KR20010024570A - 세포성 면역계의 저해제인 ｃｄ8 - Google Patents

세포성 면역계의 저해제인 ｃｄ8 Download PDF

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KR20010024570A
KR20010024570A KR1020007004568A KR20007004568A KR20010024570A KR 20010024570 A KR20010024570 A KR 20010024570A KR 1020007004568 A KR1020007004568 A KR 1020007004568A KR 20007004568 A KR20007004568 A KR 20007004568A KR 20010024570 A KR20010024570 A KR 20010024570A
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protein
soluble
ala
cd8α
cell
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가오조지푸
저쓰울리히콘라드
세웰앤드류켈빈
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아비덱스 리미티드
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Abstract

가용성 CD8이 저해제로서 사용되는, CTL 활성을 저해하는 방법에 대해 설명하고 있다. 이 방법은 특히 CTL 활성의 저해가 요구되는 예를 들어 이식 환자에서의 면역억제 치료에 유용하다.

Description

세포성 면역계의 저해제인 ＣＤ8{CD8 AS AN INHIBITOR OF THE CELLULAR IMMUNE SYSTEM}
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT:
(A) NAME: ISIS INNOVATION LIMITED
(B) STREET: 2 South Parks Road
(C) CITY: OXFORD
(D) STATE: Oxfordshire
(E) COUNTRY: United Kingdom
(F) POSTAL CODE (ZIP): OX1 3UB
(ii) TITLE OF INVENTION: CD8 AS AN INHIBITOR OF THE CELLULAR IMMUNE
SYSTEM
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 26
(iv) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(v) CURRENT APPLICATION DATA:
APPLICATION NUMBER: WO PCT/GB98/03235
(vi) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: GB 9722779.7
(B) FILING DATE: 28-OCT-1997
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 48 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:
GACTGAGTCG CGGCCGCTGC CACCATGGCC TTACCAGTGA CCGCCTTG 48
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 42 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:
TATTCGACTG GATCCTTATA CGTATCTCGC CGAAAGGCTG GG 42
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 42 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
GGAATTCCAT ATGAGCCAGT TCCGGGTGTC GCCGCTGGAT CG 42
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 54 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
CGCGGATCCC TATGCGCCCC CCGCTGGCCG GCTCGCCTCT GGGCGCAGGG ACAG 54
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 60 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
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(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
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CACCGCGAAT TCGGATCCTA AGCGGGTCTA CAAGCTTCGG GCTTCGCTGG CAGGAAGACC 60
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 59 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:
CACCGCGAAT TCGGATCCTA AGCGGGTCTA CAAGCTTCTG GCGTCGTGGT GGGCTTCGC 59
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 60 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:
CACCGCGAAT TCGGATCCTA AGCGGGTCTA CAAGCTTCGG GCTTCGCTGG CAGGAAGACC 60
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 42 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
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(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
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GTGGCAAGCT TGGATCCTAT GGCGTCGTGG TGGGCTTCGC TG 42
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 42 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:
GGAATTCCAT ATGAGTCAAT TTCGTGTATC ACCGCTGGAT CG 42
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 35 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10:
ACATACCCAT GGGCTCTCAC TCCATGAGGT ATTTC 35
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 43 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
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ACATACAAGC TTACGGCTCC CATCTTAAGG TGAGGGGCTT GGG 43
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 9 amino acids
(B) TYPE: amino acid
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(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12:
Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val
1 5
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 9 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13:
Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu
1 5
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 9 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14:
Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu
1 5
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 42 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15:
CTGTCCAACC CGACGTCGGG CAGCTCGTGG CTCTTCCAGC CG 42
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 42 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA prmer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 16:
CGGCTGGAAG AGCCACGAGC TGCCCGACGT CGGGTTGGAC AG 42
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 99 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 17:
GGGGGAAGCT TAATGCCATT CGATTTTCTG AGCTTCAAAA ATATCGTTCA GACCACCACC 60
GGATCCTGGC GTCGTGGTGG GCTTCGCTGG CAGGAAGAC 99
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18:
Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu
1 5 10 15
Trp His
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 63 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA prmer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 19:
GAGGAGGAGC ATATGAAACC ACAAGCACCT GAACTACGAA TCTTTCCAAA GAAAATGGAC 60
GCC 63
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 36 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "Synthetic DNA primer"
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 20:
GGGGAGGGAA GCTTACTTGG TAGTAGTAGA GTTCAC 36
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 9 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 21:
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 9 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 22:
Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys
1 5
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 366 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "A synthetic DNA construct
encoding part of the extracellular domain of human CD8alpha"
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION:1..366
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 23:
ATG AGT CAA TTT CGT GTA TCA CCG CTG GAT CGG ACC TGG AAC CTG GGC 48
Met Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr Trp Asn Leu Gly
1 5 10 15
GAG ACA GTG GAG CTG AAG TGC CAG GTG CTG CTG TCC AAC CCG ACG TCG 96
Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser
20 25 30
GGC TGC TCG TGG CTC TTC CAG CCG CGC GGC GCC GCC GCC AGT CCC ACC 144
Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala Ala Ser Pro Thr
35 40 45
TTC CTC CTA TAC CTC TCC CAA AAC AAG CCC AAG GCG GCC GAG GGG CTG 192
Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu
50 55 60
GAC ACC CAG CGG TTC TCG GGC AAG AGG TTG GGG GAC ACC TTC GTC CTC 240
Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu
65 70 75 80
ACC CTG AGC GAC TTC CGC CGA GAG AAC GAG GGC TAC TAT TTC TGC TCG 288
Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser
85 90 95
GCC CTG AGC AAC TCC ATC ATG TAC TTC AGC CAC TTC GTG CCG GTC TTC 336
Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe
100 105 110
CTG CCA GCG AAG CCC ACC ACG ACG CCA TAG 366
Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro *
115 120
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 122 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 24:
Met Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr Trp Asn Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser
20 25 30
Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala Ala Ser Pro Thr
35 40 45
Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu
50 55 60
Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu
65 70 75 80
Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser
85 90 95
Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe
100 105 110
Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro *
115 120
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 400 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: other nucleic acid
(A) DESCRIPTION: /desc = "A synthetic DNA construct
encoding part of the extracellular domain of murine CD8alpha"
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION:4..396
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 25:
CAT ATG AAA CCA CAA GCA CCT GAA CTA CGA ATC TTT CCA AAG AAA ATG 48
Met Lys Pro Gln Ala Pro Glu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Lys Met
125 130 135
GAC GCC GAA CTT GGT CAG AAG GTG GAC CTG GTA TGT GAA GTG TTG GGG 96
Asp Ala Glu Leu Gly Gln Lys Val Asp Leu Val Cys Glu Val Leu Gly
140 145 150
TCC GTT TCG CAA GGA TGC TCT TGG CTC TTC CAG AAC TCC AGC TCC AAA 144
Ser Val Ser Gln Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys
155 160 165
CTC CCC CAG CCC ACC TTC GTT GTC TAT ATG GCT TCA TCC CAC AAC AAG 192
Leu Pro Gln Pro Thr Phe Val Val Tyr Met Ala Ser Ser His Asn Lys
170 175 180 185
ATA ACG TGG GAC GAG AAG CTG AAT TCG TCG AAA CTG TTT TCT GCC ATG 240
Ile Thr Trp Asp Glu Lys Leu Asn Ser Ser Lys Leu Phe Ser Ala Met
190 195 200
AGG GAC ACG AAT AAT AAG TAC GTT CTC ACC CTG AAC AAG TTC AGC AAG 288
Arg Asp Thr Asn Asn Lys Tyr Val Leu Thr Leu Asn Lys Phe Ser Lys
205 210 215
GAA AAC GAA GGC TAC TAT TTC TGC TCA GTC ATC AGC AAC TCG GTG ATG 336
Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Val Ile Ser Asn Ser Val Met
220 225 230
TAC TTC AGT TCT GTC GTG CCA GTC CTT CAG AAA GTG AAC TCT ACT ACT 384
Tyr Phe Ser Ser Val Val Pro Val Leu Gln Lys Val Asn Ser Thr Thr
235 240 245
ACC AAG CCA TAA GCTT 400
Thr Lys Pro *
250
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 131 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 26:
Met Lys Pro Gln Ala Pro Glu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Lys Met Asp
1 5 10 15
Ala Glu Leu Gly Gln Lys Val Asp Leu Val Cys Glu Val Leu Gly Ser
20 25 30
Val Ser Gln Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Leu
35 40 45
Pro Gln Pro Thr Phe Val Val Tyr Met Ala Ser Ser His Asn Lys Ile
50 55 60
Thr Trp Asp Glu Lys Leu Asn Ser Ser Lys Leu Phe Ser Ala Met Arg
65 70 75 80
Asp Thr Asn Asn Lys Tyr Val Leu Thr Leu Asn Lys Phe Ser Lys Glu
85 90 95
Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Val Ile Ser Asn Ser Val Met Tyr
100 105 110
Phe Ser Ser Val Val Pro Val Leu Gln Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr
115 120 125
Lys Pro *
130
대다수의 조직적합성 복합체 제1군 및 제2군의 단백질(사람에서 MHC 또는 HLA)은 펩티드 항원에 결합하고, 특정한 NHC 펩티드 조합에 결합하는 특수한 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T-임파구에 의한 인식의 목적으로 세포 표면상에 이들을 제공한다. 횡단막 당단백질 CD8 및 CD4는 항원 반응이 제1군 및 제2군 MHC 분자에 의해 각각 제한되는 T 임파구의 특징적인 구별된 집단이다. CD8 및 CD4는 항원이 존재하는 세포에 대한 응답으로 성숙한 T 임파구의 활성화 및 흉선의 발달 과정에서 T 세포의 분화 및 선택 양자에 있어서 중요한 역할을 한다. 그러므로, CD8 및 CD4는 T 세포 수용체에 대한 주된 보조 분자로서 생각된다. CD8 및 CD4가 면역글로불린 슈퍼패밀리 단백질이고 항원 펩티드가 아닌 NHC 분자에 결합함으로써 항원 제한을 결정하지만, 이들 유사한 기능에 대한 구조적 기초는 매우 다르다. 이들의 서열 유사성은 낮은 반면, 단량체 CD8이 αβ이종이량체 또는 αα 동종이량체로서 표현되므로 CD4는 단량체로서 세포의 표면에 발현된다.
CD8의 발현은 세포독성 T 임파구(CTL)의 특징이고 흉선에서 분화시 양성(positive) 선택 과정을 통한 발달에 있어서 중요하다. 성숙한 세포독성 임파구에서, CD8의 면역학적 역할은 복합적이고, 아직 완전히 규명되지 못했다. 현재의 이해 수준으로부터, CTL 기능에서 추정되는 3가지 기능을 예상할 수 있다. 먼저, CD8은 T 세포 시그날화에 역할을 한다. 두번째로, CD8의 중요한 작용은 상호작용의 경향을 증가시킴으로써 항원을 발현하는 세포에 T 세포를 가두어 세포-세포 부착을 돕는 것일 것이다. 전부는 아니지만 대부분의 경우에 있어서, 성숙한 세포독성 임파구 표적 세포 용해는 항-CD8 항체에 의해 차단될 수 있다. 세번째로, CD8는 MHC/펩티드 리간드에 2개의 수용체를 합동적으로 결합시키는 메커니즘에 관계하는 TCR 에 대한 공수용체로서 작용할 수 있다. TCR-MHC 및 CD8-MHC 복합체의 구조를 비교하면, 이것이 어느 정도로 합동적으로 진행되는가에 대한 실마리를 얻을 수 있다. CD8은 TCR이 결합하고 있는 MHC 분자의 펩티드가 부하된 분열상의 검출가능한 구조적 변화를 일으키지 않지만, TCR 결합에 의해 도입된 전이와 유사한 MHC α3 도메인에서 전이를 일으킨다. 그러나, 인간 TCR에 관계된 분석에서는 상기 결합이 CD8의 존재하에 에너지적으로 우세하다는 것을 나타내지는 않는다.
T 세포 공수용체 CD8은 대부분의 성숙한 세포독성 T 세포 임파구(CTL)의 표적 세포를 사멸시키는 능력에 있어서, 그리고 흉선의 분화시에 CTL의 양성적(positive) 선택에 있어서 필수적이다. T 세포 표면상에서 αα 또는 αβ 이량체로서 발현된 CD8은 MHC 제1 군 분자, 보다 구체적으로는 항원 발현 세포인 MHC 제1α3 도메인의 비결정다형적 부위에 접촉함으로써 그것의 표적에 대한 T 세포의 지향성을 증가시킨다. 또한, CD8는 p56lck를 가진 α쇄 세포질 말단의 결합을 통해 T 세포 활성화를 유발하는 인산화에 관여하고 있다.
세포성 면역 반응의 토대가 되는 분자적 기초를 분석하는 데 있어서, 관계된 상호작용의 구조적 및 동력학적 측면을 연구하기 위한 가용성 단백질 시약의 이용성이 제한되어 있다. 그러나, 최근에 대장균(E. Coli) 내지 포유동물 세포에 걸친 발현계를 사용하는 다수의 그룹들이 가용성 TCR을 얻기 위한 기법에 대해 보고하였다. 유사하게, 다수의 그룹들은 가용성 CD8을 얻는 기법에 대해 보고하였다.
리히(leahy) 등은 CHO 세포에서 2황화결합된 분비형 동종이량체로서 생성된 인간의 가용성 CD8α 분자를 결정화하는 것에 대해 기재하고 있다. CD8α는 성숙한 단백질의 제1 잔기 내지 제146 잔기를 함유한다. 잔기 1 내지 114 만을 사용하는 시도된 형태에서, 검출가능한 분비형 단백질은 생성되지 않았다.
보르지어(Boursier) 등(1993)은 대장균에서 가용성 융합 단백질로서 발현된 가용성 CD8 단백질을 제조하는 것에 대해 설명하고 있다. 한가지 형태는 성숙한 단백질의 제1 내지 제114 잔기, 즉 단백질의 면역글로불린 도메인으로 구성되었다. 가용성 단백질의 작용성에 대해서는 설명하고 있지 않다.
가르시아(Garcia) 등(1996)은 곤충 세포에서 발현된 가용성 CD8에 대해 기재하고 있다. CD8 분자는 CD8 분자의 세포 외부의 대부분, 적어도 성숙한 CD8 단백질의 제1 내지 제146 잔기를 함유하였다. 예비 결합 분석에 대해 보고하고 있다.
WO 96/22106 및 초스키 등(1998)은 T 세포를 저해하기 위한 목적을 가진 뮤린의 CD8 단편에 대해 개시하고 있다. 이 펩티드는 100 ㎍/ml의 고농도로 사용된다. 펩티드가 실제로 MHC 세포에 결합하는가의 여부를 나타내는 증거는 없다.
본 발명은 가용성(또는 비세포성) 형태의 CD8을 사용하여 면역 반응, 특히 CD8 양성 임파구가 관계된 세포성 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 가용성 형태의 CD8 및 가용성 CD8의 다중합체(multimer)에 관한 것이다.
도1b는 가용성 재조합 인간 CD8α 단백질의 아미노산 서열을 도시하고 있다.
도2는 대장균에서 발현된 절제된 단백질을 도시하고 있다. 도메인 구성(상부) 및 박테리아에서 발현된 절제된 단백질의 범위를 도시하는 CD8α의 개요도. L-리더 서열, Ig= 면역글로불린 도메인, MP=막에 인접한 도메인, Tm=횡단막 도메인, Cyt.=세포질 도메인. 숫자는 대장균에서 발현된 단백질의 말단점 및 성숙한 단백질에 대한 도메인 경계부의 아미노산 위치를 나타내고 있다. 'C'는 CD8αα 이량체에서 쇄 내부의 이황화 결합을 형성하는 데 관계된 위치 143 및 160 에서 시스테인 잔기의 존재 및 위치를 나타낸다. 예시된 절제된 단백질에 대한 코돈 정보를 함유하는 발현 벡터는, 실시예에 기재된 바와 같이 첨가된 5′ 말단에서 코돈의 사용을 변화시키는 방법 및 인간 CD8α에 대한 원래의 코돈을 사용하는 방법 둘다에 의해 구성되었다.
도19는 가용성 재조합 마우스의 CD8α 단백질 아미노산 서열을 도시하고 있다.
도면에 대해서는 하기 실시예에서 보다 상세히 설명하고 있다.
본 발명은 가용성 CD8이 생체내 및 시험관내에서 모두 CTL 활성을 강하게 저해한다는 놀라운 발견을 기초로 한 것이다. CD8이 단순히 공수용체라는 사실과 MHC에 대한 CD8의 공지된 낮은 친화성이 주어졌으므로(Garcia et al 1996), 이는 전적으로 예상치 못한 것이었다. 가용성 CD8이 표적 세포상에 있는 MHC 분자의 1% 이하와 결합하는 것이 저해를 나타내기에 충분하다는 사실이 밝혀졌다. 이 효과는 T 세포에서 초기 시그날 작용의 완전한 저해에 의해 벅어도 부분적으로는 설명된다. 이 효과는, 소량의 돌연변이된 펩티드 리간드가 T 세포를 단절시킬 수 있는 "펩티드 길항작용" 현상과 유사성을 가지고 있다. 유사한 형태에서, T 세포에서 다중합성 시그날화 복합체를 분해하거나 탈안정화시킴으로써 T 세포 상에 있는 수용체 및 표적 세포상에 있는 MHC 세포 사이의 매우 작은 상호작용을 방지하는 것은 놀라운 효과를 가져올 수 있다. 또한, 저해 효과는 초스키 등(상기 인용 문헌)의 펩티드 농도에 비해 훨씬 낮은 가용성 CD8의 농도에서 강하게 나타나는 것이 관찰된다.
인간 CD8α의 세포외 면역글로불린을 대장균 내에 과다발현시키는 기법이 고안되었다. mRNA에서 2차적 구조의 형성을 방지하기 위해, 유전자의 5′ 영역에서의 코돈 사용의 변화를 설계하였다. 성숙한 단백질의 잔기 1-120을 포함하므로 시그날 펩티드를 배제시키는 CD8α의 단편, 세포질 및 횡단막 도메인 및 막에 근접한 줄기(stalk) 영역을 박테리아 세포 함유체(inclusion body)로부터 회수하고 재폴딩시켜 동종이량체의 가용성 수용체를 가진 하나의 종을 생성시켰다. 도2는 전술한 바와 같은 CD8의 도메인 구조를 도시하고 있으며, 발현되었으나 바르게 폴딩되지 않았던 CD8 단백질의 기타 절제에 대해 도시하고 있다. HLA-A2 헤비 체인 및 β2-마이크로글로불린은 유사한 방식으로 발현되었고, HIV-1로부터의 pol 에피토프에 상응하는 합성 펩티드 항원을 사용하여 재폴딩되었다. CD8α/HLA-A2 복합체는 용액중에서, 하나의 CD8αα 이량체 대 하나의 HLA-A2-펩티드 단위의 화학양론을 이용한 공재결정화에 의해 형성되었다.
본원 명세서에서 데이터는, CD8αα 수용체의 단편이 T 세포의 세포독성을 저해할 수 있고 CD8αα 단편의 돌연변이가 이 능력을 조절할 수 있다는 사실을 입증하기 위해서 주어진다. 가용성 CD8의 저해적 활성은 생체내 및 시험관내에서 모두 현저하다. 대장균내의 인간 CD8α의 세포외 면역글로불린 도메인을 고도로 발현시키고 MHC 결합 수용체로서 CD8αα 이량체를 폴딩시키기 위한 상기 기법이 본원 명세서 중에 기재되어 있다. 또한, 펩티드 항원과 결합된 HLA-A2 및 CD8αα 사이의 복합체의 조합 및 결정화에 대해 기재하고 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 표적 세포에 대항하는 T 임파구의 저해 활성을 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 CD8 분자의 가용성 형태에 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
CD8 분자는 작용성 면역글로불린 도메인을 가지는 적당한 임의의 가용성 CD8 분자일 수 있다. 일반적으로, 이는 선택적으로 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환된(여기서, 특히 치환은 MHC에 대한 가용성 CD8의 결합 친화성을 증가시킴) 천연의 CD8 면역글로불린 도메인 전부 또는 상당 부분을 포함할 것이다.
본원 명세서에서 용어 "가용성 형태"는 세포 표면 수용체에 관련된 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방식으로 CD8 분자에 관련하여 사용된다. 세포 표면 수용체의 가용성 형태는 횡단막 도메인의 결실에 의해 천연 형태로부터 유도될 수 있다. 이 단백질은 세포질 및 횡단막 도메인 모두를 제거함으로써 절제되거나, 보유된 전부 또는 일부의 세포질 도메인을 사용하여 횡단막 도메인을 결실시킬 수 있다. 중요한 것은 수용체의 바람직한 세포외 작용이 유지되는 것인데, 이는 CD8 면역글로불린 도메인의 MHC 결합 능력의 경우이다. 이 단백질은 단백질 분해에 의해 또는 유전자조작된 절제된 또는 부분적으로 결실된 형태를 발현함으로써 소정의 형태를 얻을 수 있도록 개질될 수 있다.
본 발명은 면역억제 치료를 필요로 하는 환자의 치료에서의 특정한 용도를 발견하였다. 이러한 환자는 이식 환자, 즉 이식을 기다리거나 이식을 받거나, 이식을 받은 후의 환자를 포함한다. 자가면역 질환 및 알러지는 면역억제 치료에 의해 유용하게 치료될 수 있다. 한가지 특정예는 바이러스 감염의 결과로서 T 세포가 작용하게되는 악화된 천식이다, 폐에 대한 심한 손상이 일어나고 그 결과에 이를 수 있는 만성 천식이다. 현재 치료는 강하게 면역계를 억제하는 코르티코스테로이드를 사용하는 것이다. 바람직한 치료는 본원 명세서에 기재된 바와 같이 가용성 CD8에 의해 CTL 작용을 특이하게 차단하는 것과 같은, 면역계를 보다 선택적으로 억제하는 치료일 것이다.
그러므로, 다른 측면에서 본 발명은 약학적 허용 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 가용성 형태의 CD8 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 도1b에 도시된 서열을 가진 특정한 가용성 CD8 단백질을 제공하는데, 상기 당백질은 이량체로서 폴딩되고 표적 세포를 사멸시키는 세포독성 T 세포 임파구의 작용을 저해하는 특성을 가지고 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 도1b에 도시된 것과 다음 중 하나 이상이 다른 단백질로서, 표적 세포를 사멸시키는 세포독성 T 세포 임파구의 작용에 영향을 주는 성질을 가지고 이량체로서 폴딩된 단백질을 제공한다:
ⅰ) N-말단에 존재하는 메티오닌;
ⅱ) N-말단에 하나 또는 수개의 아미노산 잔기의 부재;
ⅲ) 서열 leu-leu-leu-his-ala-ala-arg-pro-의 일부 또는 전부로 이루어진 N-말단에 첨가된 하나 또는 수개의 아미노산 잔기;
ⅳ) 보유된 아미노산 잔기 116 내지 120에 의해 정의되는 부위를 적어도 일부는 가지지만 C-말단에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산 잔기의 부재;
ⅴ) 서열 -ala-pro-arg-pro-pro-thr-pro-ala의 일부 또는 전부로 이루어진 C 말단에 첨가된 하나 또는 수개의 아미노산 잔기;
ⅵ) C-말단에 첨가된 CD8 세포질 막 펩티드 서열의 일부 또는 전부;
ⅶ) 단백질의 CD8 작용성에 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 또는 다수의 아미노산 잔기의 보존적 변이체(variant);
ⅷ) 표적 세포를 사멸시키는 세포독성 T 세포 임파구의 작용을 저해하는 성질을 증가시키거나 제거하는 것을 포함하는, CD8 작용성을 변화시키는 돌연변이;
ⅸ) 정제의 목적으로 N 또는 C 말단에 단백질 또는 펩티드의 첨가;
ⅹ) 검출용 표지의 제공. 본원 명세서에 기재된 바와 같은 단백질이 특히 제공되는데, 여기서 E는 제99 위치에서 N을 대신한다. 제54, 55위치에서 EE가 QN을 대신하는 전술한 바와 같은 단백질이 또한 제공된다.
보다 구체적으로, 이 측면에서 본 발명은 면역글로불린 도메인 및 막의 인접한 줄기 영역의 단편(여기서, CD8 분자는 분자의 2개의 쇄 사이에 이황화 결합이 없음)을 비롯한 CD8의 세포외 영역의 상당 부분을 함유하는 가용성 CD8 분자를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 HLA-A2와 본원 명세서에서 정의된 것과 같은 가용성 CD8 단백질의 복합체를 제공한다. 이 복합체의 다른 형태는 하나의 단백질 이량체 대 하나의 HLA-A2 펩티드 단위의 화학양론을 가진 결정형으로서 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전슐한 바와 같은 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계를 포함한다: ⅰ) 단백질을 발현시키는 적절힌 개질된 CD8 유래의 유전자를 제공하는 단계로서, 상기 단백질은 박테리아에서 적어도 CD8 단백질의 면역글로불린 유사 도메인에 실질적으로 상응하는 단계; ⅱ) 상기 박테리아 내에서 CD8 유래의 유전자를 발현시키고 박테리아 배양물로부터 발현된 단백질을 회수하는 단계; ⅲ) 발현된 단백질을 처리하여 그것의 정제를 용이하게 하고 정제를 수행하는 단계. 단계 ⅰ)에서 제공된 CD8 유래의 유전자가, 발현된 mRNA에서 5′헤어핀 2차 구조의 형성을 방지함으로써 발현을 증가시키도록 설계된 침묵 돌연변이에 의해 개질되는 것이 바람직하다. 단계 ⅲ)에서는, 발현된 단백질의 처리가 단백질을 용해하고 처리하여 그 천연 상태와 유사한 형태로 폴딩되도록 하는 것을 포함하는 것이 바람직하다. CD8 유래의 유전자 산물은 면역글로불린-유사 및 막에 인접한 CD8 단백질의 줄기 여역에 상응하는 것이 바람직하다.
본원 명세서 중에 기재된 가용성 CD8 분자는 다중합체의 형태, 즉 2개 이상의 가용성 CD8 분가가 서로 결합하여 2작용성 또는 다작용성 종류를 생성하는 것이다. CD8 분자는 연결 분자에 의해 서로 결합될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 가용성 CD8은 막 구조 또는 입자와 같이 큰 실재물에 부착될 수 있다.
적합한 연결 분자는 바이오틴에 대한 4개의 결합 부위를 가지는 아비딘, 스트렙타비딘 및 엑스트라비딘과 같은 다가의 부착 분자를 포함한다. 그러므로, 바이오티닐화된 CD8 분자는 다수의 CD8 결합 부위를 가진 CD8의 다중합체 복합체로 형성될 수 있다. 생성된 복합체에서 다수의 CD8 분자는 복합체를 제조하기 위하여 사용된 연결 분자의 양에 관련된 CD8의 양, 및 임의의 다른 바이오티닐화된 분자의 존재 또는 부재에 의해 좌우될 것이다. 바람직한 복합체는 3중합 또는 4중합 CD8 복합체이다.
선택적으로 이미 다중합체 형태인 가용성 CD8에 대한 적당한 구조는 비이드와 같은 입자인 것이 바람직한, 고체 구조 및 리포좀과 같은 막 구조를 포함한다. CD8 분자에 의해 외부적으로 코팅될 수 있는 다른 구조도 또한 적합하다.
본 발명의 방법에 따른 방법에 특히 유용한 다중합 형태의 CD8는 예를 들어 결합 분자와 같은 스트렙타비딘을 통해 바이오티닐화된 가용성 CD8를 결합시켜 형성한 다중합체를 포함한다. CD8 분자의 하나 또는 두개의 쇄는 α 또는 β 쇄 상에서 택(tag)으로서 발현된 바이오티닐화 서열에 의해 바이오티닐화된다. 또한, 가용성 CD8 분자와 결합된 리포좀의 특정 용도인데, 여기서 CD8은 이어서 다중합체를 적절한 수단에 의해 리포좀의 막에 부착시킨 다중합체의 형태인 경우 유리하다.
가용성 CD8은 치료 또는 예방되어야 할 상태에 있어서 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 이식 거부의 예방의 목적으로는, 관련된 국소 부위로 1회 이상 주사하는 것이 가장 적합할 수 있다. 반면에, 효과가 전신을 통해 나타나는 자가면역질환은 혈류로 가용성 CD8을 직접 주입함으로써 더울 적절할 수 있다.
면역억제제로서 적절한 조성물 및 CD8의 투여량은 당업자에 의해 고안될 수 있다. 가용성 CD8을 소량으로 2회 이상 투여하는 것이 고용량으로 단일 투여하는 것에 비해 바람직하다. 예를 들어, 제제는 높은 속도의 바늘을 사용하지 않는 전달 장치에 의해 전달하기 위해 고안된 것과 분말 제제 또는 액체 제제일 수 있다.
본 발명의 조성물은 병용요법에서 특정한 다른 면역억제제중에 다른 약제오 함께 투여되거나, 이를 추가로 포함할 수 있다.
가장 일반적으로 사용되는 면역억제제는 현재 예를 들어 메토트렉세이트, 설파살라진, 히드록시퀴놀린, 6-MP/아자티오프린 및 시클로스포린(Baert and Rutgeerts, 1997; Singer and Mccune, 1998)과 같은 보다 강력한 억제제 및 코르티코스테로이드를 포함할 수 있다. 이러한 모든 치료 방법은 독성과 관련된 심각한 부작용을 가지지만, 긴급의 용도에서 이를 제거하거나 감소시키는 약물에 대한 필요성이 있다(McKendry, 1997; Ortiz et al., 1998; Sibilia et al., 1998; Singer and McCune, 1998). 다수의 면역억제제가 함께 사용되는 경우에, 총 용량은 낮아졌다 하더라고 더 큰 효능을 가진다는 사실이 밝혀졌다(Verhoeven et al., 1998).
다른 면역역제제는 아스피린 및 이부프로펜과 같은 보다 완화되었지만 덜 강력한 비스테로이드 치료, 보다 특이적인 면역 조절자 작용에 기초한 새로운 부류의 약제를 포함한다. 이 후자의 부류는 인터루킨, 사이토킨, 재조합 부착 분자 및 단일클론성 항체를 포함한다(for reviews see baert and rutgeerts, 1997; chatenoud, 1998).
sCD8αα는 제1군 MHC 분자에 대해 특이성을 가지므로, 제1군 복합체를 발현하는 표적 세포에 대한 세포독성 또는 메모리 T 세포의 반응만을 저해할 것으로 예측된다. 다수의 세포성 면역 반응은 제1군 및 제2군에 의해 제한된 T 세포를 수반하는 복합적인 성질을 띈다. 몇가지 경우에 있어서, 바람직하지 않은 CTL 반응을 억제하기 위해 sCD8αα를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 많은 경우에서, sCD8αα는 다른 면역억제제 또는 면역 반응에서 다른 요소를 억제하는 약제와 함께 사용시에 유용할 수 있다.
면역억제 치료 프로토콜에 있어서 sCD8αα를 포함하는 것이 면역억제의 효능을 증가시킬 수 있고, 특히 독성 또는 다른 부작용을 가지는, 투여되는 다른 약물의 양을 감소시킬 수 있을 것으로 예상된다.
1. CD8αα 수용체의 구조
인간 CD8 유전자는 235개의 아미노산의 단백질을 발현한다. 도2에 도시된 바와 같이, 단백질의 구성은 다음의 도메인들로 분류될 수 있다(폴리펩티드의 아미노 말단에서 시작하고, 카르복시 말단에서 종료됨):
a. 시그날 펩티드(아미노산 -21 내지 -1)
이것은 수용체를 세포 표면으로 수송하는 동안 인간 세포에서 분해 제거되어 성숙한 활성 수용체의 부분을 구성하지 않는다.
b. 면역글로불린(Ig)-유사 도메인(약 아미노산 1-115)
이 도메인은 면역계를 조절하는 데 관여하는 다수의 다른 분자(즉, 단백질의 면역글로불린 부류)의 구조와 유사한 구조(일명, 면역글로불린 폴드라고 불림)를 가정한다. 인간 MHC 분자 HLA-A2와 복합체를 이룬 CD8αα 수용체의 결정 구조는 CD8αα 수용체의 Ig 도메인이 리간드에 어떻게 결합하는가를 설명하였다.
c. 막에 인접한 줄기 영역(아미노산 116-160).
이 도메인은 연장된 연결 영역으로 생각되며, CD8αα 수용체가 T 세포의 표면으로부터 MHC 복합체의 상부를 걸쳐 이것이 결합하고 있는 이것의 α3 도메인에 도달하도록 한다/. 줄기 영역은 글리코실화되고, 고정된 것으로 생각된다. 본 발명의 내용에서, 줄기 부위는 MHC 결합에서 아무런 역할을 하지 않는 것으로 생각된다:
d. 트랜스맴브레인 도메인(아미노산 161-188). 횡단막 도메인은 세포막에서 CD8αα 수용체에 부착하므로 가용성 재조합 단백질의 일부가 아니다.
e. 세포질 도메인(아미노산 189-214). CD8의 세포질 말단은 인산화에 의한 연속적인 T 세포 활성화에 관계하는 p56lck와의 결합을 통해 T 세포에서 시그날 작용을 매개한다.
본 발명은 2가지 형태의 CD8 수용체, 즉 αα 및 αβ(EMBL/GENBANK 데이터베이스 기탁 번호: CD8α, M27161; CD8β, X13444)를 포함한다.이 2가지 형태의 수용체는 기능적으로 동일하고, 면역 억제에 대해 하나 또는 다른 것을 사용하는 것에 따른 유의성 있는 효과의 차이는 예상되지 않는다.
예상되는 임의의 가용성 CD8 단백질의 주된 특징은, 이것이 MHC 분자와 접촉하기 위한 결합 부위를 구성하므로 효과의 조절을 담당하지 않는 부위이기때문에, 이것이 올바로 폴딩된 Ig 도메인을 함유한다는 점이다. 본 발명의 대상인 특정한 CD8 단백질의 변이체가 예상되며, 이는 다음과 같이 제시된다:
a. C- 말단 절제점의 변화. 길거나 짧은 형채의 수용체는 안정하거나 작용성일 수 있다. 가용성 형태의 횡단막 단백질의 최적인 절제점이 어디인가를 예측하는 일반적인 규칙은 없다, CD8의 경우에, 폴리펩티드는 1 내지 15개의 아미노산이 짧거나 길 수 있다. 그러나, 분자의 C 말단이 짧아진 경우, 분자는 막에 인접한 줄기 부위의 짧은 단편을 여전히 보유한다. 가용성 CD8은 결실된 트렘스멤브레인 도메인을 가진 세포질 도메인을 또한 포함할 수 있다. C 말단은 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 정제의 목적으로 글루타치온-S-트랜스페라아제와 같은 단백질 또는 펩티드 도메인에 융합될 것으로 예상된다.
b. N-말단 절제점의 변화
정확히 시그날 서열이 어디서 종료하고 Ig 도메인이 어디서 시작하는가에 대해서는 일부 모호한 점이 있다. N-말단 절제점은 단백질의 기능에 영향을 주지 않으면서 C-말단 절제점과 같이 다소 변화될 가능성이 있다. N 말단은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 정제의 목적을 위한 글루타치온-S-트랜스페라아제와 같은 펩티드 또는 단백질 도메인에 융합될 것으로 예상된다.
c. 아미노산 치환
다수의 보존적 아미노산 치환은 CD8 수용체 및 MHC 사이의 결합에 임의의 유의성 있는 변화를 유발하지 않으면서 단백질 내에 도입될 수 있다.
d. 작용성을 변화시키도록 설계된 돌연변이
MHC 분자인 즉 HLA-A2(Gao et al 1997) 및 CD8αα 사이에 복합체 구조를 가지므로, 상호작용에 영향을 주어 면역 억제 효과에 영향을 줄 목적으로 돌연변이를 설계할 수 있다. 2가지 이러한 돌연변이가 아래에 기재되어 있다: 잔기 99를 글루탐산으로 치환하고('99E'라고 명명함), 잔기 54 및 55를 글루탐산으로 이중 치환함('54,55E'라고 명명함). 이들 돌연변이는 대조군, 즉 MHC에 대한 CD8αα 수용체 결합을 없애기 위한 돌연변이로서 설계되었다. 돌연변이체 99E는 잔여 효과를 가진 반면, 돌연변이체 54, 55E는 어떠한 억제도 나타내지 않는다. 그러므로, 반대 효과(즉, CD8αα 수용체 및 MHC 분자사이의 결합력을 증가시키는 효과)를 가진 돌연변이를 또한 설계하는 것을 예상할 수 있다.
다음의 실시예들은 도면을 참고하여 보다 명확히 기재되어 있다:
실시예 1
대장균에서 CD8αα 동종이량체의 높은 수준의 발현 및 결정화
물질 및 방법
CD8α 및 cDNA의 클로닝 및 대장균 발현 벡터의 구성
클론된 Pfu 중합 효소(스트라타젠) 및 세포독성 임파구 cDNA를 주형으로서 사용하는 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 CD8α를 암호화하는 DNA 단편을 수득하였다.
PCR 반응은 센스 프라이머;
5′-GACTGAGTCGCGGCCGCTGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTG-3′(서열 번호: 1)
및 안티센스 프라이머:
5′-TATTCGACTGGATCCTTATACGTATCTCGCCGAAAGGCTGGG-3′ (서열 번호: 2)
를 사용하여 수행되었다.
PCR 생성물은 Eag I 및 BamHI를 사용하여 제한 분해되었고 pBluescript II KS(스트라타젠)내로 클론하여 플라스미드 BJ082를 얻었다. 완전한 길이의 CD8α를 암호화하는 서열의 존재는 T4 중합 효소(파마시아)를 사용하는 이중 나선 디데옥시 서열결정법(SB70754)에 의해 입증되었다. 박테리아의 발현 벡터의 구성에 있어서, 주형으로서 BJ082를 사용하는 5개의 PCR 생성물을 제조하였는데, 차후에 이는 CD8α의 성숙한 면역글로불린 유사 도메인에 의해 메티오닌을 암호화한다. PCR 반응은 센스 프라이머:
5′-ATTCCATATGAGCCAGTTCCGGGTGTCGCCGCTGGAT-3′(서열 번호: 3)
및 안티센스 프라이머:
A: 5′-CGCGGATCCCTATGCGCCCCCCGCTGGCCGGCTCGCCTCTGGGCGCAGGGACAG-3′(서열 번호: 4)
B: 5′-CACCGCGAATTCGGATCCTAAGCGGGTCTACAAGCTTCGGGCTTCGCTGGCAGGAAGACC-3′(서열 번호: 5)
C: 5′-CACCGCGAATTCGGATCCTAAGCGGGTCTACAAGCTTCTGGCGTCGTGGTGGGCTTCGC-3′(서열 번호: 6)
D: 5′-CACCGCGAATTCGGATCCTAAGCGGGTCTACAAGCTTCGGGCTTCGCTGGCAGGAAGACC-3′(서열 번호: 7)
또는 E: 5′-GTGGCAAGCTTGGATCCTATGGCGTCGTGGTGGGCTTCGCTG-3′(서열 번호: 8)를 사용하여 수행되었다.
이들 PCR 생성물을 Nde I 및 Bam HI로 제한 분해하고 벡터 pGMT7내로 클론시켜 잔기 A: 위치 143에서 시스테인 잔기가 세린으로 돌연변이된 1-150, B: 1-146, C: 1-120/141-146, D: 1-116/141-146, 및 E: 1-120에 대한 발현 카세트를 얻었다. 서열 확인 후, 발현에 대하여 벡터를 시험하였으나(하기 참조), 모든 벡터로부터 CD8α 단백질 발현의 유도는 모노클론성 항체 OKT(ATCC 번호 CRL8014)를 사용하는 면역블롯 분석에 의해 검출할 수 있었다. 상응하는 단백질을 암호화하는 5개의 새로운 PCR 단편을 개질된 센스 프라이머:
5′-GGAATTCCATATGAGTCAATTTCGTGTATCACCGCTGGAT CG-3′ (서열 번호: 9)
를 사용하여 차후에 생성하였는데, 상기 센스 프라이머는 암호화 부위에서 6개의 침묵 돌연변이를 도입한다.
이들 PCR 단편은 Nde I 및 Hind III으로 제한 분해되었고 벡터 pGMT7내로 클론되어 UG195(A), UG231(B), UG222(C), pAAE3(D) 및 BJ112(E)를 얻었다.
HLA-A2 발현 벡터의 구성
HLA-A*0201(HLA-A2)의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 DNA 단편은, 주형으로서 B 세포 cDNA를 사용하는 PCR에 의해 얻었다. PCR 반응은 센스 프라이머:
5′-ACATACCCATGGGCTCTCACTCCATGAGGTATTTC (서열 번호: 10)
및 안티센스 프라이머:
5′-ACATACAAGCTTACGGCTCCCATCTTAAGGTGAGGGGCTTGGG-3′(서열 번호: 11)
를 사용하였다. PCR 생성물은 Nco I 및 Hind III로 제한 분해되고 pET23d+(노바겐)내로 클론하여 디데옥시 서열결정법에 의해 확인되었다.
2 마이크로글로불린 서브유닛의 발현에 사용되는 플라스미드 pHN1-β2m은 하버드 메디칼 스쿨의 데이비드 엔 가르보치 및 돈 씨 윌리에 의해 친절하게 제공되었다.
대장균에서 CD8α의 발현
T7-CD8α 발현 벡터를 대장균 균주인 BL21DE3pLysS(노바겐)내로 형질감염시키고, 하나의 콜로니로부터 100 ㎍/ml의 암피실린을 함유하ㅡㄴ TYM 배지중에서 성장시켰다. T7 프로모터로부터의 발현은, IPTG를 0.05 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 약 OD600=0.4에서 유도되었고, 8시간 이하동안의 초기 유도 시간 과정이 이어졌다. IPTG에 의한 유도 후 4시간이 경과하였을 때, 임의의 구조체로서 관찰되는 당백질 수율의 증가는 없었다.
박테리아의 세포 함유체로부터 CD8α의 대규모 제조 및 가용화
원심분리 및 10 mM EDTA, 2 mM DTT, 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM Nacl, 10% v/v 글리세롤, 200 mg/l 라이소자임, 1.0 mM PMSF를 함유하는 용해 완충액(원래 박테리아 배양물 1 ℓ당 20 ml) 중에서 재현탁시켜 박테리아 세포를 회수하였다. 용액을 동결-해동하고 총 5분간 음파처리하였다. 동용적의 세척 완충액(0.5 %v/v Triton X-100, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 0.1% v/v 나트륨 아지드)로 혼합한 다음, 추가로 30분간 용액을 얼음상에 두었다. 세포 함유체를 벡만 JA-20 로토에서 10분간 15,000 rpm으로 원심분리하여 펠릿화한 다음, 테플론 균질혼합기를 사용하여 세척 완중액(원래 배양물 1 ℓ당 20 ml) 중에 재현탁시켰다. 회수 및 세척 단계를 총 4회 반복하였다. 최종 회전시킨 후, 펠렛을 8 M Urea, 20 mm Tris-HCl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 10% v/v 글리세롤, 500 mM NaCl, 10 mM DTT로 구성된 우레아 완충액 중에 용해시켜 4℃에서 밤새 반복하였다. 30분간 전술한 바와 같이 원심분리하여 세포 함유체 현탁액으로부터 파편을 제거하고 맑은 현탁액을 -70℃에서 저장하였다.
CD8αα 수용체의 재폴딩:
2 ml의 우레아 완충액 중의 CD8αα 단백질(10 mg/ml)을 15 ml의 구아니딘 완충액(6M 구아니딘 염산염, 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 10 mM DTT)중에 첨가하고 실온에서 30분간 방치하여 평형화한 다음, 200 mM Tris-HCl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 1M L-아르기닌, 0.1 mM PMSF, 6.5 mM 시스테아민 및 3.7 mM 시스타민으로 구성된 재폴딩 완충액 1 ℓ에 첨가하였다. 2개 많이상의 펄스의 20 mg 단백질을 24시간 간격으로 재폴딩 혼합물에 첨가하고 용액을 4℃에서통 72시간동안 교반하였다.
HLA-A2/pol의 재폴딩 데
HLA-A2 헤비 체인, β2m 및 펩티드[ILKEPVHGV(서열 번호: 12), 분자 과학 옥스포드 센터에 의해 합성되고 HIV-1 역전사 효소의 잔기 309-317에 상응함]을 변형에 대해 전술한 바와 거의 동일하게 재폴딩시켜, 이것을 CD8α의 폴딩에 대해 전술한 바와 같은 재폴딩 완충액 내로 주입하기 전에 단백질에 첨가하였다(David N, Garboczi, personal communication).
폴딩된 CD8αα 수용체의 정제
벡만 J-6B 중에서 약 4,000 rpm에서 30분간 원심분리시켜 재폴딩 혼합물을 제거하였다. 이어서, 상청액을 10 kD 포어 배제 크기를 가진 다이아플로우 초여과막을 사용하는 아미톤 2000 스티어드 셀(Amicon 2000 Stirred Cell) 중에 약 200 ml로 농축시켰다. 이어서, 샘플을 벡만 JA-20 로토중에서 15,000 rpm으로 30분간 원심분리시킨 후, 아미콘 8400 스티어드 셀중에 10 ml로 추가 농축시켰다. 겔 여과 및 양이온 교환을 수반하는 2 단계 정제 절차 이전에, 농축된 샘플을 0.22 ㎛의 멸균 필터를 통해 여과시켰다. CD8α의 이후의 제제는, 재폴딩 및 농출 단계 사이에 단백질 용액을 투명하게 하기 위해 도입된 원심분리 및 여과 단계가 용액중에서 정확히 폴딩된 수용체를 유지하는 데 필수적이라는 사실을 나타내었다. 겔 여과 단계는 20 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl중에서 평형화된 파마시아 수퍼덱스 G-75 칼럼 상에서 수행되었다. CD8αα 동종이량체를 함유하는 분획을 수집하고, 아미콘 센트리프렙-10을 사용하여 50 mM MES(pH 6.5)내로 완충액 교환시켰다. 이온 교환 단계를 파마시아 모노-S 컬럼 상에서 수행하고, 이로부터 단백질을 50 mM MES(pH 6.5) 중 0-1 M NaCl의 구배를 이용하여 용출시켰다.
정제된 단백질의 생화학적 및 물리적 분석
폴딩되고 정제된 단백질의 단백질 농도는 브래드포드 분석(Biorad)에 의해 측정되었다. 폴딩된 CD8α의 확인은 에드만의 N-말단 서열결정법에 의해 수행되었다. CD8α의 질량 분광 분석은 전기분무 이온화 계면이 장착된 VG 기구 3중-4개의 극을 가진 대기 질량 분광분석기를 사용하여 수행되었다. 최종 농도가 1% v/v가 되도록 포름산을 첨가하여 산성화된 1:1 v/v 아세토니트릴/울의 단백질 샘플 10 ㎍을 20 ㎕/분의 유동 속도로 주입하였다. 질량 분광분석기는 말의 심장 미오글로빈(Mr 16951.48)을 사용하여 눈금화되었다.
CD8αα/HLA-A2 복합체의 결정화
10 mg/ml의 CD8αα 및 20 mg/ml의 HLA-A2/pol을 함유하는 단백질 용액 1 마이크로ℓ를 크리스탈 스트린 키트 I 및 II(햄튼 연구소)로부터 1 ㎕의 저장액과 혼합하였다. 실온에서 마이크로브릿지상에 있는 액적으로부터의 수증기 확산에 의해 결정화를 수행하였다.
결과
CD8α 유전자의 5′말단에서 2차적 mRNA 구조에 대한 경향을 감소시키는 돌연변이는 대장균에서의 발현 가능성을 크게 증가시킨다.
광범위한 발현계에서 사용하기 위한 CD8α 발현 벡터를 구성하기 위해서, 주형으로서 세포독성 T-임파구로부터 제조된 cDNA를 사용하는 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 완전한 오픈 리딩 프레임을 구성하는 DNA 단편을 먼저 생성시켰다. 이어서, 이 단편을 함유하는 플라스미드는 T7 프로모터를 함유하는 플라스미드내에 삽입된 5개의 CD8α cDNA 단편을 합성하기 위해 PCR 반응의 제2 세대중에 주형으로서 사용되었다. 이들 구조체 모두는 최초 코돈에 이어지는 성숙한 CD8α N-말단 부위를 가진 폴리펩티드 쇄를 암호화하는데, 이는 전체 면역글로불린 도메인을 포함하지만 이것의 C-말단에 다른 지점에서 절제되어 있다. 동일한 C-말단 절제부를 가지지만 CD8α 시그날 서열을 포함하는 구조체를 곤충 세포에서 바쿨로바이러스 프로모터로부터 발현하기 위해 시험하였다.
이전에, 곤충 및 CHO 세포에서 인간 CD8α를 발현하는 것은 Cys143을 통한 이량체의 이황화 결합이 분비형 수용체의 생성에 있어서 중요하다는 것을 나타내었다/ 대조적으로, 막에 결합된 수용체를 공유적으로 연결시키는 데 또한 관여하는 Cys160은 가용성 CD8αα의 발현을 방지한다는 것이 밝혀졌다. 이것과 함께, 곤충 세포에서 CD8α 1-146, 1-120/141-146 및 1-116/141-146은 분비형 이량체(데이터로 제시하지 않음)로서 발현될 수 있다는 사실을 발견하였다. 곤충 세포로부터 CD8αα 이량체를 분비하기 위한 Cys143 잔기의 필요조건은 세포내부 수송시에 단백질의 폴딩 또는 이것의 안정성에 있어서 필수적이다. 이들 가능성은 현재 구분될 수 없는데, 그 이유는 Cys143을 포함하거나 이것이 생략된 시험관내 구조체에서 단백질의 폴딩을 박테리아에서 시험하는 경우 시스테인 잔기가 문제를 일으킬 가능성이 있기 때문이다.
원래 인간 CD8α 코돈을 사용하는 삽입물을 함유하는 플라스미드로부터, 겔 전기영동 및 쿠마지 염색(도3, 레인 1-2) 후 전체 세포 추출물을 비교하여 측정되었을 때, 대장균 중에서 검출될 수 있었다. 대조적으로, A/T가 더 많은 유전자의 5′말단을 제조하기 위해 침묵 돌연변이에 의해 CD8α 중의 6개의 코돈을 변화시켰을 때, 발현을 용이하게 검출할 수 있었다(도3, 레인 3-4). 낮은 G/C 함량으로 인해 염기쌍의 가능성을 약화시킬 것으로 생각되는, 이러한 변화는 CD8α mRNA의 5′말단에서 헤어핀 형성 경향을 감소시킨다. 그러므로, 원래 서열에서 2차 구조를 형성하는 것은 대장균에서의 발현 가능성에 심각한 악영향을 줄 것으로 생각된다. 돌연변이된 구조체로부터의 발현은 돌연변이되지 않은 서열로 얻어진 발현 레벨의 2배 이상이 증가된 ℓ당 100 mg 이상을 생성하는 것으로 생각된다.
박테리아로 발현된 단백질의 대규모 제조, 초기 정제 및 가용화
용해된 박테리아를 박현하는 CD8α로부터 세포 분획을 분석하는 것은, 이전에 박테리아로 발현된 MHC 헤비 체인 및 β2m 폴리펩티드에서 관찰된 바와 같이, 거의 모든 단백질이 세포 함유체 중에 침착된다는 사실을 보여준다. 세척에 의한 CD8α 세포 함유체의 정제는 약 90%의 순도인 것으로 측정되었다(도3, 레인 5). HLA-A2 및 β2m을 사용하여 유사한 세포 함유물을 수득하였다. CD8 세포 함유체는 MHC 쇄에 사용되는 pH 6.5 완충액에서 용해되지 않지만, pH를 8.0으로 조정하고 다량의 염 및 10% 글리세롤을 첨가하면 이것이 쉽게 용해되었다.
가용성 CD8α 수용체의 재폴딩 및 정성 분석
감소하고 변성하는 완충액 중에 재용해된 CD8 폴리펩티드를 천연 단백질 구조를 형성시키는 조건중에 희석시켰다. 48시간동안 폴딩을 진행시킨 다음, 가용성 단백질을 분석 및 겔 여과에 의해 정제하게 위해 농축시켰다. 도2에 도시되고 발현된 4개의 폴리펩티드는 주로 고분자량의 응집체 피크를 나타내었다(데이터로 제시하지 않음). 이것과 대조적으로, 1-120 폴리펩티드의 용출 양상은 CD8αα 이량체에 대해 예측된 바와 같이 약 30 kDa의 한가지 주된 피크를 보여준다(도4). 이 용출 양상에서, 응집체의 없는 것이 분명하다. CD8αα 이량체는 약 175 mM NaCl(도4b)에서 단일 피크로서 용출하는 모노-S 칼럼상에서 양이온 교환에 의해 추가로 정제되었다.이 피크의 겔 분석은 CD8α에 대한 예상된 위치에서 하나의 밴드만을 나타낸다(도3의 레인 6).
정제된 CD8α의 확인은 2가지 방법에 의해 확인되었다. 에드만 서열결정법은 도입된 메티오닌 잔기가 대장균에서 분해되었음을 나타내는 CD8α의 성숙한 N-말단에 상응하는 일련의 10개의 아미노산을 생성하였다. 전기분무 질량 분광분석기는 시작하는 메티오닌을 제외한 잔기 1-120에 대한 13,463.2 달톤의 이론치에 매우 가까운 CD8α의 분자량(13,464.0)을 확인하였다. 매우 고분자량의 작은 피크는, 메티오닌 잔기가 분해되지 않은 단백질에 상응하는 것으로 생각된다(도5).
CD8αα 이량체 및 HLA-A2/pol 사이의 공-재촐딩 및 가용성 복합체
성분 분자의 재폴딩의 유효성이 복합체의 형성에 의해 증가될 수 있는가의 여부를 시험하기 위해, 공-재폴딩 실험을 수행하였다. 농축된 단백질의 겔 여과 분석 결과, CD8αα 및 HLA-A2 양자의 폴딩이 손상되고 더 많은 응집체가 개별적인 재폴딩동안에서 보다 이러한 조건하에서 형성된다는 것을 알게 되었다(도6). 그러나, CD8α 재폴딩(도4a) 및 HLA-A2 재폴딩(도시되지 않음) 중 어느 하나에도 나타나지 않는 CD8αα/HLA-A2 복합체에 대해 약 75 kDa에 상응하는 예상된 위치에 피크를 검출할 수 있다. 이 피크에서의 단백질 분석 결과, 복합체 중 예상되는 성분은 하나의 CD8αα 이량체 대 하나의 HLA-A2에 상응하는 양으로 존재하고 있으며, 이는 안정한 복합체가 용액 중에서 형성될 수 있다는 것을 의미한다.
HLA-A2/pol과의 복합체에서 CD8αα의 결정화
개별적으로 재폴딩된 HLA/A2 및 CD8αα의 2:1 혼합물로 결정화를 수행한 결과, 2개의 완충액 조건(12% PEG 20,000, 100 mM MES pH 6.5 및 15% PEG 6000, 50 mM MES pH 6.0)하 실온에서 약 7일간 방치한 후 육안으로 관찰가능한 결정을 생성하였다. 하나의 결정은 이후에 2.7Å 리솔루션(resolution)에서 회절하였다. 결정의 조성물을 분석하기 위해, 단편을 세척하고 재용해시킨 후 겔 전기영동에 의해 분석하였다(도7, 레인 2). 이 샘플에서 나타난 단백질의 밴드는 개개의 ALA-A2 및 CD8α(각각 도7의 레인 3-4)으로부터 얻어진 밴드에 정확하게 대응한다. 게다가, CD8α 대 헤비 체인의 비 및 β2m 밴드는 수용체-리간드 복합체(도7의 레인 1)에 상응하는 것으로 생각되는 공-재폴딩 피트로부터 얻어진 샘플에서 발견되는 것과 동일하다.
도1 및 도3 내지 7에 대한 부호 설명
도1a는 인간 CD8α의 cDNA 서열(하부) 및 단백질 서열(상부, 하나의 문자로 된 코드)을 나타낸다. 시그날 펩티드, Ig-유사 도메인, 막에 인접한 도메인, 횡단막 도메인 및 세포질의 도메인의 범위를 나타내고 있다.
도1b는 발현된 인간 CD8α의 단편의 단백질 서열 및 DNA 서열을 도시하고 있다. Ig-유사 도메인 및 막에 인접한 도메인의 범위를 제시하고 있다. 번역 개시 코돈을 암호화하기 위해 또는 대장균에서 발현을 증가시키기 위해 DNA 서열상에 첨가된 염기는 낮은 경우의 문자에서 나타내고 있다.
도3은 CD8α의 발현 및 정제를 도시하고 있다. 약 10 ㎍의 단백질 샘플을 15%의 SDS-PAGE 겔상에서 서열결정법에 의해 분석하였다. M= 단백질 크기 마커; 레인 1=원래 코돈을 사용하는 CD8α의 잔기 1-120에 대한 발현 플라스미드를 함유하는 비유도된 BL21 세포의 전체 용융물; 레인 2=4시간 동안 0.5 mM IPTG로 유도된 점을 제외하고는 레인 1과 동일함; 레인 3=5′말단에서 변형된 코돈을 사용하는 CD8α 발현 플라스미드를 함유하는 비유도된 BL21 세포의 용융물; 레인 4= 4시간동안 0.5 mM IPTG로 유도된 점을 제외하고는 레인 3과 동일함; 레인 5=레인 4에서와 동일한 세포로부터 얻어진 정제된 세포 함유체 분획; 레인 6=겔 여과 및 이온 교환에 의해 재폴딩되고 정제됨. 크기 마커의 분자량 및 CD8α의 예상 위치를 나타낸다.
도4는 CD8α의 정제를 나타내고 있다. A; 농축된 CD8α 재폴딩의 수퍼덱스 G-75 겔 여과 양상, 양상 위의 숫자는 표준 물질의 분자량의 용출점을 나타낸다. b 겔 여과로부터 주된 피크의 모노-S z칼럼으로부터의 NaCl 용출 양상.
도5는 가용성 CD8αα 수용체의 전기분무 질량 분광분석을 나타내고 있다. a, 양성자 충돌후의 질량 대 전하의 비의 피크를 나타내는 CD8αα의 전기분무 질량 스펙트럼; b, 단일 공여체 피크의 분자량을 나타내는 A에서 나타난 스펙트럼의 탈회선(deconvolution).
도6은 ALA-A2 및 CD8α의 재폴딩 겔 여과 양상을 나타내고 있다. 겔 여과는 수퍼덱스 G-200 컬럼상에서 수행되었다. 양상위의 숫자는 표준 물질의 분자량의 용출점을 나타낸다. 얻어진 피크의 단백질 성분을 화살표 위에 나타난다.
도7은 공재폴딩되고 공결정화된 CD8αα 및 ALA-A2의 SDS-pAGE 분석에 대해 도시하고 있다. 레인 1-4 및 M은 쿠마지 블루로 염색하였고, 레인 5는 은으로 염색하였다. 레인 1 및 5: 도5에 나타난 피크로부터 공폴딩된 CD8α, ALA-A2, β2m 및 펩티드ALA-A2; 레인 2: 재용해된 결정; 레인 3: ALA-A2; 레인 4: CD8αα, M: 지시된 것과 같은 단백질 크기. A2 헤비 체인(A2HC), β2m 및 CD8α에 상응하는 밴드는 화살표로 나타낸다.
논의
CD8α의 발현
CD8α의 발현에 있어서, 우리는 대규모 정제에 불충분하므로 대장균내에서 의 발현에 주안점을 둔 곤충의 세포로부터 얻어진 생성물을 발견하였다. 박테리아에서, 3개의 파라메타는 일반적으로 외부 단백질에 대해 얻어질 수 있는 발현 레벨의 주된 결정 인자인 것 같다. 이들은 mRNA에서 2차 구조에 대한 경향, 코돈 사용이 박테리아 선호에 일치하는 정도 및 발현된 단백질의 숙주에 대한 독성이다. CD8α의 경우, N-말단에 인접한 염기가 쌍을 이룰 가능성을 감소시키도록 설계된 6개의 침묵 코돈 변화는 총 단백질의 약 30%를 구성하는 레벨로 2배 이상까지 발현 레벨을 증가시킨다. 놓은 발현 레벨, 및 단백질이 세포 함유체로부터 정제될 수 있는 용이성은 박테리아 발현을 추가의 연구에 대해 바람직한 선택으로 만들었다.
CD8α의 재폴딩
CD8α의 재폴딩 효능은 세포 함유체로부터 단백질을 가용화시키기 위해 사용된 완충액 조건에 따라 달라지는 것으로 밝혀졌다. 특히, 높은 산화환원 전위, 높은 이온 강도 및 재폴딩 이전에 강한 변성화제를 첨가하는 것은 CD8αα 이량체의 수율을 증가시킨다. 겔 여과에 의해 폴딩된 수용체 제제를 분석하는 것은 눈에 띄는 집합체의 존재를 나타내지 않았고, 양이온 교환이후에 제제는 4℃에서 수개월간 완전히 균질하고 안정한 것 같았다.
용액에서 재결정화에 의해 형성된 CD8αα-HLA-A2 복합체의 분석
ALA-A2조합체 및 CD8αα를 발현하는 폴리펩티드 밴드의 예상 몰 비는 용액중에서 형성된 복합체 및 결정중에서 동일하지만 밴드 강도에 의해 나타난 화학양론은 다소 예측할 수 없다. CD8이 T 세포 표면에서 이량체로서 검출되므로, CD8이 2개의 MHC 분자와 결합하고 2가의 화학양론이 T 세포 표적 세포 연결 및 T 세포 활성화에 관계되어 있을 수 것으로 추정되었다. 그러나, CD8α 균주가 β2m보다 쿠마지로 약화된다는 것을 고려하면, 복합체의 겔 분석은 1:1의 ALA-A2:CD8αα보다 도 큰 비를 나타내고 이것은 결정 구조에 의해 확인되었다.
세포 또는 가용성 뮤린 CD8 및 TCR에 관계된 최근의 연구는 제1군 MHC에 상협적으로 결합하는 메커니즘이 2개의 수용체에 대해 존재할 수 있다는 것을 의미하였다. 인간 CD8αα/HLA 및 TCR/HLA의 결정 구조를 비교한 결과, ㅈ개의 수용체가 결합시에 에너지적 단점과 연결될 수 있는 HLA 헤비 체인의 α3 도메인에서 전이를 도입함을 나타낸다. 인간 CD8 및 TCR과 제1군 MHC의 복합체에 대한 추가의 연구 결과, HLA 헤비 체인중에 도입된 구조적 전이는 이들 수용체의 상협적인 결합을 위한 메커니즘을 구성한다.
실시예 2
CD8αα 수용체의 면역 억제적 효과
표준 세포독성 T 세포 분석에서, 적합한 표적 세포, 즉 비교적 제한적인 MHC를 발현하는 세포를 펩티드(1시간) 및 방사선활성 크롬으로 1차 항온처리한다. T 세포 수용체 (TCR) 및 CD8이 세포 표면의 표적 세포상의 펩티드 및 MHC 의 복합체를 인식하지만, 리간드가 절적하고 충분한 농도로 존재한다면, T 세포는 표적 세포를 용해시킬 것이다. 용해 작용은 방사선 활성인 크롬의 방출을 측정하는 것에 의해 평가되었다.
도8은 다음과 같이 수행된 일련의 실험의 결과를 나타낸다.
ALA-A2에 의해 제한된 HIV 1''gag' 펩티드(SLYNTVATL(서열 번호: 13))를 인식하는 인간의 T 세포주(풍부하고 선택됨)가 사용되었다. 일정한 수의 표적 세포, 5000, HLA-A*0201을 발현하는 '868' B 세포를 사용하였고 T 세포의 수를 변화시켰다. 'E:T'는 표적 세포에 대한 T 세포의 수의 비를 나타낸다. 4개의 E:T의 비를 시험하였다. 펩티드 농도는 10-11내지 10-7M로 변화되었다(플롯상에서 수평 축). (펩티드 농도의 단위는 별다른 지싯가 없는 한 log10M이다). CD8 의 효과를 프로브하는 4개 조의 실험을 수행하였는데, 이들은 다음과 같은 차트상의 부호에 의해 표시된다.
'PBS;-대조군으로서 세포 매지 단독으로 배양(인산염으로 완충된 염수)
'CD8 Ab'-항-CD8 모노클론 항체(100 ㎍/ml)인 OKT8(이것과 ALA-A2 사이의 상호작용을 차단하며 T 세포상의 CD8에 결합함으로써 일부 저해 효과를 가짐)로 배양.
'CD8'-100 ㎍/ml에서 가용성 CD8 수용체의 존재하에서 배양.
'CD8 돌연변이체'-100 ㎍/ml에서 54-55E 이중 돌연변이화에 의해 가용성 CD8의 존재하에서 배양.
이들 실험에 대한 분석 요소는
18 마이크로ℓ의 10X 펩티드
18 마이크로ℓ의 PBS 또는 1 mg/ml의 CD8αα 또는 CD8 OKT8Ab를 함유하는 PBS
50 마이크로ℓ의 표적물(5,000 868 B 세포)
5,000 내지 50,000 CTL을 함유하는 100 마이크로ℓ.
도8의 그래프는 2시간의 배양 후에 수집된 결과를 나타낸다.
도9는 데이터가 6시간의 배양후에 수집되었다는 점을 제외하고는 도8과 동일한 실험으로부터 얻어진 데이터를 도시하고 있다.
도8 및 도9에서 데이터는:
- 더 많은 수의 표적 세포가 예상한 펩티드 농도보다 높은 농도에서 치사된다. 저농도에서 표적 세포상에서 특정 표적 분자의 밀도는 매우 낮아서 3를 활성화할 수 없다.
- T 세포 상에 있는 CD8을 차단하는 CD8 항체는 PBS(대조군) 에 비해 일부 억제 효과를 가진다.
-표적 세포상의 MHC에 결합한다고 생각되는 가용성 CD8은 CD8 항체의 저해 효과에 비해 확실한 저해 효과를 가진다.
- 가용성 CD8의 효과는 그것이 치환된 2개의 중요한 아미노산을 가진 돌연변이체로서 MHC에 결합하는 것이 억제 효과를 가지지 않는다는 데 특히 관련된다.
도10은 다음과 같이 수행되는 일련의 실험의 결과를 도시한다. ALA-A2에 의해 제한되는 HIV1 'gag'펩티드를 인식하는 동일한 인간 T 세포주는 도9 및 도9의 실험에서와 동일하게 사용되었다. 일정한 수의 표적 세포 및 T 세포, 각각 5,000개가 사용되었다. 펩티드 농도는 10-11내지 10-7M(플롯상의 수평축)로 다양했다.
CD8 의 효과를 프로브하는 5개 조의 실험을 수행하였다:
'PBS;-대조군으로서 세포 매지로 배양;
'CD8 A''- 100 ㎍/ml에서 가용성 CD8 수용체의 2차 제제의 존재하에서 배양.
'CD8 B''- 100 ㎍/ml에서 가용성 CD8 수용체의 2차 제제의 존재하에서 배양.
'돌연변이체 22'-100 ㎍/ml에서 54-55E 이중 돌연변이화에 의해 가용성 CD8의 존재하에서 배양.
'돌연변이체 15'-100 ㎍/ml에서 54-55E 이중 돌연변이화에 의해 가용성 CD8의 존재하에서 배양.
결과는 2시간의 배양후에 수집되었다.
도10의 데이터는 도8 및 도9의 데이터로부터 얻어진 결론을 확장한 것으로서, 가용성 CD8의 2가지 제제의 유사한 효과를 입증하고 있다.
도11은 가용성 CD8의 농도가 0 내지 100 ㎍/ml로 변화된 것을 제외하고는 전술한 바와 동일하게 수행된 실험을 도시하고 있다. 이 3개의 흔적은 10-9, 10-8및 10-7M에 상응한다. E:T의 비는 1:1이고 1시간의 분석을 수행하였다.
도11은 세포 용해의 CD8 저해가 적정가능함을 도시하고 있다.
도12는 ALA-A2에 의해 제한된 HIV1 펩티드에 특이적인 T 세포 클론이 사용된 점을 제외하고는 앞에서 개요된 것과 유사한 실험으로부터 데이터를 도시하고 있다. E:T의 비는 5/1이고 펩티트 농도는 10-7내지 10-5으로 변화했다. 용해는 절대적인 판독치를 나타내고, 특이적인 용해 작용은 백그라운드에 대해 수정된 결과를 나타내고 있다.
도12에서의 데이터는 CD8의 효과가 T-세포 클론으로 관찰된다는 사실을 입증하고 있다.
도13은 MP1β에 의해 측정된 바와 같이 T 세포 자극 및 표적 세포 용해작용 둘다를 나타내는 CD8 저해의 또 다른 적정이다. MIP1β는 이들의 활성화 단계에 비례하는 양으로 T 세포에 의해 생성되는 T 세포 활성화 마커이다. 이는 저해 효과가 T 세포 활성화의 저해에 관련된다는 것을 입증한다. 이 용해작용 분석에 있어서, E:T의 비는 8:1이고 펩티드 농도는 10 마이크로M이고 펩티드 대조군은 100 마이크로g/ml의 CD8αα를 함유하지 않고 감해진 베이스라인은 펩티드/CD8αα가 없는 음성 대조군이었다.
도14는 CD8에 비의존적인 희귀한 T 세포 반응을 수반하는 실험으로부터 얻어진 데이터에 대해 도시하고 있다. 이 실험은, 세포독성 T 임파구의 다른 샘플이 E:T의 비가 5:1이고 OKT8 CD8 항체의 농도가 다른 '868'B 세포를 사용한 사멸 분석에서 배양되었다. 이 기호는 30분후에 수집한 데이터를 도시하고 있다.
대조군으로서 세포 배지를 사용한 'PBS' 배양
'600/100/10 ㎍/ml-각각의 배양 데이터세트에 사용된 OKT8 CD8 항체의 농도.
도14의 데이터는 독성 효과에 기인하여 임의의 단백질이 저해하는 매우 높은 농도라는 점을 제외하고는 CD8 T 세포의 특정한 샘플에 대한 CTL 반응이 항체에 의해 저해될 수 없다는 것을 입증하고 있다.
이 실험에서는 펩티드 ILKEPVHGV(서열 번호: 12)에 대해 특이적인 ALA-A2 Pol-제한된 CTL 세포주를 사용하였다. 이 세포주는 항-CD8 항체를 사용한 예비 배양시에 표적 세포의 부족한 저해 작용에 의해 정의된 바와 같이 CD8에 비의존적이다.
도15는 유사한 조건, 즉 E:T는 5:1이고 '868' B 세포가 표적 세포로서 사용된 조건하에서 광범위한 펩티드 농도에서 가용성 CD8 수용체로 배양된 동잃나 세포를 이용한 유사한 실험으로부터 얻은 데이터를 나타내고 있다.
대조군으로서 세포 배지를 사용한 'PBS' 배양
100 ㎍/ml에서 가용성 CD8αα 수용체를 사용한 'CD8'배양
도15의 데이터는 이 세포 샘플에 대한 CTL 반응이 가용성 CD8에 의해 저해되지 않는다는 것을 입증하고 있다.
그러므로, 도14 및 15의 데이터는 함께 도8내지 13에서 검사된 CTL 반응에서 관찬되는 가용성 CD8에 의해 매개된 저해가 비특이적인 효과에 기인한 것이 아니라는 것을 나타내고 있다.
실시예 3
CD8-의존성 및 비의존성 CTL에서 초기 단백질 티로신 인산화에 대한 sCD8αα의 효과
HLA와 결합되고 항원이 펄스된 엡스타인 바르 바이러스로 형질전환된 B 세포를 항원 발현 세포(APC)로 사용되었다. CTL을 E:T가 10:1의 비로 첨가하기 전에 가용성 sCD8αα로 APC를 5분간 배양하였다. 37℃에서 10분간 배양한 다음, 세포를 펠렛화하고 용해 완충액(푸부 등, 1998) 중에서 용해시켰다. 용해물을 벤치답 마이크로퓨지중에서 13,000 rpm으로 원심분리하여 투명하게 하고, SDS-PAGE에 의해 분리시켰다. 겔은 니트로셀룰로오스 막상에서 웨스턴 블롯되고, 이어서 막은 항-포스포티로신 mAb에 의해 프로브되었다. 차 항원은 2차 항원에 결합된 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 및 향상된 화학적형광(chemiluminescence: ECL)에 의해 검출되었다.
결과는 도16에 나타나 있다. (A) 001 ALA-A2/Gag CTL 클론(CD8-의존성) 및 (B)SC6 ALA-A2/Pol CTL 세포주(CD8-비의존성)로부터의 세포 용해물의 항-포스포티로신 면역블롯. 항원으로 펄스된 B 세포(105)는 sCD8αα가 없는 경우(레인 1), 100 ㎍/ml의 sCD8αα가 존재하는 경우(레인 2 및 3 각각), 또는 200 또는 100 ㎍/ml의 CD8α Glu54/Glu55돌연변이체가 존재하는 경우(레인 4 및 5 각각)에 CTL(106)에 제공되었다. 또한, 남아있는 CTL(레인 7) 및 비펄스화된 B 세포를 제공하는 CTL을 도시하고 있다. 전반적인 단백질 티로신 인산화, 구체적으로 면역블롯의 상부 및 하부의 ζ쇄 인산화를 지시된 다른 시간동안 누출시켰다. CD8-비의존성 CTL에 대해 단지 ζ쇄의 티로신 인산화만을 도시하고 있다.
실험은 T 세포 활성화에 세포내부적인 효과를 평가할 수 있게 하였다(도16). sCD8αα의 존재하에, 003 Gag/ALA-A2로 제한된 CTL 클론 중에서 단백질 티로신의 인산화는 인덱스 펩티드에 반응하여 유도되지 않으므로, 효능제 펩티드와 펄스되지 않은 B 세포에 대한 반응에서 관찰되는 것과 유사한 활성화 단계만을 유발했다(도16a, 레인 2, 3 및 6). 그러므로, 단지 펩티드에 특이적인 단백질 티로신 인산화가 영향을 받을 것이므로, sCD8αα의 저해적 효과는 TCR/CD3 복합체를 통한 시그날화에 제한되는 것으로 생각된다. sCD8αα에 의한 CD3 티로신 인산화의 저해는, p56lck활성화의 저해와 일치하는 시그날화의 최초 단계에서 T 세포 활성화가 방해됨을 의미한다. 인산화에 대한 저해적 효과는 Glu54/Glu55돌연변이체의 존재하에서 관찰되지 않았다(도16a, 레인 4 및 5). CD8-의존성 CTL을 포함하는 관찰에서와 상반되게, SC6 Pol/ALA-A2로 제한되고 CD8-의존성 CTL 세포주중에서 CD3 쇄의 인산화(도18b), 또는 전반적인 활성화(도시되지 않음)에서 어떤 효과도 관찰될 수 없었다.
이들 결과는 가용성 CD8 수용체가, MHC 분자의 특이성을 통해 CD8-의존성 CTL 활성화의 강력한 저해제로서 작용할 수 있다는 사실을 나타낸다. sCD8αα CTL가 TCR/CD8 복합체를 총해 초기 시그날화를 완전히 배제한다는 관찰은 놀라운 것이다. 이것은 사용된 농도에서, 가용성 단백질이 CD8-MHC 상호작용 부위의 대부분을 차단하는 정상 상태의 레벨에서 결합하며 TCR 접촉이 아닌 CD8 접촉을 위한 MHC 분자의 서브세트를 저해하는 것이 시그날화를 부정할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 4
시스테인 22 내지 세린의 돌연변이를 가진 CD8αα의 발현 및 재폴딩
일반적으로, 시험관내에서 단백질 폴딩에 가장 큰 영향을 주는 인자는 폴리펩티드중에 있는 시스테인 잔기의 수이다. 시스테인 잔기의 수가 많을 수록, 동일한 폴리펩티드(쇄 내부의 이황화 가교) 및 2개 이상의 폴리펩티드 쇄(쇄 내부의 이황화 가교)이 조성물이 이황화 가교를 형성할 가능성이 커진다. 그러므로, 펀연의 단백질 구조에서 짝을 이루지 않은 시스테인 잔기의 돌연변이화는 시험관내에서 폴딩시에 얻어지는 생성물에 거의 항상 유익하다. 이러한 잔기는 매우 자주 세린 또는 알라닌 잔기로 돌연변이된다.
ALA-A2αα에서, 성숙한 단백질의 제33 위치의 시스테인 잔기는 천연의 구조에서 짝을 이루고 있지 않다(Gao et al., 1997; Leahy et al., 1992). 그러므로, 시험관내 폴딩을 통해 얻어질 수 있는 CD8αα의 생성물을 증가시키기 위해, 이 잔기는 PCR 돌연변이화 반응(스트라타젠)에서 하기의 프라이머를 사용하여 세린 잔기로 돌연변이되었다:
5´-CTG TCC AAC CCG ACG TCG GGC AGC TCG TGG CTC TTC CAG CCG-3´(서열 번호: 15)
및
5´-CGG CTG GAA GAG CCA CGA GCT GCC CGA CGT CGG GTT GGA CAG-3´(서열 번호: 16)
시스테인 코돈을 세린 코돈으로 변화시킨 이 잔기는 프라이머 서열에서 밑줄로 표시되어 있다.
실시예 5
단순화된 완충액 조건에서 CD8αα의 재폴딩
CD8αα의 비용을 절감하고, 단백질의 생체내 용도에 바람직하지 않을 수 있는 일부 완충액을 제거하기 위해, 단순화된 조건하에서 재촐딩을 시험하였다.
재폴딩(즉, 우레아 완충액 2 ml중 10 mg/ml의 CD8αα를 15 ml의 구아니딘 완충액에 첨가하고 평형화시키는 것) 이전에 실시예 1에 기재된 바와 동일하지만 하기 완충액 조건에서 재폴딩하여 단백질을 제조하는 경우, 시각적으로 확인되는 폴딩 생성물이 얻어졌다:
재폴딩 완충액 2:
0-10 mM 트리스-HCl(pH 8.0)
0-0.1 mM PMSF
6.5 mM 시스티민
3.7 mM 시스타민.
실시예 6
바이오티닐화 택(tag)에 융합된 CD8αα의 발현 및 다중합 CD8αα 단백질 복합체의 생성
가용성 CD8α용 발현 벡터는, 또한 박테리아 효소인 Bir A(스카츠, 1993)에 대한 기질인 "바이오티닐화 택"에 대한융합으로서 CD8α를 발현시키도록 개질될 수 있다. 하기 DNA 올리고("안티센스" 쇄에 상응함)는 PCR 반응에 있어서 실시예 1에 기재된 센스 프라이머와 함께 사용되어 CD8α 융합 유전자를 생성하였다:
5´-GGG GGA AGC TTA ATG CCA TTC GAT TTT CTG AGC TTC AAA AAT ATC GTT CA G ACC ACC ACC GGA TCC TGG CGT CGT GGT GGG CTT CGC TGG CAG GAA GAC(서열 번호: 17)
그리고 나서, 하기 단백질을 서열(하나의 문자 코드)을 발현된 CD8α 폴리펩티드에 첨가하였다:
G S G G G L N D I F E A Q K I E W H(서열 번호: 18)
택화된 CD8α 단백질(CD8α-BT)은 CD8α에 대해 사용된 것과 동일한 조건하에서 유사한 수율의 이량체로서 재폴딩되고 CD8α와 유사한 레벨로 발현되었다. 택화된 단백질의 작용성 유효성은 CD8αα-BT가 바이오틴-스트렙타비딘에 의해 고정화된 표면 플러스몬 레소넌스 실험에 의해 입증되었으며, 가용성 제1군 MHC 분자에 대해 특이적인 결합을 나타내었다.
보다 상세하게, 바이오티닐화된 택 서열을 보유하는 CD8α는 대장균에 대해 기재된 바와 동일하게 발현되고, 재폴딩되며 정제되고 Bir A 효소(스카츠 1993)에 의해 바이오티닐화되었다. 바이오티닐화된 sCD8αα는 바아코어 스트렙타비딘으로 코팅된 플로우 셀의 표면에 고정화되어 3700 반응 단위의 굴절 지수의 변화가 일어낫다. 모노클로날 항체 OX68은 다른 플로오셀 사에 고정화되어 3400 Ru의 굴절 지수의 변화를 일으켰다. 바이오티닐화된 sCD8αα는 연속적으로 2개의 플로우 셀을 통과하고 OX58 항체로 코팅된 플로우 셀은 CD8-코팅된 클로우셀에 대한 대조군으로서 작용하게 되었다. HIV-1의 Pol 펩티드, 및 ALA-A2로 폴딩된 MHC 복합체의 가용성 형태는 하나의 문자 코드의 펩티드 서열: ILKEPVHGV(서열 번호: 12)을 가진 HIV-1 중합효소 잔기 476-484)는 도17에서 기지된 농도에서 표면상에 유동되었다. 2개의플로우 셀로부터 RU의 변화 양상은 중복되었다(도17). 모든 농도에서, RU의 변화는 OX68로 코팅된 플로우 셀내에서보다 sCD8αα로 코팅된 플로우 셀에서 더 높았다. 도17에 도시된 바와 같이, 택화되고 바이오티닐화되며 고정된 CD8에 대한 특이적인 결합이 관찰되었다. 그러므로, 이 형태의 CD8은 기능적 완전성에 대해 제안된 바와 같이 고정화될 수 있으므로 다중합 CD8 복합체의 생성에 적합할 수 있다.
다중합성 CD8 복합체는 CD8αα 이량체보다 항원을 발현하는 세포에 더 큰 안정성으로 결합할 것으로 생각될 수 있다. 바이오티닐화된 CD8αα-BT 단백질은 예를 들면 아비딘 또는 스트렙타비딘에 부착함으로써 또는 이량체의 4중합체로서 제조되거나, 아비딘- 또는 스트렙타비딘으로 코팅된 다양한 형태의 비이드에 부착되거나 지질 유도체로 제조된 리포좀의 표면에 결하될 수 있다. 이 방법으로, 항원을발현하는 세포에데대해 상당한 정도로 결합하므로 세포독성 T 세포 반응의 유효한 억제제로 작용하는 높은 다중합화의 CD8 입자가 얻어질 것이다.
CD8 4중합체 및 CD8으로 코팅된 비이드의 제조
바이오티닐화된 CD8αα를 4중합화하기 위해, 엑스트라비딘(시그마)를 1:4의 몰비로 첨가하였다. 형광으로 표지된 엑스트라비딘을 세포를 표지하는 실험용으로 사용한다. 단계적으로 첨가하여 엑스트라비딘을 포화시키는데, 이는 바이오티닐화 반응을 일부 불완전하게 하고 단백질 측정을 일부 불명확성하게 한다. 엑트스라비딘의 첨가 및 결합 사이에 15분동안 얼음상에 방치한 후, 최종 첨가가 끝나면 밤새 4℃에서 방치한다. 눈금화된 수퍼덱스 200 칼럼(파마시아)용액의 작은 샘플을 겔 여과함으로써 4중합체화를 확인한다. 이어서, CD8 4중합체 용액을 프로테아제 저해제 혼합액 및 0.05%의 나트륨 아지드의 존재하에 4℃에서 저장한다.
유사한 접근법은 다양한 형태의 비이드 또는 가용성 CD8를 보유한 고체 지지체를 코팅하는데 사용될 수 있다. 아비딘/스트렙타딘으로 코팅된 비이드는 시판되는 것으로부터 구할 수 있고(예를 들어, 노르웨이의 오슬로에 소재하는 디나폴에서 시판하는 디나비드 또는 독일의 베그기쉬 글라드바흐에 소재하는 말데티 바이오텍에서 시판하는 MACS), 약 4.5 ㎛ 내지 65 nm의 직경을 가진 광범위한 입도로 시판된다. 바이오틴-스트렙타딘을 통한 디나비드상의 MHC-펩티드 복합체의 고정화에 대해서는 전술한 바와 같다(베세이 등, 1997). 정제된 바이오티닐화된 단백질은 스트렙타딘으로 코팅된 비이드로 예를 들어 4℃에서 30분간 항온처리된 후, 상기 비이드를 세척하여 비결합된 단백질을 제거한다. 이들 MHC-펩티드로 코팅된 비이드는 TCR을 발현하는 세포주를 자극하는데 사용되었을 때, 항원 특이적 반응을 유도하였다. 유사하게, CD8의 4중합체 또는 단량체의 바이오티닐화된 가용성 CD8는 아비딘/스트렙타딘으로 코팅된 비이드 상에 고정화될 수 있거나 바이오티닐화되지 않은 CD8은 항-CD8 항체 코팅에 의해, 직접적인 화학적 가교에 의해 또는 다른 적절한 수단에 의해 고정화될 수 있다.
리포좀의 제조 및 약물 충전
멸균되고 내부독소를 검사한 지질 및 다른 성분은 다수의 공급원, 예를 들어 미국의 시그마 케미칼 컴퍼니 또는 아반티 폴라 리피드 인코포레이티드로부터 입수할 수 있다.
리포좀은 베지클 형성 지질 및 바이오티닐화된 베지클 형성 지질의 혼합물로부터 제조된다. 이어서, 바이오티닐화된 CD8은 아비딘, 스트렙타비딘 또는 엑스트라비딘과 같은 적합한 결합제를 통해 리포좀의 외부에 결합된다. 치료제와 같은 시약 및/또는 검출가능한 표지는, 필요한 경우 막내에 이쓴 수성 용적에 포획되거나 막 자체내로 포함된다.
실시예 7
MHC에 대한 CD8αα의 친화성을 변화시키기 위해 돌연변이될 수 ㅣㅇㅆ는 잔기
MHC에 대한 CD8αα의 친화성은 MHC에 접촉시키는 하나 이상의 잔기를 치환함으로써 증가될 수 있다. 증가된 친화성은 세포독성 T 세포 반응을 저해하는 sCD8αα의 능력을 증가시킬 수 있는데, 그 이유는 항원을 발현하는 세포의 표면상에 있는 MHC 분자상의 sCD8αα 분자가 차지하는 공간이 증가될 것으로 생각되기 때문이다. 하기 잔기의 리스트로부터 하나 이상의 치환(수자는 성숙한 CD8α 단백질 서열에서 아미노산의 위치를 가리킴)은 MHC에 대한 CD8αα의 친화성을 증가시킬 수 있다.
아르기닌 4 세린 31
리신 21 세린 34
발린 24 트레오닌 51
류신 25 글루타민 54
류신 26 아스파라긴 55
세린 27 아스파르테이트 75
아르파라긴 28 류신 97
프롤린 29 아스파라긴 99
트레오닌 30 세린 100
CD8αα/CD8 구조로부터 추론된 접촉 잔기의 목록 참조(Gao et al., 1997)
아미노산 잔기의 치환은 일상적이며, 공지된 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 이어서, 치환된 CD8α는 이것을 CD8 이량체에 포함시키거나 세포독성 T 세포 분석을 수행함으로써(예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같음), T 세포 저해 효과에 대해 시험되고/거나 본원에 기재된 기법을 이용하여 MHC 결합에 대해 시험될 수 있다.
실시예 8
동물 실험에 대한 뮤린의 가용성 CD8αα
CD8에 의해 접촉된 CD8 및 MHC 부위 사이의 상동성으로 인해 동물 실험에서 인간 CD8의 면역저해적 효과를 시험할 수 있다(실시예 10 참조). 그러나, 뮤린의 sCD8αα는 본원 명세서 중에 기재된 인간 분자와 유사하게 설계될 수 있다. 뮤린의 분자는 sCD8αα를 장기간 투여하는 효과의 연구에서 특히 유용할 것이다. 인간 및 뮤린의 CD8α 분자는 서열에 있어서 매우 유사하고, 인간 분자에 대해 특이적인 제2의 면역 반응은 마우스에서 장기간의 연구동안 그것의 기능에 영향을 줄 수 있었다.
대장균에서 발현 및 인간 sCD8αα에 유사한 가용성 이량체 형태로 재폴딩시키기 위한 뮤린의 CD8α 유전자는 뮤린의 CTL cDNA를 주형으로 이용하고 하기 프라이머 서열이 뮤린 CD8α에 적합하도록 설계된 중합 효소 연쇄 반응 방법(PCR)에 의해 생성되었다(Lyt-2; (나카우치 등, 1985)):
센스 프라이머:
Nde I
M K P Q A P E L R I F P K K M
GAG GAG GAG CAT ATG AAA CCA CAA GCA CCT GAA CTA CGA ATC TTT CCA AAG AAA ATG
D A
GAC GCC -3′(서열 번호: 19)
안티센스 프라이머:
HindIII
5′- GGG GAG GGA AGC TTA CTT GGT AGT AGT AGA GTT CAC -3′(서열 번호: 20)
클로닝의 목적으로 도입된, 염기를 함유하는 제한 부위 및 대장균 내에서 발현을 증가시키기 위해 센스 프라이머 중에 변화된 염기를 밑줄로 표시하고 있다.
도18은 뮤린 CD8α(데이터베이스 기탁 번호: M12052)의 도메인 구성 및 cDNA 서열 및 단백질 서열을 도시하고 있다. 도19는 PCR 반응에서 생성된 DNA 단편의 DNA 서열 및 가용성 재조합 뮤린의 CD8α의 추정된 단백질 서열에 대해 도시하고 있다. 가용성 인간 CD8α에 대해 본원 명세서에서 기재된 바와 같이 가용성 뮤린의 CD8α의 변화는 생성되어 동물 실험에서 사용될 수 있다. 이러한 변이체는 예를 들어 본원에서 설명된 단백질에 비해 N 말단에서 하나 또는 일부 아미노산이 길거나 짧은 것이거나 C 말단에서 하나 또는 일부 아미노산이 길거나 짧은 것일 수 있다. 본원 명세서 중에 기재된 것 이외에 또는 그 대신에 다른 침묵 돌연변이(즉, 단백질 서열을 변화시키지 않는 DNA 돌연변이)가 대장균에서 발현을 증가시킬 목적으로 도19에서 도시된 발현 카세트의 40개의 대붑분의 5′ 염기중에 도입될 수 있다.
또한, 도18 및 도19에 나타난 바와 같이 짝을 이루지 않은 시스테인 잔기가 돌연변이된 단백질을 생성하는 것이 재폴딩의 효율을 증가시킬 것으로 생각된다.
도18 및 도19에 대한 기호
도18: 하나의 문자 코드로 표시된 단백질 서열(상부)을 가진 마우스 CD8α(하부 서열)의 cDNA 서열. 예상된 범위의 시그날 서열, 면역글로ㅜㄹ린-유사 도메인, 막에 인접한 '줄기" 영역, 횡단막 도메인 및 세포질 도메인이 단백질 서열상에 표시되어 있다(Nakauchi et al., 1985; Nakauchi et al., 1987). 내부쇄 이황화 결합으로 생각되는 2개의 시스테인 잔기는으로 표시된다. 짝을 이루지 않고 단백질의 수율을 증가시키기 위해 돌연변이될 수 있는, 인간의 CD8α(실시예 4 참고)에 대해 제시된 바와 같은 시스테인 잔기는 T 세포으로 표시된다.
도19: 대장균에서 마우스 CD8α를 발현하기 위한 카세트의 DNA 서열. 단백질 서열(상부)은 하나의 문자 코드로 표시된다. 내부쇄 이황화 결합을 형성하는 것으로 생각되는 2개의 시스테인 잔기는으로 표시된다. 짝을 이루지 않고 단백질의 수율을 증가시키기 위해 돌연변이될 수 있는, 인간의 CD8α(실시예 4 참조)에 대해 제시된 바와 같은 시스테인 잔기는 T 세포으로 표시된다.
PCR에 의해 생성된 카세트가 적합한 벡터, 예를 들어 pGMT7(Studier et al., 1990)으로 클론될 수 있는 제한 효소에 적합한 인지 부위를 나타내고 있다. 원래 DNA 서열의 일부가 아니고 서브클로닝을 허용하면서 개시 코돈을 암호화하기 위해 첨가되거나 박테리아의 발현을 증가시키기 위해 돌연변이된 염기를 소문자로 도시하고 있다.
실시예 9
MHC에 대한 가용성 CD8α의 결합 친화성의 측정
표면 플라스몬 공명(SPR) 기법은 가용성 CD8α 및 MHC 제1군 펩티드 복합체 사이의 상호작용의 친화성을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어 가용성 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환된 가용성 CD8 분자가 비치환된 가용성 CD8에 비해 결합 친화성이 증가되었는지 감소되었는지 여부를 결정하는 데 유용할 것이다.
HBS(BIAcore AB)에서 BIAcoreTM2000(BIAcore AB, St Albans, UK)을 사용하여 SPR 연구를 수행하였다. HBS는 10 mM HEPES(pH 7.4), 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20을 함유한다. 스트렙타비딘(시그마)는 아민 커플링 키트(BIAcore)를 사용하는 1차 아민을 통해 CM5 센서 칩(BIAcore)에 공유결합되어 있다. 커플링을 위해, 스트렙타비딘을 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.5) 중에 용해시키고, 0.5 mg/ml에서 주입한다. 고정화 레벨은 6000 내지 11000 반응 단위이다. 바이오티닐화된 ALA-A2 및 대조군 단백질은 이어서 스트렙타비딘과 결합된 표면 위에 0.5 내지 10분동안 0.05 내지 0.15 mg/ml로 주입함으로써 고정화된다.
ALA-A2에 결합하는 가용성 CD8은 대조군의 표면 상에서 주입되는 경우보다 고정화된 ALA-A2를 발현하는 표면 상에서 주입되는 경우에 더 큰 반응을 나타낼 것이다. HLA에 대한 가용성 CD8의 결합 친화성은 특정될 수 있다.
도 20
CD8αα는 고정화된 ALA-A2에 특이적으로 결합한다
유사한 농도(야생형 CD8αα 또는 CD8αα 돌연변이체 Q54E/N55D를 ALA-A2(고체 흔적) 또는 고정화된 대조군 단백질(점선의 흔적)을 가진 플로우 셀을 통해 90초 동안 주입하였다(고체 막대). ALA-A2는 인플루엔자 매트릭스 펩티드(ALA-A20flu, 표1 참조)를 발현하였다. 이 실험은 고정화된 대조군 단백질 또는 ALA-A2의 ∼2000 RU를 사용하여 5 마이크로ℓ 분-1의 유동 속도로 25℃에서 수행되었다. 대조군 유동셀네에서 관찰되는 주입된 CD8αα 샘플에서 관찰된 높은 백그라운드 반응은 매우 높은 단백질 농도의 결과인 주입된 CD8αα 샘플의 높은 굴절 지수를 반영한다. CD8αα는 특이적인 결합을 나타내는 대조군에 비해 고정화된 ALA-A2을 발현하는 표면상에서 주입되었을 때 더 큰 반응을 나타낸다. CD8αα 변이체는 결합하지 않았고, 상호작용의 특이성을 확인하였다.
도 21
ALA-A2에 대한 CD8αα의 친화성
CD8αα/ALA-A2 상호작용의 친화성은 평형 결합 분석에 의해 측정되었다. CD8αα는 관련없는 고정화된 대조군 단백질 또는 ALA-A2를 보유한 플로우 셀을 통해 30-60초동안 표시된 농도로 주입되었다. CD8 및 대조군 플로우 셀 중에서 반응사이의 차이로서 결합을 측정하였다. 이 실험은 (A) 25℃ 및 (B) 37℃에서 수행되었다. 고체 세포주는 데이터에 대한 랑구미르(Langmuir) 결합 등온선의 비선형 적합을 나타낸다. 이들은 (A) 및 (B)에 대해 156 μM 및 736 μM의 Kd 수치를 산출하였다. 이 삽입은 동일한 데이터의 스카차드 플롯을 도시하고 있는데, Kd 값은 선형 에 의해 얻어졌다. 이 유동 속도는 (A) 및 (B) 각각에서 고정화된 ALA-A2 ∼9000 및 ∼1900 RU를 사용하여 5 내지 10 마이크로ℓ/분이었다. 2개의 펩티드/ALA-A2 복합체에 대한 CD8αα의 결합력에 있어서 유사한 친화성이 측정되었다(표 1).
ALA-A2에 대한 CD8αα 결합의 동력학
예비분석은 CD8αα/MHC-펩티드 상호작용의 동력학이 매우 급속도로 일어난다는 것을 나타내므로, BIAcore 상에서 가장 빠른 속도로 0.1초의 간격으로 데이터를 수집하였다. CD8αα를 ALA-A2 상에서 약 25℃로 주입하는 경우, 0.4초 이내에 평형에 도달하였는데, 이로 인해 해리 속도 상수(Kon)를 직접 측정하는 것은 불가능했다. 해리는 매우 신속하게 일어났으며, 반응은 주입이 종료된 지 0.4초이내에 처음 상태로 되돌아왔다. 해리 시간이 흘로우 셀로부터 단백질을 세척하는 데 걸린 시간과 동일하므로, 유동 속도는 1.67 마이크로ℓ.s-1로 증가되었다. 이 유동 속도에서, CD8αα는 명맥한 Koff인 18s-1로 해리하였다. 백그라운드 반응이 대조 플로우 셀로 떨어지는 속도(∼24s-1)는 세척 시간을 측정가능하게 한다. 이는 이 유동 속도[유동 속도 + 유동 셀 용적(∼0.06 마이크로ℓ)]에 대해 측정된 이론치(∼28s-1)와 일치했다. CD8αα/MHC 제1군의 상호작용에 대한 진정한 koff는 당연히 18s-1이상일 것인데, 그 이유는 BIAcore 실험에서 통상적으로 관찰되는 재결합이 해리 이후에 일어나며 이것은 제외뵐 수 없다. 또한, 37℃에서 koff는 25℃에서보다 높은데, 그 이유는 친화성이 5배 낮기 때문이다(표 1). koff가 ≥18s-1이고 Kd가 126 μM(25℃)인 경우, kon은 ≥140000M-1s-1으로 계산될 수 있다. kon은 전형적인 단백질-단백질 상호작용이고, CD8αα/MHC 제1군의 상호작용의 낮은 친화성은 특이하게 느린 kon의 결과가 아니라는 것을 나타낸다.
펩티드/ALA-A2에 대한 CD8αα 결합의 결합 친화성 평형
리간드* 온도(℃) Kd(μM)**
HLA-A2-flu 25 159±18(n=5)
HLA-A2-flu 37 629±151(n=2)
HLA-A2-pol 25 126±34(n=7)
HLA-A2-pol 37 712(n=1)
*ALA-A2flu; ALA-A2 와 인플루엔자 매트릭스 단백질 58-66(GILGFVFTL(서열 번호: 21); ALA-A2-pol: ALA-A2와 HIV-1 중합 효소 476-484(ILKEPVHGV(서열 번호: 12))
**평균±SD 또는 n=2에 대해서, 평균±n의 독립적인 측정값의 범위
실시예 10
CTL 초회 항원 자극 및 생체내 sCD8αα의 활성의 저해
생체내에서 세포의 면역 반응을 저해하는 sCD8αα의 능력을 마우스에서 2가지 실험에 의해 시험하였고, 백시니아 바이러스에서 암호화되는 에피토프에 대한 응답에 대한 sCD8αα의 영향을 분석하였다(개략적인 설계를 위해 도22 참고). 모든 결과는 각각의 용해 레벨의 5가지 각각의 측정으로부터 평균치로서 제시되었다.
물질 및 방법
마우스: 양자의 실험에서 Black 6(야생형 실험용 마우스 종) 종 마우스를 사용하였다.
바이러스: 백시니아 바이러스 종 G2(vvG2)는 재조합 바이러스 종이다. 백시니아 바이러스로 세포를 감염시키며 일반적으로 불량한 특성을 가진 다수의 백시니아 펩티드 에피토프가 MHC에 의해 제한되어 발현된다. 그러나, vvG2 종으로 감염시키면, LCM 바이러스 G2 당단백질로부터 제33 내지 제41 아미노산(하나의 문자 코드로 된 서열: KAVYNFATC (서열 번호: 22)에 상응하여 펩티드 에피토프가 발현된다. 마우스에서, G2 에피토프는 MHC 분자인 Db에 의해 발현된다.
표적 세포: MC57 항원을 발현하는 세포(레이스트 등, 1987)는 마우스의 MHC 분자인 Kb및 Db를 발현한다.
실험 1:
0일째, 마우스 1(M1)에 2 x 106pfu 백시니아 바이러스 종 G2 및 200 마이크로ℓ의 인산염 완충액(PBS, 표준 생리학적 염의 완충액)을 사용하여 정맥 주사하였다.
0일째, 마우스 2(M2)에 2 x 106pfu 백시니아 바이러스 종 G2 및 인산염 완충액 중 sCD8αα 200 마이크로ℓ를 사용하여 정맥 주사하였다.
어느 동물에도 명맥한 부작용은 없었다.
CTL 활성을 분석하기 위해 전술한 절차를 변형하여 사용하였다(leist et al 1987).
6일째 되는 날에, 비장을 마우스로부터 제거하고 임파구를 세척하여 제거하였다. 비장 세포를 ConA 상청액으로 24-웰 플레이트 중에 배양하였다. G2 33-41 에피토프에 상응하는 합성 단백질을 웰에 첨가하고 임파구가 4일동안 증식하도록 방치하였다.
10일째 되는 날에, T 세포를 계수하고 CTL 사멸 분석을 다음과 같이 수행하였다. 크롬51로 표지된 MC57 세포를 G2 33-41 펩티드로 1시간동안 예비펄스화한 다음, 효능기에 있는 배양된 마우스 임파구와 표적 비율로 혼합시켰다. 세정제의 첨가에 의해 용해된 MC57 세포의 웰로부터 크롬51숫자는 100% 용해로 설정되었다.
실험 2
마우스 3(M3)은 복강내로 주입을 실시한 점을 제외하고는 M1과 동일하게 처리하였다.
마우스 4(M4)는 복강내로 주입을 실시한 점을 제외하고는 M2와 동일하게 처리하였다.
다시, 명백한 부작용의 징후는 없었다.
E:T M1(PBS) M2(CD8) M3(PBS) M4(CD8)
21:1 76% 42% 89% 43%
7:1 73% 35% 66% 30%
시험관내 대조 실험:
G2 33-41에 대한 CTL의 반응이 CD8에 의존적인가 및 sCD8αα에 의해 저해되는가를 확인하기 위하여, 가용성 CD8의 효과를 마우스 1로부터 배양된 CTL을 사용하는 용해 분석에서 시험하였다. 표 3에 제시된 바와 같이, G2 33-41에 대한 마우스 CTL의 반응은 항-CD8 항체 및 sCD8αα 양자에 의해 명맥히 저해될 수 있다.
항-CD8 YTS 169.4(Cobbokd et al., 1984) 및 sCD8αα에 의한 M1 CTL 반응의 저해. 표적 비율(E:T)에 대한 효과기는 모든 실험에서 10:1이었다. 100 ㎍의 항-CD8 mAb YT62.1 또는 25 마이크로ℓ의 sCD8αα는 200 마이크로ℓ의 분석에 첨가되었다.
첨가 PBS YT62.1 sCD8αα
용해 수준 82% 46% 44%
실험 3
마우스 5 및 6(M5 및 M6: 대조 동물)은 PBS 완충액을 2회 주입으로 투여하였다는 점(한 번은 백시니아 바이러스 G2로 주입하기 5시간 전, 및 한 번은 첫번째 주입 후 24시간이 경과하였을 때)을 제외하고는 M3와 동일하게 처리되었다.
마우스 7 및 8(M7 및 M8)은 2회의 주입이 이루어진 것(제1회는 백시니아 바이러스 G2로 주입하기 전 1시간 전, 및 제1회 주입 후 24시간 후)을 제외하고는 M4와 동일하게 처리되었다. 실험 1 및 2에 있어서, 명백한 부작용의 징후는 없었다.
6일째에, 세포를 비장으로부터 세척하고, 웰의 절반을 임차구 배양물로 ConA 상청액의 존재하에 성장시키고, 나머지 절반은 그것 없이 성장시켰다. 이는 sCDαα의 효과가 ConA 상청액을 첨가하지 않는 경우에도 단순히 잘 검출될 수 있는가를 알기 위해 수행하였다. ConA 상청액은 몇가지 사이토킨을 함유하므로, 특이적 비특이적 용해 활성을 자극하여 배양후 관찰되는 용해를 확장시킨다. 이는 sCD8αα의 저해적 효과를 방해하는 데 기여할 수 있었다.
표4에서 도시된 바와 같이, 동물의 sCD8αα는 G2 펩티드에 특이적인 세포독성 T 세포의 증식에 명백한 저해적 효과를 가졌다. 이 저해적 효과는 예상된 바와 같이, ConA 상청액 없이 성장된 배양물에서 약간 더 분명하였다.
M5-8의 각각으로부터 성장한 비장 배양물의 4개 조의 용해 수준. 각각의 용해 수준은 2중으로 측정되었다.
실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4
M5 -ConA 14 % 21 % 31 % 35 %
M6 -ConA 21 % 20 % 33 % 45 %
M7 -ConA -1 % -1 % 4 % 11 %
M8 -ConA -4 % 0 % 3 % 10 %
M1 +ConA 19 % 28 % 25 % 33 %
M2 +ConA 19 % 33 % 56 % 38 %
M7 +ConA 2 % 7 % 7 % 20 %
M8 +ConA 7 % 12 % 21 % 24 %
M7 및 M8로부터의 비장 배양물에서 관찰된 "음성" 용해는 CTL의 완전한 저해 및 모든 결과로부터 '"자발적인 용해"를 감한 데 기인한다. 이 현상은 CTL 분석에 대해 공통적이다.
〔참고 문헌〕

Claims (19)

  1. 표적 세포에 대항하는 T 임파구의 활성을 저해하는 방법으로서, 표적 세포를 가용성 형태의 CD8 분자에 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가용성 CD8이 인간의 CD8인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 가용성 CD8이 선택적으로 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환된 천연 CD8 면역글로불린 도메인의 전부 또는 상당 부분을 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 가용성 CD8이 CD8의 막에 인접한 줄기(stalk) 영역의 단편을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 가용성 CD8이 2 이상의 CD8 분자의 다중합체(multimer)로서 제공되는 방법.
  6. 가용성 형태의 CD8 분자와 약학적 허용 희석제, 부형제 또는 담체를 함께 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    면역억제 치료를 위한 조성물.
  8. 연결 분자(linker molecule)를 통해 상호 부착된 2 이상의 CD8 분자를 포함하는 가용성 CD8 다중합체.
  9. 도1b에 도시된 바와 같은 서열을 가진 단백질로서, 표적 세포를 사멸시키는 세포독성 T 세포 임파구의 작용을 저해하는 성질을 가지고 이량체로서 폴딩된 단백질.
  10. 도1b에 도시된 것과 다음 중 하나 이상이 다른 단백질로서, 표적 세포를 사멸시키는 세포독성 T 세포 임파구의 작용에 영향을 주는 성질을 가지고 이량체로서 폴딩된 단백질:
    N-말단에 존재하는 메티오닌;
    N-말단에 하나 또는 수개의 아미노산 잔기의 부재;
    서열 leu-leu-leu-his-ala-ala-arg-pro-의 일부 또는 전부로 이루어진 N-말단에 첨가된 하나 또는 수개의 아미노산 잔기;
    보유된 아미노산 잔기 116 내지 120에 의해 정의되는 부위를 적어도 일부는 가지지만 C-말단에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산 잔기의 부재;
    서열 -ala-pro-arg-pro-pro-thr-pro-ala의 일부 또는 전부로 이루어진 C 말단에 첨가된 하나 또는 수개의 아미노산 잔기;
    C-말단에 첨가된 CD8 세포질 막 펩티드 서열의 일부 또는 전부;
    단백질의 CD8 작용성에 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 또는 다수의 아미노산 잔기의 보존적 변이체(variant);
    표적 세포를 사멸시키는 세포독성 T 세포 임파구의 작용을 저해하는 성질을 증가시키거나 제거하는 것을 포함하는, CD8 작용성을 변화시키는 돌연변이;
    정제의 목적으로 N 또는 C 말단에 단백질 또는 펩티드의 첨가;
    검출용 표지의 제공.
  11. 제10항에 있어서,
    면역글로불린 도메인, 막에 인접한 줄기 영역의 단편을 포함하는 CD8의 세포외 영역의 상당 부분을 함유하는 가용성 CD8 분자인 단백질로서, 상기 CD8 분자의 2개의 쇄 사이에 이황화 결합이 없는 단백질.
  12. 제10항에 있어서,
    제99 위치에서 N 대신에 E인 단백질.
  13. 제10항에 있어서,
    제54, 55 위치에서 QN 대신에 EE인 단백질.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 단백질과 HLA-A2의 복합체.
  15. 제14항에 있어서,
    하나의 단백질 이량체 대 하나의 HLA-A2 펩티드 단위의 화학양론을 가진 결정형 복합체.
  16. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 제조하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법:
    ⅰ) 적절히 개질된 CD8 유래의 유전자를 제공하여 박테리아에서 적어도 CD8 단백질의 면역글로불린-유사 도메인에 실질적으로 상응하는 단백질을 발현시키는 단계;
    ⅱ) 상기 박테리아에서 상기 CD8 유래의 유전자를 발현시키고 박테리아 배양물로부터 발현된 단백질을 회수하는 단계;
    ⅲ) 발현된 단백질을 그것의 정제가 용이하도록 처리하고 정제를 수행하는 단계.
  17. 제16항에 있어서,
    단계 ⅰ)에서 제공된 CD8 유래의 유전자가, 발현된 mRNA에서 5′헤어핀 2차 구조의 형성을 방지함으로써 발현을 증가시키도록 설계된 침묵 돌연변이(silent mutation)에 의해 개질되는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    단계 ⅲ)에서, 발현된 단백질의 처리는 단백질을 용해시키고 그 천연 상태와 유사한 형태로 폴딩될 수 있도록 하며, 이어서 이것이 정제되는 것을 포함하는 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD8 유래의 유전자 산물이 CD8 단백질의 면역글로불린-유사 및 막에 인접한 줄기 영역에 상응하는 방법.
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