JP2023103318A - 方法 - Google Patents

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ハロップ，リチャード
Richard Harrop
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Oxford Biomedica UK Ltd
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Abstract

【課題】慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、急性骨髄性白血病、B細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、及びT細胞急性リンパ芽球性白血病等の血液癌を治療するための方法を提供する。【解決手段】患者に、5T4特異的抗体、免疫細胞、5T4ワクチン等から選ばれる、5T4標的剤を投与することを含む方法を提供する。前記抗体が抗体薬物コンジュゲートの形態であり、前記免疫細胞が、T細胞、NK細胞又はNKT細胞であることが好ましい。【選択図】なし

Description

本発明は、血液癌を治療するための免疫療法アプローチに関する。特に、本発明は、5T4抗原を標的とすることにより血液癌を治療するための方法に関する。従って、本発明は、5T4標的剤を対象に投与することを含む、血液癌を治療するための方法を提供する。本発明はまた、5T4特異的キメラ抗原受容体（CAR）及び癌の治療におけるその使用を提供する。
血液癌は、骨髄及びリンパ細胞株という2つの主要な血液細胞系統のいずれかに由来し得る。骨髄細胞株は通常、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ及び肥満細胞を産生し、リンパ細胞株はB、T、NK、及び形質細胞を産生する。リンパ腫、リンパ球性白血病、及び骨髄腫はリンパ系に由来するが、急性及び慢性骨髄発生性（myelogenous）白血病、骨髄異形成症候群、及び骨髄増殖性疾患は骨髄に由来する。
血液癌は多くの症状を引き起こし得る。最も一般的なもののいくつかは、衰弱、疲労、息切れ、あざのできやすさ及び出血のしやすさ、頻繁な感染症、リンパ節腫大、腹部の膨満や痛み（腹部臓器の腫大による）、骨又は関節の痛み、骨折、計画外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続性の軽度の発熱、並びに排尿減少（腎機能障害による）である。一部の癌では、他の癌よりも特定の症状が生じる可能性が高い。例えば、骨痛は骨髄腫においてより頻繁にみられ、リンパ節腫大はリンパ腫で最も一般的である。リンパ節腫大の具体的な影響は、これらの節の位置及び大きさによって異なる。
総合すると、米国では血液悪性腫瘍が新たな癌診断の9.5％を占め、英国では毎年3万人の患者が診断されている。血液癌の罹患率は、集団の高齢化及びほとんどの症例で予防をもたらすことができないことの結果として、それらに付随する結果とともに増加する可能性があることが予想され得る。
現在、血液癌を治療するためのいくつかの治療選択肢、例えば、化学療法、放射線療法、免疫療法及び骨髄移植が利用可能である。
しかしながら、血液癌を治療又は予防する代替の方法が当技術分野において必要とされている。
本発明者らは、驚くべきことに、血液癌では抗原5T4が細胞上に発現され、従って、5T4を標的とすることにより、血液癌の治療又は予防のための選択肢が与えられることを見出した。
従って、本発明は、対象に5T4標的剤を投与することを含む、対象における血液癌を治療又は予防するための方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、血液癌の治療又は予防における使用のための5T4標的剤を提供する。
また、血液癌を治療若しくは予防するための医薬の製造における5T4標的剤の使用、及び血液癌を治療若しくは予防するための5T4標的剤の使用が提供される。
本発明はまた、5T4特異的キメラ抗原受容体（CAR）及び5T4特異的CARを発現する細胞、並びに癌、特に血液癌の治療又は予防におけるそれらの使用を提供する。
別の態様では、本発明は、血液癌の治療又は予防のための5T4を標的とする癌ワクチンを提供する。
本発明の他の態様は、添付の特許請求の範囲、並びに以下の記載及び記述において提示される。これらの態様は、別個の項目の見出し下で提示され得る。しかしながら、各項目の見出し下での教示は、必ずしもその特定の項目の見出しに限定されないことは理解されるべきである。
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当技術分野において（例えば細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学において）通常の知識を有する者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子的、遺伝学的及び生化学的方法には標準的な技術が用いられる。一般的には、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.及びAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology (1999)第4版, John Wiley & Sons, Inc.; 並びに Guthrieら, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innisら1990. Academic Press, San Diego, Calif.), McPhersonら, PCR Volume 1, Oxford University Press, (1991), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 第2版(R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.), 及びGene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, E. J. Murray編, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.)を参照されたい。これらの文書は、参照により本明細書に組み込まれる。
5T4-CAR-Tコンストラクトの概略図。これらは、α-5T4 scFv（H8若しくは2E4）；共刺激ドメイン（CD28若しくは4-1BB）；又はプロモーター領域（CMV若しくはEF1α）にバリエーションを含む。 ヒトT細胞へのCAR-5T4コンストラクトの形質導入、及びそれに続くヒトT細胞の増殖。 図２－１の続き。 5T4陽性腫瘍細胞への暴露後の5T4 CAR-T細胞によるin vitroでのIFNγ分泌。 ヒト中皮腫細胞株NCI-H226（5T4高発現株（expresser））及び結腸直腸細胞株LS174T（5T4低発現株）に対する、in vitroでの5T4 CARコンストラクトH8-EF1α-CD3ζ/4-1BB及び2E4-EF1α-CD3ζ/4-1BBの活性。 5T4特異的モノクローナル抗体／5T4タンパク質を用いた、in vitroでの5T4遮断に対する5T4 CARコンストラクト（H8-EF1α-CD3ζ/4-1BB及び2E4-EF1α-CD3ζ/4-1BB）の特異性。 卵巣癌細胞と共培養した場合の、CAR-T細胞の機能性のin vitro評価についての概要。 健常ドナーと比較した、卵巣癌患者由来のPBMCへの5T4 CARコンストラクトの形質導入。 卵巣癌患者から採取した腫瘍分離物上の5T4発現。 自己卵巣腫瘍分離物と共培養したCAR-T 5T4細胞によるIFNγ分泌。 図９－１の続き。 卵巣癌モデルに対する5T4 CAR-T細胞のin vivo有効性を示す生存曲線；コンストラクト：CMV-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB及びCMV-H8-CAR-CD3ζ/CD28；マウス：NSG（1群当たり3匹）；細胞用量/経路：2×107個総T細胞、IV投与。 卵巣癌モデルに対する5T4 CAR-T細胞の最小有効用量を示す生存曲線；コンストラクト：CMV-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB及びCMV-H8-CAR-CD3ζ/CD28；腫瘍細胞：SKOV-3卵巣癌（2.5×106個のIP投与チャレンジ）；CAR-T細胞：IV投与により送達された1×107、0.3×107、0.1×107、0.03×107個のCAR-T細胞。 卵巣癌チャレンジに対するIP又はIV投与によるCAR-T投与の有効性の比較を示す生物発光画像。腫瘍細胞：SKOV-3卵巣癌（2.5×106個のIP投与チャレンジ）；CAR-T細胞：IP又はIV投与経路による1×107個又は1×106個のCAR-T細胞。 図１２－１の続き。 異なるα-5T4 ScFvを用いた、卵巣癌モデルに対する5T4 CAR-T細胞のin vivo有効性を示す生存曲線；コンストラクト：(H8-EF1α-CD3ζ/4-1BB及び2E4-EF1α-CD3ζ/4-1BB)；試験細胞：1×107個のCAR T細胞；腫瘍細胞：SKOV-3卵巣癌。 異なるα-5T4 ScFvを用いた、卵巣癌モデルに対する5T4 CAR-T細胞のin vivo有効性を示す生存曲線；コンストラクト：(H8-EF1α-CD3ζ/4-1BB及び2E4-EF1α-CD3ζ/4-1BB)；腫瘍細胞：NCI-H929骨髄腫細胞。 3つの骨髄腫細胞株における5T4発現のFACS分析；A:陽性対照（乳房[MCF7]細胞株）；B:陰性対照（DLBCL）；C:H929骨髄腫株；D:JJN3骨髄腫細胞株；E:RPMI-8226細胞株。 5T4について染色する、免疫組織化学画像；A:CHO細胞（陰性対照）；B:5T4でトランスフェクトしたCHO細胞（陽性対照）；C:MCF7（乳房）細胞；D:H929（骨髄腫）細胞 多発性骨髄腫を有する4人の患者から採取した骨髄腫試料において5T4について染色する、免疫組織化学画像。 癌治療における癌幹細胞の根絶の重要性。従来の化学療法（標準的な療法）は、急速に増殖する細胞を除去することによりほとんどの固形腫瘍を減量するが、膜局在薬物輸送体のために治療により耐性を示す可能性が高い癌幹細胞（CSC）を見逃し、それにより再発がもたらされ得ることが仮定されている。手術を除く、腫瘍を除去するための最適な治療レジメンは、腫瘍内のバルク腫瘍細胞と癌幹細胞の両方を標的とすることであるといえる（例えば5T4標的療法）。 固形腫瘍における癌幹細胞上の5T4発現。図は、OVCAR-3(卵巣)、MCF7(乳房)、HCT116(結腸直腸)、HT29(結腸直腸)、U251(膠芽腫)及びA549(肺)細胞株における、「バルク」腫瘍細胞（単層）又は癌幹細胞（スフィア）上の5T4発現のレベルを示す。 図１９－１の続き。
血液癌
多数の様々な種類の血液癌が存在する。本発明は、前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病ではない血液癌まで及ぶ。
血液癌の主な種類は、白血病、リンパ腫又は骨髄腫に分類され得る。
白血病は、通常骨髄中で発生し多数の異常な白血球をもたらす癌のグループである。これらの白血球は十分に成長せず、芽球又は白血病細胞と称される。
臨床的及び病理学的に、白血病は多数のグループに細分化される。最初の区分は、その急性型及び慢性型との間にある：
急性白血病は、未成熟血液細胞数の急増により特徴づけられる。このような細胞に起因する密集により、骨髄は健全な血液細胞を産生することができなくなる。悪性細胞が急激に進行及び蓄積し、その後血流に溢れ出て身体の他の臓器に拡がるため、急性白血病では迅速な治療が必要とされる。急性型の白血病は子供において最も一般的な型の白血病である。
慢性白血病は、比較的成熟しているが依然として異常である白血球の過剰な集積により特徴づけられる。典型的には数か月又は数年かけて進行し、細胞が通常よりもはるかに高い速度で産生され、多数の異常な白血球がもたらされる。
急性白血病は迅速に治療されなければならないのに対し、慢性型は、治療の最大の有効性を確保するために、治療前しばらくの間監視されることがある。慢性白血病はほとんどが高齢者で発症するが、いかなる年齢群でも発症し得る。
さらに、当該疾患は、どのような種類の血液細胞が罹患しているかによって細分化される。これは、リンパ芽球性若しくはリンパ球性白血病、及び骨髄性若しくは骨髄発生性白血病に白血病を分ける。大抵のリンパ球性白血病にはB細胞が関与する。骨髄性又は骨髄発生性白血病では、通常赤血球、いくつかの他の種類の白血球、及び血小板を形成するようになる骨髄細胞の種類で癌化が起きる。
従って、白血病には4つの主な種類：急性骨髄性（AML）、急性リンパ芽球性（ALL）、慢性骨髄性（CML）及び慢性リンパ球性（CLL）がある。これら4つの主な種類は、すべての白血病症例の約85％を占める。
治療は、必要に応じて支持ケア及び緩和ケアに加え、化学療法、放射線療法、標的療法、及び骨髄移植の何らかの組み合わせを含み得る。
白血病は、様々な慣例に従って、例えば、限定されないが以下に記述するものに、分類及び／又は階層化され得る。本発明は、すべてのステージ及び分類に及ぶ。
AML
AMLのFrench-American-British分類は以下に基づく：
CML
CMLは、見通しの予測に役立つ3つのグループに分類される。これらのグループはステージではなくフェーズと称される。フェーズは、血液又は骨髄中に見られる未成熟白血球-骨髄芽球（芽球）-の数に主に基づく。異なるグループの専門家はフェーズを定義するために若干異なるカットオフ値を示唆しているが、（世界保健機関により提案される）一般的な体系を以下に記載する。
＜慢性フェーズ＞
このフェーズの患者は、典型的には、血液又は骨髄試料中に10％未満の芽球を有する。これらの患者は通常、（たとえあったとしても）かなり軽度の症状を有し、通常、標準的な治療に反応する。大抵の患者は、慢性フェーズで診断される。
＜加速フェーズ＞
以下のいずれかに該当する場合、患者は加速フェーズにあるとみなされる：
・骨髄及び血液試料が、10％を超えるが20％未満の芽球を有する
・高血中好塩基球数（白血球の少なくとも20％を構成する好塩基球）
・治療によって改善しない、高い白血球数
・治療によりもたらされたものでない、非常に高い又は非常に低い血小板数
・白血病細胞における新たな染色体変化
CMLが加速フェーズにある患者は、発熱、食欲不振及び体重減少等の症状を有し得る。加速フェーズのCMLは、慢性フェーズのCMLほど治療に反応しない。
＜芽球フェーズ（blast phase）（急性フェーズ又は急性転化とも称される）＞
このフェーズにおける患者から得られる骨髄及び／又は血液試料は、20％を超える芽球を有する。芽細胞は、骨髄を超えて組織及び臓器に広がることがよくある。これらの患者は、発熱、食欲不振及び体重減少を有することが多い。このフェーズでは、CMLは侵攻性の急性白血病と非常に同じようにふるまう。
ALL
分類は免疫表現型に基づいてもよい。細胞遺伝学的試験、フローサイトメトリー及び他の検査室試験により、ALLの亜型及び患者の予後についてより詳細な情報が提供される。これらの試験は、白血病の免疫表現型に基づきALLをグループ分けするのに役立ち、それは以下を考慮する：
・白血病が由来するリンパ球の種類（B細胞又はT細胞）
・これらの白血病細胞がどれほど成熟しているか
ALLの亜型は現在、以下のように称される：
B細胞ALL
・初期の前駆B細胞ALL（Early pre-B ALL）（pro-B ALLとも称される）－約10％の症例
・一般的なALL（Common ALL）－約50％の症例
・前駆B細胞ALL－約10％の症例
・成熟B細胞ALL（バーキット白血病）－約4％の症例
T細胞ALL
・前駆T細胞ALL－約5～10％の症例
・成熟T細胞ALL－約15～20％の症例
ALLの亜型は各々、わずかに異なる見通し（予後）を持つが、（白血病細胞における遺伝子変化のような）他の要素もまた影響を与え得る。
混合系統急性白血病
近年、新たな検査室試験により、少数の急性白血病は実際にはリンパ球性の特徴及び骨髄性の特徴の両方を有することが示された。白血病細胞は、同一細胞において骨髄性の形質及びリンパ球性の形質の両方を有することがある。他の症例では、ある人は骨髄性の特徴を有するいくつかの白血病細胞及びリンパ球性の特徴を有する他の白血病細胞を有し得る。これらの種類の白血病は、混合系統白血病、骨髄性マーカーを有するALL（My+ALL）、リンパ球性マーカーを有するAML、又は急性混合型白血病（BAL）と称され得る。
ほとんどの研究は、これらの白血病はALL又はAMLの標準的な亜型よりも見通しが悪い傾向があることを示唆する。
CLL
CLLをステージ分類するための2つの異なるシステムがある：
・Raiシステム：これは米国でより頻繁に使用される。
・Binetシステム：これは欧州でより広く使用される。
＜Raiステージ分類システム＞
Raiシステムは1968年に最初に考案された。当時、CLLを診断するのに必要であったのは、（感染のような）いかなる他の原因をも有しないリンパ球増加症－血液及び骨髄中の多数のリンパ球、のみであった。これは当初、15,000個リンパ球/mm3を超える血液、及び少なくとも40％のリンパ球から構成される骨髄と定義されていた。
現在は、CLLの診断のために、患者は少なくとも5,000個/mm3のモノクローナルリンパ球（モノクローナルリンパ球増加症と称されることもある）を有しなければならないが、全体のリンパ球数は多くなくてもよい。モノクローナルとは、細胞がすべて同一細胞に由来することを意味し、特殊な検査で同一の化学パターンを有する細胞をもたらし得る。
このステージ分類の目的のために、リンパ球増加症についてCLL（モノクローナルリンパ球増加症を伴うもの等）の診断を代用することができる。
このシステムは、CLLを5つのステージに分ける:
・Raiステージ0：リンパ球増加症であり、リンパ節、脾臓、又は肝臓の腫大がなく、赤血球及び血小板数が正常に近い。
・RaiステージI：リンパ球増加症＋リンパ節腫大。脾臓及び肝臓は腫大しておらず、赤血球及び血小板数は正常に近い。
・RaiステージII：リンパ節腫大を伴う又は伴わない、リンパ球増加症＋脾臓腫大（及び場合によっては肝臓腫大）、赤血球及び血小板数は正常に近い。
・RaiステージIII：リンパ節、脾臓又は肝臓腫大を伴う又は伴わない、リンパ球増加症＋貧血（少なすぎる赤血球）。血小板数は正常に近い。
・RaiステージIV：貧血、リンパ節、脾臓又は肝臓腫大を伴う又は伴わない、リンパ球増加症＋血小板減少症（少なすぎる血小板）
本発明の一態様では、血液癌は白血病である。白血病は、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、B細胞急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）、及びT細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）から選択され得る。
本発明の一態様では、血液癌はALLではない。一態様では、血液癌はB-ALLではない。
本発明による血液癌はリンパ腫であり得る。リンパ腫は、リンパ球から生じる癌の1グループである。リンパ腫の2つの主要なカテゴリーは、ホジキンリンパ腫（HL）及び非ホジキンリンパ腫（NHL）である。ホジキンリンパ腫は、リンパ腫の約15％を占める。それは、その予後及びいくつかの病理学的特性において、他の形態のリンパ腫と異なる。ホジキンリンパ腫は、リードスタンバーグ細胞と称される細胞の種類の存在により特色づけられる。ホジキンリンパ腫以外のすべてのリンパ腫であると定義される非ホジキンリンパ腫は、ホジキンリンパ腫よりも一般的である。多種多様なリンパ腫がこのクラスにあり、原因、関与する細胞の種類、及び予後は種類により異なる。非ホジキンリンパ腫の発生率は、年齢と共に増大する。それはさらに複数の亜型に分けられる。
2001年に公開され2008年に改訂されたWHO分類は、「改定された欧州－米国リンパ腫分類（revised European-American lymphoma classification）」（REAL）において築かれた基盤に基づく。このシステムは、細胞種（即ち、腫瘍に最も類似する正常な細胞種）により、及び表現型、分子、若しくは細胞発生（cytogenic）の特性を定義することにより、リンパ腫をグループ分けする。5つのグループは以下である：
1. 成熟B細胞新生物
2. 成熟T細胞及びNK細胞新生物
3. 前駆リンパ性新生物
4. ホジキンリンパ腫
5. 免疫不全関連リンパ増殖性障害
リンパ腫は、15～24歳の若年者において最も一般的な血液癌であり、毎年UKにおいて14,000を超えるリンパ腫の新たな症例が診断される。
現在の治療は以下のうち1つ以上を含み得る：化学療法、放射線療法、標的療法、及び手術。一部の非ホジキンリンパ腫では、リンパ腫細胞により産生される増大した量のタンパク質により血液が非常に濃くなるため、タンパク質を除去するために血漿交換が行われる。
本発明の一態様では、血液癌はリンパ腫である。
或いは、本発明による血液癌は骨髄腫であり得る。骨髄腫は、骨髄中で発生する形質細胞（通常抗体の産生に関与する白血球の種類）の癌である。骨髄腫細胞は、血流を通って移動し、他の骨に集まることがある。骨髄腫が骨髄中の多くの部位で頻繁に生じる場合、それはよく多発性骨髄腫と称される。
最初は、大抵症状は気づかれない。進行すると、骨痛、出血、頻繁な感染症、及び貧血が生じ得る。合併症にはアミロイドーシスが含まれ得る。骨髄中の骨髄腫細胞の過剰産生は、血液を構成する様々な種類の細胞：白血球、赤血球及び血小板の産生に影響を与える。骨髄腫細胞はまた、骨に損傷をもたらすことがあり、それは骨を壊れやすい状態のままにし得る。
骨髄腫は、40歳未満の患者において見られることもあるが、一般的には高齢の患者において発症する。骨髄腫細胞によりもたらされる骨への損傷は、高カルシウム血症をもたらしうる。高カルシウムは脱水症及び腎臓への損傷をもたらし得る。
米国での骨髄腫の罹患率は、2014年では約24,000の新たな症例とともに約77,600の症例であると報告されている。生存率は年齢、診断のステージ等の要素によって異なるが、平均5年生存率は45％未満であると推定される。患者は典型的には、併用療法の繰り返しで治療され、再発の時間間隔は各々の一連の治療とともに短くなる。大部分の患者は最終的にはさらに治療することのできない再発を有する。この後期ステージでは、生存期間中央値は6～9か月しかなく、治療は主に症状を低減し生活の質を管理する緩和療法である。
上述のように、骨髄腫は形質細胞を巻き込む疾患である。
骨髄腫は様々な慣例に従って、分類及び／又は階層化され得る。例えば、Fonseca等 Leukemia (2009) 23, 2210-2221を参照されたい。疾患の大きさ及び侵攻性を特徴づけるいくつかのシステムが使用されている。
例えば、国際骨髄腫ワーキンググループの診断基準及び国際病期分類システム（ISS）が一般的に使用される。
国際骨髄腫ワーキンググループの診断基準：
無症候性／くすぶり型骨髄腫：モノクローナル（M）タンパク質が≧30g/L、及び／又は骨髄クローン細胞が≧10％であるが、関連の臓器若しくは組織障害（related organ or tissue impairment、ROTI）（末端臓器損傷）がない。
症候性骨髄腫：Mタンパク質が≧30g/L、及び／又は骨髄クローン細胞が≧10％であり、形質細胞の増殖プロセスに起因する可能性があり；CRAB（カルシウム、腎不全、貧血、及び骨病変：血清カルシウム上昇≧11.5 mg/100 mL；腎機能不全[血清クレアチニン＞1.73 mmol/L]；正常下限を下回る＞2 g/100 mLのヘモグロビン値、又は＜10 g/100 mLのヘモグロビン値を有する正色素性、正球性貧血；溶解性病変、重度の骨減少症又は病的骨折）により明示されるROTI（末端臓器損傷）の証拠を有しなければならない。
非分泌性骨髄腫：血清及び尿中のMタンパク質の欠如、骨髄形質細胞増加症及びROTI。
骨髄腫のステージは、国際病気分類システムに従って分類され得る：
ステージI：血清β2ミクログロブリン＜3.5 mg/L、かつ血清アルブミン≧3.5 g/dL
ステージII：ステージIでもステージIIIでもない
ステージIII：血清β2ミクログロブリン≧5.5 mg/L
本明細書における「骨髄腫」との記載は、すべての種類及びステージの骨髄腫を包含するよう意図される。
例えば、骨髄腫は多発性骨髄腫であり得る。
骨髄腫はステージI、ステージII又はステージIII骨髄腫であり得る。
癌幹細胞
本発明の他の態様では、本発明者は驚くべきことに、血液癌でも固形腫瘍により特徴づけられる癌でも癌幹細胞において5T4が発現されることを見出した。
癌幹細胞は、膜結合型多剤トランスポーター及び表面マーカーの発現、自己再生及び分化する能力、並びに同様のシグナル伝達経路への依存を含む、正常幹細胞の特性のいくつかを共有する。これらの特性によりCSCは従来の化学療法を回避することができ、それは多くの腫瘍が治療後に再発する理由を説明し得る（図18）。
本願実施例において実証されるように、5T4は固形腫瘍でも血液癌でも幹細胞上に発現される。本明細書で使用される場合、「癌幹細胞」は、正常な幹細胞に関連する特性を有する癌幹細胞を指す。例えば、特定の癌試料において見られるすべての細胞種を生じさせる能力。癌幹細胞は、腫瘍原性（腫瘍形成性）細胞である。癌幹細胞は、自己再生及び複数の細胞種への分化の幹細胞プロセスを通して腫瘍を生成し得る。このような細胞は、明確な集団として腫瘍中に存続し、新たな腫瘍を生じさせることにより再発及び転移を引き起こし得る。
図18に表すように、癌幹細胞を死滅させることにより腫瘍細胞が生き残り腫瘍再発を引き起こし続ける可能性が減少するため、癌幹細胞を標的とすることにより患者の転帰が改善され得る。
従って、癌幹細胞上に存在する5T4を標的とすることにより、癌の再発の可能性が低減され得る。
このように、一態様では、本発明は、対象における癌再発を予防又は低減するための方法であって、前記対象に5T4標的剤を投与することを含む、方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、対象における癌再発の予防又は低減における使用のための5T4標的剤を提供する。
対象における癌再発を予防又は低減するための医薬の製造における5T4標的剤の使用、及び対象における癌再発を予防又は低減するための5T4標的剤の使用もまた、提供される。
「癌再発」との用語は、改善又は寛解の期間後の、再発のX線診断を含む再発の診断又は癌再発の徴候及び症状を指す。
本発明の一態様では、癌転移を治療するための方法であって、前記方法は前記対象に5T4標的剤を投与することを含む、方法が提供される。更なる態様では、本発明は、対象における癌転移の治療における使用のための5T4標的剤を提供する。対象において癌転移を治療するための医薬の製造における5T4標的剤の使用、及び癌転移を治療するための5T4標的剤の使用もまた、提供される。
本発明はまた、癌患者の生存期間を改善するための方法であって、前記方法は前記対象に5T4標的剤を投与することを含む、方法に関する。更なる態様では、本発明は、癌患者の生存期間の改善における使用のための5T4標的剤を提供する。癌患者の生存期間を改善するための医薬の製造における5T4標的剤の使用、及び癌患者の生存期間を改善するための5T4標的剤の使用もまた、提供される。
本発明はまた、癌患者において癌幹細胞を低減又は除去するための方法であって、前記方法は前記対象に5T4標的剤を投与することを含む、方法に関する。更なる態様では、本発明は、癌患者における癌幹細胞の低減又は除去における使用のための5T4標的剤を提供する。癌患者において癌幹細胞を低減又は除去するための医薬の製造における5T4標的剤の使用、及び癌患者において癌幹細胞を低減又は除去するための5T4標的剤の使用もまた、提供される。
「癌幹細胞を低減する」との表現は、腫瘍組織において、例えば腫瘍組織の所与の体積又は所与の断面積において、癌幹細胞の数を低減することを包含する。
一態様では、対象は、過去に化学療法剤等の別の癌治療で治療されていてもよい。対象は、化学療法治療等の少なくとも1つの癌療法に対し難治性であり得る。対象は、化学療法治療等の癌療法での過去の治療後、再発中であり得る。癌は、薬剤耐性癌であり得る。
一態様では、癌は本明細書に記載の血液癌である。
一態様では、血液癌は、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病及びB細胞急性リンパ芽球性リンパ腫から選択され得る。
一態様では、癌は固形腫瘍により特徴づけられ、ここで、前記癌は、頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）、非小細胞肺癌（NSCLC）、乳癌、又は胃癌ではない。一態様では、癌は、頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）、非小細胞肺癌（NSCLC）、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌又は膵臓癌ではない。
非限定的な例として、固形腫瘍により特徴づけられる癌には、胆管、骨、膀胱、脳／CNS、子宮頚部、子宮内膜、筋肉、中皮腫、ニューロン、食道、卵巣、側膜／腹膜、腎臓、皮膚、小細胞肺癌（SCLC）、精巣、甲状腺、胎盤、子宮、及び外陰部の癌が含まれる。
一態様では、癌は、卵巣癌、膠芽腫、及び結腸直腸癌から選択される。一態様では、癌は小細胞肺癌（SCLC）であり得る。
一態様では、癌は卵巣癌又は膠芽腫である。
5T4抗原
5T4は、70％を超える腎臓、胸部、消化管、結腸、及び卵巣の上皮癌で発現することが知られている、72kDaの癌胎児性糖タンパク質である。しかし、本発明の前には、それが血液悪性腫瘍上に発現することは考えられていなかった。
5T4の発現は、組織化学的染色により検出されるように、腫瘍特異的であると考えられ、消化管及び下垂体において低レベルの散剤的な染色が観察されるのみである。しかし、この染色のレベルは非常に低いので、それが特異的か否かを判定するのは困難である。組織化学的分析は、5T4の発現が結腸直腸癌、卵巣癌、胃癌及び非小細胞肺癌において予後不良の指標であることを示す。さらに、腫瘍細胞は5T4をコードするcDNAで形質導入された場合、運動性の増大を示すことから、この分子の発現は腫瘍における転移性特性を誘導し得ることが示唆される。
5T4抗原は、5T4として知られるポリペプチドであり、例えば国際公開第89/07947号において特徴づけられている。「5T4」はMyers等により特徴づけられるヒト5T4であってもよく、その配列はGenBankに登録番号Z29083で掲載されている。マウスの配列又はマウス5T4（m5T4）はGenBankに登録番号AJ012160で掲載されている。マウス及びヒト5T4遺伝子の構成は、例えば、King等、Biochim Biophys Acta 1999; 1445 (3); 257-70に記載される。イヌ及びネコ5T4配列は、例えば国際公開第02/38612号に記載される。
ヒト5T4cDNAの配列分析により、当該抗原はロイシンリッチリピート（LRR）タンパク質ファミリーの一員と特定された（Myers, K. A.等 (1994)）。当該タンパク質は、44アミノ酸の短い細胞質尾部と、連結されたシステイン含有隣接領域を有し親水性ドメインにより分離される2つのロイシンリッチリピート（LRR）領域から成る細胞外ドメインとを含有する。細胞外ドメイン中の7つのコンセンサスNxS/T Nグリコシル化部位のすべてが、2つの高マンノース鎖と、少量のコアフコシル化を有する5つのシアル酸付加2～4分岐複合鎖とを含む複合グリカンの組み合わせでグリコシル化される（Shaw, D. M.等 (2002)）。
ヒト及びマウス5T4 cDNAの配列比較（King 等(1999)）により、種間で5T4分子の構造が高度に保存されていることが示される。これらの分子は81％のアミノ酸同一性を共有し、細胞質及び膜貫通ドメインは完全に保存されている。ヒト分子中の7つのN結合型グリコシル化部位のうち6つはマウスにおいて保存されている。最もN末端側の部位（N81）は欠如しているが、C末端隣接領域に追加の部位（N334）が存在し、ヒト分子と同様のレベルのグリコシル化が推測される。マウスタンパク質は、親水性ドメインにおいてグリコシル化部位に隣接する追加の6アミノ酸を含有し、それは先行する6アミノ酸の直接反復（direct repeat）である。栄養膜における5T4の発現により、それがすべての哺乳類に共通の発生段階に存在することが示唆される。これにより、5T4が哺乳類全体で高度に保存されている可能性が高くなる。
本明細書で使用される「5T4抗原」又は「5T4」との表現は、その断片、好ましくは明らかなエピトープを有する断片、及び5T4の抗原性を保持するアミノ酸挿入、欠失若しくは置換を含むそのバリアントを包含する。適切には、5T4抗原との用語には、少なくとも1つの5T4の一般的な抗原決定基を保持する5T4のペプチド及び他の断片が含まれる。
従って、本明細書に記載される5T4抗原には、5T4の生理学的及び／又は物理的特性を保持する5T4のアミノ酸変異体、グリコシル化バリアント、及び他の共有結合誘導体（covalent derivative）が含まれる。例示の誘導体には、5T4が、天然のアミノ酸以外の部分を用いて置換、化学的、酵素的又は他の適切な手段により共有結合的に修飾された分子が含まれる。このような部分は、酵素又は放射性同位体等の検出可能な部分であり得る。
特定の種、好ましくは哺乳類において見出された5T4の天然のバリアントがさらに含まれる。このようなバリアントは、同一遺伝子ファミリーの関連遺伝子により、特定遺伝子の対立遺伝子バリアントによりコードされ得る、又は5T4遺伝子の別のスプライシングバリアントを表し得る。
一般的な抗原決定基を保持する誘導体は、5T4の断片であり得る。5T4の断片は、その個々のドメイン、並びにそのドメイン由来のより小さなポリペプチドを含む。好ましくは、本発明による5T4に由来するより小さいポリペプチドは、5T4に特有の単一のエピトープを定義する。断片は、理論上、5T4の1つの特性を保持する限り、ほとんど任意の大きさであっても良い。好ましくは、断片は、5～400アミノ酸長であるだろう。より長い断片は、完全長の5T4の短縮化とみなされ、一般的に「5T4」との用語に包含される。有利には、断片は、5～25アミノ酸長程度の比較的小さいペプチドである。好ましいのは、約9アミノ酸長のペプチドである。
5T4の誘導体はまた、5T4に特有の少なくとも1つの特徴を維持するための要件に従う、アミノ酸欠失、付加又は置換を含有し得る、その変異体を含む。従って、保存アミノ酸置換は、5'又は3'末端からの短縮化と同様に、実質的に5T4の性質を変更することなく行われ得る。欠失及び置換はさらに、本発明に含まれる5T4の断片に対し行われ得る。5T4変異体は、例えば1個以上のアミノ酸の付加、交換、及び／又は欠失をもたらすin vitroでの変異誘発に付された5T4をコードするDNAから産生され得る。例えば、5T4の置換、欠失、又は挿入バリアントは、組換え法により作製され、5T4の天然型との免疫交差反応性についてスクリーニングされ得る。
5T4の断片、変異体、及び他の誘導体は、好ましくは、5T4と実質的な相同性を保持する。本明細書で使用する場合、「相同性」とは、2つの実体が、起源及び機能において同様であると当業者が判定するのに十分な特性を共有することを意味する。
「実質的な相同性」とは、相同性が配列同一性を示す場合、直接の配列アライメント及び比較により判断される40％を超える配列同一性、好ましくは45％を超える配列同一性、最も好ましくは50％を超える配列同一性を意味する。
5T4の標的化
「標的とする」とは、治療的又は予防的介入が5T4抗原に基づくか、又は5T4抗原に向けられることを意味する。これは、例えば、5T4抗原を含む免疫学的組成物又はワクチンの対象への投与等の能動免疫療法アプローチを含み得る。或いは、受動免疫療法、例えば、養子T細胞又はB細胞移入（adoptive T cell transfer or B cell transfer）が取られ得る。養子T細胞又はB細胞移入では、5T4抗原を認識するT若しくはB細胞、又はT及びB細胞が、腫瘍又は他の生体組織（限定されないが、リンパ節、血液又は腹水を含む）から単離され、ex vivo又は in vitroで増殖させられ、対象に再投与される。このようなT又はB細胞は、5T4を認識するよう操作され得る。
更なる選択肢では、5T4抗原を認識する抗体は、対象に投与され得る。一態様では、このような抗体は5T4抗原を発現する細胞に細胞毒性ペイロードを送達するよう改変され得る。
本明細書で論じられるように、他の態様では5T4抗体薬物コンジュゲートが使用され得る。抗体薬物コンジュゲート（ADC）は、モノクローナル抗体の結合特異性を化学療法剤の効力と組み合わせる。一例は、患者において5T4陽性癌、例えば結腸直腸癌及び乳癌、を治療するために有用な、非天然アミノ酸及びドラスタチンリンカー誘導体を含有する特異的抗体を含む抗体薬物コンジュゲートである（例えば、国際公開第2013/068874号を参照されたい）。
当業者は、細胞表面の抗原について、抗体はその抗原を認識するだろうことを理解するだろう。抗原が細胞内抗原である場合、抗体はその抗原ペプチド：MHC複合体を認識する。抗原を「認識する」抗体は、これらの可能性の両方を包含する。
本明細書で定義されるように、「治療」とは、治療されている疾患の1つ以上の症状を、治療前の症状に比べ、低減、緩和、又は除去することを指す。
「予防（Prevention）」（又は予防（prophylaxis））とは、疾患の症状の発症を遅らせるか、又は防止することを指す。予防は完全であり得る（従って、疾患が生じない）、又は一部の個体において、若しくは限定された時間だけ効果的であり得る。
本明細書に記載の本発明の一態様では、対象は哺乳類、好ましくは、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ又はモルモットであるが、最も好ましくは、対象はヒトである。
本明細書に記載の本発明の一態様では、本発明による癌の治療又は予防の方法は、前記治療又は予防を必要とする対象を特定する工程を含む。
本明細書に記載の本発明の一態様では、患者から取得された腫瘍試料は、5T4標的剤の投与前に、5T4の発現について分析又はスクリーニングされ得る。例えば、試料は、対象から得られる腫瘍試料、血液試料、又は組織試料、又は末梢血単核細胞試料であり得る。一態様では、試料は骨髄試料であり得る。5T4標的剤は、その腫瘍試料が5T4発現を示す患者に対し、本発明に従って投与され得る。つまり、本発明による癌は5T4陽性癌であり得る、即ち5T4を発現する細胞を含み得る。
抗体
一態様では、5T4標的剤は抗体である。つまり、5T4を認識するか、又は5T4に特異的な抗体、即ち、抗体は5T4抗原に特異的に結合する。
「特異的結合」とは、不均質（不均一）試料中に同時に存在する2つの分子種が、試料中の他の分子種への結合に優先して互いに結合することができることを指す。典型的には、特異的結合相互作用は、反応液中の偶発的な結合相互作用よりも、少なくとも2倍、より典型的には少なくとも10倍、大抵は少なくとも100倍、識別する；分析物を検出するのに用いられる場合、特異的結合は、不均質（不均一）試料中の分析物の存在を決定するに当たり十分な識別力を有する。
「抗体」（Ab）は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、及び所望の生物学的活性を示す抗体断片を含む。抗体断片は、少なくとも1つの抗体-抗原結合部位を含む断片であり得る。抗体断片は、例えば、5T4又はその断片への特異的な結合を示す。従って、生物学的活性は、5T4への結合活性であり得る。「免疫グロブリン」（Ig）との用語は、「抗体」と同義に用いられ得る。
「抗体断片」とは、インタクト抗体の一部分、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片；線状抗体（linear antibody）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多特異的抗体が含まれる。
「Fc」断片は、ジスルフィドにより結び付けられる双方のH鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Fc領域における配列により決定され、その領域はまた、特定の種類の細胞上で見られるFc受容体（FcR）により認識される部分である。
一態様では、抗体はモノクローナル抗体である。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」との用語は、実質的に均一な抗体の集団から取得される抗体を指す。即ち、その集団を構成する個々の抗体は、微量存在し得る潜在的な天然の変異を除いて同一である。
モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に向けられている。さらに、様々な決定基（エピトープ）に向けられる様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられている。モノクローナル抗体は、当技術分野における標準的な方法により調製され得る。
モノクローナル抗体は、当技術分野において既知の方法、例えばハイブリドーマ法を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法では、マウス又はその他の適切な宿主動物は、典型的には、標的、即ち今回の場合は5T4、に特異的に結合する抗体を産生する又は産生することができるリンパ球を生じさせる免疫剤で免疫化される。
モノクローナル抗体はまた、当技術分野において既知の組換えDNA法により生産され得る。適切なモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）単離及び配列決定され得る。
in vitroの方法はまた、一価抗体を調製するのに適している。抗体の断片、特にFab断片を産生するための抗体の分解は、当技術分野において既知の通常の技術を用いて達成され得る。例えば、分解はパパインを用いて行われ得る。パパイン分解の例は国際公開第94/29348号に記載される。抗体のパパイン分解は、典型的には、それぞれ単一の抗原結合部位を有するいわゆるFab断片である2つの同一の抗原結合断片、及び残りのFc断片を産生する。ペプシン処理は、F(ab')2断片及びpFc'断片を産生する。
モノクローナル抗体には、重鎖及び／又は軽鎖の部分が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又はそれに対し相同であるが、鎖の残りは、他の種に由来する又は他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又はそれに対し相同である、「キメラ」抗体、並びに同一の生物学的活性を示す限りそのような抗体の断片が含まれ得る。
断片の結合活性が、未改変の抗体又は抗体断片に比べ、有意に変化しない又は損なわれないならば、抗体断片はまた、特定領域若しくは特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、又は他の選択される改変を含み得る。
これらの改変は、ジスルフィド結合することのできるアミノ酸を除去／付加する、その生体寿命（bio-longevity）を増大させる、その分泌特性を変える等のいくつかの追加の特性を提供し得る。いかなる場合でも、抗体断片は、結合活性、結合ドメインでの結合の調節等の生物活性特性を有しなければならない。抗体の機能的又は活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発、その後の発現及び発現されたポリペプチドの試験により特定され得る。このような方法は当業者に既知であり、抗体断片をコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。
抗体はヒト化抗体又はヒト抗体であり得る。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はそれらの断片（例えばFv、Fab、Fab'、又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。
ヒト化抗体には、レシピエント抗体の相補性決定領域（CDR）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力（capacity）を有する、マウス、ラット、又はウサギ等の非ヒト種のCDR（ドナー抗体）由来の残基により置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク（FR）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたCDR又はフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、可変ドメインでは、すべての又は実質的にすべてのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、すべての又は実質的にすべてのFR領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンのFc、の少なくとも一部分を含み得る。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において既知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトのソースからそれに導入された1個以上のアミノ酸残基を有する。これら非ヒトアミノ酸残基は大抵、「移入」残基と称され、それらは典型的には「移入」可変ドメインから取り出される。ヒト化は、齧歯類CDR又はCDR配列にヒト抗体の対応する配列を置換することにより本質的に行われ得る。従って、「ヒト化」抗体とは、インタクトとは実質的にいえないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列により置換されている、キメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのCDR及び場合によりいくつかのFR残基が、齧歯類抗体における類似部位由来の残基により置換される、ヒト抗体である。
トランスジェニック動物（例えばマウス）が、内生の免疫グロブリン産生がない状態でヒト抗体の完全なレパートリーを作るために使用され得る。例えば、キメラ及び生殖細胞系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（heavy chain joining region）遺伝子のホモ接合欠失により、内生の抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。このような生殖細胞系列変異体マウスにおいてヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入すると、抗原チャレンジ時にヒト抗体が産生されるだろう。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいて産生され得る。
抗体は、薬学的に許容可能な担体中で対象に投与され得る。典型的には、製剤を等張にするために、適切な量の薬学的に許容可能な塩が製剤中で使用される。
薬学的に許容可能な担体の例には、食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液が含まれる。抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の持続放出性製剤もまた、使用され得る。例えば、投与経路及び投与される抗体の濃度によって、特定の担体がより好ましい場合があることは、当業者にとって明らかであるだろう。
抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、胸膜内、皮下、筋肉内）により、又は有効な形態での血流への送達を確実にする注入等の他の方法により、対象に投与され得る。抗体はまた、局所的並びに全身的な治療効果を発揮するために、腫瘍内又は腫瘍周囲経路により投与され得る。
有効な投与量及び抗体を投与するためのスケジュールは、経験的に決定されてもよく、そのような決定をすることは当技術分野における技術の範囲内である。投与されなければならない抗体の投与量は、例えば、抗体を投与される対象、投与経路、用いられる抗体の特定の種類、及び投与される他の薬物によって異なるだろうことは、当業者は理解するだろう。
単独で用いられる抗体の典型的な1日投与量は、1日あたり約1（μg/kg）から100 mg/kg体重以上までの範囲であり得る。
抗体の投与後、抗体の有効性は当業者に既知の様々な方法で評価され得る。例えば、治療を受けている対象において癌細胞の大きさ、数、及び／又は分布が監視され得る。抗体が投与されない場合に生じるだろう疾患経過に比べ、腫瘍成長を停止させ、腫瘍縮小をもたらし、及び／又は新たな腫瘍の発生を防ぐ、治療上投与される抗体は、癌の治療のために有効な抗体である。
本発明によれば、抗体は5T4特異的抗体である。
5T4特異的抗体は、例えば、R&D Systems (MN, USA)、LifeSpan BioSciences, Inc (WA, USA)及びCreative Biolabs (NY, USA)から市販されている。
5T4特異的抗体の例はまた、国際公開第98/55607号、国際公開第2001/036486号、国際公開第2003/038098号、国際公開第2006/031653号、米国特許出願公開第2006/0088522号、米国特許出願公開第2016/0185859号、国際公開第2007/106744号、国際公開第2012/131527号及び国際公開第2013/068874号に記載されている。
一本鎖抗5T4抗体、並びに治療用分子に融合された抗5T4抗体配列を含む融合タンパク質もまた、記載されている。例えば、ヒトIgG1定常ドメイン又はマウスB7.1の細胞外ドメインに融合された抗5T4抗体配列は、5T4発現腫瘍細胞株の細胞溶解を誘導する（Myers等 (2002) Cancer Gene Ther. 9: 884-96, Shaw等 (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1524: 238-46;米国特許出願公開第2003/0018004号）。同様に、スーパー抗原に融合された一本鎖抗5T4抗体は刺激し得る。in vitroにおける非小細胞肺癌細胞のT細胞依存細胞溶解（Forsberg等 (2001) Br. J. Cancer 85: 129-36）。変異したスーパー抗原ブドウ球菌エンテロサイトトキシンA（staphylococcal enterocytotoxin A、SEA）に融合された、モノクローナル抗体5T4のマウスFab断片である、PNU-214936を用いた第I相臨床試験は、限定された細胞毒性及びいくらかの抗腫瘍反応を示した（Cheng等(2004) J. Clin. Oncol. 22(4):602-609）。この製品の第3相試験はまた、Hawkins等 Clin Cancer Res. 2016 Jul 1;22(13):3172-81. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-15-0580. Epub 2016 Feb 5に公開されている。
一態様では、抗体は、H8抗体（Hole及びStern 1988 Br. J. Cancer 57:239-246を参照）又はH8抗体に基づく抗体であり得る。H8抗体は、5T4抗原の立体配座エピトープ（conformational epitope）（例えば、Shaw等 (2002) Biochem. J. 363: 137-45, 国際公開第98/55607号を参照）、ラットモノクローナル抗体（Woods等(2002) Biochem. J. 366: 353-65）、及び5T4マウスモノクローナル抗体（米国特許第5,869,053号）を認識する。
H8 5T4特異的抗体は、例えばR&D Systemsから市販されている。
他の態様では、5T4抗原に結合する抗体は、本願実施例に記載の2E4抗体、又は2E4抗体に基づく抗体であり得る。
2E4抗体の配列は、配列番号12に示される：
ペプチド及びワクチン
癌抗原又は癌抗原由来のペプチドを含有する癌ワクチンが提案されている。
本発明は、血液癌の治療又は予防における使用のための、本明細書に定義される5T4抗原又は5T4抗原ペプチドを含む免疫学的組成物又はワクチンを提供する。
上述の通り、様々な5T4抗原分子の配列は当技術分野において既知であり、従って、本発明による使用のためにペプチド又はタンパク質を誘導し得る。
適切なペプチドは、例えば、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2000/029428号、国際公開第2006/120473号、国際公開第2007/034188号、Mulryan等 (2002) Mol. Cancer Ther. 1: 1129-37; 英国特許出願公開第2,370,571号及び第2,378,704号; 欧州特許出願公開第1,160,323号及び第1,152,060号に示され得る。
免疫学的組成物又はワクチンは、任意の方法において使用され得る、又は本発明に従って血液癌を治療又は予防するために本明細書に記載のように使用され得る。従って、本発明は、本発明による免疫学的組成物又はワクチンを投与することを含む、対象において血液癌を治療又は予防する方法を包含する。
「ペプチド」との用語は、通常の意味で用いられ、典型的には隣接アミノ酸のαアミノ基及びカルボキシル基との間のペプチド結合により互いに連結される一連の残基、典型的にはLアミノ酸を意味する。当該用語には、修飾ペプチド及び合成ペプチド類似体が含まれる。
ペプチドは、化学的方法を用いて作製され得る（Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin.）。例えば、ペプチドは、固相法により合成され（Roberge JY等(1995) Science 269: 202-204）、樹脂から切断され、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製され得る（例えば、Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY）。自動合成は、例えば、製造業者により提供される使用説明書に従ってABI 43 1 Aペプチドシンセサイザー（Perkin Elmer）を用いて達成され得る。
或いは、ペプチドは組換え法により、又は抗原であるか若しくは抗原を含むポリペプチドからの切断により、作製され得る。ペプチドの組成物は、アミノ酸分析又はシークエンシング（例えばエドマン分解法）により確認され得る。
免疫学的組成物又はワクチンは、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含む医薬組成物であり得る。医薬組成物は、任意選択で1種以上の更なる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含み得る。このような製剤は、例えば、皮内若しくは皮下投与、又は静脈内若しくは腹腔内注入に適した形態であり得る。癌ワクチンの議論については、例えば、Butterfield, BMJ. 2015 22;350を参照されたい。
組成物は、アジュバントをさらに含み得る。アジュバントの例には、限定されないが、アルミニウム塩、油エマルジョン、及び細菌成分（例えばLPS及びリポソーム）が含まれる。
一態様では、ワクチンは、ペプチド、タンパク質、又は代替的にペプチド若しくはタンパク質をコードするDNA若しくはRNA分子の形態で、5T4抗原を含み得る。
さらに、5T4抗原ワクチンは細胞の状態で送達され得る。例えば、5T4抗原又はペプチドは、細胞、例えば抗原提示細胞上に発現されるか、パルスされるか、又は載せられてもよく、細胞はその後対象に投与される。
この一例は、抗原若しくはペプチドでパルスされたか若しくはそれを載せられた、又は1種、2種若しくはそれ以上の抗原を発現するよう（DNA若しくはRNA導入を介して）遺伝子組換えされた、樹状細胞ワクチンである（例えば、上記Butterfield 2015を参照）。樹状細胞ワクチンを調製する方法は、当技術分野において既知である。
本明細書において論じられるワクチンによる細胞は、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞であり得る。
適切なワクチンはまた、本明細書に記載の5T4抗原に関連するDNA又はRNAワクチンの形態であり得る。例えば、5T4抗原、又はそれに由来するペプチド若しくはタンパク質をコードするDNA又はRNAは、例えば対象への直接注射により、ワクチンとして使用され得る。1種以上の5T4抗原は、1種以上の抗原をコードするDNA又はRNA配列を含有する細菌又はウイルスベクターを介して送達され得る。
本明細書に記載のワクチンは、任意の適切な方法で投与され得る。例えば、ワクチンは、当技術分野において既知の任意の適切な送達機構により送達され得る。ワクチンはベクター送達系の使用を伴う場合もある、或いは、ベクター送達系は必要でない場合もある。ベクターはウイルス性又は細菌性であり得る。適切なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス又はポックスウイルスに由来し得る。リポソームは送達系として使用され得る。リステリアワクチン又はエレクトロポレーションもまた、使用され得る。
細胞ベースのワクチンは、ex vivoで調製され、その後対象に投与され得る。
本発明はさらに、その表面上に5T4ペプチド等の5T4抗原分子若しくはその一部分を発現する細胞、又はその細胞の集団を提供する。その細胞は、血液癌の治療又は予防における使用のための本明細書の任意の方法により取得できる（又は取得される）。
細胞のin vivo投与のために、当技術分野において一般的又は標準的な細胞集団の任意の投与様式、例えば注射又は注入、が適切な経路により使用され得る。一態様では、対象1kg当たり1×104～1×108個の細胞が投与され得る。一態様では、対象1kg当たり約107個又は107個以下の細胞が投与され得る。従って、例えばT細胞の用量又はワクチン接種の用量として、例えば、ヒトでは、対象1kg当たり0.1～20×107個の細胞の用量が、1回用量で、即ち用量当たり、投与され得る。一態様では、対象1kg当たり1×104～1×105個の細胞、1×105～1×106個の細胞、1×106～1×107個の細胞、又は1×107～1×108個の細胞が投与され得る。ワクチン接種の適用のためには、用量当たり1～20×106個の細胞が使用され得る。必要に応じて、投与は後で繰り返され得る。
ワクチンはまた、5T4をコードするDNA又はRNAの形態であり、限定されないがウイルスベクター、抗原提示細胞及びエレクトロポレーションを含む追加の方法により送達され得る。
本明細書に記載の免疫学的組成物又はワクチンは、本発明による方法において使用され得る。即ち、本発明は、5T4ペプチド等の5T4抗原を含む免疫学的組成物を投与することを含む、対象において血液癌を治療又は予防するための方法を包含する。
一態様では、ワクチン接種は、治療的ワクチン接種である。この態様では、免疫学的組成物又はワクチンは、血液癌を治療するために血液癌を有する対象に投与される。
更なる態様では、ワクチン接種は予防的ワクチン接種である。この態様では、免疫学的組成物は、血液癌を発症するリスクを有する可能性がある対象に投与される。
一態様では、ワクチンは、過去に血液癌を有していたことがあり、血液癌の再発のリスクがある対象に投与される。
免疫学的組成物において使用される抗原の用量は、使用される抗原によって異なり得る。タンパク質抗原のin vivoでの使用については、用量は0.5～500μg、例えば10～100μg又は10～200μgの範囲であり得る。ペプチド抗原については、0.1～4000μg、例えば0.1～2000μg、0.1～1000μg又は0.1～500μg、例えば0.1～100μgのin vivo用量が用いられ得る。
本発明による免疫学的組成物又はワクチンにより、対象において免疫反応が引き起こされ得る。引き起こされ得る「免疫反応」は、液性及び／又は細胞性免疫であってもよく、例えば、抗体産生の刺激、又は表面上に「外来」抗原を発現している細胞を認識し破壊し得る（或いはそうでなければ除去し得る）細胞傷害性若しくはキラー細胞の刺激である。従って、「免疫反応を刺激すること」との用語には、すべての種類の免疫反応及びそれらを刺激するための機構が含まれ、本発明の好ましい態様を形成するCTLの刺激が包含される。好ましくは、刺激される免疫反応は、細胞傷害性CD8 T細胞及びヘルパーCD4+ T細胞である。免疫反応の程度は、免疫反応のマーカー、例えばIL-2若しくはIFNγ等の分泌分子、又は抗原特異的T細胞の産生により評価され得る。
一態様では、TroVax（登録商標）ワクチンが使用され得る。
TroVax(登録商標)（Oxford BioMedica plc）は、改変ワクシニアアンカラ（Modified Vaccinia Ankara、MVA）と称されるワクシニアウイルス（VV）の高度弱毒株から成り、改変プロモーターmH5の調節制御下のヒト5T4糖タンパク質遺伝子を含有する（例えば、Amato等 Clin Cancer Res; 16(22) November 15, 2010; Harrop等 Cancer Immunol Immunother. 2012 Dec;61(12):2283-94; Harrop R等 Cancer Immunol Immunother. 2013 Sep;62(9):1511-20、国際公開第2000/29428号、国際公開第2010/007365号、国際公開第2010/079339号、及び国際公開第2012/059750号を参照されたい）。
TroVax(登録商標)は、本明細書に記載の方法及び／又は用途において使用され得る。
異種プライムブーストワクチンレジメンは、国際公開第98/56919号（異なるプライマー及びブースター組成物をCD8+ T細胞エピトープ源として用いる、標的抗原に対する防御CD8+ T細胞免疫反応の生成）、又は国際公開第2001/021201号（プライミング組成物の事前投与後、抗原に対する個々のCD8+ T細胞免疫反応を高めるための、抗原又は抗原のCD8+ T細胞エピトープをコードする複製欠損アデノウイルスベクターの使用）に記載されるように使用され得る。プライミング組成物は、抗原若しくはエピトープ、又は抗原若しくはエピトープをコードする核酸を含んでも良く、DNA、Ty-LVP'S又は改変ウイルスアンカラ（Modified Virus Ankara、MVA）であっても良く、5T4を標的とするワクチンの投与のために、国際公開第2012/172277号（免疫反応を誘発する又は高めるためにチンパンジーアデノウイルスを使用する）が使用され得る。
細胞療法
更なる態様では、本発明は、対象における血液癌の治療又は予防における使用のための、5T4を認識する細胞、好ましくは免疫細胞、例えばT細胞又はナチュラルキラー（NK）細胞又はNK T細胞、を提供する。或いは、本発明は、対象における血液癌の治療又は予防における使用のための医薬の製造における、5T4を認識するT細胞、NK細胞、又はNKT細胞等の免疫細胞の使用を提供する。更なる選択肢では、本発明は、対象における血液癌の治療又は予防における、5T4を認識する免疫細胞、好ましくはT細胞の使用を提供する。一態様では、このような5T4標的細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）である。一態様では、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。
「免疫細胞」との記載は、免疫系の細胞、例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞又は樹状細胞を包含することを意図する。一態様では、免疫細胞はT細胞である。更なる態様では、免疫細胞は、NK細胞又はNKT細胞である。
一態様では、本発明は、対象における血液癌の治療又は予防における使用のための、5T4を認識する細胞集団を提供する。或いは、本発明は、対象における血液癌の治療又は予防における使用のための医薬の製造における、5T4を認識する細胞集団の使用を提供する。更なる選択肢では、本発明は、対象における血液癌の治療又は予防における、5T4を認識する細胞集団の使用を提供する。一態様では、細胞は、本明細書に記載される免疫細胞である。好ましくは、細胞は、T細胞、NK細胞又はNKT細胞である。
細胞又は細胞集団は、組成物、例えば、本明細書に記載される医薬組成物の形態であり得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、化学療法剤、例えばアスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン等の他の薬学的に活性な薬剤又は薬物をさらに含む。
さらに、いくつかの態様では、緩衝剤が組成物中に含まれ得る。適当な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、並びに様々な他の酸及び塩が含まれる。いくつかの態様では、2種以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤又はその混合物は、典型的には、組成物全体の約0．001重量％～約4重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製するための方法は既知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、Lippincott Williams & Wilkins; 第21版（2005年5月1日）により詳細に記載されている。
養子細胞治療（adoptive cell therapy）のための細胞の投与方法は既知であり、提供される方法及び組成物に関連して使用され得る。例えば、養子T細胞療法の方法は、例えば、Gruenberg等に対する米国特許出願公開第2003/0170238号;Rosenbergに対する米国特許第4,690,915号; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85に記載されている。例えば、Themeli等（2013) Nat Biotechnol. 31（10）： 928－933; Tsukahara等（2013) Biochem Biophys Res Commun 438（1）： 84－9; Davila等（2013) PLoS ONE 8（4): e61338を参照されたい。
細胞療法は、自家移植により行われてもよく、自家移植では、細胞療法を受ける対象又はそのような対象由来の試料から細胞が単離され、及び／又は別の方法で調製される。従って、一態様では、細胞は、治療を必要とする対象、例えば患者に由来し、細胞は、単離及び処理後、同一の対象に投与される。
或いは、細胞療法は、同種移植により行われてもよく、同種移植では、細胞療法を受けるか、又は最終的に細胞療法を受ける対象以外の対象、例えば第1の対象から細胞が単離され、及び／又は別の方法で調製される。このような実施形態では、細胞はその後、同種の異なる対象、例えば、第2の対象に投与される。いくつかの実施形態では、第1及び第2の対象は、遺伝的に同一である。いくつかの実施形態では、第1及び第2の対象は、遺伝的に類似している。いくつかの実施形態では、第2の対象は、第1の対象と同じHLAクラス又はスーパータイプを発現する。代替の実施形態では、同種T細胞は、機能的T細胞受容体（TCR）並びに／又はヒト白血球抗原（HLA）、例えばHLAクラスI及び／若しくはHLAクラスIIを欠いていてもよい。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、疾患又は状態を治療又は予防するのに有効な量、例えば治療的有効量又は予防的有効量、の細胞を含む。いくつかの実施形態では、治療的又は予防的有効性は、治療される対象の定期的評価により監視される。数日以上にわたる反復投与については、状態に応じて、所望の疾患症状の抑制が生じるまで治療が繰り返される。しかしながら、他の投与レジメンが有用である場合もあり、他の投与レジメンが決定されてもよい。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与、組成物の複数回ボーラス投与、又は組成物の持続注入投与により送達され得る。
本発明はまた、以下の工程を含む、5T4を標的とする細胞集団を提供するための方法を提供する：
i) 対象から単離された試料から細胞を単離すること；及び
ii）細胞を増殖させて、5T4を標的とする細胞集団を提供すること。
一態様では、細胞はT細胞である。一態様では、細胞は、NK細胞又はNKT細胞である。
試料は、対象由来の腫瘍、血液又は組織試料であり得る。
一実施形態では、細胞が単離される試料は、血液試料、腫瘍試料、腫瘍関連リンパ節試料、又は転移部位からの試料であり得る。
細胞がT細胞である場合、T細胞集団は、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞又はCD8+及びCD4+ T細胞を含み得る。
得られた細胞集団は、（例えば、対象から単離された試料と比較して）5T4を標的とする細胞数の増大を有し得る。
T細胞は、例えば、免疫調節受容体（限定されないが、Lag 3、PD1、TIGIT、PD-L1、BTLA、CTLA4、TGFβ受容体、IL10受容体を含む）の遺伝子編集によって、免疫抑制に対して耐性にされていてもよい。
一態様では、操作された細胞、例えば標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体を含む操作された免疫細胞、である細胞が使用され得る。改変に適した細胞は、対象、例えば、限定されないがヒト対象を含む哺乳動物対象、から取得され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む、当業者に知られている多くの供給源から取得され得る。適切な細胞には、自然免疫系又は適応免疫系の細胞（例えば、T細胞、NK細胞又はNKT細胞等のリンパ球を含む骨髄細胞又はリンパ細胞）等の免疫系の細胞が含まれる。他の適切な細胞には、誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、iPSC）を含む多分化能をもつ（multipotent）幹細胞及び多能性（pluripotent）幹細胞等の幹細胞が含まれる。一態様では、細胞は、対象から直接単離され、及び／又は対象から単離され凍結された細胞等の初代細胞である。
特定の態様では、適切な細胞は、フィコール分離等の当業者に知られている多くの技術を用いて、哺乳動物対象から採取された1単位の血液から取得され得る。一態様では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスにより取得される。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含有する。アフェレーシスにより採取された細胞は、血漿分画を除去するために洗浄され得、任意選択で、その後の処理工程のために適切な緩衝液又は媒体中に置かれ得る。細胞は、例えばリン酸緩衝食塩水中で洗浄され得る。カルシウムの欠損によりT細胞の活性化が増大され得るので、特定の実施形態では、洗浄溶液はカルシウム及び／若しくはマグネシウムを欠いているか、又は多くの若しくは全ての二価陽イオンを欠いている場合がある。
Miltenyi CD25マイクロビーズ等の当技術分野で既知の方法を用いて、細胞から制御性T細胞（CD25+細胞）が除去され得る。CD25+細胞の除去は、アフェレーシス前に、又はCAR発現細胞（例えば、T細胞又はNK細胞）の産生中に行われ得る。CARを発現する細胞の増殖及び／又は機能に負の影響を与える他の細胞種もまた除去され得る。このような免疫抑制細胞は、CD14、CD11b、CD33、CD15、又は免疫抑制細胞の他のマーカーを発現する細胞を含み、細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体を用いる磁気免疫粘着（magnetic immunoadherence）又はフローサイトメトリー等の当業者に既知の方法を用いることにより、細胞集団から除去され得る。
細胞からはまた、1つ以上のチェックポイント阻害剤、例えば、PD1、CD223（LAG3）、PD-L1及びCTLA4、PD-L2、TIM3、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、CD276（B7-H3）、B7-H4（VTCN1）、CD270（HVEM又はTNFRSF14）、KIR、A2aR、MHCクラスI MHCクラスII、GALS、アデノシン、TGFβ受容体を発現する細胞が除去され得る。制御性T細胞の除去と同時に、1つ以上のチェックポイント阻害剤を発現する細胞が細胞集団から除去され得る。
制御性T細胞、免疫抑制細胞及びチェックポイント阻害剤を発現する細胞の除去は、例えば、そのような制御性T細胞、免疫抑制細胞若しくはチェックポイント阻害剤を認識する複数の抗体を発現するビーズ、又はそのような抗体を発現するビーズの混合物を用いて、同時に行われ得る。例えば、抗CD25抗体又はその断片、又は他の結合部分、並びに抗チェックポイント阻害剤抗体又はその断片、又は他の結合部分は、同時除去のために同一のビーズ又は別々のビーズの混合物に付着し得る。或いは、特定の細胞種の除去は連続的に行われ得る。
一態様では、細胞は、例えば、抗CD3／抗CD28結合ビーズ（例えば、ダイナビーズ（登録商標）ヒトT活性化因子（Human T-Activator）CD3／CD28）、又は他の適切な試薬とのインキュベーションにより、正に選択され得る。
いくつかの態様では、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別(MACS) (Miltenyi Biotec、Auburn、CA）を介する。MACSシステムは、磁性粒子が付着した細胞を高純度で選択することができる。MACSは、外部磁場の適用後に標的細胞及び非標的細胞が連続的に溶出されるように機能し得る。磁性粒子に付着した細胞は、付着していない細胞が溶出されている間、保持され、その後、磁場に保持されていた細胞もまた溶出され得る。特定の態様では、例えば、取り扱いを低減するために、単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養、及び／又は製剤化の1つ以上を実施するのに閉鎖系が使用される。閉鎖系は、国際公開第2009/070003号又は国際公開第2009/072003号に記載されている。
免疫細胞は、例えば、国際公開第01/62895号、国際公開第2016/196388号、EP第1586655号、米国特許第5,199,942号、米国特許第6,352,694号、米国特許第7,144,575号、米国特許第7,067,318号、米国特許第7,172,869号、米国特許第7,572,631号に記載されるような、当技術分野において既知の方法により、ex vivo又はin vitroで活性化及び増殖され得る。末梢血採取又は骨髄外植片から哺乳動物CD34+造血幹細胞及び前駆細胞を収集した後、そのような細胞は、特定の成長因子の存在下でex vivoで増殖させることができる。国際公開第92/21402号に記載の成長因子に加えて、flt3-L、IL-1、IL-3及びc-kitリガンド等の他の因子が細胞の培養及び増殖に使用され得る。
免疫細胞集団は、抗原提示細胞によって提示されるような、表面に付着する作用物質及び／又はリガンド、例えば5T4抗原と接触することにより増殖させることができる。或いは、そのような作用物質はCD3／TCR複合体関連シグナルを刺激することができ、リガンドは細胞の表面上に存在する共刺激分子を刺激することができる。一態様では、T細胞集団は、抗CD3抗体若しくはその抗原結合断片、若しくは表面上に固定化された抗CD2抗体と接触すること、又はカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼC活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触することにより刺激され得る。T細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子と結合するリガンドが用いられる。例えば、T細胞集団を、T細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+ T細胞又はCD8+ T細胞の増殖を刺激するために、抗CD3抗体及び抗CD28抗体が使用され得る。
特定の態様では、免疫細胞（例えば、PBMC又はT細胞）は、抗CD3抗体及びIL-2の両方の一方に細胞を接触させることにより、増殖させられ、刺激される。細胞は、抗CD3又は抗CD28ビーズなしで増殖させられ得る。
一態様では、2種の作用物質は、同一のビーズ上又は別々のビーズ上でビーズ上に固定される。例として、一次活性化シグナルを提供する作用物質は、抗CD3抗体又はその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する作用物質は、抗CD28抗体又はその抗原結合断片であり、両作用物質は、同一のビーズに共に固定化される。一態様では、同等の分子量の各抗体がビーズに結合され、CD4+ T細胞の増殖及びT細胞の成長を刺激する。特定の態様では、1：1の比率でCD3及びCD28抗体を用いて観察される増殖と比較してT細胞増殖の増大が観察されるようなCD3：CD28抗体の比率が、ビーズに結合される。一態様では、ビーズに結合されるCD3：CD28抗体の比率は、100:1～1:100の範囲である。一態様では、抗CD3抗体よりも多くの抗CD28抗体が使用される。
更なる態様では、T細胞、NK細胞又はNK-T細胞等の細胞は、作用物質で被覆されたビーズと混合され、その後ビーズ及び細胞は分離され、次いで、細胞が培養される。或いは、培養の前に、作用物質で被覆されたビーズ及び細胞は共に培養される。或いは、ビーズ及び細胞は、まず磁力等の力の適用により濃縮され、細胞表面マーカーの結合の増大をもたらし、それによって細胞刺激を誘導する。特定の態様では、ビーズは常磁性ビーズ（例えば、ダイナビーズ又はMACSビーズ）である。
いくつかの態様では、分離及び／又は他の工程は、CliniMACSシステム(Miltenyi Biotec)を用いて実施される。
一態様では、CARをコードする核酸を組み込んだ細胞を増殖させる。細胞は、数時間から約14日間の期間、培養下で増殖させることができる。特定の態様では、特に複数サイクルの刺激が行われる場合、細胞は、14日よりも長く増殖させることができる。
細胞培養に適した条件は、当業者に知られ、適切な培地（例えば、最小必須培地（MEM）、DMEM、α-MEM、F12、RPMI 1640、X-vivo 15、X-vivo 20、オプティマイザー（Optimzer）、AIM－V、TexMAC）の使用を含む。培地は、細胞の増殖及び生存能力を改善する因子、例えば血清（ヒト血清又はウシ胎児血清）、IL-2、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、TNF-α、又は細胞の増殖及び生存能力を増大させることが当業者に知られている任意の他のそのような添加剤を含有し得る。細胞は、成長を支えるのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）及び雰囲気（例えば、空気＋5% CO2）の下で維持されるだろう。
本明細書に記載の細胞は、5T4に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）若しくはT細胞受容体（TCR）、又は5T4に特異的に結合する親和性増強TCRを発現し得る。従って、細胞は、5T4特異的CAR又はTCRを発現するように操作され得る。
一態様では、操作される細胞の抗原結合部分は、キメラT細胞受容体（TCR）である。このようなTCRは、組換えTCR又は天然のT細胞からクローニングされたTCRであり得る。
このため、5T4を標的とするための更なる選択肢は、5T4に特異的なCAR又はTCRを発現するT細胞、NK細胞又はNKT細胞等の細胞の使用を含む。
細胞は、特定の抗原に特異的であるようにex vivoで操作され得、自己抗原特異的細胞が対象に投与され得る。
CAR及びTCRは、以下でさらに詳細に記述されるが、遺伝子成分（例えば、CAR又はTCR）を細胞に導入するための種々の方法は、当技術分野において周知である。例示的な方法には、例えば、レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクターを用いるウイルス形質導入、トランスポゾン、エレクトロポレーション、及びDNA標的化タンパク質、例えば亜鉛フィンガータンパク質、エンドヌクレアーゼ等のエフェクタータンパク質に融合された転写活性化因子様タンパク質（例えば、TALE及びTALEN）が含まれる（June等 2009 Nature Reviews Immunology 9.10; 704-716）。
いくつかの態様では、まず細胞の成長及び／又は活性化を刺激し、その後、細胞の形質導入を行い、その後、改変された細胞を臨床適用に十分な数まで増殖させることにより、遺伝子導入が達成される。
組換え核酸は、組換え感染性ウイルス粒子を用いて細胞内に導入され得る。レンチウイルス等のレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期にわたる安定した組み込み及び娘細胞でのその伝播を可能にするので、長期的な遺伝子導入を達成するのに適している。レンチウイルスに由来するベクターはまた、非分裂細胞を形質導入することができる。
適切なレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（MLV）、脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）、ヒトT細胞白血病ウイルス（HTLV）、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、藤波肉腫ウイルス（FuSV）、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo MLV)、FBRマウス骨肉腫ウイルス(FBR MSV)、モロニーマウス肉腫ウイルス（Mo-MSV）、アベルソンマウス白血病ウイルス（A-MLV）、トリ骨髄細胞腫ウイルス-29（MC29）及びトリ赤芽球症ウイルス（AEV）、並びに骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）等のγレトロウイルスに由来するものが含まれる。レトロウイルスの詳細なリストは、Coffin等（1997）“Retroviruses”, Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763に見出され得る。適切なレンチウイルスベクターは、HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV又はビスナレンチウイルスに由来してもよく、米国特許第6,924,123号、米国特許第7,056,699号、国際公開第98/17815号、国際公開第99/32646号、国際公開第01/79518号、国際公開第03/064665、米国特許第6,969,598号に記載されている。
ベクターはまた、ベクター産生中に導入遺伝子の発現を妨げる、国際公開第2015/092440号に記載のTRiPシステムを含み得る。
本明細書に記載される細胞に形質導入するのに適した他のベクターには、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターが含まれる。（例えば、Koste 等(2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens等 (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino等 (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park等, Trends Biotechnol. 2011 November ; 29(11): 550-557を参照）。
組換え核酸は、エレクトロポレーション又は転位を介して本明細書に記載される細胞に導入され得る。免疫細胞において遺伝物質を導入及び発現する他の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.に記載される）、プロトプラスト融合、陽イオン性リポソーム媒介トランスフェクション；タングステン粒子促進微粒子ボンバードメント（tungsten particle-facilitated microparticle bombardment）（Johnston, Nature, 346: 776-777（1990））；及びリン酸ストロンチウムDNA共沈（Brash等, Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）が含まれる。
また、遺伝子操作された細胞を産生するための方法、核酸、組成物、及びキットが提供される。遺伝子操作は、遺伝子操作された要素、又は細胞に導入するための他の要素、例えば遺伝子破壊タンパク質若しくは核酸をコードする要素、をコードする核酸の導入を含み得る。
TCR及び親和性増強TCRを生成するための方法は、当技術分野において既知である。親和性増強TCRとは、ペプチド-MHC複合体に対する親和性の増強を有するTCRである（例えば、患者試料（例えば患者の末梢血又はTIL）からTCRをコードするTCR遺伝子を単離すること、及び（例えば、in vitroで変異誘発し、親和性が増強された（又は親和性成熟した)TCRを選択することにより）TCR配列の改変を介してペプチド-MHC複合体に対するTCR親和性を改善することを含む）。このようなTCR遺伝子を細胞（例えばT細胞、NK細胞又はNKT細胞）に導入する方法は、当技術分野において既知である。多様なヒトTCRレパートリーを有する抗原陰性ヒト化トランスジェニックマウス（例えば、ABabDIIマウス等のTCR/MHCヒト化マウス）を抗原で免疫化すること、及びこのような免疫化トランスジェニックマウスから抗原特異的TCRを単離することを含む、最適な親和性を有するTCRを特定する方法もまた、当技術分野において既知である（例えば、Obenaus M等, Nat Biotechnol. 33(4):402-7, 2015を参照）。いくつかの態様では、高親和性TCRは、例えば、国際公開第2004/044004号に記載の方法又は当業者に知られている他の方法により生成される。
本明細書に記載の発明による特定の態様では、細胞若しくは細胞集団又は組成物は、例えば、T細胞、NK細胞又はNKT細胞等の細胞の単離及び増殖後に、対象に再注入される。これを達成するための適切な方法は本明細書に記載されており、当業者にも知られているであろう。例えば、T細胞を生成し、選択し及び増殖させるための方法については、例えばDudley J Immunother. 2003; 26(4): 332-342、及び Rosenberg等 2011 Clin Cancer Res:17(13):4550-7を参照されたい。T細胞を再注入するための方法は、Dudley等 Clin Cancer Res. 2010 Dec 15; 16(24): 6122-6131、及びRooney等 Blood. 1998 Sep 1;92(5):1549-55に記載されている。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の細胞組成物を対象に投与することを含む、対象において血液癌を治療するための方法に関する。細胞組成物は、T細胞、NK細胞又はNKT細胞組成物であり得る。
本方法は、以下の工程を含み得る：
(i) 対象から細胞含有試料を単離すること；
(ii) 5T4を標的とする細胞集団を増殖させること；及び
(iii) 対象に(ii)由来の細胞を投与すること。
細胞は、例えば5T4特異的CAR又はTCRを用いて、本明細書に記載されるように5T4を標的とするように操作され得る。
従って、本方法は、以下の工程を含み得る：
(i) 細胞含有試料を単離すること；
(ii) 5T4を認識するCAR又はTCRを発現するように細胞を操作し、5T4を標的とする細胞集団を提供すること；及び
(iii) 操作された細胞を増殖させること；
(iv) 対象に(ii)又は(iii)由来の細胞を投与すること。
上記の方法は、工程(ii)の前に任意選択の増殖工程を含み得る。
本発明はまた、以下を含む、血液癌を有する患者を治療する方法を提供する：
(i) 血液癌を有する患者を特定すること；及び
(ii) 任意選択で、そのような患者の血液癌細胞が5T4抗原を発現するか否か判定すること；及び
(iii) 本明細書に定義される細胞若しくは細胞集団（又は任意の5T4標的剤）を前記患者に投与すること。
T細胞が使用される場合、増殖させた5T4反応性T細胞集団は、例えば5T4ペプチドを用いて増殖させてないT細胞集団よりも高い活性を有し得る。「活性」との記載は、5T4ペプチド又は抗原、例えば増殖のために用いられたペプチドに対応するペプチド、での再刺激に対するT細胞集団の反応を表し得る。反応をアッセイするための適切な方法は、当技術分野において既知である。例えば、サイトカイン産生が測定され得る（例えば、IL2又はIFNγ産生が測定され得る）。「より高い活性」との記載には、例えば、1～5、5～10、10～20、20～50、50～100、100～500、500～1000倍の活性の増大が含まれる。
T細胞クローンであって、それから所望の標的特異性を有するTCR α鎖及びβ鎖がクローニングされるT細胞クローンを特定することにより、親和性増強TCRは生成され得る。次に、候補TCRは、α鎖及びβ鎖の相補的決定領域でPCR定方向変異誘発を受ける。各CDR領域における変異は、天然のTCRを上回る増強された親和性を有する変異体を得るためにスクリーニングされ、選択される。完了したら、リード候補はベクターにクローニングされ、アフィニティー増強TCRを発現するT細胞における機能試験を可能とする。
CARとは、通常の形式では、T細胞のエフェクター機能にモノクローナル抗体（mAb）の特異性を移植するタンパク質である。それらの通常の形態は、T細胞生存及び活性化シグナルを伝達する複合エンドドメイン（compound endodomain）にすべて連結される、抗原を認識するアミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメインを有する、I型膜貫通ドメインタンパク質の形態である。
これらの分子の最も一般的な形態は、標的抗原を認識するモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（scFv）を用いる。scFvはスペーサー及び膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合される。このような分子は、scFvによるその標的の認識に応答して、それが発現される細胞の活性化をもたらす。細胞がこのようなCARを発現する場合、それは、標的抗原を発現する標的細胞を認識し死滅させる。腫瘍関連抗原に対していくつかのCARが開発されており、このようなCAR発現細胞を用いた養子移入アプローチは、現在、様々な癌の治療のための臨床試験中である。CARは、例えば、国際公開第2014/031687号に記載されている。
いくつかの態様では、組換え受容体（例えばCAR）の抗体部分は、ヒンジ領域、例えば、IgG4ヒンジ領域、及び／又はCH1/CL、及び／又はFc領域等の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分をさらに含む。特定の態様では、定常領域の一部分は、抗原認識要素、例えばscFvと膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として働く。スペーサーは、スペーサーの非存在下での反応性と比較して、抗原結合後の細胞の反応性の増大を与える長さであり得る。例示的なスペーサーには、国際公開第2014/031687号に記載されるスペーサーが含まれる。スペーサーの長さは約10～200アミノ酸の間で変化し得る。
抗原認識ドメインは、一般に、1つ以上の細胞内シグナル伝達要素、例えば、CARの場合にはTCR複合体等の抗原受容体複合体を介した活性化、及び任意選択で関連する共刺激シグナル、及び／又は他の細胞表面受容体を介したシグナルを模倣するシグナル伝達要素、に連結されている。従って、いくつかの態様では、抗原結合要素は、1つ以上の膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結されている。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは細胞外ドメインに融合される。一態様では、受容体中のドメインの1つと天然に結合している膜貫通ドメインが使用される。いくつかの例では、受容体複合体の他の構成要素との相互作用を最小限にするために、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同一又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを避けるように、選択されるか、又はアミノ酸置換により改変される。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然又は合成の供給源に由来する。供給源が天然である場合、いくつかの態様では、当該ドメインは任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域には、T細胞受容体のα、β、又はζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来する膜貫通領域が含まれる。或いは、膜貫通ドメインは合成物であり得る。いくつかの態様では、合成膜貫通ドメインは、ロイシン及びバリン等の疎水性残基を主に含む。いくつかの態様では、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンの三つ組が合成膜貫通ドメインの各両端に見出されるであろう。いくつかの態様では、結合はリンカー、スペーサー、及び／又は膜貫通ドメインを介する。
組換え受容体の適切な細胞内シグナル伝達ドメインには、天然の抗原受容体を介したシグナル（例えばCD3シグナル）、共刺激受容体との組み合わせにおけるこのような受容体を介したシグナル（例えば、CD3/CD28シグナル）、及び／又は共刺激受容体単独を介したシグナルを模倣するか、又はそれらに近づける細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。いくつかの態様では、短いオリゴ又はポリペプチドリンカーが存在し、CAR等の組換え受容体の膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の結合を形成する。
CAR等の組換え受容体は、一般に、少なくとも1つの細胞内シグナル伝達要素を含む。いくつかの態様では、受容体は、CD3ζ鎖等のT細胞活性化及び細胞傷害性を媒介するTCR CD3鎖等の、TCR複合体の細胞内要素を含む。従って、いくつかの態様では、抗原結合部分は、1つ以上の細胞シグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの態様では、細胞シグナル伝達ドメインは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／又は他のCD膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、受容体は、Fc受容体γ CD8、CD4、CD25、又はCD16等の1種以上の追加の分子の一部分をさらに含む。例えば、いくつかの態様では、キメラ受容体は、CD3-ゼータ（CD3-ζ）又はFC受容体γとCD8、CD4、CD25又はCD16との間のキメラ分子を含む。
いくつかの態様では、CAR又は他のキメラ受容体が結合すると、受容体の細胞質ドメイン又は細胞内シグナル伝達ドメインは、サイトカイン若しくは他の因子の分泌等の細胞溶解活性若しくはTヘルパー活性等の、免疫細胞の正常なエフェクター機能又は反応の少なくとも1つを活性化する。いくつかの態様では、抗原受容体要素又は共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分は、例えば、それがエフェクター機能シグナルを伝達する場合、インタクトな免疫刺激鎖の代わりに使用される。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメイン又はドメインは、T細胞受容体（TCR）の細胞質配列を含み、いくつかの態様では、天然の状況下でそのような受容体と協調して作用し、抗原受容体の関与後シグナル伝達を開始する共受容体の細胞質配列も含む。
天然のTCRについては、完全な活性化には一般にTCRを介したシグナル伝達だけでなく、共刺激シグナルも必要となる。従って、いくつかの態様では、完全な活性化を促進するために、二次又は共刺激シグナルを生成するための要素もCARに含まれる。他の態様では、CARは、共刺激シグナルを生成するための要素を含まない。いくつかの態様では、追加のCARが、同じ細胞において発現され、二次又は共刺激シグナルを生成するための要素を提供する。
いくつかの態様では、T細胞の活性化は、2つのクラスの細胞質シグナル伝達配列、即ちTCRを介して抗原依存的一次活性化を開始する配列(一次細胞質シグナル伝達配列）、及び抗原非依存的に作用し、二次若しくは共刺激シグナルを提供する配列（二次細胞質シグナル伝達配列）、により媒介されると記載される。いくつかの態様では、CARは、そのようなシグナル伝達要素の一方又は両方を含む。
いくつかの態様では、CARは、TCR複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif、ITAM）として知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。TCRζ、FcRγ、GcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b、及びCD66dは、ITAMを含有する一次細胞質シグナル伝達配列の例である。特定の態様では、CARにおける細胞質シグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する配列を含む。
特定の態様では、CARは、CD28、4-1BB、OX40、DAP10及びICOS等の共刺激受容体のシグナル伝達ドメイン及び／又は膜貫通部分を含む。いくつかの態様では、同一のCARが活性化要素と共刺激要素の両方を含む。
いくつかの態様では、活性化ドメインは、あるCAR内に含まれるが、共刺激要素は、異なる抗原を認識する他のCARにより提供される。いくつかの態様では、CARは、活性化若しくは刺激性CAR、又は共刺激性CARを含み、いずれも同一細胞上に発現する（国際公開第2014/055668号参照）。いくつかの態様では、細胞は、1つ以上の刺激性若しくは活性化CAR、及び／又は共刺激性CARを含む。他の態様では、例えばオフターゲット効果を低減するために、細胞は、阻害性CAR、例えば疾患若しくは状態に関連する及び／又はそれに特異的な抗原以外の抗原を認識するCAR、をさらに含み、それにより、疾患標的化CARを介して送達される活性化シグナルが、阻害性CARのそのリガンドへの結合により減少又は阻害される（iCAR、Fedorov等 2013, Sci Transl Med. 5: 215参照）。
特定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3（例えば、CD3-ζ）細胞内ドメインに連結されたCD28膜貫通及びシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζ細胞内ドメインに連結されたキメラCD28及びCD137（4-1BB/TNFRSF9）共刺激ドメインを含む。
いくつかの態様では、CARは、1つ以上の共刺激ドメイン及び活性化ドメイン、例えば細胞質部分における一次活性化ドメインを包含する。例示的なCARは、CD3ζ、CD28及び4-1BBを含む。
特定の態様では、CARは、抗体又は抗体断片を含有する細胞外部分を含む。いくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、抗体若しくは断片を含有する細胞外部分、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、抗体又は断片はscFvを含み、細胞内ドメインはITAMを含有する。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3-ζ鎖のζ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、CARは、細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、膜貫通ドメインはCD28の膜貫通部分を含む。いくつかの態様では、CARはT細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。いくつかの態様では、T細胞共刺激分子はCD28又は4-1BBである。
本明細書中で使用される場合、「T細胞受容体」又は「TCR」との用語は、抗原の提示に応答してT細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体を指す。TCRは、主要組織適合複合体分子に結合した抗原の認識に関与する。TCRはアルファ（α）及びベータ（β）鎖のヘテロ二量体から構成されるが、いくつかの細胞ではTCRはガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖からなる。TCRは、α／β型及びγ／δ型で存在する可能性があり、それらは構造的に類似しているが、異なる解剖学的位置及び機能を有する。各々の鎖は、可変ドメイン及び定常ドメインという2つの細胞外ドメインから構成される。TCRは、例えば、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、記憶T細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、及びγδT細胞を含む、TCRを含む任意の細胞で改変され得る。
TCRは、内因性TCR、即ち、内因性であるか又はT細胞に本来備わっている（T細胞上に天然に存在する）TCRであり得る。このような場合、内因性TCRを含むT細胞は、特定の抗原を発現することが知られている哺乳動物から単離されたT細胞であり得る。T細胞は、例えば癌を有する対象から単離された初代T細胞であり得る。T細胞は、対象から単離された腫瘍浸潤リンパ球（TIL）又は末梢血リンパ球であり得る。或いは、内因性抗原特異的TCRを含むT細胞は、哺乳動物から単離された細胞の混合集団内のT細胞であってもよく、混合集団は、in vitroで培養されている間に、内因性TCRにより認識される抗原に曝露され得る。抗原を認識するTCRを含むT細胞は、in vitroで増殖（expand）又は増殖（proliferate）し、それにより内因性抗原特異的受容体を有するT細胞の数を増大させる。
本発明による抗原特異的TCR、例えば5T4特異的TCRは、外因性TCR、即ちT細胞に本来備わっていない（T細胞上に天然に存在しない）抗原特異的TCRであり得る。組換えTCRとは、1つ以上の外因性TCR α-、β-、γ-、及び／又はδ-鎖をコードする遺伝子の組換え発現を介して生成されたTCRである。組換えTCRは、単一の哺乳動物種に完全に由来するポリペプチド鎖を含んでもよく、又は抗原特異的TCRは、2つの異なる哺乳動物種からのTCRに由来するアミノ酸配列からなるキメラ若しくはハイブリッドTCRであってもよい。例えば、抗原特異的TCRは、マウスTCRに由来する可変領域、及びヒトTCRの定常領域を含んでもよく、従って、当該TCRは「ヒト化」されている。組換えTCRを作製する方法は当技術分野において既知である。例えば、米国特許第7,820,174号、第8,785,601号、第8,216,565号、及び米国特許出願公開第2013/0274203号を参照されたい。
本明細書に記載される発明のT細胞は、内因性抗原特異的TCRを含んでもよく、また、外因性（組換え）TCR又は他の組換えキメラ受容体をコードする1つ以上の核酸を用いて、形質転換、例えば形質導入又はトランスフェクト、されてもよい。このような外因性キメラ受容体、例えばキメラTCRは、内因性TCRが天然に特異的である抗原の範囲を超えて、形質転換T細胞に追加の抗原に対する特異性を付与し得る。
本発明の一態様では、記載される抗原結合部分はいずれも、多特異性であってもよく、即ち、それは、1個を超える抗原を認識する。一態様では、抗原結合部分は、二重又は三重特異性抗体である。多特異性抗体を生成するための多くの方法が当技術分野には存在し、当業者によって知られているであろう。
一態様では、抗原結合部分はまた、限定されないが、分化抗原（例えば、メラノサイト分化抗原）、突然変異抗原（例えば、p53）、過剰発現された細胞性抗原（例えば、HER2）、ウイルス抗原（例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質）、並びに精巣及び卵巣の生殖細胞において発現されるが正常な体細胞ではサイレントである癌／精巣（CT）抗原（例えば、MAGE及びNY-ESO-1）を含む、腫瘍関連抗原に結合し得る。
5T4特異的CAR
本発明はまた、モノクローナル抗5T4抗体由来の重鎖（VH）及び軽鎖（VL）可変断片を含む細胞外リガンド結合ドメイン、リンカー、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びにシグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、5T4特異的CARを提供する。本発明によるCARは、本明細書に記載の発明の任意の方法又は使用において用いられ得る。
以下の表はCARの様々な要素の例示的配列を示す：
一態様では、本発明による5T4特異的CARは、配列番号3に対し少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99若しくは100％の配列同一性を有する「抗5T4」ドメイン又は細胞外リガンド結合ドメインを含む。抗5T4ドメインは、本明細書に記述されるマウスモノクローナルH8抗体に由来し得る。一態様では、抗5T4ドメインは、配列番号3に対し少なくとも95％、好ましくは少なくとも98％又はより好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する。
他の態様では、抗5T4ドメインは、2E4抗体に由来し得る。2E4抗体は、本願実施例に記載される。
一態様では、細胞外リガンド結合ドメインは、H8モノクローナル抗体由来のCDRを含むVH鎖、及びマウスモノクローナルH8抗体由来のCDRを含むVL鎖を含む。これらの配列は当技術分野において既知である－例えば、国際公開第2016/034666号を参照されたい。
細胞外リガンド結合ドメインは、本明細書に記述されるようにヒト化されたVH鎖及びVL鎖を含み得る。
一態様では、本発明による5T4特異的CARは、配列番号11に対し少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99若しくは100％の配列同一性を有する「抗5T4」ドメイン又は細胞外リガンド結合ドメインを含む。抗5T4ドメインは、本明細書に記述される2E4抗体に由来し得る。一態様では、抗5T4ドメインは、配列番号11に対し少なくとも95％、好ましくは少なくとも98％、又はより好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する。
一態様では、本発明による5T4特異的CARは、配列番号4に対し少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％の配列同一性を有する「リンカー」ドメインを含む。一態様では、リンカードメインは、配列番号4に対し少なくとも95％、好ましくは少なくとも98％、又はより好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する。
一態様では、本発明による5T4特異的CARは、配列番号5に対し少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％の配列同一性を有する「CD8ヒンジ」ドメインを含む。一態様では、CD8ヒンジドメインは、配列番号5に対し少なくとも95％、好ましくは少なくとも98％、又はより好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する。
一態様では、本発明による5T4特異的CARは、配列番号6に対し少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％の配列同一性を有する「CD8膜貫通」ドメインを含む。一態様では、CD8膜貫通ドメインは、配列番号6に対して少なくとも95％、好ましくは少なくとも98％、又はより好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する。
一態様では、本発明による5T4特異的CARは、配列番号7に対し少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％の配列同一性を有する「41BB共刺激」ドメインを含む。一態様では、41BB共刺激ドメインは、配列番号7に対し少なくとも95％、好ましくは少なくとも98％、又はより好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する。
一態様では、本発明による5T4特異的CARは、配列番号8に対し少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％の配列同一性を有する「CD3ζ刺激」ドメインを含む。一態様では、CD3ζ刺激ドメインは、配列番号8に対し少なくとも95％、好ましくは少なくとも98％、又はより好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する。
一態様では、本発明は、配列番号1に示される配列、又は配列番号1に対し少なくとも92％の同一性を有する配列、を有する5T4特異的CARを提供する。
一態様では、CARは、配列番号1の配列を有する。
一態様では、CARは、配列番号1に対し少なくとも92、93、94、95、96、97、98又は99％同一である配列を有する。
一態様では、本発明は、配列番号13に示される配列、又は配列番号13に対し少なくとも70％の同一性を有する配列、を有する5T4特異的CARを提供する。
一態様では、CARは配列番号13の配列を有する。
一態様では、CARは、配列番号13に対し少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99％同一である配列を有する。
配列同一性は、任意の都合の良い方法により評価され得る。しかし、配列間の配列同一性の程度を決定するためには、配列の多重アラインメントを作成するコンピュータプログラム、例えば、Clustal W（Thompson等, (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680）が有用である。ALIGN（Myers等, (1988) CABIOS, 4: 1-17）、FASTA（Pearson等, (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol., 183: 63-98）、及びギャップ付きBLAST（gapped BLAST）（Altschul等, (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402）のような、配列のペアを比較し整列させるプログラムもまた、この目的に有用である。
さらに、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute）のDaliサーバーは、構造に基づくタンパク質配列のアラインメントを提供している（Holm (1993) J. Mol. Biol., 233: 123-38; Holm (1995) Trends Biochem. Sci., 20: 478-480; Holm (1998) Nucleic Acid Res., 26: 316-9）。
多重配列アラインメント及びパーセント同一性の計算は、標準的なBLASTパラメータを用いて（利用可能なすべての生物由来の配列、Blosum 62行列、ギャップコスト：存在（existence）11、延長（extension）1を用いて）決定され得る。
或いは、以下のプログラム及びパラメータが使用され得る:プログラム: Align Plus 4、version 4.10 (Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite)。DNA比較：グローバル比較、標準線形スコアリング行列（Standard Linear Scoring matrix）、ミスマッチペナルティ＝2、オープンギャップペナルティ＝4、伸長ギャップペナルティ（Extend gap penalty）＝1。アミノ酸比較：グローバル比較、BLOSUM 62スコアリング行列。
従って、バリアントが親の機能的活性を保持する、即ち、バリアントが機能的に等価である、言い換えれば、それらが親の活性を有するか又は示す限り、例えばCAR構造の文脈において、記載された又は与えられた配列のバリアントは本発明の範囲に含まれる。このようなバリアントは、親配列と比較して1つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、付加又は欠失を含み得る。
所与のアミノ酸配列の「バリアント」とは、例えば1個又は2個のアミノ酸残基の側鎖が、それが由来する親ペプチドの機能的活性を保持するように、（例えば、それを他の天然アミノ酸残基の側鎖、又は何らかの他の側鎖と置換することにより）変更され得ることを意味することが意図される。
バリアントは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンの残基から選択されるもののうち1個以上によるアミノ酸残基の置換を含み得る。
このようなバリアントは、塩基性から塩基性、酸性から酸性、極性から極性等の同種置換（homologous substitution）、即ち同種交換的（like-for-like）／保存的置換、から生じ得る。非同種置換、即ちあるクラスの残基から他のクラスの残基への非同種置換、或いはオルニチン、ジアミノ酪酸、ノルロイシン、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシン等の非天然アミノ酸の組入れを伴う非同種置換もまた生じ得る。
置換は保存的置換であり得る。本明細書で使用される場合、「保存的置換」とは、所与の位置でアミノ酸同一性を変化させて、ほぼ同等の大きさ、電荷及び／又は極性のアミノ酸と置換することを指す。アミノ酸の天然の保存的置換の例には、以下の8つの置換群（通常の一文字表記により指定される)が含まれる: (1）M、I、L、V; (2）F、Y、W; (3）K、R、（4）A、G; (5）S、T; (6）Q、N; (7）E、D；及び（8）C、S。また、1個以上のアミノ酸が化学的に誘導体化された、例えば化学基で置換された、機能的に等価な誘導体もまた、含まれる。機能的に等価な誘導体は、ペプチド合成の前又は後に特定のアミノ酸を反応させることにより化学的に修飾され得る。例えばR. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification,第3版 CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004）に記載の例は、当技術分野において既知である。アミノ酸の化学修飾には、限定されないが、アシル化による修飾、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元的アルキル化、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）を用いたアミノ基のトリニトロベンジル化、カルボキシル基のアミド修飾及びシステインのシステイン酸への過ギ酸酸化によるスルフヒドリル修飾、水銀誘導体の形成、他のチオール化合物を用いた混合ジスルフィドの形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸又はヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、並びにアルカリ性pHでのシアン酸塩を用いたカルバモイル化が含まれるが、これらに限定されない。
核酸及びベクター
本発明はまた、配列番号1のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号1に対し少なくとも92％の同一性を有する配列を有する核酸分子を包含する。核酸分子は、配列番号1に対し92、93、94、95、96、97、98、99又は100％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。一態様では、核酸分子は、配列番号1の配列からなるアミノ酸配列をコードする。
一態様では、核酸分子は、配列番号2、3、4、5、6、7及び／若しくは8のいずれかのアミノ酸配列をコードする配列、並びに／又はそれに対して少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100％の配列同一性を有する1個若しくは複数個の配列を有する。一態様では、配列同一性のレベルは、少なくとも95％、又は好ましくは98％である。
一態様では、核酸分子は、配列番号：2、3、4、5、6、7及び8のアミノ酸配列をコードする配列を有する。
本明細書に記載の「核酸分子」とは、天然若しくは合成のDNA若しくはRNA、又はそれらの任意の組合せであり得る。5T4特異的CARをコードする核酸は、それが宿主生物の細胞機構により翻訳され得るように、構築され得る。従って、天然の核酸は、例えばその安定性を増大させるよう修飾され得る。DNA及び／又はRNA、ただし特にRNAは、ヌクレアーゼ耐性を改善するために修飾され得る。
例えば、リボヌクレオチドの既知の修飾には、2'-O-メチル、2'-フルオロ、2'-NH2、及び2'-O-アリルが含まれる。修飾された核酸は、核酸のin vivoでの安定性を増大させ、その送達を増強若しくは媒介し、又は身体からのクリアランス率を低下させるためになされた化学修飾を含み得る。このような修飾の例には、所与のRNA配列のリボース及び／又はリン酸及び／又は塩基位置における化学的置換が含まれる。例えば、国際公開第92/03568号; 米国特許第5,118,672号; Hobbs等, (1973) Biochemistry 12:5138; Guschlbauer等, (1977) Nucleic Acids Res. 4:1933; Schibaharu等, (1987) Nucleic Acids Res. 15:4403; Pieken等, (1991) Science 253:314を参照されたい。
本発明はまた、例えば、配列番号1のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号1に対し少なくとも92％の同一性を有する配列を有する、本明細書に記載の核酸分子に対し、高、中又は低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸分子を包含する。一態様では、条件は、高ストリンジェンシー条件である。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を指す。このような条件は、当業者に明らかである。当業者に知られているように、ハイブリッドの安定性は、配列相同性が1％低下するごとに約1～1.5℃減少するハイブリッドの融解温度（Tm）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度及び温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、より高いストリンジェンシー条件下で行われ、続いて様々なストリンジェンシーの洗浄が行われる。
本明細書中で使用される場合、高ストリンジェンシーとは、65～68℃、1M Na+において安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。高ストリンジェンシー条件は、例えば、6× SSC、5×デンハルト、1% SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）、0.1 Na+ピロリン酸、及び非特異的競合物として0.1mg/ml変性サケ精子DNAを含有する水溶液中でのハイブリダイゼーションにより提供され得る。ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェンシー洗浄がいくつかの段階で行われ、ハイブリダイゼーション温度で0.2～0.1× SSC、0.1% SDS中で最終洗浄（約30分）が行われ得る。
中ストリンジェンシーとは、約60～62℃である以外、上記溶液中でのハイブリダイゼーションに相当する条件を指す。この場合、最終洗浄は、ハイブリダイゼーション温度で、1× SSC、0.1% SDS中で行われる。
低ストリンジェンシーとは、約50～52℃における上記溶液中でのハイブリダイゼーションに相当する条件を指す。この場合、最終洗浄は、ハイブリダイゼーション温度で2× SSC、0.1 % SDS中で行われる。
これらの条件は、様々な緩衝液、例えばホルムアミドベースの緩衝液、及び温度を用いて適応及び再現され得ることは理解される。デンハルト溶液及びSSCは、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に当業者に周知である（例えば、Sambrook等, 編者 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York又はAusubel等, 編者 (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.参照）。プローブの長さ及びGC含量も役割を果たすので、最適なハイブリダイゼーション条件は経験的に決定されなければならない。
本発明はまた、配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1に対し少なくとも92％の同一性を有する配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を含むベクターを包含する。一態様では、核酸分子は、配列番号9に示される配列を有する。
核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結され得る。一態様では、EF1αプロモーターが利用される（配列番号10参照）。
核酸は、発現カセット又は発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞に導入するためのプラスミド、又はウイルスベクター、又は哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのプラスミド若しくはレンチウイルス等のウイルスベクター）中にあってもよい。適切なレンチウイルスベクターは、HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV又はビスナレンチウイルスに由来してもよく、米国特許第6,924,123号、米国特許第7,056,699号、国際公開第1998/055607号、国際公開第1998/17815号、国際公開第1999/32646号、国際公開第2001/79518号、国際公開第2003/06465号、米国特許第6,969,598号に記載されている。
本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞において核酸を送達又は維持することができる任意の作用物質であり得、ウイルスベクター、プラスミド、裸の核酸、ポリペプチド若しくは他の分子と複合体を形成した核酸、及び固相粒子上に固定化された核酸を含む。
本明細書に記述されるように、本発明は、本発明の核酸分子又はベクターを前記免疫細胞にex-vivoで導入することを含む、免疫療法のための免疫細胞を提供する方法を包含する。
一態様では、前記核酸分子は、レンチウイルスベクター中に含まれる。更なる態様では、レンチウイルスベクターは、HIV又はEIAVに由来する。
癌の治療又は予防
本発明の5T4特異的CARは、療法において、即ち薬剤として使用され得る。
特に、本発明の5T4特異的CARは、癌の治療又は予防において使用され得る。
本発明は、本発明の5T4特異的CARを対象に投与することを含む、対象における癌の治療又は予防のための方法を提供する。
癌の治療若しくは予防における使用のための医薬の製造における本発明の5T4特異的CARの使用、及び癌の治療若しくは予防における5T4特異的CARの使用もまた、提供される。
本発明の5T4特異的CARは、5T4抗原を発現する癌の治療又は予防において使用され得る。
例えば、そのような癌には、限定されないが、胆管、骨、膀胱、脳／CNS、乳房、結腸直腸、子宮頸部、子宮内膜、胃、頭頸部、肝臓、肺、筋肉、中皮腫、神経、食道、卵巣、膵臓、側膜／腹膜、前立腺、腎臓、皮膚、精巣、甲状腺、胎盤、子宮及び外陰部腫瘍等の固形腫瘍を含む癌が含まれる。
一態様では、癌は固形腫瘍を含まず、本明細書に記載の血液癌である。
一態様では、癌は卵巣癌である。
一態様では、癌は中皮腫である。
一態様では、癌は骨髄腫である。
一態様では、癌は、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病又はT細胞急性リンパ芽球性白血病である。
一態様では、癌は、前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病、例えば小児前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病である。
免疫細胞
提供されるのは、操作された免疫細胞又は免疫刺激細胞等の細胞、並びに養子療法等において当該細胞を産生及び使用するための方法、及び当該細胞を含有する医薬組成物等の組成物である。
従って、本発明は、本明細書に記載の5T4特異的CARを発現する免疫細胞を提供する。このような細胞の集団もまた、提供される。
一態様では、本発明は、本明細書に定義される核酸又はベクターをex vivoで細胞に導入することを含む、T細胞、NK細胞又はNKT細胞等の免疫細胞を提供するための方法を提供する。
一態様では、細胞又は細胞集団は、療法において、即ち薬剤として使用され得る。
細胞又は細胞集団は、癌を治療又は予防するために使用され得る。
一態様では、癌は骨髄腫である。
一態様では、細胞は、同種移植により適したものとするよう、遺伝子組換えされ得る。
細胞は、例えば、国際公開第2013/176915号に記載のT細胞受容体（TCR）の1つ以上の構成要素を発現する少なくとも1つの遺伝子を不活性化することにより、同種異系にされてもよく、それは、HLA又はβ2ITIタンパク質をコード又は調節する遺伝子発現の不活性化と組み合わされてもよい。移植片対宿主症候群及び移植片拒絶のリスクが低減され得る。
免疫細胞は、例えば5T4陽性悪性細胞を治療するための標準ケアとして使用される免疫抑制薬又は化学療法治療に対する耐性を改善するために、さらに遺伝子操作され得る。例えば、Campath（アレムツズマブ）及びグルココルチコイド治療の薬物標的であるCD52及びグルココルチコイド受容体(G)は、細胞をこれらの治療に耐性とし、特異的5T4 CARが与えられていない内因性T細胞に対する競合上の優位性をそれらに与えるために、不活性化され得る。他の免疫抑制薬であるテプリズマブに対する耐性を付与するために、CD3遺伝子の発現もまた、抑制又は低減され得る。化学療法に一般的に使用される細胞増殖抑制剤である6-チオグアニンに対する耐性を付与するために、HPRTの発現もまた、抑制又は低減され得る。
PDCD1又はCTLA-4等の、T細胞活性化の調節因子として働く「免疫チェックポイント」として働くタンパク質をコードする遺伝子もまた、不活性化され得る。
一態様では、細胞は、他の抗原に特異的に結合し、細胞に共刺激シグナルを誘導することができる他の遺伝子操作された抗原受容体、例えば共刺激受容体、例えばキメラ共刺激受容体を含み得る。いくつかの態様では、このような他の標的抗原と、第1の受容体により認識される第1の標的抗原とは異なる。
投与
本発明による細胞又は細胞集団は、医薬組成物等の組成物の形態で投与されてもよく、その組成物は、細胞若しくは細胞集団及び1種以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。
細胞若しくは細胞集団又は組成物の投与は、任意の適切な手段、例えば注射、摂取、埋植、移植又は吸入又は輸液により行われ得る。
投与は、任意の適切な経路、例えば局所又は全身投与により行われ得る。
一態様では、投与は、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、腫瘍内又は筋肉内であり得る。
一態様では、投与は、局所投与、例えば腹腔内又は胸腔内投与である。一態様では、癌は卵巣癌又は中皮腫であり、投与は腹腔内（卵巣）又は胸膜内（中皮腫）である。
一態様では、投与は全身的であり、癌は骨髄腫である。
投与される細胞数は、1×105～1×1010細胞/kg体重の範囲であり得る。いくつかの態様では、投与される細胞数は、体重1kg当たり約1×106～2×107細胞である。いくつかの態様では、投与される細胞数は、1×107～1×1011細胞の範囲である。細胞は、上記の範囲内で、免疫療法において一般的に知られている注入技術を用いることにより、1回又は複数回投与され得る（例えば、Rosenberg等 1998 New Eng. J. Med. 319; 1676）。特定の態様では、細胞は、腹腔内又は胸膜内経路を介して投与され得る。一態様では、癌は卵巣癌又は中皮腫である。
特定の態様では、細胞（例えばT細胞、NK細胞又はNK-T細胞）を対象に投与し、その後、血液を再採取し（又はアフェレーシスを行い）、細胞を活性化させ、活性化及び／又は増殖させた細胞を対象に再注入することが望ましい場合がある。
患者に投与される細胞数は、治療される状態の正確な性質及び患者の状態によって異なるだろう。患者への投与のための用量のスケーリングは、当技術分野において記載された許容される方法に従って行われ得る。
特定の態様では、例えばCAR又はTCRを発現する細胞（例えば、T細胞、NK細胞又はNKT細胞）の投与前に、対象に対してリンパ球除去が行われる。リンパ球除去は、メルファラン、サイトキサン（Cytoxan）、シクロホスファミド、及びフルダラビン又はリンパ球除去に適することが当業者に知られている類似の薬剤の1つ以上を投与することを含む。
併用療法
本発明による5T4標的剤、例えば5T4特異的CAR T細胞は、単独療法として、又は例えば、癌、例えば血液癌の治療のための標準的ケアと組み合わせて使用され得る。
「組み合わせて」とは、本発明による任意の態様を施与する前、それと同時、又はその後に追加の療法を施与することを指すことがある。
従って、癌の治療のための方法は、単独療法として、又は追加の抗癌剤若しくは癌の症状を軽減するための他の薬剤と組み合わせて、有効量の本発明の5T4標的剤、例えば5T4特異的CAR T細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む。
例えば、5T4標的剤は、チェックポイント遮断療法、共刺激抗体、化学療法及び／又は放射線療法、標的療法又はモノクローナル抗体療法と組み合わせて投与され得る。
一態様では、5T4標的剤は、免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤と組み合わせて投与され得る。阻害性免疫チェックポイントタンパク質の例には、限定されないが、PD-1、CTLA-4、BTLA、KIR、LAG3、TIGIT、CD155、B7H3、B7H4、VISTA及びTIM3が含まれる。活性化免疫チェックポイントタンパク質の例には、限定されないが、GITR、OX40、4-1BB、ICOS、HVEMが含まれる。免疫チェックポイントタンパク質はまた、阻害又は活性化するよう免疫反応を調節する他の免疫チェックポイントタンパク質に結合するタンパク質を指すこともある。このようなタンパク質には、限定されないが、PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、HVEM、GAL9、ICOSリガンド、OX-40リガンド、GITRリガンド、4-1BBリガンドが含まれる。
一態様では、5T4標的剤は、サイトカイン療法と組み合わせて投与され得る。サイトカイン療法には、限定されないが、IFN-α、IL-2、IFN-γ、IL-1、IL-3、GM-CSF／IL-3融合タンパク質、IL-4、-5、-7、-10、-12、-18、-21、及びTNF-α療法が含まれる。
本明細書で使用される化学療法の実体は、細胞に対して破壊的である実体を指し、即ち、当該実体は細胞の生存能力を低減させる。化学療法の実体は、細胞毒性薬であり得る。企図される化学療法剤には、限定されないが、アルキル化剤、アントラサイクリン、エポチロン、ニトロソウレア、エチレンイミン／メチルメラミン、アルキルスルホン酸塩、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ピリミジン類似体、エピポドフィロトキシン（epipodophylotoxin）、L-アスパラギナーゼ等の酵素；IFNα、IL-2、G-CSF及びGM-CSF等の生物反応修飾物質；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン等の白金配位錯体、アントラセンジオン、ヒドロキシウレア等の置換尿素、N-メチルヒドラジン（MIH）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（o,p'-DDD）及びアミノグルテチミド等の副腎皮質抑制剤；プレドニゾン及び等価物、デキサメタゾン、並びにアミノグルテチミド等の、ホルモン及び副腎皮質ステロイドアンタゴニストを含むアンタゴニスト；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール等のプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物等のエストロゲン；タモキシフェン等の抗エストロゲン剤；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン；フルタミド等の抗アンドロゲン剤、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体及びリュープロリド（leuprolide）；及びフルタミド等の非ステロイド性抗アンドロゲン剤。
非限定的な例として、一態様では、5T4標的剤は、多発性骨髄腫を治療するために使用されるプロテアソーム阻害剤であるカルフィルゾミブ（例えば、KYPROLIS（登録商標））と組み合わせて投与され得る(Siegel DS等 Blood 2012; 120:2817-2825参照）。カルフィルゾミブは、静脈内／IV注入として投与され得る。カルフィルゾミブは、多発性骨髄腫を治療するために、様々な追加の薬剤と組み合わされている。例えば、カルフィルゾミブはレナリドミド及び／又はデキサメタゾン及び／又はポマリドミドと組み合わされている。一態様では、カルフィルゾミブは、レナリドミド又はポマリドミド、デキサメタゾン、及び5T4標的剤との併用療法で投与され得る。
カルフィルゾミブはまた、パノビノスタットと組み合わされている(Berdeja JG等 Haematologica 2015; 100:670-676を参照）。一態様では、カルフィルゾミブは、パノビノスタット及び5T4標的剤との併用療法で投与される。
併用療法のための他の例示的な薬剤は、CD38（多発性骨髄腫細胞上に高度に発現される糖タンパク質）に結合するヒトモノクローナル抗体であるダラツムマブ（例えば、DARZALEX（商標））である。ダラツムマブは、多発性骨髄腫を治療するために静脈内注入により患者に投与され得る(Lokhorst HM等 N Engl J Med 2015; 373:1207-1219を参照）。
一態様では、5T4標的剤は、悪性多発性骨髄腫細胞のマーカーであるCD319又はシグナル伝達リンパ球活性化分子F7（SLAMF7）に結合するモノクローナル抗体であるエロツズマブ（例えば、EMPLICITI（商標））と組み合わされ得る。エロツズマブは、多発性骨髄腫の治療のために静脈内注入により患者に投与され得る(Zonder JA等 Blood 2012; 120: 552-559を参照）。
或いは、併用療法は、多発性骨髄腫を治療するために患者に与えられる免疫調節剤であるレナリドミド（例えば、REVLIMID（登録商標））を含み得る。
併用療法のための他の例示的な薬剤は、多発性骨髄腫及びマントル細胞リンパ腫を治療するために患者に与えられるプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブ（例えば、VELCADE（登録商標））である(Richardson PG等 N Engl J Med 2003; 348:2609-2617を参照）。ボルテゾミブは静脈注射を介して患者に投与され得る。
併用療法のための他の例示的な薬剤は、癌（特に、多発性骨髄腫、急性骨髄球性白血病、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、乳癌、並びに肺癌を含む）を治療するために使用されるアルキル化剤であるシクロホスファミド（例えば、CYTOXAN（登録商標））である。
アルキル化剤であるメルファランもまた、癌（多発性骨髄腫及び卵巣癌を含む）を治療するための併用療法で使用され得る。メルファランは、経口、注射又は注入として投与され得る。
併用療法のための他の例示的な薬剤には、多発性骨髄腫の治療に使用される免疫調節剤であるポマリドミド（例えば、POMALYST（登録商標））、及び癌（多発性骨髄腫を含む）の治療に使用されるプロテアソーム阻害剤であるイキサゾミブ（NINLARO（登録商標））が含まれる。
薬物コンジュゲート
本明細書に記述されるように、更なる態様では、本発明による5T4標的剤は、それ自体が、癌細胞、例えば血液癌細胞に、例えば毒性分子を選択的に送達する担体として作用し得る。即ち、例えば抗体／CARの特異性により、5T4を発現する細胞への毒性ペイロードの選択的送達が達成され得る。
一例として、5T4特異的抗体又はCAR/CAR T細胞の特異性は、連結された細胞毒性剤を血液細胞等の癌細胞に送達するために利用され得る。
一態様では、抗体薬物コンジュゲート又はCAR T細胞薬物コンジュゲートが使用され得る。
コンジュゲーションのための適切なコンジュゲート及び方法は当技術分野において既知である－例えば、Parslow等 Biomedicines 2016, 4:14における総説を参照されたい。
本発明は、以下、実施例によりさらに説明される。実施例は、当業者が本発明を実施するのを助ける役割を果たすこと目的としており、本発明の範囲を限定することは決して意図されていない。
［実施例1. 2E4抗体の製造及び5T4 CARコンストラクトの設計］
＜2E4抗体の製造＞
カラムクロマトグラフィー(ニッケルビーズ)を用いてCHO細胞から精製した、C末端エンテロキナーゼ切断配列、mycエピトープ、及び6ヒスチジンタグを有する、5T4の細胞外ドメインを含む組み換えタンパク質を、免疫原として用いた。Immuno-Precise(カナダ) ラピッドプライムプロトコルを利用し（3匹のマウスを免疫化後、4回迅速なブースト（rapid boost）を行った）、マウスにおいてmAbを作成した。
ドナー脾臓細胞をSP2/0骨髄腫IgGハイブリドーマと融合させた。ELISAにより、組み換えタンパク質に対するmAbをスクリーニングし、同じC末端タグを有する異なるロイシンリッチタンパク質の細胞外ドメインに対するmAbをカウンタースクリーニング（counter-screen）した。10個の上清を更なる研究のために選択した。
細胞溶解物においていくつかの上清により追加のバンドが検出されたが、すべての上清がウェスタンブロットにより組み換えヒト5T4を認識した。ウェスタンブロットにおける還元及び非還元5T4タンパク質両方の認識力を用い、4種のmAbをプロテインGカラム精製のために選択した。シークエンシング並びにウェスタンブロット及びELISAによる更なる分析により、4種のmAb各々は唯一無二であることが実証された。
2E4抗体を更なる研究のために選択した。
＜5T4 CARコンストラクト＞
EF1α-H8-4-1BB/CD3ζ 5T4コンストラクト(pRKh- EF1α-H8-4-1BB)は、図1Bに記載のように生成した；5T4-CARタンパク質をコードするコドン最適化配列(配列番号9)(H8 scFv抗原結合ドメイン、CD8ヒンジ及び膜貫通ドメイン、4-1BB共刺激ドメイン、並びにCD3ζ刺激ドメインから成る)は、デノボDNA合成により生成した。合成した5T4-CARカセットをHIV-1 GFPゲノムプラスミド(pRKHVCG)に挿入してGFP遺伝子を置換し、5T4-CAR導入遺伝子を内部サイトメガロウィルス(CMV)プロモーターの下流に配置してpRKh5T4CD8プラスミドを生じさせた。最後に、CMVプロモーターを、伸長因子1α（EF1α）プロモーターと置換してpRKh-EF1α-H8-4-1BBを産生した；EF1α配列(配列番号10)は、pEF1α-coTRAP-Puroプラスミドに由来していた。
pRKh-EF1α-H8-4-1BBプラスミドは一連の分子クローニング実験を介して構築した。方向性ライゲーション（directional ligation）を促すために、pRKHVCG及びpUC57-h5T4-CD8（pRKHVCGにも見出される制限部位に対応する2個の制限部位が両側に配置されている、5T4-CARタンパク質をコードする配列を有する）の親コンストラクトの両方を、相補的な付着末端を生む2つの異なる制限酵素で消化した。pRKHVCGベクターバックボーン及び5T4-CARをコードする断片を、ゲル電気泳動及びそれに続くゲル精製により単離した。前者の断片は自己ライゲージョンを防ぐためアルカリホスファターゼ工程で処理した。両方の線状断片を、DNAリガーゼを用いてライゲーションし、生じたpRKh5T4CD8コンストラクトを一般的なDH5α E.coli 株において伝播させた。プロモーター配列の置換は、先述と類似の方法により達成した。
EF1α-2E4-4-1BB/CD3ζ 5T4コンストラクト（pRKh- EF1α-2E4-4-1BB）は、図1Cに記載のように生成した；2E4抗原結合部分をコードする配列（配列番号11）を合成し、H8ドメイン配列を置換してpRKh- EF1α-H8-4-1BBに挿入した。
[実施例2.CAR-5T4 T細胞のin vitroでの活性 - 図2～4]
＜腫瘍細胞株：＞
調査した腫瘍細胞株は、NCI-H226(中皮腫、ATCC; Middlesex, UK)、SKOV-3 (卵巣腺癌、ATCC; Middlesex, UK)、BT20 (乳癌、ATCC; Middlesex, UK)、OVCAR-3 (卵巣腺癌、ATCC; Middlesex, UK)、LS174T (結腸直腸腺癌、ATCC; Middlesex, UK)、DLD-1 (結腸直腸、ATCC; Middlesex, UK)、及びNCI-H929 (骨髄腫、ATCC; Middlesex, UK)であった。
各細胞株を培養するために用いた培地は、以下の通りであった：NCI-H226培地: RPMI 1640 (SIGMA, DORSET, UK)、1% グルタミン(SIGMA, DORSET, UK)、1% HEPES (Gibco; Paisley, UK)、1% ピルビン酸ナトリウム(SIGMA, DORSET, UK)及び10% FBS (SeraLabs; West Sussex, UK)。 SKOV-3培地: McCoys 5a培地(Life Technologies; Carlsbad CA, US; Carlsbad CA, US)、1% グルタミン(SIGMA, DORSET, UK)、10% FBS (SeraLabs; West Sussex, UK)。BT20培地: イーグル最小必須培地(SIGMA, DORSET, UK)、10% FBS (SeraLabs; West Sussex, UK)、1% グルタミン(SIGMA, DORSET, UK)。OVCAR-3 培地: RPMI 1640 (SIGMA, DORSET, UK)、1% グルタミン(SIGMA, DORSET, UK)、1% HEPES (Gibco; Paisley, UK)、1% ピルビン酸ナトリウム(SIGMA, DORSET, UK)、1% インスリン(SIGMA, DORSET, UK)及び20% FBS (SeraLabs; West Sussex, UK)。LS174T 培地: イーグル最小必須培地(SIGMA, DORSET, UK)、10% FBS (SeraLabs; West Sussex, UK)、1% グルタミン(SIGMA, DORSET, UK)。NCI-H929: RPMI1640 (SIGMA, DORSET, UK)、10% FBS (SeraLabs; West Sussex, UK)及び1% グルタミン(SIGMA, DORSET, UK)。
細胞は、T75フラスコ中で増殖させ、＞80％のコンフルエンシーに達するまで標準的な細胞培養プロトコルに従って継代した。細胞は、インキュベーター（Panasonic; Loughborough, UK）中で、37℃及び5％ CO2で培養した。NCI-H226、SKOV-3及びNCI-H929細胞は、週2回、1:10希釈で継代した。BT20、OVCAR-3及びLS174T細胞は、週1回、同様に1:10希釈で継代した。接着細胞株をPBS（SIGMA, DORSET, UK）中で洗浄し、37℃で5分間TrypLE Express（商標）(GIBCO; Paisley, UK)を用いてフラスコから解離させ、等量の培地で中和させ、遠心分離し、適切な量の、更なる細胞培養のための、又はサイトカイン放出アッセイ若しくはWST-1アッセイに使用するための培地、又はフローサイトメトリーのためのPBS中に再懸濁した。非接着細胞株（NCI-H929）は、培養物から取り出し、遠心分離し、更なる細胞培養で使用する前に、培地又はフローサイトメトリーのためのPBS中に再懸濁した。直ぐに通常の組織培養をする場合を除き、細胞は氷上で保存した。
この通常の培養については、細胞を1:10希釈で培地に添加し、T75フラスコ中で25mLの総量とした。サイトカイン放出アッセイ及びWST-1アッセイにおいて使用した細胞は、氷上で扱い、Guava PCA (Millipore; Watford, UK)を用いて計数し、ペレット化し、それぞれ1×105細胞/ml及び1×104細胞/mlの濃度で培地中に再懸濁した。
＜PBMC及びT細胞活性化：＞
PBMCは、CTL（Bonn、Germany）から購入したか、又はCovance（Maidenhead、UK）から購入した血液から以前に生成した。T細胞は、以下からなるT細胞培地中で培養して、PBMCのバイアルから活性化させた: X-Vivo 15（Sartorius; Surrey, UK）、ヒトAB血清（Akron Biotech; Florida, US）、GlutaMax（Life Technologies; Carlsbad CA, US）、HEPES（Gibco; Paisley, UK; Paisley, UK）、N-アセチルシステイン（APP Pharmaceuticals; Illinois, US）、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA, DORSET, UK）、MEMイーグルビタミン混合（Eagle Vitamin mix）(Lonza; Slough, UK）及びrhIL-2（R&D Systems; Abingdon, UK）。簡単に説明すると、凍結したPBMCのバイアルを、37℃に設定した水浴中で穏やかに解凍することにより復活させ、細胞を予め加温した培地にゆっくりと添加した。細胞のアリコートは、Guava PCAを用いて計数した。細胞を遠心沈殿させ、5×105細胞/mlを与えるような容量の培地に再懸濁した。T細胞は、3:1のビーズ対細胞比でCD3/CD8増殖ビーズ（expansion beads）(GIBCO; Paisley, UK）を用いて、活性化した。ビーズを洗浄し、PBS中に再懸濁した後、4×106細胞及び1.2×107ビーズ及び500μl培地を24ウェルプレートに加えた。
＜T細胞の形質導入／CAR T細胞の生成＞
上述のようにT細胞活性化のためにPBMCを調製した。その後、250μlの適切に希釈したベクター、即ちCAR-T 5T4コンストラクト（H8及び2E4）を添加することにより、2回、連続した日（活性化直後の0日目、及び1日目）に、細胞に形質導入した。細胞は、感受性細胞に対するウイルス粒子の比を表す1、0.33及び0.11の感染多重度（MOI）で、ベクターを用いて形質導入した。陰性対照として、PBMCを活性化させたが、ベクターは添加しなかった。形質導入後、細胞は、5×105の濃度でMM+IL-2中で維持した。細胞を維持するために、穏やかなピペッティングによりウェルを完全に再懸濁し、Guava PCAを用いて3、6、9、10及び14日目に計数するためにアリコートを取り出した。MM+IL2を細胞に添加して、細胞を5×105細胞/mlの濃度に維持し、必要に応じて増殖培養物をT25及びT75フラスコに移した。10日目には、培地にIL-2を添加しなかった。細胞は14日目まで培養し、14日目にサイトカイン放出及び殺細胞（WST-1）アッセイにより機能性について評価した。
＜サイトカイン放出アッセイ＞
サイトカイン放出アッセイは、製造業者の使用説明書に従って行った。試験試料（7μl）を43μlの緩衝液に添加した。CBA Flex Set（BD Biosciences; Oxford, UK）をプロトコルに従って用い、CBA分析を行った。FCAP Arrayソフトウェア（BD Biosciences; Oxford, UK）上で、データを分析した。
＜WST-1/殺細胞アッセイ＞
標的細胞（NCI-H226又はLS174T）を各ウェルに添加した（平底96ウェルプレートの1×104）。T細胞を0.5:1、1:1、10:1及び30:1のE:T比で添加した。標的細胞のみ及びT細胞のみの対照もまた、調製した。細胞を、5% CO2雰囲気中、37℃で18～24時間、インキュベートした。
翌日、50μlのWST-1試薬を1:10のPBSで希釈し、細胞に添加し、630nm参照波長と440nmで吸光度プレートリーダーを用いて、毎時間プレートを読み取った。殺細胞のパーセンテージは、以下により算出した：
([実験O.D)-(対照O.D.)]/([最大O.D.)-(対照O.D.])×100
[実施例3. CAR-5T4 T細胞の特異性 - 図5]
5T4特異的モノクローナル抗体又は可溶性5T4タンパク質を腫瘍細胞株及びCAR-5T4 T細胞と共にインキュベートした遮断実験により、5T4 CARコンストラクトの特異性を決定した。両遮断薬を漸増し、IFNγ分泌に対する影響を評価した。
＜腫瘍細胞株＞
調査した腫瘍細胞株は、NCI-H226 (中皮腫、ATCC; Middlesex, UK)及びLS174T (結腸直腸腺癌、ATCC; Middlesex, UK)であった。NCI-H226細胞の培養に用いた培地は、RPMI 1640 (SIGMA, DORSET, UK)、1% グルタミン(SIGMA, DORSET, UK)、1% HEPES (Gibco; Paisley, UK)、1% ピルビン酸ナトリウム(SIGMA, DORSET, UK)及び10% FBS (SeraLabs; West Sussex, UK)であった。LS174T細胞の培養に用いた培地は、イーグル最小必須培地(SIGMA, DORSET, UK)、10% FBS (SeraLabs; West Sussex, UK)、1% グルタミン(SIGMA, DORSET, UK)であった。NCI-H929: RPMI1640 (SIGMA, DORSET, UK)、10% FBS (SeraLabs; West Sussex, UK)及び1% グルタミン(SIGMA, DORSET, UK)。
細胞を、T75フラスコ中で増殖させ、＞80％のコンフルエンシーに達するまで標準的な細胞培養プロトコルに従って継代した。細胞は、インキュベーター（Panasonic; Loughborough, UK）中で、37℃及び5％ CO2で培養した。接着細胞株は、PBS（SIGMA, DORSET, UK）中で洗浄し、37℃で5分間TrypLE Express（商標）(GIBCO; Paisley, UK)を用いてフラスコから解離させ、等量の培地で中和させ、遠心分離し、適切な量の、更なる細胞培養のための、又はサイトカイン放出アッセイ若しくはWST-1（殺細胞）アッセイに使用するための培地、又はフローサイトメトリーのためのPBS中に再懸濁した。
＜PBMC及びT細胞活性化:＞
PBMCは、CTL（Bonn、Germany）から購入したか、又はCovance（Maidenhead、UK）から購入した血液から以前に生成した。T細胞は、以下からなるT細胞培地中で培養して、PBMCのバイアルから活性化させた: X-Vivo 15（Sartorius; Surrey, UK）、ヒトAB血清（Akron Biotech; Florida, US）、GlutaMax（Life Technologies; Carlsbad CA, US）、HEPES（Gibco; Paisley, UK; Paisley, UK）、N-アセチルシステイン（APP Pharmaceuticals; Illinois, US）、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA, DORSET, UK）、MEMイーグルビタミン混合 (Lonza; Slough, UK）及びrhIL-2（R&D Systems; Abingdon, UK）。簡単に説明すると、凍結したPBMCのバイアルを、37℃に設定した水浴中で穏やかに解凍することにより復活させ、細胞を予め加温した培地にゆっくりと添加した。細胞のアリコートは、Guava PCAを用いて計数した。細胞を遠心沈殿させ、5×105細胞/mlを与えるような容量の培地に再懸濁した。T細胞は、3:1のビーズ対細胞比でCD3/CD8増殖ビーズ (GIBCO; Paisley, UK）を用いて、活性化した。ビーズを洗浄し、PBS中に再懸濁した後、4×106細胞及び1.2×107ビーズ及び500μl培地を24ウェルプレートに加えた。
＜T細胞の形質導入／CAR T細胞の生成＞
上述のようにT細胞活性化のためにPBMCを調製した。その後、250μlの適切に希釈したベクター、即ちCAR-T 5T4コンストラクト（H8及び2E4）を添加することにより、2回、連続した日（活性化直後の0日目、及び1日目）に、細胞に形質導入した。細胞は、感受性細胞に対するウイルス粒子の比を表す1、0.33及び0.11の感染多重度（MOI）で、ベクターを用いて形質導入した。陰性対照として、PBMCを活性化させたが、ベクターは添加しなかった。形質導入後、細胞は、5×105の濃度でMM+IL-2中で維持した。細胞を維持するために、穏やかなピペッティングによりウェルを完全に再懸濁し、Guava PCAを用いて3、6、9、10及び14日目に計数するためにアリコートを取り出した。MM+IL2を細胞に添加して、細胞を5×105細胞/mlの濃度に維持し、必要に応じて増殖培養物をT25及びT75フラスコに移した。10日目には、培地にIL-2を添加しなかった。細胞は14日目まで培養し、14日目にサイトカイン放出及び殺細胞（WST-1）アッセイにより機能性について評価した。
＜サイトカイン放出アッセイ:＞
遮断なし
T細胞及び標的細胞は、WST-1殺細胞アッセイと同様に調整した。WST-1を添加する前に、上清のアリコート（50μL）を取り、別のプレートに移し、サイトカイン放出アッセイによる分析前に-20℃で保存した。
5T4タンパク質での遮断
T細胞を、1時間インキュベートする前に、連続希釈した組換え5T4タンパク質と共にインキュベートした。丸底96ウェルプレート中に1:1のE:T比でT細胞を腫瘍細胞に添加し（1×105細胞）、5% CO2雰囲気中、37℃で18～24時間インキュベートした後、上清を取って、別のプレートに移し、サイトカイン放出アッセイによる分析前に-20℃で保存した。
5T4特異的モノクローナル抗体2E4での遮断
腫瘍細胞NCI-H226及びLS174Tを、200μg/mlの開始濃度を有する抗5T4抗体2E4の連続希釈液（1:10）と共に1時間インキュベートした。丸底96ウェルプレート中で1:1のE:T比で、2E4抗体と共にインキュベートした腫瘍細胞にT細胞を添加し（1×105細胞）、5％ CO2雰囲気中、37℃で18～24時間インキュベートした後、上清を取って別のプレートに移し、サイトカイン放出アッセイによる分析前に-20℃で保存した。
サイトカイン放出アッセイは、製造業者の使用説明書に従って行った。試験試料（7μl）を43μlの緩衝液に添加した。CBA Flex Set（BD Biosciences; Oxford, UK）をプロトコルに従って用い、CBA分析を行った。FCAP Arrayソフトウェア（BD Biosciences; Oxford, UK）上で、データを分析した。
[実施例4. 癌患者由来のT細胞の形質導入及びCAR-T細胞の機能性]
本研究では、以下の組換えレンチウイルスベクターを用いた：
試験物質ベクターを、20mM Tris、100mM NaCl、10mg/mLスクロース、10mg/mLマンニトール、pH 7.3を含有するTSSM製剤緩衝液中に懸濁した。TSSM緩衝液はOxford BioMedica (UK) Ltdにより供給され、凍結保存した。
本研究は、以下の4つのパートに分けた：
1. 卵巣癌を有する約15人の患者からの適合腫瘍（matched tumour）及び末梢血単核細胞の採取
2. 免疫組織化学を用いた、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）卵巣腫瘍切片上の5T4発現の評価
3. フローサイトメトリーを用いた、分離された（disaggregated）腫瘍細胞上の5T4発現の評価
4. サイトカイン放出により測定される、卵巣癌細胞と共培養した場合のCAR-T細胞の機能性の評価（図6で取り上げる）
＜適合腫瘍及び血液試料の採取＞
英国マンチェスターのSt Mary's Hospitalで卵巣癌の手術を受けた患者から固形腫瘍生検を採取した。試料は、適切な倫理的承認（Ref: 14/NW/1260）及びインフォームドコンセントを得て、中央マンチェスター大学病院NHS Foundation Trust Biobankを通して採取した。固形腫瘍生検は、MACS組織保存溶液（Miltenyi Biotec, Germany）を含有する滅菌物（sterile universal）中に採取し、処理のために検査室に直接輸送するか、又は処理前最大24時間、4℃で保存した。EDTA (BD Biosciences, Oxford, UK）を含有するBD Vacutainer採血管に20～30mlの血液を採取した。血液試料は室温で保存し、採取後24時間以内に処理した。分析に利用可能な試料を表1に挙げる。
分離された腫瘍細胞における5T4発現の評価
腫瘍分離（Tumour disaggregation）
製造業者のプロトコルに従って市販の機械的/酵素的分解キット（GentleMACS, Miltenyi Biotec, Germany）を用い、卵巣腫瘍試料を解離させ、単細胞懸濁液とした。簡単に説明すると、腫瘍生検を滅菌メスを用いて2～4mm3の断片に切断し、RPMI-1640（Lonza, Slough, UK）並びに適切な量の酵素H、R及びA（ヒト腫瘍分離キット、Miltenyi Biotec, Germany）を有するCチューブ（Miltenyi Biotec, Germany）に移した。次に、CチューブをGentleMACS分離装置（dissociator）上に上下逆に置き、36秒間の機械的分離プログラムに3回かけた（h_tumour_01、h_tumour_02及びh_tumour_03）。これには、1回目及び2回目の分離プログラム後に行ったMACSmixチューブ回転装置（tube rotator）(Miltenyi Biotec, Germany）を用いた連続回転下37℃での2回の30分インキュベーションを挟んだ。分離後、懸濁液を100μmストレーナーに通して、20mlのT細胞培地を有する50mlファルコンに入れ、400Gで5分間遠心分離した。上清を廃棄し、残った細胞ペレットを完全に再懸濁し、細胞を計数した。次に、細胞を90% FCS/10% DMSO中で1～2×107細胞/mlの濃度で凍結保存した。
フローサイトメトリー
腫瘍分離から得られた細胞は、1×106細胞/mlの濃度でT細胞培地中に再懸濁した。細胞懸濁液の100μlのアリコート（1×105細胞）を、96ウェルU底プレート上の適切な数のウェルに移した。細胞をFACS緩衝液中で1回洗浄し、暗所、4℃で30分間、FACS緩衝液中の1:100のEpCAM抗体（PE、クローン9C4、Biolegend）及び5T4抗体（クローンH8及び2E4）で染色した。この後、細胞をFACS緩衝液中で1回洗浄し、次いでPBS中の1%パラホルムアルデヒド（PFA)（Sigma-Aldrich, UK）200μl中に再懸濁した。固定細胞をFACSチューブに移した。LSR Fortessa（BD Biosciences, UK）上で分析を行った。データは、FlowJo v. 7.6.2ソフトウェア(Tree Star Inc, Ashland, OR）を用いて分析した。補正（Compensation）は、単一の染色対照を用いて手動で行った。
図8は、試験した腫瘍分離物（disaggregate）の大部分が、高いパーセンテージ（＞50%）の5T4陽性細胞を含有していたことを示す。このグラフはまた、H8又は2E4 5T4特異的モノクローナル抗体での腫瘍分離物の染色が、同等の結果を生じることを示す。
4.3. T細胞の形質導入及びCAR-T機能性
分量調整
（上述のように）ベクターは、TSSM製剤緩衝液中に予め製剤化して供給した。ベクターのバイアルをウェットアイス上で解凍した。必要に応じて、ベクターのバイアルを室温で短時間（数分）解凍した。解凍したら、バイアルをマイクロフュージ（microfuge）内で短時間パルスし（5～10秒、13,000rpm）、確実にすべてのベクター液（vector article）を蓋/キャップの内部から回収し、約3回上下にピペッティングして穏やかに混合することにより懸濁した。解凍したベクターは、解凍後ウェットアイス上で維持し、凍結保存から取り出した後3時間以内に使用した。ベクターのすべての希釈液を、細胞培養培地中に作製した。
T細胞の形質導入及び増殖
卵巣癌を有する患者からフィコール密度遠心分離により末梢血単核細胞（PBMC）を採取し、アリコートで凍結した。アリコートを解凍した後、PBMC由来のT細胞をネガティブ単離（negative Isolation）(Miltenyl Blotec)により濃縮し、適切なレンチウイルスベクター、抗CD3/CD28ダイナビーズ（Invitrogen, UK）及びIL-2（100IU/mL; Novartis）と混合した。必要に応じて新たな培地及びIL-2を添加しながら（一般的には2～3日毎）、その後7～14日間にわたって、T細胞の数を増加させた。ダイナビーズは、磁気分離により3～5日後に培養物から除去した。1～7日目は300IU/mLのIL2を有していたが、残りの日については100IU/mLに減量した。培養終了時に、遠心分離により細胞を採取し、フィコール密度遠心分離により死細胞を除去し、トリパンブルー排除及び血球計計数値により生存細胞数を決定した。
図7に示されるように、H8又は2E4 CARコンストラクトを使用した場合、卵巣癌患者に由来するPBMCの形質導入レベルは、健常ドナーの形質導入と同等である。
CAR-T細胞機能性の評価
in vitro機能性アッセイには、96ウェルプレートの個々のウェルにおける、200μLの培地中の1:1の比率でのCAR-T細胞集団と適合標的腫瘍細胞との共培養が含まれた。同時に、CAR-T細胞を単独で（陰性対照）、並びに50ng/mLのPMA及び1μg/mLのロノマイシン（lonomycin）とともに（陽性対照）、培養した。37℃で24時間インキュベートした後、上清を採取し、サイトカイン産生を測定した。製造業者の使用説明書に従ってIFNγ及びIL-2 ELISAキット（いずれもDiaclone, France）を用いて、IFNγ及びIL-2産生を測定する。
図9は、患者のCAR-T 5T4細胞が、SKOV-3及びOVCAR-3細胞株、並びに患者自身の（自己）腫瘍分離物との共培養に反応してIFNγを分泌することを示す。
［実施例5. 卵巣癌モデルに対するin vivo有効性］
以下の実施例は、NSGマウスで確立されたSKOV-3腫瘍に対する5T4特異的CARの試験に焦点を当てた。NHSBTから得たバフィーコートを末梢血単核細胞（PBMC）の供給源として用いた。CD3+ T細胞をネガティブ単離(Miltenyi Biotec)により単離し、ダイナビーズで活性化し、予め試験した量の、抗5T4(H8).CD28.CD3ζ (5T4.CD28ζ) CAR又は抗5T4(H8).4-1BB.CD3ζ (5T4.4-1BBζ) CARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。次いで、形質導入した細胞をin vitroで増殖させた後、CAR発現及びin vitro機能について分析し、その後、確立したSKOV-3.Luc腫瘍を有するNSGマウスに静脈内注入した。以下、これについてさらに詳細に述べる。
CAR T細胞のin vitro生成。
T細胞の供給源として、バフィーコート（BC）92及び102を用いた。BC92からT細胞を単離すると、CD14+骨髄細胞及びCD19+ B細胞の頻度が減少する（それぞれ、14から2.4%、12.3から0.7%）と共に、CD3+ T細胞頻度が53から83%に増大した。BC108からでは、CD14+骨髄細胞及びCD19+ B細胞は各々1%未満の相対頻度に減少する（CD14+ 28.3%から0.9%; CD19+ 22.7%から0.5%）とともに、CD3+ T細胞は36.6%から81.5%に濃縮された。
約1～1.5×106個のCD3+ T細胞を用いて、ダイナルビーズ（1:1の比率）、IL-2（100IU/mL）及びレンチウイルスベクターを含む最初の形質導入培養を確立した。7日後、ダイナルビーズを培養物から除去し、細胞を計数し、約0.5×106個の細胞を2週間の迅速な増殖（3人の同種ドナー由来の照射フィーダー細胞、抗CD3、抗CD28及び300IU/mLのIL-2（培養7日後に100IU/mLに減量する）との培養）に使用した。この時点で、T細胞を回収し、フィコールし、洗浄し、計数した。いずれの場合も、各培養（モック、5T4.CD28ζ、5T4.4-1BBζ）について、最低でも200倍の増殖が観察され、合計＞108個の細胞が生成された。
5T4 CAR T細胞のin vivo試験
5T4 CARの最初のin vivo試験は、他のCAR / TCRモデルについて我々のグループで以前に使用された設計に従った。簡潔に説明すると、約2.5×106個のSKOV3.Luc細胞をレシピエントNSG（NOD/SCID IL-2Rγ-/-）マウスに腹腔内経路により注射し、7日後にCAR-T細胞をIV経路により注入した（合計約2×107細胞）。6日目（T細胞移植の1日前）、及びその後、マウスを屠殺する約60日目まで定期的な時間に、Brukerシステムにより動物をイメージングした。この時点を選択したのは、我々の以前の研究により、ヒトT細胞がマウス組織抗原を認識する結果として、ヒトT細胞移植から約50～60日後に、NSGマウスが異種移植片対宿主疾患（xGvHD）の症状を発症し始めることが示されているためである。
ブルカーイメージングにより、食塩水又は同一のバフィーコート由来の2×107個の対照非形質導入モックT細胞が投与されたマウスが、発光レベルの増大を有することが明確に示された。これは、食塩水及びモックT細胞処理動物がすべて、腫瘍投与後45日以内に腫瘍で死亡したことと相関していた。1組の試料では、どちらの5T4 CAR-T細胞群についても、発光の増大は観察されず、これらのマウスはすべて60日目の終了時まで生存し、腫瘍の証拠は存在しなかった。別の1組の試料では、5T4.4-1BBζ CAR-T細胞が投与されたマウスでは、5T4.CD28ζ CAR-T細胞と比較して、発光のわずかな増大があるように見え、5T4.4-1BBζ腫瘍群の1匹の動物は、60日目の終了時前に腫瘍で死亡した。5T4.CD28ζ CAR処理群には腫瘍で死亡した動物はいなかった。
図10は、食塩水又はモック形質導入T細胞が投与された対照群と比較した、5T4 CAR T細胞で処理したNSGマウスの生存率を示す。
全ての実験の生存率を合わせると、どちらの5T4.CAR T細胞処理群も、食塩水及びモック処理動物と比較した場合、生存率において非常に有意な差を有した(p＜0.001、ログランク検定）。
［実施例6. 卵巣癌モデルに対する最小用量及び送達経路の要件］
本研究は、（上に示すように）卵巣（SKOV-3）腫瘍細胞株を有するNSGマウスモデルにおいて有効性を実証するのに必要な5T4-CAR形質導入T細胞の最小用量を推定するために設計した。
さらに、本研究はまた、CAR-T細胞送達の静脈内経路を腹腔内経路と比較した。
形質導入
本研究では以下のベクターを用いた
形質導入は、上述のプロトコルと同様に行った。簡潔に説明すると、末梢血単核細胞（PBMC）を、正常な健常ドナー(NHS BTから供給されたバフィーコーン（buffy cone）又はボランティアからの献血）からフィコール密度遠心分離により回収し、アリコートで凍結した。アリコートを解凍した後、PBMC由来のT細胞をネガティブ単離(Miltenyl Blotec)により濃縮し、適切なレンチウイルスベクター、抗CD3/CD28ダイナビーズ（Invitrogen, UK）及びIL-2（100IU/mL; Novartis）と混合した。必要に応じて新たな培地及びIL-2を添加しながら（一般的には2～3日毎）、その後7～14日間にわたって、T細胞を増殖させた。ダイナビーズは、磁気分離により3～5日後に培養物から除去した。より多数のT細胞が必要とされる場合、迅速な増殖プロトコルにより、照射フィーダー細胞（凍結した同種NHSBTバフィーコーン由来の3つのドナーPBMCがプールされ、放射線照射される（25Gy、Paterson Building X線源））を100フィーダー細胞:1 CART細胞の比でCART細胞と共に培養し、14日間1日おきにIL-2を供給しながら30ng/mlの抗CD3（OKT3; オルソクローン（orthoclone）, Janssen Cilag)及びCD28（R&D systems）抗体並びにIL-2（Chiron, Amsterdam）で有糸分裂を促進するように刺激した。1～7日目は300IU/mLのIL2とし、残りの日については100IU/mLに減量した。培養終了時に、遠心分離により細胞を採取し、フィコール密度遠心分離により死細胞を除去し、トリパンブルー排除及び血球計計数値により生存細胞数を決定した。
最小用量研究群
最小用量を評価するための研究プロトコル
1. 0日目: 100μLの食塩水中で腹腔内（IP）に2.5×106個のSKOV-3 Luc細胞を注射。
2. 7日目: 100μLの食塩水中で静脈内（IV）経路により5T4 CAR-T細胞を注入（用量については上表を参照されたい；対照動物には2×107個のモック形質導入細胞及び食塩水のみ投与）。
3. 6、13、20、27、34、41及び48日目:Luminaシステムを用いた腫瘍のIVISイメージング。
4. 14、21、28及び60日目:T細胞生着を分析するために尾部出血を採取。
60日目:実験終了時。可能であれば、腫瘍を発生した動物から組織を採取する。
投与経路研究群
投与経路を評価するための研究プロトコル
1. 0日目: 1001-11食塩水中でi.pで2.5×106個のSKOV-3 Luc細胞を注射。
2. 7日目: 腹腔内（i.p.）又はi.v.経路により5T4 CART細胞を注入（用量の詳細については表3を参照されたい;対照動物には2×107個のモック形質導入細胞及び食塩水のみ投与）。
3. 6、13、20、27、34、41及び48日目:Luminaシステムを用いた腫瘍のIVISイメージング。
4. 14、21、28及び60日目:T細胞生着を分析するために尾部出血を採取。
5. 60日目: 5T4発現を決定するため、また5T4 CARを調べるために組織を採取及びIHCに利用。末端出血を採取し、5T4 CAR-T細胞についてフローサイトメトリーにより分析。CAR-T細胞が十分な数まで存在する場合、生着したCAR-T細胞の機能のin vitro評価は、サイトカイン産生について5T4+及び5T4-標的細胞とのin vitro共培養により評価される（培養上清のELISA又は細胞内フローサイトメトリーによる）。
最小有効用量についての結果
本実験において、SKOV3.Luc腫瘍を有するNSGマウスは、2.2×105個のCAR-T細胞の用量に相当する0.1×107個のT細胞の用量まで5T4.CD28ζ CAR-T細胞を投与することにより、腫瘍成長に対し効果的に保護されたことが、生物発光から明らかであった。5T4.4-1BBζ CART細胞群の全マウスが実験終了時点までに腫瘍を生じたこともまた、明らかであった。
マウスの生存期間中央値は、5T4.CD28ζ CART細胞群では最低T細胞用量で95日であり、0.3×107個の5T4.CD28ζ CART細胞群では非腫瘍関連事象の影響を受けていたが86日であったのに対し、食塩水群及びモックT細胞群では両方とも56日であった。残りの5T4.CD28ζ CART細胞群についての生存期間中央値は、これらの実験群各々において生存率が高かったために、決定することができなかった（図11）。これに対して、最大の5T4.4-1BBζ T細胞用量（7.6×105個のCAR-T細胞に相当する107個のT細胞）は、対照に対し生存レベルの改善を示し、116日の生存期間中央値が達成され、1匹の動物が生き続けていたが、実験終了時に重大な腫瘍量を有していた。腫瘍成長の遅延は、0.3×107個のT細胞群（2.3×105個のCART細胞;生存期間中央値78日）で観察されたが、2つの最も低いCAR-T細胞群（7.6×104個のCAR-T細胞に相当する0.1×107個の全細胞、及び2.3×104個のCAR-T細胞に相当する0.03×107個の全細胞）では効果的な抗腫瘍反応は観察されなかった。
総じて、この実験は、わずか2.2×105個の5T4.CD28ζ CAR-T細胞が、有意なin vivoでの抗腫瘍効果を与えることを実証した。確立されたSKOV-3腫瘍を有するマウスの生存は、7.6×105個の5T4.4-1BBζ CAR-T細胞での治療によって増強されたが、この用量のCART細胞は、この特定の実験では全ての腫瘍を根絶することはできなかった。
投与経路についての結果
生物発光画像（図12）は、IV又はIP経路により高用量の5T4.CD28ζCAR-T細胞（6.5×105個のCAR+ T細胞に相当する1×107個の総T細胞）を投与したマウスでは、SKOV3-Luc腫瘍成長が制御されることを示した。106個の5T4.CD28ζ CAR-T 細胞（6.5×104個のCAR+ T 細胞に相当）を投与したIV及びIP処理動物の両方で、明らかな腫瘍成長の遅延があったが、腫瘍はこれらの動物で発生し、実験終了前に各群で死をもたらした（6.5×105個のCAR+ T 細胞に相当する1×107個の総T細胞）。5T4.4-1BBζ CAR-T細胞を投与した動物については、最大用量のCAR-T細胞で腫瘍成長に対する保護のレベルの低下があり、すべての動物で腫瘍成長を防ぐことはできなかった（2.6×105個のCAR+ T細胞に相当する1×107個の総T細胞）。対照動物はすべて74日以内に腫瘍成長で死亡した。
群を合わせての発光分析は、いずれの経路によっても与えられる107個の5T4.CD28ζ CAR-T細胞の抗腫瘍効果を明確に示し、28日目まではIP及びIV両方の106個の5T4.CD28ζ CAR-T細胞群における腫瘍成長のレベルは同等に見えるが、106個の5T4.CD28ζ CAR-T細胞の局所的なIP注入による一過性の反応を示唆する。
重要なことに、すべての5T4.CD28ζ CAR T細胞群は、対照群と比較して統計学的に有意な腫瘍成長の程度を示したが、治療群間に統計学的差異は見られず、これはこの原理証明実験における群サイズが小さいことに起因する可能性が最も高かった。対照的に、最大用量の5T4.4-1BBζ CAR-T細胞のみがSKOV-3-Luc腫瘍成長に有意な効果を有し、28日目までの腫瘍成長の証拠の前約3週間、腫瘍成長は明らかに低減した。しかし、個々の腫瘍成長曲線は、腫瘍成長が制御された集団全体と比較して、少し複雑な話を描いており、実際、2匹の動物ではより後の時点で低下し、1匹の動物で明らかに腫瘍を生じ、それにより約80日目に淘汰された。CD28に基づくCARの比較的迅速な抗腫瘍活性と比較した、4-1BBζ CAR活性のこの遅発性抗腫瘍動態は、Sadelain研究室からの最近の出版物に記載されている（Zhao等(2015) Cancer Cell 28(4): 415-428）。
CD28ζに基づくCARにより媒介される抗腫瘍効果のこれらの観察は、対照動物よりも改善された生存につながった。一方、106個の5T4.4-1BBζ IPのみは、対照群に対して有意な生存の改善を示したが、より高い用量のIP群では、1匹の動物の損失が本実験における生存分析に影響を与えた。
総じて、本研究は、IP又はIV投与経路により注入されたCAR-T細胞が、同等の相対的有効性を示すことを示唆する。
[実施例7. H8及び2E4 α-5T4抗体を有するCAR-T細胞間の比較]
本研究は、SKOV-3卵巣癌モデルにおいて、異なる5T4 scFvを用いるコンストラクト（EF1α-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB又はEF1α-2E4-CAR-CD3ζ/4-1BB）を比較した場合、優れた有効性の証拠があるか否かを判定するために行った。
本研究において用いたベクターを、以下に示す
T細胞形質導入は、上述のように行った。
SKOV-3/NSG腫瘍モデルの処理群
結果
各細胞集団の5T4特異的反応は、SKOV-3腫瘍細胞との共培養により評価した。すべての5T4-CAR T細胞集団は、モック形質導入T細胞のサイトカイン産生のバックグラウンドレベルを上回るIFNγ及びIL-2を産生した。さらに、EF1αプロモーターを含有するコンストラクトは、CMVプロモーターと比較してより高いサイトカインレベルを生じるように見えた。しかし、CMV群についてのフェノタイピングデータが欠如しているため、CMV群ではCAR+ T細胞数がEF1α群と比較して少なく、従ってサイトカイン放出が低いことを説明するという可能性を除外することはできない。H8及び2E4コンストラクトの比較については、同じ説明は成り立たず、2E4形質導入T細胞のパーセンテージ（29%）はH8コンストラクト（12.9%）よりも高いが、サイトカイン分泌のレベルは低い。
続いて、SKOV-3細胞チャレンジに対する5T4 CAR-T細胞の有効性の評価を、NSGマウスにおいてin vivoで試験した（上記の処理群）。SKOV3腫瘍負荷が7日目（CAR-T細胞投与日）に群間で同等であり、腫瘍成長の遅延はEF1α-2E4-CAR-CD3ζ/4-1BB (2E4-EF1α）及びEF1α-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB (H8-EF1α）処理動物では見られるが、CMV-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB群では見られないことが、生物発光により示された。
総じて、図13で取り上げるように、EF1α-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB T細胞では、EF1α-2E4-CAR-CD3ζ/4-1BB T細胞と比較して、生存が統計学的に有意に増大した（P=0.008、ログランク、Mantel-Cox検定）。表5に報告した形質導入効率に基づき、107個の標的用量のT細胞は、EF1α-2E4-CAR-CD3ζ/4-1BBで形質導入された2.9×106個のCAR+細胞、及びEF1α-H8-CAR-CD3ζ/4-1BBで形質導入された1.29×106個のCAR+細胞を含有した。従って、H8コンストラクトで見られた優れた有効性は、CAR+ T細胞用量のみに基づいて予測されるものではなく、このモデルではコンストラクト自体が2E4-CAR-CD3ζ/4-1BB等価物よりも強力であることが示唆された。
[実施例8：骨髄腫癌モデルに対するin vivo有効性]
骨髄腫細胞株に対する5T4 CAR-T細胞の有効性を評価するための処理群
結果
上表に詳述したように、NSGマウスに、I.P.又はI.V.投与経路を介して2×106個のNCI-H929細胞をチャレンジした。腫瘍チャレンジの7日後、I.V.投与経路を介して1×107個のCAR-T細胞でマウスを処理した。形質導入T細胞の表現型に基づき、EF1α-H8-CAR-CD3ζ/4-1BBで形質導入した5.98×106個の用量のCAR+T細胞が送達され、EF1α-2E4-CAR-CD3ζ/4-1BBで形質導入した3.86×106個のCAR+T細胞が送達された。
NCI-H929骨髄腫細胞株（低レベルの5T4を発現する）でのIVチャレンジ後、EF1α-H8-CAR-CD3ζ/4-1BB形質導入T細胞で処理したマウスは、モック形質導入T細胞又はEF1α-2E4-CAR-CD3ζ/4-1BB形質導入T細胞で処理した動物と比較して、統計学的に有意な生存の改善を示した（それぞれP=0.0018及びP=0.034;図14参照）。
[実施例9-骨髄腫細胞における5T4の発現]
Oxford BioMedicaの抗5T4 H8モノクローナル抗体を用いたFACSにより5T4発現を調査し、以下の方法に従ってR&D Systemsの抗5T4抗体を用いて免疫組織化学を行った：
＜フローサイトメトリーによる5T4発現の評価＞
腫瘍細胞フローサイトメトリーに用いた抗体は抗5T4 H8マウスモノクローナル抗体であった；これは直接PEがコンジュゲートした抗体として用いた。抗体を調整して、腫瘍細胞株上の5T4の細胞表面発現を検出するための最適濃度を決定した。使用した濃度は25μg/mlから0.5μg/mlに至るまでの範囲であった。抗体は、FACS緩衝液(BD Biosciences; Oxford, UK）中で希釈した。マウスIgG1アイソタイプ対照(BD; Oxford, UK;必要に応じてコンジュゲートした）を陰性対照として用いた。
細胞を計数後、PBS中に再懸濁し、1×106細胞/mlの濃度とした。500μlの細胞懸濁液を各FACSチューブに添加し、4mlの総量でPBS中で細胞を洗浄した。次に希釈した抗体をペレット化した細胞に添加し、+4℃で30分間インキュベートした。二次抗体を添加する場合、上述のように細胞をPBS中で洗浄し、抗体を添加し、細胞を+4℃で30分間インキュベートした。その後、細胞を1mlのPBS中で再度洗浄し、Cytofix（BD Biosciences; Oxford, UK）で固定した。データをBD FACSVerse（BD Biosciences; Oxford, UK）上で取得し、FACSuiteソフトウェア(BD Biosciences; Oxford, UK）上で解析した。
5T4染色に最適な抗体濃度は2.5μg/mLであることが見出された;その後の実験すべてにおいてこの濃度を使用した。
＜免疫組織化学による5T4発現の評価＞
・FFPE切片を、100%キシレン中で3回、毎回5分間洗浄することにより脱蝋した。
・FFPE切片を、100%、92%及び70%エタノール中でそれぞれ5分間洗浄することにより再水和した。
・次に切片をdH2O中に5分間置いた。
・まず、加熱した水浴中で95℃で30分間、1×抗原回復溶液（Dako）中で、次に室温で20分間、新たな1×抗原回復溶液中で、切片をインキュベートすることにより、抗原回復を行った。
・次に切片をdH2O中に5分間置いた。
・切片を、室温で1時間、ブロッキング溶液（1% BSA及び2% FBSを含むPBS）中でブロッキングした。
・ブロッキング緩衝液を除去した。プロトコルに記載されている洗浄の最大回数及び長さを用い、製造業者の使用説明書に従って、Dako増幅キット（amplification kit）を使用した。
・5T4抗体(R&D)を25μg/mlとして用い、濃度をIgG1対照（ebioscience）と合わせた。
・次に、切片をヘマトキシリンで1分間対比染色し、次にdH2O中で3回、毎回5分間洗浄した。
・切片を、70%、92%及び100%エタノール中でそれぞれ5分間洗浄することにより脱水した。
・切片を、100%キシレン中で3回、毎回5分間洗浄した。
・切片をDPXと共に固定した。
・次に、Miraxスキャナーを用いて切片をスキャンし、Panoramic Viewerソフトウェアを用いて画像を処理した。
FACSの結果は、図15に示す。試験した5種類の多発性骨髄腫細胞株のうち3種類において、FACSにより5T4の発現が検出された：骨髄腫細胞株JJN3、RPMI-8229及びH929が5T4発現について陽性であった。U266及びTHEIL細胞株はFACSにより陰性であった。陽性対照としてMFC7乳癌細胞を用いた。
免疫組織化学染色を用いて、JJN3、RPMI-8226及びH929骨髄腫細胞株において5T4発現を検出した。H929は上述の研究で使用した。
結果を図16に示す。図16A及びBは、それぞれ、陰性対照（5T4について染色されたCHO細胞）及び陽性対照（5T4を安定に発現し、5T4発現について染色されたCHO細胞）を表す。図16Cは、5T4発現について染色されたMCF7乳癌細胞を示す。図16Dは、5T4発現について染色されたH929骨髄腫細胞を示す。
[実施例10-ヒト骨髄腫試料における5T4の発現]
以下の方法に従って、R&D Systemsの抗5T4抗体を用いた免疫組織化学により、患者から採取された骨髄腫試料における5T4発現を調査した。
Leicaミクロトームを用いて、結腸、胎盤及び多発性骨髄腫のFFPEブロックからの切片（4μm）を調製した。使用した試薬はすべて、他に記載されない限り、EnVision（商標）FLEX+ キット（Dako、K8012）の一部であった。
Envision（商標）FLEX標的回復液（Target Retrieval Solution）を用いて、Dako PT Linkチャンバーにおいて、97℃で20分間、pH6.1で、切片を抗原回復に供した。pH 6.1での抗原回復後、切片を5分間Envision Flex洗浄緩衝液(pH 7.6、Dako、#K8007）中に置き、その後Dako Autostainer Plusにかけた。次に、切片をEnvision Flexペルオキシダーゼブロッキング試薬と共に5分間インキュベートし、次にFlex洗浄緩衝液で2回洗浄した。続いて、切片を無血清タンパク質ブロック試薬（Dako、# X0909）で10分間インキュベートし、これをエアジェットにより除去した。
一次抗体と共に、又は一次抗体の非存在下で30分間、全切片をインキュベートした。抗5T4抗体は3.125μg/mlで加え、濃度及び種を一致させた非免疫マウスIgG1をアイソタイプ対照抗体として用いた。アッセイ試薬は、パンサイトケラチン（PCK）に対する抗体と共に結腸の切片をインキュベートすることにより検証した。
一次抗体と共にインキュベートした後、切片をFlex洗浄緩衝液で2回洗浄し、Flex HRPポリマーと共に20分間インキュベートし、次いでFlex洗浄緩衝液で2回洗浄した。次に、全切片をジアミノベンジジン（DAB）基質と共に10分間インキュベートし、次いで蒸留水で洗浄した。
切片をヘマトキシリンで対比染色し、上昇系列のエタノール（90～99%）中で脱水し、キシレンを3回交換して透明にし、DePeX下でカバーガラスをした。5T4の免疫反応性を評価するために、研究スタッフ及び病理専門医（consultant pathologist）により、デジタル画像がAperio ScanScope AT Turboデジタルスキャナーを用いて撮影され、分析された。
5T4発現について評価した16個の試料のうち2個は、所々弱い5T4免疫反応性の骨髄腫細胞を示した。1つの試料は弱～中程度の免疫染色を示し、4番目の試料は腫瘍細胞の細胞質内及び細胞膜上に中程度の免疫染色を示した。総じて、4個の試料は5T4免疫反応性であり（図17）、残りの12個の試料は5T4について陰性であり、5T4についての陽性率は25%であることが示された。
[実施例11-血液癌における5T4の発現]
材料及び方法
＜血液学的悪性腫瘍上の5T4発現の評価＞
血液学的悪性腫瘍上の5T4発現は、以下に記載するようにFACS装置を用いたフローサイトメトリーにより評価した。
＜液性腫瘍試料＞
以下の血液学的悪性腫瘍を有する患者から、骨髄細胞又は末梢血単核細胞（PBMC）の試料を選択した：
i. 多発性骨髄腫、
ii. 慢性骨髄性白血病（CML）
iii. 慢性リンパ球性白血病（CLL）
iv. 急性骨髄性白血病（AML）
v. B細胞急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）
vi. T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）
vii. 急性前骨髄球性骨髄性白血病（APML）。
これらの試料は、Tissue Solutions Ltd.、Histologix Ltd.、及びマンチェスター癌研究センター（Manchester Cancer Research Centre、MCRC)バイオバンクから入手した。
＜血液学的悪性腫瘍上の5T4発現の評価:染色プロトコル及びゲーティング戦略（Gating Strategy）＞
細胞のバイアルを解凍し、10% FBS、5mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン/100μg/mLストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地中に再懸濁した。この後、細胞を洗浄し、PBS中に再懸濁した。細胞を、分析する試料に関連する数のFACSチューブに、均等に分けた。その後、製造業者のプロトコルに従ってZombie Aqua（商標）と共に細胞をインキュベートした。インキュベーション後、細胞をBD FACS染色緩衝液（Stain Buffer）(カタログ番号554656）中で洗浄した。すべての患者サンプルをAPSから得た特注のコンジュゲート5T4-PE抗体を用いて染色し、以下の各セクションに記載の種々の腫瘍マーカーと共に30分～1時間、+2℃～+8℃で同時染色した。インキュベーション後、細胞を染色緩衝液で2回洗浄し、製造業者のプロトコルに従ってBD CytoFix（554655）中に再懸濁した。次いで、細胞をペレット化し、PBS中に再懸濁した。
FACSVerseフローサイトメーター(BD Biosciences)上で収集を行った。各場合において、生細胞ゲートでは10,000件の事象（event）が収集された。データ分析は、FlowJoバージョン10を用いて行った。
存在する場合、死細胞の排除には、Zombie Aqua（商標）fixable viabilityキット（BioLegend）を使用した。前方散乱対側方散乱(FSC/SSC)に基づき、細胞残屑をさらに除外した。
結果
CLL、多発性骨髄腫、B-ALL、AML、CML、APML及びT-ALLを有する患者から採取した末梢血又は骨髄試料の5T4発現について、フローサイトメトリーにより評価した。試料中に存在する他の非悪性細胞の中から悪性細胞種を特定するのを助けるために、いくつかの系統の細胞表面マーカー、並びに癌幹細胞表現型を示すマーカーを使用した。
研究から得られたすべての結果を以下の表に要約する。5T4発現は、様々な血液学的悪性腫瘍において見られることがわかる。
CD34を主要な表現型マーカーとして用い、5T4がCSC上に発現するか否かを判定した。以下の表に示されるように、5T4は、多数の癌幹細胞において発現されることが見出された。
［実施例12-固形腫瘍細胞株における癌幹細胞上の5T4発現の評価］
＜固形腫瘍細胞株＞
以下の細胞株を、単層（標準的な細胞培養条件）としての培養後、又はスフィア（sphere）形成後（CSCに富む）、5T4発現について評価した：
i. OVCAR-3（卵巣癌）
ii. MCF7（乳癌）
iii. HCT116（結腸直腸癌）
iv. HT29（結腸直腸癌）
v. A549（肺癌）
vi. U251（膠芽腫）
＜単層細胞培養物＞
HCT116、HT29、MCF7及びA549細胞は、10%ウシ胎児血清（FBS）、2mM L-グルタミン及び50μg/mlペニシリン-ストレプトマイシンを含有するDMEM培地で培養した。OVCAR3細胞は、20% FBS、10μg/mlヒトインスリン、2mM L-グルタミン及び50μg/mlペニシリン-ストレプトマイシンを含有するRPMI培地で培養した。U251細胞は、10% FBS、1%ピルビン酸ナトリウム、1%非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン及び50μg/mlペニシリン-ストレプトマイシンを含有するMEM培地で培養した。すべての細胞は、37℃、5% CO2/95%空気雰囲気で、95%の相対湿度で培養した。
＜スフィア細胞培養＞
スフィア培養の方法は、Farnie等 (2007) Journal of the National Cancer Institute 99, 616-627から適合させた。ポリHEMAを95%エタノール中に溶解し、細胞培養フラスコに添加した後、エタノールを一晩蒸発させた。HCT116及びHT29細胞は、基本スフィア培地（basic sphere medium）（DMEM/F12、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、1×B27サプリメント）で培養し; MCF7、U251及びA549細胞は、マンモスフィア培地（基本スフィア+10ng/ml hEGF、5μg/mlインスリン、0.5μg/mlヒドロコルチゾン）で培養し、OVCAR3細胞は、卵巣スフィア培地（基本スフィア+20ng/ml hEGF、5μg/mlインスリン、15ng/ml hbFGF及び0.4% FBS)で培養した。
＜実験細胞培養及びフローサイトメトリー＞
各細胞株を、1cm2あたり2000個の細胞で上記のように、単層条件下で2つのT75フラスコ、及びスフィア条件下で4つのT175フラスコ中で培養した。24時間後、各細胞株の3つのスフィアフラスコ及び1つの単層フラスコを回収して単細胞懸濁液にし、CD133-APC（試験当たり5μl、eBioscience（商標）、カタログ番号17-1338-42）又はCD117-APC（試験当たり5μl、eBioscience（商標）、カタログ番号17-1178-42）と共に又はそれなしで、5T4-PE（試験当たり5μl）で標識した。対応するアイソタイプ標識を、各細胞株及び条件について行った（IgG1-PE、試験当たり12.5μl;及びIgG1-APC、試験当たり5μl、eBioscience（商標）、カタログ番号17-4714-82）。抗体標識は、96ウェルプレート中で30分間、氷上で、FACS緩衝液（PBS、5% FCS、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン）中で行った後、ウェルをFACS緩衝液中で2回洗浄した。フローサイトメトリーはMACSQuant Analyzer 10上で行い、分析はFlowJo V10を用いて行った。
残りの単層フラスコは、細胞が少なくとも60%のコンフルエンシーに達するまで培養し続け（「バルク細胞」）、一方、残りのスフィアフラスコは、7日間培養した後フローサイトメトリーのために回収して単細胞懸濁液にした。抗体標識は、上述のように行った。
結果
結果を図19に示す。本研究のデータは、研究した細胞株について5T4が癌幹細胞上に発現されることを実証する。さらに、MFIの一貫した増加により、癌幹細胞については細胞当たりの5T4の発現がより高い可能性があることが示唆される。
本明細書で参照されるすべての文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、それらが参照される対象には特に注意が払われる。本発明の記載した方法及び系の種々の変更及び変形は、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、当業者に明らかとなるだろう。
本発明は特定の好ましい実施形態との関連において説明したが、請求項に記載の本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際、分子生物学、細胞免疫学又は関連分野の当業者にとって明らかである、本発明を実施するための記載された様式の種々の変更は、特許請求の範囲内であることが意図されている。
＜SEQUENCE LISTING＞

<110> Oxford BioMedica (UK) Limited

<120> METHOD

<130> PA23-214

<150> GB 1704084.1
<151> 2017-03-15

<150> GB 1721603.7
<151> 2017-12-21

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 515
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> 5T4-specific CAR sequence

<400> 1

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15


Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser
20 25 30


Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys
35 40 45


Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln
50 55 60


Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn
65 70 75 80


Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr
85 90 95


Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr
100 105 110


Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr
115 120 125


Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Val Thr Ser Val Thr Val Ser
130 135 140


Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160


Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
165 170 175


Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
180 185 190


Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile
195 200 205


Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly
210 215 220


Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ala
225 230 235 240


Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro
245 250 255


Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Leu
260 265 270


Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro
275 280 285


Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
290 295 300


Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
305 310 315 320


Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
325 330 335


Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
340 345 350


Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
355 360 365


Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
370 375 380


Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
385 390 395 400


Glu Leu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
405 410 415


Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
420 425 430


Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
435 440 445


Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
450 455 460


Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
465 470 475 480


Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
485 490 495


Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
500 505 510


Pro Pro Arg
515


<210> 2
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Oncostatin M leader

<400> 2

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15


Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser
20


<210> 3
<211> 244
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> H8 anti5T4 domain

<400> 3

Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15


Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
20 25 30


Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp
35 40 45


Ile Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys
50 55 60


Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala
65 70 75 80


Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
85 90 95


Cys Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110


Gln Val Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125


Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro
130 135 140


Thr Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys
145 150 155 160


Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175


Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala
180 185 190


Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205


Phe Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys
210 215 220


Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240


Glu Ile Lys Arg



<210> 4
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> linker

<400> 4

Ala Ala Ala
1


<210> 5
<211> 65
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> CD8 hinge

<400> 5

Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu
1 5 10 15


Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
20 25 30


Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
35 40 45


Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
50 55 60


Asp
65


<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> CD8 transmembrane region

<400> 6

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15


Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20


<210> 7
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> 41BB costimulatory domain

<400> 7

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15


Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30


Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40


<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> CD3 zeta stimulatory domain

<400> 8

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15


Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30


Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45


Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60


Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80


Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95


Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110


Arg



<210> 9
<211> 1548
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> codon-optimised sequence encoding the 5T4-CAR protein

<400> 9
atgggagtgc tgctgaccca gagaaccctg ctgtctctgg tgctggccct gctgttccct 60

agcatggcca gcatggaagt gcagctgcag cagagcggcc ctgacctcgt gaaacctggc 120

gcctccgtga agatcagctg caaggccagc ggctacagct tcaccggcta ctacatgcac 180

tgggtcaagc agagccacgg caagagcctg gaatggatcg gccggatcaa ccccaacaac 240

ggcgtgaccc tgtacaacca gaagttcaag gacaaggcca tcctgaccgt ggacaagagc 300

agcaccaccg cctacatgga actgcggagc ctgaccagcg aggacagcgc cgtgtactac 360

tgcgcccggt ccaccatgat caccaactac gtgatggact actggggcca agtgaccagc 420

gtgaccgtgt ctagcggagg cggaggatct ggcggcggag gaacaggcgg agggggatct 480

agcatcgtga tgacccagac ccccaccttc ctgctggtgt ctgccggcga cagagtgacc 540

atcacatgca aggcctccca gagcgtgtcc aacgacgtgg cctggtatca gcagaagcct 600

ggccagagcc ccaccctgct gattagctac accagctcca gatatgccgg cgtgcccgac 660

agattcatcg gcagcggcta tggcaccgac ttcaccttca ccatcagcac actgcaggcc 720

gaggacctgg ctgtgtactt ctgtcagcaa gactacaaca gcccccctac cttcggcgga 780

ggcaccaagc tggaaatcaa gagagccgcc gctctgagca acagcatcat gtacttcagc 840

cacttcgtgc ccgtgtttct gcccgccaag cctaccacaa cccctgcccc tagacctcct 900

accccagccc ctacaatcgc cagccagcct ctgtctctga ggcccgaggc ttgtagacct 960

gctgctggcg gagccgtgca caccagagga ctggatttcg cctgcgacat ctacatctgg 1020

gcccctctgg ccggcacatg tggcgtgctg ctgctgagcc tcgtgatcac cctgtactgc 1080

aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 1140

accacccagg aagaggacgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 1200

gagctgctga gagtgaagtt cagcagatcc gccgacgccc ctgcctacca gcagggacag 1260

aatcagctgt acaacgagct gaacctgggc agacgggaag agtacgacgt gctggacaag 1320

cggagaggca gggaccctga gatgggcggc aagcccagaa gaaagaaccc ccaggaaggc 1380

ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggaatgaag 1440

ggcgagcgga gaagaggcaa gggccacgat ggactgtacc agggcctgag caccgccacc 1500

aaggacacct atgacgccct gcacatgcag gctctgcccc ccagatga 1548


<210> 10
<211> 1179
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> EF1alpha promoter sequence

<400> 10
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240

gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300

acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360

gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420

cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480

ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540

caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600

gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660

gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720

ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780

gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840

acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900

tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960

tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020

gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080

ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140

gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179


<210> 11
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> 2E4 anti5T4 domain

<400> 11

Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15


Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
20 25 30


Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp
35 40 45


Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Asp
50 55 60


Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80


Ser Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
85 90 95


Cys Ala Leu Ser Thr Met Ile Thr Thr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110


Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125


Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Val Met Thr Gln Thr Pro
130 135 140


Lys Phe Leu Leu Ala Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys
145 150 155 160


Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175


Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
180 185 190


Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205


Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys
210 215 220


Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240


Glu Ile Lys



<210> 12
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> 2E4 antibody sequence

<400> 12

Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15


Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
20 25 30


Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp
35 40 45


Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Asp
50 55 60


Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80


Ser Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
85 90 95


Cys Ala Leu Ser Thr Met Ile Thr Thr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110


Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125


Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Val Met Thr Gln Thr Pro
130 135 140


Lys Phe Leu Leu Ala Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys
145 150 155 160


Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175


Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
180 185 190


Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205


Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys
210 215 220


Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240


Glu Ile Lys



<210> 13
<211> 514
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> 5T4-specific CAR sequence

<400> 13

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15


Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser
20 25 30


Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys
35 40 45


Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln
50 55 60


Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn
65 70 75 80


Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gln Asp Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr
85 90 95


Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu Leu His Ser Leu Thr
100 105 110


Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Ser Thr Met Ile Thr
115 120 125


Thr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
130 135 140


Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160


Asn Phe Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Ala Ser Ala Gly
165 170 175


Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
180 185 190


Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
195 200 205


Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly
210 215 220


Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
225 230 235 240


Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe
245 250 255


Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ala Ala Leu Ser
260 265 270


Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala
275 280 285


Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
290 295 300


Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
305 310 315 320


Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
325 330 335


Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
340 345 350


Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
355 360 365


Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
370 375 380


Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
385 390 395 400


Leu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
405 410 415


Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
420 425 430


Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
435 440 445


Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
450 455 460


Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
465 470 475 480


Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
485 490 495


Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
500 505 510


Pro Arg



<210> 14
<211> 730
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> sequence encoding the 2E4 antigen binding moiety

<400> 14
atggaagtgc agctgcagca gtctggcccc gagctcgtga aacctggcgc ctccgtgaag 60

atcagctgca aggccagcgg ctacagcttc accggctact acatgcactg ggtcaagcag 120

agccacgtga agtccctgga atggatcggc cggatcaacc cctacaacgg cgccaccacc 180

tacaaccagg acttcaagga caaggcctcc ctgaccgtgg acaagagcag cagcaccgcc 240

agcatggaac tgcacagcct gaccagcgag gacagcgccg tgtactactg tgccctgagc 300

accatgatca ccaccgcttg gtttgcctac tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtct 360

ccaggaggcg gaggatctgg cggcggagga acaggcggag ggggatctaa cttcgtgatg 420

acccagaccc ccaagttcct gctggcctct gccggcgaca gagtgaccat cagctgcaag 480

gccagccaga gcgtgtccaa cgacgtgggc tggtatcagc agaagcccgg ccagagcccc 540

aagctgctga tctacttcgc cagcaaccgg tacaccggcg tgcccgacag attcatcggc 600

agcggctacg gcaccgactt caccttcacc atcagcaccg tgcaggccga ggacctggcc 660

gtgtacttct gtcagcaaga ctacagcagc cctttcacct tcggctccgg caccaagctg 720

gaaatcaagg 730
コンジュゲーションのための適切なコンジュゲート及び方法は当技術分野において既知である－例えば、Parslow等 Biomedicines 2016, 4:14における総説を参照されたい。
本発明は以下の態様も提供する。
［１］ 対象に5T4標的剤を投与することを含む、対象における血液癌を治療又は予防するための方法であって、前記血液癌が、前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）でない、方法。
［２］ 前記5T4標的剤が、抗体又はその生物学的に活性な断片である、［1］に記載の方法。
［３］ 前記抗体が、モノクローナル抗体又はその生物学的に活性な断片である、［2］に記載の方法。
［４］ 前記モノクローナル抗体が、H8 5T4特異的抗体又は2E4 5T4特異的抗体に基づく、［3］に記載の方法。
［５］ 前記抗体が抗体薬物コンジュゲートの形態である、［2］～[4]のいずれか一に記載の方法。
［６］ 前記5T4標的剤が免疫細胞である、［1］に記載の方法。
［７］ 前記免疫細胞が、T細胞、NK細胞又はNKT細胞である、［6］に記載の方法。
［８］ 前記免疫細胞がT細胞である、［7］に記載の方法。
［９］ 前記細胞が、5T4特異的キメラ抗原受容体（CAR）又はT細胞受容体（TCR）を含む、［6］～[8]のいずれか一に記載の方法。
［１０］ 前記5T4標的剤が5T4ワクチンである、［1］に記載の方法。
［１１］ 前記5T4標的剤が静脈内投与により投与される、［1］～[10]のいずれか一に記載の方法。
［１２］ 前記対象が哺乳類の対象である、［1］～[11]のいずれか一に記載の方法。
［１３］ 前記対象がヒト対象である、［1］～[12]のいずれか一に記載の方法。
［１４］ 前記血液癌が、白血病、リンパ腫又は骨髄腫から選択される、［1］～[13]のいずれか一に記載の方法。
［１５］ 前記血液癌が、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、急性骨髄性白血病、B細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、及びT細胞急性リンパ芽球性白血病から選択される、［14］に記載の方法。
［１６］ 前記5T4標的剤が、更なる癌療法と組み合わせて同時に又は連続的に投与される、［1］～[15]のいずれか一に記載の方法。
［１７］ 血液癌の治療又は予防における使用のための、［1］～[13]のいずれか一に定義される5T4標的剤。
［１８］ 血液癌の治療又は予防のための医薬の製造における、［1］～[13]のいずれか一に定義される5T4標的剤の使用。
［１９］ ［1］～[16]のいずれか一に記載の、対象における血液癌を治療又は予防するための方法であって、前記方法が、5T4発現について対象由来の試料を事前スクリーニングすることを含む、方法。
［２０］ 前記血液癌が、白血病、リンパ腫又は骨髄腫から選択される、［17］に記載の使用のための5T4標的剤、又は［18］に記載の5T4標的剤の使用。
［２１］ 前記血液癌が、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、急性骨髄性白血病、B細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、及びT細胞急性リンパ芽球性白血病から選択される、［17］に記載の使用のための5T4標的剤、又は［18］に記載の5T4標的剤の使用。［２２］ 前記対象が、5T4発現について事前スクリーニングされる、又は事前スクリーニングされている、［17］に記載の使用のための5T4標的剤、又は［18］に記載の5T4標的剤の使用。
［２３］ モノクローナル抗5T4抗体由来のVH及びVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びにシグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む5T4特異的CARであって、前記CARが、配列番号1に示される配列、又は配列番号1に対し少なくとも92％の配列同一性を有する配列を有する、5T4特異的CAR。
［２４］ モノクローナル抗5T4抗体由来のVH及びVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びにシグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む5T4特異的CARであって、前記CARが、配列番号13に示される配列、又は配列番号13に対し少なくとも70％の配列同一性を有する配列を有する、5T4特異的CAR。［２５］ ［23］又は[24]に記載の5T4特異的CARを含む免疫細胞。
［２６］ ［25］に記載の免疫細胞の集団。
［２７］ 前記細胞又は細胞の集団がT細胞である、［25］に記載の免疫細胞又は［26］に記載の細胞の集団。
［２８］ 前記細胞又は細胞の集団がNK細胞又はNKT細胞である、［25］に記載の免疫細胞又は［26］に記載の細胞の集団。
［２９］ ［25］～[28]のいずれか一に記載の細胞又は細胞の集団を含む組成物。
［３０］ ［23］又は[24]に記載の5T4特異的CAR、［25］～[28]のいずれか一に記載の細胞若しくは細胞の集団、又は［29］に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象における癌を治療するための方法。
［３１］ 医薬としての使用のための、［23］又は[24]に記載の5T4特異的CAR、［25］～[28]のいずれか一に記載の細胞若しくは細胞の集団、又は［29］に記載の組成物。
［３２］ 癌の治療における使用のための、［23］又は[24]に記載の5T4特異的CAR、［25］～[28]のいずれか一に記載の細胞若しくは細胞の集団、又は［29］に記載の組成物。
［３３］ 癌の治療又は予防のための医薬の製造における、［23］又は[24]に記載の5T4特異的CAR、［25］～[28]のいずれか一に記載の細胞若しくは細胞の集団、又は［29］に記載の組成物の使用。
［３４］ 前記5T4特異的CAR、細胞、細胞集団、組成物又は医薬が、静脈内、腹腔内若しくは胸膜内投与される、又は静脈内、腹腔内若しくは胸膜内投与のためのものである、［30］に記載の方法、［32］に記載の使用のための5T4特異的CAR、細胞、細胞集団若しくは組成物、又は［33］に記載の使用。
［３５］ 前記癌が骨髄腫である、［30］に記載の方法、［32］に記載の使用のための5T4特異的CAR、細胞、細胞集団若しくは組成物、又は［33］に記載の使用。
［３６］ 前記癌が、卵巣癌又は中皮腫である、［30］に記載の方法、［32］に記載の使用のための5T4特異的CAR、細胞、細胞集団若しくは組成物、又は［33］に記載の使用。
［３７］ 前記方法が、5T4発現について対象を事前スクリーニングすることを含む、［30］に記載の対象における骨髄腫を治療又は予防する方法。
［３８］ 前記対象が、5T4発現について事前スクリーニングされる、又は事前スクリーニングされている、［30］に記載の使用のための5T4標的剤、又は［33］に記載の5T4標的剤の使用。
［３９］ 5T4特異的CARを発現する免疫細胞を作製する方法であって、前記方法が、前記CARを発現するウイルスベクターで前記免疫細胞に形質導入する工程を含む、方法。
［４０］ 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、［39］に記載の方法。
［４１］ レンチウイルスベクターがHIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV又はビスナレンチウイルスに由来する、［40］に記載の方法。
［４２］ 対象における癌再発を予防又は低減するための方法であって、前記方法は、［1］～[13]のいずれか一に定義される5T4標的剤を前記対象に投与することを含む、方法。［４３］ 前記癌が、血液癌、又は固形腫瘍により特徴づけられる癌である、［42］に記載の方法。
［４４］ 前記血液癌が、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、急性骨髄性白血病及びB細胞急性リンパ芽球性リンパ腫から選択される、［43］に記載の方法。
［４５］ 固形腫瘍により特徴づけられる前記癌が、卵巣癌、膠芽腫及び結腸直腸癌から選択される、［43］に記載の方法。

Claims (45)

  1. 対象に5T4標的剤を投与することを含む、対象における血液癌を治療又は予防するための方法であって、前記血液癌が、前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）でない、方法。
  2. 前記5T4標的剤が、抗体又はその生物学的に活性な断片である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記抗体が、モノクローナル抗体又はその生物学的に活性な断片である、請求項2に記載の方法。
  4. 前記モノクローナル抗体が、H8 5T4特異的抗体又は2E4 5T4特異的抗体に基づく、請求項3に記載の方法。
  5. 前記抗体が抗体薬物コンジュゲートの形態である、請求項2～4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 前記5T4標的剤が免疫細胞である、請求項1に記載の方法。
  7. 前記免疫細胞が、T細胞、NK細胞又はNKT細胞である、請求項6に記載の方法。
  8. 前記免疫細胞がT細胞である、請求項7に記載の方法。
  9. 前記細胞が、5T4特異的キメラ抗原受容体（CAR）又はT細胞受容体（TCR）を含む、請求項6～8のいずれか1項に記載の方法。
  10. 前記5T4標的剤が5T4ワクチンである、請求項1に記載の方法。
  11. 前記5T4標的剤が静脈内投与により投与される、請求項1～10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 前記対象が哺乳類の対象である、請求項1～11のいずれか1項に記載の方法。
  13. 前記対象がヒト対象である、請求項1～12のいずれか1項に記載の方法。
  14. 前記血液癌が、白血病、リンパ腫又は骨髄腫から選択される、請求項1～13のいずれか1項に記載の方法。
  15. 前記血液癌が、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、急性骨髄性白血病、B細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、及びT細胞急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項14に記載の方法。
  16. 前記5T4標的剤が、更なる癌療法と組み合わせて同時に又は連続的に投与される、請求項1～15のいずれか1項に記載の方法。
  17. 血液癌の治療又は予防における使用のための、請求項1～13のいずれか1項に定義される5T4標的剤。
  18. 血液癌の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項1～13のいずれか1項に定義される5T4標的剤の使用。
  19. 請求項1～16のいずれか1項に記載の、対象における血液癌を治療又は予防するための方法であって、前記方法が、5T4発現について対象由来の試料を事前スクリーニングすることを含む、方法。
  20. 前記血液癌が、白血病、リンパ腫又は骨髄腫から選択される、請求項17に記載の使用のための5T4標的剤、又は請求項18に記載の5T4標的剤の使用。
  21. 前記血液癌が、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、急性骨髄性白血病、B細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、及びT細胞急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項17に記載の使用のための5T4標的剤、又は請求項18に記載の5T4標的剤の使用。
  22. 前記対象が、5T4発現について事前スクリーニングされる、又は事前スクリーニングされている、請求項17に記載の使用のための5T4標的剤、又は請求項18に記載の5T4標的剤の使用。
  23. モノクローナル抗5T4抗体由来のVH及びVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びにシグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む5T4特異的CARであって、前記CARが、配列番号1に示される配列、又は配列番号1に対し少なくとも92％の配列同一性を有する配列を有する、5T4特異的CAR。
  24. モノクローナル抗5T4抗体由来のVH及びVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びにシグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む5T4特異的CARであって、前記CARが、配列番号13に示される配列、又は配列番号13に対し少なくとも70％の配列同一性を有する配列を有する、5T4特異的CAR。
  25. 請求項23又は24に記載の5T4特異的CARを含む免疫細胞。
  26. 請求項25に記載の免疫細胞の集団。
  27. 前記細胞又は細胞の集団がT細胞である、請求項25に記載の免疫細胞又は請求項26に記載の細胞の集団。
  28. 前記細胞又は細胞の集団がNK細胞又はNKT細胞である、請求項25に記載の免疫細胞又は請求項26に記載の細胞の集団。
  29. 請求項25～28のいずれか1項に記載の細胞又は細胞の集団を含む組成物。
  30. 請求項23又は24に記載の5T4特異的CAR、請求項25～28のいずれか1項に記載の細胞若しくは細胞の集団、又は請求項29に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象における癌を治療するための方法。
  31. 医薬としての使用のための、請求項23又は24に記載の5T4特異的CAR、請求項25～28のいずれか1項に記載の細胞若しくは細胞の集団、又は請求項29に記載の組成物。
  32. 癌の治療における使用のための、請求項23又は24に記載の5T4特異的CAR、請求項25～28のいずれか1項に記載の細胞若しくは細胞の集団、又は請求項29に記載の組成物。
  33. 癌の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項23又は24に記載の5T4特異的CAR、請求項25～28のいずれか1項に記載の細胞若しくは細胞の集団、又は請求項29に記載の組成物の使用。
  34. 前記5T4特異的CAR、細胞、細胞集団、組成物又は医薬が、静脈内、腹腔内若しくは胸膜内投与される、又は静脈内、腹腔内若しくは胸膜内投与のためのものである、請求項30に記載の方法、請求項32に記載の使用のための5T4特異的CAR、細胞、細胞集団若しくは組成物、又は請求項33に記載の使用。
  35. 前記癌が骨髄腫である、請求項30に記載の方法、請求項32に記載の使用のための5T4特異的CAR、細胞、細胞集団若しくは組成物、又は請求項33に記載の使用。
  36. 前記癌が、卵巣癌又は中皮腫である、請求項30に記載の方法、請求項32に記載の使用のための5T4特異的CAR、細胞、細胞集団若しくは組成物、又は請求項33に記載の使用。
  37. 前記方法が、5T4発現について対象を事前スクリーニングすることを含む、請求項30に記載の対象における骨髄腫を治療又は予防する方法。
  38. 前記対象が、5T4発現について事前スクリーニングされる、又は事前スクリーニングされている、請求項30に記載の使用のための5T4標的剤、又は請求項33に記載の5T4標的剤の使用。
  39. 5T4特異的CARを発現する免疫細胞を作製する方法であって、前記方法が、前記CARを発現するウイルスベクターで前記免疫細胞に形質導入する工程を含む、方法。
  40. 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項39に記載の方法。
  41. レンチウイルスベクターがHIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV又はビスナレンチウイルスに由来する、請求項40に記載の方法。
  42. 対象における癌再発を予防又は低減するための方法であって、前記方法は、請求項1～13のいずれか1項に定義される5T4標的剤を前記対象に投与することを含む、方法。
  43. 前記癌が、血液癌、又は固形腫瘍により特徴づけられる癌である、請求項42に記載の方法。
  44. 前記血液癌が、慢性リンパ球性白血病、骨髄腫、急性骨髄性白血病及びB細胞急性リンパ芽球性リンパ腫から選択される、請求項43に記載の方法。
  45. 固形腫瘍により特徴づけられる前記癌が、卵巣癌、膠芽腫及び結腸直腸癌から選択される、請求項43に記載の方法。
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