CN1720326A

CN1720326A - 通过抑制tap活性增强mhcⅰ类分子对外来表位的展示的方法

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Publication number: CN1720326A
Application number: CNA2003801046962A
Authority: CN
Inventors: 岩本爱吉; 立川爱
Original assignee: Dnavec Research Inc
Current assignee: Dnavec Research Inc
Priority date: 2002-10-01
Filing date: 2003-10-01
Publication date: 2006-01-11
Also published as: CA2500413A1; AU2003268721A1; EP1559780A1; JPWO2004031380A1; US20060099218A1; KR20050062572A; WO2004031380A1

Abstract

本发明涉及通过抑制TAP活性增强MHC I类分子上的外来表位展示的方法。构建编码TAP抑制因子和与表位相连的β2m并能感染哺乳动物细胞的病毒载体，并将其导入哺乳动物细胞。本发明人通过TAP抑制因子的作用减少内源性MHC I类/肽复合物，成功地在细胞表面高频率地展示MHC I类/肽复合物，该复合物含有该载体所表达的与表位相连的β2m。本方法可用于感染、癌症等的疫苗疗法。

Description

通过抑制TAP活性增强MHC I类分子对外来表位的展示的方法

技术领域

本发明涉及通过抑制TAP活性增强MHC I类分子上的外来表位展示的方法。

背景技术

MHC(主要组织相容性复合体)I类分子是由重链(HC)和β2-微球蛋白(β2m)组成的异二聚体，它几乎存在于每一种细胞的细胞膜表面。MHC I类分子含有由重链形成的沟，沟中可装载10个氨基酸左右的肽。所得MHC I类/肽复合物由在细胞免疫中起作用的细胞毒T淋巴细胞(CTL)上的T细胞受体(TCR)识别。因此，将MHC I类分子上展示的肽称为“表位”(抗原决定簇)。

糙面内质网表面存在的、被称作TAP(与抗原加工有关的转运蛋白)的转运蛋白将得自胞质中产生的自身抗原、病毒抗原和肿瘤抗原的肽片段运送至糙面内质网。在此它们与MHC I类重链和β2m形成稳定的MHC I类/肽复合物。β2-微球蛋白分子所起的作用是维持MHC I类分子三维结构的稳定性，并将重链运送至细胞表面(Tasuku Honjo and Takeshi Watanabe(ed.)，“Immune System：Recognition，differentiation，and proliferation”，The MolecularBiology Society of Japan(ed.)，Maruzen Co.，Ltd.，Tokyo：p117-118)。已知未与肽结合的空MHC I类分子在37℃的培养条件下非常不稳定。

表位，即MHC I类分子上展示的肽是很重要的分子，它可引发针对某种抗原的特异性细胞免疫力。表位是开发肽疫苗所必不可少的组分，所述肽疫苗可用作抗病毒(如HIV)感染或抗癌症的免疫治疗剂。然而，得自很多种病毒抗原和肿瘤抗原的主要表位的肽与MHC I类分子的结合活性较弱。因此，一般说来，当将这些肽单独用作疫苗时，由于它们的稳定性较低，预期不会有什么效果。迄今为止，已将人工表位有效用于黑素瘤患者的临床研究，所述表位具有氨基酸取代，籍此增强与MHC I类分子的结合能力却不会失去其抗原性。然而，鉴定和开发这种稳定性和抗原性皆有所改良的表位却是棘手和困难的，不会总能得到想要的表位。

另一方面，人们发现β2m可以增强MHC I类分子上肽的稳定性，基于此发现，开发出使用β2m的佐剂作用的系统。

最近，人们尝试表达MHC I类/肽复合物，其中表位肽与MHC I类分子和MHC II类分子或β2m融合(Uger，R.A.and Barber，B.H.，J.Immunol.160：1598-1605(1998)；White，J.et al.，J.Immunol.162：2671-2676(1999)；Kang，X.et al.，Cancer Res.57：202-205(1997)；Uger，R.A.et al.，J.Immunol.162：6024-6028(1999)；美国专利号5,869,270)。据报道，与单独使用的肽，特别是那些使用与MHC I类分子的结合活性较弱的表位构建出的肽相比，通过使用接头使表位肽序列与β2m的N-末端融合(与表位相连的β2m；e/β2m)，这些复合物表现出增强的稳定性和CTL识别。

目前，通过在大肠杆菌中分开表达和纯化重链(HC)和β2m蛋白，接着在体外使这些分子与合成肽一起折迭，即可制备出含有人MHC I类分子的MHC I类/肽复合物。与之形成对照的是，关于小鼠MHC I类分子，有人报道过使用杆状病毒载体构建出得自昆虫细胞的MHC I类/肽复合物(White，J.et al.，J.Immunol.162：2671-2676(1999))。在此系统中，在用杆状病毒共感染的细胞中构建出MHC I类/肽复合物，所述病毒分别表达MHC I类的重链和与表位相连的β2m。由于杆状病毒载体系统表达位于昆虫细胞(例如Sf9细胞)有效启动子下游的外源基因，因此难以将该系统应用于哺乳动物细胞(国际公开号Hei 6-502990的已公开日语译文)。另外，尽管Punnonen等人已公开用于DNA改组的基因疫苗载体(Punnonen，J.et al.，Genetic VaccineVector Engineering，美国专利申请流水号20010006950)，但与表位融合的MHC I类重链或β2m仍未被述及。

发明内容

本发明的目的是提供通过抑制TAP活性增强MHC I类分子上的外来表位展示的方法。

本发明人利用重组DNA技术构建出编码与表位相连的β2m的基因，以使用感染哺乳动物细胞的病毒载体，在哺乳动物细胞中表达与表位相连的β2m分子，并开发出在这些细胞中产生MHC I类/肽复合物的系统。然而，由于哺乳动物细胞表面有很多种MHC I类分子，各个MHC I类分子展示不同种得自细胞内存在的蛋白质的肽，因此，当在哺乳动物细胞中表达与表位相连的β2m时，同与表位相连的β2m形成复合物所必需的MHC I类分子的可利用水平会随着肽水平的降低而降低。

本发明人认为增加能展示所需表位的MHC I类分子的出现频率对于诱导免疫力非常重要。例如，为了使用MHC I类/肽复合物量化抗原-特异性CTL的频率，已开发出利用“MHC I类/肽四聚体复合物(四聚体)”的方法(Altman J.D.et al.，Science 274：94-96(1996))。通过使用生物素-亲和素结合系统使单体MHC I类/肽复合物四聚体化，接着加入荧光标记，制备出所述四聚体，并将其用于FACS分析。由于该方法可以直接分析分离自个体的外周血单核细胞样品，因此该方法不仅简单，能直接反映出每个个体中的频率，还具有高敏感性和高特异性(Wilson，J.D.K.et al.，J.Exp.Med.188：785-790(1998)；Kuroda，M.J.et al.，J.Exp.Med.187：1373-1381(1998))。本发明人注意到下述细节：在分析上述MHC I类/肽复合物时，尽管因比例为1∶1的单体MHC I类/肽复合物与TCR的结合较弱，使原先尝试的FACS分析未能成功，但单体MHC I类/肽复合物的四聚体化，即MHC I类/肽复合物与TCR多重结合的同时存在，使得首次分析该复合物成为可能。

另外，在上述的哺乳动物细胞中的与表位相连的β2m表达系统中，当展示多种得自细胞内蛋白质的肽时，附近出现展示所需表位的MHC I类/肽复合物的可能性也许会降低。

考虑到上述两点，本发明人推测：如果位于细胞膜表面的MHC I类/肽复合物上能有效展示一种表位，所述表位也能被TCR有效识别，即CTL可以被有效激活。例如，迄今为止，据报道通过在预先用酸处理的细胞表面添加高浓度的单个合成肽，然后洗涤以除去MHC I类/肽复合物上展示的肽，即可有效激活CTL(Langlade-Demoyen，P. et al.，Int.Immunol.6：1759-1766(1994))。然而，尽管该操作实际上可以在体外进行，但不可能在体内进行。另外，难以将所述操作用于免疫疗法，当考虑到如上文所述，肽的稳定性较低时，更是如此。

因此，本发明人想通过使用能抑制TAP-介导的肽转运的分子来抑制源自细胞的抗原呈递，从而仅呈递与β2m融合的所需表位以用作抗原。首先构建重组仙台病毒(SeV)载体，该载体表达得自I型单纯疱疹病毒(HSV-1)的ICP47(Hill，A.et al.，Nature 375：411-415(1995)；Fruh，K.et al.，Nature 375：415-418(1995))和得自人巨细胞病毒(CMV)、已知为TAP-抑制因子的US6(Ahn，K.et al.，Immunity 6：613-621(1997)；Hengel，H.et al.，Immunity 6：623-632(1997))。将这些载体导入人CD4+T淋巴细胞细胞系H9和MT-2细胞，然后通过流式细胞术分析细胞表面的MHC I类/肽复合物。结果，尽管未在被野生型SeV感染的对照细胞中检测到MHC I类/肽复合物水平的显着变化，但在被表达TAP-抑制性分子US6的SeV载体感染的细胞中，MHC I类/肽复合物水平随着时间而降低，这表明新的(从头开始)MHC I类/肽复合物的表达受到抑制。

接着，用表达ICP47或US6的SeV载体感染上述细胞，然后通过进一步用酸处理细胞，使细胞表面表达的表位解离。该处理能有效降低最初存在于细胞表面的MHC I类/肽复合物水平。此外，本发明人进行了实验，想通过在细胞中同时表达TAP-抑制性分子以及与表位相连的β2m，在细胞表面高水平地表达具有单个表位的MHC I类/肽复合物。为此，本发明人构建出同时表达TAP-抑制性分子(US6)以及与表位相连的β2m的载体。载体表达的表位与β2m融合，因此所述表位在糙面内质网上的存在与TAP不相关。使用该载体，通过TAP-抑制性因子的作用降低展示内源性蛋白质衍生肽的MHC I类/肽复合物的水平，籍此本发明人成功地以高频率表达出MHC I类/肽复合物，所述复合物含有与β2m结合的所需外来表位。因此，本发明首次提供了一个新概念，即将TAP-抑制性分子用于“在细胞表面高频率表达具有单个肽的MHC I类/肽复合物的系统”，所述系统有望用作免疫疗法所用的疫苗。

本发明可以在哺乳动物细胞中以高纯度表达MHC I类/肽复合物，所述复合物含有所需的与表位相连的β2m。例如，如实施例中所示，通过将感染哺乳动物细胞的病毒载体导入细胞，其中所述载体表达与表位结合的β2m或MHC I类重链，并且在TAP抑制剂的存在下表达所述载体，就可以优先在细胞表面形成含有由导入基因表达的表位的MHC I类/肽复合物。

如实施例中所示，与用得自HIV-1 Nef蛋白的合成表位肽脉冲的细胞相比，同时表达与表位相连的β2m(例如与得自HIV-1 Nef蛋白的表位结合的β2m)和MHC I类重链(HLA-A*2402)的细胞被抗原-特异性CTL同等或更有效地识别。另外，通过在靶细胞的培养物溶液中加入从细胞(其中已导入表达与表位相连的β2m的SeV载体)中回收的与表位相连的β2m，与表位相连的β2m能诱导针对靶细胞的抗原特异性CTL反应。这些发现表明编码与表位相连的β2m的载体可用于体内或来自体内的基因治疗，从而诱导抗原-特异性免疫应答。在此系统中使用TAP抑制剂使得以较高纯度展示所需表位成为可能。通过在TAP-抑制蛋白的存在下，在个体中产生所需MHC I类/肽复合物，可以实现十分有效的免疫疗法。

因此，本发明人建立了通过抑制TAP来抑制内源性表位的展示，从而有效展示外来表位的方法。在TAP抑制剂的存在下，体内或回体导入载体能够诱导抗原-特异性细胞免疫力，其中所述载体表达与表位融合的MHC I类重链或β2m。例如，本发明的方法可用于诱导针对病毒或细菌感染所致传染性疾病的保护性免疫力，并可用于抗癌免疫疗法。

即，本发明涉及通过抑制TAP活性增强MHC I类分子上的外来表位展示的方法，更具体地涉及：

(1)增强MHC I类分子上的外来表位展示的方法，其中所述方法包括下述步骤：

(a)抑制细胞中的TAP活性；和

(b)在所述细胞中表达与表位融合的MHC I类重链或与表位融合的β2m；

(2)(1)的方法，其中所述方法还包括酸处理步骤；

(3)(1)或(2)的方法，其中所述抑制细胞中的TAP活性的步骤包括使所述细胞与具有TAP抑制活性的蛋白质接触的步骤，或将编码所述蛋白质的载体导入所述细胞的步骤；

(4)(3)的方法，其中所述的具有所述TAP抑制活性的蛋白质是US6或ICP47；

(5)(3)的方法，其中所述载体是感染哺乳动物细胞的病毒载体；

(6)(5)的方法，其中所述载体是仙台病毒载体；

(7)哺乳动物细胞，其中(i)所述细胞中的TAP基因表达受到抑制，所述细胞含有TAP抑制剂，或所述细胞以可表达的方式携有编码所述TAP抑制剂的基因，其中(ii)所述细胞以可表达的方式携有编码与表位融合的MHC I类重链或与表位融合的β2m的基因；

(8)用于展示表位的试剂盒，其含有：(i)TAP抑制剂或能表达所述抑制剂的载体；和(ii)与表位融合的MHC I类重链或与表位融合的β2m，或能表达所述与表位融合的MHC I类重链或所述与表位融合的β2m的载体；和

(9)能表达(i)和(ii)的载体：

(i)TAP抑制剂；和

(ii)与表位融合的MHC I类重链或与表位融合的β2m。

本发明提供了通过抑制TAP活性增强MHC I类分子上的外来表位展示的方法。具体地，本发明的方法包括下述步骤：(a)抑制细胞的TAP活性，和(b)在细胞中表达与表位融合的MHC I类重链或与表位融合的β2m。对步骤(a)和(b)的次序没有限制，上述方法实际包括的次序为先进行步骤(a)再进行步骤(b)，先进行步骤(b)再进行步骤(a)，同时进行步骤(a)和(b)。TAP是属于ATP-结合盒家族的分子，它包括两种，即TAP-1和TAP-2。

人TAP-1基因描述于例如登录号NM 000593(SEQ ID NO：47)(蛋白质ID NP_000584(SEQ ID NO：48))(Garbi，N.et al.，Eur.J.Immunol.33：264-273(2003)；Heintke，S.et al.，FEBS Lett.533：42-46(2003)；Ozbas-Gerceker，F.etal.，Turk J Pediatr 44：91-97(2002)；Seliger，B.et al.，Int.J.Oncol.20：349-353(2002)；Saveanu，L.and Van Endert，P.M.，Adv.Exp.Med.Biol.495：79-82(2001)；Chen，H.L.et al.，Nat.Genet.13：210-213(1996)；Beck，S.et al.，J.Mol.Biol.255：1-13(1996)；Jackson，D.G.and Capra，J.D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：11079-11083(1993)；Glynne，R.et al.，Eur.J.Immunol.23：860-866(1993)；Beck，S.et al.，J.Mol.Biol.228：433-441(1992)；Bodmer，J.G.et al.，Tissue Antigens 39：161-173(1992)；Bahram，S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：10094-10098(1991)；Spies，T.et al.，Nature 348：744-747(1990)；Trowsdale，J.et al.，Nature 348(6303)：741-744(1990)).TAP-1也被称为APT1，PSF1，ABC 17，ABCB2，RING4或D6S114E。另外，大鼠TAP-1基因描述于例如登录号NM_032055(蛋白质ID NP_114444)(Rudolph，M.G.et al.，J.Mol.Biol.324：975-990(2002)；Daumke，O.and Knittler，M.R.，Eur.J.Biochem.268：4776-4786(2001)；Deverson，E.V.et al.，Nature 348：738-741(1990)).小鼠TAP-1基因描述于登录号NM_013683(蛋白质ID NP_038711)(Garbi，N.et al.，Eur.J.Immunol.33：264-273(2003)；Ruedl，C.et al.，Eur.J.Immunol.32：818-825(2002)；Neveu，R.et al.，Mol.Immunol.38：661-667(2002)；Marusina，K.et al.，J.Immunol.158：5251-5256(1997)；Van Kaer，L.etal.，Cell 71：1205-1214(1992)；Hanson，I.M.and Trowsdale，J.，Immunogenetics34：5-11(1991)；Cho，S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：5197-5201(1991)；Monaco，J.J.et al.，Science 250(4988)：1723-1726(1990))。

人TAP-2基因描述于例如登录号NM_000544(SEQ ID NO：49)(蛋白质ID NP_000535(SEQ ID NO：50)(Garbi，N.et al.，Eur.J.Immunol.33：264-273(2003)；Heintke，S.et al.，FEBS Lett.533：42-46(2003)；Ozbas-Gerceker，F.etal.，Turk J Pediatr 44：91-97(2002)；Penfomis，A.et al.，Hum.Immunol.63：61-70(2002)；Saveanu，L.and Van Endert，P.M.，Adv.Exp.Med.Biol.495：79-82(2001)；Yan，G.et al.，J.Immunol.162：852-859(1999)；Cesari，M.M.etal.，Immunogenetics 45：280-281(1997)；Pattanakitsakul，S.et al.，TissueAntigens 47：353-355(1996)；Beck，S.et al.，J.Mol.Biol.255：1-13(1996)；Cano，P.and Baxter-Lowe，L.A.，Tissue Antigens 45：139-142(1995)；de la Salle，H.et al.，Science 265：237-241(1994)；Glynne，R.et al.，Eur.J.Immunol.23：860-866(1993)；Powis，S.H.et al.，Immunogenetics 37：373-380(1993)；Beck，S.et al.，J.Mol.Biol.228：433-441(1992)；Bodmer，J.G.et al.，Tissue Antigens 39：161-173(1992)；Powis，S.H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：1463-1467(1992)；Kelly，A.et al.，Nature 355：641-644(1992)；Bahram，S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：10094-10098(1991)；Trowsdale，J.et al.，Nature 348(6303)：741-744(1990)).TAP-2也被称为APT2，PSF2，ABC18，ABCB3，RING11或D6S217E。另外，小鼠TAP-1基因描述于例如登录号NM_011530(蛋白质ID NP_035660，P36371)(Garbi，N.et al.，Eur.J.Immunol.33：264-273(2003)；Marusina，K.et al.，J.Immunol.158：5251-5256(1997)；Yang，Y.et al.，J.Biol.Chem.267：11669-11672(1992)；Attaya，M.et al.，Nature 355：647-649(1992)；Monaco，J.J.et al.，Science 250：1723-1726(1990))。大鼠TAP-1基因描述于例如登录号NM_032056(蛋白质ID NP_114445)(Powis，S.J.et al.，Nature 354：528-531(1991))。牛TAP-1基因描述于例如登录号NM_174222(蛋白质ID NP_776647)(Ambagala，A.P.et al.，Immunogenetics 54：30-38(2002))。

TAP-1和TAP-2基因表现出多态性。在本发明中，提及TAP-1和TAP-2基因时，包括它们各自所有类型的多态性。具体地说，在本发明中，TAP-1和TAP-2基因分别包括编码蛋白质的核酸，所述蛋白质含有与上述哺乳动物TAP-1(如NP_000584，NP_114444或NP_038711)和TAP-2(如NP_000535，NP_035660，P36371，NP_114445或NP_776647)蛋白具有68％或更高，优选70％或更高，更优选75％或更高，更优选80％或更高，更优选85％或更高，更优选90％或更高，更优选95％或更高同一性的氨基酸序列。这些蛋白质参与加工表位。

使用例如BLASTP程序(Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))可测定氨基酸序列同一性。例如，在NCBI(国立生物技术信息中心)的BLAST网页，使用默认值为参数，不使用任何包括低复杂度的过滤器，即可进行检索(Altschul，S.F.et al.，Nature Genet.3：266-272(1993)；Madden，T.L.et al.，Meth.Enzymol.266：131-141(1996)；Altschul，S.F.et al.，NucleicAcids Res.25：3389-3402(1997)；Zhang，J.& Madden，T.L.，Genome Res.7：649-656(1997))。例如，使用blast2sequences程序(Tatiana A et al.，FEMSMicrobiol Lett.174：247-250(1999))比较两个序列，比对这两个序列以测定序列同一性。例如，通过使缺口与错配相等即可计算出哺乳动物TAP-1(如NP_000584，NP_114444或NP_038711)和TAP-2(如NP_000535，NP_035660，P36371，NP_114445或NP_776647)蛋白整个氨基酸序列的同一性数值。

另外，在本发明中，TAP-1和TAP-2基因分别包括在严紧条件下可与上述哺乳动物TAP-1(如NM_000593，NM_032055或NM_013683)和TAP-2(如NM_000544，NM_011530，NM_032056或NM_174222)基因中的30或更多个核苷酸，更优选50或更多个核苷酸，更优选100或更多个核苷酸，更优选150或更多个核苷酸，更优选全长蛋白质-编码序列杂交的核酸。在杂交中，这种核酸可通过由含有哺乳动物TAP-1或TAP-2基因编码序列的核酸或者杂交靶核酸制备探针，然后检测与相应核酸杂交的探针来鉴定。严紧杂交条件包括例如于48℃，优选50℃，更优选55℃，更优选60℃，在含有5×SSC(1×SSC含有150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)，7％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)，100μg/ml变性鲑精DNA，5×Denhardt’s溶液(1×Denhardt’s溶液含有0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％牛血清白蛋白和0.2％Ficoll)的溶液中杂交，接着在与杂交温度相同的温度下，在含有2×SSC和0.1％(w/v)SDS，优选1×SSC和0.1％(w/v)SDS，更优选0.5×SSC和0.1％(w/v)SDS，更优选0.1×SSC和0.1％(w/v)SDS中振荡洗涤2小时。

TAP-1和TAP-2都具有跨膜结构域，并通过在内质网膜上形成异二聚体而起到转运蛋白的作用。两者中缺乏任一个都无法在MHC I类分子上进行抗原呈递。TAP转运蛋白以依赖于ATP的方式将胞质中加工的肽转运至内质网，所述肽在此与MHC I类分子结合。在本发明中，TAP包括TAP-1和TAP-2。另外，抑制TAP活性包括抑制TAP-1活性和/或TAP-2活性。可以直接或间接抑制TAP活性。例如，抑制TAP活性包括通过使用直接作用于TAP的抑制剂直接抑制TAP活性，以及通过抑制TAP表达(转录或翻译)间接抑制TAP活性。通过在细胞内表达TAP基因的反义核酸，或通过表达能在细胞内切割TAP基因转录物的核酶，即可抑制TAP的表达。通过使用具有双链RNA部分的核酸进行RNA干扰，也可抑制TAP基因的表达，其中所述RNA部分含有TAP基因转录物的一部分的互补序列。所有这些都可用作本发明的TAP抑制剂。

一般说来，RNAi表示一种现象，即通过将RNA导入细胞或在细胞中表达所述RNA，即可通过诱导mRNA破坏靶基因来抑制靶基因表达，其中所述RNA含有有义RNA和反义RNA，前者具有与靶基因mRNA序列的一部分同源的序列，后者具有与有义RNA互补的序列(Genes Dev.15：188-200(2001)；Elbashir，SM et al.，Nature 411：494-498(2001))。当将具有RNAi作用的双链RNA导入细胞时，被称为DICER的酶(RNase III核酶家族的成员)将与双链RNA接触，双链RNA会降解成被称为小的干扰RNA(siRNA)的小片段。在本发明中，除了细胞内加工所产生的这种RNA外，也将人工合成或表达的、用于通过RNAi抑制靶基因表达的RNA分子统称为siRNA。在本发明中，具有RNAi作用的RNA包括这些siRNA。在体内通过siRNA可抑制靶基因的表达(Anton P.et al.，Nature Vol.418：38-39(2002)；David L.etal.，Nature genetics Vol.32：107-108(2002))。

一般说来，siRNA是含有核苷酸序列及其互补序列的RNA，所述核苷酸序列具有某个靶基因的转录序列(mRNA序列)的15或更多个邻接的核苷酸(更优选16或更多个核苷酸，17或更多个核苷酸，18或更多个核苷酸，或19或更多个核苷酸)，通过杂交，所述核苷酸序列与其互补序列彼此形成双链RNA。优选siRNA在一条链上包括19至30个邻接核苷酸，更优选20至25个邻接核苷酸，更优选21至23个邻接核苷酸的序列或其互补序列，而在相反链上含有能与之形成互补对的序列。然而，对RNA的长度没有限制，因为即便是具有较长序列的RNA，也有望被内源性降解为具有RNAi作用的siRNA。另外，也可以事先使用例如DICER，从靶基因上切割对应于完整或几乎完整的mRNA区域的长链双链RNA，并将降解产物用作siRNA。该降解产物有望包括具有RNAi作用的RNA分子(siRNA)。根据此方法，没必要选择预期具有RNAi作用的mRNA区域。即并非总需准确定义对靶基因而言具有RNAi作用的序列。

已知末端具有几个核苷酸的突出端的双链RNA一般具有较高RNAi作用。本发明中使用的siRNA需要，但不是必需在末端(优选在3’末端)具有几个核苷酸的突出端。尽管对形成突出端的核苷酸序列的长度没有限制，但优选2个核苷酸的突出端。例如，在本发明中，可以适当使用具有TT(两个胸腺嘧啶)，UU(两个尿嘧啶)或其它核苷酸的突出端的双链RNA(最优选分子具有19个碱基对的双链RNA部分和2个核苷酸(TT)的突出端部分)。在本发明中，siRNA包括具有形成突出端的DNA的分子。

另外，可用间隔序列连接在siRNA内形成碱基对的两条链。即也可适当使用通过由间隔序列形成环，环上下的其余两个序列彼此退火所产生的双链RNA。尽管对间隔序列的长度没有限制，但其长度可以是例如3至23个核苷酸。

另外，本发明也可使用能表达上述siRNA的载体。即本发明涉及使用能表达具有RNAi作用的RNA的载体。例如，上述载体可以是核酸，其中双链siRNA的一条链和另一条链分别与不同的启动子连接，以分开表达每一条链。任选地，可使用可变剪接由一个启动子转录两种RNA。任选地，载体可表达单链RNA，其中有义链和反义链由间隔序列(形成环)来连接。由所述载体表达的RNA通过形成具有RNAi作用的RNA茎来抑制靶基因表达。茎的长度与上述siRNA的类似，可以是例如19至29个核苷酸。尽管对间隔序列的长度没有限制，但其长度可以是例如3至23个核苷酸。茎的5’和/或3’末端可具有几个核苷酸的突出端，也可不具有该突出端。使用本领域技术人员公知的基因工程技术可以容易地制备这些载体(Brummelkamp，T.R.et al.，Science 296：550-553(2002)；Lee，N.S.et al.，NatureBiotechnology 19：500-505(2001)；Miyagishi，M.，and Taira，K.，NatureBiotechnology 19：497-500(2002)；Paddison，P.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：1443-1448(2002)；Paul，C.P.et al.，Nature Biotechnology 19：505-508(2002)；Sui，G.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 99(8)：5515-5520(2002)；ProcNatl Acad Sci USA 99：14943-14945(2002)；Paddison，P.J.et al.，Genes Dev.16：948-958(2002))。更具体地，通过将编码靶RNA序列的DNA适当插入多种已知的表达载体，就可以构建出重组载体。优选的启动子包括RNA聚合酶III启动子。具体地，可使用例如U6Pol III启动子，H1 RNA启动子(H1RNA是一种构成RNase P的成分)等。

下文描述了一个优选的siRNA实例；然而，本发明可使用的siRNA并不局限于此。首先，选择位于靶基因起始密码子下游至少50个核苷酸，优选至少60个核苷酸，更优选至少70个核苷酸处的转录区。优选此处存在AA序列。然后选择AA序列之后的17至20个核苷酸(例如AA之后的19个核苷酸)。对AA的下一个核苷酸没有限制，但优选G或C。这里所选择序列的GC含量优选为20至80％，更优选为30至70％，更优选为35至65％。另外，在施用siRNA的组织所表达的基因中，优选所选择的序列特异于靶基因。例如，优选地，通过使用选择出的序列作为询问项检索基因序列公共数据库，确证在存在于施用siRNA的个体内的基因中，除了靶基因外，没有任何基因具有相同的转录序列。另外，优选从靶基因的蛋白质编码序列(CDS)中选择序列。适当的siRNA包括具有这些选定序列，但不含开头的AA的序列(优选在3’末端添加UU或TT)及其互补序列(优选在3’末端添加UU或TT)。按照与上述内容类似的方式，不是检索AA序列之后的序列，而是检索CA序列之后的序列。或者，也可以检索除AA或CA以外的其它序列。也可以从如此制备的多种siRNA中适当选择具有最适RNAi作用的RNA。

本领域技术人员根据靶基因的核苷酸序列可以适当制备出具有RNAi作用的RNA。通过使用已知的TAP基因作为探针筛选哺乳动物cDNA文库，或者通过RT-PCR，可以容易地从上述公共基因数据库中获得靶TAP基因的核苷酸序列。根据所获得的基因的核苷酸序列，根据上文的描述即可设计出siRNA。

不总是必需知道靶基因的完整核苷酸序列。只需知道可被选作siRNA的邻接RNA区(例如20至30个核苷酸)即可。因此，甚至可以由基因片段，如EST(已表达序列标志)制备siRNA，虽然由所述基因片段无法获知完整的核苷酸序列，但根据基因片段的核苷酸序列可知道部分mRNA序列。当在临床上使用合成的siRNA时，可对其进行修饰。

另一方面，当使用反义核酸抑制基因表达时，它们可含有针对靶TAP基因转录序列内的13或更多个邻接核苷酸，优选14或更多个核苷酸，更优选15或更多个核苷酸(18或更多个核苷酸，20或更多个核苷酸，或25或更多个核苷酸)的反义序列。例如，优选的反义核酸包括针对下述区域的反义序列：早期转录序列内的外显子-内含子边界，内含子-外显子边界，含有翻译起始密码子的区域，5’末端周围的非翻译区，成熟mRNA的蛋白质编码区(CDS)内13或更多个邻接核苷酸，优选14或更多个核苷酸，更优选15或更多个核苷酸的核苷酸序列。另外，当在临床上使用反义核酸时，它们一般含有合成的寡聚体。反义核酸可以是DNA，它们可以被修饰。例如，通常已知将S oligo(硫代磷酸型寡核苷酸)用作反义核酸，其中磷酸二酯键的O(氧)原子被S(硫)原子所取代，从而降低了对核酶消化的敏感性，同时仍能保持活性。目前，正在进行将S oligo作为反义药物直接注射至染病区域的临床研究。S oligo也适用于本发明。尽管优选反义核酸序列与靶基因或其部分互补，但不必完全互补，只要它能有效抑制基因表达即可。优选转录的RNA与靶基因转录物90％或90％以上互补，最优选95％或95％以上互补。为了有效抑制靶基因表达，优选反义核酸的链长度为17或更多个核苷酸，更优选20或更多个核苷酸，更优选25或更多个核苷酸，更优选30或更多个核苷酸，更优选40或更多个核苷酸，更优选50或更多个核苷酸，最优选100或更多个核苷酸。也可以在细胞内表达反义RNA。通过在能在靶细胞中起作用的启动子的下游连接编码所需RNA的核酸以构建载体，然后将载体导入细胞，即可达到此目的。

至于载体，可使用病毒载体，包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺-伴随病毒载体、负链RNA病毒载体，以及非病毒载体，包括脂质体。使用这些载体系统或载体来进行基因转移，通过使用来自体内的方法，体内方法等将所述载体施用于患者，即可进行基因治疗。

或者，可使用核酶或编码核酶的载体来抑制TAP基因表达。术语“核酶”指的是具有催化活性的RNA分子。由于有多种具有不同活性的核酶，也可以设计能位点-特异性地切割RNA的核酶。尽管核酶包括长度为400或更多个核苷酸的核酶，如I组内含子型RNA和RNase P中所含的M1RNA，那些具有长度约为40个核苷酸的活性结构域，被称为锤头型核酶(Rossi et al.，Pharmac.Ther.50：245-254(1991))或发夹型核酶(Hampel et al.，Nucl.Acids Res.18：299-304(1990)，and U.S.Pat.No.5,254,678)的核酶也是已知的(Makoto Koizumi and Eiko Ohtsuka，Protein，Nucleic acid and Enzyme35：2191(1990))。

例如，尽管锤头型核酶的自切割结构域切割序列G13U14C15内C15的3’方向，据认为U14和A9之间碱基对的形成对于活性而言至关重要，已证实切割也发生在A15或U15而不是C15的3’方向(Koizumi，M.et al.，FEBSLett.228：228(1988))。当以底物-结合位点与靶位点附近的RNA序列互补的方式设计核酶时，可以构建能识别靶RNA内的UC、UU或UA序列的限制性酶-样RNA-切割核酶(Koizumi，M.et al.，FEBS Lett.239：285(1988)；Makoto Koizumi and Eiko Ohtsuka，Protein，Nucleic acid and Enzyme 35：2191(1990)；Koizumi，M.et al.，Nucl.Acids Res.17：7059(1989))。

另外，发夹型核酶也可用于本发明的目的。例如，在烟草环斑病毒卫星RNA的负链中可发现此类核酶(Buzayan，JM.，Nature 323：349(1986))。已证实也可由发夹型核酶构建靶-特异性RNA切割核酶(Kikuchi，Y.& Sasaki，N.，Nucl Acids Res.19：6751(1991)；Kikuchi，Y.，Kagaku to Seibutu 30：112(1992))。因此，通过使用核酶特异性切割靶基因的转录物，即可抑制靶基因表达。

或者，为了抑制TAP活性，可在TAP基因中导入突变，或者通过基因靶向技术缺失TAP基因。在本发明中，“抑制TAP活性”也包括提供或制备TAP基因表达有缺陷的细胞。在本发明中，TAP抑制剂包括能直接或间接抑制TAP活性的化合物。即TAP抑制剂包括这些反义核酸、核酶、siRNA，还包括能抑制TAP基因表达的因子。对TAP抑制剂没有限制，只要其具有TAP-抑制活性即可；TAP抑制剂包括蛋白质、肽化合物、非-肽化合物、核酸、核酸类似物和小分子化合物。

当TAP抑制剂由核酸编码时，通过将表达核酸的载体导入细胞即可表达所述抑制剂。TAP-抑制蛋白的例子包括得自单纯疱疹病毒的ICP47(Hill，A.et al.，Nature 375：411-415(1995)；Fruh，K.et al.，Nature 375：415-418(1995))和得自巨细胞病毒的US6(Ahn，K.et al.，Immunity 6：613-621(1997)；Hengel，H.et al.，Immunity 6：623-632(1997))。

具体地，得自人I型疱疹病毒的ICP47描述于登录号NC_001806(145311-145577的互补链)(SEQ ID NO：51)(蛋白质ID NP_044675，P03170(SEQ ID NO：52))(Dolan，A.et al.，J.Gen.Virol.73(Pt 4)：971-973(1992)；Perry，L.J.and McGeoch，D.J.；J.Gen.Virol.69(Pt 11)：2831-2846(1988)；McGeoch，D.J.et al.，J.Gen.Virol.69(Pt 7)：1531-1574(1988)；McGeoch，D.J.et al.，Nucleic Acids Res.14(4)：1727-1745(1986)；McGeoch，D.J.et al.，J.Mol.Biol.181(1)：1-13(1985))。另外，得自人2型疱疹病毒的ICP47描述于登录号NC_001798(147775-148035的互补链)(蛋白质ID NP_044543)(Barnett，B.C.et al.，J.Gen.Virol.73(Pt 8)：2167-2171(1992)；McGeoch，D.J.et al.，J.Gen.Virol.72(Pt 12)：3057-3075(1991)；Everett，R.D.and Fenwick，M.L.，J.Gen.Virol.71(Pt 6)：1387-1390(1990)；McGeoch，D.J.et al.，J.Gen.Virol.68(Pt 1)：19-38(1987))。

关于得自巨细胞病毒的US6，例如，得自人CMV的US6描述于登录号AY072775(SEQ ID NO：53)(蛋白质ID AAL67143(SEQ ID NO：54)，NP_040091)，而得自黑猩猩CMV的US6描述于登录号NC_003521(蛋白质ID NP_612779)(Davison，A.J.et al.，J.Gen.Virol.84(Pt 1)：17-28(2003))。

ICP47分子通过与TAP分子的肽-结合位点结合来抑制TAP-介导的肽转运(Tomazin，R.et al.，EMBO J.15：3256-3266(1996))。另一方面，US6分子抑制ATP与TAP-1的结合，进而导致对肽转运的抑制作用(Hewitt，E.et al.，EMBO J.20：387-396(2001))。在本发明中，这两种分子都可用于抑制TAP活性。上述病毒包括多个亚种和毒株，优选将它们用于本发明，只要由相应基因编码的蛋白质具有TAP-抑制活性即可。另外，这些蛋白质不仅包括野生型蛋白质，还包括经修饰的蛋白质，只要它们能保持TAP-抑制活性即可。例如，可使用具有TAP抑制活性的部分肽。另外，还可添加其它肽，如标记。例如，可使用具有His标记的蛋白质(参见实施例)。

具体地，在本发明中，ICP47和US6蛋白包括这样一些蛋白质，所述蛋白质分别含有与上述ICP47蛋白(如NP_044675，P03170(SEQ ID NO：52)或NP_044543)和US6蛋白(如AAL67143(SEQ ID NO：54)，NP_040091或NP_612779)的氨基酸序列具有68％或更高，优选70％或更高，更优选75％或更高，更优选80％或更高，更优选85％或更高，更优选90％或更高，更优选95％或更高同一性的氨基酸序列。根据本说明书中提及的方法可计算出氨基酸序列的同一性。例如，可计算出与ICP47蛋白(如NP_044675，P03170(SEQ ID NO：52)或NP_044543)或US6蛋白(如AAL67143(SEQ IDNO：54)，NP_040091或NP_612779)的完整氨基酸序列的同一性评分。

另外，在本发明中，ICP47和US6蛋白包括由核酸编码的蛋白质，在严紧条件下，所述核酸分别能与上述ICP47蛋白(如NC_001806的145311-145577或NC_001798的147775-148035)和US6蛋白(如AY072775或NC_003521)的蛋白质编码序列内的30或更多个核苷酸，优选50或更多个核苷酸，更优选100或更多个核苷酸，更优选150或更多个核苷酸，更优选整个序列杂交。严紧杂交条件包括上文所述的条件。

尽管可使用任何合乎需要的表达载体来表达TAP抑制蛋白，但优选使用感染哺乳动物细胞的病毒载体。构建载体，使其除了能表达TAP抑制剂外，还能同时表达与表位融合的MHC I类重链或与表位融合的β2m，此部分内容将在下文描述。

尽管对TAP活性的抑制可以是瞬时的，但优选持续的时间足以使与表位融合的MHC I类重链或β2m得以表达(例如3小时或更长时间，优选为6，18，24或30小时或更长时间)。例如，当进行在细胞内表达与表位融合的MHC I类重链或β2m这一步骤时，可持续抑制TAP活性直至外来表位被显着展示为止。

更优选本发明的方法中除了有抑制TAP活性的步骤外，还包括酸处理的步骤，以表现出外来表位展示的增强。对酸处理的次序没有限制。可在抑制TAP活性或在细胞中表达与表位融合的蛋白质的步骤之前，之后或与之同时进行酸处理。例如，使用表达载体同时表达TAP抑制剂和与表位融合的蛋白质时，一种具体的酸处理方法包括下述步骤：(i)在细胞中表达TAP抑制蛋白和与表位融合的MHC I类重链或β2m；和(ii)用酸处理细胞。尽管抑制TAP活性的步骤会中止内源性抗原加工，但用酸处理细胞会解离细胞表面已展示的表位肽。在本文中，酸处理表示将细胞暴露于酸性环境，使得细胞表面展示的表位肽被显着解离。例如，通过于4℃，用肽-剥离缓冲液(0.13M柠檬酸(pH3)，66mM Na₂HPO₄，150mM NaCl和17μg/ml酚红)处理细胞1分钟，接着使用足够量的培养基(例如RPMI1640)进行中和，即可进行酸处理。本领域技术人员能通过其它可获得类似效果的方法进行酸处理。

可以使用任何合乎需要的表位与MHC I类重链或β2m结合。本文所用术语“表位”指的是能被免疫细胞识别的肽。所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞。在本发明中，优选的表位包括能被T细胞识别的表位。表位不仅包括抗原呈递细胞上展示的表位，还包括任何合乎需要的肽，只要它能被免疫细胞识别即可。例如，具有人工制备的氨基酸序列的肽也可用作表位。更优选表位是抗原呈递细胞(APC)上展示的肽或含有所述肽的一部分的肽。在本发明中，用作表位的蛋白质或肽的“一部分”一般含有8或更多个，优选9或更多个，更优选10或更多个，12或更多个，或15或更多个邻接的氨基酸。另外，在本发明中，将通过细胞内抗原加工所展示的表位肽称为内源性展示表位，而将其它表位称为“外来表位”。例如，即使表位的氨基酸序列与内源性展示表位的氨基酸序列相同，本发明的外来表位仍包括外源性添加的表位或未经内源性抗原加工而展示的表位。另外，本发明的外来表位还包括以融合蛋白的形式与构成MHC，包括MHC I类重链和β2m的蛋白质共价结合的表位肽。使用TAP抑制剂的本发明方法通过抑制细胞内的抗原加工，能在细胞上高频率展示外来表位。

外来表位可与MHC I类重链或β2m结合。对本发明所用的表位没有限制，可以使用多种对例如肿瘤、感染和其它一般性疾病有治疗作用的合乎需要的表位。用作表位的肽的链长度可以适当地改变，但一般为8或更多个氨基酸的肽，例如，优选使用约10个氨基酸的肽。当表位与β2m结合时，表位可与β2m的任何位点相连接，但优选例如使表位与分泌的β2m分子的N-末端相连接。为此，表位在紧接β2m分泌信号的下方与之结合，然后，必要时经由间隔区与β2m蛋白连接，以产生所需融合蛋白。或者，无需间隔区直接将表位与β2m连接。对间隔区的氨基酸序列没有任何限制；然而，用作间隔区的肽优选包括含有例如氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：1)或其重复序列(Gly-Gly-Gly-Ser)_n的肽。对重复次数(n)没有限制，它可以是例如1至5(1，2，3，4或5)。当使用间隔区时，优选使用长度达16个氨基酸，例如4，8或16个氨基酸的间隔区。任何合乎需要的哺乳动物β2m分子都可不加限制地用作β2m。当用于人时，优选使用人β2m。例如，可根据下文实施例中所述的方法分离人β2m基因。另外，β2m可以是野生型蛋白质或具有改变的氨基酸序列的突变型蛋白质。

当表位与MHC I类重链结合时，表位可与MHC I类重链任何合乎需要的位点结合，但优选与分泌后能将表位置于MHC I类分子N-末端的位点结合。为此，表位在紧接MHC I类重链分泌信号序列的下方与之结合，然后，必要时经由间隔区与MHC I类重链连接，以产生所需融合蛋白。或者，无需间隔区直接将表位与MHC I类重链连接。

对间隔区的氨基酸序列没有任何限制；然而，用作间隔区的肽优选包括含有例如氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：2)或其重复序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n的肽。对重复次数(n)没有限制，它可以是例如1至5。根据使用小鼠MHC I类分子H2-K^d的报道，当比较10个氨基酸的间隔区GGPGGGSGGG(SEQ ID NO：3)，20个氨基酸的间隔区GGP(GGGGS)₂GGGSGGG(SEQ ID NO：4)和30个氨基酸的间隔区GGP(GGGGS)₄GGG SGGG(SEQ ID NO：5)的间隔序列时，10个氨基酸的间隔序列能被最有效地识别(Mottez，E.et al.，J.Exp.Med.181：493-502(1995))。另外，根据使用人MHC I类分子HLA-A2的报道，使用10个氨基酸的间隔序列(GGSGGGASGG)(SEQ ID NO：6)能有效展示黑素瘤抗原表位(Kang，X.et al.，Cancer Res.57：202-205(1997))。因此，优选经由这些间隔序列与表位结合。

对MHC I类重链的来源没有特别的限制。优选将人MHC I类分子(HLA)用于人。人MHC I类分子被称为人白细胞抗原(HLA)，其种类十分丰富。这些分子中的任一种都可用作本发明的HLA。例如，本发明可应用于任何类型的HLA，已在感染和癌症中鉴定出所述HLA的靶表位，所述HLA可用作定制或特制的试剂或药物。

特别地，HLA-A24(约60-70％)，HLA-A2(约40％)和HLA-A26(约20％)是日本较常见的HLA类型，接下来是HLA-A11(20％)，HLA-A31(将近20％)和HLA-A33(将近20％)。当将本发明应用于日本受试者时，特别优选这些HLA类型。

为了开发在某种程度上可应用于例如日本受试者中的很多非特定个体的试剂或药物，优选在日本人种群中具有5％或更高等位基因频率的HLA类型(即日本人中10％或更高HLA类型频率)。所述HLA类型包括：

A基因座 B基因座

A*0201 B*0702

A*0206 B*1501

A*1101 B*3501

A*2601 B*4001

A*31012 B*4002

A*3303 B*44031

B*4601

B*52011

B*5401

在实施例中，本发明人将A24-限制性HLA I类重链用作MHC I类分子，将A24-限制性HLA I类分子上展示的得自HIV-1的表位用作表位。约60-70％的日本人种群具有HLA-A*2402基因型。因此，A24-限制性HLA I类重链，特别是A*2402(Litte，A.-M.，Immunogenetics 35：41-45(1992))适用于日本人种群。MHC I类重链可以是野生型蛋白质或具有经改变的氨基酸序列的突变型蛋白质。

可使用公知的重组基因技术(J.Sambrook and D.W.Russell eds.，″Molecular cloning：a laboratory manual″，3rd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001))，将与表位融合的MHC I类重链或β2m以及TAP抑制蛋白制备成重组蛋白质。可以不加限制地将任何合乎需要的表达系统，包括质粒载体和病毒载体用作表达重组蛋白质的表达载体。已知多种用于生产重组蛋白质的表达载体-宿主细胞系统，可使用任何合乎需要的宿主细胞，例如细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。使用已知的蛋白质纯化方法可以将所表达的重组蛋白质纯化为基本上纯的形式。在本发明的一个优选实施方案中，可在哺乳动物细胞内表达与表位融合的MHC I类重链或β2m。由于在哺乳动物细胞中表达能够用糖链等对表达的蛋白质进行正常修饰，因此，与在大肠杆菌中表达相比，在哺乳动物细胞中表达可增强给免疫细胞呈递抗原的效率。可在哺乳动物细胞中表达的载体不仅可用于生产重组蛋白质，还可以将其导入细胞并在靶细胞表面展示外源性抗原。优选通过将能感染哺乳动物细胞的病毒载体导入细胞，而在哺乳动物细胞中表达与表位融合的MHC I类重链或β2m以及TAP抑制蛋白。

可将编码与表位相连的β2m和MHC I类重链的膜结合形式的基因导入细胞，以大量表达将在细胞表面展示特定表位的MHC I类/肽复合物。这些细胞对表位特异性CTL有极佳的抗原呈递能力。

即，本发明提供了：

(1)产生与表位融合的MHC I类重链或与所述表位融合的β2m的方法，其中所述方法包括下述步骤：

(a)抑制细胞中的TAP活性；和

(b)在所述细胞中表达所述的与所述表位融合的MHC I类重链或所述的与所述表位融合的β2m。

(2)(1)的方法，其中所述方法还包括酸处理步骤。

(3)(1)或(2)的方法，其中所述抑制细胞中的TAP活性的步骤是使具有TAP抑制活性的蛋白质与所述细胞接触，或将编码所述蛋白质的载体导入所述细胞的步骤。

(4)(3)的方法，其中所述具有TAP抑制活性的蛋白质是US6或ICP47。

(5)(3)的方法，其中所述载体是能感染哺乳动物细胞的病毒载体。

(6)(5)的方法，其中所述载体是仙台病毒载体。

(7)含有与表位融合的MHC I类重链或与所述表位融合的β2m的组合物，其中通过(1)至(6)中任一项的方法生产所述的与所述表位融合的MHC I类重链或所述的与所述表位融合的β2m。

本发明还涉及生产能表达与表位融合的MHC I类重链或β2m的哺乳动物细胞的方法。具体地说，该方法包括下述步骤：(a)抑制哺乳动物细胞中的TAP活性；和(b)在细胞中表达编码与表位融合的MHC I类重链或β2m的基因。对步骤(a)和(b)的次序没有限制。可以先进行其中任一步骤，或者同时进行两个步骤。所获得的细胞可用于引发抗原-特异性的细胞免疫力。例如，通过使用此方法在源自患者的细胞(如树状细胞)中高频率表达所需外来表位，即可在患者体内引发抗原-特异性的细胞免疫力。特别优选通过将编码具有TAP抑制活性的蛋白质的载体导入细胞，来进行抑制哺乳动物细胞中的TAP活性的步骤。这会导致TAP抑制蛋白在细胞中表达。当同时进行步骤(a)和(b)时，本发明还包括在细胞中同时导入编码具有TAP抑制活性的蛋白质和与表位融合的MHC I类重链或β2m的载体的步骤，以及通过将编码具有TAP抑制活性的蛋白质的基因插入编码与表位融合的MHC I类重链或β2m的载体，而由单个载体同时表达两种蛋白质的步骤。或者，将步骤(b)用于TAP基因已缺失或TAP表达已被抑制的细胞。可从这些细胞或培养物上清液中回收所生产的与表位融合的MHC I类重链或β2m。通过例如已知的基因靶向法，可以制备出TAP基因已缺失的细胞。使用Cre-loxP系统等也可以对TAP基因表达进行条件控制。本发明提供了哺乳动物细胞，其中TAP活性受到抑制，但仍以可表达的方式含有编码与表位融合的MHCI类重链或β2m的基因。另外，本发明提供了哺乳动物细胞，其含有TAP抑制剂或以可表达的方式含有编码TAP抑制剂的基因，还以可表达的方式含有编码与表位融合的MHC I类重链或β2m的基因。本文中的术语“细胞以可表达的方式含有基因”指的是基因在细胞中表达或基因保留在细胞内，使得用药物等可诱导其表达。例如，它包括能使用诱导型启动子或Cre-loxP系统诱导表达基因的细胞。

即本发明提供了：

(1)哺乳动物细胞(i)其中TAP活性受到抑制，和(ii)以可表达的方式携有编码与表位融合的MHC I类重链的基因或编码与表位融合的β2m的基因。

(2)哺乳动物细胞(i)其中TAP基因的表达受到抑制，含有TAP抑制剂，或以可表达的方式携有编码TAP抑制剂的基因，和(ii)以可表达的方式携有编码与表位融合的MHC I类重链的基因或编码与表位融合的β2m的基因。

(3)(2)的方法，其中TAP抑制剂是US6或ICP47。

(4)(1)至(3)中任一项的方法，其中经由能感染哺乳动物细胞的病毒载体将编码TAP抑制剂的基因和/或编码与表位融合的MHC I类重链或与表位融合的β2m的基因导入细胞。

(5)(4)的方法，其中载体是仙台病毒载体。

(6)含有(1)至(5)中任一项的哺乳动物细胞的组合物。

对能感染哺乳动物细胞的病毒载体没有限制，当使用能感染哺乳动物细胞的病毒载体表达TAP抑制蛋白和/或与表位相连的β2m或MHC I类重链时，可以使用任何合乎需要的病毒载体。另外，本发明所用的能感染哺乳动物细胞的病毒载体能感染除哺乳动物细胞以外的细胞。优选载体对宿主细胞没什么毒性，并能获得高水平的转基因表达。适用于本发明的病毒载体包括例如腺病毒载体、腺-伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、痘苗病毒载体、禽痘病毒载体和仙台病毒载体，但本发明并不局限于此。使用这些载体系统，可以构建出表达TAP抑制剂，与表位相连的MHC I类重链或β2m，或TAP抑制剂和与表位相连的MHC I类重链或β2m的重组病毒载体。本文所用术语“重组病毒载体”指的是通过重组多核苷酸产生的病毒载体。重组多核苷酸被定义为其一端或两端不象天然状态下那样被结合的多核苷酸。更具体地，它指人工重组的多核苷酸链或新合成的多核苷酸。“重组”病毒载体包括例如通过基因操作构建的病毒载体，以及通过基因扩增构建的载体而制备的病毒载体。通过在宿主细胞中表达重组病毒cDNA以重建病毒颗粒，即可产生重组病毒载体。

根据本领域技术人员已知的方法可制备重组病毒载体。例如，根据Saito等人的方法(Miyake et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1320-24(1996)；Kanegae et al.，“Biomanual Series 4-Gene Transfer and Expression，Methods ofAnalysis”(in Japanese)，43-58(1994)，Yodosha)，可以构建出基因治疗最常用的腺病毒载体。例如，用适当的限制性酶(例如SwaI)切割42kb的粘粒pAdexlcw(Kanegae et al.，Saiboukougaku，13(8)：757-763(1994))，其含有31kb Ad DNA，几乎是除E1和E3区外的全长腺病毒(Ad)5型基因组，然后适当脱盐并通过凝胶过滤进行纯化。随后使用T4 DNA连接酶，使外源基因的表达单位与经切割的粘粒发生连接反应，通过热处理使酶失活。通过凝胶过滤使所得连接物脱盐，然后用SwaI切割。苯酚处理和凝胶过滤之后，再次用SwaI切割经切割的产物。使用Gigapack XL(Stratagene，USA)体外包装部分产物。然后将连接的产物导入大肠杆菌细胞。由细胞的一些氨苄青霉素-抗性转化子制备粘粒，通过用限制性酶消化分析其结构，从而分离出以所需方向(与E1A和E1B的转录方向相反)插入外源性基因表达单位的重组粘粒。在另一个系列中，通过Saito等的方法(Kanegae et al.，文献同上)制备缺乏E1和E3区域的腺病毒5型(Ad5毒株d1X)的DNA-末端蛋白质复合物(DNA-TPC)。用例如EcoT22I消化该复合物，然后通过凝胶过滤等进行脱盐和纯化。将经EcoT22I消化的片段与按上文所述获得的重组粘粒混合，然后使用例如Cellphect试剂盒(Pharmacia，Sweden)导入293细胞。第二天，悬浮被转染的293细胞，将悬浮液及其10倍至100倍的稀释液接种于96-孔培养板上。约2周后，从孔中分离含有死细胞的培养物溶液，其中可观察到(通过在293细胞中重组而产生的)重组腺病毒的增殖。反复冻融培养物溶液以从细胞中释放出腺病毒颗粒。离心后，用上清液(原代病毒溶液)感染铺于24-孔培养板上的293细胞。3天后，分离含有死细胞的培养物溶液。冻融部分溶液，象制备原代病毒溶液那样离心获得上清液(继代病毒溶液)。离心其余溶液以获得细胞。由细胞制备DNA，通过用限制性酶消化分析重组腺病毒DNA的结构，以选择经证实具有所需DNA结构的克隆。用较大量的继代病毒溶液感染293细胞，类似地冻融培养物溶液，离心获得第三代病毒溶液。根据Saito等的方法(Kanegae et al.，文献同上)测定第三代病毒溶液的滴度之后，即可获得重组腺病毒载体(Miyake et al.，文献同上；Kanegae et al.，Acta Paediatr.Jpn，38：182-188(1996))。

另外，例如，也可以使用逆转录病毒载体(Wakimoto et al.，Protein NucleicAcid and Enzyme 40：2508-2513(1995))和腺-伴随病毒载体(Tamaki et al.，Protein Nucleic Acid and Enzyme 40：2532-2538(1995))。本领域已知有效产生这些载体的方法。

为了产生其它可用于将基因转移至哺乳动物细胞内的载体，国际公开号Hei 6-502069的已公开日语译文、已审公开的日本专利申请号(JP-B)Hei6-95937和JP-B Hei 6-71429公开了产生重组痘苗病毒的详细方法。另外，JP-B Hei 6-34727和国际公开号Hei 6-505626的已公开日语译文公开了产生重组乳头瘤病毒的方法。另外，未审公开的日本专利申请号(JP-A)Hei5-308975公开了产生重组腺-伴随病毒的方法，国际公开号Hei 6-508039的已公开日语译文公开了产生重组腺病毒的方法。

在本发明中，特别优选的能感染哺乳动物细胞的病毒载体包括副粘病毒载体。本文中的术语“副粘病毒载体”指的是源自副粘病毒、能将基因转移至宿主细胞的载体。最近，属于副粘病毒科的仙台病毒(SeV)被开发成为一种基因转移载体(Kato，A.et al.，EMBO J.16：578-589(1997)；WO97/16538；WO 97/16539)。SeV载体毒性较低，并能由转移基因表达大量蛋白质。此外，由于插入载体的基因未被导入宿主染色体，因此，SeV载体具有安全性高的优点。SeV载体具有高基因组稳定性，根据异源基因表达实验，已证实该载体能长时间稳定表达插入的异源基因，尽管持续多次地进行传代，基因的碱基中却没出现多少突变(Yu，D.et al.，Genes Cells 2，457-466(1997))。另外，可导入基因的大小以及因缺乏衣壳结构蛋白而导致的包装柔性是SeV载体的另一个有利特性。具有复制能力的SeV载体能导入至少为4kb的外源基因。另外，通过在载体中添加转录单位，可以同时表达两个或多个基因。基于SeV复制子由载体复制的病毒载体重新感染至邻近的细胞。然后，在被感染细胞的胞质中复制的多拷贝RNP在细胞分裂的过程中分布至子代细胞，因此，载体有望持续表达。另外，SeV载体具有较宽的组织适应性。

由于仙台病毒载体不是人类的病原体，因此，就安全性而言，优选将仙台病毒用于人类基因治疗的临床试验。高效基因转移的主要障碍是：在大多数情况下，导入的DNA必须被转运至细胞核中，或者必须清除核膜以经由质粒DNA等表达转基因。然而，对于仙台病毒而言，外源基因的表达由细胞微管蛋白以及病毒复制时胞质中的RNA聚合酶(L蛋白)共同驱动。这表明仙台病毒不与宿主细胞的染色体相互作用，这就避免了细胞癌化和无限增殖化的危险。另外，已知仙台病毒对于啮齿类动物而言是导致肺炎的病原体，但它不是人类的病原体，这一点得到有关研究结果的支持，所述研究证实鼻内施用野生型仙台病毒对非人灵长类动物不会造成伤害(Hurwitz，J.L.et al.，Vaccine，15：533-540(1997))。这些特征表明仙台病毒载体可用于人类治疗，并且进一步支持了仙台病毒载体是体内或来自体内的基因治疗的理想工具之一这一观点。

本文所用术语“副粘病毒”被定义为副粘病毒科的病毒或其衍生物。本发明中所用的副粘病毒包括例如：属于副粘病毒科的病毒，如仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒、distemper病毒、猴副流感病毒(SV5)、以及I，II和III型人副流感病毒。在本发明中，优选的副粘病毒包括属于副粘病毒亚科(包括呼吸病毒属、风疹病毒属和麻疹病毒属)的病毒，更优选呼吸病毒属(也称为副粘病毒属)或其衍生物。可用于本发明的呼吸病毒包括例如I型人副流感病毒(HPIV-1)，III型人副流感病毒(HPIV-3)，III型牛副流感病毒(BPIV-3)，仙台病毒(也称为I型小鼠副流感病毒)和X型猴副流感病毒(SPIV-10)。在本发明中，最优选副粘病毒是仙台病毒。这些病毒可以是天然的、野生型的、突变的、实验室-传代的、人工构建的毒株等。不完整的病毒，如DI颗粒(Willenbrink，W.and Neubert，W.J.，J.Virol.68：8413-8417(1994))以及合成的寡核苷酸可用作生产病毒载体的原料。

通过构建与适当启动子相连的、含有编码病毒基因组的DNA的重组DNA，在体外或体内转录构建体，在副粘病毒L、P和NP蛋白的存在下重建RNP，并形成含有RNP的病毒颗粒，即可产生重组副粘病毒载体。根据本领域技术人员已知的方法，即可由载体DNA重建病毒(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820(1997)；Kato，A.et al.，EMBO J.16：578-587(1997)；Yu，D.et al.，Genes Cells 2：457-466(1997)；WO 97/16539；WO97/16538；Durbin，A.P.et al.，Virol.235：323-332(1997)；Whelan，S.P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392(1995)；Schnell，M.J.et al.，EMBO J.13：4195-4203(1994)；Radecke，F.et al.，EMBO J.14：5773-5784(1995)；Lawson，N.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481(1995)；Garcin，D.et al.，EMBO J.14：6087-6094(1995)；Kato，A.et al.，Genes Cells 1：569-579(1996)；Baron，M.D.and Barrett，T.，J.Virology 71：1265-1271(1997)；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404(1996))。这些方法能由DNA重建出合乎需要的副粘病毒载体，包括副流感病毒、水泡性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙台病毒载体，以及其它(-)链RNA病毒载体。一般通过下述步骤制备副粘病毒载体：(a)在表达NP，P和L蛋白的细胞(辅助细胞)中转录得自副粘病毒、编码负单链RNA或其互补链(正链)的载体DNA；(b)培养细胞并由培养物上清液回收病毒颗粒。由载体DNA转录的RNA与NP，L和P蛋白形成RNP复合物，导致产生由含包膜蛋白的外部包膜包裹的病毒颗粒。

本发明的其它病毒载体包括病毒基因有缺失的病毒载体。例如，可使用病毒复制的必需基因已缺失的复制缺陷型病毒载体。当副粘病毒载体DNA中的F基因和/或HN基因等缺失时，病毒自身不会形成感染性的病毒颗粒。通过将这些缺失的基因和/或编码另一种病毒的包膜蛋白的基因导入病毒生产细胞，并分开表达它们，即可装配出感染性的病毒颗粒。根据或基于本领域技术人员已知的方法(WO 00/70055和WO 00/70070)，也可以产生这些缺失型病毒载体。通过例如添加至基因上游的转录起始序列的类型即可控制载体的外源基因表达水平(WO 01/18223)。另外，病毒载体还包括含有其它病毒的包膜蛋白的假型病毒载体。所述包膜蛋白可以是例如VSV-G(WO 00/70055和WO 00/70070)。

可将收集到的动物细胞-感染性病毒载体纯化至基本上纯。通过已知的纯化/分离方法，包括过滤、离心和柱纯化或其组合即可进行纯化。术语“基本上纯”指的是在病毒载体作为组分存在于其中的样品中，病毒载体是样品的主要部分。一般说来，当得自病毒载体的蛋白质占样品中总蛋白质(除去作为载体或稳定剂添加于其中的蛋白质)的10％或以上，优选20％或以上，更优选50％或以上，更优选70％或以上，更优选80％或以上，甚至更优选90％或以上时，可以证实样品是基本上纯的病毒载体。副粘病毒纯化方法的具体例子包括使用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(JP-B Sho62-30752；JP-B Sho 62-33879；和JP-B Sho 62-30753)，以及用含有岩藻糖硫酸的多糖和/或其降解产物吸附病毒的方法(WO 97/32010)。

通过将以可表达的方式编码TAP抑制蛋白以及与表位相连的β2m或MHC I类重链的、能感染哺乳动物细胞的病毒载体导入哺乳动物细胞，即可在细胞内高频率表达所需表位。本发明提供了生产与表位相连的β2m或与表位相连的MHC I类重链的方法，所述方法包括将(一种或多种)能感染哺乳动物细胞的病毒载体导入哺乳动物细胞的步骤，所述病毒载体以可表达的方式编码：(i)TAP抑制蛋白；和(ii)与表位相连的β2m或与表位相连的MHC I类重链。在本发明中，编码(i)和(ii)的、能感染哺乳动物细胞的病毒载体可以是不同的或相同的。

另外，本发明提供了哺乳动物细胞，其中已导入(一种或多种)能感染哺乳动物细胞的病毒载体，所述病毒载体以可表达的方式编码：(i)TAP抑制蛋白；和(ii)与表位相连的β2m或与表位相连的MHC I类重链。在本发明中，编码(i)和(ii)的、能感染哺乳动物细胞的病毒载体可以是不同的或相同的。另外，本发明提供了上述哺乳动物细胞，其中当表位与β2m相连时，进一步导入以可表达的方式编码不含表位的MHC I类重链的、能感染哺乳动物细胞的病毒载体，或者当表位与MHC I类重链相连时，进一步导入以可表达的方式编码不含表位的β2m的、能感染哺乳动物细胞的病毒载体。这些载体可以与编码TAP抑制蛋白和与表位相连的蛋白质的载体相同或不同。TAP抑制蛋白的具体例子是US6和ICP47。另外，特别优选将副粘病毒载体用作能感染哺乳动物细胞的病毒载体。

通过本发明的方法表达的与表位相连的β2m可用于体外CTL试验。CTL试验的靶细胞一般包括得自与CTL相同之个体的细胞系。例如，可将用合成肽脉冲的、被EB病毒转化的B细胞系(自身-类淋巴母细胞系，自身-LCL)的细胞用作靶细胞。或者，不使用合成肽，而是添加通过本发明方法制备的与表位相连的β2m，或者将表达例如TAP抑制蛋白和与表位相连的β2m的病毒载体感染至自身-LCL。通过共-感染分别表达例如TAP抑制蛋白、所需的MHC I类重链(膜-结合形式)、以及将要展示于MHC I类重链上的与表位相连的β2m的病毒载体，可以类似地使用人细胞系的细胞。

另外，可使用通过本发明的方法产生的与表位相连的β2m来建立表位-特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。通过体外特异性的单次或多次刺激，可以建立这种表位-特异性CTL。例如，通过使用经HIV Nef138-10肽脉冲的经照射自身PBMC刺激感染了HIV的个体的外周血单核细胞(PBMC)，然后在IL-2的存在下共培养，即可建立HIV Nef138-10-特异性CTL。本文通常使用合成肽，但被表达与表位相连的β2m的病毒载体感染的细胞的培养物上清液(游离形式的与表位相连的β2m)显示出类似的作用。也可通过将表达例如TAP抑制蛋白和与表位相连的β2m的病毒载体感染至刺激细胞来建立表位-特异性CTL。

可使用通过本发明方法获得的与表位相连的β2m来诱导抗原-特异性细胞免疫应答。即，得自本发明的与表位相连的β2m可用作抗原-特异性细胞免疫应答的诱导物。根据本发明获得的与表位相连的β2m可用于诱导抗原-特异性细胞免疫应答。

另外，经由SeV表达系统表达的与表位相连的β2m与细胞表面作为分泌蛋白的HLA-A*2402分子结合，可以有效地将抗原呈递至CTL。通过本发明的方法产生的与表位相连的β2m可用作蛋白质制品。即通过纯化与表位相连的β2m并从中除去污染的病毒，即可获得可用于临床的抗原-特异性细胞免疫应答的诱导物。通过本发明的方法产生的与表位相连的β2m可用作药物组合物的成分。

例如，通过包括使与表位相连的β2m与(表位-特异性)CD8+T细胞接触之步骤的方法，可以特异性地使用与表位相连的β2m诱导抗原-特异性细胞免疫应答。

例如，与表位相连的β2m可用于在体外建立表位-特异性CTL细胞系。通过体外的一至几轮特异性刺激，可以建立表位-特异性CTL细胞系。例如，为了建立HIV Nef138-10-特异性CTL细胞系，可使用经HIV Neff38-10肽脉冲的经照射自身PBMC刺激感染了HIV-1的个体的PBMC，然后在IL-2的存在下共培养。本文通常使用合成肽进行刺激；然而通过加入根据本发明方法产生的与表位相连的β2m也能获得类似效果。

另外，在体外的CTL试验中，与表位相连的β2m可用于脉冲靶细胞。可用根据本发明方法产生的与表位相连的β2m，而不是用合成肽来脉冲CTL试验中的靶细胞，所得结果与使用合成肽的相同。一般说来，细胞表面已表达了MHC I类重链(膜-结合形式)+β2m+肽的复合物。用肽脉冲欲用脉冲肽替代复合物的肽部分。当用与表位相连的β2m脉冲时，β2m和复合物的肽部分会发生有效交换。通过酸处理可除去预先存在的表位肽。

与表位相连的β2m也可用于脉冲来自患者体内的树状细胞。从患者体内分离外周血单核细胞，然后通过标准方法诱导其分化成树状细胞。例如，给患者皮下施用树状细胞，所述细胞中已导入表达与表位相连的β2m和TAP抑制蛋白的病毒载体。结果，与体外实验中类似，由于与表位相连的β2m在细胞表面被表达成MHC I类重链和与表位相连的β2m的复合物，因此有望诱导表位-特异性CTL。由于与被肽脉冲的细胞相比，用与表位相连的β2m脉冲的树状细胞有望以较高密度在MHC I类重链上稳定而长期地表达表位，因此，所述树状细胞可用作细胞疫苗(治疗性疫苗)。

以可表达的方式编码与表位相连的β2m或MHC I类重链的、能感染哺乳动物细胞的病毒载体可与能表达TAP抑制剂或TAP抑制蛋白的载体联合用于诱导抗原-特异性细胞免疫应答。本发明涉及一种组合物，其含有：(i)TAP抑制剂或以可表达的方式编码TAP抑制剂的载体；和(ii)(a)与表位相连的β2m或与表位相连的MHC I类重链，或(b)以可表达的方式编码与表位相连的β2m或与表位相连的MHC I类重链的载体。载体可适当悬浮于药物可接受的溶液中。例如，载体可包含在生理盐水、培养液或血清中。所述组合物可用作在MHC I类上展示外来表位的增强剂。所述组合物也可用作抗原-特异性细胞免疫应答的诱导物。编码TAP抑制蛋白的载体可以不同于编码与表位相连的β2m或编码MHC I类重链的载体，或者，单个载体可编码这些蛋白质。即，本发明还包括以可表达的方式编码TAP抑制剂以及与表位相连的β2m或MHC I类重链中的任一种的载体。另外，本发明涉及(i)TAP抑制剂或以可表达的方式编码TAP抑制剂的载体；和(ii)与表位相连的β2m或MHC I类重链，或以可表达的方式编码与表位相连的β2m或MHCI类重链的载体在提高MHC I类上展示的外来表位水平和诱导抗原-特异性细胞免疫应答中的用途。这些病毒载体可用于基因治疗。本发明提供了药物组合物，其含有(i)TAP抑制剂或以可表达的方式编码TAP抑制剂的载体；和(ii)与表位相连的β2m或MHC I类重链，或以可表达的方式编码与表位相连的β2m或MHC I类重链的载体。另外，本发明涉及用于展示表位的试剂盒，其含有(i)TAP抑制剂或能表达TAP抑制剂的载体；和(ii)与表位融合的MHC I类重链或β2m，或能表达与表位融合的MHC I类重链或β2m的载体。如果可能的话，将(i)和(ii)分开，也可以将它们混合。所述试剂盒可包括多种TAP抑制剂或能表达它们的载体，也可包括多种MHC I类重链或β2m，或能表达多种MHC I类重链或β2m的载体。它们可适当溶解或悬浮于药物可接受的溶液中。特别优选载体是能感染动物细胞的病毒载体。由于本发明的含有载体的组合物以及试剂盒能够诱导抗原-特异性细胞免疫应答，因此它们可用于诱导针对感染、癌症等的抗原-特异性免疫应答。通过直接(体内)施用或间接(回体)施用所述组合物或试剂盒而进行的基因表达，即可在基因治疗中使用本发明的组合物或试剂盒。

例如，在体外建立表位-特异性CTL细胞系的过程中，通过使用上述组合物或试剂盒而不是使用合成肽即可获得刺激细胞的刺激作用。

本发明的组合物和试剂盒也可用于在体外CTL试验中脉冲靶细胞。在TAP受抑制的条件下用表达与表位相连的β2m的病毒载体感染，而不是使用合成肽脉冲的自身-LCL细胞可用作靶细胞来检测细胞毒活性。另外，为了将人细胞系用作靶细胞，可用表达所需MHC I类重链(膜-结合形式)的病毒载体，以及表达通过MHC I类重链呈递的与表位相连的β2m和TAP抑制蛋白的病毒载体共感染所述细胞。

另外，本发明的组合物和试剂盒可用于在患者的树状细胞中回体表达表位。从患者体内分离外周血单核细胞，通过标准方法诱导其分化至树状细胞。将本发明的组合物施用于树状细胞，然后将细胞接种于患者皮下。特别适合使用病毒载体进行基因转移。重点是在经脉冲的树状细胞表面，脉冲肽或与表位相连的β2m蛋白的表达能持续多久。实际上，当用肽脉冲细胞时，树状细胞表面的表位表达在短期内消失。与之形成对照的是，通过使用能在细胞内表达与表位相连的β2m的病毒载体感染树状细胞，即可长期表达与表位相连的β2m。另外，本发明的组合物和试剂盒也可用于体内基因治疗，其中通过体内施用所述组合物和试剂盒，可诱导表位-特异性的CTL。

用于表达外来表位的基因转移靶细胞优选包括具有抗原呈递能力的细胞。所述细胞特别地包括树状细胞(DC)。例如，通过使用本发明的方法，将表达与外来表位相连的β2m或MHC I类重链的载体导入来自体内的树状细胞，即可在树状细胞中以高频率形成所需的MHC I类/肽复合物。所得细胞可用于激活抗原-特异性T细胞。本发明包括哺乳动物细胞，其中已外源性导入编码与表位相连的β2m或MHC I类重链的基因，而且TAP活性受到抑制。具有抗原-呈递能力的合乎需要的分离细胞可用作哺乳动物细胞。特别地，也可将编码不与表位相连的MHC I类/肽复合物亚单位的外源基因导入细胞，以形成大量MHC I类/肽复合物。转基因可由染色体外部的表达载体编码，或整合至细胞染色体内。当表达膜-结合形式的MHC I类重链时，与膜结合的MHC I类/肽复合物在细胞表面表达。所述细胞对表位-特异性CTL有极好的抗原-呈递能力。上文所述的其中已导入编码与表位相连的β2m或与表位相连的MHC I类重链的外源基因，而且TAP活性受到抑制的哺乳动物细胞也可用作药物组合物的成分。

必要时，本发明的组合物可与合乎需要的药物可接受载体混合。本文中的术语“药物可接受的载体”表示能给细胞施用，且不会显着抑制活性成分的活性的物质。例如，本发明的组合物可包括生理盐水，磷酸缓冲盐水(PBS)等。当在鸡蛋中增殖副粘病毒载体时，含有载体的组合物可含有尿囊酸。另外，含有细胞的组合物可悬浮于生理盐水、PBS、培养液等中。另外，本发明的组合物可含有载体，如去离子水和5％葡萄糖溶液。另外，组合物还可含有其它成分，包括植物油、悬浮剂、去污剂、稳定剂和抗生素。另外，还可加入防腐剂和其它添加剂。本发明的组合物可用作试剂和药物。组合物还可用作疫苗。本发明还涉及本发明的组合物用作试剂、药物或疫苗的用途。为了增强免疫原性，疫苗组合物也可含有免疫促进剂，包括细胞因子、霍乱毒素和沙门氏菌毒素。另外，疫苗可与佐剂混合，佐剂包括明矾、不完全弗氏佐剂、MF59(油乳剂)、MTP-PE(得自分枝杆菌细胞壁的胞壁酰三肽)和QS-21(得自皂树Quilaja saponaria)。

另外，可有效地与细胞因子组合以增强施用本发明的药物组合物的佐剂作用。所述组合包括：i)IL-2与单链IL-12的组合(Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(15)：8591-8596(1999))，ii)IL-2与γ-干扰素的组合(美国专利号5,798,100)，iii)仅用GM-CSF，和iv)用于治疗脑瘤的GM-CSF与IL-4的组合(J.Neurosurgery 90(6)：1115-1124(1999))。

本发明的疫苗可用于例如肿瘤、感染和其它一般性疾病。例如，为了治疗感染，需分析传染性微生物抗原蛋白质的表位，然后产生与表位融合的β2m或MHC I类重链。抗原蛋白质包括例如针对流感的强毒株型H5N1的包膜；针对日本脑炎的包膜蛋白(Vaccine 17(15-16)：1869-1882(1999))；针对AIDS的HIV gag或SIV gag蛋白(J.Immunology 164：4968-4978(2000))，HIV包膜蛋白，Nef蛋白和其它病毒蛋白质；霍乱抗原，例如霍乱毒素B亚单位(CTB)(Arakawa，T.et al.，Nature Biotechnology，16(10)：934-8(1998)；Arakawa，T.et al.，Nature Biotechnology，16(3)：292-7(1998))；狂犬病抗原，例如狂犬病毒的糖蛋白(Lodmell，D.L.et al.，Nature Medicine 4(8)：949-52(1998))；和宫颈癌抗原，例如人乳头瘤病毒6型的衣壳蛋白L1(J.Med.Virol60：200-204(2000))。另外，本发明还可应用于十分需要使用疫苗的致病性副粘病毒，如麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒。另外，也可使用抗原蛋白质的表位，所述抗原蛋白质包括：日本脑炎病毒的JE-E抗原蛋白质(JP-A Sho64-74948，JP-A Hei 1-285498)，人单纯疱疹病毒的gD2蛋白(JP-A Hei5-252965)，得自丙型肝炎病毒的肽(JP-AHei 5-192160)和得自假狂犬病毒的多肽(国际公开号7-502173的已公开日文译文)。例如，分析被这些病原体微生物感染的患者的细胞，以鉴定抗原呈递细胞(APC)上呈递的抗原蛋白质的表位。通过选择适当的HLA类型即可鉴定出针对所需HLA类型的表位。

治疗肿瘤时，在临床上至关重要的是针对肿瘤-特异性抗原开发出不同的和新颖的治疗策略和方法。例如，在肿瘤疗法中，可在抗原-呈递细胞(APC)，如肿瘤细胞或DC细胞中表达与表位相连的β2m或MHC I类重链，或者也可以施用蛋白质产物，如与表位相连的β2m和MHC I类/肽复合物。

开发疫苗疗法的一般方法包括使用DC细胞，已知DC细胞具有为辅助T细胞(Th)呈递抗原的能力，并具有经由MHC I类分子将抗原高效呈递给CTL的能力(Mayordomo，J.I.et al.，Nature Med.1(12)：1279-1302(1995))。作为肿瘤免疫疗法的一个例子，Yasushi Fuji等(National Hospital Kyushu CancerCenter)正在进行一项研究，旨在建立一种利用经证实能在多种恶性肿瘤中表达的MAGE抗原作为靶标的肿瘤疫苗疗法。对7个病例使用了该方法，包括6例复发的胃肿瘤和1例复发的食道肿瘤。结果，在复发的食道肿瘤病例中观察到转移淋巴结缩小，肿瘤标记物的减少以及临床症状(嘶哑)的改善。在6例胃肿瘤的4例中观察到肿瘤标记物的减少。未观察到副作用，暗示出肿瘤免疫疗法的安全性。另外，在很多病例中观察到临床症状的改善和肿瘤标记物的减少，这表明通过选择给药途径、适用的病例等，免疫疗法有可能用作有效的治疗方法。在实践中，已开始对使用MAGE-3肽的DC疫苗疗法进行临床研究，已证实所述疗法是针对进行性复发消化器官癌症病例的安全的肿瘤-特异性免疫疗法。然而，为了给很多患者预防性地施用这种疫苗，寻找给每个患者施用作为“天然佐剂”的树状细胞的最佳状况显然是困难的和不现实的。因此，本领域需要有效的方法(Yamagishi，H.etal.，Oral presentation in the General meeting of Japan society of Cancer Therapy：October 12(1999)，Gifu City)。将本发明应用于这种肿瘤疫苗疗法将会十分有效。

通过使用病毒疫苗防止感染即可预防由病毒引起的肿瘤发生。因此，与由其它因素导致的肿瘤相比，病毒导致的肿瘤实际上可以被更好地预防。例如，与肝肿瘤有关的丙型肝炎病毒(HCV)、与子宫癌有关的人乳头瘤病毒(HPV)和与成人T细胞白血病有关的HTLV-1是旨在预防和治疗感染的候选疫苗。肝肿瘤在日本人的肿瘤中占较大比例。丙型肝炎病毒感染不是在口腔中发生的，其中的大部分会变成慢性，甚至在具有正常免疫能力的健康成人中也是如此。约20％被感染的个体预计会患有慢性肝炎或肝硬化。另外，很多肝硬化患者会得肝细胞癌。尽管用干扰素治疗丙型肝炎可以治愈部分患者，但其效力并不能如最初预期的那样，直至目前，对超过一半的患者仍没有有效的疗法。一般说来，通过免疫接种诱导中和抗体就可以预防病毒感染。然而，丙型肝炎病毒很容易突变，迄今为止尚未证实能中断其感染的中和抗体的存在。已知除了诱导中和抗体外，诱导CTL也可预防病毒感染。本发明有望在病毒感染的过程中诱导CTL激活。

Moriyama，T等(Jichi Medical School)正在研究一种诱导CTL的新方法，该方法使用编码病原体抗原的基因本身作为疫苗(DNA疫苗)。正如他们的论文中所述，该方法也存在问题，例如表达不充分和给药位点局限于肌肉(Kurane，I.“DNA vaccine，present situation and new findings”，CurrentConcepts in Infectious Diseases 19(3)：6-9(2000))。另一篇论文描述了利用HER2的癌症疫苗，HER2是在乳腺癌中过表达的具有酪氨酸激酶活性的膜型糖蛋白(Kageyama，S.，Watanabe，M.，Hiasa，A.，and Suku，K.，“Cancer andimmunity，cancer-specific immune therapy，vaccine therapy against breast cancerusing a HER-derived peptide”，New Horizon for Medicine 32(5)：1167-1172(2000))。例如，使用本发明的病毒载体产生的癌症疫苗有望发挥比这些DNA疫苗更高的作用。通过使用在哺乳动物组织中具有较宽表达范围的病毒载体(腺病毒载体、腺-伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体等)来构建载体，即可提供高效疫苗。

尽管子宫癌是雌性-特异性肿瘤，但开发预防和治疗HPV感染的疫苗的重要性与其它肿瘤相同。HTLV-1的主要感染途径是母婴传播。然而，也有其它途径。尽管最近发现的HGV的病原性仍不清楚，但它象HCV一样在社会上广泛传播，这表明从公共卫生的角度考虑，需要预防这种病毒。因此，该病毒也是本发明作用的靶标。

有关抗原呈递细胞的应用和给药途径的研究也是至关重要的。研究得最深入的疫苗疗法给药途径包括下述步骤：(1)在体外将外周血中所含的单核细胞分化成DC；和(2)经由静脉内注射将它们返回至患者体内。该方法利用了DC细胞经由MHC I类分子将抗原呈递至CTL的能力。该系统需要良好的设备和培养时间。最近，有人描述了利用皮肤的疫苗疗法。有关抗病毒疫苗疗法和癌症疫苗疗法的研究引起人们的注意，所述疗法利用了树状细胞，包括朗氏细胞(LC)，最近已发现这些细胞能经由细胞表面的MHC I类分子将内源性抗原，如病毒抗原和癌症抗原有效呈递给CTL。由于很多LC细胞位于皮肤表皮，通过在皮肤上使用病毒肽或编码抗原的基因，即可开发出有效的DNA疫苗疗法。然而，正常皮肤中的LC细胞处于休眠状态，对Th和CTL具有较低的抗原呈递能力，迁移至淋巴结的能力较差。因此，使用正常皮肤难以实现病毒疫苗疗法或癌症疫苗疗法。为了解决这些问题，Naohiro Seo和Masahiro Takigawa(Hamamatsu Univ.School of Medicine)及其同事证实：通过8至15次重复用纱带摩擦(TS)以破坏最外面的皮肤层，即角质层屏障，皮肤上的LC细胞被激活，然后迁移至淋巴结并将抗原有效呈递至Th细胞(日本专利申请号Hei 10-316585，“Percutaneous peptideimmunization via comeum barrier-disrupted murine skin for experimental tumorimmunoprophylaxis″；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：371-376(2000))。该方法因能将病毒肽、癌症肽或抗原DNA应用于屏障受损的皮肤而扩展了病毒疫苗和癌症疗法的可能性。这些给药方法可应用于本发明。

为了完成更加大胆的临床应用，重要的是构建人HLA-局限型癌症-特异性CTL细胞系，并且克隆编码癌症-反应性CTL-诱导抗原的基因，所述抗原被所述细胞系识别，从而开发出在临床上可用于针对癌症患者的肿瘤-特异性免疫疗法的靶分子。通过鉴定与患者的HLA类型相同的HLA所呈递的表位，并使用鉴定出的表位产生疫苗载体或肽疫苗，有望更加有效地诱导免疫应答。

日本人种群中多发的癌症包括例如肺癌、消化道癌(食道、胃和结肠癌)、肝癌、头颈癌、乳腺癌、子宫癌、恶性卵巢瘤、肾瘤和白血病。在这些癌症中，临床上选择鳞状细胞癌和腺癌的组织类型作为治疗靶是有用的，因为它们占日本人群癌症中的大多数。表皮癌不仅占日本成人恶性肿瘤中的大多数，在世界范围内也是最多发的癌症。因此，表皮癌细胞-特异性抗原的表位适用于本发明。另外，关于HLA，鉴定出HLA-A24(约60％癌症患者)，HLA-A2(约40％)和HLA-A26(约20％)-局限型CTL-识别的癌症-消退抗原特别重要，因为这些HLA类型在日本也占据优势。根据这些类型，鉴定出预期为HLA-A11(20％)，HLA-A31(达20％)和HLA-33(达20％)的抗原也是至关重要的。95％或更多的日本人种群具有HLA-A24，-A2，-A26，-A31和-A33中的至少一种。另外，这些HLA等位基因在不同种族中广泛分布。因此，优选从具有这些HLA类型的细胞中鉴定出编码癌症-反应性CTL-诱导抗原的基因，并将它们用于本发明。

Kyogo Ito(Medical school of Kurume Univ.)等建立了多种针对在日本人中多发的人HLA类-局限型表皮癌(腺癌和鳞状细胞癌)的特异性杀伤性T细胞，并且克隆了编码抗原的基因，所述抗原由这些细胞识别，并能诱导表皮癌-反应性CTL。另外，他们还鉴定出由所述基因编码的癌症抗原肽，并在体外分析所述抗原肽诱导杀伤性T细胞的能力(Tou，U.，Yamana，H.，Sueyoshi，S.，Shintani，F.，Tanaka，T.，Kubota，M.，Mine，T.，Sasahara，H.，and Ito，K.，“Cloning and analysis of an antigen gene from the peripheral bloodlymphocytes after the specific adoptive immunotherapy by a local injection ofCTL from a patient carrying esophagus cancer”，The Japanese Society ofGastroenterological Surgery33(7)：1191(2000))。迄今为止，已克隆出分别得自鳞状细胞癌和腺癌cDNA文库的4个基因(SART-1至SART-4)和3个基因，并且分析了它们的编码蛋白质。在导入SART-1基因的癌细胞中诱导选择性细胞凋亡。另外，HLA-A24-局限型肽(SART-1 690-698)强烈诱导CTL，HLA-A26-局限型肽(SART-1 736-744)在具有HLA-A2601，-A2602或-A2603的癌症患者中诱导CTL(Yamana，H.and Ito，K.(Medical School of KurumeUniv.)，“Antigen peptide therapy of tumors；cancer immunotherapy using theSART-1 antigen peptide”，Journal of Clinical and Experimental Medicine 190(2)：129-133(1999)；Inoue，K.(Research Institute of National Cancer Center)，Nakao，M.，Matsunaga，K.，Matsuoka-kikuchi，S.，Yamana，H.，and Ito，K.(MedicalSchool of Kurume Univ.)，“Induction of CTL in peripheral blood lymphocytesfrom HLA-A26-positive healthy subjects and cancer patients with different HLAsubtypes，using the SART-1 peptide”，General meeting abstracts of JapaneseCancer Association)。另外还发现140kD SART-3-反应性癌症-反应性CTL-诱导抗原能在增殖细胞和癌细胞核中选择性地表达，在抗原中鉴定出两个九肽，它们对HLA-A24-+癌症患者的淋巴细胞具有CTL-诱导能力(Yamana，H.，Sasatomi，T.，Miyagi，Y.，Tou，U.，Shiromizu，K.，and Ito，K.(Medical Schoolof Kurume Univ.)，Japan Surgical Society(supplement)101：417(2000))。为了在多种癌症中在蛋白质水平上表达这些癌症-反应性CTL-诱导抗原，在60至80％的鳞状细胞癌和除乳腺癌外40至50％的腺癌中表达SART-1抗原；在60％以上的鳞状细胞癌中表达SART-2；在包括腺癌和鳞状细胞癌的大多数恶性肿瘤中表达SART-3。与之形成对照的是，这些抗原在除睾丸以外的正常组织中不表达(Ito，K.，Shichijo，S.，and Yamana，H.(Medical School ofKurume Univ.)，“Tumor immunity 9，Human cancer-specific T cell-recognizedantigen 2，Squamous cell carcinoma-reactive CTL-inducing antigen SART-1 andpeptide vaccines”，Immunology Frontier 9(3)：195-204(1999))。HLA-A26和HLA-A*2402分别为22％和约60％的日本人共享。因此，这些肽疫苗有望用于日本的很多鳞状细胞癌患者。Kurume大学计划使用上述肽进行1期临床研究(Yamana，H.and Ito，K.(Medical School of Kurume Univ.)，“Anexplanation of guideline to clinical studies”，A proposal regarding the firstclinical studies on tumor peptide vaccines，Cellular Molecular Medicine 1(1)：89-95(2000))。本发明可用于得自这些抗原肽的表位。

通过将编码上述肽抗原的基因用于本发明，即可进行针对肿瘤、致病的感染性微生物等的有效免疫疗法。除了这些抗原外，表位包括癌症抗原Muc-1和Muc-1-样粘蛋白串联重复肽(美国专利号5,744,144)和黑素瘤gp100抗原。使用这些基因的免疫疗法已被用于多种癌症，包括乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌等。另外还发现编码上述肿瘤抗原肽HER2的基因在约20至40％的乳腺癌、恶性卵巢瘤、胃癌和非-小细胞肺癌中过表达或扩增，显示出较高的肿瘤特异性倾向。源自HER2的两个九肽(HER2p63-71和HER2p 780-788)是本发明表位的例子，所述肽得自树状细胞，所述树状细胞纯化自恶性卵巢瘤患者和正常健康受试者的外周血单核细胞(Eur.J.Immunol.30：3338-3346(2000))。另外，本发明的药物组合物可用于使用CEA表位肽的、CEA-阳性进行性实体肿瘤的癌症疫苗疗法(Kim，C.et al.，CancerImmunol.Immunother.47：W 90-96(1998))。例如，通过有选择地收集血液成分，可从患者体内分离出大量外周血单核细胞，通过加入IL-4和GM-CSF由单核细胞组分诱导树状细胞，然后将通过本发明的方法产生的含有CEA表位肽的β2m或载体自身导入经诱导的树状细胞，最后将树状细胞作为“DC疫苗”皮下给药(Kyoto Prefectural University of Medicine)，“A case of bonemetastatic lung cancer wherein dissociation between serum CEA values andanti-tumor effect was achieved via CEA-specific active immunotherapy”.International Association of Surgeons and Gastoenterologists)。

任选地，本发明可用于一般性疾病。例如，为了治疗糖尿病，对于I型糖尿病动物模型而言，可将胰岛素片段肽用作表位(Coon，B.et al.，J.Clin.Invest.104(2)：189-194(1999))。

当用作疫苗时，可以足以至少部分诱导抗原特异性细胞免疫应答的量施用本发明的组合物。然而，蛋白质的给药剂量或基因的表达水平应通过考虑其有效水平和中毒水平来确定。给药途径可适当选自例如经皮、经鼻、经支气管、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内和皮下给药，但并不局限于此。可以局部或全身性给药。通过例如本发明所述的CTL试验即可检测对细胞免疫力的诱导。

通过本领域技术人员已知的方法可以检测使用含载体的组合物导入细胞的基因的表达水平。通过例如Northern杂交、RT-PCR或RNA保护试验可以检测和/或定量基因的转录产物。也可原位进行通过Northern杂交和RNA保护试验的检测。可使用抗体进行Western印迹、免疫沉淀、RIA、ELISA、Pull-down试验等以检测翻译产物。另外，为了较容易地检测表达产物，可在欲表达的蛋白质上连接标记物，或者将报道基因插入载体以使它们能被表达。报道基因的例子包括-半乳糖苷酶、CAT、碱性磷酸酶和GFP蛋白；然而，并不局限于此。

蛋白质组合物，如与表位相连的β2m或MHC I类/肽复合物的剂量可根据欲治疗的疾病，患者的体重、年龄、性别和症状，给药的目的，施用组合物的类型，给药途径等的不同而改变，但本领域技术人员可以适当地确定剂量。蛋白质剂量范围可以是例如10ng/kg至100μg/kg，优选为100ng/kg至50μg/kg，更优选1μg/kg至5μg/kg。当联合使用多种表位给药时，可以上述剂量施用每一种表位。蛋白质组合物，如与表位相连的β2m或MHC I类/肽复合物可以适当地与药物可接受的载体混合。

载体组合物的剂量可根据疾病、体重、年龄、性别、症状、给药的目的、转基因等的不同而改变，但本领域技术人员可以适当地确定剂量。优选以约10⁵pfu/ml至约10¹¹pfu/ml，更优选以约10⁷pfu/ml至约10⁹pfu/ml，最优选以约1×10⁸pfu/ml至约5×10⁸pfu/ml的浓度范围施用处于药物可接受载体中的副粘病毒载体。剂量优选为约10⁵pfu/轮至10¹¹pfu/轮，更优选为约10⁷pfu/轮至10⁹pfu/轮，最优选为约10⁸pfu/轮至10⁹pfu/轮。当联合施用不同载体时，以上述剂量施用每一种载体。

本发明的组合物可施用给所有的哺乳动物，包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛和狗。

附图简述

图1显示出构建能表达与表位相连的β2m(e/β2m)的SeV载体所用质粒(e/β2m/pSeVb)的结构。(A)显示出在pSeV18b(+)的NotI位点插入e/β2m的编码序列所获得的e/β2m/pSeVb的结构。(B)显示出β2微球蛋白和由载体编码的与表位相连的β2微球蛋白的结构。(C)显示出插入的NotI片段的核苷酸序列。

图2显示出构建能表达膜-结合形式的HLA-A*2402的SeV载体所用质粒(A24fu11/pSeVb)的结构。(A)显示出在pSeV18b(+)的NotI位点插入A24full的编码序列所获得的A24full/pSeVb的结构。(B)显示出插入的NotI片段的核苷酸序列。

图3显示出构建能表达TAP抑制因子的SeV载体所用质粒的结构。(A)显示出在pSeV18c(+)的NotI位点(N和P基因之间)分别插入ICP47his和US6hisA24full的编码序列所获得的ICP47his/pSeVc和US6his/pSeVc的结构。(B)显示出插入的NotI片段的核苷酸序列。

图4显示出共表达与表位相连的β2m(e/β2m)和TAP抑制蛋白(ICP47his或US6his)的SeV载体的结构。由e/β2m/pSeVb和ICP47his/pSeVc构建<e/β2m+ICP47his>/pSeV，由e/β2m/pSeVb和US6his/pSeVc构建<e/β2m+US6his>/pSeV。

图5显示出膜表达形式的MHC I类/肽复合物的作用。用感染复数(m.o.i.)分别为10和2的A24full/SeVb和e/Nef138-β2m/SeVb(图中表示为“A24full+e/Nef138-β2m”)共感染H9细胞(HLA-A*2402-人T细胞系)。将用A24full/SeVb和wt/SeV(而不是e/Nef138-β2m/SeVb)(图中表示为“A24full+wt”)共感染的H9细胞用作阴性对照。另外，用肽脉冲H9细胞以用作对比实验(图中表示为“A24full+wt肽脉冲(10μl)”)。18小时之后，用100μCiNa₂ ⁵¹CrO₄标记细胞2小时，以使用Nef138-10-特异性CTL克隆进行⁵¹Cr释放试验。(A)显示出试验方法，(B)显示出结果。

图6显示出分泌形式的与表位相连的β2m的作用。以m.o.i.为2的e/Nef138-β2m/SeVb或wt/SeV(用作对照)感染H9细胞(HLA-A*2402人T细胞系)，3天后，收集培养物上清液并使用0.22μm的滤器过滤。

作为靶细胞，以m.o.i.分别为10和2的A24full/SeVb和wt/SeV共感染H9细胞(HLA-A*2402人T细胞系)。感染18小时之后，用100μCiNa₂ ⁵¹CrO₄标记靶细胞2小时。然后，用按上文所述制备的含有e/Nef138-β2m的培养物上清液(实心方块)脉冲细胞，将10μM合成的Nef138-10肽(实心菱形)用作阳性对照，或将被wt/SeV感染的细胞的培养物上清液用作阴性对照(空心圆)。1小时后，使用Nef138-10-特异性CTL克隆进行⁵¹Cr释放试验。作为对比实验，以m.o.i.分别为10和2的A24full/SeVb和e/Nef138-β2m/SeVb共感染H9细胞，并按照类似的方法将H9细胞用于试验(实心圆)。(A)显示出试验方法，(B)显示出结果。

图7显示出通过导入表达TAP抑制蛋白的SeV载体，细胞表面MHC I类/肽复合物水平的降低。以m.o.i.为3的ICP47his/SeVc或US6his/SeVc感染H9细胞，感染18，24，30和42小时之后收集细胞，接着用抗-MHC I类抗体染色，通过流式细胞术分析细胞表面MHC I类/肽复合物的表达水平(A)。(B)组中的数值表示M.F.I.(平均荧光强度)。另外，点线表示被同种型对照SeV感染的细胞，而实线表示被野生型SeV感染的细胞(图8，9和11中使用了相同的符号)。TAP抑制蛋白的表达使细胞膜表面新MHC I类/肽复合物的表达受抑制，从而导致MHC I类/肽复合物水平一直降低。然而，由于已有的MHC I类/肽复合物不受影响，因此降低的水平较低。

图8显示出酸处理对已有的MHC I类/肽复合物的作用。酸处理1，3和6小时之后，用抗-MHC I类抗体染色MT-2细胞，然后通过流式细胞术分析细胞表面MHC I类/肽复合物的表达水平(A)。酸处理从细胞膜表面的MHCI类/肽复合物中除去了肽，从而导致MHC I类/肽复合物水平降低(B)。然后，在约6小时之内，细胞膜表面MHC I类/肽复合物的表达即可恢复到与酸处理前几乎相同的水平。

图9显示出酸处理和导入表达TAP抑制蛋白的SeV载体对抑制MHC I类/肽复合物表达的作用。以m.o.i.为3的ICP47his/SeVc或US6his/SeVc感染MT-2细胞，用酸处理14小时之后，用抗-HLA-A24抗体染色6小时。然后通过流式细胞术分析细胞膜表面MHC I类/肽复合物的表达水平(A)。由于通过酸处理除去了已有的MHC I类/肽复合物，同时通过TAP抑制蛋白抑制了细胞表面新MHC I类/肽复合物的表达，甚至在酸处理后6小时，细胞表面MHC I类/肽复合物的表达水平仍然较低(B)。

图10的照片显示由导入细胞的SeV载体共表达的与表位相连的β2m和TAP抑制蛋白。用抗-(His)₆抗体(A)和抗-β2m抗体(B)检测两种蛋白。这些照片显示，被<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV感染的细胞表达出e/Nef138-β2m和US6his。泳道M，分子量标记；泳道1，<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV；泳道2，US6his/SeVc；泳道3，e/Nef138-β2m/SeVb；泳道4，e/Nef138-β2m/SeVc和泳道5，wt(野生型)SeV。

图11显示出因导入使与表位相连的β2m和TAP抑制蛋白共表达的SeV载体所致的与表位相连型β2m结合的MHC I类/肽复合物的表达。(A)显示出试验方法，(B)显示出结果。尽管在仅导入了表达ICP47his或US6his的SeV载体(<e/Nef138-β2m+ICP47his>/SeV或<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV)的细胞中，甚至在酸处理6小时后，细胞表面MHC I类/肽复合物的水平仍然较低，但在导入了共表达e/Nef138-β2m和ICP47his或US6his的SeV载体的细胞中，在酸处理6小时后，即可恢复酸处理前细胞表面MHC I类/肽复合物的水平。

实施本发明的最佳模式

下文将参照实施例具体阐述本发明，但本发明并不局限于此。另外，本说明书中提及的所有参考文献都列入本文作为参考。

[实施例1] 分离HLA-A*2402基因和人β2m基因

HLA-A*2402基因、人MHC I类基因和人β2m基因克隆自外周血单核细胞(PBMC)的信使RNA(mRNA)，所述细胞取自携有HLA-A24的正常健康受试者。用Micro-FastTrack试剂盒(Invitrogen)制备mRNA，用AMV-RTFirst-strand cDNA合成试剂盒(LIFE SCIENCE)合成cDNA。

将所得cDNA用作模板，使用分别针对HLA-A*2402和β2m基因的引物套HLA-5P2和HLA-3B以及b2m-5’和b2m-3’进行PCR。

HLA-5P2，5’-GGGCGGATCCGGACTCAGAATCTCCCCAGACGCCGAG-3’(SEQ IDNO：7)

HLA-3B，5’-CCGCCTCGAGCTGGGGAGGAAACAGGTCAGCATGGGAAC-3’(SEQID NO：8)

b2m-5’，5’-GGCACGAGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGC-3’(SEQ ID NO：9)

b2m-3’，5’-AATTTGGAATTCATCCAATCCAAATGCGGC-3’(SEQ ID NO：10)

以94℃30秒，58℃30秒和72℃1分钟进行35轮PCR循环，接着于72℃进行延伸反应达7分钟。使用Ex Taq(TaKaRa)进行PCR。使用pGEM-T载体系统(Promega)(分别被称为A*2402/pGEM和β2m/pGEM)克隆所获得的PCR产物，通过测序反应进一步证实其核苷酸序列。通过在AB1-377DNA测序仪上电泳，使用染料终止剂化学(Big-Dye terminator cycle sequencingReady Reaction Kit；Applied Biosystems)进行测序反应。

[实施例2] 构建与表位相连的β2m的表达载体

进行下述步骤以构建编码SeV载体的质粒(e/β2m/pSeVb)，所述SeV载体表达与表位相连的β2m。通过PCR将每种表位和接头的序列插入β2m信号序列的下游，并通过PCR添加仙台病毒的E和S信号以及NotI识别位点(图1)。接头的氨基酸序列(GGGSGGGSGGGS/SEQ ID NO：11)被设计成具有3个重复的GGGS(SEQ ID NO：1)序列。所用引物如下：

e/b2m-al， 5’

-GGAGGTGGCGGGTCCGGAGGTGGTTCTGGTGGAGGTTCGATCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’(SEQ ID NO：12)

e(Nef)-a2， 5’

-TCTGGCCTGGAGGCTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTTCGGAGGAGGTGGCGGGTCC-3’(SEQ ID NO：13)

e(Env)-a2， 5’

-TCTGGCCTGGAGGCTAGATACCTAAGGGATCAACAGCTCCTAGGGATTGGAGGTGGCGGGTCC-3’(SEQ ID NO：14)

e/b2m-a3， 5’

-TGCGGCCGCCGTACGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCT-3’(SEQ ID NO：15)

b2m-d， 5’

-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGTTACATGTCTCGATCCCACTT-3’(SEQ ID NO：16)

使用β2m/pGEM为模板，并使用一套引物e/b2m-al和e/b2m-d，以94℃1分钟，48℃1分钟和72℃1分钟进行15轮PCR循环，接着于72℃进行延伸反应达7分钟。在相同条件下，以所得PCR产物为模板，使用e(Nef)-a2或e(Env)-a2和b2m-d再次进行PCR，接着，在相同条件下使用这些产物为模板，并使用e/b2m-a3和b2m-d再次进行PCR，分别获得e/Nef138-β2m和e/Env584-β2m片段。使用pGEM-T载体系统(Promega)克隆每个片段，通过测序反应进一步证实其序列。然后用NotI消化含有任一片段的每种载体，并将其插入pSeV18⁺b(+)经NotI消化的位点，再证实其核苷酸序列。由此获得e/Nef138-β2m/pSeVb和e/EnV584-β2m/pSeVb(统称“e/β2m/pSeVb”)。另一方面，按照与上文所述类似的方法，使用b2m-a(5’-TGCGGCCGCCGTACGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTA-3’(SEQ ID NO：17)和b2m-d构建仅表达天然β2m的仙台病毒β2m/pSeVb。Nef表位(Nef138-10)和Env表位(Env584-11)的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：21和23。

[实施例3] 构建表达膜结合形式的MHC I类重链的载体

通过PCR添加仙台病毒的E和S信号和NotI位点(图2)。

所用引物如下：

A24-a#，5′-TGCGGCCGCCGTACGCCGAGGATGGCCGTCATGGCGCCCCG-3′(SEQID NO：28)

A24-d4，

5′-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGTCACACTTTACAAGCTGTGAG-3′(SEQ ID NO：29)

使用A*2402/pGEM为模板，并使用一套引物A24-a#和A24-d4，以94℃1分钟，48℃1分钟和72℃1分钟进行15轮PCR循环，接着于72℃进行延伸反应达7分钟，产生A24full片段。按照与产生e/β2m/pSeVb类似的方法获得A24full/pSeVb。

[实施例4] 构建ICP47的表达载体以及ICP47和表位的共表达载体

如文献所述(McGeoch，D.J.，Nucleic Acids Res.14(4)：1727-1745(1986))，将得自单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的ICP47(US12)基因克隆至质粒US12/pGEX-5X-2。使用PCR在ICP47基因片段上添加组氨酸标记(his)、仙台病毒的E和S信号以及NotI位点(图3)。

所用引物如下：

ICP-Esn，

5′-TGCGGCCGCAGTAAGAAAAACTTAGGGTCAAACGTACGGCCGAGATGTCGTGGGCCCTGGAAAT-3′(SEQ ID NO：34)

ICPhis-R，

5′-TTGCGGCCGCTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGAGCTCCACGGGTTACCGGATTAC-3′(SEQ ID NO：35)

使用US12/pGEX-5X-2为模板，以94℃1分钟，48℃1分钟和72℃1分钟进行15轮PCR循环，接着于72℃进行延伸反应达7分钟，产生ICP47his片段。按照与产生e/β2m/pSeV类似的方法，通过将ICP47his片段导入pSeV18⁺c(+)，获得ICP47his/pSeVc(Kato，A.et al.，J.Virol.73(11)：9237-9246(1999))。

用KpnI和SpnI(New England BioLab)消化e/Nef138-β2m/pSeVb和ICP47his/pSeVc以分别产生e/Nef138-β2m/pSeVb的含有e/Nef138-β2m的片段(4kb)和ICP47his/pSeVc的含有ICP47his的片段(15kb)，接着使用LigationKit Ver.2(TaKaRa)将它们连接起来，产生<e/Nef138-β2m+ICP47his>/pSeV(图4)。

[实施例5] 构建US6的表达载体以及US6和表位的共表达载体

文献中已描述过人巨细胞病毒(CMV)株AD169的溶液(Chen，Z.et al.，Virology 258(2)：240-248(1999))。使用CMV毒株AD169溶液的DNA提取物为模板进行PCR(图3)。所用引物如下：

US6-a，5′-TGCGGCCGCCACTCCTTCACTATGGATCTCTTG-3′(SEQ ID NO：36)

US6his-d1，

5′-CTACGGCGTACGTCAATGGTGGTGATGGTGGTGAGCTCCGGAGCCACAACGTCGAAT-3′(SEQ ID NO：37)

US6his-d2，5′-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGTCA-3′(SEQ ID NO：38)

使用一套引物US6-a和US6his-d1，以94℃1分钟，48℃1分钟和72℃1分钟进行15轮PCR循环，接着于72℃进行延伸反应达7分钟，产生US6his片段。按照与产生e/β2m/pSeVb类似的方法获得US6his/pSeVc。

按照与构建<e/Nef138-β2m+ICP47his>/pSeV类似的方法，由e/Nef138-β2m/pSeVb和US6his/pSeVc的重组获得<e/Nef138-β2m+US6his>/pSeV(图4)。

[实施例6] 仙台病毒载体的重建和感染

文献中已描述过pSeV18⁺b(+)，pGEM-L，pGEM-P，pGEM-N和vTF7-3(Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820(1997)；Kato，A.et al.，EMBO.J.16：578-587(1997)；Yu，D.et al.，Genes Cells，2：457-466(1997))。根据上述参考文献中描述的方法进行仙台病毒载体的重建。分别由e/Nef138-β2m/pSeVb和e/Env584-β2m/pSeVb产生仙台病毒载体e/Nef138-β2m/SeVb和e/Env584-β2m/SeVb(总称为e/β2m/SeVb)。另外，由A24full/pSeVb产生仙台病毒载体A24full/SeVb。

仙台病毒载体ICP47his/SeVc和<e/Nef138-β2m+ICP47his>/SeV分别得自ICP47his/pSeVc和<e/Nef138-β2m+ICP47his>/pSeV。仙台病毒载体US6his/SeVc和<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV分别得自US6his/pSeVc和<e/Nef138-β2m+US6his>/pSeV。

在添加有10％胎牛血清(FCS)、100U/ml链霉素和100U/ml青霉素(LifeTechnologies)的MEM(Sigma)(M10)中培养猴肾细胞系CV-1和LLCMK2。除非另有说明，以每个所示的m.o.i，用重组仙台病毒感染CV-1细胞，然后在无血清培养基中培养3天。

[实施例7] 回收和定量测定与表位相连的β2m(e/β2m)

以40,000×g离心被e/β2m/SeVb或β2m/SeVb(无表位)感染的CV-1细胞的培养物上清液以除去仙台病毒颗粒，并收集上清液。

使用夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)定量培养物上清液中的e/β2m。将2.5μg/ml抗-人β2微球蛋白单克隆抗体(DAKO)用作捕获抗体，将500ng/ml经过氧化物酶标记的抗-人β2微球蛋白单克隆抗体(DAKO)用作检测抗体。使用TMB过氧化物酶显色试剂盒(BIO-RAD)来显色。

将纯化的人β2微球蛋白(Biogenesis)用作标准样品。

[实施例8] 建立Nef138-10-特异性CTL克隆

在每孔含100μl R10培养基的96孔培养板中，将携有HLA-A*2402的HIV-1感染者的3×10⁵个PBMC培养过夜。第二天，加入刺激细胞(在添加有0.2μg/ml PHA(Sigma)和10％Lymphocult-T(Biotest)的RPMI1640(Sigma)(R10)中活化过夜，以3000拉德照射，并用10μM Nef138-10脉冲1小时的自身PHA-blast)，在1μg/ml抗-人CD28的存在下培养2周。每隔2周，再用刺激细胞(以10,000拉德(rad)照射并用10μM Nef138-10脉冲的、被EB病毒转化的自身B细胞系(B-LCL))进一步刺激细胞。2至4次刺激之后，当证实了CTL活性时，便可克隆细胞。

通过在10％Lymphocult-T和2.5％PHA-sup(来自正常健康受试者、用0.2μg/ml PHA刺激48小时的PBMC(3×10⁶/ml)的培养物上清液)的存在下，将0.8个细胞/孔的细胞与1×10⁵个细胞/孔的刺激细胞(以10,000拉德照射并用10μM Nef138-10脉冲的自身B-LCL)和5×10⁴个细胞/孔的饲养细胞(来自正常健康受试者、以3000拉德照射的PBMC)一起保温3至4周以进行克隆。

[实施例9] CTL识别导入了SeV的细胞，该细胞形成膜结合形式的MHC I类/肽复合物

按下述进行CTL ⁵¹Cr释放试验。在添加有10％FCS，100U/ml链霉素和100U/ml青霉素的RPMI1640(Sigma)(R10)中培养人CD4⁺T淋巴细胞系H9。用100μCiNa₂ ⁵¹CrO₄标记细胞(2×10³个细胞/孔；靶细胞)2小时，用R10洗涤3次并用10μM肽(Nef138-10)脉冲1小时。当将导入SeV载体的细胞用作靶细胞时，在标记之前17小时(即在加入效应细胞之前20小时)，以10∶2的m.o.i.用图5中所述的SeV载体组合感染细胞。以每种E∶T比例(效应细胞∶靶细胞)加入实施例8的细胞以用作效应细胞。37℃保温细胞4小时，使用γ计数器测定培养物上清液中释放的⁵¹Cr的量。分别以R10和4％TritonX-100/PBS替代效应细胞以测定自发释放和最大释放。

特异性裂解(％)的计算公式为(每个样品的cpm-自发释放的cpm)/(最大释放的cpm-自发释放的cpm)×100。

图5显示出CTL识别膜结合形式的MHC I类/肽复合物的结果。结果表明在被A24full/SeVb和e/Nef138-β2m/SeVb共感染的细胞中可检测到抗原-特异性CTL激活。

[实施例10] 从被SeV感染的细胞中回收的与表位相连的β2m的作用

为了制备被SeV感染的细胞所产生的与表位相连的β2m，以m.o.i 2用e/Nef138-β2m/SeVb感染H9细胞。3天后，收集培养物上清液并过滤，产生含有与表位相连的β2m的溶液。与实施例9类似，使用被A24full/SeVb感染的H9细胞作为靶细胞进行CTL试验，以比较用肽和上述含有与表位相连的β2m的溶液脉冲的效果。

图6显示出与表位相连的β2m的作用。通过在靶细胞培养物溶液中加入从被SeV感染的细胞的培养物上清液中回收的与表位相连的β2m，检测到抗原-特异性CTL活性。

[实施例11] 通过ICP47或US6下调细胞表面的MHC I类/肽复合物

在添加有10％FCS，100U/ml链霉素和100U/ml青霉素的RPMI1640(Sigma)(R10)中培养人CD4⁺T淋巴细胞系H9的细胞，MT-2细胞和小鼠杂交瘤A11.1M(Foung，S.K.H.，et al.，Human Immunol.15：316-319(1986))细胞。在含有10％Lymphocult-T(Biotest)的R10培养基中培养由HIV-1患者诱导的CTL系和CTL克隆。

以m.o.i.3用ICP47his/pSeVc和US6his/pSeVc共感染人CD4⁺T淋巴细胞系H9细胞，18，24，30和42小时之后，用经FITC标记的抗-MHC I类单克隆抗体3F10(Ancell)染色，然后通过流式细胞术进行分析。即，于4℃使H9细胞与100倍稀释的抗-MHC I类抗体3F10-FITC反应20分钟，接着洗涤3次，并用含有1％低聚甲醛的PBS(磷酸缓冲盐水)固定。将含有2％胎牛血清和0.1％叠氮钠的PBS用于染色和洗涤。使用FACS Caliber(BecktonDickinson)进行流式细胞术，并使用FlowJo Ver.3.3(Treestar)进行分析。

当将被野生型SeV感染的细胞用作对照时，未检测到MHC I类/肽复合物表达的显著变化，但是，当用ICP47his/SeVc或US6his/SeVc感染细胞时，MHC I类/肽复合物水平却一直在降低，这表明膜表面新MHC I类/肽复合物的表达受到抑制(图7)。然而，由于存在已有的MHC I类/肽复合物，因此未观察到显著的降低。

[实施例12] 酸处理对已有的MHC I类/肽复合物的作用

既然通过抑制TAP活性可抑制新MHC I类/肽复合物的表达，那么可以检查酸处理对已有的MHC I类/肽复合物的作用。

于4℃，用200μl肽剥离缓冲液(0.13M柠檬酸(pH3)，66mM Na₂HPO₄，150mM NaCl，17μg/ml酚红)处理MT-2细胞(HLA-A24+)1分钟以进行释放肽的酸处理，接着用12ml RPMI1640中和。处理后立即(0小时)和1，3和6小时之后，用能产生抗-HLA-A24抗体的杂交瘤A11.1M的培养物上清液染色细胞，接着用经FITC标记的抗-小鼠IgG抗体(Immunotech)染色细胞，并按上文所述通过流式细胞术进行分析(图8)。

已证实酸(pH3)处理能从膜表面的MHC I类/肽复合物中除去肽，导致细胞表面MHC I类/肽复合物水平的降低。6小时之后可恢复至处理前的水平。

[实施例13] 通过酸处理和使用TAP抑制蛋白的表达载体使细胞表面 MHC I类/肽复合物水平降低

既然已证实酸处理可有效降低已有的MHC I类/肽复合物的水平，那么可以通过用TAP抑制蛋白的表达载体感染细胞，在TAP抑制蛋白被有效表达之后(感染后14小时)进行酸处理以除去已有的MHC I类/肽复合物，在酸处理之后6小时分析细胞膜表面的MHC I类/肽复合物水平，进而检查TAP抑制蛋白在抑制细胞膜表面新MHC I类/肽复合物中的作用。

以m.o.i.3用ICP47his/SeVc或US6his/SeVc感染MT-2细胞，如实施例12所述，14小时之后用酸处理，如实施例12所述，处理后6小时用MHCI类/肽复合物(A11.1M)染色，并通过流式细胞术进行分析(图9)。结果证实ICP47和US6都能有效抑制细胞表面新MHC I类/肽复合物的表达。另外，还证实了ICP47和US6具有几乎相同的抑制作用。

[实施例14] 通过TAP抑制蛋白和与表位相连的β2m的共表达载体共表达TAP抑制蛋白和与表位相连的β2m

使用Western印迹分析实施例5构建的表达TAP抑制蛋白和与表位相连的β2m的载体是否能实际表达出这两种蛋白质。

以m.o.i.3，用分别或同时表达e/Nef138-β2m和US6his的SeV载体以及野生型SeV感染CV-1细胞，24小时之后收集被感染的细胞。用TNE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.8)，1％NP40，0.15M NaCl，1mM EDTA，10μg/ml抑蛋白酶肽)裂解收集到的被感染细胞，将溶解的组分上样至SDS-PAGE，接着使用抗-(His)₆抗体和抗-β2m抗体进行Western印迹以证实US6his和e/Nef138-β2m蛋白的表达(图10)。将样品印迹至PVDF膜上，然后使用BlockAce(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)进行封闭，于4℃，使膜与1000-倍稀释的抗-(His)₆抗体，Penta-His抗体(QIAGEN)或抗-β2m抗体(Immunotech)反应1小时。洗涤4次之后，室温下使膜与2000-倍稀释的经HRP标记的抗-小鼠IgG抗体(Roche)反应1小时，洗涤4次，然后使用Lumi-Light plussubstrate(Roche)显色。使用Lumi Imager F1(Boehringer Manheim)进行检测。用TBS-T(20mM Tris-HCl(pH7.5)，500mM NaCl，0.05％Tween-20)洗涤，用10-倍稀释的Block Ace稀释抗体。结果，在被<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV感染的细胞中，证实了US6his和e/Nef138-β2m的表达。而且，US6his的表达水平与被US6his/SeVc感染的细胞中的几乎相同。

[实施例15] 在酸处理之后通过共表达TAP抑制蛋白和与表位相连的 β2m的载体回收MHC I类/肽复合物

从实施例13和14的结果看，在被共表达TAP抑制蛋白和与表位相连的β2m的载体感染的、用酸处理过的细胞中，在细胞膜表面展示内源性蛋白质衍生表位的MHC I类/肽复合物的表达有望受抑制，导致无需TAP-介导的肽转移、具有与表位相连的β2m的MHC I类/肽复合物高频率表达。

因此，以m.o.i.3，用ICP47his/SeVc或US6his/SeV，和<e/Neff138-β2m+ICP47his>/SeV或<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV感染MT-2细胞，如实施例13所述，14小时之后用酸处理，如实施例13所述，6小时后用MHC I类/肽复合物(A11.1M)染色，并通过流式细胞术进行分析(图11)。在被ICP47his/SeVc或US6his/SeVc感染的细胞中，细胞膜表面MHC I类/肽复合物的表达受抑制，在被<e/Nef138-β2m+ICP47his>/SeV或<e/Nef138-β2m+US6his>/SeV感染的细胞中回收到的MHC I类/肽复合物水平与被野生型SeV感染的细胞中的几乎相同。这表明：被共表达TAP抑制蛋白和与表位相连的β2m的载体感染的细胞高密度地表达了同与表位相连的β2m结合的MHC I类/肽复合物。

工业实用性

当在哺乳动物细胞中表达与表位相连的MHC I类或β2m时，本发明通过抑制内源性表位的展示，能有效展示所需的外来表位。因此，本发明能在细胞表面高频率表达能展示某些特异性(单个)表位的MHC I类/肽复合物。通过使用本发明的方法体内或回体导入表达与表位相连的MHC I类或β2m的载体，可以有效诱导所需的抗原-特异性细胞免疫应答。本发明能用于诱导针对感染的保护性免疫力，并可用于癌症免疫治疗中的基因治疗等。

序列表

<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)

<120>通过抑制TAP活性增强MHC I类分子对外来表位的展示的方法

<130>D3-A0102P

<140>

<141>

<150>JP 2002-288394

<151>2002-10-01

<160>54

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>1

Gly Gly Gly Ser

1

<210>2

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>2

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>3

Gly Gly Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10

<210>4

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>4

Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly

20

<210>5

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>5

Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

20 25 30

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>6

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly

1 5 10

<210>7

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>7

gggcggatcc ggactcagaa tctccccaga cgccgag 37

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>8

ccgcctcgag ctggggagga aacaggtcag catgggaac 39

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>9

ggcacgagcc gagatgtctc gctccgtggc 30

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>10

aatttggaat tcatccaatc caaatgcggc 30

<210>11

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>11

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210>12

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>12

ggaggtggcg ggtccggagg tggttctggt ggaggttcga tccagcgtac tccaaagatt 60

<210>13

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>13

tctggcctgg aggctagata tccactgacc tttggatggt gcttcggagg aggtggcggg 60

tcc 63

<210>14

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>14

tctggcctgg aggctagata cctaagggat caacagctcc tagggattgg aggtggcggg 60

tcc 63

<210>15

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>15

tgcggccgcc gtacggccga gatgtctcgc tccgtggcct tagctgtgct cgcgctactc 60

tctctttctg gcctggaggc t 81

<210>16

<211>71

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>16

ttgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg ttacatgtct 60

cgatcccact t 71

<210>12

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>17

tgcggccgcc gtacggccga gatgtctcgc tccgtggcct ta 42

<210>18

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<220>

<221>CDS

<222>(21)..(80)

<400>18

gcggccgccg tacggccgag atg tct cgc tcc gtg gcc tta gct gtg ctc gcg 53

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala

1 5 10

cta ctc tct ctt tct ggc ctg gag gct 80

Leu Leu Ser Leu Ser Gly Leu Glu Ala

15 20

<210>19

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<400>19

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala

20

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(30)

<400>20

aga tat cca ctg acc ttt gga tgg tgc ttc 30

Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe

1 5 10

<210>21

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>21

Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe

1 5 10

<210>22

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(33)

<400>22

aga tac cta agg gat caa cag ctc cta ggg att 33

Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile

1 5 10

<210>23

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<400>23

Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile

1 5 10

<210>24

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(60)

<400>24

gga ggt ggc ggg tcc gga ggt ggt tct ggt gga ggt tcg atc cag cgt 48

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg

1 5 10 15

act cca aag att 60

Thr Pro Lys Ile

20

<210>25

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<400>25

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg

1 5 10 15

Thr Pro Lys Ile

20

<210>26

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(18)

<400>26

aag tgg gat cga gac atg taacgtacgc cgtagtaaga aaaacttagg 48

Lys Trp Asp Arg Asp Met

1 5

gtgaaagttc atcgcggccg c 69

<210>27

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<400>27

Lys Trp Asp Arg Asp Met

1 5

<210>28

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>28

tgcggccgcc gtacgccgag gatggccgtc atggcgcccc g 41

<210>29

<211>71

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>29

ttgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg tcacacttta 60

caagctgtga g 71

<210>30

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<220>

<221>CDS

<222>(21)..(38)

<400>30

gcggccgccg tacgccgagg atg gcc gtc atg gcg ccc 38

Met Ala Val Met Ala Pro

1 5

<210>31

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<400>31

Met Ala Val Met Ala Pro

1 5

<210>32

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(18)

<400>32

ctc aca gct tgt aaa gtg tgacgtacgc cgtagtaaga aaaacttagg 48

Leu Thr Ala Cys Lys Val

1 5

gtgaaagttc atcgcggccg c 69

<210>33

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<400>33

Leu Thr Ala Cys Lys Val

1 5

<210>34

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>34

tgcggccgca gtaagaaaaa cttagggtca aacgtacggc cgagatgtcg tgggccctgg 60

aaat 64

<210>35

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>35

ttgcggccgc tatcaatggt ggtgatggtg gtgagctcca cgggttaccg gattac 56

<210>36

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>36

tgcggccgcc actccttcac tatggatctc ttg 33

<210>37

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>37

ctacggcgta cgtcaatggt ggtgatggtg gtgagctccg gagccacaac gtcgaat 57

<210>38

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>38

ttgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg tca 53

<210>39

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<220>

<221>CDS

<222>(43)..(60)

<400>39

gcggccgcag taagaaaaac ttagggtcaa acgtacggcc gag atg tcg tgg gcc 54

Met Ser Trp Ala

1

ctg gaa 60

Leu Glu

5

<210>40

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<400>40

Met Ser Trp Ala Leu Glu

1 5

<210>41

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(42)

<400>41

cgt aat ccg gta acc cgt gga gct cac cac cat cac cac cat 42

Arg Asn Pro Val Thr Arg Gly Ala His His His His His His

1 5 10

tgatagcggc cgc 55

<210>42

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<400>42

Arg Asn Pro Val Thr Arg Gly Ala His His His His His His

1 5 10

<210>43

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<220>

<221>CDS

<222>(41)..(58)

<400>43

gcggccgcag taagaaaaac ttagggtcaa agccttcact atg gat ctc ttg att 55

Met Asp Leu Leu Ile

1 5

cgt 58

Arg

<210>44

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<400>44

Met Asp Leu Leu Ile Arg

1 5

<210>45

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(42)

<400>45

att cga cgt tgt ggc tcc gga gct cac cac cat cac cac cat 42

Ile Arg Arg Cys Gly Ser Gly Ala His His His His His His

1 5 10

tgatagcggc cgc 55

<210>46

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<400>46

Ile Arg Arg Cys Gly Ser Gly Ala His His His His His His

1 5 10

<210>47

<211>2960

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(165)..(2588)

<223>

<400>47

ggcacgaggg tgtgcgtgat ggagaaaatt gggcaccagg gctgctcccg agattctcag 60

atctgatttc cacgcttgct accaaaatag tctgggcagg ccacttttgg aagtaggcgt 120

tatctagtga gcaggcggcc gctttcgatt tcgctttccc ctaa atg gct gag ctt 176

Met Ala Glu Leu

1

ctc gcc agc gca gga tca gcc tgt tcc tgg gac ttt ccg aga gcc ccg 224

Leu Ala Ser Ala Gly Ser Ala Cys Ser Trp Asp Phe Pro Arg Ala Pro

5 10 15 20

ccc tcg ttc cct ccc cca gcc gcc agt agg gga gga ctc ggc ggt acc 272

Pro Ser Phe Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Gly Gly Leu Gly Gly Thr

25 30 35

cgg agc ttc agg ccc cac cgg ggc gcg gag agt ccc agg ccc ggc cgg 320

Arg Ser Phc Arg Pro His Arg Gly Ala Glu Ser Pro Arg Pro Gly Arg

40 45 50

gac cgg gac ggc gtc cga gtg cca atg gct agc tct agg tgt ccc gct 368

Asp Arg Asp Gly Val Arg Val Pro Met Ala Ser Ser Arg Cys Pro Ala

55 60 65

ccc cgc ggg tgc cgc tgc ctc ccc gga gct tct ctc gca tgg ctg ggg 416

Pro Arg Gly Cys Arg Cys Leu Pro Gly Ala Ser Leu Ala Trp Leu Gly

70 75 80

aca gta ctg cta ctt ctc gcc gac tgg gtg ctg ctc cgg acc gcg ctg 464

Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Asp Trp Val Leu Leu Arg Thr Ala Leu

85 90 95 100

ccc cgc ata ttc tcc ctg ctg gtg ccc acc gcg ctg cca ctg ctc cgg 512

Pro Arg Ile Phe Ser Leu Leu Val Pro Thr Ala Leu Pro Leu Leu Arg

105 110 115

gtc tgg gcg gtg ggc ctg agc cgc tgg gcc gtg ctc tgg ctg ggg gcc 560

Val Trp Ala Val Gly Leu Ser Arg Trp Ala Val Leu Trp Leu Gly Ala

120 125 130

tgc ggg gtc ctc agg gca acg gtt ggc tcc aag agc gaa aac gca ggt 608

Cys Gly Val Leu Arg Ala Thr Val Gly Ser Lys Ser Glu Asn Ala Gly

135 140 145

gcc cag ggc tgg ctg gct gct ttg aag cca tta gct gcg gca ctg ggc 656

Ala Gln Gly Trp Leu Ala Ala Leu Lys Pro Leu Ala Ala Ala Leu Gly

150 155 160

ttg gcc ctg ccg gga ctt gcc ttg ttc cga gag ctg atc tca tgg gga 704

Leu Ala Leu Pro Gly Leu Ala Leu Phe Arg Glu Leu Ile Ser Trp Gly

165 170 175 180

gcc ccc ggg tcc gcg gat agc acc agg cta ctg cac tgg gga agt cac 752

Ala Pro Gly Ser Ala Asp Ser Thr Arg Leu Leu His Trp Gly Ser His

185 190 195

cct acc gcc ttc gtt gtc agt tat gca gcg gca ctg ccc gca gca gcc 800

Pro Thr Ala Phe Val Val Ser Tyr Ala Ala Ala Leu Pro Ala Ala Ala

200 205 210

ctg tgg cac aaa ctc ggg agc ctc tgg gtg ccc ggc ggt cag ggc ggc 848

Leu Trp His Lys Leu Gly Ser Leu Trp Val Pro Gly Gly Gln Gly Gly

215 220 225

tct gga aac cct gtg cgt cgg ctt cta ggc tgc ctg ggc tcg gag acg 896

Ser Gly Asn Pro Val Arg Arg Leu Leu Gly Cys Leu Gly Ser Glu Thr

230 235 240

cgc cgc ctc tcg ctg ttc ctg gtc ctg gtg gtc ctc tcc tct ctt ggg 944

Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Val Val Leu Ser Ser Leu Gly

245 250 255 260

gag atg gcc att cca ttc ttt acg ggc cgc ctc act gac tgg att cta 992

Glu Met Ala Ile Pro Phe Phe Thr Gly Arg Leu Thr Asp Trp Ile Leu

265 270 275

caa gat ggc tca gcc gat acc ttc act cga aac tta act ctc atg tcc 1040

Gln Asp Gly Ser Ala Asp Thr Phe Thr Arg Asn Leu Thr Leu Met Ser

280 285 290

att ctc acc ata gcc agt gca gtg ctg gag ttc gtg ggt gac ggg atc 1088

Ile Leu Thr Ile Ala Ser Ala Val Leu Glu Phe Val Gly Asp Gly Ile

295 300 305

tat aac aac acc atg ggc cac gtg cac agc cac ttg cag gga gag gtg 1136

Tyr Asn Asn Thr Met Gly His Val His Ser His Leu Gln Gly Glu Val

310 315 320

ttt ggg gct gtc ctg cgc cag gag acg gag ttt ttc caa cag aac cag 1184

Phe Gly Ala Val Leu Arg Gln Glu Thr Glu Phe Phe Gln Gln Asn Gln

325 330 335 340

aca ggt aac atc atg tct cgg gta aca gag gac acg tcc acc ctg agt 1232

Thr Gly Asn Ile Met Ser Arg Val Thr Glu Asp Thr Ser Thr Leu Ser

345 350 355

gat tct ctg agt gag aat ctg agc tta ttt ctg tgg tac ctg gtg cga 1280

Asp Ser Leu Ser Glu Asn Leu Ser Leu Phe Leu Trp Tyr Leu Val Arg

360 365 370

ggc cta tgt ctc ttg ggg atc atg ctc tgg gga tca gtg tcc ctc acc 1328

Gly Leu Cys Leu Leu Gly Ile Met Leu Trp Gly Ser Val Ser Leu Thr

375 380 385

atg gtc acc ctg atc acc ctg cct ctg ctt ttc ctt ctg ccc aag aag 1376

Met Val Thr Leu Ile Thr Leu Pro Leu Leu Phe Leu Leu Pro Lys Lys

390 395 400

gtg gga aaa tgg tac cag ttg ctg gaa gtg cag gtg cgg gaa tct ctg 1424

Val Gly Lys Trp Tyr Gln Leu Leu Glu Val Gln Val Arg Glu Ser Leu

405 410 415 420

gca aag tcc agc cag gtg gcc att gag gct ctg tcg gcc atg cct aca 1472

Ala Lys Ser Ser Gln Val Ala Ile Glu Ala Leu Ser Ala Met Pro Thr

425 430 435

gtt cga agc ttt gcc aac gag gag ggc gaa gcc cag aag ttt agg gaa 1520

Val Arg Ser Phe Ala Asn Glu Glu Gly Glu Ala Gln Lys Phe Arg Glu

440 445 450

aag ctg caa gaa ata aag aca ctc aac cag aag gag gct gtg gcc tat 1568

Lys Leu Gln Glu Ile Lys Thr Leu Asn Gln Lys Glu Ala Val Ala Tyr

455 460 465

gca gtc aac tcc tgg acc act agt att tca ggt atg ctg ctg aaa gtg 1616

Ala Val Asn Ser Trp Thr Thr Ser Ile Ser Gly Met Leu Leu Lys Val

470 475 480

gga atc ctc tac att ggt ggg cag ctg gtg acc agt ggg gct gta agc 1664

Gly Ile Leu Tyr Ile Gly Gly Gln Leu Val Thr Ser Gly Ala Val Ser

485 490 495 500

agt ggg aac ctt gtc aca ttt gtt ctc tac cag atg cag ttc acc cag 1712

Ser Gly Asn Leu Val Thr Phe Val Leu Tyr Gln Met Gln Phe Thr Gln

505 510 515

gct gtg gag gta ctg ctc tcc atc tac ccc aga gta cag aag gct gtg 1760

Ala Val Glu Val Leu Leu Ser Ile Tyr Pro Arg Val Gln Lys Ala Val

520 525 530

ggc tcc tca gag aaa ata ttt gag tac ctg gac cgc acc cct cgc tgc 1808

Gly Ser Ser Glu Lys Ile Phe Glu Tyr Leu Asp Arg Thr Pro Arg Cys

535 540 545

cca ccc agt ggt ctg ttg act ccc tta cac ttg gag ggc ctt gtc cag 1856

Pro Pro Ser Gly Leu Leu Thr Pro Leu His Leu Glu Gly Leu Val Gln

550 555 560

ttc caa gat gtc tcc ttt gcc tac cca aac cgc cca gat gtc tta gtg 1904

Phe Gln Asp Val Ser Phe Ala Tyr Pro Asn Arg Pro Asp Val Leu Val

565 570 575 580

cta cag ggg ctg aca ttc acc cta cgc cct ggc gag gtg acg gcg ctg 1952

Leu Gln Gly Leu Thr Phe Thr Leu Arg Pro Gly Glu Val Thr Ala Leu

585 590 595

gtg gga ccc aat ggg tct ggg aag agc aca gtg gct gcc ctg ctg cag 2000

Val Gly Pro Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Val Ala Ala Leu Leu Gln

600 605 610

aat ctg tac cag ccc acc ggg gga cag ctg ctg ttg gat ggg aag ccc 2048

Asn Leu Tyr Gln Pro Thr Gly Gly Gln Leu Leu Leu Asp Gly Lys Pro

615 620 625

ctt ccc caa tat gag cac cgc tac ctg cac agg cag gtg gct gca gtg 2096

Leu Pro Gln Tyr Glu His Arg Tyr Leu His Arg Gln Val Ala Ala Val

630 635 640

gga caa gag cca cag gta ttt gga aga agt ctt caa gaa aat att gcc 2144

Gly Gln Glu Pro Gln Val Phe Gly Arg Ser Leu Gln Glu Asn Ile Ala

645 650 655 660

tat ggc ctg acc cag aag cca act atg gag gaa atc aca gct gct gca 2192

Tyr Gly Leu Thr Gln Lys Pro Thr Met Glu Glu Ile Thr Ala Ala Ala

665 670 675

gta aag tct ggg gcc cat agt ttc atc tct gga ctc cct cag ggc tat 2240

Val Lys Ser Gly Ala His Ser Phe Ile Ser Gly Leu Pro Gln Gly Tyr

680 685 690

gac aca gag gta gac gag gct ggg agc cag ctg tca ggg ggt cag cga 2288

Asp Thr Glu Val Asp Glu Ala Gly Ser Gln Leu Ser Gly Gly Gln Arg

695 700 705

cag gca gtg gcg ttg gcc cga gca ttg atc cgg aaa ccg tgt gta ctt 2336

Gln Ala Val Ala Leu Ala Arg Ala Leu Ile Arg Lys Pro Cys Val Leu

710 715 720

atc ctg gat gat gcc acc agt gcc ctg gat gca aac agc cag tta cag 2384

Ile Leu Asp Asp Ala Thr Ser Ala Leu Asp Ala Asn Ser Gln Leu Gln

725 730 735 740

gtg gag cag ctc ctg tac gaa agc cct gag cgg tac tcc cgc tca gtg 2432

Val Glu Gln Leu Leu Tyr Glu Ser Pro Glu Arg Tyr Ser Arg Ser Val

745 750 755

ctt ctc atc acc cag cac ctc agc ctg gtg gag cag gct gac cac atc 2480

Leu Leu Ile Thr Gln His Leu Ser Leu Val Glu Gln Ala Asp His Ile

760 765 770

ctc ttt ctg gaa gga ggc gct atc cgg gag ggg gga acc cac cag cag 2528

Leu Phe Leu Glu Gly Gly Ala Ile Arg Glu Gly Gly Thr His Gln Gln

775 780 785

ctc atg gag aaa aag ggg tgc tac tgg gcc atg gtg cag gct cct gca 2576

Leu Met Glu Lys Lys Gly Cys Tyr Trp Ala Met Val Gln Ala Pro Ala

790 795 800

gat gct cca gaa tgaaagcctt ctcagacctg cgcactccat ctccctccct 2628

Asp Ala Pro Glu

805

tttcttctct ctgtggtgga gaaccacagc tgcagagtag gcagctgcct ccaggatgag 2688

ttacttgaaa tttgccttga gtgtgttacc tcctttccaa gctcctcgtg ataatgcaga 2748

cttcctggag tacaaacaca ggatttgtaa ttccttactg taacggagtt tagagccagg 2808

gctgatgctt tggtgtggcc agcactctga aactgagaaa tgttcagaat gtacggaaag 2868

atgatcagct attttcaaca taactgaagg catatgctgg cccataaaca ccctgtaggt 2928

tcttgatatt tataataaaa ttggtgtttt gt 2960

<210>48

<211>808

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>48

Met Ala Glu Leu Leu Ala Ser Ala Gly Ser Ala Cys Ser Trp Asp Phe

1 5 10 15

Pro Arg Ala Pro Pro Ser Phe Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Gly Gly

20 25 30

Leu Gly Gly Thr Arg Ser Phe Arg Pro His Arg Gly Ala Glu Ser Pro

35 40 45

Arg Pro Gly Arg Asp Arg Asp Gly Val Arg Val Pro Met Ala Ser Ser

50 55 60

Arg Cys Pro Ala Pro Arg Gly Cys Arg Cys Leu Pro Gly Ala Ser Leu

65 70 75 80

Ala Trp Leu Gly Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Asp Trp Val Leu Leu

85 90 95

Arg Thr Ala Leu Pro Arg Ile Phe Ser Leu Leu Val Pro Thr Ala Leu

100 105 110

Pro Leu Leu Arg Val Trp Ala Val Gly Leu Ser Arg Trp Ala Val Leu

115 120 125

Trp Leu Gly Ala Cys Gly Val Leu Arg Ala Thr Val Gly Ser Lys Ser

130 135 140

Glu Asn Ala Gly Ala Gln Gly Trp Leu Ala Ala Leu Lys Pro Leu Ala

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Leu Ala Leu Pro Gly Leu Ala Leu Phe Arg Glu Leu

165 170 175

Ile Ser Trp Gly Ala Pro Gly Ser Ala Asp Ser Thr Arg Leu Leu His

180 185 190

Trp Gly Ser His Pro Thr Ala Phe Val Val Ser Tyr Ala Ala Ala Leu

195 200 205

Pro Ala Ala Ala Leu Trp His Lys Leu Gly Ser Leu Trp Val Pro Gly

210 215 220

Gly Gln Gly Gly Ser Gly Asn Pro Val Arg Arg Leu Leu Gly Cys Leu

225 230 235 240

Gly Ser Glu Thr Arg Arg Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Val Val Leu

245 250 255

Ser Ser Leu Gly Glu Met Ala Ile Pro Phe Phe Thr Gly Arg Leu Thr

260 265 270

Asp Trp Ile Leu Gln Asp Gly Ser Ala Asp Thr Phe Thr Arg Asn Leu

275 280 285

Thr Leu Met Ser Ile Leu Thr Ile Ala Ser Ala Val Leu Glu Phe Val

290 295 300

Gly Asp Gly Ile Tyr Asn Asn Thr Met Gly His Val His Ser His Leu

305 310 315 320

Gln Gly Glu Val Phe Gly Ala Val Leu Arg Gln Glu Thr Glu Phe Phe

325 330 335

Gln Gln Asn Gln Thr Gly Asn Ile Met Ser Arg Val Thr Glu Asp Thr

340 345 350

Ser Thr Leu Ser Asp Ser Leu Ser Glu Ash Leu Ser Leu Phe Leu Trp

355 360 365

Tyr Leu Val Arg Gly Leu Cys Leu Leu Gly Ile Met Leu Trp Gly Ser

370 375 380

Val Ser Leu Thr Met Val Thr Leu Ile Thr Leu Pro Leu Leu Phe Leu

385 390 395 400

Leu Pro Lys Lys Val Gly Lys Trp Tyr Gln Leu Leu Glu Val Gln Val

405 410 415

Arg Glu Ser Leu Ala Lys Ser Ser Gln Val Ala Ile Glu Ala Leu Ser

420 425 430

Ala Met Pro Thr Val Arg Ser Phe Ala Ash Glu Glu Gly Glu Ala Gln

435 440 445

Lys Phe Arg Glu Lys Leu Gln Glu Ile Lys Thr Leu Asn Gln Lys Glu

450 455 460

Ala Val Ala Tyr Ala Val Asn Ser Trp Thr Thr Ser Ile Ser Gly Met

465 470 475 480

Leu Leu Lys Val Gly Ile Leu Tyr Ile Gly Gly Gln Leu Val Thr Ser

485 490 495

Gly Ala Val Ser Ser Gly Asn Leu Val Thr Phe Val Leu Tyr Gln Met

500 505 510

Gln Phe Thr Gln Ala Val Glu Val Leu Leu Ser Ile Tyr Pro Arg Val

515 520 525

Gln Lys Ala Val Gly Ser Ser Glu Lys Ile Phe Glu Tyr Leu Asp Arg

530 535 540

Thr Pro Arg Cys Pro Pro Ser Gly Leu Leu Thr Pro Leu His Leu Glu

545 550 555 560

Gly Leu Val Gln Phe Gln Asp Val Ser Phe Ala Tyr Pro Asn Arg Pro

565 570 575

Asp Val Leu Val Leu Gln Gly Leu Thr Phe Thr Leu Arg Pro Gly Glu

580 585 590

Val Thr Ala Leu Val Gly Pro Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Val Ala

595 600 605

Ala Leu Leu Gln Asn Leu Tyr Gln Pro Thr Gly Gly Gln Leu Leu Leu

610 615 620

Asp Gly Lys Pro Leu Pro Gln Tyr Glu His Arg Tyr Leu His Arg Gln

625 630 635 640

Val Ala Ala Val Gly Gln Glu Pro Gln Val Phe Gly Arg Ser Leu Gln

645 650 655

Glu Asn Ile Ala Tyr Gly Leu Thr Gln Lys Pro Thr Met Glu Glu Ile

660 665 670

Thr Ala Ala Ala Val Lys Ser Gly Ala His Ser Phe Ile Ser Gly Leu

675 680 685

Pro Gln Gly Tyr Asp Thr Glu Val Asp Glu Ala Gly Ser Gln Leu Ser

690 695 700

Gly Gly Gln Arg Gln Ala Val Ala Leu Ala Arg Ala Leu Ile Arg Lys

705 710 715 720

Pro Cys Val Leu Ile Leu Asp Asp Ala Thr Ser Ala Leu Asp Ala Asn

725 730 735

Ser Gln Leu Gln Val Glu Gln Leu Leu Tyr Glu Ser Pro Glu Arg Tyr

740 745 750

Ser Arg Ser Val Leu Leu Ile Thr Gln His Leu Ser Leu Val Glu Gln

755 760 765

Ala Asp His Ile Leu Phe Leu Glu Gly Gly Ala Ile Arg Glu Gly Gly

770 775 780

Thr His Gln Gln Leu Met Glu Lys Lys Gly Cys Tyr Trp Ala Met Val

785 790 795 800

Gln Ala Pro Ala Asp Ala Pro Glu

805

<210>49

<211>3719

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(97)..(2205)

<223>

<400>349

ggaccagagc cggtagcgag gttgggagag acggagcgga cctcagcgct gaagcagaag 60

tccccggagc tgcggtctcc ccgccgcggc tgagcc atg cgg ctc cct gac ctg 114

Met Arg Leu Pro Asp Leu

1 5

aga ccc tgg acc tcc ctg ctg ctg gtg gac gcg gct tta ctg tgg ctg 162

Arg Pro Trp Thr Ser Leu Leu Leu Val Asp Ala Ala Leu Leu Trp Leu

10 15 20

ctt cag ggc cct ctg ggg act ttg ctt cct caa ggg ctg cca gga cta 210

Leu Gln Gly Pro Leu Gly Thr Leu Leu Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu

25 30 35

tgg ctg gag ggg acc ctg cgg ctg gga ggg ctg tgg ggg ctg cta aag 258

Trp Leu Glu Gly Thr Leu Arg Leu Gly Gly Leu Trp Gly Leu Leu Lys

40 45 50

cta aga ggg ctg ctg gga ttt gtg ggg aca ctg ctg ctc ccg ctc tgt 306

Leu Arg Gly Leu Leu Gly Phe Val Gly Thr Leu Leu Leu Pro Leu Cys

55 60 65 70

ctg gcc acc ccc ctg act gtc tcc ctg aga gcc ctg gtc gcg ggg gcc 354

Leu Ala Thr Pro Leu Thr Val Ser Leu Arg Ala Leu Val Ala Gly Ala

75 80 85

tca cgt gct ccc cca gcc aga gtc gct tca gcc cct tgg agc tgg ctg 402

Ser Arg Ala Pro Pro Ala Arg Val Ala Ser Ala Pro Trp Ser Trp Leu

90 95 100

ctg gtg ggg tac ggg gct gcg ggg ctc agc tgg tca ctg tgg gct gtt 450

Leu Val Gly Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Ser Trp Ser Leu Trp Ala Val

105 110 115

ctg agc cct cct gga gcc cag gag aag gag cag gac cag gtg aac aac 498

Leu Ser Pro Pro Gly Ala Gln Glu Lys Glu Gln Asp Gln Val Asn Asn

120 125 130

aaa gtc ttg atg tgg agg ctg ctg aag ctc tcc agg ccg gac ctg cct 546

Lys Val Leu Met Trp Arg Leu Leu Lys Leu Ser Arg Pro Asp Leu Pro

135 140 145 150

ctc ctc gtt gcc gcc ttc ttc ttc ctt gtc ctt gct gtt ttg ggt gag 594

Leu Leu Val Ala Ala Phe Phe Phe Leu Val Leu Ala Val Leu Gly Glu

155 160 165

aca tta atc cct cac tat tct ggt cgt gtg att gac atc ctg gga ggt 642

Thr Leu Ile Pro His Tyr Ser Gly Arg Val Ile Asp Ile Leu Gly Gly

170 175 180

gat ttt gac ccc cat gcc ttt gcc agt gcc atc ttc ttc atg tgc ctc 690

Asp Phe Asp Pro His Ala Phe Ala Ser Ala Ile Phe Phe Met Cys Leu

185 190 195

ttc tcc ttt ggc agc tca ctg tct gca ggc tgc cga gga ggc tgc ttc 738

Phe Ser Phe Gly Ser Ser Leu Ser Ala Gly Cys Arg Gly Gly Cys Phe

200 205 210

acc tac acc atg tct cga atc aac ttg cgg atc cgg gag cag ctt ttc 786

Thr Tyr Thr Met Ser Arg Ile Asn Leu Arg Ile Arg Glu Gln Leu Phe

215 220 225 230

tcc tcc ctg ctg cgc cag gac ctc ggt ttc ttc cag gag act aag aca 834

Ser Ser Leu Leu Arg Gln Asp Leu Gly Phe Phe Gln Glu Thr Lys Thr

235 240 245

ggg gag ctg aac tca cgg ctg agc tcg gat acc acc ctg atg agt aac 882

Gly Glu Leu Asn Ser Arg Leu Ser Ser Asp Thr Thr Leu Met Ser Asn

250 255 260

tgg ctt cct tta aat gcc aat gtg ctc ttg cga agc ctg gtg aaa gtg 930

Trp Leu Pro Leu Asn Ala Asn Val Leu Leu Arg Ser Leu Val Lys Val

265 270 275

gtg ggg ctg tat ggc ttc atg ctc agc ata tcg cct cga ctc acc ctc 978

Val Gly Leu Tyr Gly Phe Met Leu Ser Ile Ser Pro Arg Leu Thr Leu

280 285 290

ctt tct ctg ctg cac atg ccc ttc aca ata gca gcg gag aag gtg tac 1026

Leu Ser Leu Leu His Met Pro Phe Thr Ile Ala Ala Glu Lys Val Tyr

295 300 305 310

aac acc cgc cat cag gaa gtg ctt cgg gag atc cag gat gca gtg gcc 1074

Ash Thr Arg His Gln Glu Val Leu Arg Glu Ile Gln Asp Ala Val Ala

315 320 325

agg gcg ggg cag gtg gtg cgg gaa gcc gtt gga ggg ctg cag acc gtt 1122

Arg Ala Gly Gln Val Val Arg Glu Ala Val Gly Gly Leu Gln Thr Val

330 335 340

cgc agt ttt ggg gcc gag gag cat gaa gtc tgt cgc tat aaa gag gcc 1170

Arg Ser Phe Gly Ala Glu Glu His Glu Val Cys Arg Tyr Lys Glu Ala

345 350 355

ctt gaa caa tgt cgg cag ctg tat tgg cgg aga gac ctg gaa cgc gcc 1218

Leu Glu Gln Cys Arg Gln Leu Tyr Trp Arg Arg Asp Leu Glu Arg Ala

360 365 370

ttg tac ctg ctc ata agg agg gtg ctg cac ttg ggg gtg cag atg ctg 1266

Leu Tyr Leu Leu Ile Arg Arg Val Leu His Leu Gly Val Gln Met Leu

375 380 385 390

atg ctg agc tgt ggg ctg cag cag atg cag gat ggg gag ctc acc cag 1314

Met Leu Ser Cys Gly Leu Gln Gln Met Gln Asp Gly Glu Leu Thr Gln

395 400 405

ggc agc ctg ctt tcc ttt atg atc tac cag gag agc gtg ggg agc tat 1362

Gly Ser Leu Leu Ser Phe Met Ile Tyr Gln Glu Ser Val Gly Ser Tyr

410 415 420

gtg cag acc ctg gta tac ata tat ggg gat atg ctc agc aac gtg gga 1410

Val Gln Thr Leu Val Tyr Ile Tyr Gly Asp Met Leu Ser Asn Val Gly

425 430 435

gct gca gag aag gtt ttc tcc tac atg gac cga cag cca aat ctg cct 1458

Ala Ala Glu Lys Val Phe Ser Tyr Met Asp Arg Gln Pro Asn Leu Pro

440 445 450

tca cct ggc acg ctt gcc ccc acc act ctg cag ggg gtt gtg aaa ttc 1506

Ser Pro Gly Thr Leu Ala Pro Thr Thr Leu Gln Gly Val Val Lys Phe

455 460 465 470

caa gac gtc tcc ttt gca tat ccc aat cgc cct gac agg cct gtg ctc 1554

Gln Asp Val Ser Phe Ala Tyr Pro Asn Arg Pro Asp Arg Pro Val Leu

475 480 485

aag ggg ctg acg ttt acc cta cgt cct ggt gag gtg acg gcg ctg gtg 1602

Lys Gly Leu Thr Phe Thr Leu Arg Pro Gly Glu Val Thr Ala Leu Val

490 495 500

gga ccc aat ggg tct ggg aag agc aca gtg gct gcc ctg ctg cag aat 1650

Gly Pro Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Val Ala Ala Leu Leu Gln Asn

505 510 515

ctg tac cag ccc aca ggg gga cag gtg ctg ctg gat gaa aag ccc atc 1698

Leu Tyr Gln Pro Thr Gly Gly Gln Val Leu Leu Asp Glu Lys Pro Ile

520 525 530

tca cag tat gaa cac tgc tac ctg cac agc cag gtg gtt tca gtt ggg 1746

Ser Gln Tyr Glu His Cys Tyr Leu His Ser Gln Val Val Ser Val Gly

535 540 545 550

cag gag cct gtg ctg ttc tcc ggt tct gtg agg aac aac att gct tat 1794

Gln Glu Pro Val Leu Phe Ser Gly Ser Val Arg Asn Asn Ile Ala Tyr

555 560 565

ggg ctg cag agc tgc gaa gat gat aag gtg atg gcg gct gcc cag gct 1842

Gly Leu Gln Ser Cys Glu Asp Asp Lys Val Met Ala Ala Ala Gln Ala

570 575 580

gcc cac gca gat gac ttc atc cag gaa atg gag cat gga ata tac aca 1890

Ala His Ala Asp Asp Phe Ile Gln Glu Met Glu His Gly Ile Tyr Thr

585 590 595

gat gta ggg gag aag gga agc cag ctg gct gcg gga cag aaa caa cgt 1938

Asp Val Gly Glu Lys Gly Ser Gln Leu Ala Ala Gly Gln Lys Gln Arg

600 605 610

ctg gcc att gcc cgg gcc ctt gta cga gac ccg cgg gtc ctc atc ctg 1986

Leu Ala Ile Ala Arg Ala Leu Val Arg Asp Pro Arg Val Leu Ile Leu

615 620 625 630

gat gag gct act agt gcc cta gat gtg cag tgc gag cag gcc ctg cag 2034

Asp Glu Ala Thr Ser Ala Leu Asp Val Gln Cys Glu Gln Ala Leu Gln

635 640 645

gac tgg aat tcc cgt ggg gat cgc aca gtg ctg gtg att gct cac agg 2082

Asp Trp Asn Ser Arg Gly Asp Arg Thr Val Leu Val Ile Ala His Arg

650 655 660

ctg cag gca gtt cag cgc gcc cac cag atc ctg gtg ctc cag gag ggc 2130

Leu Gln Ala Val Gln Arg Ala His Gln Ile Leu Val Leu Gln Glu Gly

665 670 675

aag ctg cag aag ctt gcc cag ctc cag gag gga cag gac ctc tat tcc 2178

Lys Leu Gln Lys Leu Ala Gln Leu Gln Glu Gly Gln Asp Leu Tyr Ser

680 685 690

cgc ctg gtt cag cag cgg ctg atg gac tgaggcccca gggatactgg 2225

Arg Leu Val Gln Gln Arg Leu Met Asp

695 700

gccctcttct caggggcgtc tccaggaccc agagctgttc ctgctttgag tttccctaga 2285

gctgtgcggc cagatagctg ttcctgagtt gcaagcacga tggagatttg gacactgtgt 2345

gcttttggtg gggtggagag gtggggtggg gtggggtgtg gtggggtggg aggctgtctg 2405

tgtccaggaa acttaattcc ctggtgacta gagctttgcc tggtgatgag gagtattttg 2465

tggcataata catatatttt aaaatatttt ccttcttacg tgaactgtat acattcatat 2525

agaaaattta gacaatataa aaaagtacaa agaagaaaag taaaagtacc cattgtttca 2585

cttcctggag ataaccatag ttgctatttt gctgcctgtc ccatcagtcg tttatctgtt 2645

gtttgagata gaaattaacc aaaaatgaca taaatattca tgagattgcc ttcctatatc 2705

cttccttgtt cctaccagtg tctgctattt tgaagaagct agggtctgga gggacagaga 2765

acagttccct gattaacagt attaatagcg acattggtaa cagctaccat ttatagagtt 2825

ttaatgggag taggagctat gctaagtgtt tttcatgtat tatcgttttt aatcattatc 2885

cccaacccta tgaggttggt tattatcccc attttacaga tgaggaaact gaagctcaaa 2945

gaggctcaat gactttccca aggtggtcgt agtggtggag ttggagtttg aacacaggcc 3005

tgaccctaga gtccacaccc tgacccaatc aattatattg catcttgggt ccataaaccc 3065

taatccataa tcccatcaag aaaagctctg ctgctcttag ctctaaataa ttcagaatct 3125

attctcttct ctccagtccc gttgttatag tcttcactca tagacttaag atgatcccat 3185

caccagagag gtttctctac cattagcttc cctcttccgg ccattcttca caaagtcatt 3245

tttctaaatt ctgtgtcaca tacgatgatg gcatttctgg aaattccttc aggtgctctc 3305

aagccctgct gcagagatcc ttttcagagc acacactgtt ccagcccatc tgtctcaccc 3365

tctcctgttg tatccagctc cacgacaaac tttctgcctt ccccaacacc tttgtgcctt 3425

tgcatatggt gttttcttgc ccattttctg ctcgactcgc ccctgatttt caagttcaag 3485

acttaactca gggttcaggt cttccaggag gccttactta tgtcgtcagt ctggggaact 3545

ctccatgtgc ttctatcact gtgcggttac ctctttcaca gcccttttaa agttctatct 3605

tccctttccc accttttttg accttccact agaccatgag cacctgggcg gaaagccata 3665

tatcttatta agctttatat ctgctacctg gccgagggct aattcatagt ggag 3719

<210>50

<211>703

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>50

Met Arg Leu Pro Asp Leu Arg Pro Trp Thr Ser Leu Leu Leu Val Asp

1 5 10 15

Ala Ala Leu Leu Trp Leu Leu Gln Gly Pro Leu Gly Thr Leu Leu Pro

20 25 30

Gln Gly Leu Pro Gly Leu Trp Leu Glu Gly Thr Leu Arg Leu Gly Gly

35 40 45

Leu Trp Gly Leu Leu Lys Leu Arg Gly Leu Leu Gly Phe Val Gly Thr

50 55 60

Leu Leu Leu Pro Leu Cys Leu Ala Thr Pro Leu Thr Val Ser Leu Arg

65 70 75 80

Ala Leu Val Ala Gly Ala Ser Arg Ala Pro Pro Ala Arg Val Ala Ser

85 90 95

Ala Pro Trp Ser Trp Leu Leu Val Gly Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Ser

100 105 110

Trp Ser Leu Trp Ala Val Leu Ser Pro Pro Gly Ala Gln Glu Lys Glu

115 120 125

Gln Asp Gln Val Asn Asn Lys Val Leu Met Trp Arg Leu Leu Lys Leu

130 135 140

Ser Arg Pro Asp Leu Pro Leu Leu Val Ala Ala Phe Phe Phe Leu Val

145 150 155 160

Leu Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Ile Pro His Tyr Ser Gly Arg Val

165 170 175

Ile Asp Ile Leu Gly Gly Asp Phe Asp Pro His Ala Phe Ala Ser Ala

180 18 5190

Ile Phe Phe Met Cys Leu Phe Ser Phe Gly Ser Ser Leu Ser Ala Gly

195 200 205

Cys Arg Gly Gly Cys Phe Thr Tyr Thr Met Ser Arg Ile Asn Leu Arg

210 215 220

Ile Arg Glu Gln Leu Phe Ser Ser Leu Leu Arg Gln Asp Leu Gly Phe

225 230 235 240

Phe Gln Glu Thr Lys Thr Gly Glu Leu Asn Ser Arg Leu Ser Ser Asp

245 250 255

Thr Thr Leu Met Ser Asn Trp Leu Pro Leu Asn Ala Asn Val Leu Leu

260 265 270

Arg Ser Leu Val Lys Val Val Gly Leu Tyr Gly Phe Met Leu Ser Ile

275 280 285

Ser Pro Arg Leu Thr Leu Leu Ser Leu Leu His Met Pro Phe Thr Ile

290 295 300

Ala Ala Glu Lys Val Tyr Ash Thr Arg His Gln Glu Val Leu Arg Glu

305 310 315 320

Ile Gln Asp Ala Val Ala Arg Ala Gly Gln Val Val Arg Glu Ala Val

325 330 335

Gly Gly Leu Gln Thr Val Arg Ser Phe Gly Ala Glu Glu His Glu Val

340 345 350

Cys Arg Tyr Lys Glu Ala Leu Glu Gln Cys Arg Gln Leu Tyr Trp Arg

355 360 365

Arg Asp Leu Glu Arg Ala Leu Tyr Leu Leu Ile Arg Arg Val Leu His

370 375 380

Leu Gly Val Gln Met Leu Met Leu Ser Cys Gly Leu Gln Gln Met Gln

385 390 395 400

Asp Gly Glu Leu Thr Gln Gly Ser Leu Leu Ser Phe Met Ile Tyr Gln

405 410 415

Glu Ser Val Gly Ser Tyr Val Gln Thr Leu Val Tyr Ile Tyr Gly Asp

420 425 430

Met Leu Ser Asn Val Gly Ala Ala Glu Lys Val Phe Ser Tyr Met Asp

435 440 445

Arg Gln Pro Asn Leu Pro Ser Pro Gly Thr Leu Ala Pro Thr Thr Leu

450 455 460

Gln Gly Val Val Lys Phe Gln Asp Val Ser Phe Ala Tyr Pro Asn Arg

465 470 475 480

Pro Asp Arg Pro Val Leu Lys Gly Leu Thr Phe Thr Leu Arg Pro Gly

485 490 495

Glu Val Thr Ala Leu Val Gly Pro Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Val

500 505 510

Ala Ala Leu Leu Gln Asn Leu Tyr Gln Pro Thr Gly Gly Gln Val Leu

515 520 525

Leu Asp Glu Lys Pro Ile Ser Gln Tyr Glu His Cys Tyr Leu His Ser

530 535 540

Gln Val Val Ser Val Gly Gln Glu Pro Val Leu Phe Ser Gly Ser Val

545 550 555 560

Arg Asn Asn Ile Ala Tyr Gly Leu Gln Ser Cys Glu Asp Asp Lys Val

565 570 575

Met Ala Ala Ala Gln Ala Ala His Ala Asp Asp Phe Ile Gln Glu Met

580 585 590

Glu His Gly Ile Tyr Thr Asp Val Gly Glu Lys Gly Ser Gln Leu Ala

595 600 605

Ala Gly Gln Lys Gln Arg Leu Ala Ile Ala Arg Ala Leu Val Arg Asp

610 615 620

Pro Arg Val Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ala Leu Asp Val Gln

625 630 635 640

Cys Glu Gln Ala Leu Gln Asp Trp Asn Ser Arg Gly Asp Arg Thr Val

645 650 655

Leu Val Ile Ala His Arg Leu Gln Ala Val Gln Arg Ala His Gln Ile

660 665 670

Leu Val Leu Gln Glu Gly Lys Leu Gln Lys Leu Ala Gln Leu Gln Glu

675 680 685

Gly Gln Asp Leu Tyr Ser Arg Leu Val Gln Gln Arg Leu Met Asp

690 695 700

<210>51

<211>264

<212>DNA

<213>人疱疹病毒1

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(264)

<223>

<400>51

atg tcg tgg gcc ctg gaa atg gcg gac acc ttc ctg gac acc atg cgg 48

Met Ser Trp Ala Leu Glu Met Ala Asp Thr Phe Leu Asp Thr Met Arg

1 5 10 15

gtt ggg ccc agg acg tac gcc gac gta cgc gat gag atc aat aaa agg 96

Val Gly Pro Arg Thr Tyr Ala Asp Val Arg Asp Glu Ile Asn Lys Arg

20 25 30

ggg cgt gag gac cgg gag gcg gcc aga acc gcc gtg cac gac ccg gag 144

Gly Arg Glu Asp Arg Glu Ala Ala Arg Thr Ala Val His Asp Pro Glu

35 40 45

cgt ccc ctg ctg cgc tct ccc ggg ctg ctg ccc gaa atc gcc ccc aac 192

Arg Pro Leu Leu Arg Ser Pro Gly Leu Leu Pro Glu Ile Ala Pro Ash

50 55 60

gca tcc ttg ggt gtg gca cat cga aga acc ggc ggg acc gtg acc gac 240

Ala Ser Leu Gly Val Ala His Arg Arg Thr Gly Gly Thr Val Thr Asp

65 70 75 80

agt ccc cgt aat ccg gta acc cgt 264

Ser Pro Arg Asn Pro Val Thr Arg

85

<210>52

<211>88

<212>PRT

<213>人疱疹病毒1

<400>52

Met Ser Trp Ala Leu Glu Met Ala Asp Thr Phe Leu Asp Thr Met Arg

1 5 10 15

Val Gly Pro Arg Thr Tyr Ala Asp Val Arg Asp Glu Ile Asn Lys Arg

20 25 30

Gly Arg Glu Asp Arg Glu Ala Ala Arg Thr Ala Val His Asp Pro Glu

35 40 45

Arg Pro Leu Leu Arg Ser Pro Gly Leu Leu Pro Glu Ile Ala Pro Asn

50 55 60

Ala Ser Leu Gly Val Ala His Arg Arg Thr Gly Gly Thr Val Thr Asp

65 70 75 80

Ser Pro Arg Asn Pro Val Thr Arg

85

<210>53

<211>549

<212>DNA

<213>人巨细胞病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(549)

<223>

<400>53

atg gat ctc ttg att cgt ctc ggt ttt ctg ttg atg tgt gcg ttg ccg 48

Met Asp Leu Leu Ile Arg Leu Gly Phe Leu Leu Met Cys Ala Leu Pro

1 5 10 15

acc ccc ggt gag cgg tct tcg cgt gac ccg aaa acc ctt ctc tct ctg 96

Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Arg Asp Pro Lys Thr Leu Leu Ser Leu

20 25 30

tct ccg cga caa caa gct tgt gtt ccg aga acg aag tcg cac aga ccc 144

Ser Pro Arg Gln Gln Ala Cys Val Pro Arg Thr Lys Ser His Arg Pro

35 40 45

gtt tgt tac aac gat aca ggg gac tgc aca gat gca gat gat agc tgg 192

Val Cys Tyr Asn Asp Thr Gly Asp Cys Thr Asp Ala Asp Asp Ser Trp

50 55 60

aaa cag ctg ggt gag gac ttt gcg cac caa tgc ttg cag gcg gcg aaa 240

Lys Gln Leu Gly Glu Asp Phe Ala His Gln Cys Leu Gln Ala Ala Lys

65 70 75 80

aag agg cct aaa acg cac aaa tcc cgt ccg aac gat agg aac ctt gag 288

Lys Arg Pro Lys Thr His Lys Ser Arg Pro Asn Asp Arg Asn Leu Glu

85 90 95

ggt agg ctg acc tgt caa cga gtc cgt cgg cta ctg ccc tgt gat ttg 336

Gly Arg Leu Thr Cys Gln Arg Val Arg Arg Leu Leu Pro Cys Asp Leu

100 105 110

gat att cat cct agc cac cgg ttg tta acg ctt atg aat aac tgc gtc 384

Asp Ile His Pro Ser His Arg Leu Leu Thr Leu Met Asn Ash Cys Val

115 120 125

tgt gac ggg gcc gtt tgg aac gcg ttt cgc ttg ata gaa cga cac gga 432

Cys Asp Gly Ala Val Trp Asn Ala Phe Arg Leu Ile Glu Arg His Gly

130 135 140

ttc ttc gct gtg act ttg tat tta tgt tgc ggg att act ctg ctg gtt 480

Phe Phe Ala Val Thr Leu Tyr Leu Cys Cys Gly Ile Thr Leu Leu Val

145 150 155 160

gtt att cta gca ttg ctg tgc agc ata aca tac gaa tcg act gga cgt 528

Val Ile Leu Ala Leu Leu Cys Ser Ile Thr Tyr Glu Ser Thr Gly Arg

165 170 175

ggg att cga cgt tgt ggc tcc 549

Gly Ile Arg Arg Cys Gly Ser

180

<210>54

<211>183

<212>PRT

<213>人巨细胞病毒

<400>54

Met Asp Leu Leu Ile Arg Leu Gly Phe Leu Leu Met Cys Ala Leu Pro

1 5 10 15

Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Arg Asp Pro Lys Thr Leu Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Pro Arg Gln Gln Ala Cys Val Pro Arg Thr Lys Ser His Arg Pro

35 40 45

Val Cys Tyr Asn Asp Thr Gly Asp Cys Thr Asp Ala Asp Asp Ser Trp

50 55 60

Lys Gln Leu Gly Glu Asp Phe Ala His Gln Cys Leu Gln Ala Ala Lys

65 70 75 80

Lys Arg Pro Lys Thr His Lys Ser Arg Pro Asn Asp Arg Asn Leu Glu

85 90 95

Gly Arg Leu Thr Cys Gln Arg Val Arg Arg Leu Leu Pro Cys Asp Leu

100 105 110

Asp Ile His Pro Ser His Arg Leu Leu Thr Leu Met Asn Asn Cys Val

115 120 125

Cys Asp Gly Ala Val Trp Asn Ala Phe Arg Leu Ile Glu Arg His Gly

130 135 140

Phe Phe Ala Val Thr Leu Tyr Leu Cys Cys Gly Ile Thr Leu Leu Val

145 150 155 160

Val Ile Leu Ala Leu Leu Cys Ser Ile Thr Tyr Glu Ser Thr Gly Arg

165 170 175

Gly Ile Arg Arg Cys Gly Ser

180

Claims

1.增强MHC I类分子上的外来表位展示的方法，其中所述方法包括下述步骤：

(a)抑制细胞中的TAP活性；和

(b)在所述细胞中表达与表位融合的MHC I类重链或与表位融合的β2m。

2.权利要求1的方法，其中所述方法还包括酸处理步骤。

3.权利要求1或2的方法，其中所述抑制细胞中的TAP活性的步骤包括使所述细胞与具有TAP抑制活性的蛋白质接触的步骤，或将编码所述蛋白质的载体导入所述细胞的步骤。

4.权利要求3的方法，其中所述的具有所述TAP抑制活性的蛋白质是US6或ICP47。

5.权利要求3的方法，其中所述载体是感染哺乳动物细胞的病毒载体。

6.权利要求5的方法，其中所述载体是仙台病毒载体。

7.哺乳动物细胞，其中(i)所述细胞中的TAP基因表达受到抑制，所述细胞含有TAP抑制剂，或所述细胞以可表达的方式携有编码所述TAP抑制剂的基因，且其中(ii)所述细胞以可表达的方式携有编码与表位融合的MHCI类重链或与表位融合的β2m的基因。

8.用于展示表位的试剂盒，其含有：(i)TAP抑制剂或能表达所述抑制剂的载体；和(ii)与表位融合的MHC I类重链或与表位融合的β2m，或能表达所述与表位融合的MHC I类重链或所述与表位融合的β2m的载体。

9.能表达(i)和(ii)的载体：

(i)TAP抑制剂；和

(ii)与表位融合的MHC I类重链或与表位融合的β2m。