DE69930630T2

DE69930630T2 - B2-Mikroglobulin-Fusionsproteine und Varianten mit hoher Affinität

Info

Publication number: DE69930630T2
Application number: DE69930630T
Authority: DE
Inventors: K. Randall Silver Spring RIBAUDO; Michael San Diego SHIELDS
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1999-06-03
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2019-06-04
Also published as: ATE321859T1; EP1086224A1; DE69930630D1; WO1999064597A1; EP1086224B1; AU4545799A

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die auf β₂-Mikroglobulin basieren und die Verwendung von solchen Zusammensetzungen bei immunologischen Verfahren, die das Abzielen von Proteinen auf Zelloberflächen betreffen. Die offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren weisen eine besondere Anwendbarkeit bei Vakzination und Tumortherapie auf.
Hintergrund der Erfindung
MHC I und Aktivierung von cytotoxischen T-Zellen
Das Beta-2-Mikroglobulin (β₂m) Protein ist eine Komponente der Klasse I des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC I). MHC I wird durch die Assoziation von β₂m und einem Alpha-Protein (auch als die "schwere" Kette bekannt) gebildet, das drei Domänen a1, a2 und a3 umfaßt. MHC I wird auf der Oberfläche der meisten Arten von kernhaltigen Zellen gefunden, wo es den CD8⁺ T-Zellen Antigene präsentiert, die von Proteinen abgeleitet werden, die im Cytosol synthetisiert werden. Es sind zwei Signale für die Aktivierung von naiven CD8⁺ T-Zellen nötig. Das erste Signal wird durch die Interaktion des T-Zell-Rezeptors (TCR) mit dem MHC I-Antigenkomplex auf der Antigen-präsentierenden Zelloberfläche bereitgestellt. Das zweite Signal wird durch die Interaktion eines Liganden auf der Antigen-präsentierende Zelle (APC) mit einem zweiten Rezeptor generiert, der auf der T-Zell-Oberfläche vorhanden ist. Dieses zweite Signal wird als Co-Stimulation bezeichnet, und der APC-Ligand wird häufig als ein co-stimulatorisches Molekül bezeichnet. Die am besten charakterisierten co-stimulatorischen Moleküle auf APCs sind die strukturell verwandten Glycoproteine B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86), die mit dem CD28-Rezeptor auf der T-Zell-Oberfläche interagieren. Die Aktivierung von CD8⁺ T-Zellen durch diese beiden Signale führt zu der Proliferation von Antigen-spezifischen cytotoxischen T-Zellen, die Zellen erkennen und zerstören, die das Signalantigen präsentieren. Diese cytotoxischen T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der immunologischen Abwehr gegen intrazelluläre Pathogene, wie z.B. Viren und Tumore. Eine ausführliche Darstellung der immunologischen Basis der cytotoxischen T-Zell-Antwort kann in "Janeway and Travers" gefunden werden (Immunobiology: the immune system in health and disease, Current Biology Ltd./Garland Publishing, Inc. New York, 1997).
Das Versagen eines exogenen (nicht-eigenen) Antigens, eine cytotoxische T-Zell-Antwort zu stimulieren, kann auf einer Blockierung eines der vielen Punkte des oben beschriebenen cytotoxischen T-Zell-Aktivierungswegs zurückgeführt werden (s. Ploeg, 1998, Science 280:248-53). Das Versagen des cytotoxischen T-Zell-Aktivierungswegs ist von großer Bedeutung in zwei bestimmten Bereichen der Medizin: Vakzinierung und Tumorimmunologie.
Cytotoxische T-Zellen und Vakzinierung
Die Vakzin-Technologie hat sich in den letzten Jahren auf die Untereinheiten-Vakzine fokussiert. Untereinheiten-Vakzine umfassen isolierte pathogene Bestandteile, wie z.B. virales Capsid oder virale Hülle oder synthetische Peptide, die eine antigenische Determinante auf einem Pathogen-verwandten Protein nachahmen. Zum Beispiel beschreibt das U.S. Patent Nr. 4,974,168 Leukämie-assoziierte Immunogene, die Peptide sind, die auf Hüllenproteinen eines Leukämie-assoziierten Virus basieren. Allerdings, während Untereinheit-Vakzine CD4⁺ T-Helfer-Zellen stimulieren können (die eine Schlüsselrolle bei humoraler Immunität spielen), waren Versuche, CD8⁺ cytotoxische T-Zellen mit solchen Impfstoffen in vivo zu stimulieren, weitgehend erfolglos. Es wurde postuliert, daß der Grund dafür die Unfähigkeit des exogen verabreichten Vakzin-Peptids, ist mit den MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche zu assoziieren (Liu, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10496-8). Mit anderen Worten, die Blockierung in dem cytotoxischen T-Zell-Aktivierungsweg tritt in der Phase auf, wo das Antigen in das MHC I -Molekül geladen wird.
Eine für dieses Problem vorgeschlagene Lösung ist es, das antigen Peptid mit einem Molekül zu kombinieren, das leicht in Zellen aufgenommen wird (zusammengefaßt von Liu, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10496-8). Folglich basiert diese Strategie darauf, das Antigen in das Cytosol zu bekommen, so daß es sich dem normalen Weg anschließen kann, durch den Antigene zur Präsentation durch MHC I verarbeitet werden. Demgegenüber nahmen sich Rock et al. (J. Immunol. 150:1244-52, 1993) einer Strategie zum Erhöhen der Bindung des Vakzin-Peptids auf MHC-I an, das bereits auf der Zelloberfläche vorhanden ist. Rock et al., (J. Immunol. 150:1244-52, 1993) berichteten, daß die Verabreichung von exogenem gereinigtem β₂m zusammen mit dem Vakzin-Peptid eine erhöhte Beladung des Peptids auf MHC I in vivo bewirkt und dabei eine cytotoxische T-Zell-Antwort gegen das Peptid stimuliert. Die Verwendung von exogenem β₂m als ein Vakzin-Hilfsstoff wird auch im U.S. Patent Nr. 5,733,550 (von Rock et al.) beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Shields et al., The Journal of Virology, Vol. 160 Nr. 5 und Björkman et al., Nature, Vol. 329, S. 506–512 betreffen MHC Klasse I Antigene.
Tumorzellen und Evasion des Immunsystems
Eine Immunität gegen Tumorzellen ist hauptsächlich zellvermittelt, was sowohl CD8⁺ cytotoxische T-Zellen als auch CD4⁺ T-Helfer-Zellen einschließt. Allerdings, trotz der Tatsache, daß Tumorzellen tumorspezifische Proteine exprimieren, die als Selbst-Antigene nicht durch das Immunsystem erkannt werden, entkommen sie häufig der Erkennung durch das Immunsystem. Es können eine Anzahl von Faktoren an der Fähigkeit der Tumorzellen teilnehmen, eine Immunerkennung zu vermeiden, einschließlich des Herunter-Regulierens der Expression von co-stimulatorischen Proteinen. Die TCR-Stimulierung in Abwesenheit von co-stimulatorischen Molekülen führt zu einem Versagen, die T-Zelle und die Induktion einer klonalen Anergie zu aktivieren. Folglich beugt eine Herunter-Regulierung der co-stimulatorischen Proteine in Tumorzellen einer normalen Aktivierung von T-Zellen vor, die an Tumorantigenen auf der Zelloberfläche binden und erlaubt es der Tumorzelle daher, der Erkennung zu entkommen.
Es haben einige Forschergruppen versucht, dieses Problem durch Entnehmen von Tumorzellen von einem Patienten, Bereitstellen von exogenen co-stimulatorischen Molekülen auf der Oberfläche der entnommenen Tumorzellen und anschließendem Wiedereinführen der Tumorzellen in den Patienten, so daß Immunerkennung stattfinden kann, zu adressieren. Zum Beispiel offenbart die Europäische Patentanmeldung Nr. 96302009.4 ein Verfahren, bei dem Tumorzellen von einem Patienten entnommen werden, transfiziert werden, um sowohl B7 als auch CD2 (einen Co-Rezeptor, der bei T-Zellenadhäsion und Aktivierung involviert ist) auf der Tumorzelloberfläche zu exprimieren und anschließend in dem Patienten wiedereingeführt werden. Es wird von den wieder eingeführten Zellen berichtet, eine breite immunologische Antwort gegen sowohl die wiedereingeführten transfizierten Tumorzellen als auch die nicht-transfizierten Tumorzellen innerhalb des Patientenkörpers zu stimulieren, was zu einer Tumorregression führt.
Sich eines alternativen Ansatzes zu diesem Problem annehmend, beschreiben Gerstmayer et al. (J Immunol. 158:4584-90, 1997) ein chimäres B7-Antikörperprotein, in dem der Antikörper für das erbB2 Proto-onkogene Produkt spezifisch ist. Dieses chimäre Molekül ist spezifisch auf der Oberfläche von erbB2 exprimierenden Tumorzellen lokalisiert und präsentiert den cytotoxischen T-Zellen die B7 co-stimulatorischen Moleküle, was zu einer erhöhten Proliferation von cytotoxischen T-Zellen führt. Folglich schlägt Gerstmayer et al. vor, (J. Immunol. 158:4584-90, 1997), daß Fusionsproteine, die einen Anti-Tumorantikörper und ein co-stimulatorisches Molekül umfassen, als Tumor-Immunotherapeutika nützlich sein können. Allerdings würde dieser Ansatz dievorherige Kenntnis und Charakterisierung von tumorspezifischen Antigenen, die auf den Tumorzellen jedes individuellen Patienten exprimiert werden und die Verwendung eines Antikörpers, der für die bestimmte Art der Tumorzellen spezifisch ist, voraussetzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung verwendet eine Form eines Beta-2-Mikroglobulins, wie beansprucht, um die Probleme zu adressieren, die mit Versagen des cytotoxischen T-Zell-Aktivierungsweg bei sowohl Vakzinierung als auch Tumortherapie assoziiert sind. Die beanspruchte Erfindung stellt auch Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die auf β₂m basieren, die breit anwendbar sind, um eine Expression jedes erwünschte Zielprotein auf der Oberfläche jeder Säugetierzelle zu erhalten.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Fusionsproteine bereit, die eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz umfassen, wobei die zweite Aminosäuresequent das β₂-Mikroglobulin hβ₂m S55V ist. Bei besonderen Anwendungen kann die erste Aminosäuresequenz ein co-stimulatorisches Protein, wie z.B. B7.1 oder B7.2 oder ein anderes Protein sein, das eine immunologische Aktivität aufweist, wie z.B. ein Cytokin, ein Integrin oder ein zelluläres Adhäsionsmolekül. Beispiele von solchen Proteinen schließen Interleukin (z.B. IL-2, IL-12), Granulocyten-Macrophagen koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), Lymphozyten Funktions-assoziierte Proteine (z.B. LFA-1, LFA-3) und intrazelluläre Adhäsionsmoleküle (z.B. ICAM-1, ICAM-2) ein. In anderen Ausführungsformen kann die erste Aminosäure des Fusionsproteins jedes Protein sein, von dem erwünscht ist, daß es auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert wird. Es wird gezeigt, daß diese Fusionsproteine ein wirksamer Weg sind, um ein erwünschtes Protein, wie z.B. B7, auf die äußere Membran einer Zelle abzuzielen. ("B7" wird generisch verwendet, um entweder auf B7.1 oder B7.2 hinzuweisen.)
Im Hinblick auf die Tumortherapie wird gezeigt, daß ein Exprimieren eines Fusionsproteins auf der Oberfläche einer Tumorzelle, das ein β₂m zusammen mit einem co-stimulatorischen Protein umfaßt, die Immunantwort eines Tiers auf die Tumorzelle signifikant erhöhen kann. In einem Beispiel wird ein Fusionsprotein, umfassend das hβ₂m zusammen mit dem co-stimulatorischen Protein B7 (genannt B7-β₂m) auf die Oberfläche der Tumorzellen abgezielt, so daß die Tumorzellen das B7-β₂m-Fusionsprotein den T-Zellen präsentieren. Diese Zellen werden anschließen abgeschwächt und in Mäuse eingeführt. Von T-Zellen, die aus diesen Mäusen entfernt wurden, wurde gezeigt, daß diese signifikant wirksamer gegen die gleiche Art von Tumorzellen ware, als äquivalente Zellen von Mäusen, die mit Tumorzellen behandelt wurden, die nur β₂m präsentierten.
Die durch die Erfindung bereitgestellten β₂m-Fusionsproteine weisen eine breite Anwendung auf, indem sie nützlich sind, jedes erwünschte Protein auf die äußere Membran einer Zelle zu abzuzielen. Diese Fusionsproteine können auf die Oberfläche einer Zelle in etlichen Wegen abgezielt werden. In einem Ansatz werden Zellen, die MHC-I exprimieren, einfach mit einer Präparation des Fusionsproteins inkubiert, was zum Einschließen des Fusionsproteins auf der Zelloberfläche fährt. Alternativ kann das Fusionsprotein in die Zelle eingeführt werden, so daß es in den MHC I-Weg eingeschlossen wird. In einem anderen Ansatz wird ein Nukleinsäwemolekül, das für das Fusionsprotein kodiert, durch Transformation in eine Zelle eingeführt. Die Expression dieses Nukleinsäuremoleküls führt dazu, daß das Fusionsprotein innerhalb der Zelle produziert wird und auf die Zellmembran exportiert wird. Wo das Fusionsprotein in das Cytosol zum Export auf die äußere Membran eingeführt wird oder wo es durch ein Nukleinsäuremolekül innerhalb der Zelle exprimiert wird, ist es wünschenswert, ein Signalpeptid am N-Terminus des Fusionspeptids einzuschließen, so daß das Fusionsprotein zu der äußeren Membran der Zelle transportiert wird. Zu diesem Zweck kann das β₂m Signalpeptid verwendet werden. In all diesen Ansätzen ist das Ergebnis, daß das β₂m Fusionsprotein auf der Oberfläche der Zelle präsentiert wird.
In einer Ausführungsform schließt die Erfindung Nukleinsäuremoleküle ein, die für die offenbarten Fusionsproteine codieren, sowie Nukleinsäurevektoren, die solche Nukleinsäuremo leküle umfassen. Transgene Zellen, die diese Nukleinsäuremoleküle umfassen, werden auch durch die Erfindung bereitgestellt.
Verfahren zum Exprimieren des beanspruchten β₂m Fusionsproteins auf der Oberfläche einer Zelle werden durch die Erfindung bereitgestellt. Solche Verfahren schließen in Kontakt bringen einer Zelle mit einem Fusionsprotein, umfassend eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz, wobei die zweite Aminosäuresequenz ein β₂m ist, ein. Ein alternatives Verfahren, das durch die Erfindung bereitgestellt wird, umfaßt Transformieren der Zelle mit einem Nukleinsäuremolekül, das für so ein Fusionsprotein codiert.
Die Erfindung stellt weiter die Verwendung der beanspruchten Proteine in Verfahren zum Verstärken der Immunantwort eines Tieres auf ein Antigen, das auf der Oberfläche einer Zelle präsentiert wird, bereit. Solche Verfahren umfassen ein Bereitstellen eines β₂m Fusionsproteins auf der Oberfläche der Zelle und ein Verabreichen der Zelle dem Säugetier. Bei solchen Anwendungen umfaßt das Fusionsprotein vorzugsweise β₂m, das an ein co-stimulierendes Protein, wie z.B. B7 oder ein anderes Protein fusioniert ist, das eine immunologische Aktivität aufweist. Exprimieren des β₂m Fusionsproteins auf der Zelloberfläche kann durch In Kontakt bringen der Zelle mit dem Fusionsprotein oder Transformieren der Zelle mit einem Nukleinsäuremolekül, das für das Protein codiert, erreicht werden. Diese Verfahren können für die Behandlung von Tumoren angewendet werden; in solchen Behandlungen ist das Antigen gegen das eine erhöhte Immunantwort erwünscht ist, ein Tumorantigen und die Zelle, die das Antigen trägt, eine Tumorzelle. Die Tumorzelle kann aus dem Körper eines Säugetiers, das einen Tumor aufweist, entnommen werden oder kann in vitro von einer sich vermehrenden Tumorzellinie abgeleitet werden. Das β₂m Fusionsprotein wird in die Tumorzelle eingeführt (z.B. durch Inkubation der Tumorzelle mit dem Protein oder durch Transformation der Tumorzelle mit einer Nukleinsäure, die für das Fusionsprotein kodiert), so daß die Tumorzelle das Fusionsprotein auf ihrer Oberfläche präsentiert. Die Tumorzelle, die das Fusionsprotein trägt, wird anschließend einem Säugetier verabreicht. In bestimmten Ausführungsformen kann die Tumorzelle abgeschwächt werden, bevor sie dem Säugetier verabreicht wird. Solche Abschwächung kann mittels Standardmitteln, wie z.B. radioaktive Strahlung, Hitze oder chemische Behandlung, erreicht werden. Sobald im Körper des Säugetiers, wird die Kombination von Tumorartigenen und dem β₂m-Fusionsprotein auf der Oberfläche der Tumorzellen durch CD8⁺ T-Zellen erkannt, was zu T-Zell-Aktivierung, Proliferation und dadurch einer erhöhten cytolytischen T-Zell-Antwort gegen sowohl die eingeführten Tumorzellen und andere Tumorzellen in dem Säugetier führt, die das gleiche Tumorantigen exprimieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch modifizierte humane β₂m (hβ₂m) Proteine bereit, die eine erhöhte Affinität für MHC-I aufweisen. Von solchen Proteinen wurde gezeigt, daß sie an die Alphakette von MHC I mit höherer Affinität als Wild-Typ hβ₂m binden und daß sie eine T-Zellerkennung von APCs erhöhen, die modifiziertes hβ₂m tragen. In bestimmten Ausführungsformen weisen die modifizierten hβ₂m Proteine einen Valin-Rest an Position 55 anstelle des Serinrests auf, der in der reifen Form des natürlich vorkommendem hβ₂m (d.h. Wild-Typ) gefunden wird. Solche modifizierten hβ₂m Proteine werden als hβ₂m S55V bezeichnet.
hβ₂m S55V ist als ein Vakzinhilfsstoff anstelle des Wild-Typ hβ₂m brauchbar. Folglich ist ein Aspekt der Erfindung eine Vakzin-Präparation, die wenigstens ein Antigen und hβ₂m S55V umfaßt. hβ₂m S55V kann auch anstelle von Wild-Typ hβ₂m bei den oben diskutierten Fusionsproteinen verwendet werden. Zusätzlich können β₂m-Fusionsproteine auch in solchen Vakzinpräparationen verwendet werden, die entweder ein Wild-Typs β₂m, oder im Falle von hβ₂m, hβ₂m S55V verwenden.
Sequenzprotokoll
Die Nuklein- und Aminosäuresequenzen, die im Sequenzprotokoll aufgelistet sind, werden mittels Standard-Buchstabenabkürzungen für Nukleotidbasen und dem Drei-Buchstaben-Code für Aminosäuren gezeigt. Es wird nur ein Strang jeder Nukleinsäuresequenz gezeigt, aber es ist selbstverständlich, daß der komplementäre Strang durch jede Bezugnahme des gezeigten Strangs eingeschlossen wird.

SEQ ID Nr. 1 zeigt die Aminosäuresequenz des Wild-Typ (natürlich vorkommenden) hβ₂m.
SEQ ID Nr. 2 zeigt die Aminosäuresequenz des B7-β₂m-Fusionsproteins (umfassend das B7.2 co-stimulatorische Molekül).
SEQ ID Nr. 3 zeigt die Aminosäuresequenz des B7-β₂m-Fusionsproteins, das die β₂m Signalsequenz aufweist, die an den N-Terminus der B7-Domäne angegliedert ist.
SEQ ID Nr. 4 bis 7 zeigen Primer, die zur Konstruktion des hβ₂m S55V verwendet werden.
SEQ ID Nr. 8 und 9 zeigen Primer, die zum Amplifizieren, des B7.2-Proteins verwendet werden.
SEQ ID Nr. 10 zeigt die Aminosäuresequenz des reifen hβ₂m S55V.
SEQ ID Nr. 11 und 12 zeigen die Aminosäure-Linker-Sequenzen, die zwischen den zwei Domänen eines Fusionsproteins verwendet werden können.
SEQ ID Nr. 13 und 14 zeigen Aminosäuresequenzen von Signalpeptiden, die zur Richtung, der Expression eines Proteins in einer Zelle verwendet werden können.
SEQ ID Nr. 15 zeigt die Aminosäuresequenz für einen c-myc tag.
SEQ ID Nr. 16 bis 20 zeigt die Aminosäuresequenzen für Peptide, die in dem HLA-Stabilisierungstest verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden (z.B. Wild-Typ) β₂m; das Signalpeptid ist doppelt unterstrichen und die Aminosäurenumerierung beginnt an dem Isoleucin-Rest, der der erste Rest des reifen Proteins ist. Das Serin an Position 55, das in S55V durch Valin ausgetauscht ist, wird in Fettdruck gezeigt.
2 ist eine schematische Darstellung des B7.2-β₂ Mikroglobulinfusionspeptidkonstrukts.
3 zeigt die Sequenz des B7.2-β₂m Fusionspeptids. Rest 1 ist ein Methionin, das zur Expression nötig ist, die Reste 2 bis 220 sind der extrazelluläre Teil von murinem B7-2, die Reste 221 bis 225 (Kursivschrift) sind eine Sequenz, die durch die Einführung einer Restriktionsstelle in die Nukleinsäuresequenz erzeugt werden, die Reste 226 bis 240 (unterstrichen) sind die Verknüpfungs-("Linker")-Sequenz und die Reste 241 bis 339 sind die reife Form des β₂m.
4 zeigt die Sequenz eines B7-β₂m Fusionspeptids, das die hβ₂m-Signalsequenz aufweist (Reste 1 bis 20, doppelt unterstrichen). Die Reste 21 bis 223 sind der extrazelluläre Teil von murinem B7-2, die Reste 240 bis 244 (Kursivschrift) sind eine Sequenz, die durch die Einführung einer Restriktionsstelle in die Nukleinsäurese quenz erzeugt werden, die Reste 245 bis 259 (unterstrichen) sind die Linker-Sequenz und die Reste 260 bis 358 sind die reife Form von β₂m.
5 ist ein Graph, der den Effekt von Plättchen-gebundenem B7-β₂m auf die BALB/c Milz-T-Zell-Proliferation bei Anwesenheit einer suboptimalen Konzentration an löslichem 2C11 zeigt.
6 ist ein Graph, der die Wirksamkeit von P815 "Antigen-primed" T-Zellen (die mit P815-Zellen, die nur P815 Antigene oder P815 Antigene und entweder B7-β₂m oder β₂m präsentieren, geprimed sind), P815-Tumorzellen zu lysieren, zeigt.
7 ist ein Graph, der die Stabilisierung von Zelloberflächen HLA-A1(a), -A2(b), und -A3(c) durch mutiertes β₂m und Peptid verdeutlicht. Alle Werte sind als mittlere Fluoreszenzintensität angegeben.
8 zeigt die Inhibierung der myc-β₂m-Bindung durch S55V und nβ₂m auf Zelloberflächen HLA-A1(a), -A2(b) und -A3(c). Alle Werte sind als mittlere Fluoreszenzintensität angegeben.
9 zeigt, daß die S55V-Mutante die CTL-Erkennung besser als Wild-Typ nβ₂m in sowohl Hmy2-C1R-A2 (a) und Hmy2.C1R-A3 (b) Zielzellen erhöht.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Abkürzungen und Definitionen
Um die Überprüfung und das Verständnis der Erfindung zu erleichtern, wird die folgende Erklärung von Abkürzungen und Definitionen von Ausdrücken bereitgestellt:
β₂m: Beta-2-Mikroglobulin. Dieser Ausdruck umfaßt jedes Säugetier-beta-2 Mikroglobulinprotein, einschließlich humane und murine Beta-2-Mikroglobuline. Der Ausdruck "hβ₂m" betrifft spezifisch humanes Beta-2-Mikroglobulin. cDNAs und Gene, die für Säugetier-β₂ms kodieren, sind im Stand der Technik gut bekannt, sowie die entsprechenden β₂m-Sequenzen. Beispiele schließen solche Sequenzen ein, die in Parnes and Seidman (Cell 29:661-9, 1982), Gates et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:554-8, 1981) (murin); Suggs et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6613-7, 1981), Guessow et al. (J. Immunol. 139:3132-8, 1987), Cunningham et al. (Biochem. 12:4811-22, 1973) (Mensch); und Ellis et al. (Immunogenetics 38:310, 1993) (Rinder) beschrieben werden. Diese Sequenzen sind auch in der GenBank unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html verfügbar.
Der Ausdruck "Wild-Typ β₂m" und "natürlich vorkommendes β₂m" betrifft das β₂m-Protein, das aus der bestimmten in Frage kommenden Säugetierspezies isoliert wird. Zum Beispiel betrifft Wild-Typ β₂m ein Beta-2-Mikroglobulinprotein, das eine Aminosäuresequenz von hβ₂m aufweist, das aus einer humanen Quelle (z.B. Serum) isoliert wurde. Folglich ist ein Beispiel eines Wild-Typ β₂m das hβ₂m-Protein, das in Cunningham et al. (Biochem. 12:4881-1973) offenbart wird und das auch in der GenBank unter der Zugangsnummer A90371 erhältlich ist und in 1 und SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird. Der Ausdruck "modifiziertes β₂m" betrifft ein Beta-2-Mikroglobulinprotein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die von einer Wild-Typ β₂m-Aminosäuresequenz modifiziert wurde. Zum Beispiel ist hβ₂m S55V eine mutierte Form von hβ₂m, in dem der Serinrest, der an Position 55 im reifen Wild-Typ hβ₂m (siehe 1 und SEQ ID Nr. 1) vorkommt, durch einem Valinrest ersetzt wird. Der Ausdruck hβ₂m S55V umfaßt Formen von hβ₂m, die sich vom Wild-Typ hβ₂m durch Substitution von Serin für ein Valin an Position 55 unterscheiden, sowie Formen von hβ₂m, die die S55V-Modifikation und zusätzliche Aminosäuresequenzmodifikationen aufweisen.
Fusionsprotein: Ein Protein, umfassend zwei Aminosäuresequenzen, die in der Natur nicht zusammen verknüpft gefunden werden. Der Ausdruck "β₂m-Fusionsprotein" betrifft ein Protein, das eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz umfaßt, wobei die zweite Aminosäuresequenz ein β₂-Mikroglobulin ist. Die β₂m Aminosäuresequenz und die erste Aminosäuresequenz können alternativ als Domänen des Fusionsproteins bezeichnet werden. Folglich stellt die vorliegende Erfindung zum Beispiel Fusionsproteine bereit, umfassend erste und zweite Domänen, wobei die zweite Domäne ein β₂m-Protein ist. Die Brücke zwischen der ersten und zweiten Domäne des Fusionsproteins ist üblicherweise, aber nicht notwendigerweise, eine Peptidverknüpfung. Bei bestimmten β₂m-Fusionsproteinen können die zwei Domänen mittels eines Verknüpfungspeptids verbunden sein. In β₂m-Fusionsproteinen ist die erste Domäne vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, mit dem N-Terminus der β₂m-Domäne verknüpft.
Diese Fusionsproteine können auch durch die Formel X-Y dargestellt werden, wobei X ein Protein ist, wie z.B. ein co-stimulatorisches Protein, und Y ein β₂m-Protein ist. In einer weiteren Ausführungsform des offenbarten Fusionsproteins kann eine Signalpeptidsequenz an den N-Terminus des ersten Proteins verknüpft vorliegen. So ein dreiteiliges Protein kann folglich als S-X-Y dargestellt werden, wobei S das Signalpeptid ist, X ein Protein ist, wie z.B. ein co- stimulatorisches Protein und X ein β₂m-Protein ist. Wo das Fusionsprotein in einer eukaryontischen Zelle exprimiert wird, ist das Signalpeptid vorzugsweise ein eukaryontisches Signalpeptid, das eine abgezielte Expression des Fusionsproteins auf der Zellmembran bewirkt. Während eine Anzahl von Signalpeptiden zu diesem Zweck verwendet werden kann, ist das bevorzugte Signalpeptid das β₂m-Signalpeptid (in 1 gezeigt). Wo das Fusionsprotein in einer prokaryontischen Zelle exprimiert wird, ist das Signalpeptid vorzugsweise ein prokaryontisches Signalpeptid, das zu der Sekretion des Fusionspeptids in das Wachstumsmedium führt, wo es leicht geerntet und gereinigt werden kann. Geeignete prokaryontische Signalpeptide sind im Stand der Technik gut bekannt. Wo das X-Protein und β₂m durch eine Peptidbrücke verknüpft sind, kann das Fusionsprotein als X-L-Y dargestellt werden oder falls ein Signalpeptid vorhanden ist, als S-X-L-Y, wobei L die Peptidbrücke ist.
Bestimmte β₂m-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung schließen als ihre β₂m-Komponente das hβ₂m S55V Protein ein. Bestimmte Reste in der β₂m-Komponente solcher Fusionsproteine können durch die Zahl der Reste, die sie von dem ersten Rest des reifen hβ₂m (was Isoleucin ist) entfernt sind, bezeichnet werden. Folglich kann die β₂m-Komponente eines Fusionsproteins, das hβ₂m S55V einschließt, als ein humanes β₂-Mikroglobulin bezeichnet werden, das ein Valin an Position 55 aufweist.
Transformiert: Eine transformierte Zelle ist eine Zelle, in der ein Nukleinsäuremolekül durch molekularbiologische Techniken eingeführt wurde. Wie hier verwendet, umfaßt der Ausdruck Transformation alle Techniken, durch die ein Nukleinsäuremolekül in solch eine Zelle eingeführt werden kann, einschließlich Transfektion mit viralen Vektoren, Transformation mit Plasmidvektoren und Einführung von nackter DNA durch Elektroporation, Lipofektion und Partikel Gun-Beschleunigung.
Isoliert: Eine "isolierte" biologische Komponente (wie z. B. eine Nukleinsäure oder ein Protein) wurde im wesentlichen von anderen biologischen Komponenten in der Zelle des Organismus, in dem die Komponente natürlicherweise vorkommt, z.B. andere chromosomale oder extrachromosomale DNA und RNA und Proteine, getrennt und gereinigt. Nukleinsäuren und Proteine, die "isoliert" wurden, schließen folglich Nukleinsäuren und Proteine ein, die durch Standardreinigungsmethoden gereinigt wurden. Der Ausdruck umfaßt auch Nukleinsäuren und Proteine, die durch rekombinante Expression in einer Wirtszelle hergestellt werden, sowie chemisch synthetisierte Nukleinsäuren.
Vektor: Ein Nukleinsäuremolekül wie in eine Wirtszelle eingeführt, wodurch eine transformierte Wirtszelle hergestellt wird. Ein Vektor kann Nukleinsäuresequenzen einschließen, die es ihm erlauben, sich in der Wirtszelle zu replizieren, wie z.B. einen Replikations-Ursprung. Ein Vektor kann auch eines oder mehrere auswählbare Markergene und andere genetische Elemente einschließen, wie im Stand der Technik bekannt.
Gereinigt: Der Ausdruck gereinigt erfordert nicht absolute Reinheit, er ist eher als ein relativer Ausdruck gedacht. Folglich ist z.B. ein gereinigtes β₂m-Proteinpräparat eines, in dem das β₂m Protein reiner als das Protein in seiner natürlichen Umgebung innerhalb einer Zelle ist. Vorzugsweise wird ein Präparat eines Proteinpräparats so gereinigt, daß das Protein wenigstens 50 % des Gesamtproteininhalts des Präparats umfaßt.
Funktionsfähig verknüpft: Eine erste Nukleinsäuresequenz ist mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verknüpft, wenn die erste Nukleinsäuresequenz in einer funktionalen Beziehung mit der zweiten Nukleinsäuresequenz plaziert wird. Zum Beispiel wird ein Promoter funktionsfähig an eine kodierende Sequenz verknüpft, wenn der Promoter die Transkription oder Expression der kodierenden Sequenz beeinflußt. Im allgemeinen sind funktionsfähig verknüpfte DNA-Sequenzen fortlaufend und, wo notwendig, um zwei Proteinkodierende Regionen zu verbinden, in dem gleichen Leserahmen.
Rekombinant: Eine rekombinante Nukleinsäure ist eine, die eine Sequenz aufweist, die nicht natürlich vorkommt oder eine Sequenz aufweist, die durch künstliche Kombination von zwei anderweitig getrennten Segmenten einer Sequenz hergestellt wird. Diese künstliche Kombination wird häufig durch chemische Synthese oder, allgemein üblicher, durch die künstliche Manipulation von isolierten Segmenten der Nukleinsäuren, z.B. durch Gentechnik, erhalten.
Tumorzellen: Eine neoplastische Zelle, die entweder maligne oder nicht-maligne sein kann. Tumorzellen schließen Zellen von sowohl soliden als auch nicht-soliden Tumoren (wie z.B. hämatologische Malignitäten) ein. Tumore können Muttergeschwulste sein, die aus einem bestimmten Organ abstammen (wie z.B. Brust, Prostata, Blase oder Lunge). Tumore gleichen Gewebetyps können in Tumore unterschiedlicher Unterarten eingeteilt werden (ein klassisches Beispiel sind bronchogene Karzinome (Lungentumore), die ein Adenokarzinom, kleine Zelle-, schwammartige Zelle- oder großer Zelltumor sein können).
Säugetier: Dieser Ausdruck schließt sowohl humane als auch nicht-humane Säugetiere ein. Ähnlich schließt der Ausdruck "Patient" sowohl humane als auch tierische Subjekte ein.
Herstellung und Verwendung von β₂m-Fusionsproteinen
In der vorliegenden Erfindung werden, soweit nicht anders beschrieben, Standardmolekularbiologische, biochemische und immunologische Methoden verwendet. Solche Standardmethoden sind beschrieben in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989), Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley-Intersciences, 1987), Innis et al. (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (eds.), Academic Press, Inc., San Diego, Kalifornien, 1990) und "Harlow and Lane" (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988). Methoden zum Herstellen von Nukleinsäuresequenzen, die Fusionsproteine exprimieren, sowie Methoden zum Exprimieren und Reinigen von Fusionsproteinen sind im Stand der Technik gut bekannt und werden z.B. in den U.S. Patenten Nr. 5,580,756 und 5,698,679 beschrieben. Die folgenden Absätze werden als Leitlinie bereitgestellt.
Standardtechniken können verwendet werden, um genetische Konstrukte herzustellen, die β₂m-Fusionsproteine exprimieren, einschließlich Verdauung mit Restriktionsendonukleasen, Ligation und die Polymerasekettenreaktion. Jedes Säugetiergen oder cDNA, die für β₂m kodieren, können als Quelle der β₂m kodierenden Sequenz verwendet werden. Solche Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt und in öffentlichen Datenbanken, wie z.B. GenBank, verfügbar. Als Beispiel wird die Sequenz der humanen β₂m cDNA in Guessow et al. (J. Immunol. 139:3132-8, 1987 GenBank: Zugangsnummer: M 17986) beschrieben. Besonders schließt diese cDNA-Sequenz Regionen ein, die für das Signalpeptid hβ₂m kodiert (s. 1).
In gleicher Weise sind Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die als die zweite Domäne des Fusionsproteins ausgewählt werden können, im Stand der Technik gut bekannt. Während die Auswahl der zweiten Proteindomäne üblicherweise ein co-stimulatorisches Protein oder ein Protein sein wird, das irgendeine andere immunologische Aktivität aufweist, können Fusionsproteine erzeugt werden, die β₂m als die zweite Domäne verwenden und jedes andere Protein, von dem gewünscht wird, das es auf die Oberfläche einer Zelle abgeliefert wird, als die erste Domäne. Beispiele von cDNAs, die für Proteine kodieren, die costimulatorische Aktivität aufweisen, schließen die ein, die für humanes B7.1 (Freeman et al., 1989, J. Immunol. 143:2714-22, GenBank, Zugangsnummer: M27533), B7.2 (Azuma et al., 1993, Nature 366:76-9, GenBank, Zugangsnummer: L25259), LFA-3 (Wallner et al., 1987, J. Exp. Med. 166:923-32, GenBank, Zugangsnummer Y00636) und ICAM-1 (Simmons et al., 1988, Nature 331;624-7), GenBank, Zugangsnummer X06990) kodieren. Beispiele von anderen immunologisch aktiven Proteinen schließen ICAM-3 (Fawcett et al., 1992, Nature 360:481-4, GenBank, Zugangsnummer 550015), VCAM-1 (Damle et al., 1992, J. Immunol. 148;1985-92), CD59 (Menu et al., 1994, J. Immunol. 153:2444-56), CD40 (Hancock et al., 1996, Proc Natl. Acad. Sci USA 93:13967-72) und GM-CSF (Takashi et al., JP 1991155798-A, GenBank, Zugangsnummer E02975) ein. Proteine, die andere Aktivitäten aufweisen, wie z.B. Tumornekrosefaktor (TNF, Masaaki et al., JP 1985185799 , GenBank, Zugangsnummer E00423) können auch als die erste Domäne in dem Fusionsprotein verwendet werden. Als Beispiel können Proteine, die Apoptose (wie z.B. TNF) oder Anergie induzieren, verwendet werden, um bestimmte Klassen von antigenspezifischen aktivierten T-Zellen zu zerstören. Folglich können Myelin-basisches Protein (MBP)-spezifische autoreaktive T-Zellen, die an der Stelle der Entzündung bei Multiple Sklerose-Patienten gefunden werden, durch Einführen von Zielzellen in den Patienten, die MBP exprimieren und die auch ein TNF-β₂m Fusionsprotein präsentieren, zerstört werden.
cDNA-Klone, die für β₂m und das zweite Protein kodieren, können wie in den zitierten Referenzen oder durch PCR-Amplifikation aus mRNA (oder cDNA-Banken) von Zellen, die das bestimmte Protein exprimieren, erhalten werden. Die cDNA-Amplifikation wird, wie durch Innis et al. beschrieben (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (eds), Academic Press, Inc., San Diego, Kalifornien, 1990) mittels Primer durchgeführt, die so aufgebaut sind, um die erwünschten Teile der cDNA zu amplifizieren. Zum Beispiel können cDNA Primer so aufgebaut werden, um nur den Teil der β₂m cDNA zu amplifizieren, der für die reife Form von β₂m kodiert. PCR kann auch verwendet werden, um die amplifizierten Fragmente für die Ligation anzupassen.
Zusätzlich zu einer β₂m Domäne und einer zweiten Proteindomäne (z.B. B7) können β₂m Fusionsproteine auch zusätzliche Elemente einschließen, wie z.B. eine Linkersequenz zwischen der β₂m Domäne und der zweiten Domäne und ein Signalpeptid. Die Linkersequenz ist üblicherweise zwischen 10 und 25 Aminosäuren lang und dient zum Bereitstellen einer Rota tions-Freiheit im Fusionskonstrukt, wobei die entsprechende Konformationsfaltung der zwei angrenzenden Proteindomänen erhöht wird. Solche Linkersequenzen sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen den Glycin(4)-Serinspacer (GGGGS x3, SEQ ID Nr. 11) ein, der von Chaudhary et al. (Nature 339:394-397, 1989) beschrieben wird. Eine Version dieses Linkers, in dem die dritte Wiederholung des Verknüpfungsmotivs zu GGGAS (SEQ ID Nr. 12) modifiziert ist, wird auch in 3 und in SEQ ID Nr. 2 gezeigt. Um die β₂m-Fusionsproteine herzustellen, können auch andere Verknüpfungssequenzen verwendet werden.
Signalpeptide dienen zur gerichteten Expression eines bestimmten Proteins an eine bestimmte Stelle in der Zelle. Abhängig davon, ob entweder das Fusionsprotein in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle exprimiert werden soll, wird ein prokaryontisches oder eukaryontisches Signalpeptid ausgewählt. Prokaryontische Singalpeptide, die die direkte Sekretion von Peptiden in das Medium richten, können besonders nützlich sein, wenn große Mengen von Fusionspeptid hergestellt werden. Beispiele von solchen Signalsequenzen schließen die prokaryontische Signalsequenz des Pectatlyasegens pelB (Power et al., 1992, Gene 113:95-9,
(KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA; SEQ ID Nr. 13)) und das äußere Membranprotein ompT (Ouzzine et al., 1994, Febs Lett 339:195-9 (MRAKLLGIVLTPIAISFAST, SEQ ID Nr. 14)) ein. Eukaryontische Signalpeptide, die die Expression eines Peptids auf der Zelloberfläche regeln, sind nützlich, wo das Fusionsprotein auf der Oberfläche der Zelle präsentiert werden soll. Das Signalpeptid von β₂m (in 3 und SEQ ID Nr. 2 gezeigt) ist für diesem Zweck besonders geeignet.
In ihrer grundlegendsten Form werden Nukleinsäuren, die für β₂m-Fusionsproteine kodieren, x-y umfassen, worin x eine Nukleinsäuresequenz ist, die für die erste Proteindomäne (z.B. B7) kodiert und y eine Nukleinsäuresequenz ist, die für die β₂m-Proteindomäne codiert. Wo eine Linkersequenz einzuführen ist, kann die Nukleinsäure als x-1-y dargestellt werden, wobei 1 eine Nukleinsäuresequenz ist, die für das Linkerpeptid codiert. Wo eine Signalsequenz einzuführen ist, kann die Nukleinsäure als s-x-1-y dargestellt werden, wobei s eine Nukleinsäuresequenz ist, die für das Signalpeptid kodiert. Vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, ist die relative Orientierung der Nukleinsäuresequenz so, daß in dem kodierten Fusionsprotein das N-terminale Ende des β₂m-Proteins mit dem C-terminalen Ende der zweiten Proteindomäne verknüpft ist. In allen Fällen sind die verschiedenen Nukleinsäuresequenzen, die das β₂m-Fusionsproteinkonstrukt umfassen (z.B. s, 1, x und y) funktionsfähig verknüpft, so daß die Elemente in einem einzelnen Leserahmen vorbunden sind.
Nukleinsäurekonstrukte, die Fusionsproteine exprimieren, können auch regulatorische Elemente einschließen, wie z.B. Promotoren, Enhancer und 3'-regulatorische Regionen, wobei deren Auswahl von diesen basierend, auf der Art der Zelle bestimmt werden, in der das Protein zu exprimieren ist. Die Konstrukte werden in einen Vektor eingeführt, der geeignet ist, das β₂m-Fusionsprotein in dem ausgewählten Zelltyp zu exprimieren.
Ein ausgewähltes β₂m-Fusionsprotein kann durch Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystem erhalten werden, von denen viele im Stand der Technik bekannt sind. Heterologe Proteine können in prokaryontischen Zellen durch Plazieren eines starken, regulierten Promotors und einer wirksamen ribosomalen Bindungsstelle stromaufwärts des β₂m-Fusionsproteinkonstrukts produziert werden. Geeignete Promotorsequenzen schließen Beta-Lactamase, Tryptophan (trp) und Lambda-abgeleitete P_L-Promotoren ein. Prokaryontische Expressionsvektoren und Expressionssysteme, die zum Produzieren hoher Spiegel an Protein-bakteriellen Zellen geeignet sind, sind kommerziell erhältlich und schließen das pBAD, P_L und Superlinkerexpressionssysteme ein, die durch Invitrogen (Carlsbad, CA) hergestellt werden, und das pMAL-Expressionssystem, das durch New England Biolabs (Beverly, MA), hergestellt wird. Zusätzlich sind Methoden und Plasmidvektoren zum Produzieren von heterologen Proteinen in Bakterien in Sambrook et al. beschrieben (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Häufig werden Proteine, die in hohen Spiegeln exprimiert werden, in unlöslichen Einschlußkörpern gefunden; Methoden, um Proteine aus diesen Aggregaten zu extrahieren, werden durch Sambrook et al. beschrieben (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Kapitel 17). Vektoren, die zum Produzieren von intakten nativen Proteinen geeignet sind, schließen pKC30 (Shimatake and Rosenberg, 1981, Nature 292:128), pKK177-3 (Amann and Brosius, 1985, Gene 40:183) und pET-3 (Studiar and Moffatt, 1986, J. Mol. Biol. 189:113) ein. Geeignete prokaryontische Zellen zur Expression von großen Mengen an β₂m Fusionsproteinen schließen Escherichia coli und Bacillus subtilis ein.
Eukaryontische Zellen, wie z.B. Chinese Hamster Ovary- (CHO), Affennieren- (COS), HeLa-Spodoptera frugiperda- und Saccharomyces cerivisiae-Zellen können auch verwendet werden, um β₂m Fusionsproteine zu exprimieren. Regulatorische Regionen, die zur Verwendung in diesen Zellen geeignet sind, schließen für Säugetierzellen virale Promotoren, wie z.B. solche von CMV, Adenovirus und SV40 und für Hefezellen den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase and Alkoholdehydrogenase ein. Eukaryontische Zellexpressionssysteme sind auch kommerziell erhältlich und schließen Pichia pastoris, Drosophila, Baculovirus und das Sindbis Expressionssystem, das durch Invitrogen hergestellt wird (Carlsbad, CA), ein.
Der Transfer von DNA in eukaryontische, insbesondere humane oder andere Säugetierzellen ist mittlerweile eine herkömmliche Technik. Die Vektoren werden in die Empfängerzellen als reine DNA (Transfektion) durch z.B. Präzipitation mit Kalziumphosphat (Graham and vander Eb, 1973, Virology 52:466) oder Strontiumphosphat (Brash et al., 1987, Mol Cell Biol. 7:2013), Elektroporation (Neumann et al., 1982, EMBO J 1:841), Lipofektion (Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413), DEAE Dextran (McCuthan et al., 1968, J. Natl. Cancer Inst. 41:351), Mikroinjektion (Mueller et al., 1978, Cell 15:579), Protoplastenfusion (Schafner, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163-7) oder Pelletkanonen (Klein et al., 1987, Nature 327:70) eingeführt. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle durch Infektion mit Virusvektoren eingeführt werden. Es sind Systeme entwickelt worden, die z.B. Retroviren (Bernstein et al., 1985, Gen. Engr'g 7:235), Adenoviren (Ahmad et al., 1968, J. Virol. 57:267) oder Herpesvirus (Spaete et al., 1982, Cell 30:295) verwenden.
Das β₂m-Fusionsprotein, das in Säugetierzellen produziert wird, kann im Anschluß an die Freisetzung des Proteins in den Überstand extrahiert werden und kann mittels einer Immunoaffinitätssäule gereinigt werden, die mittels anti-β₂m Antikörpern hergestellt wird. Alternativ kann das β₂m-Infusionsprotein als ein chimäres Protein mit z.B. β-Globulin exprimiert werden. Danach wird ein Antikörper gegen β-Globulin verwendet, um das chimäre Protein zu reinigen. Anschließend werden entsprechende Proteaseschnittstellen, die zwischen dem β-Globulin-Gen und der Nukleinsäuresequenz, die das β₂m-Fusionsprotein kodiert, konstruiert werden, verwendet, um die zwei Polypeptidfragmente nach Translation voneinander zu trennen. Ein nützlicher Expressionsvektor zur Erzeugung von β-Globulin chimärer Proteine ist pSG5 (Stratagene).
Als Beispiel kann eine cDNA die für ein β₂m Fusionsprotein mit einem N-terminalen Methionin zur Initiierung der Translation, kodiert, in pET2I-d (Novagen) subkloniert werden, was das rekombinante Protein in Einschlußkörper richtet. Alternativ können kommerziell er hältliche Insektenzellexpressionssysteme, wie z.B. das Baculovirus Expression Vektor System von Pharmingen (San Diego, CA), für die kombinierten Expression und Faltung von β₂m und β₂m Fusionsproteinen verwendet werden, wobei die exprimierten Proteine nur anschließende Reinigung benötigen.
Proteine, die wie oben beschrieben exprimiert werden, können durch eine Immunaffinitätssäule weiter gereinigt werden und direkt zur Behandlung von Säugetierzellen verwendet werden. Alternativ kann die Expression eines β₂m Fusionsproteins in einer Säugetierzelle durch Einführen eines Vektors erhalten werden, der eine Nukleinsäuresequenz in die Zelle trägt, die für das Protein kodiert. Nukleinsäuremoleküle, die für β₂m Fusionsproteine kodieren, tragen eine Signalsequenz, wie z.B. die β₂m Signalsequenz, die für diesen Zweck besonders bevorzugt ist.
In einem Aspekt der Erfindung werden die beanspruchten β₂m Fusionsproteine als Immuntherapeutika verwendet, und die Säugetierzelle ist eine Tumorzelle. Bei vielen Krebspatienten entkommen Tumorzellen der Immunerkennung durch Herabregulierung von MHC und/oder co-stimulatorischer Molekülexpression. Entsprechend ist eine Behandlungsmethode, die früher vorgeschlagen wurde, ein Entnehmen von Tumorzellen aus einem Patienten, Einführen eines co-stimulatorischen Moleküls, wie z.B. B7, in die Zellen und anschließende Zurückgabe der Zellen in den Patienten (siehe z.B. europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer EP 0 733 373 A2 ). Von der Anwendung der hier offenbarten Entdeckung in solchen Verfahren, wird von dem Einführen eines β₂m Fusionsproteins in Tumorzellen erwartet, das es einen beachtlichen Vorteil bereitstellt.
Erhalten der β₂m Fusionsproteinexpression auf der Oberfläche von Tumorzellen kann entweder durch direktes Inkubieren von Tumorzellen mit einer gereinigten Präparation des Fusionsproteins oder durch Einführen eines Vektors, der das Fusionsprotein exprimiert, in die Zellen erhalten werden. Es sind alle Tumorarten potentiell der Behandlung durch diesen Ansatz zugänglich, einschließlich z.B. Karzinome der Brust, der Lunge, des Pankreas, der Eierstöcke, der Niere, des Darms und der Blase sowie Melanome und Sarkome.
Ein Einschließen des β₂m-Fusionsproteins auf der Oberfläche von Tumorzellen durch Inkubation des gereinigten Fusionsproteins mit den Zellen kann durch Inkubation der Tumorzellen mit dem rekombinanten Protein (1–5 μM) in serumfreiem Medium für 2 bis 16 Stunden erhal ten werden. Zusätzlich können Tumorzellen kurz mit einem niedrigen pH-Puffer (pH 2,5 bis 3,5) behandelt werden, um endogenes β₂m und Peptide von Zelloberflächen MHC I Molekülen zu entfernen, gefolgt durch Rekonstitution mit dem β₂m-Fusionsprotein und relevanten MHC I Bindungspeptiden für 1 bis 16 Stunden.
Wo eine Nukleinsäure, die für das Fusionsprotein kodiert, in die Tumorzellen einzuführen ist, wird die Nukleinsäure vorzugsweise in einen geeigneten Expressionsvektor eingeschlossen. Geeignete Vektoren schließen Plasmid-, Cosmid- und virale Vektoren, wie z.B. Retroviren, Adenoviren und Herpesviren, ein. Funktionsunfähige Viren, wie z. B. solche, die im U.S. Patent Nr. 5,665,362 beschrieben werden, können zu diesem Zweck verwendet werden. Aufgrund der hohen Effizienz, mit der virale Vektoren Säugetierzellen infizieren, wird von viralen Vektoren erwartet, daß sie Vorteile gegenüber anderen Vektortypen bereitzustellen. Der Vektor wird anschließend in die Tumorzelle durch Eine aus einer Auswahl an Techniken eingeführt, wie z.B. Elektroporation, Lipofektion, Co-Kultivierung mit Virus-produzierenden Zellen oder anderen Standardmitteln. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Tumorzellen Zellen, die von dem zu behandelnden Patienten entnommen werden, aber alternativ können die Tumorzellen Zellen aus einer Tumorzellinie sein, wie z.B. die humanen Tumorzellinien, die durch die "American Type Culture Collection" (ATCC, Manassas, VA) erhältlich sind. Wenn es erwünscht ist, die Zellen zu screenen, um diejenigen zu selektieren, in die der Vektor eingeführt wurde, kann dies durch eine Vielzahl von Mitteln einschließlich Selektieren auf die Expression des Auswahlmarkers, falls einer verwendet wird, oder Screenen der Expression des β₂m Fusionsproteins auf den Oberflächen der Zellen erreicht werden. Das letztere Verfahren kann bequem mittels eines fluoreszenzaktivierten Zellsorters (FACS) durchgeführt werden.
Die Tumorzellen werden dem Patienten anschließend in Kombination mit einem geeigneten Träger, wie z.B. gepuffertem Wasser, Salzlösung oder Glycin, verabreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform, wobei die Tumorzellen Zellen sind, die ursprünglich dem Patienten entnommen wurden, werden diese abgeschwächt bevor sie dem Patienten verabreicht werden. Eine abgeschwächte Zelle ist eine Zelle, die metabolisch aktiv ist, aber nicht länger fähig ist, zu proliferieren. Verfahren zum Abschwächen von Tumorzellen sind gut bekannt und schließen solche ein, die in EP 0 733 373 A2 beschrieben werden.
In einer alternativen Ausführungsform können Zellmembranen der Tumorzellen, die das β₂m Fusionsprotein einschließen, dem Patienten anstelle von intakten Tumorzellen verabreicht werden. Eine Zellmembranpräparation kann leicht durch Aufbrechen oder Lysieren der Zellen mittels Standardtechniken, wie z.B. einer "French Press", Einfrieren-Auftauen oder Ultraschallbehandlung hergestellt werden. Im Anschluß an das Aufbrechen der Zellen kann eine Membran-angereicherte Fraktion durch Zentrifugation erhalten werden.
Die vorliegende Beschreibung umfaßt auch andere immuntherapeutische Verfahren zum Behandeln von Zuständen, wie z.B. Krebs, einschließlich adoptiver Immuntherapie. Wie im Stand der Technik bekannt, schließt die adoptive Immuntherapie, ein Erhalten von Lymphoid-Zellen, die einem bestimmten Antigen ausgesetzt sind, Kultivieren dieser Zellen ex vivo unter Bedingungen, wodurch die Aktivität der Zellen erhöht wird und anschließend Verabreichen der Zellen an ein Inidividuum ein. Die Lymphoid-Zellen sind vorzugsweise T-Zellen, die von einem Krebspatienten entnommen wurden, z.B. T-Zellen von einem dränierten Lymphknoten. Diese T-Zellen werden mit Tumorzellen inkubiert, die, wie oben beschrieben, von dem Patienten entnommen werden, die so behandelt wurden, daß sie ein β₂m-Fusionsprotein auf ihrer Zelloberfläche präsentieren. Dementsprechend ist ein Aspekt der vorliegenden Beschreibung eine Form der adoptiven Immuntherapie, in der die Inkubation von Lymphoid-Zellen ex vivo in einem Medium durchgeführt wird, das Tumorzellen enthält, die ein β₂m Fusionsprotein präsentieren vor einer Verabreichung der Zellen an einen Patienten. Die technischen Details von Verfahren zum Entnehmen von lymphoiden Zellen, ex vivo Kultivierung solcher Zellen mit Immunstimulantien und Verabreichungen an Patienten sind im Stand der Technik bekannt und werden z.B. in den U.S. Patenten Nr. 4,690,915 ("Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans"), 5,229,115 ("Adoptive immunotherapy with interleukin-7"), 5,631,006 ("Immunotherapy protocol of culturing leukocytes in the presence of interleukin-2 in a hollow fiber cartridge") und 4,902,288 ("Implantable immunotherapy system using stimulated cells") und den darin zitierten Referenzen beschrieben.
Herstellung und Verwendung von β₂m S55V und β₂m-Fusionsproteinen in Vakzinpräparationen
Verfahren für die Herstellung und Verwendung von β₂m als ein Vakzinadjuvans sind im Stand der Technik bekannt und schließen solche ein, die im U.S. Patent Nr. 5,733,550 beschrieben werden, das hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen wird. Solche Verfahren können für die Verwendung von β₂m S55V sowie β₂m Fusionsproteinen bei Vakzinpräparaten sowie der Verfahren von Vakzination angewendet werden.
Die β₂m-Fusionsproteine können wie oben beschrieben hergestellt werden. Nukleinsäuremoleküle, die für Formen von hβ₂m kodieren, die die S55V Aminosäuresubstitution tragen, können mittels Standard-Mutagenesetechniken hergestellt werden, wie z.B. stellengerichtete Mutagenese oder durch PCR, wie in Beispiel 4 unten beschrieben. Das kodierte hβ₂m S55V kann in und prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystemen, wie oben für die β₂m-Fusionsproteine beschrieben, exprimiert und von dieser gereinigt werden.
β₂m Fusionsproteine und hβ₂m S55V können als Hilfsstoffe in Vakzinpräparationen verwendet werden, wobei sie in diesem Fall mit einem Antigen in einer Vakzinpräparation kombiniert werden können oder sie können dem Patienten entweder kurz oder nach Verabreichung einer herkömmlichen Vakzinpräparation verabreicht werden. Vorzugsweise wird das β₂m Fusionsprotein oder hβ₂m S55V an der gleichen Stelle und gleichzeitig mit der Antigenpräparation verabreicht. Wo ein hβ₂m Fusionsprotein als ein Vakzinadjuvans verwendet wird, kann die hβ₂m-Komponente des Proteins eine S55V Form des hβ₂m sein. Das Protein, mit dem das β₂m fusioniert ist, wird vorzugsweise ein co-stimulatorisches Protein, wie z.B. B7, sein.
Üblicherweise ist das Antigen, das einem Patienten zusammen mit einem β₂m-Präparat der vorliegenden Erfindung (z.B. einer Präparation eines beanspruchten β₂m Fusionsmoleküls oder eines S55V hβ₂m) verabreicht wird, ein Peptidantigen, das an die Klasse I MHC Moleküle des Patienten binden kann. Peptidantigene, die verwendet werden können, schließen Tumorantigene sowie Antigene von pathogenen Organismen einschließlich Viren und Bakterien ein. Beispiele von geeigneten Antigenen schließen HIV gp120, Untereinheiten von Influenzanukleoprotein oder Hämagglutinin und Tumorantigene, wie diskutiert durch Boon et al., (Ann. Rev. Immunol. 12:337-65, 1994); Finn (Curr. Opin. Immunol. 5:701-8) und Sligluff et al. (Curr. Opin. Immunol. 6:733-40, 1994) ein. Solche Antigene können aus einer ursprünglichen Quelle (z.B. Tumorzellen) isoliert oder extrahiert werden oder durch rekombinante Mittel hergestellt oder chemisch synthetisiert werden. Die Vakzinierung kann durch Verabreichung eines einzelnen Peptidantigens oder eines Cocktails von Antigenen, die von einer oder mehreren Antigenquellen abgeleitet werden, durchgeführt werden.
Das β₂m, das die Basis des in den Vakzin-Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete β₂m S55V bildet, kann jedes Säugetier-β₂m sein. Es kann bevorzugt sein, ein β₂m zu verwenden, das von der gleichen Säugetierspezies abgeleitet wird, wie das Säugetier, das geimpft werden soll, um das Risiko einer Immunantwort auf das verabreichte β₂m-Präparat zu verringern. Allerdings, da xenogenes β₂m in vivo üblicherweise nicht inflammatorisch ist, kann dies nicht erforderlich sein.
Vakzinpräparationen entsprechend der vorliegenden Erfindung können durch jedes bekannte Mittel verabreicht werden, einschließlich intramuskuläre und intravenöse Injektion. In seiner einfachsten Form wird die β₂m-Präparation, die einem Säugetier verabreicht wird, in einer herkömmlichen Dosierungsform, vorzugsweise kombiniert mit einem pharmazeutischen Hilfsstoff, Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht. Geeignete pharmazeutische Träger können fest oder flüssig sein und können Puffer, Antioxidantien, wie z.B. Ascorbinsäure, andere Polypeptide oder Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Kohlenwasserstoffe, Chelatbildner oder andere Stabilisatoren und Hilfsmittel einschließen. Geeignete feste Träger schließen Lactose, Magnesiumstearat, Kaolin, Saccharose, Talkum, Stearinsäure, Gelatine, Agar, Pektid, Akazie und Kakaobutter ein. Die Menge eines festen Trägers wird in Abhängigkeit davon, welcher Träger ausgewählt wird, stark variieren, ist aber vorzugsweise ungefähr von 25 mg bis ungefähr 1 g pro Dosis des wirksamen Mittels. Geeignete flüssige Träger schließen neutrale gepufferte Salzlösung, wahlweise mit geeigneten Konservierungsmitteln, Stabilisatoren und Hilfsstoffen ein. Der Träger oder Verdünnungsmittel kann auch zeitverzögernde Materialien, die im Stand der Technik gut bekannt sind, einschließen, wie z.B. Glycerindiastearat, entweder allein oder mit einem Wachs. Die vorhergehenden Beispiele von geeigneten pharmazeutischen Trägern sind lediglich beispielhaft und ein Fachmann wird erkennen, daß ein sehr großer Bereich von solchen Trägern angewendet werden kann. Es können auch Liposomen-basierte Abgabesysteme zur Abgabe von β₂m-Präparaten verwendet werden. Liposomen-basierende Systeme, die angewendet werden können, um eine meßbare Freisetzung in den Blutstrom des Mittels über Zeit bereitzustellen, sind im Stand der Technik gut bekannt und werden durch die Systeme beispielhaft erläutert, die in den U.S: Patenten Nr. 4,356,167 ("Liposome drug delivery systems"), 5,580,575 ("Therapeutic drug delivery systems"), 5,595,756 ("Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents") und 5,188,837 ("Lipospheres for controlled delivery of substances") und in den darin zitierten Dokumenten, beschrieben wurden.
Die Formulierung der β₂m-Präparation mit einem pharmazeutischen Träger kann viele physikalische Formen annehmen, ist aber vorzugsweise eine sterile flüssige Suspension oder Lösung, die zur direkten Injektion geeignet ist. Vorzugsweise wird dem Patienten die β₂m-Präparation in einer wie oben beschriebenen Formulierung verabreicht (z.B. in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger), wobei die Formulierung eine klinisch wirksame Menge des Mittels einschließt. Im Kontext der Vakzinierung ist "eine klinisch wirksame Menge" der β₂m-Präparation eine Menge, die ausreichend ist, um eine Erhöhung der Immunantwort auf das Zielantigen zu erhöhen, z.B. um eine cytotoxische T-Zell-Antwort herzustellen, die größer ist als die bei fehlender Verabreichung der β₂m-Präparation. Die Quantifizierung der Immunantwort, die von einer Vakzinierung herrückt, kann durch Standardmethoden, wie z.B. Lymphoproliferation als Antwort gegen das Testartigen an vitro oder Lyse der Zielzellen durch spezifische cytotoxische T-Lymphozyten erhalten werden.
Es versteht sich, daß eine klinisch wirksame Dosis einer β₂m-Präparation abhängig von dem tatsächlich verwendeten β₂m (z.B. ob es ein β₂m Fusionsprotein oder β₂m-S55V allein ist) und den Charakteristika des Patienten (Alter, Gewicht, andere eingenommene Medikamente, usw.) variieren wird. Folglich wird die Abschätzung einer klinisch wirksamen Dosierung letztendlich durch einen Mediziner, Veterinär oder anderen Mitarbeiter des Gesundheitssystems, der mit dem Patienten vertraut sind, entschieden. Üblicherweise wird ein Verabreichen einer β₂m-Präparation die ein Säugetier als ein Bestandteil eines Vakzinierungsschema die Verabreichung von ungefähr 10 ng bis 1 g an β₂m-Präparation pro Dosis einschließen, wobei Einzeldosiseinheiten von ungefähr 10 mg bis 100 mg, allgemein verwendet werden, und spezifische Dosierungen von bis zu 1 mg oder 10 mg auch innerhalb des allgemein verwendeten Bereichs liegen. Die Menge an Antigen, die in der Vakzinpräparation eingeschlossen wird, die ein β₂m-Adjuvans verwendet, wird üblicherweise die gleiche sein wie die, die in Vakzinpräparationen ohne das β₂m-Adjuvans eingeschlossen werden, obwohl größere oder kleinere Menge an Antigen verwendet können, wie klinisch geeignet.
Wo das β₂m dem Säugetier in einer einzelnen Präparation mit den Vakzinantigenen verabreicht wird, kann die Präparation einfach durch Mischen einer klinisch wirksamen Menge des β₂m mit der Antigenpräparation formuliert werden. Vakzine umfassend Tumorantigene und ein β₂m können von Tumorzellen hergestellt werden, die transformiert wurden, um das β₂m zu exprimieren.
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen zum Veranschaulichen der Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung des β₂m-B7 Fusionsproteins
Das murine B7.2:humane β₂m-Fusionsprotein (mb7β₂) wurde in vielen Schritten wie folgt hergestellt: Die extrazelluläre Domäne des murinen B7.2 (Freeman et al., 1993, J. Exp. Med. 178:2185-92, GenBank: Zugangsnummer L25606) wurde durch PCR von dem Plasmid mB7-2 (von Richard Hodes, NIH) mittels der folgenden zwei Oligonukleotide amplifiziert:
mB7-2 5' PCR Oligo: AGGGTACCATGGTTTCCGTGGAGACGCAAGC (SEQ ID. Nr. 8)
und
mB7-2 3' PCT Oligo: TCGAATTCATGATGCTAGCCCAATACGTTTGAGGAGATGG (SEQ ID Nr. 9), die eingebaute Restriktionsstellen zum Klonieren aufweisen (Fettdruck):
KpnI: GAATTC; NcoI: CCATGG; und BspH1: TGATGA.
Das resultierende PCR-Fragment wurde mit NcoI und BspH1 geschnitten und als eine aminoterminale Verlängerung in einen NcoI geschnittenen Bluescript SK-Vektor ligiert, der das Signalpeptid von hβ₂m (Guessow et al., 1987, J. Immunol. 139:3132-8, GenBank: Zugangsnummer: M17986), den c-myc-Tag EQKLISEEDLN (Zhou et al., 1996, Mol Immunol. 33:1127-34, SEQ-ID Nr. 15), und mit Vollängen-hβ₂m (Plasmid #267) enthält. Das resultierende Konstrukt (Plasmid #392) wurde anschließend mit NheI geschnitten, um es 5' von der myc-Sequenz zu linearisieren. Es wurden synthetische Oligonukleotide, die für einen [Gly4Ser]₃-Spacer kodieren, mit NheI kompatiblen Enden konstruiert und in den linearisierten Vektor ligiert, um Plasmid #396 zu erzeugen. Schließlich wurde die gesamte kodierende Sequenz des Wild-Typ hβ₂m (ohne einen myc-Tag) aus einer hβ₂m-cDNA PCR-amplifiziert, mit dem Zusatz einer NheI-5'-Stelle und einer Not I-Stelle-3' der kodierende Sequenz. Dieses Produkt wurde mit NheI und NotI verdaut und in das Plasmid #396 subkloniert, das auch mit NheI und NotI verdaut wurde, um Plamid #406 zu generieren. Dieses Plasmid enthielt die Signalsequenz von hβ₂m, gefolgt von der extrazellulären Domäne von mB7.2, einem 15 Aminosäure-Spacer, und dann reifem hβ₂m. Für die Expression in Bakterien wurde die eukaryontische Signalsequenz entfernt. Folglich wurde das Plasmid #406 mit NcoI und NotI verdaut, um das Fusionsprotein freizusetzen, das ohne daß das Signalpeptid vorhanden ist, und dies wurde dann anschließend in den bakteriellen Expressionsvektor pET21-d subkloniert, der mit NcoI und NotI linearisiert wurde.
Im Anschluß an die Transfektion des BL21 (DE3) Bakterienstammes von E. coli wurde die Proteinsynthese mit IPTG induziert, die Zellen wurden geerntet, lysiert und Einschlußkörper wurden gewaschen und solubilisiert. Im Anschluß an das Rückfalten des rekombinanten Materials wurde es weiter durch Gelfiltration und/oder Affinitätschromatographie mit anti-β₂m-Antikörpern gereinigt. Experimente, in denen mit Säure behandelten Zellen, die nur HLA-A2 exprimieren, unter verschiedenen Bedingungen mit dem, wie oben beschrieben hergestellten, B7-β₂m Fusionsprotein induziert wurden, und anschließend einer FACS-Analyse mittels Konformations-sensitiven Antikörper von verschiedenen Spezifizitäten unterzogen wurden, bestätigten das Folgende: (1) die B7-Domäne des Fusionsproteins ist nativ gefaltet; (2) die β₂m-Domäne des Fusionsproteins ist nativ gefaltet; und (3) die β₂m-Domäne des Fusionsproteins funktioniert, um die MHC I Expression (Daten nicht gezeigt) zu stabilisieren.
Beispiel 2
Das B7-β₂m Fusionsprotein co-stimuliert T-Zellen
Die Fähigkeit von B7-β₂m, Milz-T-Zellen zu co-stimulieren, wurde in vitro festgestellt. Antikörper, die für den B7-Rezeptor CD28 spezifisch sind, wurden als eine Kontrolle verwendet. β₂m, rekombinantes B7-β₂m oder anti-CD28 wurden zu den Wells einer Mikrotiterplatte hinzugegeben und bei 37°C für zwei Stunden inkubiert, um das Binden zu unterstützen. Anschließend wurden die Platten gewaschen, um überschüssiges Reagenz zu entfernen, und Milz-T-Zellen von BALB/c-Mäusen wurden zu den Wells in Anwesenheit von suboptimalen Konzentrationen des löslichen anti-T-Zellrezeptors 2C11 gegeben. Die Platten wurden für 48 Stunden inkubiert und anschließend wurde ³H-Thymidin zugegeben und es ihm ermöglicht, für 20 h sich in die proliferierenden Zellen einzubauen. Am Ende der Zeitdauer wurden die Zellen entfernt, und die Menge an aufgenommenen ³H-Thymidin wurde gemessen.
Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, daß, während keine T-Zell-Proliferation in den Wells beobachtet wurden, die allein β₂m enthielten, rekombinantes B7-β₂m eine co-Stimulierung der T-Zellen bereitstellt, die wenigstens so effektiv war, wie die des anti-CD28 Antikörpers. Ein typisches Ergebnis wird in 5 gezeigt.
BEISPIEL 3
Behandlung von Tumorzellen mit dem β₂m-B7 Fusionsprotein erhöht die Erzeugung von tumorspezifischen cytotoxischen T-Zellen
Die Fähigkeit des B7-β₂m Fusionsproteins, eine T-Zell-Erkennung und -Antwort gegen Tumorzellantigenen zu stimulieren, wurde mit der entsprechenden Aktivität von hβ₂m allein verglichen. DMA/2 Mäuse wurden jeweils mit 3 × 10⁶ syngenischen P816 Tumorzellen vakziniert, die vorher in serumfreiem Iscove-modifziertem Dulbecco's Medium (SF IMDM) mit entweder 0,2 μM B7-β₂m, 0,2 μM hβ₂m allein oder keinem zusätzlichen Reagenz inkubiert wurden. Proben jedes Typs wurden mittels Durchflußcytometrie analysiert, um zu zeigen, daß sie auf B7 oder hβ₂m färben. Diese Tumorzellen wurden anschließend mit 20.000 Rad bestrahlt und in die Mäuse injiziert. Eine Woche später wurden die Mäuse mit identisch präparierten Zellen re-immunisiert. Nach einer weiteren Woche wurden die Mäuse getötet, und ihre Milzzellen wurden in Kultur mit bestrahlten P815 stimulatorischen Zellen für eine Woche restimuliert. Die resultierenden kultivierten T-Zellen wurden anschließend auf ihre Fähigkeit hin untersucht, unbehandelte P815 Tumorzellen abzutöten.
Die in 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Milzzellen von den Mäusen, die mit den B7-β₂m Infusionsprotein behandelten Tumorzellen immunisiert wurden, dreifach wirksamer bei der Abtötung von Tumorzellen waren als Zellen von Mäusen, die entweder mit den hβ₂m behandelten oder unbehandelten Tumorzellen immunisiert wurden. Diese Daten zeigen, daß die Anwesenheit des Fusionsproteins auf der Tumorzellenoberfläche die Immunsystemantwort gegen die auf der Tumorzellenoberfläche präsentierten Tumorantigene erhöhten.
BEISPIEL 4
Herstellung einer hochaffinen Variante von hβ₂m
Es wurde eine Anzahl von Varianten von hβ₂m erzeugt und mittels MHC-Stabilisierung, T-Lymphozytenlyse und myc-β₂m Bindungs- und Inhibierungstests auf Aktivität hin untersucht. Der hydrophile Serin 55 (S55)-Rest von hβ₂m, der an der hβ₂m/Schwerekette-Schnittstelle verdeckt und direkt angrenzend an ein angeordnetes Wassermolekül ist, wurde als der Zielrest für die Mutagenese identifiziert. Dieser Rest wurde zu hydrophoben Resten mit ansteigender Masse (Valin, Isoleucin, Phenylalanin) mutagenisiert, um die hydrophoben Interaktionen zu unterstützen, und das angeordnete Wasser abzuschließen.
Die hβ₂m-Sequenzvarianten wurden durch Mutieren von hβ₂m cDNA in Bluescript SK (Stragene, La Jolla, CA), mittels dem "ExSite mutagenesis system" (Stratagene) entsprechend den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Die mutierten cDNAs wurden in den bakteriellen Expressionsvektor pET-2Id(+) (Novagen, Madison, WI) mittels erzeugter NcoI- und BamHI-Stellen jeweils an dem 5'- bzw. 3'-Ende der reifen Proteinsequenz subkloniert. Die verwendeten Oligonukleotide, um Varianten der hβ₂m-Sequenz zu erzeugen, waren wie folgt:

Sense S55F: 5' TTC TTC AGC AAG GAC TGG TCT TTC 3' (SEQ ID Nr. 4)
Sense S55I: 5' ATT TTC AGC AAG GAC TGG TCT TTC 3' (SEQ ID Nr. 5)
Sense S55V: 5' GTG TTC AGC AAG GAC TGG TCT TTC 3' (SEQ ID Nr. 6)
Gemeinsames Antisense: 5' TAA GTC TGA ATG CTC CAC TTT TTC 3' (SEQ ID Nr. 7)

Die Expression und Reinigung der mutierten hβ₂ms wurden wie vorher durch Shields et al. (J. Immunol. 160:2297-307, 1998) beschrieben durchgeführt. In Kürze wurden, hβ₂m-Konstrukte in pET-21d(+) in den BL21(DE3) Bakterienstamm von E. coli transformiert. Bei einer O.D._600nm von 0,6 wurden die Kulturen mit 1 mM IPTG für vier Stunden induziert, und Einschlußkörper wurden durch Zentrifugation nach Ultraschallbehandlung der Bakterien in 200 nM Tris, 2 mM EDTA, 10 % Triton X-100, pH 7,6 isoliert und in 200 mM Tris, 2 mM EDTA und pH 7,6 gewaschen. Die Einschlußkörper wurden in 6 M Guanidin-HCI, das 0,3 M DDT, 100 mM Tris, pH 8,0 und eine Mischung an Proteaseninhibitoren enthält (5 μg/ml Leupeptin, 0,5 mM AEBSF, 1 % Aprotinin) solubilisiert. Im Anschluß an einer Übernacht-Dialyse in 6 M Guanidin bei pH 2,0 wurde rekombinantes Protein über 72 Stunden in 0,4 M Arginin, 5 mM oxidiertem Glutathion, 100 mM Tris, 2 mM EDTA bei 10°C rückgefaltet. Im Anschluß die an Rückfaltung wurden die Präpärationen erschöpfend gegen 0,4 M Arginin, 100 mM Tris, 2 mM EDTA bei pH 8,0 und anschließend mit PBS bei 4°C dialysiert. Die Zubereitungen wurden als ein einzelner Peak durch präparative FPLC auf einer Superdex 75 pg Gelfiltrationssäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gereinigt, mittels Centriprep-3 konzentrierenden Einheiten (Amicon, Beverly, MA) aufkonzentriert, sterilfiltriert, und die Konzentrationen wurden auf O.D._280nm Meßwerten basierend, berechnet. Rekombinantes hβ₂m wurde bewertet, ≥ 95 % rein zu sein, basierend auf einer Analyse durch SDS-PAGE und analytische FPLC.
BEISPIEL 5
hβ₂m S55V erzeugt erhöhte MHC I Stabilisierung
Ein HLA-Stabilisierungstest wurde verwendet, um die hβ₂m-Varianten zu screenen. Eine Anzahl von HLA-Allelen, HLA-A1, HLA-A2, und HLA-A3 wurde analysiert, um festzustellen, ob eine der Punktmutanten Allel-spezifische Effekte zeigte.
In diesem und den folgenden Experimenten waren die verwendeten Zellinien, monoklonalen Antikörper (mAKs) und Peptide wie folgt:
Zellinien und Antikörper: Hmy2.C1R-Zellen (Storkus et al., 1987, J. Immunol. 138:1657) wurden mit HLA-A1, -A2 und -A3 wie vorher beschrieben (Winter et al., 1991, J. Immunol. 146:3508; DiBrino et al., 1993, J. Immunol. 151:5930) stabil transfiziert. Der HLA-A2/HTLV-1 TAX 11-19 Peptid-spezifische CTL-Klon N1218 und HLA-A3/Influenza NP 265-273-Peptidklon 2G12 wurden isoliert und, wie vorher durch Biddison et al. (J. Immunol. 159:2018, 1997) beschrieben, restimuliert. Alle mAKs wurden als Kulturüberstände verwendet, die in DMEM gewachsen waren, das mit 10 % fötales Kälberserum, 20 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % Pen-strep und 0,04 mg/ml Gentamicinsulfat (Vollständiges-DMEM) ergänzt war. GAP.A3 (HLA-A3 spezifische) und BB7.5 (pan-HLA-ABC-spezifische) Hybridome wurden von der "American Type Culture Collection" (Manassas, VA) erhalten. Das myc-spezifische 9E10-Hybridom wurde zuvor von Evan et al. (Mol Cell Biol. 5:3610-6, 1985) beschrieben. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Lösungen zum Zellwachstum von Biofluids (Rockville, MD) erhalten.
Peptide: Die verwendeten Peptide waren die HLA-A1-bindende Ornithindecarboxylase 309-317 (OD 309): SSEQTFMYY (SEQ ID Nr. 16)- das HLA-A2-bindende HTLV-I-TAX 11-19: LLFGYPVYV (SEQ ID Nr. 17) und HIV gag 77-85: SLYNTVATL (SEQ ID Nr. 18); und das HLA-A3-bindende pn2a.A3: KLYEKVYTYK (SEQ ID Nr. 19) und Influenza NP 265-273: ILRGSVAHK (SEQ ID Nr. 20) (DiBrino et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:1508, DiBrino et al., 1994, J. Immunol. 152:620; Honma et al., 1997, J. Neuroimmunol. 73:7; Parker et al., 1992, J. Immunol. 149:3580; Parker et al., 1994, J. Immunol. 152:163; und Parker et al., 1995, Immunol. Res. 14:34). Diese Peptide wurden von Bachem (Torrance, CA) erworben oder durch Dr. John E. Coligan (Natl. Inst. of Allergy and Infectious Diseases, NIH) bereitgestellt. Alle Peptide wurden durch Reverse-Phase-HPLC gereinigt und waren > 95% rein, was durch analytische HPLC und Massenspektrometrie festgestellt wurde.
Die MHC-Stabilisierung wurde im wesentlichen wie vorher beschrieben mit kleinen Modifikationen durchgeführt (Bremers et al., 1995, J. Immunol. Emphasis Tumor Immunol. 18:77; van der Burg et al., 1995, Hum. Immunul. 44:189; Sugawara et al., 1987, J. Immunol. Methods 100:83). In Kürze, wurde Hmy2.C1R-Zellen (Storkus et al., 1987, J. Immunol. 138: 1657) wurden mit HLA-A1, -A2 und -A3 wie zuvor beschrieben stabil transfiziert (Winter et al., 1991; J. Immunol. 146:3508; DiBrino et al., 1993, J. Immunol. 151:5930). Hmy2.C1R-A1, -A2 und A3-Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, in 0,13M Zitronensäure, 66 mM Na₂HPO₄, bei pH 2,9 (pH 3,2 für A2-Zellen) für 90 Sekunden bei 4°C resuspendiert, mit zwei 50 ml Wechsel von IMDM gewaschen und in SF IMDM (identisch zu SF DMEM, wobei IMDM verwendet wurde) resuspendiert. Es wurden 10⁵ Zellen pro Well in eine 96 Well Mikrotiterplatte gegeben, die Hybridoma-Überstände, Peptide und hβ₂m-Verdünnungen in einem Gesamtvolumen von 150 μl enthielt. Die HLA-A1-transfizierten Hmy2.C1R-Zellen wurden mit BB7.5 mAK und 10 μg/ml A1-bindendem OD 309-Peptid kombiniert. HLA-A2-transfizierte Hmy2.C1K-Zellen wurden mit BB7.5 mAK und 2,5 μg/ml A2-bindendem HIV gag-Peptid kombiniert. HLA-A3-transfizierte Hmy2.C1R-Zellen wurden mit GAP.A3 mAK und 1,25 μg/ml A3-bindendem pn2a.A3-Peptid kombiniert. Nach 4 Stunden Inkubation bei 23°C wurden die Zellen zweimal mit FACS-Puffer (PBS, 2 mg/ml BSA, 0,02% NaN₃) gewaschen und mit FITC-konjugiertem Ziegen-anti-Maus IgG (H+L) F(ab')₂-Fragment (Cappel/Organon Teknika, Durham, NC) für eine Stunde bei 4°C gefärbt. Die Zellen wurden zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und in 1% Formaldehyd in PBS fixiert, gefolgt von Durchflußzytometrieanalyse auf einer FACScanII Maschine (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
7 zeigt die Fähigkeit der S55-Variante, hβ₂m HLA-A1 (7a), HLA-A2 (7b) und HLA-A3 (7c) in Anwesenheit eines spezifischen Bindungspeptids und eines entsprechenden HLA-spezifischen Antikörpers zu stabilisieren. Die S55V-Variante („X"-Symbol in 7) stabilisiert HLA-A1 und HLA-A3 ungefähr zweifach bzw. dreifach besser als Wild-Typ-hβ₂m (Raute) bei einem molaren Spiegel, und die Wirkungen auf HLA-A2-Stabilisierung durch S55V waren leicht besser als die, die mit Wild-Typ-hβ₂m erhalten wurden. S55F (Quadrate) war ähnlich zu Wild-Typ-hβ₂m für alle getesteten Allele, während die Wirkungen von S55V (Dreiecke) in Abhängigkeit von den Allelen varierte (besser mit HLA-A1 und schlechter mit -A2 und -A3).
Beispiel 6
hβ₂m S55V bindet an MHC I mit einer höheren Affinität als Wild-Typ-hβ₂m
Die in den Experimenten in dem vorhergehenden Beispiel verwendeten Antikörper wurden aufgrund ihrer Abhängigkeit von sowohl hβ₂m und Peptid ausgewählt, um "vollständige" Moleküle nachzuweisen, d.h. schwere Kette/hβ₂m/Peptide, die zu trimeren Komplexen nativ gefaltet sind. Da dieser Bindungs-Test die Anwesenheit eines Antikörpers zusätzlich zu hβ₂m und Peptid (van der Burg, 1995, Hum. Immunol. 44:189) erfordert, gab es die Möglichkeit, daß der Antikörper selber einen Effekt ausübt, der für eine bestimmte hβ₂m-Mutante spezifisch ist. Aufgrund von Bedenken bezüglich der potentiellen Mitwirkung der Antikörper auf die Stabilisierung der Zelloberflächen-MHC I-Komplexe wurde ein Bindung-Inhibierungstest entwickelt, der direkt die relativen Fähigkeiten von hβ₂ms misst, an MHCI-Moleküle zu binden. Dieser Test erfordert markiertes hβ₂m, um die Inhibierung zu messen. Verfahren zum Markieren, wie z. B. Biotinylierung und Jodinierung sind zufällige Reaktionen und erzeugen vielfach markierte Spezies, die weitere Reinigung vor Verwendung in einem geeignetem kompetetiven Test erfodern (Hochman et al., 1988, J. Immunol. 140:2322). Allerdings erzeugt endogenes Markieren mit einem Epitoptag eine einheitlich markierte Spezies von hβ₂m. Zusätzlich würden Tyrosin- und Lysinreste (übliche Ziele der Biotinylierung und Jodinierung), von denen bekannt ist, daß die an der MHC-schwere Kette/hβ₂m-Schnittstelle sind, nicht durch einen endogenen Marker beeinträchtigt werden. Daher wurde ein Epitoptag (myc) an dem Aminoterminus von hβ₂m erzeugt, und die Fähigkeit der verschiedenen hβ₂m-Mutanten, mit dem myc-hβ₂m um die Bindung an die Zelloberflächen zu konkurrieren, wurde unter Verwendung des anti-myc mAb 9E10 untersucht.
Um die funktionelle Aktivität des myc-hβ₂m selber zu etablieren, wurden direkte Bindungstudien durchgeführt. In Kürze, wurden Hmy2.C1R-transfizierte Zellen mit 2,5 × 10⁵ pro Röhrchen in einem 500 μl Volumen bei 37°C für 16 Stunden in SF IMDM mit 2,5 μM myc-β₂m, 20 μg/ml Peptid und den angegebenen Konzentrationen des Inhibitors β₂m inkubiert. Das OD 309-Peptid wurde für HLA-A1, das HIV gag-Peptid für HLA-A2 und das pn2aA3-Peptid für HLA-A3 verwendet. Die Zellen wurden dreimal in einfachem IMDM gewaschen, gefolgt durch Inkubation mit 9E10 (anti-myc)-Hybridom-Überstand bei 4°C für eine Stunde. Nach Waschen mit IMDM wurden die Zellen für eine Stunde mit FITC-anti-Maus-IgG bei 4°C gefärbt. Die Zellen wurden ein letztes Mal in FACS-Puffer gewaschen und durch Durchflusszytometrie analysiert, wobei auf lebende (Propidium-Jodid) ausschließende Zellen gefiltert wurde. Bei Anwesenheit eines entsprechenden Peptids gab es eine Konzentrations-abhängige myc-β₂m-Bindung für alle untersuchten Allele. Jedoch, falls die Zellen in Abwesenheit des Peptids mit myc-β₂m inkubiert wurden, wurde keine nennenswerte myc-β₂m-Bindung erhalten.
Die relativen Fähigkeiten von Wild-Typ hβ₂m und S55V, die Bindung von myc-β₂m an HLA-Moleküle zu inhibieren, wurden als nächstes mittels eines Inhibierungstestverfahrens verglichen. Der Inhibierungstest war identisch zu dem Bindungstest, mit den folgenden Modifikationen: Es wurden in allen Fällen 2,5 μM myc-hβ₂m verwendet und verschiedene Konzentrationen an nicht-myc-markierten rekombinanten hβ₂m wurden eingeschlossen, um die myc-hβ₂m-Bindung auf die Zelloberflächen MHC zu inhibieren. Die Prozent Inhibierung wurde durch die folgende Gleichung berechnet: (1-((experimenteller Hintergrund)/(kein Inhibitor-Hintergrund))) × 100. 10-20000 geschleuste Ereignisse pro Probe wurden gezählt, und alle Experimente wurden wenigstens zweimal wiederholt. Im Vergleich mit Wild-Typ-hβ₂m inhibierte die S55V-Mutante die myc-hβ₂m-Bindung bei einem molaren Spiegel für HLA-A1, -A2 und -A3 (8) ungefähr 2,5-fach besser. Diese Ergebnisse zeigen die höhere relative Affinität der S55V-Mutante für HLA-A1 (8a), -A2 (8b) und -A3 (8c) im Vergleich zu Wild-Typ-hβ₂m.
Beispiel
hβ₂m S55V erhöht die CTL-Erkennung von Zielzellen
Die Wirksamkeit von hβ₂m bei der Erhöhung der exogenen Peptidbeladung auf MHC I – Moleküle wurde mittels eines CTL-Lysis-Tests (Depierreux et al., 1997, J. Immunol. Methods 203:77) wie folgt gemessen: Mit HLA-A2 oder HLA-A3-transfizierte Hmy2.C1R-Zellen wurden auf 4 × 10⁶ Zellen/ml in vollständigem DMEM, das mit 20 μM BATD (das ein fluoreszierendes Chelat mit Europium bildet; Wallac, Gaithersburg, MD) ergänzt war, resuspendiert und für 30 bis 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden in 10 ml serumfreiem (sf) CTL-Medium (IMDM, das mit 5 mg/ml Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO), 2 mM L-Glutamin, 1,25 mM Sulfinpyrazon (Sigma) und 1% Pen-strep ergänzt war) resuspendiert, zentrifugiert und einmal mit SF CTL-Medium gewaschen. Die Zellen wurden anschließend mit Peptid- und/oder β₂m SF CTL-Medium für 60 bis 90 Minuten bei 37°C gepulst. Die Zellen wurden zweimal in SF CTL-Medium gewaschen, in CTL-Medium (5% fötalem Kälberserum anstelle von BSA) resuspendiert und im erwünschten Effektor: Ziel-Verhältnis mit CTL-Klonen in Rundbodenmikrotiterplatten (CTL-Klon N1218 bei einem E:T-Verhältnis von 4:1 (9a) oder der NP-spezifische HLA-A3-begrenzte CTL-Klon 2711 bei einem E:T-Verhältnis von 2:1 (9b) kombiniert. Die Platten wurden sanft bei 100 × g für 2 Minuten zentrifugiert und anschließend bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Schließlich wurden die Platten bei 300 × g zentrifugiert und 20 μl/Well wurden zu 200 μl an 0,3 M Essigsäure, 60 mM Natriumazetat, 7,5 μg/ml Europium (Aldrich, Milwaukee, WI), überführt, und die Platte wurde auf einem Wallac 1234 DELFIA Fluorometer gelesen. Die Prozent spezifische Lyse wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:
100 × ((experimentelle Blindprobe)-(spontane Blindprobe))/((maximale Blindprobe)-(spontane Blindprobe)).
In diesem Test korreliert die Zielzell-Lyse nicht nur mit der Behandlung eines spezifischen Peptidantigens, er zeigt auch, daß das Peptid in einer immunologisch relevanten Art gebunden wird. Die Hmy2.C1R-A2-Zielzellen (eine humane lymphoblastoide Zelle, im wesentlichen Null für HLA-Moleküle außer für transfizierte HLA-A2.1) (Winter et al., 1991; J. Immunol. 146:3508; DiBrino et al., 1993, J. Immunol. 151:5930) wurden mit einer suboptimalen Konzentration an HTLV-1 TAX-Peptid (9,3 × 10^–12m/l) oder Kontroll-A2-bindendes HIV gag-Peptid bei 1 × 10^–9 m/l für 90 Minuten in serumfreien CTL-Medium in Abwesenheit oder Abwesenheit von ansteigenden Konzentrationen von gereinigtem, rekombinanten hβ₂m pulsiert und anschließend als Ziel in einem herkömmlichen Lysetest verwendet. Die Anwesenheit von Wild-Typ-hβ₂m erhöhte drastisch die spezifische Lyse durch das TAX-spezifischen CTL-Klon in einer dosisabhängigen Weise. Mittels dieser suboptimalen Peptidkonzentration gab es 20% Lyse in Abwesenheit von hβ₂m. Der Zusatz von 8 μM hβ₂m erhöht die Lyse auf das Maximum, das bei diesem E:T-Verhältnis erhalten wurde. In Abwesenheit von hβ₂m wären 100-fach höhere Peptidkonzentrationen erforderlich, um vergleichbare Spiegel der Lyse (Daten nicht gezeigt) zu erhalten.
Nachdem die Fähigkeit des Wildtyp-hβ₂m etabliert wurde das Beladen von antigenem Peptid auf Zellen zu erhöhen, wurde die Aktivität der S55V-Variante in diesem Test untersucht.
Zwei CTL-Klone, die spezifisch für ein HTLV-1-TAX-Peptid im Kontext von HLA-A2 und einem Influenza Nukleoprotein-Peptid im Kontext sind, wurden in dem Test wie oben beschrieben verwendet, unter Verwendung von Hmy2.C1R-Transfektanten, mit einer suboptimalen Konzentration an Antigenpeptid (NP 265-273, 1 × 10^–10 M/l) oder Kontroll-A3-bindendem pn2a.A3-Peptid bei 1 × 10^–6 M/l gepulst wurden. Die S55V-Mutante war bei einem molaren Spiegel vierfach effektiver als Wild-Typ hβ₂m beim Erhöhen der Zielzellenlyse für HLA-A2 (9a) und 6- bis 7-fach besser für HLA-A3 (9b). Kontrollen mit irrelevanten A2 und -A3 bindenden Peptiden führten nur zum Hintergrundspiegel von Abtötung bei den höchsten verwendeten Konzentrationen an hβ₂m. Zusätzlich zeigten viele TAX-spezifische A2-restringierte Klone ähnliche Spiegel an S55V-erhöhter Abtötung, relativ zum Wild-Typ-hβ₂m (Daten nicht gezeigt).
Angesichts der vielen möglichen Ausführungsformen, in denen die Grundsätze der Erfindung angewendet werden können, wird es erkannt werden, daß die vorhergehenden Beispiele nur zum Zweck der Veranschaulichung angeboten werden und den Bereich der Erfindung nicht begrenzen. Vielmehr wird der Bereich der Erfindung durch die folgenden Ansprüche definiert.
Sequenzprotokoll

Claims

Fusionsprotein, umfassend eine erste und zweite Domäne, wobei die zweite Domäne ein menschliches β₂-Mikroglobulin ist, das einen Valin-Rest an der Postition 55 aufweist (h β₂ S55V).
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die erste Domäne mit dem Amino-Terminus der zweiten Domäne verbunden ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die erste Domäne ein co-stimulierendes Protein ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 3, wobei das co-stimulierende Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus B7.1 und B7.2.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die erste Domäne ein Integrin, ein Cytokin oder ein Zelladhäsionsmolekül ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten Domänen durch einen Peptidlinker verknüpft sind.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das Fusionsprotein weiterhin ein Signalpeptid, das mit dem N-Terminus der ersten Domäne verbunden ist, umfaßt.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das h β₂ S55V eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 10 gezeigt aufweist.
Zelle, die eine Zellmembran umfassend ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 aufweist.
Zelle nach Anspruch 9, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
Protein nach Anspruch 1, umfassend eine Struktur X-Y, wobei X eine Proteindomäne und Y ein h β₂ S55V ist.
Protein nach Anspruch 11, umfassend eine Struktur X-L-Y, wobei L ein Peptidlinker ist.
Protein nach Anspruch 12, umfassend S-X-L-Y, wobei S ein Signalpeptid ist.
Protein nach Anspruch 7 oder 13, wobei das Signalpeptid ein β₂m-Signalpeptid ist.
Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 11 bis 14 kodiert.
Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15.
Transformierte Zelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15.
Protein nach Anspruch 1 oder 11, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 gezeigt aufweist.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, zur Verwendung in einem Verfahren zur Verstärkung der Immunantwort eines Säugetiers auf ein Antigen, das auf der Oberfläche einer Zelle präsentiert wird, wobei das Verfahren ein: In Kontakt bringen der Zelle mit dem Protein umfaßt, so daß das Fusionsprotein auf der Zelloberfläche präsentiert wird; wobei die Zelle einem Säugetier verabreicht werden soll.
Protein nach Anspruch 19, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist und wobei die erste Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus B7.1 und B7.2.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15, das für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert, zur Verwendung in einem Verfahren zur Verstärkung der Immunantwort eines Säugetiers auf ein Antigen, das auf der Zelloberfläche präsentiert wird, wobei das Verfahren: Transformieren der Zelle mit dem Nukleinsäuremolekül umfaßt, so daß die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einer Expression eines Fusionsproteins resultiert, das durch das Nukleinsäuremolekül kodiert wird und das auf der Oberfläche der Zelle präsentiert wird; und wobei die Zelle einem Säugetier verabreicht werden soll.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 21, wobei das Molekül für ein Protein nach Anspruch 4 kodiert und wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
Humanes β₂-Mikroglobulinmolekül, das einen Valin-Rest an der Position 55 aufweist.
Humanes β₂-Mikroglobulinmolekül nach Anspruch 23, wobei das Molekül die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 10 gezeigt umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung, umfassend mindestens ein Antigen und ein Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem menschlichen β₂-Mikroglobulinmolekül, das ein Valin an der Position 55 aufweist; und (b) einem Fusionsprotein, umfassend eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz, wobei die zweite Aminosäuresequenz h β₂ S55V ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Antigen ausgewählt ist aus Gruppe bestehend aus bakteriellen, viralen und Tumor-Antigenen.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 25, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Impfung eines Säugetiers.
Zusammensetzung, umfassend ein Antigen und ein Mikroglobulinprotein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) eiem menschlichen β₂-Mikroglobulinprotein, das ein Valin an der Position 55 aufweist; und (b) einem Fusionsprotein, umfassend eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz, wobei die zweite Aminosäuresequenz h β₂ S55V ist, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Impfung eines Säugetiers.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, zur Verwendung in einem Verfahren zur Stimulierung einer Tumor-reaktiven zytotoxischen T-Zell-Antwort, umfassend: (a) Inkubieren von Tumorzellen, die aus einem Patienten isoliert wurden, mit dem Protein, so daß das Fusionsprotein auf der Oberfläche der Tumorzellen präsentiert wird; (b) Inkubieren von T-Zellen, die aus dem Patienten isoliert wurden, in der Anwesenheit der Tumorzellen, die das Fusionsprotein präsentieren, um die Anzahl der Tumor-reaktiven T-Zellen zu erhöhen; und wobei eine therapeutisch wirksame Dosis an Tumor-reaktiven T-Zellen an den Patienten zu verabreicht werden soll.