JP2022500011A - 固形腫瘍を治療するためのキメラ抗原受容体細胞 - Google Patents

固形腫瘍を治療するためのキメラ抗原受容体細胞 Download PDF

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Abstract

本明細書に記載の組成物および方法は、ＣＡＲ Ｔ療法を使用して固形腫瘍を治療する。前記組成物は、シグレック（ｓｉｇｌｅｃ）タンパク質に結合する細胞外ドメインまたはペプチドホルモンキスペプチン（ｋｉｓｓｐｅｐｔｉｎ）に結合する受容体を含むＣＡＲを含む。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月３０日に提出された米国仮出願６２／７２５，０２５、２０１８年９月１３日に提出された米国仮出願６２／７３１，０７９、２０１８年１１月１日に提出された米国仮出願６２／７５４，１７５、２０１９年２月１９日に提出された米国仮出願６２／８０７，４８２、２０１９年５月３日に提出された米国仮出願６２／８４２，９３６、および２０１９年５月１６日に提出された米国仮出願６２／８４８，９８４の優先権の利益を主張し、そのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の情報
２０１９年８月２９日頃に作成された、ファイルサイズが約５３３ ＫＢの「ＳＤＳ１．００５３ＰＣＴ ８−２９−２０１９＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するコンピューターで読み取り可能なテキストファイルには、本出願の配列表が含まれており、そのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、修飾細胞および用途に関し、具体的には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞を用いて癌を治療するための組成物および方法に関する。
既存のほとんどの癌治療法には、手術、放射線療法、化学療法、標的療法および免疫療法が含まれる。従来技術には、末期癌患者の治療効果が良くなく、副作用があり、患者の生活の質が低下するという欠点がある。例えば、腎臓癌の治療には、切除術、標的療法（抗ＶＥＧＦやｍＴＯＲ阻害剤など）や免疫療法（ＩＬ−２、ＰＤ１抗体など）が含まれる。膵臓癌の治療には、外科的切除、放射線療法および化学療法がある。尿路上皮癌の治療には、外科的切除、化学放射線療法、標的療法および免疫療法が含まれる。乳腺癌の治療には、外科的切除、化学放射線療法、標的療法および免疫療法が含まれる。卵巣癌の治療には、外科的切除、放射線療法、化学療法および標的療法が含まれる。前立腺癌の治療には、外科的切除、化学放射線療法、標的療法および免疫療法が含まれる。食道癌の治療には、外科的切除、放射線療法および化学療法が含まれる。結腸直腸癌の治療には、外科的切除、放射線療法、化学療法および標的療法が含まれる。子宮内膜癌の治療には、外科的切除、放射線療法、化学療法および標的療法が含まれる。
実施形態には、特定の抗原が、腫瘍細胞での発現が正常組織での発現と比較して相対的に低いということが見られる。また、正常組織で発現している場合、他のいくつかの抗原は、特定の組織（例えば、細胞集団または臓器）で特異的に発現しており、かつその組織上の正常細胞を死滅させることは、患者に生命を脅かす事象（例えば、合併症）を引き起こさない。非必須組織の例としては、前立腺、乳腺などの臓器、またはメラノサイトが挙げられる。従って、本開示の実施形態は、これらの抗原の少なくとも１つを結合する細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびＣＡＲを含む細胞を用いた癌の治療に関する。
実施形態は、ＣＡＲ細胞を用いて癌を治療するための組成物および方法に関する。実施形態は、ＣＡＲをコードする単離核酸配列に関するものであり、ここで、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、ＣＡＲの細胞外ドメインは、固形腫瘍の抗原に結合する。抗原は、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ １２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、ＡＬＰＰ、ＳＬＣ２Ａ１４、ＧＳ１−２５９Ｈ１３．２、ＥＲＶＦＲＤ−１、ＡＤＧＲＧ２、ＥＣＥＬ１、ＣＨＲＮＡ２、ＧＰ２またはＰＳＧ９を含み得る。
本発明の概要は、主張された主題の主な特徴または必要な特徴を特定することを意図しておらず、主張された主題の範囲を制限するために使用されることも意図していない。
図面と組み合わせて具体的な実施形態について説明する。異なる図面で使用される同じ参照番号は、類似または同一の項目を示す。
ＣＡＲ構造の一例を示す模式図である。 ＣＡＲを発現するＴ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 抗ＳＩＧＬＥＣ１５ ＣＡＲの殺傷アッセイの結果を示す。 抗ＳＩＧＬＥＣ１５ ＣＡＲのサイトカイン放出アッセイの結果を示す。 抗ＳＩＧＬＥＣ１５ ＣＡＲのサイトカイン放出アッセイの結果を示す。 抗ＫＩＳＳＲ ＣＡＲの殺傷アッセイの結果を示す。 抗ＫＩＳＳＲ ＣＡＲのサイトカイン放出アッセイの結果を示す。 ＡＣＰＰ抗体のフローサイトメトリーアッセイを示す。 ＡＣＰＰ抗体のフローサイトメトリーアッセイを示す。 ＡＣＰＰ抗体のフローサイトメトリーアッセイを示す。 前立腺癌のパラフィン切片の免疫蛍光染色を示す。 ＡＣＰＰを発現する２９３Ｔ細胞を示す。 ＡＣＰＰ ＣＡＲを発現するＴ細胞のサイトメトリーアッセイを示す。 共培養アッセイの結果を示す。 ＡＣＰＰに応答した抗ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞のＩＦＮ−γ放出を示す。 ヒトＣＡＲ抗体を検出することにより、Ｔ細胞上の抗ＡＣＰＰ ＣＡＲのＣＡＲ発現を測定できることを示す。 抗ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン放出アッセイを示す。 様々な条件でのＣＤ１３７の発現を示す。 様々な条件でのＣＤ１３７の発現を示す。 ＥＬＩＳＡアッセイ後のマウス血清中のＵＰＫ２−Ｈｉｓに対する抗体価を示す。 ８つのファージディスプレイ抗体のＵＰＫ２−Ｈｉｓへの結合を、ファージＥＬＩＳＡに基づいて分析したものを示す。 組換えモノクローナル抗体と組換えＵＰＫ２−Ｈｉｓとの結合のＥＬＩＳＡ分析を示す。 組換え抗ＵＰＫ２ ｍＡｂの特異性のＥＬＩＳＡ分析を示す。 結合分子の例示的な構造を示す。 マーカーとその用途の表を示す。 ＣＡＲの例示的な構造を示す。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解しているものと同じ意味である。本開示の実施または試験において本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料も依然として記載されている。本開示の目的のために、以下の用語は次のように定義される。
冠詞「１つ（ａ／ａｎ）」は、１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の文法的目的語を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素」は１つの要素または複数の要素を意味する。
「約」とは、参照数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの変化が２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％に達することを意味する。
本明細書で使用されるように、「活性化」という用語は、検出可能な細胞の増殖を誘導するのに十分に刺激されている細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生および検出可能なエフェクター機能と関連し得る。「活性化されたＴ細胞」という用語は、特に、細胞分裂しているＴ細胞を指す。
「抗体」という用語は最も広く使用されており、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを指し、望ましい生物学的活性または機能を示せばよい。本開示における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂとＦ（ａｂ）２、および一本鎖抗体とヒト化抗体（Ｈａｒｌｏｗら，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗら，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）を含む様々な形態で存在し得る。
「抗体フラグメント」という用語は、全長抗体の一部、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域を指す。抗体フラグメントの他の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２とＦｖフラグメント、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。「Ｆｖ」という用語は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントを指す。このフラグメントは、緊密で、非共有結合される１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインを折り畳むことにより、６つの超可変ループ（Ｈ鎖からの３つのループとＬ鎖からの３つのループ）が生成され、抗原結合に使用されるアミノ酸残基を提供し、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むＦｖの半分）であっても、その親和性が結合部位全体（二量体）よりも低いが、抗原を認識して結合する能力がある。
本明細書で使用される「抗体重鎖」は、自然に存在するコンフォメーションですべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。本明細書で使用される「抗体軽鎖」は、自然に存在するコンフォメーションですべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。Κおよびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。「合成抗体」という用語は、例えば、ファージによって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。前記用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成、および抗体を得るためまたは抗体をコードするアミノ酸を得るためのＤＮＡ分子の発現によって生成された抗体を含む。合成ＤＮＡは、当技術分野で利用可能でよく知られている技術を使用して得られる。
「抗原」という用語は、抗体産生、または特異的免疫機能を持つ細胞の活性化、またはその両方を含み得る、免疫応答を誘発する分子を指す。抗原は、すべてのタンパク質やペプチドを含む任意の高分子、または組換えやゲノムＤＮＡに由来する分子を含む。例えば、ＤＮＡは、免疫応答を誘発するタンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列または一部のヌクレオチド配列を含むため、本明細書で使用される用語「抗原」をコードする。抗原は、遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はない。抗原は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生体液を含む生体サンプルから生成、合成、または誘導することができる。
本明細書で使用されるように、「抗腫瘍作用」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存数の減少、腫瘍細胞を有する被検体の平均余命の増加または癌性病態に関連する様々な生理学的症状の改善に関連する生物学的作用を指す。「抗腫瘍作用」は、そもそも腫瘍の発生を予防する際のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によって明らかにすることができる。
「自己抗原」という用語は、免疫系によって外来であると誤認される抗原を指す。自己抗原には、細胞表面受容体を含む、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質が含まれる。
「自己の」という用語は、その後同じ被検体に再導入される、被検体に由来する材料を説明するために使用される。
「同種異系の」という用語は、同じ種の異なる被検体に由来する移植片を説明するために使用される。一例として、ドナー被検体は、関連または非関連またはレシピエント被験体であり得るが、ドナー被検体はレシピエント被験体と同様の免疫系マーカーを有する。
「異種の」という用語は、異なる種に由来する被検体の移植片を説明するために使用される。一例として、ドナー被検体はレシピエント被験体とは異なる種に由来し、ドナー被検体およびレシピエント被験体は遺伝的および免疫学的に不適合であり得る。
「癌」という用語は、異常な細胞の急速で制御されない成長を特徴とする疾患を指す。癌細胞は、局所的に転移し、または血流とリンパ系を介して体の他の部分に転移する可能性がある。様々な癌の例としては、乳腺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが含まれる。
治療される可能性のある癌には、血管新生されていない、またはまだ実質的に血管新生されていない腫瘍、および血管新生された腫瘍が含まれる。癌は、非固形腫瘍（例えば、白血病やリンパ腫などの血液腫瘍）、または固形腫瘍を含んでもよい。本開示のＣＡＲで治療される癌の種類には、癌腫、芽細胞腫および肉腫、ならびに特定の白血病またはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに肉腫、癌腫や黒色腫などの悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されるものではない。成人腫瘍／癌および小児腫瘍／癌も含まれる。
血液癌は、血液または骨髄の癌である。血液学的（または血行性）癌の例としては、急性白血病（急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性の白血病や赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病や慢性リンパ性白血病など）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度型および高悪性度型）、多発性骨髄腫、ウォルデンストロームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および骨髄異形成症を含む白血病が含まれる。
固形腫瘍は、通常、嚢胞や液状の部分を含まない異常な組織の塊である。固形腫瘍には、良性のものと悪性のものがある。様々な種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類に応じて命名される（肉腫、癌腫やリンパ腫など）。肉腫や癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫およびＣＮＳ（中枢神経系）腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫や混合神経膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫とも呼ばれる）、星細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫や脳転移など）が含まれる。固形腫瘍抗原は、固形腫瘍で発現される抗原である。実施形態では、固形腫瘍抗原はまた、健康な組織において低レベルで発現される。固形腫瘍抗原およびその関連する疾患腫瘍の例を表１に提供する。
Figure 2022500011
Figure 2022500011
明細書全体において、文脈によって別段の要求をしていない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という言葉は、前記ステップや要素（成分やコンポーネント）或いはステップや要素の群を含むことを示唆するが、他のステップや要素或いはステップや要素の群を除外しないように理解される。
「・・・からなる」という語句は、「・・・からなる」という語句の後のあらゆるものを含み、かつそれに限定されることを意味する。従って、「・・・からなる」という語句は、リストされた要素が必須または必要であり、他の要素が存在しないことを示す。
「基本的には・・・からなる」という語句は、語句の後にリストされた任意の要素を含み、かつ本開示においてリストされた要素に対して指定された活動または動作に妨害または影響しない他の要素を含み得ることを意味する。従って、「基本的には・・・からなる」という語句は、リストされた要素が必須または必要であるが、他の要素は選択可能であり、リストされた要素の活動または動作に影響するかどうかに応じて、存在する場合と存在しない場合があることを示す。
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と相補的である。相補性は、核酸の一部の塩基のみが塩基対合規則に従って一致する「部分的な」相補性であってもよく、核酸間に存在する「完全な」または「全体的な」相補性であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に大きな影響を与える。
「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ）」または「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」という用語は、（ａ）参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と実質的に同一または相補的であるか、ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸配列と同じのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または（ｂ）参照ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸配列と実質的に同じのアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチド、を意味する。
「共刺激リガンド」という用語は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子を指し、それがＴ細胞上の相同の共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが担持されたＭＨＣ分子との結合によって提供される一次シグナル以外のシグナルを提供し、前記シグナルは、増殖、活性化、分化および他の細胞応答の少なくとも１つを含むＴ細胞応答を媒介する。共刺激リガンドは、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、ＣＤ７のリガンド、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを含み得る。共刺激リガンドは、特に、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなど、Ｔ細胞に存在する共刺激分子と特異的に結合するアゴニストまたは抗体、をさらに含む。
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の相同結合パートナーを指す。共刺激分子は、ＭＨＣ クラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌ様受容体を含む。
「共刺激シグナル」という用語は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞の増殖および／または主要分子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを引き起こすシグナルを指す。「疾患」および「病状」という用語は、互換的に使用されてもよいし、特定の疾患または病状の病原性物質が分からない（従って、病因がまだ解明されていない）可能性があるため、疾患としてまだ周知されておらず、臨床医によって多かれ少なかれ特定の症状が特定されている望ましくない状態または症候群としてのみ認識されているという点で、異なる場合がある。「疾患」とは、被検体の健康状態が恒常性を維持できない状態であり、疾患が改善されなければ、被検体の健康が悪化し続ける状態をいう。対照的に、被検体の「病症」とは、動物が恒常性を維持できる健康状態であるが、その動物の健康状態が、病症がない場合よりも好ましくない状態である。無治療のまま放置しても、病症があるからといって、動物の健康状態がさらに低下するとは限らない。
「有効」という用語は、望ましい、期待された、または意図された結果を達成するのに十分であることを意味する。例えば、治療設定における「有効量」は、治療上または予防上の有益性をもたらすのに十分な化合物の量であり得る。「エンコード」という用語は、決定されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）、または決定されたアミノ酸配列およびその結果として生じる生物学的特性のいずれかを有する生物学的プロセスにおいて、他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして機能するために、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおける特定ヌクレオチド配列の固有特性を指す。従って、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合に、前記遺伝子は前記タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一のヌクレオチド配列（「Ｕ」で「Ｔ」が置換されていることを除き、通常は配列表に記載されている）を有するコード化鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡ転写のテンプレートとして使用される非コード化鎖は、いずれも、前記遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするものとして参照することができる。
「外因性」という用語は、野生型の細胞または生物体に自然に存在しないが、通常は分子生物学的技術によって細胞内に導入される分子を指す。外因性ポリヌクレオチドの一例として、ベクター、プラスミドおよび／または所望のタンパク質をコードする人工核酸構築物が含まれる。ポリヌクレオチドおよびタンパク質に関して、「内因性」または「自然的」という用語は、与えられた野生型の細胞または生物体内に見出され得る自然に存在するポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列を指す。同様に、分子生物学的技術によって、第１の生物体から単離して第２の生物体に転移された特定のポリヌクレオチド配列は、第２の生物体に対して「外因性」のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列と見なされる。具体的な実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、分子生物学的技術によって、そのようなポリヌクレオチド配列を含んでいる微生物に「導入」することができ、例えば、自然に存在するポリヌクレオチド配列の１つ以上の他のコピーを作成し、コードされたポリペプチドの過剰発現を促進する。「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に操作可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって提供され、またはインビトロ発現系において提供され得る。発現ベクターは、当技術分野で知られている、組換えポリヌクレオチドを組み込んだすべてのもの、例えば、コスミド、プラスミド（例えば、裸、またはリポソームに含まれている）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む。
「相同」という用語は、２つの比較される配列の１つの位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、２つのポリペプチド間または２つのポリヌクレオチド間の配列類似性または配列同一性を意味し、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占有されている場合、分子は前記位置で相同である。２つの配列間の相同性の割合は、２つの配列が共有している一致するまたは相同な位置の数を、比較された位置の数で割ったもの×１００の関数である。例えば、２つの配列における１０個の位置のうち６個の位置が一致しまたは相同であれば、２つの配列は６０％の相同性を有する。例えば、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を有する。相同性が最大になるように、２つの配列をアラインメントしたときに比較が行われる。
「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスを指す。このようなタンパク質に含まれるメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥの５つである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、消化管分泌物、呼吸器や生殖器の粘液分泌物などの体内分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの被検体における一次免疫応答で産生される主な免疫グロブリンである。凝集、補体固定および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌やウイルスからの防御に重要な役割を果たしている。ＩｇＤは、既知の抗体機能を有しないが、抗原受容体として機能できる免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンへの暴露時に、肥満細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことにより、即時型の過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
「単離」という用語は、基本的または実質的には、通常、その自然状態でそれに付随する成分を含まない材料を指す。前記材料は、細胞、またはタンパク質や核酸などの高分子であり得る。例えば、本明細書で使用される「単離ポリヌクレオチド」は、自然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、フラグメントに通常隣接する配列から除去されたＤＮＡフラグメントを指す。あるいは、本明細書で使用される「単離ペプチド」または「単離したポリペプチド」などは、ペプチドまたはポリペプチド分子を、その自然な細胞環境から、および細胞の他の成分との会合から、インビトロで単離および／または精製したものを指す。
「基本的に精製された」という用語は、通常、その自然状態でそれに会合する成分を基本的に含まない材料を指す。例えば、基本的に精製された細胞は、その自然に存在する状態または自然状態で通常会合している他の細胞種類から単離された細胞を指す。特定の場合には、基本的に精製された細胞集団は均質な細胞集団を指す。それ以外の場合には、この用語は、単に、その自然状態でそれと自然に会合している細胞から単離された細胞を指す。実施形態では、細胞はインビトロで培養される。実施形態では、細胞はインビトロで培養されない。
本開示の全文では、一般的に存在する核酸塩基の以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｔ」はチミジン、「Ｕ」はウリジンを表す。
特に指定のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮退版であり、かつ同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、さらに、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がある形態で１つ以上のイントロンを含んでもよい程度でイントロンを含み得る。
「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、レトロウイルスの中でも独特であり、非分裂細胞に感染することができ、また、大量の遺伝子情報を宿主細胞のＤＮＡに送り込むことができるため、遺伝子送達ベクターとしては最も効率的な方法の１つである。さらに、レンチウイルスを用いることで、遺伝子情報を宿主染色体に組み込むことができ、安定して形質導入された遺伝子情報が得られる。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶはすべてレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、有意なレベルの遺伝子導入をインビボで達成する手段を提供する。
「調節」という用語は、治療をしないまたは化合物を使用しない場合の被検体における応答レベルと比較して、および／または他の同様であるが未治療の被検体における応答レベルと比較して、被検体における応答レベルの検出可能な増加または減少を媒介することを指す。前記用語は、天然のシグナルや応答を干渉し、および／または影響を与え、それによって被検体、好ましくはヒトにおいて有益な治療応答を媒介することを含む。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに、「操作可能に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現している場合には、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合には、コード化配列に操作可能に連結されており、または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されている場合には、コード化配列に操作可能に連結されている。
「転写制御下」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、プロモーターがポリヌクレオチドに操作可能に連結され、且つポリヌクレオチドに対して正しい位置および配向にあることを指す。
「過剰発現された」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、特定の組織または臓器からの正常な細胞における発現レベルに対する、患者の前記組織または臓器の固形腫瘍などの疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の異常な発現レベルを示すことを意図する。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で知られている標準的なアッセイによって確定することができる。
組成物の「非経口投与」という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、胸骨内注射または注入技術を含む。
「患者」、「被検体」や「個体」などの用語は、本明細書で互換的に使用可能であり、かつ、本明細書に記載された方法に適合する任意のヒト、動物または生体を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、被検体または個体は、ヒトまたは動物である。実施形態では、「被検体」という用語は、免疫応答が誘発され得る生体（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。被検体の例としては、ヒト、および犬、猫、マウス、ラットおよびそれらの遺伝子組み換え種などの動物が含まれる。
治療を必要とする被検体またはその必要性がある被検体には、治療を必要とする疾患、病状または病症を有する被検体が含まれる。その必要性がある被検体は、疾患、病状または病症の予防のために治療を必要とする被検体も含まれる。実施形態では、疾患は癌である。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを指す。前記用語は、通常、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾された形態の、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドの重合体形態を指す。前記用語は、一本鎖や二本鎖形態を含む核酸のすべての形態を含む。
「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または以下に定義される厳しい条件で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、さらに少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドを含む。従って、「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語は、１つ以上のヌクレオチドが付加または欠失されたか、異なるヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチドを含む。この点に関して、当技術分野でよく理解されるように、参照ポリヌクレオチドに対して、突然変異、付加、欠失および置換を含む特定の改変を行うことができ、それにより、改変されたポリヌクレオチドは参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持するか、参照ポリヌクレオチドに対して活性が増加する（すなわち、最適化される）。ポリヌクレオチド変異体は、例えば、本明細書に記載された参照ポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％（および少なくとも５１％〜少なくとも９９％およびその間のすべての整数パーセンテージ、例えば、９０％、９５％または９８％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」という用語は、自然に存在する対立遺伝子変異体およびオーソログを含む。
「ポリペプチド」、「ポリペプチドフラグメント」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用でき、アミノ酸残基のポリマーならびにその変異体および合成類似体を指す。従って、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成の非自然に存在するアミノ酸であるアミノ酸ポリマー、例えば、対応する自然に存在するアミノ酸の化学類似体、および自然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。特定の態様において、ポリペプチドは、通常、様々な化学反応を触媒する（すなわち、その速度を上げる）酵素ポリペプチドまたは「酵素」を含み得る。
「ポリペプチド変異体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって参照ポリペプチド配列と区別されるポリペプチドを指す。実施形態では、ポリペプチド変異体は、保存的または非保存的であり得る１つ以上の置換によって参照ポリペプチドと区別される。実施形態では、ポリペプチド変異体は保存的置換したものを含み、この点において、いくつかのアミノ酸は、ポリペプチド活性の性質を変えることなく、略類似する特性を有する他のアミノ酸に変更され得ることは、当技術分野でよく理解されている。ポリペプチド変異体はまた、１つ以上のアミノ酸が付加または欠失されたか、異なるアミノ酸残基によって置換されたポリペプチドを含む。
「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構が認識され、または合成機構の導入によって、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するために必要なＤＮＡ配列を指す。「発現制御配列」という用語は、特定の宿主生物において操作可能に連結されたコード化配列を発現させるために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択的なオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。「結合（ｂｉｎｄ）」、「結合（ｂｉｎｄｓ）」または「．．．と互いに作用する」という用語は、サンプルまたは生体中の第２の分子を認識して付着するが、サンプル中の他の構造的に無関係な分子を基本的に認識または付着しない分子を指す。抗体に関して、本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特異的な抗原を認識するが、サンプル中の他の分子を基本的に認識または結合しない抗体を指す。例えば、１つの種からの抗原と特異的に結合する抗体は、１つ以上の種からのその抗原にも結合し得る。しかし、そのような種間反応性は、それ自体が抗体の特異的な分類を変更しない。別の例では、抗原と特異的に結合する抗体は、異なる対立遺伝子型の抗原に結合してもよい。しかしながら、このような交差反応性は、それ自体が抗体の特異的な分類を変更しない。特定の場合には、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、抗体、タンパク質またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用することができ、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを暗示する；例えば、抗体は、任意のタンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識「Ａ」および抗体を含む反応で、エピトープＡ（または遊離の非標識Ａ）を含む分子が存在すると、抗体に結合する標識Ａの量が減少する。
「結合タンパク質」とは、別の分子に非共有結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、結合タンパク質は、それ自体に結合し（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成）、および／または別のタンパク質の１つ以上の分子に結合してもよい。結合タンパク質は、複数種類の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合の活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）とは、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化された結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーを介して、ＤＮＡを配列特異的に結合させるタンパク質または、より大きなタンパク質内のドメインのことである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、通常、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
ジンクフィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように工学処理することができ、例えば、自然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域のエンジニアリング（１つ以上のアミノ酸の改変）を介して実現される。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインは、特定の所望のＤＮＡ配列を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するために、ＤＮＡ切断ドメインに融合してもよい。例えば、一対のＺＦＮ（例えば、ＺＦＮ左腕（ｌｅｆｔ ａｒｍ）およびＺＦＮ右腕（ｒｉｇｈｔ ａｒｍ））は、特定の所望のＤＮＡ配列（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子）を標的とし、その改変を引き起こすように工学処理されてもよい。
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合性バックボーンの切断を指す。様々な切断方法があり、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない。一本鎖切断および二本鎖切断は両方とも可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断により、平滑末端または千鳥状の末端が生成され得る。実施形態では、融合ポリペプチドは、標的化された二本鎖ＤＮＡの切断のために使用される。
「標的部位」または「標的配列」とは、結合のための十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。例えば、配列５’ ＧＡＡＴＴＣ ３’は、Ｅｃｏ Ｒｌ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
「融合」分子とは、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学タイプの分子であってもよいし、異なる化学タイプの分子であってもよい。第１のタイプの融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの融合）および融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるが、これらに限定されない。第２のタイプの融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドの融合、およびマイナー溝バインダー（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）と核酸の融合が含まれるが、これらに限定されない。
細胞内での融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じることができ、ここで、ポリヌクレオチドは転写され、かつ転写物は翻訳され、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断やポリペプチドライゲーションもまた、細胞内でのタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞へ送達するための方法は、本開示の他の場所に提示される。
遺伝子発現の「調節」とは、遺伝子活性の変化を指す。発現の調節は、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を含んでもよいが、こられに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活化、ランダム変異）は、発現を調節するために使用され得る。遺伝子不活化とは、本明細書に記載のＺＦＰを含まない細胞と比較して、遺伝子発現の任意の減少を意味する。従って、遺伝子不活化は、部分的なものであっても完全なものであってもよい。
「関心領域」とは、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子、または遺伝子内や遺伝子に隣接する非コード配列であって、ここで、外因性分子を結合することが好ましい。結合は、標的化されたＤＮＡ切断および／または標的化された組換えのために行われたものであってよい。関心領域は、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）または感染ウイルスゲノムに存在し得る。関心領域は、遺伝子のコーディング領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列またはイントロンなどの転写された非コーディング領域内、またはコーディング領域の上流または下流の非転写領域内に存在し得る。関心領域の長さは、最小で単一のヌクレオチド対であってもよく、最大で２，０００個のヌクレオチド対であってもよく、またはヌクレオチド対の任意の整数値であってもよい。
「統計的に有意」とは、その結果が偶然に発生した可能性が低いことを意味する。統計的有意性は、当技術分野で知られている任意の方法で決定することができる。一般的に使用される有意性の尺度は、帰無仮説が真である場合に観察された事象が発生する頻度または確率であるｐ値を含む。得られたｐ値が有意性レベルよりも小さい場合、帰無仮説は棄却される。単純な場合に、有意性レベルは０．０５以下のｐ値で定義される。「減少した」または「低下した」または「より少ない」量は、通常、「統計的に有意な」または生理学的に有意な量であり、本明細書に記載の量またはレベルの約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０または５０倍以上（例えば、１００、５００、１０００倍）（１以上のすべての整数および小数点、例えば１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の減少を含む。
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその相同リガンドとの結合によって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達などのシグナル伝達イベントを媒介して、誘導された一次応答を指す。刺激は、特定の分子の発現の変化、例えば、ＴＧＦ−βのダウンレギュレーションおよび／または細胞骨格構造の再編成を媒介することができる。ＣＤ３ζは、一次応答に関して、ＣＡＲ構築物の唯一適切な一次シグナル伝達ドメインではない。例えば、１９９３年に戻って、ＣＤ３ζとＦｃＲγの両方がＣＡＲ分子の機能的な一次シグナル伝達ドメインとして示された。Ｅｓｈｈａｒら，“Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎｓ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇａｍｍａ ｏｒ ｚｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”ＰＮＡＳ，１９９３ Ｊａｎ １５；９０（２）：７２０−４から、ｓｃＦｖが「ＦｃＲγ鎖またはＣＤ３複合鎖」に融合された２つのＣＡＲ構築物がＴ細胞の活性化と標的細胞を誘発したことが示された。注意すべきこととして、Ｅｓｈｈａｒらによって実証されたように、一次シグナル伝達ドメインＣＤ３ζまたはＦｃＲγのみを含むＣＡＲ構築物は、共刺激ドメインが存在しなくても機能する。他の非ＣＤ３ζに基づくＣＡＲ構築物が長年にわたって開発されてきた。例えば、Ｗａｎｇら（『Ａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲｓ） Ｂａｓｅｄ Ｕｐｏｎ ａ Ｋｉｌｌｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＫＩＲ） Ｔｒｉｇｇｅｒｓ Ｒｏｂｕｓｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ』 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．２２，ｎｏ．Ｓｕｐｐｌ．１，Ｍａｙ ２０１４，第Ｓ５７ページ）は、ｓｃＦｖが「キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の膜貫通ドメインと細胞質ドメイン」に融合されたＣＡＲ分子を試験した。Ｗａｎｇらは、「メソテリンを標的とするＫＩＲに基づくＣＡＲ（ＳＳ １−ＫＩＲ）が、ＣＤ３に基づくＣＡＲに相当する抗原特異的な細胞障害活性とサイトカイン産生を誘発する」と報告した。同じグループからの２番目の出版物には、Ｗａｎｇら（「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｕｓｉｎｇ ＤＡＰ１２− Ｂａｓｅｄ，Ｍｕｌｔｉｃｈａｉｎ，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ． ２０１５ Ｊｕｌ；３（７）：８１５−２６）は、抗原認識のための一本鎖可変フラグメントがＫＩＲ２ＤＳ２（刺激性キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ））の膜貫通ドメインと細胞質ドメインに融合されたＣＡＲ分子が、免疫チロシンベースの活性化モチーフ含有アダプターであるＤＡＰ１２を有するヒトＴ細胞に導入されると、インビトロとインビボの両方で機能することを示した。
「刺激分子」という用語は、抗原提示細胞に存在する相同刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を指す。例えば、刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体複合体に会合するζ鎖である。
「刺激リガンド」という用語は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在する場合、Ｔ細胞などの細胞上の相同結合パートナー（本明細書で「刺激分子」をいう）に特異的に結合でき、それによって、活性化、免疫応答の開始、増殖および類似のプロセスを含む、Ｔ細胞の一次応答を媒介するリガンドを指す。刺激リガンドは当技術分野で周知であり、特に、ペプチド、抗ＣＤ３抗体、超アゴニスト抗ＣＤ２８抗体および超アゴニスト抗ＣＤ２抗体が負荷されたＭＨＣ クラスＩ分子を包含する。
「治療の」という用語は、治療および／または予防を指す。治療効果は、病状の抑制、寛解または根絶または病状の緩和によって得られる。
「治療上有効な量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求めている組織、系または被検体の生物学的または医学的応答を誘発する本発明の化合物の量を指す。「治療上有効な量」という用語は、投与されたときに、治療される病症または疾患の１つ以上の徴候または症状の進行を防止するか、またはある程度軽減するのに十分である化合物の量を含む。治療上有効な量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療される被検体の年齢、体重などによって変化する。
「疾患を治療する」という用語は、被検体が経験する疾患または病症の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度の軽減を指す。
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に転移または導入されたプロセスを指す。「トランスフェクトの」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。前記細胞は、一次被験細胞およびその子孫を含む。
「ベクター」という用語は、単離核酸を含み、単離核酸をインビトロとインビボ（受験体の体内）で細胞内部に送達し得るポリヌクレオチドを指す。線状ポリヌクレオチド、イオンまたは両親媒性化合物と会合するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含む、多数のベクターが当技術分野で知られている。従って、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。前記用語はまた、細胞への核酸の転移を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどを含む。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、腺伴随ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれる。例えば、レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、調節機能または構成機能を持つ他の遺伝子をさらに含む。レンチウイルスベクターは当技術分野で周知である。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが含まれる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重弱毒化することによって生成され、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆを欠失させることで、生物学的に安全なベクターとなる。
範囲：本開示全体を通して、本開示の様々な態様を範囲形式で提示することができる。理解されるように、範囲形式の説明は、単に便宜上および簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではない。従って、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、可能なすべてのサブ範囲を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、１から６までのような範囲の説明は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までのサブ範囲と、その範囲内の個々の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３および６が具体的に開示されていると考えるべきである。範囲の広さに関係なく適用される。本開示の実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞を用いた癌の治療に関する。実施形態は、ＣＡＲをコードする単離核酸配列に関するものであり、ここで、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、ＣＡＲの細胞外ドメインは、固形腫瘍の抗原に結合する。例えば、転写データによると、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲなどの抗原は、正常組織での発現が非常に低いが、腎臓癌に関連する細胞での発現が高いことが示されている。いくつかの抗原の情報を以下の表２に提供している。
Figure 2022500011
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＳＩＧＬＥＣ１５に結合する。ＳＩＧＬＥＣ１５は、細胞膜上に発現する受容体タンパク質で、シアリル化グリカンを認識する。転写データから、尿路上皮癌細胞では過剰発現し、正常組織では低レベルで発現していることが予測される。主に脾臓やリンパ節に多く見られ、他の免疫臓器でもある程度の低発現が見られる。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＳＩＧＬＥＣ１５に結合し、前記ＳＩＧＬＥＣ１５は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号４５−５６のアミノ酸配列のうちの１つを含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を被検体に投与することを含む。実施形態では、腫瘍は、尿路上皮癌に関連する。被検体におけるＴ細胞応答とは、補助、殺傷、調節および他のタイプのＴ細胞に関連する細胞媒介性免疫を指す。例えば、Ｔ細胞応答は、免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助すること、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を認識して破壊することなどの活動を含み得る。被検体におけるＴ細胞応答は、Ｔ細胞が殺すウイルス感染細胞および／または腫瘍細胞の数、ウイルス感染細胞および／または腫瘍細胞との共培養においてＴ細胞が放出するサイトカインの量、被検体におけるＴ細胞の増殖レベル、Ｔ細胞の表現型の変化（例えば、記憶Ｔ細胞への改変）、および被検体におけるＴ細胞の寿命または寿命のレベルなどの様々な指標を介して検出することができる。
実施形態では、インビトロ殺傷アッセイは、ＣＡＲ Ｔ細胞と抗原陽性細胞を共培養してＣＡＲ Ｔ細胞の殺傷効力を測定することによって実施されてもよい。ＣＡＲＴ細胞は、対応する抗原を発現しない対照細胞と比較して、ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養した対応する抗原陽性細胞の数の減少、およびＩＦＮγ、ＴＮＦαなどの放出の増加を示すことにより、対応する抗原陽性細胞に対して殺傷作用を有すると考えてもよい。さらに、ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性を試験してもよい。例えば、免疫不全マウスにおいて、本明細書に記載の抗原を用いて異種移植モデルを確立してもよい。ヒト癌細胞または腫瘍生検組織を免疫不全のげっ歯類（異種移植モデル）に異種移植することは、過去２０年間、新規な癌治療薬の開発のための主要な前臨床スクリーニングを構成してきた（Ｓｏｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．ＰＭＣ ２０１４ Ａｕｇ ２１およびＭｏｒｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２，−２４７ − ２５０ （２００７））。ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性をインビボで評価するために、腫瘍異種移植片を有する免疫不全マウスを、ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性（例えば、マウス腫瘍およびマウス血中ＩＦＮγ、ＴＮＦαなどの減少）について評価した。
「キメラ抗原受容体」または代替可能な「ＣＡＲ」という用語は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、細胞質ドメイン）を含む組換えポリペプチド構築物を指す。実施形態では、ＣＡＲポリペプチド構築物におけるドメインは、同じポリペプチド鎖上にある（例えば、キメラ融合タンパク質を含む）。実施形態では、ＣＡＲポリペプチドのドメインは、同一の分子上になく、例えば、互いに隣接していないか、または異なるポリペプチド鎖上にある。
実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の刺激分子および／または共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含んでもよい。実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３−ζの一次シグナル伝達ドメイン）に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む。実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはさらに、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを含む。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、リンパ球の有効応答（抗原に対する応答）を誘導するための細胞表面分子を含んでもよい。
ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間には、スペーサードメインが組み込まれる場合がある。本明細書で使用されるように、「スペーサードメイン」という用語は、通常、ポリペプチド鎖中の細胞外ドメインおよび／または細胞質ドメインに膜貫通ドメインを連結するために機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大３００個のアミノ酸、１０〜１００個のアミノ酸、または２５〜５０個のアミノ酸を含んでもよい。ＣＡＲの細胞外ドメインは、特定の腫瘍マーカー（例えば、腫瘍抗原）を標的とする抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、またはＴＣＲα結合ドメインやＴＣＲβ結合ドメインなどのＴＣＲ）を含んでもよい。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞を介した免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。腫瘍抗原は当技術分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、前立腺特異的タンパク質（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体およびメソセリンを含む。例えば、ＣＡＲが結合する抗原がＣＤ１９である場合、そのＣＡＲをＣＤ１９ＣＡＲと呼ぶ。
実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、柔軟なリンカーによって連結された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域を含むｓｃＦｖで構成される。一本鎖可変領域フラグメントは、短い連結ペプチドを用いて軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を連結することにより調製される（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８）。連結ペプチドの例は、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ ＩＤ：２４）を有するＧＳリンカーであり、１つの可変領域のカルボキシ末端と別の可変領域のアミノ末端の間を約３．５ｎｍ架橋する。他の配列のリンカーが設計および使用されている（Ｂｉｒｄら，１９８８，上記と同様）。通常、リンカーは、短く、柔軟なポリペプチドであり得、約２０以下のアミノ酸残基を含む。一方、医薬の付着または固体支持体への付着などの付加的な機能を実現するためにリンカーを修飾し得る。一本鎖変異体は、組換えまたは合成によって生産することができる。ｓｃＦｖの合成生産のためには、自動合成装置を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え生産のためには、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適当なプラスミドを適当な宿主細胞、例えば、酵母、植物、昆虫や哺乳類細胞などの真核生物、または大腸菌などの原核生物のいずれかに導入することができる関心のあるｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの連結などの通常の操作によって調製することができる。得られたｓｃＦｖは、当技術分野で知られている標準的なタンパク質精製技術を用いて単離することができる。
実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κまたは軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソセリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α ２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ ＭＡＧＥ Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２ ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８または腫瘍によって発現されるウイルス関連抗原を含む。実施形態では、ＣＡＲの結合要素は、相同抗原に結合したときに、腫瘍細胞を成長させず、または死滅か減少させるように促進するように腫瘍細胞に影響を与える任意の抗原結合部位を含むことができる。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＫＩＳＳ１Ｒに結合する。ＫＩＳＳ１Ｒは、転移抑制遺伝子ＫＩＳＳ１によってコードされるペプチドであるキスペプチン（メタスティン）を結合するガラニン様Ｇタンパク質共役型受容体である。ＫＩＳＳ１ Ｒは、内分泌機能の調節に関与し得る。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＫＩＳＳ１Ｒに結合し、前記ＫＩＳＳ１Ｒは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、配列番号７１および７２のアミノ酸配列のうちの１つを含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、固形腫瘍は、腎臓癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＣＬＤＮ６に結合する。ＣＬＤＮ６は、密着結合鎖の構成要素であり、内在性膜タンパク質であるクローディンファミリーのメンバーである。転写データから、クローディンファミリーのメンバーである密着結合鎖の構成要素が子宮内膜癌、尿路上皮癌で高度に発現し、正常組織で少量発現していることが予測される。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＣＬＤＮ６に結合し、前記ＣＬＤＮ６は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、配列番号２９−４４のアミノ酸配列のうちの１つを含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、固形腫瘍は、子宮内膜癌および／または尿路上皮癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＭＵＣ１６に結合する。ＭＵＣ２１およびＭＵＣ１６は、ムチンファミリーに属する大きな膜結合型糖タンパク質である。ムチンはＯ−グリコシル化されたタンパク質で、上皮表面の保護粘膜バリアの形成に重要な役割を果たしている。食道癌の場合、ＭＵＣ２１は食道への発現が制限されている。ＭＵＣ１６は、正常組織では発現が低く、子宮内膜でも発現が低い。卵巣癌の場合には、ＭＵＣ１６は高度に発現している。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＭＵＣ１６に結合し、前記ＭＵＣ１６は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、配列番号６３−７０のアミノ酸配列のうちの１つを含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、固形腫瘍は、卵巣癌に関連する。実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＳＬＣ６Ａ３に結合する。ＳＬＣ６Ａ３はドーパミントランスポーターであり、ナトリウムおよび塩化物依存性神経伝達物質トランスポーターファミリーのメンバーである。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＳＬＣ６Ａ３に結合し、前記ＳＬＣ６Ａ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法を含み、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、腫瘍は腎臓癌を含む。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＱＲＦＰＲに結合する。ＱＲＦＰＲは、ピログルタミル化されたＲＦアミドペプチド受容体であり、そのリガンドであるＱＲＦＰとともに脂肪形成に関与し得る。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＱＲＦＰＲに結合し、前記ＱＲＦＰＲは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、固形腫瘍は、腎臓癌に関連する。実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＧＰＲ１１９に結合する。ＧＰＲ１１９は、Ｇタンパク質共役型受容体のロドプシンサブファミリーに属し、膵臓や消化管での発現が低く、グルコースのホメオスタシスに関与し得る。転写データから、膵臓癌での高度発現が予測される。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＧＰＲ１１９に結合し、前記ＧＰＲ１１９は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、腫瘍は、膵臓癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＵＰＫ２に結合する。ＵＰＫ２は、膀胱の正常組織や膀胱癌を含む尿路上皮癌で主に発現している、高度に保存された非対称単位膜の尿路上皮特異的内在性膜タンパク質の一つである。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＵＰＫ２に結合し、前記ＵＰＫ２は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、固形腫瘍は、尿路上皮癌および／または膀胱癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＡＤＡＭ１２に結合する。ＡＤＡＭ１２は、ヘビ毒ディスインテグリンに構造的に関連するタンパク質ファミリーのメンバーであり、細胞−細胞と細胞−マトリックスの相互作用に関与し、かつ、胎盤や乳腺／膵臓癌などの腫瘍で高度に発現している。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＡＤＡＭ１２に結合し、前記ＡＤＡＭ１２は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、固形腫瘍は、乳腺癌および／または膵臓癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＳＬＣ４５Ａ３に関連する。ＳＬＣ４５Ａ３は原形質膜タンパク質であり、前立腺癌の場合、正常組織は主に前立腺で発現する。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＳＬＣ４５Ａ３に結合し、前記ＳＬＣ４５Ａ３は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、固形腫瘍は、前立腺癌に関連する。実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＡＣＰＰに結合する。ＡＣＰＰは、オルトリン酸モノエステルからアルコールおよびオルトリン酸への変換を触媒する酵素であり、膜貫通ドメインを含み、原形質膜−エンドソーム−リソソーム経路に局在する。前立腺癌の場合、正常組織は主に前立腺で特異的に発現する。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＡＣＰＰに結合し、前記ＡＣＰＰは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、固形腫瘍は、前立腺癌に関連する。実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＭＵＣ２１に結合する。ＭＵＣ２１およびＭＵＣ１６は、ムチンファミリーに属する大きな膜結合型糖タンパク質である。ムチンはＯ−グリコシル化されたタンパク質で、上皮表面の保護粘膜バリアの形成に重要な役割を果たしている。受験者が食道癌を有する場合、ＭＵＣ２１は食道への発現が制限されている。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＭＵＣ２１に結合し、前記ＭＵＣ２１は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、固形腫瘍は、食道癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＭＳ４Ａ１２に結合する。ＭＳ４Ａ１２は、結腸細胞の先端膜に見られる細胞表面タンパク質であり、結腸での発現が制限されており、結腸直腸癌の治療に利用され得る。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＭＳ４Ａ１２に結合し、前記ＭＳ４Ａ１２は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、固形腫瘍は、結腸直腸癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＡＬＰＰに結合する。ＡＬＰＰは、リン酸モノエステルの加水分解を触媒する金属酵素であるアルカリホスファターゼである。ＡＬＰＰの発現は胎盤に限定される。卵■腺癌、漿液性嚢胞腺癌やその他の卵巣癌の細胞でＡＬＰＰの強い異所性発現が検出されている。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＡＬＰＰに結合し、前記ＡＬＰＰは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、固形腫瘍は、子宮内膜癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＳＬＣ２Ａ１４に結合する。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＳＬＣ２Ａ１４に結合し、前記ＳＬＣ２Ａ１４は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、腫瘍は、精巣癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＧＳ１−２５９Ｈ１３．２に関連する。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＧＳ１−２５９Ｈ１３．２に結合し、前記ＧＳ１−２５９Ｈ１３．２は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、腫瘍は、甲状腺癌、または神経膠腫、または精巣癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＥＲＶＦＲＤ−１に関連する。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＥＲＶＦＲＤ−１に結合し、前記ＥＲＶＦＲＤ−１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、腫瘍は、腎臓癌または尿道癌に関連する。実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＡＤＧＲＧ２に結合する。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＡＤＧＲＧ２に結合し、前記ＡＤＧＲＧ２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、腫瘍は、卵巣癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＥＣＥＬ１に結合する。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＥＣＥＬ１に結合し、前記ＥＣＥＬ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、腫瘍は、子宮内膜癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＣＨＲＮＡ２に結合する。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＣＨＲＮＡ２に結合し、前記ＣＨＲＮＡ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、腫瘍は、前立腺癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＧＰ２に結合する。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＧＰ２に結合し、前記ＧＰ２は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、腫瘍は、膵臓癌に関連する。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＰＳＧ９に結合する。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＰＳＧ９に結合し、前記ＰＳＧ９は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、ＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、腫瘍は、腎臓癌または肝臓癌に関連する。
本開示はまた、二重特異性キメラ抗原受容体（図２６を参照）、二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、および／またはポリヌクレオチドを含む修飾細胞に関し、ここで、二重特異性キメラ抗原受容体は第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、かつ第１の抗原結合ドメインが第１の抗原を認識し、第２の抗原結合ドメインが第２の抗原を認識する。実施形態では、第１の抗原は白血球に関連する抗原であり、第２の抗原は固形腫瘍抗原である。実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は、同一または異なる。実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は、両方とも固形腫瘍抗原である。例えば、第１の抗原は腫瘍関連ＭＵＣ１であり、第２の抗原は配列番号１−２２の抗原のうちの１つから選択される。実施形態では、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、リンカー（例えば、配列番号１８８）を介して連結される。
実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。
実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。実施形態は、本明細書に記載の単離核酸配列を含むベクターに関する。実施形態は、本明細書に記載の単離核酸配列を含む単離細胞に関する。
実施形態は、本明細書に記載のＣＡＲを含むＴ細胞を含む細胞集団を含む組成物に関する。実施形態は、本明細書に記載の単離核酸配列によってコードされるＣＡＲに関連する。
本明細書に記載のＣＡＲ細胞および修飾細胞を含む細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、または非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、トーティポテント幹細胞、または造血幹細胞であってもよい。また、細胞は、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されるＴ細胞であってもよい。実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球に由来し得る。本明細書に記載の細胞の増幅および遺伝子修飾に先立って、細胞の供給源は、種々の非限定的な方法によって被検体から得られ得る。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む多くの非限定的な供給源から得られ得る。実施形態では、利用可能で、かつ当業者に知られている任意の数のＴ細胞株を使用することができる。実施形態では、細胞は、健康なドナー、癌と診断された患者、または感染症と診断された患者に由来し得る。実施形態では、細胞は、異なる表現型特性を示す細胞の混合集団の一部である。
「幹細胞」という用語は、自己複製能力と他のタイプの細胞に分化する能力を持つ、あらゆるタイプの細胞を指す。例えば、幹細胞は２つの娘幹細胞（インビトロで胚性幹細胞と培養した場合に発生）、または１つの幹細胞と分化した細胞（血液細胞を生成できる造血幹細胞で発生）を生成する。異なるタイプの幹細胞は、その由来および／または他のタイプの細胞に分化する能力の程度に基づいて区別され得る。幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞（すなわち、多能性幹細胞）、体性幹細胞、誘導多能性幹細胞、およびその他の任意のタイプの幹細胞を含み得る。
多能性胚性幹細胞は、胚盤胞の内部の細胞塊に存在し得、生来の高い分化能力を有する。例えば、多能性胚性幹細胞は、体内であらゆるタイプの細胞を形成する可能性がある。インビトロで長期間成長した場合、ＥＳは多能性を維持し、娘細胞は多系統分化の可能性を維持する。
体性幹細胞は、（胎児からの）胎児幹細胞と（骨髄などの様々な組織に存在する）成体幹細胞を含み得る。これらの細胞は、多能性ＥＳ細胞よりも分化能力が低いと見なされ、中で胎児幹細胞の能力が成体幹細胞の能力よりも高く、それらは明らかに限られた数の異なるタイプの細胞にしか分化しないで、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）として説明されている。「組織特異的な」幹細胞は、一般的には、１種類の細胞しか生まない。例えば、胚性幹細胞は、血液幹細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ））に分化することができ、これは、さらに様々な血液細胞（例えば、赤血球、血小板、白血球など）に分化することができる。
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）は、特定の遺伝子の発現を誘導することにより、非多能細胞（例えば、成体細胞）から人工的に誘導された多能性幹細胞を含み得る。誘導多能性幹細胞は、特定の幹細胞遺伝子やタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、能力や分化能など、多くの点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの自然に存在する多能性幹細胞と類似している。誘導多能性細胞は、成人の胃、肝臓、皮膚細胞および血液細胞から単離することができる。
実施形態では、ＣＡＲ細胞、修飾細胞または細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは樹状細胞である。例えば、ＣＡＲ細胞、修飾細胞または細胞は、Ｔ細胞である。
実施形態では、抗原結合分子はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。実施形態では、ＴＣＲは修飾ＴＣＲである。実施形態では、ＴＣＲは、患者において自然に発生する腫瘍特異的Ｔ細胞に由来する。実施形態では、ＴＣＲは腫瘍抗原に結合する。実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ｐ５３、ＭＡＧＥ−Ａ３またはＮＹ−ＥＳＯ−１を含む。実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲγおよびＴＣＲδ鎖、またはＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を含む。実施形態では、標的抗原に対して高い親和性を有するＴＣＲを発現するＴ細胞クローンを単離することができる。実施形態では、特定のＨＬＡ対立遺伝子の背景で優性Ｔ細胞応答を誘発可能であることが知られているエピトープを表すペプチドでパルス化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養することができる。次に、ＭＨＣ−ペプチドテトラマー染色および／または低滴定濃度の同族ペプチド抗原でパルス化された標的細胞を認識および溶解する能力に基づいて、高親和性クローンを選択することができる。クローンを選択した後、分子クローニングにより、ＴＣＲαおよび ＴＣＲβ鎖、またはＴＣＲγおよびＴＣＲδ鎖を同定して単離する。例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖の場合、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子配列を用いて、ヒトＴ細胞における両ＴＣＲ鎖の安定した高レベルの発現を理想的に促進できる発現構築物を生成する。次に、形質導入媒体（例えばγレトロウイルスまたはレンチウイルス）を生成して、その機能性（抗原特異性および機能親和性）について試験を行い、且つ臨床用ベクターを多く生成するために使用され得る。最終生成物のアリコートを使用して、標的Ｔ細胞集団（通常、患者のＰＢＭＣから精製）に形質導入することができ、前記標的Ｔ細胞集団は、被検体への注入前に増幅される。
実施形態では、ＣＡＲの結合要素は、任意の抗原結合部分を含んでもよく、前記抗原結合部分は、その相同抗原に結合すると、腫瘍細胞に影響を与え、例えば、腫瘍細胞を死滅させること、腫瘍細胞の成長を抑制すること、または腫瘍細胞の死を促進する。所望の分子をコードする核酸配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによって、前記遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を導出することによって、または標準的な技術を用いて、前記遺伝子を含む細胞および組織から直接単離することによって、本分野で知られている組換え法を用いて得ることができる。または、クローン化するのではなく、関心のある遺伝子を合成的に産生することができる。
本開示の実施形態はさらに、本開示のＤＮＡが挿入されるベクターに関する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、トランスジェニック遺伝子の長期的且つ安定的な統合および娘細胞内でのその増殖を可能にするので、長期的な遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できるという点で、マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルスに由来するベクターよりも多くの優位性である。また、免疫原性が低いという利点もある。
ウイルスは、インビトロおよびインビボ（被検体内）で核酸を細胞に送達するために使用され得る。核酸を細胞に送達し得るウイルスの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれる。
核酸を細胞に送達するための非ウイルス性の方法、例えば、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、およびオリゴヌクレオチド、リポプレックス、デンドリマー、および無機ナノ粒子の使用も存在する。
ＣＡＲをコードする天然または合成の核酸の発現は、通常、ＣＡＲポリペプチドまたはその一部をコードする核酸を１つ以上のプロモーターに操作可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、複製および真核生物への組み込みに適している。代表的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、および所望の核酸配列の発現調節に有用なプロモーターを含む。
ＣＡＲをコードする合成核酸の発現および哺乳動物細胞への遺伝子導入に関連する追加情報は、米国特許番号ＵＳ８，９０６，６８２に提供されており、その全体が参照により組み込まれている。
本開示の医薬組成物は、治療（または予防）する疾患に適切な方法で投与され得る。投与の量や頻度は、患者の病状、疾患の種類や重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は臨床試験により決定されることもある。
「免疫学的に有効な量」、「抗腫瘍効果のある量」、「腫瘍抑制効果のある量」または「治療上有効な量」が指示される場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、患者（被検体）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および病状の個人差を考慮して、医師によって決定され得る。本明細書に記載のＴ細胞の医薬組成物は、１０４〜１０９個の細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５〜１０６個の細胞／ｋｇ体重（前記範囲内のすべての整数値を含める）の投与量で投与し得るとは言える。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与されてもよい。細胞は、免疫療法において一般的に知られている注入技術を使用して投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照）。当業者は、患者の疾患徴候をモニタリングし、それに応じて治療方法を調整することにより、特定の患者に対する最適な投与量および治療レジームを容易に決定することができる。実施形態では、被検体に活性化のＴ細胞を投与してから、血液を採取し（またはアフェレーシスを実施する）、活性化および増幅されたＴ細胞を収集し、かつ、これらの活性化および増幅されたＴ細胞を患者に再注入することが望しい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実施することができる。実施形態では、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血からＴ細胞を活性化することができる。実施形態では、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃまたは１００ｃｃの採血からＴ細胞を活性化することができる。理論に縛られることなく、このような複数回の採血／複数回の再注入の手段を採用すれば特定のＴ細胞集団を選択することができる。
本明細書に記載の医薬組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、注入、植入または移植を含む、任意の便利な方法で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髓内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または腹腔内投与で患者に投与することができる。実施形態では、本開示のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって被検体に投与される。実施形態では、本開示のＴ細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注入することができる。本開示の実施形態では、本明細書に記載された方法、またはＴ細胞を治療レベルまで増幅する当技術分野で知られている他の方法を用いて活性化および増幅された細胞は、任意の数の関連する治療方法と組み合わせて（例えば、治療の前に、同時に、または後に）患者に投与され、ここで、前記治療方法は、抗ウイルス療法、ＭＳ患者に対するシドフォビルおよびインターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても知られる）またはナタリズマブ治療、乾癬患者に対するエファリズマブ治療、またはＰＭＬ患者に対する他の治療などの医薬による治療を含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、本開示のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、マイコフェノレートおよびＦＫ５０６）、抗体、または他の免疫消失薬（例えば、ＣＡＭ ＰＡＴＨ）、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用することができる。これらの医薬は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害するか、または成長因子誘導シグナルの伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）を阻害する。（Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ ６６：８０７−８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，Ｉｍｍｕｎ ７３：３１６−３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ ５：７６３−７７３，１９９３；Ｉｓｏｎｉｅｍｉ（上記と同様））。実施形態では、本開示の細胞組成物は、骨髓移植、Ｔ細胞切除療法（フルダラビンなどの化学治療薬を使用）、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドまたは抗体（例えば、ＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨ）と組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与される。実施形態では、本開示の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する試薬、例えばリツキサンなどのＢ細胞切除療法に続いて投与される。例えば、被検体は、高用量化学療法による標準的な治療に続いて、末梢血幹細胞移植を受けることができる。実施形態では、移植の後に、被検体は、本開示の増幅された免疫細胞の注入を受ける。実施形態では、増幅された細胞は、手術の前または後に投与される。
患者に投与される上記の治療の投与量は、治療される病状の正確な性質および治療レシピエントによって変化する。ヒトへの投与のための投与量のスケーリングは、様々な要因に応じて、医師が当技術分野で周知される慣行に従って行うことができる。
米国特許号ＵＳ８，９０６，６８２は、工学処理または修飾されたＴ細胞を用いた癌治療の方法の追加情報を提供しており、参照によりその全体が組み込まれている。
実施形態では、本明細書に記載された細胞集団は、自家ＣＡＲ Ｔ細胞療法に使用される。実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞療法、ＴＣＲ Ｔ細胞療法およびＮＫ細胞療法である。
実施形態は、修飾細胞を調製するためのインビトロ方法に関する。前記方法は、被検体から細胞サンプルを取得することを含み得る。例えば、サンプルは、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を含み得る。前記方法は、少なくともＣＡＲをコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトすることと、ＣＡＲを発現するＴ細胞増殖を選択的に強化する培地でＣＡＲＴ細胞集団をエクスビボで培養することをさらに含み得る。
実施形態では、サンプルは、凍結保存されたサンプルである。実施形態では、細胞サンプルは、臍帯血から得られるものであり、または被検体からの末梢血サンプルである。実施形態では、細胞サンプルは、アフェレシスまたは静脈穿刺によって得られる。実施形態では、細胞サンプルはＴ細胞亜集団である。
本開示の実施形態は、遺伝子融合に関連する分子を用いたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞を用いた癌の治療に関する。実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列に関するものであり、ここで、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外ドメインは、遺伝子融合体の遺伝子融合抗原に結合する。
本明細書で使用されるように、用語「遺伝子融合」は、遺伝子の少なくとも一部とその他の遺伝子の少なくとも一部との融合を指す。遺伝子融合は、遺伝子全体または遺伝子のエクソンを含む必要はない。いくつかの例では、遺伝子融合は、癌の改変に関連する。遺伝子融合産物とは、遺伝子融合により得られたキメラゲノムＤＮＡ、キメラメッセンジャーＲＮＡ、短縮型タンパク質またはキメラタンパク質を指す。遺伝子融合産物は、米国特許９９３８５８２に記載されている様々な方法によって検出することができ、前記特許は参照により本明細書に組み込まれている。「遺伝子融合抗原」とは、遺伝子融合により生成された短縮型タンパク質またはキメラタンパク質を指す。実施形態では、遺伝子融合抗原のエピトープは、遺伝子融合抗原の一部、または遺伝子融合によって引き起こされる別の抗原の免疫原性部分を含み得る。実施形態では、遺伝子融合抗原は、細胞膜と相互作用するか、または細胞膜の一部となる。
実施形態では、遺伝子融合は、第１の遺伝子の少なくとも一部と第２の遺伝子の少なくとも一部との融合を含む。実施形態では、第１の遺伝子および第２の遺伝子は、表３に記載の融合体の第１の遺伝子および第２の遺伝子を含む。実施形態では、遺伝子融合抗原は、表３に記載の病状に関連する。
実施形態では、ヒト細胞における標的分子（表２に記載）のｍＲＮＡ発現レベルおよびタンパク質発現レベルの検出は、ｑＰＣＲやＦＡＣＳなどの実験方法を用いて行ってもよい。さらに、対応する腫瘍細胞において特異的に発現された、正常組織細胞での発現が非常に低くまたは検出不可能な標的分子を同定することができる。
実施形態では、インビトロ殺傷アッセイ、および抗原陽性細胞と共培養されたＣＡＲ Ｔ細胞の殺傷実験を実施することができる。ＣＡＲ Ｔ細胞は、対応する抗原を発現しない対照細胞と比較して、対応する抗原陽性細胞に対する殺傷作用、ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養した対応する抗原陽性細胞の数の減少、ＩＦＮγ、ＴＮＦαなどの放出の増加を示し得る。
実施形態では、インビボ殺傷アッセイを実施してもよい。例えば、マウスに対応する発癌性の抗原腫瘍細胞を移植し、ＣＡＲ Ｔ細胞を注入することができ、これにより、マウス腫瘍が減少し、マウス血中からＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびその他のシグナルが検出される可能性がある。
実施形態は、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法に関し、ここで、前記方法は、本明細書に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
実施形態は、本明細書に記載の単離核酸を含むベクターに関する。
実施形態は、本明細書に記載の単離核酸配列を含む単離細胞に関する。実施形態は、本明細書に記載のＣＡＲを含むＴ細胞集団を含む組成物に関する。実施形態は、本明細書に記載の単離核酸配列によってコードされるＣＡＲに関連する。実施形態は、被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の腫瘍を治療する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む。
Figure 2022500011
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実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ分子は、関心のある抗原に結合するための１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲは、免疫グロブリンやＴ細胞受容体における特異的抗原に結合するための可変ドメインの一部である。各可変ドメインには、３つのＣＤＲがある。可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインがあるため、抗原結合用の６つのＣＤＲがある。さらに、抗体には２本の重鎖と２本の軽鎖があるため、抗体には抗原結合用の合計１２のＣＤＲがある。実施形態では、ＣＡＲ分子は、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２またはＡＬＰＰのうちの１つ以上のＣＤＲを含む。
本開示は、１つ以上の異なる抗原結合ドメインを含む修飾細胞について説明する。修飾細胞は、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメイン、すなわち、遺伝子修飾細胞を増幅および／または維持するための第１の抗原結合ドメインと、標的細胞（例えば腫瘍細胞）を死滅させるための第２の抗原結合ドメインとを含み得る。例えば、第１の抗原結合ドメインは、白血球（ＷＢＣ）の細胞表面分子（例えば、ＣＤ１９）などの表面マーカーに結合し、第２の抗原結合ドメインは、腫瘍細胞上の標的抗原に結合する。実施形態では、細胞表面分子は、ＷＢＣの表面抗原である。実施形態では、腫瘍細胞上の標的抗原は、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ １２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２、またはＡＬＰＰのうちの１つ以上を含む。少なくとも２つの抗原結合ドメインは、同一または異なる修飾細胞上に位置し得る。例えば、修飾細胞は、ＣＤ１９に結合するＣＡＲを含む修飾細胞、ＡＣＰＰに結合するＣＡＲを含む修飾細胞、ＣＤ１９およびＡＣＰＰに結合するＣＡＲを含む修飾細胞、および／またはＣＤ１９およびＡＣＰＰにそれぞれ結合する２つのＣＡＲを含む修飾細胞を含み得る。実施形態では、修飾細胞は、癌を有する被検体を治療するために使用され得る。
実施形態では、本明細書に記載の修飾細胞は、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインを含むＣＡＲ分子を含む。ＣＡＲ分子は、二重特異性ＣＡＲ分子であってもよい。例えば、２つの抗原結合ドメインは、同じＣＡＲ分子、異なるＣＡＲ分子、またはＣＡＲ分子とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に存在し得る。単一のＣＡＲは、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインを含み得、または２つの異なる抗原結合ドメインは、それぞれ別個のＣＡＲ分子上に存在する。少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインは、同一のＣＡＲ分子または異なるＣＡＲ分子上に存在し得るが、同一の修飾細胞中にある。さらに、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインは、同一の修飾細胞中のＣＡＲ分子およびＴ細胞受容体上に存在し得る。実施形態では、二重特異性ＣＡＲ分子は、ＷＢＣの抗原（例えば、ＣＤ１９）に結合する結合ドメインと、固形腫瘍抗原に結合する結合ドメインとを含み得る。実施形態では、二重特異性ＣＡＲ分子は、２つの異なる固形腫瘍抗原に結合する２つの結合ドメインを含み得る。
実施形態では、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインは、異なる修飾細胞によって発現される異なるＣＡＲ分子上に存在する。さらに、１つ以上の異なる抗原結合ドメインは、異なる修飾細胞によって発現されるＣＡＲ分子およびＴ細胞受容体上に存在する。
関連する配列は、本出願およびイノベーティブセルラーセラピューティクス株式会社（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）のＰＣＴ特許出願番号：ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７５０６１、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０８８９１４およびＰＣＴ／ＵＳ１９／０１３０６８に提供されており、その全体が参照により組み込まれている。
以下の例示的な実施形態および実施例を参照して、本開示をさらに説明する。これらの例示的な実施形態および実施例は、例示のみを目的として提供され、特に指定されていない限り、本発明を限定することを意図しない。従って、本開示は、以下の例示的な実施形態および実施例に限定されると解釈されるべきではなく、本明細書に提供される示唆の結果として明らかになる任意のおよびすべての変形を包含するように解釈されるべきである。
例示的な実施形態
例示的な実施形態は以下のとおりである。
１、固形腫瘍の抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列。
２、細胞外ドメインはＳＩＧＬＥＣ１５に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
３、細胞外ドメインはＳＩＧＬＥＣ１５に結合し、前記ＳＩＧＬＥＣ１５は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
４、細胞外ドメインは、配列番号４５−５６のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
５、実施形態２−４のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
６、腫瘍は、尿路上皮癌に関連する、実施形態１−５のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
７、細胞外ドメインはＫＩＳＳ１Ｒに結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
８、細胞外ドメインはＫＩＳＳ１Ｒに結合し、前記ＫＩＳＳ１Ｒは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
９、細胞外ドメインは、配列番号７１および７２のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
１０、実施形態７−９のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
１１、腫瘍は、腎臓癌に関連する、実施形態１および７−１０のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
１２、細胞外ドメインはＣＬＤＮ６に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
１３、細胞外ドメインはＣＬＤＮ６に結合し、前記ＣＬＤＮ６は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
１４、細胞外ドメインは、配列番号２９−４４のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
１５、実施形態１２−１５のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
１６、腫瘍は、子宮内膜癌および／または尿路上皮癌に関連する、実施形態１および１２−１６のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
１７、細胞外ドメインはＭＵＣ１６に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
１８、細胞外ドメインはＭＵＣ１６に結合し、前記ＭＵＣ１６は、配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
１９、細胞外ドメインは、配列番号６３−７０のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
２０、実施形態１７−１９のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
２１、腫瘍は、卵巣癌に関連する、実施形態１および１７−２０のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
２２、細胞外ドメインはＳＬＣ６Ａ３に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
２３、細胞外ドメインはＳＬＣ６Ａ３に結合し、前記ＳＬＣ６Ａ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
２４、実施形態２２および２３のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
２５、腫瘍は、腎臓癌に関連する、実施形態１および２２−２４のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
２６、細胞外ドメインはＱＲＦＰＲに結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
２７、細胞外ドメインはＱＲＦＰＲに結合し、前記ＱＲＦＰＲは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
２８、実施形態２６および２７のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
２９、腫瘍は、腎臓癌に関連する、実施形態１および２６−２８のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
３０、細胞外ドメインはＧＰＲ１１９に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
３１、細胞外ドメインはＧＰＲ１１９に結合し、前記ＧＰＲ１１９は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
３２、実施形態３０および３１のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
３３、腫瘍は、膵臓癌に関連する、実施形態１および３０−３２のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
３４、細胞外ドメインはＵＰＫ２に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
３５、細胞外ドメインはＵＰＫ２に結合し、前記ＵＰＫ２は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
３６、実施形態３４および３５のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
３７、腫瘍は、尿路上皮癌および／または膀胱癌に関連する、実施形態１および３４−３６のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
３８、細胞外ドメインはＡＤＡＭ１２に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
３９、細胞外ドメインはＡＤＡＭ１２に結合し、前記ＡＤＡＭ１２は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
４０、実施形態３８および３９のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
４１、腫瘍は、乳腺癌および／または膵臓癌に関連する、実施形態１および３８−４０のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
４２、細胞外ドメインはＳＬＣ４５Ａ３に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
４３、細胞外ドメインはＳＬＣ４５Ａ３に結合し、前記ＳＬＣ４５Ａ３は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
４４、実施形態４２および４３のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
４５、腫瘍は、前立腺癌に関連する、実施形態１および４２−４４のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
４６、細胞外ドメインはＡＣＰＰに結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
４７、細胞外ドメインはＡＣＰＰに結合し、前記ＡＣＰＰは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
４８、実施形態４６および４７のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
４９、腫瘍は、前立腺癌に関連する、実施形態１および４６−４８のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
５０、細胞外ドメインはＭＵＣ２１に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
５１、細胞外ドメインはＭＵＣ２１に結合し、前記ＭＵＣ２１は、配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
５２、実施形態５０および５１のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
５３、腫瘍は、食道癌に関連する、実施形態１および５０−５２のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
５４、細胞外ドメインはＭＳ４Ａ１２に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
５５、細胞外ドメインはＭＳ４Ａ１２に結合し、前記ＭＳ４Ａ１２は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
５６、実施形態５４および５５のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
５７、腫瘍は、結腸直腸癌に関連する、実施形態１および５４−５６のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
５８、細胞外ドメインはＡＬＰＰに結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
５９、細胞外ドメインはＡＬＰＰに結合し、前記ＡＬＰＰは、配列番号８のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
６０、実施形態５８および５９のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
６１、腫瘍は、子宮内膜癌に関連する、実施形態１および５８−６０のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
６２、細胞外ドメインはＳＬＣ２Ａ１４に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
６３、細胞外ドメインはＳＬＣ２Ａ１４に結合し、前記ＳＬＣ２Ａ１４は、配列番号９のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
６４、実施形態６２および６３のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
６５、腫瘍は、精巣癌に関連する、実施形態１および６２−６４のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
６６、細胞外ドメインはＧＳ１−２５９Ｈ１３．２に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
６７、細胞外ドメインはＧＳ１−２５９Ｈ１３．２に結合し、前記ＧＳ１−２５９Ｈ１３．２は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
６８、実施形態６６および６７のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
６９、腫瘍は、甲状腺癌または神経膠腫、または精巣癌に関連する、実施形態１および６６−６９のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
７０、細胞外ドメインはＥＲＶＦＲＤ−１に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
７１、細胞外ドメインはＥＲＶＦＲＤ−１に結合し、前記ＥＲＶＦＲＤ−１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
７２、実施形態７０および７１のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
７３、腫瘍は、腎臓癌または尿道癌に関連する、実施形態１および７０−７２のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
７４、細胞外ドメインはＡＤＧＲＧ２に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
７５、細胞外ドメインはＡＤＧＲＧ２に結合し、前記ＡＤＧＲＧ２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
７６、実施形態７４および７５のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
７７、腫瘍は、卵巣癌に関連する、実施形態１および７４−７６のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
７８、細胞外ドメインはＥＣＥＬ１に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
７９、細胞外ドメインはＥＣＥＬ１に結合し、前記ＥＣＥＬ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
８０、実施形態７８および７９のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
８１、腫瘍は、子宮内膜癌に関連する、実施形態１および７８−８０のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
８２、細胞外ドメインはＣＨＲＮＡ２に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
８３、細胞外ドメインはＣＨＲＮＡ２に結合し、前記ＣＨＲＮＡ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
８４、実施形態８２および８３のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
８５、腫瘍は、前立腺癌に関連する、実施形態１および８２−８４のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
８６、細胞外ドメインはＧＰ２に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
８７、細胞外ドメインはＧＰ２に結合し、前記ＧＰ２は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
８８、実施形態８６および８７のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
８９、腫瘍は、膵臓癌に関連する、実施形態１および８６−８８のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
９０、細胞外ドメインはＰＳＧ９に結合する、実施形態１に記載の単離核酸配列。
９１、細胞外ドメインはＰＳＧ９に結合し、前記ＰＳＧ９は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離核酸配列。
９２、実施形態９０および９１のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
９３、腫瘍は、腎臓癌または肝臓癌に関連する、実施形態１および９０−９２のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
９４、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域を含む、実施形態１−９３のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
９５、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１−９３のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
９６、実施形態１−９３のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含む、ベクター。
９７、実施形態１−９３のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含む、単離細胞。
９８、実施形態９６または９７のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞集団を含む、組成物。
９９、実施形態１−９３のいずれか一項に記載の単離核酸配列によってコードされる、ＣＡＲ。
１００、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外ドメインは、遺伝子融合体の遺伝子融合抗原に結合する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列。
１０１、遺伝子融合は、第１の遺伝子の少なくとも一部と第２の遺伝子の少なくとも一部との融合を含む、実施形態１００に記載の単離核酸配列。
１０２、第１の遺伝子および第２の遺伝子は、表５に記載の融合体の第１の遺伝子および第２の遺伝子を含む、実施形態１０１に記載の単離核酸配列。
１０３、遺伝子融合抗原は、表３に記載の病状に関連する、実施形態１０２に記載の単離核酸配列。
１０４、実施形態１００−１０３のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することを含む、固形腫瘍を有する被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、または被検体の固形腫瘍を治療する方法。
１０５、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域を含む、実施形態１００−１０３のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
１０６、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１００−１０３のいずれか一項に記載の単離核酸配列または方法。
１０７、実施形態１００−１０６のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含む、ベクター。
１０８、実施形態１００−１０６のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含む、単離細胞。
１０９、実施形態８または９のいずれか一項に記載のＣＡＲを含むＴ細胞集団を含む、組成物。
１１０、実施形態１００−１０６のいずれか一項に記載の単離核酸配列によってコードされる、ＣＡＲ。
１１１、細胞または修飾細胞は、健康なドナーまたは癌を有する被検体に由来するＴ細胞であり、かつ修飾Ｔ細胞は、免疫チェックポイント阻害剤に関連するドミナントネガティブ形態の受容体を含む、実施形態１−１１０のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１１２、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アッテネーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化タンパク質３（ＬＡＧ−３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（２Ｂ４）およびＣＤ １６０から選択される、実施形態１−１１０のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１１３、免疫チェックポイント阻害剤は、修飾ＰＤ−１である、実施形態１１２に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１１４、修飾ＰＤ−１は、ＰＤ−１シグナル伝達のための機能的なＰＤ−１細胞内ドメインを欠いて、ヒト細胞のヒトＴ細胞のＰＤ−１と特定の細胞のＰＤ−Ｌ１との間の経路を妨害しており、ＰＤ−１細胞外ドメイン、ＰＤ−１膜貫通ドメインまたはそれらの組み合わせであるかのもの、または野生型ＰＤ−１細胞内ドメインと比較して置換または欠失を有する修飾ＰＤ−１細胞内ドメインを含むか、もしくは特定の細胞のＰＤ−Ｌ１に結合するＰＤ−１細胞外ドメインを含む可溶性受容体であるかのものを含む、実施形態１１２に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１１５、集団のヒトＴ細胞のサイトカイン産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果は、修飾ＰＤ−１をコードする核酸配列の少なくとも一部を含まないヒトＴ細胞のサイトカイン産生に対するＰＤ−Ｌ１の阻害効果よりも小さい、実施形態１１２に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１１６、修飾Ｔ細胞は、サイトカインなどの治療薬を発現および分泌するように工学処理されている、実施形態１−１０４のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１１７、治療薬は、ＩＦＮ−γであるか、またはＩＦＮ−γを含む、実施形態１１６に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１１８、治療薬は、ＩＬ−６またはＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７およびＣＣＬ１９のうちの少なくとも１つであるか、またはそれらを含む、実施形態１１６に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１１９、治療薬は、ＩＬ−１５またはＩＬ−１２、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれらを含む、実施形態１１６に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１２０、小タンパク質または治療薬は、組換えまたは天然のサイトカインであるか、またはそれらを含む、実施形態１１６に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１２１、治療薬は、小タンパク質に関連するＦＣ融合タンパク質を含む、実施形態１１６に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１２２、小タンパク質は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−６またはＩＦＮ−γであるか、またはそれらを含む、実施形態１１６に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１２３、治療薬は、Ｈｉｆ１ａ、ＮＦＡＴ、ＦＯＸＰ３および／またはＮＦｋＢによって調節される、実施形態１１６に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１２４、小タンパク質または治療薬は、２つ以上の組換えまたは天然のサイトカインであるか、またはそれらを含み、前記サイトカインは、２Ａまたは／ＩＲＥＳ成分を介して収集される、実施形態１１６に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１２５、修飾Ｔ細胞は、第１の標的ベクターおよび第２の標的ベクターを含み、第１の標的ベクターは、血液抗原および治療薬に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含み、第２の標的ベクターは、固形腫瘍抗原およびドミナントネガティブ形式免疫検出点分子に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む、実施形態１−１２４のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１２６、修飾Ｔ細胞は、第１の標的ベクターおよび第２の標的ベクターを含み、第１の標的ベクターは、ＣＤ１９および治療薬に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含み、第２の標的ベクターは、ＵＰＫ２、ＡＣＰＰ、ＳＩＧＬＥＣ１５またはＫＩＳＳ１Ｒおよびドミナントネガティブ形式ＰＤ−１に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む、実施形態１−１２４のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１２７、修飾Ｔ細胞は、第１の標的ベクターおよび第２の標的ベクターを含み、第１の標的ベクターは、血液抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含み、第２の標的ベクターは、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む、実施形態１−１２４のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１２８、修飾Ｔ細胞は、第１の標的ベクターおよび第２の標的ベクターを含み、第１の標的ベクターは、Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含み、第２の標的ベクターは、固形腫瘍抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を含む、実施形態１−１２４のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１２９、固形腫瘍抗原は、表２に記載の抗原のうちの少なくとも１つであり、および／またはＢ細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、実施形態１２８に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１３０、固形腫瘍抗原は、表２に記載の抗原のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１２８に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１３１、実施形態１３０に記載のＴ細胞組成物の有効量を被検体に投与することを含み、前記被検体は、Ｂ細胞抗原に結合するＣＡＲを持たないＣＡＲ Ｔ細胞の有効量が投与された被検体と比較して、より高いレベルのＴ細胞増幅を有する、所望の被検体におけるＴ細胞増幅を誘発および／または増強する方法。
１３２、修飾Ｔ細胞は、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、またはそれらの組み合わせをコードする核酸配列を含む、実施形態１−１３１のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１３３、修飾Ｔ細胞は、核酸配列を持たないＴ細胞よりも増殖性が高い、実施形態１３２に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１３４、増殖可能な細胞は、細胞治療機能などの正常なＴ細胞／ＣＡＲ Ｔ細胞の機能を保持する、実施形態１３３に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１３５、Ｔ細胞はＣＡＲを含み、前記ＣＡＲの細胞外ドメインによって認識される試薬の存在下で培養され、それによって修飾ＣＡＲ細胞が産生される、実施形態１３３に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１３６、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、またはそれらの組み合わせの統合は、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、またはそれらの組み合わせのゲノム統合と、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴまたはそれらの組み合わせの構成的発現とを含む、実施形態１−１３５のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１３７、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴまたはそれらの組み合わせの発現は、ｒｔＴＡ−ＴＲＥ系などの誘導性発現系によって調節される、実施形態１−１３６のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１３８、修飾Ｔ細胞は、ＨＳＶ−ＴＫ系などの自殺遺伝子をコードする核酸配列を含む、実施形態１−１３６のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１３９、前記細胞は、初代ヒトＴ細胞の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）への応答と比較して、生体非適合性のヒト受容体においてＧＶＨＤ応答が減少する、実施形態１−１３８のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１４０、細胞は、内因性ＴＲＡＣ遺伝子の発現が低下する、実施形態１−１３８のいずれか一項に記載の単離核酸配列、修飾Ｔ細胞または方法。
１４１、抗体は、重鎖可変領域（ＨＶＲ）配列および軽鎖可変領域（ＬＶＲ）配列を含み、前記重鎖可変領域配列は、配列番号８３、８７、８９または８５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域配列は、配列番号８２、８６、８８または８４のアミノ酸配列を含む、ＡＣＰＰに結合する抗体。
１４２、ＬＶＲは、配列番号８２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む、実施形態１４１に記載の抗体。
１４３、ＬＶＲは、配列番号８６のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号８７のアミノ酸配列を含む、実施形態１４１に記載の抗体。
１４４、ＬＶＲは、配列番号８８のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号８９のアミノ酸配列を含む、実施形態１４１に記載の抗体。
１４５、ＬＶＲは、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む、実施形態１４１に記載の抗体。
１４６、抗体は、ＬＶＲ、リンカーおよびＨＶＲを含むｓｃＦｖである、実施形態１４１−１４５のいずれか一項に記載の抗体。
１４７、ＨＶＲは、ヒトＩｇＧ鎖定常領域に結合する、実施形態１４１−１４６のいずれか一項に記載の抗体。
１４８、ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３である、実施形態１４７に記載の抗体。
１４９、抗体は、細胞毒性剤にコンジュゲートされる、実施形態１４１−１４６のいずれか一項に記載の抗体。
１５０、細胞毒性剤は、放射性同位体または毒素である、実施形態１４１−１４６のいずれか一項に記載の抗体。
１５１、抗体は、４−１ ＢＢまたはＣＤ２８またはそれらの組み合わせに由来する配列にコンジュゲートされる、実施形態１４１−１４６のいずれか一項に記載の抗体。
１５２、抗体またはフラグメントは、ＨＥＫ２９３細胞で産生される、実施形態１４１−１４６のいずれか一項に記載の抗体。
１５３、実施形態１４１−１５２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントと、薬学的に許容されるキャリアとを含む、組成物。
１５４、容器と、それに含まれる組成物とからなる製造品において、組成物は、実施形態１４１−１５２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む、製造品。
１５５、実施形態１４１−１５２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
１５６、実施形態１４１−１５２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントをコードする、発現ベクター。
１５７、実施形態１５５および１５６のいずれか一項に記載の核酸を含む、宿主細胞。
１５８、実施形態１４１−１５２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントの治療上有効な量を被検体に投与することを含む、癌を有する被検体を治療する方法。
１５９、実施形態１４１−１５２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントの治療上有効な量を被検体に投与することを含む、前立腺癌を有する被検体を治療する方法。
１６０、実施形態１４１−１５２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む抗原認識ドメインと、細胞内ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、修飾細胞。
１６１、実施形態１４１−１５２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む抗原認識ドメインと、細胞内ドメインとを含む修飾細胞を、被検体に投与することを含む、癌を有する被検体を治療する方法。
１６２、修飾細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、胚胎細胞、樹状細胞またはマクロファージのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１６０および１６１のいずれか一項に記載の修飾細胞または方法。
１６３、遺伝子修飾細胞は、インビボで複製する、実施形態１６２に記載の方法。
１６４、修飾細胞は、被検体において記憶細胞を形成する、実施形態１６１に記載の方法。
１６５、修飾細胞を、被検体に静脈内投与する、実施形態１６１に記載の方法。
１６６、修飾細胞は、被検体に存続する、実施形態１６１に記載の方法。
１６７、修飾細胞は、自己Ｔ細胞である、実施形態１６１に記載の方法。
１６８、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む修飾細胞において、ＣＡＲは、配列番号８３および８２、８７および８６、８９および８８、または８５および８４のアミノ酸配列を含むＡＣＰＰ抗原結合ドメインを含む、修飾細胞。
１６９、ＣＡＲはさらに、膜貫通ドメイン、共刺激分子の細胞内ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１６８に記載の修飾細胞。
１７０、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１６９に記載の修飾細胞。
１７１、抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである、実施形態１６９に記載の修飾細胞。
１７２、ｓｃＦｖは、配列番号８３および８２のアミノ酸配列を含む、実施形態１６９に記載の修飾細胞。
１７３、ｓｃＦｖは、配列番号８７および８６のアミノ酸配列を含む、実施形態１６９に記載の修飾細胞。
１７４、ｓｃＦｖは、配列番号８９および８８のアミノ酸配列を含む、実施形態１６９に記載の修飾細胞。
１７５、ｓｃＦｖは、配列番号８５および８４のアミノ酸配列を含む、実施形態１６９に記載のヒトＴ細胞。
１７６、Ｔ細胞は、核酸配列を含むベクターを含む、実施形態１６７に記載の修飾細胞。
１７７、ベクターはレンチウイルスベクターである、実施形態１７６に記載の修飾細胞。
１７８、修飾細胞は、白血球の抗原に結合する他のＣＡＲを含む、実施形態１６８−１７７のいずれか一項に記載の修飾細胞。
１７９、白血球の抗原はＢ細胞抗原である、実施形態１７８に記載の修飾細胞。
１８０、前記Ｂ細胞抗原の抗原はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、実施形態１７９に記載の修飾細胞。
１８１、修飾細胞は、ドミナントネガティブＰＤ−１を含む、実施形態１６８−１８０のいずれか一項に記載の修飾細胞。
１８２、修飾細胞は、機能的なＰＤ−１細胞内ドメインを欠いた修飾ＰＤ−１を含む、実施形態１６８−１８０のいずれか一項に記載の修飾細胞。
１８３、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域を含む、実施形態１６８−１８０のいずれか一項に記載の修飾細胞。
１８４、抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）またはＣＤ４である、実施形態１８３に記載の修飾細胞。
１８５、修飾細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞である、実施形態１６８−１８４のいずれか一項に記載の修飾細胞。
１８６、修飾細胞はさらに、治療薬をコードする核酸配列を含む、実施形態１６８−１８５のいずれか一項に記載の修飾細胞。
１８７、治療薬は、組換えＤＮＡ構築物、ｍＲＮＡまたはウイルスベクターの形で修飾細胞中に存在する、実施形態１８６に記載の修飾細胞。
１８８、修飾細胞は、治療薬をコードする治療薬ｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡは、修飾細胞のゲノムに組み込まれていない、実施形態１８６に記載の修飾細胞。
１８９、修飾細胞は、核酸配列または単離核酸配列を含み、前記核酸配列は、細胞内での治療薬の発現および／または分泌を調節する転写調節因子の結合部位を含むプロモーターを含む、実施形態１８６に記載の修飾細胞。
１９０、転写調節因子は、Ｈｉｆ１ａ、ＮＦＡＴ、ＦＯＸＰ３および／またはＮＦｋＢであるか、またはそれらを含む、実施形態１８９に記載の修飾細胞。
１９１、プロモーターは、転写調節因子に応答する、実施形態１８９に記載の修飾細胞。
１９２、プロモーターは、治療薬をコードする核酸配列に操作可能に連結され、これにより、プロモーターが細胞での治療薬の発現および／または分泌を駆動する、実施形態１８９に記載の修飾細胞。
１９３、実施形態１６８−１９２のいずれか一項に記載の修飾細胞を含む、医薬組成物。
１９４、実施形態１９３に記載の組成物の有効量を被検体に投与することを含む、所望の被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、および／または被検体の腫瘍を治療する方法。
１９５、抗体または抗体フラグメントは、重鎖可変領域（ＨＶＲ）配列および軽鎖可変領域（ＬＶＲ）配列を含み、前記重鎖可変領域配列は、配列番号９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８または１２２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域配列は、配列番号９３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７または１２１のアミノ酸配列を含む、ＵＰＫ２に結合する抗体または抗体フラグメント。
１９６、ＬＶＲは、配列番号９３のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号９４のアミノ酸配列を含む、実施形態１９５に記載の抗体または抗体フラグメント。
１９７、ＬＶＲは、配列番号９７のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む、実施形態１９５に記載の抗体または抗体フラグメント。
１９８、ＬＶＲは、配列番号１０１のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む、実施形態１９５に記載の抗体または抗体フラグメント。
１９９、ＬＶＲは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む、実施形態１９５に記載の抗体または抗体フラグメント。
２００、ＬＶＲは、配列番号１０９のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む、実施形態１９５に記載の抗体または抗体フラグメント。
２０１、ＬＶＲは、配列番号１１３のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む、実施形態１９５に記載の抗体または抗体フラグメント。
２０２、ＬＶＲは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む、実施形態１９５に記載の抗体または抗体フラグメント。
２０３、ＬＶＲは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲは、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む、実施形態１９５に記載の抗体または抗体フラグメント。
２０４、ＨＶＲは、ヒトＩｇＧ鎖定常領域に結合する、実施形態１９５−２０３のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント。
２０５、ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３である、実施形態２０４に記載の抗体または抗体フラグメント。
２０６、抗体または抗体フラグメントは、細胞毒性剤にコンジュゲートされる、実施形態１９５−２０５のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント。
２０７、細胞毒性剤は、放射性同位体または毒素である、実施形態１２に記載の抗体または抗体フラグメント。
２０８、抗体または抗体フラグメントは、４−１ ＢＢまたはＣＤ２８またはそれらの組み合わせに由来する配列にコンジュゲートされる、実施形態１９５−２０７のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント。
２０９、抗体またはフラグメントは、ＨＥＫ２９３細胞で産生される、実施形態１９５−２０８のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント。
２１０、抗体はｓｃＦｖである、実施形態１９５−２０９のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント。
２１１、ｓｃＦｖは、配列番号９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６または１２０を含むか、またはそれらである、実施形態２１０に記載の抗体または抗体フラグメント。
２１２、抗体または抗体フラグメントは、配列番号９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６または１２０を含む、実施形態２１０に記載の抗体または抗体フラグメント。
２１３、実施形態１９５−２１２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントと、薬学的に許容されるキャリアとを含む、組成物。
２１４、容器と、それに含まれる組成物とからなる製造品において、組成物は、実施形態１９５−２１２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む、製造品。
２１５、実施形態１９５−２１２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
２１６、実施形態１９５−２１２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントをコードする、発現ベクター。
２１７、実施形態２１または２１６のいずれか一項に記載の核酸を含む、宿主細胞。
２１８、実施形態１９５−２１２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントの治療上有効な量を被検体に投与することを含む、ＵＰＫ２陽性腫瘍（例えば、尿路上皮癌および膀胱癌）を有する被検体を治療する方法。
２１９、実施形態１９５−２１２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントの治療上有効な量を被検体に投与することを含む、尿路上皮癌および膀胱癌を有する被検体を治療する方法。
２２０、実施形態１９５−２１２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
２２１、実施形態２２０に記載のＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチド。
２２２、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む修飾細胞であって、ＣＡＲは、実施形態１９５−２１２のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含むＵＰＫ２抗原結合ドメインを含む、修飾細胞。
２２３、ＣＡＲはさらに、膜貫通ドメイン、共刺激分子の細胞内ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む、実施形態２２２に記載の修飾細胞。
２２４、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態２２３に記載の修飾細胞。
２２５、抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである、実施形態２２２−２２４のいずれか一項に記載の修飾細胞。
２２６、ｓｃＦｖは、配列番号９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６または１２０のアミノ酸配列を含む、実施形態２２２−２２４のいずれか一項に記載の修飾細胞。
２２７、修飾細胞は核酸配列を含むベクターを含み、前記核酸配列は、配列番号９１、９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５または１１９を含む、実施形態２２２−２２４のいずれか一項に記載の修飾細胞。
２２８、ベクターはレンチウイルスベクターである、実施形態２２７に記載の修飾細胞。
２２９、修飾細胞は、患者から単離された初代ヒトＴ細胞に由来するＴ細胞である、実施形態２２２−２２８のいずれか一項に記載の修飾細胞。
２３０、修飾細胞は、ヒトドナーから単離された初代ヒトＴ細胞に由来するＴ細胞である、実施形態２２２−２２８のいずれか一項に記載の修飾細胞。
２３１、細胞は、内因性ＴＲＡＣ遺伝子の発現が低下する、実施形態２２９に記載の修飾細胞。
２３２、修飾細胞は、白血球の抗原に結合する他のＣＡＲを含む、実施形態２２２−２３１のいずれか一項に記載の修飾細胞。
２３３、白血球の抗原はＢ細胞抗原である、実施形態２３２に記載の修飾細胞。
２３４、前記Ｂ細胞抗原はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢＣＭＡである、実施形態２３３に記載の修飾細胞。
２３５、修飾細胞は、ドミナントネガティブＰＤ−１を含む、実施形態２２２−２３４のいずれか一項に記載の修飾細胞。
２３６、修飾細胞は、機能的なＰＤ−１細胞内ドメインを欠いた修飾ＰＤ−１を含む、実施形態２２２−２３４のいずれか一項に記載の修飾細胞。
２３７、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域を含む、実施形態２２２−２３４のいずれか一項に記載の修飾細胞。
２３８、抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）またはＣＤ４である、実施形態２３７に記載の修飾細胞。
２３９、修飾細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞である、実施形態２２２−２３８のいずれか一項に記載の修飾細胞。
２４０、修飾細胞はさらに、治療薬をコードする核酸配列を含む、実施形態２２２−２３９のいずれか一項に記載の修飾細胞。
２４１、治療薬は、組換えＤＮＡ構築物、ｍＲＮＡまたはウイルスベクターの形で修飾細胞中に存在する、実施形態２４０に記載の修飾細胞。
２４２、修飾細胞は、治療薬をコードする治療薬ｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡは、修飾細胞のゲノムに組み込まれていない、実施形態２４０に記載の修飾細胞。
２４３、修飾細胞は、核酸配列または単離核酸配列を含み、前記核酸配列は、細胞内での治療薬の発現および／または分泌を調節する転写調節因子の結合部位を含むプロモーターを含む、実施形態２４０に記載の修飾細胞。
２４４、転写調節因子は、Ｈｉｆ１ａ、ＮＦＡＴ、ＦＯＸＰ３および／またはＮＦｋＢであるか、またはそれらを含む、実施形態２４３に記載の修飾細胞。
２４５、プロモーターは、転写調節因子に応答する、実施形態２４３に記載の修飾細胞。
２４６、プロモーターは、治療薬をコードする核酸配列に操作可能に連結され、これにより、プロモーターが細胞での治療薬の発現および／または分泌を駆動する、実施形態２４３に記載の修飾細胞。
２４７、実施形態２２２−２４６のいずれか一項に記載の修飾細胞を含む、医薬組成物。
２４８、実施形態２４７に記載の組成物の有効量を被検体に投与することを含む、所望の被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法、および／または被検体の腫瘍を治療する方法。
２４９．抗原に結合する第１の結合ドメインと、Ｔ細胞ＣＤ３受容体複合体に結合する第２の結合ドメインとを含む、結合分子をコードする単離核酸配列。
２５０．抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）またはＣＤ４である、請求項２４９に記載の単離核酸。
２５１、第２の結合ドメインはＣＤ３εに結合し、および／または第１の結合ドメインは、配列番号３０、３４、３８、４２、４６、６４、６８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０および１３６−１７２のアミノ酸配列のうちの１つを含む、実施形態２４９に記載の単離核酸配列。
２５２、第１の結合ドメインは、ｔｎ−Ｍｕｃ１、ＴＳＨＲ、ＦＺＤ１０、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ １６、Ｍｕｃ １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６またはＳＩＧＬ１Ｃに結合する、実施形態２４９に記載の単離核酸配列。
２５３、単離核酸配列は、配列番号１２３−１３５のアミノ酸配列のうちの１つを含むポリペプチドをコードする、実施形態２４９に記載の単離核酸配列。
２５４、実施形態２４９−２５３のいずれか一項に定義される核酸配列を含む、ベクター。
２５５、実施形態１−５のいずれか一項に定義される核酸配列、または実施形態２５４に定義されるベクターで形質転換またはトランスフェクトする、宿主細胞。
２５６、実施形態１−４のいずれか一項に定義される結合分子の発現を許容する条件下で実施形態２５４に定義される宿主細胞を培養することと、培養物から産生された結合分子を回収することとを含む、実施形態１ー４のいずれか一項に記載の結合分子を産生する方法。
２５７、実施形態１ー４のいずれか一項に記載の結合分子、または実施形態２５６に記載の方法によって産生される結合分子を含む、医薬組成物。
２５８、実施形態１ー４のいずれか一項に定義される結合分子、実施形態１−４のいずれか一項に定義される核酸分子、実施形態２５３に定義されるベクターおよび／または実施形態７に定義される宿主細胞を含む、キット。
２５９、実施形態１ー４のいずれか一項に記載の結合分子を、所望の被検体に投与すること、または実施形態２５６に記載の方法を含む、疾患を治療または改善するための方法。
２６０、白血球の細胞表面分子に結合する抗原結合分子を含むＴ細胞の有効量を、所望の被検体に投与することをさらに含み、ここで、白血球の細胞表面分子は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３０、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１６９、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８またはＣＤ１３である、実施形態２５９に記載の方法。
２６１、抗原結合分子は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、実施形態２６０に記載の方法。
２６２、Ｔ細胞は、抗原に結合する他のＣＡＲを含む、実施形態２６１に記載の方法。
２６３、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外ドメインは、腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列。
２６４、少なくとも２つの結合ドメインは、それぞれｔａ−Ｍｕｃ１および非ｔａ−Ｍｕｃ１抗原に結合するｓｃＦｖである、実施形態２６３に記載の単離核酸配列。
２６５、少なくとも２つの結合ドメインは、ｔａ−Ｍｕｃ１に結合する抗原結合ドメインと、ｔａ−Ｍｕｃ１と異なる抗原に結合する他の抗原結合ドメインとを含む、実施形態２６３に記載の単離核酸配列。
２６６、ｔａ−Ｍｕｃ１と異なる抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）またはＣＤ４である、実施形態２６５に記載の単離核酸配列。
２６７、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域を含む、実施形態２６３に記載の単離核酸配列。
２６８、少なくとも２つの結合ドメインは、配列番号１３５および配列番号３０、３４、３８、４２、４６、６４、６８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０および１３６−１７２のうちの１つを含む、実施形態２６３に記載の単離核酸配列。
２６９、少なくとも２つの結合ドメインは、配列番号７０および配列番号５９−８４のうちの１つを含む、実施形態１５に記載の単離核酸配列。
２７０、実施形態２４９−２５３および２６３−２６８のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含む、ＣＡＲ細胞集団。
２７１、実施形態２７０に記載のＣＡＲ細胞集団を含む、医薬組成物。
２７２、実施形態２７１に記載の組成物の有効量を被検体に投与することを含む、所望の被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強し、所望の被検体におけるＴ細胞応答を誘発および誘致し、および／または被検体の腫瘍を治療する方法。
２７３、２つ以上の異なる抗原結合ドメインを含む修飾細胞であって、少なくとも第１の抗原結合ドメインは細胞表面マーカーに結合し、第２の抗原結合ドメインは腫瘍抗原に結合する、１つ以上の修飾細胞。
２７４、細胞表面マーカーは、白血球の細胞表面マーカーを含む、実施形態２７３に記載の１つ以上の修飾細胞。
２７５、腫瘍抗原は、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＳＬＣ６Ａ３、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＱＲＦＰＲ、ＧＰＲ１１９、ＣＬＤＮ６、ＵＰＫ２、ＡＤＡＭ１２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＡＣＰＰ、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ１６、ＭＳ４Ａ１２またはＡＬＰＰのうちの１つ以上を含む、実施形態２７３または２７４に記載の１つ以上の修飾細胞。
２７６、抗原結合ドメインは、同じＣＡＲ分子、異なるＣＡＲ分子、またはＣＡＲ分子とＴ細胞受容体に存在する、実施形態２７３−２７５のいずれか一項に記載の１つ以上の修飾細胞。
２７７、２つ以上の異なる抗原結合ドメインは、異なる修飾分子の異なるＣＡＲ分子に存在する、実施形態２７３−２７６のいずれか一項に記載の１つ以上の修飾細胞。
２７８、２つ以上の異なる抗原結合ドメインは、異なる修飾分子のＣＡＲ分子とＴ細胞受容体に存在する、実施形態２７３−２７７のいずれか一項に記載の１つ以上の修飾細胞。
２７９、実施形態２７３−２７８のいずれか一項に記載の１つ以上の修飾細胞を含む、細胞集団。
２８０、実施形態１−２７９のいずれか一項に記載の核酸配列、ＣＡＲ分子、抗体、ベクター、細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物、キットまたは方法の、療法によって被検体の体を治療する方法における用途。
２８１、被検体はヒトまたは動物である、実施形態２８０に記載の用途。
２８２、被検体は、癌に罹患している、実施形態２８０または２８１に記載の用途。
２８３、被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する、実施形態２８０−２８２のいずれか一項に記載の用途。
２８４、実施形態１−２７９のいずれか一項に記載の核酸配列、ＣＡＲ分子、抗体、ベクター、細胞、細胞集団、組成物、医薬組成物、キットまたは方法の、被検体におけるＴ細胞応答を誘発および／または増強する方法における用途。
２８５、被検体はヒトまたは動物である、実施形態２８４に記載の用途。
２８６、被検体は、癌に罹患している、実施形態２８４または２８５に記載の用途。
以下の実施例を参照して、本開示をさらに説明する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供され、特に指定されていない限り、本発明を限定することを意図しない。従って、本開示は、以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、本明細書に提供される示唆の結果として明らかになる任意のおよびすべての変形を包含するように解釈されるべきである。
Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現
ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクター（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ１３７ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｅｆｆｉｃａｃｙ，Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，第１７巻第８号，１４５３−１４６４，２００９年８月を参照、前記参考文献は参照により本明細書に組み込まれる）を生成し、かつ、それをヒトＴ細胞に導入した。
患者から初代Ｔ細胞を得た。得られた初代Ｔ細胞をレンチウイルスベクターで形質導入し、修飾Ｔ細胞を得た。フローサイトメトリーを実施し、分析し、初代Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現を決定した（図２）。細胞培養、レンチウイルスベクター構築およびフローサイトメトリーに関連する技術は、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＤ１３７ ｄｏｍａｉｎｓ．３３６０−３３６５ ＰＮＡＳ ２００９年３月３日，第１０６巻第９号に記載されており、前記参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
抗原発現と関連腫瘍の分析
ヒト細胞における標的分子のｍＲＮＡ発現レベルおよびタンパク質発現レベルの検出は、ｑＰＣＲやＦＡＣＳなどの実験方法を用いて行われる。以下に列挙する標的分子のいくつかは、対応する腫瘍細胞において特異的に発現するが、正常組織での発現が比較的低くまたは検出不可能である。例えば、８つの遺伝子は、正常組織に局在し、かつ、腫瘍細胞において過剰発現した。標的点と腫瘍の対応する関係を表４に示す。様々なアッセイ（例えば、殺傷）を実施し、結果を図３−７に示す。細胞培養、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイの構築に関連する技術は、「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＤ１３７ ｄｏｍａｉｎｓ」，ＰＮＡＳ ２００９年３月３日、第１０６巻第９号、３３６０−３３６５に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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遺伝子融合抗原の同定
遺伝子融合産物および遺伝子融合抗原を同定するために、データベース（例えば、ＴＣＧＡ）を分析した数百の遺伝子融合産物が同定され、かつ、癌との関連性が決定された。これら数百の遺伝子融合産物のうち、さらに所定の基準に基づいて３３の遺伝子融合抗原群が同定された。例えば、これらの遺伝子融合産物が腫瘍細胞で発現しており、かつ、融合遺伝子の融合タンパク質が原形質膜に位置していることは見出された。これら３３の遺伝子融合抗原群の情報を表５に示す。表５の各行に対応するサンプルは、ＴＣＧＡ−Ｄ８−Ａ１ＸＪ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ１４Ｍ−０７、ＴＣＧＡ−Ｅ２−Ａ５７４−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ２９Ｒ−０７、ＴＣＧＡ−ＦＵ−Ａ３ＴＸ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ２２Ｕ−０７、ＴＣＧＡ−ＣＶ−７４３４−０１Ａ−１１Ｒ−２１３２−０７、ＴＣＧＡ−Ｇ７−６７９３−０１Ａ−１１Ｒ−１９６５−０７、ＴＣＧＡ−ＤＢ−５２７７−０１Ａ−０１Ｒ−１４７０−０７、ＴＣＧＡ−ＫＴ−Ａ７Ｗ１−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ３４Ｆ−０７、ＴＣＧＡ−ＶＭ−Ａ８ＣＤ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ３６Ｈ−０７、ＴＣＧＡ−ＤＤ−Ａ３Ａ５−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ２２Ｌ−０７、ＴＣＧＡ−ＤＤ−ＡＡＥＡ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ４１Ｃ−０７、ＴＣＧＡ−ＺＳ−Ａ９ＣＦ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ３８Ｂ−０７、ＴＣＧＡ−４４−７６７０−０１Ａ−１１Ｒ−２０６６−０７、ＴＣＧＡ−５５−７２８１−０１Ａ−１１Ｒ−２０３９−０７、ＴＣＧＡ−６２−８３９４−０１Ａ−１１Ｒ−２３２６−０７、ＴＣＧＡ−７８−７１４３−０１Ａ−１１Ｒ−２０３９−０７、ＴＣＧＡ−７８−７１４６−０１Ａ−１１Ｒ−２０３９−０７、ＴＣＧＡ−４６−６０２５−０１Ａ−１１Ｒ−１８２０−０７、ＴＣＧＡ−８５−７７１０−０１Ａ−１１Ｒ−２１２５−０７、ＴＣＧＡ−Ｏ２−Ａ５２Ｖ−０１Ａ−３１Ｒ−Ａ２６２−０７、ＴＣＧＡ−ＦＢ−ＡＡＰＺ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ４１Ｂ−０７、ＴＣＧＡ−Ｐ８−Ａ５ＫＣ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ３５Ｋ−０７、ＴＣＧＡ−ＷＢ−Ａ８１Ｄ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ３５Ｌ−０７、ＴＣＧＡ−ＥＪ−５５１０−０１Ａ−０１Ｒ−１５８０−０７、ＴＣＧＡ−ＥＪ−Ａ４６Ｇ−０１Ａ−３１Ｒ−Ａ２６Ｕ−０７、ＴＣＧＡ−ＺＧ−Ａ９Ｌ２−０１Ａ−３１Ｒ−Ａ４１Ｏ−０７、ＴＣＧＡ−ＺＧ−Ａ９Ｌ２−０１Ａ−３１Ｒ−Ａ４１Ｏ−０７、ＴＣＧＡ−ＥＩ−７００２−０１Ａ−１１Ｒ−１９２８−０７、ＴＣＧＡ−ＤＸ−Ａ１ＫＺ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ２４Ｘ−０７、ＴＣＧＡ−ＤＸ−Ａ２Ｊ０−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ２１Ｔ−０７、ＴＣＧＡ−ＤＸ−Ａ３ＵＦ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ３０Ｃ−０７、ＴＣＧＡ−ＤＸ−ＡＢ２Ｖ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ４１Ｉ−０７、ＴＣＧＡ−Ｋ１−Ａ６ＲＵ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ３２Ｑ−０７およびＴＣＧＡ−ＥＢ−Ａ２４Ｄ−０１Ａ−１１Ｒ−Ａ１８Ｔ−０７を含み、それぞれがＴＣＧＡデータベース内のバーコードを表す。ＴＣＧＡバーコードは、ＴＣＧＡデータベース内の参加者およびそのサンプルのメタデータを表す。
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抗ＳＩＮＧＬＥＣ−１５ ＣＡＲおよび抗ＫＩＳＳＲ ＣＡＲ
図２は、ＣＡＲを発現するＴ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。１日目に、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を選別した。３日目に、ＣＡＲをコードするレンチウイルスをＴ細胞に感染させる（感染多重度（ＭＯＩ）：５０：１）。５−６日目に、発現アッセイを行った。６日目に、３Ｔ３−抗原−ｍｃｈｅｒｒｙ−ＳＣを用いて３０：１の比率でＴ細胞を培養した。図２−７に記載されている配列および参考文献を、表７に示す。
図３は、抗ＳＩＧＬＥＣ１５ ＣＡＲ（ＳＩＧＬＥＣ１５−ＣＡＲ 配列番号４６、５０、５１および５２）殺傷アッセイの結果を示す。抗ＳＩＧＬＥＣ１５ ＣＡＲ Ｔ細胞が基質細胞を死滅させたことが観察された。陰性対照ＳＩＧＬＥＣ１５単独群は、抗ＳＩＧＬＥＣ１５ ＣＡＲ Ｔ細胞を添加していない群であり、ＮＴ群は非トランスフェクトＴ細胞に添加された。図４および図５は、基質細胞と共培養した抗ＳＩＧＬＥＣ１５ ＣＡＲのサイトカイン放出アッセイ結果を示す。
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図６は、抗ＫＩＳＳＲ ＣＡＲ（ＫＩＳＳＲ−ＣＡＲ：配列番号７１）の殺傷アッセイ結果を示す。抗ＫＩＳＳ１Ｒ ＣＡＲ Ｔ細胞が基質細胞を死滅させたことが観察された。ＮＴ群は、非トランスフェクトＴ細胞に添加された。図７は、基質細胞と共培養した抗ＫＩＳＳＲ ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン放出アッセイ結果を示す。
ＡＣＰＰ抗体の調製と抗ＡＣＰＰ ＣＡＲ
図８−１０は、ＡＣＰＰ抗体のフローサイトメトリーアッセイを示す。ｐｃＤＮＡ−ＡＣＰＰ−ｆｌａｇプラスミドで２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、Ｃ末端ｆｌａｇタグ付きＡＣＰＰタンパク質を発現させた。２日後、７個のＡＣＰＰ抗体とｆｌａｇタグ抗体染色法を用いて染色を検出した。ＡＣＰＰ単一染色は膜染色を破らないので、まずＡＣＰＰ一次抗体を添加し、次にヤギ抗ヒトＦＩＴＣ二次抗体を使用する。ｆｌａｇ標識が単色の場合は、ＡＰＣ直接標識一次抗体を使用して、膜を染色する。破裂した時、Ｆｌａｇ／ＡＣＰＰ二重染色を行う。Ｆｌａｇタグ抗体は、抗原を発現している細胞の２６．３９％を検出した。Ｓ５Ｄ１抗体は、ＡＣＰＰ抗原を発現している細胞の３０．３５％を検出した。二重染色の結果、陽性細胞はＡＣＰＰとｆｌａｇの発現レベルが同じであった。染色結果は特異的である。Ｓ５Ｆ２は結合が弱く、残りの抗体の流れにはシグナルがない。トランスフェクトされたプラスミドは、２９３Ｔ細胞上でＣ末端ｆｌａｇタグ付きＡＣＰＰ膜貫通タンパク質を発現することができた。フローサイトメトリー実験により、ＡＣＰＰ抗体Ｓ５Ｄ１は細胞膜で発現する抗原との結合能力が良好であることが示された。Ｆｌａｇ標識により、タンパク質の正常発現が確認された。
図１０中の親和性アッセイについて、ＧＥ社のＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ−１００生体分子間相互作用分析装置を用いて、２つのモノクローナル抗体Ｓ５Ｄ１およびＳ５Ｆ２の親和性を分析した。従来の手順を用いて、親和性分析を行った。チップ上にコーティングした抗ヒト抗体を用いて、ヒトモノクローナル抗体Ｓ５Ｄ１またはＳ５Ｆ２を捕捉した。次いで、組換え的に発現した異なる濃度のＰＡＰを移動相として用いて、親和性分析を行った。モノクローナル抗体Ｓ５Ｄ１の親和性は約９ ｎＭであった。Ｓ５Ｆ２の親和性は１００ ｎＭよりも低いと推定される。Ｓ５Ｄ１はＡＣＰＰ抗原に対する親和性が高い。抗体の配列を表６に示す。
選択された血清前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）抗原をクローニングして発現させ、ファージディスプレイヒト抗体ライブラリー（ヒトファージディスプレイ）の調製されたＰＡＰ抗原を用いてスクリーニングすることによって、ＡＣＰＰ抗体を生成した。ＡＣＰＰ遺伝子配列を組換え抗原発現ベクターＰＴＳＥ−Ｈｉｓにクローニングした。構築した組換えプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＧＥ社のＨｉｓｔｒａｐ ＦＦアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて組換えタンパク質を精製した。古典的な固相スクリーニング戦略を参考にし、ＡＣＰＰ−Ｈｉｓを抗原としてヒト一本鎖抗体ライブラリーをスクリーニングした。一本鎖抗体ライブラリーは、完全合成ヒト一本鎖抗体、天然ヒト一本鎖抗体、半合成半天然一本鎖抗体ライブラリーの合計１２のサブライブラリーから構成される。ライブラリーの総容量は１０９を超え、正解率は約７５％である。固相被覆抗原を用いて、従来のスクリーニングを３回行った。２回目のスクリーニングの後および３回目のスクリーニングの後に、６００個のモノクローナルクローン（１２００個のモノクローナルクローン）をランダムに選択して、モノクローナル同定を行った。ＰＡＰに特異的に結合し得る約４０の陽性モノクローナルを得た。全てのモノクローナルについて配列分析を行った。その結果、これらの陽性クローンは７つの異なる抗体配列を共有していた。代表的なクローンは、それぞれＳ４Ｃ７、Ｓ５Ｄ１、Ｓ５Ｆ２、Ｓ９Ｆ５、Ｓ１０Ｅ１２、Ｓ１２Ｄ４およびＳ１２Ｄ９（配列を表６に示す）である。上記７つのｓｃＦｖの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子を、それぞれ真核発現ベクターｐＴＳＥＧ１ｎおよびｐＴＳＥＫにクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞一過性発現系を用いて、７つのヒト全抗体を調製した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて、組換え的に発現した全抗体を精製した。
図１１は、前立腺癌のパラフィン切片の免疫蛍光染色を示す。対応する方法は、１．組織の脱水、２．組織の透明化、３．ワックスの浸漬、４．埋め込み、５．スライス処理およびスライスのベーキング、６．セクショニングおよび脱ろう、７．抗原賦活化、８．血清ブロッキング、９．一次抗体の添加、１０．蛍光二次抗体の添加、１１．光から保護する血清ブロッキング、１２．一次抗体の添加、１３．蛍光二次抗体の添加、１４．染料コアの複合、１５．画像の収集、を含む。このように、前立腺癌ｉｎｓｉｔｕと、癌腫ｉｎ ｓｉｔｕに隣接する組織では、ＡＣＰＰの発現が高い。同時に、染色に使用したＡＣＰＰ抗体はＳ５Ｄ１であり、この抗体はＡＣＰＰを特異的に認識できることを示している。次のさらなる実験のために、Ｓ５Ｄ１を選択した。腫瘍組織切片におけるＡＣＰＰ発現は、免疫蛍光染色により可視化することができ、かつ、抗体の特異性および感度を反映することもできる。
図１２は、ＡＣＰＰを発現する２９３Ｔ細胞を示す。０日目に、２９３−ＷＴ（２９３−野生型）細胞を消化し、６ウェルプレート上に置いた。１日目に、ＡＣＰＰ−レンチウイルス発現ベクターで細胞を感染させた。２日目に、培地を交換してレンチウイルスを除去し、新鮮な培地を加えた。細胞を消化し、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリーに使用した抗体はＳ５Ｄ１であり、使用量は１ μｇ／１００μｌであった。流式細胞の分析結果、２９３Ｔ−ＡＣＰＰ細胞のＡＣＰＰ発現は９７．８０％であった。前記２９３Ｔ−ＡＣＰＰ細胞は、その後の実験でＡＣＰＰ陽性細胞として使用することができる。ＡＣＰＰは、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能を評価する実験のためのＡＣＰＰ陽性細胞として用いることができる２９３Ｔ細胞で過剰発現させることができる。
図１３は、抗ＡＣＰＰ ＣＡＲを発現するＴ細胞（抗ＡＣＰＰ ｓｃＦｖ：ＳＥＱ ＩＤ：１７３）のフローサイトメトリーアッセイを示す。０日目に、健康なボランティアから末梢血を採取し、ＣＤ３＋ Ｔ細胞を選別し、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを１：１の比率で添加した。１日目に、Ｔ細胞をベクターでトランスフェクトした。ＭＯＩ＝１３の感染率に従ってＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞を得て、ＭＯＩ＝１３０の感染率に従ってＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞を得た。２日目に、培地を交換してレンチウイルスを除去した。その後、新鮮な培地を用いて細胞を再懸濁した。
第６日目に、フローサイトメトリーを用いてＣＡＲ発現を検出した。ＣＤ１９ＣＡＲとＡＣＰＰ ＣＡＲはいずれもヒト化抗体を含むため、ヒトＣＡＲ抗体を検出に用いた。その結果、感染Ｔ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲの発現は５９．５５％、感染Ｔ細胞におけるＡＣＰＰ ＣＡＲの発現は２６．１６％であった。ＣＤ１９ＣＡＲおよびＡＣＰＰ ＣＡＲはいずれもヒト化抗体であるため、ヒトＣＡＲ抗体をフローサイトメトリー検出に用いてＣＡＲの発現を測定した。
図１４は、共培養アッセイの結果を示す。ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞とＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲ比をＮＴ細胞で正規化した。１０４個のＣＡＲ＋細胞と１０４個の２９３Ｔ−ＷＴまたは２９３Ｔ−ＡＣＰＰまたはＮａｌｍ−６細胞を共培養した。４８時間後に、ＣＡＲ陽性ＣＤ８陽性細胞のＣＤ１３７発現をフローサイトメトリーで検出した。左列は、２９３Ｔ−ＷＴ細胞と共培養したＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ１３７発現で、ＣＤ１９ＣＡＲ群、ＡＣＰＰ ＣＡＲ群ともにＣＤ１３７発現がない。これは、２９３Ｔで特異的抗原の発現がないために、ＣＡＲ Ｔ細胞が活性化できないことを示している。中間の一列は、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＡＣＰＰを過剰発現させた２９３Ｔまたは２９３Ｔ−ＡＣＰＰ細胞と共培養したものである。ＡＣＰＰ ＣＡＲ群でのＣＤ１３７の発現は２７．１５％であり、ＣＤ１９ＣＡＲ群ではＣＤ１３７は発現しなかった。これは、ＡＣＰＰ−ＣＡＲ Ｔ細胞がＡＣＰＰによって認識され、活性化されたことを示している。右列は、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞が特異的に認識し活性化したＣＤ１９陽性細胞であるＮａｌｍ−６細胞とＣＡＲ Ｔ細胞を共培養したものである。その結果、ＣＤ１９ＣＡＲ群ではＣＤ１３７の発現は２１．０１％であり、ＡＣＰＰ ＣＡＲ群ではＣＤ１３７は発現しなかった。結果は予想通りである。まとめると、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞はＡＣＰＰ抗原を特異的に認識し、かつ、それによって活性化できることが確認された。ＣＤ１３７は、Ｔ細胞の活性化のためのマーカータンパク質であるため、ＣＡＲ Ｔ細胞と基質標的細胞との共培養後、ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ１３７のアップレギュレーションレベルは、ＣＡＲ Ｔ細胞が活性化されているかどうかを判断するために使用され得る。
図１５は、ＡＣＰＰに応答した抗ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞のＩＦＮ−γ放出を示す。ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞とＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲ比をＮＴ細胞で正規化した。０．２×１０４個または１０４個のＣＡＲ＋細胞と１０４個の２９３Ｔ−ＷＴまたは２９３Ｔ−ＡＣＰＰまたはＮａｌｍ−６細胞を共培養して実験を行った。２４時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−γの放出量を測定した。Ｎａｌｍ−６はＣＤ１９陽性細胞であり、２９３Ｔ−ＡＣＰＰはＡＣＰＰを過剰発現する２９３Ｔ細胞である。図１５は、ＣＡＲ Ｔ細胞：基質細胞の１：１の結果を示す図である。２９３Ｔ−ＡＣＰＰと共培養したとき、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞は、有意なＩＦＮ−γ放出を示し、これにより、２９３Ｔ−ＡＣＰＰがＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞によって認識され、ＩＦＮ−γを放出して標的細胞を殺すことができることを示している。同時に、Ｎａｌｍ−６はまた、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞によって認識され、ＩＦＮ−γを放出して標的細胞を殺すことができる。さらに、Ｎａｌｍ−６は、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ放出を刺激しなかった。また、ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、２９３Ｔ−ＡＣＰＰによるＩＦＮ−γ放出を刺激することができなかった。要約すると、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＡＣＰＰ陽性標的細胞を特異的に認識し、かつ、その刺激下で標的細胞を殺すためのＩＦＮ−γを放出することができる。Ｔ細胞が標的細胞を殺す過程では、通常、ＩＦＮ−γなどのサイトカインが大量に放出され、殺傷能力を高める。従って、ＣＡＲ Ｔ細胞が標的細胞を殺す能力を有するかどうかは、ＣＡＲ Ｔ細胞を基質標的細胞と共培養したときに放出されるＩＦＮ−γの放出量によって判断することができる。
図１６は、ヒトＣＡＲ抗体を検出することにより、Ｔ細胞上の抗ＡＣＰＰ ＣＡＲのＣＡＲ発現を測定できることを示す。０日目に、健康なボランティアから末梢血を採取し、ＣＤ３＋ Ｔ細胞を選別し、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを１：１の比率で添加した。１日目に、Ｔ細胞をベクターでトランスフェクトした。ＭＯＩ=１の感染率に従ってＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞を得て、ＭＯＩ＝５０の感染率に従ってＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞を得た。２日目に、培地を交換してレンチウイルスを除去した。その後、新鮮な培地を用いて細胞を再懸濁した。第６日目に、フローサイトメトリーを用いてＣＡＲ発現を検出した。ＣＤ１９ＣＡＲとＡＣＰＰ ＣＡＲはいずれもヒト化抗体であるため、ヒトＣＡＲ抗体を検出に用いた。結果を図に示す。ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ１９ＣＡＲの発現は５０．６４％であり、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞（６５０１）におけるＡＣＰＰの発現は３７．２％であり、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞（６５０３）におけるＡＣＰＰの発現は３３．９３％であり、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞（６５０４）におけるＡＣＰＰの発現は４５．６３％であった。１９ＣＡＲおよびＡＣＰＰ ＣＡＲはいずれもヒト化抗体であるため、ヒトＣＡＲ抗体をフローサイトメトリー検出に用いることでＣＡＲの発現レベルを得ることができる。
図１７は、ＡＣＰＰに応答したＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン放出を示す。ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞とＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲ比をＮＴ細胞で正規化した。０．２×１０４または１×１０４個のＣＡＲ＋細胞と１ｘ１０４個の２９３Ｔ−ＡＣＰＰまたはＮａｌｍ−６細胞を共培養して実験を行い、２４時間後に、上清を収集してＩＦＮ−γおよびＩＬ２を検出した。Ｎａｌｍ−６はＣＤ１９陽性細胞であり、２９３Ｔ−ＡＣＰＰはＡＣＰＰを過剰発現する２９３Ｔ細胞である。図１７は、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ ６５０３が２９３Ｔ−ＡＣＰＰと共培養したときに、ＩＦＮ−γおよびＩＬ２放出の有意な増加を示しており、これにより、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ ６５０３細胞が２９３Ｔ−ＡＣＰＰを認識し、かつ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ２の放出を活性化することを示している。対照的に、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ ６５０１および６５０４細胞は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ２の放出を活性化することができなかった。同時に、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｎａｌｍ−６を認識し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ２の放出を活性化することができた。さらに、Ｎａｌｍ−６は、ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ放出を刺激できなかった。同時に、２９３Ｔ−ＡＣＰＰは、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ放出を活性化できなかった。これは、２つの標的となるＣＡＲ Ｔ細胞が特異的であることを示している。Ｔ細胞が標的細胞を殺す過程では、通常、ＩＦＮ−γやＩＬ２などのサイトカインが大量に放出され、殺傷能力を高める。従って、ＣＡＲ Ｔ細胞が標的細胞を殺す能力を有するかどうかは、ＣＡＲ Ｔ細胞を基質標的細胞と共培養したときに放出されるＩＦＮ−γおよびＩＬ２の放出量によって判断することができる。
図１８と図１９は、様々な条件でのＣＤ１３７の発現を示す。ＣＡＲ １２０４は、ヒト由来のＣＤ１９ＣＡＲであり、ヒトＣＡＲ抗体およびＣＤ１３７抗体で標識することができる。ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞とＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲ比をＮＴ細胞で正規化した。１０４個のＣＡＲ＋細胞と１０４個の２９３Ｔ−ＡＣＰＰまたはＮａｌｍ−６細胞と共培養し、かつ２４時間後に、フローサイトメトリーによってＣＤ８陽性細胞のＣＤ１３７発現を検出した。１行目は、ＣＡＲ Ｔ細胞と２９３Ｔ−ＡＣＰＰと共培養した結果である。ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１３７を発現するために、２９３Ｔ−ＡＣＰＰによって活性化されなかった。ＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ ６５０３細胞は、ＣＤ１３７を発現するために、２９３Ｔ−ＡＣＰＰによって活性化された。ＡＣＰＰ ＣＡＲＴ ６５０１および６５０４細胞は、ＣＤ１３７を発現するために、２９３Ｔ−ＡＣＰＰによって活性化されなかった。２行目は、ＣＡＲ Ｔ細胞とＣＤ１９陽性細胞株Ｎａｌｍ６と共培養した結果である。ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１３７を発現するために、Ｎａｌｍ６によって活性化することができる。全てのＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｎａｌｍ６によって活性化されてＣＤ１３７を発現することができず、これは、ＣＤ１９ＣＡＲ ＴとＡＣＰＰ ＣＡＲ Ｔ細胞が特異的であることを示している。ＣＤ１３７は、Ｔ細胞の活性化のためのマーカータンパク質である。このように、ＣＡＲ Ｔ細胞と基質標的細胞を共培養した後、ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ１３７の発現を検出することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞が活性化されていると判断される。
ＵＰＫ２抗体の調製
大腸菌発現系を用いて、組換えＵＰＫ２細胞外ドメイン（ＵＰＫ２−Ｈｉｓ）を調製した。６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを採取し、免疫前にマウスの尾静脈採血を行い、バックグラウンド血清を残した。ＵＰＫ２−Ｈｉｓ組換え抗原を初めて免疫化し、完全フロイントアジュバントで乳化した。各マウスに５０μｇの組換え抗原を腹腔内注射した。２週間ごとに免疫を強化し、ＵＰＫ２−Ｈｉｓ組換え抗原を不完全アジュバントで乳化した。３回の追加免疫のために、各マウスに５０μｇの組換え抗原を腹腔内注射した。３回目の追加免疫の前に尾静脈採血を行い、血清のＵＰＫ２抗体価を分析した。その結果、４匹のマウスのうち３匹の血清中のＵＰＫ２抗体価は１０６以上に達し（図２０）、免疫が成功したことが示された。
免疫に衝撃を与えるように５回目の免疫を変更し、アジュバントを含まないＵＰＫ２−Ｈｉｓ組換え抗原を免疫原として使用した。各マウスに５０μｇの組換え抗原を腹腔内注射し、免疫３日後にマウスを死なせた。マウスから脾臓細胞を採取し、図２０において「左前」とマークを付ける。
マウスリンパ球分離液（Ｄａｋｋｏ、ＣＡＴ#ＤＫＷ３３−Ｒ０１００）を用いてマウス脾臓リンパ球を分離し、分離されたリンパ球をトータルＲＮＡ抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＣＡＴ#ＤＰ４３０）を用いて合計した。ＲＮＡ抽出を行った。抽出したトータルＲＮＡをテンプレートとして、第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ科学、ＣＡＴ#Ｋ１６２１）を用いて重鎖可変領域と軽鎖可変領域をそれぞれ合成した。逆転写プライマーは遺伝子特異的プライマーであり、かつ、プライマーのペアリングを行った。これらの領域は、それぞれ抗体重鎖定常領域および抗体軽鎖定常領域に位置し、かつ、特異的配列はそれぞれ、ＰｍＣＧＲ：ＴＧＣＡＴＴＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＧＣＣ（配列番号１８９）およびＰｍＣＫＲ：ＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣ（配列番号１９０）である。合成したｃＤＮＡを直ちに−７０℃で保存した。その後、逆転写によりｃＤＮＡを得て、かつ、それをテンプレートとしてプライマー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、 ２０１ （１９９７）、 ３５−５５）を得て、マウス抗体ＶＨおよびＶＫをそれぞれＰＣＲにより増幅した。オーバーラップ拡張ＰＣＲ法を用いて一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を構築した。最後に、調製したマウス一本鎖抗体遺伝子をベクターｐＡＤＳＣＦＶ−Ｓにクローニングし、ＳｃＦｖライブラリーを構築した。この抗体ライブラリーのライブラリー容量は１．６×１０８に達し、正解率は４１．５％であった。
組換えＵＰＫ２−ｈｉｓを抗原として用いて、古典的な固相スクリーニング戦略を参考にしてマウス一本鎖抗体ライブラリーをスクリーニングし、２回目では、結合、溶出、中和、感染および増幅の３回のスクリーニングを行った。３回目のスクリーニングの後、ファージＥＬＩＳＡにより、約７００個のモノクローナルクローンを同定した。ＥＬＩＳＡシグナルの高陽性が高い６０個のクローンを選択して配列分析を行い、ＵＰＫ２−Ｈｉｓに結合する、配列が異なる８つの菌株を得た。この８つの抗体は、クローンＳ２Ｂ７、Ｓ２Ｅ２、Ｓ３Ａ４、Ｓ３Ｃ１０、Ｓ３Ｄ１０、Ｓ７Ｆ９、Ｓ７Ｆ１１およびＳ７Ｇ７である（図２１）。８つのモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列（ｓｃＦｖ）を表６に示す。
上記８つのｓｃＦｖの重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を、それぞれ真核発現ベクターｐＴＳＥＧ１ｎおよびｐＴＳＥＫにクローニングし、かつ同社のＨＥＫ２９３細胞一過性発現系を用いて８つのマウス−ヒトキメラ抗体（マウス抗体可変領域）を調製した。ヒト抗体定常領域）。組換え全抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで示した。これらの８つの抗体は正常に発現しており、その純度はタンパク質同定のためのレベルを満たしていた。
古典的なＥＬＩＳＡ法により、抗原ＵＰＫ２−Ｈｉｓに結合する組換え全抗体の能力を分析した。結果を図２２に示す。図２２に示すように、全ての８つの抗体は抗原ＵＰＫ２−Ｈｉｓに結合することができる。
同時に、調製されたモノクローナル抗体の特異性を、同様のＥＬＩＳＡ法により分析した。図２３に示すように、これらの８つの組換え抗体は組換えＵＰＫ２−Ｈｉｓを特異的に認識することができ、かつ、各種無関係な抗原には明らかな非特異的結合がない。
ＧＥ社のＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ−１００を用いて８つのモノクローナル抗体の親和性を分析した。従来の手順を用いて親和性分析を行い、具体的には、まず、チップ上に被覆した抗ヒト抗体でヒトモノクローナル抗体を捕捉し、次に、異なる濃度の組換えＵＰＫ２−Ｈｉｓを移動相として親和性分析を行った。表８に示すように、これらの組換え抗体の親和性（ＫＤ）は、通常、０．１ ｎＭ〜１０ ｎＭの間である。このうち、Ｓ７Ｆ１１／Ｓ７Ｇ７の結合と解離が遅く、Ｓ３Ｄ１０の結合が遅すぎた。この３つのモノクローナル抗体をＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ−１００で親和性分析を行ったとき、ＫＤの自動フィッティングが悪く、データは参考用のものに過ぎない。
Figure 2022500011
本研究では、組換えＵＰＫ２細胞外ドメイン（ＵＰＫ２−Ｈｉｓ）を使用して、マウスの免疫、マウス免疫ライブラリーの構築、スクリーニングおよびモノクローナル同定を完了した。異なる配列を有し、組換えＵＰＫ２に結合し得る８つのマウスモノクローナル抗体（Ｓ２Ｂ７、Ｓ２Ｅ２、Ｓ３Ａ４、Ｓ３Ｃ１０、Ｓ３Ｄ１０、Ｓ７Ｆ９、Ｓ７Ｆ１１およびＳ７Ｇ７）を得て、予備的な特異性分析により、これらのモノクローナル抗体が組換えＵＰＫ２−ｈｉｓに特異的に結合することが示された。ＢＩＡｃｏｒｅに基づく親和性分析の結果、これらの組換え抗ＵＰＫ２抗体の親和性は通常、０．１ｎＭ〜１０ｎＭの間であった。
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれたことが明確かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。上記のことを様々な実施形態で説明したが、当業者は、その精神から逸脱することなく、様々な修正、置換、省略および変更が可能であることを理解するべきである。

Claims (24)

  1. 重鎖可変領域（ＨＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＶＲ）を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号８３、８７、８９または８５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号８２、８６、８８または８４のアミノ酸配列を含む、ＡＣＰＰに結合する抗体。
  2. 前記ＬＶＲは、配列番号８２のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗体フラグメント。
  3. 前記ＬＶＲは、配列番号８６のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号８７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗体フラグメント。
  4. 前記ＬＶＲは、配列番号８８のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号８９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗体フラグメント。
  5. 前記ＬＶＲは、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体または抗体フラグメント。
  6. 重鎖可変領域（ＨＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＶＲ）を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８または１２２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号９３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７または１２１のアミノ酸配列を含む、ＵＰＫ２に結合する抗体または抗体フラグメント。
  7. 前記ＬＶＲは、配列番号９３のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号９４のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体または抗体フラグメント。
  8. 前記ＬＶＲは、配列番号９７のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体または抗体フラグメント。
  9. 前記ＬＶＲは、配列番号１０１のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体または抗体フラグメント。
  10. 前記ＬＶＲは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体または抗体フラグメント。
  11. 前記ＬＶＲは、配列番号１０９のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体または抗体フラグメント。
  12. 前記ＬＶＲは、配列番号１１３のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体または抗体フラグメント。
  13. 前記ＬＶＲは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体または抗体フラグメント。
  14. 前記ＬＶＲは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲは、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体または抗体フラグメント。
  15. 前記ＨＶＲは、ヒトＩｇＧ鎖定常領域に連結され、かつ前記ヒトＩｇＧはＩｇＧ１またはＩｇＧ３である、請求項１−１４のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント。
  16. 前記抗体または抗体フラグメントは、細胞毒性剤にコンジュゲートされ、かつ前記細胞毒性剤は放射性同位体または毒素である、請求項１−１４のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント。
  17. 前記抗体はｓｃＦｖであり、かつ前記ＬＶＲはリンカーを介してＨＶＲに連結される、請求項１−１４のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント。
  18. 請求項１−１７のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  19. 前記ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインは、配列番号７１、４５および４９−５６のうちの１つを含み、かつ前記ＣＡＲはＫＩＳＳ１ＲまたはＳＩＧＬＥＣ−１５に結合する、ＣＡＲ。
  20. 請求項１−１９のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメントまたはＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチド。
  21. 請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含む、修飾細胞。
  22. 前記修飾細胞はＴ細胞である、請求項２１に記載の修飾細胞。
  23. 前記ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、前記細胞外ドメインは、抗原に結合する結合ドメインを含む、請求項１８−２２のいずれか一項に記載のＣＡＲ、ポリヌクレオチドまたは修飾細胞。
  24. 前記細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域を含む、請求項２３に記載のＣＡＲ、ポリヌクレオチドまたは修飾細胞。
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