１１６）を除き、すべてのＰＥＧ化されていないムテインのＫＤｓは、天然のままの蛋白質の６５−１５０％以内であり、これは、アッセイの標準的誤差の範囲内である。表１記載。

データは無修飾Ｉｌ−１ｒａによって示された活性の百分率として示されている。標準偏差は１０％以内である。
例IX：ＰＥＧ化天然のままのムテインＩＬ−１ｒａ
いくつかのＰＥＧ化天然のまま、及びムテインのＩＬ−１ｒａ分子の薬物動態学的特性が分子をラットに静脈注射した後試験された。天然のままの、またはＰＥＧ化したＩＬ−１ｒａは静脈内ボーラス投与（３mg／kg）で注射された。連続の血液検体を尾静脈から採取し、天然のままの、またはＰＥＧ化したＩＬ−１ｒａについて酵素−結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイした。その結果得られた経時的血漿中濃度プロファイル（図８）は、ＰＥＧ化は、静脈注射後の血漿からのＩＬ−１ｒａの消失に著しい影響を有していることを物語っている。血漿中のＩＬ−１ｒａとＩＬ−１ｒａのＰＥＧ誘導体の消失は、３つの指数成分によって最もよく記述される。ラットにおいて、データによると、ＰＥＧ化はこれらの指数成分の半減期を６倍まで延長することが示されている（表２）。これらの指数成分の半減期は、ＰＥＧ分子のサイズが増加するにつれて増加する（表２）。その上、半減期の延長は、ＰＥＧ化の部位特異的であると考えられる証拠がある。図８のデータを解釈するために標準コンパートメント解析が使用された。半減期の延長は、受入れられた薬物動態学的理論に基づいて説明することができる。その理論によれば、薬物に対する血漿半減期は、薬物に対する血漿クリアランスと逆の関係にあり、そして、薬物のための見かけの分布容量に直接関係している。血漿からのＰＥＧ化ＩＬ−１ｒａの消失の薬物動態学的解析により、半減期の減少は、天然のままのＩＬ−１ｒａに比べて、ＰＥＧ化分子についての血漿クリアランスが減少したことと逆の関係にあることが示唆される（表２）。血漿クリアランスの減少は、腎臓によるＰＥＧ化分子の糸球体濾過の予想された減少と一致している。また、ＰＥＧ化による半減期の延長は、ＰＥＧ化分子の分布（Ｖｄ定常状態、表２）の増加に直接関係している。分布容積の増加は、ＰＥＧ化分子の細胞外プールへのＰＥＧ分子のより大きな透過を示している。この機作によって、ＰＥＧ化は、活性分子が全身的循環から、ＩＬ−１受容体が位置していると期待されるコンパートメントである血管外コンパートメントへ移動する程度が増加することによってＩＬ−１ｒａでの治療が改善される。ラットとヒトの間のＩＬ−１ｒａについてのクリアランスと分布の機作が類似しているため、ＰＥＧ化が、ヒトにおけるＩＬ−１ｒａの薬物動態学的特性を同様に改善することは明らかである。
１．ＰＥＧ化ＩＬ−１ｒａについてさらなる静脈内薬物動態学
８つのさらなるＰＥＧＩＬ−１ｒａのムテインについての静脈内薬物動態学が、前に記述された方法を使用して特徴付けられた。各分子についての静脈血漿中濃度の経時曲線を含むプロットが添付されている（図１０）。静脈内薬物動態学的データ（表３）のすべてを検討するとＰＥＧのサイズ（１こ結合か２こ結合）が増加するにつれて、血漿中クリアランスが減少し、そのため静脈内平均残存時間と血漿中ＩＬ−１ｒａ消失半減期が増加することが示された。ＰＥＧ化の部位は、ＰＥＧ化が平均血漿クリアランスを減少し、平均残存時間を延長する程度を決定する上で重要である。ＩＬ−１ｒａに２このＰＥＧｓを付加すると、野生型ＩＬ−１ｒａと比較して静脈内平均残存時間は１４倍延長される。
２．ＰＥＧ化Ｉｌ−１ｒａについての皮下薬物動態学
分子をラットに皮下注射した後、ＰＥＧ化ＩＬ−１ｒａムテインの吸収の薬物動態が特徴付けられた。連続血液検体を尾静脈から採取し、天然のままの、またはＰＥＧ化されたＩＬ−１ｒａについて酵素拮抗イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）よってアッセイした。その結果生じた皮下血漿ＩＬ−１ｒａの濃度の経時曲線が図１１にプロットされている。皮下薬物動態学的データ（表３）によってＰＥＧの部位とサイズに関連した、そして非最適化製剤における皮下注射に関連したＰＥＧ化ムテインについての変動性全身性アベイラビリティーが明らかになった。表３によって、またＰＥＧ化の皮下注射されたＩＬ−１ｒａについての平均残存時間に対する著しい正の影響が明らかとなっている。ＰＥＧのサイズが増加するにつれ、一般に平均残存時間は増加する。この増加は、おそらくリンパ性循環（より長い平均吸収時間）通じての分子量−サイズに関連したより遅い吸収、ならびにＰＥＧ分子が全身性循環（血漿）に到達した後のクリアランスの遅延のためであろう。この延長は深くヒトにおける皮下ＩＬ−１ｒａの薬物動態学的特性を改善する。

例Ｘ：３０ＫＤａのＴＮＦ阻害剤ムテインの調整
天然のままの残基について、蛋白質のアミノ末端とカルボキシル末端において、ならびに３つのグリコシル化部位すべてにおいて（図２においてみられるように、残基１，１４，１０５，１１１，及び１６１）、システインで置換が行われた。突然変異の誘発は、バクテリオファージＭ１３にクローニングされた３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤遺伝子からの一本鎖ＤＮＡ上で遂行された。この遺伝子は、１９９０年７月１９日に出願された米国特許出願Ｎｏ．０７／５５５，２７４に詳細に記述されている。突然変異は、Kunkelら（１９８７）によって記述されたように（例Ｖ参照）行われた。突然変異を誘発した遺伝子を単離し、発現ベクターｐＴ５Ｔ（Eisenbergら、Nature vol. ３４３，３４１頁（１９８９））にサブクローニングした。そして、Ｔ７発現システム株E.coli．ＢＬ２１ＤＥ３中へと形質転換された。３０ＫＤａ阻害剤ムテインを、天然の３０ＫＤａ ＴＮＦ−阻害剤について記述されたように精製し、たたみ直した。１９９０年７月１９日に出願した米国特許出願Ｎｏ．０７／５５５，２７４参照。たたみ直しは、精製した蛋白質を含む溶液にシステインを加えて行う。システインは、たたみ直しに役立ち、ムテイン中の遊離システインに“結合”する。
例ＸＩ：３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ムテインのＰＥＧ化
ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ムテインをたたみ直しの過程を通じて付着した余分のシステムを除去するために、環境温度で３０分間、ｐＨ７．０の５０ｍＭＨＥＰＥＳ中のモル濃度で６−倍過剰のＤＴＴに曝した。次に、ＤＴＴを除くために、蛋白質を抜気した５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０に対して２時間透析した。次にｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤を、モル濃度で５倍過剰のＰＥＧ化試薬１（例１Ａ参照）とｐＨ７．０の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中環境温度で２時間反応させた。ムテインの約６０％がＰＥＧ化形に変換された。
ｃ１０５ＰＥＧ化反応混合物をスーパーテックス−７５ＦＰＬＣカラム（ファルマシア）上にのせ、５０ｍＭトリスｐＨ７．０，１００ｍＭＮａＣｌ中０．２５ml／分で流した。ｃ１０５−ＰＥＧ３０ＫＤａＴＮＦ−阻害剤を含む画分をプールし、ＴＳＫ−２０００ＳＷＨＰＬＣカラム（Bio-Rad）上にのせ、同じ緩衝液中で、０．２ml／分で流した。銀で染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した実質的に純粋なｃ１０５−ＰＥＧ３０ＫＤａ ＴＮＦ−阻害剤をプールし、蛋白質濃度Bio-Rad蛋白質アッセイによって測定した。図９を参照。
活性は、１９９０年７月１９日に出願した米国特許出願Ｎｏ．０７／５５５，２７４に記述されたようにネズミＬ９２９細胞ＴＮＦ細胞毒性アッセイを使用して測定した。
例ＸII：ビス−マレイミドＰＥＧの調整
ＰＥＧのα−（２−アミノエチル）ω−アミノポリ（オキシエチレン）誘導体（以後、ビスアミノＰＥＧ）の合成は、３つの段階から成り立っていた：１）NilsonとMosbackによって（Nibsonら、Methods in Enzymology, vol.１０４，５６頁，Academic Press, Inc., Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８４）記述されたように、トレシルクロライドを使用する水酸基のスルホン化，２）トレシル化した中間体のフタルイミドによる置換（Pillaiら，J. Org. Chem. vol. ４５，５３６４頁（１９８０）），そして、３）ヒトラジンヒドラートのフタイルイミド中間体のアミンへの還元（Pillai, 上記）。出発物質、中間体、及び成績物の構造は、この例に対する付録１に示されている。２，４，６−トリニトロンベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）アッセイによって測定されたように、最適条件によって水酸基の約８０％の変換が可能であった。ビスアミノＰＥＧは、反応混合物から、イオン交換クロマトグラフィーによって精製することができる。これは、ダイマー形成を妨害しうる反応副産物を除去するための鍵となる段階である。
ビスアミノＰＥＧをマレイン酸無水物を使用してアシル化し（Butlerら、Method in Enzymology vol. ２５，１９１頁、Academic Press, Inc., Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９７２））、結果として得られた中間体を閉環して、α−（２−マレイミドエチル−ω−マレイミドポリ（オキシエチレン）（Winschら、Biol. Chem. Hoppe-Seylervol.３３６，５３頁（１９８５））を産生した。この誘導体は、マイケル付加を通じて、スルフヒドリル基と反応し、安定なチオエーテルを形成する。
例ＸIIに対する付録
出発物質
ポリエチレングリコールＰＥＧ_Xに対する一般式は
ＨＯ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−Ｈ
である。
式中、Ｘはキロドルトンにおけるポリマーの平均分子量を示し、ｎは反復するオキシエチン基の平均数である。
中間体１

中間体２

中間体３

中間体４

Ｏ−（２−マレイミドエチル）−Ｏ ¹ −メチル−ポレチレングリコール

例ＸIII：ｃ１０５ ３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ複合体についてのin vivoの結果
ＰＥＧ化ｃ１０５ ３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤分子種のうち４つの分子種の阻害効果を、in vivoで、ＴＮＦによって刺戟される２つの異なる生理作用について試験された。１つのエンドポイントは、静脈内にヒト組換え体ＴＮＦを注射したマウスの血漿中に、ＩＬ−６が出現することであった。２番目のエンドポイントはヒト組み換え体ＴＮＦの腹腔内投与後に腹腔への好中球の移動の増加であった。
実験１． ヒト組み換えＴＮＦと同時にｃ１０５ ３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤（ＰＥＧ_2,000，ＰＥＧ_3,500，ＰＥＧ_10,000）を静脈用投与すると、マウスの血漿中のＩＬ−６の誘導を阻害する。
体重が２０から２３ｇのＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを使用して、ヒト組み換え体ＴＮＦによる血漿ＩＬ−６水準の誘導を測定した。予備的実験では、２つの用量のヒト組換え体ＴＮＦ（図１２）の尾静脈からの静脈内投与後、血漿中に出現したＩＬ−６について経時的にプロットした。ピークＩＬ−６水準は、マウスあたり１０または２０μｇの組み換え体ＴＮＦでの刺戟後２時間で起った。その後の実験には、低い用量が使用された。
ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ₂₀₀₀亜鈴の力価をＰＥＧ化されていないｃ１０５ ３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤のそれと比較した。ヒト組み換え体ＴＮＦをマウスあたり１０μｇ用量において、単独またはＴＮＦ阻害剤と同時に静脈内に注射した。ＴＮＦに対する４つの異なる反応を試験した。（図１３）。その比を蛋白質含量に基いて計算した。各用量において３匹のマウスを試験した。ＩＬ−６濃度水準をＥＬＩＳＡによって測定した。
ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤もｃ１０５ ３０ＫＤａ阻害剤ＰＥＧ₂₀₀₀亜鈴もＴＮＦに対して１０：１及び５：１の比で投与したとき、ＩＬ−６水準のほぼ完全な阻害を生じた。１：１の比率においては、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ₂₀₀₀亜鈴は、ＴＮＦ単独によって刺戟されたＩＬ−６水準の９５％の減少を起したのに対し、ＰＥＧ化していないｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤は、ＩＬ−６を約７０％だけ減少させたに過ぎなかった。本実験の結果は、試験された比率において、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤もｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ₂₀₀₀亜鈴とともに、このＴＮＦによって刺戟された生理学的パラメーターのすぐれた阻害剤であることを示している。１：１の比率においてｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ₂₀₀₀亜鈴は、ＰＥＧ化されていない阻害剤よりも大きな百分率阻害を示した。
ＰＥＧ化、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤の２つの他の分子種を試験した。Ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ_3,500亜鈴とｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ_10,000亜鈴の阻害効果を血漿中ＩＬ−６誘導について試験した。該阻害剤をヒト組み換え体ＴＮＦと同時に１：１比率（ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤亜鈴：ＴＮＦ）で静脈内注射によって投与した。２つの阻害剤処置グループのそれぞれにおいて、３匹のマウスを試験した。１０匹のマウスにＴＮＦ単独で注射した。１：１の比率で投与したとき、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ_3,500亜鈴か、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ_10,000亜鈴のいずれかを注射したマウスの血漿中に検出され得るＩＬ−６は測定されなかったのに対し、ヒト組み換えＴＮＦ単独を注射したマウスにおいては、有意なＩＬ−６応答がひき出された。
２つの実験の結果は、刺戟に対して低比率（１：１）で投与されたとき、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ₂₀₀₀，ＰＥＧ_3,500，及びＰＥＧ_10,000亜鈴は、ヒト組み換え体ＴＮＦによる血漿中ＩＬ−６の誘導のすぐれた阻害剤であることを示す。
実験２．ヒト組み換え体ＴＮＦの腹腔内投与と同時に行ったｃ１０５ ３０ＫＤａ阻害剤（ＰＥＧ_3,500，ＰＥＧ_10,000，及びＰＥＧ_20,000）の皮下投与は、腹腔内における好中球の移動を阻害する。
体重２０ｇから２３ｇのＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを使用して、ヒト組換え体ＴＮＦで刺戟した後、好中球の腹腔内への移動を測定した。使用される技術は、Kim Mc Intyreら、（J. Exp. Med. vol. １７３，９３１頁（１９９１））のそれであり、ここでは手短かに述べる。マウスに０．１mlの容量のＴＮＦを腹腔内へ直接注射する。４時間後にマウスを屠殺し、死後直ちに腹腔内洗浄を行う。４mlのHankの平衡塩類溶液（ＨＢＳ）（カルシウムとマグネシウムを含まない）を腹腔内に注射する。腹部を静かにマッサージする。腹腔液を針と注射筒で吸引回収する。腹腔細胞の全数を、Coulterカウンター上で計数する。細胞懸濁液の一部量を、スライド上で乾燥し、Diffkwik染色を行う。細胞の分類計数は、直接顕微鏡検査によって行われる。１００この細胞を試験し、好中球、リンパ球、またはマクロファージとして分類する。
予備的実験において、パイロジエンを含まない食塩水か、７．５ｎｇヒト組み換え体ＴＮＦのいずれかの腹腔内投与の後に、洗浄液の組成を比較した。ＴＮＦは、好中球の百分率と腹腔洗浄液に存在する好中球の絶対数の増加をひき起した。食塩水で処理されたマウスでは、９．４×１０⁴の好中球が、洗浄液中に回収され、全腹腔細胞の２．３％を占めているに過ぎなかった。ＴＮＦ（７．５ｎｇ）処理マウスでは、好中球の総数は、１２．９×１０⁵まで増加し、好中球の百分率は１９．７％へと増加した。
ＰＥＧ化されていないｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤の力価も、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤（ＰＥＧ_3,500，ＰＥＧ_10,000，及びＰＥＧ_20,000亜鈴）と共に比較した。ＴＮＦの刺戟を、マウスあたり７．５ｎｇの一定に保ちつつ、阻害剤を１００：１，１０：１，及び１：１（ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤分子種：ＴＮＦ）の比率で試験した。比率は、蛋白質含量に基づいて計算した。マウスにはＴＮＦの腹腔内投与と同時に、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤を皮下注射した。６匹のマウスを、各投与群において試験した。４時間後に腹腔洗浄液を採取し、分析した。図１５に示された値は、腹腔洗浄液中の好中球の百分率である。ＰＥＧ化されていないｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤と、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤 ＰＥＧ_3,500亜鈴が、好中球移動を有意に阻害した最小濃度は、１００：１である。ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ_10,000とＰＥＧ_20,000亜鈴は、好中球移動を１０：１の比率で有意に阻害した。
本実験の結果は、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ_3,500，ＰＥＧ_10,000、及びＰＥＧ_20,000亜鈴は、腹腔へのＴＮＦ−促進好中球移動のすぐれた阻害剤であることを示している。ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ_10,000とＰＥＧ_20,000亜鈴は、ＰＥＧ化していないｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤、及びｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧ_3,500よりも強力であった。
例ＸIV：ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤ＰＥＧＤＢの調整と生物活性
合成
組み換え体ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤２−３mg／mlをモル濃度で４倍過剰のＤＴＴで環境温度で２時間処理する。次に、ＴＮＦ阻害剤を抜気した５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０に対して４０℃で３時間透析する。ＰＥＧに結合した亜鈴を創製するために、ＴＮＦ阻害剤を、ｐＨ７．０の５０ｍＭＨＥＰＥＳ中の異なるモル比のビス−マレイミドＰＥＧと反応させる。阻害剤は、等モル比ビス−マレイミドＰＥＧと反応する。反応は、環境温度で３−１２時間インキュベートされる。インキュベーション後、ＰＥＧと結合したＴＮＦ阻害剤亜鈴を、２６０ｍＭ、３１０ｍＭ、及び３５０ｍＭ食塩の段階的グレーディエントをかけて、ｐＨ４．０の５０ｍＭＨＯＡＣ中ＭＯＮＯ−ＳＦＰＬＣを使用して、ＰＥＧ化されていない、及びただ１つだけＰＥＧ化されたＴＮＦ阻害剤から精製する。ＰＥＧ−結合ＴＮＦ阻害剤亜鈴は、３１０ｍＭ食塩段階において溶出する。残存するＰＥＧ化されていないＴＮＦ阻害剤は、すべてスーパーデックス７５上のクロマトグラフィーによって除去される。
段階的試薬の添加
ＤＴＴ処理とｐＨ７．０の５０ｍＭＨＥＰＥＳへの透析の後、等モル量のビス−マレイミドＰＥＧを添加し、１．５時間のインキュベーションの後、もう１回等モル量のビス−マレイミドＰＥＧを添加する。これを１．５時間インキュベートする。これは、ＰＥＧ−結合亜鈴形成の最適水準につながる。次にＰＥＧ試薬のモル濃度で、２倍の過剰を添加し、最終ＰＥＧ−ＴＮＦ阻害剤の４：１の比率を与える。これを、２時間インキュベートし、混合物を５０ｍＭアセテートｐＨ４．０中に透析し、ＭｏｎｏＳクロマトグラフィーにかける。これは、主としてＰＥＧ−結合ダイマーと１つだけＰＥＧ化されたＴＮＦ阻害剤の混合物を生ずる。これによって、１つだけＰＥＧ化されたＴＮＦ阻害剤と亜鈴の間の方が、亜鈴とＰＥＧ化されていないＴＮＦ阻害剤の間よりも大きな分離が得られるため、ＰＥＧ−結合亜鈴のより効果的な精製ができるようになる。
この手順によって、亜鈴の生成が最適化され、より効率的な精製が可能となった。
段階反応：
ＤＴＴ処理と５０ｍＭＥＰＥＳｐＨ７．０の透析の後、モル濃度で８倍過剰のビス−マレイミドＰＥＧを添加する。これを環境温度において２時間インキュベートする。これにより実質的にすべてのＴＮＦ阻害剤がただ１つＰＥＧ化された形に変換される。１つだけＰＥＧ化された阻害剤は、ＮａＣｌのグレーディエントをかけ、ｐＨ４．０の５０ｍＭアセテート中でＭｏｎｏ−ＳＨＰＬＣを使用してＰＥＧ試薬と残存未反応ＴＮＦ阻害剤すべてから分離される。１つＰＥＧされた物質をｐＨ７．０の５０ｍＭＨＥＰＥＳ中へダイアフィルターし、２−４mg／mlまで濃縮した。ＤＴＴで処理したＴＮＦ阻害剤を、次に、ＰＥＧ−結合亜鈴の形成ができるように添加する。２時間後に、ＰＥＧ−結合亜鈴をＭｏｎｏ−ＳＨＰＬＣを使用して精製する。この方法は、２番目の異なる蛋白質化合物を添加することによって、ＰＥＧ結合へテロ亜鈴を形成するために使用できる。
この手順は、亜鈴形成を最適化し、ヘテロ亜鈴化合物の形成のために使用できる。しかし、この手順は幾分労力と時間がかかる。
ＰＥＧ−結合ＴＮＦ阻害剤−亜鈴の生物活性
ネズミＬ９２９細胞毒性アッセイにおいて、ｃ１０５ ３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤亜鈴がＴＮＦαの細胞毒性を阻害する能力を測定した。これによって、これらの分子についてＥＤ₅₀が測定できるようになった。
それらは以下の様である：
野生型ｒＴＮＦ阻害剤 ２２０ｎｇ／ml
ＢＭ−結合亜鈴 ２２０ｎｇ／ml
１９００ＭＷ ＰＥＧ−亜鈴 ４．１ｎｇ／ml
３５００ＭＷ ＰＥＧ−亜鈴 ４．８ｎｇ／ml
１０，０００ＭＷ ＰＥＧ−亜鈴 ４．６ｎｇ／ml
２０，０００ＭＷ ＰＥＧ−亜鈴 ４．２ｎｇ／ml
ＴＮＦ阻害剤亜鈴は、Ｌ９２９バイオアッセイにおいてＴＮＦβの細胞毒性を阻害する上でも活性が大きく増強された。ＴＮＦβに対するＥＤ₅₀値は以下の如くである。
野生型ｒＴＮＦ阻害剤 ７０μｇ／ml
３４００ＭＷ ＰＥＧ−亜鈴 ８０μｇ／ml
２０，０００ＭＷ ＰＥＧ−亜鈴 ２２μｇ／ml
例ＸＶ：ＰＥＧ化３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤の薬物動態
１．ＰＥＧ化３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤についての静脈内薬物動態
いくつかのＰＥＧ化３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤分子の薬物動態的特徴が、ラットに対する分子の静脈内投与後決定された。天然のままの、またはＰＥＧ化ＴＮＦ阻害剤を静脈内ボーラス投与として注射した。連続血液検体を尾静脈から採取し、ＰＥＧ化されていないか、ＰＥＧ化されたＴＮＦ阻害剤について酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイした。結果として得られた静脈内血漿中ＴＮＦ阻害剤濃度の経時変化のプロファイル（図１６）は、ＰＥＧ化が、静脈注射後の血漿からのＴＮＦ阻害剤の消失について著しい影響があることを説明している。統計学的モーメント理論（曲線化面積〔ＡＵＣ〕と初期モーメント曲線下面積を使用して図１６のデータを解釈した。データは、ＰＥＧ化がＴＮＦ阻害剤の静脈内平均残存時間をラットにおいて５０倍まで延長することを示している（表４）。静脈内平均残存時間は、結合したＰＥＧ分子の大きさが増加するにつれて増加する（表４）理論によって特定されていないけれども、平均残存時間の延長は、ある薬剤についての静脈内平均残存時間は、その薬剤についての血漿クリアランスと逆の関係にあり、薬剤のみかけ上の分布容積に直接関係すると述べる在来の薬物動態学的理論に基づいて説明することができる。血漿からのＰＥＧ化ＴＮＦ阻害剤の消失の薬物動態学的解析は半減期の延長は、ＰＥＧ化されていないＴＮＦ阻害剤にくらべて、ＰＥＧ化された分子についての血漿クリアランスの減少と逆の関係にある（表４）。血漿クリアランスの減少は腎臓による糸球体濾過における期待されたＰＥＧ分子サイズ関連減少と一致している。ＴＮＦ阻害剤に対する血漿クリアランスの機作におけるラットとヒトの間に、おそらく質的な類似性があるために、ＰＥＧ化がヒトにおいてＴＮＦ阻害剤薬物動態学的性質を改善することは明らかである。
２．ＰＥＧ化３０ＫＤａ ＴＮＦ阻害剤についての皮下薬物動態
ＰＥＧ化ＴＮＦ阻害剤の吸収薬物動態学がラットに分子を皮下注射した後特徴付けられた。連続血液検体を尾静脈から採取し、ＰＥＧ化されていないか、ＰＥＧ化されたＴＮＦ阻害剤の濃度を、経時的にアッセイし、図１７にプロットされている。皮下薬物動態学的データ（表４）から、ＰＥＧの大きさと関係したそして非−最適化製剤における皮下注射と関係したＰＥＧ化分子についての変動性の全身性アベイラビリティーが明らかになっている。表４から、皮下注射したＴＮＦ阻害剤についての平均残存時間に関するＰＥＧ化の陽性の影響も明らかになっている。ＰＥＧのサイズが大きくなるにつれて一般的に平均残存時間は増加する。理論によって特定されてはいないが、この増加は、リンパ循環（より長い平均吸収時間）を通じてのサイズ−関連のより遅い吸収ならびに、ひとたびＰＥＧ化した分子が血漿に達すると、クリアランスが遅延される結果であるらしい。この延長は深く、ヒトにおける皮下ＴＮＦ阻害剤の薬物動態学的特徴を改善する。
例ＸVI．ＰＥＧ蛋白質の溶解性
ＩＬ−１ｒａ
溶解度の検討の結果は、図１８に示されている。溶解度曲線は、ＩＬ−１ｒａの３つの異なる調整物及びＩＬ−１ｒａＰＥＧ₈₅₀₀について示されている。実験は、ミクロリッタープレート中で３７℃で行われ、すべての蛋白質は１６０mg／mlであった。プレートは、カバーでシールされ、次にプレートリーターにより、種々のタイムポイントで、４０５ｎｍにおいて読まれた。吸光度の増加は、蛋白質の沈澱の証拠である。天然のままのＩＬ−１ｒａに比べて、ＰＥＧ検体については、明らかに溶液から析出する蛋白質の量の減少がみられた。
３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤
天然のままの３０ＫＤａＴＮＦ阻害剤は、５mg／mlを超える濃度まで濃縮できない。ＰＥＧ化の後、溶解度は少くとも５倍増加した。
例ＸVII：ＩＬ−２阻害剤ヘテロ亜鈴の調整
ＰＥＧ−結合へテロ亜鈴は、最初にＩＬ−２ｒαを過剰のビス−マレイミドＰＥＧの存在下で、ＰＥＧ化することによって形成することができる。１つだけＰＥＧ化されたＩＬ−２ｒαを精製することができ、そして、ＩＬ−２ｒβを加えて残存反応性マレイミド基と反応させ、ヘテロダイマーを形成させることができる。
ＩＬ−２ｒαのＰＥＧ化の潜在部位には、アミノ及びカルボキシ末端残基、２つのＮと結合したグリコシル化部位ならびに分子中の天然のままの遊離システイン残基が含まれる。ＩＬ−２ｒαの可溶性ＩＬ−２ｒαの細胞外ドメイン中の１９２位のシステイン残基はジスルフィド結合に関与していないことが同定されている。
（Miedelら、ＢＢＲＣ,Vol. １５４，３７２頁（１９８８））。このシステイン残基は、ＩＬ−２ｒαに対するＩＬ−２の結合に影響しない抗−ＩＬ−２ｒαモノクローナル抗体のエピトープ中に横たわっている（Lorenzoら、J. mmunology, vol.１４７，２９７０頁（１９９１））。このことは、この残基は、ＩＬ−２ｒαの活性に影響することなく、ＰＥＧ化を行うそれらしい候補であることを示唆している。
ＩＬ−２ｒβについては、潜在部位には、アミノ末端、カルボキシ末端の両方、４つのＮ−結合グリコシル化部位、及びネズミエリスロポイエチン受容体（Yoshimura， LongmoreとLodish, Nature, vol.３４８，６４７頁（１９９０））における生物学的に有意な領域に類似している領域（ａ．ａ．＃１０８−１１８）が含まれる。受容体中の他の残基の点突然変異解析によっても、ヘテロ亜鈴分子中において最適の性質を生ずるＰＥＧ化の他の部位の同定ができるかもしれない。
例ＸVIII：補体系の古典的な経路を阻害するヘテロ亜鈴の調整
補体系を調節する多くの蛋白質が同定されクローニングされた。それらの若干は膜蛋白質である。膜蛋白質の１つは、ＣＲ１（補体受容体１）と呼ばれる。ＣＲ１の可溶形は、疾患のin vivo モデルにおいて検討されている。この穂体の阻害剤は、虚血後の心筋炎症と壊死（Weismanら、Science, vol. １４９，１４５−１５１頁，１９９０），逆受身アルサス反応（Yetら、J. Immunology, vol. １４６，２５０−２５６頁（１９９１）），同種異系移植の拒絶（Pruttら、J. Surgical Research,vol.５０，３５０−３５５頁（１９９１））を阻害する。
可溶性ＣＲ１はＣ３ｂとＣ４ｂに結合する。それは、３０の短いコンセンサスリピート配列（ＳＣＲ）から成っている。ＳＣＲの多くは、１つの可能なグリコシル化部位と４このシステインを含んでいる。システインのすべてはジスルフィド結合に関与しているらしい。ＳＣＲｓ１−４は、Ｃ４ｂ結合に関与することが見出されている。ＣＲ１の２つの別々の部分、ＳＣＲｓ８−１１とＳＣＲｓ１５−１８がＣ３ｂとの結合に関与している（Klicksteinら、J. Exp. Med., vol.１６８，１６９９−１７１７頁（１９８８）；Kalliら、J. Exp. Med.Vol.１７４，１４５１−１４６０頁（１９９１））。本発明によれば、ＣＲ１のＣ４ｂ結合ドメインとＣ３ｂ結合ドメインを含むヘテロ亜鈴を産生することが可能である。
ＣＲ１のＣ４ｂ結合及びＣ３ｂ結合ドメインはＰＣＲを使用してクローニングを行うことができる。これらのＳＣＲｓは１から５までのＳＣＲｓ（Ｃ４ｂ結合）、及び８から１２までのＳＣＲｓ（Ｃ３ｂ結合）である。これらのＳＣＲｓをコードする遺伝子は、E.coli．の発現ベクターにおいてクローニングすることができる。E.coli．で発現された蛋白質はたたみ直され、精製されることができる。たたみ直しの成否は、ポリＣ３ｂ、またはポリＣ４ｂとの結合能によって分析することができる。これらの遺伝子についてのin vitro突然変異誘発を行い、天然のままのアミノ酸残基をシステインに置換することができる。これらのシステインを、次に、ＰＥＧ分子を結合するのに使用することができる。ＰＥＧ化の可能性としての部位は、グルコシル化部位、またはＳＣＲ５とＳＣＲ１２のカルボキシ末端残基であろう。カルボキシ末端残基に対して余分のシステインを含むＣ４ｂと結合し、Ｃ３ｂと結合するドメインを構築し、ＰＥＧ分子をつなぐために使用することができるであろう。ＰＥＧ結合へテロ亜鈴は、例１４の２段階過程によって製造することができる。精製は、イオン交換クロマトグラフィーによって行うことができる。
例ＸIX：ＩＬ−１ｒａビス（マレイミド）−血小板由来生長因子ペプチドＰＥＧヘテロ亜鈴の合成
血小板由来生長因子（ＰＤＧＦ）ペプチド
ＹＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰＴ
は、Khachigian, L.ら、J. Bior. Chem., vol.２７６，１６６０−１６６６頁（１９９１）に記載されている。末端Ｃを加えて、マレイミドへ結合できるようにした。
ヘテロ亜鈴を２段階で合成した。第１段階においては、３μｌの０．０５ＭＨepes緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁させた１．６ナノモルのＩＬ−１ｒａに１１μｌの同じ緩衝液に溶かした６．４ナノモルのビス−マレイミドＰＥＧ₁₉₀₀を混合させた。この反応は、２０℃で３０分間行った。２番目の段階においては、４μｌの０．２Ｍナトリウムホスフェート緩衝液、ｐＨ７．０に溶かした３２ナノモルのＰＤＧＦペプチドを最初の反応の成績物に加えた。反応を、２０℃で１時間進行させた。次に、反応を３０μモルの２メルカプトエタノールを含む等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を添加することによって終結させた。
反応の最初の段階の成績物、そして、完了した２段階反応の成績物、ならびに適切な分子量のマーカーの試料を、１５％ポリアクリルアミドゲル上ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そのとき、クーマシーブルーで染めた。２番目の段階の反応は、ヘテロ亜鈴の予知されたサイズと一致したさらなるバンドを与えた。２段階反応によって、出発物ＩＬ−１ｒａの約３３％が、ヘテロ亜鈴に変換された。
反応の最初の段階の成績物は、樹脂Ｓ−セファロース上で、陽イオン交換クロマトグラフィーによって単離することができる。ヘテロダイマーは、該ペプチド中に塩基性アミノ酸が豊富なため、陽イオン交換クロマトグラフィーによって単離することができると考えられる。
本発明の教えの特定の発現系、またはＰＥＧ試薬への適用は、ここに含まれる教えに照らして、本分野において、普通の熟練した技術をもった人々の能力の範囲内にあることを理解すべきである。したがって、この分野で普通の熟練した技術をもった人々にとっては、様々な修飾と変化が、本発明の過程と成績物においてなされ得ることは明らかである。本発明は、添付した請求とその等価値の範囲に入ることを条件として、これらの修飾と変化を網羅するよう意図されている。

Claims (5)

1. 式Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂の化合物であって、式中、Ｘはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のスペーサーであり、Ｒ₁とＲ₁とは該ＰＥＧのスペーサーに共有結合しており、
   Ｒ₁とＲ₂の両方が、ＦＩＧ．２に示される３０ｋＤａＴＮＦ阻害剤のｃ１０５ムテインであり、１０５位のシステインを介してＰＥＧと結合しているか、あるいは
   Ｒ ₁ とＲ ₂ の両方が、ＦＩＧ．１に示されるＩＬ−１ｒａのｃ８４ムテインであり、該８４位のシステインを介してＰＥＧと結合しており、ＰＥＧの分子量は２００００であるか、あるいは
   Ｒ ₁ が上記ＩＬ−１ｒａのｃ８４ムテインであり、Ｒ ₂ が上記ＩＬ−１ｒａであり、Ｒ ₁ は８４位の、またＲ ₂ は１１６位のシステインを介してＰＥＧと結合しており、ＰＥＧの分子量は８５００である、
   上記化合物。
2. Ｒ₁とＲ₂が各々該ポリエチレングリコールのスペーサーにチオエーテル結合によって共有結合している請求項１記載の化合物。
3. 請求項１記載の化合物の調製方法であって、
   Ｒ₁とＲ₂とを、システインアミノ酸残基と反応するとチオエーテル結合を形成することができる少なくとも二つの反応性基を有するポリエチレングリコールの基と反応させて前記Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂化合物を形成するか、あるいは
   Ｒ₁を、システインアミノ酸残基と反応するとチオエーテル結合を形成することができる少なくとも二つの反応性基を有するポリエチレングリコール基と反応させてＲ₁−Ｘ複合体を形成し、該Ｒ₁−Ｘ複合体をＲ₂と反応させて前記Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂化合物を形成し、必要に応じて該Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂化合物を単離することからなる上記方法。
4. 請求項１記載の化合物の調製方法であって、
   部位指向性突然変異誘発によって該ポリペプチドをコードする遺伝子を変更して、少くとも１つの非天然システイン残基を含む該ポリペプチドのムテインをコードする遺伝子を創製すること；
   細菌の発現系において、該変更遺伝子を発現させること；
   発現された該ムテインを精製すること；
   該ムテインを、スルフヒドリル基を含む化合物の存在下でたたみ直すこと；
   たたみ直した該ムテインを、穏やかな還元剤で還元し、該非天然システインを遊離させること；そして、
   該ムテインを、スルフヒドリル基に特異的な活性化基を含むポリエチレングリコール基と反応させること、からなる上記方法。
5. 請求項１又は２記載の化合物を含むＴＮＦ媒介疾患及び／又はＩＬ−１媒介疾患の治療用又は予防用薬剤。

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