CN1298851C - 多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于肿瘤免疫治疗法的5T4肿瘤相关抗原(TAA)。本发明还涉及其中缺失至少一个免疫逃避基因、包含编码5T4 TAA的核酸序列的重组痘病毒载体以及用于针对其的免疫和治疗肿瘤的用途。

Description

多肽
本发明提供用于肿瘤免疫疗法的5T4肿瘤相关抗原(TAA)。本发明还涉及其中缺失至少一个免疫逃避基因的重组痘病毒载体及其在抗肿瘤疫苗接种和肿瘤治疗中的用途，所述重组痘病毒载体包含编码5T4TAA的核酸序列。
发明领域
本发明涉及可用于激发接受者抗肿瘤免疫应答的肿瘤相关抗原(TAA)。具体来说，本发明涉及5T4抗原及其在免疫治疗中的用途。
发明背景
已经鉴定并表征了人类和动物肿瘤中的多种癌胚抗原或肿瘤相关抗原(TAA)。一般来说，TAA是在胎儿发育过程中表达、在成人细胞中向下调节的抗原，因此通常成人缺乏TAA或其存在水平非常低。观测到肿瘤细胞恢复表达TAA，所以提出将TAA用于肿瘤诊断、寻靶和免疫治疗。
具体来说，最近克隆的T细胞识别的肿瘤抗原在开发抗原特异性癌症疫苗中引起极大的兴趣。然而，许多肿瘤相关抗原是非突变的免疫原性低的组织分化抗原。其免疫原性弱的可能原因是自身耐受。因此，它们几乎不能成为适合增强免疫应答的抗原肽。
尽管如此，发现部分肿瘤相关抗原规律性与大多数个体的肿瘤有关。这类抗原是特别引人注目的疫苗候选物。包括T淋巴细胞识别的黑素瘤分化抗原(MDA)、黑素瘤抗原以及数种MAGE家族的蛋白。但是，迄今的临床试验获得的结果证实，对这些抗原诱导治疗性T细胞是极其困难的。人体免疫系统对许多肿瘤抗原的明显的低反应性的一个原因可能是：它们是正常的、非突变的自身抗原。因此，将非突变自身细胞抗原用于肿瘤免疫疗法的主要障碍在打破对这种抗原的耐受。例如鼠类痘病毒重组体表达的鼠类透明带抗原能够使小鼠丧失生殖能力。这些资料表明尽管可用表达自身抗原的重组痘病毒打破自身耐受，仍然需要优化其效力，以便有效治疗确诊肿瘤成为可能。
已经充分表征了TAA 5T4(参见WO 89/07947)。它是广泛表达于各种癌症的72kDa糖蛋白，而在正常成熟组织的表达分布却非常有限(见表1)。似乎它与结肠癌和胃癌转移密切相关。已知人5T4的完整核酸序列(Myers等，1994J Biol Chem 169：9319-24)。
表1
             人5T4的分布
肿瘤类型                5T4频率(％)
乳腺癌                  84
卵巢癌                  71
胃癌                    74
结肠癌                  85
(Starzynska等，Eur J Gastroenterol Hepatol 1998 Jun；10(6)：479-84；Starzynska等，Br J Cancer 1994 May；69(5)：899-902；Starzynska等，Br J Cancer 1992 Nov；66(5)：867-9)
尽管因为可能涉及的机制，已经提出5T4用作肿瘤进展和转移潜力的标记(Carsberg等，(1996)Int J Cancer 1996Sep 27；68(1)：84-92)，但是没有提出5T4用作免疫治疗药物。打破本身以有限方式在成熟组织表达的5T4的免疫耐受还没有得到证实。因此，不能预测5T4能否成为抗癌免疫疗法的有效抗原。
发明概述
如果获得成功的治疗结果，癌症治疗的免疫疗法取决于多种因素。包括激发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的能力、激发抗体应答的能力，而重要的是打破接受者免疫耐受的能力。目前已经证实，用5T4免疫接种接受者获得成功的如上所判断的免疫治疗反应。具体来说，已经证实用5T4免疫接种可激发抗体应答。
因此，本发明提供表达编码5T4抗原的核酸的病毒载体。
5T4抗原在接受者的表达可有效激发免疫治疗性抗肿瘤应答。所述病毒载体最好有助于对表达抗原的CTL应答，而且最好是痘病毒载体如痘苗病毒载体。以下描述适合传递5T4抗原的其它病毒和非病毒载体。
本文使用的“载体”可以是任何能够传递或将核酸保持在宿主细胞中的因子，包括病毒载体、质粒、裸核酸、与多肽或其它分子复合的核酸以及固定在固相颗粒上的核酸。以下详细描述这类载体。当然本发明在其最广义上不限于传递5T4编码核酸的任何具体载体。
本文所指的“核酸”可以是天然或合成DNA或RNA或其任何组合物。按照本发明的核酸仅限于它们具有编码5T4抗原的作用，这样宿主生物体的细胞器可翻译所述核酸。因此，例如可以修饰天然核酸以增加其稳定性。可修饰DNA和/或RNA、尤其是RNA以提高其成分对核酸酶的抗性。例如已知对核糖核苷酸的修饰包括2’-O-甲基、2’-氟基、2’-氨基和2’-O-烯丙基。按照本发明修饰的核酸可包括化学修饰，进行化学修饰以增加所述核酸的体内稳定性、增强或协调其传递或降低机体的清除率。这类修饰的实例包括核糖和/或磷酸和/或特定RNA序列的各碱基位置上的化学取代。参见例如WO 92/03568；U.S.5,118,672；Hobbs等，(1973)Biochemistry 12：5138；Guschlbauer等，(1977)Nucleic Acids Res.4：1933；Schibaharu等，(1987)Nucleic AcidsRes.15：4403；Pieken等，(1991)Science 253：314，其中每个文献均具体通过引用结合到本文中。
按照本发明“表达”5T4抗原是指宿主生物体细胞通过翻译(任选转录)编码5T4的核酸产生5T4抗原。因此，5T4在所述细胞中原位产生。因为5T4是跨膜蛋白，所以其胞外部分呈现在其产生细胞的表面上。因而必要时，术语“表达”包括提供必要的信号以确保正确加工5T4，使其呈现在细胞表面而且能够与宿主免疫系统相互作用。
本文使用的术语“多肽”是指其中单体为氨基酸而且通过肽键或二硫键连接在一起的聚合物。“多肽”是指全长天然氨基酸链或其片段如选定的结合作用中的目的多肽区、合成氨基酸链或其组合物。因此“其片段”是指全长多肽中的一部分的约8-约500个氨基酸长度、更优选约8-约200个氨基酸甚至更优选约10-约50或100个氨基酸长度的氨基酸序列。另外，可包含非天然氨基酸，例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。在本发明中也使用非基因编码的常见氨基酸。
5T4抗原是称为5T4的多肽，并例如在WO89/07947中对其进行了表征。在一个优选方面，5T4是如Myers等(同上)表征的人5T4，其序列见GenBank登录号Z29083，本文称为SEQ.ID.No.1。然而，本发明包括各种5T4和5T4等位基因变异体，包括本文SEQ ID NO 3所示的犬5T4和本文SEQ ID NO 2所示的小鼠5T4(GenBank登录号AJ012160)以及片段(优选明显不同的表位)和其保留5T4抗原性的包含氨基酸插入、缺失或取代的变异体。这样的片段在下文进行更详细的描述。
第二方面，本发明涉及修饰的5T4抗原。本文使用的“修饰的抗原”是不同于天然5T4的截短、延长或用其它方法突变的5T4多肽。发现5T4产生的肽片段能够用作5T4特异性抗原决定簇。这样的肽能够在接受者体内结合HLA分子并诱导针对野生型5T4的CTL应答，通常比全长5T4更有效。此外，可通过氨基酸插入、缺失或取代使5T4肽突变；突变肽最好在接受者体内更有效地结合HLA，诱导更强的CTL应答。肽可以是任何长度，但是最好5-25个氨基酸，优选6-15个氨基酸，优选约9个氨基酸长度。
修饰肽最好是5T4的HLA CTL表位。根据利用K.Parker(NIH)设计的程序“肽结合预测”获得的更有效CTL应答的预测结果，可对这类表位进行修饰，所述程序可在下面的网址找到： http://www- bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken parker comboform(也可参阅Parker，K.C等1994.J.Immunol.152：163)。
在一个优选方面，“修饰的”5T4包括与转运肽或佐剂结合或以其它方式连接的肽以便增强其激发免疫应答的能力。例如可将肽与不依赖TAP的转运肽融合以有效转运给HLA并与HLA分子相互作用以增强CTL表位(综述参阅Yewdell等，1998J Immunother 21：127-31；Fu等，(1998)J Virol 72：1469-81)。
第三方面，本发明提供在接受者激发免疫应答的方法，包括用编码5T4抗原的核酸免疫接受者和在接受者表达5T4抗原的步骤。
如上所述用表达5T4的核酸免疫接种激发免疫应答。通过给予包含抗原的“引发(priming)”剂，然后在用引发剂有效引发后给予所述免疫系统包括追加抗原的第二剂或“加强”剂，从而可激发免疫。
用于免疫接种的载体可以是任何病毒或非病毒载体。所用的5T4抗原，无论是全长5T4还是其肽，均可以是修饰的5T4抗原，5T4抗原可以在来源上是同源(即来源于与接受者相同的物种)或异源的。
最好是激发的免疫应答是参与活化5T4特异性细胞毒性T淋巴细胞的CTL应答。
最好是所述应答是有效抑制、阻止或逆转接受者肿瘤发展的抗肿瘤免疫治疗性应答。
第四方面，本发明提供应用5T4抗原制备用于免疫治疗接受者肿瘤的组合物。
利用5T4抗原的免疫接种最好能够在接受者体内打破对5T4的免疫耐受。
按照第五方面，本发明提供包含5T4抗原的疫苗组合物。疫苗组合物可包含同源5T4抗原、异源5T4抗原或突变5T4抗原。
含5T4抗原的疫苗可以类似于相同目的的应用5T4编码核酸的方式用于肿瘤免疫或肿瘤治疗。所述疫苗组合物最好包含一种或多种佐剂。
第六方面，本发明包括编码5T4抗原的表达载体，该载体可用于表达5T4并生产适用于疫苗组合物的5T4抗原。所述载体可以是原核载体或真核载体，而且最好是能够在哺乳动物细胞中表达5T4的载体。
5T4抗原可以是任何来源的5T4抗原，而且可以是修饰的5T4抗原，例如本文所述的5T4抗原。
第七方面，本发明提供应用5T4抗原制备用于免疫接受者的组合物。利用5T4的免疫接种包括给予所述接受者免疫有效量的按照本发明第五方面的疫苗组合物。
第八方面，本发明提供应用5T4抗原制备用于使接受者绝育(sterilisation)的组合物。给予5T4抗原可以有效地使接受者绝育。所述接受者优选为女性接受者(female subject)。
本发明还涉及应用5T4寻靶分子，如抗5T4抗体如抗5T4scFvs。这些抗体可以用于(i)原位靶向天然或外源5T4和/或(ii)原位将免疫增强分子如B7.1传递至天然或外源5T4(Carroll等(1998)J Natl CancerInst 90(24)：1881-7)。这可增强5T4在所述接受者体内的免疫原性。本发明还涉及序贯使用编码5T4抗原和抗5T4抗体如抗5T4svFvs的载体。抗5T4svFvs抗体可以作为编码所述抗体的裸DNA(例如在包含编码DNA和控制其产生的短启动子区的质粒中)、包含所述编码序列的表达载体(可以是病毒或非病毒载体)或蛋白形式给予。因此，本发明提供编码5T4抗原的载体和任选与免疫刺激分子融合的能够结合5T4的因子，它们独立用于治疗肿瘤，例如序贯使用。
在再一实施方案中，本发明包括包含酶治疗/前体药物治疗和利用5T4的免疫治疗的联合治疗。例如酶治疗/前体药物治疗可包括肿瘤内或系统传递P450(任选用逆转录病毒载体或慢病毒载体传递)和环磷酰胺(CPA)，然后用5T4进行系统免疫治疗性诱导。
因此，本发明还涉及编码5T4抗原的载体、前体药物/酶的联合应用，它们分别、同时分别或联合用于治疗肿瘤。
在再一实施方案中，可将5T4或5T4肽与乙型肝炎核心抗原融合以增强T辅助细胞和抗体应答(Schodel等，1996 Intervirology 39：104-10)。
所以，按照本发明的第九方面，提供其中至少缺失一个免疫逃避基因的重组痘病毒载体，它包含编码肿瘤相关抗原(TAA)的核酸序列。
TAA抗原性弱，免疫系统将其识别为“自身”组分，因此其耐受程度非常大。尽管应用痘病毒载体能够使所述抗原被提呈，使得至少部分可服这种耐受，但是用多数痘病毒载体观测到的免疫原性效应是有限的。人们认为缺失天然存在于痘病毒的免疫逃避基因可能对用TAA免疫接种具有有益的作用。缺失免疫逃避基因的痘病毒载体可能能够打破对编码的自身抗原包括TAA的免疫耐受，因此能够使宿主增强对弱免疫原性自身抗原或其它自身抗原的免疫应答。
第十方面，本发明提供在哺乳动物激发免疫应答的方法，包括给予所述哺乳动物按照本发明第九方面的重组痘病毒载体，由此激发所述哺乳动物对TAA的免疫应答。
已知抗原如TAA依赖于产生CTL应答，以在接受者体内提供保护性效应或治疗作用，CTL应答依赖于通过MHCI途径加工抗原。据认为，长期抗原表达使高水平CTL的保持时间延长。本发明的第十一方面提供裂解活性降低的痘病毒，以增强接受者对抗原的CTL反应。
第十二方面，本发明提供应用按照本发明第九、第十一方面的重组痘病毒载体在哺乳动物激发针对TAA的免疫应答。
第十三方面，本发明提供在免疫治疗中用作肿瘤相关靶的5T4抗原。
第十四方面，本发明提供应用重组痘病毒载体打破哺乳动物对弱免疫原的免疫耐受并激发对其的免疫应答，所述重组痘病毒载体中至少一个免疫逃避基因缺失或突变并且包含编码弱免疫原的核酸序列。
在附后的权利要求书和以下的描述和讨论中提供本发明的其它方面。这些方面在单独的小节标题下给出。然而，应该指出的是，每个小节标题下的内容不一定限于其具体小节标题。
发明详述
传递或表达5T4抗原的载体
可用病毒或非病毒技术传递按照本发明的5T4多肽。
非病毒传递系统包括但不限于DNA转染方法。在此转染包括利用非病毒载体将5T4基因传递给目标哺乳动物的方法。
常规的转染方法包括电穿孔、核酸生物发射(nucleic acidbiolistics)、脂质介导的转染、紧结核酸介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质转染(lipofectin)、阳离子剂介导的转染、阳离子面或两亲物(CFA)(Nature Biiotechnology 1996 14；556)、多价阳离子如精胺、阳离子脂质或聚赖氨酸、1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲基氨基(ammonio))丙烷(DOTAP)-胆固醇复合物(Wolff和Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology16：421)和其组合物。
病毒传递系统包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或杆状病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、痘病毒如：金丝雀痘病毒(Taylor等1995Vaccine 13：539-549)、昆虫痘病毒(Li Y等1998第十三界国际痘病毒专题会议第144页，摘要)、企鹅痘病毒(penguine pox)(Standerd等J GenVirol.1998 79：1637-46)甲病毒属和基于甲病毒属的DNA载体。
逆转录病毒实例包括但不限于：鼠类白血病病毒(MLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠类白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠类骨肉瘤病毒(FBRMSV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠类白血病病毒(A-MLV)、禽髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和鸟类成红细胞增生病毒(AEV)。
逆转录病毒详细一览表见Coffin等(“Retroviruses”1997 ColdSpring Harbour Laboratory Press Eds：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第758-763页)。
慢病毒分为灵长类和非灵长类组。灵长类慢病毒实例包括但不限于：人类免疫缺陷病毒(HIV)，即人类自身免疫性缺陷综合征(AIDS)的致病原，以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒组包括原型“慢病毒”维斯那/梅迪病毒(VMV)以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)和最近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)以及牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒科与其它类型逆转录病毒一个明显的不同在于慢病毒既能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞(Lewis等1992 EMBO.J 11：3053-3058；Lewis和Emerman 1994 J.Virol.68：510-516)。相反，其它逆转录病毒如MLV不能感染非分裂细胞，如构成例如肌肉、大脑、肺和肝脏组织的细胞。
本发明的载体可以装配成内含子间断(split-intron)的载体。PCT专利申请WO 99/15683和WO 99/15684描述了内含子间断的载体。
如果腺病毒的特征与逆转录病毒/慢病毒的遗传稳定性结合，则基本上所述腺病毒可用于转导靶细胞，使其成为能够稳定感染邻近细胞的瞬时逆转录病毒产生细胞。可将这样的工程表达5T4抗原的逆转录病毒产生细胞植入生物体如动物或人类，用于治疗血管生成和/或癌症。
痘病毒载体
在本发明中优选使用痘病毒载体。工程改造痘病毒用于重组基因表达和用作重组活疫苗。需要应用重组技术将编码外源抗原的核酸导入痘病毒基因组中。如果所述核酸整合在所述病毒生活周期非必需病毒DNA位点，则新产生的重组痘病毒可能是传染性的，也就是说，感染外源细胞，由此表达所整合的DNA序列。以这种方式制备的重组痘病毒可用作活疫苗，用于预防和/或治疗疾病和传染性疾病。
5T4在重组痘病毒如痘苗病毒中表达需要将痘苗启动子与编码5T4的核酸连接。构建质粒载体(也称为插入载体)，用于通过供体质粒的所述核酸侧翼的病毒序列和存在于亲代病毒的同源序列之间的同源重组将核酸插入痘苗病毒中(Mackett等1982PNAS 79：7415-7419)。一种类型的插入载体组成如下：(a)包含转录起始位点的痘苗病毒启动子；(b)位于转录起始位点下游用于插入核酸的几个独特的限制性内切核酸酶克隆位点；(c)启动子侧翼的非必需痘苗病毒序列(如胸苷激酶(TK)基因)和指导所述核酸插入病毒基因组非必需同源区的克隆位点；和(d)在大肠杆菌中复制和选择的细菌复制起点和抗生素抗性标记。Mackett描述了这类载体实例(Mackett等1984，J.Virol.49：857-864)。
使包含需要插入的核酸的分离质粒与亲代病毒如痘病毒一起转染入细胞培养物如鸡胚成纤维细胞中。质粒中的同源痘DNA和病毒基因组之间的重组相应地产生因为在其不影响病毒活力的基因组位点存在启动子-基因构建物而修饰的重组痘病毒。
如上所述，在不影响产生的重组病毒的病毒存活力的病毒区(插入区)插入所述核酸。例如通过随机测试允许形成重组而不严重影响重组体病毒存活力的区的病毒DNA区段，可以容易地在一种病毒中鉴定这样的区。易于使用而且存在于许多病毒的一个区是胸苷激酶(TK)基因。例如TK基因见于所检测的所有痘病毒基因组[野兔痘病毒：Upton等J.Virology 60：920(1986)(兔纤维瘤病毒)；山羊痘病毒：Gershon等J.Gen.Virol.70：525(1989)(Kenya sheep-1)；正痘病毒：Weir等J.Virol46：530(1983)(痘苗病毒)；Esposito等Virology 135：561(1984)(猴痘病毒和天花病毒)；Hruby等PNAS，80：3411(1983)(痘苗病毒)；Kilpatrick等Virology 143：399(1985)(亚巴猴肿瘤病毒)；禽痘病毒：Binns等J.Gen.Virol 69：1275(1988)(鸡痘病毒)；Boyle等Virology 156：355(1987)(鸡痘病毒)；Schnitzlein等J.Virological Method 20：341(1988)(鸡痘病毒，鹌鹑痘病毒)；昆虫痘病毒(Lytvyn等J.Gen.Virol 73：3235-3240(1992)]。
在痘苗病毒中，除了TK区之外，其它插入区包括例如HindIII M。
在鸡痘病毒中，除了TK区之外，其它插入区包括例如EPO申请第0 308 220 A1所述的BamHI J[Jenkins等AIDS Research and HumanRetroviruses 7：991-998(1991)]、EcoRI-HindIII片段、BamHI片段、EcoRV-HindIII片段、BamHI片段和HindIII片段。[Calvert等J.of Virol67：3069-3076(1993)；Taylor等Vaccine 6：497-503(1988)；Spehner等(1990)和Boursnell等J.of Gen.Virol 71：621-628(1990)]。
在猪痘病毒中，优选的插入位点包括胸苷激酶基因区。
根据宿主和靶细胞类型可容易地选择启动子。例如在痘病毒时，应该使用痘病毒启动子，例如痘苗病毒7.5K或40K或鸡痘病毒C1。也可使用含有合适痘病毒序列的人工构建物。也可联合使用增强子元件以提高表达水平。此外，在部分实施方案中优选使用诱导型启动子，诱导型启动子也是本领域周知的。
用酶测定法或免疫测定法(例如免疫沉淀、放射免疫测定法或免疫印迹分析)可检测外源基因表达。重组痘苗病毒感染细胞产生的天然存在的膜糖蛋白被糖基化，并转运到细胞表面。通过应用强启动子可获得高表达水平。
用于疫苗的病毒载体的其它要求包括良好的免疫原性和安全性。MVA是复制缺陷型痘苗病毒株，具有良好的安全记录。MVA不能在大多数细胞类型和正常人体组织中复制。在少数的转化细胞类型如BHK21细胞观测到MVA复制。Carroll等(1997)证实，重组MVA在产生保护性CD8+T细胞应答方面与常规重组痘苗病毒载体同样好，是更常见使用的复制感受态痘苗病毒的有效替代物。由MVA产生的痘苗病毒株或独立开发的、具有使得MVA特别适用于疫苗的MVA特征的病毒株，也适用于本发明。
所述载体最好是痘苗病毒载体如MVA或NYVAC。最优选痘苗病毒株改良的病毒ankara(MVA)或由其产生的病毒株。痘苗病毒载体的替代载体包括禽痘病毒载体如鸡痘病毒或称为ALVAC的金丝雀痘病毒和由其产生的病毒株，它们可以感染并在人类细胞中表达重组蛋白，但是不能复制。
在本发明的一个方面，所述痘病毒载体缺失至少一个免疫逃避基因。
病毒尤其是具有大编码容量，而因此能够编码多种基因的大病毒如痘病毒，发展了多种逃避其宿主免疫系统的技术。例如它们能够逃避非特异性防御，例如补体、干扰素和炎症反应，而且它们能够干扰或阻断细胞因子的作用。从MVA缺失多种这样的免疫逃避多肽，仅留下在左侧末端区具有干扰素抗性的蛋白。
痘病毒一般为大DNA病毒，引起急性感染而不是潜伏性感染。它们编码许多抗原性蛋白，使得难以改变抗原性，因此依赖于主动免疫逃避，以保护其自身逃避哺乳动物免疫系统。它们具有编码多肽的多种基因，所述多肽对免疫系统的多个方面产生干扰：它们破坏干扰素的作用、干扰补体、细胞因子活性、炎症反应和CTL识别作用(综述，Smith等，(1997)Immunol Rev 159：137-154)。去除这些蛋白有助于增强痘病毒载体编码的弱免疫原激发接受者免疫应答的能力。
免疫逃避基因或多肽是有助于所述病毒逃避哺乳动物免疫系统的基因或其产物。所述基因或基因产物最好干扰免疫系统的作用，至少是在一个水平上干扰免疫系统的作用。许多方法可达到此目的，例如通过提供可溶性细胞因子受体的模拟物等提供信号分子的竞争物干扰信号途径。
免疫逃避基因包括但不限于以下基因：
干扰素逃避基因  痘苗病毒具有至少3个干扰IFN作用的基因。E3L基因表达一个25Kd多肽，该多肽与P1蛋白激酶竞争结合dsRNA，此过程使P1活化、eIF2α磷酸化，而且导致不能装配翻译起始复合物。此途径一般对IFN活化起作用，但是阻止E3L表达因此使翻译起始不受阻，可以阻碍该途径。
K3L基因表达的10.5Kd多肽也干扰P1活性，因为它是有效的eIF2α模拟物，而作为P1蛋白激酶竞争物发挥作用。所以其作用模式类似于E3L。
预测A18R基因编码解旋酶，它似乎干扰2’，5’-寡腺苷酸途径，而该途径是IFN反应性的。2’，5’-A激活RNAse L，其作用是阻止病毒翻译。看来在感染细胞中A18R表达降低了2’，5’-A水平。
补体  已知痘苗病毒的B5R基因产物与因子H高度相关，因子H是替代补体途径的调节物。与经典途径不同，抗原单独就可以激活该途径。因此B5R基因产物可干扰替代补体途径。
C21L基因又与人类C4b结合蛋白有关，而且作用于其表面带有C4b的细胞，以阻止与CR1补体受体结合。
可溶性细胞因子受体  痘苗病毒WR B15R基因(在痘苗病毒Copenhagen病毒株的B16R)产物与IL-1β受体IL-1R有关。
痘苗病毒Copenhagen病毒株的A53R，即WR基因ORF SalF19R编码TNF受体。然而，据认为野生型病毒的这两个基因均因为ORF断裂而失活。
据信B8R基因编码可溶性IFN-γ受体，又为所述病毒提供另一个IFN逃避机制。
炎症  据信许多基因参与阻止对病毒感染的炎症反应。这些基因包括A44L、K2L、B13R和B22R。
本发明的一个方面，重组痘病毒载体缺失大多数免疫逃避基因。最好缺失所有免疫逃避基因。因此，本发明的一个方面，所述痘病毒载体是其中K3L干扰素抗性蛋白基因被破坏或缺失的重组MVA载体。
优选对预定接受者没有危险的痘病毒。因此例如优选用于人类的病毒为：或者宿主范围有限的痘病毒如禽痘病毒，或者减毒的痘病毒如痘苗病毒的减毒株(包括NYVAC和MVA)。虽然非痘苗病毒株用于先前存在天花免疫的接受者有效，但最优选痘苗病毒减毒株。
将一种构建物导入感染MVA的细胞中，使其同源重组，所述构建物至少包含一种编码5T4的核酸，此核酸侧翼为邻接MVA基因组中的一个天然缺失如缺失II的MVA DNA序列。
一旦所述构建物导入所述真核细胞而且5T4DNA与病毒DNA重组后，优选借助于标记可分离所需要的重组痘苗病毒(Nakano等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，1593-1596[1982]，Franke等Mol.Cell.Biol.1918-1924[1985]，Chakrabarti等Mol.Cell.Biol.3403-3409[1985]，Fathi等Virology 97-105[1986]。
需要插入的构建物可以是线性的或环形的。优选环形DNA，尤其是质粒。所述构建物包含在MVA基因组天然缺失例如缺失II的左侧和右侧侧翼的序列(Altenburger，W.，Suter，C.P.和Altenburger J.(1989)Arch.Virol.105，15-27)。在天然缺失的侧翼序列之间插入外源DNA序列。
为了表达至少一种核酸，有必要使所述核酸转录所需的调节序列存在于所述核酸上游。本领域技术人员了解这类调节序列，包括例如EP-A-198，328描述的痘苗病毒11kDa基因的调节序列和7.5kDa基因的调节序列(EP-A-110，385)。
所述构建物可通过转染导入MVA感染细胞，所述转染方法包括例如：磷酸钙沉淀(Graham等Virol.52，456-467[1973；Wigler等Cell777-785[1979]电穿孔(Neumann等EMBO J.1，841-845[1982])、微量注射(Graessmann等Meth.Enzymology 101，482-492(1983))、脂质体(Straubinger等Methods in Enzymology 101，512-527(1983))原生质球(Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，2163-2167(1980))或本领域技术人员已知的其它方法。优选脂质体转染。
本发明重组引发载体和加强载体可对哺乳动物特定细胞类型具有趋向性。例如，可工程改造本发明重组载体以感染专职(professional)APC如树突细胞和巨噬细胞。已知树突细胞是成功免疫应答的最佳协调者(orchestrator)，尤其是细胞介导的应答的最佳协调者。已经证实用抗原或包含这种靶抗原的病毒载体体外处理树突细胞当输入同系基因动物或人体时可诱导有效的免疫应答(参见Nestle FO等，用肽-或肿瘤裂解物-脉冲处理的树突细胞免疫接种黑素瘤患者，Nat Med.1998Mar；4(3)：328-32和 Kim CJ等，用编码MART-1/Melan A的痘病毒感染的树突细胞体外致敏T淋巴细胞，J Immunother.1997 Jul；20(4)：276-86。所述重组载体也可以感染肿瘤细胞。或者，所述重组载体能够感染任何哺乳动物细胞。
载体的其它实例包括体外传递系统，体外传递系统包括但不限于DNA转染方法如电穿孔、DNA生物发射、脂质介导的转染和紧结DNA介导的转染。
所述载体可以是一种质粒DNA载体。本文使用的“质粒”是指用于将异源DNA导入细胞中以表达或复制异源DNA的独立元件。选择和应用这类元件完全在技术人员技术水平内。可利用许多质粒，而选择合适质粒取决于质粒的预期用途，即是用于扩增DNA还是表达DNA、需要插入质粒的DNA大小和将用所述质粒转化的宿主细胞。每种质粒根据其作用(扩增DNA还是表达DNA)和与其匹配的宿主细胞而含有不同的组分。质粒组分一般包括但不限于一种或多种以下组分：复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子、转录终止序列和信号序列。
表达质粒和克隆质粒一般均包含使所述质粒能够在一种或多种选定宿主细胞中复制的核酸序列。通常在克隆质粒中这种序列是使所述质粒独立于宿主染色体DNA复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。对各种细菌、酵母和病毒的这种序列是周知的。质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2m质粒复制起点适用于酵母，而各种病毒复制起点(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒)可用于哺乳动物细胞的克隆质粒。一般来说，哺乳动物表达质粒不需要复制起点组分，除非这些表达质粒用于高水平DNA复制感受态哺乳动物细胞如COS细胞。
大多数表达质粒是穿梭质粒，即它们能够在至少一类生物体中复制，但是能够转染入另一类生物体表达。例如在大肠杆菌中克隆一种质粒，然后将相同质粒转染入酵母或哺乳动物细胞，尽管它不能够独立于宿主细胞染色体进行复制。
最好是表达和克隆质粒可含有选择基因，也称为选择标记。这种基因编码生长于选择培养基的转化宿主细胞存活或生长所必需的蛋白。未被包含选择基因的质粒转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。通常选择基因编码的蛋白赋予对抗生素和其它毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)的抗性、互补营养缺陷或提供不能从复合培养基获得的重要营养素。
关于适合酵母的选择基因标记，可使用因为标记基因表型表达而有助于转化体选择的任何标记基因。适合酵母的标记例如为赋予对抗生素G418、潮霉素或博莱霉素的抗性的基因，或提供营养缺陷酵母突变体原养的基因如URA3、LEU2、LYS2、TRP1或HIS3基因。
因为可以在大肠杆菌中方便地进行质粒复制，因此最好包括大肠杆菌遗传标记和大肠杆菌复制起点。这些组分可从大肠杆菌质粒pBR322、Bluescript质粒或pUC质粒如pUC18或pUC19获得，它们既包含大肠杆菌复制起点又包含赋予对抗生素如氨苄青霉素抗性的大肠杆菌遗传标记。
适合哺乳动物细胞的选择标记是使得能够鉴定摄入5T4核酸的细胞的选择标记，例如二氢叶酸还原酶(DHFR，氨甲蝶呤抗性)、胸苷激酶或赋予G418或潮霉素抗性的基因。使所述哺乳动物细胞转化体处于选择压力下，只有摄入并表达所述标记的转化体才能够存活。如果是DHFR或谷氨酰胺合酶(GS)标记，选择压力的施加可以是：在所述压力不断递增的条件下培养所述转化体，由此使选择基因和连接的编码5T4的DNA均扩增(在其染色体整合位点)。扩增是在重组细胞染色体中以串联形式重复产生制备生长重要蛋白大量需要的基因和与其紧密连接的可编码需要蛋白的基因的过程。通常由此扩增的DNA用于合成需要量增加的需要蛋白。
表达和克隆质粒通常含有宿主生物体识别并与5T4核酸有效连接的启动子。这种启动子可以是诱导型或组成型。通过限制性酶消化去除来源DNA的启动子，并将分离的启动子序列插入所述质粒，从而可使所述启动子与编码5T4的DNA有效连接。天然5T4启动子序列和许多异源启动子均可用于控制5T4DNA的扩增和/或表达。术语“有效连接”是指其中所述组分的位置关系使得它们能够以其预定方式起作用的连接。与编码序列“有效连接的”控制序列的连接方式使得在适合所述控制序列的条件下表达所述编码序列。
适用于原核宿主的启动子包括例如β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子如tac启动子。已经公开了其核苷酸序列，由此使得熟练技术人员利用接头或连接物能够将其与编码5T4的DNA有效连接以提供任何需要的限制位点。用于细菌系统的启动子一般也包含与编码5T4的DNA有效连接的Shine-Delgarno序列。
优选的表达质粒为包含能够在细菌中起作用的噬菌体(如phagex或T7)启动子的细菌表达质粒。在一个最广泛使用的表达系统中，可通过T7RNA聚合酶从所述质粒转录编码所述融合蛋白的核酸(Studier等，Methods in Enzymol.185；60-89，1990)。在结合使用pET质粒的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌株中，在所述宿主细菌中由λ溶原体DE3产生T7RNA聚合酶，而且其表达处于IPTG诱导型lac UV5启动子控制之下。已经成功应用此系统超量产生许多蛋白。或者可通过感染int-噬菌体如可市售获得的CE6噬菌体(Novagen，Madison，USA)由λ噬菌体导入所述聚合酶基因。其它质粒包括包含λPL启动子的质粒如PLEX(Invitrogen，NL)、包含trc启动子的质粒如pTrcHisXpressTm(Invitrogen)或pTrc99(Pharmacia Biotech，SE)或包含tac启动子的质粒如pKK223-3(Pharmacia Biotech)或PMAL(new England Biolabs.MA，USA)。
此外，按照本发明的5T4基因最好包括分泌序列，以有助于所述多肽从细菌宿主分泌，使其以可溶性天然肽而不是包涵体产生。可从所述细菌周质间隙或者适当的话从培养基回收所述肽。
用于酵母宿主的合适启动序列可以是调节型或组成型的，而且优选由高表达酵母基因、尤其是酿酒酵母基因得到。因此可使用以下启动子：TRP1基因、ADHI或ADHII基因、酸性磷酸酶(PH05)基因的启动子；酵母接合的编码a-或α-因子的信息素基因的启动子或编码糖酵解酶的基因衍生的启动子，例如以下糖酵解酶基因的启动子：烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶或葡萄糖激酶基因、酿酒酵母GAL 4基因、S.pombe nmt 1基因；或TATA结合蛋白(TBP)基因的启动子。此外，可应用杂合启动子，杂合启动子包含一个酵母基因的上游激活序列(UAS)和包含另一个酵母基因的功能TATA盒的下游启动子元件，例如包含酵母PH05基因的UAS和含酵母GAP基因的功能TATA盒的下游启动子元件的杂合启动子(PH05-GAP杂合启动子)。合适的组成型PH05启动子例如为去除上游调节元件(UAS)的缩短的酸性磷酸酶PH05启动子，如起始于核苷酸-173而终止于PH05基因的核苷酸-9的PH05(-173)启动子元件。
质粒在哺乳动物宿主细胞中转录5T4基因可受控于衍生自病毒基因组的启动子、异源哺乳动物启动子(肌动蛋白启动子或非常强的启动子如核糖体蛋白启动子)和与5T4序列天然连接的启动子，只要这类启动子与所述宿主细胞系统匹配，所述病毒例如为多瘤病毒、腺病毒、鸡痘病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒和猿猴病毒40(SV40)。
在所述质粒中插入增强子序列可增强高等真核生物转录编码5T4的DNA。增强子相对独立于取向和位置。已知哺乳动物基因(例如弹性蛋白酶和球蛋白)的许多增强子序列。然而，人们通常愿意使用真核细胞病毒增强子。实例包括复制起点后侧(bp 100-270)的SV40增强子和CMV早期启动子增强子。可于5T4DNA的5’或3’位置将增强子剪切入所述质粒中，但是优选位于所述启动子的5’位置。
编码5T4的真核表达质粒最好包含基因座控制区(LCR)。LCR能够指导整合入宿主细胞染色质的转基因的高水平不依赖于整合位点的表达，在设计用于基因治疗用途质粒或转基因动物时，当需要在所述质粒已经整合入染色体的永久转染真核细胞系环境中表达5T4基因时LCR特别重要。
真核表达质粒也将含有终止转录和稳定mRNA必需的序列。这类序列通常可从真核生物细胞或病毒DNA或cDNA的5’和3’非翻译区获得。这些区包含转录为编码5T4的mRNA的非翻译部分的聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
表达质粒包括任何能够表达与调节序列如启动子区有效连接的5T4核酸的质粒，所述调节序列能够表达这类DNA。因此，表达质粒是指当导入合适宿主细胞时表达所述克隆DNA的重组DNA或RNA构建物，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其它质粒。合适的表达载体是本领域一般技术人员周知的，包括可在真核和/或原核细胞中复制的质粒和保持游离的质粒或整合入宿主细胞基因组的质粒。例如编码5T4的DNA可插入适合在哺乳动物细胞中表达cDNA的质粒中，例如CMV增强子基质粒如pEVRF(Matthias等，(1989)NAR 17，6418)。
实施本发明特别有用的是在哺乳动物细胞中提供瞬时表达编码5T4的DNA的表达质粒。瞬时表达通常涉及应用能够在宿主细胞中有效复制的表达质粒，使得所述宿主细胞累积许多拷贝的表达质粒，再合成高水平的5T4。对于本发明的目的，瞬时表达系统可用于例如鉴定5T4突变体，以鉴定潜在的磷酸化位点或特征鉴定所述蛋白的功能域。
构建按照本发明的质粒使用常规连接技术。使分离的质粒或DNA片段切割、加尾，并再以产生需要质粒的需要方式连接。需要的话，以已知方式进行分析以证实所构建质粒中的准确序列。构建表达质粒、体外制备转录物、DNA导入宿主细胞和进行分析以评价5T4的表达和功能的合适方法是本领域技术人员已知的。例如利用基于本文提供的序列的合适标记探针直接通过常规DNA印迹分析、定量转录的mRNA的RNA印迹分析、点印迹(DNA或RNA分析)或原位杂交可测定样品中的基因存在、扩增和/或表达。如果需要的话，本领域技术人员可容易地设计如何改良这些方法。
5T4抗原、片段和变异体
本文所指的5T4抗原包括保留至少一个常见5T4抗原决定族的5T4肽和5T4其它片段。
“常见抗原决定族”意味着所述衍生物具有至少一个5T4抗原功能。抗原功能包括具有一个能够与针对天然5T4多肽或变性5T4多肽或其片段产生的抗体交叉反应的表位或抗原位点，或能够结合HLA分子并诱导5T4特异性免疫应答的能力。因此，本发明提供的5T4包括可变剪切初级转录物产生的mRNA编码的剪切变异体、氨基酸变异体、糖基化变异体和保持5T4生理和/或物理特性的其它共价5T4衍生物。典型衍生物包括其中通过取代、化学方法、酶方法或利用非天然氨基酸的一个部分的其它合适方法共价修饰本发明蛋白的分子。这样的一个部分可以是一个可检测的部分，例如酶或放射性同位素。此外，包括见于特定物种、优选哺乳动物的天然5T4变异体。通过相同基因家族的有关基因、特定基因的等位基因变异体可编码这种变异体，或这种变异体为5T4基因的可变剪切变异体。
保持常见抗原决定族的衍生物可以是5T4片段。5T4片段包括其各个结构域以及衍生自所述结构域的较小的多肽。衍生自按照本发明的5T4的小多肽最好定义一个单一的5T4特征表位。在理论上片段几乎可以是任何大小，前提是它们保持一个5T4特征。片段最好是5-400个氨基酸长度。认为较长的片段是截短的全长5T4，而且一般包括在术语“5T4”定义内。片段最好是约5-25个氨基酸长度的较小的肽。优选约9个氨基酸长度的肽。
5T4衍生物还包括其可含有氨基酸缺失、添加或取代的突变体，前提条件是保有至少一个5T4特征性特性。因此，可进行基本上不改变5T4性质的保守氨基酸取代，同样可从5’或3’末端截短5T4。此外可对本发明包括的5T4片段进行缺失和取代。使编码5T4的DNA进行体外诱变，导致例如添加、交换和/或缺失一个或多个氨基酸，从而由编码5T4的DNA制备5T4突变体。例如可通过重组方法制备5T4的取代、缺失或插入变异体，并根据其与天然形式5T4的免疫交叉反应性进行筛选。
此外，利用国立卫生研究院K.Parker设计的程序“肽结合预测”可根据变异体肽的良好HLA结合能力进行筛选(参见Parker，K.C等1994，J.Immunol.152：163)。
5T4的片段、突变体和其它衍生物最好与5T4保持明显同源性。本文使用的“同源性”是指所述两个实体共有本领域技术人员确定它们的来源和功能相似的足够特征。同源性最好用于指序列同一性。所以，5T4衍生物最好与SEQ ID NO：2序列具有明显同一性。
当同源性是指序列同一性时，“显著同源性”意味着根据直接序列排列和对比判断，序列同一性高于40％，优选序列同一性高于45％，最优选序列同一性50％或更高。
此外可用合适的同源性算法、例如用默认参数可确定序列同源性(或同一性)。最好使用参数设定为默认参数的BLAST算法。BLAST算法在http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html网址有详细描述，将其通过引用结合到本文中。检索参数定义如下，而且优选设定为定义的默认参数。
当BLAST评价时，“显著同源性”最好就是匹配EXPECT值至少约7、优选至少约9、最优选10或更高的序列。BLAST检索的EXPECT默认阈值通常为10。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序使用的探试检索算法；这些程序利用在几个方面增强的Karlin和Altschul的统计方法(参见http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html)将显著性赋予其发现。BLAST程序适用于序列相似性检索，例如鉴定查询序列的同系物。此程序一般不用于基序型检索。关于对序列数据库相似性检索的基本问题的讨论，参见Altschul等(1994)Nature Genetics 6：119-129。
在http://www.ncbi.nlm.nih.gov可获得的5个BLAST程序可完成以下工作：
blastp比较氨基酸查询序列与蛋白序列数据库；
blastn比较核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库；
blastx比较核苷酸查询序列(双链)的6框概念的翻译产物与蛋白序列数据库；
tblastn比较蛋白查询序列与全部6读框动态翻译的核苷酸序列数据库(双链)；
tblastx比较核苷酸查询序列的6框翻译与核苷酸序列数据库的6框翻译。
BLAST应用以下检索参数：
HISTOGRAM显示每个检索的记分方框图；默认yes。(参见BLAST手册的参数H)。
DESCRIPTIONS将报告的匹配序列短描述的数目限定为规定的数目；默认限制为100条描述。(参见所述手册的参数V)。此外参阅EXPECT和CUTOFF。
ALIGNMENTS将数据库序列限定为报告高记分区段对(HSP)规定的数目；默认极限为50。如果高于此数目的数据库序列满足报告的统计学显著性阈值(参见以下的EXPECT和CUTOFF)，则只报告最大统计学显著性的匹配。(参见BLAST手册的参数B)。
EXPECT报告与数据库序列匹配的统计学显著性阈值；默认值10，这样按照Karlin和Altschul的随机模型(1990)，预期仅能偶然发现10个匹配物。如果一个匹配的统计学显著性大于EXPECT阈值，则不能报告该匹配。较低的EXPECT阈值更为严格，使得报告匹配的机会更低。分数值是可接受的。(参见BLAST手册的参数E)。
CUTOFF报告高记分区段对的截止记分。根据EXPECT值(见上文)计算默认值。只有当归为数据库序列的区段的统计学显著性至少高达归为记分等于CUTOFF值的单一HSP的统计学显著性时，才能报告数据库序列的HSP。较高的CUTOFF值更为严格，使得报告匹配的机会更小。(参见BLAST手册的参数S)。通常可以用EXPECT更直观地处理显著性阈值。
MATRIX规定BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX的交替记分矩阵。默认矩阵为BLOSUM62(Henikoff & Henikoff，1992)。有效替换选择包括：PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。BLASTN没有可用的替换记分矩阵；在BLASTN查询时指定MATRIX指示会返回出错答复。
STRAND将TBLASTN检索刚好限制于所述数据库的上链或下链；或者将BLATN、BLASTX或TBLASTX检索限制于查询序列的上链或下链的读框。
FIL TER屏蔽按照Wootton & Federhen((1993)Computers andChemistry 17：149-163)的SEG程序确定的组成复杂性低的查询序列区段，或者按照Claverie & States((1993)Computers and Chemistry 17：191-201)的XNU程序确定或者如果为BLASN则按照Tatusov和Lipman的DUST程序(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定的由短周期性内重复序列组成的区段。过滤可从blast输出消除具有统计学意义而没有生物学意义的报告(例如命中常见的酸性氨基酸丰富区、碱性氨基酸丰富区或脯氨酸丰富区)，留下可利用的与数据库序列特异性匹配的查询序列的更有生物学意义的区。
在核苷酸序列中用字母“N”(例如“NNNNNNNNNNNNN”)以及在蛋白序列中用字母“X”(例如“XXXXXXXXX”)代替过滤程序发现的复杂性低的序列。
过滤仅适用于查询序列(或其翻译产物)，不适用于数据库序列。默认过滤对于BLASTN是DUST，其它程序是SEG。
当用于SWISS-PROT中的序列时，用SEQ、XNU或二者未屏蔽任何区段不是异常情况，因此不能预期过滤总能产生作用。此外，在某些情况下，整个序列受到屏蔽，说明对未过滤查询序列报告的任何匹配的统计学显著性值得怀疑。
NCBI-gi使得在输出显示NCBI gi标识符，登录名和/或位置名(locus name)。
最优选用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST提供的简单BLAST检索算法进行序列比较。
另一方面，用在http://biology.ncsa.uiuc.edu/BW30/BW.cgi可获得的算法如FastA可确定序列同源性。人们认为FastA对于排列对比短序列优于BLAST。最好用http://biology.ncsa.uiuc.edu/BW30/BW.cgi的默认参数使用FastA算法。
最好以分离形式提供本发明的蛋白或其衍生物。“分离的”是指已经鉴定所述蛋白或衍生物，而且不含其天然环境的一种或多种组分。分离的5T4包括重组细胞培养物的5T4。存在于表达重组5T4基因的生物体的5T4，无论是否分离的5T4蛋白，均包括在本发明范畴内。
在人类抗肿瘤免疫接种中，优选使用非人类TAA。因此本发明提供犬5T4。最好提供用作人类疫苗组分的犬5T4，以在人类接受者激发针对人5T4的免疫应答。
犬5T4的序列见SEQ ID NO.3。本领域技术人员例如利用衍生自SEQ ID NO.3的核酸探针进行杂交可获得其它犬来源的序列。
因此，例举核酸可表征为编码犬5T4蛋白并与SEQ ID NO.3所示DNA序列或所述DNA序列的选定片段杂交的核苷酸序列。优选在高严格条件下与SEQ ID NO：3序列杂交的编码犬5T4的这类序列。
严格杂交是指多核酸杂交分子是稳定的杂交条件。这类条件对本领域技术人员而言是显而易见的。本领域技术人员已知，杂交分子的解链温度(Tm)反映杂交分子的稳定性，序列同源性每降低1％解链温度就降低约1-1.5℃。一般来说，杂交分子的稳定性是钠离子浓度和温度的函数。通常在高严格条件下进行杂交反应，然后进行不同严格性的洗涤。
本文使用的高严格性是指只允许在65-68℃的1M Na+中形成稳定杂交分子的核酸序列杂交的条件。例如通过在含6×SSC、5×Denhardt、1％SDS(十二烷基硫酸钠)、0.1Na+焦磷酸盐和0.1mg/ml变性鲑精DNA作为非特异性竞争物的水溶液中杂交，可提供高严格条件。杂交后，可以几个步骤进行高严格性洗涤，最后一次洗涤在0.2-0.1×SSC、0.1％SDS中于杂交温度下进行(约30分钟)。
中等严格性是指相当于在上述溶液中但是于约60-62℃杂交的条件。在此情况下，最后一次洗涤在1×SSC、0.1％SDS中于杂交温度下进行。
低严格性是指相当于在上述溶液中于约50-52℃杂交的条件。在此情况下，最后一次洗涤在2×SSC、0.1％SDS中于杂交温度下进行。
当然可以修改并用多种缓冲液例如甲酰胺为基础的缓冲液和温度重复进行这些条件。Denhardt溶液和SSC是本领域技术人员周知的，其它合适杂交缓冲液亦如此(参见例如Sambrook等编辑(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York或Ausubel等编辑(1990)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.)。因为探针的长度和GC含量也具有影响，所以不得不根据经验确定最佳最佳杂交条件。
此外，本发明优选提供能够在严格条件下与SEQ ID NO：3片段杂交的核酸序列。所述片段优选为15-50个碱基长度。优选约25个碱基长度。
根据本文提供的指导，按照本领域周知的方法可获得本发明核酸。例如利用聚合酶链反应(PCR)通过化学合成或筛选由认为具有犬5T4并以可检测水平表达的来源制备的基因组文库或合适cDNA文库，可获得本发明DNA。
合成目的核酸的化学方法是本领域已知的，包括三酯法、亚磷酸酯法、亚磷酰胺法和H-磷酸酯法、PCR和其它自动引物(autoprimer)法以及固相支持物上寡核苷酸合成。如果已知所述核酸的完整核酸序列或可获得与所述编码链互补的核酸序列，可使用这些方法。另一方面，如果已知所述目标氨基酸序列，人们可以利用每个氨基酸残基的已知和优选编码残基推断出可能的核酸序列。
分离编码犬5T4的基因的一个替代方法是按照Sambrook等1989的第14小节所述使用PCR技术。此方法需要使用与犬5T4核酸杂交的寡核苷酸探针。以下描述选择寡核苷酸的策略。
用设计用以鉴定目的基因或其编码的蛋白的探针或分析工具筛选文库。对于cDNA表达文库，合适的工具包括识别而且特异性结合犬5T4的单克隆抗体或多克隆抗体；编码相同物种或不同物种的已知或不确定犬5T4cDNA的约20-80个碱基长度的寡核苷酸；和/或编码相同基因或杂交基因的互补或同源cDNA或其片段。筛选基因组DNA文库的合适探针包括但不限于编码相同或杂交DNA的寡核苷酸、cDNA或其片段；和/或同源基因组DNA或其片段。
用探针即包括衍生自SEQ ID NO：3所示序列的寡核苷酸的本文公开的核酸，在合适杂交条件下筛选合适cDNA或基因组文库，可分离获得编码犬5T4的核酸。合适文库可市售获得或可由例如细胞系、组织样品等制得。
本文使用的探针例如为具有包括10-50、优选15-30而最优选至少约20连续碱基的核苷酸序列的单链DNA或RNA，所述连续碱基与SEQ ID NO：3所示相同数目或更多数目的连续碱基相同(或是其互补物)。选择作探针的核酸序列应该具有足够长度和足够明确，这样使假阳性结果降低到最少。所述核苷酸序列通常基于犬5T4的保守或高度同源的核苷酸序列或区。用作探针的核酸可在一个或多个位置是简并性的。当从物种的优选密码子使用未知的物种筛选文库时，使用简并寡核苷酸可能特别重要。
由其构建探针的优选区包括5’和/或3’编码序列、预期编码配体结合位点的序列等。例如本文公开的全长cDNA克隆或其片段可用作探针。最好用合适的标记方法标记本发明的核酸探针，以便杂交后随时进行检测。例如，一种合适的标记方法是放射性标记。标记DNA片段的优选方法为利用随机引发反应中的DNA聚合酶的Klenow片段掺入α32P dATP，这是本领域周知的。通常用γ32P-标记的ATP和多核苷酸激酶对寡核苷酸进行末端标记。然而，其它方法(例如非放射性方法)也可用于标记所述片段或寡核苷酸，包括例如酶标记、利用合适荧光团的荧光标记和生物素酰化。
例如用基本上包含所述完整犬5T4编码序列或基于一部分所述DNA的合适寡核苷酸筛选所述文库后，通过检测杂交信号鉴定阳性克隆；以限制性酶作图和/或DNA序列分析表征所鉴定的克隆，然后例如与本文给出序列比较进行检测，以确定它们是否包含编码完整犬5T4的DNA(即它们包括翻译起始密码子和终止密码子)。如果选定的克隆不是完整的，它们可用于再筛选相同文库或不同文库以获得重叠克隆。如果所述文库是基因组文库，则所述重叠克隆可包括外显子和内含子。如果所述文库是cDNA文库，则所述重叠克隆将包括一个可读框。在这两种情况下，通过与所述DNA和本文提供的推定氨基酸序列进行比较，可鉴定完整克隆。
设想通过核苷酸取代、核苷酸缺失、核苷酸插入或核苷酸段的倒位以及它们的组合能够容易地修饰本发明核酸。这类突变体可用于例如产生具有与天然存在的犬5T4序列不同的氨基酸序列的犬5T4突变体。诱变可以是预期的(定点诱变)或随机的。非沉默突变的突变不能将序列置于读框外而且优选不产生能够杂交产生mRNA二级结构如环或发夹的互补区。
上述考虑也适用于分离替代的鼠类(SEQ.ID.NO.2)或人(SEQ.ID.NO.1)5T4抗原。
编码5T4的载体的给予
按照本发明的药用组合物是包括所述编码5T4抗原的载体作为活性成分的物质组合物。设想包括按照本发明的所述活性成分的药用组合物的活性成分当以根据特定病例确定的剂量给予时，例如在治疗和/或预防肿瘤或其它与细胞增殖有关的疾病、感染和炎症性病症中具有优良的治疗和/或预防活性。可调整剂量方案以获得最佳治疗反应。例如可每日给予几个分剂量或根据治疗情况的紧迫性可按比例降低所述剂量。
所述活性化合物可以常规方式给予，例如口服、静脉内(当为水溶性的情况下)、肌内、皮下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(例如用缓释分子)。根据给药途径，可能需要用保护所述成分免于酶、酸和可能使所述成分失活的其它天然条件的物质对所述活性成分进行包衣。
为了通过非胃肠外给药给予所述活性化合物，将用防止其失活的物质进行包衣，或利用防止其失活的物质给予所述活性化合物。例如可用辅助剂给予所述活性化合物，或与酶抑制剂共同给予，或以脂质体给予所述活性化合物。在其最广义上应用辅助剂，包括任何免疫刺激化合物如干扰素。本文设计的辅助剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂如聚氧化乙烯油醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰腺胰蛋白酶。
脂质体包括水-包-油-包-水CGF乳剂以及常规脂质体。
所述活性化合物也可以胃肠外或腹膜内给予。还可用甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油制备分散剂。在常规贮藏和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适合注射用的药物形式包括无菌水溶液(当为水溶性时)或分散剂和用于临时配制的无菌注射溶液或分散剂的无菌粉。在所有情况下，所述药物形式必须是无菌的而且流体程度必须易于注射。在生产和贮藏条件下必须是稳定的，而且必须对微生物污染如细菌和真菌是防腐的。所述载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物以及植物油。例如应用包衣如卵磷脂、在分散剂时通过保持需要的颗粒粒度以及通过使用表面活性剂可保持合适流动性。
可应用各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thirmerosal)等可防止微生物的作用。在多数情况下，最好包含等渗剂，例如糖或氯化钠。在所述组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶可延长注射组合物的吸收。
无菌注射溶液的制备为：在含有各种其它以上列举的成分(根据需要)的合适溶剂中加入需要的量的所述活性化合物，然后过滤除菌。一般来说分散剂的制备是：将所述无菌活性成分加入无菌溶媒中，所述溶媒含有基本分散介质和所需要的以上列举的其它成分。如果为用于制备无菌注射溶液的无菌粉时，优选的制备方法为真空干燥和冻干技术，此技术可获得其上述无菌过滤溶液的所述活性成分和任何其它需要成分的粉末。
当如上所述适当保护所述活性化合物时，例如可用惰性稀释剂或可食可同化载体口服给予，或者可将其包封在硬明胶胶囊或软明胶胶囊内，或者可将其压成片，或者可将其直接加入膳食食品中。对于治疗性口服给药，所述活性成分可与赋形剂混合，并以可摄食片剂、口颊片、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式使用。在这类治疗性应用的组合物中的活性化合物量使得可获得适当的剂量。
所述片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可以含有以下成分：黏合剂如西黄蓍胶、金合欢胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；以及可加入甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精或调味剂如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当所述剂型为胶囊剂时，除了上述类型物质，它还可含有液体载体。
各种其它物质可以为包衣或改善所述剂型的物理形式。例如可用虫胶、糖或二者对片剂、丸剂或胶囊剂进行包衣。糖浆剂或酏剂可含有所述活性成分、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、颜料和调味剂如樱桃或橙调味剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何物质应该为药物纯而且在所述使用量基本上无毒。此外，所述活性化合物可加入缓释制剂和配方中。
本文使用的“药学上可接受的载体和/或稀释剂”包括任何溶剂和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。使用适用于药物活性物质的这类介质和物质是本领域周知的。除非任何常规介质或物质与所述活性成分不匹配，否则设计其在所述治疗性组合物中的使用。其它活性成分也可加入所述组合物中。
特别优选配制易于给药和剂量均一的单位剂型的胃肠外组合物。本文使用的单位剂型是指适用作待治疗的哺乳动物受治疗者的单位剂量的物理性独立单位；每个单位含有经计算可与需要的药用载体一起产生需要治疗效应的预定量的活性物质。本发明新型单位剂型的规格表示为而且直接取决于(a)所述活性物质的独特特征和需要达到的具体治疗效应，以及(b)调剂技术固有的限制，例如用于治疗活的受治疗者疾病的活性物质的固有限制，所述受治疗者其疾病状态使机体健康受损。
对于适合有效的给药，将有效量的主要活性成分与合适的药学上可接受的载体调剂成单位剂型。如果组合物含有其它活性成分，则参考所述成分的常规剂量和给药方式确定其剂量。
利用常规的效力测试试验决定按照本发明的5T4表达载体的给药方案。然而特别优选包括连续的激发和加强步骤的方案。人们观测到，这类方案可成功地较好消除免疫耐受并诱导CTL应答。在一个优选实施方案中，应用非病毒载体如编码5T4的质粒进行激发步骤，同时应用编码5T4的病毒载体如痘病毒载体进行加强免疫(参见Schneider等，1998 Nat Med 4：397-402)。
给予5T4抗原的方法
一般来说，可用以上概述的关于给予5T4编码核酸的方法给予作为常规疫苗制剂的5T4抗原，用以治疗和/或预防肿瘤。
通常可制备5T4抗原的疫苗。本领域技术人员已知包含5T4活性成分的疫苗的制备。这类疫苗一般为可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备注射前可用液体配制为溶液或悬浮液的固体形式。也可以制备乳化剂，或将所述蛋白包胶囊于脂质体中。通常将所述活性免疫原成分与药学上可接受的而且与所述活性成分匹配的赋形剂混合。合适的赋形剂例如为水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合物。
此外，如果需要的话，所述疫苗可包含微量增强所述疫苗作用的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或佐剂。可能有效的佐剂实例包括但不限于氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-nor-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和RIBI，RIBI含有用2％角鲨烯/吐温80乳液从细菌提取的3个组分(即单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPC+TDM+CWS))。
佐剂和其它物质的其它实例包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、硫酸铍、二氧化硅、高岭土、碳、油包水乳液、水包油乳液、胞壁酰二肽、细菌内毒素、脂质X、小棒杆菌(Corynebacterium parvum)(Propionobacterium acnes)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、多核糖核苷酸、海藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、皂甙、脂质体、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物或其它合成佐剂。这类佐剂可从各种来源市售获得，例如Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)或弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)。
通常使用的佐剂例如有Amphigen(水包油)、Alhydrogel(氢氧化铝)或Amphigen和Alhydrogel的混合物。只有氢氧化铝批准用于人类。
免疫原和佐剂的比例范围可以变化很大，前提是两者的含量均为有效量。例如氢氧化铝的含量可以为所述疫苗混合物(Al2O3为主)的0.5％左右。通常配制疫苗的免疫原终浓度为0.2-200μg/ml、优选5-50μg/ml、最优选15μg/ml。
配制后，将疫苗装入无菌容器，然后密封容器，保藏于低温，例如4℃，或者可以将其冻干。冻干使得可以稳定形式长期保藏。
通常通过胃肠外例如注射(例如皮下或肌内注射)给予疫苗。适合其它给予模式的其它制剂包括栓剂以及某些情况下的口服制剂。对于栓剂，传统的黏合剂和载体包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；用所述活性成分含量为0.5％-10％、优选1％-2％的混合物可制成这样的栓剂。口服制剂包含常规使用的赋形剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物的形式可以为溶液剂、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂，而且活性成分的含量为10％-95％、优选25％-70％。当冻干所述疫苗组合物时，给予前可以复制所冻干的物质，例如复制为悬浮液。复制优选用缓冲液进行。
利用肠溶包衣可制备口服给予患者的胶囊剂、片剂和丸剂，所述肠溶包衣包括例如Eudragit“S”、Eudragit“L”、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素或羟丙基甲基纤维素。
可将5T4配制为中性或盐形式的疫苗。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与所述肽的游离氨基形成)，与无机酸(如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸和马来酸)形成酸加成盐。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁以及诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸和普鲁卡因的无机碱。
对给予5T4的效力的测量
可按照本领域已知的任何技术评价5T4作为免疫治疗性分子的活性，包括对抗体产生、诱导CTL应答和肿瘤抑制模式的测定。在以下实施例中描述典型的技术。
进一步用以下实施例描述本发明，其目的仅仅是为了说明本发明，其中参考以下附图。
图1a图示一个基因构建物；
图1b图示一个基因构建物；
图2a为一个照片图；
图2b为一个照片图；
图3a为一个坐标图；
图3b为一个坐标图；
图4a为一个坐标图；
图4b为一个坐标图；
图4c为一个坐标图；
图5为一个坐标图；
图6为一个坐标图；
图7为一个坐标图；
图8为一个坐标图；和
图9为一个坐标图。
以下略为详细地描述上述图：
图1a为重组痘苗病毒MVA的图谱。转基因处于合成的痘苗病毒早期/晚期启动子控制之下。Lac Z基因处于痘苗病毒7.5k早期/晚期启动子控制之下。这些基因侧翼的DNA区衍生自MVA的缺失区2，因此使得同源重组到此位点。
图1b为重组痘苗病毒WR的图谱。转基因处于合成的痘苗病毒早期/晚期启动子控制之下。Lac Z基因处于痘苗病毒7.5k早期/晚期启动子控制之下。所述基因侧翼的DNA区衍生自Wyeth病毒株VV的胸苷激酶(tk)基因，因此使得同源重组到此位点。
图2图示表达人5T4的重组痘苗病毒的蛋白质印迹分析。使样品在12％SDS PAGE上走电泳，并将其转运到硝酸纤维素膜上。
图2a：用1∶500稀释度的MAb 5T4(抗人5T4)探测印迹。用抗小鼠HRP缀合抗体和ECL显示结合抗体。泳道1：表达人5T4的重组WR克隆1；泳道2：表达人5T4的重组WR克隆2；泳道3：用WR感染的BS-C-1细胞；泳道4：未感染的BS-C-1细胞；泳道5：B16黑素瘤细胞；泳道6：表达人5T4的B16细胞系。
图2b：用1∶500稀释度的兔抗小鼠5T4探测印迹。泳道1：表达LacZ的重组WR；泳道2：表达小鼠5T4的重组WR；泳道3：表达人5T4的重组WR；泳道4：表达小鼠5T4的重组MVA。
图3a和3b为显示用MVA-h5T4接种小鼠对用表达h5T4的CT26攻击的保护作用的两幅图。
图4a为显示用MVA-h5T4接种诱导的对表达h5T4的B16肿瘤的抗肿瘤活性的图。
图4b和4c为显示用MVA-m5T4接种诱导的对表达m5T4的B16肿瘤的抗肿瘤活性的两幅图。
图5为显示MVA-h5T4在预先建立了肺肿瘤的小鼠中诱导的肿瘤治疗作用的图。
图6为显示用MVA-m5T4接种免疫小鼠的肿瘤发育速率低于接受对照疫苗的小鼠的图。
图7为显示用MVA-m5T4免疫接种小鼠的肿瘤负荷低于接受MVA-LacZ处理的小鼠的图。
实施例
实施例1
重组痘苗病毒载体的构建
痘苗病毒的繁殖
高度减毒的病毒株MVA衍生自复制型病毒株Ankara，而且已经在原代鸡胚成纤维细胞中传代了570代以上。起初人们认为MVA复制仅限于CEF细胞，因为据报道在哺乳动物细胞中的复制能力最小。然而，进一步分析证明，幼仓鼠肾细胞(BHK-21)能够支持产生高滴度的MVA。因此也可在BHK-21或原代CEF细胞上培养MVA(Carroll &Moss(1997)Virology 238：198-211)。
为了制备CEF细胞，将10天龄鸡胚去内脏，并去除肢体和头，然后剪碎，在0.25％胰蛋白酶溶液中进行胰酶消化并于37℃温育。使细胞悬浮液通过过滤器孔，洗涤细胞，用Sorvall RC-3B以2000rpm离心浓缩5分钟(concentrated by centrifugation at 2000 rpm in a SorvallRC-3B at 1500 rpm for 5 mins)。将细胞悬浮在含10％FCS的MEM中，将其等份在175cm培养瓶并于37℃的二氧化碳培养箱培养。当单层细胞融合95％时，用胰蛋白酶消化，将其接种到另外的培养瓶或6孔培养板。或者就原代培养物转移到31℃培养箱备用(Sutter和Moss(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：10847-10851)。
制备粗制、半纯化和纯化病毒母液
制备病毒母液用于初步的重组病毒分析或用作随后的高滴度病毒制剂的病毒母液。离心去除细胞膜和细胞核或者或者通过包括蔗糖离心的其它步骤以防止预表达重组蛋白产物和细胞器污染，从而可半纯化痘苗病毒制剂。所用的方法为以下文献方法的改良方法：Earl等，载于：Ausubel等(编辑)，(1991)Current Protocols in MolecularBiology，第16.16.1-16.16.17页，纽约：Greene Publishing Associates andWiley Interscience；Earl和Moss，同上，第16.17.1-16.17.16页；Earl和Moss，同上，第16.18.1-16.18.10页；Bronte等，(1997)Proc Natl AcadSci USA 94(7)：3183-3188。
粗制病毒
在175平方厘米组织培养瓶中，以CEF或BHK-21(得自ATCC)培养MVA，以HeLa或BS-C-1(ATCC)培养WR。简单地说，用MVA或WR以感染复数(moi)约1pfu感染融合单层细胞。用含2％FCS的10ml MEM悬浮病毒，并加入包含融合单层细胞的175平方厘米培养瓶中。于37℃温育1小时后，再加入20ml含2％FCS的MEM。48-72小时后，将感染细胞刮入培养基中，以1500g离心沉淀5分钟。对于粗制病毒制剂，每个175平方厘米培养瓶用2ml MEM(2％)悬浮细胞。冻融细胞3次，超声处理并等份装入1ml冻藏管中。冻融一个代表等份，并滴定确定病毒浓度。病毒母液保藏于-20℃以下。
半纯化制剂
按以前所述(Earl等；Earl和Moss；1991)收获感染细胞。离心后，用PBS(2ml/175cm2培养瓶)重悬浮细胞，在冰上，用紧密玻璃塞匀浆器(tight fitting glass dounce homogeniser)来回匀浆30-40次。显微镜下检查细胞破碎情况。以300g离心5分钟(4℃)，以去除细胞核、细胞器和细胞膜，保留上清液。以1ml/175cm2培养瓶重悬浮细胞沉淀物，并重复离心。合并上清液，分为等份并保藏。
纯化制剂
按以前所述(Earl等；Earl和Moss；1991)收获感染细胞，并用10mM Tris.CI，pH 9.0(2ml/培养瓶)重悬浮细胞，该程序此后将样品保持在冰上。用10mM Tris如上所述匀浆。用XL 2016超声杯(Misonics，USA)以最大输出功率(500W)超声处理细胞裂解液1分钟。将样品置于冰上1分钟，重复超声多达3次。一次超声最多5ml，而且在超声过程中不断补充冰。将细胞裂解液轻轻地加到SW-27离心管中的17ml36％蔗糖(10mM Tris.Cl，pH 9.0)的层上形成分层。用SW-27转子在4℃下以13500rpm(32,900xg)离心细胞裂解液80分钟。弃上清液，病毒沉淀物重悬浮在无菌PBS中，并用杯式超声仪超声处理1分钟(在冰上)。等份浓缩病毒，保藏于-20℃以下。
实施例2
构建和特征鉴定表达5T4的重组病毒载体
将鼠5T4基因和人5T4基因克隆入WR(pSC65)(Chakrabarti等，(1997)Biotechniques 23：1094-7)和MVA(pLW22)转移质粒中，以允许同源重组入相应病毒基因组的靶区。
表达人5T4和鼠5T4的重组MVA和WR
通过Eco RI和Bam HI限制性消化分别从pBSII-m5T4(含5T4cDNA的pBluescript(Stratagene))和pB SII-h5T4(Myers等，(1994)JBC269：9319-9324)切除1.4kb鼠5T4和1.4kb人5T4(P.Stern PatersonInstitute Manchester提供)基因。用dNTP和DNA聚合酶“补平”使片段的末端平端化。使平端末端片段克隆入pLW22(MVA转移质粒，由MCS上游的早晚期启动子(Chakrabarti等，1997)组成，邻近为用于检测重组病毒的VV 7.5Kb LacZ盒；参见图1a)的PmeI位点和pSC65的Sma I位点(b)(Chakrabarti等，1997)中。pLW22和pSC65分别控制同源重组进入缺失区II和tk基因。
在预定用于免疫接种人类接受者的构建物时，去除处于7.5k启动子控制下的LacZ基因。如以前的文献所述(Wyatt等，(1996)Vaccine14：1451-1458)，利用抗5T4单克隆抗体经活体免疫染色鉴定重组噬菌斑。
用噬菌斑纯化克隆的CEF细胞培养B.Moss(NIH，Bethesda，USA)提供的野生型MVA，而且它是用于制备以前描述的重组病毒的相同分离株(Sutter和Moss(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：10847-10851，Sutter等(1994)Vaccine 12：1032-1040，Hirsch等(1996)J Virol 70：3741-3752，Carroll和Moss(1995)Biotechniques 19：352-355，Wyatt等(1995)Virology 210：202-205，Sutter等，(1995)FEBS Lett.371：9-12，Wyatt等(1996)Vaccine 14，1451-1458，Carroll等(1997)Vaccine，15：387-394，Carroll和Moss(1997)Virology 238：198-211)。B.Moss(NIH)提供WR母液，得自ATCC分离株(参见例如Earl和Moss，1991)。以HeLa S3细胞(ATCC)制备WR母液。
用于制备重组MVA病毒的方法类似于以前所述的方法(Carroll &Moss(1997)Virology 238：198-211)。简单地说：用MVA母液以0.1感染复数感染BHK-21或CEF细胞。用100μl d.H2O将质粒DNA稀释为2μg，将其与用无菌d.H2O稀释为100μl的30μg脂质转染试剂(BRL)混合。在室温下温育10分钟后，在覆盖于Opti MEM上的感染细胞上加入脂质转染试剂/DNA溶液。于37℃温育后5小时，吸出细胞培养基，重新加入含2％FCS的MEM。温育36小时后收获细胞，在5-溴-3-吲哚基-D-半乳糖苷酶的存在下测定CEF或BH k-21细胞上β-gal的表达。分离的噬菌斑为至少另外纯化3次的噬菌斑。噬菌斑纯化后用CEF或BHK-21细胞制备少量病毒母液。
构建重组WR的方案类似于以前文献描述的方案(Carroll和Moss(1995)Biotechniques 19：352-355；Earl和Moss，1991)。简单地说：与MVA一样进行重组。但是使用BS-C-1细胞，而且使用含有LacZ基因5-溴-3-吲哚基-D-半乳糖苷酶的底物的上层琼脂，在存在BrdU下，以143B tk-细胞分析重组噬菌斑。使用中性红检测LAC Z阴性自发tk-病毒以评价病毒均一性。
使用类似于以前文献描述的方法(Carroll & Moss(1997)Virology238：198-211)，采用h5T4和m5T4特异性抗体通过直接噬菌斑免疫染色初步分析重组蛋白的表达。简单地说：重组病毒在单层BS-C-1细胞上形成噬菌斑，用丙酮/甲醇固定，用MAb 5T4处理(Hole N和Stern PL，(1990)Int J Cancer 45(1)：179-184)。用抗小鼠HRP缀合抗体和邻联茴香胺底物显示重组5T4蛋白表达。因为MAb识别构象表位，所以在非还原条件下通过蛋白质印迹分析进一步特征鉴定5T4表达蛋白。由图2可见，重组病毒高水平表达合适大小的72kDa蛋白。按Carroll &Moss(1997)Virology 238：198-211所述用双重免疫染色检测母液的均一性。
实施例3
阐明人5T4与小鼠5T4的免疫交叉保护的动物模型
为了确定一种物种的5T4基因产物是否能够在另一物种体内诱导对5T4的免疫，以鼠肿瘤模型测试重组痘病毒。小鼠模型基于BALB/c来源的化学诱导腺癌CT26(Brittain等，(1980)Cancer Res.40：179-184)和衍生自C57B6小鼠的黑素瘤系B16。CT26系和B16均稳定转化表达人5T4和鼠5T4。小鼠静脉注射(产生肺结节，CT26)或皮下注射(CT26和B16)以产生皮下单一肿瘤块。
在第0、21和42天，对各组(每组7只)BALB/c小鼠以1×107pfuIV或IM接种MVA-h5T4(在此5T4抗原称为OBAl)构建物。然后用5×105人5T4稳定转染的肿瘤细胞静脉内攻击小鼠。攻击后14天，取出小鼠肺脏，并计数肺结节。
结果3
图3a和3b所示结果证实，用MVA-h5T4免疫的小鼠当用表达h5T4蛋白的同基因肿瘤系CT26攻击时呈现抗肿瘤活性。Mann-Whitney统计分析显示，与接种MVA-LacZ或PBS的小鼠相比，接种MVA-h5T4后的保护是显著的(p＜0.05)。
实施例4
用107pfu MVA-h5T4(IV或IM)或MVA-Lac Z(IV)接种各组C57BL 6小鼠，每组5只小鼠，间隔3周，接种2次。用5×105B16-h5T4细胞攻击小鼠。肿瘤攻击后每间隔2天记录肿瘤大小。计算各个肿瘤面积。
用107pfu MVA-m5T4(IV或IM)或MVA-Lac Z(IV)接种各组C57BL 6小鼠，每组5只和7只小鼠，间隔3周，接种2次。用5×105B16-m5T4细胞攻击小鼠。肿瘤攻击后每间隔2天记录肿瘤大小。计算各个肿瘤面积。
结果4
图4a显示，当B16-h5T4攻击小鼠时接种MVA-h5T4的小鼠具有明显的抗肿瘤效应。图4a数据的Mann-Whitney统计分析证实，与接种MVA-LacZ相比，接种MVA-h5T4后的肿瘤抑制是明显的(p＜0.05)。
图4b和4c显示，当用B16-m5T4攻击小鼠时，接种MVA-m5T4具有明显的抗肿瘤效应。图4c数据的Mann-Whitney统计分析证实，与接种MVA-LacZ相比，接种MVA-m5T4后的肿瘤阻滞是显著的(p＜0.05)。
实施例5
用5×105CT26-h5T4细胞IV注射雌性BALB/c小鼠。3天后建立巨型肺肿瘤。在接种肿瘤后第3和10天以107pfu MVA-Lac Z、MVA-h5T4(每组10只小鼠)或PBS(一组5只小鼠)处理小鼠。在接种肿瘤后14天将肺脏染色并计数肿瘤。
结果5
由图5可知，MVA-h5T4处理对建立的表达h5T4的CT26肺结节具有显著治疗作用。统计学分析(Mann-Whitney)表明，与MVZ-Lac Z或PBS相比，MVA-h5T4治疗具有显著性(p＜0.05)。
实施例6
CT26-m5T4和B16-m5T4自身抗原模型
用1×107pfu MVA-LacZ(n＝3)或MVA-m5T4(n＝6)IV接种C57BL6小鼠，间隔3周接种2次。最后一次免疫后3周，用5×105表达m5T4的B16皮下攻击小鼠。监测皮下(S.C.)肿瘤的发生情况。
图6表明接种MVA-m5T4小鼠的肿瘤发展速率低于接受对照疫苗的小鼠。另外，与接受MVA-LacZ处理的小鼠相比，m5T4免疫小鼠的肿瘤体积平均小5倍(第13天时小10倍)。这种保护特性与这些小鼠产生的m5T4抗体应答平行。
实施例7
用1×107pfu MVA-LacZ(n＝5)或MVA-m5T4(n＝6)IV接种BALB/c小鼠，间隔3周接种2次。最后一次免疫后3周，用5×105表达m5T4的CT26攻击小鼠。攻击小鼠后12天取出小鼠肺脏，以盲法方式计数肿瘤结节。
结果7
图7表明MVA-m5T4免疫小鼠的肿瘤负荷比接受MVA-LacZ处理的小鼠低。这种保护特性与这些小鼠产生的m5T4抗体应答平行。
实施例8
在C57和BALB/c小鼠诱导的5T4抗体应答
如上所述，用MVA-m5T4和MVA-h5T4免疫小鼠，每次免疫接种后10天取血检测。
结果8
两次接种后，MVA-m5T4能够在BALB/c和C57B16小鼠均克服免疫耐受。此外，用DNA、接着用MVA激发小鼠没有针对m5T4的抗体应答的表现。
因此，在两种鼠的肿瘤模型证实，免疫接种表达鼠5T4的MVA对表达m5T4的同基因肿瘤细胞具有保护特性。这些抗肿瘤特性与抗m5T4免疫应答(用ELISA测定)平行。此外，证实这种免疫应答的产生不会在这些动物引起自身免疫性毒性。
实施例9
利用激活物(primer)增强免疫得到的针对5T4的免疫应答
为了评价MVA和裸DNA载体在BALB/c和C57BL6小鼠诱导对5T4的免疫的效力，既用编码小鼠5T4和人5T4的裸DNA又用MVA载体连续激发和加强接种小鼠。更具体地说，在第0天将1×107pfuMVA-5T4静脉内、50g pCl-h5T4(25g/后肢)或25g pCl-m5T4(12.5g/后肢)i接种小鼠，在第21天第二次(加强)接种MVA-5T4。在第29天从小鼠取血，以ELISA测定抗体滴度。
结果9
观测到的滴度(定义为OD高于MVA-LacZ背景OD 2倍的稀释度)
见下表2和3。
表2：接种表达人5T4和鼠5T4的MVA和DNA载体的小鼠的鼠5T4抗体滴度
  小鼠品系抗体滴度   MVA-m5T4MVA-m5T4   pCI-m5T4MVA-m5T4   MVA-h5T4MVA-h5T4   pCI-h5T4MVA-h5T4
  BALB/c   1∶10 000   ＜1∶1 000   ＜1∶1 000   ＜1∶1 000
  C57BL6   1∶16 000   ＜1∶1 000   ＜1∶1 000   ＜1∶1 000
表3：接种表达人5T4和鼠5T4的MVA和DNA载体的小鼠的人5T4抗体滴度
  小鼠品系抗体滴度   MVA-m5T4MVA-m5T4   pCI-m5T4MVA-m5T4   MVA-h5T4MVA-h5T4   pCI-h5T4MVA-h5T4
  BALB/c   1∶5 000   ＜1∶1 000   ＞1∶32 000   1∶32 000
  C57BL6   1∶4 000   ＜1∶1 000   ＞1∶32 000   ＞1∶32 000
结果表明应用DNA：MVA激发：异源5T4抗原(h5T4)加强或MVA：MVA激发：异源或同源5T4(H5T4或m5T4)加强有效产生高滴度抗体。
实施例10
用于癌症免疫治疗的修饰型5T4
可以修饰人5T4以增强其免疫原性，因而可诱导更有效的免疫治疗反应。为此，应用国立卫生研究院的K.Parker设计的程序“肽结合预测”(http://www-bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parder_comboform)(参见Parker，K.C.等1994 J.Immunol.152：163)鉴定HLA CTL表位并修饰这类表位，以增强与HLA分子的结合，因而产生更有效的CTL诱导。以下结果得自人5T4 9mer(表4)和鼠(表5)5T4 9mer：
  表4：结合HLA A 0201的人5T4 9mer
  序号   起始   序列   解离半衰期
  1   97   FLTGNQLAV   319.939
  2   364   ALIGAIFLL   284.974
  3   351   SLQTSYVFL   176.240
  4   368   AIFLLVLYL   137.482
  5   283   GLPHIRVFL   117.493
  6   358   FLGIVLALI   110.379
  7   81   NLTEVPTDL   87.586
  8   95   NLFLTGNQL   79.041
  9   222   FLYLPRDVL   63.174
  10   373   VLYLNRKGI   56.754
  11   365   LIGAIFLLV   30.890
  12   290   FLDNNPWVC   28.109
  13   301   HMADMVTWL   27.207
        表5：结合人HLA A 0201的鼠5T4
  序号   起始   序列   解离
  1   307   YMADMVAWL   3680.892
  2   81   NLLEVPADL   324.068
  3   97   FLTGNQMTV   319.939
  4   370   ALIGAIFLL   284.974
  5   228   FLFLPRDLL   178.158
  6   357   SLQTSYVFL   176.240
  7   374   AIFLLVLYL   137.482
  8   289   GLAHVKVFL   117.493
  9   364   FLGIVLALI   110.379
  10   379   VLYLNRKG   56.754
实施例11
诱变H5T4以增强结合HLA A0201
得自Parker的肽结合预测程序的上述数据表明，当人AA序列从位置301开始由YMADMVAWL突变为HMADMVTWL时，产生与HLA A0201解离的半衰期增加10倍的9mer。这种结合亲和力增加明显增强5T4多肽的CTL诱导特性(此外参阅Overwijk等，1998 J ExpMed 188：277-86)。
结果11
此外，h5T49mer从81开始由NLTEVPTDL突变为NLLEVPADL导致h5T4 9mer与HLA A 0201的解离半衰期升高4倍。
实施例12
毒性研究
没有自身免疫毒性
本研究的目的是研究在鼠类模型诱导针对5T4的自身免疫毒性的可能效应。
实验设计
用107pfu表达人5T4(MVA-h5T4)和鼠5T4(MVA-m5T4)的重组痘苗病毒MVA静脉内接种各组BALB/c和C57BL6小鼠(每组5只小鼠)。作为阴性对照，用表达大肠杆菌LacZ(MVA-LacZ)的MVA或PBS接种小鼠。
在14个月内对雌性BALB/c小鼠接种共计4次。在14个月内对C57BL6小鼠接种3次。接种后取血样品，以ELISA评价5T4特异性抗体。
结果12a
抗体应答：接种2次后，接种MVA-m5T4和MVA-h5T4小鼠血清分别含有高水平的抗m5T4和抗h5T4(见表2和表3)。
毒性：每日观测小鼠的疾病健康体征。在过去的14个月的任何时间，接种MVA-m5T4或MVA-h5T4动物的物理外观与接种MVA-Lac Z或PBS的动物的确没有不同。准备了由合格兽医准备的关于动物健康的两个报告，这两个报告均表明全部动物均表现健康。
总结
在14个月内对各组BALB/c和C57 BL6小鼠接种表达m5T4抗原的MVA(MVA-m5T4)或表达h5T4抗原的MVA(MVA-h5T4)高达4次，并检测毒性体征。尽管表明小鼠具有高滴度的抗m5T4的抗体，但是在14个月内没有患病体征。合格的兽医鉴定了这些动物，发现它们没有疾病体征，说明没有自身免疫毒性。
因此，用MVA-h5T4或MVA-m5T4接种BALB/c或C57 BL6小鼠可分别诱导针对h5T4和m5T4的抗体应答。这种应答对小鼠健康没有有害的作用。
实施例12b
5T4自身免疫对生殖能力的影响
在人体和鼠的胎盘发现了5T4。因此，抗小鼠5T4的免疫应答可能妨碍小鼠怀孕或者影响胎儿健康。我们进行了深入的研究以阐明这些问题。本研究的目的是同时在BALB/c和C57 BL6雌性小鼠评价针对m5T4的免疫应答对妊娠的影响。
实验设计
用107pfu MVA-m5T4、MVA-LacZ或PBS对各组雌性BALB/c和C57 BL6小鼠(每组5只)静脉内接种3次。在最后一次接种后的特定时间(第10、30和60天)使小鼠交配，并评价其妊娠以及生产健康幼鼠的能力。
结果12b
(i)C57 BL6小鼠的研究
表6：10天的研究
  MVA-m5T4 X3   MVA-LacZ X3  PBS
  妊娠数   4/5＝80％   4/5＝80％  3/5＝60％
  活产数   24   30  18
  平均胎仔大小   6   7.5  6
表7：30天的研究
  MVA-m5T4 X3
  妊娠数   4/5＝80％
  活产数   22
  平均胎仔大小   5.5
表8：60天的研究
  MVA-m5T4 X3
  妊娠数   5/5＝100％
  活产数   33
  平均胎仔大小   6.6
(ii)BALB/c小鼠的研究
表9：10天的研究
  MVA-m5T4 X3   MVA-LacZ X3   PBS
  妊娠数   5/5＝100％   4/5＝80％   4/5＝80％
  活产数   30   23   22
  平均胎仔大小   6   5.75   5.5
  存活到断奶的数目   24＝80.0％   19＝82.6％   22＝100％
  F∶M比例   13∶11   14∶5   11∶11
  平均体重   10.4g   11.2g   10.1g
表7：45天的研究
 MVA-m5T4 X3
  妊娠数  4/4＝100％
  活产数  24
  平均胎仔大小  6
  存活到断奶的数目  24＝100.0％
  F∶M比  15∶9
  平均体重  11.4g
总结
用表达m5T4的MVA重组病毒注射BALB/c和C57 BL6小鼠，并诱导抗m5T4抗体应答。让这些小鼠交配，证实这些小鼠的妊娠率和产仔率与用对照病毒免疫的小鼠相同(见表6-10)。此外，对断奶前幼鼠的健康没有影响。因此，接种MVA-m5T4并诱导m5T4抗体应答确实不会在以下方面对小鼠产生有害影响：(i)BALB/c和C57 BL6小鼠的生殖能力；(ii)活胎生产数和(iii)断奶前幼鼠的体重和存活率。
实施例12c
5T4在正常人组织中的分布
本研究的目的是对5T4在正常人体组织中的分布进行独立评价。部分过去的研究表明，即使发现小血管相关正常组织中的5T4表达水平低于胎盘有关组织1000倍以上，但是表达5T4的正常组织也可能成为针对此肿瘤抗原诱导的免疫应答的靶。不知道所述染色是特异性的还是反映所述MAb的部分交叉反应性。
实验设计
在GLP条件下由合格病理学者评价来自3个不同供体的32个不同组织类型的组织切片。用3个不同浓度5T4特异性Mab染色每个组织标本的冷冻切片。
结果12c
总结表11的表明，包括脑、CNS、肝脏和肾脏的所有重要器官的组织切片的5T4表达为阴性。在一个或多个供体组织的某些弱染色见于几种非重要组织。值得注意的是，在死于癌症个体的组织中观测到部分阳性染色。
尽管过去采用免疫组化分析的研究表明，在某些非癌器官的“部分小血管”中观测到一定的5T4染色，所述非癌器官“表现为弱染色”而且包括：肾脏(肾小球)、膀胱(上皮)、小肠(绒毛上皮)、子宫(子宫内膜腺体)、子宫颈(子宫颈腺)和皮肤(基底上皮)，本独立研究表明，重要器官细胞上没有5T4表达，而且某些正常组织的表达水平低并且分散，因为在所有3个供体的标本中几乎没有发现5T4表达。因此，该数据表明，与在肿瘤免疫治疗试验中使用的部分其它肿瘤抗原相比，5T4的组织表达更加严格有限。所以，这些发现再次证实了这样的观点：5T4是癌症免疫治疗的良好候选抗原。
                          表11：5T4组织分布的总结
  组织             1供者   染色分布
  1   2   3
  肾上腺膀胱血细胞骨髓乳腺小脑脑皮质结肠内皮输卵管心脏肾脏肝脏子宫颈2子宫内膜肺淋巴结卵巢胰腺甲状旁腺垂体胎盘前列腺皮肤脊髓脾脏横纹肌睾丸胸腺甲状腺2输尿管胃窦胃体(gostric body)回肠2十二指肠眼角膜眼晶状体眼视网膜   -+/++-----+-------+--++++-------+---++/+---   ------+------------+++-------+-------   ------------+-----++++-------+---+--- 仅上皮染色(Nt和1∶8)不同程度的内皮染色不同程度的上皮染色上皮细胞阳性间皮和上皮染色个别细胞染色滋养层表面全部染色仅输尿管上皮染色(Nt和1∶8)只有粘膜肌层染色
1通过相对于胎盘滋养层(+++)和阴性对照染色(-)的肉眼分析确定5T4染色强度。
2获自癌症患者的组织。
实施例13
ScFv融合蛋白的体内抗肿瘤效力数据
本研究的目的是测试一系列单链抗体融合蛋白的效力。
实验设计
表达人5T4的CT26细胞(CT26-h5T4)和CT26-neo
用PBS、LscFv-1、LscFv-2、B7-scFv、ScFv-Ig预温育细胞。
在BHK细胞系中表达LscFv-1和2。在镍柱上通过其组氨酸标记纯化LscFv-1，采用过滤系统纯化scFv-2。通过His标记从BHK细胞系纯化B7-scFv，通过过滤柱纯化scFv-Ig。以在FACS测定中饱和结合CT26-h5T4细胞需要的蛋白量定义在实验中使用的每种scFv的浓度。
使CT26-h5T4和CT26-neo细胞与饱和量的每种scFv预温育，并温育1小时。洗涤细胞后，在同基因BALB/c小鼠的胁腹皮下注射5×105细胞。
每隔1天测量一次肿瘤大小并计算肿瘤体积。
结果13
图8：CT26-neo
如果为LscFv-1，各接受组之间没有显著性差异，所述接受组在肿瘤接种后36天，与PBS对照相比，其肿瘤大小降低3倍。
图9：CT26-h5T4
用所有scFv构建物处理肿瘤对肿瘤生长具有显著的作用。用scFv-1处理的5只小鼠中的4只在第36天肿瘤消失。在第36天，scFv-1处理肿瘤比用PBS处理的肿瘤小60倍以上。
用工程表达h5T4的小鼠黑素瘤细胞系(B16)进行相似的实验时，没有抗肿瘤作用。
总结
总之，B7或IgG与5T4特异性scFv融合在CT26和B16鼠类模型中似乎没有有利的作用。因为其结合亲和力高，单独的scFv可能更有效(如BIACORE所示，与B7-scFV相比)。所以，该数据表明，单独的scFv对阻滞肿瘤具有显著的作用，而在5T4模式中不需要与scFv融合的免疫增强分子来实现对阻滞肿瘤的作用。
                            序列表
<110>Oxford Biomedica(UK)Limited
<120>多肽
<130>p5020WO
<160>27
<170>PatentIn version 3.0
<210>
<211>1263
<212>
<213>人(Homo sapiens)
<400>
atgcctgggg ggtgctcccg gggccccgcc gccggggacg ggcgtctgcg gctggcgcga     60
ctagcgctgg tactcctggg ctgggtctcc tcgtcttctc ccacctcctc ggcatcctcc    120
ttctcctcct cggcgccgtt cctggcttcc gccgtgtccg cccagccccc gctgccggac    180
cagtgccccg cgctgtgcga gtgctccgag gcagcgcgca cagtcaagtg cgttaaccgc    240
aatctgaccg aggtgcccac ggacctgccc gcctacgtgc gcaacctctt ccttaccggc    300
aaccagctgg ccgtgctccc tgccggcgcc ttcgcccgcc ggccgccgct ggcggagctg    360
gccgcgctca acctcagcgg cagccgcctg gacgaggtgc gcgcgggcgc cttcgagcat    420
ctgcccagcc tgcgccagct cgacctcagc cacaacccac tggccgacct cagtcccttc    480
gctttctcgg gcagcaatgc cagcgtctcg gcccccagtc cccttgtgga actgatcctg    540
aaccacatcg tgccccctga agatgagcgg cagaaccgga gcttcgaggg catggtggtg    600
gcggccctgc tggcgggccg tgcactgcag gggctccgcc gcttggagct ggccagcaac    660
cacttccttt acctgccgcg ggatgtgctg gcccaactgc ccagcctcag gcacctggac    720
ttaagtaata attcgctggt gagcctgacc tacgtgtcct tccgcaacct gacacatcta    780
gaaagcctcc acctggagga caatgccctc aaggtccttc acaatggcac cctggctgag     840
ttgcaaggtc taccccacat tagggttttc ctggacaaca atccctgggt ctgcgactgc     900
cacatggcag acatggtgac ctggctcaag gaaacagagg tagtgcaggg caaagaccgg     960
ctcacctgtg catatccgga aaaaatgagg aatcgggtcc tcttggaact caacagtgct    1020
gacctggact gtgacccgat tcttccccca tccctgcaaa cctcttatgt cttcctgggt    1080
attgttttag ccctgatagg cgctattttc ctcctggttt tgtatttgaa ccgcaagggg    1140
ataaaaaagt ggatgcataa catcagagat gcctgcaggg atcacatgga agggtatcat    1200
tacagatatg aaatcaatgc ggaccccaga ttaacaaacc tcagttctaa ctcggatgtc    1260
tga                                                                  1263
<210>2
<211>1281
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>2
atgcctgggg cgggctcccg gggcccctcc gccggggacg gacggctgag gttggcaagg     60
ctggcgctag tgctgctggg ttgggtctcc gcgtcggccc ccagctcttc ggtaccctcg    120
tcttccacct ccccggcaga cttcctggcc tcggggtctg cgcagcctcc gccagccgag    180
agatgccccg cggcgtgcga gtgctccgag gcggcgcgca cggttaagtg cgtgaaccgc    240
aacctgctgg aggtgccggc ggatctaccg ccttacgtgc gcaacctttt ccttaccggc    300
aaccagatga ccgtgctccc cgcgggcgcc ttcgcccgcc agccgccgct cgccgacctg    360
gaggcgctca acctcagcgg caaccacctg aaggaggtgt gtgcaggtgc cttcgagcat    420
ctgccgggtc tgcgccggct tgacctcagc cacaaccctc tcaccaacct cagcgccttc    480
gtctttgcgg gcagcaacgc cagcgtctcg gcccccagcc ccctggagga gctgatcctg    540
aatcacatcg tgccccctga ggatcagagg cagaacggga gcttcgaggg tatggtggcc    600
ttcgaaggca tggtggcagc agctctgcgc tcaggccttg cactccgagg tcttacacgc    660
ctggagctag ccagcaatca ctttcttttc ctgcctcggg acttactagc ccaactgccg    720
agtctcagat acctggacct caggaacaat tccctggtga gcctgaccta cgcatccttc    780
cgcaacctga cacacctcga aagcctccac ttggaggaca atgccctcaa ggtccttcac     840
aactccacct tggctgagtg gcaaggcctg gctcatgtca aggtgttcct ggacaacaat     900
ccctgggttt gcgactgcta catggctgac atggtggctt ggcttaaaga gacagaggtg     960
gtgccagata aagccaggct tacctgcgca ttcccggaga agatgaggaa tcgtggcctc    1020
ttagacctca acagctctga cctggactgt gacgctgtcc ttccccaatc cctgcagact    1080
tcctatgtct tcctaggtat tgttttagct ctgataggcg ctattttcct cctcgttttg    1140
tatttgaacc gtaaaggcat aaaaaagtgg atgcataaca tcagagatgc ctgcagggat    1200
cacatggaag ggtatcatta cagatacgaa atcaatgcgg accccagatt aacaaatctt    1260
agttccaact cggatgtctg a                                              1281
<210>3
<211>901
<212>DNA
<213>犬(Canis sp.)
<400>3
atcgtgcccc ccgacgaccg gcggcagaac cggagcttcg aggtcatggt ggcggctgcc     60
vddrrnrsvm vaaactccga gcgggccgcg cgcttcgcgg gctgcagtgc ctggagctgg    120
ccggcaaccg cttcragrar gcagnrctct acttgcctcg cgacgtcctg gcccagctac    180
ccggcctccg gcacctggac ctgcgcyrdv agrhdraaca attccctggt gagcctcacc    240
tacgtgtcct tccgcaacct gacgcacttg gagagcnnsv styvsrnths ctccacctgg    300
aggacaacgc cctcaaggtc cttcacaacg ccaccctggc ggagctgcag hdnakvhnat    360
aagcctgccc cacgtccggg tcttcctgga caacaacccc tgggtctgcg attgtcacat    420
gshvrvdnnw vcdchmgcag acatggtggc ctggctcaag gagacagagg tggtgccggg    480
caaagccggg ctcaccadmv awktvvgkag ttgtgcattc ccggagaaaa tgaggaatcg    540
ggccctcttg gaactcaaca gctcccacct gcakmrnran sshgactgtg accctatcct    600
ccctccatcc ctgcagactt cttatgtctt cctaggtatt gtcdcdstsy vgvttagccc    660
tgataggcgc catcttccta ctggttttgt atttgaaccg caaggggata aagagavynr    720
kgkaagtgga tgcataacat cagagatgcc tgcagggatc acatggaagg gtatcactac    780
agakwmhnrd acrdhmgyhy rtacgaaatc aatgcagacc ccaggttaac aaacctcagt    840
tccaattcgg atgtctgaga aynadrtnss nsdvacagtc ggggacagac caaggacaac    900
t                                                                    901
<210>4
<211>238
<212>PRT
<213>犬(Canis sp.)
<400>4
Ile Val Pro Pro Asp Asp Arg Arg Gln Asn Arg Ser Phe Glu Val Met
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Ala Leu Arg Ala Gly Arg Ala Leu Arg Gly Leu Gln Cys
            20                  25                  30
Leu Glu Leu Ala Gly Asn Arg Phe Leu Tyr Leu Pro Arg Asp Val Leu
        35                  40                  45
Ala Gln Leu Pro Gly Leu Arg His Leu Asp Leu Arg Asn Asn Ser Leu
    50                  55                  60
Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn Leu Thr His Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val Leu His Asn Ala Thr Leu
                85                  90                  95
Ala Glu Leu Gln Ser Leu Pro His Val Arg Val Phe Leu Asp Asn Asn
            100                 105                 110
Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp Met Val Ala Trp Leu Lys
        115                 120                 125
Glu Thr Glu Val Val Pro Gly Lys Ala Gly Leu Thr Cys Ala Phe Pro
    130                 135                 140
Glu Lys Met Arg Asn Arg Ala Leu Leu Glu Leu Asn Ser Ser His Leu
145                 150                 155                 160
Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu Gln Thr Ser Tyr Val Phe
                165                 170                 175
Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile Gly Ala Ile Phe Leu Leu Val Leu
            180                 185                 190
Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile Lys Lys Trp Met His Asn Ile Arg Asp
        195                 200                 205
Ala Cys Arg Asp His Met Glu Gly Tyr His Tyr Arg Tyr Glu Ile Asn
    210                 215                 220
Ala Asp Pro Arg Leu Thr Asn Leu Ser Ser Asn Ser Asp Val
225                 230                 235
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>5
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val
1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>6
Ala Leu Ile Gly Ala Ile Phe Leu Leu
1               5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>7
Ser Leu Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu
1               5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>8
Ala Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu
1               5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>9
Gly Leu Pro His Ile Arg Val Phe Leu
1               5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>10
Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile
1               5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>11
Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu
1               5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>12
Asn Leu Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu
1               5
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>13
Phe Leu Tyr Leu Pro Arg Asp Val Leu
1               5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>14
Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile
1               5
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>15
Leu Ile Gly Ala Ile Phe Leu Leu Val
1               5
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>16
Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys
1               5
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>17
His Met Ala Asp Met Val Thr Trp Leu
1               5
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>5T4 9 Mer
<400>18
Tyr Met Ala Asp Met Val Ala Trp Leu
1               5
<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>19
Asn Leu Leu Glu Val Pro Ala Asp Leu
1                5
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>20
Phe Leu Thr Gly Asn Gln Met Thr Val
1               5
<210>21
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>21
Ala Leu Ile Gly Ala Ile Phe Leu Leu
1               5
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>22
Phe Leu Phe Leu Pro Arg Asp Leu Leu
1               5
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>23
Ser Leu Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu
1               5
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>24
Ala Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu
1               5
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>25
Gly Leu Ala His Val Lys Val Phe Leu
1               5
<210>26
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>26
Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile
1               5
<210>27
<211>8
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>5T4 9 Mer
<400>27
Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly
1               5

Claims (28)

1.一种表达编码5T4抗原的核酸的病毒载体，其中所述病毒载体能激发接受者免疫应答。
2.根据权利要求1的载体，其中所述病毒载体为痘病毒载体。
3.根据权利要求2的载体，其中所述痘病毒载体为MVA。
4.一种用于治疗癌症的疫苗组合物，它包含作为免疫剂的自身5T4抗原。
5.根据权利要求4的疫苗组合物，它还包含一种或多种佐剂。
6.根据权利要求4或权利要求5的疫苗组合物，其中所述自身5T4抗原为修饰5T4抗原。
7.一种疫苗组合物，它包含分开、同时、序贯或联合应用以激发接受者免疫应答的、编码并表达5T4抗原的表达载体和编码并表达5T4抗原的病毒载体。
8.一种疫苗组合物，它包含分开、同时、序贯或联合应用以激发接受者免疫应答的、编码并表达修饰5T4抗原的表达载体和编码并表达5T4抗原的病毒载体。
9.根据权利要求7或8的组合物，其中所述表达载体是一种DNA质粒。
10.根据权利要求7或8的组合物，其中所述病毒载体是痘病毒载体。
11.根据权利要求10的组合物，其中所述痘病毒载体为MVA载体。
12.编码5T4抗原的核酸在制备由于在接受者激发免疫治疗性应答的药物中的用途。
13.根据权利要求12的用途，其中所述5T4抗原是修饰5T4抗原。
14.根据权利要求12或13的用途，其中所述免疫应答为CTL应答或抗体应答。
15.根据权利要求14的用途，其中所述5T4抗原利用根据权利要求1-3中任一项的病毒载体传递。
16.根据权利要求12或13的用途，其中所述5T4抗原利用根据权利要求1-3中任一项的病毒载体传递。
17.5T4抗原的用途，用于制备免疫治疗接受者肿瘤的组合物。
18.5T4抗原的用途，用于制备打破接受者对5T4抗原的免疫耐受的组合物。
19.根据权利要求17-18中任一项的用途，其中所述5T4抗原利用根据权利要求1-3中任一项的病毒载体传递。
20.根据权利要求17或18的用途，其中所述5T4抗原为修饰5T4抗原。
21.一种编码5T4抗原的载体和一种与免疫刺激分子融合的能够结合5T4抗原的因子药物的组合产品，它们在肿瘤治疗中单独使用、同一时间单独使用或混合使用。
22.一种编码5T4抗原的载体和一种前体药物/酶的组合产品，它们在肿瘤治疗中单独使用、同一时间单独使用或混合使用。
23.一种编码修饰5T4抗原的载体和一种能结合5T4抗原且与免疫刺激分子融合的药物的组合产品，它们在肿瘤治疗中单独使用、同一时间单独使用或混合使用。
24.一种编码修饰5T4抗原的载体和一种前体药物/酶的组合产品，它们在肿瘤治疗中单独使用、同一时间单独使用或混合使用。
25.用包含5T4抗原的病毒载体感染的专化抗原提呈细胞APC的用途，用于制备增强针对5T4抗原的免疫的药物。
26.根据权利要求25的用途，其中所述APC是树突细胞。
27.用5T4抗原处理的树突细胞的用途，用于制备增强针对5T4抗原的免疫的药物。
28.根据权利要求25-27中任一项的用途，其中所述5T4抗原是修饰的5T4抗原。
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