DE60022336T2

DE60022336T2 - Vefahren zur herstellung von peptiduntereinheiten aus polymer-proteinen

Info

Publication number: DE60022336T2
Application number: DE60022336T
Authority: DE
Inventors: Naoyuki Kawasaki-shi Fukuchi; Shunsuke Kawasaki-shi KAGEYAMA; Morikazu Kawasaki-shi Kito; Takashi Kawasaki-shi Kayahara; Hiroshi Kawasaki-shi YAMAMOTO
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-04-02
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2020-04-01
Also published as: ATE303400T1; US7270972B1; JP4670150B2; EP1172372A4; CA2369869C; EP1172372B1; DE60022336D1; AU3458600A; EP1172372A1; CA2369869A1; WO2000059926A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer Peptid-Untereinheit, die aus einem oligomeren Protein stammt, das Disulfidbrücken innerhalb einer Untereinheit und zwischen Untereinheiten besitzt, und eine durch dieses Verfahren hergestellte Peptid-Untereinheit.
Stand der Technik
Für Lebensaktivitäten von Organismen sind Proteine mit verschiedenen physiologischen Aktivitäten erforderlich. Viele dieser physiologisch wirksamen Proteine besitzen in ihren Molekülen eine Disulfidbrücke. Sie kommen auch als Oligomere vor, wie beispielsweise Dimere, zusammengesetzt aus homogenen oder heterogenen Peptidketten, und werden in einem solchen Zustand biosynthetisiert, dass eine Disulfidbrücke zwischen den Peptidketten gebildet wird. Während das Vorliegen eines Dimers für viele physiologisch wirksame Proteine, die als Dimer vorliegen, zum Ausdruck ihrer biologischen Aktivität von essenzieller Bedeutung ist, sind Proteine, für die nicht notwendigerweise erforderlich ist, dass sie Dimere sind, ebenfalls bekannt.
Als Beispiele für Proteine, für die zwingend erforderlich ist, dass sie ein Dimer sind, um ihre physiologische Aktivität zu exprimieren, kann der aus Blutplättchen stammende Wachstumsfaktor (platelet-derived growth factor, PDGF) usw. angeführt werden. Da jede Peptidkette eines Dimers an jede Peptidkette eines Rezeptors, das ebenfalls ein Dimer ist, gebunden werden muss, ist es wesentlich erforderlich, dass das Protein ein Dimer ist, damit es seine physiologische Aktivität exprimiert (C.H. Heldin et al., Cell. Regul., 1, Seiten 555–566, 1990).
Jedoch ist auch bekannt, dass in manchen physiologisch wirksamen Dimerproteinen eine Peptidkette (Untereinheit) als verantwortlich für eine Aktivität der Bindung an einen Rezeptor, eine enzymatische Aktivität usw. angesehen wird, während die andere Peptidkette als wichtig für Stabilität, Löslichkeit, Biosyntheseprozesse usw. des Proteins angesehen wird. Das heißt, es ist nur eine einzige Untereinheit für die Exprimierung der wesentlichen physiologischen Aktivität erforderlich. Zum Beispiel ist berichtet worden, dass Activin, obwohl Aktivin im lebenden Körper als Homodimer oder als Heterodimer vorliegt, noch eine Aktivität der Bindung an seinen Rezeptor besitzt und ungefähr einige Prozent seiner biologischen Aktivität aufrechterhält, sogar wenn es als Monomer vorliegt (P. Husken-Hindi et al., J. Biol Chem., 269, Seiten 19380–19384, 1994). Es ist auch berichtet worden, dass das prothoracicotrope Hormon (PTTH), welches in Insekten vorkommt und eine physiologische Wirkung besitzt, im lebenden Körper als Homodimer vorliegt, aber ungefähr 50 % seiner biologischen Aktivität in seinem Monomer aufrechterhalten wird (J. Ishibashi et al., Biochemistry, 33, Seiten 5912–5919, 1994). Des Weiteren ist bekannt, dass, obwohl Immunoglobulin G (IgG) ebenfalls ein Dimer ist, seine Antigen-bindende Eigenschaft in seinem Monomer aufrechterhalten wird (G.M. Edelman, Biochemistry, 7, Seite 1950, 1968).
Wie oben beschrieben, besitzen manche Dimerproteine, die physiologische Aktivitäten im lebenden Körper aufweisen, ihre physiologischen Aktivitäten sogar wenn sie als Monomer vorliegen. Des Weiteren werden die Monomere mancher Dimerproteine an ihre Rezeptoren gebunden, obwohl die Proteine ihre physiologischen Aktivitäten nicht aufweisen, wenn sie als Monomer vorliegen. Daher wird angenommen, dass, wenn ein Protein, das als Dimer existiert, als Monomer erhalten wird, das Protein eingesetzt werden kann als Protein mit einer physiologischen Wirkung oder als Protein zur Inhibierung einer physiologischen Wirkung eines ursprünglich physiologisch wirksamen Proteins, aufgrund der Bindung an seinen Rezeptor, um die Bindung des ursprünglich physiologisch aktiven Proteins zu inhibieren, obwohl es die physiologische Wirkung nicht besitzt.
Des Weiteren sind viele Fälle bekannt, in denen Proteine, die von verschiedenen Tierarten produziert werden, in anderen Tierarten eine physiologische Aktivität aufweisen. Zum Beispiel ist bekannt, dass Hirudin, das ein aus der Speichelflüssigkeit von Blutegeln isoliertes Protein ist, an Thrombin, das ein Gerinnungsfaktor im Blut ist, gebunden wird, und dadurch dessen Proteaseaktivität inhibiert. Proteine, wie beispielsweise Disintegrin und CHH-B, die an einen Plättchenrezeptor gebunden werden, und dadurch die Aggregation von Blutplättchen inhibieren, sind ebenfalls als aus Schlangengift stammende Proteine bekannt. Unter solchen heterogenen Proteinen ist CHH-B ein Protein, das an Glykoprotein Ib (GPIb), einem Glykoprotein auf der Blutplättchenmembran, gebunden wird und dadurch die Aggregation von Blutplättchen inhibiert. Es ist berichtet worden, dass CHH-B ein Heterodimer ist, und dass sein Monomer ebenfalls seine GPIb-bindende Aktivität und die Aggregation von Blutplättchen inhibierende Aktivität im Vergleich zu jenem des Heterodimers gleichwertig aufrechterhält. (N. Fukuchi et al., WO 95/08573).
Das heißt, es wird angenommen, dass ein solches Monomer eines physiologisch wirksamen Proteins, das wie oben beschrieben als Dimer biosynthetisiert wird, als wirksames Protein (Agonist) oder als eine Wirkung inhibierendes Protein (Antagonist) eingesetzt werden kann und als therapeutisches Mittel für verschiedene Krankheiten nützlich wäre.
Jedoch gibt es zwei Hauptprobleme bei der Erlangung eines Proteins, das als Dimer ursprünglich biosynthetisiert wird und im lebenden Körper vorliegt, in der Form eines Monomers, in dem seine dreidimensionale Struktur in einem solchen Ausmaß aufrechterhalten wird, dass es stabil sein sollte und wenigstens seine biologische Aktivität aufweisen sollte.
Das erste Problem ist, dass die Herstellung eines Monomers schwierig ist. Zwei wichtige Verfahren werden weithin eingesetzt, um ein Protein, das ursprünglich als Dimer vorliegt, als Monomer zu erhalten. In einem Verfahren wird ein Dimerprotein partiell reduziert, um nur eine Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten zu spalten, und dann werden neu generierte, freie Thiolgruppen blockiert. Im anderen Verfahren wird ein Cysteinrest, der an einer Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten beteiligt ist, durch ein molekularbiologisches Verfahren durch einen Alaninrest oder einen Serinrest ersetzt, und es wird dann ein Monomer hergestellt, indem ein Proteinsynthesesystem unter Verwendung einer tierischen Zelle oder dergleichen eingesetzt wird. Wie für die obengenannten Proteine wird das erstere Verfahren für PTTH, CHH-B und IgG eingesetzt, während das letztere Verfahren für Aktivin und CHH-B eingesetzt wird. Im ersteren Verfahren hat es, weil es schwierig ist, Bedingungen zur Spaltung nur der Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten in manchen Proteinen zu bestimmen, wenige Fälle gegeben, in welchen ein Monomer unter Aufrechterhaltung der Aktivität erhalten wurde. Im letzteren Verfahren muss der Cysteinrest, der an der Disulfidbrücke zwischen den Einheiten beteiligt ist, im voraus identifiziert werden, und es muss daraufhin des Weiteren eine Punktmutation in das erhaltene Gen eingeführt werden. Daher ist dies ein kompliziertes Verfahren.
Das zweite Problem ist, dass Antigenität vorkommen kann. Wenn ein Protein, das im lebenden Körper als Dimer vorkommt, als Monomer erhalten wird, kann Antigenität zum Ausdruck kommen, weil eine Region, die ursprünglich im Inneren des Moleküls war, außen aufgedeckt wird und als heterogenes Protein erkannt werden kann. Zusätzlich hierzu kann im ersten Verfahren zur Herstellung eines Monomers, bei dem Thiolgruppen nach der Reduktion blockiert werden, eine zur Blockierung verwendete Verbindung Antigenität aufweisen. Des Weiteren kann im zweiten Verfahren, bei dem eine Mutation eingeführt wird, eine Teilstruktur, die die mutierte Aminosäure enthält, ebenfalls Antigenität aufweisen. Des Weiteren weist ein aus einer anderen Tierart stammendes Protein generell Antigenität auf, und ein als Monomer erhaltenes Protein hat ebenfalls ein ähnliches Problem der Expression von Antigenität.
Mittlerweile ist gut bekannt, dass die Antigenität eines Proteins durch Polyethylenglykolierung herabgesetzt werden kann (Bioconjugate Drugs, Drug Development, fortgesetzt, Special Issue, herausgegeben durch Inada und Tanimoto, Hirokawa Shoten, 1993; A. Abuchowski et al., J. Biol. Chem., 252, Seiten 3578–3581, 1997). Insbesondere hat es viele Berichte gegeben über Verfahren unter Verwendung von Polyethylenglykol mit einer funktionellen Gruppe, die an eine freie Thiolgruppe eines Cysteinrests gebunden wird, um die Zahl der Polyethylenglykolmoleküle, die an ein Protein gebunden sind, sowie ihre Bindungsstellen zu limitieren (G.N. Cox et al., WO98/32003; G.N. Cox et al., WO94/12219; R.J. Goodson, US-Patent 5,206,344; L.G. Armes, WO92/16221). Allerdings wird in all diesen Verfahren ein Cysteinrest künstlich in einen Teil des Proteins eingefügt oder ersetzt. Es hat keine Berichte darüber gegeben, dass ein nützliches Protein erhalten wurde, indem Polyethylenglykol an eine freie Thiolgruppe gebunden wurde, ohne dass eine Aminosäure in einer Untereinheit, die ursprünglich ein Dimer bildet, künstlich ersetzt wurde.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf die obengenannten Probleme vollzogen, und eine ihrer Aufgaben ist, ein Verfahren bereitzustellen, zum leichten Erhalten, als Monomer, einer Untereinheit mit einer biologischen Aktivität in einem Protein, das ursprünglich als Oligomer, wie beispielsweise ein Dimer vorliegt, und zur gleichzeitigen Verminderung ihrer Antigenität.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben, um die vorgenannte Aufgabe zu lösen, gewissenhaft Untersuchungen angestellt. Als Ergebnis haben sie gefunden, dass, wenn eine Untereinheit, aus der ein oligomeres Protein aufgebaut ist, neu gefaltet wurde, indem die Untereinheit mit einem Mittel, das Proteine denaturiert, denaturiert wurde und daraufhin das Denaturierungsmittel entfernt wurde, wenn die Untereinheit in Anwesenheit von Polyethylenglykol mit einer funktionellen Gruppe, die an einen Cysteinrest binden konnte, neu gefaltet wurde, ein Peptid-Monomer erhalten werden konnte, das die ursprüngliche Aktivität der Untereinheit beibehielt und eine verminderte Antigenität aufwies. Somit haben sie die vorliegende Erfindung vollzogen.
Die vorliegende Erfindung stellt das folgende bereit.

(1) Verfahren zum Herstellen einer Peptid-Untereinheit, die aus einem oligomeren Protein mit Disulfidbrücken innerhalb einer Untereinheit und zwischen Untereinheiten stammt, welches die folgenden Schritte umfaßt:
(a) den Schritt des Entfaltens der Peptid-Untereinheit durch Denaturieren des oligomeren Proteins oder dessen Peptid-Untereinheit in einer Lösung mit einem Proteine denaturierenden Mittel und das Entfernen des Denaturierungsmittels aus der Lösung in Gegenwart eines Polyoxyalkylpolyethers mit einer funktionellen Gruppe, die mit einer Thiolgruppe reagiert; und
(b) den Schritt des Isolierens der Peptid-Untereinheit, die an den Polyoxyalkylpolyether gebunden ist, aus der Lösung.
(2) Verfahren gemäß (1), wobei die Peptid-Untereinheit, die in Schritt (b) isoliert wird, verminderte Antigenität aufweist.
(3) Verfahren gemäß (1), wobei das oligomere Protein ein Dimer ist.
(4) Verfahren gemäß (1), wobei der Polyoxyalkylpolyether mit der funktionellen Gruppe, die mit der Thiolgruppe reagiert, Polyethylenglycol mit einer Maleimidgruppe ist.
(5) Verfahren gemäß (1), wobei die Peptid-Untereinheit, die aus dem oligomeren Protein stammt, ein rekombinantes Protein ist.
(6) Verfahren gemäß (1), wobei das oligomere Protein oder dessen Peptid-Untereinheit unter reduzierenden Bedingungen denaturiert wird.
(7) Verfahren gemäß (1), wobei die physiologische Aktivität des oligomeren Proteins aus einer Peptid-Untereinheit hervorgeht, die das oligomere Protein bildet, und die Peptid-Untereinheit, die an den Polyoxyalkylpolyether gebunden ist, die physiologische Aktivität aufweist.
(8) Verfahren gemäß (1), wobei die Peptid-Untereinheit, die an den Polyoxyalkylpolyether gebunden ist, die Aktivität besitzt, die physiologische Aktivität des oligomeren Proteins zu inhibieren.
(9) Verfahren gemäß (1), wobei der Polyoxyalkylpolyether an einen Cysteinrest der Cysteinreste in der Peptid-Untereinheit gebunden ist, der ursprünglich an der Bildung einer Disulfidbrücke zwischen den Untereinheiten in dem oligomeren Protein beteiligt ist.
(10) Verfahren gemäß (1), wobei die an den Polyoxyalkylpolyether gebundene Peptid-Untereinheit eine Disulfidbrücke hat, die mit einer Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit in dem oligomeren Protein identisch ist.
(11) Peptid-Untereinheit, die aus einem oligomeren Peptid mit Disulfidbrücken innerhalb einer Untereinheit und zwischen Untereinheiten stammt, worin Polyoxyalkylpolyether an ein Cystein-Protein, das ursprünglich an der Bildung einer Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten des oligomeren Proteins beteiligt ist, zwischen Cysteinresten in der Peptid-Untereinheit, gebunden wird, und die Peptid-Untereinheit eine verminderte Antigenität aufweist.
(12) Peptid-Untereinheit gemäß (11), worin das oligomere Protein ein Dimerpeptid ist, das aus Schlangengift stammt und die Aktivität besitzt, die Bindung von von-Willebrand-Faktor an Blutplättchen zu inhibieren.
(13) Peptid-Untereinheit gemäß (12), worin das Schlangengift Schlangengift von Crotalus horridus horridus ist.
(14) Peptid-Untereinheit gemäß (12), die antithrombotische Aktivität aufweist.
(15) Peptid-Untereinheit gemäß (14), die ein Peptid mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist und einen an den Cysteinrest der Aminosäure der Nummer 81 in der Aminosäuresequenz gebundenen Polyoxyalkylpolyether aufweist, oder ein Derivat davon.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Herstellungsverfahren des Vektors pTrcASWT, welcher Wild-Typ-AS1051 (AS1051-WT) exprimiert.
2 zeigt ein Herstellungsverfahren des Vektors pTrcASAla, welcher Varianten-Typ-AS1051 (AS1051-Ala) exprimiert, in welchem ein Cysteinrest durch einen Alaninrest ersetzt ist.
3 zeigt die Ergebnisse einer Analyse mittels Phasenumkehr-HPLC (reverse phase HPLC), von Proben von neu gefalteten AS1051-WT- und AS1051-Ala-Proben vor der Dialyse. (a) und nach der Dialyse (b). Die Zeit ist auf der horizontalen Achse aufgetragen und die Absorbanz (216 nm), d.h. die Menge an aufgelösten Proteinen, ist auf der vertikalen Achse aufgetragen.
4 zeigt die Anzahl von Blutplättchen in Meerschweinchen nach wiederholten Verabreichungen von AS1051-Ala.
5 zeigt die Ergebnisse der Detektion von anti-AS1051-Ala-Antikörpern in Plasma von Meerschweinchen nach wiederholten Verabreichungen von AS1051-Ala.
6 ist ein Phasenumkehr-Flüssigkeitschromatogramm des Polyethylen-glykolierten AS1051 (AS1051-PEG) nach dem Verdau mit Lysyl-Endopeptidase.
7 zeigt die inhibitorischen Aktivitäten von AS1051-Ala und AS1051-PEG bezüglich der Ristocetin-Aggregation.
8 zeigt die Aktivitäten von AS1051-Ala und AS1051-PEG bezüglich der Inhibition der Bindung von fixierten Blutplättchen und vWF.
9 zeigt die Anzahl von Blutplättchen in Meerschweinchen nach wiederholten Verabreichungen von AS1051-Ala und AS1051-PEG.
Bevorzugte Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
<1> Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peptid-Untereinheit
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Peptid-Untereinheit, die aus einem oligomeren Protein mit Disulfidbrücken innerhalb einer Untereinheit und zwischen Untereinheiten stammt, und vorzugsweise eine verminderte Antigenität aufweist.
Das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte oligomere Protein ist aus zwei oder mehr Peptid-Untereinheiten zusammengesetzt und besitzt in wenigstens einer Peptidkette der Untereinheit eine Disulfidbrücke sowie eine Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten.
Beispiele für das oligomere Protein schließen ein oligomeres Protein ein, dessen physiologische Aktivität von einer Peptid-Untereinheit, aus der das oligomere Protein zusammengesetzt ist, abhängt. Des Weiteren kann das oligomere Protein auch ein oligomeres Protein sein, dessen physiologische Aktivität durch die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Peptid-Untereinheit, die an Polyoxyalkylpolyether gebunden ist, inhibiert wird. Zum Beispiel besitzt AS1051-PEG, das in den Beispielen als ein Beispiel für die erfindungsgemäße Peptid-Untereinheit genannt wird, eine anti-Blutplättchen-Wirkung, die jener von CHH-B, welches ein dimeres Peptid ist, das aus Schlangengift stammt, aus dem diese Peptid-Untereinheit stammt, ähnlich ist. Des Weiteren besitzt das vorgenannte AS1051-PEG auch eine Aktivität der Bindung an ein Glykoprotein auf einem Blutplättchen, ähnlich dem CHH-B, das ein Dimerpeptid ist, von dem die Untereinheit stammt, und inhibiert dadurch die Bindung von CHH-B. In AS1051 ist die Blutplättchen-vermindernde Wirkung, die CHH-B besitzt, deutlich herabgesetzt. Jedoch ist, obwohl seine Eigenschaften derart verändert sind, eine solche Peptid-Untereinheit nicht ausgeschlossen, solange die angestrebte physiologische Aktivität aufrechterhalten wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Verfahren zum Erlangen, unter den oben beschriebenen Peptid-Untereinheiten, aus welchen oligomere Proteine bestehen, einer Peptid-Untereinheit mit einer Disulfidbrücke innerhalb der Peptidkette, welche die obengenannte physiologische Aktivität oder eine Aktivität der Inhibition der physiologischen Aktivität besitzt, und vorzugsweise eine verminderte Antigenität aufweist.
Der hierin verwendete Begriff "verminderte Antigenität" bedeutet, dass die Antigenität der Peptid-Untereinheit, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wird, im Vergleich mit der Antigenität einer Peptid-Untereinheit, die durch ein konventionelles Verfahren aus einem oligomeren Protein erhalten wird, verringert ist. Beispiele der konventionellen Verfahren schließen ein, z.B. ein Verfahren zum Erhalten eines Monomers durch die Reduktion eines oligomeren Proteins mit einem Reduktionsmittel und daraufhin die Alkylierung einer freien Thiolgruppe mit einem Alkylierungsmittel, ein Verfahren zur Herstellung einer Peptid-Untereinheit als rekombinantes Protein, worin ein Cysteinrest, der an einer Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten beteiligt ist, durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt wird, usw.
Das oligomere Protein, auf das die Erfindung angewendet werden kann, ist nicht begrenzt, solange es aus zwei oder mehr Peptid-Untereinheiten zusammengesetzt ist und eine Disulfidbrücke in wenigstens der Peptidkette einer Untereinheit und eine Disulfidbrücke zwischen den Untereinheiten besitzt. Beispiele hiervon schließen ein: oligomere Proteine mit einer Aktivität der Bindung an Glykoprotein Ib auf einer Blutplättchenmembran, die in Schlangengift enthalten sind, wie beispielsweise jenes von Crotalus horridus horridus, Cerastes cerastes, Vipera palestinae, Echis carinatus, Trimeresurus albolabris, Trimeresurus flaboviridis, Naja haje, Naja nivea und Crotarus admanteus, sowie physiologisch aktive Proteine, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren und Zytokine (R.M. Scarborough, WO92/08472).
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann ein oligomeres Protein, das aus einem natürlichen Material, wie beispielsweise Schlangengift, erhalten wurde, so wie es ist eingesetzt werden, oder es kann eine von einem oligomeren Protein getrennte Peptid-Untereinheit verwendet werden. Als Peptid-Untereinheit, unter Untereinheiten, aus denen ein oligomeres Protein zusammengesetzt ist, wird eine Peptid-Untereinheit, die verantwortlich ist für die physiologische Aktivität des oligomeren Proteins, oder eine Peptid-Untereinheit mit einer Aktivität der Inhibition der physiologischen Aktivität eingesetzt. Mit der in der vorliegenden Erfindung angesprochenen Peptid-Untereinheit ist eine solche Peptid-Untereinheit gemeint, falls nicht etwas anderes angegeben ist. Des Weiteren kann die Peptid-Untereinheit ein rekombinantes Protein, das unter Verwendung der dafür kodierenden DNA durch eine genetische Rekombinationsmethode hergestellt wurde, sein.
Wenn die Gesamtlänge der Aminosäuresequenz der Ziel-Peptid-Untereinheit oder eines Teils davon bekannt ist, kann die für die Peptid-Untereinheit kodierende DNA in der gleichen Weise wie in der konventionellen Genklonierung kloniert werden. Zum Beispiel kann das Ziel-Gen durch das Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Verfahren unter Verwendung von auf der Grundlage einer bekannten Nukleotidsequenz hergestellten Primern erhalten werden. Es kann auch aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, indem Hybridisierung unter Verwendung einer auf ähnliche Weise hergestellten Probe durchgeführt wird. Wenn das Ziel-Gen an einer Hinterlegungsstelle hinterlegt ist, kann das hinterlegte Gen verwendet werden. Des Weiteren kann, wenn die gesamte Nukleotidsequenz des Gens bekannt ist, das Ziel-Gen auch chemisch synthetisiert werden. Wenn eine Ziel-Peptid-Untereinheit unter Peptid-Untereinheiten, aus denen ein Oligomer zusammengesetzt ist, nicht identifiziert werden kann, können für die betreffenden Peptid-Untereinheiten kodierende Gene kloniert werden.
Die Peptid-Untereinheit kann als rekombinantes Protein durch eine genetische Rekombinationsmethode hergestellt werden, indem ein für die Ziel-Peptid-Untereinheit kodierendes Gen in der gleichen Weise wie in einem konventionellen Verfahren zur Herstellung eines nützlichen Proteins verwendet wird. Das heißt, es kann ein Wirt, wie beispielsweise Escherichia coli mit einem rekombinanten Vektor transformiert werden, der durch Insertion eines für die Ziel-Peptid-Untereinheit kodierenden Gens in einen Vektor, einschließlich eines geeigneten Promotors, erhalten wurde, und daraufhin kann der Transformant kultiviert werden, um das Gen zu exprimieren. Beispiele für den Wirt schließen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefe usw. ein. Der Promotor unterliegt keiner Beschränkung, solange er in dem zu verwendenden Wirt funktioniert. Beispiele davon schließen lac, trp, tac, trc, recA, T7 (New Course of Biochemical Experiment 1, Protein VI, Synthesis and Expression, herausgegeben von der Japanese Biochemical Society, Seite 166, Yasueda & Matsui, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd., 1992), PGK, ADH1, GPD, MFα1, SUC2, PHO5, GAL1, GAL4 (New Course of Biochemical Experiment 1, Protein VI, Synthesis and Expression, herausgegeben von der Japanese Biochemical Society, Seite 215, Sakai et al., Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd., 1992) usw.
Betreffend das Expressionsschema kann die Ziel-Peptid-Untereinheit selbst direkt exprimiert werden, oder sie kann als Fusionsprotein mit einem anderen Protein exprimiert werden. Die Peptid-Untereinheit kann als Einschlusskörper oder als Protein des löslichen Typs in mikrobiellen Zellen akkumuliert werden, oder es kann aus mikrobiellen Zellen sezerniert werden. Beispiele für die Fusionsproteine schließen Fusionsproteine mit dem Maltose-bindenden Protein, Glutathion-S-Transferase, einem Histidin-tag (His-Tag) usw. ein.
Eine Peptid-Untereinheit, die aus einem Protein stammt, das ursprünglich als Oligomer vorliegt, kann mit hoher Wahrscheinlichkeit einen Cysteinrest besitzen, der nicht an einer Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit beteiligt ist, und eine in hohem Maße hydrophobe Teilstruktur besitzen, die ursprünglich mit einer anderen Peptid-Untereinheit auf der Oberfläche assoziiert war. Daher geht man davon aus, dass eine solche Peptid-Untereinheit alleine oftmals zu schlechter Stabilität und Löslichkeit in einer Lösung führt. Die schlechte Stabilität aufgrund des Vorkommens eines Cysteinrests, der nicht an einer Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit beteiligt ist, kann in der gleichen Weise vermieden werden, als in einem konventionellen Verfahren, in dem ein Cysteinrest, der ursprünglich an einer Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten beteiligt war, durch einen geeigneten Aminosäurerest, wie beispielsweise Alanin oder Serin, der keine Thiolgruppe besitzt, ausgetauscht wird. Jedoch muss zu diesem Zweck ein Cysteinrest, der ursprünglich an einer Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten beteiligt war, identifiziert werden. Sogar wenn der oben beschriebene Cysteinrest bereits identifiziert ist, muss des Weiteren eine Mutation für den Aminosäureaustausch in ein Gen eingeführt werden, und seine Durchführung ist kompliziert.
Andererseits kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein für eine Peptid-Untereinheit kodierendes Gen ohne Veränderungen exprimiert werden. Wenn Löslichkeit und Stabilität aufgrund einer solchen, vereinzelten Peptid-Untereinheit schlecht sind, kann die Peptid-Untereinheit als Einschlusskörper oder als unlösliches Protein erhalten werden.
In der vorliegenden Erfindung wird eine Peptid-Untereinheit aus einem oligomeren Protein oder seiner Peptid-Untereinheit, wie oben beschrieben, durch die obengenannten Schritte (a) und (b) erhalten. Jeder Schritt wird im folgenden erklärt.
(1) Schritt (a)
Zunächst wird ein oligomeres Protein oder seine Peptid-Untereinheit in einer Lösung mit einem Denaturierungsmittel denaturiert. Daraufhin wird das Denaturierungsmittel aus der Lösung entfernt, in Anwesenheit eines Polyoxyalkylpolyethers mit einer funktionellen Gruppe, die mit einer Thiolgruppe reagiert, um die Peptid-Untereinheit neu zu falten.
Ein Lösungsmittel der Lösung ist meist Wasser. Das Protein-Denaturierungsmittel unterliegt keiner besonderen Beschränkung, solange es ein Protein reversibel denaturieren kann. Beispiele hiervon schließen Guanidinhydrochlorid, Harnstoff usw. ein. Das Protein-Denaturierungsmittel kann bei jeder Konzentration verwendet werden, solange das Protein gelöst ist. Jedoch kann es z.B. im Bereich von 1 M bis hin zu einer gesättigten Konzentration verwendet werden, bevorzugt, von 2 M bis 8 M. Der pH-Wert der Lösung unterliegt keiner besonderen Beschränkung, aber er ist vorzugsweise im Bereich von 7 bis 12, in dem die Spaltung einer Disulfidbrücke und die Bindung von Polyethylenglykol an eine Thiolgruppe, was später erklärt werden wird, leicht stattfinden. Die Temperatur der Lösung unterliegt ebenfalls keiner besonderen Beschränkung, aber sie ist vorzugsweise im Bereich von 0 bis 40°C. Die Reaktionszeit wird ebenfalls angemessen gewählt. Die Denaturierung kann entweder unter reduzierenden Bedingungen oder nicht reduzierenden Bedingungen durchgeführt werden.
Eine Disulfidbrücke in einem oligomeren Protein oder einer Peptid-Untereinheit kann vorher unter Verwendung eines Reduktionsmittels gespalten werden, jedoch ist dies nicht notwendig. Eine einen Cysteinrest enthaltende Substanz, wie Glutathion, ein Reduktionsmittel, wie beispielsweise Dithiothreitol, ein Enzym, wie beispielsweise eine Protein-Disulfid-Isomerase oder dergleichen kann vor dem Neufaltungsverfahren zugesetzt werden.
Wenn ein oligomeres Protein oder seine Untereinheit eine Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten oder eine Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit besitzt, die sich von der Disulfidbrücke im ursprünglichen Protein unterscheidet, wird die Denaturierung vorzugsweise unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt. In der vorliegenden Erfindung sind mit reduzierenden Bedingungen Bedingungen gemeint, unter welchen die Spaltung einer Disulfidbrücke begünstigt ist, wie unter Anwesenheit einer einen Cysteinrest enthaltenden Substanz, eines Reduktionsmittels, Protein-Disulfid-Isomerase oder dergleichen. Da die Spaltung der Disulfidbrücke unter reduzierenden Bedingungen begünstigt ist, wird die Reaktion mit dem Polyoxyalkylpolyether mit einer funktionellen Gruppe, die mit einer Thiolgruppe regiert, im Neufaltungsverfahren begünstigt. Wenn ein oligomeres Protein denaturiert wird, ist es, da die Spaltung einer Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten begünstigt ist, besonders bevorzugt, dass die Denaturierung unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt wird.
Daraufhin wird das Denaturierungsmittel unter Anwesenheit von Polyoxyalkylpolyether mit einer funktionellen Gruppe, die mit einer Thiolgruppe reagiert, aus der Lösung, welche die denaturierte Peptid-Untereinheit enthält, entfernt. Das Denaturierungsmittel kann z.B. durch Dialyse aus der Lösung entfernt werden.
Typische Beispiele für die funktionelle Gruppe, die mit einer Thiolgruppe reagiert, schließen ein: eine Maleimidgruppe (R.J. Goodson et al., Bio/Technology, 8, Seite 343, 1990), eine Orthopyridyldisulfidgruppe (M. Yokoyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 164, Seite 1234, 1989), eine Vinylsulfongruppe (Shearwater Polymers Inc. Produkt Nr. M-VS-5000) usw. Die funktionelle Gruppe ist nicht begrenzt, solange sie bevorzugt an eine Thiolgruppe bindet. Beispiele für den Polyoxyalkylpolyether schließen Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyhydroxyethylglycerin, Dextran, Kohlenhydratpolymere usw. ein. Das Molekulargewicht ist nicht besonders begrenzt, aber es ist vorzugsweise im Bereich von 1000 bis 1.000.000, mehr bevorzugt im Bereich von 2000 bis 50.000, im Hinblick auf eine Verbesserung der Löslichkeit und Verringerung der Antigenität einer zu erhaltenden Peptid-Untereinheit, und Reaktivität mit einer Peptid-Untereinheit.
Der oben beschriebene Polyoxyalkylpolyether kann vor oder nach der Denaturierung eines oligomeren Proteins oder seiner Peptid-Untereinheit zur Lösung hinzugefügt werden. Er kann auch vor dem Entfernen des Denaturierungsmittels hinzugefügt werden. Meistens ist bevorzugt, dass, nachdem ein oligomeres Protein oder seine Peptid-Untereinheit mit einem Denaturierungsmittel denaturiert wird, der Polyoxyalkylpolyether hinzugefügt wird, und die Mischung für eine bestimmte Zeitspanne der Reaktion überlassen wird, und daraufhin das Denaturierungsmittel aus der Lösung entfernt wird. Die Menge an Polyoxyalkylpolyether ist bevorzugt eine äquimolare Menge oder mehr, bezogen auf die Menge des zu reagierenden Proteins.
Der Polyoxyalkylpolyether bindet an einen Cysteinrest einer Peptid-Untereinheit, indem ermöglicht wird, dass die Peptid-Untereinheit mit dem Polyoxyalkylpolyether mit einer funktionellen Gruppe, die während oder nach der Denaturierung mit einer Thiolgruppe reagiert, reagiert.
Wenn das Denaturierungsmittel wie oben beschrieben aus der Lösung entfernt wird, erfolgt die Neufaltung der denaturierten Peptid-Untereinheit, und so kann eine Peptid-Untereinheit mit einer physiologischen Aktivität, die identisch ist mit der physiologischen Aktivität des oligomeren Proteins, aus dem die Peptid-Untereinheit stammt, oder eine Aktivität der Inhibierung der physiologischen Aktivität erhalten werden.
Indem eine natürliche Oxidation (Luftoxidation) durchgeführt wird, um eine Disulfidbrücke innerhalb einer Untereinheit zu bilden, und daraufhin ein Polyoxyalkylpolyether mit einer funktionellen Gruppe, die vor dem Schritt des Entfernens des Denaturierungsmittels aus der Lösung, welche die denaturierte Peptid-Untereinheit enthält, hinzugefügt wird, kann eine Polyoxyalkylpolyethergruppe selektiv und effizient an einem Cysteinrest, der ursprünglich an der Bildung einer Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten des oligomeren Proteins beteiligt war, gebunden werden.
(2) Schritt (b)
Die an Polyoxyalkylpolyether gebundene Peptid-Untereinheit, die wie oben beschrieben hergestellt wird, wird aus der Lösung isoliert. Dieser Vorgang kann durchgeführt werden durch eine Kombination von Vorgängen, die zur konventionellen Proteinaufreinigung verwendet werden, d.h., weithin eingesetzte chromatografische Methoden, wie beispielsweise Ionenaustausch, Gelfiltrations- oder Phasenumkehrchromatografie, Elektrophorese, Präzipitationsvorgänge, wie beispielsweise Aussalzen, Entsalzungsvorgängen, Konzentrationsvorgängen usw.
Die angestrebte Peptid-Untereinheit und der Polyoxyalkylpolyether können durch die obengenannten Vorgänge getrennt werden. Wenn ein oligomeres Protein als Ausgangsmaterial verwendet wird, können die Ziel-Peptid-Untereinheit und andere Peptid-Untereinheiten separiert werden. Zum Beispiel kann eine Peptid-Untereinheit mit verminderter Antigenität, in der Polyoxyalkylpolyether an einen Cysteinrest gebunden ist, der ursprünglich an der Bildung einer Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten in einem oligomeren Protein unter Cysteinresten der Peptid-Untereinheit beteiligt war, von der anderen Peptid-Untereinheit oder den anderen Peptid-Untereinheiten getrennt werden.
Die Bindungsposition von an eine Peptid-Untereinheit gebundenem Polyoxyalkylpolyether ist vorzugsweise an einem Cysteinrest, der eine Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten im oligomeren Protein bildet. Jedoch kann dies, wenn die Bildung der Disulfidbrücken nicht bestimmt ist, eine solche Position sein, dass der Polyoxyalkylpolyether an eine spezifische Thiolgruppe bindet, wodurch die Peptid-Untereinheit eine gezielte Aktivität besitzt, stabil in einer Lösung vorliegt und vorzugsweise eine verminderte Antigenität besitzt. Die andere Disulfidbrücke in der Untereinheit ist bevorzugt die Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit des ursprünglichen oligomeren Proteins. Jedoch können sie von ihnen in einem solchen Maß abweichen, dass die Peptid-Untereinheit noch eine wesentliche physiologische Aktivität besitzt. Des Weiteren kann sie, wenn die ursprüngliche Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit nicht bestimmt ist, in einer solchen Position sein, dass die Peptid-Untereinheit als einzelnes Molekül mit einer physiologischen Aktivität identifizierbar ist und stabil in einer Lösung vorliegt. Die Anzahl der pro Molekül zu bindenden Polyoxyalkylpolyethermoleküle ist vorzugsweise gleich der Anzahl von Cysteinresten, die eine Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten im ursprünglichen Dimer-Protein bilden. Jedoch kann sie, wenn die Anzahl nicht bestimmt ist, eine solche Anzahl sein, dass das erhaltene, mit Polyoxyalkylpolyether konjugierte Monomerprotein eine physiologische Aktivität besitzt, als Einzelmolekül identifizierbar ist, und stabil in einer Lösung vorliegt.
Des Weiteren ist es ausreichend, dass die Antigenität der erhaltene, mit Polyoxyalkylpolyether konjugierten Monomer-Peptid-Untereinheit wesentlich vermindert ist, im Vergleich mit einer Peptid-Untereinheit, die nicht mit Polyoxyalkylpolyether konjugiert ist oder einer Peptid-Untereinheit, die erhalten wurde, indem ein Cysteinrest, der im ursprünglichen oligomeren Protein eine Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten bildete, durch eine andere Aminosäure ohne Thiolgruppe ausgetauscht wird. Wenn kein Befund über die Antigenität einer Peptid-Untereinheit, die nicht wie oben beschrieben, mit Polyoxyalkylpolyether konjugiert ist, kann es eine solche Antigenität sein, dass biologische und biochemische Reaktionen, die einer Antigen-Antikörper-Reaktion zugeschrieben werden können, nicht erfolgen, wenn die erhaltene, mit Polyoxyalkylpolyether konjugierte Peptid-Untereinheit, in einer minimalen, zur Immunisierung erforderlichen Anzahl von Gaben, an ein Tier verabreicht wird, und daraufhin wieder verabreicht wird.
Des Weiteren wird erwartet, dass die Stabilität der durch die vorliegende Erfindung erhaltenen, mit Polyoxyalkylpolyether konjugierten Peptid-Untereinheit im Blut, im Vergleich zu einer nicht mit Polyoxyalkylpolyether konjugierten Peptid-Untereinheit, verbessert ist.
In den später beschriebenen Beispielen wird ein Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens angeführt, indem das Verfahren auf eine Peptid-Untereinheit (α-Untereinheit), die CHH-B darstellt, das ein Dimer-Peptid ist, das aus dem Schlangengift von Crotalus horridus horridus stammt, angewendet wird. CHH-B bindet an Glykoprotein Ib (GPIb), welches ein Blutplättchenmenbran-Glykoprotein ist. Von Glykoprotein Ib ist bekannt, dass es an der Thrombogenese beteiligt ist, indem es an von-Willebrand-Faktor (vWF), das ein Protein im Blut ist, bindet (J.P. Cean et al., J. Lab. Clin. Med., 87, Seiten 586–596, 1976; K J. Clemetson et al., Thromb. Haemost., 78, Seiten 266–270, 1997). Des Weiteren ist festgestellt worden, dass es in der α-Kette von CHH-B eine GPIb-Bindungsstelle gibt, und es ist berichtet worden, dass AS1051, welches nur die isolierte α-Kette ist, eine antithrombotische Aktivität besitzt (N. Fukuchi et al., WO 95/08573). N. Fukuchi et al. (WO95/08573) haben von einem Verfahren berichtet, das die partielle Reduktion von CHH-B und den Schutz einer freien Tiolgruppe mit Glutathion einschließt, als Verfahren zur Herstellung von AS1051. Des Weiteren haben sie auch von einem Verfahren berichtet, worin das für AS1051 kodierende Gen kloniert wird, ein an einer Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten beteiligter Cysteinrest in CHH-B identifiziert wird und mutiertes AS1051 (AS1051-Ala), in welchem der Cysteinrest durch einen Alaninrest ersetzt ist, in Escherichia coli exprimiert wird, usw.
Jedoch berichtete die obengenannte Patentschrift von den Daten zur Aktivität, die unter Verwendung einer Peptid-Untereinheit, erhalten durch partielle Reduktion von CHH-B oder einem mutierten AS1051, erhalten wurde aber erwähnte nicht die Stabilität vom in Escherichia coli produzierten Wildtyp AS1051. Daher wird angenommen, dass diese Peptid-Untereinheit mit überflüssigen Cysteinresten, die nicht an einer Disulfidbrücke innerhalb einer Untereinheit beteiligt sind, eine niedrige Stabilität und eine geringe Effizienz im Neufaltungsvorgang aufweisen würden. Des Weiteren beschreibt die Patentschrift die Evaluierung der antithrombotischen Aktivität unter Verwendung von Tieren, nimmt jedoch nicht auf die Antigenität Bezug. Daher wurden die Stabilität von unter Verwendung von Escherichia coli hergestelltem AS1051 und die Antigenität des Produktes mit ausgetauschtem Alanin (AS1051-Ala), das als stabil angesehen wurde, nach der Verabreichung an Tiere zuerst untersucht.
Als Ergebnis wurde bestätigt, dass, wenn AS1051 und AS1051-Ala unter den gleichen Bedingungen denaturiert und neu gefaltet wurden, die Löslichkeit von AS1051 sehr niedrig war. Des Weiteren wurde, wenn AS1051-Ala wiederholt an Meerschweinchen verabreicht wurde, eine Abnahme von Blutplättchen bestätigt, wovon man annahm, dass es seiner Antigenität zuzuschreiben war. Andererseits wies durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenes AS1051, das mit Polyethylenglykol konjugiert war und keinen Aminosäureaustausch enthielt, eine hohe Löslichkeit und keine Abnahme von Plättchen auf.
<2> Peptid der vorliegenden Erfindung
Das Peptid der vorliegenden Erfindung ist eine Peptid-Untereinheit, die aus einem oligomeren Protein mit Disulfidbrücken in einer Untereinheit und zwischen Untereinheiten stammt, worin Polyoxyalkylpolyether an einen Cysteinrest, der ursprünglich beteiligt war an der Bildung einer Disulfidbrücke zwischen Untereinheiten im oligomeren Protein unter Cysteinresten in der Peptid-Untereinheit gebunden ist, und die Peptid-Untereinheit eine verminderte Antigenität aufweist. Eine solche Peptid-Untereinheit kann z.B. erhalten werden durch das oben beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren.
Spezifische Beispiele der erfindungsgemäßen Peptid-Untereinheit schließen eine aus einem oligomeren Protein stammende Peptid-Untereinheit ein, die ein Dimer-Peptid ist, das aus Schlangengift von Crotalus horridus horridus abgeleitet ist und eine Aktivität der Inhibierung der Bindung des von-Willebrand-Faktors an Blutplättchen besitzt. Ein spezifisches Beispiel ist ein Peptid mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz und mit an den Cysteinrest der Aminosäure Nr. 81 in der Aminosäuresequenz gebundenen Polyoxyalkylpolyether, oder ein Derivat davon. Beispiele des Derivats schließen ein Peptid ein, das den Ersatz, die Deletion, die Insertion, die Addition oder die Inversion von einem oder mehreren Aminosäureresten an einer anderen Position, als am Cysteinrest der Aminosäure Nr. 81, einschließt und eine antithrombotische Eigenschaft besitzt.
Die beschriebenen Peptide besitzen hervorragende Eigenschaften, nämlich eine Aktivität der Inhibierung der Aggregation von Blutplättchen, die jener des ursprünglichen Dimer-Proteins, CHH-B, oder des Monomer-Peptids seiner α-Untereinheit, AS1051, eine hohe Löslichkeit in einer Lösung, wie beispielsweise einem Puffer und sehr niedrige Antigenität, während AS1051, das nicht mit einem Polyetherrest versehen ist, Antigenität vorweist.
<3> Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids
Unter den durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Peptid-Untereinheiten können jene, welche im wesentlichen die gleiche biologische Wirkung als das ursprüngliche oligomere Protein besitzen, in einem Arzneimittel als Wirkstoffe für das Ziel der Wirkung verwendet werden. Des Weiteren können, unter nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Peptid-Untereinheiten, beispielsweise jene mit einer physiologischen Aktivität der Inhibierung einer biologischen Wirkung des ursprünglichen oligomeren Proteins, basierend auf einem Mechanismus, wie beispielsweise Inhibierung der Bindung des ursprünglichen oligomeren Proteins an seinen Rezeptor oder dergleichen, ebenfalls in einem Arzneimittel verwendet werden, als inhibitorische Substanz für das Ziel der Wirkung.
Im einzelnen kann es, da das obengenannte Polyethylen-glykolierte AS1051 eine Aktivität der Inhibierung der Aggregation von Blutplättchen besitzt, die jener von CHH-B und AS1051 ähnlich ist, und keine Antigenität aufweist, wenn es an Tiere verabreicht wird, als antithrombotisches Arzneimittel verwendet werden.
In einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann das erfindungsgemäße Peptid so wie es ist verwendet werden, oder als pharmazeutisch akzeptables Salz. Die Peptide können jeweils alleine oder als Gemisch von zweien oder mehr verwendet werden. Andere wirksame Bestandteile können ebenfalls zugesetzt werden. Des Weiteren kann es mit anderen Materialien vermischt werden, zur Verwendung in konventionellen pharmazeutischen Präparaten, z.B. Bestandteile, die Proteine, wie beispielsweise Serumalbumin, Puffermittel, Salze zur osmotischen Einstellung, Trägerstoffe und Bindemittel einschließen.
Beispiele für die Dosierungsform schließen Tabletten, Kapseln, subtilisierte Granulate, Sirupe, Zäpfchen, Salben, Injektionen, Augentropfen usw. ein. Unter diesen ist die Injektion bevorzugt. Als Verabreichungsverfahren können die intravenöse Verabreichung, die subkutane Verabreichung, die intramuskuläre Verabreichung, die orale Verabreichung, die Instillation, die enterale Verabreichung usw. verwendet werden, jedoch sind unter diesen die intravenöse Verabreichung, die subkutane Verabreichung, die intramuskuläre Verabreichung usw. bevorzugt.
Betreffend die Dosis für ein Tier oder einen Menschen, ist meistens zu erwarten, dass eine Dosis von Polyethylen-glykoliertem AS1051, beispielsweise im Bereich von 0,1 μg/kg bis 100 mg/kg als Menge des Peptids, die gewünschte Wirkung herbeiführt, und eine Dosis, die die optimale Wirksamkeit des Arzneimittels gewähren kann, kann in diesem Bereich ausgewählt werden.
Beispiele
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung in weiteren Einzelheiten, unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, erklärt.
Beispiel 1: Klonieren des CHH-B-α-Ketten-Proteingens
Klonierung eines CHH-B-α-Ketten-Proteingens wurde gemäß dem Verfahren von N. Fukuchi et al. (WO95/08573) aufgeführt. Im einzelnen wurde es gemäß dem folgenden Verfahren ausgeführt.
<1> Herstellung einer cDNA-Bibliothek von Crotalus horridus horridus
(1) Extraktion von mRNA aus Crotalus horridus horridus
Eine Giftdrüse von Crotalus horridus horridus wurde herauspräpariert, sofort mittels flüssigen Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung gelagert. 1,7 g der Giftdrüse wurde in 20 ml einer RNA-Extraktionslösung (4 M Guanidiumisothiocyanathydrochlorid, 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1 % β-Mercaptoethanol, 0,1 % Laurylsarcosylnatriumsalz) aufgeschlossen, unter Verwendung eines Polytron-Homogenisiergeräts (Kinematica). Diese Aufschlusslösung wurde bei 10.000 × G für 10 Minuten zentrifugiert, um unlösliche Materie zu entfernen. Der Überstand wurde mit einem gleichen Volumen eines Dichte-äquilibrierten Puffers (4 M Cäsiumchlorid, 10 mM Dinatriumethylendiamintetraacetat, pH 7,5) in einem Ultrazentrifugationsröhrchen überschichtet und bei 30.000 U/min bei 20°C für 18 Stunden zentrifugiert, um 600 μg Gesamt-RNA abzutrennen.
mRNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung eines POLY(A)-Quik-mRNA-Extraction-Kit (Stratagene), gemäß der dem Kit beigelegten Anleitung, isoliert. Das heißt, 500 μg der erhaltenen Gesamt-RNA wurde an eine Oligo-dT-Säule adsorbiert, und die Säule wurde zweimal mit 200 μl eines Puffers mit hoher Salzkonzentration und dreimal mit 200 μl eines Puffers mit niedriger Salzkonzentration gewaschen. Daraufhin wurden 200 μl des Elutionspuffers viermal bei 65°C durch die Säule hindurchgeleitet, um mRNA (10 μg) abzutrennen und zu reinigen.
(2) Synthese von cDNA
cDNA wurde unter Verwendung eines Time Savor DNA-Synthesis-Kit (Pharmacia) gemäß der dem Kit beigelegten Anleitung, synthetisiert. Das heißt, 3 μg der gereinigten mRNA wurden mit einer Erststrangreaktionsmischung vermischt, die 0,3 μg Zufalls-Hexamer-Primer, 1 mM Dithiothreitol und Reverse Transkriptase enthielt, und die Mischung wurde bei 37°C für 1 Stunde der Reaktion überlassen, um einen Erststrang zu synthetisieren.
Diese Reaktionsmischung wurde mit einer Zweitstrangreaktionsmischung vermischt, die Escherichia coli RNase H und Escherichia coli DNA-Polymerase enthielt, und die Mischung wurde bei 12°C für 30 Minuten und bei 22°C für 1 Stunde der Reaktion überlassen, um cDNA zu synthetisieren. Des Weiteren wurde die Reaktionsmischung bei 65°C für 10 Minuten inkubiert und daraufhin mit Phenol/Chloroform behandelt, um das Enzym zu deaktivieren. Anschließend wurde die Reaktionsmischung bei 400 × G für 2 Minuten unter Verwendung einer dem Kit beigelegten Gelfiltrations-Zentrifugationssäule, zentrifugiert, um unverbrauchte Primer zu entfernen und doppelsträngige cDNA (3 μg) zu erhalten.
(3) Herstellung einer cDNA-Bibliothek
Ein dem Time Savor DNA-Kit beigelegter EcoRI/NotI-Adapter wurde an beide Enden der doppelsträngigen, oben erhaltenen cDNA ligiert, gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung. Das heißt, 3 μg der cDNA, 3 μl des EcoRI/NotI-Adapters, 30 μl eines Polyethylenglykolpuffers, 1 μl einer ATP-Lösung und 1 μl T4-DNA-Ligase wurden vermischt und bei 16°C für 1 Stunde einer Ligationsreaktion unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde des Weiteren für 10 Minuten bei 65°C inkubiert, um enzymatische Aktivität zu deaktivieren. Daraufhin wurden 1,5 μl ATP-Lösung und 1 μl T4-Polynukleotidkinase hinzugefügt und die Mischung wurde bei 37°C für 30 Minuten der Reaktion überlassen, wobei das 5'-Ende des Adapters phosphoryliert wurde. Daraufhin wurde die Reaktionsmischung weiter bei 65°C für 10 Minuten inkubiert und einer Phenol/Chloroform-Behandlung unterzogen, so dass die enzymatische Aktivität desaktiviert wurde. Anschließend wurde die Reaktionsmischung bei 400 × G für 2 Minuten unter Verwendung einer dem Kit beiliegenden Gelfiltrations-Zentrifugationssäule zentrifugiert, um den unverbrauchten Adapter zu entfernen.
Die an ihren beiden Enden mit dem Adapter ligierte cDNA wurde an die EcoRI-Schnittstelle des lambda-Phagenvektors lambda-ZAPII (Stratagene) ligiert, um rekombinante Phagen-DNA herzustellen. Das heißt, es wurde zu den 400 ng der mit dem Adapter ligierten cDNA 1 μg des lambda-ZAPII/EcoRI/CIAP-Arms, ein Ligationspuffer (100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM Magnesiumchlorid, 300 mM Natriumchlorid) hinzugefügt, und ein gleiches Volumen einer Enzymlösung, die T4-DNA-Ligase, Lösung B (Ligations-Kit, hergestellt von Takara Shuzo) enthielt, wurde hinzugesetzt, und die Mischung wurde einer Ligationsreaktion bei 26°C für 10 Minuten unterzogen.
Die rekombinante Phagen-DNA, die wie oben beschrieben erhalten wurde, wurde unter Verwendung eines Verpackungs-Kits GIGAPACKII GOLD (Stratagene) gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung, verpackt. Das heißt, 3 μg der mit der cDNA ligierten lambda-ZAPII-Arm-DNA und eine Verpackungs-Extraktionslösung des Kits wurden vermischt und bei 22°C für 2 Stunden der Reaktion überlassen, um die Verpackung durchzuführen. Zu dieser Reaktionslösung wurden 500 μl einer Phagen-Verdünnungslösung (0,58 % Natriumchlorid, 0,2 % Magnesiumsulfat, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,01 % Gelatine) hinzugefügt.
Der Titer des erhaltenen, rekombinanten Phagen wurde geprüft, und daraufhin wurde eine Phagen-Bibliothek hergestellt, unter Verwendung eines halben Volumens der Phagen-Verpackungsreaktionsmischung und Escherichia coli, E. coli XL-1 Blue (Stratagene), als Empfängerbakterium. Das heißt, mit der Phagen-Verdünnungslösung verdünnte Phagen und Empfängerbakterien wurden auf 10 Plaque-bildende Medienplatten (1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Natriumchlorid, 1 mM Magnesiumsulfat, 0,2 % Maltose) mit einem Durchmesser von 150 mm bei einer solchen Dichte ausplattiert, dass 20.000 Plaques pro Platte erhalten werden sollten, und bei 37°C für 12 Stunden kultiviert, um eine rekombinante Phagen-Bibliothek zu erhalten.
<2> Gewinnung von Proben-DNA zur Isolierung des Ziel-Gens
(1) Amplifizierung eines Teilfragments des Ziel-Gens durch das RT-PCR Verfahren
Ein für das die Bindung an den von-Willebrand-Faktor an Blutplättchen inhibierende Peptid kodierendes DNA-Fragment wurde durch das RT-PCR-Verfahren amplifiziert, unter Verwendung der aus Crotalus horridus horridus extrahierten Gesamt-RNA als Rohmaterial.
Eine Stelle, welche nicht viele degenerierte Kodons besaß, wurde auf der Grundlage der in SEQ ID NO: 1 (N. Fukuchi et al., siehe oben) gezeigten Aminosäuresequenz des Peptids ausgesucht, um Primer für Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) herzustellen. Mit der chemischen Synthese der Primer wurde Biologica betraut. Die Nukleotidsequenzen dieser Primer sind in SEQ ID NO: 2 und 3 im Sequenzprotokoll gezeigt. Es wird darauf hingewiesen, dass in SEQ ID NO: 2 die 3. und 6. Nukleotide jeweils eine Mischung aus A und G und 12. Nukleotid eine Mischung aus T, C, A und G sind. In SEQ ID NO: 3 ist das 3. Nukleotid eine Mischung aus T, C, A und G, die 6. und 15. Nukleotide sind jeweils eine Mischung aus T und C, und das 9. Nukleotid ist eine Mischung aus A und G.
Die wie oben beschrieben hergestellte Gesamt-RNA von Crotalus horridus horridus wurde unter Verwendung der obigen Primer einer RT-PCR unterzogen. Der Erststrang wurde synthetisiert, indem 5 μg der Gesamt-RNA mit 2,5 μl der Reversen Transkriptase SUPERSCRIPT II (GIBCO), 20 μl eines Erstrangpuffers, der der Enzymlösung beilag, 10 μl 0,1 M Dithiothreitol und 5 μl 10 mM dNTP vermischt wurde, und Das Gemisch Mischung bei 42°C für 1 Stunde der Reaktion überlassen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei 95°C für 5 Minuten inkubiert, um die Reverse Transkriptase zu desaktivieren. Anschließend wurde PCR durchgeführt, unter Verwendung des Erststrangs als Matrize. Das heißt, 5 μl des Erstrang-Reaktionsgemisches, 10 μl eines PCR-Puffers, 5 μl 10 mM dNTP, jeweils 800 pmol der Primer und 10 Einheiten Taq-Polymerase wurden vermischt. Daraufhin wurde eine Reaktion durchgeführt, unter Verwendung eines DNA-Thermozyklers (Perkin-Elmer), mit einem Zyklus von Reaktionen bei 95°C für 0,5 Minuten, bei 52°C für 1 Minute und bei 72°C für 2 Minuten, welcher 25mal wiederholt wurde.
Dieses PCR-Reaktionsgemisch wurde einer 2%igen Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um die amplifizierte DNA zu analysieren. Als Ergebnis wurde eine DNA-Bande bei einer Position von ungefähr 300 Basenpaaren beobachtet.
(2) Bestimmung der Nukleotidsequenz des amplifizierten Fragments
Das wie oben beschrieben amplifizierte DNA-Fragment wurde in ein Plasmid subkloniert, unter Verwendung eines pCR-ScriptSK(+)-Klonierungskits (Stratagene), gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung. Das heißt, das PCR-Reaktionsgemisch wurde mit einem Ligationspuffer, 1 mM ATP, 10 ng pCRscript (Stratagene) als Vektor, 5 Einheiten des Reaktionsenzym SrfI und T4-DNA-Ligase vermischt, und eine Ligationsreaktion wurde bei 25°C für 1 Stunde durchgeführt. Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch bei 65°C für 10 Minuten inkubiert, um die Ligase zu desaktivieren. E. coli DH5α wurde mit dem Verfahren der kompetenten Zellen transformiert, unter Verwendung des Reaktionsproduktes, auf einer L-Ap-Platte ausplattiert (1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Natriumchlorid, 100 μg/ml Natriumampicillin) und bei 37°C für 18 Stunden kultiviert. Mikrobielle Zellen, welche Kolonien bildeten, wurden von der Platte abgetrennt und ein Teil von ihnen wurde in einem Flüssigmedium kultiviert, und ein Plasmid wurde mit dem alkalischen Verfahren isoliert (Molecular Cloning, 2. Auflage, Band 1, Cold Spring Harbor Press). Dieses Plasmid wurde pCHAprobe genannt.
Die Nukleotidsequenz eines klonierten Fragments von pCHAprobe wurde mittels des Farbstoffterminatorverfahrens analysiert, unter Verwendung eines DNA-Sequenziergerät A373 (Applied Biosystems) und M13M4 oder M13reverse (Takara Shuzo) als Primer, gemäß den dem Sequenziergerät beiliegenden Anweisungen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass das klonierte DNA-Fragment aus 272 Basenpaaren bestand und die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Nukleotidsequenz besaß. Als diese Sequenz in eine Aminosäuresequenz übersetzt wurde, entsprach die Sequenz einem Teil des Ziel-Peptids, und somit war bewiesen, dass das erhaltene, klonierte Fragment ein Teil des Gens war, das für das Ziel-Peptid, die CHH-B-α-Ketten-Protein-Untereinheit (AS1051), kodiert.
(3) Markierung der Sonde
pCHAprobe wurde mit den Restriktionsenzymen SacI und BamHI verdaut, für welche Restriktions-Schnittstellen an beiden Enden des klonierten Einsatz-Fragments vorhanden waren, und ein DNA-Fragment mit einer Größe von 340 Basenpaaren wurde durch 2%ige Agarosegel-Elektrophorese abgetrennt. Die DNA wurde unter Verwendung eines DNA-Rückgewinnungs-Kits (Takara EASYTRAP: Takara Shuzo) rückgewonnen, gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung. 25 ng der DNA wurde mit einem Radioisotop markiert, unter Verwendung von [α-³²P]dCTP und einem Zufallsprimer-Markierungs-Kit (Takara Shuzo). Unverbrauchtes [α-³²P]dCTP wurde unter Verwendung einer Gelfiltrations-Nick-Säule (Pharmacia) aus dem Markierungsreaktionsgemisch entfernt, um eine markierte Sonde zu erhalten.
<3> Gewinnung des Ziel-Gens durch Plaque-Hybridisierung
Die cDNA-Phagen-Bibliothek wurde unter Verwendung der obigen Sonde durch Plaque-Hybridisierung nach einem für die gesamte Länge des AS1051-Peptids kodierenden Gen durchsucht.
Die Plaques wurden von der Platte, auf der Plaques der λZAPII-cDNA-Phagen-Bibliothek, wie oben beschrieben, gebildet wurden, gemäß den dem Filter beiliegenden Anweisungen, auf einen Hybond-N-Nylonfilter (Amersham) übertragen. Dieser Filter wurde einer alkalischen Behandlung unterzogen, um die Phagen zu lysieren, und bei 80°C für 2 Stunden erhitzt, so dass die Phagen-DNA auf dem Filter immobilisiert wurde.
Dieser Filter wurde mit 1 × 106 cpm/ml der ³²P-markierten Sonde hybridisiert, in einer Lösung, die 5 × SSPE-Puffer (20 × SSPC: 3,6 M Natriumchlorid, 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,7), 20 mM Dinatrium-EDTA), 30 % Formamid, 5 × Denhartsche Lösung (100 × Denhartsche Lösung: 2 % Rinderserumalbumin, 2 % Ficoll 400, 2 % Polyvinylpyrrolidon) und 0,5 % SDS enthielt, bei 37°C für 16 Stunden. Daraufhin wurde der Filter zweimal in 6 × SSC (20 × SSC: 3 M Natriumchlorid, 0,3 M Trinatriumcitrat) und 0,1 % SDS bei Raumtemperatur gewaschen und des Weiteren zweimal in 2 × SSC und 0,1 % SDS bei 50°C gewaschen, um unspezifisch an den Filter gebundene Sonden zu entfernen. Mit diesem Filter wurde bei –80°C für 24 Stunden Röntgenfilm HP20 (Fuji Photo Film) belichtet. Klone, die sich an Positionen befanden, die positiven Punkten auf dem Film entsprachen, wurden in der primären Suche (Screening) als positive Klone von der Phagenplatte isoliert. Eine ähnliche Suchoperation wurde wiederholt, um positive Klone zu erhalten, die jeweils einen einzelnen Plaque bildeten.
Die λZAPII-cDNA-Phagen der erhaltenen positiven Klone wurden mit einem Helferphagen ExAssist (Stratagene) infiziert und dann zur Infektion von SOLR-Zellen (Stratagene), welche nicht-Amber-Suppressor-Escherichia-coli-Zellen sind, verwendet, um Escherichia coli zu erhalten, worin ein Plasmid enthalten war, worin ein cDNA-Fragment an der EcoRI-Schnittstelle eines pBluescriptSK(-)-Plasmids (Stratagene) eingefügt war. Plasmide wurden durch das alkalische SDS-Verfahren aus den mikrobiellen Zellen isoliert und die Nukleotidsequenzen der Einsatz-Fragmente wurden unter Verwendung eines DNA-Sequenziergeräts A373 (Applied Biosystems) bestimmt.
Im Ergebnis hatten vier positive Klone Nukleotidsequenzen, welche für das Ziel-Peptid kodierten, und Plasmide, welche diese besaßen, wurden als pCHA1, pCHA2, pCHA3 und pCHA4 bezeichnet. Der E. coli-Stamm HB101/pCHA1 (E. coli AJ13023), welcher pCHA1 enthielt, wurde am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science und Technology, Ministry of International Trade and Industry (Postleitzahl: 305–8566, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) am 12. August 1994, als internationale Hinterlegung gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags, hinterlegt, und erhielten die Hinterlegungsnummer FERM BP-4781. Die Nukleotidsequenz des für das AS1051-Peptid kodierende Gen, das wie oben beschrieben kloniert wurde, ist als SEQ ID NO: 5 und die Aminosäuresequenz des Peptids, für das dieses Gen kodiert, ist als SEQ ID NO: 6 im Sequenzprotokoll gezeigt. Dieses Gen besitzt ein typisches Sekretionssignal, das aus 23 Aminosäuren, beginnend mit Methionin, welche eine Translations-Initiations-Aminosäure ist, besteht.
Beispiel 2: Konstruktion eines Expressionssystems für das CHH-B-α-Ketten-Protein (AS1051) unter Verwendung von Escherichia coli
<1> Konstruktion eines Expressionssystems für das Wildtyp-CHH-B-α-Ketten-Protein
Ein Expressionssystem für das CHH-Bα-Ketten-Protein (AS1051-WT), in das keine Mutation eingeführt worden war, unter Verwendung von Escherichia coli, wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 erhaltenen Gens, wie folgt konstruiert. Ein Vektor zur Expression in Escherichia coli wurde unter Verwendung des klonierten Gens konstruiert.
Um das für das AS1051-Peptid (mit Ausnahme eines Signalpeptids) kodierende Gen in einen Expressionsvektor einzubauen, wurden DNA-Primer zur Amplifikation durch PCR synthetisiert. Zu dieser Zeit wurde als 5'-Enden-Primer ein Primer verwendet, der eine NcoI-Erkennungssequenz einschloß (ASBN: SEQ ID NO: 7), so dass das 5'-Ende des amplifizierten Fragments die NcoI-Schnittstelle aufweisen sollte. Des Weiteren besaß dieser Primer eine ATG-Nukleotidsequenz (Nukleotidnummern 10 bis 12 in SEQ ID NO: 7), welche ein Translations-Initiations-Kodon war, vor dem Kodon der N-terminalen Aminosäure des AS1051-Peptids, d.h. Asparaginsäure, auf der 5'-Enden-Seite. Dieses Initiations- Kodon überlappte mit der NcoI-Erkennungssequenz (Nukleotidnummern 8 bis 13 in SEQ ID NO: 7). Als 3'-Enden-Primer wurde ein Primer verwendet, der eine HindIII-Erkennungssequenz (SEQ ID NO: 8, die HindIII-Erkennungssequenz entspricht den Nukleotidnummern 4 bis 9) einschloß.
Das für das AS1051-Peptid kodierende Gen wurde unter Verwendung dieser Primer durch PCR amplifiziert. PCR wurde mit einem Zyklus von Reaktionen bei 94°C für 15 Sekunden, bei 35°C für 1 Minute und bei 72°C für 2 Minuten, der 25mal wiederholt wurde, durchgeführt. Das PCR-Reaktionsgemisch wurde einer Phenol/Chloroform-Behandlung unterzogen, um Taq-Polymerase zu desaktivieren. Das amplifizierte DNA-Fragment von 400 Basenpaaren wurde durch Ethanolfällung gereinigt und mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII verdaut. Dieses DNA-Fragment und ein mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII verdautes Plasmid pUC18 (Takara Shuzo) wurden unter Verwendung eines Ligations-Kits (Takara Shuzo) ligiert. Der E. coli-Stamm JM109 wurde durch das Verfahren der kompetenten Zellen mit dem erhaltenen Plasmid transformiert und bei 37°C für 16 Stunden auf einer Ampicillin-enthaltenden Platte kultiviert, um einen Transformanten zu erhalten.
Ein Plasmid wurde durch das alkalische SDS-Verfahren aus einem herangewachsenen Transformanten isoliert. Die Konstruktion des Ziel-Plasmids wurde durch Bestimmung der Nukleotidsequenz, unter Verwendung der M13M4- und M13RV-Primer (welche beide von Takara Shuzo hergestellt werden) und eines 377PRISM-DNA-Sequenziergeräts (Perkin-Elmer), bestätigt. Das hergestellte Plasmid wurde als pUCASBNH bezeichnet. Das pUCASBNH wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und HindIII verdaut und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um DNA von 400 Basenpaaren abzutrennen und zu reinigen. Diese DNA wurde mit einem Produkt ligiert, das erhalten wurde durch Verdau eines Expressionsvektors pTrcHisA (Invitrogen) mit den Restriktionsenzymen NcoI und HindIII, unter Verwendung des Ligations-Kits. Der E. coli-Stamm JM109 wurde durch das Verfahren der kompetenten Zellen mit dem erhaltenen Plasmid transformiert und auf einer Ampicillin-enthaltenden Platte bei 37°C für 16 Stunden kultiviert, um einen Transformanten zu erhalten. Der wie oben beschrieben erhaltene Expressionsvektor wurde als pTrcASWT bezeichnet. Das obige Plasmid-Konstruktionsverfahren ist in 1 dargestellt.
<2> Konstruktion eines Expressionssystems für mutiertes CHH-B-α-Ketten-Protein
Ein Expressionssystem unter Verwendung von Escherichia coli für das Protein, in dem der Cysteinrest in der Position 81 zu einem Alaninrest mutiert wurde (AS1051-Ala) wurde wie folgt konstruiert. Eine Mutation wurde durch das in "PCR-Protocols" (Ausgabe von Academic Press) beschriebene ortsgerichtete Nukleotidsequenz-Mutationsverfahren in das AS1051-Gen eingeführt, so dass ein Cysteinrest (der Cysteinrest in der Position 81 in SEQ ID NO: 1), der im AS1051-Peptid nicht in eine Disulfidbrücke involviert ist, durch Alanin ersetzt wurde. PCR wurde unter Verwendung von pCHA1 als Matrize und dem Primer ASBN (SEQ ID NO: 7) sowie einem neu synthetisierten Primer ASAlaR (SEQ ID NO: 9), oder dem Primer ASH (SEQ ID NO: 8) und einem neu synthetisierten ASAlaF (SEQ ID NO: 10), durchgeführt. Jedes Reaktionsprodukt wurde einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen und ein amplifiziertes DNA-Fragment wurde aus dem Gel extrahiert. Die zweite PCR wurde unter Verwendung jedes DNA-Fragments als Matrize sowie den Primern ASBN und ASH durchgeführt, um ein mutiertes Gen herzustellen.
Die PCR-amplifizierte DNA wurde mit einem Restriktionsenzym verdaut und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, und DNA von 400 Basenpaaren wurde aus dem Gel extrahiert. Diese DNA wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII verdaut. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem durch die Restriktionsenzyme BamHI und HindIII verdauten Plasmid pUC18 (Takara Shuzo) ligiert, unter Verwendung eines Ligations-Kits (Takara Shuzo). Der E. coli-Stamm JM109 wurde durch das Verfahren der kompetenten Zellen mit dem erhaltenen Plasmid transformiert und auf einer Ampicillin-haltigen Platte bei 37°C für 16 Stunden kultiviert, um einen Transformanten zu erhalten.
Ein Plasmid wurde mit dem alkalischen SDS-Verfahren aus dem herangewachsenen Transformanten isoliert. Die Konstruktion des Ziel-Plasmids wurde bestätigt, indem die Nukleotidsequenz unter Verwendung der M13M4- und M13RV-Primer (beide von Takara Shuzo) und einem 377PRISM-DNA-Sequenziergerät (Perkin-Elmer) bestimmt wurde. Das isolierte Plasmid wurde als pUCASAla bezeichnet. Das Plasmid pUCASAla wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und HindIII verdaut und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um DNA von 400 Basenpaaren abzutrennen und zu reinigen. Dieses DNA-Fragment wurde mit einem durch Verdau des Expressionsvektors pTrcHisA (Invitrogen) mit den Restriktionsenzymen NcoI und HindIII erhaltenen Produkt ligiert, unter Verwendung des Ligations-Kits. Der E. coli-Stamm JM109 wurde mit dem Verfahren der kompetenten Zellen mit dem erhaltenen Plasmid transformiert und auf einer Ampicillin-haltigen Platte bei 37°C für 16 Stunden kultiviert, um einen Transformanten zu erhalten. Der wie oben beschrieben hergestellte Expressionsvektor wurde als pTrcASAla bezeichnet. Das obige Plasmid-Konstruktionsverfahren ist in 2 abgebildet.
Beispiel 3: Produktion von AS1051-WT und AS1051-Ala durch E. coli und Herstellung der aktiven Form durch Neufaltung von AS1051-WT und AS1051-Ala
<1> Herstellung von Einschlusskörpern von AS1051-WT und AS1051-Ala
Die transformierten E. coli-Stämme JM109, die die Expressionsvektoren pTrcASWT und pTrcASAla für AS1051-WT und AS1051-Ala enthielten, wurden jeweils bei 37°C in L-broth (1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Natriumchlorid, 100 μg/ml Natrium-Ampicillin) kultiviert, unter Verwendung von Sakaguchi-Kolben. IPTG (Isopropyl-β-thiogalaktopyranosid) wurde zu 10 mM zugegeben, als die Trübung 0,5 erreichte, und sie wurden bei 37°C für 4 Stunden weiter kultiviert. Die mikrobiellen Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und gewaschen. Daraufhin wurden die mikrobiellen Zellen in einer 0,5 M EDTA-Lösung suspendiert. Daraufhin wurde zu dieser Lysozym gegeben, und die Suspension wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen. Die Suspension der mikrobiellen Zellen wurde durch ein Ultraschallgerät (200 W, 5 Minuten) aufgeschlossen, und das aufgeschlossene Gemisch wurde zentrifugiert, um Einschlusskörper als Präzipitate zu erhalten.
<2> Herstellung der aktiven Form durch Neufaltung von AS1051-WT und AS1051-Ala
Die erhaltenen Einschlusskörper wurden in 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), enthaltend 7 M Guanidinhydrochlorid und 10 mM EDTA, aufgelöst. Daraufhin wurde destilliertes Wasser in einem Volumen von 2,5mal der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C stehengelassen. Die Lösung wurde gegen 0,9%ige Kochsalzlösung dialysiert, unter Verwendung einer Dialysemembran, verwendend Spectra Por1 (Spectra), um Guanidinhydrochlorid zu entfernen. 3 zeigt die Ergebnisse der Fraktionierung von Lösungen von AS1051-WT und AS1051-Ala vor und nach der Dialyse durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatografie (high performance liquid chromatography, HPLC) unter Verwendung einer Phasenumkehrsäule (Pegasil ODS300, Senshu Kagaku). In 3 stellt a) die Ergebnisse für die Lösung vor der Dialyse dar und b) stellt die Ergebnisse für die Lösung nach der Dialyse dar. Es wurde festgestellt, dass AS1051-Ala, sogar wenn das Guanidinhydrochlorid entfernt wurde, stabil war, wohingegen das durch Neufaltung erhaltene AS1051-WT-Protein nach dem Entfernen von Guanidinhydrochlorid durch Dialyse unlöslich gemacht wurde.
Zur Lösung von AS1051-Ala nach der Dialyse wurde 1/9 Volumen von 0,5 M Ammoniumacetat-Puffer (pH 4,5) hinzugefügt, und das Gemisch wurde auf eine Ionenaustauschsäule unter Verwendung von CM-TOYOPEARL 6505 (2,6 × 40 cm) adsorbiert und mit Elutionslösung A (50 mM Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5)) und Elutionslösung B (0,5 M Ammoniumacetatpuffer (pH 6,4)) eluiert. Die Elution wurde mit einer Lösung von A:B = 75:25 für 20 Minuten durchgeführt, und daraufhin mit einem linearen Gradienten von A:B = 75:25 bis A:B = 50:50 für 30 Minuten. Auf diese Weise wurde ein eluierte Fraktion, die gereinigtes AS1051-Ala enthielt, erhalten.
Beispiel 4: Antigenizitätstest von AS1051-Ala in Meerschweinchen
Um die Antigenität des AS1051-Proteins, in dem der Cysteinrest an der Position 81 durch den Alaninrest ersetzt war (AS1051-Ala) in einem Meerschweinchen zu bestätigen, wurde ein Test wie folgt durchgeführt. Die Proteine wurden durch ein Mikroassay-Verfahren unter Verwendung eines Protein-Assays von Bio-Rad (Bio-Rad) quantifiziert, unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standard.
An weibliche Hartley-Meerschweinchen (Körpergewicht 200 bis 250 g) wurden AS1051-Ala (300 μg/kg) oder eine physiologische Kochsalzlösung dreimal jeden zweiten Tag mittels aurikulärer Venen verabreicht. Die Dosis war 1 ml/kg und jede Gruppe bestand aus 10 Tieren (n = 10). 3 Wochen nach der dritten Verabreichung wurde jede Verabreichungsgruppe weiter in zwei Gruppen unterteilt, und AS1051-Ala (300 μg/kg) (jeweils n = 5) oder eine physiologische Kochsalzlösung (jeweils n = 5) wurde an jede Gruppe verabreicht. Ungefähr 20 Minuten später wurde eine abdominale Sektion unter Etherisierung durchgeführt, und 8 ml Blut wurde aus der abdominalen Aorta gesammelt (0,38 % Natriumcitrat wurden hinzugefügt), unter Verwendung einer 23G-Injektionsnadel. Die Anzahl von Plättchen in dem gesammelten Blut wurde unter Verwendung eines automatischen Zellzählgeräts (Sysmex E-2000, Toa medizinische Elektronik) gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Eine deutliche Abnahme von Plättchen wurde nur in der Gruppe beobachtet, in welcher AS1051-Ala in den einleitenden und abschließenden Verabreichungen verabreicht wurde (AS/AS-Gruppe). In der Gruppe, in der die physiologische Kochsalzlösung in der einleitenden Verabreichung verabreicht wurde und AS1051-Ala in der abschließenden Verabreichung verabreicht wurde (Kochsalzlösung/AS-Gruppe), war die Anzahl von Blutplättchen die gleiche, als jene der Kontrollgruppe (Kochsalzlösung in sowohl der einleitenden als auch der abschließenden Verabreichung (Kochsalzlösung/Kochsalzlösung-Gruppe)). Daher ging man davon aus, dass die in der AS/AS-Gruppe beobachtete Abnahme von Blutplättchen der Antigenität des bei der einleitenden Verabreichung verabreichten A51051-Ala zugeschrieben werden konnte.
Des Weiteren wurde durch Zentrifugation (4°C, 2700 U/min, 10 Minuten) Plasma von dem gesammelten Blut getrennt und das Vorhandensein von Antikörpern gegen AS1051-Ala wurde durch ein Enzym-verbundenes Immun-Sorptions-Test- (ELISA-) Verfahren bestimmt. 50 μl AS1051-Ala (1 μg/ml) oder nur ein Puffer wurde jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen für ELISA hinzugefügt und über Nacht bei 4°C stehengelassen, um die Vertiefung auszukleiden. Daraufhin wurde jede Vertiefung dreimal mit PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung), enthaltend 0,05 % Tween-20, gewaschen und mit PBS (150 μl), 5 % entrahmte Milch auflösend, blockiert. Jede Vertiefung wurde des Weiteren dreimal gewaschen. 50 μl des gesammelten Meerschweinchenplasmas wurde hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde stehengelassen. Daraufhin wurde jede Vertiefung dreimal gewaschen. 50 μl einer Lösung, die erhalten wurde durch Auflösung von mit alkalischer Phosphatase markiertem Kaninchen-anti-Meerschweinchen-IgG-(H+L)-Antikörper (Zymed) 500fach mit einem Verdünnungspuffer (0,05 M Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM MgCl₂, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween-20, 0,02 % NaN₃, 1 % Rinderserumalbumin) verdünnt wurde, wurden hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde stehengelassen. Jede Vertiefung wurde dreimal gewaschen, und 1 mg/ml einer chromogenen Substrat- (p-Nitrophenylphosphat) Lösung (1 M Diethanolamin (pH 9,8)/0,5 mM MgCl₂) wurde hinzugefügt. Nach einer angemessenen Zeit für die Reaktion wurde die Absorption bei 405 nm gemessen. 5 zeigt die Absorption von Reaktionsgemischen in den mit AS1051-Ala (AS1051) ausgekleideten Vertiefungen und den Vertiefungen ohne Auskleidung (keines) für die AS/Kochsalzlösung-Gruppe und die Kochsalzlösung/Kochsalzlösung-Gruppe. Als Ergebnis der Messung wurde das Vorhandensein von an AS1051-Ala gebundenen Antikörpern in der AS/Kochsalzlösung-Gruppe nachgewiesen.
Beispiel 5: Herstellung von Polyethylen-glykoliertem AS1051-Protein (AS1051-PEG)
(1) Verfahren unter Verwendung von PEG-ierendem Reagenz mit einem Molekulargewicht von 5000
Das erfindungsgemäße Polyethylen-glykolierte Protein (AS1051-PEG) wurde wie folgt hergestellt. In der gleichen Weise als in Beispiel 3 wurden unter Verwendung von E. coli hergestellte Einschlusskörper von AS1051-WT in 0,5 M Tris- HCl-Puffer (pH 8,5), enthaltend 7 M Guanidinhydrochlorid und 10 mM EDTA, aufgelöst. Daraufhin wurde destilliertes Wasser in einem Volumen von 2,5mal der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C stehengelassen.
Des Weiteren wurde zu dieser Lösung ein Polyethylen-glykolierendes Reagenz mit einem Molekulargewicht von ungefähr 5000 (Methoxy-PEG-mal, MW 5000, Produkt Nr.: M-MAL-5000, Shearwater Polymers), welches Maleimidgruppen besaß, bei einer Konzentration von 0,2 mg/ml hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden stehengelassen. Diese Lösung wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert, unter Verwendung einer Dialysemembran, verwendend Spectra Por1 (Spectra), um Guanidinhydrochlorid zu entfernen. Zur Lösung nach der Dialyse wurde 1/9 Volumen von 0,5 M Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5) hinzugefügt und die Lösung wurde an eine Ionenaustauschsäule unter Verwendung von CM-TOYOPEARL 6505 (2,6 × 40 cm) adsorbiert und unter Verwendung von Elutionslösung A (50 mM Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5)) und Elutionslösung B (0,5 M Ammoniumacetatpuffer (pH 6,4)) eluiert. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von A:B = 80:20 bis A:B = 70:30 (20 Minuten) durchgeführt und dann mit einem linearen Gradienten von A:B = 70:30 bis A:B = 55:45 (30 Minuten). Auf diese Weise wurde eine eluierte Fraktion, die gereinigtes AS1051-PEG enthielt, erhalten.
(2) Verfahren unter Verwendung von PEG-ierendem Reagenz mit einem Molekulargewicht von 20.000
Das erfindungsgemäße, Polyethylen-glykolierte AS1051-Protein (AS1051-PEG20000) wurde, unter Verwendung eines Polyethylen-glykolierenden Reagenzes mit einem Molekulargewicht von 20.000 (Methoxy-PEG-mal, MW 20.000, Produkt Nr.: M-MAL-20000, Shearwater Polymers), wie folgt hergestellt. In der gleichen Weise wie in Beispiel 3 wurden unter Verwendung von E. coli hergestellte Einschlusskörper von AS1051-WT in 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), enthaltend 7 M Guanidinhydrochlorid und 10 mM EDTA, aufgelöst. Daraufhin wurde destilliertes Wasser in einem Volumen von 2,5mal der Lösung hinzugefügt und das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C stehengelassen.
Des Weiteren wurde zu dieser Lösung das Polyethylen-glykolierende Mittel mit einem Molekulargewicht von 20.000, welches Maleimidgruppen besitzt, bei einer Konzentration von 0,8 mg/ml hinzugefügt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden stehengelassen. Diese Lösung wurde gegen eine physiologische Kochsalzlösung dialysiert, unter Verwendung einer Dialysemembran, verwendend Spectra Por1 (Spectra) dialysiert, um Guanidinhydrochlorid zu entfernen, an eine Ionenaustauschsäule unter Verwendung von TSK-Gel CM-5PW (0,75 × 7,5 cm) adsorbiert und mit Elutionslösung A (50 mM Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5)) und Elutionslösung B (0,5 M Ammoniumacetatpuffer (pH 6,4)) eluiert. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von A:B = 100:0 bis A:B = 40:60 (20 Minuten) und dann mit einem linearen Gradienten von A:B = 40:60 bis A:B = 0:100 (5 Minuten) durchgeführt. Auf diese Weise wurde eine eluierte Fraktion, die gereinigtes AS1051-PEG20000 enthielt, erhalten.
Beispiel 6: Struktur von AS1051-PEG
SDS-Elektrophorese zeigte, dass das Molekulargewicht des erhaltenen AS1051-PEG 25 kDa war, ungefähr 10 kDa größer als jenes von AS1051-Ala, welches nicht Polyethylen-glykoliert war (15 kDa). Da Polyethylenglykol bei einer Größe beobachtet wird, die, aufgrund der Hydration in der SDS-Elektrophorese, doppelt so groß wie das ursprüngliche Molekulargewicht ist, wurde bestätigt, dass ein Molekül Polyethylenglykol (Molekulargewicht von ungefähr 5000) an ein Molekül von AS1051-PEG gebunden war. Des Weiteren war das Molekulargewicht des AS1051-PEG20000 55 kDa, welches ungefähr 40 kDa größer ist als jenes von AS1051-Ala. Wie im Fall von AS1051-PEG wurde bestätigt, dass ein Molekül Polyethylenglykol (Molekulargewicht von ungefähr 20.000) an ein Molekül von AS1051-PEG20000 gebunden war.
Anschließend wurde die Polyethylenglykol-bindende Position in AS1051-PEG und die Verbindung von Disulfidbrücken der anderen Cysteinreste wie folgt bestimmt. AS1051-PEG (100 μg) wurde mit Lysylendopeptidase (5 μg, Wako Pure Chemical Industries) in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), enthaltend 2 mM EDTA bei 37°C für 5 Stunden verdaut und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatografie unter Verwendung einer Phasenumkehrsäule (Vydac 218TP54, Vydac) fraktioniert. Elution wurde mit einem linearen Gradienten von Wasser/Acetonitril, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) (Acetonitril-Konzentration von 0 bis 50 % für 10 Minuten, Acetonitril-Konzentration von 50 % bis 100 % für 5 Minuten) durchgeführt. Auf diese Weise wurden mit Lysylendopeptidase verdaute Peptidketten als Peaks 1 bis 6 (6) erhalten.
Die Aminosäuresequenz jeder Peptidkette wurde unter Verwendung eines Protein-Sequenziergeräts Modell 476A (Applied Biosystems) analysiert. Da zwei Cysteinreste in der Kette von Peak 3 enthalten waren, wurde daraus geschlossen, dass diese beiden Cysteinreste unter Bildung einer Disulfidbrücke gekoppelt waren. Des Weiteren wurde festgestellt, dass Peak 5 aus insgesamt drei Peptidketten bestand, worin zwei Peptidketten, enthaltend einen Cysteinrest, und eine Peptidkette, enthaltend zwei Cysteinreste, durch Disulfidbrücken gekoppelt waren. Die Peptidketten dieses Peaks 5 wurden weiter mit V8-Protease (5 μg, Wako Pure Chemical Industries) in 10 mM Ammoniumcarbonatpuffer bei 25°C für 24 Stunden verdaut und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatografie unter Verwendung einer Phasenumkehrsäule (Pegasil ODS-II, Senshu Kagaku) fraktioniert. Elution wurde mit einem linearen Gradienten von Wasser/Acetonitril, enthaltend 0,1 % (TFA) durchgeführt (Acetonitril-Konzentration von 0 bis 50 % für 20 Minuten). Auf diese Weise wurden mit V8-Protease verdaute Peptidketten separat gesammelt und ihre Aminosäuresequenzen analysiert.
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Polyethylenglykolkette an einen Cysteinrest, der der Aminosäure der Nummer 81 in SEQ ID NO: 1 entsprach, gebunden war, und dass die Peptide des Peaks 5 eine solche Disulfidbrücke, wie sie in 6 gezeigt ist, besaßen. Das Schema von Disulfidbrücken in AS1051-PEG, das wie oben beschrieben bestimmt wurde, war das gleiche, als im veröffentlichten AS1051 (N. Fukuchi et al., WO 95/08573) oder anderen, ähnlichen Proteinen, die aus Schlangengift stammen.
Beispiel 7: In-vitro-Aktivität von AS1051-PEG
<1> Messung der die Aggregation von Blutplättchen inhibierenden Aktivität von AS1051-PEG
Die die Aggregation von Blutplättchen inhibierende Aktivität von in Beispiel 5 erhaltenem AS1051-PEG wurde mittels eines unten beschriebenen Verfahrens gemessen. Als Erstes wurde zu von einer Vene gesammeltem humanem Blut 0,38 % Natriumcitrat hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei 1000 U/min für 15 Minuten zentrifugiert, um Bluttplättchen-reiches Plasma zu erhalten. Die die Aggregation von Blutplättchen inhibierenden Aktivitäten von AS1051-PEG und AS1051-Ala wurden durch einen Aggregometer (HEMA TRACER 801, Niko Bioscience) gemessen. Eine Probe wurde im voraus zu 100 μl Blutplättchen-reichem Plasma hinzugefügt, bei 37°C für 2 Minuten gerührt und inkubiert. Daraufhin wurde 1/10 Volumen einer Aggregation-induzierenden Substanz in einer 10fachen Konzentration hinzugefügt, und die Blutplättchen-Aggregation wurde für 8 Minuten beobachtet. Als Aggregation-induzierende Substanz wurden Ristocetin (1,2 mg/ml, Sigma), Kollagen (10 μg/ml, MC Medical) und Adenosindiphosphat (10 μM, MC Medical) verwendet. Wie in 7 gezeigt, war die die Ristocetin-Aggregation inhibierende Aktivität von AS1051-PEG etwas stärker als jene von AS1051-Ala. Des Weiteren inhibierten weder AS1051-Ala noch AS1051-PEG die Aggregation durch Kollagen oder die Aggregation durch Adenosindiphosphat.
<2> Messung der die Bindung von von-Willebrand-Faktor (vWF) an Blutplättchen inhibierenden Aktivität
Die Inhibition der Bindung von Blutplättchen an von-Willebrand-Faktor (vWF) durch AS1051-Ala und AS1051-PEG wurde unter Verwendung von immobilisierten Blutplättchen und ¹²⁵I-markiertem vWF bestimmt.
¹²⁵I-markiertes vWF wurde durch ein unten beschriebenes Verfahren hergestellt. In einem Röhrchen für ¹²⁵I-Markierung wurden 1,5 ml Iodogenlösung (0,5 mg/ml, Piearce) in Dichlormethan vorgelegt und das Lösungsmittel wurde unter einem Stickstoffstrom entfernt, um Iodogen als Festphase zu immobilisieren. Durch Gelfiltration erhaltenes vWF von hohem molekularem Gewicht (0,19 mg/1,5 ml) wurde zum Röhrchen mit immobilisiertem Iodogen hinzugefügt. Daraufhin wurden 18,5 Mbq Na¹²⁵I hinzugefügt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Minuten der Reaktion überlassen. Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch auf eine PD10-Säule (Pharmacia Biotech), welche mit Rinderserumalbumin (BSA) blockiert und im voraus gewaschen war, aufgetragen und mit TBS (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,15 M NaCl) eluiert. Das Eluat wurde in 0,5 ml Fraktionen gesammelt und die ¹²⁵I-spezifische Aktivität jeder Fraktion wurde unter Verwendung einer gamma-Zählvorrichtung, Packard Multi Prias 4, bestimmt. Fraktionen, die eine große Menge an ¹²⁵I-vWF enthielten, wurden gesammelt, in mehrere Röhrchen aufgeteilt und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
Botrocetin wurde wie folgt gereinigt. 1 g einer lyophilisierten Zubereitung von rohem Gift von Botrops jararaca (Sigma, V-5625) wurde in 20 ml 0,9%iger Kochsalzlösung aufgelöst. Unlösliche Substanzen wurden durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wurde unter Verwendung einer Sephadex G-75-Säule (ϕ5 × 90 cm, Entwicklungslösung: 0,9%ige Kochsalzlösung, Flussrate: 4 ml/min) unterzogen. Fraktionen von 15 ml wurden gesammelt und aktive Fraktionen (Fraktionen Nrn. 49 bis 58, 150 ml) wurden vereinigt. Nach Zugabe von 1/10 Volumen 1 M Tris-HCl (pH 7,4) wurde das Gemisch auf einer DEAE-TOYOPEARL 650M (ϕ16 × 300 mm) adsorbiert und mit einem Konzentrationsgradienten von NaCl (0,15 M für 200 Minuten, von 0,15 M bis 0,4 M für 400 Minuten, Flußrate: 0,5 ml/min) eluiert. Die aktiven Fraktionen (570 bis 630 Minuten, 30 ml) wurden gesammelt, um gereinigtes Botrocetin zu erhalten.
Fixierte Blutplättchen wurden wie folgt hergestellt. Zu humanem Blutplättchen-reichem Plasma (PRP), das durch Zentrifugation von aus einem gesunden menschlichen Subjekt gesammeltem frischen Blut, zu dem 1/10 Volumen 3,8%iges Natriumcitrat hinzugefügt wurde, bei 900 U/min für 15 Minuten, erhalten wurde, wurde ein gleiches Volumen einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), auflösend 2 % Paraformaldehyd, hinzugefügt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C stehengelassen. Daraufhin wurden die Blutplättchen durch Zentrifugation gesammelt und zweimal mit 0,15 M wässriger Natriumchloridlösung in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) gewaschen. Nach dem Waschen wurden fixierte Plättchen in der gleichen Lösung suspendiert und gelagert.
Zu jeder Vertiefung einer Filterplatte mit 96 Vertiefungen (0,45 μM, Millipore Multiscreen HV, Millipore) zur Durchführung eines Tests wurde 1%iges BSA/TBS (100 μl) hinzugefügt und für mehrere Stunden stehengelassen, um den Filter im voraus zu blockieren. Zu jeder Vertiefung wurden 20 μl einer Suspension, erhalten durch 10fache Verdünnung der obengenannten, fixierten Blutplättchensuspension mit TBS, und 5 μl einer Probe und weitere 20 μl einer ¹²⁵I-markierten vWF-Lösung (ungefähr 800.000 cpm), enthaltend 0,8 μg/ml des obengenannten Botrocetins oder 2,4 mg/ml Ristocetin (Sigma) hinzugefügt und für 30 Minuten stehengelassen. Die Lösung in den Vertiefungen wurde durch Absaugen filtriert, und daraufhin wurde TBS (100 μl), enthaltend 0,05 % Tween-20, hinzugefügt und es wurde weiter durch Absaugen gewaschen. Der Filter wurde von der Filterplatte mit 96 Vertiefungen nach dem Waschen unter Verwendung einer Stanzvorrichtung (Millipore, Modellnr. MAPK 896 OB) entfernt und in Polystyrolröhrchen mit einem Volumen von 6 ml aufgeteilt, und die ¹²⁵I-Strahlungsdosis wurde unter Verwendung eines Packard Multi Prias 4 gemessen.
Als Ergebnis wurde, wie in 8 gezeigt, bestätigt, dass die Aktivität von AS1051-PEG zur Inhibierung der durch Ristocetin und Botrocetin induzierten Bindung von vWF an immobilisierte Blutplättchen etwa schwächer war als jene von AS1051-Ala, jedoch beinahe vergleichbar. Des Weiteren besaß AS1051-PEG20000 ebenfalls beinahe die gleiche Aktivität als jene von AS1051-PEG, in beiden Verfahren.
Beispiel 8: Antigenizitätstest von AS1051-PEG in Meerschweinchen
Ein Test zum Vergleich der Antigenität in einem Meerschweinchen des in Beispiel 6 (1) beschriebenen Polyethylen-glykolierten Proteins (AS1051-PEG, die PEG-Gruppe besaß ein Molekulargewicht von 5000) und jener von AS1051-Ala wurde in der gleichen Weise durchgeführt, als im in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren. Das Protein wurde in der gleichen Weise, als in Beispiel 4 für AS1051-Ala quantifiziert. Betreffend AS1051-PEG, wurde das Protein durch Vergleich der Elutionspeakfläche bei 280 nm, erhalten durch Phasenumkehr-HPLC, mit jener von AS1051-Ala quantifiziert. Die gleiche Fläche wurde definiert als die gleiche Menge an Proteinen. Die Dosen von AS1051-Ala und AS1051-PEG waren bei allen Verabreichungen 200 μg/kg. Die Subjekte wurden in drei Gruppen aufgeteilt, nämlich die AS-Ala-Gruppe (dreimalige einleitende Verabreichung von AS1051-Ala und abschließende Verabreichung von AS1051-Ala), AS-PEG-Gruppe (dreimalige einleitende Verabreichung von AS1051-PEG und abschließende Verabreichung von AS1051-PEG) und Kochsalzlösungsgruppe (dreimalige einleitende Verabreichung von physiologischer Kochsalzlösung und abschließende Verabreichung von physiologischer Kochsalzlösung), bei n = 4 für jede Gruppe (n = 3 in der AS-PEG-Gruppe), um ein Experiment durchzuführen. Als Ergebnis wurde, wie in 9 gezeigt, kein Unterschied in der Anzahl von Blutplättchen zwischen der AS-PEG-Gruppe und der Kochsalzlösungsgruppe beobachtet, und eine wesentliche Abnahme von Blutplättchen wurde in der AS-Ala-Gruppe im Vergleich mit der AS-PEG-Gruppe und der Kochsalzlösungsgruppe beobachtet. Da man davon ausgeht, dass diese Abnahme der Blutplättchen einer Antigenität, wie in Beispiel 4 gezeigt, zugeschrieben werden kann, zeigen diese Ergebnisse klar, dass AS1051-PEG eine im Vergleich zu AS1051-Ala verminderte Antigenität aufweist.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Peptid, das aus einem oligomeren Protein stammt, in einer Form hergestellt werden, die eine vorzüglichere Löslichkeit und Stabilität sowie eine verminderte Antigenität im Vergleich zu jenen, die durch konventionelle Verfahren erhalten wurden, aufweist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Herstellen einer Peptid-Untereinheit, die aus einem oligomeren Protein mit Disulfidbrücken innerhalb einer Untereinheit und zwischen Untereinheiten stammt, welches die folgenden Schritte umfaßt: a) den Schritt des Entfaltens der Peptid-Untereinheit durch Denaturieren des oligomeren Proteins oder dessen Peptid-Untereinheit in einer Lösung mit einem Proteine denaturierenden Mittel und das Entfernen des Denaturierungsmittels aus der Lösung in Gegenwart eines Polyoxyalkylpolyethers mit einer funktionellen Gruppe, die mit einer Thiolgruppe reagiert; und b) den Schritt des Isolierens der Peptid-Untereinheit, die an den Polyoxyalkylpolyether gebunden ist, aus der Lösung.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Peptid-Untereinheit, die in Schritt (b) isoliert wird, verminderte Antigenität aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das oligomere Protein ein Dimer ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Polyoxyalkylpolyether mit der funktionellen Gruppe, die mit der Thiolgruppe reagiert, Polyethylenglycol mit einer Maleimidgruppe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Peptid-Untereinheit, die aus dem oligomeren Protein stammt, ein rekombinantes Protein ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das oligomere Protein oder dessen Peptid-Untereinheit unter reduzierenden Bedingungen denaturiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die physiologische Aktivität des oligomeren Proteins aus einer Peptid-Untereinheit hervorgeht, die das oligomere Protein bildet, und die Peptid-Untereinheit, die an den Polyoxyalkylpolyether gebunden ist, die physiologische Aktivität aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Peptid-Untereinheit, die an den Polyoxyalkylpolyether gebunden ist, die Aktivität besitzt, die physiologische Aktivität des oligomeren Proteins zu inhibieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Polyoxyalkylpolyether an einen Cysteinrest der Cysteinreste in der Peptid-Untereinheit gebunden ist, der ursprünglich an der Bildung einer Disulfidbrücke zwischen den Untereinheiten in dem oligomeren Protein beteiligt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die an den Polyoxyalkylpolyether gebundene Peptid-Untereinheit eine Disulfidbrücke hat, die mit einer Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheit in dem oligomeren Protein identisch ist.