DE69804839T2

DE69804839T2 - Cd8 als inhibitor des zellulären immunsystems

Info

Publication number: DE69804839T2
Application number: DE69804839T
Authority: DE
Inventors: Gao; Conrad Gerth; Karsten Jakobsen; Kelvin Sewell
Original assignee: Avidex Ltd
Current assignee: Avidex Ltd
Priority date: 1997-10-28
Filing date: 1998-10-28
Publication date: 2002-10-10
Anticipated expiration: 2018-10-29
Also published as: DE69804839D1; JP2001521005A; NO20002148D0; ES2175798T3; PT1024822E; GB9722779D0; KR100585246B1; HK1031099A1; CN1283120A; CA2308463A1; EP1024822B1; WO1999021576A1; NO20002148L; ATE215833T1; KR20010024570A; NZ504240A; EP1024822A1; AU9637498A; CN1256147C; DK1024822T3

Description

Diese Erfindung betrifft Verwendungen wie in den Patentansprüchen definiert zur Hemmung von Immunantworten, insbesondere von zellulären Immunantworten, an denen CD8-positive Lymphozyten beteiligt sind, unter Verwendung von löslichen (oder nicht- zellulären) Formen von CD8. Die Erfindung bezieht sich auch auf Zusammensetzungen, die lösliche Formen von CD8 umfassen und auf Multimere des löslichen CD8 wie in den Patentsprüchen definiert.

EINLEITUNG

Klasse-I- und -II-Proteine des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC oder HLA beim Menschen) binden Peptidantigene und präsentieren diese auf der Zelloberfläche, damit sie von T-Lymphozyten, die einen bestimmten T-Zellrezeptor (TZR) exprimieren, welcher zu der spezifischen MHC-Peptid-Kombination passt, erkannt werden. Die transmembranären Glykoproteine CD8 und CD4 sind kennzeichnend für bestimmte Populationen von T- Lymphozyten, deren Antigenantworten durch Klasse-I- bzw. Klasse-II-MHC-Moleküle begrenzt sind. CD8 und CD4 spielen eine wichtige Rolle sowohl bei der Differenzierung und Selektion von T-Zellen während der Entwicklung im Thymus als auch bei der Aktivierung reifer T-Lymphozyten als Reaktion auf antigenpräsentierende Zellen. CD8 und CD4 gelten daher als hauptsächliche Hilfsmoleküle für T-Zellrezeptoren. Obwohl CD8 und CD4 zu der Superfamilie der Immunglobulinproteine gehören, und die Antigenrestriktion durch die Bindung an MHC-Moleküle, jedoch nicht an das Antigenpeptid, festlegen, scheint die strukturelle Basis ihrer vergleichbaren Funktion sehr unterschiedlich zu sein. Ihre Sequenzähnlichkeit ist gering, und während CD4 auf der Zelloberfläche als Monomer exprimiert ist, wird CD8 als αα-Homodimer oder αβ-Heterodimer exprimiert.
Die Expression von CD8 ist kennzeichnend für zytotoxische T-Lymphozyten (ZTL) und ist wichtig für deren Reifung durch den Vorgang der "positiven Selektion" während der Differenzierung im Thymus. Bei reifen zytotoxischen T-Lymphozyten ist die immunologische Rolle von CD8 komplex und bisher noch nicht vollständig aufgeklärt. Auf der Grundlage des derzeitigen Wissensstandes sind drei mögliche Aufgaben in Bezug auf die Funktion der ZTL denkbar. Erstens spielt CD8 eine Rolle bei der T-Zellsignalisierung. Zweitens besteht eine signifikante Aufgabe von CD8 darin, die Zell-Zelladhäsion zu unterstützen, indem es die T-Zelle durch eine Verstärkung der Avidität der Wechselwirkungen an die antigenpräsentierende Zelle bindet. Bei den meisten, jedoch nicht allen, Fällen kann die zielgerichtete Zell-Lyse reifer zytotoxischer T-Lymphozyten durch anti-CD8- Antikörper blockiert werden. Drittens könnte CD8 als Korezeptor für TZR dienen, was einen Mechanismus für kollaborative Bindung der beiden Rezeptoren an den MHC-Peptid- Liganden beinhaltet. Ein Vergleich der Strukturen der Komplexe aus TZR-MHC und CD8- MHC gibt Hinweise auf die Art und Weise der Funktion dieser Kooperativität. Obgleich CD8 keine nachweisbaren Konformationsänderungen der mit dem Peptid beladenen Spalte des MHC-Moleküls verursacht, in welcher der TZR bindet, führt es jedoch zu einer Verlagerung der α3-Domäne des MHC-Moleküls, welche mit der Verlagerung vergleichbar ist, die bei der Bindung des TZR auftritt. Eine Analyse, an der ein TZR des Menschen beteiligt war, wies jedoch nicht darauf hin, dass eine Bindung in Gegenwart von CD8 energetisch bevorzugt wird.
Der T-Zell-Korezeptor CD8 ist für die positive Selektion zytotoxischer T- Lymphozyten (ZTL) während der Differenzierung im Thymus und für die Fähigkeit der meisten reifen ZTL zur Vernichtung von Zielzellen essenziell. CD8, das auf der Oberfläche von T-Zellen als αα- oder αβ-Dimer exprimiert ist, kontaktiert die MHC-Klasse-I-Moleküle oder vor allem einen nicht polymorphen Bereich der MHC-Klasse-I-α3-Domäne auf den APZ und erhöht dadurch die betonte Affinität der T-Zelle für ihr Ziel. CD8 ist außerdem an den Phosphorylierungsereignissen beteiligt, die zur T-Zellaktivierung führen, und zwar mittels Assoziation des zytoplasmatischen Schwanzteils der α-Kette mit p56lck.
Die Analyse der molekularen Basis, die den zellulären Immunantworten zu Grunde liegt, litt bisher an einem Mangel an Verfügbarkeit löslicher Proteinreagenzien, mit denen strukturelle und kinetische Aspekte der beteiligten Wechselwirkungen untersucht werden können. In letzter Zeit haben jedoch eine Reihe von Arbeitsgruppen, die Expressionssysteme von E.coli bis hin zu Säugetierzellen benutzten, Strategien zur Erhaltung löslicher TZR berichtet. In ähnlicher Weise hat eine Zahl von Gruppen Strategien zur Erhaltung löslicher CD8 berichtet.
Leahy et al (1992) beschreiben die Kristallisation eines löslichen CD8α-Moleküls des Menschen, produziert als sezerniertes, mit Disulfidbrücken verlinktes Homodimer in CHO- Zellen. Das CD8α enthält die Reste 1 bis 146 des reifen Proteins. Von einer Versuchsversion, die nur die Reste 1 bis 114 aufwies, wurde kein nachweisbares, sezerniertes Protein produziert.
Boursier et al (1993) beschreiben die Produktion eines löslichen CD8-Proteins, das in E.coli als lösliches Fusionsprotein exprimiert wird. Eine Form bestand aus den Resten 1 bis 114 des reifen Proteins, was der Immunglobulindomäne des Proteins entspricht. Die Funktionalität des löslichen Proteins wurde nicht gezeigt.
Garcia et al (1996) beschreiben ein lösliches CD8, das in Insektenzellen exprimiert wird. Das CD8-Molekül enthielt den größten Teil des extrazellulären Teils des CD8- Moleküls, mindestens die Reste 1 bis 146 des reifen CD8-Moleküls. Berichtet werden vorläufige Bindungsstudien.
WO 96/22106 und Choski et al (1998) offenbaren Peptidfragmente eines CD8 der Maus zur Inhibition von T-Zellen. Die Peptide werden in einer sehr hohen Konzentration von 100 ug/ml verwendet. Es wird kein Beweis dafür geliefert, dass die Peptide tatsächlich an die MHC-Moleküle binden.

DIE ERFINDUNG

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung, dass lösliche Formen von CD8 die Aktivität von ZTL in bemerkenswerter Weise hemmen und zwar sowohl in vitro als auch in vivo. In Anbetracht dessen, dass CD8 nur ein Korezeptor ist, und dass die Affinität des CD8 für den MHC bekannterweise gering ist (Garcia et al 1996), war dies vollkommen unerwartet. Es stellte sich heraus, dass die Bindung von löslichem CD8 an weniger als 1% der MHC-Moleküle auf den Zielzellen für eine Hemmung ausreichend ist. Der Effekt wird zumindest teilweise durch eine vollständige Hemmung der frühen Signalisierungsereignisse in der T-Zelle erklärt. Dieser Effekt besitzt Ähnlichkeit zu dem Phänomen des "Peptidantagonismus", bei dem ein kleiner Bruchteil eines mutierten Peptidliganden T-Zellen ausschalten kann. Es wird angenommen, dass die Prävention von lediglich ein paar Wechselwirkungen zwischen den Rezeptoren auf den T-Zellen und dem MHC auf den Zielzellen einen ähnlich dramatischen Effekt haben kann, indem der multimere Signalisierungskomplex in der T-Zelle unterbrochen oder destabilisiert wird. Außerdem wurde beobachtet, dass der Hemmungseffekt am größten ist, wenn die Konzentrationen des löslichen CD8 sehr viel geringer sind als die Peptidkonzentrationen von Choski et al (oben zitiert).
Es wurde eine Strategie zur Überexpression der extrazellulären Immunglobulindomäne des CD8α des Menschen in E.coli entworfen. Es wurden Veränderungen der verwendeten Codons im 5'-Bereich des Gens entworfen, um die Bildung von Sekundärstrukturen der mRNA zu verhindern. Aus bakteriellen Einschlusskörperchen wurden ein CD8α- Fragment, welches die Reste 1-120 des reifen Proteins beinhaltete und daher das Signalpeptid ausschloss, die zytoplasmatischen und die transmembranären Domänen und ein Teil der membran-proximalen Stielregion isoliert und rückgefaltet, um eine einzelne Art eines homodimeren, löslichen Rezeptors zu produzieren. Fig. 2 veranschaulicht die Domänenstruktur von CD8 wie oben beschrieben, und zeigt andere Kürzungen des CD8α-Proteins, die zwar exprimiert, jedoch nicht korrekt gefaltet wurden. Die schwere Kette und das β2- Mikroglobulin von HLA-A2 wurden in ähnlicher Weise exprimiert und mit einem synthetischen Peptidantigen rückgefaltet, das zu dem pol-Epitop von HIV-1 korrespondiert. In Lösung und durch Ko-Kristallisation mit einer Stöchiometrie von einem CD8αα-Dimer zu einer HLA-A2-Peptid-Einheit bildeten sich CD8α/HLA-A2-Komplexe.
Hierin werden Daten gegeben, die zeigen, dass ein Fragment des CD8αα-Rezeptors in der Lage ist, T-Zelltoxizität zu hemmen, und dass Mutationen des CD8αα-Fragments diese Fähigkeit modulieren können. Die hemmende Aktivität des löslichen CD8 ist bemerkenswert, sowohl in vitro als auch in vivo. Hierin wird außerdem die obige Strategie für eine hohe Expression der extrazellulären Immunglobulindomäne des CD8α des Menschen in E.coli und für die Faltung des CD8αα-Dimers als MHC-Bindungsrezeptor beschrieben. Außerdem beschrieben ist die Vereinigung und Kristallisation des Komplexes zwischen CD8αα und einem mit Peptidantigen assoziierten HLA-A2.
In einem Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines löslichen CD8αα- oder -αβ-Moleküls, welches eine korrekt gefaltete Immunglobulindomäne aufweist, in der Herstellung eines Medikaments für eine Therapie zur Unterdrückung der Immunantwort bereit.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Multimers von zwei oder mehr löslichen CD8αα- oder -αβ-Molekülen in der Herstellung eines Medikaments für eine Therapie zur Unterdrückung der Immunantwort bereit.
Das CD8-Molekül kann jedes geeignete lösliche CD8-Molekül sein, das eine funktionelle Immunglobulindomäne, vorzugsweise die des Menschen, aufweist. Im Allgemeinen umfasst dies die ganze oder einen wesentlichen Teil der gegebenenfalls an einem oder mehreren Aminosäureresten substituierten nativen CD8-Immunglobulindomäne, und zwar insbesondere Substitutionen, welche die Bindungsaffinität des löslichen CD8 für den MHC erhöhen. Der lösliche CD8 kann weiters ein Fragment des membran-proximalen Stiels des CD8 umfassen und die Reste 1-120 des reifen CD8.
Der Ausdruck "lösliche Form" ist hierin in Beziehung zu dem CD8-Molekül in der Weise verwendet, in der er üblicherweise im Stand der Technik in Beziehung zu Rezeptoren auf der Zelloberfläche verwendet wird. Eine lösliche Form eines Rezeptors auf der Zelloberfläche wird in der Regel aus der nativen Farm durch Deletion der transmembranären Domäne erhalten. Das Protein kann durch Entfernung sowohl der zytoplasmatischen und transmembranären Domänen gekürzt werden, oder es kann eine Deletion nur der transmembranären Domäne stattfinden, bei der nur ein Teil oder die ganze zytoplasmatische Domäne erhalten bleibt. Wichtig ist, dass die gewünschte extrazelluläre Funktion des Rezeptors erhalten bleibt, welche in diesem Fall aus der MHC-Bindungsfähigkeit der CD8- Immunglobulindomäne besteht. Das Protein kann modifiziert werden, um die gewünschte Form durch proteolytische Spaltung zu erhalten, oder indem eine genetisch konstruierte gekürzte Form oder eine Form, von der Teile entfernt worden sind, exprimiert werden.
Die Erfindung findet besondere Verwendung in der Behandlung von Patienten, die einer Therapie zur Unterdrückung der Immunantwort bedürfen. Zu solchen Patienten gehören Transplantationspatienten, entweder solche, die auf eine Transplantation warten, solche, bei denen eine Transplantation vorgenommen wird, oder solche, bei denen eine Transplantation vorgenommen wurde. Außerdem können Autoimmunerkrankungen und Allergien wirksam mit einer Therapie zur Unterdrückung der Immunantwort behandelt werden. Ein spezielles Beispiel ist starkes Asthma, bei dem T-Zellen als Folge einer viralen Infektion aktiviert werden. Das Ergebnis sind schwere Lungenschäden, woraus sich chronisches Asthma entwickelt, das zum Tode führen kann. Derzeit wird mit Kortikosteroiden behandelt, welche das Immunsystem stark unterdrücken. Eine bevorzugte Behandlung wäre eine, bei der das Immunsystem gezielter unterdrückt wird, wie beispielsweise die spezifische Blockierung der Funktion der ZTL durch lösliches CD8 wie hierin beschrieben.
Die Erfindung stellt daher in einem weiteren Aspekt eine Zusammensetzung bereit, welche eine lösliche Form eines CD8αα- oder -αβ-Moleküls enthält, die eine korrekt gefaltete Immunglobulindomäne zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Exzipient oder Träger für eine Therapie zur Unterdrückung der Immunantwort enthält.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein besonderes lösliches CD8-Protein mit der in Fig. 1b gezeigten Sequenz, wobei das Protein als Dimer gefaltet ist und die Eigenschaft hat, die Wirkung zytotoxischer T-Lymphozyten, Zielzellen zu töten, aufweist.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein lösliches CD8-Protein bereit, welches sich von dem oben definierten, spezifischen Protein in einem oder mehreren der folgenden Punkte unterscheidet: i) Fehlen des Methionins am N-Terminus; ii) Fehlen von 1- 15 Aminosäureresten vom N-Terminus; iii) Hinzufügen von einem Teil der oder der gesamten Sequenz "leu-leu-leu-his-ala-ala-arg-pro" (die Signalsequenz) an den N-Terminus; iv) Fehlen von 1-15 Aminosäuren vom C-Terminus, jedoch Zurückbehalten von zumindest einem Teil der membran-proximalen Stielregion, z. B. der durch die Aminosäurereste 116-120 definierten Region; v) Hinzufügen von einem Teil der oder der gesamten Sequenz "-ala-pro- arg-pro-pro-thr-pro-ala" und den C-Terminus; vi) konservative Varianten von einem oder vielen Aminosäureresten, die sich nicht wesentlich auf die CD8-Funktionalität des Proteins auswirken; vii) Mutationen, welche die CD8-Funktionalität in einer Weise ändern, welche die Eigenschaft steigert, die Wirkung zytotoxischer T-Zell-Lymphozyten, Zielzellen zu töten, zu hemmen; viii) Hinzufügen eines Proteins oder Peptids an den N- oder C-Terminus zum Zwecke der Reinigung; ix) Versorgung mit einem Marker zum Nachweis; wobei das Protein zu einem Dimer gefaltet ist und die Eigenschaft hat, die Wirkung zytotoxischer T-Zell- Lymphozyten, Zielzellen zu töten, zu hemmen.
Insbesondere stellt dieser Aspekt der Erfindung ein lösliches CD8-Molekül bereit, welches einen wesentlichen Teil der extrazellulären Region des CD8 enthält, einschließlich der Immunglobulindomäne und einem Fragment der membran-proximalen Stielregion, wobei das CD8-Molekül nicht über ein Disulfid zwischen den beiden Ketten des Moleküls verbunden ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Komplex eines löslichen CD8- Proteins wie hierin definiert mit HLA-A2 bereit. Eine weitere Form dieses Komplexes wird in kristalliner Form mit einer Stöchiometrie von einem Proteindimer zu einer HLA-A2-Peptideinheit bereitgestellt.
Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins wie hierin beschrieben bereit, welches Verfahren die Schritte umfasst: i) Bereitstellen eines von CD8 abgeleiteten Gens, welches für ein wie hierin beschriebenes CD8-Protein in einem Bakterium kodiert; ii) Bewirken der Expression des von CD8 abgeleiteten Gens in dem Bakterium und Gewinnung des exprimierten Proteins aus einer Bakterienkultur; iii) Behandeln des exprimierten Proteins, um seine Reinigung zu erleichtern und Ausführen der Reinigung. Vorzugsweise ist das aus CD8 abgeleitete, in Schritt i) bereitgestellte Gen durch stille Mutationen modifiziert, die ausgerichtet sind, um die Expression durch Verhinderung der Bildung einer 5'-Haarnadel-Sekundärstruktur in der exprimierten mRNA zu erhöhen. Vorzugsweise beinhaltet die Behandlung des exprimierten Proteins in Schritt iii) das Löslichmachen des Proteins und die Behandlung des Proteins in einer Weise, damit es sich in eine Form faltet, die seinem nativen Zustand ähnlich ist, und welche dann gereinigt wird. Das aus CD8 abgeleitete Genprodukt korrespondiert vorzugsweise mit den immunglobulinähnlichen und membran-proximalen Stielregionen eines CD8-Proteins.
Das hierin beschriebene CD8-Molekül kann in Form eines Multimers vorliegen, d. h. zwei oder mehr lösliche CD8-Moleküle, die miteinander verbunden sind, um eine bifunktionale oder multifunktionale Art zu ergeben. Die CD8-Moleküle können über ein Linkermolekül miteinander assoziiert sein. Alternativ oder zusätzlich kann das lösliche CD8 an größere Einheiten wie beispielsweise Membranstrukturen oder Partikel gebunden sein. Die Erfindung stellt daher in einem weiteren Aspekt ein Multimer eines löslichen CD8 bereit, welches aus zwei oder mehr CD8-αα- oder -αβ-Molekülen besteht, die über ein Linkermolekül miteinander verbunden sind.
Geeignete Linkermoleküle beinhalten multivalente Anheftungsmoleküle wie beispielsweise Avidin, Streptavidin und Extravidin, von denen ein jedes vier Bindungsstellen für Biotin besitzt. Biotinylierte CD8-Moleküle können daher zu multimeren CD8-Komplexe geformt werden, die eine Mehrzahl von CD8-Bindungsstellen besitzen. Die Anzahl von CD8- Molekülen in dem resultierenden Komplex hängen von der Zahl der CD8-Moleküle im Verhältnis zu der Zahl der zur Herstellung der Komplexe verwendeten Linkermoleküle und außerdem von dem Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein beliebiger anderer biotinylierter Moleküle ab. Bevorzugte Komplexe sind trimere oder tetramere CD8-Komplexe.
Geeignete Strukturen zur Anheftung von löslichem CD8, optional bereits vorliegend in multimerer Form, beinhalten Membranstrukturen, wie beispielsweise Liposomen und solide Strukturen, welche vorzugsweise aus Partikeln, wie beispielsweise Körnchen, bestehen. Es eignen sich auch anderen Strukturen, die außen mit CD8-Molekülen beschichtet werden können.
Multimere Formen von CD8, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich sind, beinhalten Multimere, die durch Verbindung von biotinyliertem löslichen CD8 durch beispielsweise Streptavidin als Linkermolekül gebildet werden. Es sind eine oder beide Ketten des CD8-Moleküls biotinyliert, vorzugsweise mittels einer Biotinylierungssequenz, welche als Marker auf der α- oder β-Kette exprimiert ist. Von besonderem Nutzen sind auch an Liposomen gekoppelte, lösliche CD8-Moleküle, bei welchen das CD8 vorteilhafterweise in Form eines Multimers vorliegt, wobei das Multimer dann mit geeigneten Mitteln an die Lipsomenmembran angeheftet wird.
Das lösliche CD8 wird einer Weise verabreicht, die der zu behandelnden oder zu verhindernden Kondition angemessen ist. Zur Verhinderung der Transplantatabstoßung beispielsweise eignet sich am besten eine oder mehrere Injektionen in den örtlich betroffenen Bereich. Bei einer Autoimmunerkrankung, bei der die Effekte über den ganzen Körper verteilt sind, ist andererseits die Injektion des löslichen CD8 direkt ins Blut besser geeignet.
Ein Durchschnittsfachmann kann geeignete Zusammensetzungen und Dosierungen von löslichem CD8 als immunsupprimierendes Agens entwickeln. Zwei oder mehr Dosierungen einer geringeren Menge an löslichem CD8 sind einer einzelnen höheren Dosis möglicherweise vorzuziehen. Formulierungen könnten beispielsweise Flüssigformulierungen oder Pulverformulierungen sein, wie die, die beispielsweise für eine Verabreichung durch eine nadellose Hochgeschwindigkeitseinheit entwickelt worden sind.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können weiters andere Agenzien beinhalten, oder im Rahmen einer Behandlungsstrategie mit anderen Agenzien, insbesondere mit anderen Immunsuppressiva verabreicht werden.
Zu den derzeit am häufigsten verwendeten Immunsuppressiva gehören Kortikosteroide und wirkungsvollere Hemmstoffe, wie beispielsweise Methotrexat, Sulfasalazin, Hydroxychloroquin, 6-MP/Azathioprin und Cyclosporin (Baert and Rutgeerts, 1997; Singer and McCune, 1998). Jede dieser Behandlungen ist jedoch mit schweren, toxizitätsbedingten Nebenwirkungen verbunden und es werden dringend Arzneimittel benötigt, die deren Eliminierung oder Reduktion erlauben (McKendry, 1997; Ortiz et al., 1998; Sibilia et al., 1998; Singer and McCune, 1998). Es stellte sich heraus, dass viele Immunsuppressiva eine stärkere Wirkung haben, wenn sie in Kombination verwendet werden, sogar dann, wenn die Gesamtdosis verringert wird (Verhoeven et al., 1998).
Andere Immunsuppressiva beinhalten die sanftere, aber weniger wirksame Behandlung mit Nicht-Steroiden wie Aspirin und Ibuprofen, sowie eine neue Klasse von Wirkstoffen, die auf spezifischeren immunmodulatorischen Funktionen beruhen. Zu der letztgenannten Klassen gehören Interleukine, Zytokine, rekombinante Adhäsionsmoleküle und monoklonale Antikörper (für einen Überblick siehe Baert and Rutgeerts, 1997, Chatenoud, 1998).
sCD8αα ist spezifisch für Klasse-I-MHC-Moleküle und es wird daher erwartet, dass es nur die Reaktion zytotoxischer T-Zellen oder von Gedächtnis-T-Zellen auf Zielzellen, welche Klasse-I-Komplexe präsentieren, hemmt. Viele zelluläre Immunantworten setzen sich aus mehreren Teilen zusammen und schließen sowohl Klasse-I-, als auch Klasse-II- beschränkte T-Zellen ein. In manchen Situationen kann es wünschenswert sein, nur sCD8αα zu verwenden, um unerwünschte ZTL-Reaktionen zu unterdrücken. In vielen Situationen kann sCD8αα in Kombination mit anderen Immunsuppressiva oder mit Reagenzien, die andere Elemente der Immunantwort unterdrücken, nützlich sein.
Man kann sich vorstellen, dass die Aufnahme von sCD8αα in ein Behandlungsprotokoll zur Unterdrückung der Immunantwort die Wirksamkeit der Unterdrückung der Immunantwort erhöht und es insbesondere möglich macht, die verabreichte Menge anderer Arzneimittel, die toxische oder andere unerwünschte Effekte haben, zu verringern.

1. Struktur des CD8αα-Rezeptors

Das CD8-Gen des Menschen exprimiert ein Protein mit 235 Aminosäuren. Wie in Fig. 2 gezeigt, kann der Aufbau des Proteins in die folgenden Domänen eingeteilt werden (angefangen am Aminoterminus und endend am Carboxyterminus des Polypeptids):
a. Signalpeptid (Aminosäuren -21 bis -1) - dieser Teil wird in menschlichen Zellen während des Transports des Rezeptors an die Zelloberfläche abgeschnitten, und ist daher kein Teil des reifen, aktiven Rezeptors;
b. Immunglobulin (Ig)-ähnliche Domäne (ungefähr Aminosäure 1-115) - diese Domäne nimmt eine Struktur ein, die sogenannte Immunglobulinfaltung, welche mit der vieler anderen Moleküle vergleichbar ist, die an der Regulation des Immunsystems beteiligt sind, der Immunglobulinfamilie von Proteinen. Die Kristallstruktur des CD8αα-Rezeptors im Komplex mit dem MHC-Molekül HLA-A2 des Menschen zeigte, wie die Ig-Domäne des CD8αα-Rezeptors den Liganden bindet;
c. Membran-proximale Stielregion (Aminosäure 116-160). Es wird angenommen, dass diese Domäne eine erweiterte Linkerregion darstellt und es dem CD8α-Rezeptor erlaubt, von der Oberfläche der T-Zelle über den Peak des MHC-Komplexes bis hin zu dessen α3- Domäne zu "greifen", wo er dann bindet. Die Stielregion ist glykosyliert und wahrscheinlich unbeweglich. Im Kontext dieser Erfindung sollte erwähnt werden, dass nicht angenommen wird, dass die Stielregion eine Rolle bei der MHC-Bindung spielt;
d. Transmembranäre Domäne (Aminosäuren 161-188). Die transmembranäre Domäne verankert den CD8αα-Rezeptor in der Zellmembran und ist daher kein Teil des löslichen rekombinanten Proteins;
e. Zytoplasmatische Domäne (Aminsäuren 189-214); Der zytoplasmatische Schwanz von CD8 vermittelt durch seine Assoziation mit p56lck, welches an der T-Zellaktivierungskaskade von Phosphorylierungsereignissen beteiligt ist, eine Signalisierungsfunktion in T-Zellen.
Die Erfindung umfasst zwei Formen des CD8-Rezeptors, αα und αβ (Zugangskennungen für die EMBL/GENBANK: CD8α, M27161; CD8β, X13444). Die beiden Formen des Rezeptors sind funktionell äquivalent und es sind keine wesentlichen Unterschiede in der Wirksamkeit der einen oder der anderen Form bei Verwendung für die Immunhemmung zu erwarten.
Das essenzielle Merkmal eines jeden geplanten löslichen CD8-Proteins ist, dass es eine korrekt gefaltete Ig-Domäne beinhaltet, da diese Region die Bindungsregion für den Kontakt zu den MHC-Molekülen darstellt und daher für den modulierenden Effekt verantwortlich ist. Es sind Varianten der bestimmten CD8-Proteine, die Gegenstand der Erfindung sind, geplant und wie folgt aufgelistet:
a. Variationen der C-terminalen Verkürzungsstelle. Es ist möglich, dass auch längere oder kürzere Versionen des Rezeptors stabil und funktional sind. Es gibt keine allgemeine Regel zur Vorhersage, wo sich die optimale Verkürzungsstelle für eine lösliche Version eines transmembranären Proteins befindet. Im Falle von CD8 könnte das Polypeptid zwischen 1 und 15 Aminosäuren länger oder kürzer sein. Wird es am C-Terminus verkürzt, enthält das Molekül jedoch noch immer ein kurzes Fragment der membran-proximalen Stielregion. Das lösliche CD8 könnte sogar die zytoplasmatische Domäne beinhalten, wobei nur die transmembranäre Domäne entfernt sein könnte. Es wird außerdem geplant, dass der C-Terminus zum Zwecke der Reinigung mit Peptiden oder Proteindomänen, wie beispielsweise der Glutathion-S-Transferase, fusioniert werden könnte, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist.
b. Variationen der N-terminalen Verkürzungsstelle. Es existiert eine gewisse Unsicherheit darüber, wo genau die Signalsequenz endet und die Ig-Domäne beginnt. Die N- terminale Verkürzungsstelle könnte wahrscheinlich genauso wie die C-terminale Verkürzungsstelle in gewissem Maß verändert werden, ohne dass der funktionale Effekt des Proteins beeinflusst wird. Es wird außerdem geplant, dass der N-Terminus zum Zwecke der Reinigung mit Peptiden oder Proteindomänen, wie beispielsweise der Glutathion-S- Transferase, fusioniert werden könnte, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist.
c. Aminosäuresubstitutionen. Es kann vermutlich eine große Zahl konservativer Aminosäuresubstitutionen in das Protein eingefügt werden, ohne dass eine wesentliche Veränderung der Bindung zwischen dem CD8-Rezeptor und dem MHC verursacht wird.
d. Mutationen, die auf eine Veränderung der Funktionalität abzielen. Mit der Struktur des Komplexes zwischen dem CD8αα-Rezeptor und einem MHC-Molekül, HLA- A2, (Gao et al. 1997) ist es möglich, Mutationen zu entwerfen, welche voraussichtlich die Wechselwirkungen und dadurch den immuninhibitorischen Effekt beeinflussen. Unten ist die Testung zweier solcher Mutationen beschrieben, die Substitution des Restes 99 durch eine Glutaminsäure (genannt "99E") und die doppelte Substitution der Reste 54 und 55 durch Glutaminsäuren (genannt "54, 55E"). Diese Mutationen wurden als Kontrollen entwickelt, z. B. waren diese Mutationen vorgesehen, die Bindung des CD8αα-Rezeptors an den MHC zu verhindern. Die Mutante 99E hat eine Resteffekt, während die Mutante 54, 55E keine Anzeichen einer Hemmung zeigt (siehe die folgenden Daten im Hinblick auf die T-Zell-Lyse unten). Es wird daher auch die Entwicklung von Mutationen mit dem gegenteiligen Effekt, also z. B. einer Erhöhung der Bindung zwischen dem CD8αα-Rezeptor und MHC-Molekülen, geplant.
Die folgenden Beispiele werden deutlicher unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben, in denen folgendes gezeigt wird:
Fig. 1b zeigt die Aminosäuresequenz eines löslichen, rekombinanten CD8α-Proteins des Menschen.
Fig. 2 zeigt CD8α und verkürzte Proteine, exprimiert in E.coli. Schematische Darstellung von CD8αα, wobei der Domänenaufbau (oben) und das Ausmaß der verkürzten, in Bakterien exprimierten Proteine (unten) gezeigt werden: L = Leadersequenz, Ig = Immunglobulindomäne, MP = membran-proximale Domäne, TM = transmembranäre Domäne, zyt = zytoplasmatische Domäne. Die Zahlen zeigen die Aminosäurepositionen der Domänengrenzen in Bezug zum reifen Protein an und die Endpunkte der in E.coli exprimierten Proteine. "C" bezeichnet das Vorhandensein und die Positionen der Cysteinreste an Positionen 143 und 160 an, die im CD8αα-Dimer an der Bildung der Disulfidbindungen zwischen den Ketten beteiligt sind. Es wurden Expressionsvektoren mit der Codoninformation für die gezeigten gekürzten Proteine konstruiert und zwar sowohl mit der originalen Codonverwendung für das CD8α des Menschen als auch mit der veränderten Codonverwendung am 5'-Ende des Inserts wie in den Beispielen beschrieben.
Fig. 19 zeigt die Aminosäuresequenzen eines löslichen rekombinanten CD8α- Proteins der Maus.
Die Figuren werden in den Beispielen ausführlich erläutert.

BEISPIELE

BEISPIEL 1. Hochgradige Expression eines CD8αα-Homodimers in E.coli und Kristallisation.

MATERIAL UND METHODEN

Klonierung der CD8α-cDNA und Konstruktion von E.coli-Expressionsvektoren-

Durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung der pfu-Polymerase und cDNA von zytotoxischen T-Lymphozyten als Vorlage wurde ein CD8α-codierendes DNA- Fragment erhalten. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt mit dem Sense-Primer:
Das PCR-Produkt wunde mit den Restriktionsenzymen EagI und BamHI verdaut und in pBluescript II KS- (Stratagene) kloniert, um das Plasmid BJ082 zu erhalten. Das Vorhandensein der vollen Länge der Codierungssequenz von CD8α wurde durch Doppelstrang-Dideoxy-Sequenzierung (USB 70754) mit der T7-Polymerase (Pharmacia) verifiziert. Für die Konstruktion von bakteriellen Expressionsvektoren wurden fünf PCR-Produkte mit BJ082 als Vorlage hergestellt, die für ein Methionin, gefolgt von der immunglobulinähnlichen Domäne des reifen CD8α, kodieren. Die PCR-Reaktionen wurde durchgeführt mit den Sense-Primer
Diese PCR-Produkte wurden mit den Restriktionsenzymen NdeI und BamHI verdaut und in den Vektor pGMT7 kloniert, um Expressionskassetten für die Reste A: -150 mit dem Cysteinrest an Position 143 mutiert zu Serin, B: 1-146, C: 1-120/141-146, D: 1-116/141-146 und E: 1-120 zu erhalten. Nach Verifizierung der Sequenz wurden die Vektoren auf Expression getestet (siehe unten), aber die Induktion der Expression des CD8α-Proteins aus allen Vektoren war nur durch Immunblotanalyse nachweisbar, bei welcher der monoklonale Antikörper OKT-8 (ATCC-Referenz CRL8014) verwendet wurde. Mit Hilfe eines modifizierten Sense-Primers
5'-GGAATTCCATATGAGTCAATTTCGTGTATCACCGCTGGATCG-3' [SEQ- ID-Nr.: 9], der sechs stille Mutationen in die kodierende Region einfügt, wurden nacheinander fünf neue PCR-Fragmente hergestellt, welche für die korrespondierenden Proteine kodieren. Diese PCR-Fragmente wurden mit den Restriktionsenzymen NdeI und HindIIOI verdaut und in den Vektor pGMT7 kloniert, um die Plasmide UG195 (A), UG231 (B), UG222 (C), pAIE3 (D) und BJ112 (E) zu erhalten.

Konstruktion des HLA-A2-Expressionsvektors-

Durch PCR mit einer B-Zell-cDNA als Vorlage wurde ein DNA-Fragment erhalten, das die α1-, α2- und α3-Dornänen von HLA-A*0201 (HLA-A2) beinhaltet und die Reste 1- 276 umfasst. In der PCR-Reaktion wurde der Sense-Primer
5'-ACATACCCATGGGCTCTCACTCCATGAGGTATTTC-3' [SEQ-ID-Nr.: 10] verwendet, sowie der Antisense-Primer:
5'-ACATACAAGCTTACGGCTCCCATCTTAAGGTGAGGGGCTTGGG-3' [SEQ- ID-Nr.: 11]. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und HindIII verdaut und in pET23d+ (Novagen) kloniert, um das Plasmid BJ075a zu erhalten, in dem die Sequenz des HLA-A2-Fragments durch Dideoxy-Sequenzierung erhalten wurde. Das Plasmid pHN1- β2m, das zur Expression der β2-Mikroglobulin-Untereinheit verwendet wurde, wurde freundlicherweise von David N. Garboczi und Don C. Wiley, Harvard Medical School zur Verfügung gestellt.

Expression von CD8α in E.coli-

T7-CD8α-Expressionsvektoren wurden in den E.coli-Stamm BL21DE3pLysS (Novagen) transformiert und aus Einzelkoloniekulturen in TYP-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin vermehrt. Die von dem T7-Promotor ausgehende Expression wurde bei ungefähr OD600 = 0,4 durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 mM induziert und der zeitliche Verlauf der Induktion zu Beginn bis zu acht Stunden lang verfolgt. Bei keinem der Konstrukte wurde 4 Stunden nach der Induktion mit IPTG ein Anstieg des Proteinertrags beobachtet.

Präparation und Solubilisierung von CD8α aus bakteriellen Einschlusskörperchen in großem Maßstab-

Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in Lysepuffer (20 ml pro Liter ursprüngliche Bakterienkultur), der 10 mM EDTA, 2 mM DTT, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10% v/v Glyzerol, 200 mg/l Lysozym, 1,0 mM PMSF enthielt, resuspendiert. Die Lösung wurde eingefroren und wieder aufgetaut und insgesamt 5 Minuten lang beschallt (Misonix W38S). Nach dem Vermischen mit demselben Volumen an Waschpuffer (0,5% v/v Triton X-100, 10 mM EDTA, 50 mM Tri-Hcl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 0,1% v/v Natriumazid) wurde die Lösung für weitere 30 Minuten auf Eis gestellt. Die Einschlusskörperchen wurden durch Zentrifugation bei 15,000 rpm in einem Beckmann-Rotor vom Typ JA-20 10 Minuten lang pelletiert und dann in Waschpuffer (20 ml pro Liter ursprüngliche Kultur) resuspendiert, wobei ein Homogenisator aus Teflon verwendet wurde. Der Zentrifugationsschritt und die Waschschritte wurden insgesamt vier Mal wiederholt. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde das Pellet in Harnstoffpuffer aufgelöst, der aus 8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 10% v/v Glyzerol, 500 mM NaCl, 10 mM DTT bestand, und mit diesem über Kopf und über Nacht bei 4ºC vermischt wurde. Unlösliche Rückstände wurden aus der Lösung mit den Einschlusskörperchen durch 30-minütige Zentrifugation wie oben beschrieben entfernt und die klare Suspension bei -70ºC aufbewahrt.

Rückfaltung des CD8αα-Rezeptors-

Das sich in 2 ml Harnstoffpuffer befindende CD8α-Protein (in einer Konzentration von 10 mg/ml) wurde zu 15 ml Guanidinpuffer hinzugegeben (6 M Guanidinhydrochlorid, 50 mM Tris-Hcl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 10 mM DTT) und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang equilibriert, worauf es zu 1 Liter Rückfaltungspuffer gegeben wurde, der aus 200 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M L-Arginin, 0,1 mM PMSF, 6,5 mM Cysteamin und 3,7 mM Cystamin bestand. Zur der Rückfaltungsmischung wurden in Abständen von 24 Stunden noch zweimal jeweils 20 mg Protein zugegeben, und die Lösung bei 4ºC für insgesamt 72 Stunden gerührt.

Rückfaltung von HLA-A2/pol-

Die schwere Kette von HLA-A2, β2m und Peptid (ILKEPVHGV [SEQ-ID-Nr.: 12], synthetisiert von dem Oxford Centre for Molecular Sciences und korrespondierend zu den Resten 309-317 der Reversen Transkriptase von HIV-1), wurden im Wesentlichen wie beschrieben rückgefaltet, und zwar mit der Modifikation, dass Guanidinpuffer zu dem Protein hinzugegeben wurde, bevor dieses, wie oben für die Faltung von CD8α (David N. Garboczi, persönliche Mitteilung) beschrieben, in Rückfaltungspuffer eingespritzt wurde.

Reinigung des gefalteten CD8αα-Rezeptors

Die Rückfaltungsmischung wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 4,000 rpm in einem Beckmann-Rotor vom Typ J-6B geklärt, woraufhin der Überstand in einer Amicon 2000 Stirred Cell mit Hilfe einer Diaflow-Ultrazentrifugationsmembran mit einer Porenausschlussgröße von 10 kD auf ungefähr 200 ml eingeengt wurde. Danach wurde die Probe 30 Minuten bei 15,000 rpm in einem Beckman-Rotor vom Typ JA-20 zentrifugiert, und dann in einer Amicon 8400 Stirred Cell weiter auf 10 ml konzentriert. Vor einem Reinigungsverfahren, das aus zwei Schritten, Gelfiltration und Kationenaustausch, bestand, wurde die konzentrierte Probe durch einen Sterilfilter mit 0,22 um Porengröße filtriert. Anschließende Präparationen von CD8α deuteten darauf hin, dass die Zentrifugations- und Filtrationsschritte, die zur Klärung der Proteinlösung zwischen der Rückfaltung und der Konzentration eingeführt wurden, zur Aufrechterhaltung eines korrekt gefalteten Rezeptors in Lösung essenziell sind. Der Gelfiltrationsschritt wurde auf einer Superdex G-75 Säule von Pharmacia durchgeführt, die mit 20 mM Tris-Hcl (pH 8,0) und 150 mM NACl equilibriert worden war. Fraktionen, die das CD8αα-Homodimer enthielten, wurden aufgefangen, und es fand mit Hilfe einer Amicon Centriprep-10 ein Pufferaustausch in 50 mM MES (pH 6,5) statt. Der Ionenaustauschschritt wurde auf einer Mono-S-Säule von Pharmacia durchgeführt, von welcher das Protein mit einem Gradienten von 0-1 M NaCl in 50 mM Mes (pH 6,5) eluiert wurde.

Biochemische und physikalische Analyse der gereinigten Proteine-

Proteinkonzentrationen der gefalteten und gereinigten Proteine wurden durch den Bradford Assay (BioRad) bestimmt. Die Identität des gefalteten CD8α wurde durch Sequenzierung des N-Terminus mit der Methode nach Edman bestätigt. Massenspektroskopische Analyse von CD8αα wurde mit Hilfe eines atmosphärischen Dreifach-Quadruopolmassenspektrometers von VG Instruments, ausgestattet mit einer Elektrospray-Ionisierungsschnittstelle, durchgeführt. Es wurden Proteinproben von 10 ug in 20 ul 1 : 1 v/v Acetonitril/Wasser, angesäuert durch Zugabe von Ameisensäure zu einer Endkonzentration von 1% v/v, bei einer Flussrate von 10 ul/min eingespritzt. Das Massenspektrometer wurde mit Pferdeherz-Myoglobin kalibriert (Mr 16951.48).

Kristallisation des CD8αα/HLA-A2-Komplexes-

1 ul Proteinlösung, die CD8αα in einer Konzentration von 10 mg/ml und HLA-A2/pol in einer Konzentration von 20 mg/ml enthielt, wurde mit 1 ul Reservoirlösung der Crystal Screen-Kits I und II (Hampton Research) vermischt. Kristallisationsversuche wurden bei Raumtemperatur durch Dampfdiffusion von auf Mikrobrücken sitzenden Tropfen durchgeführt.

ERGEBNISSE

Mutationen, welche die Tendenz zur Bildung von Sekundärstrukturen der mRNA im 5'-Ende des CD8α-Gens verringern, erhöhen stark das Expressionpotenzial in E.coli-

Zur Konstruktion von CD8α-Expressionvektoren für eine Vielzahl von Expressionssystemen wurde zunächst in einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), in der eine aus einer zytotoxischen T-Zelllinie präparierte cDNA als Vorlage verwendet wurde, ein DNA-Fragment hergestellt, welches den gesamten offenen Leserahmen enthielt. Ein Plasmid, das dieses Fragment enthielt, wurde daraufhin in einer zweiten Generation von PCR- Reaktionen als Vorlage verwendet, um fünf CD8α-cDNA-Fragmente zu synthetisieren, die in Plasmide eingebaut wurden, welche den T7-Promotor enthielten. Alle diese Konstrukte kodierten für Polypeptidketten, in denen ein Startcodon von der N-terminalen Region des reifen CD8α gefolgt ist, und welche die gesamte Immunglobulindomäne umfassten, jedoch C- terminal davon an verschiedenen Stellen verkürzt waren (Fig. 2). Konstrukte mit äquivalenten C-terminalen Kürzungen, die jedoch die CD8α-Signalsequenz beinhalteten, wurde auf Expression unter der Kontrolle eines Baculovirus-Promotors in Insektenzellen getestet.
Zuvor hatte die Expression von CD8α des Menschen in Insektenzellen und CHO- Zellen angedeutet, dass die Disulfid-Bindung des Dimers über Cys143 für die Herstellung eines sezernierten Rezeptors entscheidend ist. Dagegen stellte sich heraus, dass Cys160, welches ebenfalls an der kovalenten Verlinkung des membrangebundenen Rezeptors beteiligt ist, die Expression von löslichem CD8αα verhindert. In Übereinstimmung damit fanden wir heraus, dass CD8α 1-146, 1-120/141-146 und 1-116/141-146 in Insektenzellen als sezernierte Dimere exprimiert werden konnten (Daten nicht gezeigt). Der Befund, dass der Cys143-Rest eine Voraussetzung für die Sekretion des CD8αα-Dimers in Insektenzellen darstellt, deutet darauf hin, dass dieser Rest entweder für die Faltung des Proteins oder für dessen Stabilität während des intrazellulären Transportes essenziell ist. Diese Möglichkeiten können derzeit noch nicht auseinander gehalten werden, und da Cysteinreste bei der Rückfaltung von Proteinen in vitro ein potenzielles Problem darstellen, wurden Konstrukte in Bakterien getestet, in denen Cys143 entweder enthalten oder nicht enthalten war (Fig. 2).
Es konnte keine Expression der Plasmide mit Inserts der ursprünglichen Codonverwendung des CD8α des Menschen in E.coli nachgewiesen werden wie sich durch den Vergleich von Gesamtzellextrakten nach Gelelektrophorese und Coomassie-Färbung ergab (Fig. 3, Spur 1-2). Im Gegensatz dazu war die Expression leicht nachweisbar, wenn sechs Codons im CD8α-Gen durch stille Mutationen verändert wurden, um das 5'-Ende des Gens reicher an A/T zu machen (Fig. 3, Spur 3-4). Zuvor wurde berichtet, dass solche Veränderungen, wie sie bei einem geringeren G/C-Gehalt und daher einem schwächeren Basenpaarungspotenzial zu erwarten wären, die Tendenz zur Bildung einer Haarnadel am 5'- Ende der CD8α-mRNA verringern. Es könnte daher sein, dass die Bildung einer Sekundärstruktur in der ursprünglichen Sequenz schwere gegenteilige Effekte auf die Möglichkeit der Expression in E.coli hat. Die Expression mutierter Konstrukte wird auf eine Höhe von mehr als 100 mg pro Liter geschätzt, was einer Steigerung von mehr als zwei Größenordnungen im Vergleich zur Expression der nicht mutierten Sequenz entspricht.

Präparation in großem Maßstab, anfängliche Reinigung und Solubilisierung von in Bakterien exprimierten Proteinen-

Die Analyse zellulärer Fraktionen lysierter Bakterien, die CD8α exprimieren, zeigte, dass praktisch alle Proteine in Einschlusskörperchen vorliegen (Fig. 3), wie es zuvor bei bakteriell exprimierten schweren Ketten des MHC und β2m-Polypeptiden beobachtet worden war. Die Reinigung der CD8α-Einschlusskörperchen durch Waschen ergab Protein, dessen Reinheitsgrad auf ungefähr 90% geschätzt wurde (Fig. 3, Spur 5). Einen ähnlichen Reinheitsgrad der Einschlusskörperchen wurde mit HLA-A2 und β2m erhalten (nicht gezeigt). CD8α-Einschlusskörperchen waren in dem Puffer mit dem pH-Wert von 6,5, der für die MHC-Ketten verwendet wurde, nicht löslich, nach Einstellung des pH-Werts auf 8,0, bei hoher Salzkonzentration und nach Zugabe von 10% Glyzerol waren sie leicht in Lösung zu bringen.

Rückfaltung und Qualitätsanalyse löslicher CD8αα-Rezeptoren-

Das erneut in Lösung gebrachte und sich in einem reduzierenden und denaturierenden Puffer befindende CD8α-Polypeptid wurde in Bedingungen verdünnt, welche die Ausbildung einer nativen Konformation erlauben. Die Faltung erfolgte zunächst während eines Zeitraums von 48 Stunden, wonach das lösliche Protein zur Analyse und Reinigung durch Gelfiltration konzentriert wurde. Vier der exprimierten und in Fig. 2 gezeigten Polypeptide produzierten hauptsächlich Aggregatpeaks mit hohem Molekulargewicht (Daten nicht gezeigt). Dagegen zeigte das Elutionsprofil des 1-120-Polypeptids einen Hauptpeak mit ungefähr 30 kDa, wie es für das CD8αα-Dimer erwartet wurde (Fig. 4A). In diesem Elutionsprofil waren keine Anzeichen von Aggregaten zu erkennen. Das CD8αα-Dimer wurde durch Kationenaustausch auf einer Mono-S-Säule bei ungefähr 175 mM NaCl weiter gereinigt (Fig. 4B). Die Gelanalyse dieses Peaks zeigte nur eine einzige Bande an der Position, an der CD8α erwartet wurde (Fig. 3, Spur 6).
Die Identität des gereinigten CD8α wurde anhand von zwei Methoden verifiziert. Nach der Edman-Sequenzierung wurden zehn Aminosäuren erhalten, die mit dem N-Terminus des reifen CD8α korrespondieren, was zeigt, dass der eingebaute Methioninrest in E.coli abgespaltet worden ist. Das durch Elektrospray-Massenspektrometrie bestätigte Molekulargewicht von CD8α (13 464,0) lag nahe bei dem theoretischen Wert von 13,463.2 Daltons für die Reste 1-120 ohne das anfängliche Methionin (Fig. 5). Ein kleinerer Peak mit etwas höherem Molekulargewicht entspricht wahrscheinlich dem Protein, von dem der Methioninrest nicht abgespalten wurde (Fig. 5).

Co-Rückfaltung und Bildung von löslichen Komplexen aus CD8αα-Dimer und HLA- A2/pol-

Um zu testen, ob die Effizienz der Rückfaltung der Komponentenmoleküle durch Komplexbildung erhöht werden könnte, wurde ein Co-Rückfaltungsexperiment durchgeführt. Gelfiltrationsanalyse des konzentrierten Proteins ergab, dass die Faltung sowohl von CD8αα als auch von HLA-A2 eingeschränkt ist, und dass sich unter diesen Bedingungen mehr Aggregate ausbilden als bei einer getrennten Rückfaltung (Fig. 6). Es ist zwar ein Peak erkennbar, allerdings befindet sich dieser an der Position, von der erwartet wurde, dass sie zu ungefähr 75 kDa des Komplexes aus CD8αα und HLA-A2 korrespondiert, und welcher weder bei der CD8α-(Fig. 4A) noch bei der HLA-A2-Rückfaltung (nicht gezeigt) auftritt. Die Analyse des Proteins in diesem Peak zeigt, dass die in dem Komplex erwarteten Komponenten enthalten sind, und zwar in Mengen, die einem CD8αα-Dimer zu einem HLA- A2 entsprechen (Fig. 7, Spur 1 und 5), was anzeigt, dass sich in Lösung ein stabiler Komplex bilden kann.

Kristallisation von CD8αα im Komplex mit HLA-A2/pol-

Kristallisationsstudien, die mit einer Mischung von 2 : 1 aus einzeln rückgefaltetem HLA-A2 und CD8αα durchgeführt wurde, ergaben unter zwei Pufferbedingungen sichtbare Kristalle, und zwar bei 12% PEG 20,000, 100 mM MES pH 6,5 und bei 15% PEG 6000, 50 mM MES pH 6,0. Ein Kristall wurde später einer Diffraktionsanalyse bei einer Auflösung von 2,7 Å unterzogen. Zur Analyse der Zusammensetzung des Kristalls wurde ein Fragment gewaschen, wieder in Lösung gebracht und durch Gelelektrophorese analysiert (Fig. 7, Spur 2). Die in der Probe vorhandenen Proteinbanden entsprachen genau denen von HLA-A2, bzw. CD8α (Fig. 7, Spur 3, bzw. 4). Des Weiteren entsprach das Verhältnis von CD8α zur schweren Kette und den β2m-Banden genau dem Verhältnis, das in der Probe aus dem Peak nach der Co-Rückfaltung vorgefunden wurde, und von welchem angenommen wurde, dass er dem Komplex aus Rezeptor und Ligand entspricht (Fig. 7, Spur 1).

Legenden zu den Fig. 1 und 3 bis 7

Fig. 1a zeigt die cDNA-Sequenz (unten) und Proteinsequenz (oben, im Ein- Buchstaben-Code) des CD8α des Menschen. Es ist angezeichnet, wie weit sich das Signalpeptid, die Ig-ähnliche Domäne, die membran-proximale Domäne, die transmembranäre Domäne und die zytoplasmatische Domäne erstrecken.
Fig. 1b zeigt die DNA-Sequenz (unten) und Proteinsequenz (oben, im Ein- Buchstaben-Code) des exprimierten Fragments des CD8α des Menschen. Es ist angezeichnet, wie weit sich die Ig-ähnliche Domäne und die membran-proximale Domäne erstrecken. Basen, die der DNA-Sequenz hinzugefügt wurden, um für ein Initiationscodon für die Translation zu kodieren oder die Expression in E.coli zu erhöhen, sind angezeigt.
Fig. 3 zeigt die Expression und die Reinigung von CD8α. Proteinproben von etwa 10 ug wurden durch Auftrennung auf einer 15%igen SDS-PAGE-Gel analysiert. M = Protein- Molekulargewichtsmarker, Spur 1 = Gesamtlysat von nicht induzierten BL21-Zellen, welche das Expressionsplasmid für die Reste 1-120 von CD8α mit der ursprünglichen Codonnutzung enthalten; Spur 2 = wie Spur 1, jedoch 4 Stunden lang mit 0,5 mM IPTG induziert; Spur 3 = Lysat nicht induzierter BL21-Zellen, welche ein CD8α-Expressionsplasmid mit einer veränderten Codonnutzung am 5'-Ende aufweisen; Spur 4 = wie Spur 3, jedoch 4 Stunden lang mit 0,5 mM IPTG induziert; Spur 5 = gereinigte Fraktion der Einschlusskörperchen aus Zellen wie in Spur 4; Spur 6 = rückgefaltet und gereinigt durch Gelfiltration und Ionenaustausch. Das Molekulargewicht der Größenmarker und die erwartete Position des CD8α sind angezeigt.
Fig. 4 zeigt die Reinigung von CD8α. A. Gelfiltrationsprofil von konzentriertem, rückgefaltetem CD8α bei einer Superdex-G-75-Säule. Zahlen über dem Profil zeigen die Elutionspunkte von Molekulargewichtsstandards an. B. NaCl-Elutionsprofil des Hauptpeaks aus der Gelfiltration bei einer Mono-S-Säule.
Fig. 5 zeigt Elektrospray-Massenspektrometer-Analyse von löslichem CD8αα- Rezeptor. A. Elektrospray-Massenspektrum von CD8αα, das Peaks des Masse- Ladungsverhältnisses nach Protonenbeschuss zeigt. B. Dekonvolution des in A gezeigten Spektrums, welche das Molekulargewicht des einzelnen, dominierenden Peaks anzeigt.
Fig. 6 zeigt das Rückfaltungs-Gelfiltrationsprofil von CD8α und HLA-A2. Die Gelfiltration erfolgte in einer Säule vom Typ Superdex G-200. Die Zahlen über dem Profil zeigen die Elutionspunkte der Molekulargewichtsstandards an. Über den Pfeilen sind die Proteinbestandteile der erhaltenen Peaks angezeigt.
Fig. 7 zeigt die SDS-PAGE-Analyse des korückgefalteten und kokristallisierten CD8αα und HLA-A2. Spur 1-4 und M wurden mit Coomassie Blue gefärbt, Spur 5 mit Silberfärbung. Spur 1 und 5: korückgefaltetes CD8α, HLA-A2, β2m und Peptid aus dem in Fig. 5 angedeuteten Peak; Spur 2: erneut in Lösung gebrachte Kristalle; Spur 3: HLA-A2; Spur 4: CD8αα, M: Proteinmolekulargewichtsgrößenmarker wie angezeigt. Die Banden, die der schweren Kette von A2 (A2-HC), β2m und CD8α entsprechen, sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

DISKUSSION

Expression von CD8α

Was die Expression von CD8α anbelangt, so fanden wir die Erträge aus Insektenzellen für eine Präparation in großem Maßstab nicht ausreichend und konzentrierten uns daher auf die Expression in. E.coli. In Bakterien wird die Höhe der Expression eines Fremdproteins im Allgemeinen, hauptsächlich durch drei Parameter festgelegt. Diese sind die Tendenz für Sekundärstrukturen in der mRNA, das Ausmaß inwieweit die Codonnutzung mit der von Bakterien bevorzugten übereinstimmt, und die Toxizität für den Wirt des exprimierten Proteins. In Falle von CD8α erhöhten sechs stille Codonveränderungen, die zur Verringerung des Basenpaarungspotentials in der Nähe des N-Terminus gedacht waren, die Expression um mehr als zwei Größenordnungen, und zwar auf ein Maß, das ungefähr 30% des Gesamtproteins entsprach. Die hohe Expression und die Leichtigkeit, mit der Protein aus Einschlusskörperchen isoliert werden kann, machten die Expression in Bakterien in den weiteren Studien zur Methode der Wahl.

Rückfaltung von CD8α

Es stellte sich heraus, dass die Rückfaltungseffizienz von CD8α von den zur Lösung des Proteins aus den Einschlusskörperchen verwendeten Pufferkonditionen abhängt. Besonders die Aufrechterhaltung eines hohen Redoxpotentials, hoher Ionenstärke und die Zugabe von stark denaturierenden Substanzen vor der Rückfaltung verbessern den Ertrag an CD8αα dramatisch. Analyse der Präparation des gefalteten Rezeptors durch Gelfiltration zeigt, dass praktisch keine Aggregate vorhanden sind, und nach dem Kationenaustausch erscheint die Präparation vollständig homogen und bei 4ºC für mehrere Monate stabil.

Analyse des in Lösung und durch Kristallisation gebildeten CD8αα-HLA-A2- Komplexes

Die geschätzten molaren Verhältnisse der Polypeptidbanden, welche der HLA-A2- Anordnung und CD8αα entsprechen, sind bei dem in Lösung gebildeten Komplex und bei dem Kristall identisch, allerdings ist die Stöchiometrie, angezeigt durch die Intensität der Banden, in gewissem Sinn unerwartet. Da CD8 auf der T-Zelloberfläche als Dimer vorkommt, wurde angenommen, dass CD8 zwei MHC-Moleküle bindet, und dass der Bindung zwischen T-Zelle und Zielzelle und der T-Zellaktivierung eine bivalente Stöchiometrie zu Grunde liegen könnte. Berücksichtigt man, dass CD8α mit Coomassie schwächer angefärbt wird als β2m, weist die Gelanalyse der Komplexe dennoch eher auf ein HLA-A2 : CD8αα-Verhältnis von 1 : 1 hin, was durch die Kristallstruktur bestätigt wurde. Auf der Kristallstruktur beruhende Überlegungen hinsichtlich der Sterik schließen aus, dass mehr als ein CD8αα-Dimer an den MHC bindet.
Jüngste Untersuchungen von Zellen oder löslichem CD8 und TZR der Maus wiesen darauf hin, dass es bei beiden Rezeptoren einen Mechanismus für die kooperative Bindung an den MHC-Klasse-I gibt. Der Vergleich der Kristallstrukturen von CD8αα/HLA und TZR/HLA des Menschen deutete an, dass beide Rezeptoren eine Verlagerung der α3-Domäne der schweren Kette des HLA veranlassen, was bei einer Bindung energetisch ungünstig sein könnte. Weitere Untersuchungen der Komplexe aus MHC-Klasse-I und CD8 und TZR des Menschen sollten klären, ob die Strukturverlagerung der schweren Kette des HLA einen Mechanismus für die kooperative Bindung dieser Rezeptoren darstellt.

Beispiel 2. Immuninhibitorischer Effekt des CD8αα-Rezeptors.

Bei einem standardmäßigen Test zytotoxischer T-Zellen werden geeignete Zielzellen, z. B. Zellen, die den relevanten restriktiven MHC exprimieren, zunächst mit Peptid (1 Stunde lang) und mit radioaktivem Chrom inkubiert. Nach dem Waschen werden die Zielzellen zu den T-Zellen gegeben. Durch den T-Zellrezeptor (TZR) und CD8 erkennt die T-Zelle den Komplex aus Peptid und MHC auf der Oberfläche der Zielzelle, und lysiert die Zielzelle, falls der Ligand geeignet und in ausreichender Konzentration vorhanden ist. Die Lyse wird durch Messung der Freisetzung von radioaktivem Chrom bewertet.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse einer Reihe von Experimenten, die folgenderweise durchgeführt wurden:
Es wurde eine Linie aus T-Zellen des Menschen (angereichert und selektiert), welche das ,gag'-Peptid von HIV1 (SLYNTVATL [SEQ-ID-Nr.: 13]) erkennen und HLA-A2- restringiert sind, verwendet. Es wurde eine gleich bleibende Zahl von Zielzellen; 5000, HLA- A*0201 exprimierende, "868"-B-Zellen, verwendet, während die Anzahl der T-Zellen verändert wurde. "E : T" entspricht dem Verhältnis der Anzahl der T-Zellen zu den Zielzellen. Getestet wurden vier E : T-Verhältnisse. Die Peptidkonzentration variierte von 10&supmin;¹¹ bis 10&supmin;&sup7; M (horizontale Achse in den Schaubildern). (Die Einheiten der Peptidkonzentration sind log&sub1;&sub0;M, es sei denn, anderes ist abgezeigt). Es wurden vier Reihen von Experimenten zur Testung des CD8-Effekts durchgeführt, diese sind wie folgt durch die Legende im Diagramm angezeigt:
"PBS" - Inkubation mit Zellmedium alleine (phosphatgepufferte Salzlösung) als eine Kontrolle;
"CD8-Ab" - Inkubation mit einem anti-CD8-monoklonalen Antikörper (100 ug/ml), OKT8, der durch die Bindung an CD8 auf der Zelloberfläche einen gewissen hemmenden Effekt haben und die Wechselwirkung zwischen diesem und HLA-A2 blockieren sollte.
"CD8" - Inkubation in Gegenwart des löslichen CD8-Rezeptors in einer Konzentration von 100 ug/ml;
"CD8-Mutante" - Inkubation in Gegenwart des löslichen CD8-Rezeptors mit der 54- 55E-Doppelmutation in einer Konzentration von 100 ug/ml.
Die Testbestandteile bei diesen Experimenten waren:
18 ul 10 · Peptid
18 ul PBS oder PBS mit 1 mg/ml CD8αα oder CD8 OKT8-Ab
50 ul Zielzellen (5,000 868-B-Zellen)
100 ul mit 5,000-50,000 ZTL
Die Schaubilder in Fig. 8 zeigen die Ergebnisse nach 2-stündiger Inkubation.
Fig. 9 zeigt Daten aus denselben Experimenten wie Fig. 8, außer, dass die Daten nach 6 Stunden Inkubation erhoben wurden.
Die Daten in Fig. 8 und 9 zeigen:
- dass erwartungsgemäß bei einer hohen Peptidkonzentration mehr Zielzellen getötet werden. Bei einer geringen Konzentration ist die Dichte der spezifischen Zielmoleküle auf der Oberfläche der Zielzelllen zu gering, um die T-Zellen zu aktivieren.
- dass der CD8-Antikörper, der CD8 auf den T-Zellen blockiert, im Vergleich zu PBS (Kontrolle) einen gewissen hemmenden Effekt hat.
- dass der lösliche CD8, von dem angenommen werden muss, dass er MHC auf den Zielzellen bindet, einen deutlichen hemmenden Effekt hat, der sogar höher ist als der des CD8-Antikörpers.
- dass der Effekt des löslichen CD8 in spezifischem Bezug steht zu seiner Bindung an den MHC, da die Mutante, bei der zwei ausschlaggebende Aminosäuren ausgetauscht wurden, keinen hemmenden Effekt hat.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse einer Reihe von Experimenten, die wie folgt durchgeführt wurden. Es wurde dieselbe menschliche T-Zelllinie, welche das "gag"-Peptid von HIV-1 erkennt und HLA-A2-restringiert ist, wie in den Experimenten in Fig. 8 und 9 verwendet. Es wurde eine gleichbleibende Anzahl von Zielzellen und T-Zellen, jeweils 5,000, verwendet. Die Peptidkonzentration wurde zwischen 10&supmin;¹¹ und 10&supmin;&sup7; M (horizontale Achse im Schaubild) variiert.
Es wurden fünf Reihen von Experimenten durchgeführt, in denen der CD8-Effekt getestet wurde:
"PBS" - Inkubation mit Zellmedium als Kontrolle;
"CD8 A" - Inkubation in Gegenwart einer Präparation des löslichen CD8-Rezeptors einer Konzentration von 100 ug/ml;
"CD8 B" - Inkubation in Gegenwart einer zweiten Präparation des löslichen CD8- Rezeptors einer Konzentration von 100 ug/ml;
"Mutante 22" - Inkubation in Gegenwart des löslichen CD8-Rezeptors mit der 54- 55E-Doppelmutation einer Konzentration von 100 ug/ml;
"Mutante 15" - Inkubation in Gegenwart des löslichen CD8-Rezeptors mit der 99E- Mutation einer Konzentration von 100 ug/ml;
Die Ergebnisse wurden nach einer 2-stündigen Inkubation zusammengestellt.
Die Daten in Fig. 10 erweitern die Schlussfolgerungen aus den Daten in Fig. 8 und 9, und zeigen bei zwei Präparationen des löslichen CD8 im Vergleich zu zwei mutierten CD8 ähnliche Effekte. Das Verhältnis E : T betrug 1 : 1, die Dauer des Tests betrug 2 Stunden.
Fig. 11 zeigt Experimente, die wie oben beschrieben durchgeführt wurden, außer das die Konzentration des löslichen CD8 von 0-100 ug/ml variiert wurde. Die drei Spuren entsprechen Peptidkonzentrationen von 10&supmin;&sup9;, 10&supmin;&sup8; und 10&supmin;&sup7; M. Das Verhältnis E : T betrug 1 : 1, die Dauer des Tests betrug 2 Stunden.
Die Daten in Fig. 11 zeigen, das die CD8-Inhibition der Zell-Lyse titrierbar ist.
Fig. 12 zeigt Daten aus einem Experiment, das den oben umrissenen ähnlich ist, außer dass ein T-Zellklon verwendet wurde, der spezifisch für das "pol"-Peptid von HIV1 (VIYQYMDDL [SEQ-ID-Nr.: 14]) und HLA-A2-restringiert ist. Die Zielzellen waren 868-B- Zellen. Das Verhältnis E : T betrug 5/1. die Peptidkonzentrationen variierten zwischen 10&supmin;&sup7; und 10&supmin;&sup5; M. "Lyse" zeigt das absolute Ableseergebnis, "spezifische Lyse" zeigt die hinsichtlich der Basiswerte korrigierten Ergebnisse.
Die Daten in Fig. 12 zeigen, dass der hemmende Effekt von CD8 auch mit einem T- Zellklon beobachtet wird.
Fig. 13 ist eine andere Titration der CD8-Inhibition, welche sowohl die Lyse der Zielzellen aus auch die T-Zellstimulation zeigt, die anhand der Produktion von MIP1β bewertet wurde. MIP1β ist ein Marker für die Aktivierung von T-Zellen, der von den T- Zellen in Mengen produziert wird, die proportional zu deren Aktivierungszustand ist. Dies zeigt, dass der hemmende Effekt mit einer Inhibition der T-Zellaktivierung korreliert. In dem Lyse-Experiment betrug das Verhältnis E : T 8 : 1; die Peptidkonzentration war 10 uM; keine der Peptidkontrollen enthielt 100 ug/ml CD8αα; der subtrahierte Basiswert bestand aus der Negativkontrolle kein Peptid/kein CD8αα. In dem M1P-Experiment wurden 10&sup5; Zellen pro Vertiefung eingesetzt; im Test wurde 10 uM Peptid in einem Gesamtvolumen von 186 ul verwendet.
Fig. 14 zeigt Daten aus Experimenten mit einer seltenen T-Zellantwort, welche von CD8 unabhängig ist. Das Experiment wird ähnlich wie die zuvor beschriebenen durchgeführt, außer dass eine andere Probe zytotoxischer T-Zell-Lymphozyten in einem Tötungs-Test mit ,868'-B-Zellen in einem Verhältnis von E : T von 5 : 1 und mit unterschiedlichen Konzentrationen an OKT8-CD8-Antikörper inkubiert wurden. Die Legende zeigt die nach 30 Minuten erhobenen Daten:
"PBS" - Inkubation mit Zellmedium als eine Kontrolle
"600/100/10 ug/ml" - die für jeden Inkubationsdatensatz verwendete Konzentration des OKT8-CD8-Antikörpers
Die Daten in Fig. 14 zeigen, dass die ZTL-Antwort dieser bestimmten Probe von T- Zellen nicht durch CD8-Antikörper gehemmt werden kann, außer bei extrem hohen Konzentrationen, bei denen jedes Protein aufgrund toxischer Effekte hemmend wirken würde. Die ZTL-Antwort bei diesem bestimmten Zelltyp ist daher unabhängig von CD8.
Dieses Experiment verwendet eine HLA-A2-Pol-restringierte ZTL-Linie, spezifisch für das Peptid ILKEPVHGV [SEQ-ID-Nr.: 12]. Diese Zelllinie ist CD8-unabhängig, definiert durch das Fehlen einer Inhibition der Lyse der Zielzellen bei Vorinkubation mit anti-CD8- Antikörper.
Fig. 15 zeigt Daten aus einem ähnlichen Experiment mit denselben Zellen, inkubiert mit löslichem CD8-Rezeptor und verschiedenen Peptidkonzentrationen unter ähnlichen Bedingungen, beispielsweise E : T 5 : 1, "868"-B-Zellen als Zielzellen. Die Legende entspricht:
"PBS" - Inkubation mit Zellmedium als eine Kontrolle
"CD8" - Inkubation mit löslichem CD8αα-Rezeptor einer Konzentration von 100 ug/ml.
Die Daten in Fig. 15 zeigte, dass die ZTL-Antwort bei dieser Zellprobe nicht durch lösliches CD8 inhibiert wird.
Zusammengenommen zeigen die Daten in Fig. 14 und 15 also, dass die von löslichem CD8 vermittelte Hemmung, die in den in Fig. 8 bis 13 untersuchten ZTL- Antworten beobachtet wurde, nicht auf einen unspezifischen Effekt zurückzuführen ist.

Beispiel 3. Effekt von sCD8αα auf frühe Protein-Tyrosin-Phosphorylierungsereignisse bei CD8-abhängigen und -unabhängigen ZTL

Als antigenpräsentierende Zellen (APZ) wurden B-Zellen mit passendem HLA, gepulst mit Antigen und transformiert mit Epstein-Barr-Virus, eingesetzt. APZ wurden vor der Zugabe von ZTL in einem. E : T-Verhältnis von 10 : 1 5 Minuten lang mit löslichem CD8αα inkubiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 37ºC wurden die Zellen pelletiert und in Lyse-Puffer lysiert (Purboo et al. 1998). Das Lysat wurde durch Zentrifugation bei 13,000 rpm in einer Berichtop-Mikrofuge geklärt und durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Gele wurden mit dem Western-Blot-Verfahren auf Nitrozellulosemembranen geblottet und die Membran danach mit einem anti-Phosphotyrosin-mAb inkubiert. Der primäre Antikörper wurde mittels eines mit Meerrettich-Peroxidase (Horseradish peroxidase; HRP)-markierten, sekundären Antikörpers und verstärkter Chemilumineszens (enhanced chemiluminescence; ECL) nachgewiesen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 16 gezeigt. Anti-Phosphotyrosin-Immunblots von Zelllysaten aus (A) dem 003-HLA-A2/Gag-ZTL-Klon (CD8-abhängig) und aus (B) der SC6- HLA-A2/Pol-ZTL-Linie (CD8-unabhängig). Mit Antigen gepulste B-Zellen (10&sup5;) wurden entweder in Abwesenheit von sCD8αα (Spur 1), in Gegenwart von 200 oder 100 ug/ml sCD8αα (Spur 2, bzw. 3) oder in Gegenwart von 200 oder 100 ug/ml an löslicher CD8α- Glu&sub5;&sub4;/Glu&sub5;&sub5;-Mutante (Spur 4, bzw. 5) den ZTL (10&sup6;) präsentiert. Ebenfalls gezeigt sind ruhende ZTL (Spur 7) und ZTL, denen ungepulste B-Zellen (Spur 6) präsentiert wurden. Um sowohl die allgemeine Protein-Tyrosin-Phosphorylierung als auch insbesondere die Phosphorylierung der z-Kette bewerten zu können, wurden die oberen und unteren Teile des Immunblots wie angezeigt unterschiedlich lang exponiert. Es ist für die CD8-unabhängigen ZTL nur die Tyrosin-Phosphorylierung der z-Kette gezeigt (B).
Dieses Experiment erlaubte die Evaluierung der intrazellulären Effekte auf die T- Zellaktivierung (Fig. 16). Die Protein-Tyrosin-Phosphorylierung in dem 003-Gag/HLA-A2- restringierten ZTL-Klon wurde in Gegenwart von sCD8αα als Antwort auf das Index-Peptid nicht induziert, was lediglich zu einem Aktivierungsstadium führte, das vergleichbar war mit der Reaktion auf nicht mit Agonist gepulste B-Zellen (Fig. 16A, Spur 2, 3 und 6). Es ist deshalb nur die peptidspezifische Protein-Tyrosin-Phosphorylierung betroffen und der hemmende Effekt von sCD8αα scheint daher auf die Signalisierung durch den TZR/CD3- Komplex limitiert zu sein. Die Inhibierung der Tyrosin-Phosphorylierung der CD3-z-Kette durch sCD8αα deutet darauf hin, dass die T-Zellaktivierung am frühesten Schritt der Signalkaskade blockiert wird, was mit der Hemmung der Aktivierung von p56lck übereinstimmt. In Gegenwart der Glu&sub5;&sub4;/Glu&sub5;&sub5;-Mutante wurde kein hemmender Effekt auf die Phosphorylierung beobachtet (Fig. 16A, Spur 4 und 5). Im Gegensatz zu den Beobachtungen mit CD8-abhängigen ZTL hatte bei den SC6-Pol/HLA-A2-restringierten und der CD8- unabhängigen ZTL-Linie keines der sCD8αα-Proteine einen Effekt auf die Phosphorylierung der z-Kette (Fig. 16B) oder auf die allgemeine Aktivierung (nicht gezeigt).
Diese Ergebnisse zeigen, dass löslicher CD8-Rezeptor durch seine Spezifität für MHC-Moleküle als potenter Inhibitor der CD8-abhängigen ZTL-Aktivierung wirken kann. Am auffälligsten ist die Beobachtung, dass sCD8αα vollständig die frühen Signalisierungsereignisse durch den TZR/CD3-Komplex blockiert. Dies weist darauf hin, dass das lösliche Protein in den hier angewandten Konzentrationen auf einer Steady-State-Stufe bindet, bei welcher die Mehrzahl der CD8-MHC-Wechselwirkungsstellen blockiert wird, oder dass die Blockierung einer Untergruppe von MHC-Molekülen die Signalisierung in Bezug auf den Kontakt mit CD8, aber nicht in Bezug auf den Kontakt mit TZR, ausschaltet.

Beispiel 4. Expression und Rückfaltung von CD8αα bei Mutation des Cystein 33 zu Serin.

Generell stellt die Anzahl der Cysteinreste im Polypeptid den Faktor dar, der die Proteinfaltung in vitro am meisten beeinflusst. Je höher die Anzahl der Cysteinreste ist, desto mehr Kombinationsmöglichkeiten ergeben sich für die Bildung von Disulfid-Brücken, sowohl in demselben Polypeptid (Disulfid-Brücken innerhalb der Ketten) als auch zwischen zwei oder mehr Polypeptidketten (Disulfid-Brücken zwischen den Ketten). Die Mutation von Cysteinresten, die in der nativen Proteinkonformation ungepaart sind, wirkt sich daher bei der Rückfaltung in vitro für die Erträge fast immer vorteilhaft aus. Meistens werden solche Reste zu Serin- oder Alaninresten mutiert.
Beim CD8αα ist der Cysteinrest an Position 33 des reifen Proteins in der nativen Konformation ungepaart (Gao et al., 1997; Leahy et al., 1992). Dieser Rest wurde daher mit den folgenden Primern in einer PCR-Mutagenese-Reaktion (Stratagene) zu einem Serinrest mutiert, um die CD8αα-Erträge bei der in vitro-Faltung zu erhöhen:
Der Rest, der das Cysteincodon zu einem Serincodon verändert, ist in den Primersequenzen unterstrichen.

Beispiel 5. Rückfaltung unter CD8αα in vereinfachten Pufferbedingungen

Um die Kosten der Rückfaltung von CD8αα zu verringern und einige der Puffer, die für den in vivo-Gebrauch des Proteins unerwünscht sein könnten, zu eliminieren, wurden Rückfaltungen unter vereinfachten Bedingungen getestet.
Wenn das Protein vor der Rückfaltung wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert wird (z. B. wurde CD8αα in einer Konzentration von 10 mg/ml in 2 ml Harnstoffpuffer zu 15 ml Guanidinpuffer gegeben und equilibrieren gelassen), aber unter den folgenden Pufferbedingungen rückgefaltet wird, so wurden praktisch identische Rückfaltungserträge erzielt:

Rückfaltungspuffer 2:

0-10 mM Tris-HCl (pH 8,0)
0-0,1 mM PMSF
6,5 mM Cysteamin
3,7 mM Cystamin.

Beispiel 6. Expression von CD8αα, fusioniert mit einem Biotinylierungsmarker, und Produktion von multimeren CD8αα-Proteinkomplexen

Der Expressionsvektor für das lösliche CD8α-Gen wurde auch modifiziert, um CD8α in einer Fusion mit dem "Biotinylierungsmarker", der ein Substrat für das bakterielle Enzym Bir A ist (Schatz, 1993), zu exprimieren. Das folgende DNA-Oligo (zum "Antisense"-Strang korrespondierend) wurde zusammen mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Primer für eine PCR-Reaktion benutzt, um das CD8α-Fusionsgen herzustellen:
was damit zu dem exprimierten CD8α-Polypeptid die folgende Proteinsequenz (im Ein-Buchstaben-Code) hinzufügte:
G S G G G L N D I F E A Q K I E W H [SEQ-ID-Nr.: 18]
Das markierte CD8α-Protein (CD8α-BT) wurde in ähnlicher Menge wie CD8α exprimiert und als Dimer mit ähnlichem Ertrag unter den gleichen Bedingungen, wie sie für CD8α verwendet wurden, rückgefaltet. Die funktionelle Validität des markierten Proteins wurde in Surface Plasmon Resonance-Experimenten gezeigt, in denen das CD8αα-BT durch Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen immobilisiert und gezeigt wurde, dass es spezifisch an lösliche Klasse-I-MHC-Moleküle bindet.
Genauer gesagt, wurde das mit einer Sequenz eines Bioinylierungsmarkers ausgestattete CD8α wie beschrieben in E.coli exprimiert, gereinigt und mit dem Bir A-Enzym biotinyliert (Schatz, 1993). Das biotinylierte sCD8αα wurde auf der Oberfläche einer mit Streptavidin beschichteten Biacore-Flusszelle immobilisiert, was zu einer Veränderung des Brechungsindex in Höhe von 3700 Response-Einheiten (RE) führte. Der monoklonale Antikörper OX68 wurde auf einer anderen Flusszelle immobilisiert, was eine Veränderung des Brechungsindex in Höhe von 3400 RE ergab. Daraufhin wurden beide Flusszellen mit dem biotinylierten sCD8αα beschickt, wobei die mit dem OX68 beschichtete Flusszelle als Kontrolle für die mit CD8 beschichtete Flusszelle diente. Die Oberflächen wurden mit der löslichen Form des mit dem Pol-Peptid von HIV-1 (HIV-1-Polymerasereste 476-484 mit der Peptidsequenz im Ein-Buchstaben-Code: ILKEPVHGV [SEQ-ID-Nr.: 12]) gefalteten MHC- Komplexes HLA-A2 beschickt und zwar in den in Fig. 17 angezeigten Konzentrationen. Die Profile der Veränderungen der RE beider Flusszellen wurden übereinander gelegt (Fig. 17). De Veränderungen der RE waren bei jeder Konzentration höher in der mit sCD8αα beschichteten Flusszelle als in der mit OX68 beschichteten Flusszelle. Die jeweiligen Profile der beiden Flusszellen sind für die vier höchsten Konzentrationen des HLA-A2-Komplexes angezeigt. Wie in Fig. 17 gezeigt, wurde eine spezifische Bindung an das markierte, biotinylierte und immobilisierte CD8 beobachtet. Diese Form vom CD8 kann also wie vorgeschlagen immobilisiert werden, wobei seine funktionale Integrität intakt bleibt und es sich daher für die Herstellung von multimeren CD8-Komplexen eignet.
Es ist zu erwarten, dass multimere CD8-Komplexe mit höherer Stabilität an antigenpräsentierende Zellen binden als das CD8αα-Dimer. Das biotinylierte CD8αα-BT- Protein könnte beispielsweise durch Bindung an Avidin oder Streptavidin als Tetramer aus Dimeren hergestellt, an verschiedene Arten avidin- oder streptavidinbeschichteter Körnchen oder an die Oberfläche von aus derivatisierten Lipiden hergestellten Liposomen gebunden werden. So könnte man CD8-Partikel einer höheren Multimerisierungsordnung erhalten, die mit signifikanter Avidität an antigenpräsentierende Zellen binden und daher als effiziente Suppressoren der zytotoxischen T-Zellantwort wirken.

Produktion von CD8-Tetrameren und CD8-beschichteten Körnchen

Um das biotinylierte CD8αα zu tetramerisieren, wurde Extravidin (Sigma) in einem molaren Verhältnis von 1 : 4 zugegeben. Fluoreszierend markiertes Extravidin wird für Zellmarkierungsexperimente verwendet. Die Zugabe erfolgte schrittweise, um eine Sättigung des Extravidin zu erreichen; dabei wurde ein gewisses Maß an Unvollständigkeit bei der Biotinylierungsreaktion und eine gewisse Ungenauigkeit bei der Proteinbestimmung in Kauf genommen. Zwischen jeder Zugabe des Extravidin zur Bindung stand das Reaktionsgemisch 15 Minuten lang auf Eis, nach der letzten Zugabe stand es mindestens über Nacht bei 4ºC. Die Tetramerisierung wurde durch Gelfiltration einer kleinen Probe der Lösung auf einer kalibrierten Superdex-200-Säule (Pharmacia) bestätigt. Die Lösung aus CD8-Tetrameren wurde dann in Gegenwart einer Mischung aus Proteaseinhibitoren und 0,05% Natriumazid bei 4ºC aufbewahrt.
Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden, um verschiedene Arten von Körnchen oder andere feste Trägermaterialien mit löslichem CD8 zu beschichten. Mit Avidin/Streptavidin beschichtete Körnchen sind kommerziell erhältlich (beispielsweise Dynabeads von DYNAL, Oslo, Norwegen, oder MACS von Miltenyi Biotec Ltd., Bergisch Gladbach, Deutschland) und zwar in vielen verschiedenen Größen von etwa 4,5 um-65 nm im Durchmesser. Die Immobilisierung von MHC-Peptidkomplexen auf Dynabeads durch Biotin- Streptavidin ist bereits beschrieben (Vessey et al., 1997). Gereinigtes, biotinyliertes Protein wird mit Streptavidin-beschichteten Körnchen für die Dauer von cirka 30 Minuten bei 4ºC inkubiert, danach werden die Körnchen gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen. Diese, mit MHC-Peptid beschichteten Körnchen rufen eine antigenspezifische Antwort hervor, wenn sie zur Stimulation einer TZR-exprimierenden Zelllinie verwendet werden. In ähnlicher Weise können CD8-Tetramere oder monomere bioinylierte, lösliche CD8 auf mit Avidin/Streptavidin beschichteten Körnchen immobilisiert werden, oder nicht-biotinyliertes CD8 kann mittels Beschichtung mit anti-CD8-Antikörpern oder durch direkte chemische Quervernetzung oder durch andere geeignete Mittel immobilisiert werden.

Produktion von Liposomen und Arzneimittel-Packaging

Lipide und andere Komponenten, steril und Endotoxin-getestet, sind kommerziell von einer Zahl von Quellen erhältlich, beispielsweise von Sigma Chemical Company oder Avanti Polar Lipids Inc., USA.
Liposome werden aus einer Mischung aus vesikelbildenden Lipiden und biotinylierten vesikelbildenden Lipiden hergestellt. Es gibt eine Vielzahl geeigneter Methoden zur Liposomenbildung. Daraufhin wird CD8 über ein geeignetes Verbindungsstück wie beispielsweise Avidin, Streptavidin oder Extravidin an die Außenseite der Liposomen gebunden. Wenn gewünscht, befinden sich in der Membran selber oder eingeschlossen im wässrigen Volumen innerhalb der Membran Nachweismarker und/oder Reagenzien, wie beispielsweise therapeutische Wirkstoffe.

Beispiel 7. Reste die mutiert werden können um die Affinität des CD8αα für den MHC zu verändern.

Die Affinität des CD8αα-Dimers für den MHC kann durch Substitution eines oder mehrere Reste erhöht werden, die den Kontakt zum MHC herstellen. Eine erhöhte Affinität kann die Fähigkeit des sCD8αα zur Inhibition der zytotoxischen T-Zellantwort erhöhen, da die Besetzung des sCD8αα-Moleküls auf den MHC-Molekülen auf der Oberfläche der antigenpräsentierenden Zellen höher sein müsste. Es ist vorstellbar, dass Substitutionen eines oder mehrerer Reste der folgenden Liste die Affinität des CD8αα für den MHC erhöhen, wobei die Zahlen sich auf die Aminosäurepositionen in der Proteinsequenz des reifen CD8α beziehen:
Arginin 4 Serin 31
Lysin 21 Serin 34
Valin 24 Tyrosin 51
Leucin 25 Glutamin 54
Leucin 26 Asparagin 55
Serin 27 Asparaginsäure 75
Asparagin 28 Leucin 97
Prolin 29 Asparagin 99
Threonin 30 Serin 100
Siehe (Gao et al., 1997) für eine Liste von Kontaktresten wie von der CD8αα/HLA- A2-Struktur abgeleitet.
Die Substitution von Aminosäureresten ist Routine und kann mit bekannten Techniken durchgeführt werden. Substituiertes CD8 kann dann auf Bindung an den MHC getestet werden, und zwar unter Anwendung von hierin beschriebenen Techniken, oder/oder es kann hinsichtlich eines hemmenden Effektes auf T-Zellen getestet werden, indem es in ein CD8- Dimer eingebaut und ein zytotoxischer T-Zelltest durchgeführt wird, beispielsweise wie in Beispiel 2 beschrieben.

Beispiel 8. Lösliches CD8αα der Maus für Tierversuche.

Die Homologie zwischen CD8 und den mit CD8 in Kontakt tretenden Bereichen der MHC-Moleküle, macht es möglich, den immuninhibitorischen Effekt des humanen CD8 in Tierversuchen zu testen (siehe auch Beispiel 10). Es ist jedoch vorstellbar, dass für bestimmte Versuche in Maussystemen ein muriner sCD8αα verwendet wird. Der murine sCD8αα kann ein ähnliches Design aufweisen wie das hierin beschriebene humane Molekül. Das murine Molekül ist besonders nützlich für die Untersuchung der Langzeiteffekte der Verabreichung von sCD8αα. Obwohl die Sequenzen der humanen und der murinen CD8α-Moleküle sehr ähnlich sind, könnten sekundäre, gegen das humane Molekül gerichtete Reaktionen seine Funktion während Langzeitstudien mit Mäusen beeinträchtigen. Durch Polymerase-Ketten- Reaktion (PCR) mit cDNA von murinen ZTL als Vorlage und den folgenden, zum murinen CD8α passenden (Lyt-2; Nakauchi et al., 1985))Primersequenzen wurde für die Expression in E.coli und die Rückfaltung in eine lösliche dimere, dem humanen sCD8αα ähnliche Form ein murines CD8α-Gen hergestellt: Sense-Primer: Antisense-Primer:
Die Restriktionsschnittstellen darstellenden Basen, die zum Zwecke der Klonierung eingebaut worden sind, sowie Basen, die im Sense-Primer verändert worden sind, um die Expression in E.coli zu erhöhen, sind unterstrichen.
Fig. 18 zeigt die cDNA-Sequenz, die Proteinsequenz und die Domänenorganisation des murinen CD8α (Datenbank-Zugangs-Nr. M12052). Fig. 19 zeigt die DNA-Sequenz des bei der PCR produzierten DNA-Fragments und die abgeleitete Proteinsequenz des rekombinanten, löslichen murinen CD8α. Es ist vorstellbar, dass Variationen des löslichen, murinen CD8α, wie hierin für das lösliche humane CD8α beschrieben, ebenfalls hergestellt und in Tierexperimenten verwendet werden können. Solche Varianten können beispielsweise am N-Terminus eine oder mehrere Aminosäuren länger oder kürzer sein, oder am C-Terminus eine oder einige. Aminosäuren länger oder kürzer, als das hier dargestellte Protein. In den 40 am äußersten 5'-Ende liegenden Basen der in Fig. 19 gezeigten Expressionskassette können andere stille Mutationen (d. h. DNA-Mutationen, welche die Proteinsequenz nicht verändern) außer oder anstatt der hierin angezeigten eingebaut werden, um die Expression in E.coli zu erhöhen.
Außerdem ist eine Produktion von Proteinen, in denen der ungepaarte, in Fig. 18 und 19 gezeigte Cysteinrest mutiert wurde, um die Rückfaltungseffizienz zu erhöhen, vorstellbar.

Legenden zu Fig. 18 und 19

Fig. 18. cDNA-Sequenz des CD8α der Maus (untere Sequenz) mit Proteinsequenz (oben), angezeigt im Ein-Buchstaben-Code. Über der Proteinsequenz sind der Voraussagegrad der Signalsequenz, die immunglobulinähnliche Domäne, die membran-proximale "Stiel"-Region, die transmembranäre Domäne und die zytoplasmatische Domäne angezeigt (Nakauchi et al., 1985; Nakauchi et al., 1987). Die beiden Cysteinreste, von denen angenommen wird, dass sie die Disulfid-Bindung innerhalb der Ketten bilden, sind mit gekennzeichnet. Der Cysteinrest, von dem angenommen wird, dass er ungepaart bleibt, und der mutiert werden kann, um den Proteinertrag zu erhöhen, wie es für das humane CD8α vorgeschlagen wurde (Siehe Beispiel 4), ist mit # gekennzeichnet.
Fig. 19. DNA-Sequenz (untere Sequenz) der Kassette zur Expression von CD8α der Maus in E.coli. Die Proteinsequenz (oben) ist im Ein-Buchstaben-Code angezeigt. Die beiden Cysteinreste, von denen angenommen wird, dass sie die Disulfid-Bindung innerhalb der Ketten bilden, sind mit gekennzeichnet. Der Cysteinrest, von dem angenommen wird, dass er ungepaart bleibt, und der mutiert werden kann, um den Proteinertrag zu erhöhen, wie es für das humane CD8α vorgeschlagen wurde (siehe Beispiel 4), ist mit # gekennzeichnet. Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, mit deren Hilfe die durch PCR hergestellte Kassette in einen geeigneten Expressionsvektor, wie beispielsweise pGMT7 (Studier et al., 1990), kloniert werden kann, sind ebenfalls angezeigt. Basen, die kein Teil der ursprünglichen DNA-Sequenz sind, und die hinzugefügt wurden, um ein Startcodon zu kodieren, eine Subklonierung zu ermöglichen, oder die mutiert worden sind, um bakterielle Expression zu erhöhen, sind in Kleinbuchstaben gezeigt.

Beispiel 9. Bestimmung der Bindungsaffinität des löslichen CD8 an MHC

Zur Untersuchung der Affinität der Wechselwirkung zwischen löslichem CD8 und dem Komplex aus MHC-Klasse-I und Peptid kann die Technik der Surface-Plasmon-Resonance (SPR) verwendet werden. Dies kann beispielsweise nützlich sein um zu bestimmen, ob ein lösliches CD8-Molekül, in dem eine oder mehrere Aminosäuren substituiert wurden, im Vergleich zum nichtsubstituierten, löslichen CD8 eine erhöhte oder verringerte Bindungsaffinität besitzt.
SPR-Untersuchungen werden an einem BIAcoreTM 2000 durchgeführt (BIAcore AB, St Albans, UK) und zwar in HBS (BIAcore AB). HBS enthält 10 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA und 0,00% Surfactant P20. Streptavidin (Sigma) ist über primäre Amine kovalent an Sensor-Chips des Typs Research Grade CM5 (BIAcore), wobei der Amine Coupling Kit (BIAcore) verwendet wurde. Zur Kopplung wurde das Streptavidin in 10 mM Natriumacetat (pH 5,5) gelöst und in einer Konzentration von 0,5 mg/ml eingespritzt. Das Ausmaß der Immobilisation reicht von 6,000 bis 11,000 Response-Einheiten. Biotinyliertes HLA-A2 und Kontrollproteine werden dann durch Einspritzung über die Streptavidin-gekoppelten Oberflächen bei 0,05 bis 0,15 mg/ml für 0,5 bis 10 Minuten immobilisiert. Als Kontrollproteine werden biotinylierte monoklonale Antikörper aus Maus und Ratte verwendet.
Lösliches CD8, das an den HLA-A2 bindet, zeigt eine höhere Response, wenn es über die Oberfläche eingespritzt wird, welche immobilisierte HLA-A2 präsentiert, als wenn es über die Kontrolloberfläche eingespritzt wird. Es kann die Bindungsaffinität eines löslichen CD8 für HLA gemessen werden.

Fig. 20. CD8αα bindet spezifisch an immobilisiertes HLA-A2.

Ähnliche Konzentrationen (~300 uM) des Wildtyps von CD8αα oder die CD8αα- Mutante Q54E/N55D wurden für 90 Sekunden durch Flusszellen mit immobilisiertem HLA- A2 (durchgezogene Linie) oder Kontrollprotein (gepunktete Linie) injiziert (gefüllte Balken). HLA-A2 präsentierte ein Protein der Influenzamatrix (HLA-A2-flu; siehe Tabelle 1). Dieses Experiment wurde bei 25ºC durchgeführt, wobei eine Flussrate von 5 ul/min&supmin;¹ und ~2000 RE an immobilisiertem HLA-A2 oder Kontrollprotein verwendet wurden. Die hohen Hintergrund-Responsewerte der Kontroll-Flusszelle spiegeln den hohen Brechungsindex der eingespritzten CD8αα-Proben wider, was eine Folge der hohen Proteinkonzentrationen ist. CD8αα zeigt im Vergleich zur Kontrolle eine höhere Response, wenn es über die Oberfläche eingespritzt wird, welche immobilisiertes HLA-A2 präsentiert, was eine spezifische Bindung anzeigt. Die CD8αα-Variante band nicht, was die Spezifität dieser Wechselwirkung anzeigt.

Fig. 21. Die Affinität der CD8αα-Bindung an HLA-A2.

Die Affinität der Wechselwirkung zwischen CD8αα/HLA-A2 wurde durch Gleichgewichtsbindungsanalyse bestimmt. CD8αα wurde in den angegebenen Konzentrationen 30-60 Sekunden lang durch die Flusszellen gespritzt, an Jenen entweder HLA-A2-flu oder ein irrelevantes Kontrollprotein immobilisiert wurde. Die Bindung wurde berechnet als Differenz zwischen den Responses in der Flusszelle mit HLA-A2-flu und der Kontrollflusszelle. Dieses Experiment wurde sowohl bei (A) 25ºC als auch bei (B) 37ºC durchgeführt. Die durchgezogene Linie repräsentiert nicht-lineare Anpassungen der Bindungsisotherme nach Langmuir an die Daten. Diese ergaben Kd-Werte von 156 uM für (A) und 736 uM für (B). Die Bildeinsätze zeigen Scatchard-Diagramme derselben Daten; die gezeigten Kd-Werte wurden durch lineare Regression erhalten. Die Flussrate betrug 5-10 ul/min bei ~9,000 und ~1,900 RE für das immobilisierte HLA-A2-flu in (A), bzw. (B). Ähnliche Affinitäten wurden für die Bindung von CD8αα an zwei unterschiedliche Peptid/HLA-A2-Komplexe gemessen (Tabelle 1).

Die Kinetik des an HLA-A2 gebundenen CD8αα

Da die vorläufige Analyse andeutete, dass die Kinetik der Wechselwirkung zwischen CD8αα und MHC-Peptid außerordentlich schnell abläuft, wurden Daten in. Abständen von 0,1 Sekunden erfasst, was der schnellstmöglichen Datenerfassungsmöglichkeit des BIAcore- Systems entspricht. Wurde CD8αα über HLA-A2 bei 25ºC eingespritzt, wurde innerhalb von 0,4 Sekunden das Gleichgewicht erreicht, was eine direkte Bestimmung der Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten (kon) unmöglich macht. Auch die Dissoziation war sehr schnell, wobei die Response innerhalb von 0,4 Sekunden nach Beendigung der Einspritzung auf die Basislinie zurückkehre. Da die Dissoziationszeit in der gleichen Größenordnung lag wie die zum Auswaschen des Proteins aus der Flusszelle benötigte Zeit, wurde die Flussgeschwindigkeit auf 1,67 ul s&supmin;¹ erhöht, was der schnellstmöglichen Geschwindigkeit des BIAcore-Systems entspricht. Bei dieser Flussgeschwindigkeit dissoziierte CD8αα mit einem scheinbaren koff-Wert von 18 s&supmin;¹. Die Geschwindigkeit, mit der die Hintergrund-Response in der Kontrollflusszelle abfällt (~24 s&supmin;¹), stellt einen Schätzwert der Waschzeit dar. Dieser stimmt gut mit dem für diese Flussgeschwindigkeit berechneten, theoretischen Wert (~28 s&supmin;¹) überein [Flussgeschwindigkeit ÷ Flusszellenvolumen (+0,06 ul)]. Der wahre Kcff-Wert für die Wechselwirkung zwischen CD8αα und MHC-Klasse-I kann durchaus höher als 18 s&supmin;¹ sein, da eine erneute Bindung nach der Dissoziation, was in BIAcore-Experimenten häufig auftritt, nicht ausgeschlossen werden konnte. Außerdem ist der koff-Wert bei 37ºC wahrscheinlich höher als bei 25ºC, da die Affinität ~5-mal geringer ist (Tabelle 1). Beträgt der koff-Wert ≥ 18 s&supmin;¹ und der Kd 126 uM (bei 25ºC), so kann der kon-Wert auf ≥ 140.000 M&supmin;¹ s&supmin;¹ berechnet werden. Der kon-Wert ist typisch für Protein-Protein-Wechselwirkungen und zeigt an, dass die geringe Affinität der Wechselwirkungen zwischen Cd8αα und MHC-Klasse-I keine Folge des ungewöhnlich langsamen kon ist. Tabelle 1. Bindungsaffinität bei einem Gleichgewicht der CD8αα-Bindung an Peptid/HLA-A2.
*HLA-A2-flu: HLA-A2 plus Influenza-Matrixprotein 58-66 (GILGFVFTL [SEQ-ID- Nr.: 21]); HLA-A2-pol; HLA-A2 plus HIV-1-Polymerase 476-484 (ILKEPVHGV [SEQ- ID-Nr.: 12]).
** Mittelwert ± SD oder, bei n = 2, ± - Bereich bei n unabhängigen Bestimmungen.

Beispiel 10. Inhibition des Priming und der Aktivität der ZTL durch sCD8αα in vivo.

Die Fähigkeit von sCD8αα zur Hemmung einer zellulären Immunantwort in vivo wurde anhand von zwei Experimenten an Mäusen getestet, in denen der Einfluss von sCD8αα auf die Antwort auf ein, in einem Vaccinia-Virus kodierten Epitop (siehe Fig. 22 für ein Designschema) bewertet wurde. Alle Ergebnisse werden als Durchschnittswerte von fünf unabhängigen Bestimmungen jeder Lysestufe präsentiert.

Material und Reagenzien:

Mäuse: In beiden Experimenten wurden Mäuse des Stammes Black 6 (Wildtyp- Labormausstamm) verwendet.
Virus: Der Stamm G2 (vvG2) des Vaccinia-Virus ist ein rekombinanter Virusstamm. Infektion von Zellen mit Vaccinia-Virus führt im Allgemeinen zur einer MHC-restringierten Präsentation einer Anzahl von ungenügend charakterisierten Vaccinia-Peptidepitopen. Infektion mit dem Stamm vvG2 führt jedoch ebenfalls zur Präsentation eines Peptidepitops, das zu den Aminosäuren 33-41 (Sequenz im Ein-Buchstaben-Code: KAVYNFATC [SEQ-ID- Nr.: 22] des G2-Glykoproteins des LCM-Virus korrespondiert. Bei der Maus wird das G2- Epitop von dem MHC-Molekül Db präsentiert.
Zielzellen: Antigenpräsentierende Zellen MC57 (Leist et al., 1987), welche die MHC- Moleküle Kb und Db der Maus exprimieren.

Experiment 1:

Maus 1 (M1) wurde an Tag 0 intravenös mit 2 · 10&sup6; pfu (plaque forming units; plaquebildende Einheiten) des G2-Stammes des Vaccinia-Virus und außerdem mit 200 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, standardmäßig verwendeter, physiologischer Salzpuffer) injiziert.
Maus 2 (M2) wurde an Tag 0 intravenös mit 2 · 10&sup6; pfu (plaque forming units) des G2-Stammes des Vaccinia-Virus und außerdem mit 200 ul sCD8αα (20 mg/ml) in PBS injiziert.
In keinem Tier kam es zu erkennbaren Nebenwirkungen.
Zur Bestimmung der ZTL-Aktivität wurde eine Modifikation eines bereits beschriebenen Verfahrens verwendet (Leist et al., 1987).
An Tag 6 wurde den Mäusen die Milz entnommen, und die Lymphozyten wurden daraus ausgewaschen. Die Milzzeilen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen zusammen mit ConA-Überstand kultiviert. In die Vertiefungen wurden synthetische Peptide gegeben, die dem 33-41-Epitop von G2 entsprachen, und die Lymphozyten konnten sich vier Tage lang vermehren.
Am Tag 10 wurden die T-Zellen gezählt und es wurden wie folgt ZTL-Kill-Tests durchgeführt. Chrom&sup5;¹-gepulste MC57-Zellen wurden mit G2-33-41-Peptid eine Stunde lang vorgepulst, dann mit den kultivierten Mauslymphozyten im angezeigten Verhältnis von Effektor zu Zielzellen gemischt. Die Chrom&sup5;¹-Werte aus den Vertiefungen mit MC57-Zellen, die durch Zugabe von Detergenz lysiert wurden, wurde als 100%ige Lyse festgesetzt.

Experiment 2:

Maus 3(M3) wurde wie M1 behandelt, außer dass die Injektionen intraperitoneal erfolgten.
Maus 4(M4) wurde wie M2 behandelt, außer dass die Injektionen intraperitoneal erfolgten.
Wieder gab es keine erkennbaren Nebenwirkungen. Tabelle 2

In vitro-Kontrollexperiment:

Um zu verifizieren, dass die ZTL-Antwort auf G2-33-41 CD8-abhängig und durch sCD8αα hemmbar ist, wurde der Effekt von löslichem CD8 in einem Lysetest mit den kultivierten ZTL aus Maus 1 getestet. Wie in Tabelle 3 gezeigt, ist die ZTL-Antwort auf G2- 33-41 sowohl durch anti-CD8-Antikörper als auch durch sCD8αα eindeutig hemmbar.
Tabelle 3. Hemmung der ZTL-Antwort von M1 durch den anti-CD8 monoklonalen Antikörper YTS 169.4 (Cobbold et al., 1984) und durch sCD8αα. In allen Experimenten betrug das Verhältnis von Effektor zu Zielzelle (E : Z) 20 : 1. 200 ul-Tests enthielten 100 ug anti-CD8-mAb YT62.1 oder sCD8αα in 25 ul.

Experiment 3:

Maus 5 und 6 (M5 und M6; Kontrolltiere) wurde wie M3 behandelt, außer dass zwei Injektionen mit PBS-Puffer verabreicht wurden, eine davon fünf Stunden vor der Infektion mit Vaccinia-Virus-G2 und eine weitere Injektion 24 Stunden nach der ersten.
Maus 7 und 8 (M7 und M8) wurde wie M4 behandelt, außer dass zwei Injektionen mit sCD8αα verabreicht wurden, eine davon fünf Stunden vor der Infektion mit Vaccinia-Virus- G2 und eine weitere Injektion 24 Stunden nach der ersten. Wie bei den Experimenten 1 und 2 wurden keine offensichtlichen Nebeneffekte beobachtet.
Nachdem an Tag 6 die Zellen aus den Milzen gewaschen worden waren, wurde eine Hälfte der Vertiefungen mit Lymphozytenkulturen mit und die andere ohne ConA-Überstand gezüchtet. Dies geschah um zu testen, ob die Effekte von sCD8αα ohne die Zugabe von ConA-Überstand deutlicher nachweisbar waren. Der ConA-Überstand enthält mehrere Zytokine und stimuliert daher sowohl die spezifische als auch die unspezifische Lyseaktivität, und ampliziert somit die nach der Kultur beobachtete Lyse. Dies könnte zur Verdeckung des hemmenden Effekts von sCD8αα führen.
Wie in Tabelle 4 zu sehen ist, hat sCD8αα bei beiden Tieren einen deutlichen hemmenden Effekt auf die Proliferation zytotoxischer T-Zellen, die spezifisch sind für das G2-Peptid. Der hemmende Effekt ist in den ohne ConA-Überstand gezüchteten Kulturen erwartungsgemäß ausgeprägter. Tabelle 4. Lysestufen der vier Ansätze mit Milzkulturen, wobei jede von M5-M8 stammte. Bei jeder Lysestufe wurden Doppelbestimmungen gemacht.
Die in den beiden von M7 und M8 stammenden Milzkulturen beobachtete "negative" Lyse ist auf die komplette Inhibition der ZTL und die Subtraktion der "Spontanlyse" von allen Ergebnissen zurückzuführen: Dieses Phänomen kommt bei ZTL-Tests häufig vor.

LITERATURSTELLEN

Baert, F., and Rutgeerts, P. (1997). Immunomodulator therapy of inflammatory bowel disease. Acta Clin Beig 52, 251-7.
Boursier, J.P., Alcover, A., Herve, F., Laisney, I. and Acuto, O: (1993) J. Biol. Chem. 268, 2013-2020.
Chatenoud, L. (1998). Tolerogenic antibodies and fusion proteins to prevent graft rejection and treat autoimmunity. Mol Med Today 4, 25-30.
Choski, S., Jameson, B.A. and Korngold, R. (1998). Nature Medicine vol. 4 no. 3, 309-314.
Cobbold, S.P., Jayasuriya, A., Nash, A., Prospero, T.D., and Waldmann, H. (1984). Therapy with monoclonal antibodies by elimination of T-cell subsets in vivo. Nature 312, 548-51.
Gao, G.F., Tormo, J., Gerth; U.C., Wyer, J.R., McMichael, A.J., Stuart, D.L, Bell,ss J.L, Jones, E.Y., and Jakobsen, B.K. (1997). Crystal structure of the complex between human CD8alpha (alpha) and HLA-A2. Nature 387, 630-4.
Garcia, K.C., Scott, C.A., Brunmark, A., Carbone, F.R., Peterson, P.A., Wilson, I.A. and Teyton, L. (1996) Nature 384, 577-581.
Leahy, D.J., Axel, R., and Hendrickson, W.A. (1992). Crystal structure of a soluble form of the human T cell coreceptor CD8 at 2.6 A resolution. Cell 68, 1145-62 Issn: 0092- 8674.
Leist, T.P., Cobbold, S.P., Waldmann, H., Aguet, M., and Zinkernagel, R.M. (1987). Functional analysies of T lymphocyte subsets in antiviral host defense. J Immunol 138, 2278- 81.
McKendry, R.J. (1997). The remarkable spectrum of methotrexate toxicities. Rheum Dis Clin North Am 23, 939-54.
Nakauchi, H., Nolan, G.P., Hsu, c., Huang, H.S., Kavathas, P., and Herzenberg, L.A. (1985). Molecular cloning of Lyt-2, a membrane glycoprotein marking a subset of mouse T lymphocytes: molecular homology to its human counterpart, Leu-2/T8, and to immunoglobulin variable regions. Proc Natl Acad Sci USA 82, 5126-30.
Nakauchi, H., Tagawa, M., Nolan, G.P., and Herzenberg, L.A. (1987). Isolation and characterization of the gene for the murine T cell differentiation antigen and immunoglobulinrelated molecule, Lyt-2. Nucleic Acids Res 15, 4337-47.
Ortiz, Z., Shea, B., Suarez Almozor, M. E., Moher, D., Wells, G.A., and Tugwell, P. (1998). The efficacy of folic acid and folinic acid in reducing methotrexate gastronointestinal toxicity in rheumatoid arthritis. A metaanalysis of randomized controlled trials. J Rheumatol 25, 36-43.
Purbhoo, M.A. et al. Copresentation of natural HIV-1 agonist and antagonist ligands falls to induce the T cell receptor signaling cascade. Proc Natl. Acad. Sci. USA95, 4527-4532 (1998).
Schatz, P. J. (1993). Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli. Biotechnology NY 11, 1138-43.
Sibilia, J., Liote, F., and Mariette, X. (1998). Lymphoproliferative disorders in rheumatoid arthritis patients cm low-dose methotrexate. Rev Rhum Engl Ed 65, 267-73.
Singer, N.G, and McCune, W.J. (1998). Update on immunosuppressive therapy. Curr Opin Rheumatol 10, 169-73.
Studier, R. W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., and Dubendorff, J.W. (1990). Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol 185, 60-89 Issn: 0076-6879.
Verhoeven, A.C., Boers, M., and Tugwell, P. (1998). Combination therapy in rheumatoid arthritis: updated systematic review. Br J Rheumatol 37, 612-9.
Vessey, S.J.R., Barouch, D.H., McAdam, S.N., Tussey, L.G, Davenport, M.A., O'Callaghan, C.A., I., B.J., McMichael; A.J., and Jakobsen, B.K. (1997). Engagement of a T cell receptor by major histocompatibility complex irrespective of peptide. Eur J Immunol 27, 879-885.

Claims

1. Verwendung eines löslichen CD8-αα oder αβ-Moleküls, welches eine korrekt gefaltete Immunglobulin-Domäne aufweist, in der Herstellung eines Medikaments für eine Therapie zur Unterdrückung der Immunantwort.

2. Verwendung eines Multimer von zwei oder mehr löslichen CD8-αα oder αβ- Molekülen in der Herstellung eines Medikaments für eine Therapie zur Unterdrückung der Immunantwort.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das lösliche CD8 menschliches CD8 ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das lösliche CD8 die ganze oder einen wesentlichen Teil der nativen CD8-Immunglobulin-Domäne aufweist und zwar gegebenenfalls an einem oder mehreren Aminosäureresten substituiert.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das lösliche CD8 weiters ein Fragment der membran-proximalen Stielregion des CD8 aufweist.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das lösliche CD8 die Reste 1-120 des reifen CD8 aufweist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 6, wobei das lösliche CD8 als Multimer von zwei oder mehreren CD8-αα oder αβ-Molekülen bereitgestellt wird.

8. Zusammensetzung, welche eine lösliche Form eines CD8-αα oder αβ-Moleküls enthält, die eine korrekt gefaltete Immunglobulin-Domäne zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Exzipient oder Träger für eine Therapie zur Unterdrückung der Immunantwort enthält.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das lösliche CD8 menschliches CD8 ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, wobei das lösliche CD8 die ganze oder einen wesentlichen Teil der nativen CD8-Immunglobulin-Domäne aufweist und zwar gegebenenfalls an einem oder mehreren Aminosäureresten substituiert.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das lösliche CD8 weiters ein Fragment der membran-proximalen Stielregion des CD8 aufweist.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das lösliche CD8 als Multimer von zwei oder mehreren CD8-Molekülen bereitgestellt wird.

13. Multimer des löslichen CD8, welches zwei oder mehrere CD8-αα oder αβ-Moleküle enthält, die durch ein Linker-Molekül aneinander angelagert sind.

14. Multimer nach Anspruch 12, wobei das lösliche CD8 menschliches CD8 ist.

15. Multimer nach Anspruch 12 oder 13, wobei das lösliche CD8 die ganze oder einen wesentlichen Teil der nativen CD8-Immunglobulin-Domäne aufweist und zwar gegebenenfalls an einem oder mehreren Aminosäureresten substituiert.

16. Multimer nach Anspruch 14, wobei das lösliche CD8 weiters ein Fragment der membran-proximalen Stielregion des CD8 aufweist.

17. Protein mit der in Fig. 1b gezeigten Sequenz, wobei das Protein als Dimer gefaltet ist und die Eigenschaft hat, die Wirkung zytotoxischer T-Lymphozyten, Zielzellen zu töten, zu hemmen.

18. Protein, das sich von dem in Fig. 1b hinsichtlich eines oder mehrerer der folgenden Punkte unterscheidet:

(i) Fehlen des Methionins am N-Terminus;

(ii) Fehlen von 1-15 Aminosäureresten vom N-Terminus;

(iii) Hinzufügen von einem Teil der oder der gesamten Sequenz leu-leu-leu-his-ala- ala-arg-pro an den N-Terminus;

(iv) Fehlen von 1-15 Aminosäureresten vom C-Terminus; jedoch. Zurückbehalten von zumindest einem Teil der Region, die durch die Aminosäurereste 116-120 definiert ist;

(v) Hinzufügen von einem Teil der oder der gesamten Sequenz -ala-pro-arg-pro- pro-thr-pro-ala an den C-Terminus;

(vi) konservative Varianten von einem oder vielen Aminosäureresten, die sich nicht wesentlich auf die CD8 Funktionalität des Proteins auswirken;

(vii) Mutationen, die die CD8 Funktionalität in einer Weise ändern, die die Eigenschaft steigert, die Wirkung zytotoxischer T-Zell-Lymphozyten, Zielzellen zu töten, zu hemmen.

(viii) Hinzufügung eines Proteins oder Peptids, an den N- oder C-Terminus zum Zwecke der Reinigung;

(ix) Versorgung mit einem Marker für die Detektion;

wobei das Protein zu einem Dimer gefaltet ist und die Eigenschaft hat, die Wirkung zytotoxischer T-Zell-Lymphozyten, Zielzellen zu töten, zu hemmen.

19. Protein nach Anspruch 18, das ein lösliches CD8-Molekül ist, welches einen wesentlichen Teil der extrazellulären Region des CD8 enthält, einschließlich der Immunglobulin-Domäne und einem Fragment der membran-proximalen Stielregion, wobei das CD8- Molekül nicht über ein Disulfid zwischen den beiden Ketten des Moleküls verbunden ist.

20. Komplex eines Proteins nach einem der Ansprüche 17 bis 19 mit HLA-A2.

21. Komplex nach Anspruch 20 in kristalliner Form, mit einem stöchiometrischen Verhältnis von einem Proteindimer zu einer HLA-A2-Peptideinheit.

22. Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Proteins nach einem der Ansprüche 17 bis 19, welches Verfahren folgende Schritte aufweist:

(i) Bereitstellen eines von CD8 abgeleiteten Gens, welches für ein Protein nach einem der Ansprüche 17 bis 19 in einem Bakterium codiert;

(ii) Bewirken der Expression des von CD8 abgeleiteten Gens in dem Bakterium und Gewinnung des exprimierten Proteins von einer Bakterienkultur;

(iii) Behandeln des exprimierten Proteins, um seine Reinigung zu erleichtern und Ausführen der Reinigung.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das von CD8 abgeleitete, in Schritt (i) bereitgestellte Gen durch stille Mutationen verändert ist, wobei die Mutationen ausgerichtet sind, um die Expression durch Verhinderung der Bildung einer 5'-Haarnadel-Sekundärstruktur in der exprimierten mRNA zu erhöhen.

24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei in Schritt (iii) die Behandlung des exprimierten Proteins beinhaltet, das Protein löslich zu machen und das Protein derart zu behandeln, um es zu veranlassen, daß es sich in eine Form faltet, die seinem nativen Zustand ähnelt, wobei das Protein dann gereinigt ist.