KR102609624B1 - 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈액암 치료에 대한 면역치료적 접근법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 5T4 항원을 표적화함으로써 혈액암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 대상체에게 5T4-표적화제를 투여하는 단계를 포함하는 혈액암 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 5T4-특이적 키메라 항원 수용체(CAR) 및 암 치료에서의 이의 용도를 제공한다.

Description

방법
본 발명은 혈액암(haematological cancer) 치료에 대한 면역치료적 접근법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 5T4 항원을 표적화함으로써 혈액암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 대상체에게 5T4 표적화제(targeting agent)를 투여하는 단계를 포함하는 혈액암 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 5T4 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 및 암 치료에서의 이의 용도를 제공한다.
혈액암은 두 가지 주요한 혈액 세포 계통인 골수성(myeloid) 세포주 및 림프성(lymphoid) 세포주로부터 유래할 수 있다. 골수성 세포주는 정상적으로 과립구(granulocyte), 적혈구(erythrocyte), 혈소판(thrombocyte), 대식세포(macrophage) 및 비만세포(mast cell)를 생산하고; 림프성 세포주는 B 세포, T 세포, NK 세포 및 형질세포(plasma cell)를 생산한다. 림프종(lymphoma), 림프구성 백혈병(lymphocytic leukaemia), 및 골수종(myeloma)은 림프성 세포주로부터 유래하지만, 급성 및 만성 골수성 백혈병(acute and chronic myelogenous leukaemia), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome) 및 골수증식성 질환(myeloproliferative disease)의 기원은 골수이다.
혈액암은 다수의 증상을 유발할 수 있다. 가장 흔한 증상 중 일부는 허약(weakness), 피로(fatigue), 숨가쁨(shortness of breath), 멍(bruising) 및 출혈(bleeding)이 생기기 쉬움, 잦은 감염(infection), 림프절 비대(enlarged lymph nodes), (복부 기관 비대로 인한) 복부 팽창(distended) 또는 통증, 뼈 또는 관절 통증, 골절(fracture), 계획하지 않은 체중 감소(weight loss), 식욕 부진(poor appetite), 야간발한(night sweat), 지속적인 미열(persistent mild fever) 및 (손상된 신장 기능으로 인한) 배뇨 감소(decreased urination)이다. 어떤 증상은 다른 암보다 일부 암에서 발생할 가능성이 더 크다. 예를 들어, 뼈 통증은 골수종에서 더욱 빈번하게 발견되며, 림프절 비대는 림프종에서 가장 흔하다. 림프절 비대의 구체적인 영향은 이들 림프절의 위치 및 크기에 달려있다.
종합하면, 혈액 악성 종양(haematological malignancy)은 미국에서 새로운 암 진단의 9.5%를 차지하며, 영국에서는 30,000명의 환자가 매년 진단된다. 혈액암의 유병률(prevalence)은 인구 고령화 및 대부분의 경우 예방 조치가 불가능한 결과로서 수반되는 결과에 따라 증가할 수 있음을 예상할 수 있다.
혈액암 치료를 위한 일부 치료적 옵션, 예를 들어 화학요법, 방사선요법, 면역요법 및 골수 이식이 현재 이용 가능하다.
그러나 혈액암을 치료 또는 예방하는 대안적인 방법이 당해 분야에 필요하다.
본 발명자들은 놀랍게도 혈액암에서 항원 5T4가 세포 상에 발현되므로, 5T4 표적화가 혈액암의 치료 또는 예방을 위한 옵션을 제공함을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 대상체에게 5T4 표적화제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈액암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 혈액암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 5T4 표적화제를 제공한다.
또한, 혈액암 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 5T4 표적화제의 용도 및 혈액암 치료 또는 예방을 위한 5T4 표적화제의 용도가 제공된다.
또한, 본 발명은 5T4-특이적 키메라 항원 수용체(CAR) 및 5T4-특이적 CAR을 발현하는 세포, 및 암, 특히 혈액암의 치료 또는 예방에 있어서의 이의 용도를 제공한다.
대안적인 양태에서, 본 발명은 혈액암의 치료 또는 예방을 위한 5T4를 표적화하는 암 백신을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 첨부된 청구범위 및 다음의 설명 및 논의에서 제시된다. 이러한 양태는 별개의 섹션 제목으로 제시될 수 있다. 그러나 각 섹션 제목 아래의 교시가 반드시 그 특정 섹션 제목으로 한정되는 것은 아니라는 것을 이해하여야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 (예를 들어, 세포 배양, 분자유전학, 핵산 화학, 혼성화 기술 및 생화학의 용어) 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 분자, 유전 및 생화학적 방법에는 표준 기술 사용된다. 일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 및 Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.; 및 Guthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.), McPherson et al., PCR Volume 1, Oxford University Press, (1991), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.), 및 Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.) 참조. 이들 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
혈액암
혈액암에는 수많은 유형이 있다. 본 발명은 프리-B(pre-B) 급성 림프구성 백혈병이 아닌 혈액암에 관한 것이다.
혈액암의 주요 유형은 백혈병(leukaemia), 림프종(lymphoma) 또는 골수종(myeloma)으로 분류될 수 있다.
백혈병은 보통 골수에서 시작하여, 많은 수의 비정상적인 백혈구를 초래하는 암 그룹이다. 이들 백혈구는 완전히 발달하지 않은 것으로, 아세포(blast) 또는 백혈병 세포(leukaemia cell)라 불린다.
임상 및 병리학적으로, 백혈병은 여러 그룹으로 세분화된다. 첫 번째 구분은 급성 및 만성 형태 사이에서 이루어진다:
급성 백혈병(acute leukaemia)은 미성숙 혈액 세포 수의 급격한 증가를 특징으로 한다. 이러한 세포들로 인해 생기는 군집(crowding)은 골수가 건강한 혈액 세포를 생산할 수 없게 만든다. 악성 세포(malignant cell)의 빠른 진행과 축적, 그 후 세포가 혈류로 흘러나와 신체의 타기관으로 확산됨으로 인하여, 급성 백혈병은 즉각적인 치료가 필요하다. 급성 형태의 백혈병은 소아에서 가장 흔한 형태의 백혈병이다.
만성 백혈병(chronic leukaemia)은 비교적 성숙하지만 여전히 비정상적인 백혈구의 과도한 축적을 특징으로 한다. 진행하는 데 전형적으로 몇 개월 또는 몇 년이 걸리지만, 세포는 정상보다 훨씬 빠른 속도로 생산되어 많은 비정상적인 백혈구가 생긴다. 급성 백혈병은 즉시 치료되어야 하지만, 만성 형태는 때때로 치료의 효과를 극대화하기 위하여 치료 전에 얼마 동안 모니터링된다. 만성 백혈병은 주로 노인에서 발생하지만, 모든 연령대에서 발생할 수 있다.
또한, 질병은 영향을 받는 혈액 세포의 종류에 따라 세분화된다. 이는 백혈병을 림프아구성(lymphoblastic) 또는 림프구성(lymphocytic) 백혈병 및 골수(myeloid) 또는 골수성(myelogenous) 백혈병으로 나눈다. 대부분의 림프구성 백혈병은 B 세포와 관련이 있다. 골수 또는 골수성 백혈병에서, 암성 변화는 일반적으로 적혈구, 일부 다른 유형의 백혈구 및 혈소판을 형성하는 골수 세포의 일종에서 발생한다.
따라서, 백혈병에는 급성 골수성(acute myeloid, AML), 급성 림프아구성(acute lymphoblastic, ALL), 만성 골수성(chronic myeloid, CML) 및 만성 림프구성(chronic lymphocytic, CLL)의 4가지 주요 유형이 있다. 이러한 4가지의 주요 유형이 모든 백혈병 사례의 약 85%를 차지한다.
치료는 필요에 따라 지지 치료(supportive care) 및 완화 치료(palliative care) 이외에도, 화학요법(chemotherapy), 방사선요법(radiation therapy), 표적 요법(targeted therapy) 및 골수 이식(bone marrow transplant)의 일부 조합을 수반할 수 있다.
백혈병은 다양한 규칙(convention), 예를 들어 아래에서 논의되지만 이에 한정되지 않는 규칙에 따라 분류 및/또는 계층화될 수 있다. 본 발명은 모든 병기(stage) 및 분류를 포함한다.
AML
AML의 프랑스-미국-영국(FAB) 분류는 다음을 기초로 한다:
CML
CML은 전망을 예측하는데 도움을 주는 3개 그룹으로 분류된다. 이들 그룹은 병기(stage) 대신 기(phase)로 지칭된다. 기는 주로 혈액 또는 골수에서 보이는 미성숙 백혈구(골수아세포(아세포))의 수에 기초한다. 서로 다른 전문가 그룹이 기를 정의하기 위하여 약간씩 다른 컷오프(cutoff)를 제안하였으나, 공통 체계(세계보건기구에 의해 제안됨)를 아래에 기술하였다.
만성기(chronic phase)
이 기의 환자는 전형적으로 혈액 또는 골수 샘플에서 10% 미만의 아세포를 나타낸다. 이들 환자는 대개 (존재할 경우) 상당히 경미한(mild) 증상을 나타내며, 보통 표준 치료에 반응한다. 대부분의 환자는 만성기에서 진단된다.
가속기(accelerated phase)
환자가 다음 중 하나에 해당될 경우 가속기에 있는 것으로 간주된다:
· 골수 또는 혈액 샘플에서 10% 초과 20% 미만의 아세포를 나타냄
· 높은 혈액 호염구 수(백혈구의 적어도 20%를 구성하는 호염구)
· 치료로 감소되지 않는 높은 백혈구 수
· 치료에 의한 것인 아닌 매우 높거나 매우 낮은 혈소판 수
· 백혈병 세포의 새로운 염색체 변화
CML이 가속기에 있는 환자는 열, 식욕 부진 및 체중 감소와 같은 증상이 있을 수 있다. 가속기의 CML은 만성기의 CML과 마찬가지로 치료에 반응하지 않는다.
아세포기(blast phase)(급성기(acute phase) 또는 아세포 급증(blast crisis)으로도 지칭됨)
이 기의 환자로부터의 골수 및/또는 혈액 샘플은 20% 초과의 아세포를 나타낸다. 아세포는 종종 골수를 넘어 조직과 기관으로 확산된다. 이들 환자는 종종 열, 식욕 부진 및 체중 감소를 나타낸다. 이 기에서, CML은 공격적 급성 백혈병과 매우 유사하다.
ALL
분류는 면역표현형(immunophenotype)에 기초할 수 있다. 세포유전학적 시험, 유세포 분석 및 기타 실험실 시험은 ALL의 아형 및 환자의 예후에 관한 더욱 상세한 정보를 제공한다. 이들 시험은 다음을 고려하여 백혈병의 면역표현형에 기초하여 ALL을 그룹으로 나누는데 도움이 된다:
· 백혈병 세포가 유래되는 림프구의 종류(B 세포 또는 T 세포)
· 이들 백혈병 세포의 성숙 정도
ALL의 아형은 현재 다음과 같이 명명된다:
B 세포 ALL
· 조기 pre-B ALL(pro-B ALL로도 지칭됨) - 사례의 약 10%
· 공통 ALL - 사례의 약 50%
· Pre-B ALL - 사례의 약 10%
· 성숙 B 세포 ALL(버킷 백혈병(Burkitt leukemia)) - 사례의 약 4%
T 세포 ALL
· Pre-T ALL - 사례의 약 5% 내지 10%
· 성숙 T 세포 ALL - 사례의 약 15% 내지 20%
ALL의 아형 각각은 약간씩 상이한 전망(예후)을 갖지만, (백혈병 세포의 유전자 변화와 같은) 다른 인자 또한 영향을 미칠 수 있다.
혼합 직계성 급성 백혈병(mixed lineage acute leukemia)
최근 몇 년 동안, 새로운 실험실 시험은 소수의 급성 백혈병이 실제로 림프구성 및 골수성 특징을 모두 가지고 있음을 보여주었다. 때때로 백혈병 세포는 동일한 세포에 골수성 및 림프구성 특성(trait)을 둘 다 가지고 있다. 다른 사례에서, 한 사람이 골수성 특징을 가진 일부 백혈병 세포와 림프구성 특징을 가진 다른 백혈병 세포를 가질 수 있다. 이러한 유형의 백혈병은 혼합 직계성 백혈병, 골수성 마커를 갖는 ALL(My+ ALL), 림프구성 마커를 갖는 AML 또는 이중표현형 급성 백혈병(biphenotypic acute leukemia, BAL)이라 지칭될 수 있다.
대부분의 연구는 이들 백혈병이 ALL 또는 AML의 표준 아형보다 불량한 전망을 나타내는 경향이 있음을 시사한다.
CLL
CLL 병기 분류(staging)를 위한 2가지의 상이한 체계가 있다:
· Rai 체계: 이것은 미국에서 더 자주 사용된다.
· Binet 체계: 이것은 유럽에서 더욱 널리 사용된다.
Rai 병기 분류 체계
Rai 체계는 본래 1968년에 고안되었다. 당시 CLL 진단에 필요한 것은 림프구 증가증(lymphocytosis)(혈액 및 골수에 감염과 같은 임의의 다른 원인이 없는 많은 수의 림프구)이었다. 이것은 본래 혈액 mm3 당 15,000개 이상의 림프구 및 골수의 적어도 40%가 림프구로 구성되는 것으로서 정의되었다.
현재 CLL 진단을 위해서는, 환자는 적어도 5,000/mm3의 단일클론성(monoclonal) 림프구를 가져야 하지만(때때로 단일클론성 림프구 증가증이라 지칭됨), 전체 림프구 수가 높을 필요는 없다. 단일클론성은 세포 모두가 동일한 세포로부터 유래함을 의미하며, 이는 특별한 시험에서 세포가 동일한 화학적 패턴을 갖게 할 수 있다.
이러한 병기 분류를 위해, 림프구 증가증에 대해 CLL의 진단(예컨대, 단일클론성 림프구 증가증)을 대신할 수 있다.
이 체계는 CLL을 5가지 병기로 나눈다:
· Rai 0기: 림프구 증가증이 있음, 림프절, 비장 또는 간 비대 없음, 정상에 가까운 백혈구 및 혈소판 수.
· Rai 1기: 림프구 증가증 및 림프절 비대. 비장 및 간은 비대되지 않고, 적혈구 및 혈소판 수는 정상에 가까움.
· Rai 2기: 림프구 증가증 및, 림프절 비대 여부와 관계없이 비장 비대(및 아마도 간 비대). 적혈구 및 혈소판 수는 정상에 가까움.
· Rai 3기: 림프구 증가증 및, 림프절, 비장 또는 간 비대 여부와 관계없이 빈혈(매우 적은 수의 적혈구). 혈소판 수는 정상에 가까움.
· Rai 4기: 림프구 증가증 및, 빈혈, 림프절, 비장 또는 간 비대 여부와 관계없이 저혈소판증(매우 적은 수의 혈소판).
본 발명의 일 양태에서, 혈액암은 백혈병이다. 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, B-세포 급성 림프아구성 백혈병(B-ALL) 및 T-세포 급성 림프아구성 백혈병(T-ALL)으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 혈액암은 ALL이 아니다. 일 양태에서, 혈액암은 B-ALL이 아니다.
본 발명에 따른 혈액암은 림프종일 수 있다. 림프종은 림프구에서 발생하는 암 그룹이다. 림프종의 두 가지 주요 카테고리는 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma, HL)과 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma, NHL)이다. 호지킨 림프종은 림프종의 약 15%를 차지한다. 호지킨 림프종은 예후 및 여러 병리학적 특성에서 다른 형태의 림프종과 상이하다. 호지킨 림프종은 리드-스텐버그 세포(Reed-Sternberg cell)라 불리는 세포 유형의 존재로 표시된다. 호지킨 림프종을 제외한 모든 림프종으로 정의되는 비호지킨 림프종은 호지킨 림프종보다 더 흔하다. 다양한 림프종이 이 부류에 있으며, 원인, 관련된 세포의 유형 및 예후는 유형에 따라 다르다. 비호지킨 림프종의 발생률(incidence)은 나이가 들면서 증가한다. 비호지킨 림프종은 여러 아형으로 더 나뉜다.
2001년에 발표되고 2008년에 업데이트된 WHO 분류는 "개정된 유럽-미국 림프종 분류"(revised European-American lymphoma classification, REAL)에 기초를 두고 있다. 이 체계는 림프종을 세포 유형(즉, 종양과 가장 유사한 정상 세포 유형)으로 분류하고, 표현형, 분자 또는 세포유전학적 특성을 정의한다. 다섯 가지 그룹은 다음과 같다:
1. 성숙한 B 세포 신생물(neoplasma)
2. 성숙한 T 세포 및 NK 세포 신생물
3. 림프계 전구세포 신생물(precursor lymphoid neoplasm)
4. 호지킨 림프종
5. 면역결핍 관련 림프증식성 장애(immunodeficiency-associated lymphoproliferative disorder)
림프종은 15 내지 24세의 젊은이에게 가장 흔한 혈액암이며, 매년 영국에서 14,000건 이상의 새로운 림프종 사례가 진단된다.
현재의 치료는 화학요법, 방사선요법, 표적 요법 및 수술 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 비호지킨 림프종에서, 림프종 세포에 의해 생성된 단백질의 양이 증가하면 혈액이 너무 걸쭉해져서 단백질 제거를 위해 혈장 교환술(plasmapheresis)이 수행된다.
본 발명의 일 양태에서, 혈액암은 림프종이다.
본 발명에 따른 혈액암은 대안적으로 골수종일 수 있다. 골수종은 골수에서 발생하는 형질 세포(항체 생산을 정상적으로 담당하는 백혈구의 한 유형)의 암이다. 골수종 세포는 혈류를 통해 이동하여 다른 뼈에 모일 수 있다. 골수종은 골수의 많은 부위에서 발생하므로, 종종 다발성 골수종이라 지칭된다.
초기에는 종종 어떠한 증상도 나타나지 않는다. 진행되면, 뼈 통증, 출혈, 잦은 감염 및 빈혈이 발생할 수 있다. 합병증은 아밀로이드증(amyloidosis)을 포함할 수 있다. 골수에서의 골수종 세포의 과잉 생성은 혈액을 구성하는 다른 유형의 세포인 백혈구, 적혈구 및 혈소판의 생성에 영향을 미친다. 골수종 세포는 또한 뼈에 손상을 일으켜 부러지기 쉽게 할 수 있다.
골수종은 일반적으로 나이가 많은 환자에서 발생하지만, 때로는 40세 미만의 환자에서도 발견된다. 골수종 세포로 인한 뼈 손상은 고칼슘혈증(hypercalcaemia)을 유발할 수 있다. 높은 칼슘은 탈수(dehydration) 및 신장 손상을 유발할 수 있다.
미국에서 골수종의 유병률(prevalence)은 약 77,600건으로 보고되었으며, 2014년에는 약 24,000건의 새로운 사례가 보고되었다. 평균 5년 생존율은 연령, 진단의 병기 등과 같은 인자에 따라 생존율이 45% 미만인 것으로 추정된다. 환자는 전형적으로 반복 라운드(repeat round)의 병용 요법으로 치료되며, 각각의 연속적인 치료 라인에서 재발하는 시간 간격이 더 짧아진다. 대다수의 환자는 결국 재발하며, 이는 더 치료될 수 없다. 이 말기(late stage)에서, 평균 생존기간(median survival)은 겨우 6 내지 9개월이며, 치료는 주로 증상을 감소시키고 삶의 질을 관리하는 완화적인 것이다.
상기 논의된 바와 같이, 골수종은 형질 세포를 포함하는 질병이다.
골수종은 다양한 규칙에 따라 분류 및/또는 계층화될 수 있다. 예를 들어, Fonseca et al. Leukemia (2009) 23, 2210-2221 참조. 질병의 규모(bulk) 및 공격성(aggressiveness)을 특성화하는 여러 체계가 사용되고 있다.
예를 들어, 국제 골수종 연구 그룹 진단 기준(International Myeloma Working Group diagnostic criteria) 및 국제 병기 결정 분류 체계(International Staging System, ISS)가 일반적으로 사용된다.
국제 골수종 연구 그룹 진단 기준:
무증상(asymptomatic/smoldering) 골수종: 단일클론성 (M)-단백질 ≥ 30 g/L 및/또는 골수 클론성 세포 ≥ 10%이지만, 관련 장기 또는 조직 손상(organ or tissue impairment, ROTI)(말단 기관(end-organ) 손상)은 없음.
증상을 동반하는(symptomatic) 골수종: M-단백질 ≥ 30 g/L 및/또는 골수 클론성 세포 ≥ 10%이며, 형질 세포 증식 과정이 원인일 수 있는 ROTI(말단 기관 손상)의 증거가 반드시 있어야 함; CRAB(칼슘, 신부전, 빈혈 및 골 병변: 혈청 칼슘 ≥ 11.5 mg/100 mL 증가; 신부전[혈청 크레아티닌 > 1.73 mmol/L]; 정상의 하한치 이하인 2 g/100 mL를 초과하는 헤모글로빈 값 또는 10 g/100 mL 미만의 헤모글로빈 값을 갖는 정색소성(normochromic), 정구성(normocytic) 빈혈; 용해성 병변(lytic lesion), 중증 골감소증(osteopenia) 또는 병리학적 골절(pathologic fracture))에 의해 나타남.
비분비성(nonsecretory) 골수종: 혈청 및 소변 중 M-단백질의 부재(absence), 골수 형질세포종(plasmacytosis) 및 ROTI.
골수종의 병기는 국제 병기 분류 체계에 따라 분류될 수 있다:
1기: 혈청 베타-2 마이크로글로불린 < 3.5 mg/L 및 혈청 알부민 ≥ 3.5 g/dL
2기: 1기도 3기도 아님
3기: 혈청 베타-2 마이크로글로불린 ≥ 5.5 mg/L
본원에서 "골수종"에 대한 언급은 모든 유형 및 병기의 골수종을 포함하는 것으로 의도된다.
예를 들어, 골수종은 다발성 골수종(multiple myeloma)일 수 있다.
골수종은 1기, 2기 또는 3기 골수종일 수 있다.
암 줄기세포(cancer stem cell)
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명자는 놀랍게도 5T4가 혈액암 및 고형 종양을 특징으로 하는 암 둘 다의 암 줄기세포에서 발현됨을 발견하였다.
암 줄기세포는 막결합 다중 약물 수송체(membrane-bound multi-drug transporter) 및 표면 마커의 발현, 자가 재생과 분화 능력 및 유사한 신호전달 경로에 대한 의존성을 포함하는 정상 줄기세포의 특성 중 일부를 공유한다. 이러한 특성은 CSC가 기존의 화학요법을 회피할 수 있게 하며, 이는 치료 후 많은 종양이 재발하는 이유를 설명할 수 있다(도 18).
본 실시예에서 입증되는 바와 같이, 5T4는 고형 종양 및 혈액암 둘 다의 줄기세포에서 발현된다. 본원에서 사용되는 "암 줄기세포(cancer stem cell)"는 정상 줄기세포와 관련된 특징을 보유하는 암 줄기세포를 지칭한다. 예를 들어, 특정 암 샘플에서 발견되는 모든 세포 유형을 만들어내는 능력. 암 줄기세포는 종양 형성성(tumorigenic or tumour-forming) 세포이다. 암 줄기세포는 자가 재생 및 여러 세포 유형으로의 분화의 줄기세포 과정을 통해 종양을 생성할 수 있다. 이러한 세포는 종양에서 별개의 집단으로서 지속될 수 있고, 새로운 종양을 만들어냄으로써 재발 및 전이를 유발할 수 있다.
도 18에 도시된 바와 같이, 암 줄기세포를 표적화하는 것은 암 줄기세포를 사멸시켜 종양 세포의 생존 및 종양 재발 유발 가능성을 감소시키기 때문에, 환자 결과를 개선할 수 있다.
따라서, 암 줄기세포 상에 존재하는 5T4를 표적화하는 것은 암의 재발 가능성을 감소시킬 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암 재발을 예방 또는 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 대상체에게 5T4 표적화제를 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암 재발을 예방 또는 감소시키는 데 사용하기 위한 5T4 표적화제를 제공한다.
또한, 대상체에서 암 재발을 예방 또는 감소시키기 위한 약제의 제조에 있어서 5T4 표적화제의 용도, 및 대상체에서 암 재발을 예방 또는 감소시키기 위한 5T4 표적화제의 용도가 제공된다.
용어 "암 재발(cancer relapse)"은 개선 또는 관해(remission) 기간 후의, 암의 재발(return)의 방사선 진단, 또는 암의 재발의 징후 및 증상을 포함하는 재발의 진단을 지칭한다.
본 발명의 일 양태에서, 암 전이(cancer metastasis)를 치료하는 방법이 제공되며, 여기에서 상기 방법은 상기 대상체에게 5T4 표적화제를 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암 전이를 치료하는 데 사용하기 위한 5T4 표적화제를 제공한다. 또한, 대상체에서 암 전이를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 5T4 표적화제의 용도, 및 암 전이를 치료하기 위한 5T4 표적화제의 용도가 제공된다.
또한, 본 발명은 암 환자의 생존기간을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 방법은 상기 대상체에게 5T4 표적화제를 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 암 환자의 생존기간을 향상시키는데 사용하기 위한 5T4 표적화제를 제공한다. 또한, 암 환자의 생존기간을 향상시키기 위한 약제의 제조에 있어서 5T4 표적화제의 용도, 및 암 환자의 생존기간을 향상시키기 위한 5T4 표적화제의 용도가 제공된다.
또한, 본 발명은 암 환자에서 암 줄기세포를 감소시키거나 제거하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 대상체에게 5T4 표적화제를 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 암 환자에서 암 줄기세포를 감소시키거나 제거하는 데 사용하기 위한 5T4 표적화제를 제공한다. 또한, 암 환자에서 암 줄기세포를 감소시키거나 제거하기 위한 약제의 제조에 있어서 5T4 표적화제의 용도, 및 암 환자에서 암 줄기세포를 감소시키거나 제거하기 위한 5T4 표적화제의 용도가 제공된다.
표현 "암 줄기세포를 감소시키는 것"은 종양 조직에서, 예를 들어 종양 조직의 주어진 부피 또는 주어진 단면적(section area)에서 암 줄기세포의 수를 감소시키는 것을 포괄한다.
일 양태에서, 대상체는 이전에 대안적인 암 치료, 예컨대 화학요법제로 치료된 적이 있을 수 있다. 대상체는 화학요법 치료와 같은 적어도 하나의 암 치료법에 불응성(refractory)일 수 있다. 대상체는 화학요법 치료와 같은 암 치료법으로 이전에 치료 후 재발 중일 수 있다. 암은 약물 내성(drug resistant) 암일 수 있다.
일 양태에서, 암은 본원에 기술된 바와 같은 혈액암이다.
일 양태에서, 혈액암은 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병 및 B 세포 급성 림프아구성 림프종으로부터 선택될 수 있다.
일 양태에서, 암은 고형 종양을 특징으로 하며, 상기 암은 두경부 편평상피세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC), 비소세포 폐암(non small cell lung cancer, NSCLC), 유방암(breast cancer) 또는 위암(gastric cancer)이 아니다. 일 양태에서, 암은 두경부 편평상피세포 암종(HNSCC), 비소세포 폐암(NSCLC), 유방암, 전립선암(prostate cancer), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 위암 또는 췌장암(pancreatic cancer)이 아니다.
비제한적인 예로, 고형 종양을 특징으로 하는 암은 담관암(bile duct cancer), 골암(bone cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌/CNS 암(brain/CNS cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 근육암(muscle cancer), 중피종(mesothelioma), 신경암(neuronal cancer), 식도암(oesophageal cancer), 난소암(ovarian cancer), 흉막/복막암(pleural/peritoneal membrane cancer), 신장암(renal cancer), 피부암(skin cancer), 소세포 폐암(small cell lung cancer, SCLC), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 태반암(uterine cancer), 자궁암(uterine cancer) 및 외음부암(vulval cancer)을 포함한다.
일 양태에서, 암은 난소암, 교아세포종(glioblastoma) 및 결장직장암(colorectal cancer)으로부터 선택된다. 일 양태에서, 암은 소세포 폐암(SCLC)일 수 있다.
일 양태에서, 암은 난소암 또는 교아세포종이다.
5T4 항원(5T4 antigen)
5T4는 신장, 유방, 위장관, 결장 및 난소 암종의 70% 이상에서 발현되는 것으로 알려진 72 kDa의 종양태아성 당단백질(oncofetal glycoprotein)이다. 그러나 본 발명 이전에는 이것은 혈액 악성 종양에서 발현되는 것으로 생각되지 않았다.
조직화학적 염색에 의해 검출된 5T4 발현은 소화관 및 뇌하수체에서 관찰된 낮은 수준의 산발성 염색만으로 종양 특이적인 것으로 보인다. 그러나 이 염색 수준이 매우 낮아서, 특이적인지를 결정하기가 어렵다. 면역조직화학적 분석은 5T4 발현이 결장직장암, 난소암, 위암 및 비소세포 폐암에서 불량한 예후의 지표(indicator)임을 나타낸다. 또한, 종양 세포가 5T4를 암호화하는 cDNA로 형질도입될 때, 이들은 이 분자의 발현이 종양에서 전이 특성을 유도할 수 있음을 시사하는 증가된 이동성을 나타낸다.
5T4 항원은 5T4로 공지된 폴리펩티드이며, 예를 들어 WO89/07947에서 특성이 분석되었다. "5T4"는 Myers 등에 의해 특성 분석된 바와 같이 인간 5T4일 수 있고, 이의 서열은 GenBank의 등록번호 Z29083에 나타나 있다. 마우스 또는 쥣과(murine) 5T4(m5T4)의 서열은 GenBank의 등록번호(accession no.) AJ012160에 나타나 있다. 마우스 및 인간 5T4 유전자의 구성(organisation)은 예를 들어, King et al. Biochim Biophys Acta 1999; 1445 (3); 257-70에 기술되어 있다. 개 및 고양이 5T4 서열은 예를 들어, WO02/38612에 기술되어 있다.
인간 5T4 cDNA의 서열 분석으로 이 항원이 단백질의 류신 풍부 반복부(leucine rich repeat, LRR) 패밀리의 구성원임이 확인되었다(Myers, K. A. et al. (1994)). 이 단백질은 44개 아미노산의 짧은 세포질 꼬리(cytoplasmic tail) 및, 연관된 시스테인 함유 측부 영역(cysteine containing flanking region)을 갖는 두 개의 류신 풍부 반복부(LRR) 영역으로 이루어지며 친수성 도메인에 의해 분리된 세포 외 도메인을 함유한다. 세포 외 도메인의 7개의 공통 NxS/T N-글리코실화 부위(consensus NxS/T N-glycosylation site)는 모두 소량의 코어 푸코실화(core fucosylation)를 갖는 두 개의 높은 만노오스 사슬(mannose chain) 및 다섯 개의 시알산화된(sialylated) 바이-안테너리(bi-antennary) 내지 테트라-안테너리(tetra-antennary) 복합 사슬을 포함하는 복합 글리칸(complex glycan)의 조합으로 글리코실화된다(Shaw, D. M. et al. (2002)).
인간 및 마우스 5T4 cDNA 사이의 서열 비교(King et al. (1999))는 종 사이에서 5T4 분자의 고도로 보존된(highly conserved) 구조를 보여준다. 이들 분자는 81%의 아미노산 동일성(identity)을 공유하며, 세포질 및 막관통 도메인은 완전히 보존된다. 인간 분자의 7개의 N-연결 글리코실화 부위 중에서 여섯 개가 마우스에서 보존된다. 대부분의 N 말단 부위(N81)는 없지만, C 말단 측부 영역에 추가 부위(N334)가 존재하여, 인간 분자와 유사한 수준의 글리코실화가 예상된다. 쥣과 단백질은 친수성 도메인의 글리코실화 부위에 인접한, 추가의 6개의 아미노산을 함유하며, 이는 선행하는 6개 아미노산의 직접적인 반복부이다. 세포영양막(trophoblast)에서 5T4의 발현은 그것이 모든 포유동물에 대한 공통적인 발달 단계에 존재함을 시사한다. 이는 5T4가 포유동물 전체에 걸쳐 고도로 보존되어 있을 가능성을 높인다.
본원에 사용된 표현 "5T4 항원" 또는 "5T4"는 이의 단편, 그리고 바람직하게는 별개의 에피토프를 갖는 단편, 및 5T4의 항원성을 보유하는 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 이의 변이체를 포괄한다. 적합하게는, 용어 5T4 항원은 5T4의 적어도 하나의 공통 항원 결정기(common antigenic determinant)를 보유하는, 펩티드 및 5T4의 다른 단편을 포함한다.
따라서 본원에 언급되는 5T4 항원은 아미노산 돌연변이체, 글리코실화 변이체, 및 5T4의 생리학적 및/또는 물리적 특성을 보유하는 5T4의 기타 공유 유도체(covalent derivative)를 포함한다. 예시적인 유도체로는 5T4가 자연 발생적인 아미노산 이외의 모이어티(moiety)로 치환, 화학적, 효소적 또는 기타 적절한 수단에 의해 공유적으로 변형되는(covalently modified) 분자를 포함한다. 이러한 모이어티는 효소 또는 방사성 동위원소와 같은 검출 가능한 모이어티일 수 있다.
나아가, 특정 종, 바람직하게는 포유동물 내에서 발견되는 5T4의 자연 발생적인 변이체가 포함된다. 이러한 변이체는 동일한 유전자 패밀리의 관련 유전자에 의해, 특정 유전자의 대립 유전자(allelic) 변이체에 의해 암호화될 수 있거나, 또는 5T4 유전자의 대안적인 스플라이싱 변이체를 나타낸다.
공통 항원 결정기를 보유하는 유도체는 5T4의 단편일 수 있다. 5T4의 단편은 이의 개별적인 도메인뿐만 아니라, 이 도메인으로부터 유래되는 더 작은 폴리펩티드도 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 5T4로부터 유래되는 더 작은 폴리펩티드는 5T4의 특징인 단일 에피토프를 정의한다. 단편은 그것들이 5T4의 하나의 특징을 보유하기만 하면 이론상으로 거의 임의의 크기일 수 있다. 바람직하게는, 단편의 길이는 5 내지 400개 아미노산일 것이다. 더 긴 단편은 전장 5T4의 절단부(truncation)로 간주되며, 일반적으로 용어 "5T4"에 포함된다. 유리하게는, 단편은 5 내지 25개 아미노산 길이 단위의 비교적 작은 펩티드이다. 약 9개 아미노산 길이의 펩티드가 바람직하다.
5T4의 유도체는 또한 5T4의 적어도 하나의 특징적 특성을 유지하도록 하기 위해, 아미노산 결실, 부가 또는 치환을 함유할 수 있는 이의 돌연변이체를 포함한다. 따라서, 보존적 아미노산 치환은 5' 또는 3' 말단으로부터의 절단일 수 있는 바와 같이, 5T4의 성질을 실질적으로 변경시키지 않고 이루어질 수 있다. 나아가, 결실 및 치환은 본 발명에 포함되는 5T4의 단편에 대해서도 이루어질 수 있다. 5T4 돌연변이체는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 부가, 교환 및/또는 결실을 초래하는 시험관 내(in vitro) 돌연변이 유발을 거친, 5T4를 암호화하는 DNA로부터 생산될 수 있다. 예를 들어, 5T4의 치환, 결실 또는 삽입 변이체는 재조합 방법에 의해 제조되며, 5T4의 천연형과의 면역 교차반응성(immuno-crossreactivity)에 대해 스크리닝될 수 있다.
5T4의 단편, 돌연변이체 및 기타 유도체는 바람직하게는 5T4와의 실질적인 상동성(substantial homology)을 보유한다. 본원에서 사용되는 "상동성"은 두 개체(entity)가 당업자가 이들이 기원 및 기능면에서 유사하다고 결정하기에 충분한 특징을 공유함을 의미한다.
상동성이 서열 동일성(identity)을 나타내는 "실질적인 상동성"은 직접 서열 정렬 및 비교에 의해 판단되는 바와 같이, 40% 초과의 서열 동일성, 바람직하게는 45% 초과의 서열 동일성 및 가장 바람직하게는 50% 초과의 서열 동일성을 의미한다.
5T4 표적화 (targeting 5T4)
"표적화"는 치료적 또는 예방적 개입(intervention)이 5T4 항원을 기초로 하거나 5T4 항원을 대상으로 함을 의미한다. 이는 예를 들어, 능동적 면역요법 접근법(active immunotherapy approach), 예컨대 5T4 항원을 포함하는 면역학적 조성물 또는 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 수동적 면역요법 접근법(passive immunotherapy approach), 예를 들어 5T4 항원을 인식하는 T 또는 B 세포 또는 T 및 B 세포가 종양, 또는 다른 체조직(림프절, 혈액 또는 복수를 포함하나 이에 한정되지 않음)으로부터 분리되고, 생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 증식되어, 대상체에게 재투여되는 입양 T 세포 이식(adoptive T cell transfer) 또는 B 세포 이식을 취할 수 있다. 이러한 T 또는 B 세포는 5T4 항원을 인식하도록 유전자 조작될 수 있다.
추가의 대안에서, 5T4 항원을 인식하는 항체가 대상체에게 투여될 수 있다. 일 양태에서, 이러한 항체는 5T4 항원을 발현하는 세포에 세포독성 페이로드(cytotoxic payload)를 전달하도록 변형될 수 있다.
본원에서 논의되는 바와 같이, 또 다른 양태에서, 5T4 항체 약물 컨쥬게이트(conjugate)가 사용될 수 있다. 항체 약물 컨쥬게이트(antigen-drug conjugate, ADC)는 단일클론성 항체의 결합 특이성을 화학치료제의 효능과 결합시킨다. 한 예는 환자에서 5T4 양성 암, 예를 들어 결장직장암 및 유방암을 치료하는데 유용한, 비 천연 아미노산 및 돌라스타틴 링커(dolastatin linker) 유도체를 함유하는 특이적 항체를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트이다(예를 들어, WO2013/068874 참조).
당업자는 세포 표면 항원의 경우, 항체가 항원을 인식할 것임을 이해할 것이다. 항원이 세포 내 항원인 경우, 항체는 항원 펩티드:MHC 복합체를 인식한다. 항원을 "인식하는" 항체는 이러한 가능성을 모두 포괄한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "치료(treatment)"는 치료 이전의 증상과 비교하여, 치료중인 질병의 하나 이상의 증상을 감소, 완화 또는 제거하는 것을 지칭한다.
"예방(prevention or prophylaxis)"은 질병의 증상의 개시(onset)를 지연시키거나 방지하는 것을 지칭한다. 예방은 절대적일 수 있거나(어떠한 질병도 발생하지 않도록 함), 또는 일부 개체에서만 또는 한정된 기간 동안만 효과적일 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 일 양태에서, 대상체는 포유동물, 바람직하게는 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 랫트, 토끼 또는 기니피그이지만, 가장 바람직하게는 대상체는 인간이다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 따른 암의 치료 또는 예방 방법은 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체를 확인하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 일 양태에서, 환자로부터 얻은 종양 샘플은 5T4 표적화제 투여 전에 5T4 발현에 대해 분석 또는 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 대상체로부터의 종양 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플 또는 말초 혈액 단핵구 세포 샘플일 수 있다. 일 양태에서, 샘플은 골수 샘플일 수 있다. 5T4 표적화제는 종양 샘플이 5T4 발현을 나타내는 환자에게 본 발명에 따라 투여될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 암은 5T4 양성 암, 즉 5T4를 발현하는 세포를 포함하는 5T4 양성 암일 수 있다.
항체
일 양태에서, 5T4 표적화제는 항체이다. 즉, 5T4를 인식하거나 5T4에 대해 특이적인 항체이며, 즉 항체는 5T4 항원에 특이적으로 결합한다.
"특이적 결합(specific binding)"은 이종(동종) 샘플에 동시에 존재하는 2개의 분자 종이 샘플 내의 다른 분자 종에 결합하는 것보다 우선하여 서로 결합하는 능력을 지칭한다. 전형적으로, 특이적 결합 상호작용은 반응에서 적어도 2배, 더욱 전형적으로는 적어도 10배, 종종 적어도 100배까지 우연한 결합 상호작용을 구별할 것이며; 분석물 검출에 사용될 때, 특이적 결합은 이종(동종) 샘플 내의 분석물의 존재를 결정할 때 충분히 차별적이다.
"항체(antibody)"(Ab)는 단일클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체) 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 적어도 하나의 항체-항원 결합 부위를 포함하는 단편일 수 있다. 항체 단편은 예를 들어, 5T4 또는 이의 단편에 대한 특이적인 결합을 나타낼 수 있다. 따라서, 생물학적 활성은 5T4에 대한 결합 활성일 수 있다. 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"(Ig)은 "항체"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
"항체 단편"은 온전한(intact) 항체의 부분, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"Fc" 단편은 이황화물에 의해 함께 유지되는 두 H 사슬의 카복시 말단 부분을 포함한다. 항체의 효과기(effector) 기능은 Fc 영역의 서열에 의해 결정되며, 이 영역은 또한 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식되는 부분이다.
일 양태에서, 항체는 단일클론성 항체이다.
본원에 사용되는 용어 "단일클론성 항체(monoclonal antibody)"는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하며, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적인 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
단일클론성 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적이다. 나아가, 상이한 결정인자(determinant)(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론성 항체는 항원의 단일 결정인자에 대한 것이다. 단일클론성 항체는 당해 분야의 표준 방법에 의해 제조될 수 있다.
단일클론성 항체는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역제(immunizing agent)로 면역되어 표적, 즉 본 경우에서는 5T4에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다.
또한, 단일클론성 항체는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 생산될 수 있다. 종래의 절차를 이용하여(예를 들어, 쥣과 항체의 중사슬 및 경사슬를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 적합한 단일클론성 항체를 암호화하는 DNA가 분리 및 시퀀싱될 수 있다.
또한, 시험관 내 방법은 1가 항체를 제조하는데 적합하다. 항체의 단편, 특히 Fab 단편을 생성하기 위한 항체의 분해(digestion)는 당해 분야에 공지된 통상의 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 분해는 파파인을 사용하여 수행될 수 있다. 파파인 분해의 예는 WO 94/29348에 기술되어 있다. 항체의 파파인 분해는 전형적으로 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 Fab 단편이라 불리는 두 개의 동일한 항원 결합 단편과 나머지(residual) Fc 단편을 생성한다. 펩신 처리는 F(ab')2 단편 및 pFc' 단편을 생성한다.
단일클론성 항체는 중사슬 및/또는 경사슬의 일부가 특정 종으로부터 유래하거나 또는 특정 항체 종류(class) 또는 하위 종류(subclass)에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상동인 "키메라 항체"를 포함할 수 있으며, 사슬(들)의 나머지는 동일한 생물학적 활성을 나타내는 한 다른 종으로부터 유래하거나 또는 다른 항체 종류 또는 하위 종류에 속하는 항체뿐만 아니라 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상동이다.
또한, 항체 단편은 단편의 결합 활성이 비변형 항체 또는 항체 단편과 비교하여 현저하게 변경되거나 손상되지 않는다면, 특정 영역 또는 특정 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환 또는 다른 선택된 변형을 포함할 수 있다.
이들 변형은 이황화 결합이 가능한 아미노산을 제거/부가하고, 생체 수명(bio-longevity)을 증가시키고, 그것의 분비 특성을 변경하는 등과 같은 몇몇 부가적인 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경우든, 항체 단편은 결합 활성, 결합 도메인에서의 결합의 조절 등과 같은 생물활성(bioactive) 특성을 가져야 한다. 항체의 작용 또는 활성 영역은 단백질의 특정 영역의 돌연변이 유발(mutagenesis) 후 발현 및 발현된 폴리펩티드의 시험에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이며, 항체 단편을 암호화하는 핵산의 부위-특이적 돌연변이 유발(site-specific mutagenesis)을 포함할 수 있다.
항체는 인간화(humanized) 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 비인간(예를 들어, 쥣과) 항체의 인간화된 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래하는 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab' 또는 다른 항체의 항원-결합 하위 서열)이다.
인간화 항체는 수용(recipient) 항체의 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여(donor) 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수용 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크(framework, FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체에서도, 유입된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 적어도 하나의, 전형적으로는 두 개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 CDR 영역과 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 서열(consensus sequence)의 FR 영역이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다.
비인간 항체를 인간화하기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 공급원(source)으로부터 인간화 항체 내로 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입(import)" 잔기라 지칭되며, 이들은 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 받아들여진다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 수행될 수 있다. 따라서, "인간화" 항체는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 가변 도메인이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체된 키메라 항체이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
형질전환 동물(예를 들어, 마우스)은 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식선 돌연변이 마우스에서 항체 중사슬 연결 영역 유전자의 동형 접합 결실(homozygous deletion)은 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래하는 것이 기술된 바 있다. 이러한 생식선 돌연변이 마우스에서 인간 생식선 면역글로불린 유전자 배열(array)의 전달은 항원 유발(challenge)시에 인간 항체의 생산을 초래할 것이다. 또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서 생산될 수 있다.
항체는 약학적으로 허용 가능한 담체로 대상체에게 투여될 수 있다. 전형적으로, 제형을 등장성으로 만들기 위해 적절한 양의 약학적으로 허용 가능한 염이 제형에 사용된다.
약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 항체를 함유하는 고체 소수성 고분자의 반투과성 매트릭스와 같은 지속 방출성 제제도 사용될 수 있다. 예를 들어, 투여 경로 및 투여되는 항체의 농도에 따라 특정 담체가 더 바람직할 수 있음은 당업자에 명백할 것이다.
항체는 주사(예를 들어, 정맥 내, 복강 내, 흉강 내, 피하, 근육 내)에 의해, 또는 유효한 형태로 혈류에 확실히 전달되도록 하는 주입(infusion)과 같은 다른 방법에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 또한, 항체는 국소적 및 전신적 치료 효과를 발휘할 수 있도록 종양 내(intratumoral) 또는 종양 주위(peritumoral) 경로에 의해 투여될 수 있다.
유효 투여량 및 항체 투여 스케쥴은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 당해 분야의 기량 내에 있다. 당업자는 투여되어야 하는 항체의 투여량이 예를 들어, 항체를 투여할 대상체, 투여 경로, 사용되는 항체의 특정 유형 및 투여되는 다른 약물에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다.
단독으로 사용되는 항체의 전형적인 1일 투여량은 하루에 약 1 μg/kg 내지 최대 100 mg/kg 체중 이상의 범위일 수 있다.
항체 투여 후, 항체의 효능은 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 치료를 받는 대상체에서의 암세포의 규모, 수 및/또는 분포가 모니터링될 수 있다. 항체를 투여하지 않을 때 발생하는 질병의 경과와 비교하여, 종양 성장을 정지시키고, 종양 수축(shrinkage)을 초래하고/하거나 새로운 종양의 발생을 방지하는, 치료적으로 투여되는 항체는 암 치료에 효과적인 항체이다.
본 발명에 따르면, 항체는 5T4 특이적 항체이다.
5T4 특이적 항체는 예를 들어, R&D Systems(미국 미네소타 주), LifeSpan BioSciences, Inc(미국 워싱턴 주) 및 Creative Biolabs(미국 뉴욕 주)로부터 상업적으로 이용 가능하다.
또한, 5T4 특이적 항체의 예는 WO 98/55607, WO2001/036486, WO2003/038098, WO2006/031653, US2006/0088522, US2016/0185859, WO2007/106744, WO2012/131527 및 WO2013/068874에 기술되어 있다.
또한, 단일 사슬 항-5T4 항체 및 치료 분자에 융합된 항-5T4 항체 서열을 포함하는 융합 단백질이 기술된 바 있다. 예를 들어, 인간 IgG1 불변 도메인 또는 쥣과 B7.1의 세포 외 도메인에 융합된 항-5T4 항체 서열은 5T4를 발현하는 종양 세포주의 세포 용해(cytolysis)를 유도한다(Myers et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9: 884-96, Shaw et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1524: 238-46; 미국 특허출원 공개번호 2003/0018004). 유사하게는, 슈퍼항원(superantigen)에 융합된 단일 사슬 항-5T4 항체는 시험관 내에서 비소세포 폐 암종 세포의 T-세포 의존성 세포 용해를 자극할 수 있다(Forsberg et al. (2001) Br. J. Cancer 85: 129-36). 돌연변이된 슈퍼항원 스태필로코커스 엔테로사이토톡신 A(staphylococcal enterocytotoxin A, SEA)에 융합된 단일클론성 항체 5T4의 쥣과 Fab 단편인 PNU-214936을 이용한 1상 임상 시험은 제한된 세포독성 및 일부 항-종양 반응을 보여주었다(Cheng et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22(4):602-609). 또한, 이 제품의 3상 임상 시험은 Hawkins et al. Clin Cancer Res. 2016 Jul 1;22(13):3172-81. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-15-0580. Epub 2016 Feb 5에 공개되었다.
일 양태에서, 항체는 H8 항체(Hole and Stern 1988 Br. J. Cancer 57:239-246 참조), 또는 H8 항체를 기초로 한 항체일 수 있다. H8 항체는 5T4 항원의 입체형태(conformational) 에피토프(예를 들어, Shaw et al. (2002) Biochem. J. 363: 137-45, WO98/55607을 참조), 랫트 단일클론성 항체(Woods et al. (2002) Biochem. J. 366: 353-65) 및 5T4 마우스 단일클론성 항체(미국 특허번호 5,869,053)를 인식한다.
H8 5T4 특이적 항체는 예를 들어, R&D Systems로부터 상업적으로 이용 가능하다.
또 다른 양태에서, 5T4 항원과 결합하는 항체는 본 실시예에 기술된 바와 같은 2E4 항체 또는 2E4 항체를 기초로 한 항체일 수 있다.
2E4 항체의 서열은 서열번호 12에 기재되어 있다:
MEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNGATTYNQDFKDKASLTVDKSSSTASMELHSLTSEDSAVYYCALSTMITTAWFAYWGQGTLVTVSPGGGGSGGGGTGGGGSNFVMTQTPKFLLASAGDRVTISCKASQSVSNDVGWYQQKPGQSPKLLIYFASNRYTGVPDRFIGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPFTFGSGTKLEIK
펩티드 및 백신
암 항원 또는 암 항원으로부터의 펩티드를 함유하는 암 백신이 제안되었다.
본 발명은 혈액암 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 5T4 항원 또는 5T4 항원 펩티드를 포함하는 면역 조성물 또는 백신을 제공한다.
상기 논의된 바와 같이, 다양한 5T4 항원 분자의 서열이 당해 분야에 공지되어 있으며, 따라서 펩티드 또는 단백질이 본 발명에 따른 사용을 위하여 유래할 수 있다.
적합한 펩티드는 예를 들어, WO2000/029428, WO2006/120473, WO2007/034188, Mulryan et al. (2002) Mol. Cancer Ther. 1: 1129-37; 영국 특허출원 공개번호 2,370,571 및 2,378,704; EP 특허출원 공개번호 EP 1,160,323 및 1,152,060(이들은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같을 수 있다.
면역 조성물 또는 백신은 본 발명에 따른 혈액암의 치료 또는 예방을 위한 임의의 방법에 사용되거나 또는 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 면역 조성물 또는 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈액암을 치료 또는 예방하는 방법을 포괄한다.
용어 "펩티드"는 전형적으로 인접한 아미노산의 α-아미노기 및 카복실기 사이의 펩티드 결합에 의하여 서로 연결되는 일련의 잔기, 전형적으로는 L-아미노산을 의미하는 통상적인 의미로 사용된다. 이 용어는 변형 펩티드 및 합성 펩티드 유사체를 포함한다.
펩티드는 화학적 방법을 이용하여 제조될 수 있다(Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin.). 예를 들어, 펩티드는 고체상 기술에 의해 합성되고(Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204), 수지로부터 분리되고, 분취 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다(예를 들어, Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY). 예를 들어, ABI 43 1 A 펩티드 합성기(Perkin Elmer)를 이용하여 제조사에 의해 제공된 설명서에 따라 자동화된 합성이 이루어질 수 있다.
이 펩티드는 대안적으로는 재조합 수단에 의해, 또는 항원이거나 항원을 포함하는 폴리펩티드로부터의 절단(cleavage)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드의 구성은 아미노산 분석 또는 시퀀싱(예를 들어, Edman 분해 절차)에 의해 확인될 수 있다.
면역 조성물 또는 백신은 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물일 수 있다. 약학 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 제형은 예를 들어, 피부 내 또는 피하 투여, 또는 정맥 내, 또는 복강 내 주입에 적합한 형태일 수 있다. 예를 들어, 암 백신에 대한 논의는 Butterfield, BMJ. 2015 22;350를 참조.
조성물은 추가로 보조제를 포함할 수 있다. 보조제의 예는 알루미늄 염, 오일 에멀젼 및 박테리아 성분(예를 들어, LPS 및 리포솜)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일 양태에서, 백신은 5T4 항원을 펩티드, 단백질, 또는 대안적으로는 이 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 분자의 형태로 포함할 수 있다.
또한, 5T4 항원 백신은 세포의 맥락에서 전달될 수 있다. 예를 들어, 5T4 항원 또는 펩티드는 세포, 예를 들어 항원 제시 세포(antigen presenting cell) 상에 발현(expressed), 노출(pulsed) 또는 로드(loaded)될 수 있으며, 세포는 그 후 대상체에게 투여된다.
이것의 한 예는 항원(들) 또는 펩티드(들)가 노출되거나 로드된, 또는 하나, 2개 이상의 항원을 발현하도록 (DNA 또는 RNA 전달을 통해) 유전자 변형된 수지상 세포(dendritic cell) 백신이다(예를 들어, 상기 Butterfield 2015 참조). 수지상 세포 백신의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
본원에 논의된 바와 같은 백신에 따른 세포는 항원 제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포일 수 있다.
또한, 적합한 백신은 본원에 기술된 바와 같은 5T4 항원과 관련되는 DNA 또는 RNA 백신의 형태일 수 있다. 예를 들어, 5T4 항원을 암호화하는 DNA 또는 RNA, 또는 이로부터 유래한 펩티드 또는 단백질은 예를 들어, 대상체에게 직접 주사함으로써 백신으로서 사용될 수 있다. 하나 이상의 5T4 항원은 하나 이상의 항원을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 함유하는 박테리아 또는 바이러스 벡터를 통하여 전달될 수 있다.
본원에 설명되는 바와 같은 백신은 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 백신은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 전달 메커니즘에 의하여 전달될 수 있다. 백신은 벡터 전달 시스템의 사용을 수반할 수 있거나, 또는 벡터 전달 시스템은 필수적이지 않을 수 있다. 벡터는 바이러스 또는 박테리아 벡터일 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 또는 수두 바이러스로부터 유래할 수 있다. 리포솜은 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 또한, 리스테리아 백신 또는 전기천공법이 사용될 수 있다.
세포 기반 백신은 생체 외(ex vivo)에서 제조된 다음 대상체에게 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 표면에 5T4 펩티드와 같은 5T4 항원성 분자 또는 이의 일부를 발현하는 세포 또는 이의 집단을 제공하며, 세포는 혈액암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본원의 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다(또는 수득된다).
세포의 생체 내 투여를 위하여, 당해 분야에서 일반적이거나 표준적인 임의의 세포 집단의 투여 방식, 예를 들어 주사 또는 주입이 적절한 경로로 사용될 수 있다. 일 양태에서, 대상체 kg 당 1×104 내지 1×108개의 세포가 투여될 수 있다. 일 양태에서, 대상체 kg 당 약 107개 이하의 세포가 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 인간에서, 대상체 kg 당 0.1 내지 20×107개 세포의 용량이 복용량(dose)으로, 즉 용량당, 예를 들어 T 세포 또는 백신 접종 용량으로 투여될 수 있다. 일 양태에서, 대상체 kg 당 1×104 내지 1×105개 세포, 1×105 내지 1×106개 세포, 1×106 내지 1×107개 세포 또는 1×107 내지 1×108개의 세포가 투여될 수 있다. 백신 접종 적용을 위하여, 용량당 1 내지 20×106개 세포가 이용될 수 있다. 필요한 경우 이 용량은 나중에 반복될 수 있다.
또한, 백신은 5T4를 암호화하는 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있고, 바이러스 벡터, 항원 제시 세포 및 전기천공법을 포함하나 이에 한정되지 않는 추가의 방법에 의하여 전달될 수 있다.
본원에 기술된 면역 조성물 또는 백신은 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 5T4 펩티드와 같은 5T4 항원을 포함하는 면역 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈액암을 치료 또는 예방하는 방법을 포괄한다.
일 양태에서, 백신 접종은 치료적 백신 접종이다. 이 양태에서, 면역 조성물 또는 백신은 혈액암을 치료하기 위하여 혈액암에 걸린 대상체에게 투여된다.
추가의 양태에서, 백신 접종은 예방적 백신 접종이다. 이 양태에서, 면역 조성물은 혈액암 발생 위험이 있을 수 있는 대상체에게 투여된다.
일 양태에서, 백신은 이전에 혈액암을 앓았고 혈액암이 재발할 위험이 있는 대상체에게 투여된다.
면역 조성물에 사용되는 항원의 용량은 사용되는 항원에 따라 다를 수 있다. 단백질 항원의 생체 내 사용을 위하여, 용량은 0.5 내지 500 μg, 예를 들어 10 내지 100 μg 또는 10 내지 200 μg 범위일 수 있다. 펩티드 항원의 경우, 0.1 내지 4000 μg, 예를 들어 0.1 내지 2000 μg, 0.1 내지 1000 μg 또는 0.1 내지 500 μg, 예를 들어 0.1 내지 100 μg의 생체 내 용량이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 면역 조성물 또는 백신은 대상체에서 면역 반응의 생성을 초래할 수 있다. 생성될 수 있는 "면역 반응"은 체액성(humoral) 및/또는 세포 매개성(cell-mediated) 면역, 예를 들어 항체 생성의 자극, 또는 세포독성 또는 표면에 "외래(foreign)" 항원을 발현하는 세포를 인식하고 파괴(또는 제거)할 수 있는 살해 세포(killer cell)의 자극일 수 있다. 따라서, 용어 "면역 반응을 자극하는 것"은 모든 종류의 면역 반응 및 이를 자극하는 메커니즘을 포함하며, 본 발명의 바람직한 양태를 형성하는 CTL 자극을 포괄한다. 바람직하게는, 자극되는 면역 반응은 세포독성 CD8 T 세포 및 헬퍼(helper) CD4+ T 세포이다. 면역 반응의 정도는 면역 반응의 마커, 예를 들어 IL-2 또는 IFNγ와 같은 분비된 분자 또는 항원 특이적 T 세포의 생성에 의해 평가될 수 있다.
일 양태에서, 트로박스(TroVax®) 백신이 사용될 수 있다.
트로박스(Oxford BioMedica plc)는 변형된 백시니아 앙카라(Modified Vaccinia Ankara, MVA)로 일컫는 우두 바이러스(vaccinia virus, VV)의 고도로 약화된 균주로 구성되며, 변형된 프로모터 mH5의 조절 제어하에 인간 5T4 당단백질 유전자를 함유한다. (예를 들어, Amato et al. Clin Cancer Res; 16(22) November 15, 2010; Harrop et al. Cancer Immunol Immunother. 2012 Dec;61(12):2283-94; Harrop R et al. Cancer Immunol Immunother. 2013 Sep;62(9):1511-20, WO 2000/29428, WO 2010/007365, WO 2010/079339, 및 WO 2012/059750 참조.)
트로박스는 본원에 기술된 방법 및/또는 용도에 사용될 수 있다.
이종 프라임 부스트 백신 접종(heterologous prime boost vaccination) 계획이 WO 98/56919(CD8+ T 세포 에피토프의 공급원으로서 상이한 프라이머 및 부스터 조성물을 이용하는, 표적 항원에 대한 방어적 CD8+ T 세포 면역 반응의 생성) 또는 WO 2001/021201(프라이밍(priming) 조성물의 사전 투여 후, 개체에게 항원에 대한 CD8+ T 세포 면역 반응을 증폭시키기 위한 항원 또는 항원의 CD8+ T 세포 에피토프를 암호화하는 복제-결핍 아데노바이러스 벡터의 사용)에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 프라이밍 조성물은 항원 또는 에피토프, 또는 항원 또는 에피토프를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있고, DNA, Ty-LVP'S 또는 변형된 백시니아 앙카라(MVA)일 수 있으며, WO 2012/172277(면역 반응을 유발하거나 증폭시키기 위한 침팬지 아데노바이러스를 이용함)이 5T4를 표적화하는 백신의 투여를 위하여 사용될 수 있다.
세포 치료법
추가의 양태에서, 본 발명은 대상체에서 혈액암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 5T4를 인식하는 세포, 바람직하게는 T 세포 또는 자연 살해(Natural Killer, NK) 세포 또는 NK T 세포와 같은 면역 세포를 제공한다. 대안적으로, 본 발명은 대상체에서 혈액암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 5T4를 인식하는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 면역 세포의 용도를 제공한다. 추가의 대안에서, 본 발명은 대상체에서 혈액암을 치료 또는 예방하는데 있어서 5T4를 인식하는 면역 세포, 바람직하게는 T 세포의 용도를 제공한다. 일 양태에서, 이러한 5T4 표적화 세포는 종양 침윤성 림프구(tumour infiltrating lymphocyte, TIL)이다. 일 양태에서, 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
"면역 세포"에 대한 언급은 면역계의 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포 또는 수지상 세포를 포괄하고자 하는 것이다. 일 양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 추가의 양태에서, 면역 세포는 NK 세포 또는 NKT 세포이다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 혈액암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 5T4를 인식하는 세포의 집단을 제공한다. 대안적으로, 본 발명은 대상체에서 혈액암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 5T4를 인식하는 세포 집단의 용도를 제공한다. 추가의 대안에서, 본 발명은 대상체에서 혈액암을 치료 또는 예방하는데 있어서 5T4를 인식하는 세포 집단의 용도를 제공한다. 일 양태에서, 세포는 본원에 기술된 바와 같은 면역 세포이다. 바람직하게는, 세포는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포이다.
세포 또는 세포 집단은 조성물, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 약학 조성물의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 다른 약학적 활성제 또는 약물, 예컨대 화학요법제, 예를 들어 아스파라기나아제(asparaginase), 부설판(busulfan), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 플루오로우라실(fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(paclitaxel), 리툭시맙(rituximab), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 등을 더 포함한다.
또한, 일부 양태에서 완충제가 조성물에 포함될 수 있다. 적합한 완충제는 예를 들어, 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨 및 다양한 기타 산 및 염을 포함한다. 일부 양태에서, 2종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)에 더욱 상세히 기술되어 있다.
입양 세포 치료법을 위한 세포 투여 방법은 공지되어 있으며, 제공되는 방법 및 조성물과 연계하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 치료방법은 예를 들어, Gruenberg 등의 미국 특허출원 공개번호 2003/0170238; Rosenberg의 미국 특허번호 4,690,915; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)에 기술되어 있다. 예를 들어, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338 참조.
세포 치료법은 자가 이식(autologous transfer)에 의해 수행될 수 있으며, 이때 세포는 세포 치료법을 받을 대상체 또는 이러한 대상체로부터 유래한 샘플로부터 분리되고/되거나 제조된다. 따라서, 일 양태에서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 환자로부터 유래하며, 후에 분리 및 처리되어 동일한 대상체에게 투여된다.
대안적으로, 세포 치료법은 동종이계 이식(allogeneic transfer)에 의해 수행될 수 있으며, 이때 세포는 세포 치료법을 받을 대상체 또는 궁극적으로 세포 치료법을 받는 대상체, 예를 들어 제1 대상체 이외의 대상체로부터 분리되고/되거나 그렇지 않으면 제조된다. 이러한 구현예에서, 세포는 그 후 동일한 종의 상이한 대상체, 예를 들어 제2 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스 또는 상위 유형(supertype)을 발현한다. 대안적인 구현예에서, 동종이계 T 세포는 기능적 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 및/또는 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II와 같은 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA)이 결여될 수 있다.
일부 구현예에서 약학 조성물은 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양으로, 예컨대 치료학적 유효량 또는 예방적 유효량으로 세포를 포함한다. 일부 구현예에서 치료적 또는 예방적 효능은 치료되는 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링 된다. 수일 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 상태에 따라, 원하는 질병 증상의 억제가 발생할 때까지 치료는 반복된다. 그러나 다른 투여 계획이 유용할 수 있으며 결정될 수 있다. 원하는 투여량은 조성물의 단일 볼루스 투여에 의해, 조성물의 다중 볼루스 투여에 의해, 또는 조성물의 연속적인 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
또한, 본 발명은 5T4를 표적으로 하는 세포 집단을 제공하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
i) 대상체로부터 분리된 샘플로부터 세포를 분리하는 단계; 및
ii) 세포를 증식시켜 5T4를 표적으로 하는 세포 집단을 제공하는 단계
를 포함한다.
일 양태에서, 세포는 T 세포이다. 일 양태에서, 세포는 NK 또는 NKT 세포이다.
샘플은 대상체로부터의 종양, 혈액 또는 조직 샘플일 수 있다.
일 구현예에서, 세포가 분리되는 샘플은 혈액 샘플, 종양 샘플, 종양 관련 림프절 샘플 또는 전이 부위로부터의 샘플일 수 있다.
세포가 T 세포일 때, T 세포의 집단은 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 포함할 수 있다.
생성된 세포 집단에는 (예를 들어, 대상체로부터 분리된 샘플과 비교하여) 증가된 수의 5T4를 표적으로 하는 세포가 있을 수 있다.
T 세포는 예를 들어, 면역 조절 수용체(Lag 3, PD1, TIGIT, PD-L1, BTLA, CTLA4, TGF베타 수용체, IL10 수용체를 포함하나 이에 한정되지 않음)의 유전자 편집에 의해 면역 억제에 내성이 있게될 수 있다.
일 양태에서, 유전자 조작된 세포, 예컨대 표적 항원에 특이적으로 결합하는 유전자 조작된 항원 수용체를 포함하는 유전자 조작된 면역 세포인 세포가 사용될 수 있다. 변형에 적합한 세포는 대상체, 예컨대 인간 대상체를 포함하나 이에 한정되지 않는 포유동물 대상체로부터 얻을 수 있다. 세포는 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell), 골수(bone marrow), 림프절 조직(lymph node tissue), 제대혈(cord blood), 흉선 조직(thymus tissue), 감염 부위로부터의 조직, 복수(ascite), 흉막 삼출액(pleural effusion), 비장 조직(spleen tissue) 및 종양(tumour)을 포함하는, 당업자에게 공지된 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 적합한 세포로는 면역계의 세포, 예컨대 선천성(innate) 또는 적응성(adaptive) 면역계의 세포(예를 들어, 골수성, 또는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 림프구 세포를 포함하는 림프구성 세포)를 포함한다. 다른 적합한 세포로는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 포함하는 다분화능(multipotent) 및 만능 줄기세포와 같은 줄기세포를 포함한다. 일 양태에서, 세포는 대상체로부터 직접 분리되고/되거나 대상체로부터 분리되어 동결된 것과 같은, 일차 세포(primary cell)이다.
특정 양태에서, 적합한 세포는 Ficoll 분리법과 같은 당업자에게 공지된 다수의 기술을 이용하여 포유동물 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 얻을 수 있다. 일 양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술(apheresis)에 의해 수득된다. 성분채집술 산물은 전형적으로 T 세포를 포함하는 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하기 위하여 세척될 수 있으며, 선택적으로 후속 처리 단계를 위하여 적절한 완충액 또는 매질에 있을 수 있다. 세포는 예를 들어, 인산 완충 식염수로 세척될 수 있다. 칼슘의 부존재는 T 세포의 활성화를 증가시킬 수 있으므로, 특정 구현예에서 세척액은 칼슘 및/또는 마그네슘이 없거나, 많은 또는 모든 2가 양이온이 없을 수 있다.
세포는 Miltenyi CD25 마이크로비드와 같은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 T 조절 세포(CD25+ 세포)가 고갈될 수 있다. CD25+ 세포의 고갈은 성분채집술 이전에 또는 CAR 발현 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 생산 중에 수행될 수 있다. 또한, CAR을 발현하는 세포의 증식 및/또는 기능에 부정적인 영향을 미치는 다른 세포 유형이 제거될 수 있다. 이러한 면역 억제 세포는 CD14, CD11b, CD33, CD15 또는 다른 면역 억제 세포의 마커를 발현하는 세포를 포함하고, 세포 표면 마커를 대상으로 하는 단일클론성 항체를 이용하는 자기 면역부착(magnetic immunoadherence) 또는 유세포 분석법(flow cytometry)과 같은 당업자에게 공지된 방법을 이용함으로써 세포의 집단으로부터 제거될 수 있다.
세포는 또한 하나 이상의 체크포인트 억제제(check-point inhibitor), 예를 들어 PD1, CD223 (LAG3), PD-L1 및 CTLA4, PD-L2, TIM3, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, CD276(B7-H3), B7-H4(VTCN1), CD270(HVEM 또는 TNFRSF14), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GALS, 아데노신, TGF베타 수용체를 발현하는 세포가 고갈될 수 있다. 세포 집단은 T 조절 세포의 고갈과 동시에 하나 이상 체크포인트 억제제를 발현하는 세포가 고갈될 수 있다.
T 조절 세포, 면역 억제 세포 및 체크포인트 억제제를 발현하는 세포의 고갈은 예를 들어, 이러한 T 조절 세포, 면역 억제 세포 또는 체크포인트 억제제를 인식하는 여러 항체를 발현하는 비드 또는 이러한 항체를 발현하는 비드의 혼합물을 이용하여 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 다른 결합 모이어티, 및 항-체크포인트 억제제 항체 또는 이의 단편, 또는 다른 결합 모이어티는 동시(simultaneous) 고갈을 위해 동일한 비드 또는 개별적인 비드의 혼합물에 부착될 수 있다. 대안적으로, 특정 세포 유형의 고갈은 순차적으로 수행될 수 있다.
일 양태에서, 세포는 예를 들어, 항-CD3/항-CD28이 컨쥬게이트된 비드(예를 들어, Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28) 또는 다른 적합한 시약과의 항온처리에 의하여 적극적으로(positively) 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 친화도 기반 선택(affinity-based selection)은 자기 활성화 세포 분류법(magnetic-activated cell sorting, MACS)(Miltenyi Biotec, 미국 캘리포니아 주 오번)을 통해서 이루어진다. MACS 시스템은 자성 입자가 부착된 세포를 고순도로 선택할 수 있다. MACS는 외부 자기장의 인가(application) 후 표적 및 비표적 세포가 순차적으로 용리되는 방식으로 작동할 수 있다. 비부착된 세포가 용리되는 동안 자성 입자에 부착된 세포는 유지되고, 그 후 자기장에 유지되었던 세포가 또한 용리될 수 있다. 특정 양태에서, 폐사슬 시스템은 예를 들어, 취급을 줄이기 위해 분리(isolation), 세포 제조, 분리(separation), 처리, 항온처리, 배양 및/또는 제형화 중 하나 이상을 수행하는데 사용된다. 폐사슬 시스템은 WO 2009/070003 또는 WO 2009/072003에 기술되어 있다.
면역세포는 예를 들어, WO 01/62895, WO 2016/196388, EP1586655, US 5,199,942, US 6,352,694, US 7,144,575, US 7,067,318, US 7,172,869, US 7,572,631에 기술된 바와 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 생체 외 또는 시험관 내에서 활성화되고 증식될 수 있다. 말초 혈액 채취물 또는 골수 이식물로부터 포유동물의 CD34+ 조혈 줄기세포 및 전구체 세포(progenitor cell)의 수집 후, 이러한 세포는 특정 성장 인자의 존재하에 생체 외에서 증식될 수 있다. WO 92/21402에 기술된 성장 인자 이외에도, flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드와 같은 다른 인자도 세포 배양 및 증식에 사용될 수 있다.
면역세포의 집단은 표면에 부착되는 작용제(agent) 및/또는 리간드, 예를 들어 항원 제시 세포에 의해 제시되는 것과 같은 5T4 항원과의 접촉에 의해 증식될 수 있다. 대안적으로, 이러한 작용제는 신호와 관련된 CD3/TCR 복합체를 자극할 수 있고, 리간드는 세포 표면에 존재하는 공동자극 분자를 자극할 수 있다. 일 양태에서, T 세포 집단은 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이온운반체(ionophore)와 함께 단백질 키나아제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)과의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포 표면상의 보조 분자(accessory molecule)의 공동자극을 위하여, 보조 분자와 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위하여, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 면역 세포(예컨대, PBMC 또는 T 세포)는 세포를 항-CD3 항체 및 IL-2 중 하나에 접촉시킴으로써 증식되며 자극된다. 세포는 항-CD3 또는 항-CD28 비드 없이 증식될 수 있다.
일 양태에서, 2개의 작용제는 동일한 비드 또는 별개의 비드 중 어느 하나의 비드상에 고정된다. 예로서, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 공동자극 신호를 제공하는 작용제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며; 두 작용제는 동일한 비드에 동시에 고정화된다. 일 양태에서, 동등한 분자량(qeuivalent molecular amount)의 각 항체가 비드에 결합되어 CD4+ T 세포 증식 및 T 세포 성장을 자극한다. 특정 양태에서, CD3:CD28 항체의 비율은 이러한 항체를 1:1의 비율로 이용하여 관찰되는 증식과 비교하여 T 세포 증식의 증가가 관찰되도록 비드에 결합된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율은 100:1 내지 1:100의 범위이다. 일 양태에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 사용된다.
추가의 양태에서, T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포와 같은 세포는 작용제가 코팅된 비드와 결합되며, 비드와 세포가 나중에 분리된 다음, 세포가 배양된다. 대안적으로, 배양 전에 작용제가 코팅된 비드와 세포는 함께 배양된다. 대안적으로, 비드와 세포는 먼저 세포 표면 마커의 결합을 증가시키는 자기력(magnetic force)과 같은 힘의 적용에 의해 농축되어 세포 자극을 유도한다. 특정 양태에서, 비드는 상자성 비드(paramagnetic bead)(예컨대, Dynabeads 또는 MACS 비드)이다.
일부 양태에서, 분리 및/또는 다른 단계는 CliniMACS 시스템(Miltenyi Biotec)을 이용하여 수행된다.
일 양태에서, CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포가 증식된다. 세포는 몇 시간 내지 약 14일의 기간 동안 배양액에서 증식될 수 있다. 특정 양태에서, 특히 여러 사이클의 자극이 수행되는 경우, 세포는 14일을 초과하여 증식될 수 있다.
세포 배양에 적합한 조건은 당업자에게 공지될 것이며, 적합한 배양 배지(예를 들어, 최소 필수 배지(minimal essential medium, MEM), DMEM, α-MEM, F12, RPMI 1640, X-vivo 15, X-vivo 20, Optimzer, AIM-V, TexMACs)의 사용을 포함할 것이다. 배양 배지는 혈청(인간 혈청 또는 소 태아 혈청), IL-2, 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, TNF-α, 또는 세포의 증식 및 생존능력을 증가시키는 것으로 당업자에 의해 공지된 임의의 다른 이러한 첨가제와 같은, 세포의 증식 및 생존능력을 향상시키는 인자를 함유할 수 있다. 세포는 성장을 지지하는 데 필수적인 조건, 예를 들어 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기 플러스 5% CO2) 하에 유지될 것이다.
본원에 기술된 세포는 5T4와 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR), 또는 5T4와 특이적으로 결합하는 친화도 증진된(affinity-enhanced) TCR을 발현할 수 있다. 따라서, 세포는 5T4 특이적인 CAR 또는 TCR을 발현하도록 조작될 수 있다.
일 양태에서, 조작된 세포의 항원-결합 모이어티는 키메라 T 세포 수용체(TCR)이다. 이러한 TCR은 재조합 TCR 또는 자연 발생적인 T 세포로부터 클로닝된 TCR일 수 있다.
따라서 5T4 표적화를 위한 추가의 옵션은 5T4에 대해 특이적인 CAR 또는 TCR을 발현하는 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포의 사용을 수반한다.
세포는 특정 항원에 특이적이도록 생체 외에서 유전자 조작될 수 있으며, 자가 항원 특이적 세포가 대상체에게 투여된다.
CAR 및 TCR은 아래에서 더욱 상세히 논의되지만, 세포 내로의 유전자 성분(예컨대, CAR 또는 TCR)의 도입을 위한 다양한 방법이 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 방법은 예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 이용하는 바이러스 형질도입, 트랜스포존, 전기천공법, 및 징크 핑거 단백질(zinc finger protein)과 같은 DNA 표적화 단백질, 엔도뉴클레아제와 같은 이펙터 단백질에 융합된 전사 활성화 인자 유사 단백질(transcription activator-like protein)(예를 들어, TALE 및 TALENS)을 포함한다(June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10; 704-716).
일부 양태에서, 유전자 전달(gene transfer)은 세포 성장 및/또는 활성화를 먼저 자극한 다음, 세포 형질도입 후에 이어 변형된 세포를 임상 적용에 충분한 수로 증식시킴으로써 달성된다.
재조합 핵산은 재조합 감염성 바이러스 입자를 이용하여 세포 내로 전달될 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 전이 유전자(transgene)의 장기적인 안정한 통합(integration) 및 딸 세포에서의 이의 전파(propagation)를 가능하게 하므로, 장기적인 유전자 전달을 달성하기에 적합하다. 또한, 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 비-분화(non-dividing) 세포를 형질도입할 수 있다.
적합한 레트로바이러스 벡터는 쥣과 백혈병 바이러스(Murine Leukaemia Virus, MLV), 비장 병소 형성 바이러스(Spleen-Focus Forming Virus, SFFV)와 같은 γ-레트로바이러스(γ-retrovirus), 인간 T 세포 백혈병 바이러스(human T-cell leukaemia virus, HTLV), 마우스 유방 종양 바이러스(mouse mammary tumour virus, MMTV), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV), 후지나미 육종 바이러스(Fujinami sarcoma virus, FuSV), 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(Moloney murine leukaemia virus, Mo MLV), FBR 쥣과 골육종 바이러스(FBR murine osteosarcoma virus, FBR MSV), 몰로니 쥣과 육종 바이러스(Moloney murine sarcoma virus, Mo-MSV), 아벨슨 쥣과 백혈병 바이러스(Abelson murine leukaemia virus, A-MLV), 조류 골수구종증 바이러스-29(Avian myelocytomatosis virus-29, MC29) 및 조류 적아세포증 바이러스(Avian erythroblastosis virus, AEV) 및 골수증식성 육종 바이러스(Myelopoliferative Sarcoma Virus, MPSV)로부터 유래하는 것들을 포함한다. 레트로바이러스의 상세한 목록은 Coffin et al. (1997) "Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763에서 찾아볼 수 있다. 적합한 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스(visna lentivirus)로부터 유래할 수 있고, US 6,924,123, US 7,056,699, WO 98/17815, WO 99/32646, WO 01/79518, WO 03/064665, US 6,969,598에 기술되어 있다.
또한, 벡터는 벡터 생산 중에 전이 유전자의 발현을 방지하는, WO 2015/092440에 기술된 TRiP 시스템을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 세포를 형질도입하는데 적합한 다른 벡터는 시미안 바이러스 40(simian virus 40, SV40), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus, AVV)로부터 유래하는 벡터를 포함한다. (예를 들어, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November ; 29(11): 550-557 참조).
재조합 핵산은 전기천공법(electroporation) 또는 전위법(transposition)을 통해 본원에 기술된 세포 내로 전달될 수 있다. 면역세포에 유전 물질을 도입하고 발현시키는 방법으로는 인산칼슘 형질감염(calcium phosphate transfection)(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에서 기술된 바와 같음), 원형질체 융합(protoplast fusion), 양이온성 리포솜 매개 형질감염(cationic liposome-mediated transfection); 텅스텐 입자-촉진 미세입자 충격법(tungsten particle-facilitated microparticle bombardment)(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 인산스트론튬 DNA 공동침전법(strontium phosphate DNA co- precipitation)(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다.
또한, 유전자 조작된 세포를 생산하기 위한 방법, 핵산, 조성물 및 키트가 제공된다. 유전자 조작은 유전자 조작된 성분, 또는 유전자 교란 단백질(gene-disruption protein) 또는 핵산을 암호화하는 성분을 암호화하는 핵산과 같은 세포 내 도입을 위한 다른 성분의 도입을 수반할 수 있다.
TCR 및 친화도 증진 TCR을 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 친화도 증진 TCR은 펩티드-MHC 복합체에 대한 친화도가 증진된(예를 들어, 환자 샘플(예를 들어, 환자 말초 혈액 또는 TIL)로부터의 TCR을 암호화하는 TCR 유전자의 분리 및 TCR 서열의 변형(예를 들어, 시험관 내 돌연변이 유발 및 증진된 친화도(또는 친화도 성숙) TCR의 선별에 의함)을 통한 펩티드-MHC 복합체에 대한 TCR 친화도의 향상을 포함함) TCR이다. 이러한 TCR 유전자를 세포(예컨대, T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포) 내로 도입하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 다양한 인간 TCR 레퍼토리를 가지고 있는 항원-음성 인간화 형질전환 마우스(예를 들어, ABabDII 마우스와 같은 TCR/MHC 인간화 마우스)의 항원으로의 면역화 및 이러한 면역화된 형질전환 마우스로부터의 항원 특이적 TCR의 분리를 포함하는 최적 친화도(optimal-affinity) TCR의 식별 방법 또한 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Obenaus M et al., Nat Biotechnol. 33(4):402-7, 2015 참조). 일부 양태에서, 예를 들어 WO 2004/044004에 기술된 방법 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 고친화성 TCR이 생성된다.
본원에 기술되는 본 발명에 따른 특정 양태에서, 세포 또는 세포 집단 또는 조성물은 예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 세포의 분리 및 증식 후에 대상체 내로 재주입된다. 이를 달성하기에 적합한 방법은 본원에 기술되어 있으며, 당업자에게도 공지될 것이다. 예를 들어, T 세포의 생성, 선별 및 증식 방법은 예를 들어, Dudley J Immunother. 2003; 26(4): 332-342, 및 Rosenberg et al. 2011 Clin Cancer Res:17(13):4550-7을 참조한다. T 세포 재주입 방법은 Dudley et al. Clin Cancer Res. 2010 Dec 15; 16(24): 6122-6131 및 Rooney et al. Blood. 1998 Sep 1;92(5):1549-55에 기술되어 있다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈액암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 세포 조성물은 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포 조성물일 수 있다.
방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(i) 대상체로부터의 샘플을 함유하는 세포를 분리하는 단계;
(ii) 5T4를 표적으로 하는 세포 집단을 증식시키는 단계; 및
(iii) 단계 (ii)로부터의 세포를 대상체에게 투여하는 단계.
세포는 예를 들어, 5T4 특이적 CAR 또는 TCR을 이용하여, 본원에 기술된 바와 같이 5T4를 표적화하도록 조작될 수 있다.
따라서, 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(i) 샘플을 함유하는 세포를 분리하는 단계;
(ii) 세포를 5T4를 인식하는 CAR 또는 TCR을 발현하도록 조작하여 5T4를 표적화하는 세포 집단을 제공하는 단계;
(iii) 조작된 세포를 증식시키는 단계; 및
(iv) 단계 (ii) 또는 (iii)으로부터의 세포를 대상체에게 투여하는 단계.
방법은 단계 (ii) 이전에 선택적인 증식 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 혈액암에 걸린 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(i) 혈액암에 걸린 환자를 식별하는 단계; 및
(ii) 선택적으로 이러한 환자의 혈액암 세포가 5T4 항원을 발현하는지 여부를 결정하는 단계; 및
(iii) 본원에 정의된 바와 같은 세포 또는 세포 집단(또는 임의의 5T4 표적화제)를 상기 환자에게 투여하는 단계.
T 세포가 사용되는 경우, 5T4 반응성 T 세포의 증식된 집단은 예를 들어, 5T4 펩티드를 사용하여 증식되지 않은 T 세포의 집단보다 높은 활성을 가질 수 있다. "활성"에 대한 언급은 5T4 펩티드, 또는 항원, 예를 들어 증식에 사용되는 펩티드에 상응하는 펩티드로의 재자극에 대한 T 세포 집단의 반응을 나타낼 수 있다. 적합한 반응 분석 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 사이토카인 생성이 측정될 수 있다(예를 들어, IL2 또는 IFNγ 생성이 측정될 수 있음). "더 높은 활성"에 대한 언급은 예를 들어, 1 내지 5배, 5 내지 10배, 10 내지 20배, 20 내지 50배, 50 내지 100배, 100 내지 500배, 500 내지 1000배의 활성의 증가를 포함한다.
친화도 증진 TCR은 원하는 표적 특이성을 갖는 TCR α 및 β 사슬이 클로닝되는 T 세포 클론을 확인함으로써 생성될 수 있다. 그 후, 후보 TCR은 α 및 β 사슬의 상보성 결정 영역에서 PCR 특이적 돌연변이 유발(PCR directed mutagenesis)을 거친다. 각 CDR 영역의 돌연변이를 스크리닝하여 비변성(native) TCR에 비해 증진된 친화도를 갖는 돌연변이체를 선별한다. 완료 시, 리드 후보를 벡터 내로 클로닝하여 친화도 증진 TCR을 발현하는 T 세포에서의 기능적 시험을 가능하게 한다.
CAR은 통상적인 형식으로, 단일클론성 항체(mAb)의 특이성을 T 세포의 효과기 기능에 접목하는 단백질이다. 이들의 통상적인 형태는 항원 인식 아미노 말단(antigen recognizing amino terminus), 스페이서(spacer), 막관통 도메인(transmembrane domain)이 모두 T 세포 생존 및 활성화 신호를 전달하는 화합물 엔도도메인(endodomain)에 연결된 I형 막관통 도메인 단백질의 형태이다.
이들 분자의 가장 일반적인 형태는 표적 항원을 인식하기 위하여 단일클론성 항체로부터 유래하는 단일-사슬 가변 단편(single-chain variable fragment, scFv)을 사용한다. scFv는 스페이서 및 막관통 도메인을 통해 신호전달 엔도도메인에 융합된다. 이러한 분자는 세포의 활성화를 초래하며, 여기서 이들은 그 표적의 scFv에 의한 인식에 반응하여 발현된다. 세포가 이러한 CAR을 발현할 때, 이들은 표적 항원을 발현하는 표적 세포를 인식하고 살해한다. 종양 관련 항원에 대해 여러 CAR이 개발되었으며, 이러한 CAR 발현 세포를 이용하는 입양 이식 접근법이 현재 다양한 암 치료를 위하여 임상 시험 중에 있다. CAR은 예를 들어, WO 2014/031687에 기술되어 있다.
일부 양태에서, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 항체 부분은 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역과 같은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역을 더 포함한다. 일부 양태에서, 불변 영역의 일부는 항원 인식 성분, 예를 들어 scFv, 및 막관통 도메인 사이에서 스페이서 영역으로서 작용한다. 스페이서는 스페이서 부존재 시의 반응성과 비교하여, 항원 결합 후에 세포 반응성을 증가시키는 길이일 수 있다. 예시적인 스페이서는 WO 2014/031687에 기술된 스페이서를 포함한다. 스페이서는 약 10 내지 200개 아미노산 길이로 다양할 수 있다.
항원 인식 도메인은 일반적으로 예컨대 CAR의 경우, TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체 및 선택적으로 관련된 공동자극 신호, 및/또는 또 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 통해 활성화를 모방하는 신호전달 성분과 같은 하나 이상의 세포 내 신호전달 성분에 연결된다. 따라서, 일부 양태에서, 항원-결합 성분은 하나 이상의 막관통 및 세포 내 신호전달 도메인에 연결된다. 일부 양태에서, 막관통 도메인은 세포 외 도메인에 융합된다. 일 양태에서, 수용체의 도메인 중 하나와 자연적으로 연결되어 있는 막관통 도메인이 사용된다. 일부 예에서, 막관통 도메인은 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형되어, 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하는 것을 방지하여, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화한다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 천연 공급원으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래한다. 공급원이 천연인 경우, 일부 양태의 도메인은 임의의 막결합 또는 막관통 단백질로부터 유래한다. 막관통 영역은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론(epsilon), CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154로부터 유래하는 것들을 포함한다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성 도메인일 수 있다. 일부 양태에서, 합성 막관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛(triplet)이 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 양태에서, 결합은 링커, 스페이서 및/또는 막관통 도메인을 통해 이루어진다.
재조합 수용체의 적합한 세포 내 신호전달 도메인은 천연 항원 수용체를 통한 신호(예를 들어, CD3 신호), 공동자극 수용체와 조합된 이러한 수용체를 통한 신호(예를 들어, CD3/CD28 신호) 및/또는 공동자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 이와 비슷한 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커가 존재하며, 이는 막관통 도메인 및 CAR과 같은 재조합 수용체의 세포질 신호전달 도메인 사이에 결합을 형성한다.
CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로 적어도 하나의 세포 내 신호전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 양태에서, 수용체는 T 세포 활성화 및 세포독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예컨대 CD3 제타 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포 내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호전달 도메인에 연결된다. 일부 양태에서, 세포 신호전달 도메인은 CD3 막관통, CD3 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 다른 CD 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서 수용체는 하나 이상의 추가의 분자, 예컨대 Fc 수용체 γ CD8, CD4, CD25 또는 CD16의 일부를 더 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 키메라 수용체는 CD3-제타(CD3-ζ) 또는 FC 수용체 γ 및 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이에 키메라 분자를 포함한다.
일부 양태에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체의 결합 시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포 내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 정상적인 효과기 기능 또는 면역세포의 반응, 예컨대, 세포용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 예컨대 사이토카인 또는 다른 인자의 분비를 활성화한다. 일부 양태에서, 항원 수용체 성분 또는 공동자극 분자의 세포 내 신호전달 도메인의 절단된 부분은 예를 들어, 그것이 효과기 기능 신호를 전달하는 경우, 온전한 면역자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 양태에서, 세포 내 신호전달 도메인 또는 도메인들은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열을 포함하며, 일부 양태에서는, 자연스러운 맥락에서 항원 수용체 결합(engagement) 후 신호 전달을 개시하기 위해 이러한 수용체와 협력하여 공동 수용체의 세포질 서열도 포함한다.
천연 TCR의 경우, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호전달뿐만 아니라 공동자극 신호 또한 요구한다. 따라서, 일부 양태에서, 완전한 활성화를 촉진하기 위하여, 제2 또는 공동자극 신호를 생성하기 위한 성분이 또한 CAR에 포함된다. 다른 양태에서, CAR은 공동자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 추가의 CAR은 동일한 세포에서 발현되며, 제2 또는 공동자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
T 세포 활성화는 일부 양태에서, 2가지 부류의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개되는 것으로 기술된다: TCR을 통한 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 서열(1차 세포질 신호전달 서열) 및 항원-비의존성 방식으로 작용하여 제2 또는 공동자극 신호를 제공하는 서열(2차 세포질 신호전달 서열). 일부 양태에서, CAR은 이러한 신호전달 성분 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
일부 양태에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 자극성 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAMs)라 알려져 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. TCR 제타, FcR 감마, GcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d는 ITAM을 함유하는 1차 세포질 신호전달 서열의 예이다. 특정 양태에서, CAR의 세포질 신호전달 도메인은 CD3 제타로부터 유래하는 서열을 포함한다.
특정 양태에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS와 같은 신호전달 도메인 및/또는 막관통 부분를 포함한다. 일부 양태에서, 동일한 CAR은 활성화 성분 및 공동자극 성분 둘 다를 포함한다.
일부 양태에서, 활성화 도메인은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 공동자극 성분은 상이한 항원을 인식하는 또 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 양태에서, CAR은 동일한 세포상에서 발현되는 활성화 또는 자극성 CAR, 공동자극 CAR을 포함한다(WO 2014/055668 참조). 일부 양태에서, 세포는 하나 이상의 자극성 또는 활성화 CAR 및/또는 공동자극 CAR을 포함한다. 다른 양태에서, 세포는 질병 또는 상태와 관련되고/되거나 이에 특이적인 항원 이외의 항원을 인식하는 것에 의해 질병 표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 신호가, 예를 들어 표적-외(off-target) 효과를 감소시키기 위해, 억제성 CAR의 리간드에 대한 결합에 의해 감소되거나 억제되는 CAR과 같은 억제성 CAR을 더 포함한다(iCAR, Fedorov et al 2013, Sci Transl Med. 5: 215 참조).
특정 양태에서, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3(예를 들어, CD3-제타) 세포 내 도메인에 연결된 CD28 막관통 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3 제타 세포 내 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB/TNFRSF9) 공동자극 도메인을 포함한다.
일부 양태에서, CAR은 하나 이상의 공동자극 도메인 및 활성화 도메인, 예를 들어 세포질 부분의 1차 활성화 도메인을 포괄한다. 예시적인 CAR은 CD3 제타, CD28 및 4-1BB를 포함한다.
특정 양태에서, CAR은 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포 외 부분 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함하며, 세포 내 도메인은 ITAM을 함유한다. 일부 양태에서, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3-제타 사슬의 제타 사슬의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 세포 외 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다. 일부 양태에서, CAR은 T 세포 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 함유한다. 일부 양태에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
본원에 사용되는 용어 "T 세포 수용체(T cell receptor)" 또는 "TCR"은 항원 제시에 반응하여 T 세포의 활성화에 참여하는 막 단백질의 복합체를 지칭한다. TCR은 주요 조직적합성 복합체 분자에 결합되는 항원을 인식하는 역할을 한다. TCR은 알파(a) 및 베타(β) 사슬의 이종이량체(heterodimer)로 구성되지만, 일부 세포에서 TCR은 감마 및 델타(γ/δ) 사슬로 구성된다. TCR은 알파/베타 및 감마/델타 형태로 존재할 수 있으며, 이는 구조적으로 유사하지만 뚜렷한 해부학적 위치 및 기능을 갖는다. 각 사슬은 가변 및 불변 도메인인 2개의 세포 외 도메인으로 구성된다. TCR은 예를 들어, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포 및 감마 델타 T 세포를 포함하는 TCR을 포함하는 임의의 세포에서 변형될 수 있다.
TCR은 내인성(endogenous) TCR, 즉 내인성이거나 T 세포에 고유한(native)(자연 발생적인) TCR일 수 있다. 이러한 경우에, 내인성 TCR을 포함하는 T 세포는 특정 항원을 발현하는 것으로 알려져 있는 포유동물로부터 분리되는 T 세포일 수 있다. T 세포는 예를 들어, 암에 걸린 대상체로부터 분리된 1차 T 세포일 수 있다. T 세포는 대상체로부터 분리되는 종양 침윤 림프구(tumour infiltrating lymphocyte, TIL) 또는 말초 혈액 림프구일 수 있다. 대안적으로, 내인성 항원 특이적 TCR을 포함하는 T 세포는 포유동물로부터 분리되는 세포의 혼합 집단 내의 T 세포일 수 있고, 혼합 집단은 시험관 내에서 배양되는 동안 내인성 TCR에 의해 인식되는 항원에 노출될 수 있다. 항원을 인식하는 TCR을 포함하는 T 세포는 시험관 내에서 증식(expand or proliferate)하여, 내인성 항원 특이적 수용체를 갖는 T 세포의 수가 증가한다.
항원 특이적 TCR, 예를 들어 본 발명에 따른 5T4 특이적 TCR은 외인성(exogenous) TCR, 즉 T 세포에 고유하지 않은(자연적으로 발생하지 않은) 항원 특이적 TCR일 수 있다. 재조합 TCR은 하나 이상의 외인성 TCR α-, β-, γ- 및/또는 δ-사슬 암호화 유전자의 재조합 발현을 통해 생성되는 TCR이다. 재조합 TCR은 전적으로 단일 포유동물 종으로부터 유래하는 폴리펩티드 사슬를 포함할 수 있거나, 항원 특이적 TCR은 2종의 상이한 포유동물 종으로부터의 TCR로부터 유래하는 아미노산 서열로 구성되는 키메라 또는 하이브리드(hybrid) TCR일 수 있다. 예를 들어, 항원 특이적 TCR은 쥣과 TCR로부터 유래하는 가변 영역, 및 TCR이 "인간화"되도록 하는 인간 TCR의 불변 영역을 포함할 수 있다. 재조합 TCR의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 7,820,174; 8,785,601; 8,216,565; 및 미국 특허출원 공개번호 2013/0274203 참조.
본원에 기술되는 본 발명의 T 세포는 내인성 항원 특이적 TCR을 포함할 수 있고, 외인성(재조합) TCR 또는 다른 재조합 키메라 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산으로 형질전환, 예를 들어 형질도입 또는 형질감염될 수도 있다. 이러한 외인성 키메라 수용체, 예를 들어 키메라 TCR은 내인성 TCR이 자연 발생적으로 특이성을 나타내는 항원 이외에도 형질전환된 T 세포에 대해 추가 항원에 대한 특이성을 부여할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 기술된 바와 같은 임의의 항원-결합 모이어티는 다중-특이적(multi-specific)일 수 있으며, 즉 이는 하나를 초과하는 항원을 인식한다. 일 양태에서, 항원-결합 모이어티는 이중-특이적 또는 삼중-특이적 항체이다. 다중특이적 항체 생성을 위한 다수의 방법이 당해 분야에 존재하며, 당업자에게 공지될 것이다.
또한, 일 양태에서, 항원-결합 모이어티는 분화 항원(예컨대, 멜라닌 세포 분화 항원), 돌연변이 항원(예컨대, p53), 과발현된 세포 항원(예컨대, HER2), 바이러스 항원(예컨대, 인간 유두종 바이러스 단백질), 및 고환 및 난소의 생식 세포에서 발현되지만 정상적인 체세포에서는 발현되지 않는 암/고환(cancer/testis, CT) 항원(예컨대, MAGE 및 NY-ESO-1)을 포함하나 이에 한정되지 않는 종양 관련 항원과 결합할 수 있다.
5T4 특이적 CAR
또한, 본 발명은 단일클론성 항-5T4 항체로부터의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 단편을 포함하는 세포 외 리간드 결합 도메인, 링커, 힌지, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인과 공동자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 5T4 특이적 CAR을 제공한다. 본 발명에 따른 CAR은 본원에 기술된 바와 같은 임의의 본 발명의 방법 또는 용도에 사용될 수 있다.
다음의 표는 CAR의 다양한 성분의 예시적인 서열을 기재한 것이다:
일 양태에서, 본 발명에 따른 5T4 특이적 CAR은 서열번호 3에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성(identity)을 갖는 "항-5T4" 도메인 또는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함한다. 항-5T4 도메인은 본원에 논의된 바와 같은 마우스 단일클론성 H8 항체로부터 유래할 수 있다. 일 양태에서, 항-5T4 도메인은 서열번호 3에 대해 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 항-5T4 도메인은 2E4 항체로부터 유래할 수 있다. 2E4 항체는 본 실시예에 기술되어 있다.
일 양태에서, 세포 외 리간드 결합 도메인은 H8 단일클론성 항체로부터의 CDR을 포함하는 VH 사슬 및 마우스 단일클론성 H8 항체로부터의 CDR을 포함하는 VL 사슬를 포함한다. 이들 서열은 당해 분야에 공지되어 있다 - 예를 들어 WO2016/034666 참조.
세포 외 리간드 결합 도메인은 본원에서 논의된 바와 같이 인간화된 VH 및 VL 사슬를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 5T4 특이적 CAR은 서열번호 11에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 "항-5T4" 도메인 또는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함한다. 항-5T4 도메인은 본원에 논의된 바와 같은 2E4 항체로부터 유래할 수 있다. 일 양태에서, 항-5T4 도메인은 서열번호 11에 대해 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 5T4 특이적 CAR은 서열번호 4에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 "링커" 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 링커 도메인은 서열번호 4에 대해 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 5T4 특이적 CAR은 서열번호 5에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 "CD8 힌지" 도메인을 포함한다. 일 양태에서, CD8 힌지 도메인은 서열번호 5에 대해 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 5T4 특이적 CAR은 서열번호 6에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 "CD8 막관통" 도메인을 포함한다. 일 양태에서, CD8 막관통 도메인은 서열번호 6에 대해 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 5T4 특이적 CAR은 서열번호 7에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 "41BB 공동자극" 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 41BB 공동자극 도메인은 서열번호 7에 대해 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명에 따른 5T4 특이적 CAR은 서열번호 8에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 "CD3 제타 자극" 도메인을 포함한다. 일 양태에서, CD3 제타 자극 도메인은 서열번호 8에 대해 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 서열 또는 서열번호 1에 대해 적어도 92% 동일성을 갖는 서열을 갖는 5T4 특이적 CAR을 제공한다.
서열번호 1:
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMEVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHGKSLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKAILTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQVTSVTVSSGGGGSGGGGTGGGGSSIVMTQTPTFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPTLLISYTSSRYAGVPDRFIGSGYGTDFTFTISTLQAEDLAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKRAAALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
일 양태에서, CAR은 서열번호 1의 서열을 갖는다.
일 양태에서, CAR은 서열번호 1에 대해 적어도 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 13에 기재된 서열 또는 서열번호 13에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 5T4 특이적 CAR을 제공한다.
서열번호 13:
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYNGATTYNQDFKDKASLTVDKSSSTASMELHSLTSEDSAVYYCALSTMITTAWFAYWGQGTLVTVSPGGGGSGGGGTGGGGSNFVMTQTPKFLLASAGDRVTISCKASQSVSNDVGWYQQKPGQSPKLLIYFASNRYTGVPDRFIGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPFTFGSGTKLEIKAAALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
일 양태에서, CAR은 서열번호 13의 서열을 갖는다.
일 양태에서, CAR은 서열번호 13에 대해 적어도 70, 71, 72, 73, 74 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 갖는다.
서열 동일성은 임의의 편리한 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나 서열 사이의 서열 동일성의 정도를 결정하기 위해서는, 서열을 다중 정렬하는 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 Clustal W(Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680)가 유용하다. 또한, ALIGN(Myers et al., (1988) CABIOS, 4: 1-17), FASTA(Pearson et al., (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol., 183: 63-98) 및 갭(gapped) BLAST(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402) 같은 서열의 쌍을 비교하고 정렬하는 프로그램이 이 목적을 위하여 유용하다.
나아가, 유럽 바이오인포매틱스 연구소(European Bioinformatics institute)의 Dali 서버는 단백질 서열의 구조 기반 정렬을 제공한다(Holm (1993) J. Mol. Biol., 233: 123-38; Holm (1995) Trends Biochem. Sci., 20: 478-480; Holm (1998) Nucleic Acid Res., 26: 316-9).
다중 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 표준적인 BLAST 파라미터(이용 가능한 모든 유기체로부터의 서열, 매트릭스 Blosum 62, 갭 코스트(gap costs): 존재(existence) 11, 연장(extension) 1을 이용함)를 이용하여 결정될 수 있다.
대안적으로, 다음의 프로그램 및 파라미터가 이용될 수 있다: 프로그램: Align Plus 4, 버전 4.10(Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite). DNA 비교: Global comparison, Standard Linear Scoring matrix, 미스매치 패널티 = 2, 오픈 갭 패널티 = 4, 익스텐드 갭 패널티 = 1. 아미노산 비교: Global comparison, BLOSUM 62 Scoring matrix.
따라서, 변이체가 모체(parent)의 기능적 활성을 유지하는 한, 즉 변이체가 기능적으로 동등한 한, 다시 말해서 변이체가 예를 들어, CAR 구조의 맥락에서 모체의 활성을 갖거나 나타내는 한, 언급되거나 또는 주어진 서열의 변이체는 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 변이체는 모 서열(parent sequence)과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다.
주어진 아미노산 서열의 "변이체(varient)"는 예를 들어, 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기의 측쇄가 펩티드가 그것이 유래하는 모 펩티드의 기능적 활성을 유지하도록 (예를 들어, 이들을 또 다른 자연 발생적인 아미노산 잔기의 측쇄 또는 일부 다른 측쇄로 치환함으로써) 변경될 수 있음을 의미하는 것으로 의도된다.
변이체는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린의 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기로의 아미노산 잔기의 치환을 포함할 수 있다.
이러한 변이체는 상동성 치환(homologous substitution), 즉 염기성을 염기성으로, 산성을 산성으로, 극성을 극성으로 등과 같은, 같은 부류(like-for-like)/보존적(conservative) 치환으로부터 발생할 수 있다. 또한, 비상동성 치환은 또한 즉, 한 부류의 잔기에서 다른 부류로, 또는 대안적으로 오르니틴, 디아미노부티르산, 노르류신, 피리딜알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비천연 아미노산의 포함을 수반하여 발생할 수 있다.
치환은 보존적 치환일 수 있다. 본원에서 사용되는 "보존적 치환(conservative substitution)"은 주어진 위치에서 아미노산 동일성을 변화시켜 대략 동등한 크기, 전하 및/또는 극성의 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 아미노산의 자연 발생적인 보존적 치환의 예는 다음의 8개의 치환기를 포함한다(종래의 1문자 코드로 나타냄): (1) M, I, L, V; (2) F, Y, W; (3) K, R, (4) A, G; (5) S, T; (6) Q, N; (7) E, D; 및 (8) C, S. 또한, 하나 이상의 아미노산이 화학적으로 유도체화된, 예를 들어 화학 기로 치환된, 기능적으로 동등한 유도체가 포함된다. 기능적으로 동등한 유도체는 펩티드의 합성 전 또는 후에 특정 아미노산과 반응시킴으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004)에 기술된 바와 같이, 예가 당해 분야에 공지되어 있다. 아미노산의 화학적 변형은 이에 제한되지 않지만, 아실화, 아미드화, 리신의 피리독실화, 환원성 알킬화, 아미노 기의 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)으로의 트리니트로벤질화에 의한 변형, 카복실 기의 아미드 변형 및 시스테인의 과산화포름산 산화에 의한 시스테산으로의 설프하이드릴 변형, 수은 유도체의 형성, 다른 티올 화합물과의 혼합된 이황화물의 형성, 말레이미드와의 반응, 요오드아세트산 또는 요오드아세트아미드와의 카복시메틸화 및 알칼리 pH에서의 시안산염과의 카바모일화를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
핵산 및 벡터
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1에 대해 적어도 92% 동일성을 갖는 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자는 서열번호 1에 대해 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 일 양태에서, 핵산 분자는 서열번호 1의 서열로 구성되는 아미노산 서열을 암호화한다.
일 양태에서, 핵산 분자는 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 및/또는 8 중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 및/또는 이에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열 또는 서열들을 갖는다. 일 양태에서, 서열 동일성의 레벨은 적어도 95% 또는 바람직하게는 98%이다.
일 양태에서, 핵산 분자는 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 갖는다.
본원에서 언급되는 바와 같이 "핵산 분자"는 자연 발생적 또는 합성 DNA 또는 RNA, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 5T4 특이적 CAR을 암호화하는 핵산은 숙주 유기체의 세포의 기구에 의해 번역될 수 있는 방식으로 구성될 수 있다. 따라서, 천연 핵산은 예를 들어, 이의 안정성을 증가시키기 위하여 변형될 수 있다. DNA 및/또는 RNA, 그러나 특히 RNA는 뉴클레아제 저항성을 향상시키기 위하여 변형될 수 있다.
예를 들어, 리보뉴클레오티드에 대한 공지된 변형은 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 2'-NH2 및 2'-O-알릴을 포함한다. 변형된 핵산은 핵산의 생체 내 안정성을 증가시키거나, 이의 전달을 증진시키거나 매개하거나, 또는 신체로부터의 청소율을 감소시키기 위하여 이루어진 화학적 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 예는 주어진 RNA 서열의 리보오스 및/또는 인산염 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환을 포함한다. 예를 들어, WO 92/03568; U.S. 5,118,672; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12:5138; Guschlbauer et al., (1977) Nucleic Acids Res. 4:1933; Schibaharu et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:4403; Pieken et al., (1991) Science 253:314 참조.
또한, 본 발명은 높은, 중간 또는 낮은 엄격성(stringency)의 조건하에서 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1에 대해 적어도 92% 동일성을 갖는 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 분자에 혼성화하는 핵산 분자를 포함한다. 일 양태에서, 조건은 높은 엄격성 조건이다.
혼성화의 엄격성은 폴리핵산 하이브리드가 안정한 조건을 지칭한다. 이러한 조건은 당해 분야의 당업자에게 명백하다. 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 하이브리드의 안정성은 하이브리드의 용융 온도(Tm)에 반영되며, 이는 서열 상동성이 1% 감소할 때마다 대략 1 내지 1.5℃ 감소한다. 일반적으로, 하이브리드의 안정성은 나트륨 이온 농도 및 온도의 함수이다. 전형적으로, 혼성화 반응은 보다 엄격한 조건 하에 수행되고, 이어서 다양한 엄격도의 세척이 수행된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 높은 엄격성은 65 내지 68℃에서 1 M Na +에서 안정적인 하이브리드를 형성하는 핵산 서열만의 혼성화를 허용하는 조건을 지칭한다. 예를 들어, 6× SSC, 5× 덴하르트(Denhardt's), 1% SDS(나트륨 도데실 설페이트), 0.1 Na+ 피로포스페이트 및 비특이적 경쟁자로서 0.1 mg/ml 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 수용액에서 혼성화함으로써, 높은 엄격성 조건을 제공할 수 있다. 혼성화 후, 0.2 내지 0.1× SSC, 0.1 % SDS에서 혼성화 온도에서 최종 세척(약 30분)으로, 높은 엄격성의 세척이 여러 단계로 수행될 수 있다.
중간 엄격성은 상기 기술된 용액 중에서의 혼성화와 동등하지만, 약 60 내지 62℃에서의 조건을 지칭한다. 이 경우, 최종 세척은 1× SSC, 0.1% SDS에서 혼성화 온도에서 수행된다.
낮은 엄격성은 상기 기술된 용액 중에서의 혼성화와 동등하지만, 약 50 내지 52℃에서의 조건을 지칭한다. 이 경우, 최종 세척은 2× SSC, 0.1% SDS에서 혼성화 온도에서 수행된다.
이들 조건은 다양한 완충액, 예를 들어 포름아미드 기반의 완충액, 및 온도를 이용하여 조정 및 재현될 수 있는 것으로 알려져 있다. 덴하르트 용액 및 SSC는 다른 적합한 혼성화 완충액처럼 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrook, et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 또는 Ausubel, et al., eds. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 참조). 프로브의 길이 및 GC 함량도 역할을 하므로, 최적 혼성화 조건은 경험적으로 결정되어야 한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1에 대해 적어도 92% 동일성을 갖는 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 일 양태에서, 핵산 분자는 서열번호 9에 기재된 바와 같은 서열을 갖는다.
핵산 분자는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일 양태에서, EF1α 프로모터가 사용된다(서열번호 10 참조).
핵산은 발현 카세트 또는 발현 벡터(예를 들어, 박테리아 숙주 세포 내로의 도입을 위한 플라스미드, 또는 바이러스 벡터, 또는 포유동물 숙주 세포의 형질감염을 위한 렌티바이러스와 같은 플라스미드 또는 바이러스 벡터) 내에 존재할 수 있다. 적합한 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래할 수 있고, US 6,924,123, US 7,056,699, WO1998/055607, WO 1998/17815, WO 1999/32646, WO 2001/79518, WO 2003/064665, US 6,969,598에 기술되어 있다.
본 발명에서 사용되는 "벡터"는 숙주 세포 내에서 핵산을 전달하거나 유지할 수 있는 임의의 작용제일 수 있고, 바이러스 벡터, 플라스미드, 네이키드 핵산, 폴리펩티드 또는 다른 분자와 복합체를 이룬 핵산 및 고체상 입자에 고정화된 핵산을 포함한다.
본원에서 논의되는 바와 같이, 본 발명은 생체 외에서 상기 면역세포 내로 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 면역요법을 위한 면역세포를 제공하는 방법을 포괄한다.
일 양태에서, 상기 핵산 분자는 렌티바이러스 벡터 내에 포함된다. 추가의 양태에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV 또는 EIAV로부터 유래된다.
암 치료 또는 예방
본 발명의 5T4 특이적 CAR은 치료에, 즉 약제로 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 5T4 특이적 CAR은 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 5T4 특이적 CAR을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 5T4 특이적 CAR의 용도, 및 암의 치료 또는 예방에 있어서 5T4 특이적 CAR의 용도가 제공된다.
본 발명의 5T4 특이적 CAR은 5T4 항원을 발현하는 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
예를 들어, 이러한 암은 고형 종양, 예컨대 담관 종양, 뼈 종양, 방광 종양, 뇌/CNS 종양, 유방 종양, 결장직장 종양, 자궁경부 종양, 자궁내막 종양, 위 종양, 두경부 종양, 간 종양, 폐 종양, 근육 종양, 중피종, 신경 종양, 식도 종양, 난소 종양, 췌장 종양, 흉막/복막 종양, 전립선 종양, 신장 종양, 피부 종양, 고환 종양, 갑상선 종양, 태반 종양, 자궁 종양 및 외음부 종양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 양태에서, 암은 고형 종양을 수반하지 않으며, 본원에 기술된 바와 같은 혈액암이다.
일 양태에서, 암은 난소암이다.
일 양태에서, 암은 중피종이다.
일 양태에서, 암은 골수종이다.
일 양태에서, 암은 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 급성 림프아구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 T 세포 급성 림프아구성 백혈병이다.
일 양태에서, 암은 프리-B 급성 림프아구성 백혈병, 예를 들어 소아 프리-B 급성 림프아구성 백혈병이다.
면역세포
조작된 면역 또는 면역자극 세포와 같은 세포뿐만 아니라, 입양 요법에서와 같이 세포를 생산하고 이용하는 방법, 및 세포를 함유하는 약학 조성물과 같은 조성물이 제공된다.
따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 5T4 특이적 CAR을 발현하는 면역세포를 제공한다. 이러한 세포의 집단 또한 제공된다.
일 양태에서, 본 발명은 생체 외에서 세포 내로 본원에 정의된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 면역 세포를 제공하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 세포 또는 세포 집단은 치료에서, 즉 약제로서 사용될 수 있다.
세포 또는 세포 집단은 암 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
일 양태에서, 암은 골수종이다.
일 양태에서, 세포는 유전적으로 변형되어 동종 이식에 더 적합해질 수 있다.
세포는 예를 들어, WO 2013/176915에 기술된 바와 같은 T 세포 수용체(TCR)의 하나 이상의 성분을 발현하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 동종이계로 만들어질 수 있으며, 이는 HLA 또는 β2ITI 단백질을 암호화하는 유전자 또는 HLA 또는 β2ITI 단백질 발현을 조절하는 유전자의 불활성화와 조합될 수 있다. 이식편 대 숙주 증후군(graft versus host syndrome) 및 이식편 거부(graft rejection) 위험은 감소될 수 있다.
면역세포는 예를 들어, 5T4 양성 악성 종양 세포를 치료하기 위한 표준 치료법으로서 사용되는 면역억제 약물 또는 화학요법 치료제에 대한 내성을 개선하기 위하여 추가로 유전자 조작될 수 있다. 예를 들어, 캄파스(알렘투주무맙) 및 글루코코르티코이드 치료제의 약물 표적인 CD52 및 글루코코르티코이드 수용체(G)는 불활성화시켜 세포를 이들 치료에 내성을 나타내게 하여, 특이적인 5T4 CAR이 부여되지 않은 내인성 T 세포에 비해 이들 세포에 경쟁적인 장점을 제공할 수 있다. 또한, CD3 유전자의 발현을 억제하거나 감소시켜 또 다른 면역억제 약물인 테플리주맙에 대한 내성을 부여할 수 있다. 또한, HPRT의 발현을 억제하거나 감소시켜 화학요법에 일반적으로 사용되는 세포증식억제제인 6-티오구아닌에 대한 내성을 부여할 수 있다.
PDCD1 또는 CTLA-4와 같은, T 세포 활성화의 조절 인자로서 작용하는 "면역 체크포인트"로 작용하는 단백질을 암호화하는 유전자 또한 불활성화될 수 있다.
일 양태에서, 세포는 또 다른 항원에 특이적으로 결합하며 공동자극 신호를 세포에 유도할 수 있는 공동자극 수용체, 예컨대 키메라 공동자극 수용체와 같은 또 다른 유전자 조작된 항원 수용체를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 또 다른 표적 항원 및 제1 수용체에 의해 인식되는 제1 표적 항원은 구분된다.
투여
본 발명에 따른 세포 또는 세포 집단은 약학 조성물과 같은 조성물의 형태로 투여될 수 있고, 이는 세포 또는 세포 집단 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다.
세포 또는 세포 집단 또는 조성물의 투여는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 주사(injection), 섭취(ingestion), 삽입(implantation), 이식(transplantation) 또는 흡입(inhalation) 또는 수혈(transfusion)에 의할 수 있다.
투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 국소 또는 전신 투여에 의할 수 있다.
일 양태에서, 투여는 정맥 내, 복강 내, 피하, 피부 내, 종양 내 또는 근육 내일 수 있다.
일 양태에서, 투여는 국소 투여, 예를 들어 복강 내 또는 흉강 내 투여이다. 일 양태에서, 암은 난소암 또는 중피종이고, 투여는 복강 내(난소암) 또는 흉강 내(중피종)이다.
일 양태에서, 투여는 전신성이며, 암은 골수종이다.
투여되는 세포의 수는 1 × 105 내지 1 × 1010개의 세포/체중 kg의 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 투여되는 세포의 수는 약 1 × 106 내지 2 × 107개의 세포/체중 kg이다. 일부 양태에서, 투여되는 세포의 수는 1 × 107 내지 1 × 1011 세포의 범위이다. 세포는 상기 기술된 범위 내에서 1회 또는 수차례, 그리고 면역요법에서 일반적으로 공지되어 있는 주입 기술을 이용하여 투여될 수 있다(예를 들어, Rosenberg et al 1998 New Eng. J. Med. 319; 1676 참조). 특정 양태에서, 세포는 복강 내 또는 흉강 내 경로를 통해 투여될 수 있다. 일 양태에서, 암은 난소암 또는 중피종이다.
특정 양태에서, 세포(예컨대, T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포)를 대상체에게 투여한 다음, 이후에 혈액을 다시 채취하고(또는 성분채집술을 수행하고), 세포를 활성화시켜 활성화 및/또는 증식된 세포를 대상체에게 다시 주입하는 것이 바람직할 수 있다.
환자에게 투여되는 세포의 수는 치료될 상태의 정확한 속성 및 환자의 상태에 따라 다를 것이다. 환자에게 투여하기 위한 용량의 규모 조절(scaling)은 당해 분야에 기술된 허용되는 방법에 따라 수행될 수 있다.
특정 양태에서, 림프구 제거법(lymphodepletion)이 예를 들어, CAR 또는 TCR을 발현하는 세포(예컨대, T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포)의 투여 전에 대상체에서 수행된다. 림프구 제거법은 멜팔란(melphalan), 싸이톡산(cytoxan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 및 플루다라빈(fludarabine) 또는 림프구 제거법에 적합하다고 당업자에게 알려져 있는 유사한 작용제 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함한다.
병용 요법(combination therapy)
본 발명에 따른 5T4 표적화제, 예를 들어 5T4 특이적 CAR T 세포는 단독요법으로 또는 예를 들어, 암, 예컨대 혈액암의 치료를 위한 표준 치료(standard of care)와 조합하여 사용될 수 있다.
'조합하여(in combination)'는 본 발명에 따른 임의의 양태의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 후의 추가의 치료제의 투여를 지칭할 수 있다.
따라서, 암 치료 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 5T4 표적화제, 예컨대 5T4 특이적 CAR T 세포를 단독요법으로서, 또는 추가의 항암제 또는 암의 증상을 완화시키는 다른 작용제와 조합하여 투여하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 5T4 표적화제는 체크포인트 차단 요법, 공동자극 항체, 화학요법 및/또는 방사선요법, 표적 요법 또는 단일클론성 항체 요법과 조합하여 투여될 수 있다.
일 양태에서, 5T4 표적화제는 면역 체크포인트 단백질의 억제제와 조합하여 투여될 수 있다. 억제성 면역체크포인트 단백질의 예는 PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, TIGIT, CD155, B7H3, B7H4, VISTA 및 TIM3을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 활성(activatory) 면역 체크포인트 단백질의 예는 GITR, OX40, 4-1BB, ICOS, HVEM을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 면역 체크포인트 단백질은 억제 또는 활성 방식으로 면역반응을 조절하는 다른 면역 체크포인트 단백질에 결합하는 단백질을 지칭할 수 있다. 이러한 단백질은 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, HVEM, GAL9, ICOS-리간드, OX-40 리간드, GITR-리간드, 4-1BB-리간드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 양태에서, 5T4 표적화제는 사이토카인 요법과 조합하여 투여될 수 있다. 사이토카인 요법은 IFN-α, IL-2, IFN-γ, IL-1, IL-3, GM-CSF/IL-3 융합 단백질, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, 및 TNF-α 요법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 화학요법 실체(entity)는 세포를 파괴하는 실체, 즉 실체가 세포의 생존능력을 감소시는 실체를 지칭한다. 화학요법 실체는 세포독성 약물일 수 있다. 고려되는 화학요법제는 제한 없이, 알킬화제(alkylating agent), 안트라사이클린(anthracycline), 에포틸론(epothilone), 니트로소우레아(nitrosourea), 에틸렌이민/메틸멜라민(ethylenimines/methylmelamine), 알킬 설포네이트(alkyl sulfonate), 알킬화제(alkylating agent), 항대사물질(antimetabolite), 피리미딘 유사체(pyrimidine analog), 에피포도필로톡신(epipodophylotoxin), L-아스파라기나아제(L-asparaginase)와 같은 효소; IFNα, IL-2, G-CSF 및 GM-CSF와 같은 생물 반응 조절제(biological response modifier); 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 카보플라틴(carboplatin)과 같은 백금 배위 착물(platinum coordination complex), 안트라세네디온(anthracenedione), 하이드록시우레아(hydroxyurea)와 같은 치환된 우레아(substituted urea), N-메틸하이드라진(N-methylhydrazine, MIH) 및 프로카바진(procarbazine)을 포함하는 메틸하이드라진 유도체(methylhydrazine derivative), 미토탄(mitotane)(o,p'-DDD) 및 아미노글루테티미드(aminoglutethimide)와 같은 부신피질 억제제(adrenocortical suppressant); 프레드니손(prednisone) 및 등가물, 덱사메타손(dexamethasone) 및 아미노글루테티미드(aminoglutethimide)와 같은 부신피질 스테로이드 길항제(adrenocorticosteroid antagonist)를 포함하는 호르몬 및 길항제; 하이드록시프로게스테론 카프로에이트(hydroxyprogesterone caproate), 메드록시프로게스테론 아세테이트(medroxyprogesterone acetate) 및 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate)와 같은 프로게스틴(progestin); 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol) 및 에티닐 에스트라디올 등가물(ethinyl estradiol equivalent)과 같은 에스트로겐(estrogen); 타목시펜(tamoxifen)과 같은 항에스트로겐(antiestrogen); 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate) 및 플루옥시메스테론(fluoxymesterone)/등가물을 포함하는 안드로겐(androgen); 플루타미드(flutamide), 생식선 자극 호르몬 분비 호르몬 유사체(gonadotropin-releasing hormone analog) 및 류프롤라이드(leuprolide)와 같은 항안드로겐(antiandrogen); 및 플루타미드와 같은 비스테로이드성 항안드로겐(non-steroidal antiandrogen)을 포함한다.
비제한적인 예로, 일 양태에서, 5T4 표적화제는 다발성 골수종 치료에 사용되는 프로테아솜 억제제(proteasome inhibitor)인 카르필조밉(예를 들어, 키프롤리스(KYPROLIS®))와 조합하여 투여될 수 있다(Siegel DS et al. Blood 2012; 120:2817-2825 참조). 카르필조밉은 정맥 내/IV 주입으로서 투여될 수 있다. 카르필조밉은 다발성 골수종을 치료하기 위하여 다양한 추가 작용제와 병용되었다. 예를 들어, 카르필조밉은 레날리도마이드 및/또는 덱사메타손 및/또는 포말리도마이드와 병용되었다. 일 양태에서, 카르필조밉은 레날리도마이드 또는 포말리도마이드, 덱사메타손 및 5T4 표적화제와의 병용 요법으로 투여될 수 있다.
또한, 카르필조밉은 파노비노스타트와 병용되었다(Berdeja JG et al. Haematologica 2015; 100:670-676 참조). 일 양태에서, 카르필조밉은 파노비노스타트 및 5T4 표적화제와의 병용 요법으로 투여된다.
병용 요법을 위한 또 다른 예시적인 작용제는 CD38(다발성 골수종 세포에서 고도로 발현되는 당단백질)과 결합하는 인간 단일클론성 항체인 다라투무맙(예를 들어, 다잘렉스(DARZALEX™))이다. 다라투무맙은 다발성 골수종을 치료하기 위하여 정맥 내 주입에 의하여 환자에 투여될 수 있다(Lokhorst HM et al. N Engl J Med 2015; 373:1207-1219 참조).
일 양태에서, 5T4 표적화제는 CD319, 또는 악성 다발성 골수종 세포의 마커인 신호전달 림프구 활성화 분자 F7(signaling lymphocytic activation molecule F7, SLAMF7)에 결합하는 단일클론성 항체인 엘로투주맙(예를 들어, 엠플리시티(EMPLICITI™))과 조합될 수 있다. 엘로투주맙은 다발성 골수종을 치료하기 위하여 정맥 내 주입에 의하여 환자에게 투여될 수 있다(Zonder JA et al. Blood 2012; 120: 552-559 참조).
대안적으로, 병용 요법은 다발성 골수종을 치료하기 위하여 환자에게 제공되는 면역조절제인 레날리도마이드(예를 들어, 레블리미드(REVLIMID®))를 포함할 수 있다.
병용 요법을 위한 또 다른 예시적인 작용제는 다발성 골수종 및 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma)을 치료하기 위하여 환자에게 제공되는 프로테아솜 억제제인 보르테조밉(예를 들어, 벨케이드(VELCADE®))이다. 보르테조밉은 정맥 내 주사를 통해 환자에게 투여될 수 있다.
병용 요법을 위한 또 다른 예시적인 작용제는 암(다른 것 중에서도 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 호지킨 및 비호지킨 림프종, 유방암 및 폐암을 포함) 치료에 사용되는 알킬화제인 시클로포스파미드(예를 들어, 싸이톡산(CYTOXAN®))이다.
알킬화제인 멜팔란 또한 암(다발성 골수종 및 난소암 포함) 치료를 위한 병용 요법에 사용될 수 있다. 멜팔란은 주사 또는 주입액으로서 경구로 투여될 수 있다.
병용 요법을 위한 다른 예시적인 작용제는 다발성 골수종 치료에 사용되는 면역조절제인 포말리도마이드(예를 들어, 포말리스트(POMALYST®)) 및 암(다발성 골수종 포함) 치료에 사용되는 프로테아솜 억제제인 익사조밉(닌라로(NINLARO®))을 포함한다.
약물 컨쥬게이트
본원에 논의되는 바와 같이, 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 5T4 표적화제는 그 자체가 암세포, 예를 들어 혈액암 세포에 예를 들어, 독성 분자를 선택적으로 전달하는 운반자(carrier)로서 작용할 수 있다. 즉, 예를 들어 항체/CAR의 특이성은 5T4를 발현하는 세포에 대한 독성 페이로드의 선택적인 전달을 달성할 수 있다.
예로서, 5T4 특이적 항체 또는 CAR/CAR T 세포의 특이성은 혈액 세포와 같은 암세포에, 연결된 세포독성제를 전달하기 위해 이용될 수 있다.
일 양태에서, 항체-약물 컨쥬게이트 또는 CAR T 세포-약물 컨쥬게이트가 사용될 수 있다.
적합한 컨쥬게이트 및 컨쥬게이션 방법은 당해 분야에 공지되어 있다 - 예를 들어, Parslow et al. Biomedicines 2016, 4:14의 리뷰를 참조.
도 1: 5T4-CAR-T 구조체의 개략도. 이들은 α-5T4 scFv(H8 또는 2E4); 공동자극 도메인(CD28 또는 4-1BB); 또는 프로모터 영역(CMV 또는 EF1α)에 있어서의 변형을 포함한다.
도 2: CAR-5T4 구조체의 인간 T 세포로의 형질도입 및 이후의 성장.
도 3: 5T4 양성 종양 세포에 대한 노출 후 5T4 CAR-T 세포에 의한 시험관 내(in vitro) IFNγ 분비.
도 4: 인간 중피종 세포주 NCI-H226(5T4 고 발현자) 및 결장직장 세포주 LS174T(5T4 저 발현자)에 대한 시험관 내에서의 5T4 CAR 구조체 H8-EF1α-CD3ζ/4-1BB 및 2E4-EF1α-CD3ζ/4-1BB의 활성.
도 5: 5T4 특이적 단일 클론 항체/5T4 단백질을 이용한 시험관 내에서의 5T4 차단에 대한 5T4 CAR 구조체(H8-EF1α-CD3ζ/4-1BB 및 2E4-EF1α-CD3ζ/4-1BB)의 특이성.
도 6: 난소암 세포와 공 배양 시 CAR-T 세포 기능성의 시험관 내 평가에 대한 개략도.
도 7: 건강한 공여자와 비교한, 난소암 환자로부터의 PBMC로의 5T4 CAR 구조체의 형질도입.
도 8: 난소암 환자로부터 회수된 종양 분해물(disaggregate) 상에서의 5T4 발현.
도 9: 자가 난소 종양 분해물과 공동 배양된 CAR-T 5T4 세포에 의한 IFNγ 분비.
도 10: 난소암 모델에 대한 5T4 CAR-T 세포의 생체 내(in vivo) 효능을 보여주는 생존 곡선; 구조체: CMV-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB 및 CMV-H8-CAR-CD3ζ/CD28; 마우스: NSG(군 당 3마리); 세포 용량/경로: 2 × 107개 총 T 세포, IV 투여.
도 11: 난소암 모델에 대한 5T4 CAR-T 세포의 최소 유효 용량을 보여주는 생존 곡선; 구조체: CMV-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB 및 CMV-H8-CAR-CD3ζ/CD28; 종양 세포: SKOV-3 난소암(2.5 × 106개 IP 투여 유발검사) CAR-T 세포: IV 투여를 통해 전달된 1 × 107, 0.3 × 107, 0.1 × 107, 0.03 × 107개 CAR-T 세포.
도 12: 난소암 유발검사에 대한 IP 또는 IV 투여를 통한 CAR-T 투여 효능 간의 비교를 보여주는 생물발광 이미지; 종양 세포: SKOV-3 난소암(2.5 × 106개 IP 투여 유발검사); CAR-T 세포: IP 또는 IV 투여 경로를 통한 1 × 107 또는 1 × 106 CAR T 세포.
도 13: 상이한 α-5T4 ScFv를 이용한 난소암 모델에 대한 5T4 CAR-T 세포의 생체 내 효능을 보여주는 생존 곡선; 구조체: (H8-EF1α-CD3ζ/4-1BB 및 2E4-EF1α-CD3ζ/4-1BB); 시험 세포: 1 × 107개 CAR T 세포; 종양 세포: SKOV-3 난소암.
도 14: 상이한 α-5T4 ScFv를 이용한 난소암 모델에 대한 5T4 CAR-T 세포의 생체 내 효능을 보여주는 생존 곡선; 구조체: (H8-EF1α-CD3ζ/4-1BB 및 2E4-EF1α-CD3ζ/4-1BB); 종양 세포: NCI-H929 골수종 세포.
도 15: 3종의 골수종 세포주에서 5T4 발현의 FACS 분석; A: 양성 대조군(유방 [MCF7] 세포주); B: 음성 대조군(DLBCL); C: H929 골수종 세포주; D: JJN3 골수종 세포주; E: RPMI-8226 세포주.
도 16: 5T4 염색의 면역조직화학 이미지; A: CHO 세포(음성 대조군); B: 5T4로 형질감염된 CHO 세포(양성 대조군); C: MCF7(유방) 세포; D: H929(골수종) 세포
도 17: 다발성 골수종 환자 4명으로부터 채취된 골수종 샘플 상의 5T4 염색의 면역조직화학 이미지.
도 18: 암 치료에서 암 줄기세포의 박멸(eradication)의 중요성.
기존의 화학요법(표준 요법)은 빠르게 증식하는 세포를 제거하여 대부분의 고형 종양을 제거하지만, 막에 위치한 약물 운반체로 인하여 요법에 더욱 저항성을 나타낼 가능성이 있는 암 줄기세포(cancer stem cell, CSC)는 놓치며, 이는 재발을 초래할 수 있는 것으로 상정하였다. 수술 이외에, 종양을 제거하기 위한 최적의 치료 계획은 벌크 종양 세포 및 종양 내의 암 줄기세포 둘 다를 표적화하는 것(예를 들어, 5T4 표적화 치료법)이라고 주장될 수 있다.
도 19: 고형 종양의 암 줄기세포 상에서의 5T4 발현. 이 도면은 OVCAR-3(난소), MCF7(유방), HCT116(결장직장), HT29(결장직장), U251(교아세포종) 및 A549(폐) 세포주에서 '벌크' 종양 세포(단일층) 또는 암 줄기세포(구체(sphere)) 상에서의 5T4 발현의 수준을 보여준다.
본 발명은 이제 실시예에 의해 추가로 설명될 것이며, 이는 본 발명을 수행하는 데 당업자에게 도움을 주기 위한 것으로, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 2E4 항체의 생산 및 5T4 CAR 구조체의 설계
2E4 항체의 생산
컬럼 크로마토그래피(니켈 비드)를 이용하여 CHO 세포로부터 정제된, C 말단 엔테로키나아제 절단 서열을 갖는 5T4의 세포 외 도메인, myc 에피토프 및 6개의 히스티딘 태그를 포함하는 재조합 단백질을 면역원(immunogen)으로서 사용하였다. Immuno-Precise(캐나다) 신속 프라임 프로토콜을 사용하여(3마리의 마우스를 면역화시킨 후 4회의 신속한 부스트(boost)), 마우스에서 mAb를 제조하였다.
공여자의 비장 세포를 SP2/0 골수종 IgG 하이브리도마와 융합시켰다. mAb를 재조합 단백질에 대해 스크리닝하고, ELISA에 의해 동일한 C 말단 태그를 갖는 상이한 류신 풍부 단백질의 세포 외 도메인에 대해 카운터-스크리닝하였다. 10개의 상청액을 추가 연구를 위하여 선별하였다.
세포 용해물에서 추가의 밴드가 일부 상청액에 의해 검출되었지만, 모든 상청액은 웨스턴 블롯에 의해 재조합 인간 5T4를 인식하였다. 웨스턴 블롯 상에서 감소되거나 감소되지 않은 5T4 단백질의 인식 강도를 이용하여, 단백질 G 컬럼 정제를 위한 4개의 mAb를 선별하였다. 시퀀싱, 및 웨스턴 블롯과 ELISA에 의한 추가 분석은 4개의 mAb 각각이 고유하다는 것을 입증하였다.
2E4 항체를 추가 연구를 위하여 선별하였다.
5T4 CAR 구조체
도 1B에서 기술된 바와 같이, EF1α-H8-4-1BB/CD3ζ 5T4 구조체(pRKh- EF1α-H8-4-1BB)를 생성하였고; 5T4-CAR 단백질을 암호화하는 코돈 최적화(condon-optimised) 서열(서열번호 9)(H8 scFv 항원 결합 도메인, CD8 힌지 및 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 자극 도메인으로 구성됨)을 드 노보(de novo) DNA 합성에 의해 생성하였다. 합성된 5T4-CAR 카세트를 HIV-1 GFP 게놈 플라스미드(pRKHVCG)에 삽입하여 GFP 유전자를 대체하고, 내부 거대세포 바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터의 하류에 5T4-CAR 전이 유전자를 위치시켜 pRKh5T4CD8 플라스미드를 생성하였다. 마지막으로, CMV 프로모터를 신장 인자 1α(elongation factor 1α, EF1α) 프로모터로 치환하여 pRKh-EF1α-H8-4-1BB를 생성하였으며; EF1α 서열(서열번호 10)은 pEF1α-coTRAP-Puro 플라스미드로부터 유래하였다.
일련의 분자 클로닝 실험을 통해 pRKh-EF1α-H8-4-1BB 플라스미드를 제작하였다. 지향성 결찰(directional ligation)을 용이하게 하기 위하여, pRKHVCG 및 pUC57-h5T4-CD8(pRKHVCG에서 또한 발견되는 것에 상응하는 2개의 제한 부위가 측면에 있는, 5T4-CAR 단백질을 암호화하는 서열을 가짐) 모(parental) 구조체를 2개의 별개의 제한 효소로 분해하여 상보적인 점착성 말단을 생성하였다. pRKHVCG 벡터 백본 및 5T4-CAR 암호화-단편을 겔 전기영동법 및 이후의 겔 정제에 의하여 분리하였다. 전자의 단편을 알칼리 인산가수분해효소 단계로 처리하여 자가 결찰을 못하도록 하였다. 두 선형 단편을 DNA 리가아제의 도움으로 결찰하고, 생성된 pRKh5T4CD8 구조체를 통상적인 DH5α 대장균 균주에서 증식시켰다. 프로모터 서열의 치환은 위에 기술된 방법과 유사한 방법을 통하여 달성하였다.
서열번호 9 - H8-CD8-4-1BB-CD3ζ (코돈 최적화 서열)
ATGGGAGTGCTGCTGACCCAGAGAACCCTGCTGTCTCTGGTGCTGGCCCTGCTGTTCCCTAGCATGGCCAGCATGGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCTGACCTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATGCACTGGGTCAAGCAGAGCCACGGCAAGAGCCTGGAATGGATCGGCCGGATCAACCCCAACAACGGCGTGACCCTGTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCATCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCACCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTCCACCATGATCACCAACTACGTGATGGACTACTGGGGCCAAGTGACCAGCGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAACAGGCGGAGGGGGATCTAGCATCGTGATGACCCAGACCCCCACCTTCCTGCTGGTGTCTGCCGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCTCCCAGAGCGTGTCCAACGACGTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCACCCTGCTGATTAGCTACACCAGCTCCAGATATGCCGGCGTGCCCGACAGATTCATCGGCAGCGGCTATGGCACCGACTTCACCTTCACCATCAGCACACTGCAGGCCGAGGACCTGGCTGTGTACTTCTGTCAGCAAGACTACAACAGCCCCCCTACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGCCGCCGCTCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCTACCACAACCCCTGCCCCTAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTCGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCTCTGCCCCCCAGATGA
서열번호 10 - EF1α 프로모터
GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
EF1α-2E4-4-1BB/CD3ζ 5T4 구조체(pRKh- EF1α-2E4-4-1BB)를 도 1C에 기술된 바와 같이 생성하였고; 2E4 항원 결합 모이어티를 암호화하는 서열(서열번호 11)을 합성하고, pRKh-EF1α-H8-4-1BB 내로 삽입하여 H8 도메인 서열을 대체하였다.
서열번호 14 - 2E4 항원 결합 모이어티
ATGGAAGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCCCCGAGCTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGGCTACTACATGCACTGGGTCAAGCAGAGCCACGTGAAGTCCCTGGAATGGATCGGCCGGATCAACCCCTACAACGGCGCCACCACCTACAACCAGGACTTCAAGGACAAGGCCTCCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCAGCATGGAACTGCACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCCCTGAGCACCATGATCACCACCGCTTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCTCCAGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAACAGGCGGAGGGGGATCTAACTTCGTGATGACCCAGACCCCCAAGTTCCTGCTGGCCTCTGCCGGCGACAGAGTGACCATCAGCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGTCCAACGACGTGGGCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTTCGCCAGCAACCGGTACACCGGCGTGCCCGACAGATTCATCGGCAGCGGCTACGGCACCGACTTCACCTTCACCATCAGCACCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTACTTCTGTCAGCAAGACTACAGCAGCCCTTTCACCTTCGGCTCCGGCACCAAGCTGGAAATCAAGG
실시예 2. CAR-5T4 T 세포의 시험관 내 활성 - 도 2 내지 4
종양 세포주:
조사된 종양 세포주는 NCI-H226(중피종, ATCC; 영국 미들섹스), SKOV-3(난소 선암종, ATCC; 영국 미들섹스), BT20(유방암종, ATCC; 영국 미들섹스), OVCAR-3(난소 선암종, ATCC; 영국 미들섹스), LS174T(결장직장 선암종, ATCC; 영국 미들섹스), DLD-1(결장직장, ATCC; 영국 미들섹스) 및 NCI-H929(골수종, ATCC; 영국 미들섹스)였다.
각 세포주를 배양하는 데 다음과 같은 배지를 사용하였다: NCI-H226 배지: RPMI 1640(SIGMA, 영국 도싯), 1% 글루타민(SIGMA, 영국 도싯), 1% HEPES(Gibco; 영국 페이즐리), 1% 피루브산 나트륨(SIGMA, 영국 도싯) 및 10% FBS(SeraLabs; 영국 웨스트서식스). SKOV-3 배지: McCoys 5a 배지(Life Technologies; 미국 캘리포니아 주 칼스배드; 미국 캘리포니아 주 칼스배드), 1% 글루타민(SIGMA, 영국 도싯), 10% FBS(SeraLabs; 영국 웨스트서식스). BT20 배지: 이글 최소 필수 배지(SIGMA, 영국 도싯), 10% FBS(SeraLabs; 영국 웨스트서식스), 1% 글루타민(SIGMA, 영국 도싯). OVCAR-3 배지: RPMI 1640(SIGMA, 영국 도싯), 1% 글루타민(SIGMA, 영국 도싯), 1% HEPES(Gibco; 영국 페이즐리), 1% 피루브산 나트륨(SIGMA, 영국 도싯), 1% 인슐린(SIGMA, 영국 도싯) 및 20% FBS(SeraLabs; 영국 웨스트서식스) LS174T 배지: 이글 최소 필수 배지(SIGMA, 영국 도싯), 10% FBS(SeraLabs; 영국 웨스트서식스), 1% 글루타민(SIGMA, 영국 도싯). NCI-H929: RPMI1640(SIGMA, 영국 도싯), 10% FBS(SeraLabs; 영국 웨스트서식스) 및 1% 글루타민(SIGMA, 영국 도싯).
세포를 T75 플라스크에서 성장시키고, >80% 컨플루언시(confluency)에 이를 때까지 표준적인 세포 배양 프로토콜에 따라 계대 배양하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터(Panasonic; 영국 러프버러)에서 배양하였다. NCI-H226, SKOV-3 및 NCI-H929 세포를 1:10으로 희석하여 매주 2회 계대 배양하였다. BT20, OVCAR-3 및 LS174T 세포 또한 1:10으로 희석하여 매주 1회 계대 배양하였다. 부착 세포주를 PBS(SIGMA, 영국 도싯)로 세척하고, 37℃에서 5분 동안 TrypLE Express™(GIBCO; 영국 페이즐리)를 이용하여 플라스크로부터 분리시키고, 동일한 부피의 배지로 중화하고, 원심분리하고, 추가 세포 배양을 위하여 또는 사이토카인 방출 분석 또는 WST-1 분석에 사용하기 위하여 적절한 부피의 배지에, 또는 유세포 분석을 위하여 PBS에 재현탁시켰다. 비부착 세포주(NCI-H929)는 배양물로부터 제거하고, 원심분리하고, 추가의 세포 배양에 사용하기 전에 배지에 재현탁시키거나 유세포 분석을 위하여 PBS에 재현탁시켰다. 세포는 즉시 통상적인 조직 배양을 제외하고, 얼음에 저장하였다.
이 통상적인 배양을 위하여, 세포를 1:10으로 희석하고 배지에 첨가하여 T75 플라스크에 총 부피 25 ml이 되게 하였다. 사이토카인 방출 분석 및 WST-1 분석에 사용된 세포는 얼음 위에서 다루었으며, Guava PCA(Millipore; 영국 왓퍼드)를 이용하여 계수하고, 펠릿화하여, 배지에 각각 1×105개 세포/ml 및 1×104개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다.
PBMC 및 T 세포 활성화:
PBMC는 CTL(독일 본)으로부터 구입하거나, Covance(영국 메이든헤드)로부터 구입한 혈액으로부터 이전에 생성하였다. T 세포를 PBMC의 바이알로부터 활성화시켜, 다음으로 구성된 T 세포 배지에 배양하였다: X-Vivo 15(Sartorius; 영국 서리), 인간 AB 혈청(Akron Biotech; 미국 플로리다 주), GlutaMax(Life Technologies; 미국 캘리포니아 주 칼스배드), HEPES(Gibco; 영국 페이즐리; 영국 페이즐리), N-아세틸시스테인(APP Pharmaceuticals; 미국 일리노이 주), 피루브산 나트륨(SIGMA, 영국 도싯), MEM 이글 비타민 믹스(Lonza; 영국 슬라우) 및 rhIL-2(R&D Systems; 영국 어빙돈). 간략하게는, 냉동 PBMC 바이알을 37℃로 설정된 수조에서 부드럽게 해동시켜 되살리고, 이를 미리 가온된 배지에 서서히 첨가하였다. Guava PCA를 이용하여 세포의 분취액(eliquot)을 계수하였다. 세포를 스핀 다운시키고, 배지에 재현탁시켜 5×105개 세포/ml을 수득하였다. 3:1의 비드 대 세포 비로 CD3/CD8 팽창 비드(GIBCO; 영국 페이즐리)를 이용하여 T 세포를 활성화시켰다. 비드를 세척하고 PBS에 재현탁시킨 후, 4×106개 세포와 1.2×107개 비드 및 500 μl의 배지를 24웰 플레이트에 첨가하였다.
T 세포 형질도입/CAR T 세포의 생성
상기 기술된 바와 같이, T 세포 활성화를 위하여 PBMC를 제조하였다. 그 후, 연속 일(0일, 활성화 직후 및 1일)에 250 μl의 적절히 희석된 벡터 CAR-T 5T4 구조체(H8 및 2E4)를 첨가하여 세포를 2회 형질도입시켰다. 바이러스 입자 대 감수성 세포의 비율을 나타내는 감염 다중도(Multiplicity of Infection, MOI) 1, 0.33 및 0.11로 벡터를 세포에 형질도입하였다. 음성 대조군으로, PBMC를 활성화시켰지만, 벡터는 첨가하지 않았다. 형질도입 후, 세포를 MM + IL-2 중에 5×105의 농도로 유지시켰다. 세포를 유지하기 위하여. 웰을 부드럽게 피펫팅하여 완전히 재현탁시키고, Guava PCA를 이용하여 3일, 6일, 9일, 10일 및 14일에 계수를 위하여 분취액을 제거하였다. MM + IL2를 세포에 첨가하여 5×105개 세포/ml의 농도로 유지하고, 필요에 따라 증식된 배양물을 T25 및 T75 플라스크로 옮겼다. 10일째에, 배지에 IL-2를 보충하지 않았다. 사이토카인 방출 분석 및 세포 살해(WST-1) 분석에 의해 기능성을 평가할 때, 14일까지 세포를 배양하였다.
사이토카인 방출 분석
제조사의 설명서에 따라 사이토카인 방출 분석을 수행하였다. 43 μl의 완충액에 시험 샘플(7 μl)을 첨가하였다. 프로토콜에 따라 CBA 플렉스 세트(Flex Set)(BD Biosciences; 영국 옥스포드)를 이용하여 CBA 분석을 수행하였다. FCAP 어레이 소프트웨어(BD Biosciences; 영국 옥스포드)에서 데이터를 분석하였다.
WST-1/세포 살해 분석
표적 세포(NCI-H226 또는 LS174T)를 평편 바닥 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다(1×104). 0.5:1, 1:1, 10:1 및 30:1의 E:T 비율로 T 세포를 첨가하였다. 표적 세포 단독 및 T 세포 단독 대조군을 또한 제조하였다. 세포를 18 내지 24시간 동안 37℃의 5% CO2 분위기에서 항온처리하였다.
다음날, 50 μl WST-1 시약을 PBS로 1:10으로 희석하여 세포에 첨가하고, 630 nm 기준 파장과 함께 440 nm에서 흡광 플레이트 판독기를 이용하여 매시간 플레이트를 판독하였다. 세포 살해의 백분율을 다음 식에 의해 계산하였다:
([실험 흡광도)-(대조 흡광도)[/([최대 흡광도)-(대조 흡광도])×100
실시예 3. CAR-5T4 T 세포의 특이성 - 도 5
5T4 특이적 단일클론성 항체 또는 가용성 5T4 단백질을 종양 세포주 및 CAR-5T4 T 세포와 함께 항온처리한 차단 실험에 의해, 5T4 CAR 구조체의 특이성을 결정하였다. 모든 차단제를 적정하고, IFNγ 분비에 미치는 영향을 평가하였다.
종양 세포주
조사한 종양 세포주는 NCI-H226(중피종, ATCC; 영국 미들섹스) 및 LS174T(결장직장 선암종, ATCC; 영국 미들섹스)였다. NCI-H226 세포를 배양하는 데 사용된 배지는 다음과 같았다: RPMI 1640(SIGMA, 영국 도싯), 1% 글루타민(SIGMA, 영국 도싯), 1% HEPES(Gibco; 영국 페이즐리), 1% 피루브산 나트륨(SIGMA, 영국 도싯) 및 10% FBS(SeraLabs; 영국 웨스트서식스). LS174T 세포를 배양하는 데 사용된 배지는 다음과 같았다: 이글 최소 필수 배지(SIGMA, 영국 도싯), 10% FBS(SeraLabs; 영국 웨스트서식스), 1% 글루타민(SIGMA, 영국 도싯). NCI-H929: RPMI1640(SIGMA, 영국 도싯), 10% FBS(SeraLabs; 영국 웨스트서식스) 및 1% 글루타민(SIGMA, 영국 도싯).
세포를 T75 플라스크에서 성장시키고, >80% 컨플루언시에 이를 때까지 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 계대배양 하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터(Panasonic; 영국 러프버러)에서 배양하였다. 부착 세포주를 PBS(SIGMA, 영국 도싯)로 세척하고, 37℃에서 5분 동안 TrypLE Express™(GIBCO; 영국 페이즐리)를 이용하여 플라스크로부터 분리시키고, 동일한 부피의 배지로 중화하여 원심분리하고, 추가 세포 배양을 위하여 또는 사이토카인 방출 분석 또는 WST-1(세포 살해) 분석에 사용하기 위하여 적절한 부피의 배지에, 또는 유세포 분석을 위하여 PBS에 재현탁시켰다.
PBMC 및 T 세포 활성화:
PBMC는 CTL(독일 본)으로부터 구입하였거나, Covance(영국 메이든헤드)로부터 구입한 혈액으로부터 이전에 생성하였다. T 세포를 PBMC의 바이알로부터 활성화시켜, 다음으로 구성된 T 세포 배지에 배양하였다: X-Vivo 15(Sartorius; 영국 서리), 인간 AB 혈청(Akron Biotech; 미국 플로리다 주), GlutaMax(Life Technologies; 미국 캘리포니아 주 칼스배드), HEPES(Gibco; 영국 페이즐리; 영국 페이즐리), N-아세틸시스테인(APP Pharmaceuticals; 미국 일리노이 주), 피루브산 나트륨(SIGMA, 영국 도싯), MEM 이글 비타민 믹스(Lonza; 영국 슬라우) 및 rhIL-2(R&D Systems; 영국 어빙돈). 간략하게는, 냉동 PBMC 바이알을 37℃로 설정된 수조에서 부드럽게 해동시켜 되살리고, 세포를 미리 가온된 배지에 서서히 첨가하였다. Guava PCA를 이용하여 세포 분취액을 계수하였다. 세포를 스핀 다운시키고, 배지에 재현탁시켜 5×105개 세포/ml을 수득하였다. 3:1의 비드 대 세포 비로 CD3/CD8 팽창 비(GIBCO; 영국 페이즐리)를 이용하여 T 세포를 활성화시켰다. 비드를 세척하고 PBS에 재현탁시킨 후, 4×106개 세포와 1.2×107개 비드 및 500μl 배지를 24웰 플레이트에 첨가하였다.
T 세포 형질도입/CAR T 세포의 생성
상기 기술된 바와 같이, T 세포 활성화를 위하여 PBMC를 제조하였다. 그 후, 연속 일(0일, 활성화 직후 및 1일)에 250 μl의 적절히 희석된 벡터 CAR-T 5T4 구조체(H8 및 2E4)를 첨가하여 세포를 2회 형질도입시켰다. 바이러스 입자 대 감수성 세포의 비율을 나타내는 감염 다중도(MOI) 1, 0.33 및 0.11로 벡터를 세포에 형질도입하였다. 음성 대조군으로, PBMC를 활성화시켰지만, 벡터는 첨가하지 않았다. 형질도입 후, 세포를 MM + IL-2 중에 5×105의 농도로 유지시켰다. 세포를 유지하기 위하여. 웰을 부드럽게 피펫팅하여 완전히 재현탁시키고, Guava PCA를 이용하여 3일, 6일, 9일, 10일 및 14일에 계수를 위하여 분취액을 제거하였다. MM + IL2를 세포에 첨가하여 5×105개 세포/ml의 농도로 유지하고, 필요에 따라 증식된 배양물을 T25 및 T75 플라스크로 옮겼다. 10일째에, 배지에 IL-2를 보충하지 않았다. 사이토카인 방출 분석 및 세포 살해(WST-1) 분석에 의해 기능성을 평가할 때, 14일까지 세포를 배양하였다.
사이토카인 방출 분석:
차단하지 않음
T 세포 및 표적 세포를 WST-1 세포 살해 분석에서와 같이 준비하였다. WST-1 첨가 전에, 상청액의 분취액(50μL)을 제거하고, 다른 플레이트로 옮겨, 사이토카인 방출 분석에 의한 분석 전에 -20℃에서 보관하였다.
5T4 단백질을 이용한 차단
T 세포를 단계별로 희석한 재조합 5T4 단백질과 항온처리한 후, 1시간 동안 항온처리하였다. T 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 1:1의 E:T 비율(1×105개 세포)로 종양 세포에 첨가하고, 5% CO2 분위기 하 37℃에서 18 내지 24시간 동안 항온처리한 후, 상청액을 제거하고, 다른 플레이트로 옮겨, 사이토카인 방출 분석에 의한 분석 전에 -20℃에서 보관하였다.
5T4-특이적 단일클론성 항체 2E4를 이용한 차단
종양 세포 NCI-H226 및 LS174T를 1시간 동안 200 μg/ml의 항-5T4 항체 2E4의 출발 농도로 단계별 희석물(1:10)과 함께 항온처리하였다. T 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 1:1의 E:T 비율(1×105개 세포)로 2E4 항체와 함께 항온처리된 종양 세포에 첨가하고, 5% CO2 분위기 하 37℃에서 18 내지 24시간 동안 항온처리한 후, 상청액을 제거하고, 다른 플레이트로 옮겨, 사이토카인 방출 분석에 의한 분석 전에 -20℃에서 보관하였다.
제조사의 설명서에 따라, 사이토카인 방출 분석을 수행하였다. 43 μl의 완충액에 시험 샘플(7 μl)을 첨가하였다. 프로토콜에 따라 CBA 플렉스 세트(Flex Set)(BD Biosciences; 영국 옥스포드)를 이용하여 CBA 분석을 수행하였다. FCAP 어레이 소프트웨어(BD Biosciences; 영국 옥스포드)에서 데이터를 분석하였다.
실시예 4. 암 환자로부터의 T 세포의 형질도입 및 CAR-T 세포 기능성
다음의 재조합 렌티바이러스 벡터를 본 연구에 사용하였다:
*TU = 형질전환 단위
시험 물질 벡터를 20mM 트리스, 100 mM NaCl, 10 mg/mL 수크로오스, 10 mg/mL 만니톨을 함유하는 TSSM 제제 완충액, pH 7.3에 현탁시켰다. TSSM 완충액은 Oxford BioMedica(영국)에서 공급하였고, 냉동 보관하였다.
연구를 4부분으로 나누었다:
1. 대략 15명의 난소암 환자로부터 매치된 종양 및 말초 혈액 단핵구 세포의 수집
2. 면역조직화학을 이용한 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin fixed paraffin embedded, FFPE) 난소 종양 절편(section)에서의 5T4 발현 평가
3. 유세포 분석을 이용한 분해된 종양 세포에서의 5T4 발현 평가
4. 난소암 세포와 공동 배양 시, 사이토카인 방출에 의해 측정된 CAR-T 세포 기능성 평가(도 6에서 강조됨).
매치된 종양 및 혈액 샘플 수집
영국 맨체스터 세인트 메리 병원에서 난소암 수술을 받는 환자로부터 고형 종양 생검을 수집하였다. 적절한 윤리적 승인(Ref: 14/NW/1260) 및 사전 동의와 함께 센트럴 맨체스터 대학교 병원 NHS 재단 트러스트 바이오뱅크를 통해 샘플을 수집하였다. MACS 조직 저장 용액(Miltenyi Biotec, 독일)을 함유하는 멸균 유니버설에 고형 종양 생검을 수집하고, 처리를 위해 실험실로 바로 수송하거나 처리 전 최대 24시간 동안 4℃에서 보관하였다. 20 내지 30 ml의 혈액을 EDTA를 함유하는 BD Vacutainer 혈액 수집 튜브(BD Biosciences, 영국 옥스포드)에 수집하였다. 혈액 샘플을 실온에 저장하고, 수집 24시간 이내에 처리하였다. 분석에 사용 가능한 샘플을 표 1에 열거하였다.
표 1: 난소암 환자로부터의 매치된 종양 및 혈액 샘플.
이 표는 종양 조직 및 말초 혈액 단핵구 세포를 분석에 이용할 수 있는 환자를 열거한 것이다. 이 표는 샘플 ID, 질병 병기(stage), 외과적 중재의 유형, 종양 조직학 및 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 종양 조직의 이용 가능성을 열거한다. [*이 환자는 고등급 장액성 난소암(high grade serous ovarian ancer)을 앓았으며, 수술 전에 선행 화학요법(neoadjuvant chemotherapy)을 받았다. 그녀는 수술 전에 전이성 병변으로 생각되는 덩어리가 간에 있음을 알게 되었다. 그녀는 화학요법에 대해 매우 양호한 반응을 보였으며, 수술 당시 유일하게 중요한 질병은 생검된 간 병변이었고, 이것은 나중에 간의 양성 혈관종(benign haemangioma)인 것으로 밝혀졌다.]
분해된 종양 세포에서의 5T4 발현의 평가
종양 분해( disaggregation )
난소 종양 샘플을 제조사의 프로토콜에 따라 상업적인 기계적/효소적 분해 키트(GentleMACS, Miltenyi Biotec, 독일)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 분리하였다. 간략하게는, 종양 생검을 멸균 메스를 사용하여 2 내지 4 mm3 단편으로 절단하고, RPMI-1640(Lonza, 영국 슬라우) 및 적절한 양의 효소 H, R 및 A(Human Tumour Dissociation Kit, Miltenyi Biotec, 독일)가 있는 C-튜브(Miltenyi Biotec, 독일)로 옮겼다. 그런 다음, C-튜브를 GentleMACS 분리기에 거꾸로 놓고, 3가지의 36초 기계적 분리 프로그램(h_tumour_01, h_tumour_02 및 h_tumour_03)을 수행하였다. 이는 제1 및 제2 분리 프로그램 후에 수행된, MACSmix 튜브 회전기(Miltenyi Biotec, 독일)를 이용한 연속적인 회전하에 37℃에서 두 차례의 30분 항온처리에 의해 주입되었다. 분리 후, 현탁액을 100 μm 여과기를 통해 20 ml의 T 세포 배지가 들어 있는 50 ml 팔콘 내로 통과시키고, 400 G에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 나머지 세포 펠릿을 충분히 재현탁시켜 세포를 계수하였다. 그런 다음, 세포를 1 내지 2×107개 세포/ml의 밀도로 90% FCS/10% DMSO에 동결 보존하였다.
유세포 분석
종양 분해로부터 수득된 세포를 T 세포 배지 중에 1 × 106개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 세포 현탁액의 100 μl 분취액(1 × 105개 세포)을 96-웰 U-바닥 플레이트의 적절한 수의 웰로 옮겼다. 세포를 FACS 완충액으로 1회 세척하고, 4℃의 암소에서 30분 동안 FACS 완충액 중 1:100으로 희석된 EpCAM(PE, 클론 9C4, Biolegend) 및 5T4(클론 H8 및 2E4) 항체로 염색하였다. 그 후, 세포를 FACS 완충액으로 1회 세척한 후, PBS 중 1% 파라-포름알데히드(PFA)(Sigma-Aldrich, 영국) 200 μl에 재현탁시켰다. 고정된 세포를 FACS 튜브로 옮겼다. LSR Fortessa(BD Biosciences, 영국)에서 분석을 수행하였다. FlowJo v. 7.6.2 소프트웨어(Tree Star Inc, 미국 오레곤 주 애실랜드)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 단일 염색 대조군을 이용하여 수동으로 보정(compensation)을 수행하였다.
도 8은 시험된 대부분의 종양 분해물이 큰 백분율(> 50%)의 5T4 양성 세포를 함유함을 보여준다. 이 그래프는 또한 H8 또는 2E4 5T4 특이적 단일클론성 항체를 이용한 종양 분해물의 염색이 비슷한 결과를 가져옴을 보여준다.
4.3. T 세포 형질도입 및 CAR-T 기능성
투여 조제물(dose preparation)
벡터는 TSSM 제제 완충액으로 미리 제형화되어 공급되었다. 벡터 바이알을 젖은 얼음(wet ice) 상에서 해동시켰다. 필요한 경우, 벡터 바이알을 실온에서 잠시(몇 분) 해동시켰다. 일단 해동되면, 바이알을 마이크로퓨지(microfuge)에서 잠시 펄싱(5 내지 10초, 13,000 rpm)하여 임의의 벡터 물품이 뚜껑/캡 내부에서 확실히 수집되게 하고, 약 3회 아래위로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하여 현탁시켰다. 해동 후, 해동된 벡터를 젖은 얼음 위에 유지시키고, 냉동 보관으로부터 제거하고 3시간 이내에 사용하였다. 벡터의 모든 희석액은 세포 배양 배지로 만들었다.
T 세포 형질도입 및 증식
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 난소암 환자로부터 피콜 밀도 원심분리에 의해 수집하고, 분취액으로 동결시켰다. 분취액 해동 시, PBMC로부터의 T 세포를 음성 분리(negative isolation)(Miltenyl Blotec)에 의해 농축하고, 적절한 렌티바이러스 벡터, 항-CD3/CD28 다이나비드(Invitrogen, 영국) 및 IL-2(100 IU/mL; Novartis)와 혼합하였다. T 세포는 신선한 배지를 사용하여 다음 7 내지 14일 동안 수적으로 증가하였으며, IL-2는 필요에 따라(보통 2 내지 3일마다) 첨가하였다. 다이나비드를 자성 분리에 의해 3 내지 5일 후에 배양물로부터 제거하였다. 1 내지 7일에는 300 IU/mL의 IL2가, 나머지 날에 100 IU/mL로 감소하였다. 배양 종료 시, 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 피콜 밀도 원심분리에 의해 죽은 세포를 제거하고, 트립판 블루 배제 및 혈구 계수기 계수에 의해 생존 세포 수를 결정하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 난소암 환자로부터 유래된 PBMC의 형질도입 수준은 H8 또는 2E4 CAR 구조체를 사용할 때 건강한 공여자의 형질도입과 비슷하다.
CAR-T 세포 기능성의 평가
시험관 내 기능성 분석은 96웰 플레이트의 개별 웰의 200 μL의 배지에서 1:1 비로 CAR-T 세포 집단 및 매치된 표적 종양 세포의 공동 배양을 포함하였다. 동시에, CAR-T 세포를 단독으로 배양하고(음성 대조군), 50 ng/mL PMA 및 1 μg/mL 이오노마이신과 함께 배양하였다(양성 대조군). 37℃에서 24시간의 항온처리 후, 상청액을 수집하고, 사이토카인 생성을 측정하였다. 제조사의 설명서에 따라 IFNγ 및 IL-2 ELISA 키트(둘 모두 Diaclone, 프랑스)를 이용하여, IFNγ 및 IL-2 생성을 측정할 수 있다.
도 9는 환자의 CAR-T 5T4 세포가 SKOV-3 및 OVCAR-3 세포주뿐만 아니라 그들 자신의 (자가) 종양 분해물과의 공동 배양에 반응하여 IFNγ를 분비함을 보여준다.
실시예 5. 난소암 모델에 대한 생체 내 효능
다음 실시예는 NSG 마우스에서 확립된 SKOV-3 종양에 대한 5T4 특이적 CAR 시험에 초점을 맞추었다. NHSBT로부터 수득한 백혈구 연층(buffy coat)을 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)의 공급원으로 사용하였다. CD3+ T 세포를 음성 분리(Miltenyi Biotec)에 의해 분리하고, 다이나비드로 활성화시키고, 사전에 시험된 양의 항-5T4(H8).CD28.CD3ζ(5T4.CD28ζ) 또는 항-5T4(H8).4-1BB.CD3ζ(5T4.4-1BBζ) CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 이어서, 형질도입된 세포를 CAR 발현 및 시험관 내 기능에 대한 분석 전에 시험관 내에서 증식시킨 후, 확립된 SKOV-3.Luc 종양을 갖는 NSG 마우스에 정맥 내 주입하였다. 이는 아래에서 더 상세히 설명한다.
CAR T 세포의 시험관 내 생성.
백혈구 연층(BC) 92 및 102를 사용하여 T 세포를 공급하였다. BC92로부터, T 세포 분리는 CD14+ 골수 세포(14에서 2.4%) 및 CD19+ B 세포(12.3에서 0.7%)의 빈도는 감소시키면서, CD3+ T 세포 빈도를 53%에서 83%로 증가시켰다. BC108로부터, CD3+ T 세포는 36.6에서 81.5%로 농축되었고, CD14+ 골수 세포 및 CD19+ B 세포 각각은 1% 미만의 상대적 빈도로 감소되었다(CD14+ 28.3에서 0.9%; CD19+ 22.7에서 0.5%).
대략 1 내지 1.5×106 CD3+ T 세포를 사용하여 다이나비드(1:1 비율), IL-2(100 IU/mL) 및 렌티바이러스 벡터를 포함하는 초기 형질도입 배양물을 확립하였다. 7일 후, 배양물로부터 다이나비드를 제거하고, 세포를 계수하고, 대략 0.5×106개의 세포를 2주 동안 빠른 증식을 위해 사용하였다(배양 7일 후 3개의 동종 공여체(allo-donor), 항-CD3, 항-CD28 및 300 IU/mL의 IL-2로부터 조사된(irradiated) 피더 세포(feeder cell)로 배양하여 100 IU/mL로 감소됨). 이 시점에서, T 세포를 수집하고, 피콜처리하고, 세척하여 계수하였다. 각각의 경우에, 각각의 배양물(모의(Mock), 5T4.CD28ζ, 5T4.4-1BBζ)에 대해 최소 200배의 증식이 관찰되었고, > 108개의 총 세포가 생성되었다.
5T4 CAR T 세포의 생체 내 시험
5T4 CAR의 초기 생체 내 시험은 다른 CAR/TCR 모델을 위해 이전에 본 그룹에서 사용된 설계를 따랐다. 간략하게는, 대략 2.5×106 SKOV3.Luc 세포를 수용자 NSG(NOD/SCID IL-2Rγ-/-) 마우스에 복강 내 경로로 주사하고, 7일 후 CAR-T 세포를 IV 경로로 주입하였다(대략 총 2×107개 세포). 동물은 6일째(T 세포 이식 1일 전)에 이어서 마우스를 희생시킨 대략 60일까지 그 이후에 정기적으로 Bruker 시스템으로 이미지화하였다. 이 시점은 본 발명자들의 이전 연구에서 NSG 마우스가 인간 T 세포가 마우스 조직 항원을 인식한 결과 인간 T 세포 이식 후 약 50 내지 60일 후 이종 이식편 대 숙주병(xGvHD)의 증상이 나타나기 시작함을 보여주었기 때문에 선택되었다.
Bruker 이미지화는 동일한 백혈구 연층으로부터 식염수 또는 2×107 대조군, 형질도입되지 않은 모의 T 세포를 받는 마우스가 발광 수준의 증가를 나타냄을 명백히 보여주었다. 이는 식염수 및 모의 T 세포 처리 동물이 모두 종양 투여 45일 이내에 종양에 굴복한(succumbing) 것과 상관관계가 있었다. 한 세트의 샘플에서, 5T4 CAR-T 세포 그룹 둘 다에 대해 발광 증가가 관찰되지 않았으며, 이들 마우스는 모두 종양의 증거 없이 60일 말까지 생존하였다. 또 다른 세트의 샘플에서는, 5T4.CD28ζ CAR-T 세포와 비교하여 5T4.4-1BBζ CAR-T 세포를 받는 마우스에서 약간의 발광 증가가 있는 것으로 나타났고, 5T4.4-1BBζ 종양 그룹의 한 마리는 60일 말 이전에 종양으로 사망하였다. 5T4.CD28ζ CAR 처리군에서는 종양으로 사망한 동물이 전혀 없었다.
도 10은 식염수 또는 모의 형질도입된 T 세포를 받은 대조군과 비교하여 5T4 CAR T 세포로 처리된 NSG 마우스의 생존을 나타낸다.
모든 실험의 생존을 조합하면, 5T4.CAR T 세포 처리군 둘 다 식염수 및 모의 처리된 동물과 비교할 때 생존에 있어서 매우 유의미한 차이가 있었다(p <0.001, 로그 순위 검정).
실시예 6. 난소암 모델에 대한 최소 용량 및 전달 경로 요건
본 연구는 (상기 나타낸 바와 같은) 난소(SKOV-3) 종양 세포주를 가지고 있는 쥣과 NSG 마우스 모델에서 효능을 입증하는 데 요구되는 5T4-CAR 형질도입 T 세포의 최소 용량을 추정하고자 설계되었다.
또한, 본 연구는 CAR-T 세포 전달의 정맥 내 경로를 복강 내 경로와 비교하였다.
형질도입
다음의 벡터를 본 연구에 사용하였다.
형질도입은 상기 기술된 프로토콜과 유사하게 수행하였다. 간략하게는, 정상적인 건강한 공여자(NHS BT 또는 지원자로부터의 헌혈로부터 공급된 버피 콘(buffy cone))로부터의 피콜 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 수집하고, 분취액으로 냉동시켰다. 분취액 해동 시, PBMC로부터의 T 세포를 음성 분리(Miltenyl Biotec)에 의해 농축하고, 적절한 렌티바이러스 벡터, 항-CD3/CD28 다이나비드(Invitrogen, 영국) 및 IL-2(100 IU/mL; Novartis)와 혼합하였다. T 세포를 다음 7 내지 14일에 걸쳐 신선한 배지로 증식시키고, 필요에 따라(보통 2 내지 3일마다) IL-2를 첨가하였다. 다이나비드를 자성 분리에 의해 3 내지 5일 후에 배양물로부터 제거하였다. 더 많은 수의 T 세포가 필요한 경우, 빠른 증식 프로토콜은 조사된 피더 세포(동결된 동종이계 NHSBT 버피 콘으로부터의 3개의 공여 PBMC를 모아 조사함(25 Gy, 패터슨 빌딩 X선 공급원))를 피더 세포 100: CART 세포 1의 비율로 CART 세포와 함께 배양하고, 30 ng/ml의 항-CD3(OKT3; 오르토클론, Janssen Cilag) 및 CD28(R&D systems) 항체에 더하여 IL-2(Chiron, 네덜란드 암스테르담)로 유사분열적으로(mitogenically) 자극하고, 14일 동안 이틀마다 IL-2 공급하는 단계를 포함한다. 1 내지 7일에는 300 IU/mL의 IL-2가, 나머지 기간 동안 100 IU/ml로 감소하였다. 배양 종료 시, 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 피콜 밀도 원심분리에 의해 죽은 세포를 제거하고, 트립판 블루 배제 및 혈구 계수기 계수에 의해 생존 세포 수를 결정하였다.
최소 용량 연구군
최소 용량 평가를 위한 연구 프로토콜
1. 0일: 100 μL 식염수 중 2.5×106 SKOV-3 Luc 세포를 복강 내(IP) 주사함.
2. 7일: 100 μL 식염수 중 5T4 CAR-T 세포를 정맥 내(IV) 경로에 의해 주입함(용량은 상기 표를 참조; 대조군 동물은 2×107 모의 형질도입 세포 및 식염수만을 처리함)
3. 6, 13, 20, 27, 34, 41 및 48일: Lumina 시스템을 이용한 종양의 IVIS 이미지화
4. 14, 21, 28 및 60일: T 세포 생착(engraftment) 분석을 위한 꼬리 채혈.
60일: 실험 종점. 가능한 경우, 종양이 발생한 동물로부터 조직을 수집할 것임.
연구 그룹의 투여 경로
투여 경로의 평가를 위한 연구 프로토콜
1. 0일: 1001-11 식염수 중 2.5×106 SKOV-3 Luc 세포를 i.p 주사함.
2. 7일: 5T4 CART 세포를 복강 내(i.p.) 또는 i.v. 경로로 주입함(용량 세부사항에 대해서는 표 3을 참조; 대조군 동물은 2×107 모의 형질도입 세포 및 식염수만을 처리함)
3. 6, 13, 20, 27, 34, 41 및 48일: Lumina 시스템을 이용한 종양의 IVIS 이미지화
4. 14, 21, 28 및 60일: T 세포 생착 분석을 위한 꼬리 채혈.
5. 60일: 조직을 수집하고, 5T4 발현을 결정하고 또한 5T4 CAR을 조사(interrogate)하기 위한 IHC에 이용할 수 있음. 말단 혈액(terminal bleed)을 수집하고, 5T4 CAR-T 세포에 대한 유세포 분석에 의해 분석함. CAR-T 세포가 충분한 수로 존재하는 경우, 생착된 CAR-T 세포 기능의 시험관 내 평가를 사이토카인 생성에 대하여 5T4+ 및 5T4- 표적 세포와의 시험관 내 공동 배양에 의해 평가함(배양물 상청액의 ELISA 또는 세포 내 유세포 분석법에 의함).
최소 효능 용량에 대한 결과
이 실험에서, SKOV3.Luc 종양 보유 NSG 마우스는 종양 성장에 대항하여 2.2×105 CAR-T 세포의 용량과 같은 0.1×107 T 세포의 용량까지 5T4.CD28ζ CAR-T 세포의 용량에 의해 효과적으로 보호된다는 것이 생물발광으로부터 분명해졌다. 또한, 5T4.4-1BBζ CART 세포군의 모든 마우스가 실험 종료 시점까지 종양이 발생하였다는 것 또한 분명하였다.
식염수 및 모의 T 세포군에서 마우스의 평균 생존은, 0.3×107 5T4.CD28ζ CART 세포군이 비종양 관련 사건에 의해 영향을 받았지만, 5T4.CD28ζ CART 세포군에서 가장 낮은 T 세포 용량의 경우 95일 및 0.3×107 5T4.CD28ζ CART 세포군에서 86일과 비교하여, 둘 다 56일이었다. 나머지 5T4.CD28ζ CART 세포군에 대한 평균 생존은 이들 실험군 각각에서 높은 생존율로 인해 결정할 수 없었다(도 11). 이에 비해, 가장 높은 5T4.4-1BBζ T 세포 용량(7.6×105 CAR-T 세포와 동등한 107 T 세포)은 실험 종료 시 상당한 종양 부하(tumor load)를 나타내었으나 살아남은 한 마리가 116일의 평균 생존을 달성하여, 대조군에 비해 개선된 생존 수준을 보여주었다. 0.3×107 T 세포군(2.3×105 CART 세포; 평균 생존 78일)에서 종양 성장 지연이 관찰되었지만, 2개의 가장 낮은 CAR-T 세포군(7.6×104 CAR-T 세포와 동등한 0.1×107 총 세포 및 2.3x104 CAR-T 세포와 동등한 0.03×107 총 세포)에서는 효과적인 항종양 반응이 관찰되지 않았다.
종합하면, 이 실험은 2.2×105 5T4.CD28ζ CAR-T 세포만이 유의미한 생체 내 항종양 효과를 전달함을 입증하였다. 이 용량의 CART 세포가 이 특정 실험에서 모든 종양을 근절시키지는 못했지만, 확립된 SKOV-3 종양을 갖는 마우스의 생존은 7.6×105 5T4.4-1BBζ CAR-T 세포로의 치료법에 의해 증진되었다.
투여 경로에 대한 결과
생물발광 이미지(도 12)는 IV 또는 IP 경로에 의해 고용량의 5T4.CD28ζ CAR-T 세포를 투여 받은 마우스에서 SKOV3-Luc 종양 성장이 제어됨을 보여주었다(6.5×105 CAR+ T 세포와 동등한 1×107 총 T 세포). 106 5T4.CD28ζ CAR-T 세포(6.5×104 CAR+ T 세포와 동등함)를 투여 받은 IV 및 IP 처리된 동물 모두에서 종양 성장의 명백한 지연이 있었지만, 종양은 이들 동물에서 발생하여 실험 종료 전에 각 군에서 사망을 초래하였다(6.5×105 CAR+ T 세포와 동등한 1×107 총 T 세포). 5T4.4-1BBζ CAR-T 세포를 투여 받은 동물의 경우, 모든 동물에서 종양 성장을 막을 수 없는 최고 용량의 CAR-T 세포(2.6 x 105 CAR+ T 세포와 동등한 1×107 총 T 세포)로 종양 성장에 대한 보호 수준이 감소되었다. 대조군 동물은 모두 74일 이내에 종양 성장에 굴복하였다.
조합된 그룹 발광 분석은, 28일까지는 IP 및 IV 106 5T4.CD28ζ CAR-T 세포군 둘 다에서의 종양 성장의 수준은 동등한 것으로 보이지만, 106 5T4.CD28ζ CAR-T 세포의 국소 IP 주입에 의한 일시적인 반응의 암시와 함께, 어느 경로에 의해 주어진 107 5T4.CD28ζ CAR-T 세포의 항종양 효능을 명확하게 보여준다.
중요하게는, 모든 5T4.CD28ζ CAR T 세포군은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의미한 정도의 종양 성장을 보여주었지만, 치료군 간에는 통계적 차이가 없었으며, 이는 이러한 원리 증명 실험의 군 규모가 작기 때문일 것이다. 대조적으로, 최고 용량의 5T4.4-1BBζ CAR-T 세포만이 28일까지 종양 성장의 증거가 나타나기 전에 대략 3주 동안, 종양 성장의 명백한 감소와 함께 SKOV-3-Luc 종양 성장에 유의미한 영향을 미쳤다. 그러나 개별적인 종양 성장 곡선은 종양 성장이 제어되고, 실제로 한 마리의 동물이 약 80일경에 도태(cull)되는 종양을 명백하게 발생시키는 나중 시점에서 두 마리의 동물에서 종양 성장이 감소된 전체 개체군과 비교하여 약간 더 복잡한 이야기를 그린다. CD28 기반의 CAR의 상대적으로 신속한 항종양 활성과 비교하여 4-1BBζ CAR 활성의 이러한 지연된 항종양 동역학은 Sadelain Lab의 최근 간행물에 기술된 바 있다(Zhao et al. (2015) Cancer Cell 28(4): 415-428).
CD28ζ 기반의 CAR에 의해 매개된 항종양 효과에 대한 이러한 관찰은 대조군 동물에 비하여 개선된 생존율로 해석되는 한편, 더 높은 용량의 IP 군에서 한 마리의 손실이 이 실험의 생존율 분석에 영향을 미쳤지만, 오로지 106 5T4.4-1BBζ IP만이 대조군에 비해 생존율에 유의미한 개선을 보여주었다.
종합하면, 이 연구는 IP 또는 IV 투여 경로 중 어느 하나에 의해 주입된 CAR-T 세포가 동등한 상대적 효능을 나타냄을 시사한다.
실시예 7. H8 및 2E4 α-5T4 항체를 가지는 CAR-T 세포 간의 비교
SKOV-3 난소암 모델에서 상이한 5T4 scFv(EF1α-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB 또는 EF1α-2E4-CAR-CD3ζ/4-1BB)를 이용하는 구조체를 비교할 때, 우수한 효능의 증거가 존재하는지를 결정하고자 본 연구를 수행하였다.
본 연구에 사용된 벡터를 아래에 나타내었다.
T 세포 형질도입은 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.
SKOV-3/NSG 종양 모델에 대한 처리군
결과
각 세포 집단의 5T4 특이적 반응을 SKOV-3 종양 세포와의 공동 배양에 의해 평가하였다. 모든 5T4-CAR T 세포 집단은 모의 형질도입 T 세포의 사이토카인 생산의 백그라운드(background) 이상으로 IFNγ 및 IL-2를 생산하였다. 게다가, CMV 프로모터에 비해 EF1α 프로모터를 함유하는 구조체는 더 높은 사이토카인 수준을 초래한 것으로 나타났다. 그러나 CMV 군에 대한 표현형 데이터의 부족으로 인해, CAR+ T 세포의 수가 EF1α 군과 비교하여 CMV 군에서 더 낮을 가능성이 적어서, 사이토카인 분비가 더 낮다고 할 가능성을 배제할 수 없다. 2E4 형질도입 T 세포의 백분율(29%)은 H8 구조체에 대한 것(12.9%)보다 더 높지만, 사이토카인 분비 수준은 더 낮은 H8과 2E4 구조체의 비교에 대해서는 동일한 설명이 적용되지 않는다.
SKOV-3 세포 접종(challenge)에 대한 5T4 CAR-T 세포 효능 평가를 이후에 NSG 마우스(상기 열거된 처리군)에서 생체 내 시험하였다. 생물발광은 SKOV3 종양 부하가 7일째(CAR-T 세포 투여일)에 군 전체에 걸쳐 비슷하였고, 종양 성장 지연이 EF1α-2E4-CAR-CD3ζ/4-1BB(2E4-EF1α) 및 EF1α-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB(H8-EF1α) 처리된 동물에서 나타났으나 CMV-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB 군에서는 그렇지 않았음을 보여주었다.
종합하면, 도 13에서 강조된 바와 같이, EF1α-2E4-CAR-CD3ζ/4-1BB T 세포와 비교하여 EF1α-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB T 세포에서 통계적으로 유의미한 생존율 증가가 있었다(P=0.008, 로그 순위, Mantel-Cox 검정). 표 5에 보고된 형질도입 효율을 기반으로, 107 표적 용량의 T 세포는 EF1α-2E4-CAR-CD3ζ/4-1BB로 형질도입된 2.9×106 CAR+ 세포 및 EF1α-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB로 형질도입된 1.29×106 CAR+ 세포를 함유하였다. 따라서, H8 구조체에서 나타난 우수한 효능은 CAR+ T 세포 용량 단독을 기반으로는 예상되지 않았으며, 구조체 그 자체가 이 모델에서 2E4-CAR-CD3ζ/4-1BB 균등물보다 더 강력함을 시사하였다.
실시예 8: 골수종 암 모델에 대한 생체 내 효능
골수종 세포주에 대한 5T4 CAR-T 세포 효능 평가를 위한 처리군
결과
상기 표에 상술된 바와 같이, NSG 마우스에 I.P. 또는 I.V. 투여 경로를 통하여 2×106 NCI-H929 세포를 접종하였다. 종양 접종 7일 후, 마우스를 I.V. 투여 경로를 통해 1×107 CAR-T 세포로 처리하였다. 형질도입된 T 세포의 표현형에 기초하여, EF1α-H8-CAR-CD3ξ/4-1BB로 형질도입된 5.98×106 CAR+ T 세포 용량이 전달되었고, EF1α-2E4-CAR-CD3ξ/4-1BB로 형질도입된 3.86×106 CAR+ T 세포가 전달되었다.
(낮은 수준의 5T4를 발현하는) NCI-H929 골수종 세포주를 이용한 IV 접종 후, EF1α-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB 형질도입 T 세포로 처리된 마우스는 모의 형질도입 T 세포 또는 EF1α-2E4-CAR-CD3ζ/4-1BB 형질도입 T 세포로 처리된 동물에 비해 통계적으로 유의미한 생존율 개선을 보여주었다(각각 P=0.0018 및 P=0.034; 도 14 참조).
실시예 9 - 골수종 세포에서 5T4의 발현
Oxford BioMedica의 항-5T4 H8 단일클론성 항체를 이용한 FACS에 의해 5T4 발현을 조사하였으며, 다음 방법에 따라 R&D Systems의 항-5T4 항체를 이용하여 면역조직화학을 수행하였다:
유세포 분석에 의한 5T4 발현의 평가
종양 세포 유세포 분석을 위해 사용된 항체는 항-5T4 H8 쥣과 단일클론성 항체였다; 이것을 직접적으로 PE-컨쥬게이션된 항체로서 사용하였다. 항체를 적정하여 종양 세포주 상에서 5T4의 세포 표면 발현의 검출을 위한 최적 농도를 결정하였다. 사용된 농도는 25 μg/ml 내지 0.5μg/ml 범위였다. 항체를 FACS 완충액(BD Biosciences; 영국 옥스포드)으로 희석하였다. 마우스 IgG1 이소형 대조군(BD; 영국 옥스포드; 적절하게 컨쥬게이션됨)을 음성 대조군으로 사용하였다.
계수 후, 세포를 PBS에 1×106개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 500 μl의 세포 현탁액을 각각의 FACS 튜브에 첨가하고, 세포를 4 ml의 총 부피의 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 희석된 항체를 펠릿화된 세포에 첨가하고, +4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 2차 항체가 첨가되는 경우, 세포를 상기와 같이 PBS로 세척하고, 항체를 첨가하고, 세포를 +4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 그런 다음, 세포를 다시 1 ml PBS로 세척하고, Cytofix(BD Biosciences; 영국 옥스포드)로 고정시켰다. 데이터를 BD FACSVerse(BD Biosciences; 영국 옥스포드)에서 획득하고, FACSuite 소프트웨어(BD Biosciences; 영국 옥스포드)에서 분석하였다.
5T4 염색을 위한 최적 항체 농도는 2.5 μg/mL인 것으로 나타났으며; 이 농도를 모든 후속 실험에서 사용하였다.
면역조직화학에 의한 5T4 발현의 평가
Figure 112019093193706-pct00012
각각 5분 동안 100% 자일렌에서 3X 세척하여 FFPE 절편을 탈랍(dewaxed)시켰다.
Figure 112019093193706-pct00013
각각 100%, 92% 및 70% 에탄올에서 5분 동안 세척하여 FFPE 절편을 재수화시켰다.
Figure 112019093193706-pct00014
그런 다음, 5분 동안 절편을 dH2O 중에 두었다.
Figure 112019093193706-pct00015
가열된 수조에서 95℃에서 30분 동안 1X 항원 회수 용액(antigen retrieval solution)(Dako)에서 절편을 먼저 항온처리한 다음, 실온에서 20분 동안 신선한 1X 항원 회수 용액에서 항온처리하여 항원을 회수하였다.
Figure 112019093193706-pct00016
그런 다음, 5분 동안 절편을 dH2O 중에 두었다.
Figure 112019093193706-pct00017
실온에서 1시간 동안 차단 용액(1% BSA 및 2% FBS 함유 PBS)에서 절편을 차단하였다.
Figure 112019093193706-pct00018
차단 완충액을 제거하였다. 프로토콜에 언급된 최대 세척 횟수 및 길이를 이용한 제조사의 설명서에 따라 Dako 증폭 키트를 사용하였다.
Figure 112019093193706-pct00019
5T4 항체(R&D)를 25 μg/ml로 사용하였고, 농도를 IgG1 대조군(ebioscience)과 매치시켰다.
Figure 112019093193706-pct00020
그런 다음, 절편을 1분 동안 헤마톡실린으로 대조염색한 후, dH2O 중에서 각각 5분 동안 3X 세척하였다.
Figure 112019093193706-pct00021
각각 70%, 92% 및 100% 에탄올에서 5분 동안 세척하여 절편을 탈수시켰다.
Figure 112019093193706-pct00022
100% 자일렌에서 절편을 각각 5분 동안 3X 세척하였다.
Figure 112019093193706-pct00023
절편을 DPX로 마운트시켰다.
Figure 112019093193706-pct00024
그런 다음, Mirax 스캐너를 이용하여 절편을 스캐닝하고, Panoramic Viewer 소프트웨어를 이용하여 이미지를 처리하였다.
FACS 결과를 도 15에 나타내었다. 시험한 5종의 다발성 골수종 세포주 중 3종에서 FACS에 의해 5T4 발현이 검출되었다: 골수종 세포주 JJN3, RPMI-8229 및 H929는 5T4 발현에 대해 양성이었다. U266 및 THEIL 세포주는 FACS에 의해 음성이었다. MFC7 유방암 세포를 양성 대조군으로 사용하였다.
면역조직화학적 염색을 이용하여 5T4 발현을 JJN3, RPMI-8226 및 H929 골수종 세포주에서 검출하였다. H929를 상기 기술된 연구에서 사용하였다.
결과를 도 16에 나타내었다. 도 16A 및 16B는 각각 음성(5T4에 대해 염색된 CHO 세포) 및 양성(안정적으로 5T4를 발현하며 5T4 발현에 대해 염색된 CHO 세포) 대조군을 나타낸다. 도 16C는 5T4 발현에 대해 염색된 MCF7 유방암 세포를 나타낸다. 도 16D는 5T4 발현에 대해 염색된 H929 골수종 세포를 나타낸다.
실시예 10 - 인간 골수종 샘플에서 5T4의 발현
다음의 방법에 따른 R&D Systems으로부터의 항-5T4 항체를 이용한 면역조직화학에 의해, 환자로부터 회수된 골수종 샘플에서 5T4 발현을 조사하였다.
Leica 마이크로톰을 이용하여 결장, 태반 및 다발성 골수종의 FFPE 블록으로부터 절편(4μm)을 준비하였다. 달리 언급되지 않는 한, 사용된 모든 시약은 EnVision™ FLEX+ 키트(Dako, K8012)의 일부였다.
Envision™ FLEX 표적 회수 용액을 이용하여, 20분 동안 97℃의 Dako PT Link 챔버에서 pH 6.1에서 절편의 항원을 회수하였다. pH 6.1에서 항원 회수 후, 5분 동안 절편을 Envision Flex 세척 완충액(pH 7.6, Dako, #K8007) 중에 둔 후, Dako Autostainer Plus에 로딩하였다. 그런 다음, 절편을 5분 동안 Envision Flex 퍼옥시다아제 차단 시약과 함께 항온처리한 다음, Flex 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 이후, 절편을 무혈청 단백질 차단 시약(Dako, # X0909)과 함께 10분 동안 항온처리하고, 무혈청 단백질 차단 시약을 공기 분사(air-jet)로 제거하였다.
모든 절편을 1차 항체와 함께 또는 1차 항체의 부재하에 30분 동안 항온처리하였다. 항-5T4 항체를 3.125 μg/ml으로 사용하고, 농도 및 종을 매치시킨 비면역 마우스 IgG1을 이소형 대조 항체로 사용하였다. 팬사이토케라틴(pancytokeratin, PCK)에 대한 항체와 함께 결장 절편을 항온처리함으로써 분석 시약을 검사하였다.
1차 항체와 함께 항온처리한 후, 절편을 Flex 세척 완충액으로 2회 세척하고, Flex HRP 고분자와 함께 20분 동안 항온처리한 다음, Flex 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 그런 다음, 모든 절편을 10분 동안 디아미노벤지딘(DAB) 기질과 항온처리한 다음, 증류수로 세척하였다.
절편을 헤마톡실린으로 대조염색하고, 농도를 점차 증가시킨 에탄올(90 내지 99%)에서 탈수시키고, 세 번의 자일렌 교체로 제거하고, DePeX 하에서 커버슬립을 덮었다. Aperio 스캔스코프 AT 터보 디지털 스캐너를 이용하여 디지털 이미지를 캡쳐하고, 연구진과 자문 병리학자가 분석하여 5T4 면역반응성을 평가하였다.
5T4 발현에 대해 평가된 16개의 샘플 중 2개는 때때로 약한 5T4 면역반응성 골수종 세포를 나타내었다. 한 샘플은 약한 내지 중간 정도의 면역염색을 보여주었고, 네 번째 샘플은 세포질 및 종양 세포의 원형질막에서 중간 정도의 면역염색을 나타내었. 전체적으로 4개의 샘플이 5T4 면역 반응성을 나타내었고(도 17), 나머지 12개 샘플은 5T4에 대해 음성이었고 5T4에 대해 25% 양성을 나타내었다.
실시예 11 - 혈액암에서 5T4의 발현
재료 및 방법
혈액 악성 종양에 대한 5T4 발현의 평가
아래 기술된 바와 같이 FACS 기계를 이용한 유세포 분석에 의해 혈액학적 악성 종양에 대한 5T4 발현을 평가하였다.
액형(liquid) 종양 샘플
다음의 혈액학적 악성 종양 환자로부터 골수 세포 또는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 샘플을 선별하였다:
i. 다발성 골수종,
ii. 만성 골수성 백혈병(CML)
iii. 만성 림프구성 백혈병(CLL)
iv. 급성 골수성 백혈병(AML)
v. B 세포 급성 림프아구성 백혈병(B-ALL)
vi. T 세포 급성 림프아구성 백혈병(T-ALL)
vii. 급성 전골수구성 골수성 백혈병(APML).
이들 샘플은 Tissue Solutions Ltd., Histologix Ltd. 및 맨체스터 암 연구센터(MCRC) 바이오뱅크로부터 입수하였다.
혈액 악성 종양에 대한 5T4 발현의 평가: 염색 프로토콜 및 게이팅 전략(gating strategy)
세포 바이알을 해동시키고, 10% FBS, 5 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린/100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 세척하고, PBS에 재현탁시켰다. 세포를 분석 대상 샘플에 대해 적절한 수의 FACS 튜브에 동일하게 나누었다. 이어서, 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 Zombie Aqua™와 함께 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 BD FACS 염색 완충제(카탈로그 번호 554656)로 세척하였다. 모든 환자 샘플을 APS로부터 얻어진 맞춤형 컨쥬게이션(custom conjugated) 5T4-PE 항체를 사용하여 염색하고, +2℃ 내지 +8℃에서 30분 내지 1시간 동안 아래의 각각의 섹션에 기재된 다양한 종양 마커로 염색하였다. 항온처리 후 세포를 염색 완충액으로 2회 세척하고, 제조사의 프로토콜에 따라 BD CytoFix(554655)에 재현탁시켰다. 이어서 세포를 펠릿화하고, PBS에 재현탁시켰다.
FACSVerse 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 획득을 수행하였다. 각각의 경우에, 라이브 셀 게이트에서 10,000개의 이벤트가 획득되었다. FlowJo 버전 10을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
존재하는 경우, 죽은 세포를 배제하기 위하여, Zombie Aqua™ 고정 생존 키트(BioLegend)를 사용하였다. FSC/SSC(Forward versus Side scatter)를 기초로 하여 세포 찌꺼기(debris)를 추가로 배제하였다.
결과
CLL, 다발성 골수종, B-ALL, AML, CML, APML 및 T-ALL 환자로부터 회수된 말초 혈액 및 골수 샘플을 유세포 분석에 의해 5T4 발현에 대해 평가하였다. 샘플에 존재하는 다른 비악성 세포 중에서 악성 세포 종류의 확인을 돕기 위한 몇몇 계통의 세포 표면 마커 및 암 줄기세포 표현형을 나타내는 마커를 이용하였다.
전체적인 연구 결과를 아래 표에 요약하였다. 5T4 발현이 상이한 혈액 악성 종양에서 나타남을 볼 수 있다.
CD34는 5T4가 CSC 상에서 발현되는지를 결정하기 위한 1차 표현형 마커로서 사용되었다. 아래 표에 나타난 바와 같이, 5T4는 다수의 암 줄기세포에서 발현되는 것으로 나타났다.
표: 혈액 악성 종양에서의 5T4 발현. 표는 5T4 양성인 것으로 결정된 샘플의 백분율 및 암 줄기세포에서의 발현이 검출되었는지 여부와 함께 FACS에 의해 5T4 발현에 대해 분석된 환자 샘플의 수를 나타낸다.
실시예 12 - 고형 종양 세포주의 암 줄기세포 상에서의 5T4 발현의 평가
고형 종양 세포주
단일층(monolayer)으로서의 배양(표준 세포 배양 조건) 후 또는 구체(sphere) 형성(CSC에 대해 농축됨) 후 5T4 발현에 대하여 다음의 세포주를 평가하였다:
i. OVCAR-3(난소암)
ii. MCF7(유방암)
iii. HCT116(결장직장암)
iv. HT29(결장직장암)
v. A549(폐암)
vi. U251(교아세포종)
단일층 세포 배양
HCT116, HT29, MCF7 및 A549 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS), 2 mM L-글루타민 및 50 μg/ml 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. OVCAR3 세포는 20% FBS, 10 μg/ml 인간 인슐린, 2 mM L-글루타민 및 50 μg/ml 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 배지에서 배양하였다. U251 세포는 10% FBS, 1% 피루브산 나트륨, 1% 비필수 아미노산, 2 mM L-글루타민 및 50 μg/ml 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 MEM 배지에서 배양하였다. 모든 세포는 95% 상대 습도의 37℃, 5% CO2/95% 공기 분위기에서 배양하였다.
구체 세포 배양
구체 배양을 위한 방법은 Farnie et al. (2007) Journal of the National Cancer Institute 99, 616-627로부터 조정하였다. 폴리-HEMA를 95% 에탄올에 용해시키고, 세포 배양 플라스크에 첨가한 다음, 에탄올을 밤새 증발시켰다. HCT116 및 HT29 세포를 기본 구체 배지(DMEM/F12, 100 IU/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 1x B27 보충)에서 배양하였다; MCF7, U251 및 A549 세포는 맘모스피어 배지(기본 구체 플러스 10 ng/ml hEGF, 5 μg/ml 인슐린, 0.5 μg/ml 하이드로코르티손)에서 배양하였고, OVCAR3 세포는 난소 구체 배지(기본 구체 플러스 20 ng/ml hEGF, 5 μg/ml 인슐린, 15 ng/ml hbFGF 및 0.4% FBS)에서 배양하였다.
실험 세포 배양 및 유세포 분석
각 세포주를 단일층 조건에서 2개의 T75 플라스크 및 상기 기술된 바와 같이 구체 조건에서 4개의 T175 플라스크에서 cm2 당 2000개의 세포로 배양하였다. 24시간 후, 각 세포주의 3개의 구형 플라스크 및 하나의 단일층 플라스크를 단일 세포 현탁액으로 수거하고, CD133-APC(시험당 5 μl, eBioscience™, cat # 17-1338-42) 또는 CD117-APC(시험당 5 μl, eBioscience™, cat # 17-1178-42)와 함께 또는 없이 5T4-PE(시험당 5 μl)로 라벨링하였다. 각각의 세포주 및 조건에 대해 상응하는 이소형 라벨링를 수행하였다(IgG1-PE, 시험당 12.5 μl; 및 IgG1-APC, 시험당 5 μl, eBioscience™, cat # 17-4714-82). 96 웰 플레이트에서 얼음 상에서 30분 동안 FACS 완충액(PBS, 5% FCS, 100IU/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신)에서 항체 라벨링을 수행한 후, 웰을 FACS 완충액 중에서 2회 세척하였다. MACSQuant Analyzer 10에서 유세포 분석을 수행하였고, FlowJo V10을 사용하여 분석을 수행하였다.
나머지 단일층 플라스크는 세포가 적어도 60% 컨플루언시에 도달할 때까지('벌크 세포(bulk cell)') 배양하면서 유지하였고, 나머지 구형 플라스크는 유세포 분석을 위해 단일 세포 현탁액으로 수거하기 전에 7일 동안 배양하였다. 항체 라벨링은 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과
결과를 도 19에 나타내었다. 이 연구의 데이터는 5T4가 연구된 세포주에 대한 암 줄기세포 상에서 발현됨을 입증한다. 또한, MFI의 일관된 증가는 암 줄기세포에서 세포 당 5T4의 잠재적으로 더 높은 발현을 시사한다.
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본 발명은 특정 바람직한 구현예와 관련하여 설명되었지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정 구현예에 과도하게 한정되어서는 안 된다는 점을 이해하여야 한다. 실제로, 분자 생물학, 세포 면역학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한, 본 발명을 실시하기 위한 기술된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
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Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 165 170 175 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 180 185 190 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile 195 200 205 Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly 210 215 220 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ala 225 230 235 240 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro 245 250 255 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Leu 260 265 270 Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro 275 280 285 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 290 295 300 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 305 310 315 320 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 325 330 335 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 340 345 350 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 355 360 365 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 370 375 380 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 385 390 395 400 Glu Leu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 405 410 415 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 420 425 430 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 435 440 445 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 450 455 460 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 465 470 475 480 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 485 490 495 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 500 505 510 Pro Pro Arg 515 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oncostatin M leader <400> 2 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser 20 <210> 3 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H8 anti5T4 domain <400> 3 Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 20 25 30 Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys 50 55 60 Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Val Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro 130 135 140 Thr Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 145 150 155 160 Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala 180 185 190 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Phe Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys 210 215 220 Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Ile Lys Arg <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 4 Ala Ala Ala 1 <210> 5 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 hinge <400> 5 Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu 1 5 10 15 Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 35 40 45 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 50 55 60 Asp 65 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 transmembrane region <400> 6 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 7 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 41BB costimulatory domain <400> 7 Lys Arg Gly Arg Lys 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agcatggcca gcatggaagt gcagctgcag cagagcggcc ctgacctcgt gaaacctggc 120 gcctccgtga agatcagctg caaggccagc ggctacagct tcaccggcta ctacatgcac 180 tgggtcaagc agagccacgg caagagcctg gaatggatcg gccggatcaa ccccaacaac 240 ggcgtgaccc tgtacaacca gaagttcaag gacaaggcca tcctgaccgt ggacaagagc 300 agcaccaccg cctacatgga actgcggagc ctgaccagcg aggacagcgc cgtgtactac 360 tgcgcccggt ccaccatgat caccaactac gtgatggact actggggcca agtgaccagc 420 gtgaccgtgt ctagcggagg cggaggatct ggcggcggag gaacaggcgg agggggatct 480 agcatcgtga tgacccagac ccccaccttc ctgctggtgt ctgccggcga cagagtgacc 540 atcacatgca aggcctccca gagcgtgtcc aacgacgtgg cctggtatca gcagaagcct 600 ggccagagcc ccaccctgct gattagctac accagctcca gatatgccgg cgtgcccgac 660 agattcatcg gcagcggcta tggcaccgac ttcaccttca ccatcagcac actgcaggcc 720 gaggacctgg ctgtgtactt ctgtcagcaa gactacaaca gcccccctac cttcggcgga 780 ggcaccaagc tggaaatcaa gagagccgcc gctctgagca acagcatcat gtacttcagc 840 cacttcgtgc ccgtgtttct gcccgccaag cctaccacaa cccctgcccc tagacctcct 900 accccagccc ctacaatcgc cagccagcct ctgtctctga ggcccgaggc ttgtagacct 960 gctgctggcg gagccgtgca caccagagga ctggatttcg cctgcgacat ctacatctgg 1020 gcccctctgg ccggcacatg tggcgtgctg ctgctgagcc tcgtgatcac cctgtactgc 1080 aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 1140 accacccagg aagaggacgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 1200 gagctgctga gagtgaagtt cagcagatcc gccgacgccc ctgcctacca gcagggacag 1260 aatcagctgt acaacgagct gaacctgggc agacgggaag agtacgacgt gctggacaag 1320 cggagaggca gggaccctga gatgggcggc aagcccagaa gaaagaaccc ccaggaaggc 1380 ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggaatgaag 1440 ggcgagcgga gaagaggcaa gggccacgat ggactgtacc agggcctgag caccgccacc 1500 aaggacacct atgacgccct gcacatgcag gctctgcccc ccagatga 1548 <210> 10 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1alpha promoter sequence <400> 10 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660 gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720 ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780 gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840 acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900 tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960 tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020 gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080 ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140 gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179 <210> 11 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E4 anti5T4 domain <400> 11 Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 20 25 30 Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Asp 50 55 60 Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Ser Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Ser Thr Met Ile Thr Thr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Val Met Thr Gln Thr Pro 130 135 140 Lys Phe Leu Leu Ala Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys 145 150 155 160 Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 180 185 190 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys 210 215 220 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Ile Lys <210> 12 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2E4 antibody sequence <400> 12 Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 20 25 30 Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Asp 50 55 60 Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Ser Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Ser Thr Met Ile Thr Thr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Val Met Thr Gln Thr Pro 130 135 140 Lys Phe Leu Leu Ala Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys 145 150 155 160 Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 180 185 190 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys 210 215 220 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Ile Lys <210> 13 <211> 514 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5T4-specific CAR sequence <400> 13 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser 20 25 30 Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys 35 40 45 Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln 50 55 60 Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn 65 70 75 80 Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Asp Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu Leu His Ser Leu Thr 100 105 110 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Ser Thr Met Ile Thr 115 120 125 Thr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 130 135 140 Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Asn Phe Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Ala Ser Ala Gly 165 170 175 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 180 185 190 Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 195 200 205 Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly 210 215 220 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 225 230 235 240 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe 245 250 255 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ala Ala Leu Ser 260 265 270 Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala 275 280 285 Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 290 295 300 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 305 310 315 320 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 325 330 335 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 340 345 350 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 355 360 365 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 370 375 380 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 385 390 395 400 Leu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 405 410 415 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 420 425 430 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 435 440 445 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 450 455 460 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 465 470 475 480 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 485 490 495 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 500 505 510 Pro Arg <210> 14 <211> 730 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding the 2E4 antigen binding moiety <400> 14 atggaagtgc agctgcagca gtctggcccc gagctcgtga aacctggcgc ctccgtgaag 60 atcagctgca aggccagcgg ctacagcttc accggctact acatgcactg ggtcaagcag 120 agccacgtga agtccctgga atggatcggc cggatcaacc cctacaacgg cgccaccacc 180 tacaaccagg acttcaagga caaggcctcc ctgaccgtgg acaagagcag cagcaccgcc 240 agcatggaac tgcacagcct gaccagcgag gacagcgccg tgtactactg tgccctgagc 300 accatgatca ccaccgcttg gtttgcctac tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtct 360 ccaggaggcg gaggatctgg cggcggagga acaggcggag ggggatctaa cttcgtgatg 420 acccagaccc ccaagttcct gctggcctct gccggcgaca gagtgaccat cagctgcaag 480 gccagccaga gcgtgtccaa cgacgtgggc tggtatcagc agaagcccgg ccagagcccc 540 aagctgctga tctacttcgc cagcaaccgg tacaccggcg tgcccgacag attcatcggc 600 agcggctacg gcaccgactt caccttcacc atcagcaccg tgcaggccga ggacctggcc 660 gtgtacttct gtcagcaaga ctacagcagc cctttcacct tcggctccgg caccaagctg 720 gaaatcaagg 730

Claims (45)

  1. 대상체에서의 혈액암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 5T4-표적화제를 포함하는 약학 조성물로서,
    상기 혈액암은 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia), 골수종(myeloma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukaemia), B 세포 급성 림프아구성 백혈병(B cell acute lymphoblastic leukaemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukaemia) 및 T 세포 급성 림프아구성 백혈병(T cell acute lymphoblastic leukaemia)으로부터 선택되는 것이고,
    상기 5T4-표적화제는:
    (i) 단일클론성 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편으로서, 상기 단일클론성 항체는 H8 5T4-특이적 항체를 기반으로 하고, H8 5T4-특이적 항체는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것; 또는
    (ii) 5T4-특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 또는 5T4에 특이적인 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)를 포함하는 면역세포로서, 상기 5T4-특이적 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 항체-약물 컨쥬게이트(conjugate)의 형태인 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포인 것인, 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 면역세포는 T 세포인 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 5T4-표적화제는 정맥 내 투여를 통해 투여되는 것인, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 대상체는 포유동물 대상체인 것인, 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 대상체는 인간 대상체인 것인, 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 5T4-표적화제는 동시적으로 또는 순차적으로 추가의 암 치료제와 병용하여 투여되는 것인, 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 대상체는 5T4 발현에 대해 사전 스크리닝되거나 사전 스크리닝되었던 적이 있는 것인, 약학 조성물.
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