JPWO2004031380A1

JPWO2004031380A1 - ＴＡＰ活性の阻害によりＭＨＣｃｌａｓｓＩによる外来エピトープの提示を増強する方法

Info

Publication number: JPWO2004031380A1
Application number: JP2004541263A
Authority: JP
Inventors: 愛吉岩本; 愛立川
Original assignee: 株式会社ディナベック研究所
Priority date: 2002-10-01
Filing date: 2003-10-01
Publication date: 2006-02-02
Also published as: CN1720326A; EP1559780A1; AU2003268721A1; WO2004031380A1; KR20050062572A; US20060099218A1; CA2500413A1

Abstract

本発明は、ＴＡＰ活性を阻害することによりＭＨＣｃｌａｓｓＩによる外来エピトープの提示を増強する方法に関する。ＴＡＰ阻害因子とエピトープ結合β２ｍを共にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを構築し、哺乳動物細胞に導入した。ＴＡＰ阻害因子により内因性のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を減少させ、ベクターから発現させたエピトープ結合β２ｍを含むＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を高頻度に細胞表面に提示させることに成功した。本発明は、感染症や癌などにおけるワクチン療法において有用である。

Description

本発明は、ＴＡＰ活性の阻害によりＭＨＣｃｌａｓｓＩによる外来エピトープの提示を増強する方法に関する。

ＭＨＣ（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ）ｃｌａｓｓＩ分子は重鎖（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ；ＨＣ）とβ２ミクログロブリン（β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ；β２ｍ）からなるヘテロダイマーであり、体内にあるほとんどの細胞がその細胞膜表面上に持つ。ＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子はその重鎖によって作られるペプチド収容溝に１０アミノ酸前後からなるペプチドを収容することができ、そのＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が細胞性免疫の担い手である細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）上のＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＣＲ）によって認識されることから、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子によって提示されるペプチドは「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ；抗原決定基）」と呼ばれる。
細胞質内で作られた自己抗原、あるいはウイルス抗原、腫瘍抗原などに由来するペプチド断片はＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉｇｅｎｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）と呼ばれる粗面小胞体上にあるトランスポーターを介して粗面小胞体へと運ばれ、そこでＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖およびβ２ｍとともに安定なＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を形成する。β２−ミクログロブリン分子はＭＨＣｃｌａｓｓＩの立体構造の安定性の確保とＨ鎖の細胞表面への輸送に役割を果たしている（日本分子生物学会編「免疫系：認識・分化・増殖」本庶佑、渡邊武編集、丸善株式会社、１１７−１１８ページ）。ペプチドを結合していない空のＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子は３７℃の培養条件では非常に不安定であることが知られている。
ＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子によって提示されるペプチドであるエピトープは、ある抗原に対する特異的な細胞性免疫を誘導するのに非常に重要な分子であり、ＨＩＶをはじめとするウイルス感染や、癌に対する免疫治療としてペプチドワクチンの開発が試みられている。しかしながら多くのウイルス抗原や腫瘍抗原由来の主要なエピトープは、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子とペプチドとの結合が弱く、ペプチドのみをワクチンとして使用してもその安定性の低さから一般に効果が期待できない。これまでに抗原性を損なわずＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子との結合を高めるアミノ酸置換を行った人工のエピトープを用いた、メラノーマ患者に対する臨床研究では効果が認められているが、このような安定性、抗原性に優れたエピトープを同定、開発することは煩雑で困難であり、必ずしも目的のものが得られるわけではない。
また一方でβ２ｍによるＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子上のペプチドの安定性の増加という現象が知られており、そのβ２ｍのアジュバント効果を利用した系の開発も行われている。
近年、エピトープペプチドをＭＨＣｃｌａｓｓＩおよびＩＩ分子あるいはβ２ｍに融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現が試みられている（Ｕｇｅｒ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＢａｒｂｅｒ，Ｂ．Ｈ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１５９８−１６０５；Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．ｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２６７１−２６７６；Ｋａｎｇ，Ｘ．ｅｔａｌ．，１９９７，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７：２０２−２０５；Ｕｇｅｒ，Ｒ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１６２：６０２４−６０２８；米国特許第５，８６９，２７０号）。これらの系では、β２ｍのＮ末端にリンカーを介してエピトープのペプチド配列を融合させること（エピトープ結合β２ｍ；ｅｐｉｔｏｐｅ−ｌｉｎｋｅｄ−β２ｍ）（″ｅ／β２ｍ″とも表記する）によって、特にＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子との結合力の弱いエピトープに関してペプチド単独に比して安定性が増加しＣＴＬによる認識も高まることが報告されている。
現在ヒトのＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子について用いられているＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体は、大腸菌にて重鎖（ＨＣ）およびβ２ｍ蛋白質を別々に発現させ、精製し、さらに合成ペプチドを用いた３者によるインビトロフォールディングにてＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を作製している。それに対してマウスのＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子についてバキュロウイルスベクターを用い、昆虫細胞由来のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の作製が報告されている（Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．ｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２６７１−２６７６）。この系ではＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖、エピトープ結合β２ｍを各々発現するバキュロウイルスを重感染させることによって、その細胞内でＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が作られる。バキュロウイルスベクターは昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）で有効なプロモーターの下流で外来遺伝子を発現するシステム（特表平６−５０２９９０）であるため、哺乳類由来の細胞を利用することは困難である。また、ＰｕｎｎｏｎｅｎらはＤＮＡシャッフリングに用いる遺伝子ワクチンベクターを開示しているが、エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍについては記載されていない（Ｐｕｎｎｏｎｅｎ，Ｊ．他、ＧｅｎｅｔｉｃＶａｃｃｉｎｅＶｅｃｔｏｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、米国特許出願第２００１０００６９５０号）。

本発明は、ＴＡＰ活性の阻害によりＭＨＣｃｌａｓｓＩによる外来エピトープの提示を増強する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、遺伝子組み換えによりエピトープを結合したβ２ｍをコードする遺伝子を構築し、哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを用いてこのエピトープ結合β２ｍを哺乳動物細胞で発現させて、これらの細胞においてＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を生産させる系の開発を行った。しかし、哺乳動物の細胞表面には多数のＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子が存在しており、それぞれのＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子は細胞内に存在するタンパク質由来の様々なペプチドを提示しているため、エピトープ結合β２ｍを哺乳動物細胞で発現させた場合、このエピトープ結合β２ｍと複合体を形成するＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子の割合はその分低下してしまう。
本発明者らは、目的のエピトープを提示したＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子の頻度を高めることは、免疫誘導にとって極めて重要だと考えた。例えば、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を用いた抗原特異的ＣＴＬの頻度の定量において、″ＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド・テトラメリック複合体（テトラマー）″〔ＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ｐｅｐｔｉｄｅｔｅｔｒａｍｅｒｉｃｃｏｍｐｌｅｘ（ｔｅｔｒａｍｅｒ）〕を用いる方法が開発されている（ＡｌｔｍａｎＪ．Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：９４−９６（１９９６））。これはＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体をｂｉｏｔｉｎ−ａｖｉｄｉｎの結合を用いて４量体化し、さらに蛍光標識を付加したもので、ＦＡＣＳによる解析に利用される。この方法は個体から分離した末梢血単核球をそのまま用いて測定することができるため、簡便で個体内の頻度を直接反映する上、非常に感度がよく、さらに特異性も高いことが確認されている（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：７８５−７９０（１９９８）；Ｋｕｒｏｄａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１３７３−１３８１（１９９８））。本発明者らは、上記に示したＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の解析においては、当初試みられていた単量体のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体では１：１のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体とＴＣＲの結合力が弱いためＦＡＣＳによる解析が不可能であったが、それをテトラマーにすること、つまり複数のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体−ＴＣＲの結合が同時に存在することによってはじめて解析が可能になったという経緯に注目した。
また、上記のエピトープ結合β２ｍを哺乳動物細胞で発現させる系においても、細胞内に存在するタンパク質由来の様々なペプチドを提示させたままにしておくことにより、目的のエピトープを提示しているＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が近傍に存在する確率が低下する可能性がある。
以上の二つの点を考えあわせることで、本発明者らは、一つの細胞膜上のＭＨＣｃｌａｓｓ１／ペプチド複合体上に同じエピトープを高率に提示させることができれば、ＴＣＲによる認識もより効率よく行われる、すなわちＣＴＬを効率良く活性化できると考えた。例えば、これまでにも細胞表面を酸処理することによって、提示されているＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体上のペプチドをはがし、洗い流した後に単一の合成ペプチドを高濃度に加えるとＣＴＬを効率良く活性化できるという報告がある（Ｌａｎｇｌａｄｅ−Ｄｅｍｏｙｅｎ，Ｐ．ｅｔａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１７５９−１７６６）。しかしながらこのような操作は試験管内では可能であるが、実際の個体内では不可能であり、かつ上記のようにペプチドの安定性は低いことを考えると免疫治療への応用は難しい。
そこで本発明者らは、ＴＡＰを介したペプチド輸送を阻害する分子を用いて細胞由来の抗原提示を阻害し、β２ｍに融合した目的のエピトープのみを抗原提示させようと考えた。まず、ＴＡＰ阻害因子として知られる単純ヘルペスＩ型ウイルス（ＨＳＶ−１）由来のＩＣＰ４７（Ｈｉｌｌ，Ａ．ｅｔａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ３７５：４１１−４１５；Ｆｒｕｈ，Ｋ．ｅｔａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ３７５：４１５−４１８）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＵＳ６（Ａｈｎ，Ｋ．ｅｔａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６：６１３−６２１；Ｈｅｎｇｅｌ，Ｈ．ｅｔａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６：６２３−６３２）を発現する組み換えセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを構築した。このベクターを、ヒトＣＤ４陽性Ｔリンパ球株Ｈ９、およびＭＴ−２に導入し、フローサイトメトリーにより細胞表面上のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を解析した。その結果、対照の野生型ＳｅＶを感染させた細胞ではＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体レベルに有意な変化は検出されなかったが、ＴＡＰ阻害分子ＵＳ６を発現するＳｅＶベクターを感染させた細胞では、時間と共にＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体レベルが減少し、新規（ｄｅｎｏｖｏ）のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現が抑制されていることが示された。
次に、ＩＣＰ４７またはＵＳ６を発現するＳｅＶベクターを上記細胞に感染後、さらに酸処理を行って細胞表面上に発現するエピトープを解離させた。この処理により、細胞表面上にもともと存在するＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体をより効率的に減少させることが可能であった。さらに本発明者らは、エピトープ結合β２ｍと同時にＴＡＰ阻害分子を細胞内に発現させることによって、細胞表面上の単一エピトープを持つＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の高率な発現を試みた。そのために本発明者らは、ＴＡＰ阻害分子（ＵＳ６）とエピトープ結合β２ｍを共発現するベクターを構築した。ベクターから発現されるエピトープはβ２ｍと融合しているため、ＴＡＰとは無関係に粗面小胞体内に存在することができる。このベクターを用い、ＴＡＰ阻害因子の効果により内在性蛋白質由来のペプチドを提示するＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を減少させ、目的の外来エピトープが結合したβ２ｍを含むＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を高頻度で発現させることに成功した。このように、「細胞表面上の単一ペプチドを持つＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の高率な発現」に関してＴＡＰ阻害分子を用いた系は本発明により初めて提供されたまったく新しい概念であり、免疫治療ワクチンとして期待が持たれる。
本発明により、目的のエピトープ結合β２ｍを含むＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を、哺乳動物細胞において高い純度で発現させることが可能となる。例えば、実施例に示すようなエピトープを結合したβ２ｍまたはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を発現する哺乳動物細胞感染性のウイルスベクターを細胞に導入し、ＴＡＰ阻害剤存在下で発現させることにより、導入遺伝子から発現されるエピトープを含むＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を優先的に細胞表面に形成させることができる。
実施例に示すように、エピトープ結合β２ｍ（ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク由来のエピトープが結合しているβ２ｍ）とＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）とを共発現させた細胞は、ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク由来の合成エピトープペプチドをパルス投与した場合と同等またはそれ以上の効率で抗原特異的ＣＴＬに認識される。また、エピトープ結合β２ｍを発現するＳｅＶベクター導入細胞から回収したエピトープ結合β２ｍは、エピトープ結合β２ｍを標的細胞の培養液に添加することによって、標的細胞に対する抗原特異的ＣＴＬの反応を誘導する。これらの知見は、エピトープ結合β２ｍをコードするベクターが、抗原特異的な免疫反応を誘導するためのインビボまたはエクスビボにおける遺伝子治療に有用であることを示している。ここにＴＡＰ阻害剤を用いることにより、さらに高純度で目的のエピトープを提示させることが可能となる。ＴＡＰ阻害蛋白質の存在下で目的のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を個体内で産生させれば、極めて効果の高い免疫治療を実現することが可能と考えられる。
このように本発明者らは、ＴＡＰの阻害を介して内因性のエピトープの提示を阻害することによって、効率的に外来エピトープを提示させる方法を確立した。ＴＡＰ阻害剤の存在下でエピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍを発現するベクターをインビボおよびエクスビボで導入することにより、抗原特異的細胞性免疫を誘導することが可能になる。本発明の方法は、例えばウイルスやバクテリア等の感染症に対する防御免疫の誘導、および癌に対する免疫療法などに有用である。
すなわち本発明は、ＴＡＰ活性を阻害することによりＭＨＣｃｌａｓｓＩによる外来エピトープの提示を増強する方法に関し、より具体的には、
（１）ＭＨＣｃｌａｓｓＩによる外来エピトープの提示を増強する方法であって、
（ａ）細胞のＴＡＰ活性を阻害する工程、および
（ｂ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープを融合させたβ２ｍを該細胞で発現させる工程、を含む方法、
（２）酸処理を行う工程をさらに含む、（１）に記載の方法、
（３）細胞のＴＡＰ活性を阻害する工程が、ＴＡＰ阻害活性を有する蛋白質を該細胞に接触させる工程または、該蛋白質をコードするベクターを該細胞へ導入する工程である、（１）または（２）に記載の方法、
（４）ＴＡＰ阻害活性を有する蛋白質がＵＳ６またはＩＣＰ４７である、（３）に記載の方法、
（５）ベクターが哺乳動物細胞に感染可能なウイルスベクターである、（３）に記載の方法、
（６）ベクターがセンダイウイルスベクターである、（５）に記載の方法、
（７）（ｉ）ＴＡＰ遺伝子の発現が阻害されているか、ＴＡＰ阻害剤を含むか、またはＴＡＰ阻害剤をコードする遺伝子を発現可能に保持し、かつ（ｉｉ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはエピトープを融合させたβ２ｍをコードする遺伝子を発現可能に保持する哺乳動物細胞、
（８）（ｉ）ＴＡＰ阻害剤または該阻害剤を発現可能なベクター、および（ｉｉ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはエピトープを融合させたβ２ｍ、またはエピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはエピトープを融合させたβ２ｍを発現可能なベクター、を含むエピトープを提示させるためのキット、
（９）下記（ｉ）および（ｉｉ）の両方を発現可能なベクター；
（ｉ）ＴＡＰ阻害剤、および
（ｉｉ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープを融合させたβ２ｍ、に関する。
本発明は、ＴＡＰ活性を阻害することによりＭＨＣｃｌａｓｓＩによる外来エピトープの提示を増強する方法を提供する。本発明の方法は、具体的には、（ａ）細胞のＴＡＰ活性を阻害する工程、および（ｂ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープを融合させたβ２ｍを該細胞で発現させる工程、を含む方法である。工程（ａ）および（ｂ）の順序に制限はなく、上記方法には、（ａ）または（ｂ）のどちらを先に行った場合も、また同時に行った場合も含まれる。ＴＡＰとは、ＡＴＰ結合カセットファミリーに属する分子で、ＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２の２種類がある。
ヒトＴＡＰ−１遺伝子は、例えばＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ＿０００５９３（配列番号：４７）（ｐｒｏｔｅｉｎＩＤＮＰ＿０００５８４（配列番号：４８））を参照のこと（Ｇａｒｂｉ，Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，２６４−２７３（２００３）；Ｈｅｉｎｔｋｅ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５３３，４２−４６（２００３）；Ｏｚｂａｓ−Ｇｅｒｃｅｋｅｒ，Ｆ．ｅｔａｌ．，ＴｕｒｋＪＰｅｄｉａｔｒ４４，９１−９７（２００２）；Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２０，３４９−３５３（２００２）；Ｓａｖｅａｎｕ，Ｌ．ａｎｄＶａｎＥｎｄｅｒｔ，Ｐ．Ｍ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４９５，７９−８２（２００１）；Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１３，２１０−２１３（１９９６）；Ｂｅｃｋ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５，１−１３（１９９６）；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄＣａｐｒａ，Ｊ．Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，１１０７９−１１０８３（１９９３）；Ｇｌｙｎｎｅ，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，８６０−８６６（１９９３）；Ｂｅｃｋ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２８，４３３−４４１（１９９２）；Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ．Ｇ．ｅｔａｌ．，ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ３９，１６１−１７３（１９９２）；Ｂａｈｒａｍ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，１００９４−１００９８（１９９１）；Ｓｐｉｅｓ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８，７４４−７４７（１９９０）；Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８（６３０３），７４１−７４４（１９９０））。ＴＡＰ−１は、ＡＰＴ１，ＰＳＦ１，ＡＢＣ１７，ＡＢＣＢ２，ＲＩＮＧ４，またはＤ６Ｓ１１４Ｅなどとも呼ばれる。また、例えばラットＴＡＰ−１遺伝子は、ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ＿０３２０５５（ｐｒｏｔｅｉｎＩＤＮＰ＿１１４４４４）に記載されている（Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｍ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２４，９７５−９９０（２００２）；Ｄａｕｍｋｅ，０．ａｎｄＫｎｉｔｔｌｅｒ，Ｍ．Ｒ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，４７７６−４７８６（２００１）；Ｄｅｖｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｖ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８，７３８−７４１（１９９０））。マウスＴＡＰ−１遺伝子は、ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ＿０１３６８３（ｐｒｏｔｅｉｎＩＤＮＰ＿０３８７１１）に記載されている（Ｇａｒｂｉ，Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，２６４−２７３（２００３）；Ｒｕｅｄｌ，Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，８１８−８２５（２００２）；Ｎｅｖｅｕ，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８，６６１−６６７（２００２）；Ｍａｒｕｓｉｎａ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，５２５１−５２５６（１９９７）；ＶａｎＫａｅｒ，Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ７１，１２０５−１２１４（１９９２）；Ｈａｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．ａｎｄＴｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３４，５−１１（１９９１）；Ｃｈｏ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，５１９７−５２０１（１９９１）；Ｍｏｎａｃｏ，Ｊ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０（４９８８），１７２３−１７２６（１９９０））。
ヒトＴＡＰ−２遺伝子は、例えばＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ＿０００５４４（配列番号：４９）（ｐｒｏｔｅｉｎＩＤＮＰ＿０００５３５（配列番号：５０））に記載されている（Ｇａｒｂｉ，Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，２６４−２７３（２００３）；Ｈｅｉｎｔｋｅ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５３３，４２−４６（２００３）；Ｏｚｂａｓ−Ｇｅｒｃｅｋｅｒ，Ｆ．ｅｔａｌ．，ＴｕｒｋＪＰｅｄｉａｔｒ４４，９１−９７（２００２）；Ｐｅｎｆｏｒｎｉｓ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６３，６１−７０（２００２）；Ｓａｖｅａｎｕ，Ｌ．ａｎｄＶａｎＥｎｄｅｒｔ，Ｐ．Ｍ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４９５，７９−８２（２００１）；Ｙａｎ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，８５２−８５９（１９９９）；Ｃｅｓａｒｉ，Ｍ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４５，２８０−２８１（１９９７）；Ｐａｔｔａｎａｋｉｔｓａｋｕｌ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ４７，３５３−３５５（１９９６）；Ｂｅｃｋ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５，１−１３（１９９６）；Ｃａｎｏ，Ｐ．ａｎｄＢａｘｔｅｒ−Ｌｏｗｅ，Ｌ．Ａ．，ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ４５，１３９−１４２（１９９５）；ｄｅｌａＳａｌｌｅ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５，２３７−２４１（１９９４）；Ｇｌｙｎｎｅ，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，８６０−８６６（１９９３）；Ｐｏｗｉｓ，Ｓ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３７，３７３−３８０（１９９３）；Ｂｅｃｋ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２８，４３３−４４１（１９９２）；Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ．Ｇ．ｅｔａｌ．，ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ３９，１６１−１７３（１９９２）；Ｐｏｗｉｓ，Ｓ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，１４６３−１４６７（１９９２）；Ｋｅｌｌｙ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５５，６４１−６４４（１９９２）；Ｂａｈｒａｍ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，１００９４−１００９８（１９９１）；Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８（６３０３），７４１−７４４（１９９０））。ＴＡＰ−２は、ＡＰＴ２，ＰＳＦ２，ＡＢＣ１８，ＡＢＣＢ３，ＲＩＮＧ１１，Ｄ６Ｓ２１７Ｅなどとも呼ばれる。また、マウスＴＡＰ−１遺伝子は、例えばＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ＿０１１５３０（ｐｒｏｔｅｉｎＩＤＮＰ＿０３５６６０，Ｐ３６３７１）に記載されている（Ｇａｒｂｉ，Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，２６４−２７３（２００３）；Ｍａｒｕｓｉｎａ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，５２５１−５２５６（１９９７）；Ｙａｎｇ，Ｙ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１１６６９−１１６７２（１９９２）；Ａｔｔａｙａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５５，６４７−６４９（１９９２）；Ｍｏｎａｃｏ，Ｊ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０，１７２３−１７２６（１９９０））。ラットＴＡＰ−１遺伝子は、例えばＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ＿０３２０５６（ｐｒｏｔｅｉｎＩＤＮＰ＿１１４４４５）に記載されている（Ｐｏｗｉｓ，Ｓ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５４，５２８−５３１（１９９１））。ウシＴＡＰ−１遺伝子は、例えばＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ＿１７４２２２（ｐｒｏｔｅｉｎＩＤＮＰ＿７７６６４７）に記載されている（Ａｍｂａｇａｌａ，Ａ．Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ５４，３０−３８（２００２））。
ＴＡＰ−１遺伝子およびＴＡＰ−２遺伝子には、多型が存在する。これらの多型は全て本発明においてそれぞれＴＡＰ１−１遺伝子およびＴＡＰ−２遺伝子に含まれる。具体的には、本発明においてＴＡＰ−１遺伝子およびＴＡＰ−２遺伝子には、それぞれ上記に示した哺乳動物ＴＡＰ−１蛋白質（ＮＰ＿０００５８４、ＮＰ＿１１４４４４、またはＮＰ＿０３８７１１など）および哺乳動物ＴＡＰ−２蛋白質（ＮＰ＿０００５３５、ＮＰ＿０３５６６０、Ｐ３６３７１、ＮＰ＿１１４４４５、またはＮＰ＿７７６６４７など）と、アミノ酸配列において６８％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸が含まれる。これらの蛋白質は、エピトープのプロセッシングに関与している。
アミノ酸配列の同一性は、例えばＢＬＡＳＴＰプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を用いて決定することができる。例えばＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴのウェブページにおいてＬｏｗｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙを含むフィルターは全てＯＦＦにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．（１９９３）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．７：６４９−６５６）。例えば２つの配列の比較を行うｂｌａｓｔ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓプログラム（ＴａｔｉａｎａＡｅｔａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、例えば哺乳動物ＴＡＰ−１蛋白質（ＮＰ＿０００５８４、ＮＰ＿１１４４４４、またはＮＰ＿０３８７１１など）および哺乳動物ＴＡＰ−２蛋白質（ＮＰ＿０００５３５、ＮＰ＿０３５６６０、Ｐ３６３７１、ＮＰ＿１１４４４５、またはＮＰ＿７７６６４７など）のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算すればよい。
また、本発明においてＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２遺伝子には、それぞれ上記に示した哺乳動物ＴＡＰ−１遺伝子（ＮＭ＿０００５９３、ＮＭ＿０３２０５５、またはＮＭ＿０１３６８３など）および哺乳動物ＴＡＰ−２遺伝子（ＮＭ＿０００５４４、ＮＭ＿０１１５３０、ＮＭ＿０３２０５６、またはＮＭ＿１７４２２２など）の蛋白質コード配列の３０塩基以上、より好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上、より好ましくは１５０塩基以上、より好ましくはコード配列全長と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸が挙げられる。ハイブリダイゼーションにおいては、哺乳動物ＴＡＰ−１または２遺伝子のコード配列を含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５ｘデンハルト液（１ｘデンハルト溶液は０．２％ポリビニールピロリドン、０．２％牛血清アルブミン、および０．２％フィコールを含む）を含む溶液中、４８℃、好ましくは５０℃、より好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で２ｘＳＳＣ，０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、好ましくは１ｘＳＳＣ，０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、より好ましくは０．５ｘＳＳＣ，０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、より好ましくは０．１ｘＳＳＣ，０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で、振蘯しながら２時間洗浄する条件である。
ＴＡＰ−１とＴＡＰ−２は双方とも膜貫通ドメインを持ち、小胞体膜上でヘテロダイマーを形成してトランスポーターの機能を発揮する。この２つのどちらが欠けてもＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子による抗原提示はできなくなる。細胞質内でプロセシングを受けたペプチドはＴＡＰトランスポーターによってＡＴＰ依存性に小胞体内へと輸送され、そこでＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子と結合する。本発明においてＴＡＰには、ＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２が含まれる。またＴＡＰ活性の阻害は、ＴＡＰ−１および／またはＴＡＰ−２の活性の阻害が含まれる。ＴＡＰ活性の阻害は、直接または間接であってよい。例えば、ＴＡＰ活性の阻害には、ＴＡＰに直接作用する阻害剤を適用してＴＡＰの活性を阻害すること、およびＴＡＰの発現（転写または翻訳）の抑制により間接的にＴＡＰ活性を阻害することが含まれる。ＴＡＰの発現の阻害は、ＴＡＰ遺伝子のアンチセンス核酸を細胞で発現させたり、あるいはＴＡＰ遺伝子の転写産物を切断するリボザイムを細胞で発現させることにより実施することができる。また、ＴＡＰ遺伝子の転写産物の一部の相補配列を含む２本鎖ＲＮＡ部分を持つ核酸を用いて、（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ；ＲＮＡ干渉）によりＴＡＰ遺伝子の発現を阻害してもよい。これらは全て、本発明においてＴＡＰ阻害剤となる。
一般的にＲＮＡｉとは、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部と相同な配列からなるセンスＲＮＡおよびこれと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡを含むＲＮＡを細胞内に導入または発現させることにより、標的遺伝子ｍＲＮＡの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現が阻害される現象を言う（ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２００１，１５：１８８−２００；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ＳＭｅｔａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４−４９８）。ＲＮＡｉ効果を持つ２本鎖ＲＮＡが細胞内に導入されると、ＤＩＣＥＲといわれる酵素（ＲＮａｓｅＩＩＩ核酸分解酵素ファミリーの一種）が２本鎖ＲＮＡと接触し、２本鎖ＲＮＡがｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる小さな断片に分解される。本発明においてｓｉＲＮＡは、このような細胞内プロセッシングにより生成したＲＮＡに加え、ＲＮＡｉにより標的遺伝子の発現を阻害するために人工的に合成または発現させたＲＮＡ分子もｓｉＲＮＡと総称する。本発明におけるＲＮＡｉ効果を有すＲＮＡには、これらのｓｉＲＮＡが含まれる。ｓｉＲＮＡにより、インビボにおいて標的遺伝子の発現を抑制することができる（ＡｎｔｏｎＰ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＶｏｌ．４１８３８−３９２００２；ＤａｖｉｄＬ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅｇｅｎｅｔｉｃｓＶｏｌ．３２１０７−１０８，２００２）。
ある標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、通常、この遺伝子の転写配列（ｍＲＮＡ配列）における連続する１５塩基以上の配列（より好ましくは１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、または１９塩基以上の配列）、およびその相補配列を含み、これらの配列がハイブリダイズして２本鎖を形成するＲＮＡである。好ましくは、連続する１９〜３０塩基、より好ましくは２０〜２５塩基の配列、より好ましくは２１〜２３塩基の配列またはその相補配列を片方の鎖に含み、これと相補対を形成するようなもう一方の鎖を含むＲＮＡである。しかし、より長い配列を含むＲＮＡであっても、細胞において、ＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡへ分解されることが期待されるため、ＲＮＡの長さは特に制限されない。また、標的遺伝子のｍＲＮＡの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖ＲＮＡを、例えば、予めＤＩＣＥＲで分解させ、その分解産物を利用することも可能である。この分解産物には、ＲＮＡｉ効果を有すＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）が含まれることが期待される。この方法によれば、ＲＮＡｉ効果を有することが期待されるｍＲＮＡ上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、標的遺伝子のＲＮＡｉ効果を有する配列は、必ずしも正確に規定される必要はない。
通常、末端に数塩基のオーバーハングを有する２本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉ効果が高いことが知られている。本発明において用いるｓｉＲＮＡは、必須ではないが、末端（好ましくは３’末端）に数塩基のオーバーハングを有することが望ましい。このオーバーハングを形成する塩基の長さは特に制限されないが、好ましくは、２塩基のオーバーハングである。本発明においては例えば、ＴＴ（チミンが２個）、ＵＵ（ウラシルが２個）、その他の塩基のオーバーハングを有する２本鎖ＲＮＡ（最も好ましくは１９塩基対の２本鎖ＲＮＡ部分と２塩基（ＴＴ）のオーバーハングを有する分子）を好適に用いることができる。本発明のｓｉＲＮＡには、このようにオーバーハングを形成する塩基がＤＮＡであるような分子も含まれる。
また、ｓｉＲＮＡにおいて塩基対を形成する２つの鎖は、スペーサーを介して連結されていてもよい。すなわち、このスペーサーがループを形成して、その前後のＲＮＡ配列同士がアニールして２本鎖を形成するＲＮＡも好適に用いることができる。スペーサーの長さに制限はないが、例えば３〜２３塩基としてよい。
また、上記のｓｉＲＮＡを発現し得るベクターもまた、本発明において使用することができる。即ち本発明は、ＲＮＡｉ効果を持つＲＮＡを発現し得るベクターの使用に関する。上記ＲＮＡを発現し得るベクターは、例えば２本鎖からなるｓｉＲＮＡの一方の鎖と他方の鎖が別々に発現するように、それぞれ別々のプロモーターと連結した核酸であってよい。あるいは選択的スプライシング等により１つのプロモーターから２種のＲＮＡが転写されるようにしてもよい。あるいは、センス鎖とアンチセンス鎖がスペーサー（ループを形成する）を介して連結された一本鎖ＲＮＡを発現するベクターであってもよい。このベクターから発現したＲＮＡは、ＲＮＡｉ効果を持つＲＮＡステムを形成して標的遺伝子の発現を抑制する。ステムの長さは上記のｓｉＲＮＡと同様であるが、例えば１９〜２９塩基としてよい。スペーサーの長さに制限はないが、例えば３〜２３塩基としてよい。５’および／または３’に数塩基のオーバーハングを有していても、いなくてもよい。これらのベクターは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、容易に作製することができる（ＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐＴＲｅｔａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：５５０−５５３：ＬｅｅＮＳｅｔａｌ．（２００１）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９：５００−５０５；ＭｉｙａｇｉｓｈｉＭ＆ＴａｉｒａＫ（２００２）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９：４９７−５００；ＰａｄｄｉｓｏｎＰＪｅｔａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１４４３−１４４８；ＰａｕｌＣＰｅｔａｌ．（２００２）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９：５０５−５０８；ＳｕｉＧｅｔａｌ．（２００２）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９９（８）：５５１５−５５２０；ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９９：１４９４３−１４９４５，２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ，ＰＪｅｔａｌ．（２００２）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１６：９４８−９５８）。より具体的には、目的のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって構築することが可能である。プロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどを好適に用いることができる。具体的には、例えばＵ６ＰｏｌＩＩＩプロモーター、およびＨ１ＲＮＡプロモーター（Ｈ１ＲＮＡはＲＮａｓｅＰを構成する一成分である）などが利用できる。
以下に、好ましいｓｉＲＮＡの一例を例示するが、本発明において用いられ得るｓｉＲＮＡはこれらに限定されない。まず、標的遺伝子の開始コドンから、５０塩基以上、好ましくは６０塩基以上、より好ましくは７０塩基以上下流の転写配列領域を選択する。該領域から、好ましくはＡＡ配列を見つけ、該ＡＡに続く１７〜２０ヌクレオチド（例えばＡＡに続く１９ヌクレオチド）を選択する。ＡＡの次の塩基は特に制限はないが、ＧまたはＣである配列が好適には選択される。ここで、選択する配列のＧＣ含量は、２０〜８０％であることが好ましく、より好ましくは３０〜７０％、より好ましくは３５〜６５％である。また、選択した配列は、ｓｉＲＮＡを投与する組織で発現する遺伝子の中で、標的遺伝子に特異的な配列であることが好ましい。例えば、公共の遺伝子配列データベースで選択配列をｑｕｅｒｙにして検索し、投与個体の遺伝子の中で標的遺伝子以外に同一の配列を転写配列に持つ遺伝子が存在しないことを確認することが好ましい。また配列は、標的遺伝子の蛋白質コード配列（ＣＤＳ）内から選択することが好ましい。このようにして選択された配列の初めのＡＡを除く配列を含む配列（好ましくは、３’にＵＵまたはＴＴが付加されている）、およびその相補配列（好ましくは３’にＵＵまたはＴＴを有する）は、好適なｓｉＲＮＡとなる。またＡＡに続く配列を探す代わりに、ＣＡに続く配列を上記と同様に探してもよい。あるいはＡＡまたはＣＡ以外の配列であってもよい。複数種作製されたｓｉＲＮＡから、最適なＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡを適宜選択することも可能である。
ＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡは、当業者においては標的遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。標的となるＴＡＰ遺伝子の塩基配列は、上述のように公共の遺伝子データベースから容易に取得することができるし、既知のＴＡＰ遺伝子をプローブに、哺乳動物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたり、あるいはＲＴ−ＰＣＲにより取得することができる。得られた遺伝子の塩基配列を基に、上記の説明に従ってｓｉＲＮＡを設計することができる。
標的となる遺伝子の配列は、必ずしも遺伝子全長の塩基配列が判明している必要はない。ｓｉＲＮＡとして選択可能な任意の連続するＲＮＡ領域（例えば、２０〜３０塩基）が判明していればよい。従って、ＥＳＴ（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ）等のようにｍＲＮＡの一部は判明しているが、全長が判明していない遺伝子断片からも、該断片の塩基配列を基にｓｉＲＮＡを作製することが可能である。合成したｓｉＲＮＡを臨床に使用する場合、ｓｉＲＮＡは修飾することができる。
また、アンチセンス核酸により遺伝子の発現を抑制する場合は、標的となるＴＡＰ遺伝子の転写される配列の連続した１３ヌクレオチド以上、好ましくは１４ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１５ヌクレオチド以上（１８ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、または２５ヌクレオチド以上）に対するアンチセンス配列を含む核酸であってよい。例えば、初期転写配列中のエクソン−イントロン境界、イントロン−エクソン境界、翻訳開始コドンを含む領域、５’端近傍の非翻訳領域、または成熟ｍＲＮＡ中の蛋白質コード配列（ＣＤＳ）の連続した１３ヌクレオチド以上、好ましくは１４ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１５ヌクレオチド以上に対するアンチセンス配列を含む核酸などが好ましい。また臨床応用を考慮する場合、使用されるアンチセンス核酸は、通常、合成オリゴマーである。アンチセンス核酸はＤＮＡであってよく、さらに修飾されていてもよい。例えば、ヌクレアーゼ分解に対する感受性を減らし、且つアンチセンス核酸としての活性を維持するために、リン酸エステル結合部のＯ（酸素）をＳ（硫黄）に置換したＳオリゴ（ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド）の利用が一般に知られている。このＳオリゴは現在ではアンチセンス薬として、直接患部に注入される臨床試験が行なわれている。本発明においてもこのＳオリゴを好適に使用することができる。アンチセンス核酸の配列は、標的遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは、好ましくは１７塩基以上であり、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２５塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、より好ましくは４０塩基以上、より好ましくは５０塩基以上であり、さらに好ましくは１００塩基以上である。アンチセンスＲＮＡは細胞内で発現させることもできる。標的細胞で活性を持つプロモーターの下流に目的のＲＮＡをコードする核酸を連結したベクターを作製し、これを細胞に導入すればよい。
ベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどが利用できる。これらのベクター系または遺伝子導入用の担体を利用して、ｅｘｖｉｖｏ法やｉｎｖｉｖｏ法などにより患者へ投与を行う遺伝子治療が可能となる。
また、リボザイム、またはリボザイムをコードするベクターを利用してＴＡＰ遺伝子の発現を行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在し、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計も可能である。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型（Ｒｏｓｓｉｅｔａｌ．（１９９１）Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．５０：２４５−２５４）やヘアピン型（Ｈａｍｐｅｌｅｔａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：２９９−３０４，ａｎｄＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２５４，６７８）と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素、１９９０年、３５、２１９１）。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ら著、ＦＥＢＳＬｅｔｔ、１９８８年、２２８、２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムが作出できる（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ら著、ＦＥＢＳＬｅｔｔ，１９８８年、２３９，２８５．、小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素、１９９０年、３５，２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ら著、ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ、１９８９年、１７，７０５９．）。
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６年、３２３，３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．＆Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９１，１９，６７５１．、菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．）。このように、リボザイムを用いて標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
またＴＡＰ活性を阻害するには、ＴＡＰ遺伝子に変異を導入したり、あるいはターゲティングによりＴＡＰ遺伝子を欠失させてもよい。本発明において「ＴＡＰ活性を阻害する工程」は、ＴＡＰ遺伝子の発現が欠損した細胞を提供または準備する工程であってもよい。本発明においてＴＡＰ阻害剤にはＴＡＰの活性を直接または間接に阻害する化合物が含まれ、このようなアンチセンス核酸およびリボザイム、ｓｉＲＮＡ、さらにＴＡＰ遺伝子の発現を抑制する因子などもＴＡＰ阻害剤に含まれる。ＴＡＰ阻害剤としては、ＴＡＰを阻害する活性を有する限り制限はなく、タンパク質、ペプチド性化合物、非ペプチド性化合物、核酸、核酸アナログ、低分子化合物などであってよい。
ＴＡＰ阻害剤が核酸によりコードされうる場合は、該核酸を発現するベクターを細胞に導入することによりＴＡＰ阻害剤を発現させることができる。例えば、ＴＡＰ阻害蛋白質としては、特に単純ヘルペスウイルス由来のＩＣＰ４７（Ｈｉｌｌ，Ａ．ｅｔａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ３７５：４１１−４１５；Ｆｒｕｈ，Ｋ．ｅｔａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ３７５：４１５−４１８）およびサイトメガロウイルス由来のＵＳ６（Ａｈｎ，Ｋ．ｅｔａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６：６１３−６２１；Ｈｅｎｇｅｌ，Ｈ．ｅｔａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６：６２３−６３２）などが挙げられる。
具体的には、Ｈｕｍａｎｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１のＩＣＰ４７は、ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＣ＿００１８０６（１４５３１１．．１４５５７７の相補鎖）（配列番号：５１）（ｐｒｏｔｅｉｎＩＤＮＰ＿０４４６７５、Ｐ０３１７０（配列番号：５２））に記載されている（Ｄｏｌａｎ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３（Ｐｔ４），９７１−９７３（１９９２）；Ｐｅｒｒｙ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９（Ｐｔ１１），２８３１−２８４６（１９８８）；ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９（Ｐｔ７），１５３１−１５７４（１９８８）；ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４（４），１７２７−１７４５（１９８６）；ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１（１），１−１３（１９８５））。また、Ｈｕｍａｎｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２のＩＣＰ４７は、ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＣ＿００１７９８（１４７７７５．．１４８０３５の相補鎖）（ｐｒｏｔｅｉｎＩＤＮＰ＿０４４５４３）に記載されている（Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂ．Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３（Ｐｔ８），２１６７−２１７１（１９９２）；ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２（Ｐｔ１２），３０５７−３０７５（１９９１）；Ｅｖｅｒｅｔｔ，Ｒ．Ｄ．ａｎｄＦｅｎｗｉｃｋ，Ｍ．Ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１（Ｐｔ６），１３８７−１３９０（１９９０）；ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８（Ｐｔ１），１９−３８（１９８７））。
サイトメガロウイルスＵＳ６については、例えばヒトＣＭＶＵＳ６はＡｃｃｅｓｓｉｏｎＡＹ０７２７７５（配列番号：５３）（ｐｒｏｔｅｉｎＩＤＡＡＬ６７１４３（配列番号：５４）、ＮＰ＿０４００９１）、チンパンジーＣＭＶＵＳ６はＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＣ＿００３５２１（ｐｒｏｔｅｉｎＩＤＮＰ＿６１２７７９）に示されている（Ｄａｖｉｓｏｎ，Ａ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８４（Ｐｔ１），１７−２８（２００３））。
ＩＣＰ４７分子はＴＡＰ分子のペプチド結合部位と結合することによってＴＡＰによるペプチドの輸送を阻害する（Ｔｏｍａｚｉｎ，Ｒ．ｅｔａｌ．，１９９６，ＥＭＢＯＪ．１５：３２５６−３２６６）。一方、ＵＳ６分子はＴＡＰ１へのＡＴＰの結合を阻害し、その結果ペプチドの輸送を阻害している（Ｈｅｗｉｔｔ，Ｅ．ｅｔａｌ．，２００１，ＥＭＢＯＪ．２０：３８７−３９６）。これらのいずれの分子も、本発明においてＴＡＰ活性を阻害するために用いることができる。上記のウイルスは、複数の亜種や株等が存在するが、該当する遺伝子がコードする蛋白質がＴＡＰ阻害活性を持つ限り本発明において好適に用いることができる。また、これらの蛋白質は、野生型蛋白質に限らず、ＴＡＰを阻害する活性を有する限り、野生型から改変された蛋白質なども含まれる。例えば、ＴＡＰ阻害活性を持つ部分ペプチドであってもよい。また、タグなどの他のポリペプチドを付加してもよい。例えば、Ｈｉｓタグを付加した蛋白質を用いてもよい（実施例参照）。
具体的には、本発明においてＩＣＰ４７蛋白質およびＵＳ６蛋白質には、それぞれ上記に示したＩＣＰ４７蛋白質（ＮＰ＿０４４６７５、Ｐ０３１７０（配列番号：５２）、またはＮＰ＿０４４５４３など）およびＵＳ６蛋白質（ＡＡＬ６７１４３（配列番号：５４）、ＮＰ＿０４００９１、またはＮＰ＿６１２７７９など）と、アミノ酸配列において６８％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質が含まれる。アミノ酸配列の同一性は、本明細書に記載した方法に従って計算すればよい。例えばＩＣＰ４７蛋白質（ＮＰ＿０４４６７５、Ｐ０３１７０（配列番号：５２）、またはＮＰ＿０４４５４３など）またはＵＳ６蛋白質（ＡＡＬ６７１４３（配列番号：５４）、ＮＰ＿０４００９１、またはＮＰ＿６１２７７９など）のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。
また、本発明においてＩＣＰ４７蛋白質およびＵＳ６蛋白質には、それぞれ上記に示したＩＣＰ４７蛋白質（ＮＣ＿００１８０６の１４５３１１．．１４５５７７、またはＮＣ＿００１７９８の１４７７７５．．１４８０３５など）またはＵＳ６蛋白質（ＡＹ０７２７７５、またはＮＣ＿００３５２１など）の蛋白質コード配列の３０塩基以上、より好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上、より好ましくは１５０塩基以上、より好ましくはコード配列全長と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、上記した通りである。
ＴＡＰ阻害蛋白質を発現させるための発現ベクターは所望のベクターを用いることができるが、哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターが好ましい。ベクターは、ＴＡＰ阻害剤の他に、後述のエピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープを融合させたβ２ｍを共発現するように構築することが可能である。
ＴＡＰ活性の阻害は一過的であってもよいが、好ましくはエピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍが発現するのに十分な期間（例えば３時間以上、好ましくは６、１８、２４、または３０時間以上）、持続的に阻害する。例えば、エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍを該細胞で発現させる工程において、外来エピトープが有意に提示されるのに十分な期間、ＴＡＰ活性が阻害されていることが好ましい。
外来エピトープの提示を増強する本発明の方法においては、ＴＡＰ活性を阻害する工程に加え酸処理を行う工程を含むことがより好ましい。酸処理を行う順序は制限されない。ＴＡＰ活性を阻害する工程、またはエピトープ融合蛋白質を細胞で発現させる工程の前後または同時に行えばよい。例えば、発現ベクターを用いてＴＡＰ阻害因子とエピトープ融合蛋白質とを共発現させる場合に酸処理を行う方法の１つを具体的に挙げれば、（ｉ）ＴＡＰ阻害蛋白質、およびエピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍを細胞で発現させる工程に続き、（ｉｉ）該細胞に酸処理を行う工程、を行う方法である。ＴＡＰ活性を阻害する工程により、内因的な抗原プロセッシングの過程が遮断される一方、酸処理により既に細胞表面に提示されているエピトープペプチドを解離させることができる。酸処理とは、細胞表面に提示されているエピトープペプチドが有意に解離するような酸性環境に細胞を暴露することを言う。酸処理は、例えば細胞を４℃のｐｅｐｔｉｄｅｓｔｒｉｐｐｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（０．１３Ｍｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ（ｐＨ３），６６ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４，１５０ｍＭＮａＣｌ，１７μｇ／ｍｌＰｈｅｎｏｌＲｅｄ）で１分間処理し、その後十分量の培養液（例えばＲＰＭＩ１６４０）にて中和することにより実施することができる。当業者であれば、これ以外にも同様の効果を示す酸処理を異なるプロトコルで行うことができる。
ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍに結合させるエピトープは所望のものを用いることができる。本発明において「エピトープ」とは、免疫細胞により認識され得るペプチドを言う。免疫細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞などが挙げられる。本発明において好ましいエピトープは、Ｔ細胞により認識されるペプチドである。エピトープは、抗原提示細胞により提示されたペプチドのみならず、免疫細胞により認識され得る限り所望のペプチドであってよく、例えば、人工的に作製したアミノ酸配列からなるペプチドをエピトープとして用いることもできる。より好ましくは、エピトープは抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示されたペプチドまたはその部分を含むペプチドである。本発明においてエピトープとなる蛋白質またはペプチドの「部分」は、通常、連続した８アミノ酸以上を含む部分である。好ましくは、連続した９アミノ酸以上、より好ましくは連続した１０以上、１２以上、または１５以上のアミノ酸を含む部分である。また、本発明において細胞内で抗原プロセッシングを経て提示されているエピトープペプチドを、その細胞において内因的に提示されているエピトープと言い、それ以外のエピトープを「外来エピトープ」という。例えば、仮にアミノ酸配列が内因的に提示されたエピトープと同じであっても、細胞外から添加されたり、細胞内の抗原プロセッシングを経ないで提示されているエピトープは本発明において外来エピトープに含まれる。また、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍなどのＭＨＣを構成する蛋白質に融合蛋白質の形態で共有結合しているエピトープペプチドなどは、本発明において外来エピトープに含まれる。ＴＡＰ阻害剤を用いる本発明の方法により、細胞内の抗原プロセッシングを阻害し外来エピトープを高頻度で細胞に提示させることができる。
外来エピトープは、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍのどちらにでも結合させることができる。本発明において用いられるエピトープに制限はなく、例えば腫瘍、感染症、およびその他の一般的な疾患に対して治療効果を有する所望のエピトープ等を用いることができる。エピトープは、一般的には８アミノ酸以上、例えば約１０アミノ酸のペプチドを用いることが好ましいが、エピトープとするペプチドの長さは適宜変えることができる。β２ｍに結合させる場合、エピトープはβ２ｍの所望の部位に結合させてよいが、例えば分泌後のβ２ｍ分子のＮ末端となるようにエピトープを結合させることが好ましい。このためには、β２ｍの分泌シグナル配列に続いてエピトープを結合し、場合によりスペーサー配列を介して、β２ｍ蛋白質を連結した融合蛋白質を製造すればよい。あるいは、スペーサーを介さず、エピトープを直接β２ｍと連結してもよい。スペーサーのアミノ酸配列に特に制限はないが、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１）からなるアミノ酸配列またはその繰返しである（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_ｎ等を含むペプチドを用いることが好ましい。繰返し回数（ｎ）に制限はないが、例えば１〜５（１、２、３、４、または５）にすることができる。スペーサーを用いる場合、その長さは好ましくは１６アミノ酸以内であり、例えば４アミノ酸、８アミノ酸、または１６アミノ酸等を例示することができる。用いられるβ２ｍとしては特に制限はなく、所望の哺乳動物のβ２ｍ分子を用いることができる。ヒトへの適用のためにはヒトβ２ｍが好ましい。ヒトβ２ｍ遺伝子は例えば実施例に記載したようにして単離することができる。なおβ２ｍは野生型蛋白質であってもよく、アミノ酸配列が改変された蛋白質であってもよい。
ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖にエピトープを結合させる場合、エピトープはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖の所望の部位に結合させてよいが、例えば分泌後のＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子のＮ末端となるようにエピトープを結合させるのが好ましい。このためには、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖の分泌シグナル配列に続いてエピトープを結合し、場合によりスペーサーを介して、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を連結した融合蛋白質を製造すればよい。あるいはスペーサーを介さず、エピトープを直接ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖と連結してもよい。
スペーサーのアミノ酸配列に特に制限はないが、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：２）からなるアミノ酸配列またはそのくり返しである（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_ｎ等を含むペプチドを用いることが好ましい。くり返し回数（ｎ）には制限はないが、例えば１〜５にすることができる。マウスＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子であるＨ２−Ｋ^ｄを用いた報告では１０アミノ酸ＧＧＰＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号：３）、２０アミノ酸ＧＧＰ（ＧＧＧＧＳ）_２ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号：４）、３０アミノ酸ＧＧＰ（ＧＧＧＧＳ）_４ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号：５）のスペーサー配列を比較した場合、１０アミノ酸のスペーサー配列のものが最も効果的に認識されている（Ｍｏｔｔｅｚ，Ｅ．ｅｔａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：４９３−５０２）。また、ヒトのＭＨＣｃｌａｓｓＩであるＨＬＡ−Ａ２分子を用いた報告では１０アミノ酸（ＧＧＳＧＧＧＡＳＧＧ）（配列番号：６）のスペーサー配列を用いて、メラノーマ抗原エピトープを効果的に提示させている（Ｋａｎｇ，Ｘ．ｅｔａｌ．，１９９７，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７：２０２−２０５）。従って、これらのスペーサー配列を介してエピトープを結合することは好ましい。
ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖としては、その由来に特に制限はないが、ヒトへの適用のためにはヒトのＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子（ＨＬＡ）が好ましい。ヒトのＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子はヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）と呼ばれ、非常に多様性に富んでいる。本発明において用いるＨＬＡは、これらのいずれの分子でもよい。例えば感染症や癌などにおいて目的のエピトープが判明しているいずれのＨＬＡ型にも本発明を適用することが可能であり、オーダーメイド（あるいはテーラーメイド）な試薬または医薬とすることができる。
特に日本においては、ＨＬＡ−Ａ２４（約６〜７割）、ＨＬＡ−Ａ２（約４割）、及びＨＬＡ−Ａ２６（約２割）などのＨＬＡ型の頻度が高く、次いで、ＨＬＡ−Ａ１１（２割）、−Ａ３１（２割弱）、−Ａ３３（２割弱）の頻度も高い。これらのＨＬＡは、日本人への適用を考えた場合に特に好ましい。
ある程度の不特定多数に対応した試薬および医薬の開発のためには、例えば日本であれば、日本人において５％以上のアレル頻度のＨＬＡ（すなわち１０％以上の日本人が有している）が好ましい。このようなＨＬＡ型としては以下のものが挙げられる。
ＡｌｏｃｕｓＢｌｏｃｕｓ
Ａ＊０２０１Ｂ＊０７０２
Ａ＊０２０６Ｂ＊１５０１
Ａ＊１１０１Ｂ＊３５０１
Ａ＊２６０１Ｂ＊４００１
Ａ＊３１０１２Ｂ＊４００２
Ａ＊３３０３Ｂ＊４４０３１
Ｂ＊４６０１
Ｂ＊５２０１１
Ｂ＊５４０１
実施例において本発明者らは、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子としてＡ２４拘束性ＨＬＡｃｌａｓｓＩ重鎖を用い、エピトープとしては、Ａ２４拘束性ＨＬＡｃｌａｓｓＩ分子によって提示されるＨＩＶ−１由来のエピトープを用いた。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２という遺伝子型は日本人の約６〜７割が持つ。従って、Ａ２４拘束性ＨＬＡｃｌａｓｓＩ重鎖、特にＡ＊２４０２（Ｌｉｔｔｅ，Ａ．−Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：４１−４５（１９９２））は、日本人への適用を考えた場合に好適である。ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖は野生型蛋白質であってもよく、アミノ酸配列が改変された蛋白質であってもよい。
エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍ、あるいはＴＡＰ阻害蛋白質は、公知の遺伝子組み換え技術により組み換え蛋白質として調製することができる（Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌｅｄｓ．，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ″，３ｒｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）。組み換え蛋白質の発現に用いる発現ベクターに制限はなく、プラスミドベクターやウイルスベクターなど所望の発現系を用いればよい。組み換え蛋白質産生のための発現ベクター−宿主細胞系は様々なものが知られており、宿主細胞としては、例えばバクテリア、酵母、動物細胞、および植物細胞など所望の細胞を用いることができる。発現された組み換え蛋白質は、公知の蛋白質精製方法により実質的に純粋になるように精製することができる。本発明において好ましい態様においては、エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍは哺乳動物細胞において発現される。これにより、大腸菌などで発現させる場合に比べ、糖鎖などの修飾が正常に起こり、免疫細胞への抗原提示の効率が高まることが期待される。哺乳動物細胞で発現可能なベクターは、組み換え蛋白質の製造のためのみならず、ベクターを細胞に導入し、標的細胞の細胞表面に外来エピトープを提示させるために用いることもできる。哺乳動物細胞におけるエピトープ融合ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍ、あるいはＴＡＰ阻害蛋白質の発現は、哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターの導入により行うことが好適である。
エピトープ結合β２ｍと膜結合型のＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖の両者の遺伝子を導入すれば、細胞表面上に特定のエピトープを提示する大量のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が発現される。この細胞は、エピトープ特異的ＣＴＬに対し、優れた抗原提示能を有している。
すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープを融合させたβ２ｍを製造する方法であって、
（ａ）細胞のＴＡＰ活性を阻害する工程、および
（ｂ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープを融合させたβ２ｍを該細胞で発現させる工程、を含む方法。
［２］酸処理を行う工程をさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］細胞のＴＡＰ活性を阻害する工程が、ＴＡＰ阻害活性を有する蛋白質を該細胞に接触させる工程または、該蛋白質をコードするベクターを該細胞へ導入する工程である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ＴＡＰ阻害活性を有する蛋白質がＵＳ６またはＩＣＰ４７である、［３］に記載の方法。
［５］ベクターが哺乳動物細胞に感染可能なウイルスベクターである、［３］に記載の方法。
［６］ベクターがセンダイウイルスベクターである、［５］に記載の方法。
［７］［１］から［６］のいずれかに記載の方法により製造された、エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープを融合させたβ２ｍを含む組成物。
また本発明は、エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖または、β２ｍを発現する哺乳動物細胞の製造方法に関する。この方法は、具体的には、（ａ）哺乳動物細胞のＴＡＰ活性を阻害する工程、および（ｂ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍをコードする遺伝子を該細胞で発現させる工程、を含む。工程（ａ）および（ｂ）の順序は限定されない。どちらを先に行ってもよく、また同時に行ってもよい。得られた細胞は、抗原特異的細胞性免疫を誘導するために有用である。例えば、患者由来の細胞（例えば樹状細胞）にこの方法を用いて目的の外来エピトープを高頻度に発現させ、患者体内において抗原特異的細胞性免疫を誘導することができる。特に、哺乳動物細胞のＴＡＰ活性を阻害する工程を、ＴＡＰ阻害活性を有する蛋白質をコードするベクターを該細胞に導入する工程により実施することが好ましい。これにより、細胞でＴＡＰ阻害蛋白質が発現する。このとき、上記の工程（ａ）および（ｂ）は同時に行う場合、例えばＴＡＰ阻害活性を有する蛋白質をコードするベクター、およびエピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはβ２ｍをコードするベクターを細胞に共導入すること、また、ＴＡＰ阻害活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を、エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍをコードするベクターに組み込み、同一ベクターから両者の蛋白質を共発現させることも本発明に含まれる。あるいは、ＴＡＰ遺伝子を欠損させたり、ＴＡＰ遺伝子の発現を抑制させた細胞に、工程（ｂ）を行ってもよい。この細胞またはその培養上清から、産生されたエピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープを融合させたβ２ｍを回収することができる。ＴＡＰ遺伝子を欠損した細胞は、例えば公知の遺伝子ターゲティング法に従って作り出すことができる。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系などを利用して、コンディショナルにＴＡＰ遺伝子の発現を制御することもできる。本発明は、ＴＡＰ活性が阻害されており、かつエピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはβ２ｍをコードする遺伝子を発現可能に保持する哺乳動物細胞を提供する。また本発明は、ＴＡＰ阻害剤を含むかまたはＴＡＰ阻害剤をコードする遺伝子を発現可能に保持し、かつエピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはβ２ｍをコードする遺伝子を発現可能に保持する哺乳動物細胞を提供する。細胞がある遺伝子を発現可能に保持するとは、該細胞においてその遺伝子が発現しているか、または薬剤等により発現を誘導することが可能であるように細胞に含まれていることを言う。例えば、誘導性プロモーターやＣｒｅ−ｌｏｘＰ系などを利用することにより、誘導的にその遺伝子を発現できる細胞などが挙げられる。
すなわち、本発明は以下を提供する。
〈１〉（ｉ）ＴＡＰ活性が阻害されており、かつ（ｉｉ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはエピトープを融合させたβ２ｍをコードする遺伝子を発現可能に保持する哺乳動物細胞。
〈２〉（ｉ）ＴＡＰ遺伝子の発現が阻害されているか、ＴＡＰ阻害剤を含むか、またはＴＡＰ阻害剤をコードする遺伝子を発現可能に保持し、かつ（ｉｉ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはエピトープを融合させたβ２ｍをコードする遺伝子を発現可能に保持する哺乳動物細胞。
〈３〉ＴＡＰ阻害剤がＵＳ６またはＩＣＰ４７である、〈２〉に記載の方法。
〈４〉ＴＡＰ阻害剤をコードする遺伝子、および／またはエピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはエピトープを融合させたβ２ｍをコードする遺伝子が、哺乳動物細胞に感染可能なウイルスベクターを介して細胞に導入されている、〈１〉から〈３〉のいずれかに記載の方法。
〈５〉ベクターがセンダイウイルスベクターである、〈４〉に記載の方法。
〈６〉〈１〉から〈５〉のいずれかに記載の細胞を含む組成物。
哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを用いてＴＡＰ阻害蛋白質、および／またはエピトープ結合β２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を発現させる場合、用いるベクターとしては特に制限はなく、所望のウイルスベクターを用いることができる。本発明において用いられる哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターは、哺乳動物細胞以外の細胞に感染する能力を有していてもよい。ベクターとしては、宿主に対する毒性が低く、導入遺伝子の高い発現が得られるものが好ましい。本発明において好適なウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、フォウルポックスウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが挙げられるがこれらに制限されない。これらのベクター系を用いて、ＴＡＰ阻害因子、エピトープ結合ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍ、あるいはＴＡＰ阻害因子とエピトープ結合ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはβ２ｍとを発現する組み換えウイルスベクター等を構築することができる。なお、本明細書において、「組み換え」ウイルスベクターとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウイルスベクターを言う。組み換えポリヌクレオチドとは、片端または両端が自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。より具体的には、例えば人為的にポリヌクレオチド鎖が繋ぎ替えられたり、あるいは新たに生成されたポリヌクレオチドである。「組み換え」ウイルスベクターは、例えば遺伝子操作により構築されたウイルスベクターまたはそれを増幅して得られるウイルスベクターが含まれる。組み換えウイルスベクターは、例えば、組み換えウイルスｃＤＮＡを宿主細胞で発現させ、ウイルス粒子を再構成して生成することができる。
組み換えウイルスベクターは当業者に周知の方法に従って調製することができる。例えば、遺伝子治療などに最も普通に利用されるアデノウイルスベクターの作製は、斎藤らの方法（Ｍｉｙａｋｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、１３２０−２４頁；鐘ヶ江ら、バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法、１９９４、４３−５８頁、羊土社）に従い、例えばアデノウイルス（Ａｄ）５型ゲノムのほぼ全長からＥ１及びＥ３領域を除く３１ｋｂのＡｄＤＮＡを持つ４２ＫｂのコスミドｐＡｄｅｘｌｃｗ（鐘ヶ江ら、１９９４、細胞工学、１３巻、８号、７５７−７６３頁）を、適当な制限酵素例えばＳｗａＩ等で切断し、ゲル濾過等にて適宜脱塩精製し、外来遺伝子発現ユニットをＴ４リガーゼ等による連結反応に供した後、酵素を熱失活し、ゲル濾過にて脱塩し、ＳｗａＩによる切断反応を行う。切断産物はフェノールによる酵素失活処理後脱塩し、再びＳｗａＩで切断する。その一部についてギガパックＸＬキット（ストラタジーン社、米国）等によるインビトロ・パッケージングを行い、連結産物を大腸菌に導入し得られたアンピシリン耐性形質転換株のいくつかについてコスミドを調製し、制限酵素消化によりその構造を調べ、外来遺伝子発現ユニットが目的の方向（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂの転写と逆方向）に挿入された組換えコスミドを単離する。一方で、Ｅ１及びＥ３領域を欠くアデノウイルス５型（Ａｄ５ｄｌＸ株）のＤＮＡ−末端蛋白質複合体（ＤＮＡ−ＴＰＣ）を斎藤らの方法（鐘ヶ江ら、１９９４、バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法、４３−５８頁、羊土社）により調製する。これを例えば、制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで消化し、ついでゲル濾過等により脱塩精製する。該コスミドとＥｃｏＴ２２Ｉ消化断片を混合し、セルフェクトキット（ファルマシア社、スウェーデン）等を用いて、２９３細胞に導入する。翌日、トランスフェクションした２９３細胞を懸濁し、その懸濁液、および１０倍ないし１００倍希釈液（２９３細胞懸濁液にて希釈）を９６穴プレートに撒く。約２週間後に、２９３細胞内での組換えによって生じた組換えアデノウイルスの増殖が見られたウェルから、死滅細胞を含む培養液を取り出す。それを数回凍結融解し、アデノウイルス粒子を細胞から放出させる。その遠心上清液（１次ウイルス液）を、２４穴プレートにまいた２９３細胞に感染させる。３日後に死細胞を含む培養液を取り出し、一部は１次ウイルス液作成の要領で凍結融解し、遠心上清液を得る（２次ウイルス液）。残りの培養液を遠心し、細胞を得る。それよりＤＮＡを調製し、制限酵素切断によって組換えアデノウイルスＤＮＡの構造を検討し、目的の構造が確認されたクローンを選択する。その２次ウイルス液を用いて、より多量の２９３細胞に感染させ、その培養液を同様に凍結融解、遠心し、３次ウイルス液を得る。３次ウイルス液について、斎藤らの方法（鐘ヶ江ら、１９９４、バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法、４３−５８頁、羊土社）により、力価を測定する。このようにして、組み換えアデノウイルスベクターを得ることができる（Ｍｉｙａｋｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、１３２０−１３２４頁；Ｋａｎｅｇａｅら、１９９６、ＡｃｔａＰａｅｄｉａｔｒ．Ｊｐｎ、３８巻、１８２−１８８頁）。
他にも、例えばレトロウイルスベクター（脇本ら、１９９５、蛋白質核酸酵素、４０巻、２５０８−２５１３頁）、アデノ随伴ウイルスベクター（玉寄ら、１９９５、蛋白質核酸酵素、４０巻、２５３２−２５３８頁）などを用いることができる。これらは既に確立された方法で、効率的にベクターを生産出来ることが公知となっている。
哺乳動物に遺伝子導入可能なその他のベクターを製造するための詳細は、組換えワクシニアウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０２０６９、特公平６−９５９３７、特公平６−７１４２９が知られている。組換えパピローマウイルスを製造する方法としては特公平６−３４７２７、特表平６−５０５６２６が知られている。組換えアデノ随伴ウイルスを製造する方法としては、特開平５−３０８９７５が知られている。組換えアデノウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０８０３９が知られている。
本発明において特に好適な哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターは、パラミクソウイルスベクターである。「パラミクソウイルスベクター」とは、パラミクソウイルスに由来し遺伝子を宿主細胞に導入するベクター（担体）を指す。パラミクソウイルス科に属するセンダイウイルス（ＳｅＶ）は最近、遺伝子導入ベクターとして開発が進められている（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１６：５７８−５９８，１９９７；国際公開番号９７／１６５３８号および国際公開番号９７／１６５３９号）。ＳｅＶベクターは毒性が低く、導入した遺伝子から発現される蛋白質量が極めて高い。また、ベクター内の遺伝子が宿主染色体へ導入されることがないため、安全性にも優れている。ＳｅＶベクターのゲノムの安定性は高く、異種遺伝子発現の結果ではウイルスを連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓＣｅｌｌｓ２，４５７−４６６（１９９７））。また、カプシド構造タンパク質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）など性質上のメリットがある。複製能を有するＳｅＶベクターは、外来ＤＮＡを少なくとも４ｋｂｐまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する事が可能である。ＳｅＶのレプリコンをベースにしたベクターは複製されたウイルスが周囲の細胞にも再感染し、感染細胞の細胞質で多コピーに複製されたＲＮＰが細胞の分裂に伴い娘細胞にも分配されるため持続発現が期待される。また、ＳｅＶベクターは非常に広い組織適用範囲を持つ。
また、安全性の面においても、ヒトへの病原性が否定されているため、センダイウイルスベクターはヒトへの遺伝子治療の臨床試験に好適に用いられうることが示唆される。第一に、プラスミドＤＮＡ等による導入遺伝子の発現は、多くの場合、導入したＤＮＡの核局在化または核膜の消失が必要であることが、遺伝子発現の成功率を低下させる主要な障害になっている。しかし、例えばセンダイウイルスなどの場合、外来遺伝子の発現は、細胞質内において細胞性チューブリンおよび自身が持つＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ蛋白質）の両方によってウイルスの複製に伴って駆動される。これは、センダイウイルスが宿主の染色体と相互作用しないことを示しており、染色体異常による細胞の癌化および不死化などの安全面における問題が生じないと考えられる。第二に、センダイウイルスは齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、ヒトに対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ１５：５３３−５４０，１９９７）。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルスベクターが、ヒトの治療へ応用しうることを示唆し、センダイウイルスベクターが、インビボまたはエクスビボでの遺伝子治療における有望な選択肢の一つとなることを支持するものである。
本発明において「パラミクソウイルス」とはパラミクソウイルス科に属するウイルスまたはその誘導体を指す。本発明に用いられ得るパラミクソウイルスとしては、例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型等が挙げられる。本発明においてパラミクソウイルスは、好ましくはパラミクソ亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルス、より好ましくはレスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（パラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。本発明に用いられ得るレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウイルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などであり得る。ＤＩ粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，８４１３−８４１７（１９９４））等の不完全ウイルスや、合成したオリゴヌクレオチド等も、ウイルスベクターを製造するための材料として使用することができる。
組み換えパラミクソウイルスベクターは、ウイルスゲノムをコードするＤＮＡに適当な転写プロモーターを連結した組み換えＤＮＡを構築し、これを試験管内または細胞内で転写させ、パラミクソウイルスのＬ、Ｐ、およびＮＰタンパク質の共存下でＲＮＰを再構成させ、このＲＮＰをを含むウイルス粒子を形成させることによりベクターを生成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡからのウイルスの再構成は公知の方法に従って行うことができる（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯＪ．１６：５７８−５８７；Ｙｕ，Ｄ．ｅｔａｌ．，１９９７，ＧｅｎｅｓＣｅｌｌｓ２：４５７−４６６；国際公開９７／１６５３９号；国際公開９７／１６５３８号；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯＪ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯＪ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯＪ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔａｌ．，１９９６，ＧｅｎｅｓＣｅｌｌｓ１：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄＢａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄＥｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含む所望のパラミクソウイルスベクターおよびその他の（−）鎖ＲＮＡウイルスベクターをＤＮＡから再構成させることができる。パラミクソウイルスベクターは、通常、（ａ）パラミクソウイルスに由来するネガティブ鎖一本鎖ＲＮＡまたはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするベクターＤＮＡを、ＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞（ヘルパー細胞）で転写させ、（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収することにより調製することができる。ベクターＤＮＡから転写されたＲＮＡはＮＰ、Ｌ、およびＰタンパク質とＲＮＰ複合体を形成し、さらにエンベロープ蛋白質を含む外殻に包まれたウイルス粒子が形成する。
また本発明においてウイルスベクターには、ウイルス遺伝子を欠損したベクターも含まれる。例えばウイルスの複製に必須の遺伝子を欠損させた複製能欠損型ウイルスベクターなどであってもよい。パラミクソウイルスベクターＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子および／またはＨＮ遺伝子等を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、ウイルス産生細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。このような欠失型ウイルスベクターの製造方法も、公知の方法に従って、または順じて実施することができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。ベクターからの外来遺伝子の発現量は、例えば、その遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（国際公開番号ＷＯ０１／１８２２３）。また、ウイルスベクターは、このウイルス以外に由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウイルスベクターであってもよい。このようなエンベロープ蛋白質には、ＶＳＶ−Ｇなどが挙げられる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
回収した動物細胞感染性ウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスベクター由来の蛋白質の割合が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
ＴＡＰ阻害蛋白質、およびエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターは、哺乳動物細胞に導入することにより、該細胞で高頻度に目的のエピトープを発現させることができる。本発明は、エピトープ結合β２ｍまたはエピトープ結合ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖の製造方法であって、（ｉ）ＴＡＰ阻害蛋白質、および（ｉｉ）エピトープ結合β２ｍ若しくはエピトープ結合ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖、を発現可能にコードする（１つまたは複数の）哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程を含む方法を提供する。（ｉ）および（ｉｉ）をコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターは、別々のベクターである場合も、同一のベクターである場合も、本発明に含まれる。
また、本発明は、（ｉ）ＴＡＰ阻害蛋白質、および（ｉｉ）エピトープ結合β２ｍ若しくはエピトープ結合ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖、を発現可能にコードする（１つまたは複数の）哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターが導入された哺乳動物細胞を提供する。（ｉ）および（ｉｉ）をコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターは、別々のベクターである場合および同一のベクターである場合が本発明に含まれる。また本発明は、β２ｍにエピトープを結合させた場合には、エピトープを結合していないＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を、また、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖にエピトープを結合させた場合には、エピトープを結合していないβ２ｍを、発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターがさらに導入された上記哺乳動物細胞を提供する。このベクターは、ＴＡＰ阻害蛋白質やエピトープ結合蛋白質をコードするベクターと同一のベクターでも別々のベクターでもよい。ＴＡＰ阻害蛋白質としては、特にＵＳ６およびＩＣＰ４７が挙げられる。また哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターとしては、特にパラミクソウイルスベクターが好ましい。
本発明の方法を用いて発現させたエピトープ結合β２ｍは、インビトロにおけるＣＴＬアッセイに利用することもできる。ＣＴＬアッセイの標的細胞としては、通常ＣＴＬと同一個体由来の細胞株、例えばエプシュタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）を用いてｔｒａｎｓｆｏｒｍしたＢ細胞株（ａｕｔｏ−ｌｙｍｏｈｏｂｌａｓｔｏｉｄｃｅｌｌｌｉｎｅ，ａｕｔｏ−ＬＣＬ）を合成ペプチドでパルスしたものが用いられるが、合成ペプチドの代わりに本発明の方法により製造したエピトープ結合β２ｍを添加したり、あるいは合成ペプチドの代わりに、例えばＴＡＰ阻害蛋白質とエピトープ結合β２ｍを発現するウイルスベクターをａｕｔｏ−ＬＣＬに感染させることによって標的細胞として使用することができる。またヒトの細胞株を使用する場合、例えばＴＡＰ阻害蛋白質を発現するベクター、および目的のＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖（膜結合型）を発現するウイルスベクターとそのＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖によって提示されるエピトープ結合β２ｍとを発現するウイルスベクターを多重感染させることによって同様に標的細胞として使用することができる。
また、本発明の方法を用いて製造されたエピトープ結合β２ｍはエピトープ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の樹立に使用することができる。エピトープ特異的ＣＴＬは、試験管内で１回〜数回特異的な刺激を加えることによって樹立できる。例えばＨＩＶＮｅｆ１３８−１０特異的ＣＴＬを樹立する場合、ＨＩＶ−１感染者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、放射線照射によって増殖不能にしＨＩＶＮｅｆ１３８−１０ペプチドでパルスしたｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（同一個体由来の細胞）で刺激を加え、ＩＬ−２存在下で共培養することによって可能となる。この時、通常合成ペプチドを使用するが、エピトープ結合β２ｍを発現するウイルスベクターを感染させた細胞の培養上清（すなわち遊離型エピトープ結合β２ｍ蛋白質）でも同様の効果が見られる。また、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞に例えばＴＡＰ阻害蛋白質とエピトープ結合β２ｍとを発現するウイルスベクターを感染させることによっても同様にＣＴＬを樹立できる。
本発明の方法により得られるエピトープ結合β２ｍは、抗原特異的細胞性免疫を誘導するために使用することができる。すなわち、本発明により得られるエピトープ結合β２ｍは、抗原特異的細胞性免疫の誘導剤となる。本発明により得られるエピトープ結合β２ｍは、抗原特異的細胞性免疫を誘導するために使用できる。
また、ＳｅＶの発現系にて発現したエピトープ結合β２ｍは、これが分泌型蛋白質の形で細胞表面上のＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子と結合し、ＣＴＬに効率良く抗原を提示できる。本発明の方法を用いて製造されるエピトープ結合β２ｍはタンパク製剤として利用することが可能であり、これを精製しウイルスの混入を除去すれば、臨床応用に有用な抗原特異的細胞性免疫誘導剤を得ることができる。本発明の方法を用いて産生されるエピトープ結合β２ｍは医薬組成物として有用である。
例えば、エピトープ結合β２ｍを用いて抗原特異的細胞性免疫を誘導する方法は、具体的には、エピトープ結合β２ｍを（エピトープ特異的）ＣＤ８陽性Ｔ細胞に接触させる工程を含む方法により実施することができる。
例えば、インビトロでのエピトープ特異的ＣＴＬ細胞株の樹立において、エピトープ結合β２ｍは有用である。エピトープ特異的ＣＴＬは、試験管内で１回〜数回特異的な刺激を加えることによって樹立できる。例えばＨＩＶＮｅｆ１３８−１０特異的ＣＴＬを樹立する場合、ＨＩＶ−１感染者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、放射線照射によって増殖不能にし、ＨＩＶＮｅｆ１３８−１０ペプチドでパルスしたｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（同一個体由来の細胞）で刺激を加え、ＩＬ−２存在下で共培養することによって実施することができる。この時、通常合成ペプチドを使用するが、例えば本発明の方法で製造したエピトープ結合β２ｍを添加しても同様の効果が得られる。
また、エピトープ結合β２ｍは、インビトロでのＣＴＬアッセイの標的細胞のパルスに有用である。ＣＴＬアッセイの標的細胞をパルスする際、合成ペプチドの代わりに本発明の方法で製造したエピトープ結合β２ｍを添加しても同様の効果が得られる。通常は細胞表面上に、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖（膜結合型）＋β２ｍ＋ペプチドが既に発現している。ペプチドのパルスは、ペプチド部分の入れ替えを狙ったやり方であるが、エピトープ結合β２ｍを用いることにより、高い効率でβ２ｍ＋ペプチドとの入れ替えが行われるものと考えられる。既存のエピトープペプチドは、酸処理で除去することができる。
また、エクスビボで患者樹状細胞へパルスする際にもエピトープ結合β２ｍは有用である。患者の末梢血単核球を採取し、スタンダードな方法で樹状細胞へと分化を誘導する。例えばエピトープ結合β２ｍとＴＡＰ阻害蛋白質を発現するウイルスベクターを導入した樹状細胞を患者の皮下に接種する。インビトロの項と同様に、細胞表面でＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖＋エピトープ結合β２ｍの形で発現し、エピトープ特異的ＣＴＬを誘導できることが期待される。樹状細胞をペプチドでパルスした場合より、エピトープがＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖上に長期間、安定に、さらに高密度に発現する可能性があり、細胞性ワクチン（治療ワクチン）として期待できる。
エピトープ結合β２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターは、ＴＡＰ阻害剤またはＴＡＰ阻害蛋白質を発現可能なベクターと組み合わせて抗原特異的細胞性免疫を誘導するために使用することができる。本発明は、（ｉ）ＴＡＰ阻害剤またはＴＡＰ阻害剤を発現可能にコードするベクター、および（ｉｉ）（ａ）エピトープ結合β２ｍ若しくはエピトープ結合ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖または（ｂ）エピトープ結合β２ｍ若しくはエピトープ結合ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を発現可能にコードするベクターを含む組成物に関する。ベクターは、適宜薬学的に許容される溶液中に懸濁させることができる。例えば、ベクターは生理食塩水、培養液、または血清中に含まれていてよい。該組成物は、ＭＨＣｃｌａｓｓＩによる外来エピトープの提示の増強剤として有用である。また該組成物は、抗原特異的細胞性免疫の誘導剤として有用である。ＴＡＰ阻害蛋白質をコードするベクターと、エピトープ結合β２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖をコードするベクターは、別々のベクターであってもよく、あるいは同一ベクター内にコードされていてもよい。すなわち、ＴＡＰ阻害剤を発現可能にコードするベクターとエピトープ結合β２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を発現可能にコードするベクターとが同一のベクターである場合も本発明に含まれる。また本発明は、（ｉ）ＴＡＰ阻害剤またはＴＡＰ阻害剤を発現可能にコードするベクター、および（ｉｉ）エピトープ結合β２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープ結合β２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を発現可能にコードするベクターの、ＭＨＣｃｌａｓｓＩによる外来エピトープの提示を増強するための使用、および抗原特異的細胞性免疫を誘導するための使用に関する。このようなウイルスベクターは、遺伝子治療のために有用である。本発明は、（ｉ）ＴＡＰ阻害剤またはＴＡＰ阻害剤を発現可能にコードするベクター、および（ｉｉ）エピトープ結合β２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープ結合β２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を発現可能にコードするベクターを含む医薬組成物を提供する。また、本発明は（ｉ）ＴＡＰ阻害剤または該阻害剤を発現可能なベクター、および（ｉｉ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはβ２ｍ、または該ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはβ２ｍを発現可能なベクター、を含むエピトープを提示させるためのキットに関する。（ｉ）と（ｉｉ）が分離可能である場合は、それらは分離されていてもよく、または混ぜ合わされていてもよい。キットには、複数種のＴＡＰ阻害剤または該阻害剤を発現可能なベクターが含まれていてもよく、また複数種のＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはβ２ｍ、または該ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはβ２ｍを発現可能なベクターが含まれていてもよい。これらは適宜、薬学的に許容される溶液に溶解または懸濁されていてよい。ベクターとしては、特に動物細胞感染性ウイルスベクターが好ましい。ベクターを含む本発明の組成物およびキットは、抗原特異的細胞性免疫を誘導できるため、感染症や癌などにおいて抗原特異的免疫を誘導するために有用である。本発明の組成物またはキットの遺伝子治療への応用としては、直接（インビボ）投与による遺伝子発現、間接（エクスビボ）投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても投与することができる。
例えば、インビトロでのエピトープ特異的ＣＴＬ細胞株の樹立において、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞での刺激において合成ペプチドを使用する代わりに上記組成物またはキットを適用することによってＣＴＬを樹立できる。
また、インビトロでＣＴＬアッセイの標的細胞のパルスにおいて使用することもできる。合成ペプチドの代わりに例えばＴＡＰ阻害下でエピトープ結合β２ｍ発現ウイルスベクターをａｕｔｏ−ＬＣＬに感染させることによって標的細胞として使用することができ、細胞傷害活性を検出することができる。またヒトの細胞株を使用する場合、目的のＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖（膜結合型）を発現するウイルスベクターと、そのＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖によって提示されるエピトープ結合β２ｍおよびＴＡＰ阻害蛋白質を発現するウイルスベクターとを重感染させることによって同様に標的細胞として使用することができる。
さらに本発明の組成物およびキットは、エクスビボで患者樹状細胞でのエピトープ発現にも有用である。患者の末梢血単核球を採取し、スタンダードな方法で樹状細胞へと分化を誘導する。この樹状細胞に本発明の組成物を投与してその細胞を患者の皮下に接種する。特にウイルスベクターを用いた遺伝子導入を行うことが好ましい。ペプチドやエピトープ結合β２ｍ蛋白などでパルスしても、樹状細胞上でどれくらいの期間持続発現されるかが問題となりうる。実際にペプチドパルスでは、樹状細胞上でのエピトープは発現が短期間で消失することが指摘されている。その点ウイルスベクターを感染させ、細胞内からエピトープ結合β２ｍを発現させれば、長期にわたってエピトープ結合β２ｍを発現させることができる。さらに、インビボでの投与によりエピトープ特異的ＣＴＬを誘導するインビボ遺伝子治療にも本発明の組成物およびキットは有用である。
外来エピトープを発現させるための遺伝子導入の標的となる細胞は、好ましくは抗原提示能を有する細胞である。このような細胞としては、特に樹状細胞（ＤＣ）が挙げられる。例えば、エクスビボにおいて、樹状細胞に、本発明の方法を用いて外来エピトープ結合β２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を発現するベクターを導入することによって、該細胞において所望のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を高頻度で形成させることができる。この細胞を用いて、抗原特異的Ｔ細胞を活性化することができる。エピトープ結合β２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖をコードする遺伝子が外来的に導入され、かつＴＡＰ活性が阻害された哺乳動物細胞は本発明に含まれる。哺乳動物細胞としては、抗原提示能を有する所望の単離細胞等を用いることができる。特に、該細胞において、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体のうちエピトープを結合させていないサブユニットをコードする遺伝子も外来的に導入することにより、大量のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を形成させることができる。これらの導入遺伝子は染色体外に存在する発現ベクターにコードされていてもよく、また細胞の染色体に組み込まれていてもよい。膜結合型ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を発現させれば、該細胞表面に膜結合型ＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が発現する。この細胞は、エピトープ特異的ＣＴＬに対して優れた抗原提示能を有する。上記のエピトープ結合β２ｍ若しくはエピトープ結合ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖をコードする遺伝子が外来的に導入され、かつＴＡＰ活性が阻害された哺乳動物細胞は、医薬組成物の成分としても有用である。
本発明における組成物は、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わされていてよい。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、細胞に投与することが可能であり、有効成分の活性を有意に阻害しない材料である。例えば本発明において組成物は、生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などを含み得る。鶏卵で増殖させたパラミクソウイルスベクターを含む組成物等においては尿液を含んでよい。また細胞を含む組成物は生理食塩水、ＰＢＳ、または培養液などに懸濁してもよい。また本発明の組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。本発明の組成物は試薬として、および医薬として有用である。また本発明の組成物はワクチンとして有用である。本発明は、本発明における組成物の試薬、医薬、またはワクチンとしての使用にも関する。ワクチン組成物は、免疫原性を高めるために、サイトカイン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を添加することもできる。またワクチンには、ミョウバン、不完全Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバント、ＭＦ５９（オイルエマルジョン）、ＭＴＰ−ＰＥ（マイコバクテリア細胞壁由来のｍｕｒａｍｙｌｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ）、およびＱＳ−２１（ｓｏａｐｂａｒｋｔｒｅｅＱｕｉｌａｊａｓａｐｏｎａｒｉａ由来）などのアジュバントを組み合わせることもできる。
また、本発明の医薬組成物の投与に際しては、アジュバント効果を高めるサイトカイン類を組み合わせることも有効である。このような遺伝子としては、例えばｉ）ＩＬ−２と一本鎖ＩＬ−１２との組み合わせ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６（１５）：８５９１−８５９６，１９９９）、ｉｉ）ＩＬ−２とインターフェロン−γ（米国特許第５，７９８，１００号）、ｉｉｉ）単独で用いられる顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ｉｖ）脳腫瘍を治療対象としたＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の組み合わせ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ９０（６），１１１５−１１２４（１９９９））などが挙げられる。
ワクチンとして用いる場合、例えば腫瘍、感染症、およびその他の一般的な疾患に対して適用することができる。感染症の治療としては、例えば感染性微生物の抗原蛋白のエピトープを解析し、これを結合させたβ２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を製造することができる。抗原蛋白としては、例えばインフルエンザにおいては、強毒株Ｈ５Ｎ１型等のエンベロープ、日本脳炎においては、例えばエンベロープ蛋白質（Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１５−１６，１８６９−１８８２（１９９９））、エイズにおいては、例えばＨＩＶｇａｇまたはＳＩＶｇａｇ蛋白質（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００）ｖｏｌ．１６４，４９６８−４９７８）、ＨＩＶエンベロープ蛋白質、Ｎｅｆ蛋白質、その他のウイルス蛋白質などが挙げられる。コレラにおいては、例えばコレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）（ＡｒａｋａｗａＴ，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６（１０）：９３４−８、ＡｒａｋａｗａＴ，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６（３）：２９２−７）、狂犬病においては、例えば狂犬病ウイルスの糖タンパク（ＬｏｄｍｅｌｌＤＬｅｔａｌ．，１９９８，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ４（８）：９４９−５２）、子宮頚癌においては、ヒトパピローマウイルス６型のカプシドタンパクＬ１（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ，６０，２００−２０４（２０００））などが挙げられる。また、病原性のパラミクソウイルス、例えば、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルスのようなワクチンの必要性の高いウイルスに本発明を適用することもできる。また、日本脳炎のＪＥ−Ｅ抗原タンパク質（特開昭６４−７４９８２、特開平１−２８５４９８）、ヒト単純ヘルペスウイルスのｇＤ２タンパク質（特開平５−２５２９６５）、Ｃ型肝炎ウイルス由来ポリペプチド（特開平５−１９２１６０）、偽狂犬病ウイルス由来ポリペプチド（特表平７−５０２１７３）などにおけるエピトープを用いることもできる。例えば、これらの病原性微生物に感染した患者由来の細胞を解析して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）において提示された抗原蛋白のエピトープを同定する。ＨＬＡ型を適宜選択することにより、所望のＨＬＡ型に対するエピトープを同定することが可能である。
腫瘍特異的抗原に着目し、それらを標的とした多角的な新しい治療戦略や治療法の開発を行うことには腫瘍治療の上で臨床的意義がある。例えば腫瘍治療としては、腫瘍細胞、またはＤＣ細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）にエピトープ結合β２ｍ若しくはＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖を発現させたり、エピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体等の蛋白質製剤を投与することができる。
一般的な手法としては、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）への抗原提示能を持つことが知られている樹状細胞（ＤＣ）が、ＣＴＬに対してもＭＨＣクラスＩ分子を介して高い抗原提示能を有することが知られており、これを用いたワクチン療法の開発が挙げられる（Ｊ．Ｉ．Ｍａｙｏｒｄｏｍｏｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．１（１２），１２７９−１３０２，（１９９５））。腫瘍免疫療法の一例としては、種々の悪性腫瘍にも発現が認められるＭＡＧＥ抗原を標的とした腫瘍ワクチン療法の確立が藤也寸志ら（国立病院九州がんセンター）により進められている。再発胃腫瘍症例６例、再発食道腫瘍１例の７例に対し治療を施行したところ、食道腫瘍症例で転移リンパ節の縮小、腫瘍マーカーの減少および臨床症状（嗄声）の改善が認められ、胃腫瘍症例では６例中４例で腫瘍マーカーの減少を認めている。副作用は全く認められておらず、腫瘍免疫療法の安全性が示唆されている。また臨床症状の改善や腫瘍マーカーの低下が見られた症例が多く、ワクチンの投与法や適応症例の選別などにより有効な治療法となりうる可能性を示唆している。ＭＡＧＥ−３ペプチドを用いたＤＣワクチン療法は、実際に臨床試験が開始され、進行再発消化器癌症例に対する安全な腫瘍特異的免疫療法となる可能性が示唆される。しかしながら多数の患者を対象とした予防的ワクチン投与においては、″ｎａｔｕｒｅａｄｊｕｖａｎｔ″である樹状細胞を各々の患者に対して最適に調整、投与していくのは明らかに頻雑で、非現実的である。何らかの効率的方法が求められている（『山岸久一ら京都府立医科大学日本癌治療学会総会１９９９年１０月１２日（火）於岐阜市での発表』）。このような腫瘍ワクチン療法に本発明を適用することは極めて有効であると考えられる。
ウイルスが引き金となってできる腫瘍の予防は、そのウイルスのワクチンによる感染予防により達成されうる。ウイルスが原因の腫瘍は他の原因による腫瘍に比較し、確実に予防が可能となる。例えば、肝臓腫瘍に関わるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、子宮がんに関わるパピローマウイルス（ＨＰＶ）、成人性白血病の原因であるＨＴＬＶ−１につき、感染予防と治療を目的としたワクチンがあげられる。肝臓腫瘍は日本の腫瘍発症の中でも高い割合を占める。Ｃ型肝炎ウイルスは非経口的に感染し、免疫能が正常の成人であっても高率に慢性化する。感染者の約２０％は慢性肝炎、肝硬変を発症するものと考えられる。更に、肝硬変患者の多くで肝細胞癌が発症する。Ｃ型肝炎に対する治療はインターフェロンの登場により患者の一部で治癒に導くことが可能となったが、有効率は当初期待されたほどではなく、半数以上の患者に対して、いまだに有効な治療法がない現状である。一般のウイルス感染の予防は、ワクチン接種により中和抗体を誘導して行うがＣ型肝炎ウイルスは変異しやすく、現在の所、感染を終息させる中和抗体の存在は証明されていない。ウイルス感染症では中和抗体の誘導以外にＣＴＬを誘導することにより、感染予防が可能であることが知られている。本発明により、このようなケースに対してもＣＴＬ活性化を誘導できると期待される。
森山貴志（自治医科大学）らは、ＣＴＬを誘導する新しい方法として病原体抗原をコードする遺伝子そのものをワクチンとして用いる方法（ＤＮＡワクチン）を研究している。その問題点は概説書が示すとおり、発現量が十分でない、投与部位が筋肉などに限られる等がある（『ＤＮＡワクチンその現状と新知見；倉根一郎（感染症研）；今日の感染症；Ｖｏｌ．１９，ＮＯ．３ＰＡＧＥ．６−９，２０００』）。また『癌と免疫癌の特異的免疫療法ＨＥＲ２由来ペプチドによる乳癌のワクチン療法；影山慎一，渡辺正人，日浅厚則，珠玖洋（三重大医）；現代医療；Ｖｏｌ．３２，ＮＯ．５ＰＡＧＥ．１１６７−１１７２２０００』では乳癌などで過剰発現が認められているチロシンキナーゼ活性を持つ膜型糖蛋白質ＨＥＲ２を利用した癌ワクチンについて概説されている。例えば、本発明に従いウイルスベクターを利用して癌ワクチンを製造すれば、このようなＤＮＡワクチンよりも高い効果を発揮することが期待される。哺乳動物の広範な組織で発現可能なウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクターなど）を用いてベクターを構築すれば、高い効果を有するワクチンを提供することが可能と考えられる。
子宮がんは女性のみの腫瘍であるが、ＨＰＶによる感染予防と治療ワクチンの開発の重要性は変わらない。ＨＴＬＶ−１は、母子感染が主な感染ルートと理解されるに至ったが、それ以外の感染経路もある。近年発見されたＨＧＶは病原性は明確になっていないが、ＨＣＶと共に社会に拡がっており、このようなウイルスの防疫も公衆衛生上必要であり、本発明の適用の対象となる。
抗原提示細胞の利用並びに投与経路に関する検討も重要である。最も研究されている投与経路は、樹状細胞（ＤＣ）がＣＴＬに対してもＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子を介する抗原提示能を有することを利用して、末梢血に存在する単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）を用いて試験管内でＤＣに分化させ、これを静脈内注射で体内にもどす方法を用いたワクチン療法である。この方法は相当の施設と、培養時間を必要とする方法である。最近注目される方法は皮膚を利用したワクチン療法である。ランゲルハンス細胞（ＬＣ）を含む樹状細胞は、近年その細胞上のＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子を介してウイルス抗原や癌抗原などの内在性の抗原を効率的にＣＴＬに提示することが判明し、この細胞を用いた抗ウイルスワクチン法や癌ワクチン治療法の研究が大きく注目されている。皮膚の表皮には多数のＬＣが常在しているので、皮膚へのウイルスペプチドまたは癌ペプチド、さらには抗原含有遺伝子の塗布により効果的なＤＮＡワクチン法が開発できる可能性がある。しかしながら正常皮膚でＬＣは休止状態にありＴｈやＣＴＬへの抗原提示能は低く、リンパ節内への移動性にも富まないので正常皮膚を用いてのウイルスワクチン法や癌ワクチン治療法は実現が難しい。これを解決する方法として、瀬尾尚弘、瀧川雅浩（浜松医科大学）らは皮膚最外層の角質層バリアをテープストリッピング（ＴＳ）を８〜１５回繰り返すことによって破壊し、その皮膚でＬＣが活性化し、リンパ節内へ移動し効率的にＴｈ細胞に抗原提示することを実証した（特願平１０−３１６５８５Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｐｅｐｔｉｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｖｉａｃｏｒｎｅｕｍｂａｒｒｉｅｒ−ｄｉｓｒｕｐｔｅｄｍｕｒｉｎｅｓｋｉｎｆｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｕｍｏｒｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｖｏｌ．９７Ｉｓｓｕｅ１，３７１−３７６，Ｊａｎｕａｒｙ４，２０００）。このような方法はバリア破壊皮膚へのウイルスペプチド、癌ペプチドさらには抗原ＤＮＡの適用においてウイルスワクチンまたは癌治療の可能を広げるものである。本発明においても、これらの投与方法を適用することができる。
さらに確実な臨床応用のためには、ヒトＨＬＡ拘束性癌特異的ＣＴＬ株を作製し、その認識する癌反応性ＣＴＬ誘導抗原遺伝子をクローニングし、癌患者に対して臨床応用可能な腫瘍特異的免疫療法の標的分子を開発することが重要である。対象とする患者と同じ型を持つＨＬＡにより提示されたエピトープを同定し、これを用いてワクチンベクターやペプチドワクチンを製造することにより、より効果的に免疫を誘導することが期待できる。
日本において多発する癌、例えば肺癌、消化管癌（食道、胃、大腸癌）、肝癌、頭頚部癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、腎癌及び白血病のなかでも、組織型としてはそれらの大部分を占める扁平上皮癌及び腺癌を治療ターゲットする事は臨床上有益である。上皮性癌は日本における成人悪性腫瘍の大半を占めるのみならず、世界にも最も頻発する癌である。よって、上皮性癌細胞特異的抗原のエピトープは、本発明において好適に用いられる。またＨＬＡとしては日本でも発現頻度の高いＨＬＡ−Ａ２４（癌患者の約６割）、ＨＬＡ−Ａ２（約４割）、及びＨＬＡ−Ａ２６（約２割）抗原拘束性のＣＴＬ認識性癌退縮抗原の同定が特に重要である。次いで、ＨＬＡ−Ａ１１（２割）、−Ａ３１（２割弱）、−Ａ３３（２割弱）を対象とする同定も重要である。日本人の９５％以上は少なくともＨＬＡ−Ａ２４、−Ａ２、−Ａ２６、−Ａ３１、−Ａ３３のいずれか一方を保有する。また上記ＨＬＡアレールは人種をこえて広く認められる。したがってこれらのタイプのＨＬＡを持つ細胞から癌反応性ＣＴＬ誘導抗原遺伝子を同定し、これを本発明に適用することが好ましい。
伊東恭悟（久留米大医）らは日本人に多発するヒトＨＬＡ−クラス・拘束性上皮癌（腺癌及び扁平上皮癌）に対する特異的キラーＴ細胞を多数樹立し、それらの認識する上皮癌反応性ＣＴＬ誘導能をもつ抗原遺伝子をすでにクローニングしている。さらに同遺伝子によりコードされる癌抗原ペプチドを同定し、同ペプチドによるインビトロにおけるキラーＴ細胞誘導能の解析が行われている（食道癌患者自己ＣＴＬ癌局注による特異的養子免疫療法後の末梢血リンパ球に対するクローニングとその解析：唐宇飛，山名秀明，末吉晋，新谷文彦，田中寿明，久保田雅博，峯孝志，笹原弘子，伊東恭悟（久留米大）；日本消化器外科学会雑誌；Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．７，Ｐａｇｅ１１９１，２０００）。これまでのところ扁平上皮癌ｃＤＮＡライブラリーより４種類の遺伝子（ＳＡＲＴ−１〜ＳＡＲＴ−４）、腺癌ｃＤＮＡライブラリーより３種類の遺伝子がクローニングされ、それらをコードする蛋白が解析されている。ＳＡＲＴ−１遺伝子導入した癌細胞は選択的アポトーシスを誘導した。またＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチド（ＳＡＲＴ−１６９０−６９８）が強いＣＴＬ誘導およびＨＬＡ−Ａ２６拘束性ペプチドＳＡＲＴ−１７３６−７４４によるＨＬＡ−Ａ２６０１、−Ａ２６０２、−Ａ２６０３癌患者ＣＴＬ誘導が確認されている（『腫ようの抗原ペプチド療法ＳＡＲＴ−１抗原ペプチドを用いた癌ワクチン療法；山名秀明，伊東恭悟（久留米大医）；医学のあゆみ；Ｖｏｌ．１９０，ＮＯ．２ＰＡＧＥ．１２９−１３３１９９９』、『ＳＡＲＴ１ペプチドによるサブタイプの異なるＨＬＡ−Ａ２６陽性健康人及び癌患者末梢血リンパ球からのＣＴＬの誘導；井上佳子（国立腫瘍セ研）；中尾真修，松永和子，増岡・菊地慈，山名秀明，伊東恭悟（久留米大医）；日本癌学会総会記事』）。さらにＳＡＲＴ−３癌反応性ＣＴＬ誘導抗原遺伝子：１４０ｋＤのＳＡＲＴ−３抗原が増殖細胞に選択的に発現し、かつ癌細胞に限って核内にも発現し、同抗原内にＨＬＡ−Ａ２４＋癌患者リンパ球よりＣＴＬ誘導能を有する２つの９個のアミノ酸からなるペプチド（ｎｏｎａｐｅｐｔｉｄｅ）が同定されている（『転移性癌患者におけるＨＬＡ−Ａ２４拘束性ｌｃｋ由来ペプチドを用いた細胞傷害性Ｔ細胞の誘導と機能解析；山名秀明，笹富輝男，宮城佳昭，唐宇飛，白水和雄，伊東恭悟（久留米大医）；日本外科学会雑誌；Ｖｏｌ．１０１，臨時増刊号ＰＡＧＥ．４１７２０００』）。これらの癌反応性ＣＴＬ誘導抗原の各種癌における蛋白レベルでの発現はＳＡＲＴ−１抗原は扁平上皮癌の６０〜８０％、乳癌を除く腺癌の４０〜５０％に発現していた。またＳＡＲＴ−２は扁平上皮癌の６０％以上に、ＳＡＲＴ−３は腺癌、扁平上皮癌を含む大部分の悪性腫瘍で発現していた。これに対し、これらの抗原は正常組織には睾丸を除き発現されていない（腫よう免疫９ヒト癌特異的キラーＴ細胞により認識される抗原２へん平上皮癌反応性ＣＴＬ誘導抗原ＳＡＲＴ−１およびペプチドワクチン；伊東恭悟，七条茂樹，山名秀明（久留米大医）；免疫ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＦｒｏｎｔｉｅｒ；Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．３，Ｐａｇｅ１９５−２０４，１９９９）。ＨＬＡ−Ａ２６は日本人の２２％、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２は日本人の約６０％が保有している。これらより、日本における多くの上皮性癌患者に対してこれらのペプチドワクチンは応用可能と考えられている。現在久留米大学において上記ペプチドを用いての第１相臨床試験が計画されている（臨床ガイドライン解説第１回腫瘍ペプチドワクチン臨床試験のガイドラインについての提案；山名秀明，伊東恭悟（久留米大医）；分子細胞治療；Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１，Ｐａｇｅ８９−９５，２０００）。これらの抗原蛋白質に由来するエピトープに本発明を適用することは有効であると考えられる。
以上に記載したペプチド抗原をコードする遺伝子を本発明に用いれば、腫瘍および病原性感染微生物等に対する有効な免疫治療を行うことが可能となる。その他のエピトープとしては、癌抗原Ｍｕｃ−１またはＭｕｃ−１様ムチンタンデムリピートペプチド（米国特許第５，７４４，１４４号）、メラノーマｇｐ１００抗原などが挙げられる。これらの遺伝子による治療は、乳癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌等、幅広い応用が示されている。また、上記に示した腫瘍抗原ペプチドＨＥＲ２遺伝子の正常組織および腫瘍での発現は、乳癌、卵巣癌、胃癌、非小細胞性肺癌において約２０から４０％の症例に遺伝子増幅または発現の増加が認められ、その発現増加は腫瘍特異性の傾向が高いと考えてよい。卵巣癌患者および健常人末梢血由来単核球より精製した樹状細胞とＨＥＲ２由来の２種の９ｍｅｒペプチド（ＨＥＲ２ｐ６３−７１、ｐ７８０−７８８）なども例示することができる（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００，３０：３３３８−３３４６）。また、ＣＥＡ陽性進行固形癌に対して、ＣＥＡエピトープペプチドを用いた癌ワクチン療法（特異能動免疫療法）に本発明の医薬組成物等を適用することも考えられる（Ｋｉｍ，Ｃ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４７（１９９８）９０−９６）。例えば、成分採血により患者より多量の末梢血単核細胞を採取した後、その単球分画からＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ添加下に樹状細胞（ＤＣ）を誘導、誘導されたＤＣに本発明の方法を用いて製造したＣＥＡペプチドのエピトープを含むβ２ｍあるいはベクターを導入し、″ＤＣワクチン″として皮内投与することが考えられる（ＣＥＡ特異的能動免疫療法により血清ＣＥＡ値と抗腫よう効果に解離を認めた肺癌骨転移の一例；清水啓二，上田祐二，伊藤剛，岡本和真，白数積雄，阪倉長平，大辻英吾，北村和也，山岸久一（京都府医大）；日本臨床外科学会雑誌）。
また、一般病への適用も考えられる。糖尿病においては、例えばＩ型糖尿病モデル動物において、インシュリン断片のペプチドをエピトープとして利用することが考えられる（Ｃｏｏｎ，Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９９，１０４（２）：１８９−９４）。
本発明の組成物をワクチンとして用いる場合、抗原特異的細胞性免疫を少なくとも部分的に誘導するのに十分な量を投与される。但し、投与蛋白質量、または導入遺伝子の発現量は、その有効レベルおよび中毒レベルを考慮して決められるべきである。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、または皮下等に行われうるがそれらに限定されない。また局所あるいは全身に投与し得る。細胞性免疫の誘導は、本発明に記載したようなＣＴＬアッセイ等により検出することができる。
ベクターを含む組成物の投与により細胞に導入された遺伝子の発現量は、当業者に公知の方法によりアッセイすることが可能である。遺伝子の転写産物は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡプロテクションアッセイ等により検出・定量することができる。ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ等による検出はｉｎｓｉｔｕでも行い得る。また、翻訳産物を検出するには、抗体を用いたウェスタンブロット、免疫沈降、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、プルダウンアッセイ等により行うことができる。また、導入遺伝子発現の検出を容易にするため、発現させる蛋白質にタグを付加したり、レポーター遺伝子を発現するようにベクター中に組み込んでおくことも可能である。レポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、アルカリホスファターゼ、またはＧＦＰをコードする遺伝子等が挙げられるがこれらに制限されない。
エピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体などの蛋白質組成物の投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。例えば、蛋白質量として、１０ｎｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇ、好ましくは１００ｎｇ／ｋｇから５０μｇ／ｋｇ、より好ましくは１μｇ／ｋｇから５μｇ／ｋｇの範囲であるとよい。複数のエピトープを組み合わせて投与する場合には、それぞれを上記の量で投与するとよい。エピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体などの蛋白質組成物は、適宜、薬学上容認可能な担体を含んでよい。
ベクター組成物の投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。パラミクソウイルスベクターであれば、投与されるベクターの濃度は好ましくは約１０^５ｐｆｕ／ｍｌから約１０^１１ｐｆｕ／ｍｌ、より好ましくは約１０^７ｐｆｕ／ｍｌから約１０^９ｐｆｕ／ｍｌ、最も好ましくは約１×１０^８ｐｆｕ／ｍｌから約５×１０^８ｐｆｕ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。投与量は、好ましくは約１０^５ｐｆｕ／回から１０^１１ｐｆｕ／回、より好ましくは約１０^７ｐｆｕ／回から１０^９ｐｆｕ／回、最も好ましくは約１０^８ｐｆｕ／回から１０^９ｐｆｕ／回で投与する。複数のベクターを組み合わせて投与する場合には、それぞれを上記の量で投与するとよい。
本発明の組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。

図１は、エピトープ結合β２ｍ（ｅ／β２ｍ）を発現するＳｅＶベクター製造用プラスミド（ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂ）の構造を示す図である。（Ａ）は、ｐＳｅＶ１８ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位にｅ／β２ｍコード配列が挿入されたｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂの構造を示す。（Ｂ）はベクターがコードするβ２ミクログロブリンおよびエピトープ結合β２ミクログロブリンの構造、（Ｃ）は挿入したＮｏｔＩ断片の配列を示す。
図２は、膜結合型ＨＬＡＡ＊２４０２を発現するＳｅＶベクター製造用プラスミド（Ａ２４ｆｕｌｌ／ｐＳｅＶｂ）の構造を示す図である。（Ａ）は、ｐＳｅＶ１８ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位にＡ２４ｆｕｌｌのコード配列が挿入されたＡ２４ｆｕｌｌ／ｐＳｅＶｂの構造を示す。（Ｂ）は挿入したＮｏｔＩ断片の配列を示す。
図３は、ＴＡＰ阻害因子を発現するＳｅＶベクター製造用プラスミドの構造を示す図である。（Ａ）は、ｐＳｅＶ１８ｃ（＋）のＮｏｔＩ部位（Ｎ遺伝子とＰ遺伝子の間）にＩＣＰ４７ｈｉｓまたはＵＳ６ｈｉｓＡ２４ｆｕｌｌのコード配列が挿入された、それぞれＩＣＰ４７ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃおよびＵＳ６ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃの構造の構造を示す。（Ｂ）は挿入したＮｏｔＩ断片の配列を示す。
図４は、エピトープ結合β２ｍ（ｅ／β２ｍ）およびＴＡＰ阻害蛋白質（ＩＣＰ４７ｈｉｓまたはＵＳ６ｈｉｓ）を共発現するＳｅＶベクターの構造を示す図である。ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂとＩＣＰ４７ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃから〈ｅ／β２ｍ＋ＩＣＰ４７ｈｉｓ〉／ｐＳｅＶを、ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂとＵＳ６ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃから〈ｅ／β２ｍ＋ＵＳ６ｈｉｓ〉／ｐＳｅＶを構築した。
図５は、膜発現型ＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の効果を示す図である。Ｈ９細胞（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２−ヒトＴ細胞株）にＡ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂおよびｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂをそれぞれｍ．ｏ．ｉ．＝１０および２で感染した（図中″Ａ２４ｆｕｌｌ＋ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ″）。陰性コントロールとしてｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂの代わりにｗｔ／ＳｅＶを感染したものを用いた（図中″Ａ２４ｆｕｌｌ＋ｗｔ″）。また比較としてペプチドをパルスする実験も行った（図中″Ａ２４ｆｕｌｌ＋ｗｔペプチドパルス（１０μｌ）″）。１８時間後１００μＣｉのＮａ_２ ^５１ＣｒＯ_４で２時間ラベルしＮｅｆ１３８−１０特異的ＣＴＬクローンを用いて^５１Ｃｒ放出アッセイを行った。（Ａ）はアッセイの手順を、（Ｂ）はその結果を示す。
図６は、分泌型エピトープ結合β２ｍの効果を示す図である。Ｈ９細胞（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２−ヒトＴ細胞株）にｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂまたは対照群としてｗｔ／ＳｅＶをｍ．ｏ．ｉ．＝２で重感染させ、３日後に培養上清を回収し０．２２μｍのフィルターを用いて濾過した。
標的細胞としてＨ９細胞（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２−ヒトＴ細胞株）にＡ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂおよびｗｔ／ＳｅＶをそれぞれｍ．ｏ．ｉ．＝１０および２で重感染した。ＳｅＶ感染後、１８時間経過した標的細胞を１００μＣｉのＮａ_２ ^５１ＣｒＯ_４で２時間ラベルした。その後、上記のように調製したｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍを含む培養上清（黒四角）、もしくは陽性コントロールとして１０μＭＮｅｆ１３８−１０合成ペプチド（黒菱形）、陰性コントロールとしてｗｔ／ＳｅＶ感染細胞培養上清（白丸）をパルスした。１時間後、Ｎｅｆ１３８−１０特異的ＣＴＬクローンを用いて^５１Ｃｒ放出アッセイを行った。比較としてＡ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂおよびｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂをそれぞれｍ．ｏ．ｉ．＝１０および２で重感染したＨ９細胞も同様にアッセイした（黒丸）。（Ａ）はアッセイの手順を、（Ｂ）はその結果を示す。
図７は、ＴＡＰ阻害蛋白質を発現するＳｅＶベクターの導入による細胞表面上のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の減少を示す図である。ＩＣＰ４７ｈｉｓ／ＳｅＶｃまたはＵＳ６ｈｉｓ／ＳｅＶｃをＨ９細胞にｍ．ｏ．ｉ．３で感染させ、１８，２４，３０，４２時間後に細胞を回収し、抗ＭＨＣｃｌａｓｓＩ抗体にて染色し、細胞表面のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現量をフローサイトメトリーにて解析した（Ａ）。パネル（Ｂ）中の数値はＭ．Ｆ．Ｉ．（ＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＩｎｔｅｎｓｉｔｙ、平均蛍光強度）を表す。また、点線はアイソタイプコントロール、実線は野生型ＳｅＶを感染させたものを表す（以下図８、９、１１も同じ）。ＴＡＰ阻害蛋白質の発現により、新規のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の膜表面の発現が阻害され、時間の経過とともにＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が減少した。しかしながら既存のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体には影響をおよぼさないので、減少のレベルは少ない。
図８は、既存のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体への酸処理の効果を示す図である。ＭＴ−２細胞を酸処理の後、１，３，６時間後に抗ＭＨＣｃｌａｓｓＩ抗体にて染色し、細胞表面のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現量をフローサイトメトリーにて解析した（Ａ）。酸処理により細胞膜表面のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体上のペプチドが剥がれ、細胞表面上のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体は減少した（Ｂ）。その後６時間程度でほぼ酸処理前と同程度まで細胞膜上のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現量が回復した。
図９は、酸処理およびＴＡＰ阻害蛋白質を発現するＳｅＶベクターの導入によるＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現の抑制効果を示す図である。ＭＴ−２細胞にＩＣＰ４７ｈｉｓ／ＳｅＶｃまたはＵＳ６ｈｉｓ／ＳｅＶｃをｍ．ｏ．ｉ．３で感染させ、１４時間後に酸処理を行い、その６時間後に抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体にて染色し、細胞膜表面のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現量をフローサイトメトリーにて解析した（Ａ）。酸処理により既存のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が除去され、さらにＴＡＰ阻害蛋白質によって新規のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の細胞表面への発現が抑制された結果、酸処理から６時間後も細胞表面のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現量は低いままであった（Ｂ）。
図１０は、エピトープ結合β２ｍおよびＴＡＰ阻害蛋白質を共発現するＳｅＶベクターの細胞への導入、細胞内での両蛋白質の発現を示す写真である。（Ａ）は抗（Ｈｉｓ）_６抗体、（Ｂ）は抗β２ｍ抗体を用いた。〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＵＳ６ｈｉｓ〉／ＳｅＶ感染細胞においてｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍおよびＵＳ６ｈｉｓが発現していることが示されている。レーンＭ：サイズマーカー、レーン１：〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＵＳ６ｈｉｓ〉／ＳｅＶ、レーン２：ＵＳ６ｈｉｓ／ＳｅＶｃ、レーン３：ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂ、レーン４：ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｃ、レーン５：ｗｔ（野生型）ＳｅＶ。
図１１は、エピトープ結合β２ｍおよびＴＡＰ阻害蛋白質を共発現するＳｅＶベクターの導入によるエピトープ結合β２ｍを結合したＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現を示した図である。（Ａ）はアッセイの手順、（Ｂ）はその結果を示す。ＩＣＰ４７ｈｉｓまたはＵＳ６ｈｉｓのみを発現するＳｅＶベクター（それぞれ〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＩＣＰ４７ｈｉｓ〉／ＳｅＶまたは〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＵＳ６ｈｉｓ〉／ＳｅＶ）を用いて導入した細胞では酸処理の６時間後も細胞表面上のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体は減少したままであるが、ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍとＩＣＰ４７ｈｉｓまたはＵＳ６ｈｉｓとを共発現するＳｅＶベクターを導入した細胞では酸処理の６時間後に酸処理前のレベルまで細胞表面上のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現量が回復していることを示している。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子およびヒトβ２ｍ遺伝子の単離
ヒトのＭＨＣｃｌａｓｓＩの１つであるＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子、およびヒトβ２ｍ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ２４を持つ健常人末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）よりクローニングした。ｍＲＮＡの分離にはＭｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ｃＤＮＡ合成にはＡＭＶ−ＲＴＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（ＬＩＦＥＳＣＩＥＮＣＥ）を用いた。
得られたｃＤＮＡを鋳型にしてＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子はプライマーＨＬＡ−５Ｐ２，ＨＬＡ−３Ｂを用いて、β２ｍ遺伝子はｂ２ｍ−５’，ｂ２ｍ−３’を用いてＰＣＲにより増幅した。

ＰＣＲは９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃１分、３５サイクルの後、７２℃７分で伸長反応を行った。ＰＣＲはＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてクローニングし（それぞれＡ＊２４０２／ｐＧＥＭおよびβ２ｍ／ｐＧＥＭとした）、塩基配列をシークエンス反応にて確認した。シークエンス反応はｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｇ−ＤｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎｋｉｔ；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＡＢＩ−３７７ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒにて電気泳動を行った。
［実施例２］エピトープ結合β２ｍ発現ベクターの作製
以下のようにして、エピトープ結合β２ｍを発現するＳｅＶベクターをコードするプラスミド（ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂ）を構築した。β２ｍのシグナル配列の下流への各エピトープ、リンカーの挿入、センダイウイルスのＥ，Ｓシグナル、ＮｏｔＩ部位の付加はＰＣＲ法によって行った（図１）。リンカーのアミノ酸配列は、ＧＧＧＳ（配列番号：１）が３回繰り返した配列（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ／配列番号：１１）となるようにした。
使用したプライマー；

β２ｍ／ｐＧＥＭを鋳型にｅ／ｂ２ｍ−ａ１，ｂ２ｍ−ｄを用いて９４℃１分、４８℃１分、７２℃１分、にて１５サイクル行った後、７２℃７分にて伸長反応を行った。得られたＰＣＲ産物を鋳型としてｅ（Ｎｅｆ）−ａ２，あるいはｅ（Ｅｎｖ）−ａ２とｂ２ｍ−ｄとを用いて同条件にてＰＣＲを、さらにそのＰＣＲ産物を鋳型としてｅ／ｂ２ｍ−ａ３とｂ２ｍ−ｄとを用いて同条件にてＰＣＲを行い、それぞれｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ，ｅ／Ｅｎｖ５８４−β２ｍ断片を得た。ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ，ｅ／Ｅｎｖ５８４−β２ｍ断片を、それぞれｐＧＥＭ−Ｔｖｅｔｏｒｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてクローニングし、塩基配列をシークエンス反応にて確認した。塩基配列確認後ＮｏｔＩにて消化し、ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）のＮｏｔＩ切断部位に挿入し、再度塩基配列を確認しｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ｐＳｅＶｂ，ｅ／Ｅｎｖ５８４−β２ｍ／ｐＳｅＶｂを得た（「ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂ」と総称する）。また、本来のβ２ｍのみを発現するセンダイウイルスβ２ｍ／ｐＳｅＶｂはｂ２ｍ−ａ（５’−ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＡＣＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡ−３’／配列番号：１７）とｂ２ｍ−ｄとを用いて上記と同様にβ２ｍ／ｐＳｅＶｂを得た。Ｎｅｆのエピトープ（Ｎｅｆ１３８−１０）のアミノ酸配列を配列番号：２１に、Ｅｎｖのエピトープ（Ｅｎｖ５８４−１１）のアミノ酸配列を配列番号：２３に示す。
［実施例３］膜結合型ＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖発現ベクターの作製
センダイウイルスＥ，Ｓシグナル、ＮｏｔＩ部位の付加はＰＣＲにて行った（図２）。
使用したプライマー；

Ａ＊２４０２／ｐＧＥＭを鋳型としてＡ２４−ａ＃，Ａ２４−ｄ４を用い９４℃１分、４８℃１分、７２℃１分、にて１５サイクル行った後、７２℃７分にて伸長反応を行い、Ａ２４ｆｕｌｌ断片を得た。以下ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂ作製時と同様にＡ２４ｆｕｌｌ／ｐＳｅＶｂを得た。
［実施例４］ＩＣＰ４７発現ベクターおよびＩＣＰ４７／エピトープ共発現ベクターの作製
単純ヘルペス１型ウイルス（ＨＳＶ−１）由来のＩＣＰ４７（ＵＳ１２）遺伝子がクローニングされているＵＳ１２／ｐＧＥＸ−５Ｘ−２は文献「ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４（４）：１７２７−１７４５（１９８６）」に記載されている。ＩＣＰ４７遺伝子断片へのヒスチヂンタグ（ｈｉｓ），センダイウイルスのＥ，Ｓシグナル、ＮｏｔＩ部位の付加はＰＣＲにて行った（図３）。
使用したプライマー；

ＵＳ１２／ｐＧＥＸ−５Ｘ−２を鋳型として用い９４℃１分４８℃１分、７２℃１分、にて１５サイクル行った後、７２℃７分にて伸長反応を行い、ＩＣＰ４７ｈｉｓ断片を得た。以下、ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶ作製時と同様にこの断片をｐＳｅＶ１８^＋ｃ（＋）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（１１）：９２３７−９２４６（１９９９））に導入してＩＣＰ４７ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃを得た。
ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ｐＳｅＶｂとＩＣＰ４７ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃをＫｐｎＩ，ＳｐｎＩＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂ）で消化し、ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ｐＳｅＶｂのｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍを含む断片（４ｋｂ）とＩＣＰ４７ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃのＩＣＰ４７ｈｉｓを含む断片（１５ｋｂ）をＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーションを行い、〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＩＣＰ４７ｈｉｓ〉／ｐＳｅＶを得た（図４）。
［実施例５］ＵＳ６発現ベクターおよびＵＳ６／エピトープ共発現ベクターの作製
ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＡＤ１６９株ウイルス液は文献「Ｃｈｅｎ，Ｚ．ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２５８（２）：２４０−２４８（１９９９）」に記載されている。ＣＭＶＡＤ１６９株ウイルス液からのＤＮＡ抽出液を鋳型としてＰＣＲ反応を行った（図３）。
使用したプライマー；

ＵＳ６−ａ，ＵＳ６ｈｉｓ−ｄ１を用い９４℃，１分、４８℃，１分、７２℃，１分、にて１５サイクル行った後、７２℃，７分にて伸長反応を行い、ＵＳ６ｈｉｓ断片を得た。以下ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂ作製時と同様にＵＳ６ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃを得た。
〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＩＣＰ４７ｈｉｓ〉／ｐＳｅＶと同様にｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ｐＳｅＶｂとＵＳ６ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃの組み換えによって〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＵＳ６ｈｉｓ〉／ｐＳｅＶを得た（図４）。
［実施例６］センダイウイルスベクターの再構成および感染
ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋），ｐＧＥＭ−Ｌ，ｐＧＥＭ−Ｐ，ｐＧＥＭ−Ｎ，ｖＴＦ７−３はＨａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯＪ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔａｌ．，１９９７，ＧｅｎｅｓＣｅｌｌｓ２：４５７−４６６に記載されている。センダイウイルスベクターの再構成は、上記文献に記載の方法に従って行った。ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ｐＳｅＶｂおよびｅ／Ｅｎｖ５８４−β２ｍ／ｐＳｅＶｂから、それぞれセンダイウイルスベクターｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂおよびｅ／Ｅｎｖ５８４−β２ｍ／ＳｅＶｂを得た（ｅ／β２ｍ／ＳｅＶｂと総称する）。またＡ２４ｆｕｌｌ／ｐＳｅＶｂからセンダイウイルスベクターＡ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂを得た。
ＩＣＰ４７ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃおよび〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＩＣＰ４７ｈｉｓ〉／ｐＳｅＶから、それぞれセンダイウイルスベクターＩＣＰ４７ｈｉｓ／ＳｅＶｃおよび〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＩＣＰ４７ｈｉｓ〉／ＳｅＶを得た。また、ＵＳ６ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃおよび〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＵＳ６ｈｉｓ〉／ｐＳｅＶから、それぞれセンダイウイルスベクターＵＳ６ｈｉｓ／ＳｅＶｃおよび〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＵＳ６ｈｉｓ〉／ＳｅＶを得た。
サルの腎臓由来細胞株ＣＶ−１およびＬＬＣＭＫ２は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）培地（Ｍ１０）にて培養した。以下のセンダイウイルスの感染においては、特に断らない限り、それぞれ記載されたｍ．ｏ．ｉ．にて組換えセンダイウイルスをＣＶ−１細胞に感染させ、無血清ＭＥＭにて三日間培養した。
［実施例７］エピトープ結合β２ｍ（ｅ／β２ｍ）の回収および定量
ｅ／β２ｍ／ＳｅＶｂまたはβ２ｍ／ＳｅＶｂ（エピトープなし）を感染させたＣＶ−１細胞の培養上清を、センダイウイルス粒子を除去するため、４０，０００×ｇで遠心し上清を回収した。
培養上清中のｅ／β２ｍの定量はサンドウィッチｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法にて行った。Ｃａｐｔｕｒｅ抗体には抗ヒトβ２ミクログロブリンモノクローナル抗体（ＤＡＣＯ）２．５μｇ／ｍｌを、ｄｅｔｅｃｔｏｒ抗体には抗ヒトβ２ミクログロブリンモノクローナル抗体パーオキシダーゼ標識（ＤＡＫＯ）５００ｎｇ／ｍｌを用い、発色にはＴＭＢパーオキシダーゼ発色キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。
標準サンプルに精製ヒトβ２ミクログロブリン（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を用いた。
［実施例８］Ｎｅｆ１３８−１０特異的ＣＴＬクローンの樹立
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２を持つＨＩＶ−１感染者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を３×１０^５／９６ｗｅｌｌずつＲ１０１００μｌで一晩培養した。次の日にｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（０．２μｇ／ｍｌＰＨＡ（ＳＩＧＭＡ）、１０％Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ−Ｔ（Ｂｉｏｔｅｓｔ）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）培地（Ｒ１０）で一晩活性化し３，０００ｒａｄにて放射線照射を行った後、１０μＭのＮｅｆ１３８−１０で１時間パルスした自己のＰＨＡ−ｂｌａｓｔ）を加え、抗ヒトＣＤ２８１μｇ／ｍｌ存在下で２週間培養した。その後１週間おきにｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（１０，０００ｒａｄで放射線照射し１０μＭＮｅｆ１３８−１０でパルスした自己のＥｐｓｔｅｉｎ−ＢａｒｒｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＢ細胞株（Ｂ−ＬＣＬ））で刺激を加えた。２〜４回刺激後、ＣＴＬ活性が確認できたらクローニングを行った。
クローニングは０．８ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞を１×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（１０，０００ｒａｄの放射線照射後、１０μＭＮｅｆ１３８−１０でパルスをした自己のＢ−ＬＣＬ）、５×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌｆｅｅｄｅｒ細胞（３，０００ｒａｄで放射線照射した健常人ＰＢＭＣ）とともに１０％Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ−Ｔ，２．５％ＰＨＡ−ｓｕｐ（健常人ＰＢＭＣ（３×１０^６／ｍｌ）を０．２μｇ／ｍｌＰＨＡで４８時間刺激した培養上清）存在下で３〜４週間培養した。
［実施例９］膜結合型ＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を形成するＳｅＶ導入細胞のＣＴＬによる認識
ＣＴＬ^５１Ｃｒ放出アッセイを以下のようにして行った。ヒトＣＤ４^＋Ｔリンパ球株Ｈ９を１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）培地（Ｒ１０）にて培養した。２×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの標的細胞（ヒトＴ細胞株Ｈ９）を１００μＣｉＮａ_２ＣｒＯ_４で２時間ラベルし、Ｒ１０にて３回洗った後、１０μＭのペプチド（Ｎｅｆ１３８−１０）で１時間パルスした。ＳｅＶベクター導入細胞を標的細胞とする場合は、ラベルの１７時間前（すなわち、エフェクター細胞を添加する２０時間前）に図５に示す組み合わせでＳｅＶベクターの感染をｍ．ｏ．ｉ．＝１０：２で行った。各Ｅ：Ｔ比（エフェクター細胞：標的細胞比）にしたがって実施例８の細胞をエフェクター細胞として加え４時間３７℃でインキュベートし、その上清中の^５１Ｃｒをγカウンターで測定した。自然放出（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｒｅｌｅａｓｅ）の測定にはエフェクター細胞の代わりにＲ１０を、最大放出（Ｍａｘｉｍｕｍｒｅｌｅａｓｅ）の測定にはエフェクター細胞の代わりに４％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳを入れた。
特異的リシス（ＳｐｅｃｉｆｉｃＬｙｓｉｓ）（％）は［各サンプルのｃｐｍ−自然放出（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｒｅｌｅａｓｅ）のｃｐｍ］／［最大放出（Ｍａｘｉｍｕｍｒｅｌｅａｓｅ）のｃｐｍ−自然放出（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｒｅｌｅａｓｅ）のｃｐｍ］×１００で計算した。
膜結合型ＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体のＣＴＬによる認識を調べた結果を図５に示した。Ａ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂとｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂを共導入した細胞において、抗原特異的ＣＴＬ活性化を検出できることが判明した。
［実施例１０］ＳｅＶ導入細胞から回収したエピトープ結合β２ｍの効果
ＳｅＶ導入細胞で産生されたエピトープ結合β２ｍを調製するため、ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂをＨ９細胞にｍ．ｏ．ｉ．＝２で導入し、３日後に培養上清を回収し濾過してエピトープ結合β２ｍを含む溶液を得た。Ａ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂを感染させたＨ９を標的細胞として実施例９と同様のＣＴＬアッセイを行い、ペプチドでのパルスと上記で得たエピトープ結合β２ｍを含む溶液でのパルスを比較した。
エピトープ結合β２ｍの効果を図６に示した。ＳｅＶ導入細胞から回収したエピトープ結合β２ｍを標的細胞の培養液に添加することによって、抗原特異的ＣＴＬ活性を検出できることが判明した。
［実施例１１］ＩＣＰ４７，ＵＳ６による細胞表面ＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体のｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ヒトＣＤ４^＋Ｔリンパ球株Ｈ９、ＭＴ−２、マウスのハイブリドーマＡ１１．１Ｍ（Ｆｏｕｎｇ，Ｓ．Ｋ．Ｈ．，ｅｔａｌ．，１９８６，ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｌ．１５：３１６−３１９）は１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）培地（Ｒ１０）にて培養した。ＨＩＶ−１感染者から誘導したＣＴＬｌｉｎｅ、ＣＴＬｃｌｏｎｅは１０％Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ−Ｔ（Ｂｉｏｔｅｓｔ）を含むＲ１０にて培養した。
ヒトＣＤ４^＋Ｔリンパ球株Ｈ９にＩＣＰ４７ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃ，ＵＳ６ｈｉｓ／ｐＳｅＶｃをｍ．ｏ．ｉ．３にて感染させ、１８、２４、３０、４２時間後に抗ＭＨＣｃｌａｓｓＩモノクローナル抗体３Ｆ１０ＦＩＴＣ標識（Ａｎｃｅｌｌ）で細胞表面を染色し、フローサイトメトリーにて解析した。１００倍希釈した抗ＭＨＣｃｌａｓｓＩ抗体、３Ｆ１０−ＦＩＴＣと４℃、２０分間反応させた後、３回洗浄し１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）にて固定した。染色および洗浄には２％ウシ胎児血清、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを用いた。フローサイトメトリーはＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて行い、解析にはＦｌｏｗＪｏＶｅｒ．３．３（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いた。
対照として用いた野生型ＳｅＶを感染させた細胞では、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現量に有意な変化は検出されなかったが、ＩＣＰ４７ｈｉｓ／ＳｅＶｃおよびＵＳ６ｈｉｓ／ＳｅＶｃを感染させた細胞では時間の経過とともにＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が減少し、新規のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の膜表面の発現が抑制されていることが示唆された（図７）。しかしながら既存のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が存在しているため、劇的には減少していない。
［実施例１２］既存のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体への酸処理の効果
ＴＡＰの阻害により新規のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現を抑制できることが示されたことから、次に既存のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を酸処理により除去する処理による効果を確認した。
酸処理によるペプチドの解離は、ＭＴ−２細胞（ＨＬＡ−Ａ２４＋）を４℃のｐｅｐｔｉｄｅｓｔｒｉｐｐｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（０．１３Ｍｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ（ｐＨ３），６６ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４，１５０ｍＭＮａＣｌ，１７μｇ／ｍｌＰｈｅｎｏｌＲｅｄ）２００μｌで１分間処理し、その後１２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０にて中和することにより行った。処理直後（０時間）、１、３、６時間後に抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体産生ハイブリドーマ、Ａ１１．１Ｍの培養上清、抗マウスＩｇＧ抗体ＦＩＴＣ標識（Ｉｍｕｎｏｔｅｃｈ）で染色し、上記と同様にフローサイトメトリーにて解析した（図８）。
酸（ｐＨ３）で細胞を処理することにより、膜表面ＭＨＣＣｌａｓｓＩ／ペプチド複合体上のペプチドが剥がれ、細胞表面上のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が減少することが示された。また、６時間後には元のレベルまで回復することが示された。
［実施例１３］酸処理およびＴＡＰ阻害蛋白質発現ベクターによる細胞表面ＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の減少
酸処理が既存のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を減少させることがわかったので、ＴＡＰ阻害蛋白質発現ベクター感染後ＴＡＰ阻害蛋白質が十分量発現した後（１４時間後）、酸処理を施し既存のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を除去し、さらに６時間後に細胞膜表面のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を解析することによって、ＴＡＰ阻害蛋白質による新規のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の細胞膜表面の発現抑制の効果を調べた。
ＭＴ−２細胞にＩＣＰ４７ｈｉｓ／ＳｅＶｃまたはＵＳ６ｈｉｓ／ＳｅＶをｍ．ｏ．ｉ．３にて感染させ、１４時間後に実施例１２と同様に酸処理を行い、その６時間後に実施例１２と同様にＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体（Ａ１１．１Ｍ）で細胞表面を染色し、フローサイトメトリーにて解析した（図９）。ＩＣＰ４７，ＵＳ６ともに新規のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の細胞表面への発現を効果的に抑制していることが示された。また、その抑制効果はほぼ同程度であることが確認された。
［実施例１４］ＴＡＰ阻害蛋白質とエピトープ結合β２ｍ共発現ベクターによるＴＡＰ阻害蛋白質とエピトープ結合β２ｍの同時発現
実施例５で作製したＴＡＰ阻害蛋白質とエピトープ結合β２ｍを共に発現するベクターが実際に両蛋白質を発現しているかをウエスタンブロットにて解析した。
ＣＶ−１細胞にｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ、ＵＳ６ｈｉｓを各々発現するＳｅＶ、および共発現するＳｅＶ、野生型ＳｅＶをｍ．ｏ．ｉ．３にて感染させ、その２４時間後に感染細胞を回収した。回収した感染細胞をＴＮＥＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８），１％ＮＰ４０，０．１５ＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，１０μｇ／ｍｌａｐｒｏｔｉｎｉｎ）にて溶解し、その可溶画分にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、さらに抗（Ｈｉｓ）_６抗体、抗β２ｍ抗体にてウエスタンブロッティングを行い、ＵＳ６ｈｉｓ、ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍの蛋白発現を確認した（図１０）。ＰＶＤＦ膜にブロッティングした後、ブロックエース（大日本製薬）にてブロッキング後１０００倍希釈した抗（Ｈｉｓ）_６抗体Ｐｅｎｔａ−ＨｉｓＡｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ）、または抗β２ｍ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）と４℃、１時間反応させた。４回洗浄後２０００倍希釈した抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰ標識（Ｒｏｃｈｅ）と室温１時間反応させ、４回洗浄後Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔｐｌｕｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて発色させた。検出はＬｕｍｉＩｍａｇｅｒＦ１（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｍ）を用いて行った。洗浄にはＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用い、抗体の希釈には１０倍希釈したブロックエースを用いた。〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＵＳ６ｈｉｓ〉／ＳｅＶ感染細胞においてＵＳ６ｈｉｓ、ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍの発現が確認された。ＵＳ６ｈｉｓの発現量もＵＳ６ｈｉｓ／ＳｅＶｃとほぼ同程度であることが確認された。
［実施例１５］ＴＡＰ阻害蛋白質とエピトープ結合β２ｍ共発現ベクターによる酸処理後のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の回復
実施例１３、１４より酸処理を施したＴＡＰ阻害蛋白質とエピトープ結合β２ｍ共発現ベクター感染細胞では内在性蛋白質由来のエピトープを提示したＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の細胞膜表面の発現が抑制され、ＴＡＰを介したペプチドの輸送を必要としないエピトープ結合β２ｍと結合しているＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が高密度に発現していると考えられる。
ＭＴ−２細胞にＩＣＰ４７ｈｉｓ／ＳｅＶｃまたはＵＳ６ｈｉｓ／ＳｅＶ、〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＩＣＰ４７ｈｉｓ〉／ＳｅＶまたは〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＵＳ６ｈｉｓ〉／ＳｅＶをｍ．ｏ．ｉ．３にて感染させ、１４時間後に実施例１３と同様に酸処理を行い、その６時間後に実施例１３と同様にＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体（Ａ１１．１Ｍ）で細胞表面を染色し、フローサイトメトリーにて解析した（図１１）。ＩＣＰ４７ｈｉｓ／ＳｅＶｃ，ＵＳ６ｈｉｓ／ＳｅＶｃ感染細胞ではともに細胞膜表面のＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体の発現が抑制されているが、〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＩＣＰ４７ｈｉｓ〉／ＳｅＶ、〈ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ＋ＵＳ６ｈｉｓ〉／ＳｅＶ感染細胞では野生株ＳｅＶ感染細胞とほぼ同レベルまでＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が回復している。これは、ＴＡＰ阻害蛋白質とエピトープ結合β２ｍ共発現ベクター感染細胞ではエピトープ結合β２ｍを結合しているＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体が非常に高密度に発現していることを示している。

産業上の利用の可能性

本発明により、哺乳動物細胞においてエピトープ結合ＭＨＣｃｌａｓｓＩまたはβ２ｍを発現させる場合に、内因性のエピトープの提示を抑制することによって目的の外来エピトープを効率的に提示させることが可能となった。これによりある特定の（単一の）エピトープを提示するＭＨＣｃｌａｓｓＩ／ペプチド複合体を細胞表面に高密度に発現することが可能となる。インビボおよびエクスビボでエピトープ結合ＭＨＣｃｌａｓｓＩまたはβ２ｍを発現させるベクターを導入する際に本発明の方法を適用すれば、目的の抗原に対して特異的な細胞性免疫を効果的に誘導することが可能である。本発明は、感染症に対する防御免疫の誘導、および癌に対する免疫療法などにおける遺伝子治療等に有用である。

【配列表】

Claims

ＭＨＣｃｌａｓｓＩによる外来エピトープの提示を増強する方法であって、
（ａ）細胞のＴＡＰ活性を阻害する工程、および
（ｂ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープを融合させたβ２ｍを該細胞で発現させる工程、を含む方法。
酸処理を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
細胞のＴＡＰ活性を阻害する工程が、ＴＡＰ阻害活性を有する蛋白質を該細胞に接触させる工程または、該蛋白質をコードするベクターを該細胞へ導入する工程である、請求項１または２に記載の方法。
ＴＡＰ阻害活性を有する蛋白質がＵＳ６またはＩＣＰ４７である、請求項３に記載の方法。
ベクターが哺乳動物細胞に感染可能なウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
ベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項５に記載の方法。
（ｉ）ＴＡＰ遺伝子の発現が阻害されているか、ＴＡＰ阻害剤を含むか、またはＴＡＰ阻害剤をコードする遺伝子を発現可能に保持し、かつ（ｉｉ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはエピトープを融合させたβ２ｍをコードする遺伝子を発現可能に保持する哺乳動物細胞。
（ｉ）ＴＡＰ阻害剤または該阻害剤を発現可能なベクター、および（ｉｉ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはエピトープを融合させたβ２ｍ、またはエピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖若しくはエピトープを融合させたβ２ｍを発現可能なベクター、を含むエピトープを提示させるためのキット。
下記（ｉ）および（ｉｉ）の両方を発現可能なベクター；
（ｉ）ＴＡＰ阻害剤、および
（ｉｉ）エピトープを融合させたＭＨＣｃｌａｓｓＩ重鎖またはエピトープを融合させたβ２ｍ。