DE69730693T2

DE69730693T2 - Mhc-komplexe und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE69730693T2
Application number: DE69730693T
Authority: DE
Inventors: R. Peter RHODE; Jin-An Jiao; Martin Burkhardt; C. Hing WONG
Original assignee: Altor Bioscience Corp
Current assignee: ImmunityBio Inc
Priority date: 1996-01-31
Filing date: 1997-01-30
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2017-01-31
Also published as: US5869270A; DK0877760T3; AU729672B2; US20020034513A1; CA2244755A1; EP1526141A3; EP0877760A4; ATE276275T1; AU2253897A; US7141656B2; DE69730693D1; WO1997028191A1; EP1526141A2; US6309645B1; JP2000515363A; EP0877760B1; EP0877760A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Komplexe von Molekülen des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes (MHC) und die Verwendungen solcher Komplexe. Zum Beispiel betrifft die Erfindung in einem Aspekt leere MHC-Komplexe, die ein MHC-Molekül mit einer Peptid-Bindungsfurche und ein präsentierendes Peptid enthalten, das nicht kovalent an das MHC-Protein gebunden ist. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionskomplexe, die ein Einzelketten-MHC-Klasse-II-Molekül und ein präsentierendes Peptid, das kovalent an die Peptid-Bindungsfurche des MHC-Proteins gebunden ist, einschließen. Die erfindungsgemäßen MHC-Komplexe sind für eine Vielzahl von Anwendungen verwendbar, einschließlich in vitro-Screens zur Identifizierung und Isolierung von Peptiden, welche die Aktivität von T-Zellen modulieren.
2. Hintergrund
Antigen-spezifische T-Zell-Antworten werden durch antigenische Peptide, die an die Bindungsfurche oder -spalte von Glykoproteinen des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes (MHC) gebunden sind, als Teil des Mechanismus des Immunsystems ausgelöst, um Fremd-Antigene zu identifizieren und um auf diese zu reagieren. Die gebundenen antigenischen Peptide interagieren mit T-Zell-Rezeptoren und modulieren dadurch eine Immunantwort. Die antigenischen Peptide sind über nicht-kovalente Mittel an spezielle "Bindungstaschen" gebunden, die aus polymorphen Resten der Bindungsfurche des MHC-Proteins bestehen. MHC-Klasse-II-Moleküle sind heterodimere Glykoproteine, die aus α- und β-Ketten bestehen. Die α1- und β1-Domänen dieser Moleküle sind so zusammengefaltet, dass sie eine Peptid-Bindungsfurche bilden. Antigenische Peptide binden das MHC-Molekül durch eine Interaktion zwischen den Anker-Aminosäuren auf dem Peptid und den α1- und β1-Domänen. Die Kristallstruktur des humanen Klasse- II-HLA-DR1-Komplexes mit einem Influenzavirus-Peptid legt nahe, dass die N- und C-terminalen Enden des gebundenen Peptids so aus der Bindungsfurche herausragen, dass der C-Terminus des Peptids proximal zu dem N-Terminus der β-Kette liegt [J. Brown et al., Nature 364: 33–39 (1993), L. Stern et al., Nature 368: 215–221 (1994)]. MHC-Klasse-I-Moleküle haben andere Domänen-Organisationen als MHC-Klasse-II-Moleküle, besitzen jedoch im Allgemeinen eine ähnliche Struktur mit einer Peptid-Bindungsstelle oder -furche, welche distal zu den Membrandomänen liegt [siehe z. B. A. Rudensky et al., Nature 353: 622–626 (1991)]. Sie auch die US-Patente 5,284,935; 5,260,422; 5,194,425; 5,130,297 und die WO 92/18150 und WO 93/10220 bezüglich der Diskussionen von MHC-Molekülen.
Die α- und β-Ketten-Transmembrandomänen spielen eine wichtige Rolle beim Zusammenbau und/oder dem extrazellulären Transport von MHC-Molekülen. Zum Beispiel können Aminosäurenveränderungen in den TM-Domänen defekte MHC-Moleküle hervorbringen [P. Cosson et al., Science 258: 659 (1992), W. Wade et al., Immunology 32: 433 (1995), H. Kozono et al., Nature 369: 151 (1994)]. Die α- und β-Ketten-Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen wurden offenbart (siehe z. B. Brown, supra, und die darin enthaltenen Referenzen).
MHC-Moleküle, die mit antigenischen Peptiden komplexiert sind, können eine selektive Immunsuppression über mehrere verschiedene Mechanismen induzieren [siehe z. B. J. Guery et al., Critical Reviews in Immunology 13(3/4): 195–206 (1993)].
Insbesondere wurde berichtet, dass Peptid-MHC-Komplexe auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen nur dann eine klonale Expansion einer T-Zell-Linie, die für das MHC-gebundene Peptid spezifisch ist, induziert, wenn die Antigen-präsentierenden Zellen auch co-stimulatorische Signale abgeben. Ein vorgeschlagener Ansatz macht sich dieses Erfordernis einer T-Zell-Aktivierung zunutze und demonstriert eine Inhibition der T-Zell-Entwicklung durch die Interaktion mit dem an das MHC-Molekül gebundene antigenische Peptid in der Abwesenheit von co-stimulatorischen Signalen [siehe M. Nicolle et al., J. Clin. Invest. 93: 1361–1369 (1994) und S. Sharma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11465–11469 (1991)].
Ein anderer vorgeschlagener Ansatz inhibiert die T-Zell-Entwicklung mit MHC-Molekülen, die ein gebundenes Peptid enthalten, das einen Antagonisten oder Teil-Agonisten eines T-Zell-Rezeptors (TcR) darstellt [siehe B. Evavold et al., Immunology Today 14(12): 602–609 (1993)].
Mit Hilfe von Modifikationen der antigenischen Peptide, die an T-Zell-Rezeptoren gebunden sind, wurde versucht, die Reste zu untersuchen, die für spezifische T-Zell-Antworten verantwortlich sind. Eine Bestimmung solcher "aktivierenden" Aminosäuren der antigenischen Peptide könnte einen Einblick über eine geeignete Sequenz eines partiellen TcR-Agonisten oder -Antagonisten geben. Siehe Evavold, B. et al., supra.
Es wurde auch spekuliert, dass neue Vaccine entwickelt werden könnten, die auf der Bestimmung der Art der verschiedenen antigenischen Peptide, die an MHC-Moleküle gebunden sind, basieren [siehe R. Chicz et al., Immunology Today 15(4): 155–160 (1994)].
Clark et al. (US-Patent Nr. 5,260,422) und Clark et al. (WO 93/09810) offenbaren ein Einzelketten-Hybrid-MHC-Molekül, das sowohl Teile eines Klasse-I-Moleküls als auch eines Klasse-II-Moleküls enthält. Clark beschreibt auch ein Einzelketten-MHC-Molekül, das lediglich die Klasse-II-α1- und Klasse-II-β1-Domänen enthält.
Die WO 95/23814 beschreibt ein Produkt und ein Verfahren zum Regulieren der Aktivität von T-Zellen unter Verwendung von Haupt-Histokompatibilitätskomplexen (MHC), die stabil an antigenische Peptide gebunden sind. Die WO 95/23814 beschreibt auch ein antigenisches Peptid, das kovalent an ein Haupt-Histokompatibilitätskomplex(MHC)-Protein über einen neuen Linker gebunden ist, was dadurch die Bildung eines stabilen Peptid-MHC-Komplexes ermöglicht, entweder alleine oder in Kombination mit zusätzlichen MHC-Proteinketten, die fähig sind, von einem T-Zell-Rezeptor (TcR) erkannt zu werden. Die WO 95/23814 beschreibt weiter ein Hybrid-Einzelkettenmolekül, das sowohl Teile eines MHC-Klasse-I-Moleküls als auch eines MHC-Klasse-II-Moleküls umfasst.
Godeau et al. (J. Biol. Chem. 267: 24223–24229, 1992) beschreibt ein Einzelketten-MHC-Klasse-I-Molekül.
Die WO 93/17095 beschreibt ein heterodimeres (d. h. aus zwei getrennten Untereinheiten bestehendes) MHC-Klasse-I-Molekül.
Stern et al. (Cell 68: 465–477, 1992) und WO 93/16191 beschreiben die Expression von natürlichen MHC-Klasse-II-Heterodimeren (d. h. zwei getrennte Untereinheiten) durch die Co-Infektion von Insektenzellen mit zwei Baculovirus-Konstrukten, die unabhängig voneinander für die MHC-α- und β-Untereinheiten kodieren. Die α- und β-Untereinheiten, die in derselben Zelle co-exprimiert werden, lagern sich zusammen, um ein MHC-Klasse-II-Heterodimer zu bilden.
Altman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10330–10334, 1993) beschreibt die Wiederherstellung eines heterodimeren (d. h. aus zwei getrennten Untereinheiten bestehenden) MHC-Klasse-II-Moleküls. Verkürzte Formen von MHC-Klasse-II-α- und β-Untereinheiten wurden in E. coli getrennt exprimiert. Die aufgereinigten α- und β-Proteine wurden dann zusammen vermischt, um das MHC-Klasse-II-Heterodimer zu bilden.
Kozono et al. (Nature 369: 151–154, 1994) beschreibt die Expression eines heterodimeren (d. h. aus zwei getrennten Untereinheiten bestehenden) MHC-Klasse-II-Moleküls aus einem einzelnen Baculovirus-Konstrukt, das zur getrennten Expression der α- und β-MHC-Klasse-II-Untereinheiten fähig ist. Die getrennt exprimierten α- und β-Untereinheiten verbinden sich dann innerhalb der infizierten Insektenzelle, um das MHC-Klasse-II-Heterodimer zu bilden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Einzelkette-MHC-Klasse-II-Molekül, umfassend in Sequenz kovalent gebunden: 1) eine Klasse-II-β-Kette, 2) einen Einzelketten-Linker und 3) eine Klasse-II-α-Kette, wobei das Einzelketten-MHC-Klasse-II-Molekül weiter ein präsentierendes Peptid, das nicht-kovalent an eine Peptid-Bindungsfurche des MHC-Moleküls gebunden ist, umfasst, wobei die Klasse-II-β-Kette eine β2-Kette umfasst, multivalente MHC-Komplexe und Verwendungen solcher MHC-Moleküle und -Komplexe.
Wir haben entdeckt, dass Einzelketten-MHC-Klasse-Komplexe ohne ein kovalent gebundenes präsentierendes Peptid (d. h. ein leerer MHC-Komplex) geladen werden kann, indem ein präsentierendes Peptid mit dem Komplex so in Kontakt ge bracht wird, dass das präsentierende Peptid an die Peptid-Bindungsfurche des Komplexes nicht-kovalent bindet. Im Allgemeinen wird das präsentierende Peptid nicht-kovalent an die Peptid-Bindungsfurche des leeren MHC-Komplexes über eine stabile Wasserstoffbindung binden. Die erfindungsgemäßen Einzelketten-MHC-Klasse-II-Komplexe sind überraschender Weise stabil und für eine Vielzahl von Applikationen verwendbar. Zum Beispiel können beladene MHC-Klasse-II-Moleküle oder Einzelketten-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionskomplexe verwendet werden, um verschiedene Immunantworten in einem Säugetier zu modulieren, z. B. T-Zell-Apoptose, T-Zell-Anergie, T-Zell-Cytokin-Freisetzung, Immunsuppression und Induktion von T-Zellen. Leere MHC-Moleküle, insbesondere leere Einzelketten-MHC-Klasse-II-Moleküle, sind verwendbar z. B. bei in vitro-Screens zum Nachweis von Peptiden, die die Aktivität von T-Zellen modulieren, einschließlich Peptiden, die T-Zell-Rezeptor-Antagonisten und Teil-Agonisten darstellen.
Wir haben kürzlich höchst nützliche MHC-Klasse-I- und Klasse-II-Peptid-Fusionsmoleküle in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US95/09816, eingereicht am 31. Juli 1995, sowie der US-Anmeldung Seriennr. 08/382,454, eingereicht am 1. Februar 1995, offenbart. Die MHC-Fusionskomplexe umfassen ein präsentierendes Peptid, das kovalent (d. h. fusioniert) an das MHC-Molekül gebunden ist.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Ausdruck "präsentierendes Peptid" ein Peptid, das zur Modulation der Aktivität eines T-Zell-Rezeptors fähig ist, entweder eine T-Zell-Proliferation zu induzieren, eine T-Zell-Entwicklung zu inhibieren oder zu inaktivieren, wie es durch die unten offenbarten Assays bestimmt wird, einschließlich dem Assay, der die aufeinander folgenden Schritte der Kultivierung von T-Zellen einschließt, um dieselben zu proliferieren, und das In-Kontakt-Bringen der T-Zellen mit einem Einzelketten-MHC-Peptid-Fusionskomplex oder einem erfindungsgemäßen beladenen Einzelketten-MHC-Komplex und der anschließenden Bestimmung, ob der Komplex die Weiterentwicklung der T-Zellen inhibiert.
Der Ausdruck "leer" (insbesondere "leeres MHC-Molekül" oder ein ähnlicher Wortlaut), wie hier verwendet, bezeichnet ein in der Erfindung verwendetes MHC-Molekül (Klasse-I oder II), das kovalent oder nicht kovalent an ein präsentierendes Peptid gebunden ist. Vorzugsweise gehört das leere MHC-Molekül der Klasse-II an und umfasst eine einzelne Polypeptidkette statt getrennter Polypeptide.
Der Ausdruck "beladen" (insbesondere "beladenes MHC-Molekül" oder ein ähnlicher Wortlaut), wie hier verwendet, bezeichnet ein leeres MHC-Molekül (Klasse-I oder II), das ein präsentierendes Peptid einschließt, das nicht kovalent an die Peptid-Bindungsfurche oder -spalte des MHC-Moleküls gebunden ist, vorzugsweise in einer Weise, so dass das beladene MHC-Molekül die Aktivität der T-Zellen modulieren kann. Die nicht-kovalente Bindung wird geeigneterweise über eine stabile Wasserstoffbindung zwischen dem präsentierenden Peptid und der Peptid-Bindungsfurche oder -spalte des leeren MHC-Moleküls hergestellt. Die nicht-kovalente Bindung kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Vorzugsweise gehört das beladene MHC-Molekül der Klasse-II an und umfasst eine einzelne Polypeptidkette statt getrennter Polypeptide.
Die erfindungsgemäßen Einzelketten-MHC-Peptid-Fusionskomplexe als auch die hier offenbarten besitzen eine Anzahl von signifikanten Vorteilen. Zum Beispiel erforderte die bisherige Praxis die Aufreinigung von MHC-Molekülen, die zuvor mit Peptiden aus Antigen-präsentierenden Zellen beladen worden sind. Solche beladenen Peptide waren im Allgemeinen fest gebunden und konnten nicht in effizienter Weise mit dem Peptid von Interesse ausgetauscht werden. Im Gegensatz dazu können die hier offenbarten MHC-Komplexe oder die Einzelketten-MHC-Klasse-II-Komplexe der Erfindung ein einzelnes antigenisches Peptid enthalten, einschließlich eines Peptids mit bekannter Struktur. Eine Analyse der Interaktionen mit T-Zell-Rezeptoren wird durch Verwendung solcher MHC-Moleküle ermöglicht. Zusätzlich kann eine große Vielzahl von Peptiden für eine Interaktion mit T-Zellen aufgrund der Tatsache, dass nur eine kleine Anzahl (ca. 4 bis 6) an Aminosäuren in dem präsentierenden Peptid zu Bindung an ein bestimmtes MHC-Molekül wichtig sind, präsentiert werden. Das bedeutet, dass eine Bibliothek von unterschiedlichen Peptiden, die lediglich aufgrund ihrer MHC-Ankerreste beschränkt sind, kovalent an das MHC-Molekül zur Präsentation von T-Zellen gebunden werden können. Ferner kann für therapeutische Anwendungen statt einer Verabreichung eines MHC-Moleküls an ein Subjekt ein DNA-Expressionsvektor, der für das MHC-Molekül, das an das präsentierende Peptid gebunden ist, kodiert, zur in vivo-Expression des MHC-Fusionskomplexes verabreicht werden. Ein solcher Ansatz vermeidet kostenintensive Aufreinigungsschritte, die mit der Herstellung von rekombinanten Proteinen verbunden sind, und vermei det die Komplexitäten einer Antigen-Aufnahme und -Verarbeitung, wie sie mit konventionellen Verfahrensweisen verbunden sind.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten leeren MHC-Moleküle besitzen auch eindeutige Vorteile. Zum Beispiel können leere Einzelketten-MHC-Klasse-II-Moleküle leicht mit verschiedenen geeigneten präsentierenden Peptiden kombiniert werden, um beladene MHC-Moleküle zu bilden. Die Fähigkeit, erfindungsgemäße leere MHC-Moleküle in zweckmäßiger Weise zu beladen, ermöglicht das Durchmustern von vielen präsentierenden Peptiden, um die Fähigkeit von jedem präsentierenden Peptid zu bestimmen, die T-Zell-Rezeptor-Aktivität zu modulieren.
Die in der Erfindung verwendeten leeren MHC-Moleküle, z. B. leere Einzelketten-MHC-Klasse-II-Moleküle, können als ein stabiles Polypeptid in einer löslichen Form oder auf der Oberfläche von Säugetierzellen exprimiert werden. In jeder Form kann das leere MHC-Molekül mit einem geeigneten präsentierenden Peptid in Kontakt gebracht werden, um ein beladenes MHC-Molekül mit einer gewünschten T-Zell-modulierenden Aktivität zu bilden. Erfindungsgemäße Einzelketten-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionsmoleküle umfassen ein präsentierendes Peptid, das kovalent an den N-Terminus der α- oder β-Kette des MHC-Proteins gebunden ist. Zum Beispiel besitzt ein Einzelketten-MHC-Klasse-II-Molekül ein präsentierendes Peptid, das kovalent an die MHC-α- oder -β-Kette gebunden ist. Vorzugsweise ist das präsentierende Peptid an den N-Terminus der α- oder β-Kette über einen Peptid-Linker verbunden.
Erfindungsgemäße Einzelketten-MHC-Peptid-Fusionsmoleküle können verkürzt sein (insbesondere kann ein Transmembranteil fehlen) oder können in "voller Länge" vorliegen und einen Transmembranteil oder Teile davon und eine cytoplasmatische Domäne oder Teile davon einschließen. Wie unten genauer diskutiert, werden für einige Ansätze ein MHC-Molekül in geeigneter Weise eingesetzt, das keinen Transmembranteil enthält, während für andere Anwendungen MHC-Moleküle eingesetzt werden, die einen Transmembranteil und/oder einen cytoplasmatischen Teil und/oder andere solche Domänen enthalten. In einigen Fällen, bei denen ein MHC-Molekül keine Transmembrandomäne oder einen Teil davon enthält, können eine oder mehrere hydrophile Aminosäuren, vorzugsweise etwa 1 bis 10 Histidine zu dem MHC-Molekül hinzugefügt werden, um die Lösbarkeit zu erhöhen.
Die erfindungsgemäßen Einzelketten-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionskomplexe umfassen vorzugsweise eine flexible Linkersequenz, die zwischen dem MHC-Protein und dem präsentierenden Peptid liegt. Die Linkersequenz sollte eine wirksame Positionierung des präsentierenden Peptids in Bezug auf die MHC-Molekül-Bindungsfurche ermöglichen, so dass das präsentierende Peptid die Aktivität eines T-Zell-Rezeptors modulieren kann, um entweder eine T-Zell-Proliferation zu induzieren oder eine T-Zell-Entwicklung zu inhibieren oder zu inaktivieren, wie es durch die unten offenbarten Assays bestimmt wird, einschließlich der in vitro-Assays, welche die aufeinander folgenden Schritte der Kultivierung von T-Zellen einschließen, um dieselben zu proliferieren, und das In-Kontakt-Bringen der T-Zellen mit einem Einzelketten-MHC-Peptid-Fusionskomplex und der anschließenden Bestimmung, ob der MHC-Komplex die Weiterentwicklung der T-Zellen inhibiert.
Wie weiter hier im Zusammenhang mit den MHC-Peptid-Fusionskomplexen offenbart, können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten MHC-Komplexe Einzelketten-Fusionsproteine sein, d. h. solche, in denen die α- und β-Ketten-Untereinheiten als ein Einzelketten-Fusionsprotein verbunden sind und in denen das präsentierende Peptid vorzugsweise an die β-Kette des Fusionsproteins gebunden ist. Solch ein verknüpfter Einzelkettenkomplex weist eine Vielzahl von Vorteilen auf. Insbesondere können beim Reduzieren des Komplexes zu einem Einzelmolekül die Ausbeute und Stabilität der Moleküle erhöht werden. Dies ist insbesondere für lösliche Moleküle wichtig, die nicht in effizienter Weise in aktiver Form hergestellt werden. Die Einzelketten-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionskomplexe der vorliegenden Erfindung sind für die hier offenbarten Verfahren verwendbar, einschließlich zur in vitro-Identifikation von Peptiden, die von einem T-Zell-Rezeptor erkannt werden, Verfahren zum Supprimieren einer Immunantwort (z. B. Behandlung von Individuen mit Immunerkrankungen wie Autoimmunerkrankungen oder Allergien) und Verfahren zum Induzieren einer erwünschten Immunantwort, z. B. in denen ein Säugetier in dessen Immunfähigkeit eingeschränkt ist oder wahrscheinlich werden wird, beispielsweise in denen das Immunsystem durch eine virale Infektion (z. B. AIDS) oder Chemotherapie (z. B. Strahlungstherapie zur Behandlung von Krebs) supprimiert ist, und diagnostische Verfahren wie HLA-Typisierung und diagnostisches in vivo-Imaging. Eine direkte Verabreichung eines DNA-Konstrukts, das für einen Einzelketten-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionskomplex kodiert, ist auch bevorzugt.
Auch sind hier Verfahren zur in vitro-Identifikation von Peptiden beschrieben, welche von einem T-Zell-Rezeptor erkannt werden, einschließlich Peptiden, die eine T-Zell-Entwicklung induzieren können, und Peptiden, die auf T-Zell-Rezeptoren in antagonistischer Weise wirken, d. h. T-Zell-Rezeptor(TcR)-Antagonisten oder Teil-Agonisten, und Verfahren zum Supprimieren einer Immunantwort in einem Säugetier, insbesondere einem Menschen, welche die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Einzelketten-MHC-Komplexes, vorzugsweise von Einzelketten-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionskomplexen oder beladenen Einzelketten-MHC-Klasse-II-Komplexen an das Säugetier umfassen. Die Verfahren schließen die Behandlung eines Säugetiers ein, das an einer Autoimmunerkrankung wie multiple Sklerose, insulinabhängige Diabetes mellitus oder rheumatoide Arthritis leidet oder dafür anfällig ist oder, alternativ, ein Säugetier, das für eine unerwünschte Immunantwort(en) anfällig ist, wie z. B. ein Subjekt mit chronischen Allergien oder ein Patient, bei dem eine Transplantatsoperation wie eine Organ- oder Hauttransplantatsoperation durchgeführt worden ist.
Eine Immunantwort kann durch eine oder eine Kombination von alternativen Strategien supprimiert werden. Daher sind hier Behandlungsverfahren zur Suppression einer Immunantwort durch Induzieren einer Anergie oder Apoptose von T-Zellen offenbart und es wird die Verabreichung einer wirksamen Menge eines oder mehrerer erfindungsgemäßer MHC-Komplexe, vorzugsweise Einzelketten-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionskomplexe oder beladene Einzelketten-MHC-Klasse-II-Komplexe beschrieben, wobei im Wesentlichen kein(e) co-stimulatorische(s) Signal(e) vorliegen. Typischerweise wird ein verkürzter erfindungsgemäßer MHC-Komplex eingesetzt, d. h. ein löslicher MHC-Komplex, der keine Transmembran- und cytoplasmatische Domänen von MHC-Molekülen mit voller Länge oder intakten MHC-Molekülen oder Teilen davon enthält. Ein weiteres Verfahren zur Suppression einer Immunantwort betrifft die Verabreichung einer wirksamen Menge eines oder mehrerer MHC-Fusionskomplexe oder beladener MHC-Moleküle, die ein präsentierendes Peptid enthalten, das ein T-Zell-Antagonist oder ein Teil-Agonist ist.
Wie hier weiter in Bezug auf MHC-Peptid-Fusionskomplexe, die ein präsentierendes Peptid enthalten, das ein T-Zell-Rezeptor-Antagonist oder -Teil-Agonist ist, offenbart, können die erfindungsgemäßen MHC-Moleküle, die solche präsentierenden Peptide umfassen, als ein löslicher MHC-Fusionskomplex, dem co- stimulatorische Signale fehlen, verabreicht werden. Alternativ kann eine Verabreichung auch in der Form einer wirksamen Menge einer DNA-Sequenz, die einen Vektor umfasst, der für einen MHC-Fusionskomplex mit "voller Länge" kodiert, d. h. einen Komplex, der MHC-Proteine mit voller Länge enthält, einschließlich des Transmembran-Teils und einem präsentierenden Peptid mit einer Antagonisten- oder Teil-Agonisten-Aktivität, das kovalent an das MHC-Molekül gebunden ist, vorgenommen werden.
Auch sind hier Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort in einem Säugetier beschrieben, die im Allgemeinen die Verabreichung einer wirksamen Menge einer DNA-Sequenz, die einen Vektor umfasst, der für einen MHC-Fusionskomplex mit "voller Länge" kodiert, d. h. ein Komplex, der MHC-Proteine mit voller Länge enthält, einschließlich des Transmembran-Teils und eines präsentierenden Peptids, das kovalent an das MHC-Molekül gebunden ist. Alternativ kann der Vektor für einen leeren Einzelketten-MHC-Komplex kodieren, wobei der exprimierte Komplex mit einem geeigneten präsentierenden Peptid unter Bedingungen, die das beladene Molekül bilden, in Kontakt gebracht wird. Vorzugsweise wird DNA, die für einen MHC-Fusionskomplex mit voller Länge kodiert, an ein Säugetier zusammen mit einer DNA-Sequenz, die für einen T-Zell-co-stimulatorischen Faktor kodiert, wie einem Gen, das für B7 oder B7-2 kodiert, verabreicht. Wie hier verwendet, bezeichnet der Ausdruck "T-Zell-co-stimulatorischer Faktor" ein Peptid, das fähig ist, ein co-stimulatorisches Signal zu erzeugen, um dadurch die T-Zell-Proliferation in der Gegenwart eines oder mehrerer MHC-Fusionskomplexe zu aktivieren. Eine solche Aktivierung der T-Zell-Proliferation kann durch die hier offenbarten Assays bestimmt werden, einschließlich des Assays, der in Beispiel 9 beispielhaft beschrieben ist und unten diskutiert wird. Ferner sind diagnostische Verfahren beschrieben, einschließlich der HLA-Typisierung und des diagnostischen in vivo-Imaging unter Verwendung von MHC-Fusionskomplexen oder beladenen MHC-Molekülen, einschließlich MHC-Fusionskomplexen oder beladenen MHC-Molekülen, die einen radioaktiven Marker enthalten (z. B. ¹²⁵I, ³²P oder ⁹⁹Tc) oder eine andere nachweisbare Markierung. Weitere Aspekte der Erfindung sind unten diskutiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A und 1B zeigen einen MHC-Fusionskomplex, der eine Linkersequenz einschließt. 1C zeigt schematisch einen MHC-Fusionskomplex, der an ein Immunglobulin gebunden oder fusioniert ist.
2 zeigt das Schema zum Isolieren des I-A^d α1-α2-Genfragments und die Klonierung davon. 8 benennt die in dem beschriebenen Verfahren verwendeten Oligonukleotid-Primer.
3 zeigt das Schema zum Isolieren des I-A^d β1-β2-Genfragments, das Anheften der Linkersequenz und das Einführen der Oligonukleotide, die für die antigenischen Peptide kodieren. 8 bestimmt die in dem beschriebenen Verfahren verwendeten Oligonukleotid-Primer.
4 zeigt das Klonierungsschema für humanes HLA-DR1 α1-α2. 8 bestimmt die in dem beschriebenen Verfahren verwendeten Oligonukleotid-Primer.
5 zeigt das Klonierungsschema für die humane HLA-DR1 β1-β2-Kette. 8 bestimmt die in dem beschriebenen Verfahren verwendeten Oligonukleotid-Primer.
6 zeigt das Schema zur Isolierung des I-A^s α1-α2-Genfragments und die Klonierung davon. 8 bestimmt die in dem beschriebenen Verfahren verwendeten Oligonukleotid-Primer.
7 zeigt das Schema zum Isolieren des I-A^s β1-β2-Genfragments, das Anheften der Linkersequenz und das Einführen der Oligonukleotide, die für die antigenischen Peptide kodieren. 8 bestimmt die in dem beschriebenen Verfahren verwendeten Oligonukleotid-Primer.
8 (SEQ ID NOs: 26–74) zeigt die Sequenzen der zur Herstellung der MHC-Fusionskomplexe verwendeten Oligonukleotide.
9 (welche die 9A–9F einschließt) (SEQ ID NOs: 75–98) zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von löslichen MHC-Fusionskomplexen.
10A und 10B zeigen die Säugetierzell-Expressionsvektoren, die in dem folgenden Beispiel 2 verwendet wurden.
11A und 11B zeigen DNA-Konstrukte, die in dem folgenden Beispiel 2 beschrieben sind. In den 11A und 11B (und 15, 16A und 16B) bezeichnet die Abkürzung "PE" einen Promotor und Enhancer, die Abkürzung "LS" bezeichnet ein Leitsequenz-Exon und die Abkürzung "HC" bezeichnet eine schwere Kette.
12 zeigt das Schema zum Einführen von Restriktionsstellen in das 2,7 kB große Insert der kappa-Kette über eine PCR-Stellen-gerichtete Mutagenese.
13 zeigt das Schema zur Herstellung eines Fusionsgens, das für die konstante Region der MHC (Klasse-IIα)/kappa-Kette in einen Säugetierzell-Expressionsvektor kodiert.
14 (SEQ ID NOs: 99–102) zeigt die Primer, die für die Sequenzierung des mutierten 2,7-kB-Fragments verwendet wurden.
15 zeigt das Schema zur M13-Mutagenese und die Klonierung des MHC II β-variablen Gens.
16A und 16B zeigen Vektoren zur Expression von chimären MHC II/Ig-Proteinen.
17 zeigt das Schema zur Herstellung eines Expressionsvektors für den MHC-Fusionskomplex voller Länge.
18A und 18B (SEQ ID NOs: 103–109) zeigen die DNA- und Aminosäuresequenzen von MHC-Fusionskomplexen mit voller Länge.
19 (insgesamt 7 Blätter) zeigt das Klonierungsschema, das in dem folgenden Beispiel 12 durchgeführt worden ist. 20 beschreibt die in dem beschriebenen Klonierungsschema verwendeten Oligonukleotid-Primer.
20 (SEQ ID NOs: 110–112) beschreibt die für die Herstellung der MHC-Fusionskomplexe verwendeten Sequenzen von Oligonukleotid-Primern.
21 zeigt graphisch die funktionelle Aktivität der vier Klone des Beispiels 13 zusammen mit einer Negativkontrolle (NSO) und einer Positivkontrolle (A20), wobei der Wert der optischen Dichte der ersten vier Verdünnungen des Überstands der DO11.10-Kultur gezeigt ist.
22 zeigt graphisch die Ergebnisse des T-Zell-Proliferations-Assays von dem folgenden Beispiel 15.
23 zeigt graphisch die Ergebnisse des T-Zell-Proliferations-Assays von dem folgenden Beispiel 16.
24 beschreibt einen Einzelketten-MHC-Fusionskomplex.
25 (insgesamt 4 Blätter) zeigt das in dem folgenden Beispiel 17 durchgeführte Klonierungsschema.
26 (SEQ ID Nos: 113–120) beschreibt die Sequenzen der Oligonukleotid-Primer, die für die Herstellung der MHC-Fusionskomplexe verwendet wurden.
27 (SEQ ID NO: 121) zeigt die DNA- und Aminosäurensequenzen des Gens der SSC1-Einzelkette.
28 (SEQ ID NO: 122) zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen des Gens der SCT1-Einzelkette.
29 (SEQ ID NO: 123) zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen des Gens der SCE1-Einzelkette.
30 ist eine schematische Darstellung des Gens, das für das Einzelketten-IA^d/OVA 323–229-MHC-Fusionsmolekül (d. h. sc-IA^d/OVA) kodiert. Die Kozak-Konsensus-Sequenz ist eingezeichnet. Der Pfeil bezeichnet die Signal-Peptidase-Spaltungsstelle. "//" in den IA^d β1-β2- und IA^d α-Domänen stellen Aminosäure- und Nukleotidsequenzen in 28 dar, die aus Klarheitsgründen weggelassen wurden. Das OVA 323–339-Peptid (gestrichelte Linie) fehlt in dem sc-IA^d/Blank-MHC-Molekül.
31A und 31B sind Diagramme, welche die Zelloberflächenexpression (31A) und die T-Zell-induzierende Aktivität (31B) des sc-IA^d/OVA-Moleküls veranschaulichen.
32 ist eine Aufnahme von zwei Gelen, welche die Expression des sc-IA^d-MHC-Moleküls mit einem kovalent gebundenen OVA-Peptid (sc-IA^d/OVA) und ohne OVA-Peptid (sc-IA^d/Blank) in Insektenzellen zeigt.
33 ist ein Diagramm, das das sc-IA^d-OVA-Protein zeigt, das die IL-2-Expression in T-Zellen induziert.
34A, 34B und 34C sind Diagramme, die veranschaulichen, dass sc-IA^d/OVA und sc-IA^d/gD die IL-2-Expression in T-Zellen induzieren. 34C zeigt, dass ein beladenes sc-IA^d-Molekül (mittlere Säule) T-Zellen stärker induziert als der entsprechende sc-Fusionskomplex (rechte Säule).
35 ist eine Aufnahme eines Ethidiumbromid-gefärbten Gels, das zeigt, dass der anti-T-Zell-Rezeptor-Antikörper (anti-TcR-mAb) oder sc-IA^d/OVA eine T-Zell-Apoptose induzieren kann. Die Nukleosomenleiter in den Bahnen 3 und 4 sind ein Kennzeichen für eine Apoptose.
36A und 36B sind Diagramme, die zeigen, dass eine in vivo-Expression von sc-IA^d/OVA eine klonale T-Zell-Expansion supprimiert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben diskutiert, haben wir MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionskomplexe und Expressionsvektoren, die für solche Komplexe kodieren, und Verfahren zur Verwendung von solchen Fusionskomplexen und Expressionsvektoren identifiziert.
Im Allgemeinen kann die Herstellung von MHC-Peptid-Fusionskomplexen durch die hier beschriebenen Verfahren und durch anerkannte rekombinante DNA-Techniken bewirkt werden, beispielsweise durch Herstellung von Plasmid-DNA, Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen, Ligation von DNA, Transformation oder Transfektion eines Wirts, Kultivierung des Wirts und Isolierung und Aufreinigung des exprimierten Fusionskomplexes. Solche Verfahren sind im Allgemeinen bekannt und offenbart, z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning (2. Aufla ge 1989). Wie unten noch genauer erklärt, sind diese Verfahren auch zur Herstellung von leeren und beladenen MHC-Molekülen, wie sie in der Erfindung verwendet worden sind, geeignet. Das bedeutet, dass zur Herstellung von leeren und beladenen MHC-Molekülen die folgenden Verfahren und Beispiele zur Herstellung von MHC-Fusionskomplexen eingesetzt werden können, mit der Ausnahme, dass die DNA-Sequenz, die für das fusionierte präsentierende Peptid kodiert, nicht in einem Genkonstrukt, das für das leere/beladene Molekül kodiert, eingeschlossen ist, oder das gebildete Fusionskonstrukt wird mit geeigneten rekombinanten Techniken behandelt, um den gebundenen Teil des präsentierenden Peptids, wie unten beispielhaft dargestellt, zu entfernen. Ferner sind die folgenden Diskussionen, die sich auf das MHC-Fusionsmolekül beziehen, z. B. bevorzugte präsentierende Peptide, bevorzugte Linker, Molekulargewichte des Moleküls, usw., auch für leere und beladene MHC-Moleküle, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, anwendbar.
Genauer gesagt wird eine DNA, die für ein gewünschtes MHC-Protein kodiert, von einer geeigneten Zelllinie, wie sie beispielsweise in dem folgenden Beispiel 1 offenbart ist, erhalten. Andere DNA-Quellen, die für ein MHC-Protein kodieren, sind bekannt, z. B. humane lymphoblastoide Zellen. Nach der Isolierung kann das Gen, das für das MHC-Molekül kodiert, durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder durch andere bekannte Maßnahmen auf dem Gebiet amplifiziert werden. Geeignete PCR-Primer zur Amplifikation des MHC-Peptidgens können Restriktionsstellen des PCR-Produkts zufügen. Zum Beispiel umfasst das PCR-Produkt zur Expression eines verkürzten Fusionskomplexes, insbesondere eines löslichen MHC-Fusionskomplexes, der keine Transmembran- oder cytoplasmatische Teile enthält und an ein Immunglobulin gebunden ist, wie IgG, vorzugsweise IgG-Spleißstellen und Leitsequenzen, die für eine saubere Expression und Sekretion des MHC-Immunglobulin-Fusionskomplexes notwendig sind. Das PCR-Produkt umfasst vorzugsweise eine Sequenz, die für die Linkersequenz kodiert, oder eine Restriktionsenzymstelle zur Ligation einer solchen Sequenz. Geeignete PCR-Primer, PCR-Bedingungen und Konstruktionstechniken für Expressionsvektoren sind beispielsweise in den folgenden Beispielen und den Zeichnungen offenbart.
Die Linkersequenz des präsentierenden Peptids ist vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, die für ein Peptid kodiert, das wirksam das präsentierende Peptid in der Bindungsfurche des MHC-Moleküls positionieren kann. Der hier verwendete Ausdruck "das präsentierende Peptid wird wirksam in die Bindungsfurche eines MHC-Moleküls positioniert" oder "MHC-Fusionskomplex der zur Modulation der Aktivität einer T-Zelle fähig ist" oder andere, ähnliche Wortlaute sollen die Bedeutung haben, dass das präsentierende Peptid, das an ein MHC-Protein gebunden ist, so positioniert ist, dass das präsentierende Peptid und der Fusionskomplex zur Modulation der Aktivität eines T-Zell-Rezeptors fähig ist, entweder um die T-Zell-Proliferation zu induzieren oder zu inhibieren oder um eine T-Zell-Entwicklung zu inaktivieren, wie es durch einen der unten offenbarten Assays bestimmt werden kann, einschließlich des Assays, der die aufeinander folgenden Schritte der Kultivierung von T-Zellen einschließt, um dieselben zu proliferieren, und das In-Kontakt-Bringen der T-Zellen mit einem erfindungsgemäßen MHC-Fusionskomplex und der anschließenden Bestimmung, ob der MHC-Fusionskomplex die Weiterentwicklung der T-Zellen inhibiert.
Vorzugsweise umfasst die Linkersequenz des präsentierenden Peptids etwa 7 bis 20 Aminosäuren, bevorzugter etwa 8 bis 16 Aminosäuren, noch bevorzugter sind etwa 8 bis 12 Aminosäuren. Die Linkersequenz ist vorzugsweise flexibel, so dass das präsentierende Peptid nicht in einer einzelnen unerwünschten Konformation gehalten wird. Der Linker umfasst vorzugsweise hauptsächlich Aminosäuren mit kleinen Seitenketten wie Glycin, Alanin und Serin, um die Flexibilität zu gewährleisten. Vorzugsweise umfassen etwa 80 oder 90% der Linkersequenz oder mehr Glycin-, Alanin- oder Serinreste, vorzugsweise Glycin- und Serinreste. Vorzugsweise enthält die Linkersequenz keine Prolinreste, welche die Flexibilität hemmen könnten. Bei einem MHC-Fusionskomplex, der ein MHC-Klasse-II-Molekül enthält, ist die Linkersequenz in geeigneter Weise an die β-Kette des MHC-Moleküls gebunden, obwohl die Linkersequenz auch an die α-Kette des MHC-Moleküls angeheftet werden könnte. Um ein präsentierendes Peptid mit einem MHC-Klasse-II-β-Ketten-Molekül kovalent zu verbinden, sollte die Aminosäuresequenz des Linkers fähig sein, etwa 30 Å von dem N-terminalen Rest der MHC-Klasse-II-β-Kette bis zu dem C-terminalen Rest des präsentierenden Peptids zu umspannen. Siehe z. B. 1A und 1B der Zeichnungen. Wenn eine solche β+-Peptidkette zusammen mit der α-Kette exprimiert wird, sollte das verbundene präsentierende Peptid in die α1- und β1-Bindungsfurche gefaltet werden, was ein funktionelles MHC-Molekül, wie allgemein in 1 beschrieben, ergibt. Eine andere geeignete Linkersequenz ist ASGGGGSGGG (SEQ ID NO: 1) (d. h. Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly), vorzugsweise verbunden an die erste Aminosäure der β1-Domäne des MHC-Klasse-II-Proteins. Es können unterschiedliche Linkersequenzen verwendet werden, einschließlich einer beliebigen Anzahl von flexiblen Linker-Designs, die erfolgreich verwendet wurden, um die variablen Regionen von Antikörpern miteinander zu verknüpfen [siehe M. Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97–105 (1991)]. Geeignete Linkersequenzen können leicht empirisch gefunden werden. Zum Beispiel kann ein DNA-Konstrukt, das für einen MHC-Fusionskomplex kodiert, der eine Linkersequenz einschließt, kloniert und exprimiert werden und der Fusionskomplex kann getestet werden, um zu bestimmen, ob der Komplex zur Modulation der Aktivität eines T-Zell-Rezeptors fähig ist, entweder um eine T-Zell-Proliferation zu induzieren oder zu inhibieren oder eine T-Zell-Entwicklung zu inaktivieren, wie durch den unten offenbarten Assay bestimmt. Die geeignete Größe und die Sequenzen von Linkersequenzen können auch durch konventionelle Computer-Modellierungstechniken bestimmt werden, basierend auf der vorhergesagten Größe und Form des MHC-Moleküls.
Vorzugsweise werden die Restriktionsstellen in dem DNA-Konstrukt, das die fusionierten Nukleotidsequenzen umfasst, die für die Linkersequenz und das MHC-Protein kodieren, so entworfen, dass im Wesentlichen jede Nukleotidsequenz, die für ein präsentierendes Peptid von Interesse kodiert (z. B. entweder ein antigenisches oder ein antagonistisches präsentierendes Peptid) an das Konstrukt angeheftet werden kann. Zum Beispiel sind in einem bevorzugten System, das beispielhaft in den folgenden Beispielen dargestellt ist, geeignete Restriktionsstellen (z. B. AflII- und NheI-Stellen) zwischen dem Ende der Leitsequenz und dem Anfang des Linkers eingeschlossen, um die Einführung einer Vielzahl von präsentierenden Peptiden in das Gen der β-Kette des MHC-Moleküls zu ermöglichen. Siehe z. B. 3 der Zeichnungen. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von spezifisch bevorzugten Leitsequenzen sind in den 18A und 18B der Zeichnungen gezeigt.
Der Bestandteil eines präsentierenden Peptids eines MHC-Fusionskomplexes sollte in der Lage sein, die Aktivität einer T-Zelle, wie unten diskutiert, zu modulieren. Bei einem MHC-Fusionskomplex, der ein Klasse-II-MHC-Molekül enthält, hat das präsentierende Peptid vorzugsweise eine Länge von etwa 4 bis 35 Aminosäuren, bevorzugter etwa 6 bis etwa 30 Aminosäuren, noch mehr bevorzugt etwa 8 bis etwa 25 Aminosäuren. Bei einem MHC-Fusionskomplex, der ein Klasse-I-MHC-Molekül enthält, hat das präsentierende Peptid vorzugsweise eine Länge von etwa 4 bis 25 Aminosäuren, bevorzugter etwa 6 bis 20 Aminosäuren, noch mehr bevorzugt etwa 6 bis etwa 15 Aminosäuren, wobei etwa 8 bis etwa 10 Aminosäuren noch bevorzugter sind. Klasse-I- und Klasse-II-MHC-Moleküle zeigen eine bevorzugte Bindung an die unterschiedlichen Peptidsequenzen. Kürzlich wurden Anker-Reste, die MHC-Allel-spezifische Peptid-Motive, definieren, in Klasse-II-Bindungspeptiden identifiziert [F. Sinigaglia et al., Curr. Opin. in Immun. 6: 52–56 (1994)]. Zum Beispiel ist in humanen Klasse-II-HLA-DR1-Molekülen eine aromatische Aminosäure (z. B. Tyr, Phe oder Trp) gewöhnlich am Amino-Terminus des Peptids (Position 1), ein hydrophober Rest (z. B. Met oder Leu) an Position 4 und eine kleine Aminosäure (z. B. Ala oder Gly) an Position 6 anzutreffen. Andere MHC-Moleküle haben unterschiedliche Motive, siehe z. B. für Klasse-II-Moleküle Sinigaglia, supra, für Klasse-I-Moleküle [siehe K. Parker et al., J. Immunol. 152: 163–175 (1994)]. Bevorzugte präsentierende Peptide umfassen das gewünschte MHC-Bindungsmotiv, um eine optimale MHC-Bindung zu ermöglichen. Daher ist z. B. in humanen Klasse-II-HLA-DR1-MHC-Molekülen eine aromatische Aminosäure (z. B. Tyr, Phe oder Trp) vorzugsweise in der Nähe des Amino-Terminus des präsentierenden Peptids (Position 1), ein hydrophober Rest (z. B. Met oder Leu) an Position 4 des präsentierenden Peptids und eine kleine Aminosäure (z. B. Ala oder Gly) an Position 6 des präsentierenden Peptids anzutreffen. Bei Immunsuppressionsverfahren (z. B. um Autoimmunerkrankungen oder Allergien zu behandeln oder anderweitig eine nicht-gewollte T-Zell-Antwort zu supprimieren), kann das präsentierende Peptid vorzugsweise dasselbe sein oder homolog (z. B. mindestens mehr als etwa 80 oder 90% der gemeinsamen Sequenz) zu einem Peptid sein, das dafür bekannt ist oder von dem angenommen wird, dass es für die Aktivierung von T-Zellen in der betroffenen Erkrankung verantwortlich ist. Daher wird z. B. das MPB-Peptid 80–105 von mehr als 30% der MPB-spezifischen T-Zellen, die aus Patienten mit multipler Sklerose isoliert wurden, erkannt [siehe E. Meinl et al., J. Clin. Invest. 92: 2633–2643 (1993)] und sollten als ein präsentierendes Peptid in MHC-Fusionskomplexen, die für die hier offenbarten Immunsuppressionsanwendungen. verwendet werden, geeignet sein. Zusätzlich kann die Aktivität eines bestimmten: präsentierenden Peptids, d. h. ein antigenisches oder antagonistisches oder ein Teil-Agonist leicht in empirischer Weise durch die hier offenbarten Verfahren bestimmt werden, einschließlich der unten beschriebenen in vivo-Assays.
Um den Vektor, der für einen MHC-Fusionskomplex kodiert, herzustellen, wird die Sequenz, die für das MHC-Molekül kodiert, an eine Sequenz, die für das präsentierende Peptid kodiert, unter Verwendung von geeigneten Ligasen gebunden. DNA, die für das präsentierende Peptid kodiert, kann durch Isolieren von DNA aus natürlichen Quellen oder mittels bekannter synthetischer Verfahren, z. B. das Phosphattriester-Verfahren, erhalten werden. Siehe z. B. Oligonukleotide Synthesis, IRL Press (M. Gait, Hrsg., 1984). Synthetische Oligonukleotide können auch unter Verwendung von kommerziell erhältlichen automatisierten Oligonukleotid-Syntheseapparaten hergestellt werden. Eine Nukleotidsequenz, die für ein MHC-Molekül kodiert, kann direkt mit einer DNA-Sequenz, die für das präsentierende Peptid kodiert, verknüpft werden oder es kann in noch typischerer Weise eine DNA-Sequenz, die für die oben diskutierte Linkersequenz kodiert, zwischen der Sequenz, die für das MHC-Molekül kodiert, und der Sequenz, die für das präsentierende Peptid kodiert, eingefügt werden und mittels geeigneter Ligasen verknüpft werden.
Andere Nukleotidsequenzen können auch in dem Genkonstrukt mit eingeschlossen sein. Zum Beispiel kann eine Promotorsequenz, welche die Expression der Sequenz, die für das an das präsentierende Peptid fusionierte MHC-Peptid kodiert, kontrolliert oder eine Leitsequenz, welche den MHC-Fusionskomplex an die Zelloberfläche oder das Zellkulturmedium leitet, in das Konstrukt eingeschlossen werden oder in dem Expressionsvektor, in den das Konstrukt eingefügt wird, vorliegen. Ein Immunglobulin- oder CMV-Promotor ist besonders bevorzugt. Siehe die folgenden Beispiele. Eine starke Translations-Initiationssequenz kann auch in dem Konstrukt eingeschlossen sein, um die Effizienz der translationalen Initiation zu erhöhen. Eine bevorzugte Initiationssequenz ist die Kozak-Konsensus-Sequenz (CCACCATG) (SEQ ID NO: 2). Siehe auch 18A und 18B der Zeichnungen.
Vorzugsweise enthält eine in einem DNA-Konstrukt eingeschlossene Leitsequenz eine wirksam positionierte Restriktionsstelle, so dass ein für ein präsentierendes Peptid von Interesse kodierendes Oligonukleotid an das MHC-Molekül angeheftet werden kann. Zweckmäßigerweise kann die Restriktionsstelle in das 3'-Ende der Leitsequenz eingefügt werden, was manchmal hier auch als Verknüpfungssequenz bezeichnet wird, z. B. mit einer Länge von etwa 2 bis 10 Kodons, wobei die Verknüpfungssequenz vor der kodierenden Region des präsentierenden Peptids positioniert wird. Eine besonders bevorzugte Restriktionsstelle ist die AflII-Stelle, obwohl andere Spaltungsstellen auch vor der kodierenden Region des präsentierenden Peptids eingefügt werden können. Wie oben diskutiert, ermöglicht die Verwendung einer Restriktionsstelle in Kombination mit einer zweiten Restriktionsstelle, die typischerweise am Anfang der für den Linker kodierenden Sequenz positioniert ist, eine schnelle und zielgerichtete Insertion von Sequenzen, die für eine Vielzahl von präsentierenden Peptiden kodieren, in das DNA-Konstrukt für den MHC-Fusionskomplex. Bevorzugte Leitsequenzen enthalten eine starke Translations-Initiationsstelle und eine Cap-Stelle am 3'-Ende ihrer mRNA. Vorzugsweise ist eine Leitsequenz an die α-Domäne eines Klasse-I-MHC-Moleküls gebunden und vorzugsweise ist eine Leitsequenz an die β-Domäne eines Klasse-II-MHC-Moleküls gebunden. Bevorzugte Leitsequenzen ermöglichen eine sekretorische Expression des MHC-Fusionskomplexes.
Eine Anzahl von Strategien können, wie hier offenbart, eingesetzt werden, um erfindungsgemäße MHC-Fusionskomplexe zu exprimieren. Zum Beispiel kann das oben beschriebene MHC-Gen-Fusionskonstrukt in einen geeigneten Vektor mittels bekannter Maßnahmen, wie z. B. durch Verwendung von Restriktionsenzymen, welche die Schnitte in dem Vektor zur Insertion des Konstrukts machen, eingefügt werden, mit anschließender Ligation. Der Vektor, der das Genkonstrukt enthält, wird dann in einen geeigneten Wirt zur Expression des MHC-Fusionspeptids oder -komplexes eingeführt. Siehe allgemein Sambrook et al., supra. Die Auswahl von geeigneten Vektoren kann empirisch erfolgen, basierend auf Faktoren, die das Klonierungsprotokoll betreffen. Zum Beispiel sollte der Vektor kompatibel mit dem eingesetzten Wirt sein und ein für ihn richtiges Replikon besitzen. Ferner muss der Vektor fähig sein, die DNA-Sequenz, die für den zu exprimierenden MHC-Fusionskomplex kodiert, aufzunehmen. Geeignete Wirtszellen umfassen eukaryontische und prokaryontische Zellen, vorzugsweise solche Zellen, die leicht transformiert werden können und ein schnelles Wachstum im Kulturmedium aufweisen. Insbesondere umfassen bevorzugte Wirtszellen Prokaryonten wie E. coli, Bacillus subtilis, usw. und Eukaryonten wie Tierzellen und Hefestämme, z. B. S. cerevisiae. Säugetierzellen sind im Allgemeinen bevorzugt, insbesondere J558, NSO, SP2-O oder CHO. Andere geeignete Wirte umfassen z. B. Insektenzellen wie SF9. Es werden konventionelle Kultivierungsbedingungen eingesetzt. Siehe Sambrook, supra. Stabile transformierte oder transfizierte Zelllinien können dann ausgewählt werden. Zellen, die einen MHC-Fusionskomplex exprimieren, können anhand bekannter Verfahren bestimmt werden. Zum Beispiel kann die Expression eines MHC-Fusionskomplexes, der an ein Immunglobulin gebunden ist, durch einen ELISA, der spezifisch für das gebundene Immunglobulin ist, und/oder durch ein Immunoblot-Verfahren bestimmt werden.
In einem bevorzugten Protokoll zur Herstellung von geeigneten MHC-Fusionskomplexen werden DNA-Sequenzen, die für das präsentierende Peptid und die β1-β2-Domänen des MHC-Moleküls (Klasse-II) kodieren, so angeordnet, dass das C-terminale Ende des präsentierenden Peptids an eine Anfangs-Aminosäure der β1-Domäne, vorzugsweise die erste Aminosäure der β1-Domäne, über eine flexible Linkersequenz verbunden ist. Ein solches Konstrukt ist in den 1A und 1B der Zeichnungen gezeigt. Für ein Klasse-I-MHC-Molekül ist vorzugsweise die DNA-Sequenz, die für das präsentierende Peptid kodiert, an die α-Domäne des MHC-Moleküls gebunden, vorzugsweise derart, dass das präsentierende Peptid an das Ende des N-Terminus der α-Kette gebunden wird. Wie oben diskutiert, werden bevorzugte Restriktionsstellen zwischen dem Ende der Leitsequenz und dem Anfang des Linkers eingebaut, so dass im Wesentlichen jedes Oligonukleotid, das für ein präsentierendes Peptid von Interesse kodiert (d. h. antigenisches oder antagonistisches), an das Gen für die β-Kette verknüpft werden kann. Für eine lösliche Expression sind die α1-α2- und Peptid-gebundenen β1-β2-Domänen in geeigneter Weise an ein Immunglobulin fusioniert, vorzugsweise an die konstanten Domänen der kappa- bzw. schweren Ketten des Immunglobulins, wie in 1C gezeigt. Bevorzugte Immunglobuline für eine solche Fusion an α und β zur löslichen Expression umfassen z. B. die konstanten Domänen der leichten Kette und die CH2-CH3-Domänen von IgG2b.
Ein exprimierter MHC-Fusionskomplex kann anhand bekannter Verfahren isoliert und aufgereinigt werden. Typischerweise wird das Kulturmedium zentrifugiert und der Überstand wird dann mittels Affinitäts- oder Immuno-Affinitätschromatographie aufgereinigt, z. B. Protein A- oder Protein G-Affinitätschromatographie oder durch ein Immun-Affinitätsprotokoll, das die Verwendung von monoklonalen Antikörpern umfasst, die den exprimierten Fusionskomplex, wie z. B. einen verbundenen MHC oder eine Immunglobulin-Region davon, binden. Zum Beispiel können MHC-Fusionskomplexe, die humane HLA-DR1-Sequenzen enthalten, mittels Affinitätschromatographie auf einer Sepharose-Säule mit monoklonalem Antikörper L243 durch allgemein bekannte und offenbarte Verfahren aufgereinigt werden, z. B. siehe Harlow, E. et al., Antibodies, A Laboratory Manual (1988). Der monoklonale Antikörper L243 ist spezifisch für ein Konformations-Epitop des richtig gefalteten HLA-DR1-Moleküls [J. Gorga et al., J. Biol. Chem. 262: 6087–16094] und daher würde er zur Aufreinigung des biologisch aktiven MHC-Fusionskomplexes bevorzugt sein. Der MHC-Fusionskomplex kann auch eine Sequenz enthalten, um eine Aufreinigung zu unterstützen; siehe z. B. das folgende Beispiel 17, das die Verwendung eines 6 × His-Tags offenbart.
Verkürzte MHC-Fusionskomplexe enthalten ein MHC-Molekül, das ausreichend verkürzt ist, so dass der MHC-Fusionskomplex in das Kulturmedium nach der Expression ausgeschieden werden kann (z. B. physiologische Bedingungen; in der fast vollständigen oder vollständigen Abwesenheit von Detergenz und dergleichen). Daher wird ein verkürzter MHC-Fusionskomplex keine Bereiche einschließen, die reich an hydrophoben Resten sind, das sind typischerweise die Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen des MHC-Moleküls, obwohl zumindest Teile dieser Domänen in geeigneter Weise vorliegen können, vorausgesetzt, dass das MHC-Molekül wie diskutiert sekretiert werden kann. Daher sind z. B. für ein bevorzugtes verkürztes DR1-MHC-Molekül vorzugsweise etwa die Reste 199 bis 237 der β-Kette und etwa die Reste 193 bis 230 der α-Kette des MHC-Moleküls nicht in dem verkürzten MHC-Fusionskomplex eingeschlossen. Siehe die folgenden Beispiele. Zusätzlich zu den hier offenbarten Sequenzen wurden zuvor Sequenzen der Domänen der MHC-Klasse-I- und II-Moleküle offenbart (siehe z. B. die oben genannten Publikationen). Verkürzte MHC-Fusionskomplexe können natürlich leicht empirisch identifiziert werden, d. h. durch Überprüfen, ob der MHC-Fusionskomplex, wie diskutiert, in das Kulturmedium nach der Expression sekretiert wird. Verkürzte MHC-Fusionskomplexe können durch mehrere Maßnahmen hergestellt werden, z. B. durch Expression eines löslichen MHC-Moleküls oder durch enzymatische Spaltung (z. B. Papain) von mindestens Teilen der Transmembran- und/oder cytoplasmatischen Domänen eines MHC-Fusionskomplexes mit voller Länge.
MHC-Moleküle mit voller Länge umfassen einen Transmembranteil und/oder eine cytoplasmatische Domäne und/oder andere zelluläre Membranen oder wesentliche Teile davon (z. B. mehr als etwa 80 oder 90% solcher Sequenzen). Bei einem MHC-Klasse-II-Molekül voller Länge sind im Allgemeinen sowohl die α- und β-Ketten an die Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen gebunden, obwohl nur eine der α- und β-Ketten mit Transmembran- und cytoplasmatische Domänen verbunden sein können, insbesondere im Falle von Einzelketten-MHC-Molekülen. Wie unten diskutiert, können MHC-Moleküle voller Länge in Zellmembranen über hydrophobe Membran-durchspannende Domänen oder alternativ durch post-translationale Verknüpfung von anderen Ankerdomänen, wie die kovalent gebundene glykosylierte Form von Phosphatidylinositol, verankert sein.
Wie oben diskutiert, sind Einzelketten-MHC-Fusionskomplexe wünschenswert, d. h. ein Fusionskomplex besteht aus einem einzelnen Polypeptid statt einem Aggregat mit mehreren Ketten, wie beispielsweise der native heterotrimere Klasse-II/Peptid-Komplex, bei dem α- und β-Ketten und ein Peptid über nicht-kovalente Interaktionen miteinander verbunden sind. Im Falle eines Einzelketten-MHC-Klasse-II-Komplexes sind die α- und β-Ketten-Untereinheiten als ein Einzelketten-Fusionsprotein mit dem präsentierenden Peptid verbunden, das vorzugsweise an die β-Kette des Kettenfusionsproteins gebunden ist. Ein solches bevorzugtes Einzelketten-MHC-Molekül ist in 24 und 30 gezeigt. Vorzugsweise wird eine Linkersequenz verwendet, um die α- und β-Ketten zu verbinden. Eine solche Linkersequenz, die verwendet wird, um Domänen eines MHC-Moleküls zu verbinden, wird manchmal hier auch als "Einzelketten-Linkersequenz" bezeichnet und unterscheidet sich daher von der oben diskutierten Linkersequenz, die zwischen einem präsentierenden Peptid und einem MHC-Molekül liegt und diese kovalent verbindet.
Vorzugsweise ist ein Einzelketten-MHC-Klasse-II-Komplex zwischen dem Carboxyl-Terminus der β2-Domäne und dem Amino-Terminus der α1-Domäne gebunden, obwohl mehrere Domänen eines MHC-Komplexes über andere Positionen verbunden sein können.
Die Einzelketten-Linkersequenz sollte es dem gebundenen MHC-Molekül ermöglichen, sich in eine aktive Form zu falten, d. h. eine Form, bei der das MHC-Molekül die Aktivität einer T-Zelle modulieren kann. Solche wirksamen Einzelketten-Linkersequenzen können leicht empirisch bestimmt werden. Daher kann z. B. ein DNA-Konstrukt, das für ein Einzelketten-MHC-Molekül kodiert, bei dem α- und β-Ketten über eine Linkersequenz verbunden sind, kloniert und exprimiert werden und das Einzelketten-MHC-Molekül kann getestet werden, um zu bestimmen, ob der Komplex zur Modulation der Aktivität eines T-Zell-Rezeptors fähig ist, um entweder eine T-Zell-Proliferation zu induzieren oder eine T-Zell-Entwicklung zu inhibieren, wie es durch die unten offenbarten Assays bestimmt wird.
Sowohl die Länge als auch Zusammensetzung der Einzelketten-Linkersequenz kann im Allgemeinen variieren. Zum Beispiel kann die Länge einer geeigneten Einzelketten-Linkersequenz mit den Positionen variieren, an denen die Linkersequenz mit Polypeptidketten des MHC-Komplexes verbunden ist; in anderen Worten, die Länge der Linkersequenz kann mit der Geometrie der "Lücke" zwischen den Polypeptiden, die von der Linkersequenz überbrückt wird, variieren.
Die Einzelketten-Linkersequenz sollte vorzugsweise flexibel sein, um eine Faltung des Einzelketten-Moleküls in eine aktive Form zuzulassen. Die Linkersequenz umfasst daher hauptsächlich vorzugsweise Aminsäuren mit kleinen Seitenketten wie Glycin, Alanin und Serin, um Flexibilität zu gewährleisten. Vorzugsweise umfassen etwa 80 oder 90% der Linkersequenz oder mehr Glycin-, Alanin- oder Serinreste, vorzugsweise Glycin- und Serinreste. Vorzugsweise enthält diese Linkersequenz zwischen den α- und β-Ketten keine Prolinreste, die eine Flexibilität hemmen könnten. Vorzugsweise ist eine Linkersequenz zwischen dem Carboxy-Terminus einer β2-Domäne und dem Amino-Terminus der α1-Domäne angeordnet und wird etwa 15 bis 40 Aminosäuren, mehr bevorzugt etwa 15 bis 30 Aminosäuren umfassen. Eine besonders bevorzugte Linkersequenz ist in dem folgenden Beispiel 17 offenbart. Die geeignete Größe und Sequenz von Einzelketten-Linkersequenzen kann auch durch konventionelle Computertechniken bestimmt werden; siehe folgendes Beispiel 17.
Einzelketten-MHC-Komplexe können wie oben diskutiert und wie in den folgenden Beispielen, einschließlich der Beispiele 17 bis 19 und 25, hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine DNA, die für ein gewünschtes MHC-Protein kodiert, von einer geeigneten Zelllinie erhalten werden und das isolierte Gen kann durch PCR oder andere Mittel amplifiziert werden. Im Falle eines MHC-Klasse-II-Moleküls kann ein α1-α2-Genfragment in einen Vektor kloniert werden, gefolgt von einer Klonierung eines Genfragments, das für die β1-β2-Domänen mit einer dazwischen gelagerten Einzelketten-Linkersequenz kodiert. Der Einzelvektor wird dann in einen geeigneten Wirt exprimiert und das Einzelketten-Molekül wird geerntet und, wenn erwünscht, aufgereinigt. Siehe die folgenden Beispiele, einschließlich Beispiele 17 bis 19. Siehe auch US-Patent Nr. 5,260,203, Ladner et al., das die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern diskutiert und dessen Verfahren im Allgemeinen für die erfindungsgemäßen Einzelketten-MHC-Fusionskomplexe eingesetzt werden können.
In einem bevorzugten Herstellungsverfahren werden die kodierenden Regionen der α- und β-Ketten der MHC-Klasse-II-Moleküle erhalten, vorzugsweise indem die kodierenden Regionen durch PCR aus einer B-Zelllinie oder einer anderen Quelle für MHC-Moleküle isoliert werden. Eine Sequenz, die für ein Einzelketten-β-α-Fusions-MHC-Fusionsmolekül kodiert, kann hergestellt werden, indem die Sequenzen, die für die Transmembran-durchspannende Domäne des Gens für die β-Kette mit einer Einzelketten-Linkersequenz, die das β-Ketten-Gen mit der reifen α-Kette (vorzugsweise am ersten Kodon des α-Ketten-Gens) verbindet, wie oben diskutiert, ersetzt werden. Das α-Ketten-Gen kann in geeigneter Weise dessen Transmembranregion für eine Membran-gebundene Expression des Einzelketten-Fusionskomplexes enthalten oder das α-Ketten-Gen kann am Ende der extrazellulären Region zur löslichen Expression des Einzelketten-MHC-Fusionskomplexes verkürzt sein. Eine geeignete Restriktionsstelle und ein Linker für die Präsentation des Peptids wird vorzugsweise zwischen der β-Ketten-Leitsequenz und dem ersten Kodon der β-Kette eingefügt. Die kodierende Region von im Wesentlichen jedem präsentierenden Peptid kann dann als ein Oligonukleotid in die erzeugte Restriktionsstelle eingeführt werden. Das entstehende Konstrukt steht dann in geeigneter Weise unter der Kontrolle von Säugetier- oder bakteriellen Promotoren, einschließlich der hier offenbarten spezifischen Promotoren. Ein solches bevorzugtes MHC-Klasse-II-Einzelketten-Konstrukt enthält verbundene Nukleotidsequenzen, die das Folgende in Reihenfolge kodieren: β-Ketten-Leitsequenz/präsentierendes Peptid/Linkersequenz/β1-β2-extrazelluläre Region/Einzelketten-Linkersequenz/α1-α2-extrazelluläre Region. Die MHC-Einzelketten-DNA-Konstrukte werden in geeigneter Weise in bakterielle, baculovirale Insektenzell- und Säugetier-Expressionssysteme eingeführt, einschließlich der hier offenbarten spezifischen Expressionssystemen, dann exprimiert und, wenn erwünscht, aufgereinigt.
Ein Einzelketten-Molekül kann entweder in voller Länge vorliegen, d. h. das MHC-Molekül ist mit zellulären Domänen assoziiert und enthält z. B. die gesamten oder wesentlichen Mengen (z. B. mehr als 80% der Sequenzen) der Transmembran- und/oder cytoplasmatischen Teile einer α- oder β-Kette oder kann wie oben diskutiert zur löslichen Expression verkürzt sein. Solche verkürzten und in voller Länge vorliegenden Einzelketten-MHC-Moleküle können wie oben und in den Beispielen für mehrere Polypeptid-MHC-Komplexe beschrieben, hergestellt werden. Bei einem MHC-Klasse-II-Molekül kann ein Molekül mit voller Länge nur eine der α- und β-Ketten besitzen, die an die Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen gebunden ist, vorzugsweise die α-Kette. Ein bevorzugter Einzelketten-Fusions-MHC-Klasse-II-Komplex voller Länge umfasst kovalent gebunden in der Reihenfolge: 1) das präsentierende Peptid, 2) die Klasse-II-β-Kette, der die Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen fehlen, 3) eine Einzelketten-Linkersequenz und 4) die Klasse-II-α-Kette, die Transmembran- und cytoplasmatische Domänen oder eine Membran-Ankerdomäne enthält. Ein bevorzugter löslicher Einzelketten-Fusions-MHC-Klasse-II-Komplex umfasst kovalent gebunden in der Reihenfolge: 1) das präsentierende Peptid, 2) die Klasse-II-β-Kette, der die Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen fehlen, 3) eine Einzelketten-Linkersequenz und 4) die Klasse-II-α-Kette, der die Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen fehlen.
Bezüglich der MHC-Komplexe mit voller Länge (sowohl Einzelketten- als auch Nicht-Einzelketten-Moleküle) können die MHC-Proteine an Zellmembranen über hydrophobe Membran-durchspannende Domänen (Transmembran-Domänen) als auch über eine post-translationale Bindung an die kovalent gebundene glykosylierte Form von Phosphatidylinositol (GPI-Membran-Anker) verankert werden. Typischerweise besteht für die α- und β-Ketten des MHC-Klasse-II-Moleküls die Transmembran-Domäne aus etwa 25 hydrophoben Aminosäuren, die mit der Carboxyl-terminalen Seite der α2- und β2-Domänen verbunden sind. Diese Reste ermöglichen es dem Protein, die Membran zu durchspannen. Die Transmembranregion endet mit etwa 10 bis 15 Resten, welche den cytoplasmatischen Schwanz an dem Carboxyl-terminalen Ende jeder Kette umfassen. Es wurde gezeigt, dass diese Transmembran- und cytoplasmatischen Regionen mit Sequenzen ersetzt werden können, die eine GPI-Verknüpfung anzeigen und die signalisieren, dass die chimären GPI-verankerten Klasse-II-Moleküle Membran-gebunden sind [D. Wettstein et al., J. Exp. Med. 174: 219–228 (1991)]. GPI-verknüpfte Membran-Ankerdomänen wurden in einer Vielzahl von Proteinen gefunden, einschließlich Decay Accelerating Factor (DAF), CD59 und der humanen plazentalen alkalinen Phosphatase (HPAP) [D. Wettstein et al., J. Exp. Med. 174: 219–228 (1991); D. Kooyman et al.]. Zum Beispiel sind die 38 Carboxyl-terminalen Aminosäuren von HPAP ausreichend, um als Signalsequenz für die GPI-Verknüpfung zu agieren. Wenn die DNA-Sequenz, die für diese Domäne kodiert, mit einem sekretierten Molekül verbunden ist, wie das lösliche Protein der MHC-Klasse-II-α- oder β-Kette, wird ein Membran-gebundenes chimäres Molekül gebildet [D. Wettstein et al., J. Exp. Med. 174: 219–228 (1991)] und ein solcher An satz kann eingesetzt werden, um Peptid-verbundene Einzelketten-Klasse-II-MHC-Moleküle an eine Zellmembran zu verankern.
Die Molekulargewichte von MHC-Fusionsmolekülen als auch die leeren und beladenen MHC-Moleküle werden variieren, insbesondere in Abhängigkeit davon, ob das Molekül löslich ist oder in voller Länge vorliegt (Membran-gebunden). Ein löslicher MHC-Klasse-II-Fusionskomplex wird im Allgemeinen ein Molekulargewicht von mehr als etwa 45 kDa haben und reife α- und β-Ketten ohne Transmembran- und cytoplasmatische Domänen werden jeweils ein Molekulargewicht von mehr als etwa 20 kDa haben, typischererweise zwischen etwa 21 bis etwa 26 kDa. Typischerweise werden reife Einzelketten-MHC-Klasse-II-Moleküle ohne Transmembran- und cytoplasmatische Domänen ein Molekulargewicht von etwa 48 bis etwa 50 kDa haben. Bei (Membran-gebundenen) Molekülen mit voller Länge werden reife α- und β-Ketten im Allgemeinen ein Molekulargewicht von mehr als etwa 25 kDa haben, vorzugsweise zwischen 26 und etwa 30 kDa. Typischerweise werden reife Einzelketten-MHC-Klasse-II-Fusionsmoleküle mit einer einzelnen (mit der α- oder β-Kette verknüpften) Transmembran- oder Membran-Ankerdomäne ein Molekulargewicht von mehr als etwa 49 kDa haben, vorzugsweise zwischen etwa 50 und 52 kDa. All die oben erwähnten Molekulargewichte basieren auf einer Bestimmung durch SDS-PAGE.
Multivalente MHC-Fusionskomplexe oder leere oder beladene MHC-Moleküle sind für eine Anzahl von Anwendungen wünschenswert. Die Valenz eines MHC-antigenischen Peptid-Komplexes beeinflusst die Wirkung des Komplexes auf (einen) T-Zell-Rezeptor(en). Zum Beispiel erfordert die Aktivierung der 3DT52.5-T-Zell-Hybridome ein MHC-antigenisches Molekül, das multivalent gemacht worden ist. Monovalente, lösliche MHC-Komplexe sind zur Stimulation dieser T-Zelle nicht in der Lage [J. McCluskey et al., J. Immunology 141: 1451–1455 (1988)]. Gewünschte multivalente MHC-Fusionskomplexe schließen solche ein, die an ein Immunglobulin verknüpft sind, z. B. IgG, IgM oder Fab'₂. Chemisch kreuzvernetzte MHC-Komplexe (z. B. kreuzvernetzt zu Dendrimeren) sind auch geeignete multivalente Spezies. Zum Beispiel kann der MHC-Komplex genetisch modifiziert sein, indem Sequenzen, die für Aminosäurereste kodieren, mit chemisch reaktiven Seitenketten wie Cis oder His eingeschlossen werden. Solche Aminosäuren mit chemisch reaktiven Seitenketten können in einer Vielzahl von Positionen eines MHC-Komplexes angeordnet werden, vorzugsweise distal zum präsentierenden Peptid und zur Bindungsdomäne des MHC-Komplexes. Zum Beispiel kann der C-Terminus der β-Kette eines MHC-Moleküls, das distal zu dem präsentierenden Peptid liegt, solche reaktive(n) Aminosäure(n) enthalten. Geeignete Seitenketten können verwendet werden, um zwei oder mehrere MHC-Fusionskomplexe an ein geeignetes Dendrimer-Teilchen chemisch zu verknüpfen, um einen multivalenten MHC-Fusionskomplex zu bilden. Dendrimere sind synthetische chemische Polymere, die eine beliebige Anzahl von unterschiedlichen funktionellen Gruppen auf deren Oberfläche aufweisen können [D. Tomalia, Aldrichimica Acta 26: 91–101 (1993)]. Beispielhafte Dendrimere zur erfindungsgemäßen Verwendung umfassen z. B. E9-Starburst-Polyamin-Dendrimer und E9-Combburst-Polyamin-Dendrimer, die Cysteinreste verknüpfen können.
Es kann wünschenswert sein, einen einzelnen Expressionsvektor herzustellen, der beide Ketten eines erfindungsgemäßen MHC-Fusionskomplexes oder eines erfindungsgemäßen leeren oder beladenen Moleküls exprimiert, d. h. Sequenzen, die sowohl für die α- als auch β-Ketten eines MHC-Fusionskomplexes kodieren, sind jeweils mit einem einzelnen Expressionsvektor verbunden, selbst wenn es sich nicht um ein Einzelketten-Molekül handelt. Ein solcher Expressionsvektor kann bessere Ergebnisse liefern als einzelne Vektoren, die für jede Kette eines MHC-Fusionskomplexes verwendet werden, insbesondere dann, wenn eine Selektion auf Zellen, in die der Vektor eingeführt worden ist, schwierig ist. Es kann auch wünschenswert sein, einen einzelnen Expressionsvektor herzustellen, der für beide Ketten eines MHC-Fusionskomplexes kodiert als auch für andere Agenzien, insbesondere einen T-Zell-co-stimulatorischen Faktor wie B7 oder B7-2, d. h. Sequenzen, die für beide Ketten eines MHC-Fusionskomplexes kodieren und (eine) Sequenz(en), die für einen co-stimulatorischen Faktor kodieren, der mit einem einzelnen Expressionsvektor verbunden ist, um ein einzelnes Transformationsverfahren zu ermöglichen. Dieser Ansatz würde wiederum eine potenziell schwierige Selektion auf Zellen, die zwei oder mehrere Male transformiert oder transfiziert worden sind, ausschließen.
Die erfindungsgemäß verwendeten MHC-Moleküle der Fusionskomplexe und die leeren und beladenen Moleküle entsprechen in geeigneter Weise in ihrer Aminosäuresequenz der von natürlich vorkommenden MHC-Molekülen, z. B. den MHC-Molekülen eines Menschen (Klasse-I oder Klasse-II), einer Maus oder eines anderen Nagers oder anderen Säugetiers. Vorzugsweise werden mindestens etwa 70% der Aminosäuresequenz eines MHC-Moleküls des Fusionskomplexes identisch mit der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden MHC-Moleküls, wie die oben beschriebenen, sein, bevorzugter werden mindestens etwa 90% der Aminosäuresequenz eines MHC-Moleküls des Fusionskompexes identisch mit der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden MHC-Moleküls sein und noch bevorzugter werden etwa 98% von der gesamten Aminosäuresequenz eines MHC-Moleküls des Fusionskomplexes identisch mit der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden MHC-Moleküls sein.
Ein leeres MHC-Molekül, insbesondere ein leeres Einzelketten-MHC-Klasse-II-Molekül, kann mit einem beliebigen oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass das präsentierende Peptid nicht kovalent an das Molekül gebunden ist. Zum Beispiel können in Beispiel 1B Schritte, bei denen ein Oligonukleotid, das für das OVA-präsentierende Peptid (OPR110 und OPR111) kodiert, mit dem Linker β1-β2-Genfragment verknüpft wird, weggelassen werden. In einem anderen Beispiel kann ein präsentierendes Peptid von einem MHC-Molekül unter Verwendung von standardmäßigen rekombinanten DNA-Manipulationen ausgeschlossen werden, das bereits ein kovalent verbundenes präsentierendes Peptid aufweist. Zum Beispiel kann DNA, die für das sc-IA^d/OVA-präsentierende Peptid kodiert, mit einem geeigneten Restriktionsenzym entfernt werden (z. B. AflI und NheI). Als ein zur Veranschaulichung gedachtes Beispiel wird die Herstellung eines löslichen leeren Einzelketten-IA^d-MHC-Moleküls (d. h. sc-IA^d/Blank) in den Beispielen 25 bis 27 diskutiert.
Wie hier offenbart, können MHC-Fusionskomplexe für den Nachweis und die Charakterisierung von rekombinanten Peptiden verwendet werden. Zum Beispiel umfasst die Erfindung ein Verfahren, das verwendet werden kann, um ein nicht charakterisiertes Epitop auf T-Zellen wie folgt zu kartieren: Sequenzen, die entweder für eine Bibliothek von zufälligen Peptiden oder ausgewählten Peptiden kodieren, können in eine Position des präsentierenden Peptids eines erfindungsgemäßen Expressionsvektorsystems, wie die oben genannten, die eine DNA-Sequenz, die für ein MHC-Molekül kodiert, und gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die für eine Linkersequenz kodiert, enthalten, kloniert werden. Geeignete Restriktionsfragmente einer zweckmäßigen cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek (siehe Sambrook et al., supra) werden als Herkunftsorte der Sequenzen, die in den Expressionsvektor eingefügt werden, verwendet oder es werden alternativ ausgewählte Oligonukleotide wie synthetische Oligonukleotide mit bekannter Sequenz als eingefügte Sequenzen verwendet. Geeignete Wirte wie Säugetierzellen und andere oben genannte werden mit dem Vektor, der die Genfusion ent hält, transformiert oder transfiziert, d. h. der Sequenz, die für das MHC-Molekül kodiert, das mit einer Sequenz, die für das zusätzliche Peptid kodiert, verbunden ist. Transformanten werden unter geeigneten Bedingungen kultiviert und die Zellen werden auf Expression des Fusionskomplexes von Interesse, der mit T-Zell-Klonen reagiert, was durch die unten genannten Assays bestimmt werden kann, durchmustert. Reaktive Kolonien können dann gepickt und die Vektoren isoliert werden. Eine Sequenzanalyse der DNA-Inserts würde Klarheit darüber schaffen, welche der klonierten Peptidsequenzen dem/den Epitop(en) entsprechen, die von dem T-Zell-Klon erkannt werden. Erfindungsgemäße leere MHC-Moleküle können auf die gleiche Weise verwendet werden, mit der Ausnahme, dass die Peptide auf die leeren Moleküle beladen werden, statt das Peptid über übliche Verfahren zu verdauen.
Die Fähigkeit eines MHC-Fusionskomplexes oder von beladenen MHC-Molekülen, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Aktivität eines T-Zell-Rezeptors (einschließlich der Inaktivierung der T-Zell-Antworten) zu modulieren, kann leicht durch einen in vitro-Assay bestimmt werden. Typische T-Zellen für die Assays sind transformierte T-Zelllinien wie T-Zell-Hybridome oder T-Zellen, die von einem Säugetier isoliert worden sind, z. B. von einem Menschen oder von einem Nager wie einer Maus. Andere geeignete T-Zellen umfassen: 1) T-Zell-Hybridome, die öffentlich verfügbar sind oder durch bekannte Verfahren hergestellt werden können, 2) T-Helferzellen und 3) cytotoxische T-Zellen, vorzugsweise cytotoxische CD4⁺-Zellen. T-Zellen können aus einem Säugetier durch bekannte Verfahren isoliert werden. Siehe z. B. R. Shimonkevitz et al., J. Exp. Med. 158: 303 (1983) und die folgenden Beispiele 4 und 5.
Ein geeigneter Assay zur Bestimmung, ob ein MHC-Fusionskomplex oder ein beladenes MHC-Molekül zur Modulation der Aktivität von T-Zellen fähig ist, wird durch die aufeinander folgenden Schritte 1–4 unten wie folgt durchgeführt. T-Zellen exprimieren in geeigneter Weise einen Marker, der untersucht werden kann und der eine T-Zell-Aktivierung oder Modulation von T-Zell-Aktivität nach der Aktivierung anzeigt. Daher können z. B., wie in Beispiel 4 unten offenbart, das murine T-Zell-Hybridom DO11.10, das Interleukin-2 (IL-2) exprimiert, nach einer Aktivierung verwendet werden. IL-2-Konzentrationen können gemessen werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes präsentierendes Peptid zur Modulation der Aktivität dieses T-Zell-Hybridoms fähig ist. Ein solcher geeigneter Assay wird durch die folgenden aufeinander folgenden Schritte durchgeführt:

1. T-Zellen, die den T-Zell-Rezeptor tragen, der für den Peptid/MHC-Komplex spezifisch ist, werden von einem T-Zell-Hybridom von Interesse oder durch Isolieren aus einem Säugetier erhalten.
2. Die T-Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, die eine Proliferation ermöglichen.
3. Die proliferierenden T-Zellen werden mit einem ausgewählten MHC-Fusionskomplex (oder beladenen Molekül) in Kontakt gebracht.
4. Die T-Zelle wird mit den Antigen-präsentierenden Zellen in Kontakt gebracht, um ein Signal zu erzeugen, das zur Aktivierung erforderlich ist und das als Marker untersucht werden kann, z. B. wird eine IL-2-Produktion gemessen. Ein Abfall bei der IL-2-Produktion, z. B. ein 40%iger oder größerer Abfall bei der IL-2-Produktion nach einem Zeitraum von 24 Stunden, typischerweise ein Abfall von 50% oder mehr bei der IL-2-Produktion nach einem Zeitraum von 24 Stunden, weist darauf hin, dass der MHC-Fusionskomplex (oder das beladene Molekül) die Aktivität der T-Zellen moduliert und eine Immunantwort supprimieren kann. Das folgende Beispiel 4 stellt einen solchen Assay beispielhaft dar. Der Assay wird in geeigneter Weise zur Analyse der Aktivität von löslichen "verkürzten" MHC-Fusionskomplexen, die keinen Transmembran-Teil enthalten, eingesetzt. Zusätzlich wird der Assay in geeigneter Weise zur Identifizierung von MHC-Fusionskomplexen, die ein kovalent verknüpftes präsentierendes Peptid (oder beladenes Molekül) enthalten, die eine Funktion als ein T-Zell-Rezeptor-Antagonist oder Teil-Agonist besitzen, eingesetzt. Der Assay ist auch zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen beladenen MHC-Fusionskomplexen, wie oben erwähnt, geeignet.

Die in den Assays eingesetzten T-Zellen können unter Bedingungen inkubiert werden, die zur Proliferation geeignet sind. Zum Beispiel wird ein DO11.10-T-Zell-Hybridom zweckmäßigerweise bei etwa 37°C und 5% CO₂ in vollständigem Kulturmedium (RPMI 1640, ergänzt mit 10% FBS, Penicillin/Streptomycin, L-Glutamin und 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol) inkubiert. Serienverdünnungen des MHC-Fusionskomplexes können zu dem T-Zell-Kulturmedium zugesetzt werden. Geeignete Konzentrationen des MHC-Fusionskomplexes, der zu den T-Zellen zugefügt wird, werden typischerweise im Bereich von 10^–12 bis 10^–6 M liegen. Signale einer T-Zell-Aktivierung werden durch Antigen-präsentierende Zel len abgegeben, die mit dem passenden antigenischen Peptid beladen worden sind. Es wird angenommen, dass die Verwendung einer Antigen-Dosis und APC-Zahl, die zu einer leicht submaximalen T-Zell-Aktivierung führen, bevorzugt ist, um die Inhibition von T-Zell-Antworten mit MHC-Fusionskomplexen zu detektieren. Ein Abfall bei der IL-2-Produktion nach dem Kontakt mit dem MHC-Fusionskomplex weist darauf hin, dass der Fusionskomplex die Aktivität der T-Zellen moduliert und eine Immunantwort supprimieren kann.
Alternativ kann statt einer Messung eines exprimierten Proteins wie IL-2 eine Modulation einer T-Zell-Aktivierung durch Veränderungen bei der Antigen-abhängigen T-Zell-Proliferation in geeigneter Weise bestimmt werden, was durch Radiomarkierungstechniken, wie sie auf dem Gebiet vorhanden sind, gemessen werden kann. Zum Beispiel kann ein markiertes (z. B. mit Tritium markiertes) Nukleotid einem Assay-Kulturmedium zugegeben werden. Ein Einbau eines solchen markierten Nukleotids in DNA dient als Maß für die T-Zell-Proliferation. Siehe das folgende Beispiel 5, in dem ein Verfahren spezifisch beschrieben ist. Dieser Assay ist nicht für T-Zellen geeignet, die keine Antigen-Präsentation zum Wachstum benötigen, z. B. T-Zell-Hybridome. Es ist geeignet zur Messung der Modulation der T-Zell-Aktivierung von nicht-transformierten T-Zellen, die aus Säugetieren isoliert worden sind, durch die MHC-Fusionskomplexe (oder beladene MHC-Moleküle). Ein Abfall in dem Grad der T-Zell-Proliferation nach einem Kontakt mit dem MHC-Fusionskomplex (oder den beladenen MHC-Molekülen) weist darauf hin, dass der Komplex die Aktivität der T-Zellen moduliert und eine Immunantwort supprimieren kann, siehe z. B. das folgende Beispiel 5. Der in vitro-T-Zell-Proliferationsassay ist zur Messung der Wirkungen von MHC-Fusionskomplexen (oder beladenen MHC-Molekülen) auf Antigen-spezifische Veränderungen bei der klonalen T-Zell-Expansion in vivo bevorzugt. Ein solcher Assay ist spezifisch in dem folgenden Beispiel 7 beschrieben.
Diese in vitro-Assays können eingesetzt werden, um Peptid(e), die von DNA aus einer Zufallsbibliothek oder anderen Oligonukleotiden kodiert werden und die zur Modulation der Aktivität des T-Zell-Rezeptors fähig sind (einschließlich der Aktivierung oder Inhibition der T-Zell-Entwicklung), auszuwählen und zu identifizieren. Genauer gesagt können DNA-Sequenzen, die entweder für eine Bibliothek von Zufallspeptiden oder ausgewählten Peptiden kodieren, in eine Position eines präsentierenden Peptids eines Expressionsvektorsystems, wie die oben genannten, die eine DNA-Sequenz, die für ein MHC-Molekül kodiert und gege benenfalls eine DNA-Sequenz, die für eine Linkersequenz kodiert, enthalten, kloniert werden. Zweckmäßigerweise werden Restriktionsfragmente einer geeigneten cDNA von einer genomischen DNA-Bibliothek (siehe Sambrook et al., supra) als Herkunftsquelle für die Sequenzen verwendet, die in den Expressionsvektor eingefügt werden, oder es werden alternativ ausgewählte Oligonukleotide wie synthetische Oligonukleotide mit bekannter Sequenz als eingeführte Sequenz verwendet. Geeignete Wirte wie Säugetierzellen und die anderen oben genannten werden mit dem Vektor, der die Genfusion enthält, transformiert, z. B. der Sequenz, die für das MHC-Molekül kodiert, die mit einer Sequenz, die für das präsentierende Peptid kodiert, verbunden ist. Transformanten werden unter geeigneten Bedingungen kultiviert und die Zellen werden dann auf Expression des MHC-Fusionskomplexes (oder beladenen MHC-Molekülen) von Interesse durch In-Kontakt-Bringen desselben mit ausgewählten T-Zellen durchmustert. Die oben beschriebenen Assays, z. B. die Messung der IL-2-Produktion oder T-Zell-Proliferation, werden eingesetzt, um zu bestimmen, ob der MHC-Fusionskomplex (oder die beladenen MHC-Moleküle) die T-Zell-Aktivierung modulierte. Zum Beispiel lassen sich durch einen Abfall bei der IL-2-Produktion in APO-stimulierten T-Zellen solche MHC-Fusionskomplexe identifizieren, die die Aktivität der T-Zellen modulieren und die Immunantworten supprimieren. Alternativ können die in vitro-Assays eingesetzt werden, um die oben beschriebenen multivalenten MHC-Fusionskomplexe (oder beladenen MHC-Moleküle), die die präsentierenden Peptide, die die T-Zell-Antworten erhöhen, enthalten, zu identifizieren.
In vivo-Assays können auch in geeigneter Weise eingesetzt werden, um die Fähigkeit eines MHC-Fusionskomplexes (oder beladenen MHC-Molekülen) zu bestimmen, die Aktivität von T-Zellen zu modulieren, einschließlich der Fähigkeit, die T-Zell-Entwicklung zu inhibieren oder zu inaktivieren. Zum Beispiel kann ein MHC-Fusionskomplex (oder beladene MHC-Moleküle) auf dessen Fähigkeit untersucht werden, einen Wechsel der Immunglobulinklasse zu inhibieren (d. h. IgM zu IgG) (siehe z. B. P. Linsley et al., Science 257: 792–795 (1992)]. Ein solcher Assay ist spezifisch in dem folgenden Beispiel 6 beschrieben.
Diagnostische Verfahren unter Verwendung von MHC-Molekülen werden auch bereitgestellt, einschließlich eines diagnostischen in vivo-Imaging und einer HLA-Typisierung (siehe z. B. A. K. Abbas, Cellular and Molecular Immunology, S. 328 (W. B. Saunders Co., 1991)]. Für Imaging-Anwendungen in vivo kann ein MHC-Fusionsmolekül oder ein beladenes Molekül, das eine radioaktive Markierung aufweist (z. B. ¹²⁵I, ³²P, ⁹⁹Tc) oder eine andere detektierbare Markierung an ein Säugetier verabreicht werden und das Subjekt kann durch bekannte Verfahren zur Bindung des MHC-Moleküls oder beladenen Moleküls durchmustert werden. Eine solche Analyse eines Säugetiers könnte zur Diagnose und Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen beitragen, einschließlich z. B. der hier offenbarten unerwünschten Immunantworten.
Ein leeres MHC-Molekül, insbesondere ein leeres Einzelketten-MHC-Klasse-II-Molekül kann verwendet werden, um präsentierende Peptide, die die Peptid-Bindungsfurche oder -spalte des MHC-Moleküls in nicht-kovalenter Weise binden, zu durchmustern. Solche Screens sind zur Identifizierung solcher präsentierender Peptide, die an bestimmte MHC-Moleküle binden können, z. B. MHC-Klasse-II-Moleküle wie IA^d, DR1, IE, DP und DQ verwendbar. Als ein zur Veranschaulichung gedachtes Beispiel kann das sc-IA^d/Blank-Molekül mit einer detektierbaren Markierung modifiziert werden (z. B. ¹²⁵I, Biotin oder eine andere hier offenbarte Proteinmarkierung) und kann dann verwendet werden, um eine Zufalls-Peptidbibliothek zu durchmustern. Verfahren zum Markieren von Proteinen und Screening-Bibliotheken sind bekannt [siehe z. B. Sambrook et al., supra, und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989; hier durch Bezugnahme eingeschlossen]. Es kann eine beliebige der zahlreichen Zufalls-Peptidbibliotheken in geeigneter Weise verwendet werden [siehe z. B. J. Scott et al., Science 249: 386 (1990), J. Devlin et al., Science 249: 404 (1990), S. Cwirla et al., PNAS (USA) 87: 6378 (1990), J. Hammer et al., J. Exp. Med. 176: 1007 (1992), D. O'Sullivan et al., J. Immunol. 147: 2663 (1991)]. Peptide, die das sc-IA^d/Blank-Molekül binden, können verwendet werden, um das entsprechende beladene Molekül herzustellen. Das beladene Molekül würde dann in einem hier beschriebenen T-Zell-Assay getestet werden, um festzustellen, ob das identifizierte Peptid zur Modulation der T-Zell-Aktivität fähig ist.
Es können auch Assays eingesetzt werden, um die potenzielle Verwendung eines MHC-Fusionskomplexes zur Behandlung einer Immunerkrankung festzustellen. Zum Beispiel stellt eine experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) eine Autoimmunerkrankung in Mäusen dar und ist ein anerkanntes Modell für multiple Sklerose. Ein geeigneter Mausstamm kann behandelt werden, damit EAE entwickelt, und es kann dann ein MHC-Fusionskomplex oder beladenes Molekül verabreicht und das Tier daraufhin untersucht werden, ob eine EAE-Entwick lung nach Verabreichung des MHC-Fusionskomplexes oder beladenen Moleküls inhibiert oder verhindert worden ist. Ein solcher Assay ist spezifisch in den folgenden Beispielen 8 und 11 beschrieben.
Die Fähigkeit eines MHC-Fusionskomplexes, eine Immunantwort zu induzieren, einschließlich einer Impfung gegen eine Ziel-Erkrankung, kann leicht mittels eines in vivo-Assays bestimmt werden. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßer MHC-Fusionskomplex oder DNA, die für ein MHC-Fusionskomplex kodiert, an ein Säugetier verabreicht werden, beispielsweise eine Maus, Blutproben werden von dem Säugetier zum Zeitpunkt der Erstverabreichung und in periodischen Abständen mehrere Male danach (z. B. 2, 5 und 8 Wochen nach Verabreichung des Fusionskomplexes oder DNA) erhalten. Serum wird aus den Blutproben gesammelt und auf das Vorhandensein von Antikörpern, die durch die Immunisierung hergestellt worden sind, untersucht. Die Antikörper-Konzentrationen können bestimmt werden. Das folgende Beispiel 9 beschreibt spezifisch einen solchen Assay.
Wie hier diskutiert, kann eine direkte Verabreichung eines DNA-Konstrukts, das für einen MHC-Fusionskomplex kodiert, durch Expression des Fusionskomplexes innerhalb der Zellen des Subjekts in geeigneter Weise durchgeführt werden. Vorzugsweise wird DNA, welche die kodierenden Regionen der MHC-präsentierenden Peptidfusion enthält, in geeigneter Weise unter der Kontrolle eines passenden Promotors wie dem CMV-Promotor direkt in den Skelettmuskel des Subjekts injiziert. Um sicherzustellen, dass das Auftreten der MHC-Moleküle eine Immunantwort in dem Subjekt auslöst, werden DNA-Vektoren, die für eine co-stimulatorischen Faktor kodieren, an das Subjekt mit der DNA, die für die Fusion MHC-präsentierendes Peptid kodiert, vorzugsweise gleichzeitig verabreicht. Bevorzugte gleichzeitig verabreichte DNA-Vektoren umfassen z. B. solche, die entweder die kodierende Region von B7-1 oder B7-2 unter der Kontrolle des CMV-Promotors umfassen. Das exprimierte B7-1- und B7-2-Protein kann das co-stimulatorische Signal erzeugen, das bei der Initiation der Immunantwort mitwirkt.
Ein solcher Ansatz zur Induktion einer Immunantwort in einem Subjekt wie einem Säugetier eröffnet wesentliche Vorteile gegenüber bisherigen Ansätzen. Der erste Schritt bei der Präsentation eines fremden Protein-Antigens ist die Bindung des natürlichen Antigens an eine Antigen-präsentierende Zelle (APC). Nach Bindung an die APCs gelangen die Antigene in die Zellen, entweder durch Phagozytose, Rezeptor-vermittelte Endozytose oder Pinozytose. Solche internalisierte Antigene gelangen in intrazelluläre Membran-gebundene Vesikel, die auch als Endosomen bezeichnet werden. Nach der Endosomen-Lysosomen-Fusion werden die Antigene durch zelluläre Proteasen, die in den Lysosomen vorliegen, zu kleinen Peptiden verarbeitet. Die Peptide verknüpfen sich mit den α- und β-Ketten der MHC-Klasse-II-Moleküle innerhalb dieser Lysosomen. Diese MHC-Klasse-II-Moleküle, die zuvor in dem rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert worden sind, werden nacheinander zu den Golgi-Komlexen und dann zu dem lysosomalen Kompartiment transportiert. Der Peptid-MHC-Komplex wird auf der Oberfläche von APCs zur Aktivierung von T- und B-Zellen präsentiert. Daher sind die Verfügbarkeit von proteolytischen Verarbeitungsstellen innerhalb des Antigens, die Stabilität der resultierenden Peptide in dem Lysosom und die Affinitäten der Peptide zu den MHC-Molekülen die bestimmenden Faktoren für die Immunogenität eines bestimmten Epitops. Diese Faktoren können nicht durch Verabreichung von Adjuvanzien verändert werden. Eine direkte Expression der MHC-Fusionskomplexe (d. h. MHC, der direkt an das präsentierende Peptid kovalent gebunden ist) sollte jedoch solche Komplikationen umgehen und eine Immunantwort gegenüber dem auf den MHC-Fusionsmolekülen sitzenden Epitop induzieren.
Auch können, wie hier offenbart, Wirts-kompatible Antigen-präsentierende Zellen, in die eine solche DNA eingeführt worden ist, an das Subjekt verabreicht werden, anstatt DNA, die für einen MHC-Fusionskomplex kodiert, direkt an ein Subjekt zu verabreichen. Das bedeutet, dass DNA, die für einen oder mehrere MHC-Fusionskomplexe kodiert, in die Wirts-kompatiblen Antigen-präsentierenden Zellen eingeführt werden kann und so transformierte oder transfizierte Antigen-präsentierende Zellen können an den betreffenden Wirt verabreicht werden und auf die Stelle gerichtet werden, bei der die wirksamste Interaktion mit der passenden T-Zelle zu erwarten ist. Siehe z. B. die folgenden Beispiele 13 und 14. Nach der Verabreichung an ein Subjekt können so veränderte Zellen dann den MHC-Fusionskomplex, der von der DNA kodiert wird, auf der Zelloberfläche in vivo exprimieren. Solche veränderten Zellen können an ein Subjekt verabreicht werden, um eine Immunantwort zu induzieren oder um alternativ eine Immunantwort in Abhängigkeit von der Expression von anderen co-stimulatorischen Signalen der Zellen, wie hier offenbart, zu supprimieren. Mit anderen Worten, wenn nach einer Verabreichung die Zellen einen MHC-Fusionskomplex in Abwe senheit einer wirksamen Menge von co-stimulatorischen Signal(en) bereitstellen können oder einen MHC-Fusionskomplex bereitstellen können, der ein präsentierendes Peptid mit einer antagonistischen oder Teil-agonistischen Aktivität enthält, können die Zellen an einen Wirt verabreicht werden, um eine Immunantwort zu supprimieren. Wenn die Zellen alternativ einen MHC-Fusionskomplex in der Anwesenheit einer wirksamen Menge von co-stimulatorischen Signal(en) bereitstellen, z. B. wenn ein T-Zell-co-stimulatorischer Faktor wie B7 oder B7-2 auf der Oberfläche der Zelle exprimiert wird, können die Zellen an einen Säugetierwirt verabreicht werden, um eine Immunantwort in dem Säugetier zu induzieren, wie hier offenbart. Es kann bevorzugt sein, einen Einzelexpressionsvektor zu konstruieren, der für beide Ketten eines MHC-Fusionskomplexes und für einen T-Zell-co-stimulatorischen Faktor, soweit, wie oben diskutiert, verwendet, kodiert und diesen Vektor in eine Wirts-kompatible APC einzuführen, um die Zellen zur Verabreichung zu präparieren. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass der Ausdruck "Wirts-kompatible" Antigen-präsentierende Zellen Antigen-präsentierende Zellen bezeichnet, die denselben Haplotyp aufweisen wie der des Subjekts oder "Wirts", an den die Zellen verabreicht werden sollen. Vorzugsweise sind die transformierten Wirts-kompatiblen Antigen-präsentierenden Zellen solche, die in die Lymphknoten des Wirts, an den die Zellen verabreicht worden sind, migrieren und dort den MHC-Fusionskomplex exprimieren.
Wie oben diskutiert, besitzen MHC-Fusionskomplexe und DNA-Konstrukte, die für solche Fusionskomplexe kodieren, eine Vielzahl von therapeutischen Applikationen; beladene MHC-Moleküle können auch für solche Applikationen wie hier diskutiert verwendet werden. Zum Beispiel können MHC-Fusionskomplexe oder beladene Komplexe, die keinen Transmembran-Teil enthalten (siehe z. B. der lösliche Komplex von dem folgenden Beispiel 2) verabreicht werden, um eine Immunantwort eines Säugetiers zu supprimieren, z. B., um ein Säugetier zu behandeln, einschließlich eines Menschen, der an einer Autoimmunerkrankung leidet oder dafür anfällig ist, z. B. multiple Sklerose, Insulin-abhängige Diabetes mellitus, rheumatoide Arthritis und dergleichen. Auch zur Behandlung geeignet sind solche Subjekte, die an einer unerwünschten Immunantwort leiden oder wahrscheinlich daran leiden werden, z. B. Patienten, die eine Art Transplantatsoperation durchmachen, wie Herz-, Nieren-, Haut- oder andere Organtransplantate. In solchen Situationen kann ein Behandlungsprotokoll zweckmäßigerweise vor der Operation beginnen.
Wie hier offenbart, wird zur Suppression einer Immunantwort ein MHC-Fusionskomplex verabreicht, der mit einem Immunglobulin verbunden ist, z. B. der an die konstanten Domänen eines Immunglobulin-Moleküls wie einem IgG-, IgM- oder IgA-Immunglobulin oder -Fragment fusioniert ist. Siehe 1C der Zeichnungen und der folgenden Beispiele.
Viele verschiedene Ansätze können eingesetzt werden, um eine Immunantwort in einem Säugetier erfindungsgemäß zu supprimieren.
Insbesondere wurde, wie oben diskutiert, gezeigt, dass ein MHC-Molekül nur dann eine klonale Expansion einer T-Zelllinie induzieren wird, wenn auch (ein) co-stimulatorische(s) Signal(e), wie eines von den Antigen-präsentierenden Zellen, abgegeben wird. In der Abwesenheit von co-stimulatorischen Signalen bzw. zumindest in der Abwesenheit der Abgabe einer für die T-Zell-Proliferation wirksamen Menge solcher T-Zell-co-stimulatorischen Signal(e) werden die T-Zellen zu einem Zustand der Anergie oder zur Apoptose induziert, was zu einer klonalen Deletion führt.
Demgemäß beinhaltet ein Behandlungsverfahren zur Suppression einer Immunantwort die Verabreichung einer wirksamen Menge eines oder mehrerer MHC-Fusionskomplexe oder beladener Moleküle, wobei im Wesentlichen kein(e) co-stimulatorische(s) Signal(e) vorhanden ist/sind, um auf diese Weise eine Anergie für spezifische T-Zellen zu induzieren und eine unerwünschte Immunantwort wirksam zu supprimieren. Vorzugsweise wird ein "verkürzter" löslicher MHC-Komplex verabreicht, d. h. der MHC-Komplex enthält keinen Transmembran-Teil. Das präsentierende Peptid des verabreichten löslichen MHC-Fusionskomplexes oder beladenen MHC-Moleküls kann so ausgewählt werden, dass es spezifisch für T-Zellen einer unerwünschten Immunantwort ist, um einen Zustand der Anergie bezüglich dieser T-Zellen zu induzieren. Solche präsentierenden Peptide können leicht identifiziert werden und durch die oben genannten in vitro-Protokolle ausgewählt werden.
Lösliche MHC-Fusionskomplexe oder beladene Moleküle können in geeigneter Weise einem Säugetier durch Injektion verabreicht werden, z. B. durch intraperitoneale oder intravenöse Injektion. Eine topische Verabreichung, z. B. Augentropfen, und eine Verabreichung über nasale und Lungeninhalatoren sollte auch möglich sein. Ein MHC-Fusionskomplex, zumindest solche Komplexe, die in the rapeutischen Anwendungen verwendet werden, sollten in Säugetierzellen hergestellt werden und vor ihrer Verwendung aufgereinigt werden, so dass fast keine oder keine Bakterien oder Pyrogene darin vorliegen. Die optimale Dosis für eine gegebene therapeutische Anwendung kann durch konventionelle Maßnahmen bestimmt werden.
MHC-Fusionskomplexe oder beladene Moleküle können in geeigneter Weise an ein Subjekt (insbesondere ein Säugetier wie einem Menschen oder an Tiere wie Vieh) zur Behandlung verabreicht werden oder sie können als pharmazeutische Zusammensetzungen vorliegen, die den Fusionskomplex oder das beladene Molekül umfassen. Solche erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden durch die auf dem Gebiet bekannten Verfahren hergestellt und verwendet. Zum Beispiel können Formulierungen, die eine therapeutisch wirksame Menge eines MHC-Fusionskomplexes oder beladener Moleküle enthalten, als Einheitsdosis- oder Multidosis-Behälter vorliegen, z. B. versiegelte Ampullen und Fläschchen, und sie können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, was nur den Zusatz des sterilen Flüssigkeitsträgers, z. B. Wasser für Injektionen, unmittelbar vor der Verwendung erforderlich macht. Liposomen-Formulierungen können auch für viele Applikationen bevorzugt sein. Andere Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung werden auch geeignet sein und schließen wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen ein, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika und Lösungsmittel enthalten können, die die Formulierung mit dem Blut des bestimmten Empfänger isotonisch macht; und wässrige und nicht-wässrige Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel einschließen können.
Ein anderes Behandlungsverfahren zur Suppression einer Immunantwort beinhaltet die Verabreichung eines MHC-Fusionskomplexes, der ein kovalent gebundenes präsentierendes Peptid enthält, das einen T-Zell-Rezeptor-Antagonisten oder Teil-Agonisten darstellt, oder eines beladenen MHC-Moleküls, das das präsentierende Peptid enthält, das ein solcher T-Zell-Rezeptor-Antagonist oder Teil-Agonist ist [siehe A. Sette et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 413–431 (1994)]. Der MHC-Fusionskomplex oder das beladene MHC-Molekül kann in verkürzter Form vorliegen und kann als ein lösliches Protein wie oben beschrieben verabreicht werden. Alternativ kann der MHC-Fusionskomplex oder das beladene MHC-Molekül in voller Länge vorliegen, d. h. es wird einen Transmembran-Teil enthalten. Die Behandlung mit diesen Komplexen wird die Verabreichung einer wirksamen Menge einer DNA-Sequenz umfassen, die einen DNA-Vektor umfasst, der für einen erfindungsgemäßen MHC-Fusionskomplex voller Länge und ein präsentierendes Peptid, das ein TcR-Antagonist oder Teil-Agonist ist, kodiert. Siehe z. B. die Diskussion oben und die Beispiele 3, 10 und 11, die geeignete Maßnahmen zur Herstellung solcher MHC-Fusionskomplexe und die Verwendung derselben zur immunsuppressiven Therapie mit geeigneten Maßnahmen verfolgen. Präsentierende Peptide, die TcR-Antagonisten oder Teil-Agonisten sind, können leicht identifiziert werden und durch die oben genannten in vitro-Protokolle ausgewählt werden. Ein MHC-Komplex, der ein präsentierendes Peptid enthält, das ein TcR-Rezeptor-Antagonist oder Teil-Agonist ist, ist besonders zur Behandlung von Allergien und Autoimmunerkrankungen wie multiple Sklerose, Insulin-abhängige Diabetes mellitus und rheumatoide Arthritis bevorzugt.
Weiter können, wie oben diskutiert, Wirts-kompatible Antigen-präsentierende Zellen, in die DNA, die für einen MHC-Fusionskomplex kodiert, eingeführt worden ist, an ein Subjekt verabreicht werden, um eine Immunantwort zu supprimieren. Nach Verabreichung exprimieren die Zellen einen MHC-Fusionskomplex in Abwesenheit einer wirksamen Menge eines T-Zell-co-stimulatorischen Signals/Signale, d. h. so dass eine T-Zell-Anergie induziert wird und/oder die verabreichten Zellen exprimieren einen MHC-Fusionskomplex, der ein gebundenes präsentierendes Peptid mit einer antagonistischen oder agonistischen Teil-Aktivität enthält.
Unterschiedliche immunsuppressive Therapien der Erfindung können sowohl in Kombination verwendet werden als auch mit anderen bekannten immunsuppressiven Mitteln wie anti-entzündlich wirkenden Arzneimitteln, um für eine wirksamere Behandlung einer T-Zell-vermittelten Erkrankung zu sorgen. Zum Beispiel können immunsuppressive MHC-Fusionskomplexe oder beladene MHC-Moleküle in Kombination mit anti-entzündlichen Agenzien wie Kortikosteroiden und nicht-steroidalen Arzneimitteln zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien verwendet werden.
Auch sind hier Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort in einem Säugetier wie einem Menschen beschrieben, einschließlich der Impfung eines Säugetiers wie einem Menschen gegen ein infektiöses Mittel oder gegen eine bestimmte Erkrankung wie Krebs, insbesondere einem Melanomkrebs, oder eine andere Erkrankung wie Malaria.
Wie hier offenbart, umfassen diese Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge einer DNA-Sequenz an ein Säugetier, die einen DNA-Vektor umfasst, der für einen erfindungsgemäßen MHC-Fusionskomplex kodiert, der einen Transmembran-Teil enthält, und/oder die Verabreichung eines solchen MHC-Fusionskomplexes, der einen Transmembran-Teil enthält, und/oder die Verabreichung von Wirts-kompatiblen Antigen-präsentierenden Zellen, die eine solche DNA, die für solche MHC-Fusionskomplexe kodiert, enthalten. Die Herstellung von Expressionsvektoren für MHC-Fusionskomplexe ist oben und in den folgenden Beispielen 3 und 12 beschrieben. Verfahren zur Verabreichung von Plasmid-DNA, die Aufnahme dieser DNA durch Zellen des verabreichten Subjekts und Expression des Proteins wurden beschrieben [siehe J. Ulmer et al., Science 259: 1745–1749 (1993)].
Vorzugsweise wird die DNA, die für einen MHC-Fusionskomplex voller Länge kodiert, an ein Säugetier zusammen mit einer DNA-Sequenz verabreicht, die für einen T-Zell-co-stimulatorischen Faktor kodiert, wie z. B. DNA, die für B7 oder B7-2 kodiert. Das B7-Gen und die Expression davon ist von D. Harlan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3137–3141 (1994) beschrieben. Nach Aufnahme dieser DNA durch die Zellen des Subjekts wird der T-Zell-co-stimulatorische Faktor exprimiert und kann das/die co-stimulatorische(n) Signal(e) bereitstellen und dadurch zur Initiation der Immunantwort beitragen. Siehe die folgenden Beispiele 3 und 12, die die Herstellung von Expressionsvektoren, die B7- oder B7-2-Gene enthalten, beschreiben.
Während die Verabreichung von DNA, die für ein MHC-Fusionskomplex kodiert, an ein Säugetier wie einem Menschen, wie oben besprochen, ein bevorzugtes Verfahren zum Auslösen einer Immunantwort in dem Subjekt darstellt, können MHC-Fusionskomplexe in geeigneter Weise auch über andere Wege verabreicht werden. Daher können, wie oben besprochen, Wirts-kompatible Antigen-präsentierende Zellen, in die DNA, die für einen MHC-Fusionskomplex kodiert, eingeführt worden ist, an ein Subjekt verabreicht werden, um eine Immunantwort auszulösen. Nach der Verabreichung exprimieren die Zellen einen MHC-Fusionskomplex in Gegenwart einer wirksamen Menge von T-Zell-co-stimulatorischen Signal(en) wie B7- oder B7-2-Gene, um eine Immunantwort auszulösen und/oder die verabreichten Zellen exprimieren einen MHC-Fusionskomplex mit voller Länge, der fähig ist, eine Immunantwort auszulösen, wie es beispielsweise anhand eines Anstiegs bei der T-Zell-Proliferation gezeigt worden ist, entsprechend den in den folgenden Beispielen genauer erläuterten Verfahren. Auch wenn es typischerweise weniger bevorzugt ist als die oben diskutierten Ansätze, können MHC-Fusionskomplexe, die zum Auslösen einer Immunantwort fähig sind, z. B. ein MHC-Fusionskomplex voller Länge, der ein kovalent gebundenes antigenisches präsentierendes Peptid enthält, das die T-Zell-Proliferation stimulieren oder induzieren kann, auch direkt an ein Subjekt verabreicht werden.
Die hier beschriebenen Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort, einschließlich der Impfung eines Subjekts gegenüber einer bestimmten Erkrankung, können in Kombination mit bekannten Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Einzelketten-MHC-Klasse-II-Komplex oder ein DNA-Konstrukt, das für einen solchen MHC-Fusionskomplex kodiert, an ein Subjekt in Koordination oder in Kombination mit einer Verabreichung einer Vakzin-Zusammensetzung verabreicht werden, um die gewünschte Wirkung einer solchen Vakzin-Zusammensetzung auszulösen oder zu verlängern.
Wie hier offenbart, werden DNA-Vektoren, die für MHC-Fusionskomplexe kodieren, in geeigneter Weise an ein Säugetier, einschließlich eines Menschen, vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Die Verabreichung von cDNA in einen Skelettmuskel eines Säugetiers mit anschließender Aufnahme des verabreichten Expressionsvektors durch die Muskelzellen und die Expression des Proteins, das von der DNA kodiert wird, wurden von Ulmer et al. beschrieben und stellt ein beispielhaftes Protokoll dar [J. Ulmer et al., Science 259: 1745–1749]. Die optimale Dosis für eine gegebene therapeutische Applikation kann über konventionelle Maßnahmen bestimmt werden.
Zusätzlich können MHC-Fusionskomplexe, DNA-Vektoren, die für solche Komplexe kodieren und Wirts-kompatible Antigen-präsentierende Zellen, die solche DNA-Vektoren enthalten, in geeigneter Weise an ein Subjekt über eine Reihe von anderen Wegen verabreicht werden. Zum Beispiel kann es zur Induktion einer Immunantwort bevorzugt sein, DNA-Vektoren, die für antigenische MHC-Fusionskomplexe kodieren, allein oder zusammen mit DNA, die für einen co-stimulatorischen Faktor kodiert, intradermal an ein Subjekt durch für den Fachmann bekannte Verfahren zu verabreichen. Eine solche Verabreichung kann eine Transformation von intradermalen Antigen-präsentierenden Zellen (z. B. dendritische Zellen) und eine T-Zell-Proliferation bewirken. Siehe die Ergebnisse des folgenden Beispiels 16. MHC-Fusionskomplexe und DNA-Vektoren, die für sol che Fusionskomplexe kodieren, können auch an ein Subjekt über andere Wege verabreicht werden, beispielsweise oral oder transdermal.
Zusätzlich können neben der Behandlung von humanen Erkrankungen MHC-Fusionskomplexe und DNA-Konstrukte, die für solche Fusionskomplexe kodieren, oder beladene MHC-Moleküle von besonderem Nutzen für Veterinäranwendungen sein, z. B. zur Behandlung von Erkrankungen von Tieren wie Rindern, Schafen, usw. und Haustieren wie Hunden und Katzen.
Während MHC-Fusionskomplexe oder DNA-Konstrukte, die für solche Fusionskomplexe kodieren, oder beladene MHC-Moleküle alleine an ein Subjekt verabreicht werden können, ist es auch möglich, dass sie jeweils als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden können. Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen einen oder mehrere MHC-Fusionskomplexe oder DNA-Konstrukte, die für solche Fusionskomplexe kodieren, oder beladene MHC-Moleküle zusammen mit einem oder mehreren annehmbaren Trägern. Die Träger müssen "annehmbar" im Sinne von kompatibel mit anderen Zusätzen der Formulierung sein und dürfen für den Empfänger nicht schädlich sein. Zum Beispiel kann für eine parenterale Verabreichung, wie über eine Injektionsformulierung, eine sterile Lösung oder Suspension mit Wasser hergestellt werden oder andere pharmazeutisch annehmbare Lösungen. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen werden geeigneterweise durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren hergestellt.
Die tatsächlich bevorzugten Mengen eines gegebenen MHC-Fusionskomplexes oder eines DNA-Konstrukts, das für einen solchen kodiert, oder beladene MHC-Moleküle, die in einer bestimmten Therapie verwendet werden, werden in Abhängigkeit von der eingesetzten bestimmten aktiven Verbindung oder Verbindungen, den bestimmten formulierten Zusammensetzungen, dem Verabreichungsmodus, dem bestimmten Verabreichungsort, dem Gewicht des Patienten, dem Allgemeinbefinden, Geschlecht, usw., der bestimmten zu behandelnden Indikation, usw. und weiteren solchen solchen Faktoren, die für den Fachmann, einschließlich des verantwortlichen Arztes oder Veterinärs, ersichtlich sind, variieren. Optimale Verabreichungsraten für ein gegebenes Verabreichungsprotokoll können leicht durch den Fachmann mittels konventioneller Dosierungs-Bestimmungstests bestimmt werden, die hinsichtlich der vorausgegangenen Richtlinien und den hier beschriebenen Assays durchgeführt werden.
Erfindungsgemäße leere Einzelketten-MHC-Fusionskomplexe, vorzugsweise leere Einzelketten-MHC-Klasse-II-Komplexe, können mit einem geeigneten präsentierenden Peptid kombiniert werden, um einen erfindungsgemäßen beladenen Einzelketten-MHC-Komplex zu bilden. Es wird klar sein, dass solche beladenen Komplexe in geeigneter Weise dort eingesetzt werden, wo eine Verabreichung eines MHC-Peptid-Fusionskomplexes wie oben beschrieben angebracht ist. In Fällen, in denen ein DNA-Konstrukt, das für ein MHC-Peptid-Fusionskomplex kodiert, verwendet wird, können ein oder mehrere DNA-Konstrukte, die für einen geeigneten leeren Einzelketten-MHC-Komplex kodieren, eingesetzt werden, vorausgesetzt, dass geeignete Bedingungen für eine nicht-kovalente Bindung eines passenden präsentierenden Peptids an die Peptid-Bindungsfurche oder -spalte des leeren MHC-Moleküls vorhanden sind. Beispiele von Bedingungen zur Bindung eines geeigneten präsentiererden Peptids an ein leeres Einzelketten-MHC-Molekül sind vollständiger unten diskutiert. Beladene MHC-Komplexe, insbesondere beladene MHC-Klasse-II-Komplexe, haben eine Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen bei Menschen, Vieh und Haustieren, wie oben beschrieben.
Es wird auch klar sein, dass die oben beschriebenen Einzelketten-MHC-Fusionskomplexe verwendet werden können, um transgene Mausstämme herzustellen (siehe Beispiel 31, unten). Solche Mausstämme sind z. B. als Modellsysteme, in denen die Aktivität von T-Zellen wie T-Helferzellen, moduliert werden kann, nützlich.
Die folgenden, nicht-limitierenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
BEISPIELE 1A–1F Konstruktion von erfindungsgemäßen löslichen MHC-Fusionskomplexen
MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionsvektoren zur Expression von löslichen MHC-Klasse-II-Molekülen mit kovalent gebundenen präsentierenden Peptiden werden, wie unten in den Beispielen 1A–1F hergestellt. Die MHC-Klasse-II-Gene, die verwendet wurden, um die folgenden MHC-Fusionskomplexkonstrukte herzustellen, wurden durch PCR-Amplifikation von cDNA, die von der passenden Antigen-präsentierenden Zelle (APC) erzeugt worden ist, wie in den 2–8 der Zeichnungen gezeigt, isoliert.
Beispiel 1A. Für die I-A^d-Gene wurde Gesamt-RNA aus der Maus-B-Zell-Lymphomzelllinie A20 isoliert. Kurz gesagt wurden 1 × 10⁸ A20-Zellen (ATCC TIB 208) in 6 ml eiskaltem 4 M Guanidiniumthiocyanat, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, unter Verwendung eines Gewebe-Reiß-Homogenisierers für 5 Minuten homogenisiert. Nach der Homogenisierung wurde Sarcosyl mit einer Endkonzentration von 0,5% zugeführt und die Lösung wurde stark gemischt. Das Homogenat wurde bei 5000 g für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde auf 10 ml mit 4 M Guanidiniumthiocyanat, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,5% Sarcosyl-Puffer aufgefüllt. Der Überstand wurde vorsichtig auf der Oberseite eines 3,5-ml-Kissens von 5,7 M CsCl, 0,01 M EDTA, pH 7,5, in einem durchsichtigen SW41-Ultrazentrifugenröhrchen aufgeschichtet. Die Proben wurden in einem SW41-Rotor bei 32000 Upm für 24 Stunden bei 20°C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand vorsichtig entfernt und das RNA-Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen. Die RNA wurde in 350 μl DEPC-behandeltem Wasser, das 40 Einheiten von RNase (Promega) enthielt, gelöst. Die RNA wurde mit 35 μl 3 M Natriumacetat und 970 μl Ethanol präzipitiert. Dieses Verfahren ergab etwa 370 μg Gesamt-RNA. Die RNA wurde mit 5 μg/μl DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert und wurde für eine RT-PCR-Klonierung der I-A^d-Gene verwendet. 2 der Zeichnungen zeigt die Isolationsstrategie für das I-A^d-α1-α2-Genfragment (kodierend von aa1 bis 182) und 8 der Zeichnungen führt die verwendeten Oligonukleotid-Primer auf. Die A20-Gesamt-RNA (5 μg) wurde in cDNA unter Verwendung einer Superscript-MLV-Reversen Transkriptase (GIBCO-BRL) und einer α2-spezifischen Primer-Anlagerung entsprechend den Verfahren des Herstellers umgewandelt. Von den 20 μl erzeugter cDNA wurden 2 μl als Matrizen-DNA für die PCR verwendet. Typische PCR-Amplifikationsreaktionen (100 μl) enthielten Matrizen-DNA, 10 pmol der passenden Primer (OPR100 und OPR101), 2,5 Einheiten Taq-Polymerase, 100 μM dNTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine. Die Matrize wurde durch eine Anfangs-Inkubation bei 96°C für 5 Minuten denaturiert, in der währenddessen die Taq-Polymerase zugeführt wird, um einen Heißstart der Reaktion durchzuführen. Die gewünschten Produkte wurden durch 10 Thermozyklen bei 55°C für 1 Minute, 70°C für 1 Minute und dann 96°C für 1 Minute, gefolgt von 25 Schrittzyklen bei 70°C für 1 Minute und dann 96°C für 1 Minute, amplifiziert. Das anfängliche α1-α2-PCR-Produkt (etwa 550 bp) wurde so entworfen, dass es in einen bakteriellen Expressionsvektor, pJRS139, kloniert werden kann. die PCR-Produkte von 5 Reaktionen wurden miteinander zu einem Pool vermischt, mit 2 Volumen Ethanol/0,3 M Natriumacetat präzipitiert und die entstehenden Produkte (etwa 0,2 μg DNA) wurden in Wasser resuspendiert. Das α1-α2-Genfragment wurde mit NcoI/SpeI verdaut, über Agarose-Gelelektrophorese aufgelöst und durch Elution aus dem Agarosegel aufgereinigt. Die aufgereinigten verdauten PCR-Produkte wurden dann in den mit NcoI/SpeI verdauten pJRS139 ligiert. Das in den pJRS139 klonierte α1-α2-Genfragment wurde als 39AD2 bezeichnet und diente als Matrize für die PCR-Amplifikation, um die Restriktionsstellen und flankierenden Sequenzen hinzuzufügen, die für die Klonierung und Expression in den Säugetier-Expressionsvektoren notwendig sind. In diesen Reaktionen wurden 0,5 ng NcoI-verdauter 39AD2 als Matrize verwendet, OPR107 und OPR108 waren die Primer und die PCR-Bedingungen bestanden aus 5 Thermozyklen bei 60°C für 1 Minute, 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 20 Schrittzyklen bei 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute. Das α1-α2-PCR-Produkt (etwa 590 bp) enthält eine 5'-EcoRV-Stelle und eine 3'-EagI-Stelle zur Klonierung zwischen dem Leitsequenz-Intron und dem J-Region-Intron des IgG-kappa-Ketten-Shuttle-Vektors (siehe 9A der Zeichnungen). Zusätzlich besitzt das PCR-Produkt die IgG-Spleißstellen und Leitsequenzen, die für eine saubere Expression des MHC-IgG-Fusionsproteins notwendig sind. Die PCR-Produkte wurden mit EcoRV und EagI verdaut und Gel-gereinigt. Die aufgereinigten verdauten PCR-Produkte wurden dann in einem mit EcoRV/EagI-verdauten pBlueScript II SK+ (Stratagene) ligiert, was zu dem pA19-Konstrukt führte. Dieser Vektor wurde mit EcoRV und EagI verdaut und das entstehende α1-α2-Genfragment wurde in den pJW003-IgG-Shuttle-Vektor, wie unten in Beispiel 2 beschrieben, subkloniert.
Beispiel 1B. Der folgende Ansatz wurde verwendet, um das I-A^dd-β1-β2-Genfragment (kodierend für aa1 bis 189) zu isolieren, die Linkersequenz anzuheften und die Oligonukleotide, die für die antigenischen Peptide kodieren, einzuführen. Dieser Ansatz ist auch in 3 der Zeichnungen beschrieben. Die A20-Gesamt-RNA (10 μg) wurde unter Verwendung von Superscript-MLV-Reverse Transkriptase (GIBCO-BRL) und einer Oligo-dT-spezifischen Primer-Anlagerung entsprechend den Verfahren des Herstellers umgewandelt. Von den erzeugten 20 μl cDNA wurden 2 μl als Matrizen-DNA zur PCR verwendet. Die Reaktionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Oligonukleotid-Primer OPR102 und OPR104 waren (siehe 8 der Zeichnungen) und die PCR-Bedingungen bestanden aus 10 Thermozyklen bei 60°C für 1 Minute, 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 40 Schrittzyklen bei 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute. Das anfängliche β1-β2- PCR-Produkt (etwa 570 bp) wurde so entworfen, dass es in den bakteriellen Expressionsvektor, pJRS139, kloniert werden kann. Die PCR-Produkte wurden mit NcoI und SpeI verdaut und in der gleichen Weise wie oben beschrieben Gel-gereinigt. Die aufgereinigten verdauten PCR-Produkte wurden dann in NcoI/SpeI-verdauten pJRS139 ligiert. Das in den pJRS139 klonierte β1-β2-Genfragment wurde als 39BD2 bezeichnet und diente als Matrize zur PCR-Amplifikation, um die Linkersequenz und Restriktionsstellen und die flankierenden Sequenzen zuzufügen, die zur Klonierung und Expression in den Säugetier-Expressionsvektoren notwendig sind. In diesen Reaktionen wurden 0,5 ng NcoI verdauter 39AB2 als Matrize verwendet, OPR107 und OPR108 waren die Primer und die PCR-Bedingungen bestanden aus 5 Thermozyklen bei 60°C für 1 Minute, 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 20 Schrittzyklen bei 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute. Das Linker-β1-β2-PCR-Produkt (etwa 640 bp) enthält eine 5'-EcoRV-Stelle und eine 3'-EagI-Stelle zur Klonierung zwischen dem Leitsequenz-Intron und dem J-Region-Intron des IgG-schwere-Kette-Shuttle-Vektors (9B). Zusätzlich hat das PCR-Produkt die IgG-Spleißstellen und die Leitsequenzen, die für eine saubere Expression des MHC-IgG-Fusionsproteins notwendig sind. Um eine Klonierung der antigenischen Peptidsequenzen zu ermöglichen, wurde eine AflII-Stelle in das Ende der Signalsequenz eingebaut und eine NheI-Stelle war am Anfang des Linkers vorhanden. Die PCR-Produkte wurden mit EcoRV und EagI verdaut und Gel-gereinigt. Die aufgereinigten verdauten PCR-Produkte wurden dann in EcoRV/EagI-verdautem pBlueScript II SK+ (Stratagene) ligiert, was zu dem pB15-Konstrukt führte. Die Sequenz- und Restriktionsanalysen zeigten, dass dieses Konstrukt eine Mutation in der EcoRV-Stelle enthielt. Um diese Mutation zu korrigieren, wurden zwei Oligonukleotide (OPR119 und OPR120–2) angelagert und in den HindIII/NheI-verdauten pB15 ligiert, was zu dem Vektor pBC1 führte. Um Sequenzen einzuführen, die für die Klasse-II-I-A^d-Bindungspeptide kodieren, wurden Oligonukleotide angelagert und in den AflI/NheI-verdauten pBC1 ligiert. Das OVA 232–339-Peptid (SISQAVHAAHAEINEAGR) (SEQ ID NO: 3) wurde durch die Oligonukleotide OPR110 und OPR111, Ova:H331R (SISQAVHAARAEINEAGR) (SEQ ID NO: 4) durch OPR115 und OPR116, Ova A331Y (SISQAVHAAHYEINEAGR) (SEQ ID NO: 5) durch OPR117 und OPR118, und HEL 74–86 (NLCNIPCSALLSS) (SEQ ID NO: 6) durch OPR140 und OPR141 kodiert. Die entsprechenden Konstrukte in dem pBC1-Rückgrat wurden als pB16, pB24, pB37 und pB4 bezeichnet. Diese Vektoren wurden mit EcoRV und EagI verdaut und das entstehende Peptid-Linker-β1- β-2-Genfragment wurde in den pJW009-IgG-Shuttle-Vektor, wie in dem folgenden Beispiel 2 beschrieben, subkloniert.
Beispiel 1C. Der folgende Ansatz wurde verwendet, um das humane HLA-DR1-α1-α2-Gelenk-Genfragment (kodierend für aa1–192) zu isolieren und ist in 4 der Zeichnungen beschrieben. Zelluläre Gesamt-RNA wurde durch das oben beschriebene Verfahren aus 3 × 10⁶ BLCL-K68-Zellen, die aus einem HLA-DR1-homozygoten Individuum erhalten worden sind, hergestellt. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Superscript-MLV-Reverse Transkripase (GIBCO-BRL) und einer Oligo-dT-spezifischen Primer-Anlagerung entsprechend den Verfahren des Herstellers umgewandelt. Die PCR-Reaktionen am Anfang waren so entworfen, dass Restriktionsstellen, die für eine Klonierung des α1-α2-Gelenk-Genfragments in bakterielle Expressionsvektoren notwendig sind, hinzugefügt wurden (Arbeit, die für diese Anmeldung nicht relevant ist). PCRs wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 5 μl der Matrizen-cDNA verwendet wurden, die Primer DR1A-F und DR1A-B (8) waren und die PCR-Bedingungen aus 10 Thermozyklen bei 55°C für 1 Minute, 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 20 Schrittzyklen bei 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute bestanden. Das α1-α2-Gelenk-PCR-Produkt (etwa 570 bp) wurde mit HindIII und BamHI verdaut, Gel-gereinigt und in den HindIII/BamHI-verdauten pUC18 ligiert, was zu dem K68A3-Vektor führte. Dieser Vektor (0,5 ng) diente als Matrize für weitere PCR-Amplifikationen unter Verwendung von AF-N- und AB-S-Oligonukleotiden als Primer. Das entstehende α1-α2-Gelenk-PCR-Produkt wurde mit NcoI und SpeI verdaut, Gel-gereinigt und in den NcoI/SpeI-verdauten pJRS139 ligiert, was zu dem 39A2-Vektor führte. Dieser Vektor diente als Matrize zur PCR-Amplifikation, um die Linkersequenz und Restriktionsstellen und flankierenden Sequenzen, die zur Klonierung und Expression in den Säugetier-Expressionsvektoren notwendig sind, hinzuzufügen. PCRs wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 10 ng der NcoI-verdauten 39A2-Matrizen-DNA verwendet wurden, die Primer OPR124 und OPR125 waren (die Sequenzen davon sind in 8 der Zeichnungen beschrieben) und die PCR-Bedingungen aus 5 Thermozyklen bei 50°C für 1 Minute, 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 10 Schrittzyklen bei 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, bestanden. Das α1-α2-Gelenk-PCR-Produkt (etwa 610 bp) enthält eine 5'-EcoRV-Stelle und eine 3'-EagI-Stelle zur Klonierung zwischen dem Leitsequenz-Intron und dem J-Region-Intron des IgG-kappa-Ketten-Shuttle-Vektors (siehe 9E der Zeichnungen).
Zusätzlich besitzt das PCR-Produkt die IgG-Spleißstellen und Leitsequenzen, die für eine saubere Expression des MHC-IgG-Fusionsproteins notwendig sind. Die PCR-Produkte wurden mit EcoRV und EagI verdaut und Gel-gereinigt. Die gereinigten verdauten PCR-Produkte wurden dann in EcoRV/EagI-verdautem pA19 ligiert, was zum dem pBS-DR1A-Kontrukt führte. Dieser Vektor wurde mit EcoRV und EagI verdaut und das entstehende HLA-DR1-α1-α2-Gelenk-Genfragment wird in den pJW003-IgG-Shuttle-Vektor, wie in dem folgenden Beispiel 2 beschrieben, subkloniert.
Beispiel 1D. Der folgende Ansatz wurde verwendet, um das humane HLA-DR1-β1-β2-Gelenk-Genfragment (kodierend für aa1–198) zu isolieren, die Linkersequenz anzuheften und um die Oligonukleotide, die für die antigenischen Peptide kodieren, einzuführen. Dieser Ansatz ist auch in 5 der Zeichnungen gezeigt. Zelluläre Gesamt-RNA wurde durch das oben beschriebene Verfahren aus 3 × 10⁶-BLCL-K68-Zellen, die aus einem HLA-DR1-homozygoten Individuum erhalten wurden, hergestellt. Gesamt-RNA wurde zu cDNA (20 μl) unter Verwendung der Superscript-MLV-Reversen Transkriptase (GIBCO-BRL) und einer Oligo-dT-spezifischen Primer-Anlagerung entsprechend den Verfahren des Herstellers umgewandelt. Die PCR-Reaktionen am Anfang wurden so entworfen, dass Restriktionsstellen, die zur Klonierung des β1-β2-Gelenk-Genfragments in die bakterielle Expressionsvektoren notwendig sind, hinzugefügt wurden (Arbeit, die für diese Anmeldung nicht relevant ist). PCRs wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 5 μl der Matrizen-cDNA verwendet wurden, die Primer DR1B-F und DR1B-B waren (die Sequenzen dieser Primer sind in 8 der Zeichnungen beschrieben) und die PCR-Bedingungen aus 10 Thermozyklen bei 55°C für 1 Minute, 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 25 Schrittzyklen bei 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, bestanden. Das β1-β2-Gelenk-PCR-Produkt (etwa 610 bp) wurde mit HindIII und BamHI verdaut, Gel-gereinigt und in HindIII/BamHI-verdautem JS143.3 ligiert, was zu dem pP712-Vektor führte. Dieser Vektor (0,5 ng) diente als Matrize für die weiteren PCR-Amplifikationen unter Verwendung von BF-NN- und BB-S-Oligonukleotiden als Primer. Das entstehende β1-β2-Gelenk-PCR-Produkt wurde mit NcoI und SpeI verdaut, Gel-gereinigt und in NcoI/SpeI-verdautem pJRS139 ligiert, was zu dem 39B3-Vektor führte. Dieser Vektor diente als Matrize zur PCR-Amplifikation, um die Linkersequenz und Restriktionsstellen und flankierenden Sequenzen, die zur Klonierung und Expression in den Säugetier-Expressionsvektoren notwendig sind, hinzuzufügen. Eine Überlappungs-Extensions- PCR wurde verwendet, um eine AflII in der β1-Region zu mutieren und um die Linkersequenz hinzuzufügen. Der 39B3-Vektor wurde mit AflII und SpeI verdaut und das AflII/SpeI-β1-β2-Gelenk-Genfragment wurde Gel-gereinigt. Zwei Oligonukleotide, die für den Linker und den Anfang der β1-Region (OPR121 und OPR122) kodieren, wurden angelagert, mit Taq-DNA-Polymerase verlängert, was zu einem 78-bp-Fragment führte, bei dem das AflII in der β1-Region mutiert ist, ohne die angegebene Aminosäure zu verändern. Dieses Fragment (5 ng) wurde mit AflII/SpeI-β1-β2-Gelenk-Genfragment (5 ng) vermischt und es wurden Überlappungs-Extensionen mit 5 Thermozyklen bei 37°C für 1 Minute, 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute durchgeführt. Nach dem Zusatz der PCR-Primer OPR119 und OPR123 wurden 5 zusätzliche Thermozyklen bei 37°C für 1 Minute, 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute und 10 Schritt-Zyklen bei 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute durchgeführt. Das entstehende Linker-β1-β2-Gelenk-PCR-Produkt (etwa 670 bp) enthält eine 5'-EcoRV-Stelle und eine 3'-EagI-Stelle zur Klonierung zwischen dem Leitsequenz-Intron und dem J-Region-Intron des IgG-schwere Kette-Shuttle-Vektors (siehe 9F der Zeichnungen). Zusätzlich besitzt das PCR-Produkt die IgG-Spleißstellen und Leitsequenzen, die für eine saubere Expression des MHC-IgG-Fusionsproteins notwendig sind. Um eine Klonierung der antigenischen Peptidsequenzen zu ermöglichen, wurde eine AflII-Stelle in das Ende der Signalsequenz eingebaut und eine NheI-Stelle war am Anfang des Linkers vorhanden. Die PCR-Produkte wurden mit NheI und EagI verdaut, Gel-gereinigt und in NheI/EagI-verdautem pB16 ligiert (siehe oben), um die Genfragmente der β-Kette auszutauschen. Der entstehende Vektor wurde als pBS-DR1β bezeichnet. Um Sequenzen einzuführen, die für die Klasse-II-HLA-DR1-Bindungspeptide kodieren, wurden Oligonukleotide angelagert und in den AflII/NheI-verdauten pBS-DR1β ligiert. Das NP 404–415-Peptid mit der Sequenz QISVQPAFSVQ (SEQ ID NO: 7) wird durch die Oligonukleotide OPR128 und OPR129 kodiert und HA 307–319 mit der Sequenz PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 8) wird durch OPR130 und OPR131 kodiert. Die Sequenzen von OPR128, OPR129, OPR130 und OPR131 sind in 8 der Zeichnungen gezeigt. Die jeweiligen Konstrukte in dem pBS-DR1β-Rückgrat werden als pBS-DR1β/NP und pBS-DR1β/HA bezeichnet. Diese Vektoren werden mit EcoRV und EagI verdaut und das entstehende Peptid-Linker-β1-β2-Gelenk-Genfragment wird in den pJW009-IgG-Shuttle-Vektor, wie in dem folgenden Beispiel 2 beschrieben, subkloniert.
Beispiel 1E. Der folgende Ansatz wird verwendet, um das I-A^s-α1-α2-Genfragment (kodierend für aa1 bis 182) zu isolieren. 8 listet die verwendeten Oligonukleotid-Primer auf. 6 der Zeichnungen zeigt auch das Protokoll. Die Gesamt-RNA wurde aus der Milz einer SJL-Maus durch dasselbe Verfahren präpariert, das zur Präparation von RNA aus Zellkulturen verwendet wird. Die RNA (10 μg) wurde in cDNA (50 μl) unter Verwendung von MLV-Reverse Transkriptase (GIBCO-BRL) und einer α2-spezifischen Primer-Anlagerung entsprechend den Verfahren des Herstellers umgewandelt. PCRs wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 6 μl der Matrizen-cDNA verwendet wurden, die Primer OPR100 und OPR101 waren (die Sequenzen davon sind in 8 der Zeichnungen beschrieben) und die PCR-Bedingungen aus 5 Thermozyklen bei 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 20 Schrittzyklen bei 72°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, bestanden. Das anfängliche α1-α2-PCR-Produkt (etwa 550 bp) wurde unter Verwendung der PCR-Primer OPR107 und OPR108 mit 5 Thermozyklen bei 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 10 bis 15 Schrittzyklen bei 72°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, reamplifiziert. Das entstehende α1-α2-PCR-Produkt (etwa 590 bp) enthält eine 5'-EcoRV-Stelle und eine 3'-EagI-Stelle zur Klonierung zwischen dem Leitsequenz-Intron und dem J-Region-Intron des IgG-kappa-Kette-Shuttle-Vektors (siehe 9C der Zeichnungen). Zusätzlich besitzt das PCR-Produkt die IgG-Spleißstellen und Leitsequenzen, die für eine saubere Expression des MHC-IgG-Fusionsproteins notwendig sind. Die PCR-Produkte wurden mit EcoRV und EagI verdaut und Gel-gereinigt. Die gereinigten verdauten PCR-Produkte werden in EcoRV/EagI-verdautem pA19 ligiert (siehe oben), um die α-Kettenregionen auszutauschen. Der entstehende Vektor, pBS-IASα, wird mit EcoRV und EagI verdaut und das α1-α2-Genfragment wird in den pJW003-IgG-Shuttle-Vektor, wie in dem folgenden Beispiel 2 beschrieben, subkloniert.
Beispiel 1F. Die folgende Strategie wird verwendet, um das I-A^s-β1-β2-Genfragment (kodierend für aa1 bis 189) zu isolieren, die Linkersequenzen anzuheften und die Oligonukleotide, die für die antigenischen Peptide kodieren, einzuführen. Dieser Ansatz in auch in 7 der Zeichnungen beschrieben. Gesamt-RNA von SJL-Milz (10 μg) wurde in cDNA unter Verwendung von MLV-Reverser Transkriptase (GIBCO-BRL) und einer β2-spezifischen Primer-Anlagerung entsprechend den Verfahren des Herstellers umgewandelt. Von den 50 μl der erzeugten cDNA wurden 6 μl als Matrizen-DNA für die PCR verwendet. Die Reaktionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Oligonukleotid-Primer VW310 und OPR106 waren (8) und die PCR-Bedingungen aus 5 Thermozyklen bei 62°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 21 Schrittzyklen bei 72°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, bestanden. Um die Linkersequenzen hinzuzufügen, wurde das anfängliche β1-β2-PCR-Produkt (etwa 570 bp) unter Verwendung der PCR-Primer VW309 und OPR106 für 3 Thermozyklen bei 50°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 10 Schrittzyklen bei 72°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, reamplifiziert. Siehe 8 der Sequenzen der VW309- und OPR106-Primer. Das Linker-β1-β2-PCR-Produkt (etwa 640 bp) wurde mit NheI und EagI verdaut, Gel-gereinigt und in den NheI/EagI-verdauten pB16 ligiert (siehe oben), um die Genfragmente der β-Kette auszutauschen. Der entstehende Vektor, der als pBS-IASβ bezeichnet wird, enthält das EcoRV/EagI-Linker-β1-β2-Fragment, das zur Klonierung zwischen dem Leitsequenz-Intron und dem J-Region-Intron des IgG-kappa-Kette-Shuttle-Vektors erforderlich ist (siehe 9D der Zeichnungen). Um Sequenzen einzuführen, die für die Klasse-II-I-A^s-Bindungspeptide kodieren, wurden Oligonukleotide angelagert und in AflII/NheI-verdauten pBS-IASβ ligiert. Das MBP 91–103-Peptid (HYGSLPQKSQHGR) (SEQ ID NO: 9) wird durch die Oligonukleotide VW315 und VW316 kodiert, PLP 139–151 (HSLGKWLGHPDKF) (SEQ ID NO: 10) durch VW313 und VW314 und MBP 1–14 (MASQKRPSQRSKYL) (SEQ ID NO: 11) durch VW317 und VW318 kodiert. Die Sequenzen dieser Oligonukleotide sind in 8 der Zeichnungen beschrieben. Die entsprechenden Konstrukte in dem pBS-IASβ-Rückgrat werden als pBS-IASβ/MBP91, pBS-IASβ/PLP und pBS-IASβ/MBP1 bezeichnet. Diese Vektoren werden mit EcoRV und EagI verdaut und das entstehende Peptid-Linker-β1-β2-Genfragment wird in den in dem folgenden Beispiel 2 beschriebenen pJW009-IgG-Shuttle-Vektor subkloniert.
BEISPIEL 2 Herstellung des Expressionsvektors des MHC-Fusionskomplexes, der an Immunglobulin gebunden ist
Das folgende Protokoll umfasst die Expression von löslichen Peptid-gebundenen MHC-Klasse-II/Immunglobulin-Molekülen als chimäres Protein. Die Aufgabe besteht darin, ein Antikörper-artiges Molekül zu konstruieren, das eine konstante kappa-Domäne plus die MHC-Klasse-II-α-Kettenregion und die murine IgG2b-konstante Domäne, die mit der MHC-Klasse-II-β-Kette verknüpft ist, die an die Peptide von Interesse kovalent gebunden ist, enthält. Diese Konstrukte werden dann in getrennte Säugetier-Expressionsvektoren kloniert und verwendet, um Lymphoid-abgeleitete Zelllinien, d. h. J558, zu transfizieren.
Zwei üblich verwendete Säugetier-Expressionsvektoren werden so modifiziert, dass die chimären Konstrukte kloniert und exprimiert werden konnten. Die ursprünglichen Vektoren sind von Near et al., Molecular Immunology 27: 901–909 (1990) beschrieben. 10A der Zeichnungen zeigt den 11,7 kB großen pSVneoKappa 26-10-leichte Kette-Expressionsvektor, der pBR322 als Rückgrat und das Neomycin-Resistenz-Gen enthält. Weiterhin besitzt es ein 6,7 kB großes Stück der Keimbahn-kappa-DNA, die anfänglich als genomische DNA in lambda kloniert wurde. Ein 2,7 kB großes EcoRI-XbaI-Fragment enthält den Ig-kappa-Promotor und Enhancer, die Leitsequenz und dessen Intron, das Exon der variablen Region, das mit JK1 neu angeordnet wurde, die übrigen JK-Exons und -Introns und einen Teil des Haupt-Introns, das die variable Region der konstanten kappa-Region, wie in 11A der Zeichnungen gezeigt, voneinander trennt.
Die Peptid-gebundene β-Kette plus die IgG2b-Immunglobulin-konstante Region wurden in pSVgptHC 26-10 kloniert, der als pJW010 bezeichnet wird. Dieser Säugetierzell-Vektor wurde ursprünglich von Mulligan et al. (Science 209: 1422–1427, 1980) und später von Near et al., supra, beschrieben. Kurz gesagt hat pSVgptHC 26-10, der in 10B der Zeichnungen gezeigt ist, eine Größe von 10 kB und enthält ein E. coli-Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase-Gen (gpt) unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors. Die konstante Domäne des murinen Keimbahn-IgG2b wurde in pSVgpt als ein BglII-XbaI-Fragment kloniert. Eine weitere Veränderung zu dem von Near et al., supra, hergestellten Vektor bestand in der Klonierung eines 0,7 kB großen EcoRI-XbaI-Stücks, das den Ig-schwere Kette-Promotor/Enhancer enthält. Diese Veränderungen ergaben den pSVgptHC 26-10-Vektor mit einer XbaI-Klonierungsstelle, die verwendet wurde, um ein 1,7 kB großes XbaI-Fragment von Near et al. zu klonieren. Dieses 1,7-kB-Insert enthält eine Ig-schwere Kette-Leitsequenz und dessen Intron, das variable Exon, das an die JH4-Domäne gebunden ist, und einen Teil des Haupt-Introns, das zwischen der V-Region und der C-Region liegt. Weiterhin entspricht das 1,7-kB-Fragment der Zielsequenz der DNA, die mutiert worden ist. Zusammenfassend müssen, um eine Klonierung der α- und β-Ketten möglich zu machen, mehrere Mutationen an den 2,7-kB- und 1,7-kB-Fragmenten wie unten beschrieben vollständig durchgeführt werden.
Die Strategie zur Herstellung des pJW004-Vektors zur Klonierung und Expression des α-Ketten-Gens bestand darin, Mutationen an zwei Stellen innerhalb des in 11A beschriebenen 2,7-kB-Inserts zu erzeugen. Eine Probe von pJW004 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockland, Maryland, USA, hinterlegt und erhielt die ATCC-Nr. 75832. Eine EcoRV-Stelle wurde nach acht Nukleotiden 5' zu der variablen kappa-Region erzeugt, während eine EagI-Stelle nach acht Nukleotiden 3' von der JK1-Domäne eingeführt worden ist. Diese Mutationen würden eine gerichtete Klonierung des MHC-Klasse-II-α-Gens in den Vektor zur Expression des Fusionsmoleküls der α-Kette/konstanten kappa-Region ermöglichen. Eine Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Stellen-gerichtete Mutagenese wurde verwendet, um diese zwei Restriktionsstellen hinzuzufügen und die Primer und die durchgeführten Schritte, um diese Veränderungen zu bewirken, sind in 12 der Zeichnungen gezeigt. Das 2,7 kB große DNA-Stück wurde aus pUC19 in M13 mp18 als ein EcoRI-XbaI-Fragment, das mit EcoRI linearisiert wurde, kloniert und als Matrize (5 ng/100 μg-Gemisch) in den PCR-Reaktionen verwendet. Das 2,7-kB-Insert wurde in drei PCR-Fragmente geteilt, indem Primer entworfen wurden, die spezifisch drei unterschiedlich lange PCR-Produkte, die ein 0,8 kB großes EcoRI- bis EcoRV-Fragment, ein 0,4 kB großes EcoRV- bis EagI-Fragment und ein 1,5 kB großes EagI- bis XbaI-Fragment einschlossen, zu amplifizieren. Die zur Amplifikation von jedem Fragment verwendeten PCR-Primer sind zusammengefasst und die unterstrichene Sequenz entspricht der Stelle der Restriktions-Endonuklease. Die Primer PMC 120, [5' GCAGAAGAATTCGAGCTCGGCCCCCAG 3'] (SEQ ID NO: 12), der eine EcoRI-Stelle enthält, und PMC108 [5' GATGATATCAGAGAGAAATACATACTAACACACC 3'] (SEQ ID NO: 13), der eine EcoRV-Stelle enthält, wurden verwendet, um das 0,8 kB große Produkt zu amplifizieren, während die Primer PMC 100 [5' CGGAAGAAAGAGACTTCGGCCGCTACTTAC 3'] (SEQ ID NO: 14), der eine EagI-Stelle enthält, und PMC 102 [5' GTGTGTTAGTATGTATTTCTCTCTGATATCTTCAGCTTCCAGCAGTG 3'] (SEQ ID NO: 15), der eine EcoRV-Stelle enthält, verwendet wurden, um eine PCR mit dem 0.4-kB-Fragment durchzuführen. Das zu amplifizierende Endstück hatte eine Länge von 1,5 kB und wurde unter Verwendung der Primer PMC 99 [5' TCTTCTAGAAGACCACGCTAC 3'] (SEQ ID NO: 16), der eine XbaI-Stelle enthält, und PMC 107 [5' GATGATATCCGGCCGAAGTCTCTTTCTTCCGTTGTC 3'] (SEQ ID NO: 17), der eine EagI-Stelle enthält, amplifiziert. Zwei überlappende PCR-Reak tionen wurden mit den drei PCR-Produkten durchgeführt, um das mutierte 2,7-kB-Insert herzustellen. Die erste Überlappungs-PCR führte zu einer Amplifikation eines 1,2 kB großen Produkts unter Verwendung der Primer PMC 100 und PMC 120 und den 0,8-kB- und 0,4-kB-Fragmenten. Eine zweite Überlappungs-PCR-Reaktion wurde durchgeführt unter Verwendung der Gel-gereinigten 1,2-kB-DNA und dem 1,5-kB-Stück und den Primer PMC 99 und 120. Aus dieser Reaktion wurde ein 2,7 kB großes Fragment hergestellt, das später mit EcoRI und XbaI verdaut wurde und in pUC19 kloniert wurde. DNA aus Ligations-Reaktionsgemischen wurde in DG101-Zellen transformiert und 36 Kolonien wurden gepickt und auf Doppelverdaus unter Verwendung von EcoRV-EagI- und EcoRI-XbaI-Enzymen durchmustert.
Nach dem Nachweis von mehreren positiven Klonen durch eine Restriktionskartierung wurden drei Klone zur Sequenzierung ausgewählt. Indem die Primer PMC-33, 77, 111 und 114 verwendet wurden (die Sequenzen dieser Primer sind in 14 der Zeichnungen beschrieben), wurden 900 bp an Sequenzdaten erhalten. Die Region, bei der eine korrekte Sequenz gefunden wurde, umfasst 400 bp DNA zwischen den EcoRV- und EagI-Stellen und 300 bp 5' zu der EcoRV-Stelle und 200 bp 3' zu der EagI-Stelle. Ein Klon, pJW001, besaß eine hervorragende Sequenz, die sich von der Konsensus-Sequenz mit 5 Basen unterschied. Eine störende Beobachtung, die nach der Restriktionskartierung und der Durchsicht der Sequenzdaten, die unter Verwendung von universellen M13-Primern erzeugt worden sind, bestand darin, dass Insert-DNA, die in pUC19 kloniert wurde und in DG101 transformiert wurde, deletiert war. Diese deletierten Sequenzen stellten ein Problem dar, da ein Großteil der Transkriptions-Maschinerie zusammen mit einem Haupt-Intron, das zwischen der EagI-Stelle und XbaI liegt, deletiert war. Um das DNA-Stück, das die mutierten Stellen, EcoRV und EagI, enthielt, zu isolieren, wurde das Klon #12-Insert mit zwei spezifischen Schneideenzymen, NcoI und BsmI, verdaut. Die NcoI-Stelle befindet sich etwa 300 bp 5' von der EcoRV-Stelle und eine BsmI-Stelle ist etwa 200 bp 3' von der EagI-Stelle vorhanden. Daher wurde das 0,9 kB große NcoI-BsmI-Stück, wie in 13 der Zeichnungen gesehen werden kann, herausgeschnitten und in das pUC19/kappa 26-10-Insert kloniert, das keine EcoRV- und EagI-Stellen aufwies, aber die spezifischen Stellen NcoI und BsmI besaß. Zur Bestätigung, ob das Insert mit der richtigen Größe in pJW002 kloniert worden ist, wurde ein Aliquot von pJW002-DNA mit drei unterschiedlichen Paaren von Restriktionsenzymen, EcoRI-XbaI, NcoI-BsmI und EcoRV-EagI, verdaut.
Um sich wiederholende Rekombinationsereignisse zu verhindern, wurde der E. coli-Stamm von DG101 zu XL1-B, einem recA-negativen Wirt, geändert. Auf dieser Stufe enthielt die Insert-DNA zwei Stellenmutationen und die Klonierung des MHC-Klasse-II-α-Gens konnte weitergehen.
pJW002-DNA wurde mit EcoRV und EagI verdaut, mit alkaliner Phosphatase aus Rinderdarm (CIAP) dephosphoryliert und dann Gel-gereinigt. Die isolierte Vektor-DNA wurde dann in Ligationen mit dem Gel-gereinigten 577 bp großen und mit EcoRV-EagI-geschnittenen α-Ketten-I-A^d-Gen verwendet. Die Ligation, Transformation und Durchmusterung von 10 Kolonien ergab einen einzelnen positiven Klon, der mit zwei Enzympaaren, EcoRI-XbaI und EcoRV-EagI, verdaut wurde. Der positive Klon, pJW003 (pUC19-mutiertes kappa, das das α-Gen enthielt), wurde wachsen gelassen und die DNA wurde mit Qiagen gereinigt.
Ein dreifacher Verdau von pJW003-DNA wurde unter Verwendung von EcoRI, XbaI und HindIII durchgeführt. Die geschnittene DNA wurde dann mit Phenol-Chloroform behandelt, mit Ethanol präzipitiert und mit 70% Ethanol gewaschen und dann wurde die DNA mit ScaI verdaut und mit CIAP behandelt. pUC19-DNA migriert bei 2,7 kB auf einem Agarosegel, was es schwierig macht, pUC-DNA von der gewünschten Insert-DNA zu trennen. Jedoch hat pUC19 eine spezifische ScaI-Stelle, die zwei Fragmente mit kleinerer Größe herausschneidet und ergibt, die auf einem Agarosegel mit Abstand zu der 2,9-kB-Insert-DNA aufgetrennt werden können. Nach der Gelreinigung wurde das 2,9 kB große α-I-A^d-Gen-Insert in den EcoRI-XbaI-Gel-gereinigten pSVneo-Vektor ligiert, um pJW004 zu erzeugen (16A). Ligationen wurden in DG103 transformiert. Qiagen-Maxi-Präparationen wurden durchgeführt, um große Mengen an Vektor-DNA zu isolieren, so dass pJW004 in Säugetierzellen transfiziert werden konnte.
Die Strategie zur Klonierung des Gens von MHC-β variabel in den pSVgpt-Expressionsvektor bestand darin, vier Mutationen innerhalb des in 11B beschriebenen 1,7 kB großen XbaI-Stücks zu erzeugen. Die vier Mutationen schlossen Deletionen von zwei EcoRV-Stellen ein, wobei eine 68 Nukleotide 5' von dem Exon der Leitsequenz liegt und die andere Stelle 27 Nukleotide 5' von der variablen Region anzutreffen ist. Die anderen zwei Mutationen waren Stellenadditionen und beinhalteten eine EcoRV-Stelle 8 Nukleotide 5' von der variablen Region und eine EagI-Stelle 8 Nukleotide 3' von der JH4-Domäne. Die M13-Stellen-gerichtete Mutagenese wurde verwendet, um die Mutationen in dem 1,7-kB-Insert zu erzeugen. Der Ansatz bestand darin, eine Subklonierung mit dem 1,7 kB großen XbaI-Fragment aus pSVgptHC26-10 durchzuführen und es in M13 zu klonieren. Die Stellen-gerichtete Mutagenese wurde durchgeführt unter Verwendung des BioRad Muta-Gene in vitro-Mutagenese-Kits, der auf dem hochwirksamen und einfachen Verfahren von Kunkel basiert. Dieses Verfahren setzt einen speziellen E. coli-Stamm ein, dem die dUTPase (dut) und Uracil-N-Glykosylase (ung) fehlen. Diese Mängel ermöglichen zufällige Uracil-Substitutionen anstelle von Thymin in der M13-ssDNA. Wenn die doppelsträngige DNA oder die replikative Form (RF) in einen Wildtyp-Wirtsstamm zurück transformiert wird, degradiert die in der ursprünglichen Matrize vorhandene Uracil-N-Glykosylase Uracil in einer Weise, dass nur der DNA-Strang, der die Stellen-spezifische Mutation trägt, repliziert wird, was eine höhere Effizienz an positiven Klonen bewirkt.
Die unternommenen Schritte bei der Herstellung der Mutationen sind in 15 gezeigt. Kurz gesagt wurde der Primer PMC 26 [5' CAGGGTTATCAACACCCTGAAAAC 3'] (SEQ ID NO: 18) verwendet, um die EcoRV-Stelle, die 68 Nukleotide 5' von dem Exon der Leitsequenz vorhanden ist, zu deletieren, und er enthielt einen Einzelbasen-Austausch von A nach T, was durch das unterstrichene Nukleotid kenntlich gemacht ist. Die Deletion der zweiten EcoRV-Stelle 27 Nukleotide 5' von der variablen Region wurde mit dem Primer PMC 28 [5' GTCACAGTTATCCACTCTGTC 3'] (SEQ ID NO: 19) durchgeführt und wiederum gab es einen einfachen Punkt-Mutationsaustausch von A zu T. Der Primer PMC 96 [5' CCGTCTCCTCAGGTACGGCCGGCCTCTCCAGGTCTTCG 3'] (SEQ ID NO: 20) enthielt die Mutation der EagI-Stelle, die aus vier Basenaustauschen bestand, was durch die unterstrichenen Nukleotide kenntlich gemacht ist. Schließlich wurde der Primer PMC 97 [5' CACAGTTATCCACTCTGTCTTTGATATCACAGGTGTCCT 3'] (SEQ ID NO: 21) verwendet, um die EcoRV-Stelle zu erzeugen, indem vier Nukleotide wie gezeigt ausgetauscht wurden.
Das mutierte 1,7-kB-Insert wurde dann mit EcoRV-EagI verdaut, CIAP-behandelt, Gel-gereinigt und in Ligationen mit dem EcoRV-EagI-geschnittenen, Gel-gereinigten MHC-Klasse-II-β-Gen verwendet. Andere Varianten wie das oben in Beispiel 1 beschriebene Ova 323–339/I-A^d-β1-β2-Genfragment wurden auch in die EcoRV-EagI-Stelle kloniert und in M13 wachsen gelassen. 15 der Zeichnungen beschreibt die Strategie zur Klonierung von MHC-Klasse-II-β variabel und den Varianten in den Vektor pJW009. Nach Klonierung in pJW009 wurde die DNA mit XbaI verdaut, um die XbaI-Fragmente, die die verschiedenen Peptid-gebundenen β-variablen Gene enthielten, herauszulösen und sie wurde in den Säugetier-Expressionsvektor pJW010, wie in 16B gezeigt, subkloniert. Da eine gerichtete Klonierung nicht möglich war, wurde die Durchmusterung von positiven Klonen durch Verdau mit EcoRI-EcoRV durchgeführt. Positive Klone enthielten die β-Gene und andere Peptid-gebundene β-Ketten-Varianten wurden isoliert und die DNA wurde mit Qiagen gereinigt. Diese wurden als pHB27, pHB310, pHB412 und pHB58 für das I-A^d-β-Kettenkonstrukt, das kein Peptid enthielt, das Ova 323–339-Peptid, das Ova:H331R-Peptid bzw. das Ova:A331Y-Peptid bezeichnet (siehe Beispiel 1B). Proben von pHB27, pHB310, pHB412 und pHB58 wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA, hinterlegt und erhielten die ATCC-Nr. 75833, 75835, 75836 bzw. 75834.
Die Transfektion von Lymphoid-abgeleiteten Zellen wie J558- und NSO-Zellen kann im Wesentlichen wie von Near et al. beschrieben durchgeführt werden. 20 μg sowohl von pJW004 als auch von pJW010 wurden entweder in J55- oder NSO-Zellen durch Elektroporation unter Verwendung eines BioRad-Gen-Pulsgeräts co-transfiziert. Stabile Zelllinien wurden innerhalb von 7 bis 10 Tagen ausgewählt. Die Expression des chimären MHC-Klasse-II/Ig-Moleküls wird durch einen ELISA bestimmt, der spezifisch für die Detektion der konstanten Region des murinen IgG2b ist und/oder es wurde eine Wester-Blot-Analyse durchgeführt. Schließlich wurde das exprimierte Protein durch Protein-A- oder -G-Affinitätschromatographie aufgereinigt.
BEISPIEL 3 – Konstruktion der Peptid mit voller Länge-gebundenen MHC-Expressionsvektoren und Expressionsvektoren für co-stimulatorische Faktoren (B7-1 und B7-2)
Vektoren, die zur Co-Expression der I-A^d-α-Kette mit voller Länge und von Peptid-gebundenen I-A^d-β-Ketten-Molekülen fähig sind, werden in geeigneter Weise durch die in 17 der Zeichnungen dargestellten Verfahren konstruiert. Um die I-A^d-α-Kette mit voller Länge zu isolieren, wurde A20-Gesamt-RNA (5 μg) in cDNA unter Verwendung von Superscript-MLV-Reverse Transkriptase (GIBCO-BRL) und einer α-Ketten-TM-spezifischen Primer-Anlagerung entsprechend den Verfahren des Herstellers umgewandelt. Diese cDNA wurde als Matrize für die PCR-Amplifikation unter Verwendung eines α-Ketten-Leitsequenz-spezifischen Primers OPR132 (die Sequenz dieses Primers ist in 8 beschrieben) und eines α-Ketten-TM-spezifischen Primers OPR139 (die Sequenz dieses Primers ist in 8 beschrieben) bei den in dem oben beschriebenen Beispiel 1 vorliegenden PCR-Bedingungen verwendet. Das entstehende PCR-Produkt besitzt eine Länge von etwa 800 bp und enthält eine 5'-XmaI-Stelle und eine 3'-EcoRI-Stelle zur Klonierung zwischen dem CMV-Promotor und den SV40-Poly-A-Stellen des PEE13-Säugetier-Expressionsvektors (Celltech). Zusätzlich trägt dieses Fragment eine Kozak-Konsensus-Sequenz für eine effiziente translationale Initiation (siehe 18A der Zeichnungen). Das PCR-Produkt wurde mit XmaI und EcoRI verdaut, Gel-gereinigt und in den mit XmaI/EcoRI-verdautem PEE13 ligiert, um den PEE-IA^d-α-Vektor zu erzeugen. Das Peptid mit voller Länge-gebundene β-Ketten-Fragment wurde konstruiert, indem die Leit- und TM-Sequenzen in die Ova 323–339- und die HEL 74–86-Peptid-Linker-β1-β2-Vektoren (pB16 bzw. pB4) wie in dem oben beschriebenen Beispiel 1 eingeführt wurden. A20-Gesamt-RNA (5 μg) wurde in cDNA unter Verwendung von Superscript-MLV-Reverse Transkriptase (GIBCO-BRL) und entweder einer Oligo-dT-spezifischen oder β-Ketten-TM-spezifischen Primer-Anlagerung entsprechend den Verfahren des Herstellers umgewandelt. Diese cDNAs wurden als Matrize für die PCR-Amplifikation unter Verwendung von einem Paar β-Ketten-Leitsequenz-spezifischen Primern (OPR132/OPR133) (die Sequenzen dieser Primer sind in 8 der Zeichnungen beschrieben) oder einem Paar β-Ketten-TM-spezifischen Primern (OPR134/OPR135) (die Sequenzen dieser Primer sind in 8 der Zeichnungen beschrieben) verwendet. Das 110 bp große β-Leitsequenz-PCR-Produkt enthält 5'-HindIII- und XmaI-Stellen und eine 3'-AflII-Stelle zur Klonierung in die pBC1- und pB16-Peptid-Linker-β1-β2-Vektoren. Die Einführung der AflII-Stelle tauscht die letzten zwei Aminosäuren der I-A^d-β-Ketten-Leitsequenz mit denen der in der IgG-Leitsequenz anzutreffenden Aminosäuren aus. Das β-Leitsequenz-PCR-Produkt wurde mit HindIII und XmaI verdaut, Gel-gereinigt und in HindIII/AflII-verdautem pB16 ligiert, um pDM21 zu erzeugen. Das 180 bp große β-TM-PCR-Produkt enthält eine 5'-BstXI-Stelle und 3'-XmaIII- und EcoRI-Stellen zur Klonierung in pDM21. Das β-TM-PCR-Produkt wurde mit BstXI und EcoRI verdaut, Gel-gereinigt und in BstXI/EcoRI-verdautem pDM21 ligiert, um den pIA^dβ/OVA-Vektor, pVW229, zu erzeugen. Die Ova-Peptid-Oligonukleotide wurden mit dem in dem Beispiel 1 oben beschriebenen HEL-Peptid-Oligonukleotid ge tauscht, um den pIA^dβ/HEL-Vektor zu erzeugen. Diese Vektoren wurden mit XmaI und EcoRI verdaut, um die Peptid mit voller Länge-gebundenen β-Ketten-Genfragmente zur Klonierung zwischen dem CMV-Promotor und den SV40-Poly-A-Stellen des PEE6-Säugetier-Expressionsvektors (Celltech) zu erzeugen. Diese Fragmente tragen auch die Kozak-Konsensus-Sequenz für eine effiziente translationale Initiation (18B). Die entstehenden Vektoren PEE-IA^dβ/OVA und PEE-IA^dβ/HEL wurden mit BglII und BamHI verdaut. Die CKMB-Promotor/Peptid-β-Ketten-Fragmente wurden Gel-gereinigt und in mit BamHI-verdautem PEE-IA^dα ligiert, um die endgültigen PEE-IA^d/OVA- und PEE-IA^d/HEL-Expressionsvektoren zu erzeugen. Ein Vektor ohne Peptid-Oligonukleotid, PEE-IA^d, wurde auch konstruiert und als Kontrolle verwendet.
Um die B7-1- und B7-2-Gene zu klonieren, können cDNAs aus Gesamt-RNA, die aus aktivierten Milzzellen der Maus oder aus Lymphoma-Zelllinien der Maus isoliert worden ist, erzeugt werden. Diese cDNAs dienen als Matrizen für die PCR-Amplifikation unter Verwendung von B7-1- oder B7-2-spezifischen Primern. Die erzeugten PCR-Produkte tragen 5'- und 3'-NotI-Stellen zur Klonierung zwischen dem CMV-Promotor und den SV40-Poly-A-Stellen des pCMVβ-Säugetier-Expressionsvektors (Clonetech). Diese Fragmente tragen auch die Kozak-Konsensus-Sequenz für eine effiziente translationale Initiation.
BEISPIEL 4–11 – Assays und Methoden
Allgemeine Bemerkungen
Ein oder mehrere der zahlreichen Assaysysteme werden in geeigneter Weise eingesetzt, um die Fähigkeit der löslichen MHC-Fusionskomplexe zu testen, die Aktivität von T-Zellen zu modulieren. Sie sind in den folgenden Beispielen beispielhaft dargestellt. In einem ersten beispielhaften Assay wird ein MHC-Klasse-II-I-A^d/Ig-Fusionsmolekül der Maus an ein antigenisches Peptid des Hühnereier-Lysozyms (HEL 74–86), Hühnchen-Ovalbumin (Ova 323–339) oder an ein von zwei Einzel-Substitutions-Analoga des Ova-Peptids Ova H331R oder Ova A332Y gebunden. Die HEL 74–86-, Ova 323–339- und Ova H331R-Peptide sind bekannt, I-A^d zu binden, wobei das Ova A332Y-Analogon als eine nicht-bindende Kontrolle dient [S. Buus et al., Science 235: 1353–1358 (1987); A. Sette et al., Nature 328: 395–399 (1987)]. Das His₃₃₁ ist vermutlich nicht wichtig für die MHC-Bindung, aber es ist kritisch für die T-Zell-Stimulation und der OVA H331R/I- A^d/Ig-Komplex wird als TcR-Antagonist für eine T-Zell-Stimulation dienen. Das DO11.10-T-Zell-Hybridom der Maus erkennt spezifisch den Ova 323–339/I-A^d-Komplex und wird stimuliert, um IL-2 zu erzeugen. Der in Beispiel 4 unten dargestellte Assay verwendet das lösliche Ova 323–339/I-A^d/Ig, um die T-Zell-Stimulation durch APCs zu supprimieren, die mit dem Ova-Peptid beladen sind. Weitere Wirkungen der löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Moleküle auf die Ova-spezifische T-Zell-Proliferation wurden in Beispiel 5 untersucht. Zusätzlich können die Wirkungen des löslichen Ova 323–339/I-A^d/Ig und löslichen HEL 74–86/I-A^d/Ig auf die T-Zell-Funktion in vivo, wie in den Beispielen 6 und 7 beschrieben, untersucht werden. Mäuse werden mit den antigenischen HEL- und Ova-Peptiden (gebunden an KLH-Träger) und entweder mit den löslichen Ova 323–339/I-A^d/Ig- oder den löslichen HEL 74–86/I-A^d/Ig-Molekülen injiziert. Die Inhibition der T-Zell-abhängigen Antikörper-Antworten in vivo und die Proliferation von Ova-spezifischen T-Zellen und HEL-spezifischen T-Zellen werden wie in den Beispielen 6 und 7 beschrieben charakterisiert.
Ein weiteres Modell wird durch einen Assay beispielhaft dargestellt, der die Verknüpfung eines Peptids aus dem Influenza-Nukleoprotein (NP 404–415) an die humanen Klasse-II-HLA-DR1/Ig-Moleküle beinhaltet (siehe Beispiel 5). Die löslichen NP 404–415/DR1/Ig-Moleküle werden auf ihre Fähigkeit hin analysiert, die APC/NP 404–415-abhängige Proliferation einer humanen T-Zelllinie, K68-36, zu inhibieren. Lösliche DR1/Ig-Moleküle, die an ein anders HLA-DR1-Bindungspeptid (HA 307–319) gebunden sind, werden als Negativkontrolle verwendet.
In einem zusätzlichen Modellsystem wird die Fähigkeit von löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Molekülen untersucht, die Autoimmunität zu supprimieren. Als ein Tiermodell für multiple Sklerose können SJL-Mäuse induziert werden, um eine experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) nach einer Immunisierung mit enzephalitogenen Proteinen oder Peptiden oder nach einem adoptiven Transfer T_H-Zellen, die spezifisch für diese Antigene sind, zu entwickeln. Wie unten beschrieben, sind die enzephalitogenen Regionen des basischen Myelin-Proteins (MBP 91–103) und des Proteolipoproteins (PLP 139–151) jeweils an das Klasse-II-I-A^s/Ig-Molekül der Maus gebunden. Das nicht-gebundene MBP 1–14-Peptid dient als eine Negativkontrolle. Die löslichen Peptid-gebungenen I-A^s/Ig-Moleküle werden an EAE-induzierte Mäuse verabreicht. Die Fähigkeit, das Auftreten und den Schweregrad von EAE herabzusetzen, wird, wie in dem folgenden Beispiel 8 beschrieben, bestimmt. Zusätzlich können die immunosuppressiven Wirkungen von TcR-antagonistischen PLP-Analoga, die an I-A^s-Moleküle mit voller Länge gebunden sind, in diesem System in EAE-induzierten Mäusen untersucht werden. Die Peptid/MHC-Komplexe werden in dem Muskel nach einer Injektion mit DNA hergestellt, welche die passenden Genkonstrukte, wie in dem folgenden Beispiel 11 beschrieben, enthält.
Beispiel 4 – Wirkungen der löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Moleküle in einem Ovalbumin-spezifischen T-Zell-Hybridom-System
Ein erfindungsgemäßer Assay beinhaltet die Verwendung eines murinen T-Zell-Hybridoms, DO11.10 (R. Shimonkevitz et al., J. Exp. Med. 158: 303 (1983)], das auf dessen Oberfläche einen T-Zell-Rezeptor exprimiert, der spezifisch für ein 21-Aminosäuren-Peptidfragment (aa 323–339) ist, das aus Hühnchenei-Ovalbumin (Ova) stammt. Dieses Peptid kann an DO11.10 nur durch Antigen-präsentierende Zellen (APC) präsentiert werden, die das murine Klasse-II-MHC-Molekül I-A^d exprimieren. Wenn das Peptid durch die geeigneten APCs präsentiert wird, antworten die DO11.10-Zellen durch die Herstellung von IL-2, was dann als Maß für eine T-Zell-Aktivierung untersucht werden kann. Die T-Zelllinie, die eingesetzt wird, um das Antigen zu präsentieren, ist A20.1-11 [K. Kim et al., J. Immunol. 122: 549 (1979)], die I-A^d auf deren Oberfläche exprimiert. Kurz gesagt werden A20.1-11-Zellen in der Gegenwart des Peptidfragments inkubiert, bis ihre I-A^d-Moleküle mit dem Peptid gesättigt sind (etwa 3 Stunden) und werden dann gewaschen, um nicht-gebundenes Peptid zu entfernen. DO11.10-Zellen werden mit oder ohne lösliche Peptid-gebundene MHC/Ig-Moleküle für 3 Stunden (oder mehr) inkubiert und dann intensiv gewaschen, um nicht-gebundenes Protein zu entfernen. Wie in Beispiel 1 oben beschrieben, umfassen die Peptide, die an die I-A^d-β-Kette gebunden sind, ein der zwei Einzel-Substitutions-Analoga des Ova-Peptids, Ova H331R oder Ova A332Y, oder ein Peptid aus Hühnerei-Lysozym (HEL 74–86). Die Ova 323–339-, Ova H331R-, HEL 74–86-Peptide sind dafür bekannt, dass sie I-A^d binden, wobei das Ova A332Y-Analogon dazu als eine nicht-bindende Kontrolle dient [S. Buus et al., Science 235: 1353–1358 (1987); A Sette et al., Nature 328: 395–399 (1987)]. Das HEL 74–86-Peptid dient als eine nicht-spezifische Negativkontrolle. Antigen-gepulste APC werden mit dem DO11.10-T-Zell-Hybridom (2 × 10⁵/Vertiefung) für 24 Stunden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ inkubiert. Kulturen werden in einem vollständigen Kulturmedium (RPMI 1640, ergänzt mit 10% FBS, Penicillin/Streptomycin, L-Glutamin und 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol) in flachbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Nach 24 Stunden wird der Kulturüberstand auf das Vorhandensein von IL-2 unter Verwendung der IL-2-abhängigen murinen T-Zelllinie CTLL-2 getestet.
Es werden zweifache Serienverdünnungen von jedem Kulturüberstand in fertigem Medium in flachbödigen Mikrotiterplatten hergestellt und 1 × 10⁴ CTLL-2-Zellen werden zu jeder Vertiefung dazugegeben. Nach 16 bis 20 Stunden werden die Vertiefungen der Negativkontrolle (CTLL-2, kultiviert mit Medium alleine) und die Vertiefungen der Positivkontrolle (CTLL-2-Zellen, kultiviert mit rIL-2) mikroskopisch untersucht und an dem Punkt, an dem die Zellen der Negativkontrolle zu 90% abgestorben sind, während die Zellen der Positivkontrolle noch aktiv proliferieren, wird MTT (2 mg/ml; 25 μl/Vertiefung) zugeführt und die Platten in den Inkubator für weitere 4 Stunden zurückgegeben. Zu dieser Zeit werden blaue Kristalle, die durch MTT in aktiv metabolisierenden Zellen gebildet werden, durch den Zusatz von 150 μl pro Vertiefung von 0,4 N HCl in Isopropanol pro Vertiefung gelöst. Nach vorsichtigem Mischen wird die O. D. bei 562 nm unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesegeräts (Ceres-UV900HI) bestimmt. Die Konzentration von IL-2 in den experimentellen Vertiefungen kann durch Extrapolation von einer IL-2-Standardkurve bestimmt werden und dann kann anhand des Vergleichs von IL-2 aus Kulturen, die keine rekombinanten Proteinmoleküle enthielten, mit denen, die die getesteten Moleküle enthielten, ein Inhibitionsindex errechnet werden.
Es wird angenommen, dass die Verwendung von Antigen-Dosen und APC-Zahlen, die geringfügig submaximale Antworten des Peptid-Antigens ergeben, und Antigen-präsentierende Zellen zur Aktivierung von DO11.10 bevorzugt ist, um die Inhibition des Systems durch rekombinante Proteinmoleküle nachzuweisen. Aufgrund dessen werden Experimente vorzugsweise zumindest am Anfang mit Peptid-Antigen-Pulsbedingungen bei 100 μg/ml und 10 μg/ml und mit APC-Konzentrationen von 0,5 × 10⁵/Vertiefung und 0,1 × 10⁵/Vertiefung durchgeführt.
Lösliche Peptid-gebundene MHC/Ig-Moleküle werden auf ihre Fähigkeit hin getestet, dieses System über einen Konzentrationsbereich von 10¹²–10⁶ M zu blockieren. Das Testen wird in geeigneter Weise mit etwa einem 10 : 1 bis 1 : 1 molaren Verhältnis zwischen den löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Molekülen und dem MHC-Klasse-II, der entweder auf 0,5 × 10⁵ oder 0,1 × 10⁵ A20.1-11-Zellen exprimiert wird, durchgeführt. Die Konzentrationen werden, soweit notwendig, in Abhängigkeit von den Ergebnissen der vorläufigen Experimente angepasst. Ein Abfall bei der DO11.10-IL-2-Herstellung nach der Präinkubation mit den löslichen Ova 323–339/I-A^d/Ig- oder Ova H331R/I-A^d/Ig-Molekülen im Vergleich zu einer Präinkubation mit Ova A332Y/I-A^d/Ig- oder HEL 74–86/I-A^d/Molekülen oder zu keiner Präinkubation wird zeigen, dass die löslichen Peptid-gebundenen MHC-Moleküle Immunantworten in einer Peptid-spezifischen Art supprimieren können.
Derselbe Assay kann auch verwendet werden, um Peptide zu identifizieren, die eine Funktion als TcR-Antagonist oder Teil-Agonist, wie oben beschrieben, haben.
Beispiel 5 – Wirkungen der löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Moleküle auf die Antigen-stimulierende T-Zell-Proliferation
Ein weiterer erfindungsgemäßer Assay, der die Erfindung daraufhin untersucht, ob die löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Moleküle zur Suppression von Immunantworten in T-Zellen fähig sind, werden aus Mäusen oder Menschen isoliert (statt dem T-Zell-Hybridom, das in Beispiel 4 oben beschrieben wurde).
Das DO11.10-T-Zell-Hybridom ist teilweise aktiviert und erfordert keine co-stimulatorischen Signale für eine vollständige Aktivierung. Andererseits erfordern nicht-transformierte T_H-Zellen, die aus immunisierten Mäusen isoliert worden sind, sowohl ein Peptid/MHC-Signal als auch co-stimulatorische Signale, um in Kultur zu proliferieren. Dieses System wird als ein sensitiver Maßstab für die Wirkungen der löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Moleküle auf T-Zell-Antworten verwendet werden. Ova-geprimte T-Zellen werden aus BALB/c-Mäusen (MHC-Klasse-II: I-A^d) durch Immunisierung mit 50 μg Ova 323–339-KLH in vollständigem Freund's Adjuvans subkutan am Ende des Schwanzes erhalten. Zwei Immunisierungen werden in Intervallen von 7 Tagen durchgeführt und eine Woche nach der zweiten Injektion werden die Mäuse getötet und die Inguinal- und Paraaortika-Lymphknoten werden entfernt und zu einer Einzelzell-Suspension verarbeitet.
Diese Suspension wird von Antigen-präsentierenden Zellen durch Inkubation auf Nylonwolle und Sephadex G-10-Säulen depletiert und die entstehenden gereinigten T-Zell-Populationen werden entweder in Click's Medium alleine oder mit löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Molekülen, die in Click's Medium ver dünnt sind, inkubiert. T-Zellen werden mit löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Molekülen (wie in Beispiel 4 oben beschrieben) für 3 Stunden vor dem Waschen und der Initiation des Proliferations-Assays kultiviert, jedoch kann dieser Zeitraum, wenn notwendig, auch auf 24 Stunden erhöht werden.
Aktivierte B-Zellen von BALB/c-Mäusen werden als Antigen-präsentierende Zellen in dem Proliferations-Assay verwendet. B-Zellen werden hergestellt, indem Milzzellen mit 50 μg/ml LPS für 48 bis 72 Stunden kultiviert werden, wobei nach dieser Zeit aktivierte Zellen durch Dichtegradienten-Zentrifugation auf Lymphoprep isoliert werden. Aktivierte B-Zellen werden dann mit dem Ovalbumin-Peptid für 3 Stunden gepulst, intensiv gewaschen, mit Paraformaldehyd fixiert, um die Proliferation von B-Zellen zu inhibieren, und zu den gereinigten T-Zellen zugegeben.
Der Proliferations-Assay wird in Rundboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei 37°C, 5% CO₂, für 3–5 Tage durchgeführt. Die Vertiefungen werden mit 1 μCi ³H-Thymidin für 18 Stunden vor Kultivierungsende gepulst und mit einem Skatron-Zellerntegerät geerntet. Der Einbau von ³H-Thymidin in DNA wird als Maß für die T-Zell-Proliferation bestimmt, indem ein LKB-Flüssigkeits-Scintillationsspektrometer verwendet wird. Ein Abfall bei der T-Zell-Proliferation nach der Präinkubation mit den löslichen Ova 323–339/I-A^d/Ig-Molekülen im Vergleich zu einer Präinkubation mit den Ova A332Y/I-A^d/Ig- oder HEL 74–86/I-A^d/Ig-Molekülen oder zu keiner Präinkubation zeigt, dass die löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Moleküle Immunantworten in einer Peptid-spezifischen Weise supprimieren können.
Die Messung von IL-2-Konzentrationen in Vertiefungen nach 24 und 48 Stunden, die proliferierende T-Zellen enthalten, kann eine gute Alternative sein, um den 3 bis 5 Tage lang dauernden Assay der Proliferation durchzuführen. Anfängliche Experimente beinhalten den Vergleich dieser zwei Systeme, um zu bestimmen, welches empfindlicher für einen Nachweis der Inhibition sein könnte. Da der Nachweis von IL-2 ein frühes Aktivierungsereignis misst, hat es sich in dieser Situation als nützlicher herausgestellt.
Anfängliche Experimente, die vor dem Testen von löslichen Peptid-gebundenen MHC-Molekülen durchgeführt worden sind, werden die Optimum-Parameter für diese Systeme bestimmen, d. h. supramaximale, maximale und submaximale Konzentrationen des Peptid-Antigens für einen Puls mit Antigen-präsentieren den Zellen, optimale und suboptimale Dosierungen von APC/Vertiefung und die optimale Länge des Proliferations-Assay (3–5 Tage) oder des IL-2-Produktions-Assays. Wie oben diskutiert wird angenommen, dass das System empfindlicher auf eine Inhibition mit rekombinanten Proteinen bei einem suboptimalen Spiegel der T-Zell-Aktivierung sein wird, so dass solche Bedingungen vorzugsweise für die Anfangsexperimente gewählt werden.
Die Wirkungen der löslichen Peptid-gebundenen humanen Klasse-II-MHC/Ig-Moleküle auf die Antigen-stimulierte humane T-Zell-Proliferation wird auch untersucht. Lösliche HLA-DR1/Ig-Moleküle, die entweder an das nukleäre Protein NP 404–415 von Influenza oder an das Hämagglutinin-Protein HA 307–318 von Influenza kovalent gebunden sind, können wie in den Beispielen 1 und 2 oben beschrieben hergestellt werden. Beide Peptide sind dafür bekannt, dass sie HLA-DR1-Moleküle binden. Ein NP 404–415/DR1-spezifischer humaner T-Zell-Klon, K68-36, wird verwendet, um die Wirkungen der Präinkubation auf die löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Moleküle auf die ³H-Thymidin-Inkorporation, die durch NP 404–415-beladene APCs stimuliert wurden, zu testen (BLCL-K68-Zellen; EBV-transformierte B-Zellen von demselben Spender), wie oben beschrieben. Wiederum zeigt ein Abfall bei der T-Zell-Proliferation nach einer Präinkubation mit den löslichen NP 404–415/DR1/Ig-Molekülen im Vergleich zu einer Präinkubation mit den HA 307–318/DR1/Ig-Molekülen oder keiner Präinkubation, dass die löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Moleküle humane Immunantworten in einer Peptid-spezifischen Weise supprimieren können.
Diese Assays können auch zum Bestimmen, ob ein Peptid eine Funktion als TcR-Antagonist oder Teil-Agonist, wie oben diskutiert, besitzt, eingesetzt werden.
Beispiel 6 – In vivo-Wirkungen der löslichen Peptid-gebundenen MHC-Moleküle auf Antikörper-Antworten
Wie oben diskutiert, wurde gezeigt, dass Peptid-MHC-Komplexe auf der Oberfläche von APCs nur die klonale Expansion einer reaktiven T-Zelllinie, die für das MHC-gebundene Peptid spezifisch ist, induzieren wird, wenn die APCs auch co-stimulatorische Signale abgeben. Wenn co-stimulatorische Signale, die von APCs abgegeben werden, fehlen, werden diese speziellen reaktiven T_H-Zellen zu einem Zustand der Anergie induziert werden.
Zum Testen, ob die löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Moleküle eine T_H-Zell-Anergie in vivo induzieren können, können die Wirkungen solcher Moleküle auf einen T_H-Zell-abhängigen Immunglobulin-Klassenwechsel (d. h. IgM zu IgG) und auf eine klonale Expansion von Peptid-spezifischen T-Zelllinien (das folgende Beispiel 7) untersucht werden.
Um den Ig-Klassentausch zu untersuchen, wurden drei Testgruppen wie folgt zusammengesetzt:

(a) 15 BALB/c-Mäuse werden intraperitoneal (IP) mit 10–100 μg des Ova 323–339-KLH-Konjugats in vollständigem Freund's Adjuvans injiziert, um eine Immunantwort gegenüber dem Ova 323–339-Peptid zu induzieren. Am Tag davon und am Tag der Immunisierung mit Ova-KLH werden 5 der Mäuse IP mit 10–100 μg des löslichen Ova 323–339/MHC-I-A^d/Ig in PBS injiziert. Dieses lösliche Ova-Fusionsprotein bindet an den T-Zell-Rezeptor (TcR), der auf den Ova 323–339-spezifischen T_H-Zellen sichtbar ist. Aufgrund des Fehlens des co-stimulatorischen Signals werden diese T_h-Zellen in einem Zustand der Anergie induziert. Die verbleibenden 10 Mäuse dienen als Kontrolle. 5 von ihnen erhalten PBS und weitere 5 erhalten intraperitoneal MHC-I-A^d/Ig.
(b) Identische Experimente werden mit dem HEL-KLH-Konjugat und HEL 74–86/MHC-I-A^d/Ig durchgeführt.
(c) 25 BALB/c-Mäuse werden wie oben beschrieben mit beiden Ova-KLH- und HEL-KLH-Konjugaten injiziert. 5 dieser Mäuse werden intraperitoneal mit Ova 323–339/MHC-I-A^d/Ig injiziert und 5 von ihnen werden mit HEL 74–86/MHC-I-A^d/Ig intraperitoneal behandelt. Die anderen Mäuse erhielten entweder PBS oder MHC-I-A^d/Ig als Kontrolle.

10 Tage nach der Immunisierung wird Blut aus jeder Maus durch Schwanzblutung gesammelt. Mäuse werden mit Metafan auf die folgende Weise narkotisiert: Baumwolle oder Mull wird mit 20 bis 25 Tropfen Metafan befeuchtet und in einen Glasbehälter mit einem Metall- oder Glasdeckel gegeben. Die Maus wird auf der Oberseite eines Gitterrosts gegeben, der sich oberhalb der befeuchteten Baumwolle oder Mull befindet. Wenn die Atmung langsamer wird, wird die Maus aus der Kammer genommen und die Zehen werden zusammengezwickt, um die Reflexe zu überprüfen. Wenn die Maus ausreichend narkotisiert ist, wird der Schwanz unter eine Hitzelampe gehalten, um den Blutstrom zu erhöhen. Nach der Desinfektion des Schwanzes mit Isopropyl- oder Ethylalkohol wird die Spitze mit einer scharfen Schere abgeschnitten. Das Blut wird in einem Eppendorf-Gefäß gesammelt. Die Blutung kann durch "Melken" des Schwanzes erhöht werden. Nach dem Einsammeln des Bluts wird auf der Spitze des Schwanzes mit einem Mullpflaster Druck ausgeübt. Das Blut wird bei etwa 14000 g für 3–5 Minuten zentrifugiert und das Serum gesammelt.
Assays werden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Maxisorp F8; Nunc, Inc.), die mit 1–50 μg/ml mit Ova-KLH oder ganzem Ovalbumin unter Verwendung eines Tris-HCl-Beschichtungspuffers, pH 8,5, beschichtet sind, durchgeführt. Ein zweiter Satz von Platten wird mit 1–50 μg/ml HEL-KLH oder ganzem HEL beschichtet. Die Platten werden mit einem drucksensitiven Film (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA) abgedeckt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten werden dann mit Waschlösung gewaschen (Imidazol/NaCl/0,4% Tween-20) und durch Zusatz von 100 μl/Vertiefung einer 3%igen BSA-Lösung blockiert. Nach der Inkubation auf einem Platten-Rotiergerät bei Raumtemperatur für 30 Minuten werden die Platten fünfmal mit Waschlösung gewaschen. Die Maus-Seren werden 1 : 500 in Proben-/Konjugat-Lösungsmittel (2% Gelatine + 0,1% Tween-20 in TBS) verdünnt und dann zweifach seriell auf der Platte verdünnt. Zwei identische Platten werden für jedes beschichtete Protein angesetzt, eine zur Bestimmung des IgM-Titers und die andere für IgG. Nach der 30-minütigen Inkubation auf einem Platten-Rotationsgerät bei Raumtemperatur werden die Platten fünfmal mit Waschlösung gewaschen. Es werden Ziegen-anti-Maus-IgM-HRP- und Ziegen-anti-Maus-IgG-HRP-Konjugate (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, 1 : 100-Verdünnung in Proben-/Konjugat-Verdünnungsmittel) zu den passenden Platten zugegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation auf einem Platten-Rotationsgerät bei Raumtemperatur werden die Platten fünfmal mit Waschlösung gewaschen und dann mit 100 μg/Vertiefung mit ABTS-Entwicklungssubstrat (Kirkgaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) für 10 Minuten auf einem Platten-Rotationsgerät bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionen werden mit 100 μg/Vertiefung Quench-Puffer (Kirkgaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) gestoppt und der Absorptionswert wird bei 405 nm unter Verwendung eines automatisierten Mikrotiterplatten-ELISA-Lesegeräts (Ceres UV900HI, Bioteck, Winooski, Vermont) ausgelesen. Der Titer wird bestimmt, indem die abgelesene Absorption gegenüber dem Log der Verdünnungen der Proben aufgetragen wird und die Verdünnung am Mittelpunkt bestimmt wird (50% der Absorption). Die Titer für IgM werden dann gegenüber denen von IgG verglichen. Die Seren werden auch auf Kreuzreaktivität hin getestet.
Beispiel 7 – T_H-Zell-Stimulation in Mäusen, die mit löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Molekülen behandelt wurden
Die Wirkungen der löslichen Peptid-gebundenen MHC/Ig-Moleküle auf die klonale Expansion von Peptid-spezifischen T-Zelllinien in vivo kann in geeigneter Weise entsprechend dem folgenden Assay untersucht werden.
Die Behandlungsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe) sind identisch zu denen, die in dem Beispiel 6 oben beschrieben sind. Das Immunisierungsprotokoll sieht wie folgt aus: Mäuse werden intraperitoneal mit 10–100 μg des löslichen Ova 323–339/MHC-I-A^d/Ig in PBS injiziert und 24 Stunden später subkutan am Schwanzende mit 50 μg Ova 323–339-KLH injiziert. Diese zwei Injektionen werden 6 und 7 Tage später wiederholt. 7 Tage nach Beendigung des zweiten Satzes der Injektionen werden die Mäuse getötet. Die Inguinal- und Paraaorta-Lymphknoten werden entfernt und zu einer Einzelzell-Suspension verarbeitet.
Die Suspension wird durch Inkubation auf Nylonwolle und Sephadex G-10-Säulen auf Antigen-präsentierende Zellen depletiert und die entstehenden gereinigten T-Zell-Populationen werden mit APCs inkubiert, die entweder mit dem Ova 323–339-Peptid oder dem HEL 74–86-Peptid gepulst worden sind.
Aktivierte B-Zellen aus BALB/c-Mäusen werden auf die Antigen-präsentierenden Zellen in dem Proliferations-Assay verwendet. B-Zellen werden hergestellt, indem Milzzellen mit 50 μg/ml LPS für 48 bis 72 Stunden kultiviert werden, wobei nach dieser Zeit die aktivierten Zellen durch Dichtegradienten-Zentrifugation mit Lymphoprep isoliert werden. Aktivierte B-Zellen werden dann mit dem Ova 323–339-Peptid oder dem HEL 74–86-Peptid für 3 Stunden gepulst, intensiv gewaschen, mit Paraformaldehyd fixiert, um die Proliferation von B-Zellen zu inhibieren, und zu den gereinigten T-Zellen von jedem Feld der Mäuse zugegeben.
Der Proliferations-Assay wird in Rundboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei 37°C, 5% CO₂, für 2–3 Tage durchgeführt. Die Vertiefungen werden mit 1 μCi ³H-Thymidin für 18 Stunden vor Kultivierungsende gepulst und unter Verwendung eines Skatron-Zellerntegeräts geerntet. Der Einbau von ³H-Thymidin in [TEXT FEHLT]
Dann wird als Maß einer T-Zell-Proliferation bestimmt, indem ein LKB-Flüssig-Szintillationsspektrometer verwendet wird. Der Grad der Peptid-reaktiven T-Zell-Proliferation weist auf die T_H-Zell-Antworten (d. h. klonale Expansion) hin, die in den Mäusen nach Immunisierung stattgefunden haben.
Beispiel 8 – Lösliches Peptid-gebundene MHC/Ig-vermittelte Inhibition der EAE-Induktion in SJL-Mäusen
Experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) ist eine Autoimmunerkrankung in Mäusen und dient als Tiermodell für multiple Sklerose. Enzephalitogene Regionen von zwei Proteinen, basisches Myelinprotein (MBP 91–103) und Proteolipoprotein (PLP 139–151) sind definiert worden. In dem empfindlichen SJL-Mausstamm kann EAE induziert werden, so dass diese nach einer Immunisierung mit dem enzephalitogenen Peptid oder einem adoptiven Transfer von MBP-reaktiven T-Zellen ausgelöst wird. Zur Bestimmung, ob eine Behandlung mit löslichen MHC-Fusionskomplexen wie MBP 91–103/MHC-I-A^s/Ig- und PLP 139–151/MHC-I-A^s/Ig-Komplex eine EAE-Entwicklung nach der T-Zell-Aktivierung verhindern wird, können SJL-Mäuse mit dem untersuchten MHC-Fusionskomplex, z. B. MBP 91–103 und PLP 139–151 in reaktiven T-Zell-Blastozyten in vivo injiziert werden.
Um EAE in SJL-Mäusen mit MBP 91–103 zu induzieren, werden Mäuse mit 400 μg MBP 91–103 in vollständigem Freund's Adjuvans auf dem Zungenrücken immunisiert. 10 bis 14 Tage später werden regional vorkommende Lymphknotenzellen wie oben beschrieben geerntet und in Platten mit 24 Vertiefungen bei einer Konzentration von 6 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung in 1,5 ml RPMI 1640-Medium/10% fötales Rinderserum/1% Penicillin/Streptomycin mit einem Zusatz von MBP bei 50 μg/ml kultiviert. Nach einer 4-tägigen in vitro-Stimulation werden MBP 91–103-reaktive T-Zell-Blastozyten über einen Ficoll/Hypaque-Dichtegradienten geerntet, zweimal in PBS gewaschen und 1,3 × 10⁷ Zellen werden in jede Maus injiziert. Mäuse, die enzephalitogene MBP 91–103-reaktive T-Zellen erhielten, erhielten dann entweder 100 μg lösliches MBP 91–103/I-A^s/Ig, 100 μg MBP 1–14/I-A^s/Ig (die Negativkontrolle) oder normale Kochsalzlösung an den Tagen 0, 3 und 7 i. v. (Gesamtdosis 300 μg). Klinische und histologische Beurteilungen werden durchgeführt, um zu bestätigen, dass das MBP 91–103/I-A^s/Ig die Entwicklung von EAE in diesen Mäusen inhibiert hat.
Um EAE in SJL-Mäusen mit dem PLP-Peptid 139–151 zu induzieren, wurden Mäuse mit dem PLP-Peptid 139–151, das in PBS gelöst war, immunisiert und mit vollständigem Freund's Adjuvans, das Mycobacterium tuberculosis H37Ra bei 4 mg/ml enthält, in einem 1 : 1-Verhältnis vermischt. Mäuse werden mit 150 μg des Peptid-Adjuvans-Gemisches injiziert. Am gleichen Tag und 48 Stunden später wurden an alle Tiere 400 ng Pertussis-Toxin verabreicht. Der adoptive Transfer von EAE wurde dann wie oben beschrieben durchgeführt. PLP 139–151/I-A^s/Ig wurde statt MBP 91–103/I-A^s/Ig verwendet, um die Entwicklung von EAE zu verhindern.
Beispiel 9 – Antikörper-Antwort in Mäusen, die mit den Peptid-gebundenen MHC-Expressionsvektoren vakziniert wurden
Der folgende Assay (veranschaulicht mit PEE-IA^d/OVA) zeigt, wie eine Immunantwort in einem Säugetier gemäß der Erfindung durch Verabreichung (z. B. IM) eines oder mehrerer präsentierender Peptid-gebundener MHC-Expressionsvektoren induziert werden kann und dass eine Co-Verabreichung von DNA, die für einen co-stimulatorischen Faktor wie B7-1(oder B7-2)-Expressionsvektor kodiert, angewendet werden kann, um die Immunantwort, wie oben diskutiert, weiter zu steigern. Dieses System stellt ein einzigartiges Verfahren zum Induzieren von Immunantworten (einschließlich der Bereitstellung einer Impfung gegenüber einer gezielten Erkrankung) bereit, das die Komplexitäten einer Antigen-Aufnahme und -Verarbeitung umgeht.
BALB/c-Mäuse (5 pro Gruppe) wurden intramuskulär (IM) in beiden Hinterbeinen mit 100 μg von Folgendem injiziert: (1) PEE-IA^d/OVA, das die kodierenden Regionen von Ova 323–339/I-A^d unter der Kontrolle des CMV-Promotors trägt, (b) pCMV/B7-1 oder pCMV/B7-2, der die kodierenden Regionen des B7-1- oder B7-2-Gens unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält, (c) PEE-IA^d/OVA und entweder pCMV/B7-1 oder pCMV/B7-2, (d) PEE-IA^d/HEL, der die kodierende Region HEL 74–86/I-A^d unter der Kontrolle des CMV-Promotors trägt, (e) PEE-IA^d/HEL und entweder pCMV/B7-1 oder pCMV/B7-2 oder (f) PEE-IA^d, der die kodierende Region von I-A^d unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält. Injektionen werden nach 0, 3 und 6 Wochen gegeben.
Nach 0, 2, 5 und 8 Wochen post-initialer Injektion wird Blut von jeder Maus durch Schwanzblutung, wie in Beispiel 6 beschrieben, gesammelt. Das Blut wird bei etwa 14000 g für 3–5 Minuten zentrifugiert und das Serum gesammelt.
Assays werden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Maxisorp F8; Nunc, Inc.) durchgeführt, die mit 1–50 μg/ml mit OVA-KLH und HEL-KLH unter Verwendung eines Tris-HCl-Beschichtungspuffers, pH 8,5, beschichtet. Die Platten werden mit einem drucksensitiven Film bedeckt (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA) und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten werden dann mit Waschlösung gewaschen (Imidazol/NaCl/0,4% Tween-20) und durch Zusatz von 100 μl/Vertiefung einer 3%igen BSA-Lösung blockiert. Nach Inkubation auf einem Platten-Rotationsgerät bei Raumtemperatur für 30 Minuten wurden die Platten fünfmal mit Waschlösung gewaschen. Maus-Serum wird 1 : 500 in Proben-/Konjugat-Verdünnungsmittel (2% Gelatine + 0,1% Tween-20 in TBS) verdünnt und dann zweifach seriell auf der Platte verdünnt. Proben der Maus-Seren werden sowohl auf OVA-KLH- als auch HEL-KLH-beschichtete Platten laufen gelassen, um diese auf Kreuzreaktivität zu testen. Nach Inkubation auf einem Platten-Rotationsgerät bei Raumtemperatur für 30 Minuten werden die Platten fünfmal mit Waschlösung gewaschen und dann werden 100 μl der Ziegen-anti-Maus-IgG-HRP-Konjugate (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, 1 : 100-Verdünnung in Proben-/Konjugat-Verdünnungsmittel) zu den passenden Platten zugeführt. Nach Inkubation auf einem Platten-Rotationsgerät bei Raumtemperatur für 30 Minuten werden die Platten fünfmal mit Waschlösung gewaschen und dann mit 100 μg/Vertiefung eines ABTS-Entwicklungssubstrats (Kirkgaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) für 10 Minuten auf einem Platten-Rotationsgerät bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionen werden mit 100 μl/Vertiefung Quench-Puffer gestoppt (Kirkgaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) und der Absorptionswert wird unter Verwendung eines automatisierten Mikrotiterplatten-ELISA-Lesegeräts (Ceres UV900HI, Bioteck, Winooski, Vermont) bei 405 nm gelesen. Der Titer kann bestimmt werden, indem die abgelesene Absorption gegenüber dem Log der Verdünnungen der Proben aufgetragen wird und die Verdünnung beim Mittelpunkt bestimmt wird (50% der Absorption).
Beispiel 10 – Detektion von Peptid-spezifischen T-Zellen nach Induktion einer Immunantwort mit Peptid-gebundenen MHC-Expressionsvektoren
Zur Bestimmung, ob eine intramuskuläre Injektion von DNA Mäuse erfolgreich immunisiert hat, um eine T-Helfer-Zell-Antwort gegenüber Ovalbumin aufzubauen, kann ein Ovalbumin-spezifischer T-Zell-Proliferations-Assay eingesetzt werden. Mäuse werden entsprechend dem in Beispiel 9 beschriebenen Protokoll immunisiert und T-Zellen werden aus den Inguinal- und Paraaorta-Lymphknoten 7 Tage nach der zweiten Immunisierung präpariert.
Die Suspension wird von Antigen-präsentierenden Zellen durch Inkubation auf Nylonwolle und Sephadex G-10-Säulen depletiert und die entstehenden aufgereinigten T-Zell-Populationen werden mit APCs inkubiert, die entweder mit dem OVA 323–339-Peptid oder dem HEL 74–86-Peptid gepulst worden sind. Aktivierte B-Zellen aus BALB/c-Mäusen werden als Antigen-präsentierende Zellen in dem Proliferations-Assay verwendet. B-Zellen werden durch Kultivierung von Milzzellen mit 50 μg/ml LPS für 48 bis 72 Stunden hergestellt, wobei nach dieser Zeit aktivierte Zellen durch Dichtegradienten-Zentrifugation mit Lymphoprep isoliert werden. Aktivierte B-Zellen werden dann entweder mit dem Ova 323–339-Peptid oder dem HEL 74–86-Peptid für 3 Stunden gepulst, intensiv gewaschen, mit Paraformaldehyd fixiert, um die Proliferation von B-Zellen zu inhibieren, und zu den gereinigten T-Zellen hinzugefügt.
Der Proliferations-Assay wird in Rundboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei 37°C, 5% CO₂, für 3–5 Tage durchgeführt. Vertiefungen werden mit 1 μCi ³H-Thymidin für 18 Stunden vor Kultivierungsende gepulst und unter Verwendung eines Skatron-Zellerntegeräts geerntet. Der Einbau von ³H-Thymidin in DNA als Maß der T-Zell-Proliferation wird unter Verwendung eines LKB-Flüssig-Szintillationsspektrometers bestimmt. Der Grad der Peptid-reaktiven T-Zell-Proliferation weist auf die T-Zell-Antworten (d. h. klonale Expansion) hin, die in den Mäusen nach der Immunisierung stattgefunden haben.
Beispiel 11 – Suppression einer Autoimmunerkrankung in Mäusen, die mit TcR-antagonistischen Peptid-gebundenen MHC-Expressionsvektoren injiziert wurden
Die Beispiele 3 und 9–10 oben zeigen die Verfahrensweisen, die zur Stimulation von Immunantworten über MHC-Fusionskomplexe verwendet wurden. Wie oben diskutiert, können ähnliche Verfahren eingesetzt werden, um Immunantworten durch Verwendung von TcR-antagonistischen Peptiden, die an die MHC-Moleküle gebunden sind, zu inhibieren, d. h. das präsentierende Peptid, das kovalent an das MHC-Peptid gebunden ist, ist ein TcR-Antagonist oder Teil-Agonist. Wie in Beispiel 1 beschrieben, ist das PLP-Peptid 139–151 zur Induktion von EAE in SJL-Mäusen fähig. Analoga dieses Peptids wurden auf TcR-antagonistische Aktivität auf einem Feld von I-A^s-beschränkten, PLP 139–151-spezifischen T-Zell- Klonen charakterisiert. Zwei verschiedene Analoga, PLP-W144Y (HSLGKYLGHPDKF) (SEQ ID NO: 22) und PLP-W144L (HSLGKLLGHPDKF) (SEQ ID NO: 23), wurden als besonders nützlich für die Inhibition der in vitro-T-Zell-Proliferation in den meisten getesteten T-Zell-Klonen gefunden [A. Franco et al., Eur. J. Immunol. 24: 940–946 (1994)]. Als ein Modellsystem können Vektoren, die zur Co-Expression der PLP-Peptid-Analogon-gebundenen I-A^s-β-Ketten- oder der I-A^s-α-Ketten-Moleküle mit voller Länge fähig sind, konstruiert werden. Die Vektorkonstruktion ist im Wesentlichen ähnlich der in dem Beispiel 3 oben beschriebenen. Das native PLP 139–151-gebundene MHC-Konstrukt dient als eine Positiv(antigenische)-Kontrolle. Diese Vektor-DNAs (mit und ohne den B7- oder B7-2-Expressionsvektoren) werden in geeigneter Weise IM in SJL-Mäusen vor und während der Induktion von EAE injiziert (siehe Beispiel 9 für die Injektionsverfahren). EAE kann durch den adoptiven Transfer von PLP 139–151-reaktiven T_H-Zellen durch die in Beispiel 8 oben beschriebenen Verfahren induziert werden. Klinische und histologische Bewertungen werden durchgeführt, um zu bestätigen, dass die PLP-Antagonisten/I-A^s-Expresionsvektor-Injektion durch die Entwicklung von EAE in den Mäusen inhibiert war.
Beispiel 12 – Konstruktion von Peptid mit voller Länge-gebundenen I-A^d-MHC-Expressionsvektoren
Vektoren, die zur Co-Expression der I-A^d-α-Ketten- mit voller Länge und Peptid-gebundenen I-A^d-β-Ketten-Molekülen fähig sind, wurden, wie in 19 der Zeichnungen beschrieben, und durch dieselben oder ähnliche Verfahren, wie in dem Beispiel 3 oben offenbart, hergestellt. Bei den I-A^d-Genen wurde Gesamt-RNA aus der B-Zell-Lymphom-A20-Zelllinie der Maus isoliert. Kurz gesagt wurden 1 × 10⁸ A20-Zellen (American Type Collection Culture Zugangs-Nr. TIB 208) in 6 ml eiskaltem 4 M Guanidiniumthiocyanat, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, unter Verwendung eines Gewebeaufbruch-Homogenisierers für 5 Minuten homogenisiert. Nach der Homogenisierung wurde Natriumsarcosyl mit einer Endkonzentration von 0,5% zugeführt und die Lösung wurde stark gemischt. Das Homogenat wurde bei 5000 g für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde auf 10 ml mit 4 M Guanidiniumcyanat, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,5% Natriumsarcosyl-Puffer, aufgefüllt. Der Überstand wurde vorsichtig auf die Oberseite eines 3,5-ml-Kissens aus 5,7 M CsCl, 0,01 M EDTA, pH 7,5, in einem durchsichtigen SW41-Ultrazentrifugationsröhrchen beschichtet. Die Proben wurden in einem SW41-Rotor bei 32000 Upm für 24 Stunden bei 20°C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand vorsichtig entfernt und das RNA-Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen. Die RNA wurde in 350 μl 3 M Natriumacetat und 970 μl Ethanol gelöst. Dieses Verfahren ergab etwa 370 μg Gesamt-RNA. Die RNA wurde auf 5 μg/ml mit DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert und für eine RT-PCR-Klonierung der I-A^d-Gene verwendet.
Um die I-A^d-α-Kette mit voller Länge zu isolieren, wurde A20-Gesamt-RNA (5 μg) zu cDNA unter Verwendung von M-MLV-Reverse Transkriptase (GIBCO-BRL) und einer α-Ketten-TM-spezifischen Primer-Anlagerung (Oligonukleotid OPR139) entsprechend den empfohlenen Verfahren des Herstellers umgewandelt. Diese cDNA wurde als Matrize für die PCR-Amplifikation unter Verwendung eines α-Ketten-Leitsequenz-spezifischen Primers (OPR136) und einem α-Ketten-TM-spezifischen Primer (OPR139) verwendet. Siehe 20 der Zeichnungen, wo die Sequenzen der OPR136- und OPR139-Primer offenbart sind. Typische PCR-Amplifikationsreaktionen (100 μl) enthielten Matrizen-DNA, 10 pmol der passenden Primer, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase, 100 μM dNTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine. Die Matrize wurde durch eine anfängliche Inkubation bei 96°C für 5 Minuten denaturiert, während die Taq-Polymerase für einen Heißstart der Reaktion zugesetzt wurde. Die gewünschten Produkte wurden durch 10 Thermozyklen bei 58°C für 30 Sekunden, 72°C für 1 Minute, dann 96°C für 1 Minute, gefolgt von 20 Schrittzyklen bei 70°C für 1,5 Minuten, dann 96°C für 1 Minute, amplifiziert. Das entstehende PCR-Produkt (800 bp) enthält eine 5'-XmaI-Stelle und eine 3'-EcoRI-Stelle zur Klonierung. Zusätzlich trägt dieses Fragment eine Kozak-Konsensus-Sequenz für eine effiziente translationale Initiation (siehe 18A der Zeichnungen, wo die Sequenz des PCR-Produkts offenbart ist). Das PCR-Produkt wurde mit XmaI und EcoRI verdaut, Gel-gereinigt und in XmaI/EcoRI-verdautem pUC18 ligiert, um den Vektor pJRS163-10 zu erhalten. Nach der Überprüfung der Sequenz wurde das XmaI/EcoRI-Fragment ausgeschnitten, gereinigt und zwischen dem CMV-Promotor und den SV40-poly-A-Stellen des PEE13-Säugetier-Expressionsvektors (Celltech) subkloniert, was den pJRS164-Vektor ergab.
Das Peptid mit voller Länge-gebundene β-Ketten-Fragment wurde hergestellt, indem die Leit- und TM-Sequenzen in dem OVA 323–339-Peptid (SISQAVHAAHAEINEAGR) (SEQ ID NO: 24)-gebundenen β1-β2-Vektor (pB16) wie in Beispiel 1 oben beschrieben eingeführt wurden. A20-Gesamt-RNA (5 μg) wurde zu cDNA unter Verwendung von Superscript-MLV- oder M-MLV-Reverse Transkriptase (GIBCO-BRL) und entweder einer Oligo-dT-spezifischen oder β-Ketten-TM-spezifischen Primer-Anlagerung (mit OPR135, die Sequenz davon ist in 20 gezeigt) entsprechend den empfohlenen Verfahren des Herstellers umgewandelt. Diese cDNAs wurden als Matrize für die PCR-Amplifikationen unter Verwendung von entweder einem Paar β-Ketten-Leitsequenz-spezifischen Primern (OPR132/OPR133; die Sequenzen dieser Primer sind in 20 der Zeichnungen offenbart) und einem Paar β-Ketten-TM-spezifischen Primern (OPR134/OPR135; die Sequenzen dieser Primer sind in 20 der Zeichnungen offenbart) verwendet. Die PCR-Amplifikationsbedingungen waren ähnlich den oben beschriebenen in diesem Beispiel. Spezifischer gesagt bestanden die Thermozyklusbedingungen zur Amplifikation der Leitsequenz aus 10 Thermozyklen bei 60°C für 1 Minute, 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 30 Schrittzyklen bei 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute, wobei die Bedingungen zur Amplifikation der TM-Domäne aus 5 Thermozyklen bei 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 25 Schrittzyklen bei 70°C für 1 Minute und 96°C für 1 Minute bestanden. Das 110 bp große β-Leitsequenz-PCR-Produkt enthält 5'-HindIII- und XmaI-Stellen und eine 3'-AflII-Stelle zur Klonierung in den pB16-OVA-Peptid-Linker-β1-β2-Vektor. Der Einschluss der AflII-Stelle verändert die letzten zwei Aminosäuren der I-A^d-β-Ketten-Leitsequenz zu solchen, wie sie in der IgG-Leitsequenz anzutreffen sind (siehe 18B der Zeichnungen). Das β-Leitsequenz-PCR-Produkt wurde mit HindIII und XmaI verdaut, Gel-gereinigt und in HindIII/AflII-verdautem pB16 ligiert, um pDM21 zu ergeben. Das 180 bp große β-TM-PCR-Produkt enthält eine 5'-BstXI-Stelle und 3'-XmaIII- und EcoRI-Stellen zur Klonierung in den pDM21-Vektor. Das β-TM-PCR-Produkt wurde mit BstXI und EcoRI verdaut, Gel-gereinigt und in BstXI/EcoRI-verdautem pDM21 ligiert, um den pVW229-Vektor zu ergeben. Dieser Vektor wurde mit XmaI und EcoRI verdaut, um die Peptid-gebundenen α-Ketten-Genfragmente mit voller Länge zur Klonierung zwischen dem CMV-Promotor und den SV40-poly-A-Stellen des PEE6-Säugetier-Expressionsvektors (Celltech) zu erzeugen. Diese Fragmente tragen auch die Kozak-Konsensus-Sequenz (CCACCATG) (SEQ ID NO: 2) für eine effiziente translationale Initiation (siehe 18A der Zeichnungen). Der entstehende pVW231 wurde mit BglII und BamHI verdaut. Der CMV-Promotor/Peptid-β-Ketten-Fragmente wurde Gel-gereinigt und in BamHI-verdautem pJRS164 ligiert, um den endgültigen pJRS165.1-Expressionsvektor zu erzeugen, der die I-A^d- und OVA-gebundenen β-Ketten-Gene mit voller Länge enthielt.
Zusätzliche Plasmide, die das I-A^d-α-Ketten-Gen mit voller Länge und entweder das β-Ketten-Gen ohne ein gebundenes Peptid oder mit dem HEL 74–86-Peptid (NLCNIPSCALLSS) (SEQ ID NO: 25) enthielten, wurden wie in dem Schema der 19 der Zeichnungen hergestellt und dienten als Kontrollen bei den Induktionsstudien. Die AflII/BstXI-Fragmente von pBC1 und pB4 (wie in Beispiel 1 oben offenbart) enthielten die Linker-β1-β2-Region bzw. die HEL-Peptid-Linker-β1-β2-Region wurde ausgeschnitten, Gel-gereinigt und in AflII/BstXI-verdautem pVW229 ligiert. Die entstehenden Vektoren pFB12 und pFBH3 besitzen XmaI/EcoRI-Fragmente und enthalten das β-Ketten-Gen mit voller Länge, das entweder an kein Plasmid oder an das HEL-Peptid gebunden ist. Diese Fragmente wurden ausgeschnitten, Gel-gereinigt und zwischen dem CMV-Promotor und den SV-poly-A-Stellen von XmaI/EcoRI-verdautem PEE6 ligiert, was die pB1 und pBH4 ergab. Diese Vektoren wurden mit BglII und BamHI verdaut und die CMV-Promotor/β-Ketten-Fragmente wurden Gel-gereinigt und in den BamHI-verdauten pJRS164 ligiert, um pAB5, den Expressionsvektor, der die I-A^d-α- und β-Ketten-Gene mit voller Länge ohne ein gebundenes Peptid enthält, und pABH1, den Expressionsvektor, der I-A^d-α mit voller Länge und HEL-gebundene β-Ketten-Gene enthält, zu erzeugen. Beispiele der zuvor genannten Plasmide pJRS165.1, pAB5 und pABH1 (Hinterlegungs-Nr. 97301, 97032 bzw. 97033) wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt.
Das murine B7-1-Gen wurde aus einer Plasmid-MB7-PCR2-Matrize, die das B7-Gen (zur Verfügung gestellt von E. Podack, Univ. of Miami) enthält, amplifiziert. Diese Reaktionen wurden mit Ultima-Polymerase (Perkin-Elmer) entsprechend den empfohlenen Verfahren des Herstellers unter Verwendung der B7-spezifischen Primer B7-1-2F und B7-1-2B (die Sequenzen dieser Primer sind in 20 der Zeichnungen offenbart) durchgeführt. Die Thermozyklusbedingungen bestanden aus 20 Thermozyklen bei 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 1,5 Minuten und 96°C für 1 Minute, gefolgt von 10 Schrittzyklen bei 72°C für 1,5 Minuten und 96°C für 1 Minute. Das erzeugte PCR-Produkt trägt 5'- und 3'-NotI-Stäme zur Klonierung. Dieses Fragment trägt auch die Kozak-Konsensus-Sequenz (CCACCATG) (SEQ ID NO: 2) für eine effiziente translationale Initiation. Das Produkt wurde mit NotI verdaut, Gel-gereinigt und zwischen dem CMV-Promotor und den SV-poly-A-Stellen des NotI-verdauten pCMVβ-Säugetier-Expressionsvektors ligiert (Clonetech). Der entstehende Vekor wurde als pUB719 bezeichnet.
Beispiel 13 – Entwicklung einer Zelllinie, die einen funktionellen Fusionskomplex auf de Zelloberfläche exprimiert
Wie weiter unten im Detail beschrieben, wurde ein muriner B-Zell-Tumor (NSO; H-2^d-Hintergrund) mit dem pJRS165.1-Konstrukt transfiziert (murine I-A^d/OVA 323–339, in Beispiel 12 oben beschrieben) und es wurde durch Durchflusszytometrie-Analyse der Zelloberfläche gezeigt, dass er den MHC-Teil des Fusionskomplexes exprimiert. Zusätzlich wurde gezeigt, dass der Fusionskomplex, der auf diesen Zellen exprimiert wurde, zur Modulation der Aktivität des passenden T-Zell-Rezeptors (TcR) durch Induktion der IL-2-Produktion in dem I-A^d-beschränkten, OVA-Peptid 323–339-spezifischen T-Zell-Hybridom DO11.10 fähig ist. Die Ergebnisse zeigen unter anderm, dass (1) das kovalent gebundene Fusionspeptid in die Bindungsspalte des MHC unter Beibehaltung der Konformation des MHC beladen werden kann, (2) die Peptid/MHC-Fusion die funktionelle Integrität des MHC-Moleküls beibehält (d. h. es ist in der Lage, den TcR zu binden und die Peptid-spezifischen T-Zellen zu aktivieren) und (3) die gewöhnlichen physiologischen Mechanismen für eine Peptidbeladung von MHC-Molekülen und eine anschließende Antigen-Präsentation durch die vorliegende Erfindung umgangen werden können.
A. Erzeugung von transfizierten Lymphozyten
Die murine NSO-B-Zell-Tumorlinie wurde entsprechend der Anleitung von Celltech, Glutamine Synthetase Gene Amplification System, mit geringfügigen Abweichungen transfiziert. Dieses Verfahren setzt Elektroporation ein, um Säugetierzellen mit einem Vektor (PEE-13), der die kodierende Region der Glutamin-Synthetase enthält, zu transfizieren. Transfizierte Zellen haben die Fähigkeit, Glutamin zu synthetisieren, so dass sie ohne exogene Zufuhr überleben. Eine Selektion von transformierten Klonen wurde durchgeführt, indem die Zellen isoliert wurden, die in Glutamin-freiem Medium wachsen. Kurz gesagt wurden 1 × 10⁷ NSO-Zellen zweimal in eiskaltem PBS gewaschen und in 760 μl kaltem PBS resuspendiert. 40 μg (40 μl bei 1 μg/ml) SalI-verdautem pJRS165.1 (siehe Beispiel 12 oben) Plasmid-DNA wurde zu den Zellen in einer Elektroporationskuvette (0,4 cm) zugegeben. Das Zell/DNA-Gemisch wurde auf Eis für 5 Minuten platziert und die Zellen wurden dann unter Verwendung eines Gene Pulser (Biorad) elektroporiert, der einen Puls von 250 Volt, 960 μFd, abgibt. Die gepulsten Zellen wurden für 2–5 Minuten auf Eis platziert, aus der Kuvette entfernt und zu 30 ml nicht-selektivem Medium zugegeben (IMDM, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin). Die Zellen wurden in flachbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zu 50 μl/Vertiefung ausplattiert (4 Platten, Zellsuspension in 30 ml Medium wie oben; 5 Platten, Zellsuspension 1 : 4 verdünnt; 5 Platten, Zellsuspension 1 : 20 verdünnt) und dann mit 5% CO₂ bei 37°C inkubiert. Für die Negativkontrolle wurde dieselbe Prozedur der Elektroporation und Ausplattierung durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die DNA weggelassen wurde. Am nächsten Tag wurden 150 μl des selektiven Mediums [IMDM, 10% dialysiertes FBS, Penicillin/Streptomycin, Nukleoside (6 μg/ml A, G, C und U; 2 μg/ml T), 60 μg/ml Glutamat und Asparagin] zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden mit selektivem Medium wöchentlich gefüllt, indem 100 μl/Vertiefung des verwendeten Mediums entfernt wurden und 100 μl/Vertiefung des frischen Mediums zugesetzt wurden, was es den Zellen ermöglichte, das Medium von sämtlichem restlichem Glutamin allmählich zu depletieren. Nur solche Zellen, die transformiert worden sind, werden überleben; Kolonien werden in 14–21 Tagen nachweisbar. Die Kolonien oder Klone wurden expandiert und auf die Expression eines Oberflächen-MHC-Klasse-II-Fusionskomplexes mit korrekter Konformation, wie unten beschrieben, durchmustert.
B. Konformation des MHC/Peptid-Fusionskonstrukts
Klone, die durch die oben genannte Transfektion erzeugt wurden, wurden auf Expression des Klasse-II-MHC-Fusionskomplexes bei Spiegeln analysiert, die signifikant höher waren als die der Elternzelle NSO. NSO/IA^d/OVA-Klone (1 × 10⁵) oder Kontrollzellen, NSO oder A20.1-11 [K. Kim et al., J. Immunol. 122: 549 (1979)], wurden mit FITC-konjugiertem anti-IA^d-Antikörper (Pharmingen, 1 : 100-Verdünnung) in Färbepuffer (PBS/1% FBS) für 45 Minuten bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Nach einem dreimaligen Waschen in Färbepuffer wurde die Fluoreszenz mit einem Beckton Dickinson FACScan-Durchflusszytometer untersucht. Ein isotypischer nicht-relevanter Antikörper (FITC-konjugierter anti-IA^k, Pharmingen 1 : 100) wurde als Negativkontrolle verwendet. Die IA^d-Fluoreszenzintensität wurde mit der IA^k-Expression verglichen, um die spezifische Fluoreszenz zu bestimmen (siehe die in der Tabelle unten beschriebenen Ergebnisse). In dieser Tabelle sind die Daten als grüne Fluoreszenz des Peak-Kanals gezeigt, was ein Maß für die Fluoreszenzintensität ist und somit ein Maß für die Dichte der auf der Zelloberfläche exprimierten IA^d-Moleküle. Die Zelllinie der Negativkontrolle (NSO) hat einen Peak bei Kanal 67 und die Positivkontrolle (A20.1-11) bei Kanal 1322. Die Klone, die eine höhere Peak-Fluoreszenz als die von Kanal 100 aufwie sen, wurden für die weitere Analyse der Funktionalität des Fusionsproteins ausgewählt. Die in Tabelle 1 aufgelisteten Klone wurden als Masse wachsen gelassen, gefroren und für die zukünftige Verwendung gelagert. Da der Antikörper das MHC-Molekül mit der Konformation erkennt, bedeutet die Fähigkeit, den MHC-Fusionskomplex auf der Zelloberfläche mit einem Antikörper nachzuweisen, dass die Konformation der MHC-Klasse-II in dem rekombinanten Fusionskomplex erhalten geblieben ist.
TABELLE 1 IA^d-Expression auf NSO/IA^d/OVA-Klonen (in Fluoreszenz des Peak-Kanals)
C. Demonstration der funktionellen Aktivität des MHC-Fusionskomplexes
Um die biologisch relevante Aktivität dieser rekombinanten Proteinmoleküle zu verifizieren, wurde die Fähigkeit der Moleküle, mit dem passenden T-Zell-Rezeptor in vitro auf eine Antigen-spezifische Weise zu interagieren und die Aktivierung der T-Zelle zu verursachen, bewertet.
Ein murines T-Zell-Hybridom, DO11.10 [Shimonkevitz, R. et al. (1983) J. Exp. Med. 158: 303], wurde verwendet, das auf dessen Oberfläche einen T-Zell-Rezeptor exprimiert, der für ein 21 Aminosäure-Peptid-Fragment (A2A 323–339), das sich von dem Hühnchenei-Ovalbumin (OVA) ableitet, spezifisch ist. Dieses Peptid kann dem DO11.10 nur durch Antigen-präsentierende Zellen (APC), die das murine Klasse-II-MHC-Molekül I-A^d exprimieren, präsentiert werden. Wenn das Peptid durch die passende APC präsentiert wird, werden DO11.10-Zellen darauf durch die Erzeugung von IL-2 reagieren, was dann als Maß der T-Zell-Aktivierung analysiert werden kann. Die Zelllinie, die als eine Positivkontrolle diente, war A20.1-11, die I-A^d auf dessen Oberfläche exprimiert. Kurz gesagt wurden A20.1-11-Zellen (1 × 10⁵/Vertiefung) zusammen mit dem Peptid (1 μg/Vertiefung) und den DO11.10-Zellen (2 × 10⁵/Vertiefung) für 24 Stunden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ inkubiert. NSO-Zellen (als Negativkontrolle) und NSO/IA^d/OVA-Klone (1 × 10⁵) wurden mit DO11.10-Zellen in der Abwesenheit des Peptids inkubiert. Kulturen wurden in vollständigem Kulturmedium (RPMI 1640, 10% FBS, Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol) in flachbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Nach 24 Stunden wurden die Kulturüberstände auf das Vorliegen von DO11.10-abgeleitetem IL-2 unter Verwendung der IL-2-abhängigen murinen T-Zelllinie CTLL-2, wie unten beschrieben, untersucht.
Kurz gesagt wurden zweifache Serienverdünnungen von jedem Kulturüberstand in vollständigem Medium in flachbödigen Mikrotiterplatten hergestellt und 1 × 10⁴ CTLL-2-Zellen wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach 16–20 Stunden wurden die Vertiefungen der Negativkontrolle (CTLL-2 kultiviert mit Medium alleine) und die Vertiefungen der Positivkontrolle (CTLL-2-Zellen kultiviert mit rIL-2) mikroskopisch untersucht und bei dem Punkt, an dem die Negativkontroll-Zellen zu etwa 90% abgestorben waren, während die Positivkontroll-Zellen noch aktiv proliferierten, wurde MTT (2 mg/ml in PBS; 25 μl/Vertiefung) zugegeben und die Platten wurden für weitere 4 Stunden zurück in den Inkubator gestellt. Zu diesem Zeitpunkt wurden blaue Kristalle von Formazan, die sich in aktiv metabolisierenden Zellen gebildet haben, durch den Zusatz von 150 μl 0,4 N HCl in Isopropanol pro Vertiefung gelöst. Nach vorsichtigem Mischen wurde die O. D. bei 562 nm unter Verwendung eines Ceres UV900HI-Platten-Lesegeräts bestimmt. Die Daten, die die funktionelle Aktivität der oben diskutierten vier Klone zusammen mit den geeigneten Negativ(NSO)-Kontrollen zeigen, sind in 21 der Zeichnungen gezeigt und stellen ein Diagramm dar, das den O. D.-Wert der ersten vier Verdünnungen des DO11.10-Kulturüberstands als ein Maß der T-Zell-Aktivierung zeigt.
Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass der MHC-Peptid-Komplex, der auf diesen transfizierten Zellen exprimiert wird, insofern biologisch funktionell ist, als er den TcR auf DO11.10 beansprucht und die Herstellung von IL-2 auslöst. Diese Ergebnisse zeigen, dass manipulierte Zellen, die spezifische MHC/Peptidkonstrukte in der Abwesenheit von co-stimulatorischen Signalen exprimieren, von klinischer Wichtigkeit für solche Krankheitszustände sein können, in denen eine unangemessene Immunantwort gegenüber einem Peptid pathologische Konsequenzen für den Wirt bewirkt, beispielsweise wie bei einer Allergie oder bei bestimmten Autoimmunerkrankungen. Diese Technik hat auch das Potential, über eine weitere Manipulation der veränderten Zellen als ein Vektor zur Abgabe eines positiven Signals zur Immunisierung zu dienen.
Beispiel 14 – Assay zur Immuninduktion oder -suppression durch Zellen, die den MHC-Fusionskomplex exprimieren
Der folgende Assay kann eingesetzt werden, um die Fähigkeit von erfindungsgemäßen Zelllinien des MHC-Fusionskomplexes (d. h. Zellen, in denen DNA, die für einen MHC-Fusionskomplex kodiert, eingeführt worden ist) zur Induktion oder Suppression einer Immunantwort in einem Wirt, an den die Zellen verabreicht worden sind, zu bewerten.
Die folgende beispielhafte Darstellung des Assays verwendet ein Tiermodell zur Immunisierung mit dem Ovalbumin-Peptid 323–339 und eine Manipulation der Antwort auf das Peptid unter Verwendung von Zellen, die den veränderten Fusionskomplex exprimieren, wie in Beispiel 13 oben beschrieben. Die Verfahrensweise dieses Beispiels kann für eine Vielzahl von MHC-Fusionskomplexen angewendet werden, die ein präsentierendes Peptid enthalten, das eine Immunantwort in Säugetieren modulieren (d. h. supprimieren oder induzieren) kann und das an ein MHC-Molekül gebunden werden kann, beispielsweise über einen oben beschriebenen flexiblen Linker.
Die Zellen, die in diesem Assay eingesetzt werden können (NSO/IA^d/OVA.B2, NSO/IA^d/OVA.B4, NSO/IA^d/OVA.B5 und NSO/IA^d/OVA.A4) werden mit DNA des MHC/OVA 323–339-Fusionskomplexes, pJRS165.1 (siehe Beispiele 12 und 13 oben) transfiziert. Diese Zellen exprimieren nur geringe Spiegel von co-stimulatorischen Molekülen (d. h. eine nicht-wirksame Menge der T-Zell-Proliferation) und sind daher nicht fähig, das anfängliche Priming-Ereignis zur Induktion der Immunität gegenüber dem Peptid einzuleiten (es ist auf dem Gebiet bekannt, dass B-Zellen zur Aktivierung von Gedächtnis-T-Zellen fähig sind, jedoch sind sie im Gegensatz zu "professionellen APC" nicht in der Lage, das zur Induktion der Immunität erforderliche Signal abzugeben). Die Injektion dieser Zellen in einen histokompatiblen Wirt kann zu einer Interaktion mit T-Zellen in der Abwesenheit von co-stimulatorischen Molekülen führen und dadurch zur Induktion einer Antigen-spezifischen Unempfänglichkeit oder T-Zell-Toleranz.
Der Assay kann insbesondere wie folgt durchgeführt werden. BALB/c(IA^d)-Mäuse (3–4 pro Gruppe) werden i. v. in den Schwanz oder s. c. am Ende des Schwanzes mit den in Tabelle 2 unten aufgeführten Zellen oder Reagenzien injiziert. Die Zellen werden in PBS gewaschen, zu 1 × 10⁸/ml in PBS resuspendiert und in die Schwanzvene injiziert (0,1 ml; 1 × 10⁷ Zellen/Maus). Das Ovalbumin-Peptid (2 mg/ml in PBS) wird mit vollständigem Freund's Adjuvans, das Mycobacterium tuberculosis H37Ra enthält, in einem 1 : 1 v/v-Verhältnis vermischt. 50 μl werden s. c. in jeder Seite am Ende des Schwanzes injiziert. 7 Tage nach der letzten Injektion werden die Lymphknoten (Inguinal-, paraaortische, Hals-, Achsel-, Oberarmlymphknoten) entfernt und homogenisiert, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Lymphknoten aus einzelnen Mäusen aus einer Gruppe wurden getrennt verarbeitet. Die T-Zellen wurden aus den Lymphknoten-Populationen durch Passagierung der Zellsuspensionen über G-10 und Nylonwolle aufgereinigt, um anhaftende Zellen zu entfernen. Antigen-präsentierende Zellen werden aus der Milz von natürlichen BALB/c-Mäusen durch Homogenisierung der Milz hergestellt, um eine Einzelzell-Suspension durch Lyse der Erythrozyten unter Verwendung von Gey's Lösung, Behandlung mit Mitomycin C (100 μg/ml in RPMI 1640/1% FBS für 1 Stunde bei 37°C) zu erhalten, um die APC-Proliferation zu inhibieren, und durch drei Waschschritte, um restliches Mitomycin C zu entfernen. Assays zur Induktion einer T-Zell-Antwort werden in rundbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. 2–4 × 10⁵ T-Zellen werden mit 2–4 × 10⁵ APC vermischt. Jede T-Zell-APC-Kombination wird dreifach mit und ohne OVA-Peptid (im Bereich von 10–200 ng/Vertiefung) für 3–5 Tage inkubiert. Etwa 18 Stunden vor Kultivierungsende werden 0,4 μCi ³H-Thymidin zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Vertiefungen werden unter Verwendung eines Skatron-Zellerntegeräts geerntet und der Einbau von ³H-Thymidin (ein Maß der DNA-Synthese und daher der T-Zell-Proliferation) wird unter Verwendung eines LKB-Flüssig-Szintillationsspektrometers bestimmt.
Eine positive Antwort liegt vor, wenn die Vertiefungen, die das Peptid enthalten, signifikant mehr DNA umfassen als die Vertiefungen ohne Peptid. Typischerweise sind solche Mäuse positiv, wenn die Proliferation (durchschnittliche cpm) als Antwort auf das Peptid um mehr als 3 Standardabweichungen größer ist als die Hintergrund-Proliferation ohne Peptid. Für jede Gruppe wird die durchschnittliche Peptid-spezifische Proliferation berechnet, indem die durchschnittlichen Werte der experimentellen Gruppe mehr als etwa 3 Standardabweichungen weniger als der Durchschnitt der positiven Kontrollgruppe beträgt.
Bezüglich Tabelle 2 unten dienen die Gruppen 1 (nicht-injiziert) und 4 (Injektion von NSO alleine) als Negativkontrollen und sollten nicht aufgrund einer in vitro- Veränderung mit dem Peptid reagieren. Gruppe 2 erhält zwei Injektionen des Peptids, das klassische Immunisierungsprotokoll, und sollte optimal auf die in vitro-Peptid-Präsentation reagieren. Gruppe 3 erhält eine Injektion des Peptids und es kann erwartet, dass es suboptimal in vitro reagiert. Gruppe 5 erhält NSO-Zellen als erstes und danach eine Woche später das Peptid. Die Injektion von NSO-Zellen sollte nicht mit dem Priming durch das Peptid interferieren, daher sollten die Ergebnisse aus dieser Gruppe zu denen von Gruppe 3 ähnlich sein und als Negativkontrolle zur Induktion von Toleranz dienen (Gruppe 7). Gruppe 6 erhielt die Zellen, die den Fusionskomplex exprimieren. Aufgrund der Expression von co-stimulatorischen Molekülen, die für die Stimulation von natürlichen T-Zellen notwendig sind, dient diese Gruppe als eine Negativkontrolle für Gruppe 7. Keine Antwort aus dieser Gruppe könnte potenziell die Bedeutung haben von entweder "keine Reaktion" oder "spezifische Unempfindlichkeit". Gruppe 7, die eine Anfangsinjektion von NSO/IA^d/OVA-Zellen und danach eine Injektion des Peptids erhält, wird zwischen diesen beiden Möglichkeiten differenzieren. Ein Fehlen der Antwort auf eine in vitro-Veränderung mit dem Peptid dieser Gruppe weist auf die Induktion einer spezifischen Unempfindlichkeit oder Toleranz hin.
TABELLE 2
Beispiel 15 – T-Zell-Aktivierung nach intramuskulärer (i. m.) Injektion von DNA, die für den MHC-Fusionskomplex alleine kodiert oder in Kombination mit DNA, die für co-stimulatorische Moleküle kodiert
Der Skelettmuskel kann eine Rolle als immunologische Mikroumgebung spielen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Fremd-Gene in Muskelzellen exprimiert werden können [J. Wolff et al., Science 247: 1465 (1990)] und dass eine Immunantwort gegen diese Antigene ausgelöst wird [J. Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993)]. Es wurde auch berichtet, dass eine Stimulation von kultivierten humanen Muskelzellen (Myoblasten) mit Interferon-γ (IFN-γ) zu der Expression von MHC-Klasse-II-Komplexen auf diesen Zellen führt [N. Goebels et al., J. Immunol. 149: 661–667 (1992)].
Muskelzellen der Maus wurden mit DNA, die für einen spezifischen murinen OVA 323–339/IA^d/MHCII-Fusionskomplex (pJRS165.1) und das co- stimulatorische Signal B7-1 (pUB719) kodiert, injiziert, um lokale Antigen-präsentierende Zellen (APCs), die den Fusionskomplex, der das Ovalbumin-Peptid 323–339 enthält, zu exprimieren. Diese APCs werden gegebenenfalls T-Zellen aktivieren. Wie unten ausgeführt, wurde DNA, die für einen MHC-Fusionskomplex und ein co-stimulatorisches Molekül kodiert, (i. m.) in BALB/c-Mäuse injiziert, um eine spezifische T-Zell-Proliferationsantwort auf das Peptid, das durch die DNA kodiert wird, auszulösen (veranschaulicht mit pJRS165.1 und pUB719).
Drei Gruppen von BALB/c-Mäusen (3 Mäuse pro Gruppe) wurden i. m. in Oberschenkelmuskel von beiden Hinterbeinen mit 50 μl sterilem PBS injiziert, das die Plasmide 1) pJRS165.1, das die kodierende Region des murinen OVA 323–339/IA^d-MHCII unter der Kontrolle des CMV-Promotors alleine, oder 2) pJRS165.1 und pUB719, welche die kodierende Region des murinen B7-Gens unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthalten, oder 3) pUB719 alleine enthalten. Die Mäuse wurden wie zuvor in einer Kammer, die mit Metafan^® (Pitman-Moor, Mundelein, IL) gesättigt war, gemäß dem in Beispiel 6 oben beschriebenen Verfahren narkotisiert.
Innerhalb jeder Gruppe wurden 3 Mäuse mit 100 μg DNA in 100 μl PBS in der Woche 0 injiziert und es wurde eine Boost-Injektion derselben DNA in der Woche 3 durchgeführt. 10 Tage nach der letzten Injektion wurden die Inguinal- und paraaortischen Lymphknoten gesammelt. Lymphknotenzellen wurden isoliert und einem OVA-spezifischen T-Zell-Proliferations-Assay wie folgt ausgesetzt. Die Zellen wurden dreimal in vollständigem Medium gewaschen (RPMI 1640, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin, Streptomycin und 5 × 10^–5 2-Mercaptoethanol) und bei 5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. 100 μl der Zellsuspension wurden zu den Vertiefungen einer rundbödigen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugesetzt. Verdünnungen des OVA(323–339)-Peptids wurden im Bereich von 0,8 μg/ml bis 10 μg/ml hergestellt und 100 μg/Vertiefung wurden zu den Zellen dreifach zugegeben. Die Hintergrund-Proliferation wurde bestimmt, indem das Peptid weggelassen wurde. Die Platten wurden mit 5% CO₂ bei 37°C für 3–5 Tage inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit 0,4 μCi ³H-Thymidin für 18 Stunden vor Kultivierungsende gepulst und unter Verwendung eines Skatron-Zellerntegeräts geerntet. Der Einbau von ³H-Thymidin in die DNA wurde als ein Maß der T-Zell-Proliferation unter Verwendung eines LKB-Flüssig-Szintillationsspektrometers bestimmt. Der Grad der Peptid-reaktiven T-Zell- Proliferation war ein Hinweis für die T-Zell-Antworten (d. h. klonale Expansion), die in den Mäusen nach Immunisierung stattgefunden haben.
Die Ergebnisse des Proliferations-Assays sind in 22 der Zeichnungen gezeigt. Genauer gesagt hat eine Injektion von 100 μg DNA keine signifikante OVA-spezifische T-Zell-Proliferation aufgewiesen, weder im Falle der pJRS165.1-Injektion noch im Falle eine Co-Injektion von pUB719. Diese Ergebnisse zeigen, dass in diesem Falle eine intramuskuläre Verabreichung von DNA, die für OVA 323–339/MCHII-Fusionskomplexe kodiert, alleine oder in Kombination mit einem co-stimulatorischen DNA-Molekül keine Immunantwort gegen das OVA-Peptid induzierte. Die beschränkte proliferative Antwort, die bei hohen Dosen von injizierter pJRS165.1-DNA beobachtet wurde (d. h. 100 μg), kann auf das Ergebnis von transformierenden intradermalen dendritischen Zellen (intradermale APCs) während der Injektion zurückzuführen sein (siehe Beispiel 16 unten).
Beispiel 16 – In vivo-T-Zell-Aktivierung nach interdermaler (i. d.) Injektion von DNA, die für den MHC-Fusionskomplex kodiert
Dendritische Zellen sind professionelle, intradermale Antigen-präsentierende Zellen (APCs). Die Transformation dieser Zellen (in diesem Beispiel veranschaulicht) oder anderen Zellen (wie in Beispiel 13 oben beispielhaft beschrieben) mit spezifischen MHC-Klasse-II-Fusionskomplexen kann eine Peptid-spezifische T-Zell-Antwort induzieren. Diese APCs tragen bereits die co-stimulatorischen Moleküle (d. h. B7-1), welche das zweite Aktivierungssignal an T-Zellen bereitstellen.
Zwei Gruppen von BALB/c-Mäusen (9 Mäuse pro Gruppe) wurden i. d. auf dem rasierten Rücken mit 100 μl PBS injiziert, das 10 μg von 1) pJRS165.1, das die kodierende Region des Gens der OVA 323–339/IA^d-MHC-Klasse-II-Fusion unter der Kontrolle des CMV-Promotors trägt, oder 2) pABH1, das die kodierende Region des murinen HEL 74–86/I-A^d-MHCII-Fusionskomplexes unter der Kontrolle des CMV-Promotors als eine Kontrollgruppe trägt, enthält. 4, 7 und 14 Tage nach der Injektion wurden die Inguinal- und paraaortischen Lymphknoten gesammelt. Lymphknotenzellen wurden isoliert und einem OVA-spezifischen T-Zell-Proliferations-Assay wie folgt ausgesetzt. Zellen wurden dreimal in vollständigem Medium (RPMI-1640, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin, Streptomycin und 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol) gewaschen und mit 5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. 100 μl der Zellsuspension wurden zu den Vertiefungen einer rundbödigen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugesetzt. Verdünnungen des OVA(323–339)-Peptids wurden im Bereich von 0,08 μg/ml bis 10 μg/ml hergestellt und 100 μl/Vertiefung wurden zu den Zellen dreifach zugesetzt. Eine Hintergrund-Proliferation wurde bestimmt, indem das Peptid weggelassen wurde. Die Platten wurden mit 5% CO₂ bei 37°C für 3–5 Tage inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit 0,4 μCi ³H-Thymidin für 18 Stunden vor Kultivierungsende gepulst und unter Verwendung eines Skatron-Zellerntegeräts geerntet. Der Einbau von ³H-Thymidin-DNA wurde als Maß der T-Zell-Proliferation unter Verwendung eines LKB-Flüssig-Szintillationsspektrometers bestimmt. Der Grad der Peptid-reaktiven T-Zell-Proliferation gab einen Hinweis für die T-Zell-Antworten (d. h. klonale Expansion), die in den Mäusen nach der Immunisierung stattfand.
Die Ergebnisse des Proliferations-Assays sind in 23 der Zeichnungen gezeigt. Es wurde keine signifikante spezifische T-Zell-Proliferation (etwa 2500 cpm) 4 Tage nach der Injektion in pJRS165.1- oder pABH1-injizierten Mäusen nachgewiesen. 7 Tage nach der Injektion zeigen Lymphknotenzellen aus pJRS165.1-injizierten Mäusen eine 12 Mal höhere Proliferation bei einer stimulierenden Peptid-Konzentration von 0,31 μg/ml im Vergleich zu Tag 4. Höhere Peptid-Konzentrationen verringerten die proliferative Antwort auf etwa 15000 cpm. Jedoch zeigten Zellen aus pABH1-injizierten Mäusen keinen signifikanten Anstieg bei der Proliferation (etwa 7000 cpm) bei allen drei Zeitpunkten. Die spezifische(OVA)-proliferative Antwort am Tag 14 nach der Injektion ist um das 3-Fache niedriger als am Tag 7, was darauf hinweist, dass der maximale Stimulationszeitraum abgeklungen ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass intradermale APCs mit einem funktionellen OVA 323–339/MHCII-Fusionskomplex transformiert worden sind und dass OVA-spezifische T-Zellen geprimt und expandiert worden sind. Aufgrund der Abwesenheit eines Stimulus (HEL-Peptid) proliferieren die HEL-spezifischen T-Zellen (aktiviert durch pABH1-transformierte APCs) nicht in dem Test. Eine Lag-Periode von 4 Tagen wurde vor jeder T-Zell-Aktivierung beobachtet.
Beispiel 17 – Konstruktion von Vektoren zur Expression von löslichen und Membran-gebundenen Einzelketten-MHC-Klasse-II-Molekülen mit spezifischen präsentierenden Peptiden
Die MHC-Klasse-II-Gene, die für diese Konstrukte verwendet wurden, wurden ursprünglich durch PCR-Amplifikation von cDNA, die von den passenden APCs, wie oben in den Beispielen beschrieben, hergestellt worden ist, isoliert (siehe insbesondere Beispiel 1 oben). Fragmente der I-A^d-α- und β-Ketten-Gene wurden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von klonierten Genen als Matrizen-DNA erzeugt und wurden in dem in 25 der Zeichnungen gezeigten Klonierungsschema zusammengebaut, was zu einem chimären Gen führte, das für das antigenische Peptid, OVA 323–339, das an ein Einzelketten-I-A^d-Molekül gebunden ist, kodierte. Kurz gesagt diente das α1-α2-Genfragment, das in 39AD2 kloniert wurde, als Matrize für die PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer JLA007 und JLA010 (alle Oligonukleotide, die bei der Klonierung verwendet wurden, sind in 26 der Zeichnungen aufgelistet), wobei zusätzlich eine 5'-XhoI- und eine 3'-XmaI-Restriktionsstelle zugeführt worden ist. Das α1-α2-PCR-Produkt wurde mit XhoI und XmaI verdaut, Gel-gereinigt und in den pLL101-Vektor subkloniert, was zu dem pJAα9-Konstrukt führte. Dieser Vektor fügt eine Sequenz hinzu, die für 6 × His-Tags am Ende des α1-α2-Proteins kodiert, um auf diese Weise das Protein besser aufreinigen zu können.
Die Strategie zur Isolierung des I-A^d-β1-β2-Genfragments und das Anheften der Linkersequenz wurde in den oben genannten Beispielen beschrieben. Das 10-aa-Linker-β1-β2-Genfragment in pBC1 diente als Matrize für eine PCR-Amplifikation unter Verwendung von JLA005- und JLA009-Primern, um so NcoI- und SpeI-Restriktionsstellen zuzufügen, die für eine nachfolgende Klonierung notwendig sind. Die PCR-Produkte wurden mit NcoI/SpeI verdaut und der verdaute pJAα9 ergab das pJAα9β20-Konstrukt. Um ein Einzelketten-Klasse-II-Molekül zu erzeugen, wurde durch Computermodellierung der Kristallstruktur von HLA-DR1 herausgefunden, dass ein flexibler Linker zwischen dem Carboxy-Terminus der β2-Domäne und dem Aminoterminus der α1-Domäne eingefügt werden konnte. Basierend auf der Tatsache, dass der Abstand zwischen diesen Resten 47 Å betrugt, wurde ein 24-Aminosäuren-Linker, der primär das sich viermal wiederholende (GGGGS)-Motiv umfasste, erstellt und verwendet. Um Sequenzen, die für dieses flexible Peptid kodieren, zwischen den klonierten Bund β-Ketten-Genfragmenten einzuführen, wurden die Oligonukleotide JA301 und JA302 angelagert und in SpeI/XhoI-verdautem pJAα9β20 ligiert. Das entstehende Konstrukt wurde als pJALNK bezeichnet. pJALNK wurde mit NheI und EcoRI verdaut und das β1β2-α1α2-Einzelketten-Genfragment wurde Gel-gereinigt. Dieses Fragment wurde in den pVW229-Vektor eingefügt, der die β-Ketten-Leitsequenz trägt und in die Regionen, die für das OVA 323–339-Peptid kodieren, wie in den oben genannten Beispielen beschrieben. Das entstehende Konstrukt SSC1 enthält ein chimäres Gen, das für das β-Leitsequenz/OVA-Peptid/10-aa-Linker/β1-β2/20-aa-Linker/α1-α2/6 × His-Tag kodiert. Die Sequenz dieses Gens ist in 27 der Zeichnungen gezeigt.
Um einen Vektor zur Expression von löslichen Einzelketten(sc)-Klasse-II-Molekülen in einem Insektenzell-Expressionssystem herzustellen, wurde das chimäre Gen von SSC1 durch Verdau mit NcoI und EcoRI entfernt und Gel-gereinigt. Das Fragment wurde in dem NcoI/EcoRI-verdautem p2Bac-Vektor (In Vitrogen – Teil Nr. V1980-10) ligiert, um pMBSC1.2 zu entwerfen.
Um einen Vektor zu erzeugen, der zur Expression von Membran-gebundenen sc-Klasse-II-Molekülen in Säugetierzellen fähig ist, wurde das BclI-EcoRI-Fragment von pJRS163-10, das für die α-Ketten-Transmembran(TM)-Domäne kodiert, in den BclI-EcoRI-verdauten SSCI-Vektor subkloniert. Der entstehende Vektor, SCTM1, wurde mit XmaI und EcoRI verdaut und die Einzelketten-I-A^d-OVA-Kassette wurde in den PEE13-Säugetier-Expressionsvektor eingeführt, was das SCT1-Konstrukt ergab. Die Sequenz des chimären Gens ist in 28 der Zeichnungen gezeigt.
Um einen Vektor zu erzeugen, der zur Expression von löslichen sc-MHC-Molekülen in Säugetierzellen fähig ist, wurde die α-Ketten-Matrizen-DNA durch PCR aus pJRS163-10 unter Verwendung der Primer JS305 und OPR142 amplifiziert, wobei dadurch die Sequenz, die für den EE-Antikörper-tag kodiert, an das 3'-Ende des Genfragments zugefügt worden ist. Das PCR-Produkt wurde mit BclI/EcoRI verdaut und in den verdauten SSC1-Vektor kloniert. Der entstehende Vektor SCEE1 wurde mit BclI/EcoRI verdaut und die Einzelketten-I-A^d-OVA-Kassette wurde in den PEE13-Säugetier-Expressionsvektor eingeführt, was das SCE1-Konstrukt ergibt. Die Sequenz des chimären Gens ist in 29 der Zeichnungen gezeigt. Proben der oben genannten Einzelketten-Plasmide pMBSC1.2, SCT1 und SCE1 wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt.
Beispiel 18 – Herstellung von löslichen Einzelketten-MHC-Molekülen (MHC II (I-A^d) in Insektenzellen)
Das aufgereinigte pMBSC1.2-Plasmid wurde für eine Co-Transfektion verwendet und das rekombinante Virus wurde aus Wildtyp-AcMNPV durch eine limitieren de Verdünnung angereichert (siehe D. R. O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. WH Freeman & Co., New York (1992)). Es wurden stets SF9-Zellen verwendet.
Der Überstand aus den Vertiefungen wurde durch ELISA getestet, um das Virus-produzierende rekombinante Produkt (sc-I-A^d-OVA) zu identifizieren. Der ELISA-Assay beinhaltet die Beschichtung von 100 ng M5/114 (ATCC TIB 120)-anti-IA^d auf die Vertiefungen der Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in 50 μl 0,1 M Carbonatpuffer, pH 8,2. Die Blockierung wurde mit 200 μl PBS, 10% FBS (fötales Rinderserum von Biowhittaker, Teil Nr. 14-901F) für mindestens 1 Stunde durchgeführt und die Platten wurden dreimal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen (PBS mit 0,5 ml Tween-20/1). Proben wurden zu 100 μl/Vertiefung zugeführt und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden viermal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen. Biotinyliertes AMS-32-1-anti-IA^d (Teil Nr. 06032D von Pharmingen) wurde zu 100 ng/Vertiefung in 100 μl PBS, 10% FBS, zugeführt. Nach der Inkubation für 15 Minuten bei 37°C wurden die Platten viermal mit Waschpuffer gewaschen. Avidinperoxidase (Sigma) wurde bei 250 ng/Vertiefung in 100 μl/Vertiefung PBS, 10% FBS, zugeführt und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann achtmal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen und 100 μl ABTS-Substrat (Kirkgaard & Perry, Teil Nr. 5050-00 oder 50-60-01) wurden pro Vertiefung zugegeben. Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen.
Der Überstand des Co-Transfektionsgemisches wurde auf I-A^d-Reaktivität durch den oben genannten ELISA getestet. Die mittlere Absorption der Zweifach-Vertiefungen sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Die Spezifität des beobachteten Signals ist wie gezeigt auf die Sekretion von sc-I-A^d-OVA in den Kulturüberstand durch SF9-Zellen zurückzuführen.
Die Subklonierung durch limitierende Verdünnung wurde auf dem Co-Transfektionsgemisch durchgeführt, indem das Virus in vollständigen Medien (TNMFH, Teil Nr. 51942 von JRH Biosciences, ergänzt mit 10% FBS) verdünnt wurde und indem die Virus-Verdünnungen mit 2 × 10⁴ SF9-Zellen/Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen inkubiert wurden. Der Überstand aus den Vertiefungen, die sichtbare Anzeichen einer Infektion ohne Polyhedra aufwiesen, wurde in dem IA^d-ELISA getestet. Die Klone C6 (1,557) und F8 (1,446) sind stark positiv. C12 ist klar negativ (0,124).
500 μl des positiven Klons C6 wurden zu jedem der drei 1 l-Gefäße zugefügt, die SF9-Zellen mit 1 × 10⁶ Zellen/ml enthielten. Etwa 2200 ml des Infektionsüberstands wurden zur Aufreinigung von sc-I-A^d-OVA, wie in Beispiel 19 unten beschrieben, verwendet. Der so aufgereinigte Einzelketten-MHC II-Komplex wurde auf dessen Fähigkeit untersucht, die Aktivität des DO11.10-T-Zell-Hybridoms, wie in Beispiel 20 unten beschrieben, zu modulieren. TABELLE 3 I-A^d-ELISA von Insektenzell-Kulturüberständen aus Co-Transfektionen

Probenverdünnung Absorption

Unverdünnt 0,857

1 : 2 0,524

1 : 4 0,305

1 : 8 0,165
Negativkontrollen einschließlich Probenverdünnungsmittel (0,064) und der Überstand aus einer Infektion, die mit einem rekombinanten Baculovirus durchgeführt wurde, der das Gen der Neuron-spezifischen Enolase (NSE) enthielt, wies in SF9-Zellen eine unerhebliche Bindung (0,098) auf.
Beispiel 19 – Aufreinigung von Einzelketten-MHC-Molekülen (MHC II (I-A^d) exprimiert in Insektenzellen)
Die folgenden Schritte wurden bei der Präparation von löslichem Einzelketten-I-A^d-OVA aus Insektenzell-Kulturüberständen durchgeführt.
Ammoniumsulfat-Fraktionierung: Bei 0–4°C wurde festes Ammoniumsulfat (0,436 g/ml) langsam in das Insektenzell-Kulturmedium (2200 ml) gegeben, während die Probe gerührt wurde. Nach dem Zusatz von Ammoniumsulfat wurde die Probe für 30 Minuten weiter gerührt. Das Gemisch wurde dann bei 26000 g und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet wurde in 100 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) resuspendiert. Die resuspendierte Probe wurde gegen 4000 ml PBS bei 4°C für etwa 20 Stunden dialysiert, mit einem Wechsel von frischem PBS nach den ersten 4,5–5 Stunden der Dialyse. Das Volumen der dialysierten Probe wurde gemessen und festes NaCl sowie 20% (v/v) Tween-20 wurde zu 0,5 NaOH zugegeben, gefolgt von einer Filtration durch einen 0,8-μm-Filter.
Metall-Chelat-Affinititäts- und Immun-Affinitätschromatographie: Die folgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Ni-IDA-Sepharose: Die durch den oben genannten Fraktionierungsschritt erhaltene Probe wurde auf eine Ni-IDA-Sepharose-Schnellflusssäule (2,6 × 7,2 cm, 38,0 ml) geladen, die mit mindestens 5 Bettenvolumen PBS, 0,5 M NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20, pH 8,0, equilibriert worden ist. Die Durchflussrate der beladenen Probe betrug 3 ml/Minute. Die Säule wurde dann mit mindestens 7–8 Bettvolumen des oben genannten Equilibrierungspuffers gewaschen, gefolgt von 2,5–3 Bettvolumen 20 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 0,2 M NaCl. Die Durchflussrate für den Waschschritt betrug 5 ml/Minute. Das I-A^d-Protein wurde durch schrittweises Erniedrigen des pHs durchgeführt, indem verschiedene Anteile des Puffers A (20 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 0,2 M NaCl) und des Puffers B (20 mM Na₂HPO₄, pH 3,0, 0,2 M NaCl) vermischt wurden, entsprechend dem Programm eines FPLC-Controllers. Ein ELISA-Assay unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers anti-I-A^d (der Konformations-Epitope der I-A^d-Moleküle erkennt) zeigt, dass I-A^d in Fraktionen, die mit 90% und 100% Puffer B eluiert worden sind, vorhanden ist. Diese A_280nm-Peaks, die bei 90% und 100% Puffer eluierten, wurden gepoolt und unmittelbar mit 1 M Tris auf pH 7,0 eingestellt. Die Probe wurde konzentriert und der Puffer wurde in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, durch Ultrafiltration ausgetauscht.
Immuno-Affinitätschromatographie: Die Probe von dem oben genannten Schritt wurde zuerst über eine Protein-A-Sepharose-Schnellflusssäule (1,6 × 5 cm, 10 ml) durchgeführt und dann auf eine Säule (1,6 × 3,4 cm, 6,8 ml) von Protein-A-Sepharose-Schnellfluss aufgetragen, die mit MKD 6, einem monoklonalen anti-I-A^d-Antikörper, kreuzvernetzt. Die zwei Säulen wurden zuvor mit 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, equilibriert. Nach der Probenauftragung wurde die Immuno-Affinitätssäule mit 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, gewaschen, bis eine A_280nm-Grundlinie erreicht wurde. Die Antikörper-Säule wurde dann mit demselben Puffer gewaschen, der 1 M NaCl wie oben enthielt, um nicht-spezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Das I-A^d-Protein wurde dann mit 50 mM Glycin-NaOH, pH 11,0, eluiert. Der eluierte Protein-Peak (gemessen bei A_280nm) aus der Antikörper-Säule wurde unmittelbar auf pH 8,0 mit 2 M Glycin, pH 2,0, eingestellt, konzentriert und der Puffer wurde mit 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, durch Ultrafiltration ausgetauscht. Die gereinigte Probe wurde bei 4–8°C gelagert. Die Reinheit und Funktionalität der I-A^d-Probe wurde durch eine Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese bzw. einen T-Zell-Aktivierungs-Assay (siehe unten) getestet. Der gereinigte Einzelketten-I-A^d-OVA aus dieser Präparation zeigte keine kontaminierenden Banden auf einem Coomassie-gefärbten Polyacrylamidgel und das Gesamtprotein betrug laut Gesamtprotein-Assay 125 μg/ml.
Beispiel 20 – Aktivität von Einzelketten-MHC-Molekülen
Es wurde bestimmt, ob gereinigte Einzelketten-I-A^d-OVA-MHC-Komplexe das OVA-spezifisch DO11.10-T-Zell-Hybridom aktivieren konnte, was durch Messung der IL-2- und IL-4-Produktion gemessen wurde. Dieses Verfahren beinhaltet die Beschichtung von Einzelketten-I-A^d-OVA auf IMMULON II-Platten (Dynatech) in PBS über Nacht bei 4°C. Die Vertiefungen wurden geleert, einmal mit PBS gewaschen und 1 × 10⁵ DO11.10-Zellen wurden pro Vertiefung in 200 μl RPMI, 10% FBS, zugeführt. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C in einem feuchten Inkubator mit 10% CO₂ wurden die Kulturüberstände geerntet, die Zellen durch Zentrifugation entfernt und die IL-2- und IL-4-Spiegel wurden durch ELISA wie folgt bestimmt.
Der Ratten-anti-Maus-IL-2-ELISA-Capture-Antikörper (Pharmingen, Teil Nr. 18161D) wurde mit 100 ng/Vertiefung in 50 μl 0,1 M Carbonat, pH 8,2, beschichtet. Die Blockierung wurde mit 200 μl PBS, 10% FBS, für mindestens 1 Stunde durchgeführt und die Platten wurden dreimal mit 200 μl Waschpuffer (PBS mit 0,5 ml Tween-20 pro 1) gewaschen. Die Proben wurden zu 100 μl/Vertiefung zugegeben und für 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden viermal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen und biotinylierter Ratten-anti-Maus-IL-2 (Pharmingen) wurde zu 100 ng/Vertiefung in 100 μl PBS, 10% FBS, zugeführt. Nach einer 45-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten viermal mit Waschpuffer gewaschen. Avidinperoxidase (Sigma, Teil Nr. A-3151) wurde zu 250 ng/Vertiefung in 100 μl/Vertiefung PBS, 10% FBS, zugeführt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann achtmal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen und 100 μl ABTS-Substrat (Kirkgaard & Perry, Teil Nr. 5060-00 oder 50-66-01) wurde pro Vertiefung zugeführt. Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen. Das IL-4-ELISA-Protokoll war identisch, mit der Ausnahme, dass die Verwendung der IL-4-spezifischen Capture- und Sonden-Antikörper (Pharmingen) verwendet wurden. Die Ergebnisse eines Aktivierungs-Assays sind in Tabelle 4 unten gezeigt. Weder DO11.10-Zellen alleine noch DO11.10 + A20(I-A^d-positiv)-Zellen sekretierten IL-2 oder IL-4. Der sc-I-A^d-OVA führte zu einer Sekre tion von IL-2 und IL-4 durch das DO11.10-T-Zell-Hybridom. Eine zweite Aktivierung wurde mit niedrigeren Dosen von immobilisiertem sc-I-A^d-OVA durchgeführt. Die Sekretionsspiegel von IL-2 und IL-4 wurden jeweils auf 0, wie in Tabelle 5 unten gezeigt, heruntertitriert. In beiden Experimenten wurden IL-2 und IL-4 durch DO11.10-Zellen in einer Dosis-abhängigen Art bezüglich der Exposition gegenüber immobilisiertem sc-I-A^d-OVA sekretiert.
TABELLE 4 DO11.10-Aktivierungs-Assay unter Verwendung von immobilisiertem aufgereinigtem sc-I-A^d-OVA
TABELLE 5 DO11.10-Aktivierungs-Assay unter Verwendung einer weiteren Verdünnung von immobilisiertem aufgereinigtem sc-I-A^d-OVA
Beispiel 21 – Herstellung von Einzelketten-MHC-Molekülen (Klasse II) in Säugetierzellen
Die Transfektion und Selektion von Säugetierzelllinien wurde wie folgt durchgeführt: 1 × 10⁷ NSO-Zellen wurden zweimal in eiskaltem PBS gewaschen, in 760 μl kaltem PBS resuspendiert und mit 40 μg (1 μg/ml) SalI-linealisierter plasmidischer SCE1- oder SCT1-DNA vermischt. Nach 5 Minuten Inkubation auf Eis wurden die Zellen unter Verwendung eines Gene Pulser (Biorad) elektroporiert, der einen Puls von 250 Volt, 960 μFd, abgibt. Die gepulsten Zellen wurden für 2–5 Minuten auf Eis platziert und 30 ml des nicht-selektiven Mediums (IMDM, 10% FBS, 2 mM Glutamin, 5000 Einheiten/ml Penicillin, 5000 μg/ml Streptomycin) wurden zugeführt. Die Zellen wurden in flachbödigen Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und 24 Stunden später wurden 150 μl selektives Medium (IMDM, 10% dialysiertes FBS, 5000 Einheiten/ml Penicillin, 5000 μg/ml Streptomycin, 1 × Nukleoside, 1 × Glutamat + Asparagin) zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden wöchentlich mit selektivem Medium gefüllt, indem 100 μl/Vertiefung des verwendeten Mediums entfernt wurden und 100 μl/Vertiefung des frischen selektiven Mediums zugegeben wurden, was es den Zellen ermöglichte, das Medium von sämtlichem restlichem Glutamin zu depletieren. Das Glutamin-Synthetase-Gen, das in den SCE1- und SCT1-Plasmiden enthalten ist, ermöglicht ein selektives Wachstum der transformierten Zellen in Glutamin-freien Medien. Kolonien von Zellen, die mit dem Plasmid transfiziert wurden, wurden nach 14–21 Tagen nachweisbar. Die Transfektanten, die den SCT1-Vektor tragen (d. h. die Membran-gebundene Form der sc-IA^d/OVA-Moleküle), wurden expandiert und auf die Expression der MHC-Moleküle durch Durchflusszytometrie, wie unten beschrieben, durchmustert.
Klone, die mit diesem Transfektions-/Selektion-Protokoll erzeugt worden sind, wurden auf eine Oberflächenexpression von Klasse-II-MHC-Molekülen bei wesentlich höheren Spiegeln als die parentale Zelllinie analysiert. Die Zellen wurden mit FITC-konjugiertem anti-I-A^d-Antikörper, AMS 32.1 (PharMingen, 1 : 100-Verdünnung) in kaltem Färbepuffer (PBS, 1% FBS) für 45 Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in Färbepuffer wurde die Fluoreszenz mittels eines FACScan-Durchflusszytometer (Beckton Dickinson) bestimmt. Ein isotypischer FITC-konjugierter anti-I-A^k-Antikörper, 10-3.6 (PharMingen, 1 : 100-Verdünnung) wurde als eine Negativkontrolle verwendet. Die Ergebnisse eines solchen Assays sind in Tabelle 6 unten für drei unabhängige SCT1-transfizierte Zelllinien gezeigt und weisen darauf hin, dass die transfizierten Zellen das sc-I-A^d-OVA auf ihrer Zelloberfläche exprimieren.

Die Transfektanten, die den SCT1-Vektor enthielten (d. h. Membran-gebundene Form der sc-I-A^d-OVA-Moleküle), wurden expandiert und auf eine Expression und Sekretion der MHC-Moleküle durch die in Beispiel 18 oben beschriebenen I-A^d-spezifischen ELISA-Assays durchmustert. Die Ergebnisse eines solchen Assays des Kulturüberstands von zwei SCE1-transfizierten Zelllinien sind in Tabelle 7 unten gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die transfizierten Zellen das sc-I-A^d-OVA-Molekül herstellen und sekretieren. Dieses System könnte verwendet werden, um große Mengen von löslichen Peptid-gebundenen Einzelketten-MHC-Molekülen zu erzeugen. TABELLE 6 Oberflächen-Expression von I-A^d-Molekülen auf transfizierten Zelllinien

TABELLE 7 I-A^d-ELISA-Assay mit Überständen von Zellkulturen von SCE1-Transfektanten

Kulturüberstand (unverdünnt)	Absorption
NSO (parentale Zelllinie)	0,444
E10 (SCE1-Transfektante)	0,781
E11 (SCE1-Transfektante)	0,960
sc-I-A^d-OVA aus Insektenzellkultur (Positivkontrolle)	2,44

Beispiel 22 – Aktivität der Einzelketten-I-A^d-Moleküle, die auf Säugetierzellen exprimiert werden
Die Stimulation der IL-2-Freisetzung von dem OVA 323–339-spezifischen I-A^d-beschränkten DO11.10-T-Zell-Hybridom wurde wie in Beispiel 20 oben beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden 1 × 10⁵ SCT1-Transfektantenzellen oder A20.11 zusammen mit OVA-Peptid (in variierenden Mengen) und 2 × 10⁵/Vertiefung DO11.10-Zellen bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ inkubiert. Die Kulturen wurden in vollständigem Medium (RPMI 1640, ergänzt mit 10% FBS, Penicillin/Streptomycin, L-Glutamin und 50 μM 2-Mercaptoethanol) in flachbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Nach 24 Stunden wurden die Kulturüberstände auf das Vorliegen von DO11.10-abgeleitetem IL-2 unter Verwendung des oben in Beispiel 20 beschriebenen IL-2-ELISA-Assays oder durch Messung des Wachstums der IL-2-abhängigen murinen T-Zelllinie CTLL-2 untersucht. In dem zuletzt genannten Test wurden zweifache Serienverdünnungen von jedem Kulturüberstand in vollständigem Medium in flachbödigen Mikrotiterplatten hergestellt und 1 × 10⁴ CTLL-2-Zellen wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Eine Standardkurve (Mengen) von rIL-2 wurde parallel dazu laufengelassen. Nach 16 bis 20 Stunden wurde MTT (2 mg/ml, 27 μl/Vertiefung) zugegeben und die Platten wurden für 4 Stunden inkubiert. Bei diesem Zeitpunkt wurden blaue Kristalle, die durch MTT in aktiv metabolisierenden Zellen gebildet wurden, durch den Zusatz von 150 μl 0,4 N HCl in Isopropanol gelöst. Nach dem Vermischen wurde die O. D. bei 562 unter Verwendung eines Ceres-UV900HI-Plattenlesegeräts bestimmt. Die Absorption entspricht dem Spiegel des CTLL-Zellwachstums, was durch das IL-2 in den Kulturmedien gestützt wurde.

Die Ergebnisse von zwei solcher Aktivierungs-Assays sind in den Tabellen 8 und 9 unten gezeigt. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung des CTLL-Assays erhalten. TABELLE 8 Aktivierung des DO11.10-T-Zell-Hybridoms durch SCT1-transfizierte Zellen

Untersuchte Antigen-präsentierende Zelle	Ergebnis des IL-2-ELISA (Absorption)
NSO (parentale Zelllinie)	0,047
T2 (SCT1-Transfektante)	0,758
T6 (SCT1-Transfektante)	0,307
A20 + OVA 323–339-Peptid (Positivkontrolle)	1,33

TABELLE 9 Aktivierung des DO11.10-T-Zell-Hybridoms durch SCT1-transfizierte T-12-Zellen

Untersuchte Antigen-präsentierende Zelle	Ergebnis des IL-2-ELISA (Absorption)
NSO (parentale Zelllinie)	0,078
T12 (SCT1-Transfektante)	1,03
A20 + OVA 323-Peptid (Positivkontrolle)	1,45

Beispiel 23 – Immunsuppressionsverfahren unter Verwendung von löslichen Peptid-gebundenen Einzelketten-MHC-Klasse-II-Molekülen
Zum Testen, ob die löslichen Peptid-gebundenen Einzelketten-Klasse-II-Moleküle eine T_H-Zell-Anergie in einem Tiermodellsystem induzieren können, können die Wirkungen der Moleküle auf einen T_H-Zell-abhängigen Immunglobulin-Klassenwechsel (d. h. IgM zu IgG) und auf eine klonale Expansion von Peptid-spezifischen T-Zelllinien untersucht werden.
Um einen IgG-Klassenwechsel zu untersuchen, wurden zwei Testgruppen wie folgt aufgestellt: (a) 10 BALB/c-Mäuse wurden mit 100 μg OVA 323–339 in vollständigem Freund's Adjuvans H37Ra am Schwanzende injiziert und ein weiterer Boost erfolgte 7 Tage später, um eine Immunantwort gegenüber dem OVA 323–339-Peptid zu induzieren. An dem Tag vor dem Tag, an dem jede Immunisierung mit OVA stattfand, wurden 5 der Mäuse i. v. mit 10–100 μg des löslichen Einzelketten-I-A^d-OVA in PBS injiziert. Dieses lösliche Fusionsprotein wird an den T- Zell-Rezeptor (TcR) binden, der auf den OVA 323–339-spezifischen THE-Zellen anzutreffen ist. Aufgrund der Abwesenheit des co-stimulatorischen Signals werden diese T_H-Zellen zu einem Zustand der Anergie induziert. Da der Immunglobulin-Klassenwechsel ein T_H-Zell-abhängiger Prozess ist, wird erwartet, dass die Induktion von anti-OVA 323–339-IgG-Antikörper in den Einzelketten-I-A^d-OVA-behandelten Mäusen verringert sein wird. Die verbleibenden 5 Mäuse dienen als Kontrolle und erhalten PBS.
10 Tage nach der zweiten Immunisierung wird Blut von jeder Maus durch Schwanzblutung gesammelt. Das Blut wird bei etwa 14000 g für 3–5 Minuten zentrifugiert und das Serum gesammelt. Die Assays werden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Maxisorp F8; Nunc, Inc.), die mit 1–50 μg/ml Ovalbumin beschichtet sind, unter Verwendung eines Tris-HCl-Beschichtungspuffers, pH 8,5, durchgeführt. Die Platten werden mit einem drucksensitiven Film (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA) bedeckt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten werden dann mit Waschlösung gewaschen (Imidazol/NaCl/0,4% Tween-20) und durch Zusatz von 100 μl/Vertiefung einer 3%igen BSA-Lösung blockiert. Nach der Inkubation auf einem Platten-Rotationsgerät bei Raumtemperatur für 30 Minuten werden die Platten fünfmal mit Waschlösung gewaschen. Die Maus-Seren werden 1 : 500 in Proben/Konjugat-Verdünnungsmittel (2% Gelatine + 0,1% Tween-20 in PBS) verdünnt und dann zweifach seriell auf der Platte verdünnt. Es werden zwei identische Platten für jedes Beschichtungsprotein angesetzt, eine für die Bestimmung des IgM-Titers und die andere für IgG. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten werden die Platten fünfmal mit Waschlösung gewaschen. Ziegen-anti-Maus-IgM-HRP- und Ziegen-anti-Maus-IgG-HRP-Konjugate (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, 1 : 100-Verdünnung in Proben/Konjugat-Verdünnungsmittel) werden zu den passenden Platten zugegeben. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten werden die Platten fünfmal mit Waschlösung gewaschen und dann mit 100 μl/Vertiefung ABTS-Entwicklungssubstrat (Kirkgaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionen werden mit 100 μl/Vertiefung Quench-Puffer (Kirkgaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) gestoppt und die Absorptionswerte werden bei 405 nm unter Verwendung eines automatisierten Mikrotiterplatten-ELISA-Lesegeräts (Ceres UV900HI, Bioteck, Winooski, Vermont) abgelesen. Der Titer wird bestimmt, indem die abgelesene Absorption gegenüber dem Log der Verdünnungen der Proben aufgetragen wird. Die Titer von IgM werden dann verglichen. Wie oben beschrieben, wird von den löslichen Peptid-gebundenen Einzelketten-MHC-Klasse- II-Molekülen erwartet, dass sie den IgG-Klassenwechsel in einer Peptid-spezifischen Weise aufgrund der Anergie, die in den entsprechenden Peptid-reaktiven T_H-Zellen induziert wurde, zu inhibieren.
Die Wirkungen der löslichen Peptid-gebundenen Einzelketten-MHC-Moleküle auf die klonale Expansion von Peptid-spezifischen T-Zelllinien in vivo können wie folgt untersucht werden. Die Behandlungsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe) sind zweckmäßigerweise dieselben wie oben beschrieben. Das Immunisierungsprotokoll sieht zweckmäßigerweise wie folgt aus: Mäuse werden i. v. mit 10–100 μg des löslichen Einzelketten-I-A^d-OVA-Fusionsproteins in PBS injiziert und 24 Stunden später subkutan am Schwanzende mit 15 μg OVA 323–339 in vollständigem Freund's Adjuvans H37Ra injiziert. Diese zwei Injektionen werden 6 und 7 Tage später wiederholt. 7 Tage nach der Beendigung des zweiten Satzes von Injektionen werden die Mäuse getötet. Die Inguinal- und paraaortischen Lymphknoten werden entfernt und zu einer Einzelzell-Suspension verarbeitet.
Die Suspension wird von Antigen-präsentierenden Zellen durch Inkubation auf Nylonwolle und Sephadex G-10-Säulen depletiert und die entstehenden gereinigten T-Zell-Populationen werden mit APCs, die mit dem OVA 323–339-Peptid gepulst worden sind, inkubiert. B-Zellen der Milz dienen als Antigen-präsentierende Zellen. Diese Zellen werden mit Mitomycin C (50 bis 100 μg/ml in einer Suspension von 4 × 10⁶ Spleenozyten/ml) fixiert, um die Proliferation der B-Zellen zu inhibieren, intensiv gewaschen und zu den gereinigten T-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen des OVA 323–339-Peptids zugegeben. Der Proliferations-Assay wird in rundbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei 37°C, 5% CO₂, für 3–5 Tage durchgeführt. Die Vertiefungen werden mit 1 μCi ³H-Thymidin 18 Stunden vor Kultivierungsende gepulst und unter Verwendung eines Skatron-Zellerntegeräts geerntet. Der Einbau von ³H-Thymidin in die DNA stellt ein Maß für die T-Zell-Proliferation dar und wird unter Verwendung eines LKB-Flüssig-Szintillationsspektrometers bestimmt. Der Grad der Peptid-reaktiven T-Zell-Proliferation gibt einen Hinweis für die T-Zell-Antworten (d. h. klonale Expansion), die in den Mäusen nach einer Immunisierung stattfinden.
Beispiel 24 – Immunsuppressiver Ansatz durch DNA-Inokulation mit Vektoren, die die Peptid-gebundenen Einzelketten-MHC-Moleküle exprimieren
Ein Beispiel eines Modellsystems zum Testen der Wirkungen des DNA-Inokulationsansatzes (insbesondere intramuskulär oder intradermal) wird wie folgt beschrieben. Drei Gruppen von BALB/c-Mäusen werden intramuskulär (IM) in beiden Hinterbeinen mit 100 μg von: (1) SCE1, (b) SCT1 oder (c) Saline injiziert. Die Injektionen werden nach 0, 2 und 4 Wochen verabreicht. 4 und 5 Wochen nach der anfänglichen DNA-Injektion wird das OVA-Peptid 323–339 (100 μg/Maus in vollständigem Freund's H37Ra-Adjuvans) subkutan am Schwanzende injiziert. Zwei Wochen später (Woche 8) wird Blut von jeder Maus durch Schwanzblutung gesammelt und Serum wird nach Zentrifugation bei etwa 14000 g für 3–5 Minuten erhalten. Die Titer von OVA-spezifischen IgG- und IgM-Antikörpern werden wie oben beschrieben bestimmt. Die Menge an OVA-spezifischen Antikörpern gibt einen Hinweis für den T_H-Zell-gerichteten Immunglobulin-Klassenwechsel, der in den Mäusen nach einer Immunisierung mit dem Peptid stattfindet. Daher kann eine DNA-Inokulation mit den Peptid-gebundenen Einzelketten-MHC-Expressionsvektoren eine Verringerung bei dem Spiegel von Peptid-spezifischen IgG-Antikörpern verursachen, ohne eine Wirkung auf die Spiegel von IgM-Antikörpern zu haben.
Ein alternativer Assay besteht darin, die OVA-spezifische klonale Expansion von T_H-Zellen oder -Proliferation zu messen. Kurz gesagt wird eine Zellsuspension aus den Inguinal- und paraaortischen Lymphknoten 7 Tage nach der zweiten OVA-Immunisierung hergestellt. Die Suspension wird von Antigen-präsentierenden Zellen durch Inkubation auf Nylonwolle und Sephadex G-10-Säulen depletiert und die entstehenden gereinigten T-Zell-Populationen werden mit APCs inkubiert, die mit dem OVA 323–339-Peptid gepulst worden sind. B-Zellen der Milz dienen als Antigen-präsentierende Zellen. Diese Zellen werden mit Mitomycin C (50 bis 100 μg/ml in einer Suspension von 4 × 10⁶ Spleenozyten/ml) fixiert, um die Proliferation der B-Zellen zu inhibieren, intensiv gewaschen und gereinigte T-Zellen werden mit verschiedenen Konzentrationen des OVA 323–339-Peptids zugegeben. Der OVA-spezifische T-Zell-Proliferations-Assay wird wie oben beschrieben durchgeführt. Der Grad der Peptid-reaktiven T-Zell-Proliferation gibt einen Hinweise für die T_H-Zell-Antworten (d. h. klonale Expansion), die in den Mäusen nach einer Immunisierung mit dem Peptid stattfinden. Daher kann eine DNA-Inokulation mit den Peptid-gebundenen Einzelket ten-MHC-Expressionsvektoren eine Verringerung des Spiegels der Peptid-spezifischen T_H-Zell-Proliferation verursachen.
Beispiel 25 – Konstruktion und Zelloberflächenexpression eines Einzelketten-Klasse-II-MHC-Moleküls mit einer TM-Domäne (sc-IA^d/OVA)
Gemäß den oben beschriebenen Verfahren wurde das sc-IA^d/OVA-Fusionsmolekül (30) anhand des folgenden Verfahrens hergestellt:
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionen (RT-PCRs) wurden durchgeführt, um IA^d-α- und β-Ketten-Genfragmente aus Gesamt-RNA, die aus A20-1.11-Zellen isoliert wurde, zu amplifizieren [K. Kim et al., J. Immunol. 122: 546 (1979)]. Geeignete Restriktionsenzymstellen wurden an jedem Ende der Genfragmente durch PCR eingeführt, um eine Klonierung zu ermöglichen. Die DNA-Sequenz, die für einen 10-Aminosäuren-Peptid-Linker kodiert, wurde in das 5'-Ende des β1-β2-Genfragments eingeführt und die Kozak-Konsensus-Sequenz wurde an dem 5'-Ende der β-Signalsequenzen durch PCR eingeführt. Die Regionen, die für den 24-Aminosäuren-Linker und das OVA-antigenische Peptid kodieren, wurden von angelagerten Oligonukleotiden erzeugt. Der Zusammenbau der PCR-Fragmente und der doppelsträngigen Oligonukleotide in dem pBlueScript-II-Vektor (Stratagene) ergaben das sc-IA^d-Fusions-Gen (siehe 30). Zur Expression in Säugetieren wurde der pSCT1-Vektor durch Subklonieren des sc/IA^dOVA-Gens (einschließlich der α-Ketten-TM- und zytoplasmatischen Regionen) stromabwärts des CMV-Promotors von pEE13 (Cell Tech) subkloniert. Der pEE13-Vektor trägt auch ein selektierbares Glutamat-Synthetase-Gen. Um lösliche sc-IA^d-Moleküle herzustellen, wurden verkürzte sc-IA^d-Konstrukte hergestellt, indem α-Ketten-TM- und zytoplasmatische Regionen (d. h. einschließlich der Aminosäuren 183 bis 233) mit einer Aminosäuresequenz, die für 6 aufeinander folgende Histidine kodiert, ausgetauscht wurden. Diese Konstrukte wurden stromabwärts des Baculovirus-Polyhedron-Promotors von pBluebac III (Invitrogen) subkloniert. Die Fusions-Gene wurden in Baculovirus nach einer Liposomen-vermittelten Co-Transfektion von SF9-Insektenzellen mit linearisiertem Wildtyp-AcMN-PV (Invitrogen) rekombiniert. Nach der Klonierung wurden die gereinigten rekombinanten Virusbestände entsprechend den Standardverfahren hergestellt.
Es ist leicht ersichtlich, dass andere antigenische Peptide als kovalent gebundene präsentierende Peptide verwendet werden können. Zum Beispiel wurde das HSV-1-gD-Peptid verwendet, um das sc-IA^d/gD-Fusionsmolekül herzustellen, indem die Sequenz, die für das OVA 323–339-Peptid kodiert, mit der Sequenz, die für das gD-Peptid kodiert, unten, substituiert wurde. Vorzugsweise enthält das präsentierende Peptid etwa 6 bis 30 Aminosäuren (einschließlich). Für jeden Einzelketten-MHC-Fusionskomplex mit einem kovalent gebundenen präsentierenden Peptid können T-Zell-Aktivierungs-Assays, wie hier beschrieben, verwendet werden, um zu bestimmen, ob das präsentierende Peptid sich richtig in die Peptid-Bindungsfurche oder -spalte des Komplexes faltet.
Das sc-IA^d/OVA-Fusionsmolekül wurde auf eine Zelloberflächenexpression durch das folgende Verfahren getestet: Plasmacytoma NS-0-Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert waren, der das sc-IA^d/OVA-Fusions-Gen trägt, wurde selektioniert und die Oberflächenexpression der Klasse-II-Moleküle wurde durch Durchflusszytometrie untersucht. Die NSO-Zellen wurden durch Elektroporation mit linearisierter pSCT1-DNA transfiziert, welche das sc-IA^d/OVA-Fusions-Gen trägt. Die Zellen wurden durch Wachstum in Glutamin-freiem Medium selektioniert. Transfektanten (d. h. T12-Zellen) waren nach 14–21 Tagen nachweisbar und wurden auf die Oberflächenexpression von Klasse-II-Molekülen analysiert. Die Zellen wurden mit FITC-konjugiertem anti-IA^dmAb (AMS-32.1, PharMingen) gefärbt und die Fluoreszenz wurde durch Durchflusszytometrie untersucht. Ein Isotyp-angepasster FITC-konjugierter anti-IA^kmAb (10-3.6, PharMingen) wurde als eine Negativkontrolle verwendet.
31A zeigt die Zelloberflächenexpression eines funktionellen Einzelketten-Fusionsmoleküls. Stabile Transfektanten wurden durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von IA^d- und anti-IA^kmAbs analysiert. Die Ergebnisse, die für die T12-Transfektante gezeigt sind, sind ähnlich denen, die für die drei anderen unabhängigen Transfektanten beobachtet worden sind (m. f. i. = durchschnittliche Fluoreszenzintensität). Die Ergebnisse zeigen einen Anstieg bei der sc-IA^d/OVA-Expression auf der Oberfläche von Zellen, die mit dem sc-IA^d/OVA-Expressionsvektor transfiziert worden sind. Eine intakte β-TM-Domäne wird für eine Zelloberflächenexpression von Klasse-II-Molekülen nicht benötigt; ein flexibler Linker, der die β- und α-Ketten verbinden kann, kann die Funktion der β-TM-Domäne ersetzen. Schließlich zeigen die Ergebnisse, dass eine kovalente Bindung des präsentierenden Peptids an ein Einzelketten-MHC-Klasse-II- Molekül den stabilen Zusammenbau und Oberflächenexpression des MHC-Moleküls ermöglichen. Die Verknüpfung des präsentierenden Peptids mit der β-Kette wird auch einen stabilen Zusammenbau und die Zelloberflächenexpression eines Einzelketten-MHC-Fusionsmoleküls ermöglichen.
Beispiel 26 – Ein Zelloberflächen-sc-IA^d/OVA-Fusionskomplex induziert eine T-Zell-Antwort in vitro
Zur Überprüfung, ob das OVA-Peptids richtig in dem sc-IA^d-Fusionskomplex gefaltet ist, werden sc-IA^d/OVA-transfizierte Zellen auf deren Fähigkeit untersucht, T-Zellen zu stimulieren. Ein T-Zell-Hybridom der Maus (DO11.10), das einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert, wurde verwendet. Der TCR erkennt das OVA 323–339-Peptid zusammen mit IA^d. Wenn die TCRs dieser Zellen mit den APCs interagieren (hier sc-IA^d/OVA-Transfektanten) sekretieren die DO11.10-Zellen Interleukin-2 (IL-2). DO11.10-Zellen (2 × 10⁵/Vertiefung) werden in Gegenwart von NS-0-Zellen der T12-Transfektanten (1 × 10⁵/Vertiefung) für 24 Stunden kultiviert und das in das Kulturmedium freigesetzte IL-2 wurde durch einen IL-2-spezifischen ELISA bestimmt (PharMingen). Das murine IA^d-tragende B-Zell-Lymphom, A20-1.11 (1 × 10⁵/Vertiefung), das mit 20 mM OVA 323–339 gepulst wurde, diente als eine Positivkontrolle zur Antigen-Präsentation [K. Kim et al., J. Immunol. 122: 549 (1979)]. Kein IL-2 wurde in dem Kulturmedium von T12-Zellen alleine nachgewiesen. Die Ergebnisse waren ähnlich denen, die für die zwei anderen sc-IA^d/OVA-Transfektanten beobachtet wurden. Wie in 31B gezeigt, konnten NS-0-Zellen (nicht-transfiziert) die DO11.10-Zellen nicht stimulieren, wobei die Zellen, die mit dem sc-IA^d/OVA-Fusions-Gen transfiziert worden sind, die Freisetzung von IL-2 aus DO11.10-Zellen stark stimulierte. Das Ausmaß der IL-2-Sekretion war vergleichbar mit der, wie sie in IA^d-tragenden APCs beobachtet wurde, die mit dem OVA-Peptid gepulst worden sind. Die Ergebnisse zeigen, dass das OVA-Peptid sich richtig innerhalb des sc-IA^d-Fusionskomplexes faltet und dass das gefaltete OVA-Peptid zusammen mit IA^d durch den TCR auf der Oberfläche von DO11.10-Zellen erkannt wird.
Beispiel 27 – Lösliche sc-IA^d/Peptid-Fusionsmoleküle induzieren eine T-Zell-Antwort in vitro
Es wurde berichtet, dass lösliche IA^d-Heterodimere als unstabil gelten [Kozono, H. et al., Nature 369: 151 (1994)]. Die Ergebnisse unten zeigen, dass das IA^d- Molekül durch die Kombination der Dimere in eine Einzelkette stabilisiert werden. Die Stabilisierung von anderen MHC-Molekülen (z. B. MHC-Klasse-I-, IE-, DQ-, DP- oder DR-Molekülen) kann auch durch Kombination der Dimere oder Fragmenten davon in einem Einzelketten-Molekül erreicht werden.
Um die Stabilität des Einzelketten-IA^d-MHC-Moleküls nachzuweisen und zum Nachweis, dass das OVA-Peptid durch andere Peptide ersetzt werden konnte, wurde ein Baculovirus-Insektenzellsystem verwendet, um ein lösliches sc-IA^d/Peptidmolekül herzustellen. Die chimären Gene, die hergestellt wurden, waren im Allgemeinen dieselben wie in 30, außer dem präsentierenden Peptid. Zum Beispiel schlossen die chimären Gene entweder ein kovalent gebundenes OVA 323–339-Peptid (sc-IVA^d/OVA), ein Peptid (gD 246–261) [APYSTLLPPELSETP] (SEQ ID NO: 124) [S. Grammer et al., J. Immunol. 145: 2249 (1990)] aus HSV-1-Glycoprotein D (sc-IA^d/gD) oder kein Peptid (sc-IA^d/Blank) ein. In jedem Fall wurden die TM- und zytoplasmatischen Domänen des Gens der α-Kette mit einer Sequenz substituiert, die für einen Histidin-Schwanz (6 × His) kodiert, um eine lösliche Expression zu ermöglichen. Die rekombinanten Baculoviren, die die sc-IA^d-Fusions-Gene tragen, wurden durch Standardverfahren hergestellt und dann verwendet, um SF9-Insektenzellen zu infizieren. Die infizierten Zellen sekretierten lösliche sc-IA^d-Fusionsmoleküle; diese konnten in den Kulturmedien durch einen IA^d-Enzym-abhängigen Immunosorbenz-Assay (ELISA) nachgewiesen werden. Die sc-IA^d-Fusionsmoleküle wurden dann durch Immuno-Affinitätschromatographie aufgereinigt.
Das verwendete Protokoll zur Transfektion der Insektenzellen und zur Aufreinigung der sc-IA^d-Fusionsmoleküle war wie folgt: SF9-Zellen (1 × 10⁶/ml) wurden in Hink's TMN-FH-Insektenmedien plus 10% fötalem Kälberserum bei einer Multiplizität der Infektion von 10 mit Baculovirus, das die sc-IA^d-Gene trägt, infiziert. Nach 5 Tagen wurde der Kulturüberstand gesammelt, auf pH 8,0 mit 1 M Tris eingestellt und über eine Protein-A-Sepharose-Säule durchlaufen gelassen. Nicht-gebundenes Material wurde dann einer MK-D6 mAb-Protein-A-Sepharose-Säule ausgesetzt. Die Säule wurde mit 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, gewaschen. Das sc-IA^d-Fusionsprotein wurde mit 50 mM Glycin-HCl, pH 11,0, eluiert und sofort auf einen pH 8,0 neutralisiert. Das eluierte Protein wurde konzentriert und in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, unter Verwendung von Centricon 30 ausgetauscht. Die sc-IA^d-Moleküle wurden durch einen sensitiven IA^d-Konformations-spezifischen ELISA unter Verwendung von M5/114 als dem Capture-mAb und Biotin-konjugiertem AMS-32.1 (PharMingen) als das Sonden-mAb nachgewiesen. Andere mAbs (34-5-4, 39-10-8), die verwendet wurden, um die sc-IA^d-Proteine nachzuweisen, wurden von PharMingen bezogen. Kovalent gebundenes OVA-Peptid wurde unter Verwendung von polyklonalen Antiseren nachgewiesen, die zweifach mit 100 μg OVA 323–339 in vollständigem Freund's Adjuvans (H37Ra) injiziert worden sind. Für ein vollständiges Protokoll zur Herstellung von polyklonalen Antiseren wird auf Ausubel, supra, verwiesen. Im Allgemeinen ergab die Aufreinigungsprozedur 200–300 μg sc-IA^d/Peptid pro Liter Medium.
32 zeigt, dass die Insektenzellen lösliche Einzelketten-MHC-Klasse-II-Moleküle produzierten. Eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) des Eluats der Affinitätssäule zeige eine einzelne Hauptbande bei etwa 50 kDa (32, Bahnen 2 und 3). Lösliches sc-IA^d/OVA-(Bahnen 3, 5) und sc-IA^d/Blank-(Bahnen 2 und 4)Protein wurde von Baculovirus-infizierten SF9-Zellen exprimiert und durch Immun-Affinitätschromatographie unter Verwendung von immobilisierten anti-IA^d-MK-D6-mAbs aufgereinigt. Die Proben wurden mit 12% SDS-PAGE-Gel analysiert und mit Coomassie-Blau (Bahnen 1–3) gefärbt. Molekulargewichtsstandards (Bahn 1) sind angezeigt. Die sc-IA^d-Proteine wurden auch auf eine Nylonmembran transferiert und mit Maus-anti-Seren, die spezifisch für das OVA 323–339-Peptid sind, behandelt (Western-Blot, Bahnen 4 und 5). Das kovalent gebundene OVA-Peptid wurde unter Verwendung von polyklonalen anti-Seren aus Mäusen, die mit OVA 323–339 in vollständigem Freund's Adjuvans H37Ra injiziert worden sind, nachgewiesen.
Der sc/IA^d wurde glykosyliert und wies Unterschiede in der Masse aufgrund des gebundenen Peptids auf. Eine Western-Blot-Analyse bestätigte das Vorhandensein des OVA 323–339-Peptids in den sc-IA^d/OVA-Proben (32, Bahn 5). Sowohl die gereinigten sc-IA^d/OVA- und die sc-IA^d/Blank-Proteine wurden auch durch monoklonale Antikörper (mAbs) (MK-D6, M5/114, AM5-32.1, 39-10-8 und 34-5-4) erkannt. Diese mAbs erkennen Epitope auf natürlichem IA^d.
33 zeigt, dass das sc-IA^d/OVA-Molekül eine Dosis-abhängige Freisetzung von IL-2 aus D11.10-Zellen induzierte, was die Funktionalität der Baculovirus-produzierten Moleküle bestätigte. D11.10-Zellen stellen auch IL-4 her, wenn sie durch das sc-IA^d/OVA-Molekül stimuliert wurden. 33 zeigt auch, dass DO11.10-Zellen nicht auf sc-IA^d/Blank-Moleküle reagierte.
Es ist ersichtlich, dass ein Einzelketten-MHC-Fusionsmolekül ein anderes kovalent gebundenes präsentierendes Peptid sein kann, als OVA 323–339. Die Wahl der Zellen, die zur Überprüfung einer sauberen Faltung des Peptids innerhalb des Fusionsmoleküls verwendet werden, wird von dem speziellen eingesetzten präsentierenden Peptid abhängig sein. Zum Beispiel erkennt die T-Zell-Hybridom-Zelllinie GD12 das gD 246–261-Peptid zusammen mit dem IA^d-Molekül [siehe z. B. S. Grammer et al., J. Immunol. 145: 2249 (1990)].
Als ein Beispiel wurden GD12-Zellen verwendet, um zu zeigen, dass das gD-Peptid richtig in dem sc-IA^d-Fusionskomplex gefaltet war und dass das sc-IA^d/gD-Molekül T-Zellen aktivierte. Das T-Zell-Hybridom GD12 reagierte gut auf immobilisierte sc-IA^d/gD, aber nicht auf sc-IA^d/OVA (34A). Umgekehrt reagierte die DO11.10-Zelllinie gut mit dem sc-IA^d/OVA-Peptid, aber nicht mit dem sc-IA^d/gD (34B). In diesen Experimenten wurden GD12-(spezifisch für gD 246–261 und IA^d) oder DO11.10-Zellen jeweils einzeln zu 1 × 10⁵ pro Vertiefungen, die mit sc-IA^d/gD oder sc-IA^d/OVA beschichtet waren, zugegeben. Die Platten wurden über Nacht inkubiert und die Menge von IL-2 im Überstand wurde durch ELISA bestimmt.
Beispiel 28 – Herstellung und Verwendung von leeren sc-IA^d-Fusionskomplexen
Es wurde festgestellt, dass das sc-IA^d/Blank-Molekül mit dem OVA 323–339-präsentierenden Peptid beladen werden konnte. Wie in 34C gezeigt, aktivierte das beladene Fusionsmolekül unerwartet DO11.10-Zellen zu einem höheren Ausmaß als das sc-IA^d/OVA-Fusionsmolekül. 34C wird wie folgt erklärt:
34C. Immobilisiertes sc-IA^d/Blank-Protein (500 ng/Vertiefung) wurde für 20 Stunden bei 37°C in der Abwesenheit (linke Leiste) oder Anwesenheit (mittlere Leiste) eines 50 M Überschusses an OVA 323–339-Peptid in Citratpuffer, pH 5,0, inkubiert. Immobilisiertes sc-IA^d/OVA-Protein (500 ng/Vertiefung) wurde ohne Peptid inkubiert, um die Wirkungen der Bindungsbedingungen auf die Antigen-Präsentation zu bestimmen (rechte Leiste). Nach dem Entfernen des nicht-gebundenen Peptids wurden alle sc-IA^d-Moleküle auf ihre Fähigkeit hin getestet, DO11.10-Zellen zu aktivieren.
Es ist ersichtlich, dass andere erfindungsgemäße lösliche leere Einzelketten-MHC-Klasse-II-Komplexe wirksam Immunsystemantworten modulieren können (z. B. T-Zell-Induktion und Cytokin-Freisetzung). Zum Beispiel kann DNA, die für ein lösliches MHC/Ig-Molekül (Beispiel 4) kodiert, über Standardverfahren ohne das gebundene OVA-Peptid hergestellt werden, um so DNA zu erzeugen, die für das entsprechende leere MHC/Ig-Molekül kodiert. Das leere Molekül kann in geeigneter Weise exprimiert und mit einem präsentierenden Peptid beladen werden, z. B. einem OVA-Peptid, wie es hier beschrieben ist. Die Fähigkeit des beladenen löslichen MHC/Ig-Moleküls, T-Zellen zu induzieren, kann in einem hier beschriebenen T-Zell-Aktivierungs-Assay festgestellt werden.
Beispiel 29 – Lösliche sc-IA^d/Peptid-Fusionskomplexe aktivieren T-Zellen und induzieren Apoptose
DO11.10-Zellen wurden verwendet, um die Fähigkeit von löslichen sc-IA^d-Fusionsmolekülen zu testen, eine T-Zell-Apoptose zu induzieren. Nach einer Inkubation über Nacht mit dem oben beschriebenen löslichen sc-IA^d/OVA-Molekül zeigten DO11.10-Zellen bemerkenswerte Veränderungen in ihrer Zellmorphologie, einschließlich der Kernkondensation, des Auftretens von apoptotischen Körpern und des Abbaus der DNA in oligonukleosomale Banden (35, Bahn 4). Diese Veränderungen sind charakteristisch für Apoptose [P. Walker et al., BioTechniques 15: 1032 (1993)]. Ähnliche Effekte wurden in Zellen beobachtet, die mit anti-TCR- und anti-CD4-mAbs inkubiert worden sind, wobei keine Veränderungen in der Zellmorphologie oder bei der DNA-Degradation in der Zelle, die mit immobilsiertem sc-IA^d/Blank inkubiert worden ist, beobachtet wurden (vergleiche Bahnen 3 und 5 der 35).
35 wird wie folgt erklärt: DO11.10-Zellen werden in unbehandelten Vertiefungen inkubiert oder in Vertiefungen, die mit 100 ng/Vertiefung anti-TCR-mAb (H57–597, PharMingen) oder 250 ng/Vertiefung sc-IA^d-Molekülen beschichtet wurden. Nach 24 Stunden wurden die Zellen (1,2 × 10⁶/Probe) geerntet und Triton X-100-lösliches/DNA wurde isoliert [P. Walker et al., BioTechniques 15: 1032 (1993)]. Die Proben wurden durch eine 2% Agarose-Gelelektrophorese analysiert und mit Ethidiumbromid gefärbt, um eine chromosomale DNA-Leiteraufteilung nachzuweisen. Bahn 2 stammt von unbehandelten DO11.10-Zellen. Bahnen 1 und 6 zeigen DNA-Molekulargewichts-Marker.
Beispiel 30 – Lösliche sc-IA^d-MHC-Fusionsmoleküle supprimieren die T-Zell-Expansion in vivo
Mindestens zwei Signale sind für die Aktivierung von T-Zellen erforderlich, z. B. wie bei der Proliferation von T-Zellen. Ein einzelnes Signal, das an die T-Zelle über den TCR und den MHC-Klasse-II/Peptid-Fusionskomplex abgegeben wird, wird die T-Zellen abtöten oder dämpfen. Es wurde festgestellt, dass lösliche sc-IA^d/OVA-Fusionsmoleküle selektiv Antigen-spezifische T-Zellen in vivo in der Abwesenheit von zugesetzten co-stimulatorischen Signalen abtöten können. Diese Ergebnisse zeigen, dass Einzelketten-MHC-Moleküle, insbesondere Einzelketten-MHC-Klasse-II-Moleküle, hervorragend für eine Suppression der Funktion des Immunsystems in vivo geeignet sind. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die Funktion des Immunsystems induziert werden kann, wenn ein Einzelketten-MHC-Molekül in den Zellen mit einem co-stimulatorischen Signal co-exprimiert wird oder alternativ, wenn ein Einzelketten-MHC-Molekül in Zellen exprimiert wird, in denen ein geeignetes co-stimulatorisches Signal bereits in den Zellen vorhanden ist.
Um die klonale Expansion von T-Zellen in vivo zu supprimieren, verwendeten wir den Säugetier-Expressionsvektor pEE13, der durch Standardverfahren modifiziert werden kann, um das sc-IA^d/OVA-Fusions-Gen zu tragen. Die Transkription des sc-IA^d/OVA-Gens wurde durch den CMV-Promotor des Expressionsvektors angetrieben. BALB/c-Mäuse wurden mit 100 μg Plasmid-DNA (1 μg/ml in PBS) intramuskulär (IM) in den Hinterbeinen injiziert. Die Injektionen wurden für zwei weitere Male 14 und 28 Tage später wiederholt. Eine Kontrollgruppe wurde IM mit Saline in der Woche 0 und mit 100 μg eines Plasmids, das für sc-IA^d/Blank kodiert, in den Wochen 2 und 4 injiziert.
Beide Gruppen wurden dann subkutan am Schwanzende mit dem OVA 323–339-Peptid (100 μg/Maus in vollständigem Freund's H37Ra-Adjuvans) 23 und 30 Tage nach der letzten DNA-Inokulation injiziert. Eine Woche später wurden die Mäuse getötet und die Inguinal- und paraaortischen Lymphknoten wurden gesammelt. Eine Suspension von Lymphknotenzellen wurde hergestellt und Antigen-präsentierende Zellen wurden durch Inkubation auf Nylonwolle und Sephadex G-10-Säulen depletiert und die entstehenden gereinigten T-Zell-Populationen wurden mit APCs inkubiert, die mit OVA 323–339-Peptid gepulst worden sind. B-Zellen der Milz, die aus einer BALB/c-Maus stammen, dienten als APCs. Diese Zellen wurden mit Mitomycin C (50 bis 100 μg/ml in Suspension mit 4 × 10⁶ Spleenozyten/ml) fixiert, um die Proliferation der B-Zellen zu inhibieren, extensiv gewaschen und zu den gereinigten T-Zellen (2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) bei 2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung mit dem OVA 323–339-Peptid (0 bis 50 μg/Vertiefung) zugegeben. Den Zellen wurde es ermöglicht, dass sie in rundbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei 37°C, 5% CO₂, für 4 Tage proliferieren können. Zu diesem Zeitpunkt waren die Vertiefungen mit MTS (40 μl/Vertiefung) (Promega) für 4 bis 6 Stunden vor Kultivierungsende gepulst. Der Einbau von MTS wurde durch Messung der Absorption bei 490 bestimmt und ist ein Maß für die T-Zell-Proliferation.
36A und 36B zeigen die Ergebnisse der T-Zell-Proliferations-Assays unter Verwendung von Zellen aus injizierten und Kontroll-Mäusen. In 36A wurden die T-Zellen aus Mäusen isoliert, die IM-Injektionen des sc-IA^d/Blank-Plasmids (und Saline) erhielten. In 36B erhielten Mäuse IM-Injektionen des sc-IA^d/OVA-Plasmids. Mäuse wurden zweimal mit OVA-Peptid behandelt und die T-Zellen wurden aus den Lymphknoten 1 Woche später isoliert. OVA-spezifische T-Zell-Proliferations-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt. T-Zellen, die aus den Mäusen isoliert worden sind, die mit dem sc-IA^d/OVA-Plasmid injiziert worden sind, zeigten eine signifikante Verringerung in der Menge der OVA-spezifischen Proliferation im Vergleich zu denen, die aus der Kontrollgruppe, die mit sc-IA^d/Blank-Plasmid injiziert wurden, isoliert worden sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression von löslichen sc-IA^d/OVA-Molekülen die klonale Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen in vivo supprimiert.
Die Verabreichung von löslichen Einzelketten-MHC-Molekülen (z. B. lösliche sc-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionskomplexe oder lösliche beladene sc-MHC-Klasse-II-Komplexe) oder DNA-Expressionsvektoren, die für diese Moleküle kodieren, werden Immunerkrankungen in Säugetieren, insbesondere in Menschen, bei denen das unerwünschte Vorhandensein oder die Expansion von Antigenspezifischen T-Zellen eine Rolle spielt, vermindern. Zum Beispiel können lösliche Einzelketten-MHC-Moleküle (z. B. lösliche sc-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionskomplexe) oder DNA-Expressionsvektoren, die für diese Moleküle kodieren, mit einer pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz vermischt werden, z. B. physiologischer Saline, und an ein Säugetier verabreicht werden, z. B. einem Menschen, der an einer oder vermutlich an einer Immunerkrankung leidet, bei der das unerwünschte Vorhandensein oder die Expansion von Antigenspezifischen T-Zellen eine Rolle spielt. Beispiele von anderen pharmazeutisch annehmbaren Trägern sind hinreichend bekannt (siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980). Ein bestimmter Modus zur Verabreichung ist intramuskulär, obwohl auch andere Modi verwendet werden können (z. B. oral, nasal, intravenös, parenteral oder transdermal), wobei der Modus von dem zu behandelnden Zustand und dem Allgemeinbefinden des Tieres abhängig sein wird und für den Fachmann ersichtlich sein wird. Die Dosierung des löslichen Einzelketten-MHC-Fusionsmoleküls wird auch variieren in Abhängigkeiten von solchen Faktoren wie Typ und Schwere der Immunerkrankung, wird aber im Allgemeinen bei einer Dosierung liegen, die ausreicht, um die in vivo-Expression von Immunzellen wie Antigen-spezifischen T-Zellen zu supprimieren. Eine typische Dosierung würde im Bereich von 1 ng bis 10 mg des löslichen MHC-Klasse-II-Moleküls pro kg Körpergewicht liegen. Die Behandlung kann wiederholt werden, wie es erforderlich erscheint, z. B. jeden Tag.
Es wird auch verstanden werden, dass Zellen, die alle oder die meisten erfindungsgemäßen MHC-Moleküle tragen, an ein Säugetier verabreicht werden können bei einer Dosierung, die ausreicht, um T-Zellen zu induzieren. Die T-Zell-Aktivität kann durch die hier beschriebenen Assays nachgewiesen werden.
Es ist ersichtlich, dass andere lösliche beladene Einzelketten-MHC-Moleküle verwendet werden können, um das unerwünschte Vorhandensein oder die Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen in vivo zu behandeln. Zum Beispiel kann ein präsentierendes Peptid mit einer Länge von etwa 6 bis 30 Aminosäuren (einschließlich) in einem zumindest äquimolaren Verhältnis mit einem geeigneten löslichen leeren Einzelketten-MHC-Molekül vermischt werden, um das entsprechende beladene Molekül zu bilden. Das beladene Molekül kann dann mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermengt werden und an ein Säugetier verabreicht werden, z. B. einem Menschen, um eine Immunsystemerkrankung wie oben beschrieben zu behandeln.
Beispiel 31 – Konstruktion und Verwendung von transgenen Mäusen, die einen Einzelketten-MHC-Komplex tragen
Eine transgene Maus kann konstruiert werden, die ein oder mehrere Gene trägt, die für beliebige erfindungsgemäße Einzelketten-MHC-Moleküle kodieren. Als Beispiele von bevorzugten Einzelketten-MHC-Molekülen können Einzelketten-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionsmoleküle mit einer Einzel-Transmembrandomäne in der α- oder β-Kette (oder einem Teil davon), lösliche Einzelketten-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionsmoleküle und Einzelketten-MHC-Klasse-II-Moleküle, die eine oder mehrere hydrophile Aminosäuren tragen, um die Löslichkeit zu erhöhen (z. B. den 6 × His-Tag, supra) jeweils verwendet werden, um transgene Mausstämme herzustellen. Solche Mausstämme werden sich als wertvoll für in vivo-Modelle herausstellen, z. B. für die Suppression oder Expansion von Antigenspezifischen T-Zellen. Zusätzlich können Zellen, die von solchen transgenen Tieren abgeleitet sind, verwendet werden, um eine immortale Zelllinie zu etablieren, die zumindest einige ihrer unterscheidungskräftigen Kennzeichen beibehalten, während sie in vivo in nicht-definierter Weise proliferieren.
Eine transgene Maus kann hergestellt werden, die ein lösliches Einzelketten-MHC-Klasse-II-Peptid-Fusionsmolekül trägt. Zum Beispiel können DNA-Konstrukte, die für lösliche sc-IA^d/OVA- oder sc-IA^d/gD-Moleküle, supra, kodieren, an eine ausgewählte Zelle oder einen Gewebe-spezifischen Promotor und/oder Enhancer gebunden werden und das entstehende Hybrid-Gen kann (z. B. wie beschrieben von Leder et al., US-Patent NR. 4,736,866; Wagner et al., US-Patent Nr. 4,873,191 und Ohashi in The Immunologist 2: 87–92, hier unter Bezugnahme eingeschlossen) in ein Tierembryo in einem frühen Entwicklungsstadium (z. B. dem Stadium der befruchteten Oozyte) mittels Standardverfahren eingeführt werden, um ein transgenes Tier herzustellen, das erhöhte Spiegel der gewünschten Aktivität in den ausgewählten Zellen oder Geweben aufweist (z. B. T-Zellen oder neuroectodermale, endotheliale oder angiogenische Gewebe).
Transgen-positive Tiere (Gründer-Tiere) werden mit nicht-transgenen Tieren zusammengeführt und die Nachkommen (f1-Tiere) werden auf eine Übertragung von Transgen-DNA durchmustert. Die f1-transgen-positiven Tiere sind hämizygot für die Transgen-DNA und homozygote transgene Tiere können durch geeignete Zuchtverfahren erzeugt werden. Jedes Gründer-Tier und dessen transgene Nachkommen sind einzigartig im Vergleich zu anderen transgenen Mäusen, die mit demselben Transgen etabliert wurden. Die Einführung der Transgen-DNA in die genomische DNA der Maus ist zufällig und die Integrationsstelle kann eine tiefgreifende Wirkung auf die Spiegel und den Gewebe- und Entwicklungsmustern der Transgen-Expression haben. Daher wird eine Anzahl von transgenen Mauslinien etabliert und zur Selektion dieser Tiere mit den am meisten passenden Expressionsmustern durchmustert.
Transgene Linien werden anhand der Spiegel der Transgen-Expression und den hier beschriebenen T-Zell-Assays bewertet. Die Expression auf dem RNA-Spiegel wird anfänglich bestimmt, um Expressions-positive Tiere zu identifizieren und zu quantifizieren. Standardtechniken zur RNA-Analyse werden eingesetzt und umfassen PCR-Amplifikations-Assays unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die entworfen wurden, um nur Transgen-RNA-Matrizen zu amplifizieren sowie von Hybridisierungs-Lösungs-Assays unter Verwendung von Transgen-spezifischen Sonden (siehe z. B. Ausubel et al., supra). Die RNA-positiven Tiere werden dann auf ihre Protein-Expression durch Western-Immuno-Blot-Analyse unter Verwendung von z. B. IA^d- oder OVA-spezifischen Antikörpern (siehe z. B. Ausubel et al., supra) analysiert. Zusätzlich kann eine in situ-Hybridisierung und Immunozytochemie unter Verwendung von Transgen-spezifischen Nukleotid-Sonden bzw. Antikörpern in geeigneter Weise eingesetzt werden, um Expressionsstellen innerhalb von transgenem Gewebe zu lokalisieren.
Gemäß dem hier beschriebenen Verfahren wird es möglich sein, die Aktivität von OVA- oder gD-spezifischen T-Zellen in ausgewählten transgenen Mausstämmen zu verringern. Die eingesetzte DNA-Form kann eine sein, die für ein MHC-Molekül kodiert, ähnlich den verwendeten Tierarten, oder sie kann für das Homolog einer anderen Art kodieren (z. B. Mensch). Der Spiegel von T-Zellen in dem transgenen Tier kann durch die hier beschriebenen T-Zell-Assays bewertet werden.
Es soll verstanden werden, dass mit "Transgen" DNA gemeint ist, die vollständig heterolog ist (d. h. fremd) zu der transgenen Maus und die in das Maus-Genom eingeführt wird.
Es wird auch verstanden, dass mit "Promotor" ein DNA-Segment gemeint ist, an dem ein transkriptioneller Enzymkomplex vor der Einleitung der Transkription des Gens bindet. Bei der Herstellung von transgenen Mäusen schließen bevorzugte Promotoren den IA^d-Promotor und den von Ohashi et al. in Cell 65: 305–317 (1991) beschriebenen Ratten-Insulin-Promotor ein.
Die Erfindung wurde unter Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen davon beschrieben. Jedoch wird der Fachmann nach Hinzunahme dieser Offenbarung Modifikationen und Verbesserungen im Sinne und innerhalb der Erfindung machen können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Einzelketten-MHC-Klasse-II-Molekül, umfassend in Sequenz kovalent gebunden: 1) eine Klasse-II-β-Kette, 2) einen Einzelketten-Linker und 3) eine Klasse-II-α-Kette, wobei das Einzelketten-MHC-Klasse-II-Molekül weiter ein präsentierende Peptid, das nicht-kovalent an eine Peptid-Bindungsfurche des MHC-Moleküls gebunden ist, umfasst, wobei die Klasse-II-β-Kette eine β2-Kette umfasst.
MHC-Molekül nach Anspruch 1, wobei der Kette von 1) oder 3) die Transmembran-Domäne und die cytoplasmatische Domäne oder Teile davon fehlt.
MHC-Molekül nach Anspruch 2, wobei das Molekül weiter eine oder mehrere Aminosäuren, die an das N-terminale oder C-terminale Ende des Komplexes angefügt worden sind, umfasst.
MHC-Molekül nach Anspruch 3, wobei die Aminosäuren hydrophil sind oder für einen Membran-Anker kodieren.
MHC-Molekül nach Anspruch 1, wobei den Ketten von 1) und 3) die Transmembran-Domäne und die cytoplasmatische Domäne oder Teile davon fehlen.
MHC-Molekül nach Anspruch 1, wobei das MHC-Molekül lösbar ist.
MHC-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Einzelketten-Linker-Sequenz etwa 15 bis etwa 40 Aminosäuren enthält.
MHC-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Einzelketten-Linker-Sequenz etwa 15 bis etwa 30 Aminosäuren enthält.
MHC-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Einzeiketen-Linker-Sequenz etwa 8 bis 12 Aminosäuren enthält und eine Spaltungsstelle einschließt.