RU2729112C2 - Трансгенные генетические метки и способы применения - Google Patents

Трансгенные генетические метки и способы применения Download PDF

Info

Publication number
RU2729112C2
RU2729112C2 RU2016143384A RU2016143384A RU2729112C2 RU 2729112 C2 RU2729112 C2 RU 2729112C2 RU 2016143384 A RU2016143384 A RU 2016143384A RU 2016143384 A RU2016143384 A RU 2016143384A RU 2729112 C2 RU2729112 C2 RU 2729112C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
polypeptide
seq
domain
her2
Prior art date
Application number
RU2016143384A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2016143384A (ru
RU2016143384A3 (ru
Inventor
Майкл К. ДЖЕНСЕН
Адам ДЖОНСОН
Original Assignee
Сиэтл Чилдрен'С Хоспитал (Дба Сиэтл Чилдрен'С Ресёрч Инститьют)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54288361&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2729112(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Сиэтл Чилдрен'С Хоспитал (Дба Сиэтл Чилдрен'С Ресёрч Инститьют) filed Critical Сиэтл Чилдрен'С Хоспитал (Дба Сиэтл Чилдрен'С Ресёрч Инститьют)
Publication of RU2016143384A publication Critical patent/RU2016143384A/ru
Publication of RU2016143384A3 publication Critical patent/RU2016143384A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2729112C2 publication Critical patent/RU2729112C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
    • C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
    • C12Y105/01003—Dihydrofolate reductase (1.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/10—Protein-tyrosine kinases (2.7.10)
    • C12Y207/10001—Receptor protein-tyrosine kinase (2.7.10.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2820/00—Vectors comprising a special origin of replication system
    • C12N2820/002—Vectors comprising a special origin of replication system inducible or controllable

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полипептиду для мечения клетки, и может быть использовано в медицине. Полученный полипептид, содержащий внеклеточный домен полипептида HER2, может быть использован для отбора однородных продуктов в генетической терапии. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил., 9 табл., 1 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 62/058973, поданной 2 октября 2014 года, предварительной заявке на патент США № 61/977751, поданной 10 апреля 2014 года, предварительной заявке на патент США № 61/986479, поданной 30 апреля 2014 года, предварительной заявке на патент США № 62/089730, поданной 9 декабря 2014 года, предварительной заявке на патент США № 62/090845, поданной 11 декабря 2014 года, и предварительной заявке на патент США № 62/088363, поданной 5 декабря 2014 года. Содержание вышеупомянутых заявок полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПЕРЕЧЕНЬ ТАБЛИЦ ИЛИ КОМПЬЮТЕРНЫХ ПРОГРАММ
[0002] Настоящая заявка подана совместно с перечнем последовательностей в электронном виде. Перечень последовательностей предоставлен в виде файла под названием SCRI-066WO-SEQUENCE_LISTING.TXT, созданного 7 апреля 2015 года, размер которого составляет 47 кбайт. Информация, представленная в электронной форме в перечне последовательностей, полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Настоящее изобретение относится к композициям и способам, которые можно применять для детектирования экспрессии трансгена в клетках.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Экспрессия трансгенов в клетках становится важным терапевтическим подходом для лечения различных состояний. Например, при адоптивной иммунотерапии Т-лимфоциты человека модифицируют с помощью переноса гена для экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR), специфичных в отношении поверхностных молекул, экспрессируемых на опухолевых клетках. Химерные рецепторы представляют собой синтетические рецепторы, которые содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, наиболее часто одноцепочечный вариабельный фрагмент моноклонального антитела (scFv), соединенный с внутриклеточными компонентами для передачи сигналов, наиболее часто с CD3ζ по отдельности или в комбинации с одним или более костимулирующими доменами. Другие примеры состояний, которые лечили с применением клеток, модифицированных трансгеном, включают талассемию, гемофилию, инфаркт миокарда и тяжелый комбинированный иммунодефицит. Тем не менее, основная задача заключается в получении стабильной экспрессии трансгена на уровнях, сопоставимых с таковыми для эндогенных генов. Существует потребность в выявлении композиций и способов для отбора и/или детектирования клеток, которые экспрессируют высокие уровни трансгенов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Ограничивающим фактором клинического успеха и воспроизводимости стратегий генной терапии было применение и отбор однородных продуктов. Согласно настоящему изобретению была разработана генетическая метка-кандидат и инструмент для модификации клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка содержит эпитоп, основанный на Her2 человека, обозначенный Her2t. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения Her2t лишен всех внутриклеточных компонентов Her2, однако содержит трансмембранный участок Her2, конформационно интактный эпитоп, который распознается моноклональным антителом, трастузумабом (герцептин), и пептид, облегчающий поверхностную экспрессию. Три варианта конструкции Her2t, один из которых содержит полноразмерный домен IV Her2, и два содержат конформационные эпитопы, которые были разработаны на основе трехмерной структуры Her2 в комплексе с герцептином (Garrett et al J. Immunology 178:7120 (2007); Cho et al 2003), были встроены в упаковочную плазмиду для лентивирусов, epHIV7, и охарактеризованы в клетках линии СНО.
[0006] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения применение Her2t в качестве генетической метки позволяет отбирать и очищать гомогенные популяции клеточных терапевтических средств, которые экспрессируют трансген, представляющий интерес, в условиях ex vivo. Кроме того, Her2t можно использовать для отслеживания клеточных терапевтических средств в условиях in vivo; например, Her2t можно применять в качестве мишени для окрашивания клеток крови, костного мозга и аспиратов спинномозговой жидкости с помощью герцептина, чтобы проверить сохранение клеточных терапевтических средств, экспрессирующих трансген, для наблюдения за ремиссией рака до терапевтической персистенции заболевания у пациента. Her2t позволяет расширить терапевтический охват CAR-терапии, обеспечивая согласованную очистку клеток, экспрессирующих несколько трансгенов, при использовании с другой генетической меткой, такой как EGFRt.
[0007] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен выделенный полипептид, который по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 511 по 652 или с 563 по 652 последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный полипептид, включены в объем настоящего изобретения.
[0008] Согласно другим вариантам реализации в настоящем изобретении предложены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую выделенный полипептид, который по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 511 по 562 или с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2. Клетки-хозяева могут быть выбраны из группы, состоящей из CD8 Т-клеток, CD4 Т-клеток, CD4-наивных Т-клеток, CD8-наивных Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток центральной памяти и их комбинаций. Клетки-хозяева могут дополнительно содержать вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй химерный антигенный рецептор, соединенный со второй генетической меткой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота может быть введена в те же клетки-хозяева, что и нуклеиновая кислота, кодирующая выделенный полипептид, который по меньшей мере на 95% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 511 по 562 или с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вторую нуклеиновую кислоту вводят во вторую популяцию клеток-хозяев, и по меньшей мере две популяции клеток-хозяев объединены в единую композицию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки включают клетки предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-предшественники Т-лимфоцитов представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
[0009] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены способы изготовления композиций, содержащих клетки-хозяева, описанные в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ включает введение в клетку-хозяина выделенной нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновая кислота, кодирующая выделенный полипептид, который по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена (ВКД) полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 511 по 652 или с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2; и культивирование указанных клеток-хозяев в среде, содержащей по меньшей мере один фактор роста. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает отбор клеток-хозяев для экспрессии ВКД перед или после или как перед, так и после этапа культивирования. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения способ изготовления дополнительно включает введение второй нуклеиновой кислоты, кодирующей второй химерный антигенный рецептор и вторую генетическую метку, в клетку-хозяина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает отбор клеток-хозяев для экспрессии второй генетической метки перед или после или как перед, так и после этапа культивирования.
[00010] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ, включающий введение первой выделенной нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновая кислота, кодирующая выделенный полипептид, который по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 511 по 652 или с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, в первую клетку-хозяина; отбор первой популяции клеток-хозяев, которые экспрессируют ВКД, введение второй нуклеиновой кислоты, кодирующей второй химерный антигенный рецептор и вторую генетическую метку, во вторую клетку-хозяина, отбор второй популяции клеток-хозяев для экспрессии второй генетической метки, и необязательно культивирование первой и второй популяций клеток-хозяев в среде, содержащей по меньшей мере один фактор роста. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит первую и вторую популяции клеток-хозяев.
[00011] Другой аспект настоящего изобретения относится к способам и вариантам применения композиций для лечения рака, отслеживания клеток указанной композиции в условиях in vivo и уничтожения клеток указанной композиции в условиях in vivo. Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении предложен способ, включающий лечение пациента, страдающего раком и экспрессирующего опухолевый антиген, причем указанный способ дополнительно включает введение эффективного количества композиции клеток-хозяев, содержащих одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих химерный антигенный рецептор, соединенный с генетической меткой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева указанной композиции содержат первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый химерный антигенный рецептор, соединенный с первой генетической меткой, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй химерный антигенный рецептор, соединенный со второй генетической меткой. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который специфично связывается с генетической меткой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вводят антитело, которое связывается с первой генетической меткой, вводят антитело, которое специфично связывается со второй генетической меткой, или вводят оба указанных антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело метят детектируемой меткой, цитотоксическим агентом или ими обоими.
[00012] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен выделенный полипептид, причем указанный выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб.
[00013] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен выделенный полипептид, причем указанный выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her, и при этом указанный внеклеточный домен полипептида Her2, содержащий последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединен с трансмембранным доменом последовательностью, содержащей аминокислоты GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб.
[00014] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена выделенная нуклеиновая кислота, причем указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит последовательность SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her, и при этом указанный внеклеточный домен полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединен с трансмембранным доменом последовательностью, содержащей аминокислоты GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит трансген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансген содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит антигенсвязывающий домен, спейсерный участок, трансмембранный домен и по меньшей мере один стимулирующий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансген, соединен с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид Her2, с помощью саморасщепляющегося линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения саморасщепляющийся линкер представляет собой линкер Т2А, содержащий последовательность LEGGGEGRGSLLTCG (SEQ ID NO: 26). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 (CD20CAR).
[00015] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена клетка-хозяин, причем указанная клетка-хозяин содержит выделенную нуклеиновую кислоту, при этом указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит последовательность SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her, и при этом указанный внеклеточный домен полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединен с трансмембранным доменом последовательностью, содержащей аминокислоты GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит трансген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансген содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит антигенсвязывающий домен, спейсерный участок, трансмембранный домен и по меньшей мере один стимулирующий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансген, соединен с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид Her2, с помощью саморасщепляющегося линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения саморасщепляющийся линкер представляет собой линкер Т2А, содержащий последовательность LEGGGEGRGSLLTCG (SEQ ID NO: 26). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 (CD20CAR). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из CD8 Т-клеток, CD4 Т-клеток, CD4-наивных Т-клеток, CD8-наивных Т-клеток, CD8 Т-клеток центральной памяти, CD4 Т-клеток центральной памяти и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является аутологичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является антигенспецифичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
[00016] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая клетки-хозяева, причем указанные клетки-хозяева содержат выделенную нуклеиновую кислоту, при этом указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит последовательность SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her, и при этом указанный внеклеточный домен полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединен с трансмембранным доменом последовательностью, содержащей аминокислоты GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит трансген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансген содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит антигенсвязывающий домен, спейсерный участок, трансмембранный домен и по меньшей мере один стимулирующий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансген, соединен с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид Her2, с помощью саморасщепляющегося линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения саморасщепляющийся линкер представляет собой линкер Т2А, содержащий последовательность LEGGGEGRGSLLTCG (SEQ ID NO: 26). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 (CD20CAR). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из CD8 Т-клеток, CD4 Т-клеток, CD4-наивных Т-клеток, CD8-наивных Т-клеток, CD8 Т-клеток центральной памяти, CD4 Т-клеток центральной памяти и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является аутологичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является антигенспецифичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
[00017] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ изготовления композиции, причем указанный способ включает введение выделенной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и культивирование клеток-хозяев в среде, содержащей по меньшей мере один фактор роста. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит последовательность SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her, и при этом указанный внеклеточный домен полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединен с трансмембранным доменом последовательностью, содержащей аминокислоты GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит трансген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансген содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит антигенсвязывающий домен, спейсерный участок, трансмембранный домен и по меньшей мере один стимулирующий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансген, соединен с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид Her2, с помощью саморасщепляющегося линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения саморасщепляющийся линкер представляет собой линкер Т2А, содержащий последовательность LEGGGEGRGSLLTCG (SEQ ID NO: 26). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 (CD20CAR). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из CD8 Т-клеток, CD4 Т-клеток, CD4-наивных Т-клеток, CD8-наивных Т-клеток, CD8 Т-клеток центральной памяти, CD4 Т-клеток центральной памяти и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является аутологичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является антигенспецифичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фактор роста выбран из группы, состоящей из ИЛ-15, ИЛ-7, ИЛ-21, ИЛ-2 и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации способ дополнительно включает отбор клеток, которые экспрессируют полипептид Her2t. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки отбирают перед культивированием клеток в среде. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки отбирают с применением антитела, которое связывается с доменом IV Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации способ дополнительно включает введение второй выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор, соединенный со второй генетической меткой. Согласно некоторым вариантам реализации способ дополнительно включает отбор клеток, экспрессирующих вторую генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая генетическая метка содержит EGFRt. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[00018] Фигура 1. Структурная схема Her2t. (панель А) Молекулярная модель внеклеточного и трансмембранного участков Her2t (средняя панель) в сравнении с Her2 (ErbB2, слева). Her2t в комплексе с Fab герцептина (справа), (панель В) Схема молекулы Her2t, содержащей лидерный пептид, содержащий сигнальную последовательность альфа-цепи рецептора ГМ-КСФ (GMCSFRss), чтобы обеспечить экспрессию на поверхности клеток. Остальная часть последовательности Her2t состоит из эпитопа домена IV Her2 (ErbB2) (89 аминокислот) и трансмембранного участка, содержащего 23 аминокислоты, (панель С) Her2t был клонирован в рамке считывания в направлении 3'-конца относительно CAR и Т2А, чтобы обеспечить совместную экспрессию.
[00019] Фигура 2. Her2t взаимодействует с трастузумабом (герцептин) для иммуногенетического обогащения Her2t-экспрессирующими клетками, (панель А) Титрование биотинилированного герцептина с использованием в качестве мишени Her2- экспрессирующей клеточной линии, (панель В) Her2t-трансдуцированные клетки К562 до и после отбора с применением биотинилированного герцептина и микрогранул, специфичных в отношении биотина (Miltenyi). Клетки очищали до получения 95% Her2t-положительных клеток, (панель С) Эпитоп Her2t специфично распознается герцептином и не распознается коммерческими антителами к Her2t. (панель D) Исследование методом вестерн-блоттинга с применением коммерческого антитела (вверху) или биотинилированного герцептина (внизу), свидетельствующее о различной массе в кД Her2t (25 кДа) и ErbB2 (250 кДа). Дорожки слева направо (1-4): маркеры молекулярной массы, исходные клетки К562, К562 Her2t, К562 ErbB2 (Her2).
[00020] Фигура 3. Her2t является эффективным селективным маркером совместно с EGFRt для Т-клеток центральной памяти (TCM), (панель А) Очистка CD8 ТСМ из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) с помощью двухэтапной очистки на колонке. Клетки CD8+ CD45RA- первоначально отбирали с применением набора для выделения CD8 (для обогащения CD8-положительными клетками) и микрогранул, специфичных в отношении CD45RA (для удаления CD45RA положительных клеток). Затем клетки положительно отбирали с помощью микрогранул, специфичных в отношении CD62L. (панель В) CD8 TCM, транедуцированные CD19CAR-T2A-Her2 и CD20CAR-T2A-EGFRt (оба), могут быть отобраны с помощью биотинилированного герцептина или эрбитукса и микрогранул, специфичных в отношении биотина. CD8 ТСМ, транедуцированные CD19CAR-T2A-Her2t и CD20CAR-T2A-EGFRt (оба), могут быть последовательно очищены, что позволяет получить Т-клетки с двойной специфичностью для CAR-терапии. На пятой панели представлена гистограмма распределения очищенных ТСМ с двойной специфичностью (оба). На верхней гистограмме представлены результаты окрашивания с применением герцептина SA-PE (Her2t+), на нижней гистограмме представлены результаты окрашивания с применением эрбитукса SA-PE (EGFRt+) для ТСМ после двойной очистки, (панель С) Результаты исследования методом вестерн-блоттинга с применением CD3ζ-специфичного антитела на клеточных лизатах Her2t-положительных или EGFRt-положительных очищенных CD8 TCM. Дорожки слева направо (1-4): маркеры молекулярной массы, контрольная транедукция, транедукция CD19CAR-T2A-Her2t, транедукция CD19CAR-T2A-EGFRt. Интенсивности полос указывают на то, что хотя значение MFI (панель В) ниже для Her2t-окрашенных клеток, Her2t-очищенные клетки имеют более высокие уровни экспрессии трансгена, чем EGFRt-очищенные клетки. Верхние полосы = CD19CAR; Нижние полосы = эндогенный CD3ζ. Сравнение интенсивностей полос между цепью CAR ζ (верхняя панель - 50 кДа) и внутренней дзета-цепью Т-клеток хозяина (нижняя панель - 15 кДа) указывает на то, что клетки, экспрессирующие конструкцию CARher2t, имели приблизительно в 2 раза более высокую экспрессию CAR по сравнению к конструкцией CAREGFRt.
[00021] Фигура 4. Клетки, транедуцированные Her2t и Her2t/EGFRt, сохраняют эффекторный фенотип и специфичность в отношении мишени, (панель А) Характеристика целевой панели клеток К562 слева направо: исходные клетки К562, К562 CD19, К562 CD20 и К562 CD19/CD20 (по оси X: CD19+, Y-ось: CD20+). (панель В) Результаты 4-часового исследования высвобождения хрома, которые свидетельствуют о специфичности CD19- и CD20-CAR Т-клеток в отношении целевой панели клеток К562. CD8 ТСМ совместно культивировали с целевыми клетками К562 в соотношении 50:1, 25:1, 12,5:1 или 6,25:1. Только Т-клетки после двойной транедукции могли воздействовать на все клетки К562, экспрессирующие антигены. CD19CAR-T2A-Her2t и CD19CAR-T2A-EGFRt CD8 ТСМ проявляют аналогичную литическую способность, (панель С) Результаты 24-часового исследования высвобождения цитокинов. CD8 ТСМ совместно культивировали с целевыми клетками К562 при соотношении Т-клетки : мишень 2:1 в течение 24 ч, и затем супернатант исследовали для определения присутствия эффекторных цитокинов. CD8 ТСМ, транедуцированные CD19CAR-T2A-Her2t, вырабатывали более разнообразный репертуар и более высокие уровни эффекторных цитокинов по сравнению с CD8 ТСМ, транедуцированными CD19CAR-T2A-EGFRt. Панели аналогичны таковым в А и В (слева направо: исходные клетки К562, К562 CD19, К562 CD20 и К562 CD19/CD20). Аналогичные результаты были получены для CD4 ТСМ (данные не приведены), (панель D) Типичные данные по относительному увеличению выработки цитокинов в 24-часовом количественном исследовании высвобождения цитокинов. CD8 ТСМ, очищенные с помощью Her2t (CD19CAR-Her2t), вырабатывали значительно более высокие уровни эффекторных цитокинов ИЛ-2, ИФН-гамма и ФНО-альфа при совместном культивировании с К562, экспрессирующими CD19 (выше), по сравнению с CD19CAR-EGFRt. Т-тест Стьюдента р>0,05.
[00022] Фигура 5. Использование Her2t в качестве маркера для детектирования в условиях in vivo и флуоресцентного окрашивания модифицированных клеток, (панель А) CD19CAR-T2A-Her2t или CD19CAR-T2A-EGFRt-экспрессирующие CD4 и CD8 ТСМ (107) вводили внутривенно мышам линии NOD/SCID IL-2RγC0 совместно с подкожным введением 5×106 клеток NS∅-IL15, чтобы обеспечить системное поступление ИЛ-15 человека. Костный мозг собирали через 14 дней после инъекции, и клеточные суспензии исследовали методом проточной цитометрии. (панель В) На трех панелях показаны пропущенные жизнеспособные клетки (93,6% лимфоцитов), одиночные клетки (98,8% и живые клетки (99,9%. (В) Окрашивание CD8 и CD45, слева направо (контроль, CD19CAR-T2A-Her2t, CD19CAR-T2A-EGFRt ТСМ). По меньшей мере 1×107 клеток были зарегистрированы в популяциях пропущенных жизнеспособных, одиночных и живых клеток. Таким образом, несмотря на то, что CD45+ клетки составляют около 1% популяции, это эквивалентно 1×105 клеток. Остальные клетки представляют собой клетки костного мозга мыши. (панель С) CD45+ клетки человека окрашивали биотинилированным герцептином или эрбитуксом и SA-APC. Были выявлены Her2t- или EGFRt-экспрессирующие ТСМ из костного мозга, (панель D) Исходные клетки TM-LCL, Her2 (ErbB2) или Her2t-экспрессирующие клетки прикрепляли к покровным стеклам с применением поли-L-лизина, и затем окрашивали с применением биотинилированного герцептина и SA-AF647. При окрашивании биотинилированным герцептином и SA-AF647 окрашивание наблюдали только для клеток, экспрессирующих Her2 или Her2t.
[00023] Фигура 6. Очистка Her2t-положительных и EGFRt-положительных Т-клеток с помощью набора Multisort. Клетки Н9 (5×106 исходных клеток, Her2t+, EGFRt+ или Her2t+/EGFRt+) смешивали и затем подвергали очистке. Клетки сначала очищали с применением биотинилированного герцептина и микрогранул, специфичных в отношении биотина, Multisort. Микрогранулы Multisort затем удаляли и положительную фракцию очищали с применением эрбитукс-АРС и микрогранул, специфичных в отношении АРС. Готовая положительная фракция была двойной положительной в отношении Her2t и EGFRt.
[00024] Фигура 7. Три варианта Her2t (CD28hinge, IgG4hinge или Her2tG) были разработаны для улучшения связывания с антителом герцептином. Представлена общая схема, на которой указаны места вставки новых последовательностей в Her2t.
[00025] Фигура 8. Her2tG проявляет улучшенное связывание с герцептином. Клетки Н9 транедуцировали лентивирусом, содержащим Her2t или Her2tG, при MOI=1. Транедуцированные клетки затем очищали с помощью биотинилированного герцептина и микрогранул, специфичных в отношении биотина, согласно протоколу производителя. Очищенные популяции затем окрашивали для выявления Her2t или Her2tG с применением биотинилированного герцептина и стрептавидина-ФЭ. Гистограммы указывают на более прочное связывание с Her2tG.
[00026] Фигура 9. Her2tG проявляет более высокую способность к связыванию с герцептином. Клетки Н9 транедуцировали с применением 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1 и 3 мкл лентивируса (слева направо), и через 5 дней исследовали для определения связывания с герцептином. Вариант Her2t, Her2t(CD28hinge), был способен связаться с герцептином на уровнях, аналогичных таковым для исходного Her2t (результаты окрашивания Her2t не представлены, но основаны на данных предыдущих экспериментов). Her2t (IgG4hinge) улучшал связывание герцептина по сравнению с Her2t или Her2t(CD28hinge), в то время как вариант Her2tG обладал наибольшей способностью связываться с герцептином и окрашивать транедуцированные клетки Н9.
Определения.
[00027] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.
[00028] В настоящей заявке термин «приблизительно» при ссылке на измеряемое значение включает отклонения на ±20% или ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1%, и еще более предпочтительно ±0,1% от заданного значения.
[00029] В настоящей заявке термин «антиген» или «Ag» относится к молекуле, которая вызывает иммунный ответ. Иммунный ответ может включать выработку антител или активацию специфичных иммунологически компетентных клеток, или оба процесса. Очевидно, что антиген может быть создан, синтезирован, получен рекомбинантным способом или получен из биологического образца. Подходящий биологический образец может включать, но не ограничивается ими, образец ткани, образец опухоли, клетку или биологическую жидкость, такую как, например, кровь, плазма и асцитная жидкость.
[00030] В настоящей заявке термин «противоопухолевый эффект» относится к биологическому эффекту, который может проявляться в уменьшении объема опухоли, уменьшении количества опухолевых клеток, уменьшении числа метастазов, увеличении средней продолжительности жизни или уменьшении различных физиологических симптомов, связанных с раковым состоянием. «Противоопухолевый эффект» также может проявляться снижением количества рецидивов или увеличением времени до рецидива. Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении предложен способ лечения пациента, причем указанный способ включает введение эффективного количества композиции, при этом указанная композиция содержит клетки, при этом указанные клетки композиции экспрессируют химерный антигенный рецептор, содержащий антигенсвязывающий домен, связывающийся с опухолевым антигеном, экспрессируемым на раковой клетке, и генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации композиция обладает противоопухолевым действием.
[00031] В настоящей заявке термин «химерный рецептор» относится к рецептору, разработанному синтетическим способом, содержащему лигандсвязывающий домен антитела или другую белковую последовательность, которая связывается с молекулой, ассоциированной с заболеванием или расстройством, и соединенному посредством спейсерного участка с одним или более внутриклеточными сигнальными доменами Т-клетки или другими рецепторами, такими как костимулирующий домен. Химерный рецептор также может упоминаться как искусственные рецепторы Т-клеток, химерные рецепторы Т-клеток, химерные иммунорецепторы и химерные антигенные рецепторы (CAR). Указанные CAR представляют собой модифицированные рецепторы, которые могут придавать относительную специфичность иммунной рецепторной клетке. Химерные антигенные рецепторы или «CAR» упоминаются некоторыми исследователями как рецепторы, содержащие антитело или фрагмент антитела, спейсер, сигнальный домен и трансмембранный участок. Однако вследствие неожиданных эффектов, вызванных модификацией различных компонентов или доменов CAR, таких как области связывания эпитопа (например, фрагмент антитела, scFv или его часть), спейсер, трансмембранный домен и/или сигнальный домен, компоненты CAR описаны в некоторых частях настоящего документа как независимые элементы. Изменение различных элементов CAR может, например, привести к более высокой аффинности связывания в отношении специфичного эпитопа.
[00032] В настоящей заявке термин «костимулирующий домен» относится к сигнальному фрагменту, передающему Т-клеткам сигнал, который, в дополнение к основному сигналу, который передается с участием, например, дзета-цепи CD3 комплекса TCR/CD3, вызывает Т-клеточный ответ, включая, но не ограничиваясь ими, процессы активации, пролиферации, дифференцировки, секреции цитокинов и т.п. Костимулирующий домен может содержать, но не ограничивается ими, полноразмерный или часть CD27, CD28, 41ВВ, ОХ40, CD30, CD40, ICOS, антигена, ассоциированного с функцией лимфоцитов 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3, и/или лиганда, который специфично связывается с CD83. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения костимулирующий домен представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, который взаимодействует с другими внутриклеточными посредниками, чтобы вызвать клеточный ответ, включая активацию, пролиферацию, дифференцировку, секрецию цитокинов и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации, описанным в настоящем документе, химерный антигенный рецептор содержит костимулирующий домен.
[00033] В настоящей заявке термин «кодирование» относится к свойству специфичных последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таких как ген, кДНК или мРНК, выполнять функцию матриц для синтеза других макромолекул, таких как определенная последовательность аминокислот. Термин «кодирование» может быть использован взаимозаменяемо с термином «кодирующий». Следовательно, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей указанному гену, приводит к выработке белка в клетке или другой биологической системе. Термин «последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид» включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют аналогичную аминокислотную последовательность.
[00034] В настоящей заявке термин «цитотоксический Т-лимфоцит» (ЦТЛ) относится к Т-лимфоциту, экспрессирующему CD8 на своей поверхности (т.е. CD8+ Т-клетке). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения такие клетки предпочтительно представляют собой Т-клетки «памяти» (ТМ-клетки), которые вступали в контакт с антигеном.
[00035] В настоящей заявке термин Т-клетка «центральной памяти» (или «ТСМ») относится к ЦТЛ, вступавшим в контакт с антигеном, экспрессирующим CD62L или CCR-7 и CD45RO на своей поверхности, и не экспрессирующим или имеющим сниженный уровень экспрессии CD45RA, по сравнению с наивными клетками. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки центральной памяти являются положительными в отношении экспрессии CD62L, CCR7, CD28, CD 127, CD45RO и/или CD95, и/или имеют сниженный уровень экспрессии CD54RA по сравнению с наивными клетками. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена клетка-хозяин, причем указанная клетка-хозяин является антигенспецифичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка представляет собой Т-клетку центральной памяти.
[00036] В настоящей заявке термин Т-клетка «эффекторной памяти» (или «ТЕМ») относится к Т-клетке, которая вступала в контакт с антигеном, которая не экспрессирует или имеет сниженный уровень экспрессии CD62L на своей поверхности, по сравнению с клетками центральной памяти, и не экспрессирует или имеет сниженный уровень экспрессии CD45RA по сравнению с наивными клетками. Согласно некоторым вариантам реализации клетки эффекторной памяти являются отрицательными в отношении экспрессии CD62L и CCR7, по сравнению с наивными клетками или клетками центральной памяти, и имеют различные уровни экспрессии CD28 и CD45RA. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена клетка-хозяин, причем указанная клетка-хозяин является антигенспецифичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка представляет собой Т-клетку эффекторной памяти.
[00037] В настоящей заявке термин «наивные» Т-клетки относится к Т-лимфоциту, не вступавшему в контакт с антигеном, который экспрессирует CD62L и CD45RA, и не экспрессирует CD45RO- по сравнению с клетками центральной или эффекторной памяти. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наивные CD8+ Т-лимфоциты характеризуются экспрессией фенотипических маркеров наивных Т-клеток, включая CD62L, CCR7, CD28, CD127 и/или CD45RA. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена клетка-хозяин, причем указанная клетка-хозяин является антигенспецифичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка является наивной Т-клеткой.
[00038] В настоящей заявке термин «эффекторные» Т-клетки, «TE», относится к цитотоксическим Т-лимфоцитам, вступавшим в контакт с антигеном, которые не экспрессируют или имеют сниженные уровни экспрессии CD62L, CCR7 и/или CD28, и являются положительными в отношении гранзима В и/или перфорина по сравнению с клетками центральной памяти или наивными Т-клетками. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена клетка-хозяин, причем указанная клетка-хозяин является антигенспецифичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка является эффекторной Т-клеткой.
[00039] В настоящей заявке термин «предшественники Т-клеток» относится к лимфоидным клеткам-предшественникам, которые могут мигрировать в тимус и становиться предшественниками Т-клеток, которые не экспрессируют Т-клеточный рецептор. Все Т-клетки происходят от гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге. Гемопоэтические клетки-предшественники (лимфоидные клетки-предшественники), которые происходят от гемопоэтических стволовых клеток, заселяют тимус и размножаются путем деления клеток, чтобы создать большую популяцию незрелых тимоцитов. Самые ранние тимоциты не экспрессируют ни CD4, ни CD8, и поэтому классифицируются как двойные отрицательные (CD4-CD8-) клетки. По мере созревания, указанные клетки становятся двойными положительными тимоцитами (CD4+ CD8+), и, наконец, созревают в моноположительные (CD4+CD8-) или CD4-CD8+) тимоциты, которые затем высвобождаются из тимуса в периферические ткани.
[00040] Приблизительно 98% тимоцитов умирают во время процессов развития в тимусе, не пройдя ни положительного отбора, ни отрицательного отбора, в то время как другие 2% выживают и покидают тимус, чтобы стать зрелыми иммунокомпетентными Т-клетками.
[00041] Двойная отрицательная (DN) стадия предшественника Т-клеток ориентирована на выработку функциональной бета-цепи, тогда как двойная положительная (DP) стадия ориентирована на выработку функциональной альфа-цепи, в конечном итоге, обеспечивая выработку функционального αβ Т-клеточного рецептора. По мере того как развивающиеся тимоциты проходят четыре стадии DN (DN1, DN2, DN3 и DN4), Т-клетка экспрессирует инвариантную альфа-цепь, но перестраивает локус β-цепи. Если перестроенная β-цепь успешно спаривается с инвариантной α-цепью, то вырабатываются сигналы, которые приостанавливают перестройку бета-цепи (и подавляют альтернативный аллель) и приводят к пролиферации клетки. Несмотря на то, что эти сигналы требуют присутствия пре-TCR на поверхности клетки, они зависят от связывания лигандов с пре-TCR. Указанные тимоциты затем начинают экспрессировать CD4 и CD8 и прогрессируют до стадии двойной положительной (DP) клетки, когда происходит отбор α-цепи. Если перестроенная β-цепь не приводит к передаче сигналов (например, в результате неспособности спаривания с инвариантной альфа-цепью), то клетка может погибнуть вследствие исключения из процессов сигнализации (отсутствие передачи сигналов).
[00042] «Гемопоэтические стволовые клетки» или «ГСК», как описано в настоящем документе, представляют собой клетки-предшественники, которые могут дать начало миелоидным клетками, таким как, например, макрофаги, моноциты, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты/тромбоциты, дендритные клетки и лимфоидные клоны (такие как, например, Т-клетки, В-клетки, NK-клетки). ГСК представляют собой гетерогенную популяцию, в которой существуют три класса стволовых клеток, которые различаются по соотношению лимфоидного и миелоидного потомства в крови (L/M).
[00043] В настоящей заявке термины «обогащенный» и «истощенный» описывают количество типов клеток в смеси, относятся к воздействию на смесь клеток процесса или этапа, который приводит к увеличению числа «обогащенного» типа и уменьшению числа «истощенных» клеток. Следовательно, в зависимости от источника исходной популяции клеток, подвергнутой процессу обогащения, смесь или композиция может содержать 60, 70, 80, 90, 95 или 99% или более (по числу или количеству) «обогащенных» клеток, включая любое целое число, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя конечными точками любого из перечисленных значений, и 40, 30, 20, 10, 5 или 1% или менее (по числу или количеству) «истощенных» клеток, включая любое число, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя конечными точками любого из перечисленных значений.
[00044] В настоящей заявке термин «эпитоп» относится к части антигена или молекулы, которая распознается иммунной системой, включая антитела, Т-клетки и/или В-клетки. Эпитопы, как правило, содержат по меньшей мере 7 аминокислот и могу быть линейными или конформационными.
[00045] Термин «Her2» или «ERBB2» относится к мембранно-связанному протеинкиназному рецептору, который нуждается в корецепторе для связывания лиганда. Эталонная последовательность типичного полипептида Her2 может быть найдена в UniProt под номером Р04626 и SEQ ID NO: 23. (Таблица 8) Полноразмерная эталонная последовательность содержит 1255 аминокислот, включая сигнальную последовательность из 1-22 аминокислот, внеклеточный домен из 23-652 аминокислот, трансмембранный домен из 653-675 аминокислот и цитоплазматический домен из 676-1255 аминокислот, приведенные в таблице 8. Полноразмерная зрелая полипептидная последовательность содержит 1233 аминокислоты, поскольку лидерная последовательность не входит в зрелый полипептид. Известно несколько природных вариантов и изоформ. Эталонная нуклеиновая последовательность может быть найдена в Genbank под номером X03363/gI 31197. Внеклеточный домен содержит 4 области, которые соответствуют: аминокислотам 23-217 домена I; аминокислотам с 218 по 341 домена II; аминокислотам с 342 по 510 домена III; и аминокислотам с 511 по 562 домена IV последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23.
[00046] Термин «Her2t» относится к фрагменту последовательности Her2 и подходит для использования в качестве генетической метки для экспрессии трансгена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Her2t содержит домен IV внеклеточного домена Her2 и не включает полноразмерный Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Her2t специфично связывается с антителом, специфичным в отношении домена IV Her2. Согласно другим вариантам реализации Her2t содержит аминокислоты с 511 по 562 или 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23.
[00047] Термин «выделенный» используется для описания различных полипептидов, описанных в настоящем документе, и обозначает полипептид или нуклеиновую кислоту, которая была идентифицирована и отделена и/или выделена из компонентов природной среды. Предпочтительно выделенный полипептид или нуклеиновая кислота не связана с любыми компонентами, с которыми она связана в природе. Загрязняющие компоненты природной среды представляют собой материалы, которые обычно препятствуют диагностическому или терапевтическому применению полипептида или нуклеиновой кислоты, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества.
[00048] В настоящей заявке термин «внутриклеточный сигнальный домен» относится ко всему или части одного или более доменов молекулы (в настоящем изобретении молекулы химерного рецептора), которая обеспечивает активацию лимфоцита. Внутриклеточные домены таких молекул опосредуют передачу сигнала, взаимодействуя с клеточными медиаторами, чтобы вызвать пролиферацию, дифференцировку, активацию и другие эффекторные функции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные молекулы включают полноразмерный или часть CD28, CD3 и/или 4-1ВВ или их комбинации.
[00049] В настоящей заявке термин «лиганд» относится к веществу, которое специфично связывается с другим веществом с образованием комплекса. Примеры лигандов включают эпитопы антигенов, молекулы, которые связываются с рецепторами, субстратами, ингибиторами, гормонами и активаторами. В настоящей заявке термин «лигандсвязывающий домен» относится к веществу или части вещества, которая связывается с лигандом. Примеры лигандсвязывающих доменов включают антигенсвязывающие фрагменты антител, внеклеточные домены рецепторов и активные центры ферментов.
[00050] В настоящей заявке термин «функционально соединенный» относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, что приводит к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально соединена со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально соединен с кодирующей последовательностью, если промотор воздействует на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Обычно функционально соединенные последовательности ДНК являются смежными и, в случае необходимости, функциональную связь используют для соединения двух областей, кодирующих белки, в одной и той же рамке считывания.
[00051] Термин «процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» в отношении полипептидных последовательностей генетической метки, определенных в настоящем документе, определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной последовательности после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может быть достигнуто различными способами, которые известны специалистам в данной области техники, например, с помощью общедоступного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для оценки выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Например, процент идентичности аминокислотных последовательностей, полученный с применением компьютерной программы WU-BLAST-2 [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)], основан на нескольких параметрах поиска, большинство из которых установлены как значения по умолчанию. Параметры, которые не установлены как значения по умолчанию (то есть, регулируемые параметры), устанавливаются со следующими значениями: длина перекрывания = 1, доля перекрывания = 0,125, пороговая длина слова (Т) = 11 и оценочная матрица = BLOSUM62. Значение процента идентичности аминокислотных последовательностей определяют путем деления (а) количества совпадающих идентичных аминокислотных остатков между каждой или всеми аминокислотными последовательностями эталонной последовательности Her2, представленной в SEQ ID NO: 15, или аминокислотами 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, и сравниваемой аминокислотной последовательностью, представляющей интерес, как определено WU-BLAST-2, на (b) общее количество аминокислотных остатков полипептида, представляющего интерес.
[00052] В настоящей заявке термин «вариант полинуклеотида генетической метки» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, определенной ниже, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 15, или ее нуклеотидам или ее фрагменту, полученному специфично. Обычно вариант полинуклеотида или его фрагмента будет по меньшей мере приблизительно на 80% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 81% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 82% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 83% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 84% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 85% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 86% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 87% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 88% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 89% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 91% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 92% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 93% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 94% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 96% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 97% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 98% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 99% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 14, или фрагменту, полученному из нее, или идентичен указанной последовательности нуклеиновой кислоты на любую величину процента идентичности, которая находится в диапазоне между любыми двумя из перечисленных процентных значений идентичности последовательностей нуклеиновых кислот. Варианты не включают нативную нуклеотидную последовательность. В связи с этим, вследствие вырожденности генетического кода, специалист в данной области техники поймет, что большое количество вариантов полинуклеотидов, кодирующих химерный рецептор, имеет по меньшей мере приблизительно 80% идентичность последовательности нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 14, или нуклеотидами, которые кодируют полипептид, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18.
[00053] Термин «по существу очищенный» относится к молекуле, которая содержит 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% или менее других типов молекул или других типов клеток, или имеет любое значение процента очистки, которое находится в диапазоне между любыми двумя из перечисленных значений процента очистки. По существу очищенная клетка также относится к клетке, которая была отделена от других типов клеток, с которыми она обычно связана в природном состоянии. В некоторых случаях популяция по существу очищенных клеток относится к гомогенной популяции клеток.
[00054] Термин «по существу не обнаружено», при использовании в отношении присутствия опухолевого антигена или других молекул на нормальных клетках, относится к проценту нормальных клеток, которые содержат антиген или молекулу, и/или к плотности антигена на клетках. Согласно некоторым вариантам реализации «по существу не обнаружено» означает, что антиген или молекула обнаруживается на менее чем 50% нормальных клеток и/или с плотностью, которая на 50% меньше, по сравнению с количеством клеток или антигена, обнаруженного на опухолевой клетке или другой больной клетке.
[00055] В настоящей заявке «Т-клетки» или «Т-лимфоциты» могут быть получены из любого млекопитающего, предпочтительно примата, вида, включая обезьян, собак и человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки являются аллогенными (получены из одного и того же вида, но другого донора) по отношению к субъекту-реципиенту; согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки являются аутологичными (донор и реципиент представляют собой одного и того же субъекта); согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки являются сингенными (донор и реципиент являются разными субъектами, но идентичными близнецами).
[00056] «Вектор» или «конструкция» представляет собой нуклеиновую кислоту, используемую для введения гетерологичных нуклеиновых кислот в клетку, которая содержит регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию гетерологичных нуклеиновых кислот в клетке. Векторы включают, но не ограничиваются ими, плазмиды, миникольцевые нуклеиновые кислоты, геномы дрожжей и вирусов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00057] В настоящем изобретении предложен полипептид генетической метки или его вариант, и нуклеиновая кислота, кодирующая генетическую метку, которую можно применять для того чтобы обеспечить селективный маркер и/или идентификационный маркер для клеток, экспрессирующих трансген.
Генетические метки трансгена, полипептиды и варианты.
[00058] Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена генетическая метка для экспрессии трансгена, которая обеспечивает стабильную экспрессию трансгена в клетках. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка обеспечивает селекцию трансдуцированных клеток, которые экспрессируют трансген на уровне, сопоставимом с таковым для эндогенных генов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка экспрессируется на поверхности клеток, имеет сниженную иммуногенность, по существу не увеличивает полезную генетическую нагрузку в векторе и/или обеспечивает экспрессию трансгенов в различных клетках.
[00059] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка представляет собой фрагмент Her2, обозначенный Her2t, который по меньшей мере содержит эпитоп, распознаваемый антителом к Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело специфично связывается с доменом IV Her2. Согласно другим вариантам реализации антитело специфично связывается с доменом IV Her2, и не связывается с эпитопами в доменах I, II и/или III Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело к Her2 представляет собой антитело, терапевтически пригодное для лечения рака. Согласно некоторым вариантам реализации эпитоп распознается трастузумабом (герцептин). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эпитоп распознается трастузумабом и/или антителами, которые конкурируют за связывание с трастузумабом, но не другими антителами к Her2, которые связываются, например, с эпитопами в доменах I, II и/или III Her2.
[00060] В конкретном варианте реализации эпитоп содержит аминокислоты, определенные с помощью кристаллической структуры Her2 в комплексе с Fab герцептина (Cho et al., Nature (2003) 421:756). Взаимодействие между Her2 и герцептином происходит между тремя петлевыми участками (два электростатических и один гидрофобный) в домене IV. Основные аминокислоты в Her2, взаимодействующие с герцептином, включают: петлю 1 (электростатическую), которая содержит аминокислотную последовательность 580-584 EADQC (включая Glu 580 и Asp 582) (SEQ ID NO: 42), петлю 2 (гидрофобную), которая содержит аминокислотную последовательность 592-595 DPPF (включая Asp 592 и Phe 595) (SEQ ID NO: 43) и петлю 3 (электростатическую), которая содержит аминокислотную последовательность 616-625 FPDEEGACQP (включая Gin 624) (SEQ ID NO: 44) (система нумерации аминокислот основана на полноразмерной последовательности ErbB2 (Her2), представленной в SEQ ID NO: 23, включая сигнальную последовательность, и приведена в таблице 8). Используя систему нумерации, предложенную Cho et al., согласно которой из сигнальной последовательности удалены 22 аминокислоты, установлено, что во взаимодействие с герцептином вступают следующие аминокислоты Her2: Glu 558 и Asp 560 петли 1, Asp 570 и Phe 573 петли 2 и Gin 602 петли 3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагмент Her2 содержит по меньшей мере указанные остатки аминокислот и подвергается дополнительному отбору для оценки его связывания с трастузумаб или антителом, которое конкурирует за связывание с трастузумабом, при экспрессии на поверхности клетки. Не ограничивая объем настоящего изобретения, авторы настоящего изобретения полагают, что фрагмент Her2t, содержащий по меньшей мере аминокислоты 563-652, содержит эпитоп, который может связываться с трастузумабом, поскольку эпитоп меньшего размера, содержащий аминокислоты с 578 по 652, не связывается с трастузумабом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагмент Her2t содержит аминокислоты 563-652 Her2t. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагмент Her2t содержит аминокислотные последовательности 580-584 Her2t, аминокислотные последовательности 592-595 Her2t и аминокислотные последовательности 616-625 Her2t.
[00061] В конкретном варианте реализации фрагмент Her2 содержит, по существу состоит или состоит из аминокислот 511-652 (домен IV) или 563-652, приведенных в таблице 6 (SEQ ID NO: 18). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность варианта фрагмента Her2 по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 18, или идентична на величину процента, которая находится в диапазоне, определенном любыми двумя из указанных выше процентных значений, и при экспрессии на поверхности клетки связывается с трастузумабом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вариант фрагмента содержит по меньшей мере 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замену аминокислоты, предпочтительно консервативные замены аминокислот. Подходящие замены могут быть выявлены на основании кристаллической структуры Her2 в комплексе с Fab герцептина (Cho et al., Nature (2003)). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вариант фрагмента не содержит замену аминокислоты в остатках, участвующих в связывании с трастузумабом, как описано в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагмент содержит остатки в домене IV Her2, и не содержит один или более других доменов Her2, включая домен I, домен II, домен III и/или внутриклеточные домены.
[00062] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка не вызывает иммунного ответа или вызывает незначительный иммунный ответ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка выбрана из эндогенных белков для того чтобы воспользоваться преимуществами невосприимчивости субъекта к действию эндогенных белков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическую метку исследуют с помощью программного обеспечения для прогнозирования антигенных эпитопов, такого как алгоритм предсказания процессинга антигенного пептида MHC-I. Последовательность: MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPCHPECQPQNGSVT (SEQ ID NO: 16) исследуют для определения антигенных детерминант. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты генетической метки получена и/или модифицирована из последовательности зародышевой линии для включения в искусственную или синтетическую трансгенную конструкцию.
[00063] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка дополнительно содержит трансмембранный домен. Трансмембранный домен может быть получен из природного или синтетического источника. Если источник является природным, домен может быть получен из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка. Трансмембранные участки содержат по меньшей мере трансмембранную область(и) альфа, бета или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3, CD45, CD4, CD8, CD9, CD16, CD22; CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD 137 и/или CD 154. В конкретном варианте трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена Her2, представленного в таблице 6 (например, аминокислоты 653-675 (SEQ ID NO: 20). Типичная полинуклеотидная последовательность, кодирующая трансмембранный домен Her2 (SEQ. ID NO: 19), представлена в таблице 6.
[00064] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения синтетические трансмембранные домены или их варианты содержат преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность трансмембранного домена может быть по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична последовательности трансмембранного домена, приведенной в таблице 6, или значение процента идентичности последовательности находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных выше процентных значений. Варианты трансмембранных доменов предпочтительно имеют оценку степени гидрофобности по меньшей мере 50, вычисленную по шкале Kyte Doolittle.
[00065] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка содержит пептид, который усиливает поверхностную экспрессию генетической метки. Подходящие пептиды включают, например, сигнальную последовательность гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, лидерный пептид эндогенного Her2 (аминокислоты 1-22), сигнальные пептиды типа I, сигнальный пептид IgGκ и/или лидерную последовательность CD8. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO: 17.
[00066] В конкретном варианте реализации генетическая метка содержит фрагмент Her2, который связывается с трастузумабом, и трансмембранный домен, примером которого служит последовательность SEQ ID NO: 20. В другом конкретном варианте реализации генетическая метка содержит пептид, который усиливает поверхностную экспрессию, фрагмент Her2, который связывается с трастузумабом, и трансмембранный домен, примером которого служит последовательность SEQ ID NO: 15. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность варианта генетической метки на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 20, или значение процента идентичности последовательности находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных выше процентных значений, и при экспрессии на поверхности клетки связывается с трастузумабом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вариант фрагмента содержит по меньшей мере 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, или 1 замену аминокислоты, предпочтительно консервативные замены аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вариант фрагмента не содержит замену аминокислоты в остатках, участвующих в связывании с трастузумабом.
[00067] Необязательно последовательность линкера может предшествовать последовательности генетической метки и/или разделяет один или более функциональных доменов (например, пептид для усиления поверхностной экспрессии, генетическая метка, трансмембранный домен) генетической метки. Последовательности линкеров необязательно расщепляются, например, последовательности Т2А (приведенные в таблице 1) или последовательности IRES. Расщепляемые линкерные последовательности, как правило, предшествуют последовательности генетической метки в конструкции нуклеиновой кислоты. Другие линкерные последовательности, как правило, представляют собой короткие пептиды, содержащие приблизительно от 2 до 15 аминокислот, и расположены между функциональными доменами генетической метки, включая пептид для усиления поверхностной экспрессии, генетическую метку и трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкеры содержат 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот и расположены между функциональными доменами генетической метки, включая пептид для усиления поверхностной экспрессии, генетическую метку и трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации линкер представляет собой расщепляемый линкер. Согласно некоторым вариантам реализации линкер представляет собой расщепляемую последовательность Т2А. Согласно некоторым вариантам реализации линкер содержит последовательности IRES.
[00068] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система дополнительно содержит одну или более дополнительных генетических меток. Согласно другому варианту дополнительная последовательность генетической метки представляет собой фрагмент последовательности рецептора эпидермального фактора роста (EGFRt). Пример такой последовательности приведен в таблице 7. Как правило, последовательность генетической метки имеет функциональную характеристику, которая обеспечивает отбор трансдуцированных клеток и/или детектирование трансдуцированных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность генетической метки совместима с трансдукцией лимфоцитов человека.
[00069] В других вариантах реализации настоящего изобретения дополнительная генетическая метка представляет собой положительный селективный маркер. Положительная селективная генетическая метка может представлять собой ген, который при введении в клетку-хозяина экспрессирует доминирующий фенотип, обеспечивающий положительную селекцию клеток, несущих ген. Гены указанного типа известны в данной области техники и включают, среди прочего, ген гигромицин-В-фосфотрансферазы (hph), который придает устойчивость к гигромицину В, ген аминогликозидфосфотрансферазы (neo или aph) из Tn5, который кодирует устойчивость к антибиотику G418, ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), который обеспечивает устойчивость к метотрексату, DHFR dm, ген рас, который обеспечивает устойчивость к пуромицину, ген Sh ble, который инактивирует зеоцин, ген аденозиндезаминазы (ADA) и ген множественной лекарственной устойчивости (MDR). Транедуцированные клетки, культивируемые в присутствии указанных агентов, будут выживать и могут быть отобраны. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
[00070] Согласно другому варианту первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий последовательность генетической метки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность генетической метки представляет собой последовательность Her2t. Типичные полинуклеотидные и аминокислотные последовательности Her2t приведены в таблице 6, и представлены в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно. Согласно другому варианту последовательность генетической метки представляет собой фрагмент рецептора эпидермального фактора роста (EGFRt), представленный в таблице 7. Типичный полинуклеотид усеченного рецептора эпидермального фактора роста представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22.
[00071] Полинуклеотид, кодирующий генетическую метку, может быть легко получен с помощью синтетических или рекомбинантных способов из аминокислотной последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий последовательность генетической метки, функционально связан с полинуклеотидом, кодирующим линкерную последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий последовательность генетической метки, также может содержать один или более сайтов рестрикции на 5'- и/или 3'-конце кодирующей последовательности, чтобы обеспечить легкое удаление и замену полинуклеотида, кодирующего последовательность метки, другим полинуклеотидом, кодирующим другую последовательность генетической метки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида, кодирующего маркерную последовательность, оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно у человека.
[00072] Согласно некоторым вариантам реализации могут быть использованы две или более последовательностей генетической метки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая последовательность генетической метки функционально связана с первым химерным антигенным рецептором и обеспечивает возможность детектирования того, что трансдуцированная клетка экспрессирует первый CAR. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вторая последовательность генетической метки функционально связана со вторым и отличающимся CAR и обеспечивает возможность детектирования того, что трансдуцированная клетка экспрессирует второй CAR.
Нуклеиновые кислоты и векторы.
[00073] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены конструкции нуклеиновых кислот и их варианты, кодирующие генетические метки, описанные в настоящем документе.
[00074] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность фрагмента Her2 или его варианта. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность генетической метки представляет собой фрагмент рецептора эпидермального фактора роста (EGFRt), представленный в таблице 7. Типичный полинуклеотид усеченного рецептора эпидермального фактора роста представляет собой последовательность SEQ ID NO: 21. Нуклеиновые кислоты включают последовательности нуклеиновых кислот, кодоны которых оптимизированы для экспрессии в организме человека, вырожденные последовательности и варианты последовательностей.
Векторы.
[00075] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую генетическую метку. Нуклеиновая кислота, кодирующая генетическую метку, может быть упакована в вектор в виде отдельной конструкции или соединена с нуклеиновой кислотой, кодирующей трансген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая генетическую метку, упакована в вектор в виде отдельной конструкции или соединена с нуклеиновой кислотой, кодирующей трансген.
[00076] Множество комбинаций векторов могут быть сконструированы, чтобы обеспечить эффективную трансдукцию и экспрессию трансгена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой двойной упакованный или единый (все в одном) вирусный вектор. Согласно другим вариантам реализации векторы могут содержать комбинацию вирусных векторов и плазмидных векторов. Другие вирусные векторы включают пенистый вирус, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы и лентивирусные векторы. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой лентивирусный вектор.
[00077] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения плазмидный вектор или вирусный вектор содержит нуклеиновую кислоту, содержащую полинуклеотид, кодирующий генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка содержит полинуклеотид, кодирующий Her2t, и дополнительно содержит промотор, полинуклеотид, кодирующий пептид для усиления поверхностной экспрессии, и/или полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен. Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, или SEQ ID NO: 15 или ее вариант, функционально соединенный с промотором.
[00078] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения плазмидный или вирусный вектор содержит промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор направлен к CD19 или CD20, и генетическая метка содержит фрагмент Her2t. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий CAR, функционально соединен с генетической меткой с помощью саморасщепляющегося линкера. В других вариантах реализации настоящего изобретения плазмидный или вирусный вектор содержит промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор CD19, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим Her2t или EGFRt. В других вариантах реализации настоящего изобретения плазмидный или вирусный вектор содержит промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор CD20, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим Her2t или EGFRt.
[00079] Каждый элемент нуклеиновой кислоты может быть отделен от другого линкерной последовательностью, предпочтительно саморасщепляющимся линкером, таким как саморасщепляющаяся последовательность Т2А.
[00080] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гетерогенная (гетерогенная по отношению к вектору, например, лентивирусному вектору) последовательность нуклеиновой кислоты ограничена количеством дополнительных генетических компонентов, которые могут быть упакованы в вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция содержит по меньшей мере два гена, гетерогенных по отношению к вирусному вектору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция содержит не более 4 генов, гетерогенных по отношению к вирусному вектору. Число генов, гетерогенных по отношению к вирусному вектору, которые могут быть упакованы в вектор, может быть определено путем детектирования экспрессии одного или более трансгенов, и отбора векторных конструкций, которые обеспечивают трансдукцию по меньшей мере 10% клеток и/или детектируемые уровни экспрессии трансгена в по меньшей мере 10% клеток.
[00081] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лентивирус представляет собой двойной упакованный вирус. Двойной упакованный вирус содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор и первую генетическую метку. При необходимости, нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий цитокин и/или рецептор хемокина. Двойной упакованный вирус содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор и вторую генетическую метку. При необходимости, нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий цитокин и/или рецептор хемокина. Согласно некоторым вариантам реализации системы с двумя конструкциями, каждая конструкция может быть упакована в отдельный вирусный вектор и вирусные векторы могут быть смешаны для трансдукции в клеточной популяции. Согласно некоторым вариантам реализации первая и вторая генетические метки отличаются.
[00082] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения двойной упакованный вирус обеспечивает экспрессию по меньшей мере двух различных трансгенов (например, конструкций CAR) в одном типе клеток. Использование различных генетических меток обеспечивает отбор клеток, трансдуцированных двумя конструкциями. В конкретном варианте плазмидный или вирусный вектор содержит промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор CD19, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим Her2t. В других вариантах плазмидный или вирусный вектор дополнительно содержит промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор CD20, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим EGFRt.
[00083] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой миникольцо. Миникольца представляют собой эписомные ДНК-векторы, которые получают в виде кольцевой кассеты для экспрессии, которая не содержит бактериального плазмидного ДНК-остова. Небольшая молекулярная масса миниколец обеспечивает более эффективную трансфекцию и устойчивую экспрессию в течение недели по сравнению со стандартными плазмидными векторами, которые функционируют только в течение нескольких дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миникольцо содержит промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, функционально соединенный с генетической меткой. Можно применять одно или более миниколец. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миникольцо содержит промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор и первую генетическую метку, другое миникольцо содержит промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор и отличающуюся вторую генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации каждый элемент конструкций отделен нуклеиновой кислотой, такой как нуклеиновая кислота, кодирующая саморасщепляющуюся последовательность Т2А. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждое из миниколец отличается от другого химерным антигенным рецептором, включая, но не ограничиваясь ими, длину и последовательность спейсера, внутриклеточный домен для передачи сигналов и/или последовательность генетической метки.
[00084] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой транспозон PiggyBac. Транспозон PiggyBac (РВ) представляет собой мобильный генетический элемент, который эффективно перемещается между векторами и хромосомами с помощью механизма «вырезания и вставки». Во время транспозиции транспозаза РВ распознает последовательности инвертированных концевых повторов (ITR), специфичные для транспозонов, расположенные на обоих концах транспозонного вектора, эффективно перемещает содержимое из исходных сайтов и эффективно встраивает его в хромосомные сайты ТТАА. Мощная активность транспозонной системы PiggyBac обеспечивает быструю мобилизацию представляющих интерес генов, расположенных между двумя ITR в векторе РВ, в целевые геномы.
[00085] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения РВ содержит промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, функционально соединенный с генетической меткой. Может быть использован один или более транспозонов РВ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения РВ содержит промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор и первую генетическую метку, другой РВ содержит промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор и отличающуюся вторую генетическую метку. Каждый элемент конструкций отделен нуклеиновой кислотой, например, кодирующей последовательность саморасщепляющегося линкера Т2А. Согласно некоторым вариантам реализации каждый из РВ отличается от другого химерным антигенным рецептором, включая, но не ограничиваясь ими, длину и последовательность спейсера, внутриклеточный домен для передачи сигналов и/или последовательность генетической метки.
[00086] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота содержит первый промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащим лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен связывается с лигандом, при этом указанный лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, которая опосредует распознавание и удаление лимфоцитами; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер обеспечивает увеличение пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит генетическую метку.
[00087] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий отличающийся второй химерный антигенный рецептор. Первый и второй химерные антигенные рецепторы могут различаться по лигандсвязывающему домену, антигену-мишени, эпитопу антигена-мишени, длине и последовательности спейсера (короткий, средний или длинный) и внутриклеточным доменам для передачи сигналов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит отличающуюся вторую генетическую метку, которая отличается от метки, кодируемой первой нуклеиновой кислотой.
[00088] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты в отдельной лентивирусной конструкции могут быть разделены с помощью геномной инсуляторной нуклеиновой кислоты, такой как инсуляторный домена хроматина морского ежа.
[00089] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения промоторы, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой индуцируемые или конститутивные промоторы. Индуцируемые промоторы включают индуцируемый тамоксифеном промотор, индуцируемый тетрациклином промотор и индуцируемый доксоциклином промотор (например, TRE). Конститутивные промоторы включают SV40, CMV, UBC, EF1α, PGK и CAGG.
[00090] Один или более из указанных векторов могут быть использованы в комбинации для транедукции клеток-мишеней и обеспечивают экспрессию химерного антигенного рецептора.
Трансгены
[00091] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложено несколько трансгенов.
[00092] Генетические метки, описанные в настоящем изобретении, могут быть использованы для отбора, отслеживания и уничтожения клеток, трансдуцированных и экспрессирующих трансген. Генетические метки могут быть использованы с любым количеством различных трансгенов. В настоящем описании представлены типичные трансгены химерных антигенных рецепторов, однако аналогичные принципы применимы к дизайну, идентификации и отбору других трансгенов, экспрессируемых в трансдуцированных клетках.
Химерные антигенные рецепторы
[00093] Некоторые химерные антигенные рецепторы могут быть использованы в других вариантах, описанных в настоящем документе.
[00094] Система для экспрессии химерного антигенного рецептора содержит первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен связывается с лигандом, при этом указанный лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, который пригоден в качестве посредника для распознавания и устранения лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий спейсерный полипептид, причем указанный спейсер обеспечивает увеличение пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно другим вариантам реализации другой полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, находится под контролем конститутивного промотора.
Лигандсвязывающий домен.
[00095] Многие лигандсвязывающие домены могут быть использованы в других вариантах, описанных в настоящем документе.
[00096] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая химерный рецептор, содержит полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен специфично связывается с антигеном, специфичным для опухоли или вируса. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен содержит, но не ограничивается ими, рецепторы или их части, небольшие пептиды, пептидомиметики, субстраты, цитокины и тому подобное. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой антитело или его фрагмент. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или фрагмент антитела, может быть легко определена. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения полинуклеотид кодирует одноцепочечный Fv, который специфично связывается с CD19. В других конкретных вариантах реализации настоящего изобретения полинуклеотид кодирует одноцепочечный Fv, который специфично связывается с CD20, Her2, СЕ7, hB7H3 или EGFR. Последовательности указанных антител известны или могут быть легко определены специалистами в данной области техники.
[00097] Опухолевые антигены представляют собой белки, которые вырабатываются опухолевыми клетками, которые вызывают иммунный ответ. Выбор лигандсвязывающего домена согласно настоящему изобретению будет зависеть от типа рака, который лечат, и может быть направлен на опухолевые антигены или другие молекулы на поверхности опухолевых клеток. Образец опухоли от субъекта может быть охарактеризован для определения присутствия конкретных биомаркеров или поверхностных клеточных маркеров. Например, клетки рака молочной железы от субъекта могут быть положительными или отрицательными для каждого из Her2Neu, рецептора эстрогенов и/или рецептора прогестерона. Отбирают опухолевый антиген или поверхностную молекулу клетки, которые обнаруживают на опухолевых клетках отдельного субъекта. Опухолевые антигены и поверхностные молекулы клеток хорошо известны в данной области техники и включают, например, карциноэмбриональный антиген (СЕА), специфичный антиген простаты, PSMA, Her2/Neu, рецептор эстрогенов, рецептор прогестерона, ephrinB2, CD19, CD171, EGFR, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, СЕ7, hB7H3, ROR1, мезотелин, c-Met, GD-2 и/или MAGE A3 TCR. Согласно некоторым вариантам реализации молекула-мишень представляет собой молекулу на поверхности клеток, которая находится на опухолевых клетках и по существу не обнаруживается на нормальных тканях, или ее экспрессия ограничена невитальными нормальными тканями.
[00098] Согласно другому варианту молекула-мишень на опухоли содержит один или более эпитопов, связанных со злокачественной опухолью. Злокачественные опухоли экспрессируют ряд белков, которые могут служить в качестве антигенов-мишеней для распознавания, опосредованного Т-клеточным рецептором или химерным рецептором. Другие молекулы-мишени относятся к группе молекул, связанных с трансформацией клеток, таких как CD19 или CD20. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолевый антиген селективно экспрессируется или сверхэкспрессируется на клетках опухоли по сравнению с контрольными клетками этого же типа ткани. В других вариантах реализации настоящего изобретения опухолевый антиген представляет собой поверхностный полипептид клеток.
[00099] После определения поверхностной молекулы опухолевой клетки, которая может являться мишенью химерного рецептора, отбирают и описывают эпитоп молекулы-мишени. Антитела, которые специфично связываются с поверхностной молекулой опухолевых клеток, могут быть получены с применением способов получения моноклональных антител, способов фагового дисплея, основных способов получения антител человека или гуманизированных антител, или способов с применением трансгенного животного или растения, модифицированного для получения антител человека. Библиотеки фагового дисплея частично или полностью синтетических антител доступны и могут быть подвергнуты скринингу для определения антитела или его фрагмента, который может связываться с молекулой-мишенью. Также доступны фаговые библиотеки антител человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела специфично связываются с поверхностной молекулой опухолевой клетки и не вступают в перекрестные реакции с неспецифичными компонентами, такими как бычий сывороточный альбумин, или другими неродственными антигенами. После выявления аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности, кодирующей антитело, указанные последовательности могут быть выделены и/или определены. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения библиотеки фагового дисплея частично или полностью синтетических антител подвергают скринингу для определения антитела или его фрагмента, который может связываться с молекулой-мишенью.
[000100] Антитела или антигенсвязывающие фрагменты включают полноразмерные поликлональные антитела, моноклональное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, синтетическое антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, минитело и линейное антитело или их части. Фрагменты антитела содержат часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела и могут быть легко получены. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диантитела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.
[000101] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения несколько различных антител, которые связываются с конкретными поверхностными молекулами опухолевых клеток, могут быть выделены и описаны. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела описывают на основании специфичности эпитопа молекулы-мишени. Кроме того, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, антитела, которые связываются аналогичным эпитопом, могут быть выбраны на основании аффинности антитела в отношении указанного эпитопа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аффинность антитела составляет по меньшей мере 1 мМ, предпочтительно <50 нМ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выбрано антитело, которое имеет более высокую аффинность в отношении эпитопа по сравнению с другими антителами. Например, выбрано антитело, величина аффинности которого по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере 50 раз выше величины аффинности эталонного антитела, которое связывается с аналогичным эпитопом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выбрано антитело, величина аффинности которого по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз выше величины аффинности эталонного антитела, которое связывается с аналогичным эпитопом, или величина аффинности которого находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из перечисленных заданных значений.
[000102] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекулы-мишени выбирают из CD19, CD20, CD22, CD23, СЕ7, hB7H3, EGFR, CD123, CS-1, ROR1, мезотелина, Her2, c-Met, PSMA, GD-2 и/или MAGE A3 TCR и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации, если желательной является конструкция CAR Her2, генетическая метка содержит эпитоп, который не связывается с scFv, специфичным в отношении Her2, используемым в конструкции CAR. Согласно некоторым вариантам реализации, если желательной является конструкция EGFR CAR, генетическая метка содержит эпитоп, который не связывается с scFv, специфичным в отношении EGFR, используемым в конструкции CAR.
[000103] В конкретных вариантах реализации антиген-мишень представляет собой CD19. Ряд антител, специфичных в отношении CD19, известны специалистам в данной области техники и могут быть легко охарактеризованы в отношении последовательности, параметров связывания эпитопа и аффинности. В конкретном варианте реализации конструкция химерного рецептора содержит последовательность scFv из антитела FMC63. Согласно другим вариантам реализации scFv представляет собой scFv человека или гуманизированный scFv, содержащий вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность RASQDISKYLN гипервариабельного участка CDRL1 (SEQ ID NO: 27), последовательность SRLHSGV участка CDRL2 (SEQ ID NO: 28) и последовательность GNTLPYTFG участка CDRL3 (SEQ ID NO: 29). Согласно другим вариантам реализации scFv представляет собой scFv человека или гуманизированный scFv, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность DYGVS участка CDRH1 (SEQ ID NO: 30), последовательность VIWGSETTYYNSALKS участка CDRH2 (SEQ ID NO: 31) и последовательность YAMDY участка CDRH3 (SEQ ID NO: 32). В область настоящего изобретения также включены вариабельные области, аминокислотные последовательности которых по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны аминокислотной последовательности scFv из антитела FMC63, или процент идентичности последовательностей находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных выше процентных значений, и которые имеют по меньшей мере аналогичную аффинность в отношении CD19.
[000104] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гипервариабельные участки (CDR) находятся в пределах областей антитела и нумеруются в соответствии с системой нумерации по Кабат следующим образом: для легкой цепи; аминокислоты 24-34 CDRL1; аминокислоты 50-56 CDRL2; аминокислоты 89-97 CDRL3; для тяжелой цепи, аминокислоты 31-35 CDRH1; аминокислоты 50-65; CDRH2 и аминокислоты 95-102 CDRH3. Участки CDR в антителах могут быть легко определены.
[000105] Согласно некоторым вариантам реализации антиген-мишень представляет собой CD20. Ряд антител, специфичных в отношении CD20, известны специалистам в данной области техники и могут быть легко охарактеризованы в отношении последовательности, параметров связывания эпитопа и аффинности. Согласно конкретному варианту реализации конструкция химерного рецептора содержит последовательность scFv, представленную в таблице 9. Согласно другим вариантам реализации scFv представляет собой scFv человека или гуманизированный scFv, содержащий вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность RASSSVNYMD CDRL1 (SEQ ID NO: 33), последовательность ATSNLAS CDRL2 (SEQ ID NO: 34) и последовательность QQWSFNPPT CDRL3 (SEQ ID NO: 35). Согласно другим вариантам реализации scFv представляет собой scFv человека или гуманизированный scFv, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SYNMH CDRH1 (SEQ ID NO: 36), AIYPGNGDTSYNQKFKG CDRH2 (SEQ ID NO: 37) и последовательность SNYYGSSYWFFDV CDRH3 (SEQ ID NO: 38). Последовательности CDR могут быть легко определены из аминокислотной последовательности scFv. В область настоящего изобретения также включены вариабельные области, аминокислотные последовательности которых по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны аминокислотной последовательности scFv, специфичного в отношении CD20, или процент идентичности последовательностей находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных выше процентных значений, и которые имеют по меньшей мере аналогичную аффинность в отношении CD20.
[000106] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающий домен, функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим спейсерный участок. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающий домен, также может содержать один или более сайтов рестрикции на 5'- и/или 3'-концах кодирующей последовательности, чтобы обеспечить легкое удаление и замену полинуклеотида другим полинуклеотидом, кодирующим лигандсвязывающий домен, кодирующий другой антиген или обладающий другими характеристиками связывания. Например, последовательность, кодирующая сайт рестрикции, NheI, введена в направлении 5'-конца относительно лидерной последовательности; и 3'-концевой сайт рестрикции RsrII, расположенный в шарнирной области, обеспечивает субклонирование любого желаемого scFv в вектор, несущий химерный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида оптимизированы для экспрессии в клетках человека.
[000107] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающий домен, функционально соединен с сигнальным пептидом. Согласно некоторым вариантам реализации сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Могут быть использованы полинуклеотиды, кодирующие другие сигнальные пептиды, такие как CD8 альфа.
[000108] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающий домен, функционально соединен с промотором. Подходящий промотор обеспечивает экспрессию химерного антигенного рецептора в клетке млекопитающего. Согласно конкретному варианту реализации промотор представляет собой индуцируемый промотор.
[000109] Конкретный вариант полинуклеотида, кодирующего лигандсвязывающий домен, представлен в таблице 1 в виде scFv из антитела, которое специфично связывается с CD19, такого как FMC63. Полинуклеотид, кодирующий гибкий линкер, содержащий аминокислоты GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 39), отделяет цепи VH и VL в scFv. Аминокислотная последовательность scFv, включая линкер, представлена в таблице 1. (SEQ ID NO: 2) Известны другие CD19-специфичные антитела, такие как SJ25C1 и HD37. (SJ25C1: Bejcek et al. Cancer Res 2005, PMID 7538901; HD37: Pezutto et al. JI 1987, PMID 2437199).
[000110] Конкретный вариант полинуклеотида, кодирующего лигандсвязывающий домен, представлен в таблице 9 в виде scFv из антитела, которое специфично связывается с CD20. Полинуклеотид, кодирующий гибкий линкер, содержащий аминокислоты GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 39), отделяет цепи VH и VL в scFv. Аминокислотная последовательность scFv представлена в таблице 9 (SEQ ID NO: 25). Известны другие СО20-специфичные антитела, такие как 1F5 (Budde et al. 2013, PLOS One).
Спейсер
[000111] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая химерный рецептор, содержит полинуклеотид, кодирующий спейсерный участок. Как правило, спейсерный участок находится между лигандсвязывающим доменом и трансмембранным доменом химерного рецептора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок обеспечивает гибкость лигандсвязывающего домена и высокие уровни экспрессии в лимфоцитах. CD19-специфичный химерный рецептор, содержащий спейсер, который состоит из 229 аминокислот, обладал более низкой противоопухолевой активностью, чем CD19-специфичный химерный рецептор с коротким спейсерным участком, состоящим только из модифицированной шарнирной области IgG4.
[000112] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок содержит по меньшей мере от 10 до 229 аминокислот, от 10 до 200 аминокислот, от 10 до 175 аминокислот, от 10 до 150 аминокислот, от 10 до 125 аминокислот, от 10 до 100 аминокислот, от 10 до 75 аминокислот, от 10 до 50 аминокислот, от 10 до 40 аминокислот, от 10 до 30 аминокислот, от 10 до 20 аминокислот или от 10 до 15 аминокислот, или его длина находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных значений длины аминокислотной последовательности спейсера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок содержит 12 аминокислот или менее, но более 1 аминокислоты, 119 аминокислот или менее, но более 1 аминокислоты, или 229 аминокислот или менее, но более 1 аминокислоты.
[000113] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок получен из шарнирной области иммуноглобулин-подобной молекулы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок содержит полноразмерную шарнирную область IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека или IgG4 человека или ее часть, и может содержать одну или более замен аминокислот. Типичные последовательности шарнирных областей представлены в таблице 5. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения часть шарнирной области содержит аминокислоты из верхней части шарнирной области, обнаруженные между вариабельной областью тяжелой цепи и остовом, и аминокислоты остова шарнирной области, включая область полипролина.
[000114] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательности шарнирной области могут быть модифицированы в одной или более аминокислотах, чтобы избежать нежелательных структурных взаимодействий, таких как димеризация. Согласно конкретному варианту реализации спейсерный участок содержит часть модифицированной шарнирной области человека из IgG4, например, представленную в таблице 1 или таблице 5 (SEQ ID NO: 10). Типичный полинуклеотид, кодирующий часть модифицированной шарнирной области IgG4, представлен в таблице 1. (SEQ ID NO: 1). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность шарнирной области может быть по меньшей мере приблизительно на 90%, 92%, 95% или 100% идентична аминокислотной последовательности шарнирной области, представленной в таблице 1 или таблице 5. Согласно другому варианту часть шарнирной области человека из IgG4 содержит замену аминокислоты в аминокислотной последовательности остова, такую как замена CPSP с образованием СРРС.
[000115] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полноразмерную шарнирную область или ее часть комбинируют с одним или более доменами константной области иммуноглобулина. Например, часть шарнирной области может быть комбинирована с полноразмерной или частью области СН2 или СН3, или ее варианта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок не включает последовательность шарнирной области, состоящую из 47-48 аминокислот, из CD8-альфа или спейсерного участка, содержащего внеклеточную часть молекулы CD28.
[000116] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения короткий спейсерный участок содержит приблизительно 12 аминокислот или менее, но более 1 аминокислоты, и содержит полноразмерную или часть последовательности шарнирной области IgG4 или ее варианта, промежуточный спейсерный участок содержит приблизительно 119 аминокислот или менее, но более 1 аминокислоты, и содержит полноразмерную или часть последовательности шарнирной области IgG4 и область СН3 или ее вариант, и длинный спейсер содержит приблизительно 229 аминокислот или менее, но более 1 аминокислоты, и содержит полноразмерную или часть последовательности шарнирной области IgG4, область СН2 и область СН3 или ее вариант.
[000117] Полинуклеотид, кодирующий спейсерный участок, может быть легко получен с помощью синтетических или рекомбинантных способов из аминокислотной последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий спейсерный участок, функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим трансмембранный участок. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий спейсерный участок, также может содержать один или более сайтов рестрикции на 5'- и/или 3'-концах кодирующей последовательности, чтобы обеспечить легкое удаление и замену полинуклеотида другим полинуклеотидом, кодирующим другой спейсерный участок. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида, кодирующего спейсерный участок, оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида, кодирующего спейсерный участок, оптимизированы для экспрессии в клетках человека.
[000118] Согласно другому варианту спейсерный участок выбран из последовательности шарнирной области из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или его части, последовательности шарнирной области из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 в комбинации с полноразмерной или частью области СН2 или ее варианта, последовательности шарнирной области из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 в комбинации с полноразмерной или частью области СН3 или ее варианта, и последовательности шарнирной области из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 в комбинации с полноразмерной или частью области СН2 или ее варианта, и области СН3 или ее варианта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения короткий спейсерный участок представляет собой модифицированную последовательность шарнирной области IgG4 (SEQ ID NO: 10), содержащую 12 аминокислот или менее, но более 1 аминокислоты, промежуточная последовательность представляет собой последовательность шарнирной области IgG4 в комбинации с последовательностью СН3, содержащей 119 аминокислот или менее, но более 1 аминокислоты; или последовательность шарнирной области IgG4 в комбинации с областью СН2 и СН3, содержащей 229 аминокислот или менее, но более 1 аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения короткий спейсерный участок содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислот или длина аминокислотного участка находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных длин аминокислотных участков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения средний спейсерный участок содержит 13, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 119 аминокислот или длина аминокислотного участка находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных длин аминокислотных участков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок содержит 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210 или 219 аминокислот или длина аминокислотного участка находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных длин аминокислотных участков.
Трансмембранный домен.
[000119] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая химерный рецептор, содержит полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен. Трансмембранный домен обеспечивает закрепление химерного рецептора в мембране. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен химерного антигенного рецептора отличается от такового генетической метки.
[000120] Согласно другому варианту трансмембранный домен в природных условиях связан с одним из доменов в химерном рецепторе. В некоторых случаях трансмембранный домен может быть выбран или модифицирован путем замены аминокислоты, чтобы избежать связывания указанных доменов с трансмембранными доменами аналогичных или других поверхностных мембранных белков, чтобы свести к минимуму взаимодействие с другими членами рецепторного комплекса.
[000121] Трансмембранный домен может быть получен из природного или синтетического источника. В случае если источник является природным, домен может быть получен из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка. Трансмембранные участки содержат по меньшей мере трансмембранный участок(и) альфа, бета или дзета-цепи рецептора Т-клеток, CD28, CD3, CD45, CD4, CD8, CD9, CD16, CD22; CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и/или CD154. Согласно конкретному варианту реализации трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена CD28, представленную в таблице 2. Типичная полинуклеотидная последовательность, кодирующая трансмембранный домен CD28, представлена в таблице 1 (SEQ ID NO: 2).
[000122] Трансмембранный домен может быть синтетическим или представлять собой вариант природного трансмембранного домена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения синтетические трансмембранные домены или их варианты содержат преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность трансмембранного домена может быть по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична аминокислотной последовательности трансмембранного домена, представленной в таблице 2 или таблице 6, или процент идентичности последовательностей находится в диапазоне между любыми двумя из указанных выше процентных значений. Варианты трансмембранных доменов предпочтительно имеют оценку гидрофобности по меньшей мере 50, вычисленную по шкале Kyte Doolittle.
[000123] Полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, может быть легко получен синтетическими или рекомбинантными способами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим внутриклеточный участок для передачи сигналов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, также может содержать один или более сайтов рестрикции на 5'- и/или 3'-концах кодирующей последовательности, чтобы обеспечить легкое удаление и замену полинуклеотида, кодирующего трансмембранный домен, другим полинуклеотидом, кодирующим другой трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида, кодирующего трансмембранный домен, оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно клетках человека.
Внутриклеточный сигнальный домен.
[000124] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая химерный рецептор, содержит полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Внутриклеточный сигнальный домен обеспечивает активацию одной функции транедуцированной клетки, экспрессирующей химерный рецептор, после связывания с лигандом, который экспрессируется на опухолевых клетках. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения внутриклеточный сигнальный домен содержит один или более внутриклеточных сигнальных доменов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения внутриклеточный сигнальный домен представляет собой часть и/или вариант внутриклеточного сигнального домена, который обеспечивает активацию по меньшей мере одной функции транедуцированной клетки.
[000125] Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для применения в химерных рецепторах согласно настоящему изобретению включают цитоплазматические последовательности дзета-цепи CD3 и/или корецепторы, которые действуют согласованно, чтобы инициировать передачу сигналов после взаимодействия с химерным рецептором, а также любое производное или вариант указанных последовательностей и любой синтетической последовательности, которая имеет аналогичную функциональную способность. Можно утверждать, что активация Т-клеток опосредована двумя различными классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: теми, которые инициируют первичную антигензависимую активацию и обеспечивают сигнал, сходный с таковым от Т-клеточных рецепторов (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и те, которые действуют антигеннезависимым способом, чтобы обеспечить вторичный или костимуляторный сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые оказывают стимулирующее действие, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM. Примеры ITAM, содержащих первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, включают те, которые получены из CD3-дзета, FcR гамма, CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b и/или CD66d. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первичный внутриклеточный сигнальный домен может иметь по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичность последовательности с дзета-цепью CD3, содержащей последовательность, представленную в таблице 4, или процент идентичности последовательностей находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных выше процентных значений. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD3-дзета сохраняет по меньшей мере один, два, три или все участки ITAM, представленные в таблице 4.
[000126] В предпочтительном варианте реализации внутриклеточный сигнальный домен химерного рецептора может быть разработан так, чтобы содержать сигнальный домен CD3-дзета по отдельности или в комбинации с любым другим желательным цитоплазматическим доменом(ами). Например, внутриклеточный сигнальный домен химерного рецептора может содержать дзета-цепь CD3 и костимулирующий сигнальный участок.
[000127] Костимулирующий сигнальный участок относится к части химерного рецептора, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет собой поверхностную молекулу клеток, отличную от рецептора антигена или его лигандов, которая необходима для ответа лимфоцитов на антиген. Примеры подходящих молекул включают CD27, CD28, 4-1ВВ (CD 137), ОХ40, CD30, CD40, ассоциированный с функцией лимфоцитов антиген 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3, ассоциированную с дзета-цепью протеинкиназу (Zap70) и/или лиганд, который специфично связывается с CD83. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность костимулирующего сигнального домена может быть по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична аминокислотной последовательности внутриклеточного домена CD28, представленного в таблице 2, или последовательности 4-1ВВ, содержащий последовательность, представленную в таблице 3, или процент идентичности последовательностей находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных выше процентных значений. Согласно другому варианту вариант внутриклеточного домена CD28 содержит замену аминокислоты в положениях 186-187, в которых LL замещены GG.
[000128] Внутриклеточные сигнальные последовательности химерного рецептора могут быть связаны друг с другом в произвольном или указанном порядке. При необходимости, короткий олиго- или полипептидный линкер, предпочтительно содержащий от 2 до 10 аминокислот в длину, может образовывать связь. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения короткий олиго- или полипептидный линкер содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот или количество аминокислот, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных выше значений. Согласно другому варианту внутриклеточные сигнальные домены содержат полноразмерный или часть сигнального домена дзета-цепи CD3 или ее варианта, и полноразмерный или часть сигнального домена CD28 или его варианта. Согласно другому варианту внутриклеточный сигнальный домен содержит полноразмерный или часть сигнального домена дзета-цепи CD3 или ее варианта, и полноразмерный или часть сигнального домена 4-1ВВ или его варианта. Согласно другому варианту внутриклеточный сигнальный домен содержит полноразмерный или часть сигнального домена дзета-цепи CD3 или ее варианта, полноразмерный или часть сигнального домена CD28 или его варианта, и полноразмерный или часть сигнального домена 4-1ВВ или его варианта. Согласно конкретному варианту реализации аминокислотная последовательность внутриклеточного сигнального домена, содержащего вариант дзета-цепи CD3 и часть внутриклеточного сигнального домена 4-1ВВ, представлена в таблице 1. Типичная последовательность нуклеиновой кислоты представлена в таблице 1 (в пределах последовательности SEQ ID NO: 2).
[000129] Согласно другому варианту полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, содержит внутриклеточный домен 4-1ВВ, соединенный с частью домена дзета-цепи CD3. Согласно другим вариантам внутриклеточный домен 4-1ВВ и внутриклеточный домен CD28 соединены с частью домена дзета-цепи CD3.
[000130] Полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, может быть легко получен из аминокислотной последовательности с помощью синтетических или рекомбинантных способов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, также может содержать один или более сайтов рестрикции на 5'- и/или 3'-концах кодирующей последовательности, чтобы обеспечить легкое удаление и замену полинуклеотида, кодирующего внутриклеточный сигнальный домен, другим полинуклеотидом, кодирующим другой внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида, кодирующего внутриклеточный сигнальный домен, оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида, кодирующего внутриклеточный сигнальный домен, оптимизированы для экспрессии в клетках человека.
Линкерные домены.
[000131] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкерный домен обеспечивает подвижность доменов в конструкции CAR. Как будет показано ниже, линкер (SEQ ID NO: 45) между доменом IV и трансмембранным доменом Her2t обеспечивает конструкцию Her2tG. Линкер используют для придания подвижности белковым доменам. В других примерах scFv многих CAR содержат четыре последовательные субъединицы G3S, помещенные между доменами VH и VL из scFv CAR. Это обеспечивает гибкость при складывании двух доменов scFv. В примерном варианте реализации рациональное использование двух линкерных субъединиц G3S сможет придать повышенную гибкость Her2tG.
[000132] Две линкерные субъединицы G3S, соединенные в один домен (SEQ ID NO: 45), также применяли для имитации длины спейсера шарнирной области CD28 и шарнирной области IgG4. Шарнирную область CD28 и шарнирную область IgG4 ранее использовали в качестве линкера между scFv и трансмембранным участком в CAR, которые являются функциональными. Шарнирная область CD28 и шарнирная область IgG4 содержат цистеин, облегчающий димеризацию. Несмотря на то, что это обеспечивает преимущества для CAR, димеризация может ингибировать гибкость Her2t и вследствие этого препятствует существенному распознаванию герцептином. Преимущество использования двух линкеров G3S (SEQ ID NO: 45), по сравнению с тремя или четырьмя, заключается в том, чтобы уменьшить полезную нагрузку вектора, устранить потенциально ненужные последовательности и в то же время добиться расширенных функциональных возможностей.
[000133] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен выделенный полипептид, причем указанный выделенный полипептид по меньшей мере на 95% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her, и внеклеточный домен полипептида Her2, содержащий последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединен с трансмембранным доменом последовательностью, содержащей аминокислоты GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб.
Клетки-хозяева и композиции: популяции Т-лимфоцитов.
[000134] Композиции, описанные в настоящем изобретении, обеспечивают генетически модифицированные клетки-хозяева совместно с векторами и/или конструкциями, описанными в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой CD4+ и/или CD8+ Т-лимфоциты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
[000135] Т-лимфоциты могут быть собраны в соответствии с известными методиками и обогащены или истощены с помощью известных методик, таких как аффинное связывание с антителами, например, с помощью проточной цитометрии и/или иммуномагнитной сортировки. После этапов обогащения и/или истощения размножение желаемых Т-лимфоцитов в условиях in vitro можно осуществлять в соответствии с известными методиками или их вариантами, которые будут очевидны специалистам в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки представляют собой аутогенные Т-клетки, полученные от пациента.
[000136] Например, желаемая популяция Т-клеток или субпопуляция может быть размножена путем добавления исходной популяции Т-лимфоцитов к культуральной среде в условиях in vitro, с последующим добавлением к культуральной среде фидерных клеток, таких как непролиферирующие мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), (например, так, что конечная популяция клеток содержит по меньшей мере 5, 10, 20 или 40 или более фидерных клеток МКПК или количество, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных количеств для каждого Т-лимфоцита в исходной популяции, которую размножают); и инкубации культуры (например, в течение времени, достаточного для размножения Т-клеток). Непролиферирующие фидерные клетки могут включать фидерные клетки МКПК, облученные гамма-лучами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения МКПК облучают гамма-лучами в диапазоне от 3000 до 3600 рад, чтобы предотвратить деление клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения МКПК облучают гамма-лучами с интенсивностью 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500 или 3600 рад или с применением любого значения интенсивности, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя конечными точками из перечисленных значений, чтобы предотвратить деление клеток. Порядок добавления Т-клеток и фидерных клеток к культуральной среде может быть полностью изменен, при необходимости. Культуру, как правило, можно инкубировать при температуре и других условиях, которые пригодны для размножения Т-лимфоцитов. Для размножения Т-лимфоцитов человека, например, температура обычно будет по меньшей мере 25 градусов по Цельсию, предпочтительно по меньшей мере 30 градусов, более предпочтительно приблизительно 37 градусов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения температура для размножения Т-лимфоцитов человека составляет 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37 градусов по Цельсию или соответствует любому другому значению температуры между любыми двумя конечными точками любого из перечисленных значений.
[000137] Размноженные Т-лимфоциты включают CD8+ цитотоксичные Т-лимфоциты (CTL) и CD4+ хелперные Т-лимфоциты, которые могут быть специфичными в отношении антигена, присутствующего на опухоли человека или патогене.
[000138] При необходимости способ размножения может дополнительно включать этап добавления непролиферирующих EBV-трансформированных лимфобластных клеток (LCL) в качестве фидерных клеток. LCL могут быть облучены гамма-лучами в диапазоне от 6000 до 10000 рад. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения LCL облучают гамма-лучами с интенсивностью 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500 или 10000 рад или с любым значением интенсивности, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя конечными точками из перечисленных значений, чтобы предотвратить деление клеток. Фидерные клетки LCL могут быть обеспечены в любом подходящем количестве, так, что соотношение фидерных клеток LCL и исходных Т-лимфоцитов составляет по меньшей мере приблизительно 10:1.
[000139] При необходимости способ размножения может дополнительно включать этап добавления антитела к CD3 и/или антитела к CD28 к культуральной среде (например, в концентрации по меньшей мере около 0,5 нг/мл). При необходимости способ размножения может дополнительно включать этап добавления ИЛ-2 и/или ИЛ-15 к культуральной среде (например, концентрация ИЛ-2 составляет по меньшей мере приблизительно 10 Ед/мл).
[000140] После выделения Т-лимфоцитов цитотоксические и хелперные Т-лимфоциты могут быть рассортированы перед или после этапа размножения на субпопуляции наивных Т-клеток, Т-клеток памяти и эффекторных Т-клеток.
[000141] CD8+ клетки могут быть получены с применением стандартных способов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD8+ клетки далее сортируют на наивные клетки, клетки центральной памяти и клетки эффекторной памяти путем идентификации поверхностных антигенов клеток, которые связаны с каждым из указанных типов CD8+ клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки памяти присутствуют в обеих подгруппах, CD62L+ и CD62L-, CD8+ лимфоцитов периферической крови. МКПК сортируют на CD62L-CD8+ и CD62L+ CD8+ фракции после окрашивания с применением антител к CD8 и антител к CD62L. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения экспрессия фенотипических маркеров ТСМ центральной памяти включает CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и CD127 и уровень экспрессии гранзима В является низким или отсутствует. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки центральной памяти представляют собой CD45RO+ CD62L+, CD8+ Т- клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффекторные ТЕ являются отрицательными в отношении экспрессии CD62L, CCR7, CD28 и CD 127 и положительными в отношении экспрессии гранзима В и перфорина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наивные CD8+ Т-лимфоциты характеризуются экспрессией фенотипических маркеров наивных Т-клеток, включая CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD 127 и CD45RA.
[000142] Хелперные CD4+ Т-клетки сортируют на наивные Т-клетки, Т-клетки центральной памяти и эффекторные Т-клетки путем выявления клеточных популяций, которые несут поверхностные антигены клеток. CD4+ лимфоциты могут быть получены стандартными способами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наивные CD4+ Т-лимфоциты включают CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ и CD4+ Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD4+ клетки центральной памяти включают CD62L+ и CD45RO+ клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффекторные CD4+ клетки включают CD62L' и CD45RO- клетки.
[000143] Является ли клетка или клеточная популяция положительной в отношении конкретного поверхностного маркера клеток, можно определить методом проточной цитометрии путем окрашивания специфичными антителами к поверхностному маркеру и соответствующим антителом для контроля изотипа. Клеточная популяция, отрицательная в отношении экспрессии маркера, относится к отсутствию значительного окрашивания клеточной популяции специфичным антителом, по сравнению с окрашиванием антителом для контроля изотипа, положительная популяция относится к равномерному окрашиванию популяции клеток, по сравнению с окрашиванием антителом для контроля изотипа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения снижение экспрессии одного или более маркеров относится к уменьшению средней интенсивности флуоресценции на величину 1 log10 и/или уменьшению процента клеток, которые несут маркер, составляющему по меньшей мере 20% клеток, 25% клеток, 30% клеток, 35% клеток, 40% клеток, 45% клеток, 50% клеток, 55% клеток, 60% клеток, 65% клеток, 70% клеток, 75% клеток, 80% клеток, 85% клеток, 90% клеток, 95% клеток и 100% клеток и любую величину от 20 до 100%, по сравнению с эталонной популяцией клеток, или любую величину, которая находится в пределах диапазона, определенного любыми из указанных выше значений, по сравнению с эталонной популяцией клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция клеток, положительная в отношении экспрессии одного или более маркеров, относится к проценту клеток, которые несут маркер, составляющему по меньшей мере 50% клеток, 55% клеток, 60% клеток, 65% клеток, 70% клеток, 75% клеток, 80% клеток, 85% клеток, 90% клеток, 95% клеток и 100% клеток и любой процент в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных выше процентных значений, по сравнению с эталонной популяцией клеток.
[000144] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяции CD4+ и CD8+, которые являются антигенспецифичными, могут быть получены путем стимуляции наивных или антигенспецифичных Т-лимфоцитов антигеном. Например, антигенспецифичные линии Т-клеток или клоны могут быть получены для антигенов цитомегаловируса путем выделения Т-клеток от инфицированных субъектов и путем стимуляции клеток аналогичным антигеном в условиях in vitro. Также могут быть использованы наивные Т-клетки. Любое количество антигенов из опухолевых клеток может быть использовано в качестве мишеней для индукции Т-клеточных реакций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции для адоптивной клеточной иммунотерапии можно применять при лечении заболевания или расстройства, включая солидные опухоли, гематологические злокачественные опухоли, рак молочной железы или меланому.
Модификация популяций Т-лимфоцитов.
[000145] Согласно некоторым вариантам реализации желательным может быть введение функциональных генов в Т-клетки, которые будут применять в иммунотерапии в соответствии с настоящим изобретением. Например, введенный ген или гены могут улучшить эффективность терапии путем стимулирования жизнеспособности и/или функции перенесенных Т-клеток; или они могут обеспечить генетический маркер для отбора и/или оценки выживаемости или миграции в условиях in vivo; или они могут включать функции, которые улучшают безопасность иммунотерапии, например, путем придания клетке восприимчивости к контролируемой экспрессии трансгена. Введение гена можно осуществлять в соответствии с известными методиками, которые будут очевидны специалистам в данной области техники на основании настоящего описания.
[000146] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки модифицированы с применением вектора, кодирующего генетические метки, описанные в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки модифицированы с применением вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, функционально соединенный с генетической меткой. Согласно другим вариантам реализации клетки модифицированы с применением вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий только генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки получают от субъекта, подлежащего лечению. Согласно другому варианту лимфоциты получают от аллогенных доноров-людей, предпочтительно здоровых доноров-людей.
[000147] Химерные рецепторы могут быть сконструированы так, чтобы обладать специфичностью в отношении любого поверхностного маркера клеток благодаря использованию антигенсвязывающих фрагментов или вариабельных областей антител, например, молекул антител. Антигенсвязывающие молекулы могут быть связаны с одним или более модулями для передачи сигналов в клетке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модули для передачи сигналов в клетке включают трансмембранный домен CD3, внутриклеточные сигнальные домены CD3 и трансмембранные домены CD28. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения внутриклеточный сигнальный домен содержит трансмембранный и сигнальный домены CD28, соединенные с внутриклеточным доменом дзета-цепи CD3.
[000148] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналогичный или другой химерный рецептор может быть введен в каждую из популяций CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный рецептор в каждой из указанных популяций содержит лигандсвязывающий домен, который специфично связывается с аналогичным лигандом на опухоли или инфицированной клетке или с другим антигеном или эпитопом. Модули для передачи сигналов в клетке могут различаться. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения внутриклеточный сигнальный домен CD8+ цитотоксических Т-клеток аналогичен внутриклеточному сигнальному домену CD4+ Т-хелперов. Согласно другим вариантам реализации внутриклеточный сигнальный домен CD8+ цитотоксических Т-клеток отличается от внутриклеточного сигнального домена CD4+ Т-хелперов. Каждый химерный рецептор функционально соединен с отличающейся генетической меткой, что обеспечивает отбор и выявление трансдуцированных клеток, экспрессирующих оба химерных антигенных рецептора.
[000149] Другие варианты включают способы изготовления композиций, содержащих клетки-хозяева, описанные в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ включает введение в клетку-хозяина выделенной нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновая кислота, кодирующая выделенный полипептид, который по меньшей мере на 95% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 511 по 652 или с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2; и культивирование клеток-хозяев в среде, содержащей по меньшей мере один фактор роста. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает отбор клеток-хозяев для экспрессии Her2t до или после или как до, так и после, и после этапа культивирования. Согласно другим вариантам реализации способ изготовления дополнительно включает введение в клетку-хозяина второй нуклеиновой кислоты, кодирующей второй химерный антигенный рецептор и вторую генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации способ дополнительно включает отбор клеток-хозяев для экспрессии второй генетической метки до или после или как до, так и после, и после этапа культивирования. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
[000150] Согласно другим вариантам реализации способ включает введение в первую клетку-хозяина первой выделенной нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновая кислота, кодирующая выделенный полипептид, который по меньшей мере на 95% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 511 по 652 или с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2; отбор первой популяции клеток-хозяев, которые экспрессируют Her2t, введение второй нуклеиновой кислоты, кодирующей второй химерный антигенный рецептор и вторую генетическую метку, во вторую клетку-хозяина, отбор второй популяции клеток-хозяев для экспрессии второй генетической метки и необязательно культивирование первой и второй популяций клеток-хозяев в среде, содержащей по меньшей мере один фактор роста. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция включает первую и вторую популяции клеток-хозяев. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
[000151] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый из CD4 или CD8 Т-лимфоцитов может быть отсортирован в группу наивных Т-клеток, Т-клеток центральной памяти, Т-клеток эффекторной памяти или эффекторных клеток перед трансдукцией, описанной в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый из CD4 или CD8 Т-лимфоцитов может быть отсортирован в группу наивных Т-клеток, Т-клеток центральной памяти, Т-клеток эффекторной памяти или эффекторных клеток после трансдукции.
[000152] Как описано в настоящем изобретении, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наивные CD4+ клетки представляют собой CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ и/или CD4+ положительные Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD4+ клетки центральной памяти представляют собой CD62L положительные и/или CD45RO положительные клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффекторные CD4+ клетки представляют собой CD62L отрицательные и/или CD45RO положительные клетки. Каждая из этих популяций может быть независимо модифицирована с применением химерного рецептора.
[000153] Как описано в настоящем изобретении, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки памяти присутствуют в обеих подгруппах, CD62L+ и/или CD62L-, CD8+ лимфоцитов периферической крови. МКПК сортируют на фракции CD62L-, CD8+ и/или CD62L+CD8+ после окрашивания с применением антител к CD8 и антител к CD62L. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения экспрессия фенотипических маркеров Т-клеток центральной памяти (ТСМ) включает CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD127 и низкий уровень экспрессии гранзима В или отсутствие его экспрессии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки центральной памяти включают CD45RO+, CD62L+ и/или CD8+ Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффекторные Т-клетки (TE) являются отрицательными в отношении экспрессии CD62L, CCR7, CD28 и/или CD127, и положительными в отношении экспрессии гранзима В и/или перфорина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наивные CD8+ Т-лимфоциты характеризуются как CD8+, CD62L+, CD45RO+, CCR7+, CD28+ CD127+ и/или CD45RO+. Каждая из этих популяций может быть независимо модифицирована с применением химерного рецептора.
[000154] Были разработаны различные методы трансдукции, в которых для доставки генов используются частицы рекомбинантных инфекционных вирусов. Описанный подход в настоящее время является предпочтительным для трансдукции Т-лимфоцитов согласно настоящему изобретению. Вирусные векторы, которые были использованы таким способом, включают вирусные векторы, полученные из вируса обезьян 40, аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), лентивирусных векторов и ретровирусов. Соответственно, известны многочисленные способы переноса и экспрессии генов, однако основной их задачей является введение и экспрессия генетического материала в клетках млекопитающих. Некоторые из указанных выше методик были использованы для трансдукции кроветворных или лимфоидных клеток, включая трансфекцию с применением фосфата кальция, слияние протопластов и инфекцию рекомбинантным аденовирусом, аденоассоциированным вирусом и ретровирусными векторами. Первичные Т-лимфоциты были успешно трансдуцированы методом электропорации и путем инфицирования ретровирусами или лентивирусами.
[000155] Ретровирусные и лентивирусные векторы обеспечивают высокоэффективный способ переноса генов в эукариотические клетки. Кроме того, интеграция ретровирусов или лентивирусов происходит контролируемым образом и приводит к стабильной интеграции одной или более копий новой генетической информации на клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ретровирусные или лентивирусные векторы используют для переноса генов в эукариотические клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки представляют собой клетки человека.
[000156] Предполагается, что избыточная экспрессия стимулирующего фактора (например, лимфокина или цитокина) может быть токсичной для индивидуума, которого лечат. Следовательно, в объем настоящего изобретения включены сегменты генов, которые придают Т-клеткам согласно настоящему изобретению восприимчивость к отрицательному отбору в условиях in vivo. Термин «отрицательный отбор» подразумевает, что клетка после инъекции может быть устранена в результате изменения состояния индивидуума в условиях in vivo. Фенотип, подходящий для отрицательной селекции, может возникнуть в результате введения гена, который придает чувствительность к введенному агенту, например, соединению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка Her2t также обеспечивает отрицательный отбор в условиях in vivo. Например, если необходимо устранить CAR-экспрессирующие клетки с генетической меткой Her2t, то субъекту вводят антитело, которое связывается с доменом IV Her2 (например, трастузумаб), или антитело, которое конкурирует за связывание с антителом, которое связывается с доменом IV Her2. В предпочтительных вариантах реализации для устранения трансдуцированных клеток антитела содержат область Fc для активации реакций антитело-зависимой клеточной цитотоксичности, чтобы вызвать гибель трансдуцированных клеток. Согласно другим вариантам реализации антитело или его фрагмент связан с цитотоксическим агентом. Цитотоксический конъюгат связывается с клетками, экспрессирующими CAR и Her2t, и вызывает гибель клеток. Указанный способ обеспечивает абляцию введенных клеток, которые связаны с токсичностью или нежелательными побочными эффектами.
[000157] Другие гены, подходящие для отрицательного отбора, известны в данной области техники и включают, помимо всего прочего, следующие: ген тимидинкиназы вируса простого герпеса типа I (HSV-I ТК), который придает чувствительность к ганцикловиру; ген клеточной гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), ген клеточной аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT) и ген бактериальной цитозиндезаминазы.
[000158] Для трансдукции Т-лимфоцитов могут быть использованы различные способы, хорошо известные в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансдукцию осуществляют с применением лентивирусных векторов.
[000159] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждая из CD4+ и CD8+ клеток может быть по отдельности модифицирована с применением вектора экспрессии, кодирующего химерный рецептор, чтобы получить определенные популяции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки могут быть модифицированы по отдельности с помощью вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий CAR и первую генетическую метку, и/или вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий CAR и отличающуюся вторую генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкции CAR могут быть одинаковыми или различными. Например, CD8 Т-клетки трансдуцируют конструкцией CAR, содержащей первую генетическую метку, и CD4 Т-клетки трансдуцируют аналогичной конструкцией CAR, содержащей вторую генетическую метку.
[000160] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные клетки затем дополнительно сортируют на субпопуляции наивных клеток, клеток центральной памяти и эффекторных клеток, описанных выше, путем сортировки на основании экспрессии поверхностных антигенов клеток, уникальных для каждой из указанных клеточных популяций. Кроме того, популяции клеток CD4+ или CD8+ могут быть отобраны на основании их цитокинового профиля или пролиферативной активности. Например, могут быть отобраны CD4+ Т-лимфоциты, которые при стимуляции антигеном имеют повышенную выработку цитокинов, таких как ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ФНО-альфа и/или ИФН-гамма, по сравнению с контрольными трансдуцированными клетками или трансдуцированными CD8+ клетками. Согласно другим вариантам могут быть отобраны наивные CD4+ Т-клетки или CD4+ Т-клетки центральной памяти, которые имеют повышенную выработку ИЛ-2 и/или ФНО-альфа. Аналогичным образом, могут быть отобраны CD8+ клетки, которые имеют повышенную выработку ИФН-гамма, по сравнению с контрольными трансдуцированными CD8+ клетками. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяции CD4+ или CD8+ клеток отбирают на основании их цитокинового профиля или пролиферативной активности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения могут быть отобраны CD4+ Т-лимфоциты, которые при стимуляции антигеном имеют повышенную выработку цитокинов, таких как ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ФНО-альфа и/или ИФН-гамма, по сравнению с контрольными трансдуцированными клетками или трансдуцированными CD8+ клетками.
[000161] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отбирают CD4+ и CD8+ клетки, которые являются цитотоксическими по отношению к клеткам, несущим антиген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD4+ клетки, как ожидается, будут обладать незначительной цитотоксичностью по сравнению с CD8+ клетками. В предпочтительном варианте отбирают транедуцированные лимфоциты, такие как CD8+ клетки центральной памяти, которые вызывают гибель опухолевых клеток в условиях in vivo в животной модели, общепринятой для исследования конкретного типа рака.
[000162] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения отбирают транедуцированные клетки, которые способны экспрессировать генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения после трансдукции клетки, экспрессирующие, например, Her2t или EGFRt, отбирают с помощью антител, которые связываются с генетическими метками. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела обеспечивают отбор популяции клеток, содержащей по меньшей мере 80-100% клеток положительных в отношении экспрессии генетической метки.
[000163] Отобранные клетки можно оценивать для определения уровня экспрессии трансгена с применением таких методик как вестерн-блоттинг или проточная цитометрия. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки, отобранные для оценки уровня экспрессии генетической метки, также дополнительно характеризуют, чтобы оценить уровень экспрессии CAR с помощью исследования, например, количества стимулирующего домена (например, CD3-дзета), белка L и Т2А. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отбирают клетки, имеющие соотношение уровней экспрессии CAR и генетической метки приблизительно от 1:0,1 до 10:0,1.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отбирают клетки, имеющие соотношение уровней экспрессии CAR и генетической метки приблизительно 1:0,1, 2:0,1, 3:0,1, 4:0,1, 5:0,1, 6:0,1, 7:0,1, 8:0,1, 9:0,1 или 10:0,1, или любое другое соотношение уровней экспрессии CAR и генетической метки, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из перечисленных соотношений. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка Her2t может быть использована в тех случаях, когда уровень экспрессии CAR является низким, поскольку она обеспечивает более высокие уровни экспрессии трансгенов, чем EGFRt. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения генетическая метка Her2t обеспечивает увеличение уровней экспрессии трансгена по меньшей мере в 1,5 раза, 2 раза, 5 раз или 10 раз, по сравнению с генетической меткой EGFRt, или любое другое относительное увеличение, величина которого находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных значений.
[000164] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения отбирают транедуцированные Т-клетки, экспрессирующие химерный рецептор, которые могут сохраняться в условиях in vivo в животной модели, общепринятой для исследования конкретного типа рака. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения было показано, что транедуцированные CD8+ клетки центральной памяти, экспрессирующие химерный рецептор, сохраняются в условиях in vivo после введения в организм животного в течение приблизительно 3 дней или более, 10 дней или более, 20 дней или более, 30 дней или более, 40 дней или более, или 50 дней или более, или в течение любого другого промежутка времени, величина которого находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных значений. Сохранение в условиях in vivo может быть определено путем визуализации с помощью детектируемого меченого антитела, которое связывается с генетической меткой, такой как Her2t или EGFRt.
[000165] В настоящем изобретении предложено применение комбинаций CD4+ и CD8+ Т-клеток в композициях. В одном варианте реализации настоящего изобретения комбинации трансдуцированных CD4+ клеток, экспрессирующих химерный рецептор, можно комбинировать с трансдуцированными CD8+ клетками, экспрессирующими химерный рецептор, которые обладают специфичностью в отношении аналогичного лиганда, или комбинировать с CD8+ Т-клетками, которые являются специфичными в отношении другого опухолевого лиганда и другой генетической метки. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения транедуцированные CD8+ клетки, экспрессирующие химерный рецептор, комбинируют с трансдуцированными CD4+ клетками, экспрессирующими химерный рецептор, которые специфичны в отношении другого лиганда, экспрессируемого на опухоли. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения транедуцированные CD4+ клетки, экспрессирующие химерный рецептор, комбинируют с трансдуцированными CD8+ клетками, экспрессирующими химерный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD8+ и CD4+ клетки можно комбинировать в различных соотношениях, например, в соотношении CD8+ и CD4+ 1:1, в соотношении CD8+ и CD4+ 10:1, или в соотношении CD8+ и CD4+ 100:1, или в любом другом соотношении CD8+ и CD4+, величина которого находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных соотношений. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения комбинированную популяцию исследуют для оценки пролиферации клеток в условиях in vitro и/или в условиях in vivo, и отбирают соотношение клеток, которое обеспечивает пролиферацию клеток.
[000166] Популяции клеток предпочтительно размножают в условиях in vitro перед или после трансдукции и/или отбора клеток, несущих химерный рецептор, для получения достаточного количества клеток, чтобы обеспечить по меньшей мере одну инфузию субъекту-человеку, как правило, приблизительно от 104 клеток/кг до 109 клеток/кг. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения транедуцированные клетки культивируют в присутствии клеток, несущих антиген, антител к CD3, антител к CD28, ИЛ-2, ИЛ-7, ИЛ-15 и/или ИЛ-21, а также их комбинаций.
[000167] Каждую из субпопуляций CD4+ и CD8+ клеток можно комбинировать с другой. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения модифицированные наивные CD4+ клетки или CD4+ клетки центральной памяти комбинируют с модифицированными CD8+ Т-клетками центральной памяти, чтобы обеспечить синергическое цитотоксическое действие на клетки, несущие антиген, такие как опухолевые клетки.\
Композиции.
[000168] В настоящем изобретении предложены композиции для адоптивной клеточной иммунотерапии, содержащие препарат генетически модифицированных Т-лимфоцитов, описанных в настоящем изобретении.
[000169] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения препарат Т-лимфоцитов содержит CD4+ Т-клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий внеклеточную вариабельную область антитела, специфичную в отношении лиганда, связанного с заболеванием или расстройством, спейсерный участок, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен рецептора Т-клеток и генетическую метку, описанную в настоящем изобретении. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция для адоптивной клеточной иммунотерапии дополнительно содержит препарат опухолеспецифичных CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, модифицированных химерным рецептором, который обеспечивает клеточный иммунный ответ, причем препарат цитотоксических Т-лимфоцитов содержит CD8+ Т-клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий внеклеточное одноцепочечное антитело, специфичное в отношении лиганда, связанного с заболеванием или расстройством, спейсерный участок, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен рецептора Т-клеток и генетическую метку, описанную в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция Т-клеток, модифицированных химерным рецептором согласно настоящему изобретению, может сохраняться в условиях in vivo в течение по меньшей мере приблизительно 3-х дней или дольше. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения каждую из указанных популяций можно комбинировать с другой популяцией или с другими типами клеток с получением композиции.
[000170] Другие варианты реализации включают CD4 и/или CD8 клетки-хозяева, описанные в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин содержит выделенную нуклеиновую кислоту, такую как нуклеиновая кислота, кодирующая выделенный полипептид, который по меньшей мере на 95% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 511 по 652 или с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй химерный антигенный рецептор и вторую генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
[000171] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит первую клетку-хозяина, содержащую первую выделенную нуклеиновую кислоту, такую как нуклеиновая кислота, кодирующая выделенный полипептид, который по меньшей мере на 95% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 511 по 652 или с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и вторую клетку-хозяина, содержащую вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй химерный антигенный рецептор и вторую генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая клетка-хозяин и вторая клетка-хозяин могут быть аналогичными или могут различаться, например, первая клетка-хозяин может представлять собой CD8+ клетки центральной памяти, и вторая клетка-хозяин может представлять собой наивные CD4+ клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждая из первой и второй клеток-хозяев выбрана из группы, состоящей из CD8 Т-клеток, CD4 Т-клеток, CD4-наивных Т-клеток, CD8-наивных Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD4 Т-клеток центральной памяти и их комбинаций.
[000172] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения хелперный CD4+ Т-лимфоцит выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти или общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения хелперный CD4+ лимфоцит представляет собой наивную CD4+ Т-клетку, причем указанная наивная CD4+ Т-клетка включает CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+ Т-клетку.
[000173] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит выбран из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти или общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит представляет собой Т-клетку центральной памяти, причем указанная Т-клетка центральной памяти включает CD45RO+, CD62L+, CD8+ Т-клетку. Согласно другим вариантам цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит представляет собой Т-клетку центральной памяти, и хелперный CD4+ Т-лимфоцит представляет собой наивную CD4+ Т-клетку или CD4+ Т-клетку центральной памяти.
Способы
[000174] В настоящем изобретении предложены способы получения композиций для адоптивной иммунотерапии и их применения, или способы применения указанных композиций для осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или расстройство.
[000175] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы изготовления композиций, содержащих клетки-хозяева, описанные в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ включает введение в клетку-хозяина выделенной нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновая кислота, кодирующая выделенный полипептид, который по меньшей мере на 95% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 511 по 652 или с 563 по 652 SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2; и культивирование указанных клеток-хозяев в среде, содержащей по меньшей мере один фактор роста. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает отбор клеток-хозяев для экспрессии Her2t до или после или как до, так и после, и после этапа культивирования. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения способ изготовления дополнительно включает введение в клетку-хозяина второй нуклеиновой кислоты, кодирующей второй химерный антигенный рецептор и вторую генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает отбор клеток-хозяев для экспрессии второй генетической метки до или после, или как до, так и после этапа культивирования. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
[000176] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения способ включает введение в первую клетку-хозяина первой выделенной нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновая кислота, кодирующая выделенный полипептид, который по меньшей мере на 95% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 511 по 652 или с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2; отбор первой популяции клеток-хозяев, которые экспрессируют Her2t, введение второй нуклеиновой кислоты, кодирующей второй химерный антигенный рецептор и вторую генетическую метку, во вторую клетку-хозяина, отбор второй клетки-хозяина для экспрессии второй генетической метки, и необязательно культивирование первой и второй популяций клеток-хозяев в среде, содержащей по меньшей мере один фактор роста. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция включает первую и вторую популяцию клеток-хозяев.
[000177] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ изготовления композиций включает получение модифицированных наивных или хелперных CD4+ Т-клеток центральной памяти, причем указанный препарат модифицированных хелперных Т-лимфоцитов содержит CD4+ Т-клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, который специфичен в отношении поверхностной молекулы опухолевых клеток, спейсерный участок, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен и генетическую метку, описанную в настоящем изобретении.
[000178] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает получение модифицированных CD8+ Т-клеток центральной памяти, причем препарат указанных модифицированных CD8 Т-лимфоцитов центральной памяти содержит CD8+ клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, специфичный в отношении поверхностной молекулы клеток опухоли, спейсерный участок, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен и генетическую метку, описанную в настоящем изобретении. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения CD8+ клетки содержат рецептор цитокина или хемокина под контролем индуцируемого промотора.
[000179] Химерный антигенный рецептор и генетическая метка в модифицированных CD4+ Т-клетках и модифицированных цитотоксических CD8+ Т-клетках могут быть одинаковыми или различными. Например, модифицированные CD4+ Т-клетки содержат первый CAR и первую генетическую метку, в то время как цитотоксические CD8+ Т-клетки представляют собой CD8+ клетки, которые содержат отличающийся второй CAR и отличающуюся вторую генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид может кодировать химерный антигенный рецептор, который является аналогичным для обеих популяций CD4+ и CD8+ клеток. Различие между указанными двумя конструкциями CAR может включать специфичность или аффинность лигандсвязывающего домена в отношении антигена или эпитопа, длину и последовательность спейсерного участка и внутриклеточные сигнальные компоненты.
[000180] Получение клеток CD4+ и CD8+, которые модифицированы химерным рецептором, было описано выше, а также в примерах. Антигенспецифичные Т-лимфоциты могут быть получены от пациента, имеющего заболевание или расстройство, или могут быть получены путем стимуляции Т-лимфоцитов в условиях in vitro в присутствии антигена. Субпопуляции CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, которые не подвергают отбору в отношении антигенной специфичности, также могут быть выделены, как описано в настоящем документе, и комбинированы в способах изготовления. Популяции клеток преимущественно отбирают для экспрессии одной или более генетических меток, таких как Her2t и/или EGFRt.
[000181] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения комбинацию популяций клеток можно оценить для определения однородности поверхностных клеточных маркеров и способности пролиферировать на протяжении по меньшей мере двух поколений, чтобы получить одинаковый статус дифференцировки клеток. Контроль качества можно осуществлять путем определения соотношения уровней экспрессии CAR и генетической метки. Статус дифференцировки клеток и поверхностные клеточные маркеры на модифицированных Т-клетках, несущих химерный рецептор, могут быть определены методом проточной цитометрии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения статус дифференцировки клеток и маркеры на CD8+ клетках включают CD3, CD8, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4, CD45RO и/или CD45RA. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения статус дифференцировки клеток и маркеры на CD4+ клетках включают CD3, CD4, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4 CD45RO и/или CD45RA.
[000182] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные Т-клетки, несущие химерный рецептор, описанные в настоящем изобретении, могут сохраняться в условиях in vivo в течение не менее 3-х дней или по меньшей мере 10 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные Т-клетки, несущие химерный рецептор, описанные в настоящем документе, могут сохраняться в условиях in vivo в течение по меньшей мере 3 дней, 4 дней, 5, дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней или 10 дней, или на протяжении любого промежутка времени в диапазоне, определенном любыми двумя из указанных выше периодов времени. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные Т-клетки, несущие химерный рецептор, могут размножаться в условиях in vivo на протяжении по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 поколений, согласно результатам определения по разбавлению красителя CFSE. Пролиферацию и сохранение модифицированных Т-клеток, несущих химерный рецептор, можно определить с применением животной модели заболевания или расстройства, и путем введения клеток и определения сохранения и/или пролиферативной способности перенесенных клеток с помощью детектирования клеток с применением детектируемого меченого антитела, которое связывается с генетической меткой, такого как эрбитукс (EGFRt) и/или герцептин (Her2t). При использовании антител или антигенсвязывающих фрагментов для детектирования клеток, экспрессирующих трансген, в условиях in vivo, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент предпочтительно не содержит область Fc, чтобы минимизировать любую реакцию ADCC. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения пролиферацию и активацию можно исследовать в условиях in vitro, используя несколько циклов активации с применением клеток, несущих антиген.
[000183] В настоящем изобретении также предложены способы проведения клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или расстройство, включающие: введение композиции лимфоцитов, экспрессирующих один или более химерных антигенных рецепторов и генетическую метку, описанную в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, страдающего заболеванием или расстройством, причем указанный способ включает введение композиции лимфоцитов, экспрессирующих один или более химерных антигенных рецепторов и генетическую метку.
[000184] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения пациента, страдающего раком, экспрессирующим опухолевый антиген, включающий введение эффективного количества композиций, описанных в настоящем изобретении, причем клетки указанной композиции экспрессируют химерный антигенный рецептор, который содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с опухолевым антигеном, экспрессированным на раковой клетке, и генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раковые клетки экспрессируют опухолевый антиген, распознаваемый химерным антигенным рецептором на клетках. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, диффузной В-клеточной лимфомы, лимфомы, ОЛЛ, ХЛЛ и множественной миеломы.
[000185] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ лечения пациента, страдающего раком, экспрессирующим опухолевый антиген, включает введение эффективного количества композиций, описанных в настоящем документе, причем клетки указанной композиции экспрессируют первый химерный антигенный рецептор, который содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с опухолевым антигеном, экспрессируемым на раковой клетке, и первую генетическую метку и второй химерный антигенный рецептор, который содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с опухолевым антигеном, экспрессируемым на раковой клетке, и вторую генетическую метку.
[000186] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ лечения пациента, страдающего раком, экспрессирующим опухолевый антиген, включает введение эффективного количества композиции, содержащей первую клетку-хозяина, которая экспрессирует первый химерный антигенный рецептор, который содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с опухолевым антигеном, экспрессируемым на раковой клетке, и первую генетическую метку, и вторую клетку-хозяина, содержащую второй химерный антигенный рецептор, который содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с опухолевым антигеном, экспрессируемым на раковой клетке, и вторую генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
[000187] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения пациента, страдающего раком и/или экспрессирующего опухолевый антиген, причем указанный способ включает введение эффективного количества композиции, описанной в настоящем изобретении, и антитела, которое специфично связывается с генетической меткой, при этом клетки указанной композиции экспрессируют химерный антигенный рецептор, который содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с опухолевым антигеном, экспрессируемым на раковой клетке, и генетическую метку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело связывается с доменом IV Her2 или связывается с EGFRt. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела представляют собой герцептин или эрбитукс.
[000188] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если наблюдается токсическое действие композиции, вводят антитело, которое связывается с генетической меткой. Антитело может связываться и вызывать гибель CAR-экспрессирующих клеток указанной композиции, чтобы избежать токсичных и/или смертельных побочных эффектов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент предпочтительно содержит фрагмент Fc, чтобы активировать реакции ADCC. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конъюгирован с цитотоксическим агентом. Цитотоксические агенты включают кантансиноиды, калихеамицин и/или ауристатины. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цитотоксические агенты включают кантансиноиды, калихеамицин и/или ауристатины.
[000189] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело детектируемо помечено меткой для того чтобы обеспечить возможность детектирования клеток в условиях in vivo. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если антитело используют для детектирования в условиях in vivo, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент предпочтительно не содержит полноразмерной или части области Fc, чтобы избежать реакций ADCC. Детектируемые метки включают биотин, полигистидиновые метки, метки Мус, радиоактивные и/или флуоресцентные метки. Согласно некоторым вариантам реализации детектируемые метки содержат биотин, полигистидиновые метки, метки Мус, радиоактивные и/или флуоресцентные метки.
[000190] Согласно другим вариантам реализации способ включает введение субъекту препарата генетически модифицированных цитотоксических Т-лимфоцитов, который обеспечивает клеточный иммунный ответ, причем указанный препарат цитотоксических Т-лимфоцитов содержит CD8+ Т-клетки, которые содержат химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, специфичный в отношении поверхностной молекулы опухолевых клеток, спейсерный участок, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен и первую генетическую метку, описанную в настоящем изобретении, и/или препарат генетически модифицированных хелперных Т-лимфоцитов, который вызывает непосредственное распознавание опухоли и увеличивает способность препаратов генетически модифицированных цитотоксических Т-лимфоцитов вызывать клеточный иммунный ответ, причем указанный препарат хелперных Т-лимфоцитов содержит CD4+ Т-клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, специфичный в отношении поверхностной молекулы опухолевых клеток, спейсерный участок, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен и вторую генетическую метку.
[000191] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения описан способ осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или расстройство, включающий: исследование биологического образца субъекта для определения присутствия молекулы-мишени, связанной с заболеванием или расстройством, и введение композиций для адоптивной иммунотерапии, описанных в настоящем документе, причем указанный химерный рецептор специфично связывается с молекулой-мишенью.
[000192] Субъекты, которые могут получить лечение согласно настоящему изобретению, в целом включают человека и других субъектов-приматов, таких как обезьяны и человекообразные обезьяны, для ветеринарных целей. Субъекты могут быть мужского или женского пола, и могут иметь любой подходящий возраст, включая младенцев, малолетних детей, подростков, взрослых и гериатрических субъектов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъектом является субъект-примат или человек.
[000193] Указанные способы можно применять в лечении, например, гематологических злокачественных новообразований, меланомы, рака молочной железы и других эпителиальных злокачественных новообразований или солидных опухолей. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекула, связанная с заболеванием или расстройством, выбрана из группы, состоящей из орфанного тирозинкиназного рецептора ROR1, Her2, EGFR, СЕ7, hB7H3, CD19, CD20, CD22, мезотелина, СЕ А и поверхностного антигена вируса гепатита В.
[000194] Субъекты, которые могут получить лечение, включают субъектов, страдающих раком, включая, но не ограничиваясь перечисленными, рак толстой кишки, рак легких, рак печени, рак молочной железы, рак почек, рак простаты, рак яичников, рак кожи (включая меланому), рак костей, рак мозга и т.д. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения известны ассоциированные с опухолью антигены или молекулы, например, меланомы, рака молочной железы, плоскоклеточной карциномы, рака толстой кишки, лейкемии, миеломы и рака предстательной железы. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения ассоциированные с опухолью молекулы могут являться мишенью генетически модифицированных Т-клеток, экспрессирующих модифицированный химерный рецептор. Примеры включают, но не ограничиваются ими, В-клеточную лимфому, рак молочной железы, рак предстательной железы и лейкемию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект страдает В-клеточной лимфомой, раком молочной железы, раком простаты и/или лейкозом.
[000195] Клетки, полученные с помощью описанных выше способов, могут быть использованы в способах и композициях для адоптивной иммунотерапии в соответствии с известными методиками или их разновидностями, которые будут очевидны специалистам в данной области техники на основании настоящего описания.
[000196] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки получают путем сбора их из культуральной среды с последующим промыванием и концентрированием клеток в среде и контейнере, пригодном для введения («фармацевтически приемлемый» носитель) в терапевтически эффективном количестве. Подходящая среда для инфузии может представлять собой любой изотонический жидкий состав, как правило, нормальный физиологический раствор, Normosol R (Abbott) или Plasma-Lyte A (Baxter), также можно использовать 5% раствор декстрозы в воде или раствор Рингера с лактатом. Среда для инфузии может быть дополнена сывороточным альбумином человека, эмбриональной бычьей сывороткой или другими компонентами сыворотки человека.
[000197] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество клеток в композиции представляет собой транедуцированные CD4 или CD8 клетки или по меньшей мере 2 подгруппы клеток (например, 1 подгруппа представляет собой CD8+ Т-клетки центральной памяти и 2 подгруппа представляет собой CD4+ Т-хелперы) или обычно количество составляет более чем 102 клеток и вплоть до 106, вплоть до или равное 108 или 109 клеток, и может быть более 1010 клеток или любое количество клеток, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя конечными точками любого из перечисленных значений.
[000198] Количество клеток будет зависеть от конечной цели применения, для которой предназначена композиция, а также типа клеток, включенных в нее. Например, если желательны клетки, которые являются специфичными в отношении конкретного антигена, то популяция будет содержать более 70%, обычно более 80%, 85% и 90-95% указанных клеток, или любое процентное количество клеток, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных выше процентных значений.
[000199] В отношении вариантов применения, предложенных в настоящем изобретении, клетки обычно обеспечены в объеме 1 литр или менее, но более 1 нл, или 500 мл или менее, но более 1 нл, или 250 мл или 100 мл или менее, но более 1 нл, или в любом объеме, который находится в пределах диапазона, определенного двумя конечными точками любого из перечисленных значений.
[000200] Следовательно, плотность желаемых клеток, как правило, более 104 клеток/мл и обычно более 107 клеток/мл, обычно 108 клеток/мл или более. Клинически значимое количество иммунных клеток может быть распределено на несколько инфузий, которые совокупно обеспечивают количество клеток, которое соответствует или превышает 106, 107, 108, 108, 109, 1010 или 1011 клеток или любое количество клеток, которое находится в пределах диапазона, определенного двумя из указанных выше значений.
[000201] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лимфоциты могут быть использованы для придания индивидуумам иммунитета. Термин «иммунитет» означает облегчение одного или более физических симптомов, связанных с ответом на инфекцию патогеном, или на опухоль, на которую направлен ответ лимфоцитов. Количество вводимых клеток обычно находится в диапазоне, который наблюдают у нормальных индивидуумов с иммунитетом к возбудителю. Следовательно, клетки обычно вводят путем инфузии, причем с каждой инфузией вводят от 2 клеток и вплоть до по меньшей мере 106-3×1010 клеток, предпочтительно в диапазоне от по меньшей мере 107 до 109 клеток или любое количество клеток, которое находится в пределах диапазона, определенного двумя из указанных выше количеств.
[000202] Т-клетки могут быть введены с помощью однократной инфузии или нескольких инфузий в течение какого-либо периода времени. Однако поскольку ожидается, что различные индивидуумы имеют различную восприимчивость, тип и количество клеток, вводимых с помощью инфузии, а также количество инфузий и период времени, в течение которого проводят несколько инфузий, определяются лечащим врачом и могут быть определены с помощью стандартного исследования. Получение достаточных уровней Т-лимфоцитов (включая цитотоксические Т-лимфоциты и/или хелперные Т-лимфоциты) может быть легко достигнуто с применением способа быстрого размножения согласно настоящему изобретению, который приведен в качестве примера в настоящем документе.
[000203] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композицию, описанную в настоящем документе, вводят внутривенно, внутрибрюшинно, внутриопухолево, в костный мозг, в лимфатический узел и/или в спинномозговую жидкость. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции, содержащие модифицированные химерные рецепторы, доставляют в очаг опухоли. Согласно другому варианту композиции, описанные в настоящем документе, можно комбинировать с соединением, которое направляет клетки к опухоли или в компартменты иммунной системы, и при этом указанные композиции не обладают направленным действием на такие органы как легкие.
[000204] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции, описанные в настоящем документе, вводят с химиотерапевтическими агентами и/или иммунодепрессантами. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пациент сначала получает химиотерапевтический агент, который ингибирует или разрушает другие иммунные клетки, с последующим введением композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых случаях применение химиотерапии может не требоваться. Настоящее изобретение дополнительно описано далее в примерах, приведенных ниже.
Дополнительные варианты
[000205] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен выделенный полипептид, причем указанный выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, при этом указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит последовательность SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб.
[000206] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен выделенный полипептид, причем указанный выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 91%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, при этом указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her, и при этом указанный внеклеточный домен полипептида Неr2, содержащий последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединен с трансмембранным доменом последовательностью, содержащей аминокислоты GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам лидерный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб.
[000207] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена выделенная нуклеиновая кислота, причем указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, при этом указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит последовательность SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her, и при этом внеклеточный домен полипептида Her2, содержащий последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединен с трансмембранным доменом последовательностью, содержащей аминокислоты GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит трансген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансген содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит антигенсвязывающий домен, спейсерный участок, трансмембранный домен и по меньшей мере один стимулирующий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансген, соединен с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид Her2, с помощью саморасщепляющегося линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения саморасщепляющийся линкер представляет собой линкер Т2А, содержащий последовательность LEGGGEGRGSLLTCG (SEQ ID NO: 26). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25 (CD20CAR). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения размер выделенной нуклеиновой кислоты составляет 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 14,9 тыс.п.н., или любой размер, величина которого находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя перечисленными размерами конструкции.
[000208] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, причем указанная клетка-хозяин содержит выделенную нуклеиновую кислоту, при этом указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, при этом указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторьм вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит последовательность SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her, и при этом внеклеточный домен Her2 полипептида, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединен с трансмембранным доменом последовательностью, содержащей аминокислоты GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит трансген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансген содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит антигенсвязывающий домен, спейсерный участок, трансмембранный домен и по меньшей мере один стимулирующий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансген, соединен с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид Her2, с помощью саморасщепляющегося линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации саморасщепляющийся линкер представляет собой линкер Т2А, содержащий последовательность LEGGGEGRGSLLTCG (SEQ ID NO: 26). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 (CD20CAR). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из CD 8 Т-клеток, CD4 Т-клеток, CD4 наивных Т-клеток, CD8 наивных Т-клеток, CD8 клеток центральной памяти и CD4 клеток центральной памяти или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является аутологичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является антигенспецифичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения размер выделенной нуклеиновой кислоты составляет 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 14,9 тыс.п.н., или любой размер, величина которого находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя их перечисленных размеров конструкции.
[000209] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция, содержащая клетки-хозяева, причем указанные клетки-хозяева содержат выделенную нуклеиновую кислоту, при этом указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит последовательность SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, при этом указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her, и при этом внеклеточный домен полипептида Her2, содержащий последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединен с трансмембранным доменом последовательностью, содержащей аминокислоты GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит трансген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансген содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит антигенсвязывающий домен, спейсерный участок, трансмембранный домен и по меньшей мере один стимулирующий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансген, связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид Ней, с помощью саморасщепляющегося линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Неr2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Нer2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Неr2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения саморасщепляющийся линкер представляет собой линкер Т2А, содержащий последовательность LEGGGEGRGSLLTCG (SEQ ID NO: 26). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 (CD20CAR). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из CD8 Т-клеток, CD4 Т-клеток, CD4 наивных Т-клеток, CD8 наивных Т-клеток, CD8 клеток центральной памяти и CD4 клеток центральной памяти или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является аутологичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является антигенспецифичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева представляют собой гемопоэтические стволовые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения размер выделенной нуклеиновой кислоты составляет 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 14,9 тыс.п.н., или любой размер, величина которого находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из перечисленных размеров конструкции.
[000210] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ изготовления композиции, причем указанный способ включает введение выделенной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и культивирование клеток-хозяев в среде, содержащей по меньшей мере один фактор роста. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит последовательность SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her, и при этом внеклеточный домен Her2 полипептида, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединен с трансмембранным доменом последовательностью, содержащей аминокислоты GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 содержит аминокислоты 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансмембранный домен содержит аминокислоты 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенный полипептид дополнительно содержит лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лидерный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит трансген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансген содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит антигенсвязывающий домен, спейсерный участок, трансмембранный домен и по меньшей мере один стимулирующий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансген, соединен с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид Her2, с помощью саморасщепляющегося линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид Her2 по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен последовательности полипептида внеклеточного домена полипептида Her2, содержащего последовательность аминокислот с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23, соединенного с трансмембранным доменом, причем указанный выделенный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV Her2, и при этом указанный выделенный полипептид не включает полноразмерный зрелый Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения саморасщепляющийся линкер представляет собой линкер Т2А, содержащий последовательность LEGGGEGRGSLLTCG (SEQ ID NO: 26). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 (CD20CAR). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из CD 8 Т-клеток, CD4 Т-клеток, CD4 наивных Т-клеток, CD8 наивных Т-клеток, CD8 клеток центральной памяти и CD4 клеток центральной памяти или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является аутологичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин является антигенспецифичной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фактор роста выбран из ИЛ-15, ИЛ-7, ИЛ-21 или ИЛ-2, а также их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации способ дополнительно включает отбор клеток, которые экспрессируют полипептид Her2t. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки отбирают перед этапом культивирования клеток в среде. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки отобраны с применением антитела, которое связывается с доменом IV Her2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой трастузумаб. Согласно некоторым вариантам реализации способ дополнительно включает введение второй выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор, соединенный со второй генетической меткой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает отбор клеток, экспрессирующих вторую генетическую метку.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая генетическая метка содержит EGFRt.
[000211] Получение трансдуцированных клеток, содержащих CAR и последовательность маркера Her2t, описано далее.
Антитела и проточная цитометрия
[000212] Конъюгированные с флуорохромом антитела для контроля изотипа к CD3, CD4, CD8, CD45, Her2 и стрептавидину получали от BD Biosciences. Цетуксимаб (эрбитукс) и трастузумаб (герцептин) были приобретены у Детского научно-исследовательского института в Сиэтле (США). Эрбитукс и герцептин биотинилировали (Pierce) или напрямую конъюгировали с АРС (Solulink) в соответствии с инструкциями изготовителя. Сбор данных проводили на LSRFortessa (BD Biosciences), и процент клеток в области анализа рассчитывали с применением программного обеспечения для обработки данных FlowJo.
Линии клеток
[000213] Все линии клеток поддерживали в среде RPMI 1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 25 мМ HEPES (Irvine Scientific) и 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (Hyclone or Atlas), если не оговорено иное. Линии целевых клеток эритролейкоза К562 были любезно предоставлены доктором Стэнли Риддлл (Stanley Riddell) (Центр исследования рака Фреда Хатчинсона). Другие линии клеток, Т-лимфобласты линии Н9, клетки линии Raji (лимфома Беркитта человека) и 293Т (производная линия от линии клеток мезонефроса человека 293 с высокой эффективностью трансфекции) были получены из Американской коллекции типовых культур. Линии лимфобластных клеток, трансформированные вирусом Эпштейна-Барр (TM-LCLS), получали из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), как описано ранее (Pelloquin et al., 1986). Линии клеток, экспрессирующие GFP:ffluc, транедуцировали GFP:ffluc_epHIV7 и сортировали с помощью сортера FACSJazz BD.
Конструирование вектора и получение лентивируса, кодирующего Her2t или EGFRt
[000214] Лентивирусная конструкция второго поколения, 41BB-zeta CD19CAR-T2A-EGFRt_epHIV7, была описана ранее (Hudecek et al. 2013). (таблица 1)
[000215] CD20CAR-T2A-EGFRt_epHIV7 содержит scFv из Leu16 (мышиное антитело к CD20 человека), гибридизованный с частью спейсерного участка IgG4Hinge-CH3 человека (119 аминокислот) из IgG4, совместно с аналогичными сигнальными компонентами CD19CAR (4-lBB-zeta). (таблица 9)
[000216] Her2t синтезировали с помощью ПЦР, используя pDONR223-ErbB2 (Addgene) в качестве матрицы, и лентивирусный вектор epHIV7 в качестве остова, (таблицы 6 и 8) Готовый продукт, Her2t_epHIV7, содержит лидерный пептид рецептора гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (GMCSFRss), гибридизованный с доменом IV (аминокислоты 563-652) в пределах одной открытой рамки считывания, и трансмембранные компоненты Her2 (аминокислоты 653-675). EGFRt в конструкции CD19CAR-T2A-EGFRt_epHIV7 замещали Her2t с помощью ПЦР и клонирования по Гибсону. EGFRt синтезировали, как описано ранее (Wang et al. 2011). (таблица 7)
[000217] Лентивирусы, кодирующие CD19C AR-T2A-Her2t, CD19CAR-T2A-EGFRt, CD20CAR-T2A-EGFRt, Her2t и EGFRt, нарабатывали в клетках 293Т с применением упаковочных векторов pCHGP-2, PCMV-Rev2 и pCMV-G.
Получение линий клеток, экспрессирующих CAR, Her2t и/или EGFRt
[000218] Для получения CD4 или CD8 Т-клеток центральной памяти, МКПК человека выделяли с помощью Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech) из отбракованных образцов крови здоровых доноров (Центр крови Пьюджет-Саунд). МКПК от каждого донора разделяли на две группы (выделение CD4 или CD8 Т-клеток центральной памяти), и затем истощали с помощью сепаратора AutoMACS с применением наборов для выделения, специфичных в отношении CD4 или CD8, и микрогранул, специфичных в отношении CD45RA (Miltenyi Biotec), в соответствии с протоколом производителя. Истощенную фракцию затем подвергали положительному отбору с помощью AutoMACS с применением микрогранул, специфичных в отношении CD62L, чтобы получить CD4+CD45RO+CD62L+ или CD8+CD45RO+CD62L+ Т-клетки центральной памяти. Выделенные клетки затем стимулировали с применением 50 Ед/мл интерлейкина-2 (ИЛ-2), 2 нг/мл интерлейкина-15 (ИЛ-15) и микрогранул, специфичных в отношении CD3/CD28 (Life Technologies). Первичные линии Т-клеток транедуцировали на 3-й день после активации с помощью сульфата протамина (разведение 1:100) и величине MOI вируса составляющей 1, с последующим центрифугированием при 800g в течение 45 мин при 32°C. Все остальные линии клеток также транедуцировали на ранних этапах пассирования.
[000219] Подгруппы Her2t+ или EGFRt+ для каждой линии клеток обогащали с помощью иммуномагнитной селекции, используя биотин-конъюгированный герцептин или эрбитукс и микрогранулы, специфичные в отношении биотина (Miltenyi). Отобранные CD19 или CD20CAR+ Т-клетки размножали через 12-18 дней после трансдукции путем стимуляции облученными (8000 рад) TM-LCL, при соотношении Т клетки:TM-LCL составляющем 1:7, в присутствии 50 Ед/мл ИЛ-2 и 2 нг/мл ИЛ-15. CD19CAR-T2A-Her2t+/CD20CAR-T2A-EGFRt+ Т-клетки сортировали с применением биотинилированного герцептина и микрогранул, специфичных в отношении биотина Multisort (Miltenyi), затем удаляли микрогранулы, помечали клетки с применением эрбитукс-АРС и связывали с микрогранулами, специфичными в отношении АРС (Miltenyi).
Определение концентрации белка.
[000220] Лизис клеток проводили в буфере RIPА, содержащем коктейль ингибиторов протеаз. Клеточные лизаты исследовали с помощью набора для количественного исследования ВСА (Pierce), вносили в равных количествах на гели, и вестерн-блоты исследовали с применением первичных антител к Her2 и фосфо-Her2 (Cell Signaling Technology), антител к CD247 (CD3ζ, биотинилированного герцептина или антител к β-актину (для контроля количества внесенного образца). Вторичный стрептавидин, конъюгированный с IRDye 800CW, или антитела козы к Ig мыши или кролика (LI-COR) добавляли в соответствии с инструкциями изготовителя. Блоты визуализировали на инфракрасной системе визуализации Odyssey (LI-COR).
Количественные исследования цитотоксичности, выработки цитокинов и пролиферации
[000221] Цитотоксичность: Количественные исследования высвобождения хрома в течение 4 часов проводили, как описано ранее (Wang et al. 2011). Антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) определяли, используя не более 2,5×105 ТСМ клеток, экспрессирующих CD19CAR с маркером Her2t, CD20CAR с маркером EGFRt, CD19CAR-Her2t и CD20CAREGFRt, а также CD19CAR с маркерной последовательностью EGFRt, в качестве эффекторных клеток в совместных культурах с 5×103 Cr51-меченых клеток К562, экспрессирующих CD19 или CD20.
[000222] Выработка цитокина: Т-клетки (5×105) высевали в трех повторах совместно с клетками-мишенями при соотношении Е:Т составляющем 2:1 в 96-луночный планшет, и супернатанты исследовали методом проточной цитометрии микрогранул с применением панели Bio-Plex Human Cytokine (Bio-Rad) в соответствии с инструкциями изготовителя.
[000223] Пролиферация: Т-клетки метили с применением 0,2 мкМ эфира карбоксифлуоресцеинсукцинимидила (CFSE; Invitrogen), промывали и высевали в трех повторах совместно со стимулирующими клетками в среду, не содержащую экзогенных цитокинов. Через 72 ч инкубации клетки метили антителами к CD3, окрашивали для определения количества живых/мертвых клеток и исследовали методом проточной цитометрии для оценки клеточного деления жизнеспособных CD3+ клеток.
Приживление Т-клеток в условиях in vivo и ADCC
[000224] Все эксперименты на мышах были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Детского научно-исследовательского института в Сиэтле. Мыши линии NOD/Scid IL2RγCnull были получены из лаборатории Джексона или разведены в исследовательском центре.
[000225] Приживление: мышам линии NOD/Scid IL2RγCnull в возрасте от 6 до 10 недель вводили внутривенно на 0-й день 107 Her2t/EGFRt-отрицательных Т-клеток (контроль) или Her2t или EGFRt-отобранных Т-клеток и подкожно вводили 5×106 жизнеспособных клеток NS0-IL15, чтобы обеспечить системное поступление ИЛ-15 человека в условиях in vivo. Костный мозг собирали у убитых животных через 14 дней, и суспензии клеток исследовали методом проточной цитометрии с применением антител к CD45, окрашивающих реагентов для выявления живых/мертвых клеток, антител к CD4, CD8, биотинилированного герцептина или эрбитукса и стрептавидин-АРС, предоставленных BD Biosciences. Согласно другому варианту бедренные кости фиксировали в 10% формалине в течение 24 часов, декальцинировали в течение 2-х часов (Richard-Allan Scientific) и заливали парафином для иммуногистохимического окрашивания с применением антител к CD45 (DAKO), антител к EGFR (клон 31G7; Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя, или с применением биотинилированного герцептина и SA-AF647 с последующим контрастирующим окрашиванием Hoechst. Аналогичным образом, линии клеток Her2+ или Her2t+ прикрепляли к стеклам с применением поли-L-лизина и затем окрашивали с применением биотинилированного герцептина и SA-AF647. Флуоресцентные изображения получали с применением визуализирующей системы Nuance FX Biomarker.
Статистический анализ
[000226] Статистический анализ проводили с применением программного обеспечения Prism (GraphPad). Т-тесты Стьюдента проводили как двусторонние парные тесты с доверительным интервалом 95%, и результаты со значением Р менее 0,05 рассматривали как значимые. Статистический анализ выживаемости проводили с применением логарифмического рангового критерия, и результаты со значением Р менее 0,05 рассматривали как значимые.
Дизайн и начальная характеристика многофункционального поверхностного эпитопа на основе ErbB2 человека (Her2).
[000227] Применение и отбор гомогенных продуктов иммунных клеток является ограничивающим фактором для клинического успеха и воспроизводимости стратегий адоптивной терапии. Для преодоления этих ограничений был сконструирован неиммуногенный эпитоп на основе Her2 человека, названный Her2t, в качестве генетической метки-кандидата и инструмента для клеточной инженерии (фигура 1, панель A). Her2t лишен всех внутриклеточных компонентов Her2, но содержит трансмембранный участок Her2, конформационно неповрежденный связывающий эпитоп, который распознается моноклональным антителом трастузумабом (герцептин) и GMCSFRss, чтобы облегчить поверхностную экспрессию (фигура 1, панель В). Три варианта конструкции Her2t, один из которых содержит полноразмерный домен IV Her2 и два содержат минимальные конформационные эпитопы, разработанные на основе трехмерной структуры Her2 в комплексе с герцептином (Garrett et al 2007; Cho et al 2003), первоначально встраивали в лентивирусную упаковывающую плазмиду epHIV7 и характеризовали в клетках СНО. Конструкция Her2t, включая аминокислоты 563-652, представленная на фигуре 1, панель В, проявила максимальный уровень кратковременной поверхностной экспрессии, согласно результатам проточной цитометрии с применением биотинилированного герцептина и стрептавидин-конъюгированного флуорофора, и на этом основании была отобрана для последующего описания (данные не приведены).
Her2t представляет собой перспективную и функционально инертную генетическую метку
[000228] После первоначального исследования кратковременной экспрессии, конструкцию epHIV7, содержащую Her2t, применяли для получения псевдотипированных самоинактивирующихся лентивирусов с применением плазмиды, экспрессирующей VSV-g. Полученный вирус затем транедуцировали в различные типы клеток, что позволило получить 8,2-65% Her2t+ популяций (данные не приведены), при этом транедуцированные клетки эритролейкоза К562 (13,8% Her2t+) представлены в качестве типичного примера (фигура 2, панель А). Чтобы оценить возможность применения Her2t в качестве мишени для селективного обогащения популяций клеток, экспрессирующих трансген, транедуцированную популяцию К562 подвергали двухэтапной иммуномагнитной очистке с применением биотинилированного герцептина и микрогранул, специфичных в отношении биотина. Указанный способ позволял рутинно получать популяции клеток, содержащие ≥95% Her2t+ клеток (фигура 2, панель В). Последующие титровочные эксперименты выявили, что 1,2 нг или менее биотинилированного герцептина является достаточным, чтобы максимально пометить 106 Her2t+ клеток, (фигура 2, панель А).
[000229] Как показано в молекулярной модели в настоящем документе (фигура 1, панель A), Her2t лишен внеклеточных доменов I-III и содержит эпитоп связывания домена IV, необходимый для распознавания антител. Соответственно, было выдвинуто предположение, что Her2t будет неспособен связываться с коммерческими антителами к Her2 и будет уникально распознаваться герцептином. Результаты проточной цитометрии подтвердили, что герцептин может эффективно распознавать и окрашивать клетки К562, экспрессирующие Her2t и полноразмерный Her2, в то время как коммерческие антитела способны распознавать только полноразмерный Her2 (фигура 2, панель С).
[000230] Исследования Her2t и полноразмерного Her2 методом вестерн-блоттинга также проводили на отобранных с помощью герцептина клетках, экспрессирующих Her2t+ или полноразмерный Her2+, соответственно. Как ожидалось, при использовании коммерческого антитела к Her2 полноразмерный белок Her2 массой 185 кДа детектировали только в лизатах из клеток, экспрессирующих полноразмерный Her2. Аналогичным образом, фосфорилирование Her2 детектировали только в лизатах клеток, экспрессирующих полноразмерный Her2, обработанных нейрегулином. Полосу, соответствующую Her2t, детектировали только в лизатах Her2t+ клеток при окрашивании биотинилированным герцептином (фигура 2, панель D).
Her2t является узкоспецифичным и дополнительным селективным эпитопом для Т-клеточной терапии.
[000231] Высокоэффективный селективный эпитоп для лекарственных препаратов Т-клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), обозначенный EGFRt, был выявлен ранее (Wang et al 2011). Проводили исследование того, может ли совместная экспрессия Her2t в CAR-содержащих вирусных векторах облегчить клиническое применение в условиях ex vivo сконструированных лекарственных средств, экспрессирующих CAR, с широкой областью действия. Кроме того, Her2t обеспечивает разнообразие репертуара доступных, неиммуногенных селективных маркеров для CAR-перенаправленных Т-клеточных лекарственных средств и может выступать в качестве альтернативы или дополнения к стратегиям отбора на основе EGFRt (т.е. придает Т-клетке двойную специфичность в отношении нескольких опухолевых антигенов-кандидатов).
[000232] Для того чтобы оценить возможность применения Her2t в CAR-терапии, конструировали многодоменную конструкцию ДНК, состоящую из описанных ранее CD19CAR (Hudecek et al 2013) и последовательности Т2А, обеспечивающей перескок рибосом, чтобы направить коэкспрессию с Her2t (фигура 1, панель С). Полученную конструкцию CD19CAR-T2A-Her2t затем встраивали в epHIV7 и получали вирусные частицы, как было описано ранее.
[000233] Для того чтобы оценить функциональность Her2t в качестве селективного маркера, по сравнению или совместно с экспрессией EGFRt, CD4+ или CD8+ клетки центральной памяти (ТСМ) (фигура 3, панель А) транедуцировали панелью вирусных векторов, содержащих CAR-T2A-Her2t и/или CAR-T2A-EGFRt (фигура 3, панель В). CD4+ или CD8+ ТСМ, транедуцированные одним CAR-содержащим вектором, содержали 22-72% Her2t+ или EGFRt+ на этапе предварительного иммуномагнитного отбора с применением биотинилированного герцептина (Her2t) или эрбитукса (EGFRt) и микрогранул, специфичных в отношении биотина, однако популяция была последовательно обогащена до однородной чистоты (>90% после отбора (фигура 3В). Двойные положительные Her2t+- и EGFRt+-трансдуцированные клетки подвергали другому варианту иммуномагнитной сортировки с применением комбинации Multisort и микрогранул, специфичных в отношении АРС (материалы и методы), что позволило получить >90% клеток, положительных в отношении обоих трансгенов (фигура 6).
[000234] Согласно другому варианту двойные транедуцированные линии клеток могут быть отсортированы с применением свободного биотина или стрептавидина в качестве альтернативы удалению микрогранул. Поскольку обработка данных по средней интенсивности флуоресценции (MFI) проточной цитометрии выявила, что Her2t-отобранные популяции ТСМ могут экспрессировать более низкие уровни трансгенов по отношению к EGFRt-отобранным популяциям (фигура 3, панель В), далее были проведены исследования прямой корреляционной зависимости между уровнем Her2t и более низким уровнем экспрессии CAR. Для проведения указанных исследований ТСМ, экспрессирующие CD19CAR, которые были отобраны на основании экспрессии Her2t или EGFRt, лизировали, и клеточные лизаты исследовали с помощью CD3ζ-направленного вестерн-блоттинга. Результаты показывают, что Her2t-соединенные трансгены могут быть отобраны при более высоком уровне экспрессии (например, приблизительно в 2 раза), чем EGFRt-соединенные трансгены (фигура 3, панель С). Полученные результаты означают, что Her2t обеспечивает более строгий процесс отбора по сравнению с отбором на основании экспрессии EGFRt. Результаты исследования методом вестерн-блоттинга также выявили совместную экспрессию CD19CAR и CD20CAR в ТСМ, подвергнутых двойному отбору (фигура 3, панель С).
Тем, подвергнутые двойному отбору, сохраняют эффекторный фенотип и целевую специфичность в условиях in vitro
[000235] Различные типы рака подавляют или вызывают мутации антигенов-мишеней в качестве способа избегания терапии. Следовательно, одновременное нацеленное воздействие на несколько ассоциированных с опухолью антигенов является перспективным терапевтическим подходом к преодолению ускользания опухоли и может расширить терапевтический охват Т-клеточных лекарственных средств. Для того чтобы оценить, может ли совместная экспрессия двух CAR (CD19- и CD20-CAR), опосредованная отбором поверхностного маркера (Her2t и EGFRt), усилить функциональные свойства CAR-перенаправленных Т-клеток, исследовали функцию двойных положительных CAR-экспрессирующих ТСМ в условиях in vitro по сравнению с их моноположительными CAR-экспрессирующими аналогами. Результаты исследования цитотоксичности выявили, что каждая CAR-перенаправленная подгруппа ТСМ (клетки, экспрессирующие CD19-, CD20- или CD19- и CD20-CAR) приводила к аналогичным уровням специфичного лизиса при использовании в качестве мишеней клеток К562, которые экспрессируют CD19, CD20 или оба белка (фигура 4, панель А), однако не вызывала распознавание CD19-/CD20- исходных клеток-мишеней К562 (фигура 4, панель В).
[000236] Далее исследовали парную функциональность двойных положительных CAR-экспрессирующих ТСМ в отношении целевой панели К562 (фигура 4, панель В), и полученные результаты выявили, что только двойные положительные CAR-экспрессирующие ТСМ смогли обеспечить специфичный лизис К562, экспрессирующих все мишени. Напротив, CD19- или CD20-специфичные CAR-экспрессирующие клетки ТСМ обладали цитолитической активностью только в отношении клеток К562, экспрессирующих их когнатные антигены-мишени (фигура 4, панель В).
[000237] Результаты количественного исследования выработки цитокинов в ответ на стимуляцию целевой панелью К562 указывают на аналогичную специфичность. В то время как ни одна CAR-экспрессирующая ТСМ не была способна вырабатывать цитокины в ответ на совместное культивирование с исходными клетками К562, двойные положительные CAR-экспрессирующие ТСМ вырабатывали ИЛ-2, ИФН и ФНО-альфа в ответ на совместное культивирование с клетками, экспрессирующими все мишени, и выработка цитокинов была ограничена целевыми клетками K562/CD19-CD20 и K562/CD19 или K562/CD20 для моноположительных CAR-экспрессирующих TCM. (фигура 4, панель С). Полученные результаты указывают на то, что только двойные положительные CAR-экспрессирующие ТСМ являются биспецифичными в отношении CD19 и CD20, и опосредуют активацию и нацеливание Т-клеток при контакте с каким-либо антигеном по отдельности. Интересно отметить, что Her2t-отобранные CD19CAR-экспрессирующие ТСМ вырабатывали более разнообразный и расширенный профиль цитокинов (например, приблизительно в 2-3 раза больше) по сравнению с их EGFRt-отобранным аналогом, (фигура 3, панель D). Это может быть связано с узкоспецифичным характером отбора на основании экспрессии Her2t и полученным в результате повышением общего уровня экспрессии CAR в Her2x-отобранных TCM.
[000238] Поскольку противоопухолевая активность CAR коррелирует с пролиферацией и выживанием перенесенных Т-клеток, проводили количественное исследование разбавления CFSE, чтобы оценить пролиферацию CAR-модифицированных ТСМ после связывания с соответствующей мишенью(ми). Было установлено, что двойная экспрессия CAR способствует пролиферации ТСМ после стимуляции на уровне, который аналогичен таковому для CD19CAR-экспрессирующих TCM.
Отслеживание адоптивно перенесенных Her2t + Т-клеток с помощью проточной цитометрии и иммуногистохимии.
[000239] Большинство клинических исследований CAR-терапии на сегодняшний день полагались на методики, основанные на ПЦР, чтобы количественно оценить сохранение генетически модифицированных клеток после терапевтического дозирования. Применение генетических меток, специфичных для конкретного способа терапии, таких как Her2t, может дополнительно обеспечить многопараметрический фенотипический анализ и выявление инъецированных подгрупп CAR-экспрессирующих Т-клеток, что может коррелировать с терапевтическими ответами.
[000240] Чтобы оценить возможность применения Her2t в качестве агента для отслеживания в условиях in vivo, образцы костного мозга мышей NOD/ScidIL-2RγCnull, которым приживляли CD19CAR+Her2t+CD4 и CD8 ТСМ, собирали и исследовали обработанные образцы методом проточной цитометрии. (фигура 5, панель А). Аналогичные уровни приживления CD45+ Т-клеток были обнаружены у мышей, которым вводили клетки, не экспрессирующие маркер, Her2t+ и EGFRt+ клетки (фигура 5, панель В). Из всей подгруппы CD45+ Т-клеток 11,7-45,7% подвергали двойному окрашиванию CD8, что указывает на преимущественное размножение CD4+ Т-клеток. Кроме того, совместное окрашивание Her2t с применением биотинилированного герцептина и АРС-конъюгированного стрептавидина, позволило отличить Her2t+ Т-клетки от их Her2t-отрицательных аналогов (фигура 5, панель С). Полученные результаты показывают, что Her2t является перспективным маркером для отслеживания адоптивно перенесенных Т-клеток.
[000241] Далее определяли , является ли Her2t перспективной мишенью для иммуногистохимического окрашивания (IHC). В качестве предварительного исследования Her2t+ клетки прикрепляли к стеклам и окрашивали биотинилированным герцептином и флуорохром-конъюгированным стрептавидином (фигура 5, панель D).
Связывание герцептина с Her2t сенсибилизирует Т-клетки человека к ADCC.
[000242] Включение механизма безопасности во введенные Т-клетки является значимым признаком в случае возникновения нежелательного клинического явления во время терапии. Исследование цитотоксичности Her2t+ или EGFRt+ Т-клеток при совместном культивировании с МКПК, стимулированными ГМ-КСФ, в условиях in vitro будет проведено с применением герцептина или эрбитукса.
[000243] Клетки Н9 (Т-клетки) (5×106 исходных клеток, Her2t+, EGFRt+ или Her2t+/EGFRt+) смешивали и затем подвергали очистке, (фигура 6). Клетки сначала очищали с помощью биотинилированного герцептина и микрогранул, специфичных в отношении биотина, Multisort. Затем микрогранулы Multisort удаляли, и положительную фракцию подвергали очистке с применением эрбитукс-АРС и микрогранул, специфичных в отношении АРС. Готовая положительная фракция представляла собой двойную положительную фракцию в отношении Her2t и EGFRt. (фигура 6).
[000244] В используемой системе стимулированные МКПК будут выступать в качестве источника эффекторных клеток, способных индуцировать антитело-зависимую цитотоксичность в присутствии антитела. Цель может заключаться в селективном уничтожении Her2t+ или EGFRt+ клеток, когда к совместной культуре добавляют герцептин или эрбитукс, соответственно. Область применения указанных исследований будет расширена в условиях in vivo с применением ffluc+ ТСМ, которые коэкспрессируют Her2t или EGFRt. В этих условиях ТСМ будут приживлены мышам NOD/Scid IL-2RγCnull с последующим введением герцептина или эрбитукса и свежеактивированных МКПК. Приживление в условиях in vivo и антитело-опосредованное выведение ТСМ будет измерено с помощью биофотонной визуализации в условиях in vivo. Выведение, опосредованное герцептином или эрбитуксом, должно быть специфичным в отношении ТСМ, экспрессирующих Her2t, EGFRt или оба маркера.
Комбинированный отбор Her2t и EGFRt обеспечивает двойную CAR-специфичность в условиях in vivo
[000245] Цель данных экспериментов заключается в том, чтобы показать селективную противоопухолевую активность в условиях in vivo. Опухолевые клетки К562 ffluc+, которые являются CD19+, CD20+ или CD19/CD20+, получают с помощью подкожной инъекции в левый или правый бок мышей NOD/ScidIL-2RγCnull. ТСМ, экспрессирующие CD19CAR-Her2t, CD19CAR-EGFRt, CD20CAR-EGFRt или CD19CAR-Her2t и CD20CAR, вводят внутривенно после образования опухоли, и специфичность Т-клеток определяют с помощью биофотонной визуализации. Потеря активности люциферазы опухоли (общий поток фотонов) будет означать регресс опухоли.
[000246] Регрессия опухоли должна происходить для всех опухолевых мишеней, если мыши получают двойные положительные CAR-экспрессирующие ТСМ, тогда как только CD19- или CD20-экспрессирующие опухоли К562 должны регрессировать, если мыши получают ТСМ, экспрессирующие их когнатный CAR. Согласно другому варианту CD19+, CD20+ или CD19/CD20+ клетки К562 получают, как описано выше, и ffluc+CAR+TCM вводят после образования опухоли. Локализация ТСМ на основе CAR-специфичности определяют с помощью биофотонной визуализации. Her2t+EGFRt+T-клетки, подвергнутые двойному отбору, должны быть локализованы на обоих боках, независимо от антигена-мишени на опухолях К562, в то время как клетки, экспрессирующие CD19 или CD20CAR, должны быть локализованы в опухоли К562, содержащей их специфичный антиген-мишень.
Введение линкерного домена (Her2tG) между доменом IV Her2 и трансмембранным доменом позволяет усилить связывание с антителом герцептином.
[000247] На фигуре 7 представлены схемы первичной последовательности Her2t и Her2tG. Her2tG отличается от Her2t добавлением последовательности линкера между доменом IV Her2 и трансмембранным участком, и содержит последовательность GGGSGGGS (SEQ ID NO: 45), указанная конструкция обозначена Her2tG. Клетки Н9 транедуцировали лентивирусами, несущими Her2t или Her2tG, при МOI=1. Транедуцированные клетки затем очищали с помощью биотинилированного герцептина и микрогранул, специфичных в отношении биотина, согласно протоколу производителя. Очищенные популяции затем окрашивали для выявления Her2t или Her2tG с применением биотинилированного герцептина и стрептавидин-фикоэритрина (ФЭ). Данные, представленные на гистограммах, свидетельствуют о более высоком уровне связывания с Her2tG (фигура 8). Как показано на фигуре 9, клетки Н9 транедуцировали лентивирусами, взятыми в объеме 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1 и 3 мкл (слева направо), и через пять дней исследовали для определения связывания герцептина. Вариант Her2t, Her2t(CD28hinge), был способен связаться с герцептином с уровнями, аналогичными таковым для исходного Her2t (окрашивание Her2t не показано, использовали данные по интенсивности окрашивания из предшествующих экспериментов). Her2t(IgG4hinge) усиливал связывание герцептина по сравнению с Her2t или Her2t(CD28hinge), тогда как вариант Her2tG обладал наибольшей способностью связывать герцептин и окрашивать транедуцированные клетки Н9.
[000248] На основании результатов экспериментов установлено, что линкер (SEQ ID NO: 45) между доменом IV и трансмембранным доменом Her2t позволил получить конструкцию Her2tG. Линкер используют для того чтобы придать гибкость участку последовательности между белковыми доменами. В других примерах scFv многих CAR содержат четыре последовательные субъединицы G3S, помещенные между областями VH и VL из scFv CAR. Это обеспечивает гибкость при складывании двух доменов scFv. Целесообразность подхода в настоящем изобретении заключается в том, что двух линкерных субъединиц G3S достаточно, чтобы обеспечить аналогичную гибкость для Her2tG.
[000249] Две линкерные субъединицы G3S (SEQ ID NO: 45) также применяли для имитации длины спейсера CD28hinge и IgG4hinge. Оба, CD28hinge и IgG4hinge, использовали в качестве спейсеров между scFv и трансмембранной областью в CAR, которые являются функциональными. CD28hinge и IgG4hinge содержат цистеин, который облегчает димеризацию. Несмотря на то, что димеризация обеспечивает преимущества для CAR, она может ингибировать гибкость Her2t и вследствие этого препятствует значительному распознаванию герцептином. Преимущество применения двух линкеров G3S (SEQ ID NO: 45), по сравнению с тремя или четырьмя, заключается в том, чтобы ограничить полезную нагрузку вектора, устранить потенциально ненужные последовательности и в то же время добиться расширенных функциональных возможностей.
[000250] В настоящем документе описан многоцелевой поверхностный маркер клеток, обозначенный Her2t. Указанный новый маркер содержит только 113 из 1255 аминокислот, составляющих полноразмерный Her2, и лишен всех дополнительных или внутриклеточных доменов, ответственных за интактный путь передачи сигналов с участием Her2 в клетке. Гемопоэтические клетки лишены экспрессии Her2, что делает Her2t главным кандидатом для применения в качестве селективного маркера трансгенов, который, благодаря его дизайну, является функционально инертными, однако при этом позволяет проводить очистку донорных Т-клеток с получением однородных терапевтических продуктов, экспрессирующих трансген. Дизайн Her2t включает гибридизацию N-концевого фрагмента Her2t с лидерным пептидом альфа-цепи рецептора ГМ-КСФ человека. Гибридизация облегчает поверхностную экспрессию Her2t и обеспечивает уникальное распознавание минимального связывающего эпитопа трастузумабом, моноклональным антителом фармацевтического качества (герцептин).
[000251] Было показано, что благодаря минимальной занимаемой площади кДНК Her2t можно экспрессировать по отдельности или скоординированно встраивать в самоинактивирующиеся лентивирусные векторы совместно с биологически активными трансгенами, а именно химерным антигенным рецептором (CAR). Координированные уровни экспрессии трансгена были достигнуты путем добавления Her2t к CAR посредством ликера Т2А, обеспечивающего перескок рибосом, и были проверены методами проточной цитометрии и вестерн-блоттинга Her2t-очищенных CD8 Т-клеток центральной памяти. Кроме того, было показано, что Her2t является узкоспецифичным селективным эпитопом, который, по сравнению со стратегиями, основанными на отборе с помощью EGFRt, позволяет отбирать Т-клетки с более значительным уровнем экспрессии CAR и выработкой эффекторных цитокинов в условиях ex vivo. Указанная характеристика может обеспечить преимущества, если желательны более высокие уровни экспрессии трансгена, как в случае расширения области применения CAR-терапии для лечения различных типов опухолей.
[000252] Помимо повышения уровней экспрессии трансгена в Т-клетках, возможность придать отдельным Т-клеткам двойную специфичность в отношении нескольких опухолевых антигенов может обеспечить преимущества в клинических условиях. Действительно, в различных типах рака обычно наблюдается подавление или мутирование антигенов-мишеней, что требует применения стратегий, которые выходят за рамки терапии с применением только одного CAR. Аналогичным образом, было показано, что Her2t является дополнительным селективным эпитопом для EGFRt, что, в случае если каждый селективный эпитоп добавлен к CAR, может облегчить очистку Т-клеток, экспрессирующих два CAR, с применением набора Multisort. Аналогичные уровни цитотоксической активности и выработки эффекторных цитокинов между моноположительными и двойными положительными CAR-экспрессирующими Т-клетками указывают на то, что отдельная или согласованная экспрессия Her2t и EGFRt не приводит к какому-либо явному функциональному нарушению.
[000253] Герцептин поддается биотинилированию или химической конъюгации. Состав герцептина для коммерческого использования восстанавливается Н2О, соответствующей требованиям для применения в клинических условиях, и сохраняет Her2-специфичное высокоаффинное связывание после биотинилирования. Перечисленные признаки, в сочетании с наличием микрогранул, специфичных в отношении биотина (Miltenyi Biotec), соответствующих требованиям кНМП, позволяют отбирать терапевтически значимые Her2t+ клетки на устройстве CliniMACS. Было показано, что популяция клеток, содержащая не более 13,8% Her2t-положительных клеток, может быть иммуномагнитно обогащена до чистоты >90%. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о том, что биотинилированный герцептин можно комбинировать с антителами к маркерам Т-клеток, чтобы обеспечить многопараметрический фенотипический анализ и отслеживать распределение терапевтических CAR-экспрессирующих Т-клеток в условиях in vivo.
[000254] Терапевтический охват иммунотерапии на основе CAR быстро расширяется за пределы своего первоначального успеха в лечении опухолей кроветворного происхождения. Существует потребность в других генетических метках, которые по своей природе являются неиммуногенными, уникальными для популяций Т-клеток и высокоэффективными при отборе. Her2t обладает всеми вышеупомянутыми характеристиками и обеспечивает разнообразие репертуара селективных эпитопов, которые будут использованы для CAR-терапии. Кроме того, Her2t является главным кандидатом для согласованного отбора терапевтических средств, содержащих CAR, оснащенных мультиплексными генетическими системами.
[000255] Преимущество использования Her2t заключается в его миниатюрном размере. По этой причине Her2t обладает преимуществом эффективной упаковки совместно с еще большими конструкциями. Для того чтобы воспользоваться преимуществами системы предпочтительно иметь конструкцию с размером менее 5 тыс.п.н. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения размер конструкции составляет 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 14,9 тыс.п.н. или любой размер, который находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из перечисленных размеров конструкции. Небольшой размер необходим, поскольку конструкции, размер которых превышает 15 тыс.п.н., могут иметь низкие титры.
[000256] Приведенное выше описание иллюстрирует настоящее изобретение и не должно быть истолковано как ограничивающее. Объем настоящего изобретения определен нижеследующей формулой изобретения, которая включает эквиваленты формулы изобретения. Все ссылки и документы, упомянутые в настоящем документе, полностью включены в него посредством ссылки.
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
1-18 - сигнальный пептид
19-152 - внеклеточный домен
153-179 - трансмембранный домен
180-220 - внутриклеточный домен
Положение 186-187 LL→GG
Figure 00000005
1-23 - сигнальный пептид
24-186 - внеклеточный домен
187-213 - трансмембранный домен
214-255 - внутриклеточный домен
Figure 00000006
1-21 - сигнальный пептид
22-30 - внеклеточный домен
31-51 - трансмембранный домен
52-164 - внутриклеточный домен
61-89 ITAM1
100-128 - ITAM2
131-159 - ITAM3
Figure 00000007
Модифицированный IgG4 человека ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 10)
Модифицированный IgG4 человека YGPPCPPCP (SEQ ID NO: 11)
Модифицированный IgG4 человека KYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 12)
Модифицированный IgG4 человека EVVKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 13)
Figure 00000008
Figure 00000009
Figure 00000010
Figure 00000011
1-22 - сигнальный пептид
23-652 - внеклеточный домен
653-675 - трансмембранный домен
676-1255 - цитоплазматическая часть
Figure 00000012
Figure 00000013
Остальная часть конструкции СD20СAR (СВ28tm-41BB-zeta-T2A-EGFRt) аналогична конструкции CD19CAR-T2A-EGFRt.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Seattle Children's Hospital
dba Seattle Children's Research Institute
Jensen, Michael C.
Johnson, Adam
<120> ТРАНСГЕННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТКИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> SCRI.066WO
<150> 62/058,973
<151> 2014-10-02
<150> 61/977,751
<151> 2014-04-10
<150> 61/986,479
<151> 2014-04-30
<150> 62/089,730
<151> 2014-12-09
<150> 62/090,845
<151> 2014-12-11
<150> 62/088,363
<151> 2014-12-05
<160> 50
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD19CAR ДНК, кодирующая часть модифицированной шарнирной области IgG4
<400> 1
gacgtggagg agaatcccgg ccctagg 27
<210> 2
<211> 476
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD19 CAR
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
275 280 285
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
290 295 300
Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
305 310 315 320
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
325 330 335
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
340 345 350
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
355 360 365
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
370 375 380
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
385 390 395 400
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
405 410 415
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
420 425 430
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
435 440 445
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly
450 455 460
Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly
465 470 475
<210> 3
<211> 180
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> домен CD28
<400> 3
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg
180
<210> 4
<211> 240
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> домен 4-1BB
<400> 4
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
<210> 5
<211> 164
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> изоформа 3 zeta CD3 человека
<400> 5
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> шарнирная область IgG1 человека
<400> 6
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> шарнирная область IgG2 человека
<400> 7
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 8
<211> 61
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> шарнирная область IgG3 человека
<400> 8
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> шарнирная область IgG4 человека
<400> 9
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированная шарнирная область IgG4 человека
<400> 10
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированная шарнирная область IgG4 человека
<400> 11
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированная шарнирная область IgG4 человека
<400> 12
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированная шарнирная область IgG4 человека
<400> 13
Glu Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 14
<211> 408
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Her2t (усеченный Her2 белок)
<400> 14
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccatgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 120
gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 180
cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 240
ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 300
ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgtcca tcatctctgc ggtggttggc 360
attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc tttgggatcc tcatctga 408
<210> 15
<211> 135
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Her2t (усеченный Her2 белок)
<400> 15
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly
20 25 30
Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala
35 40 45
His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val
50 55 60
Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu
65 70 75 80
Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp
85 90 95
Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr
100 105 110
Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly
115 120 125
Val Val Phe Gly Ile Leu Ile
130 135
<210> 16
<211> 35
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая генетическая метка
<400> 16
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly
20 25 30
Ser Val Thr
35
<210> 17
<211> 22
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лидерная последовательность расположения белка
<400> 17
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 18
<211> 90
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Фрагмент белка Her2, распознаваемый анти-Her2
антителом
<400> 18
Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly
1 5 10 15
Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro
20 25 30
Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr
35 40 45
Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys
50 55 60
Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys
65 70 75 80
Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr
85 90
<210> 19
<211> 24
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Фрагмент трансмембранного домена Her2, трансмембранный домен Her2
<400> 19
Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly
1 5 10 15
Val Val Phe Gly Ile Leu Ile Ile
20
<210> 20
<211> 113
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен Her2 в виде аминокислот 653-675
<400> 20
Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly
1 5 10 15
Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro
20 25 30
Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr
35 40 45
Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys
50 55 60
Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys
65 70 75 80
Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val
85 90 95
Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu
100 105 110
Ile
<210> 21
<211> 1074
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая усеченный рецептор эпидермального фактора роста
<400> 21
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120
aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180
ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240
ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300
gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360
caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420
tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480
gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540
agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600
cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660
ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720
aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780
acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840
gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900
gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960
ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020
ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 1074
<210> 22
<211> 357
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Усеченный рецептор эпидермального фактора роста
<400> 22
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 23
<211> 1255
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Полноразмерная изоформа 1 Her2 человека
<400> 23
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
785 790 795 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805 810 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly
820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
930 935 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
980 985 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 1000 1005
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu
1010 1015 1020
Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly
1025 1030 1035 1040
Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly
1045 1050 1055
Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg
1060 1065 1070
Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly
1075 1080 1085
Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His
1090 1095 1100
Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu
1105 1110 1115 1120
Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln
1125 1130 1135
Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro
1140 1145 1150
Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu
1155 1160 1165
Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val
1170 1175 1180
Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln
1185 1190 1195 1200
Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala
1205 1210 1215
Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala
1220 1225 1230
Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255
<210> 24
<211> 798
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD20CAR ДНК химерного антигенного рецептора
<400> 24
atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60
gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120
atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 180
tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 360
accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420
ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480
tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540
gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600
gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660
agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 720
gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 780
acggtcaccg tctcctca 798
<210> 25
<211> 266
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD20CAR синтетический конструкт
<400> 25
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser
35 40 45
Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys
50 55 60
Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg
85 90 95
Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe
100 105 110
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
180 185 190
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
210 215 220
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
245 250 255
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Саморасщепляющийся линкер T2A
<400> 26
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly
1 5 10 15
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи, содержащая CDRL1
<400> 27
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи, содержащая CDRL2
<400> 28
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи, содержащая CDRL3
<400> 29
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи, содержащая CDRH1
<400> 30
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи, содержащая CDRH2
<400> 31
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи, содержащая CDRH3
<400> 32
Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи, содержащая CDRL1
<400> 33
Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp
1 5 10
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи, содержащая CDRL2
<400> 34
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи, содержащая CDRL3
<400> 35
Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи, содержащая последовательность CDRH1, синтетическую гуманизированную
или человеческую последовательность
<400> 36
Ser Tyr Asn Met His
1 5
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRH2, вариабельная область тяжелой цепи, содержащая синтетическую
гуманизированную или человеческую последовательность
<400> 37
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи, содержащая CDRH3, синтетическую
гуманизированную или человеческую последовательность
<400> 38
Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val
1 5 10
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислоты гибкого линкера
<400> 39
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 40
<211> 429
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Her2 домен IV и 7 аминокислотный линкер
<400> 40
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccatgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 120
gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 180
cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 240
ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 300
ggctgccccg ccgagcagag agccagcccg ttaacgggtg gaggcagcgg aggtggctcc 360
atcatctctg cggtggttgg cattctgctg gtcgtggtct tgggggtggt ctttgggatc 420
ctcatctga 429
<210> 41
<211> 142
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Her2 домен IV и 7 аминокислотный линкер
<400> 41
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly
20 25 30
Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala
35 40 45
His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val
50 55 60
Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu
65 70 75 80
Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp
85 90 95
Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile
115 120 125
Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile
130 135 140
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Петля 1 белка Her2, область белка, белок
человека
<400> 42
Glu Ala Asp Gln Cys
1 5
<210> 43
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Петля 2 белка Her2, область белка, белок
человека
<400> 43
Asp Pro Pro Phe
1
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Петля 3 белка Her2, область белка, белок
человека
<400> 44
Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro
1 5 10
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический линкер
<400> 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 46
<211> 1428
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD19 CAR
<400> 46
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120
gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240
cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360
ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420
ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc 480
cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540
gtgagctgga tccggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660
agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720
tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgagcag cgagagcaag tacggaccgc cctgcccccc ttgccctatg 840
ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg 900
gccttcatca tcttttgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 960
ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1020
gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc cgacgcccct 1080
gcctaccagc agggccagaa tcagctgtac aacgagctga acctgggcag aagggaagag 1140
tacgacgtcc tggataagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa gcctcggcgg 1200
aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1260
agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cggggcaagg gccacgacgg cctgtatcag 1320
ggcctgtcca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgccccca 1380
aggctcgagg gcggcggaga gggcagagga agtcttctaa catgcggt 1428
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG4-шарнир
<400> 47
gagagcaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 48
<211> 321
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> шарнирная область CH3
<400> 48
ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcctccct cccaggaaga gatgaccaag 60
aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 120
tgggagagca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggacagc 180
gacggcagct tcttcctgta cagccggctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 240
aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 300
ctgagcctgt ccctgggcaa g 321
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG4-шарнир
<400> 49
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> шарнирная область CH3
<400> 50
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
100 105
<---

Claims (29)

1. Полипептид для мечения клетки, содержащий: внеклеточный домен полипептида HER2, спейсер, соединенный с C-концом внеклеточного домена полипептида HER2, и трансмембранный домен, соединенный с C-концом спейсера;
причем указанный внеклеточный домен полипептида HER2 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотам с 563 по 652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23,
причем указанный спейсер выбран из группы, состоящей из шарнирного домена CD28, шарнирного домена IgG4, имеющего аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 09-13, и аминокислотной последовательности SEO ID NO: 45,
причем указанный полипептид специфично связывается с антителом, которое связывается с эпитопом в домене IV HER2, и
при этом указанный полипептид не содержит домен I HER2, соответствующий аминокислотам 23-217 последовательности SEQ ID NO: 23, домен II HER2, соответствующий аминокислотам 218-341 последовательности SEQ ID NO: 23, домен III HER2, соответствующий аминокислотам 342-510 последовательности SEQ ID NO: 23, и внутриклеточный домен HER2.
2. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанный спейсер содержит шарнирный домен IgG4, имеющий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 09-13.
3. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанный шарнирный домен IgG4 имеет аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 10-13.
4. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанный шарнирный домен IgG4 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 09.
5. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанный спейсер имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 45.
6. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанный спейсер содержит шарнирный домен CD28.
7. Полипептид по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанный полипептид содержит такие аминокислоты как глутаминовая кислота в положении 580, аспарагиновая кислота в положении 582, аспарагиновая кислота в положении 592, фенилаланин в положении 595 и глутамин в положении 624 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23.
8. Полипептид по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанный внеклеточный домен полипептида HER2 имеет аминокислотную последовательность из аминокислот 563-652 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23.
9. Полипептид по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанный трансмембранный домен имеет аминокислотную последовательность из аминокислот 653-675 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 23.
10. Полипептид по любому из пп. 1-9, дополнительно содержащий лидерный пептид, который обеспечивает экспрессию на поверхности клеток.
11. Полипептид по п. 10, отличающийся тем, что указанный лидерный пептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17.
12. Полипептид по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанное антитело представляет собой Трастузумаб или Цетуксимаб.
13. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп. 1-12.
14. Клетка-хозяин для отбора с помощью метки, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 13, причем указанная клетка-хозяин не является эмбриональной клеткой человека.
15. Клетка-хозяин по п. 14, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из CD8 Т-клетки, CD4 T-клетки, CD4 наивной Т-клетки, CD8 наивной Т-клетки, CD8 клетки центральной памяти и CD4 клетки центральной памяти.
16. Клетка-хозяин по п. 14 или 15, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин является аутологичной.
17. Клетка-хозяин по любому из пп. 14-16, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин является антигенспецифичной.
18. Клетка-хозяин по п. 14, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов.
19. Клетка-хозяин по п. 14, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
20. Способ получения обогащенной популяции меченых клеток, включающий:
введение нуклеиновой кислоты по п. 13 в клетку, причем указанная клетка не является эмбриональной клеткой человека;
культивирование указанной клетки в среде, содержащей по меньшей мере один фактор роста, для получения популяции меченых клеток; и
обогащение мечеными клетками, экспрессирующими указанный полипептид, путем приведения популяции меченых клеток в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, специфически связывающимся с указанным полипептидом.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанный фактор роста выбран из группы, состоящей из ИЛ-15, ИЛ-7, ИЛ-21, ИЛ-2 и их комбинации.
22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанное антитело представляет собой Трастузумаб или Цетуксимаб.
RU2016143384A 2014-04-10 2015-04-08 Трансгенные генетические метки и способы применения RU2729112C2 (ru)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461977751P 2014-04-10 2014-04-10
US61/977,751 2014-04-10
US201461986479P 2014-04-30 2014-04-30
US61/986,479 2014-04-30
US201462058973P 2014-10-02 2014-10-02
US62/058,973 2014-10-02
US201462088363P 2014-12-05 2014-12-05
US62/088,363 2014-12-05
US201462089730P 2014-12-09 2014-12-09
US62/089,730 2014-12-09
US201462090845P 2014-12-11 2014-12-11
US62/090,845 2014-12-11
PCT/US2015/024895 WO2015157399A1 (en) 2014-04-10 2015-04-08 Transgene genetic tags and methods of use

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020124619A Division RU2822461C1 (ru) 2014-04-10 2015-04-08 Трансгенные генетические метки и способы применения

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2016143384A RU2016143384A (ru) 2018-05-11
RU2016143384A3 RU2016143384A3 (ru) 2018-11-30
RU2729112C2 true RU2729112C2 (ru) 2020-08-04

Family

ID=54288361

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016143388A RU2751920C2 (ru) 2014-04-10 2015-04-08 Экспрессия трансгенов, регулируемая лекарственным средством
RU2016143381A RU2752275C2 (ru) 2014-04-10 2015-04-08 Способ и композиции для клеточной иммунотерапии
RU2016143385A RU2751921C2 (ru) 2014-04-10 2015-04-08 Продукты определенного состава, содержащие генетически модифицированные т-клетки
RU2016143384A RU2729112C2 (ru) 2014-04-10 2015-04-08 Трансгенные генетические метки и способы применения
RU2016143389A RU2016143389A (ru) 2014-04-10 2015-04-08 Получение генно-инженерных т-клеток посредством транспозона "спящая красавица" в сочетании с отбором метотрексатом

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016143388A RU2751920C2 (ru) 2014-04-10 2015-04-08 Экспрессия трансгенов, регулируемая лекарственным средством
RU2016143381A RU2752275C2 (ru) 2014-04-10 2015-04-08 Способ и композиции для клеточной иммунотерапии
RU2016143385A RU2751921C2 (ru) 2014-04-10 2015-04-08 Продукты определенного состава, содержащие генетически модифицированные т-клетки

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016143389A RU2016143389A (ru) 2014-04-10 2015-04-08 Получение генно-инженерных т-клеток посредством транспозона "спящая красавица" в сочетании с отбором метотрексатом

Country Status (19)

Country Link
US (12) US20170015746A1 (ru)
EP (8) EP3129405B1 (ru)
JP (12) JP6765968B2 (ru)
KR (8) KR102509481B1 (ru)
CN (7) CN106661570B (ru)
AU (8) AU2015243922B2 (ru)
BR (3) BR112016023517A2 (ru)
CA (5) CA2945303C (ru)
ES (2) ES2880932T3 (ru)
IL (5) IL297591A (ru)
MX (6) MX2016013159A (ru)
MY (4) MY185678A (ru)
NZ (3) NZ725081A (ru)
PH (4) PH12016502011A1 (ru)
RU (5) RU2751920C2 (ru)
SA (1) SA516380056B1 (ru)
SG (8) SG10201808825XA (ru)
WO (5) WO2015157399A1 (ru)
ZA (2) ZA201607060B (ru)

Families Citing this family (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100548667C (zh) * 2003-01-20 2009-10-14 日本瑞翁株式会社 层合件及其制造方法
EP3858379A1 (en) * 2013-11-21 2021-08-04 Autolus Limited Cell
SG10201808825XA (en) 2014-04-10 2018-11-29 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Defined composition gene modified t-cell products
CN106459917B (zh) 2014-04-23 2021-03-09 朱诺治疗学股份有限公司 分离、培养和遗传工程改造用于过继治疗的免疫细胞群的方法
US10494422B2 (en) 2014-04-29 2019-12-03 Seattle Children's Hospital CCR5 disruption of cells expressing anti-HIV chimeric antigen receptor (CAR) derived from broadly neutralizing antibodies
CN117427091A (zh) 2014-10-20 2024-01-23 朱诺治疗学股份有限公司 用于过继细胞治疗中的给药的组合物和方法
KR101697473B1 (ko) 2014-11-26 2017-01-18 주식회사 녹십자랩셀 T 세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법
US11266739B2 (en) 2014-12-03 2022-03-08 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions for adoptive cell therapy
JP6892822B2 (ja) 2014-12-05 2021-06-23 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター Ｂ細胞成熟化抗原を標的化する抗体および使用の方法
CA3008162A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
MA41346A (fr) 2015-01-12 2017-11-21 Juno Therapeutics Inc Eléments régulateurs post-transcriptionnels d'hépatite modifiée
WO2016115559A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1
AU2016222850B2 (en) * 2015-02-24 2021-04-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Selection methods for genetically-modified T cells
KR102632082B1 (ko) 2015-02-27 2024-02-02 아이셀 진 테라퓨틱스 엘엘씨 혈액 악성종양을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(car), 조성물 및 이의 용도
US11173179B2 (en) 2015-06-25 2021-11-16 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptor (CAR) targeting multiple antigens, compositions and methods of use thereof
KR20180021137A (ko) 2015-06-25 2018-02-28 아이셀 진 테라퓨틱스 엘엘씨 키메라 항원 수용체 (car), 조성물 및 이의 사용 방법
US11458167B2 (en) * 2015-08-07 2022-10-04 Seattle Children's Hospital Bispecific CAR T-cells for solid tumor targeting
CA2999608A1 (en) * 2015-09-22 2017-03-30 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg A method for high level and stable gene transfer in lymphocytes
ES2809550T3 (es) 2015-10-06 2021-03-04 Hope City Receptores de antígenos quiméricos dirigidos contra PSCA
AU2016341446A1 (en) * 2015-10-23 2018-05-24 Sanford Health Prognosis and treatment of squamous cell carcinomas
EP3368574A1 (en) 2015-10-30 2018-09-05 NBE-Therapeutics AG Anti-ror1 antibodies
US11020429B2 (en) 2015-11-05 2021-06-01 Juno Therapeutics, Inc. Vectors and genetically engineered immune cells expressing metabolic pathway modulators and uses in adoptive cell therapy
US11345926B2 (en) * 2015-12-14 2022-05-31 GenomeFrontier Therapeutics, Inc. Transposon system, kit comprising the same, and uses thereof
US20180371052A1 (en) * 2015-12-22 2018-12-27 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptors and enhancement of anti-tumor activity
SG11201806120WA (en) 2016-01-20 2018-08-30 Scripps Research Inst Ror1 antibody compositions and related methods
EP3202783A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-09 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Engineered antigen presenting cells and uses thereof
US20190355459A1 (en) 2016-03-16 2019-11-21 Juno Therapeutics, Inc. Methods for adaptive design of a treatment regimen and related treatments
WO2017190100A1 (en) * 2016-04-28 2017-11-02 The Trustees Of Dartmouth College Nucleic acid constructs for co-expression of chimeric antigen receptor and transcription factor, cells containing and therapeutic use thereof
EP3463396A1 (en) * 2016-06-07 2019-04-10 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Chimeric antigen receptor and car-t cells that bind bcma
JP2019517267A (ja) * 2016-06-08 2019-06-24 イントレキソン コーポレーション Ｃｄ３３特異的キメラ抗原受容体
EP4353750A3 (en) 2016-06-24 2024-07-24 iCell Gene Therapeutics LLC Chimeric antigen receptors (cars), compositions and methods thereof
US20190119636A1 (en) * 2017-10-23 2019-04-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
AU2017343780B2 (en) 2016-10-13 2023-08-31 Juno Therapeutics, Inc. Immunotherapy methods and compositions involving tryptophan metabolic pathway modulators
US11739129B2 (en) * 2016-10-21 2023-08-29 Washington University AP4 and methods of promoting T cell activation
AU2017368248A1 (en) * 2016-11-30 2019-06-06 Intrexon Corporation Steroid administration and immunotherapy
MA46995A (fr) 2016-12-03 2019-10-09 Acerta Pharma Bv Méthodes et compositions pour l'utilisation de lymphocytes t thérapeutiques en association avec des inhibiteurs de kinase
US11408005B2 (en) 2016-12-12 2022-08-09 Seattle Children's Hospital Chimeric transcription factor variants with augmented sensitivity to drug ligand induction of transgene expression in mammalian cells
CN106800601B (zh) * 2017-01-19 2021-04-06 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN110418802A (zh) * 2017-01-20 2019-11-05 朱诺治疗学有限公司 细胞表面缀合物及相关的细胞组合物和方法
US20200191774A1 (en) 2017-02-27 2020-06-18 Juno Therapeutics, Inc. Compositions, articles of manufacture and methods related to dosing in cell therapy
WO2018160622A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Endocyte, Inc. Compositions and methods for car t cell therapy
BR112019019005A2 (pt) 2017-03-14 2020-04-14 Sara Elizabeth Church métodos para armazenagem criogênica
CN106963945A (zh) * 2017-03-27 2017-07-21 山东兴瑞生物科技有限公司 一种加强型人乳头瘤病毒hpv‑16/18的二价dc疫苗
WO2018191490A1 (en) * 2017-04-13 2018-10-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of gene editing to generate universal tcr re-directed t cells for adoptive immunotherapy
JOP20180040A1 (ar) 2017-04-20 2019-01-30 Gilead Sciences Inc مثبطات pd-1/pd-l1
CN108728477B (zh) * 2017-04-24 2022-02-22 华东理工大学 一种高效的转座突变系统及构建方法
CA3063695A1 (en) * 2017-05-17 2018-11-22 Seattle Children's Hospital (Dba Seattle Children's Research Institute Generating mammalian t cell activation inducible synthetic promoters (syn+pro) to improve t cell therapy
US10780119B2 (en) 2017-05-24 2020-09-22 Effector Therapeutics Inc. Methods and compositions for cellular immunotherapy
WO2018217064A2 (ko) * 2017-05-26 2018-11-29 주식회사 녹십자랩셀 형질전환된 t세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법
EP3630132A1 (en) 2017-06-02 2020-04-08 Juno Therapeutics, Inc. Articles of manufacture and methods for treatment using adoptive cell therapy
CN107335054B (zh) * 2017-06-30 2021-01-15 山东兴瑞生物科技有限公司 一种慢性乙肝治疗性dc疫苗
CN111133002B (zh) 2017-08-07 2024-05-24 恩比伊治疗股份公司 具有高体内耐受性的基于蒽环类药的抗体药物缀合物
CA3072569A1 (en) * 2017-08-11 2019-02-14 Tribiotica Llc Methods for generating epitopes for binding to recognition molecules by templated assembly
CN111094349A (zh) * 2017-08-23 2020-05-01 马克思-德布鲁克-分子医学中心亥姆霍兹联合会 嵌合抗原受体和结合cxcr5的car-t细胞
WO2019067504A1 (en) * 2017-09-26 2019-04-04 Longwood University SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR AT PD-1 AS IMMUNOTHERAPY
WO2019079486A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Intrexon Corporation POLYPEPTIDE COMPOSITIONS COMPRISING SPACERS
CN107759700A (zh) * 2017-10-18 2018-03-06 银丰生物工程集团有限公司 靶向cd19抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用
US10329543B2 (en) 2017-10-23 2019-06-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same
US12031975B2 (en) 2017-11-01 2024-07-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy
KR20200099132A (ko) * 2017-11-01 2020-08-21 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 조작된 세포의 치료적 조성물을 생성하기 위한 프로세스
US11851679B2 (en) 2017-11-01 2023-12-26 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
WO2019089969A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
EP3707160A1 (en) 2017-11-10 2020-09-16 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Chimeric antigen receptors targeting tumor antigens
JP2021502829A (ja) 2017-11-14 2021-02-04 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター Ｉｌ−３６を分泌する免疫応答性細胞およびその使用
WO2019123340A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 3'3' cyclic dinucleotides with phosphonate bond activating the sting adaptor protein
CN111511754B (zh) 2017-12-20 2023-09-12 捷克共和国有机化学与生物化学研究所 活化sting转接蛋白的具有膦酸酯键的2’3’环状二核苷酸
CN110028588A (zh) * 2018-01-11 2019-07-19 上海细胞治疗研究院 抗原-Fc融合蛋白及其检测阳性CAR-T细胞的应用
US10561686B2 (en) 2018-01-12 2020-02-18 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
CA3089319A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods of use for car t cells
CN108103027B (zh) * 2018-02-02 2021-12-24 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法
PE20210640A1 (es) 2018-02-13 2021-03-23 Gilead Sciences Inc Inhibidores pd-1/pd-l1
CN108383914A (zh) * 2018-02-23 2018-08-10 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19的嵌合抗原受体及其应用
WO2019178613A1 (en) * 2018-03-16 2019-09-19 Immusoft Corporation B cells genetically engineered to secrete follistatin and methods of using the same to treat follistatin-related diseases, conditions, disorders and to enhance muscle growth and strength
TWI833744B (zh) 2018-04-06 2024-03-01 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 3'3'-環二核苷酸
TWI818007B (zh) 2018-04-06 2023-10-11 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 2'3'-環二核苷酸
TW202005654A (zh) 2018-04-06 2020-02-01 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 ２，２，─環二核苷酸
US10869888B2 (en) 2018-04-17 2020-12-22 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
TWI712412B (zh) 2018-04-19 2020-12-11 美商基利科學股份有限公司 Pd‐1/pd‐l1抑制劑
US20190359645A1 (en) 2018-05-03 2019-11-28 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 2'3'-cyclic dinucleotides comprising carbocyclic nucleotide
EP3793565B1 (en) 2018-05-14 2022-01-05 Gilead Sciences, Inc. Mcl-1 inhibitors
WO2019219029A1 (zh) * 2018-05-15 2019-11-21 科济生物医药（上海）有限公司 基因工程化的细胞及应用
WO2020003210A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Kangwon National University University-Industry Cooperation Foundation Anti-l1cam antibodies and uses thereof
ES2962674T3 (es) 2018-07-13 2024-03-20 Gilead Sciences Inc Inhibidores PD-1/PD-L1
CN110845621A (zh) * 2018-08-21 2020-02-28 上海恒润达生生物科技有限公司 一种靶向egfr和cd19双靶点的嵌合抗原受体方法
US20220348682A1 (en) 2018-08-30 2022-11-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
EP3844191A4 (en) * 2018-08-31 2022-06-15 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) METHODS AND COMPOSITIONS COMPRISING B7H3 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS
US11179397B2 (en) 2018-10-03 2021-11-23 Gilead Sciences, Inc. Imidazopyrimidine derivatives
CN112955435B (zh) 2018-10-24 2024-09-06 吉利德科学公司 Pd-1/pd-l1抑制剂
AU2019372046B2 (en) 2018-10-31 2022-05-26 Gilead Sciences, Inc. Substituted 6-azabenzimidazole compounds as HPK1 inhibitors
EP3873608A1 (en) 2018-10-31 2021-09-08 Gilead Sciences, Inc. Substituted 6-azabenzimidazole compounds having hpk1 inhibitory activity
TW202031894A (zh) 2018-11-01 2020-09-01 中國大陸商亘喜生物科技（上海）有限公司 用於t細胞工程之組合物及方法
WO2020102770A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 Juno Therapeutics, Inc. Methods of dosing engineered t cells for the treatment of b cell malignancies
US10918667B2 (en) 2018-11-20 2021-02-16 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expressing therapeutic agent and uses thereof
SG11202105502RA (en) * 2018-11-30 2021-06-29 Juno Therapeutics Inc Methods for treatment using adoptive cell therapy
CA3120364A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Celularity Inc. Placenta-derived allogeneic car-t cells and uses thereof
PT3886894T (pt) * 2018-11-30 2024-05-02 Juno Therapeutics Inc Métodos para dosagem e tratamento de malignidades de células b em terapia celular adotiva
AU2020231201A1 (en) 2019-03-07 2021-08-26 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 2'3'-cyclic dinucleotides and prodrugs thereof
EP3935065A1 (en) 2019-03-07 2022-01-12 Institute of Organic Chemistry and Biochemistry ASCR, V.V.I. 3'3'-cyclic dinucleotide analogue comprising a cyclopentanyl modified nucleotide as sting modulator
JP7350872B2 (ja) 2019-03-07 2023-09-26 インスティチュート オブ オーガニック ケミストリー アンド バイオケミストリー エーエスシーアール，ヴイ．ヴイ．アイ． ３’３’－環状ジヌクレオチドおよびそのプロドラッグ
WO2020191172A1 (en) * 2019-03-19 2020-09-24 Immatics US, Inc. Cd28 t cell cultures, compositions, and methods of using thereof
US20200308248A1 (en) * 2019-03-26 2020-10-01 ST Phi Therapeutics Chimeric Natural Killer Cell Receptors and Method of Using Thereof
WO2020210023A1 (en) * 2019-04-08 2020-10-15 Russell Biotech, Inc. Improved manufacturing procedures for cell based therapies
CN109979545A (zh) * 2019-04-16 2019-07-05 北京中佰耀因医药科技有限公司 一种含样本状态信息管理模块的精准用药智能报告系统
CN109872792A (zh) * 2019-04-16 2019-06-11 北京中佰耀因医药科技有限公司 一种用于指导精准用药的基因检测智能报告系统
CN109994156A (zh) * 2019-04-16 2019-07-09 北京中佰耀因医药科技有限公司 一种含报告模板信息管理模块的精准用药智能报告系统
CN109994180A (zh) * 2019-04-16 2019-07-09 北京中佰耀因医药科技有限公司 一种含基因位点信息管理模块的精准用药智能报告系统
CN110010222A (zh) * 2019-04-16 2019-07-12 长沙三济生物科技有限公司 一种基于精准用药知识库的基因身份识别系统
CN110010200A (zh) * 2019-04-16 2019-07-12 长沙三济生物科技有限公司 一种基因身份识别系统
CN109994176A (zh) * 2019-04-16 2019-07-09 北京中佰耀因医药科技有限公司 一种含样本类型信息管理模块的精准用药智能报告系统
TW202212339A (zh) 2019-04-17 2022-04-01 美商基利科學股份有限公司 類鐸受體調節劑之固體形式
TWI751516B (zh) 2019-04-17 2022-01-01 美商基利科學股份有限公司 類鐸受體調節劑之固體形式
US11453681B2 (en) 2019-05-23 2022-09-27 Gilead Sciences, Inc. Substituted eneoxindoles and uses thereof
CN114222763A (zh) * 2019-06-19 2022-03-22 尤利乌斯·马克西米利安维尔茨堡大学 在嵌合抗原受体设计中实现的超模块化IgG3间隔区结构域和多功能位点
CA3142513A1 (en) 2019-06-25 2020-12-30 Gilead Sciences, Inc. Flt3l-fc fusion proteins and methods of use
CN110608991B (zh) * 2019-09-09 2022-04-29 浙江普罗亭健康科技有限公司 基于质谱流式检测技术的细胞周期检测试剂盒及检测方法
CN114555123B (zh) 2019-10-18 2024-04-02 四十七公司 用于治疗骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的联合疗法
AU2020374947A1 (en) 2019-10-31 2022-03-31 Forty Seven, Inc. Anti-CD47 and anti-CD20 based treatment of blood cancer
TWI778443B (zh) 2019-11-12 2022-09-21 美商基利科學股份有限公司 Mcl1抑制劑
US11845723B2 (en) 2019-12-24 2023-12-19 Gilead Sciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
TWI832035B (zh) 2020-02-14 2024-02-11 美商基利科學股份有限公司 結合ccr8之抗體及融合蛋白及其用途
US12076343B2 (en) 2020-02-19 2024-09-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Engineered safety in cell therapy
CN111533808B (zh) * 2020-03-10 2021-02-09 南京医科大学 一种可自分泌TLR4 scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用
KR20220156041A (ko) 2020-03-20 2022-11-24 라이엘 이뮤노파마, 인크. 신규 재조합 세포 표면 마커
MX2022013619A (es) 2020-05-01 2022-11-16 Gilead Sciences Inc Compuestos de 2,4-dioxopirimidina que inhiben cd73.
US12043654B2 (en) 2020-06-02 2024-07-23 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Anti-GCC antibody and CAR thereof for treating digestive system cancer
CN115701999A (zh) * 2020-07-09 2023-02-14 南京传奇生物科技有限公司 用白介素-36工程化γδT细胞用于免疫疗法
CA3188656A1 (en) 2020-07-17 2022-01-20 Simurx, Inc. Chimeric myd88 receptors for redirecting immunosuppressive signaling and related compositions and methods
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
WO2022155526A2 (en) * 2021-01-15 2022-07-21 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Hybrid and truncated immune cell proteins
TW202302145A (zh) 2021-04-14 2023-01-16 美商基利科學股份有限公司 ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合及ＮＥＤＤ８活化酶Ｅ１調節次單元之共抑制以用於治療癌症
TW202313094A (zh) 2021-05-18 2023-04-01 美商基利科學股份有限公司 使用ＦＬＴ３Ｌ—Ｆｃ融合蛋白之方法
WO2022271659A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
KR20240005901A (ko) 2021-06-23 2024-01-12 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 디아실글리세롤 키나제 조절 화합물
US11976072B2 (en) 2021-06-23 2024-05-07 Gilead Sciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
WO2022271677A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
JP2024532305A (ja) * 2021-08-24 2024-09-05 賽斯尓▲チン▼生物技術（上海）有限公司 細胞を修飾する方法
MX2024003887A (es) 2021-10-14 2024-07-09 Arsenal Biosciences Inc Células inmunitarias que tienen arnch coespresados y sistemas de compuerta lógica.
CN118139858A (zh) 2021-10-28 2024-06-04 吉利德科学公司 吡地嗪-3(2h)-酮衍生物
KR20240097895A (ko) 2021-10-29 2024-06-27 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Cd73 화합물
CA3239528A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
CA3237577A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
WO2023173137A1 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 Yale University Compositions and methods for efficient and stable genetic modification of eukaryotic cells
AU2023233730A1 (en) 2022-03-17 2024-09-26 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
US20230355796A1 (en) 2022-03-24 2023-11-09 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
WO2023187031A1 (en) * 2022-04-01 2023-10-05 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG A system for drug-inducible expression of a polynucleotide
TW202345901A (zh) 2022-04-05 2023-12-01 美商基利科學股份有限公司 用於治療結腸直腸癌之組合療法
WO2023205719A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
WO2023212691A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Immatics US, Inc. DOMINANT NEGATIVE TGFβ RECEPTOR POLYPEPTIDES, CD8 POLYPEPTIDES, CELLS, COMPOSITIONS, AND METHODS OF USING THEREOF
US20230348548A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
US20240066127A1 (en) 2022-04-28 2024-02-29 Immatics US, Inc. Il-12 polypeptides, il-15 polypeptides, il-18 polypeptides, cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
CN114990069B (zh) * 2022-05-17 2023-09-22 郑州大学第一附属医院 一种过表达slc43a2的嵌合抗原受体t细胞的制备方法和应用
WO2023227900A1 (en) * 2022-05-27 2023-11-30 Autolus Limited Method
AR129552A1 (es) * 2022-06-10 2024-09-04 Joint Stock Company “Biocad” Ácido nucleico con actividad promotora y uso del mismo
WO2024006702A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Foundation Medicine, Inc. Methods and systems for predicting genotypic calls from whole-slide images
US20240116928A1 (en) 2022-07-01 2024-04-11 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
US20240091351A1 (en) 2022-09-21 2024-03-21 Gilead Sciences, Inc. FOCAL IONIZING RADIATION AND CD47/SIRPa DISRUPTION ANTICANCER COMBINATION THERAPY
CN116179495A (zh) * 2022-11-28 2023-05-30 上海恩凯细胞技术有限公司 转基因免疫细胞及其应用
WO2024129984A1 (en) * 2022-12-15 2024-06-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Homology-independent targeted dna insertion in human t cells
WO2024137652A2 (en) * 2022-12-20 2024-06-27 Abata Therapeutics, Inc. Cell therapies for type 1 diabetes
WO2024137852A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
CN118359729A (zh) * 2023-01-19 2024-07-19 武汉昭智生物技术有限公司 一种car分子、包含其的细胞或外泌体及它们的应用
CN116844685B (zh) * 2023-07-03 2024-04-12 广州默锐医药科技有限公司 一种免疫治疗效果评估方法、装置、电子设备及存储介质

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011056894A2 (en) * 2009-11-03 2011-05-12 Jensen Michael C TRUNCATED EPIDERIMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFRt) FOR TRANSDUCED T CELL SELECTION

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69128037T2 (de) 1990-11-13 1998-05-07 Immunex Corp., Seattle, Wash. Bifunktionelle wählbare fusionsgene
US20020111474A1 (en) 1990-12-14 2002-08-15 Capon Daniel J. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
JPH07507278A (ja) 1992-06-01 1995-08-10 ニューイングランド　メディカル　センター　ホスピタルズ　インク Ｃｄ４３キメラ分子による細胞間相互作用の阻害
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US6133027A (en) * 1996-08-07 2000-10-17 City Of Hope Inducible expression system
US6660257B1 (en) * 1996-10-25 2003-12-09 Pharmacia Corporation Circular permuteins of flt3 ligand
AU2472400A (en) * 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
US6912492B1 (en) * 1999-05-25 2005-06-28 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Methods for diagnosing, preventing, and treating developmental disorders due to a combination of genetic and environmental factors
JP4045713B2 (ja) 2000-01-31 2008-02-13 松下電器産業株式会社 自動機用溶接機
GB0015119D0 (en) * 2000-06-20 2000-08-09 Angeletti P Ist Richerche Bio Methods and means for regulation of gene expression
CA2413156C (en) * 2000-07-03 2009-08-18 Gala Design, Inc. Expression vectors
GB0025307D0 (en) 2000-10-16 2000-11-29 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
EP1334188B1 (en) 2000-11-07 2006-08-30 City of Hope Cd19-specific redirected immune cells
MXPA03008031A (es) 2001-03-07 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida.
US7070995B2 (en) * 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
WO2002097099A1 (en) 2001-05-29 2002-12-05 Valentis, Inc. Regulated expression of ghrh
WO2003025228A1 (en) * 2001-09-18 2003-03-27 Proteologics, Inc. Methods and compositions for treating hcap associated diseases
US20030148982A1 (en) * 2001-11-13 2003-08-07 Brenner Malcolm K. Bi-spcific chimeric T cells
US20030228606A1 (en) 2002-04-11 2003-12-11 Amgen Inc., A Corporation Of The State Of Delaware Her-2 receptor tyrosine kinase molecules and uses thereof
WO2004029284A2 (en) 2002-09-30 2004-04-08 Protein Design Labs, Inc. Efficient generation of stable expression cell lines through the use of scorable homeostatic reporter genes
AU2004213053C1 (en) * 2003-02-20 2009-07-16 Seagen Inc. Anti-CD70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
WO2004092338A2 (en) 2003-04-11 2004-10-28 Diadexus, Inc. Compositions, splice variants and methods relating to cancer specific genes and proteins
CN1809277A (zh) * 2003-04-18 2006-07-26 诺伍德免疫学有限公司 先于胸腺再活化的移植物耐受
WO2005017102A2 (en) 2003-05-30 2005-02-24 Diadexus, Inc. Compositions, splice variants and methods relating to ovarian specific nucleic acids and proteins
EP1649020B1 (en) * 2003-07-21 2017-01-11 MSD Italia S.r.l. Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof
US20070087346A1 (en) * 2003-10-24 2007-04-19 Gennaro Ciliberto Orthogonal gene switches
WO2005062881A2 (en) 2003-12-24 2005-07-14 Transgenrx, Inc. Gene therapy using transposon-based vectors
US20090098142A1 (en) 2004-06-09 2009-04-16 Kasaian Marion T Methods and compositions for treating and monitoring treatment of IL-13-associated disorders
US7910101B2 (en) * 2004-10-25 2011-03-22 Centocor, Inc. Melanocortin receptor binding mimetibodies, compositions, methods and uses
DE202005002921U1 (de) 2005-02-23 2005-04-21 Magcode Ag Verbindungssystem, insbesondere elektrisches Verbindungssystem
CN101212977A (zh) * 2005-06-01 2008-07-02 国际创新生物技术研究所有限公司 葡萄糖可诱导的胰岛素表达和治疗糖尿病的方法
CN101511994A (zh) 2006-05-22 2009-08-19 海普罗塞尔有限公司 使用真核细胞系生成蛋白质
WO2008012237A1 (en) * 2006-07-24 2008-01-31 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa Multi-antigen construct and uses thereof
US7709253B2 (en) * 2006-08-04 2010-05-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Ligand-regulable transactivation systems, methods of use thereof, methods of detecting estrogen receptor ligands, and methods of differentiating estrogen receptor ligand agonists and antagonists
WO2009013359A2 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Fraunhofer Gesellschaft Zur Förderung Der Angewandten Forschung E. V. Self coupling recombinant antibody fusion proteins
DK2279253T3 (en) * 2008-04-09 2017-02-13 Maxcyte Inc Construction and application of therapeutic compositions of freshly isolated cells
JP2012501180A (ja) 2008-08-26 2012-01-19 シティ・オブ・ホープ Ｔ細胞の抗腫瘍エフェクター機能増進のための方法および組成物
JP5771147B2 (ja) 2008-09-26 2015-08-26 トカジェン インコーポレーテッド 遺伝子治療ベクターおよびシトシンデアミナーゼ
US8829173B2 (en) * 2008-09-26 2014-09-09 Tocagen Inc. Recombinant vectors
US8329882B2 (en) * 2009-02-18 2012-12-11 California Institute Of Technology Genetic control of mammalian cells with synthetic RNA regulatory systems
WO2010141543A1 (en) 2009-06-02 2010-12-09 Targeted Molecular Diagnostics, Llc Methods for the detection and quantitation of the p95 component of her2/neu (erbb2)
US9873035B2 (en) * 2009-07-09 2018-01-23 Cfph, Llc Amusement device for a game of chance involving one or more rolling indicators on a rotating element with position indicators
US8465743B2 (en) 2009-10-01 2013-06-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
JP5285678B2 (ja) 2010-06-18 2013-09-11 株式会社エヌ・ティ・ティ・ドコモ 移動通信方法及びコアネットワーク装置
PT3012268T (pt) * 2010-09-08 2018-01-31 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus Recetores de antigénio quimérico com uma região de charneira otimizada
KR102243575B1 (ko) 2010-12-09 2021-04-22 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 키메릭 항원 수용체 변형 t 세포의 용도
BR112013018311A2 (pt) 2011-01-18 2017-03-21 Univ Pennsylvania sequência de ácido nucleico isolada, receptor de antígeno quimérico isolado, célula t geneticamente modificada, vetor, e, uso de uma célula t geneticamente modificada.
MX359513B (es) * 2011-03-23 2018-10-01 Hutchinson Fred Cancer Res Metodo y composiciones para inmunoterapia celular.
WO2012140130A1 (en) 2011-04-13 2012-10-18 Immunicum Ab Method for proliferation of antigen-specific t cells
US20130071414A1 (en) * 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
WO2012167192A2 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Precision Biosciences, Inc. Methods and products for producing engineered mammalian cell lines with amplified transgenes
US20130011394A1 (en) 2011-06-22 2013-01-10 Hoffmann-La Roche Inc. Complexes comprising mhc class i fusion polypeptides and antigen-specific antibodies and methods of use
CN109485730A (zh) 2011-10-20 2019-03-19 美国卫生和人力服务部 抗cd22嵌合抗原受体
DE102011118018B4 (de) 2011-10-25 2017-10-26 Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg Minicircles mit Transpositionskassetten und ihre Verwendung zur Transformation von Zellen
WO2013074916A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla
ES2774160T3 (es) 2012-02-13 2020-07-17 Seattle Childrens Hospital D/B/A Seattle Childrens Res Institute Receptores de antígenos quiméricos biespecíficos y usos terapéuticos de los mismos
ITRM20120058A1 (it) * 2012-02-20 2013-08-21 Pisanelli Giovanni Codacci Famiglia di molecole a base di zuccheri ad uso terapeutico e relativo procedimento di produzione
CA2864688C (en) * 2012-02-22 2023-09-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of icos-based cars to enhance antitumor activity and car persistence
US9765342B2 (en) 2012-04-11 2017-09-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting B-cell maturation antigen
US20130280220A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
WO2013177533A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 California Institute Of Technology Expression of secreted and cell-surface polypeptides
KR20150027756A (ko) 2012-05-30 2015-03-12 베일러 칼리지 오브 메디신 Dna 수복, 변경 및 대체를 위한 도구로서의 초나선 미니벡터
EP2669378A1 (en) 2012-05-31 2013-12-04 Helmut Hanenberg Cytochrome P450 suicide gene system
US9792559B2 (en) 2012-06-01 2017-10-17 Nec Corporation Switching system, line card, switch card, FDB learning method, FDB learning arbitration method and program
RS61345B1 (sr) 2012-08-20 2021-02-26 Hutchinson Fred Cancer Res Postupak i kompozicije za ćelijsku imunoterapiju
US10316289B2 (en) * 2012-09-06 2019-06-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing T memory stem cell populations
US10117896B2 (en) 2012-10-05 2018-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
JP5372297B1 (ja) 2012-12-20 2013-12-18 三菱電機株式会社 車載装置及びプログラム
US20150329640A1 (en) 2012-12-20 2015-11-19 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
EP2964753B1 (en) 2013-03-07 2018-04-25 Baylor College of Medicine Targeting cd138 in cancer
EP2777711A1 (en) 2013-03-11 2014-09-17 Icon Genetics GmbH Her2/Neu cancer vaccine
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
WO2014186469A2 (en) * 2013-05-14 2014-11-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus
EP3063175A4 (en) 2013-10-31 2017-06-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof
EP3858379A1 (en) 2013-11-21 2021-08-04 Autolus Limited Cell
CN107074957B (zh) 2014-01-13 2021-05-07 希望之城公司 在Fc间隔物区中具有突变的嵌合抗原受体(CAR)及其使用方法
JP2017513818A (ja) 2014-03-15 2017-06-01 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
SG10201808825XA (en) 2014-04-10 2018-11-29 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Defined composition gene modified t-cell products
US11458167B2 (en) 2015-08-07 2022-10-04 Seattle Children's Hospital Bispecific CAR T-cells for solid tumor targeting
IL287889B2 (en) 2016-02-05 2024-03-01 Hope City Administration of transgenic T cells for the treatment of central nervous system cancer
US11408005B2 (en) 2016-12-12 2022-08-09 Seattle Children's Hospital Chimeric transcription factor variants with augmented sensitivity to drug ligand induction of transgene expression in mammalian cells
US10714296B2 (en) 2018-12-12 2020-07-14 Axcelis Technologies, Inc. Ion source with tailored extraction shape

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011056894A2 (en) * 2009-11-03 2011-05-12 Jensen Michael C TRUNCATED EPIDERIMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFRt) FOR TRANSDUCED T CELL SELECTION

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AERTGEERTS K. et al., Structural analysis of the mechanism of inhibition and allosteric activation of the kinase domain of HER2 protein, Journal of Biological Chemistry, 2011, V. 286, N. 21, p.18756-18765. *
CHO H. S. et al., Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab, Nature, 2003, V. 421, N. 6924, p.756-760. *
FRANKEL A.E. et al., Characterization of diphtheria fusion proteins targeted to the human interleukin-3 receptor, Protein engineering, 2000, V. 13, N. 8, p.575-581. *
GARRETT J. T. et al., Novel engineered trastuzumab conformational epitopes demonstrate in vitro and in vivo antitumor properties against HER-2/neu, The Journal of Immunology, 2007, V. 178, N. 11, p.7120-7131. *
HUDECEK M. et al. Receptor Affinity and Extracellular Domain Modifications Affect Tumor Recognition by ROR1-Specific Chimeric Antigen Receptor T Cells, Clinical Cancer Research, 2013, V. 19, N. 12, p.3153-3164. *
PAKULA A.A. et al., Genetic analysis of protein stability and function, Annual review of genetics, 1989, V. 23, N. 1, p.289-310. *
WANG X. et al., A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells, Blood, 2011, V. 118, N. 5, p.1255-1263. *
WANG X. et al., A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells, Blood, 2011, V. 118, N. 5, p.1255-1263. HUDECEK M. et al. Receptor Affinity and Extracellular Domain Modifications Affect Tumor Recognition by ROR1-Specific Chimeric Antigen Receptor T Cells, Clinical Cancer Research, 2013, V. 19, N. 12, p.3153-3164. AERTGEERTS K. et al., Structural analysis of the mechanism of inhibition and allosteric activation of the kinase domain of HER2 protein, Journal of Biological Chemistry, 2011, V. 286, N. 21, p.18756-18765. CHO H. S. et al., Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab, Nature, 2003, V. 421, N. 6924, p.756-760. GARRETT J. T. et al., Novel engineered trastuzumab conformational epitopes demonstrate in vitro and in vivo antitumor properties against HER-2/neu, The Journal of Immunology, 2007, V. 178, N. 11, p.7120-7131. FRANKEL A.E. et al., Characterization of diphtheria fus *
ЛИКАРЬ Ю. Н. и др., Использование мутированного варианта человеческой деоксицитидинкиназы в качестве репортерного гена для оценки адоптивной Т-клеточной терапии, Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2012, V. 11, N. 2, c.23-31. *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2016013158A (es) 2017-04-27
JP2017515464A (ja) 2017-06-15
KR20160144432A (ko) 2016-12-16
CA2945303C (en) 2024-02-13
CN113528581A (zh) 2021-10-22
RU2751920C2 (ru) 2021-07-20
JP2020195380A (ja) 2020-12-10
MY185678A (en) 2021-05-30
NZ725079A (en) 2018-03-23
CA2945305C (en) 2023-10-17
RU2016143385A (ru) 2018-05-15
KR20230038310A (ko) 2023-03-17
NZ725081A (en) 2018-02-23
BR112016023507A2 (pt) 2017-10-17
US11414486B2 (en) 2022-08-16
AU2021201679B2 (en) 2023-05-04
JP7542270B2 (ja) 2024-08-30
RU2016143384A (ru) 2018-05-11
US10266592B2 (en) 2019-04-23
SG10201808833XA (en) 2018-11-29
IL248238B1 (en) 2024-10-01
EP3129480A4 (en) 2017-08-16
WO2015157432A1 (en) 2015-10-15
US20220380461A1 (en) 2022-12-01
AU2021200007A1 (en) 2021-03-04
BR112016023500A2 (pt) 2017-10-17
MX2016013159A (es) 2017-04-27
AU2021200007B2 (en) 2024-08-29
CN112877291A (zh) 2021-06-01
AU2015243849A9 (en) 2019-07-25
EP3129399A4 (en) 2017-11-08
JP2021019589A (ja) 2021-02-18
BR112016023517A2 (pt) 2017-10-17
EP3129405A4 (en) 2017-08-09
WO2015157391A1 (en) 2015-10-15
IL297591A (en) 2022-12-01
SG10201808811QA (en) 2018-11-29
AU2015243927B2 (en) 2021-09-02
EP3129471A1 (en) 2017-02-15
CA2945320A1 (en) 2015-10-15
EP3129405A1 (en) 2017-02-15
ZA201607061B (en) 2024-05-30
RU2016143385A3 (ru) 2018-11-30
AU2015243922A1 (en) 2016-11-03
CN106573969A (zh) 2017-04-19
MX2016013160A (es) 2017-02-09
RU2752275C2 (ru) 2021-07-26
AU2015243920B2 (en) 2020-10-08
KR102618955B9 (ko) 2024-08-12
CN106574246A (zh) 2017-04-19
JP2021036867A (ja) 2021-03-11
IL248243B1 (en) 2023-12-01
SG10201808825XA (en) 2018-11-29
US20220064292A1 (en) 2022-03-03
KR102508166B1 (ko) 2023-03-13
CN106536558A (zh) 2017-03-22
BR112016023523A2 (pt) 2017-10-17
RU2016143389A (ru) 2018-05-15
ES2880932T3 (es) 2021-11-26
SG11201608392WA (en) 2016-11-29
PH12016502009A1 (en) 2017-01-09
AU2015243922B2 (en) 2021-08-05
JP2017513470A (ja) 2017-06-01
IL248229A (en) 2016-11-30
IL248229B1 (en) 2023-01-01
WO2015157399A9 (en) 2016-11-24
KR102463529B1 (ko) 2022-11-07
KR20160143762A (ko) 2016-12-14
RU2016143381A3 (ru) 2018-11-30
JP2022184989A (ja) 2022-12-13
KR102387243B9 (ko) 2023-07-10
KR102600544B1 (ko) 2023-11-09
AU2021273652A1 (en) 2021-12-16
CN106661570A (zh) 2017-05-10
JP2017518037A (ja) 2017-07-06
IL248243A0 (en) 2016-11-30
CA2945308C (en) 2023-10-31
EP3943507A1 (en) 2022-01-26
RU2016143389A3 (ru) 2018-12-04
KR20220051024A (ko) 2022-04-25
CN106535934A (zh) 2017-03-22
US20170015746A1 (en) 2017-01-19
US20220372140A1 (en) 2022-11-24
SG11201608395PA (en) 2016-11-29
BR112016023500B1 (pt) 2024-04-30
JP2022153456A (ja) 2022-10-12
PH12016502010A1 (en) 2017-01-09
JP2017513520A (ja) 2017-06-01
CA2945303A1 (en) 2015-10-15
CN106661570A8 (zh) 2017-07-04
JP6788573B2 (ja) 2020-11-25
IL248235B (en) 2021-01-31
EP3129399A1 (en) 2017-02-15
WO2015157399A1 (en) 2015-10-15
JP7062720B2 (ja) 2022-05-06
AU2015243927A1 (en) 2016-11-03
RU2016143381A (ru) 2018-05-11
AU2015243882A1 (en) 2016-11-03
US11155616B2 (en) 2021-10-26
CA2945302A1 (en) 2015-10-15
JP7093385B2 (ja) 2022-06-29
JP2021000117A (ja) 2021-01-07
JP6765968B2 (ja) 2020-10-07
AU2021201679A1 (en) 2021-04-08
AU2015243882C1 (en) 2024-07-25
PH12016502011A1 (en) 2017-01-09
MX2016013149A (es) 2017-04-27
JP6788573B6 (ja) 2020-12-16
AU2015243882B2 (en) 2020-03-12
RU2016143388A (ru) 2018-05-14
NZ758289A (en) 2024-01-26
US20210139583A1 (en) 2021-05-13
EP3129471A4 (en) 2017-11-08
EP3129405B1 (en) 2021-02-24
KR102387243B1 (ko) 2022-04-14
JP6772068B2 (ja) 2020-10-21
US20180009891A1 (en) 2018-01-11
JP7402933B2 (ja) 2023-12-21
KR20160144430A (ko) 2016-12-16
WO2015157386A1 (en) 2015-10-15
KR102463529B9 (ko) 2024-07-31
IL248243B2 (en) 2024-04-01
MY186846A (en) 2021-08-26
IL248235A0 (en) 2016-11-30
MY184163A (en) 2021-03-24
CN106661570B (zh) 2020-02-07
EP3129399B1 (en) 2021-05-26
MY192522A (en) 2022-08-25
US10865242B2 (en) 2020-12-15
EP3129480A1 (en) 2017-02-15
US20190248891A1 (en) 2019-08-15
EP4056201A1 (en) 2022-09-14
CA2945308A1 (en) 2015-10-15
US20210002364A1 (en) 2021-01-07
EP3129053A4 (en) 2017-11-08
MX2022010807A (es) 2022-09-27
AU2015243920A1 (en) 2016-11-03
JP2017512484A (ja) 2017-05-25
JP7148580B2 (ja) 2022-10-05
AU2015243849B2 (en) 2020-12-17
IL248238A0 (en) 2016-11-30
KR102618955B1 (ko) 2023-12-27
US20170029774A1 (en) 2017-02-02
US20170267742A1 (en) 2017-09-21
KR102509481B1 (ko) 2023-03-10
SG11201608396YA (en) 2016-11-29
PH12016502012A1 (en) 2017-01-09
RU2751921C2 (ru) 2021-07-20
KR20160138298A (ko) 2016-12-02
BR112016023513A2 (pt) 2017-10-17
KR20160144431A (ko) 2016-12-16
IL248229B2 (en) 2023-05-01
ES2867224T3 (es) 2021-10-20
SG10201808819XA (en) 2018-11-29
KR20220153100A (ko) 2022-11-17
EP3954708A1 (en) 2022-02-16
JP2022109953A (ja) 2022-07-28
NZ739448A (en) 2019-10-25
SA516380056B1 (ar) 2021-07-04
SG11201608393TA (en) 2016-11-29
ZA201607060B (en) 2024-05-30
JP7106610B2 (ja) 2022-07-26
WO2015157384A1 (en) 2015-10-15
JP6765967B2 (ja) 2020-10-14
US20210371517A1 (en) 2021-12-02
RU2016143384A3 (ru) 2018-11-30
AU2015243849A1 (en) 2016-11-03
RU2016143388A3 (ru) 2018-11-30
US10611837B2 (en) 2020-04-07
CA2945305A1 (en) 2015-10-15
JP7508516B2 (ja) 2024-07-01
EP3129053A1 (en) 2017-02-15
MX2016013144A (es) 2017-04-27
CN106573969B (zh) 2021-07-30
US20170152297A1 (en) 2017-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021201679B2 (en) Transgene genetic tags and methods of use
US20210246423A1 (en) Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
RU2700765C2 (ru) Способ и композиции для клеточной иммунотерапии
CA3032054A1 (en) Combination therapies of chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
CA2981751A1 (en) Cd20 therapies, cd22 therapies, and combination therapies with a cd19 chimeric antigen receptor (car)- expressing cell
RU2822461C1 (ru) Трансгенные генетические метки и способы применения
BR112016023507B1 (pt) Polipeptídeo isolado que compreende um domínio extracelular de um polipeptídeo her2