KR102463529B1 - 약물 관련 트랜스진 발현 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 면역요법에 의해, 예컨대 CD8+ 중심 기억 T 세포 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 키메라 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 CD4+ T 세포와 중심 기억 T 세포의 조합을 입양 전달하는 것에 의해 매개되는 면역 반응을 부여하고/거나 증대시키기 위한 핵산, 벡터, 숙주 세포, 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 대안에서 유전자 변형된 숙주 세포는 약물 유도성 프로모터의 제어 하의 리간드 결합 도메인, 스페이서 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 막횡단 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 키메라 수용체의 발현을 제어하는 것은 환자의 상태에 따라 발현을 턴 온 및 오프하는 능력을 제공한다. 상기 방법에 의해 제조된 제약 제제 및 그의 사용 방법이 또한 기재되어 있다.

Description

약물 관련 트랜스진 발현 {DRUG RELATED TRANSGENE EXPRESSION}
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2014년 10월 2일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/058,973, 2014년 4월 10일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/977,751, 2014년 4월 30일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/986,479, 2014년 12월 9일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/089,730, 2014년 12월 11일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/090845, 및 2014년 12월 5일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/088,363의 우선권의 이익을 청구한다. 상기 언급된 출원의 전체 개시내용은 그 전문이 참조로 명백히 포함된다.
서열 목록, 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원한다. 서열 목록은 65kb 크기의 2015년 4월 7일에 생성된 파일 명칭 SCRI-53WO_SEQUENCE_LISTING.TXT로서 제공된다. 전자 포맷의 서열 목록 내 정보는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
종양 세포 상에서 발현된 표면 분자에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 전달에 의해 조작된 인간 T 림프구의 입양 전달은 암을 효과적으로 치료하는 잠재력을 갖는다. 키메라 수용체는 가장 통상적으로는 CD3ζ 단독 또는 1개 이상의 공동자극 도메인과 조합된 세포내 신호전달 구성요소에 연결된 세포외 리간드 결합 도메인, 가장 통상적으로는 모노클로날 항체의 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는 합성 수용체이다. 키메라 수용체의 설계에 있어서의 많은 연구는 본질적으로 정상인 조직에 심각한 독성을 유발하지 않으면서 악성 세포를 표적으로 하는 scFv 및 다른 리간드 결합 요소를 규정하고, T 세포 이펙터 기능을 활성화시키기 위해 세포내 신호전달 모듈의 최적 조성을 규정하는데 초점을 맞춰왔다.
T 세포 (CAR-T) 입양 요법 임상 시험 (T 세포를 발현하는 키메라 항원 수용체)은 강력한 항종양 활성을 증명하고 있지만, 유의한 독성이 예를 들어 생착-유발 시토카인 폭풍, 종양 용해 증후군 및 진행되는 B 세포 혈구감소증을 발생시킬 수 있고, 이들 각각은 구성적으로 발현된 CAR의 비조절된 기능적 아웃풋에서 기인할 수 있다는 것은 분명하다. 이러한 독성은 일부 문맥에서 CAR-T 세포 입양 요법의 적용성을 제한하는 것으로 위협할 수 있다. 트랜스진-변형된 입양 T 세포 면역요법을 사용하는 임상 시험은 단지 트랜스진 연관 부작용에 대부분 기여하는 트랜스진을 구성적으로 발현하거나 또는 항상 "온(ON)" 상태인 T 세포만을 시험해왔다. CAR-T 세포의 자살 유전자-매개 제거는 이러한 독성을 개선시킬 수 있지만; 이러한 접근법은 항종양 활성의 미성숙 감쇠의 위험이 있고, 치료 잠재력에 유의한 영향을 미친다.
현행 소분자-조절된 트랜스진 발현 기술은 마크롤리드, 엑디손 및 라파마이신 유사체를 포함한 다양한 약물 투입에 의존한다. 이들 시스템의 임상적 적용성은 독성 오프 타겟 효과, 바람직하지 않은 생체분포 및 약역학 프로파일, 제한된 아웃풋 동적 범위 및/또는 제한된 유용성으로 인해 FDA-승인된 상업적으로 입수가능한 제약으로서 제한된다. 게다가, 많은 이들 시스템은 이종 구성요소로부터 구축된 키메라 전사 조절인자를 사용하여, 이들 시스템을 인간 치료제에 적용 시 면역원성의 복잡을 도입한다.
치료 활성에 중요한 키메라 수용체 설계의 요소, 및 유해 부작용을 최소화하면서 생체내에서 증진된 생존 및 효능을 제공할 유전자 변형 및 입양 전달을 위한 세포 집단을 결정하는 방법을 확인할 필요가 있다. 세포 요법에 사용하기 위해 세포를 조정하기 위한, 예컨대 재조합 항원 수용체 예컨대 CAR 및/또는 이러한 세포에 의해 발현되는 다른 분자의 발현을 조정하여 치료 활성을 개선시키고/거나 생체내 생존 및/또는 효능을 증진시키고/거나 유해 부작용을 최소화하기 위한, 발현 시스템 및 방법에 대한 필요가 또한 존재한다.
본 개시내용의 한 측면은 세포에서의 약물-조절된 트랜스진 발현을 전달하는 유전자 시스템을 포함한다. 한 대안에서, 조절된 트랜스진 발현은 입양 면역요법에 사용하기 위해 설계된 세포, 예컨대 림프구에 표적화된다. 이러한 시스템은 생체내 키메라 항원 수용체 (CAR) 발현의 실시간 임상 제어를 허용하는 치유 의도를 단념시키지 않으면서, CAR 재지시된 입양 치료 전략에 대해 엄격한 안전성 속성을 제공한다. CAR 발현의 약물 반응성 전사 제어를 가능하게 하는 벡터를 조작함으로써, CAR 및 다른 세포 매개자의 활성은 임상적으로 허용되는 약동학, 조직 분포, 및 림프구의 세포외 공간과 시토졸 사이의 분배를 나타내는 임상의가 처방한 제약 약물 투입을 기반으로 하여 생체내에서 턴 "온" 및 "오프(OFF)"될 수 있다. 유전자 시스템은 약물의 부재 하에 기능적 "오프" 상태 및 약물의 존재 하에 기능적 "온" 상태 트랜스진 발현을 시행하기 위한 약물 조절된 트랜스진 발현을 제공한다.
이러한 약물의 하나의 대안은 타목시펜이다. 타목시펜은 FDA-승인되고 상업적으로 입수가능한 약물인 에스트로겐 길항제/부분 효능제이다. 이것은 경구로 섭취되고, 연장된 기간에 걸쳐 매일 기준으로 투여될 수 있다. 타목시펜은 증명된 안전성 기록, 유리한 약동학적 프로파일, 탁월한 조직 분포 및 세포외 공간과 시토졸 사이의 낮은 분배 계수를 갖는다. 다른 약물은 안전성 기록, 유리한 약동학적 프로파일 및 탁월한 조직 분포, 세포외 공간과 시토졸 사이의 낮은 분배 계수 및/또는 낮은 독성을 기반으로 하여 선택될 수 있다.
일부 대안에서, 시스템은 타목시펜의 존재 하에 트랜스진의 상류의 합성 프로모터에 결합하여 발현을 유도하는 합성 전사 조절인자를 사용한다. 타목시펜 조절된 전사 인자 ("TamR-tf", 또한 "HEA3"으로도 지정됨)는 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ER-LBD)의 돌연변이체 타목시펜-특이적 리간드 결합 도메인에 인 프레임으로 융합되고, 다시 NF-κB의 p65 활성화 도메인 (p65)에 융합된, 간세포 핵 인자 1-알파 (HNF-1α)의 N-말단 DNA 결합 도메인을 포함하는 인간 서브유닛으로 구성된 키메라 전사 인자이다. 예시적인 아미노산 서열은 표 10에 제공되고, 서열식별번호(SEQ ID NO): 40으로 확인된다. 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ER-LBD)의 돌연변이체 타목시펜-특이적 리간드 결합 도메인은 TamR-tf의 아미노산 282-595에서 발견되고, 위치 521에서 돌연변이를 갖는다. NF-κB의 p65 활성화 도메인 (p65)은 서열식별번호: 40의 아미노산 596-862에서 발견된다. 에스트로겐 유사체에 대한 인자의 친화도를 증가시키기 위해 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인에서 1개 이상의 아미노산을 변경시키는 것 및 p65 전사활성화 도메인에서 1개 이상의 아미노산을 변경시키는 것을 제한 없이 포함하는 추가의 변화가 전사 인자의 특성을 증가시키기 위해 전사 활성화인자에 대해 이루어질 수 있다.
타목시펜의 부재 하에, TamR-tf는 시토졸 열-쇼크 단백질 90 (HSP90)의 타목시펜 결합 활성 부위에의 결합에 의해 핵으로부터 제외되고, 트랜스진 발현은 "오프" 상태가 된다. 나노몰 농도의 시토졸 타목시펜은 ER-LBD 결합에 대해 HSP90을 적극적으로 능가하며, 핵으로의 TamR-tf 전위를 발생시킨다. 핵 전위 시, TamR-tf는 그의 제한된 합성 프로모터 (예를 들어 7xHBD/EF1αp)에 결합하는데 용이하게 이용가능하다. 타목시펜의 존재 하에, 7xHBD/EF1αp 프로모터에 대한 TamR-tf의 결합은 트랜스진 발현의 "온" 상태를 유도한다. 일부 대안에서, 이러한 전사 조절인자는 다양한 수준의 트랜스진 발현 제어를 제공하도록 변형될 수 있다. TamR-tf의 LBD에서의 아미노산 치환은 타목시펜 및 그의 대사물에 대한 선택적 반응성을 허용하며, 여기서 4-히드록시 타목시펜 (4-OHT)은 내인성 에스트로겐과의 상호작용이 결여된 한편 TamR-tf 활성과 관련하여 가장 약리적으로 활성인 대사물이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 세포 면역요법에 의해, 예컨대 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 단독, 또는 조합의 종양-특이적, 유전자 변형된 하위세트를 입양 전달하는 것에 의해 매개되는 면역 반응을 부여하고/거나 증대시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용은 키메라 수용체 핵산, 및 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 키메라 수용체를 코딩하는 핵산 서열은 본원에 기재된 바와 같이 효율적인 T 세포 활성화 및 특이적 표적 분자 또는 표적 분자 상의 에피토프의 인식을 위해 키메라 수용체를 맞춤화하고 조절된 전사를 제공하기 위해, 절제될 수 있고 다른 구성요소로 대체될 수 있는 수많은 모듈화된 구성요소와 함께 연결된다.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템은, 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음), 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산, 및 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템은 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 및/또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 예시적인 대안에서, 제2 핵산은 구성적 프로모터의 제어 하의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포 면역요법에 의해, 예컨대 종양-특이적, 하위세트 특이적 유전자 변형된 CD4+ T 세포를 입양 전달하는 것에 의해 매개되는 면역 반응을 부여하고/거나 증대시키는 조성물을 제공하며, 여기서 CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포가 항종양 반응성을 유지하고 종양-특이적 증식을 증가 및/또는 최대화하는 능력을 부여하고/거나 증대시킨다. 일부 대안에서, CD4+ 세포는 본원에 기재된 바와 같이 조절된 프로모터의 제어 하의 키메라 수용체 핵산 및/또는 키메라 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 변형된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포 면역요법에 의해, 예컨대 종양-특이적, 하위세트 특이적 유전자 변형된 T 세포를 입양 전달하는 것에 의해 매개되는 면역 반응을 부여하고/거나 증대시키기 위한 조성물을 제공한다. 일부 대안에서, 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 대안에서, CD8+ T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 조절된 프로모터의 제어 하에 키메라 수용체 핵산 및/또는 키메라 수용체 폴리펩티드를 발현한다.
일부 대안은 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 세포성 면역 반응을 제공하는 유전자 변형된 T 림프구 세포 제제를 투여하고, 유전자 변형된 T 림프구 세포에서 트랜스진을 유도하는 약물을 투여함으로써 상기 대상체에서 세포 면역요법을 수행하는 방법에 관한 것이다. 일부 대안에서, 유전자 변형된 T 림프구 세포 제제는 전구체 T 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 변형된 T 림프구 세포 제제는 조혈 줄기 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 변형된 CD8+ 및 유전자 변형된 CD4+ 세포 집단은 공-투여된다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, T 세포는 자가 또는 동종 T 세포이다. 상기 방법의 다양한 변형이 가능하다. 예를 들어, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 의해 발현된 키메라 수용체는 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음), 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산, 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산, 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적이다.
일부 대안에서, 키메라 수용체 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 키메라 수용체 폴리펩티드는 시스템에 의해 코딩된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산, 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 도메인이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다.
일부 대안에서, 숙주 세포가 제공되며, 여기서 숙주 세포는 시스템을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 제약상 허용되는 부형제 중 숙주 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 시스템을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포인 숙주 세포를 포함하고, 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 또 다른 숙주 세포를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포 또는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 숙주 세포, 및 전구체 T 세포 또는 조혈 줄기 세포인 제2 숙주 세포를 포함한다.
일부 대안에서, 숙주 세포를 제조하는 시험관내 방법이 제공되며, 여기서 방법은 a) 시스템을 제공하는 단계 및 b) 시스템을 별개의 단리된 T 림프구 집단에 도입시키고 각각의 T 림프구 집단을 시험관내에서 확장시키는 단계를 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, T 림프구가 확장되며, 방법은 세포를 항-CD3 및/또는 항 CD28, 및 적어도 1종의 항상성 시토카인의 존재 하에 세포가 세포 주입물로서 사용하기에 충분히 확장될 때까지 배양하는 것을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 림프구는 CD8+ 또는 CD4+이다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 암 또는 바이러스 감염의 치료를 위한 숙주 세포 또는 조성물에서 트랜스진의 발현을 유도하는 약물과 조합된 숙주 세포 또는 조성물의 용도가 제공된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 시스템을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제 중 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 시스템을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포인 숙주 세포, 및 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 또 다른 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양이다. 일부 대안에서, 고형 종양은 유방암, 뇌암, 폐암, 결장암, 신암, 췌장암, 전립선암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포 또는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 숙주 세포, 및 전구체 T 세포 또는 조혈 줄기 세포인 제2 숙주 세포를 포함한다.
일부 대안에서, 조성물 또는 숙주 세포를 암 또는 바이러스 감염을 갖는 대상체에게 투여하는 것 및 조성물 또는 숙주 세포에서 트랜스진의 발현을 유도하는 약물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 세포 면역요법을 수행하는 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 시스템을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제 중 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 시스템을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포인 숙주 세포, 및 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 또 다른 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포 또는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 숙주 세포, 및 전구체 T 세포 또는 조혈 줄기 세포인 제2 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 고형 종양은 유방암, 뇌암, 폐암, 결장암, 신암, 췌장암, 전립선암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 단리된 T 림프구 집단은 전구체 T 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 약물을 투여하는 것은 조성물 또는 숙주 세포의 투여 후에 수행되고, 여기서 투여는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 4주 또는 2달, 또는 열거된 시간 중 임의의 2개의 값 사이의 임의의 시간에 수행된다.
도 1a는 4 히드록시 타목시펜 (4OHT)의 존재 또는 부재 하에 구축물 A 및 B를 포함하는 이중 플라스미드 렌티바이러스 구축물로 형질도입된 Jurkat 세포에서 유동 세포측정법에 의해 결정된 바와 같은 ZsGreen 및 EGFRt의 발현을 제시한다. 결과는 4-OHT의 존재 또는 부재 하의 EGFRt의 발현이 세포가 구축물 A를 보유하는지를 나타낸다는 것을 제시한다. 결과는 또한 세포가 ZsGreen의 발현이 4-OHT의 존재 하에 유도됨에 따라 구축물 B를 보유한다는 것을 제시한다. 도 1b는 구축물 A가 EGFRt에 연결된 TamR-tf (HEA3)에 연결된 구성적 프로모터 EF1αp를 포함하고, 구축물 B가 ZsGreen을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 합성 프로모터 7xHBD/mE1b를 포함한다는 것을 제시한다.
도 2는 50 내지 1000nM 범위의 4-OHT의 상이한 용량과 접촉된 형질도입된 Jurkat 세포에서의 ZsGreen의 발현을 제시한다.
도 3은 4-OHT의 단일 48시간 처리에 이어 세척제거된 형질도입된 Jurkat 세포 (○) 및 4-OHT의 24시간 처리에 이어 세척제거된 다음 제15일에 4-OHT로 재자극된 형질도입된 Jurkat 세포 (■)에서의 ZsGreen의 발현의 온 및 오프 레이트 동역학을 제시한다.
도 4a-d는 이중 패키지 렌티바이러스 구축물 A 및 B로 형질도입된 CD4 중심 기억 세포에서의 ZsGreen의 발현을 제시한다. 세포는 3종의 처리군, 4OHT 단독 (도 4a), CD3/CD28 비드 공-처리와 조합된 4OHT (도 4b) 또는 48시간 동안 4OHT 단독에 이어 CD3/CD28 비드의 첨가 (도 4c)로 나뉘었다. ZsGreen의 발현은 96시간에 걸쳐 모니터링되었다. 도 4d는 구축물 A가 EGFRt에 연결된 TamR-tf (HEA3)에 연결된 구성적 프로모터 EF1αp를 포함하고, 구축물 B가 ZsGreen을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 합성 프로모터 7xHBD/mE1b를 포함한다는 것을 제시한다.
도 5a-c는 도 4에 제시된 바와 같이 이중 패키지 렌티바이러스 구축물 A 및 B로 형질도입된 CD8 중심 기억 세포에서의 ZsGreen의 발현을 제시한다. 세포는 3종의 처리군, 4OHT 단독 (도 5a), CD3/CD28 비드 공-처리와 조합된 4OHT (도 5b) 또는 48시간 동안 4OHT 단독에 이어 CD3/CD28 비드의 첨가 (도 5c)로 나뉘었다. ZsGreen의 발현은 72시간에 걸쳐 모니터링되었다.
도 6a는 도 6c에 제시된 바와 같이 구축물 A 및 B로 형질도입된 인간 Jurkat T 세포에서의 EGFRt 및 Her2t의 발현을 제시한다. EGFRt 및 Her2t의 발현은 4OHT의 존재 또는 부재 하에 모니터링하였다. 샘플은 EGFRt-APC 항체 및 헤르셉틴-비오틴, 이어서 SA-PE로 염색하였다. 도 6b는 CD19 CAR 상의 세포내 CD3 제타 쇄 (약 48 kDA)를 인식하는 마우스 항CD247로 염색된 모 Jurkat 세포 및 형질도입된 CD19CAR 형질도입된 세포의 웨스턴 블롯을 제시하고, 내인성 CD3 제타 쇄는 23 kDA으로 이동하였다. 내인성 CD3 제타 쇄는 모든 세포에서 검출되었다. CD19 CAR CD3 제타 쇄는 4-OHT에 노출된 형질도입된 Jurkat 세포에서만 검출되었다. 도 6c는 구축물 A가 EGFRt에 연결된 TamR-tf (HEA3)에 연결된 구성적 프로모터 EF1αp를 포함하고, 구축물 B가 Her2t를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 CD19CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 합성 프로모터 7xHBD/mE1b를 포함한다는 것을 제시한다.
도 7a는 4OHT의 존재 또는 부재 하에서의 추가의 선택 마커, DHFRdm을 포함하는 TamR CD19CAR LV로 형질도입된 인간 Jurkat T 세포에서의 EGFRt 및 Her2t의 발현을 제시한다. EGFRt 및 Her2t의 발현은 4OHT의 존재 또는 부재 하에 모니터링하였다. 샘플은 EGFRt-APC 항체 및 헤르셉틴-비오틴, 이어서 SA-PE로 염색하였다. 도 7b는 CD19 CAR 상의 세포내 CD3 제타 쇄 (약 48 kDA)를 인식하는 마우스 항CD247로 염색된 모 Jurkat 세포 및 형질도입된 CD19CAR 형질도입된 세포의 웨스턴 블롯을 제시하고, 내인성 CD3 제타 쇄는 23 kDA으로 이동하였다. 내인성 CD3 제타 쇄는 모든 세포에서 검출되었다. CD19 CAR CD3 제타 쇄는 4-OHT에 노출된 형질도입된 Jurkat 세포에서만 검출되었다. 도 7c는 구축물 A가 EGFRt에 연결된 TamR-tf(HEA3)에 연결된 구성적 프로모터 EF1αp를 포함하고, 구축물 B가 DHFRdm을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 Her2t를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 CD19CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 합성 프로모터 7xHBD/mE1b를 포함한다는 것을 제시한다.
도 8a는 4OHT 및 항CD3/CD28 비드의 존재 또는 부재 하에서의 추가의 선택 마커, DHFRdm을 포함하는 TamR CD19CAR LV로 형질도입된 인간 CD4 중심 기억 T 세포에서의 EGFRt 및 Her2t의 발현을 제시한다. EGFRt 및 Her2t의 발현은 4OHT의 존재 또는 부재 하에 및 항CD3/CD28 비드의 존재 또는 부재 하에 모니터링하였다. 샘플은 EGFRt-APC 항체 및 헤르셉틴-비오틴, 이어서 SA-PE로 염색하였다. 도 8b는 구축물 A가 EGFRt에 연결된 TamR-tf(HEA3)에 연결된 구성적 프로모터 EF1αp를 포함하고, 구축물 B가 DHFRdm을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 Her2t를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 CD19CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 합성 프로모터 7xHBD/mE1b를 포함한다는 것을 제시한다.
정의.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 "약"은 측정가능한 값을 지칭할 때 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 보다 더 바람직하게는 ±1% 및 보다 더 바람직하게는 ±0.1%의 변화를 포괄하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생산 또는 특이적 면역학적-적격 세포의 활성화 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 항원이 재조합적으로 생성, 합성, 생산될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있는 것은 용이하게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은, 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체 예컨대, 예를 들어, 혈액, 혈장 또는 복수액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "항종양 효과"는 종양 부피의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가 또는 암성 상태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 감소에 의해 명시될 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항종양 효과"는 또한 재발의 감소 또는 재발 전 시간의 증가에 의해 명시될 수 있다.
본원에 사용된 "키메라 수용체"는 질환 또는 장애와 연관된 분자에 결합하고, 스페이서 도메인을 통해 T 세포의 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인 또는 다른 수용체, 예컨대 공동자극 도메인에 연결된, 항체 또는 다른 단백질 서열의 리간드 결합 도메인을 포함하는 합성적으로 설계된 수용체를 지칭한다. 키메라 수용체는 또한 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체 및 키메라 항원 수용체 (CAR)로서 지칭될 수 있다. 이들 CAR은 면역 수용체 세포 상에 임의적인 특이성을 그라프팅할 수있는 조작된 수용체이다. 용어 키메라 항원 수용체 또는 "CAR"은 또한 일부 조사자에 의하면 항체 또는 항체 단편, 스페이서, 신호전달 도메인 및 막횡단 영역을 포함하는 것으로 고려된다. 그러나, 본원에 기재된 CAR의 상이한 구성요소 또는 도메인, 예컨대 에피토프 결합 영역 (예를 들어, 항체 단편, scFv 또는 그의 부분), 스페이서, 막횡단 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 변형시키는 것의 놀라운 효과로 인해, CAR의 구성요소는 본 개시내용에 걸쳐 독립적인 요소의 면에서 빈번하게 구별된다. CAR의 상이한 요소의 변이는, 예를 들어 특이적 에피토프 또는 항원에 대한 더 강한 결합 친화도로 이어질 수 있다. 본원에 사용된 용어 "공동-자극 도메인"은 예를 들어 TCR/CD3 복합체의 CD3 제타 쇄에 의해 제공되는 1차 신호에 더하여 활성화, 증식, 분화, 시토카인 분비 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 T 세포에게 제공하는 신호전달 모이어티를 지칭한다. 공동-자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-l (LFA-l), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드의 모두 또는 일부를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 대안에서, 공동-자극 도메인은 다른 세포내 매개자와 상호작용하여 활성화, 증식, 분화 및 시토카인 분비 등을 포함하는 세포 반응을 매개하는 세포내 신호전달 도메인이다. 본원에 사용된 "을 코딩하는"은 다른 거대분자 예컨대 아미노산의 규정된 서열의 합성을 위한 주형으로서 작용하는, 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드의 특정한 서열, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA의 속성을 지칭한다. 따라서, 유전자는 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우에 단백질을 코딩한다. "폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열"은 서로의 축중성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "조건부" 또는 "유도성"은 유도인자의 존재 하에 유전자 발현을 제공하고, 유도인자의 부재 하에 유전자 발현을 실질적으로 제공하지 않는 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 지칭한다.
본원에 사용된 "구성적"은 연속 생산되는 폴리펩티드의 발현을 제공하는 구성적인 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 지칭한다.
"특이적" 또는 "특이성"은 결합 파트너에 대한 리간드 또는 대안적으로 리간드에 대한 결합 파트너의 특징을 지칭할 수 있고, 결합을 위한 상보적 형상, 전하 및 소수성 특이성을 포함할 수 있다. 결합에 대한 특이성은 입체특이성, 위치선택성 및 화학선택성을 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산이 생성되도록 하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 제조하는 방법이 제공된다.
본원에 기재된 "조절하다" 또는 "조정하다"는 생물학적 과정을 제어하는 작용, 또는 생물학적 또는 세포 과정 또는 경로에 대해 변형 또는 제어 영향력을 발휘하는 것을 지칭한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음), 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산, 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 조정은 세포 분화 및 아폽토시스의 조정을 포함한다. 일부 대안에서, 조정은 단백질의 활성의 조절에 의한 세포 증식의 조정을 포함한다. 일부 대안에서, 단백질은 세포 주기 조절인자 및 전사 인자이다. 일부 대안에서, 세포 주기 조절인자는 시클린 D1, p21, p27 및/또는 cdc25A이다. 일부 대안에서, 전사 인자는 c-Myc이다.
본원에 사용된 "세포독성 T 림프구" (CTL)는 그의 표면 상에서 CD8을 발현하는 T 림프구 (예를 들어, CD8+ T 세포)를 지칭한다. 일부 대안에서 이러한 세포는 바람직하게는 항원-경험 "기억" T 세포 (TM 세포)이다.
본원에 사용된 "중심 기억" T 세포 (또는 "TCM")는 그의 표면 상에 CD62L, CCR-7 및/또는 CD45RO를 발현하고, 나이브 세포와 비교 시 CD45RA를 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖는 항원 경험 CTL을 지칭한다. 일부 대안에서, 중심 기억 세포는 나이브 세포와 비교 시 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO 및/또는 CD95의 발현에 대해 양성이고, CD54RA의 감소된 발현을 가질 수 있다. 본원에 사용된 "이펙터 기억" T 세포 (또는 "TEM")는 중심 기억 세포와 비교 시 그의 표면 상에 CD62L을 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖고, 나이브 세포와 비교 시 CD45RA를 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖는 항원 경험 T 세포를 지칭한다. 일부 대안에서, 이펙터 기억 세포는 나이브 세포 또는 중심 기억 세포와 비교 시 CD62L 및/또는 CCR7의 발현에 대해 음성이고, CD28 및/또는 CD45RA의 가변 발현을 가질 수 있다.
본원에 사용된 "나이브" T 세포는 중심 또는 이펙터 기억 세포와 비교 시 CD62L 및/또는 CD45RA는 발현하고 CD45RO-는 발현하지 않는 비-항원 경험 T 림프구를 지칭한다. 일부 대안에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD127 및/또는 CD45RA를 포함한 나이브 T 세포의 표현형 마커의 발현에 의해 특징화된다.
본원에 사용된 "이펙터" "TE" T 세포는 중심 기억 또는 나이브 T 세포와 비교 시 CD62L, CCR7, 및/또는 CD28을 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖고, 그랜자임 B 및/또는 퍼포린에 대해 양성인 항원 경험 세포독성 T 림프구 세포를 지칭한다.
혼합물 중 세포 유형의 양을 기재하기 위해 본원에 사용된 "풍부화된" 및 "고갈된"은 세포의 혼합물에 대해 "풍부화된" 유형의 수의 증가 및 "고갈된" 세포의 수의 감소를 발생시키는 과정 또는 단계를 적용하는 것을 지칭한다. 따라서, 풍부화 과정에 적용된 원래의 세포 집단의 공급원에 따라, 혼합물 또는 조성물은 "풍부화된" 세포 60, 70, 80, 90, 95 또는 99% 이상 (수 또는 카운트 단위) 및/또는 "고갈된" 세포 40, 30, 20, 10, 5 또는 1% 이하 (수 또는 카운트 단위)를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "에피토프"는 항체, T 세포 및/또는 B 세포를 포함한 면역계에 의해 인식되는 항원 또는 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 통상적으로 적어도 7개 아미노산을 갖고, 선형 또는 입체형태적일 수 있다.
"단리된"이 본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기재하는데 사용될 때, 이는 그의 자연 환경의 구성요소로부터 확인 및 분리되고/거나 회수된 폴리펩티드 또는 핵산을 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드 또는 핵산은 그것이 자연적으로 회합되는 모든 구성요소와의 회합을 함유하지 않는다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 전형적으로 폴리펩티드 또는 핵산에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "세포내 신호전달 도메인"은 림프구의 활성화를 제공하는 분자 (여기서 키메라 수용체 분자)의 1개 이상의 도메인의 모두 또는 일부를 지칭한다. 이러한 분자의 세포내 도메인은 세포 매개자와 상호작용함으로써 신호를 매개하여 증식, 분화, 활성화 및 다른 이펙터 기능을 발생시킨다. 일부 대안에서, 이러한 분자는 CD28, CD3 또는 4-1BB의 모두 또는 일부, 또는 그의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 "리간드"는 또 다른 물질에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 물질을 지칭한다. 리간드의 예는 항원 상의 에피토프, 수용체에 결합하는 분자, 기질, 억제인자, 호르몬 및/또는 활성화인자를 포함한다. 본원에 사용된 "리간드 결합 도메인"은 리간드에 결합하는 물질 또는 물질의 부분을 지칭한다. 리간드 결합 도메인의 예는 항체의 항원 결합 부분, 수용체의 세포외 도메인 및/또는 효소의 활성 부위를 포함한다. 본원에 사용된 "작동가능하게 연결된"은 이종 핵산 서열의 발현을 발생시키는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 위치할 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하고, 필요한 경우에 2개의 단백질 코딩 영역을 동일한 리딩 프레임 내에 연결한다.
본원에 확인된 키메라 수용체 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후에 각각의 리간드 결합 도메인, 스페이서, 막횡단 도메인 및/또는 림프구 활성화 도메인에 대한 참조 서열 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되며, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 부분으로서 간주하지 않는다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈라인 (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여, 관련 기술분야의 기술 내의 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)]을 사용하여 생성된 % 아미노산 서열 동일성 값은 여러 검색 파라미터를 사용하며, 그의 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 디폴트 값 (즉, 조정가능한 파라미터)으로 설정되지 않은 것은 하기 값으로 설정된다: 오버랩 스팬=1, 오버랩 분획=0.125, 단어 역치 (T)=11 및 스코어링 매트릭스=BLOSUM62. % 아미노산 서열 동일성 값은 (a) WU-BLAST-2에 의해 결정되는 바와 같이 표 2에 제공된 참조 키메라 수용체 서열의 각각의 또는 모든 폴리펩티드 아미노산 서열과 관심 비교 아미노산 서열 사이에 매칭되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 (b) 관심 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총 수로 나누는 것에 의해 결정된다. 일부 대안에서, 아미노산 또는 핵산의 퍼센트 서열 동일성은 컴퓨터 소프트웨어에 의해 결정된다.
본원에 사용된 "키메라 수용체 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "키메라 수용체 변이체 핵산 서열"은 표 1에 제시된 폴리뉴클레오티드 산 서열 또는 그의 특이적으로 유래된 단편, 예컨대 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 스페이서 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 림프구 자극 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 핵산 서열 동일성 (또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 백분율 핵산 서열 동일성)을 갖는 하기에 정의된 바와 같은 폴리펩티드-코딩 핵산 분자를 지칭한다. 통상적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편의 키메라 수용체 변이체는 표에 제시된 핵산 서열 또는 그의 유도된 단편과 적어도 80% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 81% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 82% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 83% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 84% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 86% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 87% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 88% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 89% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 90% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 91% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 92% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 93% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 94% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 96% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 97% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 98% 핵산 서열 동일성 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 핵산 서열 동일성을 가질 것이다. 변이체는 천연 뉴클레오티드 서열을 포괄하지 않는다. 이와 관련하여, 유전자 코드의 축중성으로 인해, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 표 1의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 다수의 키메라 수용체 변이체 폴리뉴클레오티드가 표 2의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 것임을 즉시 인식할 것이다.
"실질적으로 정제된"은 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 또는 그 미만의 다른 분자 유형 또는 다른 세포 유형을 갖는 분자를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 그것이 그의 자연 발생 상태에서 정상적으로 회합되는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 세포의 동종 집단을 지칭한다.
"실질적으로 발견되지 않는"이 정상 세포 상의 종양 항원 또는 다른 분자의 존재와 관련하여 사용되는 경우에, 이는 항원 또는 분자를 갖는 정상 세포 유형의 백분율 및/또는 세포 상의 항원의 밀도를 지칭한다. 일부 대안에서, 실질적으로 발견되지 않는은 항원 또는 분자가 종양 세포 또는 다른 이환 세포 상에서 발견되는 세포 또는 항원의 양과 비교 시 정상 세포 유형의 50% 미만 상에서 및/또는 50% 미만의 밀도로 발견된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "T 세포" 또는 "T 림프구"는 임의의 포유동물, 바람직하게는 원숭이, 개 및 인간을 포함한, 영장류 종으로부터의 것일 수 있다. 일부 대안에서 T 세포는 수용자 대상체와 동종이고 (동일한 종이지만 상이한 공여자로부터); 일부 대안에서 T 세포는 자가이고 (공여자와 수용자가 동일); 일부 대안에서 T 세포는 동계이다 (공여자와 수용자가 상이하지만, 일란성 쌍둥이임).
"벡터" 또는 "구축물"은 세포에서의 이종 핵산의 발현을 제공하기 위한 조절 요소를 갖는, 세포 내로 이종 핵산을 도입시키는데 사용되는 핵산이다. 벡터는 플라스미드, 미니서클, 효모 및 바이러스 게놈을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 대안에서, 벡터는 플라스미드, 미니서클, 효모 또는 바이러스 게놈이다.
본원에 기재된 "아폽토시스"는 다세포 유기체에서 발생할 수 있는 프로그램화된 세포 사멸 (PCD)의 과정을 지칭한다. 생화학적 사건은 특징적 세포 변화 (형태학) 및 사멸로 이어진다. 이들 변화는 수포화, 세포 수축, 핵 단편화, 염색질 응축 및 염색체 DNA 단편화를 포함한다. 아폽토시스에서, 세포는 스트레스에 반응하여 세포내 아폽토시스 신호전달을 개시하며, 이는 세포 자살을 초래할 수 있다. 글루코코르티코이드, 열, 방사선, 영양 결핍, 바이러스 감염, 저산소증 및 증가된 세포내 칼슘 농도에 의한, 예를 들어 막에 대한 손상에 의한 핵 수용체의 결합은 모두 손상된 세포에 의한 세포내 아폽토시스 신호의 방출을 촉발할 수 있다. 다수의 세포 구성요소, 예컨대 폴리 ADP 리보스 폴리머라제는 또한 아폽토시스를 조절하는 것을 도울 수 있다.
세포 사멸의 실제 과정이 효소에 의해 촉발되기 전에, 아폽토시스 신호는 조절 단백질이 아폽토시스 경로를 개시하도록 해야 한다. 이러한 단계는 아폽토시스 신호가 세포 사멸을 유발하도록 하거나 또는 세포가 더 이상 사멸할 필요가 없다면 과정을 중지되도록 한다. 여러 단백질이 수반되지만, 조절의 2가지 주요 방법이 확인되었다: 미토콘드리아 기능성을 표적화하는 것, 또는 어댑터 단백질을 통해 신호를 아폽토시스 메카니즘으로 직접 전달하는 것. 여러 독소 연구에서 확인된 개시를 위한 또 다른 외인성 경로는 약물 활성에 의해 유발되는 세포 내 칼슘 농도의 증가이고, 이는 또한 칼슘 결합 프로테아제 칼파인을 통해 아폽토시스를 유발할 수 있다.
아폽토시스는 많은 인자에 의해 조절될 수 있다. 이들 인자는 IL-2, IL-15, 케모카인 수용체, Bcl2, CA-Akt, dn-TGF베타RIII, dn-SHP1/2 및/또는 PD-1CD28 키메라를 발현할 수 있는 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. IL-15는 T 및 자연 킬러 세포 활성화 및 증식을 조절한다. 설치류 림프구에서, IL15는 아폽토시스 억제인자, BCL2L1/BCL-X(L)를 유도함으로써 아폽토시스를 방지하는 것으로 제시되었다. 복강 질환을 갖는 인간에서, IL-15는 Bcl-2 및/또는 BCL-xL을 유도함으로써 T-림프구에서 아폽토시스를 유사하게 억제한다. 인간에서 BCL2 유전자에 의해 코딩된 Bcl-2 (B-세포 림프종 2)는 세포 사멸을 유도하거나 (아폽토시스촉진) 억제 (항-아폽토시스)함으로써 세포 사멸 (아폽토시스)을 조절하는 조절인자 단백질의 Bcl-2 패밀리의 창립 구성원이다. Bcl-2는 구체적으로 중요한 항-아폽토시스 단백질로서 간주되고, 따라서 종양유전자로서 분류된다. Akt로도 공지된 단백질 키나제 B (PKB)는 다중 세포 과정 예컨대 글루코스 대사, 아폽토시스, 세포 증식, 전사 및 세포 이동에서 주요 역할을 하는 세린/트레오닌-특이적 단백질 키나제이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산, 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 아폽토시스를 조절하거나 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 IL-2, IL-15, 케모카인 수용체, Bcl2, CA-Akt, dn-TGF베타RIII, dn-SHP1/2 또는 PD-1CD28 키메라를 포함한다.
본원에 기재된 "체크포인트 신호전달"은 세포 주기를 특정 전이점, 체크포인트에서 차단하여, 세포 주기의 사건이 정확한 순서로 일어나는 것을 보장한다. 체크포인트 신호전달은 또한 활성화될 수 있다. 예로서 및 비제한적으로, 체크포인트 신호전달은 DNA에 대한 손상에 의해 발생할 수 있으므로 손상이 복구될 때까지 세포 주기가 진행되지 않아야 한다. "세포 주기 체크포인트"는 세포의 적절한 분열을 보장하는 진핵 세포 내 제어 메카니즘이다. 각각의 체크포인트는 세포 주기를 따라 잠재적 중단점으로서의 역할을 하며, 바람직한 조건이 충족될 때 발생하는 세포 주기의 다양한 단계를 통해 진행되면서 그 동안 세포의 상태가 평가된다. 현재, 3종의 공지된 체크포인트가 존재한다: 제한 또는 출발 체크포인트로도 공지되어 있는 G1 체크포인트; G2/M 체크포인트; 및 스핀들 체크포인트로도 공지되어 있는 중기 체크포인트. 스트레스 후에 세포 주기 이행을 저지하고/거나 세포 사멸을 유도하는 생화학적 경로는 세포 주기 체크포인트로서 공지되어 있다. 이들 체크포인트는 DNA 복제, 복구 및 분열의 충실도를 유지한다. 체크포인트 신호전달을 조절할 수 있는 폴리펩티드는 p53, p107, p130, 및 전사 리프레서 Rb를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 "음성 체크포인트 조절인자"는 종양을 효과적으로 공격하는 T-세포 반응의 능력을 제한할 수 있는 인자를 지칭한다. 이들은 또한 음성 체크포인트 신호전달로서 지칭된다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 억제 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산, 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다.
또 다른 예에서, 상류 신호전달 경로의 성장 억제 신호를 조정하는 세포 주기 억제인자, Cip/Kip 패밀리 p21Cip1, p27Kip1 및 p57Kip2의 시클린-CDK 억제인자는 세포 주기 조절을 초과하는 기능을 갖는 다면적 단백질로서 부상하였다. 세포 주기를 조절하는 것에 더하여, Cip/Kip 단백질은 또한 아폽토시스, 전사 조절, 세포 운명 결정, 세포 이동 및 세포골격 역학에서 중요한 역할을 할 수 있다. 복합 인산화 네트워크는 그들의 세포하 국재화, 단백질-단백질 상호작용 및 안정성을 변경함으로써 Cip/Kip 단백질 기능을 조정한다. 이들 기능은 배아 발생에서 종양 억제까지 이르는 과정에서, 정상 세포 및 조직 항상성의 유지에 필수적이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산, 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 폴리펩티드는 체크포인트 신호전달을 조정한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다.
본원에 기재된 "T 세포 전구체"는 흉선으로 이동하고 T 세포 수용체를 발현하지 않는 T 세포 전구체가 될 수 있는 림프성 전구체 세포를 지칭한다. 모든 T 세포는 골수의 조혈 줄기 세포로부터 기원한다. 조혈 줄기 세포로부터의 조혈 전구세포 (림프성 전구 세포)는 흉선으로 이주하고, 세포 분열에 의해 확장되어 미성숙 흉선세포의 큰 집단을 생성한다. 가장 조기 흉선세포는 CD4도 CD8도 발현하지 않고, 따라서 이중-음성 (CD4-CD8-) 세포로 분류된다. 그것이 그의 발생을 통해 진행됨에 따라, 그는 이중-양성 흉선세포 (CD4+CD8+)가 되고, 최종적으로 단일-양성 (CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+) 흉선세포로 성숙하며, 이어서 이는 흉선으로부터 말초 조직으로 방출된다.
흉선세포의 약 98%는 양성 선택 또는 음성 선택을 실패함으로써 흉선에서의 발생 과정 동안 사멸되는 반면에, 다른 2%는 생존하고 흉선에 남겨져서 성숙한 면역적격 T 세포가 된다.
전구체 T 세포의 이중 음성 (DN) 단계는 기능적 β-쇄를 생산하는 것에 초점을 맞추는 반면에, 이중 양성 (DP) 단계는 기능적 α-쇄를 생산하여 궁극적으로 기능적 αβ T 세포 수용체를 생산하는 것에 초점을 맞춘다. 발생 중인 흉선세포가 4 DN 단계 (DN1, DN2, DN3 및 DN4)를 통해 진행함에 따라, T 세포는 불변 α-쇄를 발현하지만, β-쇄 로커스를 재배열한다. 재배열된 β-쇄가 불변 α-쇄와 성공적으로 쌍형성한 경우에, β-쇄의 재배열을 중지시키고 (및 대안적 대립유전자를 침묵시키고) 세포의 증식을 발생시키는 신호가 생성된다. 이들 신호가 세포 표면에서 이러한 프리-TCR을 필요로 하더라도, 이들은 프리-TCR에 대한 리간드 결합에 의존성이다. 이들 흉선세포는 이어서 CD4 및 CD8 둘 다를 발현할 것이고, α-쇄의 선택이 일어나는 이중 양성 (DP) 단계로 진행한다. 재배열된 β-쇄가 어떠한 신호전달로도 이어지지 않으면 (예를 들어 불변 α-쇄와 쌍형성하지 못하는 결과로서), 세포는 무시 (신호전달의 결여)에 의해 사멸할 수 있다.
본원에 기재된 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 골수 세포 예컨대, 예를 들어, 대식세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포 및 림프계 (예컨대, 예를 들어, T-세포, B-세포, NK-세포)로 발생할 수 있는 전구체 세포이다. HSC는 줄기 세포의 3개 클래스가 존재하는 이종 집단을 가지며, 이는 혈액 내 림프성 대 골수성 자손의 그들의 비 (L/M)에 의해 구별된다.
본 개시내용은 트랜스진의 발현을 위한 유도성 구성요소 및 트랜스진의 발현을 위한 구성적 구성요소를 갖는 시스템을 제공한다. 시스템은 형질도입된 세포 내에 기능적 특징을 제공하기 위한 1종 이상의 트랜스진의 조절된 발현을 제공하도록 맞춤화될 수 있다.
일부 대안에서, 유도성 프로모터의 제어 하의 트랜스진은 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 유도성 프로모터는 후일에 (예를 들어 재발의 경우에) 세포의 재활성화를 제공하면서 세포에서 CAR 발현을 종결시키기 위한 능력을 제공한다. 또한, 온 및 오프 기간을 거친 CAR T 세포의 순환은 T 세포 수용체의 만성 자극으로 인한 소진 및/또는 무반응을 최소화할 수 있다.
벡터의 설계는 또한 형질도입된 세포의 1종 이상의 기능적 특징, 예컨대 형질도입된 세포의 증진된 종양 효력, 생존 및 증식을 증진시킬 수 있는 추가의 트랜스진을 제공한다. 일부 대안에서, 이들 트랜스진은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 이러한 트랜스진은 생존 및 증식을 촉진하는 유전자, 아폽토시스를 방지하는 유전자, 및 체크포인트 신호전달을 조절하는 유전자를 제한 없이 포함한다. 이러한 유전자는 IL-2, IL-15, 케모카인 수용체, Bcl2, CA-Akt, dn-TGF베타RIII, dn-SHP1/2 및/또는 PD-1CD28 키메라를 코딩하는 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진은 IL-2, IL-15, 케모카인 수용체, Bcl2, CA-Akt, dn-TGF베타RIII, dn-SHP1/2 및/또는 PD-1CD28 키메라를 코딩하는 유전자이다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 유전자는 음성 체크포인트 조절인자를 억제하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다.
본 개시내용은 제1 및 제2 핵산, 및 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 포함하는 시스템을 제공한다. 각각의 제1 및 제2 핵산은 특이적 표적 세포를 위한 시스템을 맞춤화하기 위해 삭제 및 다른 구성요소로 대체될 수 있는 수많은 모듈화된 구성요소를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 유전자 (예를 들어 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 발현의 제어를 위한 유도성 프로모터를 필요에 따라 온 및 오프 방식으로 포함한다. 다른 대안에서, 제2 핵산은 전사 활성화인자의 발현을 제공하는 구성적 프로모터를 포함한다. 일부 대안에서, 유전자는 키메라 항원 수용체를 코딩한다.
유도성 시스템.
본 개시내용은 세포에서의 트랜스진의 조절된 발현을 제공하는데 유용한 시스템을 제공한다. 이러한 트랜스진은 T 세포 수용체, 친화도 성숙 T 세포 수용체, 키메라 항원 수용체, 케모카인 수용체, 시토카인, 아폽토시스를 억제하는 유전자, 및/또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 유전자를 제한 없이 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 핵산의 요소의 용이한 치환을 제공하는 다수의 모듈 구성요소를 함유한다. 시스템의 일부 대안에서, 시스템은 세포에서의 트랜스진의 발현의 조절을 제공한다. 일부 대안에서, 트랜스진은 T 세포 수용체, 친화도 성숙 T 세포 수용체, 키메라 항원 수용체, 케모카인 수용체, 시토카인, 아폽토시스를 조절하는 유전자, 및/또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 유전자를 코딩한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 유전자는 음성 체크포인트 조절인자를 억제하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템은, 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 표적 분자는 종양 특이적 항원, 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 대안에서, 발현 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 제1 및/또는 제2 핵산을 포함한다. 키메라 수용체 핵산의 모두 또는 일부에 의해 코딩된 폴리펩티드가 또한 본원에 포함된다.
다른 대안에서, 제1 핵산은 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하며, 여기서 제1 핵산은 세포 생존 및 증식을 촉진하는 유전자, 아폽토시스를 조절하는 유전자 및/또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 이러한 유전자는 IL-2, IL-15, 케모카인 수용체, Bcl2, CA-Akt, dn-TGF베타RIII, dn-SHP1/2 및/또는 PD-1CD28 키메라를 코딩하는 유전자를 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 유전자는 음성 체크포인트 조절인자를 억제하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다.
유도성 프로모터.
시스템은 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산을 포함한다. 유도성 프로모터를 이용함으로써, 트랜스진 발현은 독성 부작용을 회피하고/거나 완화 동안 세포가 휴지되도록 하기 위해 턴 온 및 오프될 수 있다. 여러 유도성 프로모터 시스템이 공지되어 있지만, 이들 시스템의 임상적 적용성은 독성 오프 타겟 효과, 바람직하지 않은 생체분포 및 약역학 프로파일, 제한된 아웃풋 동적 범위 및/또는 제한된 유용성으로 인해 FDA-승인된 상업적으로 입수가능한 제약으로서 제한된다. 게다가, 많은 이들 시스템은 이종 구성요소로부터 구축된 키메라 전사 조절인자를 사용하여, 이들 시스템을 인간 치료제에 적용 시 면역원성의 복잡을 도입한다.
일부 대안에서, 제1 프로모터는 약물에 의해 유도가능하다. 약물은 안전성 기록, 유리한 약동학적 프로파일, 조직 분포, 세포외 공간과 시토졸 사이의 낮은 분배 계수, 낮은 면역원성, 낮은 독성 및/또는 림프구에서의 높은 발현을 기반으로 하여 선택된다. 구체적 대안에서, FDA 승인되고, 림프구에서의 트랜스진 발현을 제공하고, 다른 바람직하지 않은 유전자 발현을 활성화시키지 않고, 어떠한 이종 구성요소도 함유하지 않는 프로모터를 유도하는 약물이 선택된다. 일부 대안에서, 유도성 프로모터는 약물과 상호작용하는 전사 활성화인자에 의해 활성화된다. 전사 활성화인자는 약물의 존재 하에 활성화되거나 또는 유도성 프로모터에 결합하고 그를 활성화시킬 수 있다.
약물의 구체적 대안은 전사 활성화인자의 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인에 결합하는 약물이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜, 그의 대사물, 유사체, 및 그의 제약상 허용되는 염 및/또는 수화물 또는 용매화물을 포함한다.
타목시펜, CAS RN:10540-29-1은 또한 2-(4-((1Z)-1,2-디페닐-1-부테닐)페녹시)-N,N-디메틸-에탄아민 또는 (Z)-2-(파라-(1,2-디페닐-1-부테닐)페녹시)-N,N-디메틸아민 (IUPAC)으로 공지되어 있고, 분자식 C26H29NO, M.W. 371.52를 갖는다. 타목시펜은 조직-특이적 활성을 갖는 선택적 에스트로겐 수용체 조정인자이다. 타목시펜은 유방 조직에서 항-에스트로겐 (억제제) 작용제로서 작용하지만, 콜레스테롤 대사, 골 밀도 및 자궁내막의 세포 증식에서는 에스트로겐 (자극제)으로서 작용한다. 타목시펜은 빈번하게 제약상 허용되는 염으로서 경구로 투여된다. 예를 들어, 타목시펜 시트레이트 (RN 54965-24-1, M.W. 563.643)는 전이성 유방암의 치료를 위해, 여성에서 유방절제술 액와 절개 및 유방 조사 후 유방암의 치료를 위한 보조제로서 처방된다. 타목시펜 시트레이트는 또한 유방암에 대한 고위험의 여성에서 유방암의 발생률을 감소시키기 위해 처방된다.
주요 대사물 N-데스메틸타목시펜 (RN 31750-48-8, M.W. 357.494) 및 4-히드록시타목시펜 (4-OHT) (RN 68392-35-8, M.W. 387.52, 아피목시펜)을 포함하는, 래트, 마우스 및 인간 유방암 환자에서의 타목시펜의 대사물이 문헌 [Robinson et al., Metabolites, pharmacodynamics, and pharmacokinetics of tamoxifen in rats and mice compared to the breast cancer patient]에 개시되어 있다. 문헌 [Drug Metab Dispos January 1991 19:36-43]은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가의 시토크롬 P-450 대사물은 [Crewe et al., 2002]에 개시되어 있고, 시스-4-히드록시타목시펜 (RN 174592, M.W. 387.52; 아피목시펜, E-이성질체) 및 4'-히드록시타목시펜 ((Z)-4-(1-(4-(2-(디메틸아미노)에톡시)페닐)-1-페닐부트-1-엔-2-일)페놀)을 포함한다. 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Crewe et al., 2002, Metabolism of Tamoxifen by recombinant human cytochrome P-450 enzymes: Formation of the 4-hydroxy, 4'-hydroxy and N-desmethyl metabolites and isomerization of trans-4-hydroxytamoxifen, Drug Metab Dispos, 30(8): 869-874, FIG. 1]을 참조한다.
타목시펜에 대한 구조적 유사성을 갖는 화합물은 시스-타목시펜 (RN 13002-65-8, M.W. 371.521), 4-메틸타목시펜 (RN 73717-95-5, M.W. 385.548), N-데스메틸타목시펜 (RN 31750-48-8, M.W. 357.494), (Z)-데스에틸 메틸 타목시펜 (RN 15917-50-7, M.W. 357.494), (E)-데스에틸 메틸 타목시펜 (RN 31750-45-5, M.W. 357.494), 트랜스-4-히드록시타목시펜 (RN 68047-06-3, M.W. 387.52), 아피목시펜 (RN 68392-35-8, M.W. 387.52, 4-히드록시타목시펜), 아피목시펜, E-이성질체 (RN 174592-47-3, M.W. 387.52), 4-클로로타목시펜 (RN 77588-46-6, M.W. 405.966), 4-플루오로타목시펜 (RN 73617-96-6, M.W. 389.511), 토레미펜 (RN 89778-26-7, M.W. 405.966), 데스에틸 타목시펜 (RN 19957-51-8, M.W. 343.47), (E)-데스에틸 타목시펜 (RN 97151-10-5, M.W. 343.47), (Z)-데스에틸 타목시펜 (RN 97151-11-6, M.W. 343.47), 미프록시펜 (RN 129612-87-9, M.W. 429.6), 2-(p-(베타-에틸-알파-페닐스티릴)페녹시)트리에틸아민 (RN 749-86-0, M.W. 399.575), 드롤록시펜 (RN 82413-20-5, M.W. 387.52), 4-아이오도-타목시펜 (RN 116057-68-2, M.W. 497.413), 디히드로타목시펜 (RN 109640-20-2, M.W. 373.537), (E)-N,N-디메틸-2-(4-(1-(2-메틸페닐)-2-페닐-1-부테닐)페녹시)에탄아민 (RN 97150-96-4, M.W. 385.548)또는 4-히드록시토레미펜 (RN 110503-62-3, M.W. 421.965); 및/또는 그의 제약상 허용되는 염 및 /또는 수화물 또는 용매화물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 타목시펜의 시트레이트 염, 또는 타목시펜에 대한 구조적 유사성을 갖는 화합물의 시트레이트 염은 타목시펜 시트레이트 (RN 54965-24-1, M.W. 563.64), 2-(p-(1,2-디페닐-1-부테닐)페녹시)-N,N-디메틸에틸아민 시트레이트 (RN 7244-97-5, 563.64), (E)-타목시펜 시트레이트 (RN 76487-65-5, M.W. 563.64), 토레미펜 시트레이트 (RN 89778-27-8, M.W. 598.088), 드롤록시펜 시트레이트 (RN 97752-20-0, M.W. 579.64), 2-(p-(1,2-비스(p-메톡시페닐)-1-부테닐)페녹시)트리에틸아민 시트레이트 (RN 42920-39-8, M.W. 651.748), 2-(4-(1,2-디페닐에테닐)페녹시)-N,N-디에틸-에탄아민 2-히드록시-1,2,3-프로판트리카르복실레이트 (RN 40297-42-5, M.W. 563.643), 2-(p-(알파-페닐스티릴)페녹시)트리에틸아민 시트레이트 (RN 102433-95-4, M.W. 563.64), 2-(p-(2-(p-메톡시페닐)-1-페닐-1-부테닐)페녹시)트리에틸아민 시트레이트 (1:1) (RN 42824-34-0, M.W. 637.72), 2-(p-(1-(p-메톡시페닐)-2-페닐프로페닐)페녹시)트리에틸아민 시트레이트 (RN 13554-24-0, M.W. 607.696), 2-(p-(알파-(p-메톡시페닐)스티릴)페녹시)트리에틸아민 시트레이트 1수화물 (RN 13542-71-7, M.W. 593.669), 2-(p-(p-메톡시-알파-페닐페네틸) 페녹시)트리에틸아민 시트레이트 (RN 16421-72-0, M.W. 595.685), 알파-(p-(2-(디에틸아미노)에톡시)페닐)-베타-에틸-p-메톡시-알파-페닐페네틸 알콜 시트레이트 (1:1) (RN 35263-93-5, M.W. 639.737), 1-(p-(2-(디에틸아미노)에톡시)페닐)-2-(p-메톡시페닐)-1-페닐에탄올 시트레이트 (M.W. 611.68), 알파-p-(2-(디에틸아미노)에톡시)페닐)-베타-에틸-알파-(p-히드록시페닐)-p-메톡시페네틸 알콜 시트레이트 (RN 35263-96-8, M.W. 655.737) 및/또는 2-(p-(p-메톡시-알파-메틸페네틸)페녹시)-트리에틸아민 시트레이트 (RN 15624-34-7, M.W. 533.614)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 대안에서, 발현을 유도하는 약물의 유효량은 비유도 및/또는 기저 수준의 발현을 초과하는 트랜스진 발현의 증가를 제공하는 양이다. 일부 대안에서, 이러한 양은 약물의 공지된 투여량 및 약동학적 프로파일을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
일부 대안에서, 유도성 프로모터는 낮은 수준의 기저 활성을 갖는다. 렌티바이러스 벡터가 사용되는 경우에, 비유도 세포에서의 기저 활성의 수준은 세포가 유전자를 발현하도록 유도된 경우와 비교 시 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만이다. 기저 활성의 수준은 유동 세포측정법을 사용하여 유도인자 (예를 들어 약물)의 부재 하에 트랜스진 (예를 들어 마커 유전자)의 발현의 양을 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다.
일부 대안에서, 유도성 프로모터는 비유도된 또는 기저 활성과 비교 시 높은 수준의 유도된 활성을 제공한다. 일부 대안에서, 유도된 상태에서의 활성의 수준은 비유도된 상태에서의 활성 수준보다 2, 4, 6, 8 또는 10배 또는 그 초과로 더 크다. 일부 대안에서, 유도성 프로모터의 제어 하의 트랜스진 발현은 전사활성인자의 부재 하에 0일을 제외하고 10, 8, 6, 4, 2 또는 1일 미만 내에 턴 오프된다.
일부 대안에서, 유도성 프로모터는 기저 활성의 낮은 수준, 유도성의 높은 수준 및/또는 가역성을 위한 짧은 시간을 제공하도록 설계 및/또는 변형될 수 있다. 일부 대안에서, 유도성 프로모터는 7xHBD/mE1b 프로모터이다. 프로모터에 대한 예시적인 서열은 표 12 (서열식별번호: 41)에서 발견된다. 예를 들어, 7xHBD/mE1b 프로모터에서, 돌연변이는 전사 활성화인자의 결합이 증진되게 할 수 있다.
일부 대안에서, 시스템은, 약물 (예를 들어 타목시펜)의 존재 하에, 트랜스진의 상류의 합성 프로모터에 결합하여 발현을 유도하는 합성 전사 활성화인자를 사용한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 TamR-tf (HEA3)이다. 타목시펜 조절된 전사 인자 ("TamR-tf", 또한 "HEA3"으로도 지정됨)는 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ER-LBD)의 돌연변이체 타목시펜-특이적 리간드 결합 도메인에 인 프레임으로 융합되고, 다시 NF-κB의 p65 활성화 도메인 (p65)에 융합된, 간세포 핵 인자 1-알파 (HNF-1α)의 N-말단 DNA 결합 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 40의 아미노산 1-281)을 포함하는 인간 서브유닛으로 구성된 키메라 전사 인자이다. 예시적인 아미노산 서열은 표 10에 제공되고, 서열식별번호: 40으로 확인된다. 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ER-LBD)의 돌연변이체 타목시펜-특이적 리간드 결합 도메인은 TamR-tf의 아미노산 282-595에서 발견되고, 위치 521에서 돌연변이를 갖는다. NF-κB의 p65 활성화 도메인 (p65 또는 TAD)은 아미노산 596 내지 862에서 발견된다.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 시스템은 약물의 존재 하에 트랜스진의 상류의 합성 프로모터에 결합하여 발현을 유도하는 합성 전사 활성화인자를 사용한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 TamR-tf (HEA3)이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜이다.
전사 인자의 특성을 증가시키기 위해 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인에서 1개 이상의 아미노산을 변경시키는 것 및/또는 p65 전사활성화 도메인에서 1개 이상의 아미노산을 변경시키는 것을 제한 없이 포함하는 추가의 변화가 전사 활성화인자에 대해 이루어질 수 있다. 에스트로겐 수용체 결합 도메인의 아미노산을 변경시키는 것은 전사 활성화인자에 대한 약물의 보다 특이적인 결합을 제공할 수 있다. ER-LBD 내 변경된 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화인자의 예는 표 11에 제시된다 (서열식별번호: 43). 돌연변이는 서열식별번호: 40의 아미노산 위치 400, 543 및 544에서 만들어진다. 변경된 서열을 갖는 전사 활성화인자는 타목시펜 또는 4-OHT에 대한 증가된 친화도를 갖는다. p65 전사활성화 도메인 내 아미노산을 변경시키는 것은 형질도입된 세포의 활성화의 부재 하의 트랜스진의 증가된 발현을 제공할 수 있다.
타목시펜의 부재 하에, TamR-tf는 시토졸 열-쇼크 단백질 90 (HSP90)의 타목시펜 결합 활성 부위에의 결합에 의해 핵으로부터 제외되고, 트랜스진 발현은 "오프" 상태가 된다. 나노몰 농도의 시토졸 타목시펜은 ER-LBD 결합에 대해 HSP90을 적극적으로 능가하며, 핵으로의 TamR-tf 전위를 발생시킨다. 핵 전위 시, TamR-tf는 그의 제한된 합성 프로모터에 결합하는데 용이하게 이용가능하다. 타목시펜의 존재 하에, 7xHBD/EF1αp 프로모터에 대한 TamR-tf의 결합은 트랜스진 발현의 "온" 상태를 유도한다. 일부 대안에서, 이러한 전사 조절인자는 다양한 수준의 트랜스진 발현 제어를 제공하도록 변형될 수 있다. TamR-tf (HEA-3)의 LBD에서의 아미노산 치환은 타목시펜 및 그의 대사물에 대한 선택적 반응성을 허용하며, 여기서 4-히드록시 타목시펜 (4-OHT)은 내인성 에스트로겐과의 상호작용이 결여된 한편 TamR-tf (HEA-3) 활성과 관련하여 가장 약리적으로 활성인 대사물이다.
일부 대안에서, 유도성 프로모터는 렌티바이러스 구축물에서 및/또는 림프구에서 기능한다.
키메라 항원 수용체.
키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템은 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산을 포함한다. 다른 대안에서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드는 구성적 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜이다.
리간드 결합 도메인.
일부 대안에서, 키메라 수용체 핵산은 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 종양 또는 바이러스 특이적 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 리간드 결합 도메인은 인간화될 수 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 수용체 또는 그의 부분, 작은 펩티드, 펩티드모방체, 기질, 시토카인 등을 제한 없이 포함한다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 또는 그의 단편, 바람직하게는 그의 결합 단편이며, 이들 중 임의의 것은 인간화될 수 있다. 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산 서열은 용이하게 결정될 수 있다. 구체적 대안에서, 폴리뉴클레오티드는 CD19에 특이적으로 결합하는 단일 쇄 Fv를 코딩한다. 다른 구체적 대안에서, 폴리뉴클레오티드는 HER2, CE7, hB7H3 또는 EGFR에 특이적으로 결합하는 단일 쇄 Fv를 코딩하고, 임의로 상기 폴리뉴클레오티드는 그의 인간화 버전을 코딩한다. 이들 항체 및 그의 결합 도메인의 서열은 공지되어 있거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
종양 항원은 면역 반응을 도출하는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 본 발명의 리간드 결합 도메인의 선택은 치료될 암의 유형에 따라 달라질 것이고, 종양 항원 또는 다른 종양 세포 표면 분자를 표적화할 수 있다. 대상체로부터의 종양 샘플은 특정 바이오마커 또는 세포 표면 마커의 존재에 대해 특징화될 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터의 유방암 세포는 각각의 Her2Neu, 에스트로겐 수용체 및/또는 프로게스테론 수용체에 대해 양성 또는 음성일 수 있다. 개별 대상체의 종양 세포 상에서 발견된 종양 항원 또는 세포 표면 분자가 선택된다. 종양 항원 및 세포 표면 분자는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 암배아성 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, CE7, hB7H3, ROR1, 메소텔린, c-Met, GD-2 및/또는 MAGE A3 TCR을 포함한다. 일부 대안에서, 표적 분자는 종양 세포에서 발견되고 정상 조직에서는 실질적으로 발견되지 않거나, 그의 발현이 비-생체 정상 조직으로 제한되는 세포 표면 분자이다.
하나의 대안에서, 종양 상의 표적 분자는 악성 종양과 연관된 1종 이상의 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 T 세포 수용체 또는 키메라 수용체 매개되는 인식에 대한 표적 항원으로서 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 다른 표적 분자는 세포 형질변환-관련 분자 예컨대 종양유전자 HER-2/Neu/ErbB2의 군에 속한다. 일부 대안에서, 종양 항원은 동일한 조직 유형의 대조군 세포와 비교 시 종양 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과다발현된다. 다른 대안에서, 종양 항원은 세포 표면 폴리펩티드이다.
일단 키메라 수용체로 표적화될 수 있는 종양 세포 표면 분자가 확인되면, 표적 분자의 에피토프가 선택되고 특징화된다. 종양 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 모노클로날 항체를 수득하는 방법, 파지 디스플레이의 방법, 인간 또는 인간화 항체를 생성하는 방법, 또는 인간 항체를 생산하기 위해 조작된 트랜스제닉 동물 또는 식물을 사용하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 부분 또는 완전 합성 항체의 파지 디스플레이 라이브러리가 이용가능하고, 표적 분자에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편에 대해 스크리닝될 수 있다. 인간 항체의 파지 디스플레이 라이브러리가 또한 이용가능하다. 일부 대안에서, 항체는 종양 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하고, 비특이적 구성요소 예컨대 소 혈청 알부민 또는 다른 비관련 항원과 교차 반응하지 않는다. 일단 확인되면, 항체를 코딩하는 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 단리 및/또는 결정될 수 있다.
항체 또는 항원 결합 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 미니바디와 선형 항체의 모두 또는 일부를 포함한다. "항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하고, 용이하게 제조될 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 일부 대안에서 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 또는 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체이다. 임의의 이러한 상기 언급된 항체 또는 항체 단편은 인간화될 수 있고 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다.
일부 대안에서, 특정한 종양 세포 표면 분자에 결합하는 다수의 상이한 항체는 단리되고 특징화될 수 있다. 일부 대안에서, 항체는 표적화된 분자의 에피토프 특이성을 기반으로 하여 특징화된다. 또한, 일부 경우에서, 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 그 에피토프에 대한 항체의 친화도를 기반으로 하여 선택될 수 있다. 일부 대안에서, 항체는 적어도 1 mM, 바람직하게는 <50 nM의 친화도를 갖는다. 일부 대안에서, 항체는 50 nM, 100 nM, 200 nM, 300nM 400 nM, 500 nM, 1uM, 100uM, 200uM, 300uM, 400uM, 500uM, 600uM, 700 uM, 800uM, 900uM 또는 1mM의 친화도 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 친화도를 갖는다. 일부 대안에서, 다른 항체와 비교 시 에피토프에 대해 더 높은 친화도를 갖는 항체가 선택된다. 예를 들어, 동일한 에피토프에 결합하는 참조 항체보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 또는 적어도 50배 더 큰 친화도 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내에서 참조 항체보다 더 큰 친화도를 갖는 항체가 선택된다.
일부 대안에서, 표적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CE7, hB7H3, EGFR, CD123, CS-1, ROR1, 메소텔린, Her2, c-Met, PSMA, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 이들 표적 분자에 특이적인 항체 또는 그의 결합 단편은 인간화된다.
구체적 대안에서, 표적 항원은 CD19이다. CD19에 특이적인 다수의 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특징화될 수 있다. 구체적 대안에서, 키메라 수용체 구축물은 FMC63 항체로부터의 scFV 서열을 포함한다. 다른 대안에서, scFV는 RASQDISKYLN (서열식별번호: 88)의 CDRL1 서열, SRLHSGV(서열식별번호: 89)의 CDRL2 서열 및 GNTLPYTFG (서열식별번호: 90)의 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화 ScFv이다. 다른 대안에서, scFV는 DYGVS (서열식별번호: 91)의 CDRH1 서열, VIWGSETTYYNSALKS (서열식별번호: 92)의 CDRH2 서열 및 YAMDYWG (서열식별번호: 93)의 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화 ScFv이다. 본 개시내용은 또한 FMC63에 대한 scFv의 것에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고 CD19에 대해 적어도 동일한 친화도를 갖는 가변 영역을 고려한다.
일부 대안에서, CDR 영역은 다음과 같은 카바트에 의해 넘버링된 바와 같은 항체 영역 내에서 발견된다: 경쇄의 경우에; CDRL1 아미노산 24-34; CDRL2 아미노산 50-56; CDRL3 아미노산 89-97; 중쇄의 경우에 CDRH1 아미노산 31-35; CDRH2 아미노산 50-65; 및 CDRH3 아미노산 95-102. 항체 내 CDR 영역은 용이하게 결정될 수 있다.
구체적 대안에서, 표적 항원은 Her2이다. Her2에 특이적인 다수의 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특징화될 수 있다. 구체적 대안에서, 키메라 수용체 구축물은 헤르셉틴 항체로부터의 scFV 서열을 포함한다. 다른 대안에서, scFV는 헤르셉틴 항체의 CDRL1 서열, CDRL2 서열 및 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화 ScFv이다. 다른 대안에서, scFV는 헤르셉틴의 CDRH1 서열, CDRH2 및 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화 ScFv이다. CDR 서열은 용이하게 헤르셉틴의 아미노산 서열로부터 결정될 수 있다. 본 개시내용은 또한 헤르셉틴에 대한 scFv의 것에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고 Her2에 대해 적어도 동일한 친화도를 갖는 가변 영역을 고려한다.
본원에 기재된 "인간화 항체"은 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산되는 항체 변이체와 그의 유사성을 증가시키기 위해 변형시킨 비-인간 종으로부터의 항체를 지칭한다. "인간화"의 과정은 인간에의 투여를 위해 개발된 모노클로날 항체 (예를 들어, 항암 약물로서 개발된 항체)에 적용될 수 있다. 인간화는 특이적 항체를 개발하는 과정이 비-인간 면역계 (예컨대 마우스 내 면역계)의 활용을 수반하는 경우에 바람직할 수 있다. 이러한 방식으로 생산된 항체의 단백질 서열은 인간에서 자연적으로 발생하는 상동 항체와 부분적으로 구분되고, 따라서 인간 환자에게 투여될 때 잠재적으로 면역원성이다. 인간화 항체는 인간 항체와 보다 유사하게 이루어진 단백질 서열을 갖지만 비-인간 단백질의 보다 큰 스트레치를 보유할 수 있다는 점에서 키메라 항체와 구분된다. 인간화 항체의 유도체는 인간화 항체로부터 유래된 항체 또는 서열의 절편을 지칭할 수 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 인간화 항체 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 scFv를 포함한다. 일부 대안에서, scFv는 인간화 scFv이다.
인간화는 일부 대안에서 이종 공급원, 예컨대, 예를 들어, 설치류로부터 유래된 모노클로날 항체의 면역원성을 감소시키기기 위해 바람직할 수 있다. 인간화는 일부 대안에서 항체 또는 그의 단편과 인간 면역계와의 상호작용을 개선시키도록 하는데 또한 바람직하다. 하이브리도마 기술의 개발로 인해, 수많은 이종 항체가 인간에서 매우 면역원성이고, 이는 특히 투여가 반복될 필요가 있을 때 그의 임상을 궁극적으로 제한할 수 있다. 추가적으로, 이들은 순환으로부터 신속하게 제거될 수 있고, 뿐만 아니라 전신 염증 효과를 유발할 수 있다. 따라서 이들 상황을 회피하기 위해 일부 대안에서 인간화 전략이 바람직하다. 항체 인간화를 위한 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
일부 대안에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한, 용이한 절제 및 상이한 항원을 코딩하거나 또는 상이한 결합 특성을 갖는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 의한 폴리뉴클레오티드의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1개 이상의 제한 효소 부위를 가질 수 있다. 예를 들어, 제한 부위, NheI는 리더 서열의 상류를 코딩하고; 힌지 영역 내에 위치한 3' RsrII는 키메라 수용체 벡터 내로의 임의의 바람직한 scFv의 서브클로닝을 허용한다. 일부 대안에서, 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
일부 대안에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 신호 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 신호 펩티드는 과립구 콜로니 자극 인자에 대한 신호 펩티드이다. 다른 신호 펩티드 예컨대 CD8 알파를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 이용될 수 있다. 일부 대안에서, 폴리뉴클레오티드는 CD8 알파를 코딩한다.
일부 대안에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 포유동물 세포에서 키메라 항원 수용체의 발현을 제공하는 프로모터가 선택된다. 구체적 대안에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다.
리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 구체적 대안은 CD19에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 FMC63으로부터의 scFv로서 표 1에 제시된다. 아미노산 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 94)를 포함하는 가요성 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 scFV에서 VH 및 VL 쇄를 분리한다. 링커를 포함한 scFv의 아미노산 서열은 표 2에 제시된다 (서열식별번호: 11). 다른 CD19-표적화 항체 예컨대 SJ25C1 및 HD37은 공지되어 있다. (SJ25C1: Bejcek et al. Cancer Res 2005, PMID 7538901: HD37: Pezutto et al. JI 1987, PMID 2437199).
스페이서.
일부 대안에서, 키메라 수용체 핵산은 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 전형적으로 스페이서 영역은 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에서 발견된다. 일부 대안에서, 스페이서 영역은 리간드 결합 도메인의 가요성을 제공하고, 림프구에서의 높은 발현 수준을 허용한다. 229개 아미노산의 스페이서 도메인을 갖는 CD19-특이적 키메라 수용체는 단지 변형된 IgG4 힌지로 구성된 짧은 스페이서 영역을 갖는 CD19-특이적 키메라 수용체보다 더 낮은 항종양 활성을 가졌다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다.
일부 대안에서, 스페이서 영역은 적어도 10 내지 229개 아미노산, 10 내지 200개 아미노산, 10 내지 175개 아미노산, 10 내지 150개 아미노산, 10 내지 125개 아미노산, 10 내지 100개 아미노산, 10 내지 75개 아미노산, 10 내지 50개 아미노산, 10 내지 40개 아미노산, 10 내지 30개 아미노산, 10 내지 20개 아미노산 또는 10 내지 15개 아미노산 또는 상기 언급된 아미노산 길이 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 길이를 갖는다. 일부 대안에서, 스페이서 영역은 12개 아미노산 이하, 119개 아미노산 이하 또는 229개 아미노산 이하, 그러나 1 또는 2개 아미노산 초과를 갖는다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다.
일부 대안에서, 스페이서 영역은 이뮤노글로불린 유사 분자의 힌지 영역으로부터 유래된다. 일부 대안에서, 스페이서 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4로부터의 힌지 영역의 모두 또는 일부를 포함하고, 1개 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 힌지 영역의 예시적인 서열은 표 8에 제공된다. 일부 대안에서, 힌지 영역의 일부는 가변 중쇄와 코어 사이에서 발견되는 상부 힌지 아미노산, 및 폴리프롤린 영역을 포함하는 코어 힌지 아미노산을 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다.
일부 대안에서, 힌지 영역 서열은 바람직하지 않은 구조적 상호작용 예컨대 이량체화를 회피하기 위해 1개 이상의 아미노산에서 변형될 수 있다. 구체적 대안에서, 스페이서 영역은, 예를 들어, 표 2 또는 표 8에 제시된 바와 같은 IgG4로부터 변형된 인간 힌지 영역의 일부 (서열식별번호: 21)를 포함한다. 변형된 IgG4 힌지 영역의 일부를 코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오티드가 표 1에 제공된다 (서열식별번호: 4). 일부 대안에서, 힌지 영역은 표 2 또는 표 8에서 확인되는 힌지 영역 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성, 또는 열거된 퍼센트 서열 동일성 중 임의의 2개 사이의 임의의 다른 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 구체적 대안에서, IgG4로부터의 인간 힌지 영역의 일부는 CPSP에서부터 CPPC까지의 코어 아미노산에서 아미노산 치환을 갖는다.
일부 대안에서, 힌지 영역의 모두 또는 일부는 이뮤노글로불린의 불변 영역의 1개 이상의 도메인과 조합된다. 예를 들어, 힌지 영역의 일부는 CH2 또는 CH3 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부와 조합될 수 있다. 일부 대안에서, 스페이서 영역은 CD8알파로부터의 47-48 아미노산 힌지 영역 서열 또는 CD28 분자의 세포외 부분으로 이루어지는 스페이서 영역을 포함하지 않는다.
일부 대안에서, 짧은 스페이서 영역은 12개 아미노산 이하를 갖고 IgG4 힌지 영역 서열 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함하고, 중간형 스페이서 영역은 119개 아미노산 이하를 갖고 IgG4 힌지 영역 서열 및 CH3 영역 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함하고, 긴 스페이서는 229개 아미노산 이하를 갖고 IgG4 힌지 영역 서열, CH2 영역 및 CH3 영역 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함한다. 일부 대안에서, 짧은 스페이서 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 아미노산 또는 상기 언급된 아미노산 길이 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 크기를 갖는다. 일부 대안에서, 중간 스페이서 영역은 13, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 119개 아미노산 또는 상기 언급된 아미노산 길이 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 크기를 갖는다. 일부 대안에서, 스페이서 영역은 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210 또는 219개 아미노산 또는 상기 언급된 아미노산 길이 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 크기를 갖는다.
스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열로부터 합성 또는 재조합 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 일부 대안에서, 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 막횡단 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한, 용이한 절제 및 상이한 스페이서 영역을 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 의한 폴리뉴클레오티드의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1개 이상의 제한 효소 부위를 가질 수 있다. 일부 대안에서, 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
한 대안에서, 스페이서 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 그의 일부로부터의 힌지 영역 서열, CH2 영역 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부와 조합된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 힌지 영역 서열, CH3 영역 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부와 조합된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 힌지 영역 서열, 및 CH2 영역 또는 그의 변이체 및/또는 CH3 영역 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부와 조합된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 힌지 영역 서열이다. 일부 대안에서, 짧은 스페이서 영역은 12개 아미노산 이하이지만 1 또는 2개 아미노산 초과를 갖는 변형된 IgG4 힌지 서열이고 (서열식별번호: 4), 중간형 서열은 119개 아미노산 이하이지만 1 또는 2개 아미노산 초과를 갖는 CH3 서열을 갖는 IgG4 힌지 서열 (서열식별번호: 62); 또는 229개 아미노산 이하이지만 1 또는 2개 아미노산 초과를 갖는 CH2 및 CH3 영역을 갖는 IgG4 힌지 서열 (서열식별번호: 50)이다.
막횡단 도메인.
일부 대안에서, 키메라 수용체 핵산은 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 막횡단 도메인은 막에서의 키메라 수용체의 고정을 제공한다.
한 대안에서, 키메라 수용체 내 도메인 중 1개와 자연적으로 회합된 막횡단 도메인이 사용된다. 일부 경우에서, 막횡단 도메인은 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 결합하는 것을 회피하여 다른 수용체 복합체의 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 선택되거나 또는 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다.
막횡단 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우에, 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다.
막횡단 영역은 적어도 T-세포 수용체, CD28, CD3, CD45, CD4, CD8, CD9, CD16, CD22; CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및/또는 CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막횡단 영역(들)을 포함한다. 구체적 대안에서, 막횡단 도메인은 표 2에 제시된 바와 같은 CD28 막횡단 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. CD28 막횡단 도메인을 코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시된다 (서열식별번호: 5).
막횡단 도메인은 합성 또는 자연 발생 막횡단 도메인의 변이체일 수 있다. 일부 대안에서, 합성 또는 변이체 막횡단 도메인은 우세하게 소수성 잔기 예컨대 류신 및 발린을 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 표 2 또는 표 6에 제시된 바와 같은 막횡단 도메인과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성 또는 임의의 2개의 상기 언급된 값에 의해 규정된 범위 내의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 변이체 막횡단 도메인은 바람직하게는 카이트 둘리틀에 의해 계산 시 적어도 50의 소수성 점수를 갖는다.
막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 합성 또는 재조합 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포내 신호전달 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한, 용이한 절제 및 상이한 막횡단 도메인을 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 의한 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1개 이상의 제한 효소 부위를 가질 수 있다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다.
세포내 신호전달 도메인.
일부 대안에서, 키메라 수용체 핵산은 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 종양 세포 상에 발현된 리간드에의 결합 시 키메라 수용체를 발현하는 형질도입된 세포의 1종의 기능의 활성화를 제공한다. 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 형질도입된 세포의 적어도 1종의 기능의 활성화를 제공하는 세포내 신호전달 도메인의 일부 및/또는 변이체이다.
본 개시내용의 키메라 수용체에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 CD3 제타 쇄 및/또는 키메라 수용체 관여 후 협력하여 신호 전달을 개시하는 작용을 하는 보조-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다. T 세포 활성화는 2종의 구분되는 부류의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개되는 것으로 언급될 수 있다: 항원-의존성 1차 활성화를 개시하고 T 세포 수용체 유사 신호를 제공하는 것 (1차 세포질 신호전달 서열) 및 항원-비의존성 방식으로 작용하여 2차 또는 공동-자극 신호를 제공하는 것 (2차 세포질 신호전달 서열). 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및/또는 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 일부 대안에서, 1차 신호전달 세포내 도메인은 표 2에 제공된 서열을 갖는 CD3제타에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성 또는 적어도 열거된 퍼센트 서열 동일성 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 대안에서, CD3 제타의 변이체는 도 7에 제시된 바와 같은 적어도 1, 2, 3개 또는 모든 ITAM 영역을 보유한다.
바람직한 대안에서, 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인을 단독으로 또는 임의의 다른 목적하는 세포질 도메인(들)과 조합하여 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 CD3제타 쇄 및 공동자극 신호전달 영역을 포함할 수 있다.
공동자극 신호전달 영역은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체의 일부를 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 그들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40, CD30, CD40, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-l), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 제타 쇄 회합 단백질 키나제 (ZAP70) 및/또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 일부 대안에서, 공동자극 신호전달 도메인은 표 5에 제시된 바와 같은 CD28의 세포내 도메인에 대해 또는 표 2에 제공된 서열을 갖는 4-1BB에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성 또는 적어도 열거된 퍼센트 서열 동일성 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내인 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 한 대안에서, CD28 세포내 도메인의 변이체는 위치 186-187에서 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 LL은 GG로 치환된다.
키메라 수용체의 세포내 신호전달 서열은 무작위 또는 명시된 순서로 서로에 연결될 수 있다. 일부 대안에서, 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 연결을 형성할 수 있다. 하나의 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부 및 CD28의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함한다. 또 다른 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부 및 4-lBB의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함한다. 또 다른 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부, CD28의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부, 및 4-lBB의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함한다. 구체적 대안에서, CD3제타의 변이체 및 4-1BB 세포내 신호전달 도메인의 일부를 포함하는 세포내 신호전달 도메인의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다. 대표적인 핵산 서열은 표 1 (서열식별번호: 6; 서열식별번호: 7)에 제공된다. 일부 대안에서, 핵산 서열은 서열식별번호: 6에 제시된 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 핵산 서열은 서열식별번호: 7에 제시된 서열을 포함한다.
한 대안에서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CD3제타 도메인의 일부에 연결된 4-1BB 세포내 도메인을 포함한다. 다른 대안에서, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD28 세포내 도메인은 CD3 제타 도메인의 일부에 연결된다.
세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열로부터 합성 또는 재조합 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한, 용이한 절제 및 상이한 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 의한 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1개 이상의 제한 효소 부위를 가질 수 있다. 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다.
마커 서열.
일부 대안에서, 시스템은 유도성 프로모터의 제어 하의 1종 이상의 마커 서열을 추가로 포함한다. 마커 서열은 형질도입된 세포의 선택 및/또는 형질도입된 세포의 확인을 제공할 수 있다. 일부 대안에서, 마커 서열은 형질도입된 세포의 선택 및/또는 형질도입된 세포의 확인을 위한 것이다. 일부 대안에서, 마커 서열은 링커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 링커 서열은 절단가능한 링커 서열이다. 일부 대안에서, 링커는 절단가능한 T2A 링커이다.
다수의 다양한 마커 서열이 사용될 수 있다. 전형적으로 마커 서열은 형질도입된 세포의 선택 및/또는 형질도입된 세포의 검출을 허용하는 기능적 특징을 갖는다. 일부 대안에서, 마커 서열은 인간 림프구의 형질도입과 상용성이다. 일부 대안에서, 마커 서열은 형질도입된 세포의 선택 및/또는 형질도입된 세포의 검출을 허용한다.
양성 선택 마커는 숙주 세포에의 도입 시 유전자를 보유하는 세포의 양성 선택을 허용하는 우성 표현형을 발현하는 유전자일 수 있다. 이 유형의 유전자는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 특히 히그로마이신 B에 대한 저항성을 부여하는 히그로마이신-B 포스포트랜스퍼라제 유전자 (hph), 항생제 G418에 대한 저항성을 코딩하는 Tn5로부터의 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자 (neo 또는 aph), 메토트렉세이트에 대한 저항성을 제공하는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자, DHFR dm (표 14, 서열식별번호: 46 및 서열식별번호: 47의 예시적인 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열), 퓨로마이신에 대한 저항성을 제공하는 pac 유전자, 제오신을 불활성화시키는 Sh ble 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자 (ADA), 및 다중-약물 저항성 (MDR) 유전자를 포함한다. 이들 작용제의 존재 하에 배양된 형질도입된 세포는 생존하고 선택될 것이다.
한 대안에서, 제1 핵산은 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 한 대안에서, 마커 서열은 표 2에 제시된 바와 같은 말단절단된 표피 성장 인자 수용체이다. 말단절단된 표피 성장 인자 수용체에 대한 예시적인 폴리뉴클레오티드는 표 1에 제시된다 (서열식별번호: 9). 일부 대안에서, 마커 서열은 말단절단된 Her2 서열이다. 말단절단된 Her2 서열에 대한 예시적인 폴리뉴클레오티드 및 아미노산은 표 13에 제시되고, 각각 서열식별번호: 44 및 서열식별번호: 45로 제공된다.
일부 대안에서, 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 링커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 구체적 대안에서, 링커 서열은 표 2에 제시된 바와 같은, 절단가능한 링커 서열 T2A이다. T2A 링커를 코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오티드 서열은 표 1에 제공된다 (서열식별번호: 8)
마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열로부터 합성 또는 재조합 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 일부 대안에서, 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한, 용이한 절제 및 상이한 마커 서열을 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 의한 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1개 이상의 제한 효소 부위를 가질 수 있다. 일부 대안에서, 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
일부 대안에서, 2종 이상의 마커 서열이 사용될 수 있다. 일부 대안에서, 제1 마커 서열은 구성적 프로모터의 제어 하에 있고, 형질도입된 세포가 트랜스진을 발현하고 있는 표시를 제공한다. 다른 대안에서, 제2 마커 서열은 유도성 프로모터의 제어 하에 있고, 트랜스진 발현이 유도되었다는 표시를 제공한다. 일부 대안에서, 유도성 프로모터의 제어 하의 마커는 유도성 프로모터의 제어 하에 보다 낮은 마커 서열의 발현을 갖는 세포를 선택함으로써 다른 세포에서보다 비유도된 또는 기저 발현이 훨씬 낮은 세포를 선택하고 그러한 세포를 추가의 적용을 위해 확장시키는데 사용될 수 있다.
유도성 프로모터의 제어 하의 다른 유전자 구성요소.
일부 대안에서, 제1 핵산은 유도성 프로모터의 제어 하의 생존 및 증식을 촉진하는 유전자, 아폽토시스를 방지하는 유전자 및/또는 음성 체크포인트 신호전달을 억제하는 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 유전자는 IL-2, IL-15, 케모카인 수용체, Bcl2, CA-Akt, dn-TGF베타RIII, dn-SHP1/2 및/또는 PD-1CD28 키메라를 코딩하는 유전자를 포함한다. 이들 유전자는 또한 본원에 기재된 바와 같은 유도성 프로모터의 제어 하에 위치된다. 일부 대안에서, 유전자는 IL-2, IL-15, 케모카인 수용체, Bcl2, CA-Akt, dn-TGF베타RIII, dn-SHP1/2 및/또는 PD-1CD28 키메라를 코딩한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 유전자는 음성 체크포인트 조절인자를 억제하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다.
일부 대안에서, 제1 핵산은 시토카인 또는 케모카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 제1 유도성 프로모터를 포함한다. 또한 화학주성 시토카인으로서 지칭되는 케모카인은 림프구의 세포 트래픽킹을 조절하는 일군의 구조적으로 관련된 단백질이다. 일부 대안에서, 케모카인은 항상성 또는 염증성이다. 케모카인 수용체는 CCR2, CCR7 또는 CCR15를 포함한다. 시토카인은 인터류킨 예컨대 IL2, IL-12, IL-7 및/또는 Il-15, 인터페론, 예컨대 인터페론 δ, 종양 괴사 인자, 및 TLR4 효능제를 포함한다. 일부 대안에서, 케모카인 수용체는 CCR2, CCR7 및/또는 CCR15를 포함한다. 일부 대안에서, 케모카인 수용체는 CCR2, CCR7 또는 CCR15를 포함한다. 일부 대안에서, 시토카인은 인터류킨을 포함하며, 여기서 인터류킨은 IL2, IL-12, IL-7 및/또는 Il-15 또는 인터페론이며, 여기서 인터페론은 인터페론 δ, 종양 괴사 인자 또는 TLR4 효능제를 포함한다.
일부 대안에서, 제1 핵산은 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 제1 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 대안에서, 아폽토시스를 억제하는 유전자는, 예를 들어, Bcl2 및/또는 CA-Akt를 포함한다. 일부 대안에서, 폴리펩티드는 Bcl2 또는 CA-Akt이다.
일부 대안에서, 제1 핵산은 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 제1 유도성 프로모터를 포함한다. 이러한 유전자는 dn-TGF베타RIII, dn-SHP1/2 및/또는 PD-1CD28 키메라를 포함한다. 일부 대안에서, 폴리펩티드는 dn-TGF베타RIII, dn-SHP1/2 및/또는 PD-1CD28 키메라이다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다.
이들 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 예시적인 서열은 하기에서 발견된다:
Figure 112016108456836-pct00001
키메라 항원 수용체, 마커 서열, 시토카인, 케모카인, 아폽토시스의 억제인자 및/또는 음성 체크포인트 신호전달의 억제인자를 코딩하는 것을 포함하여 임의의 수의 핵산을 유도성 프로모터의 제어 하에 위치시킬 수 있다. 일부 대안에서, 1종 이상의 유도성 프로모터를 이용하여 각각의 핵산의 적당한 발현 수준을 제공할 수 있다. 일부 대안에서, 구축물은 유도성 프로모터의 제어 하의 시토카인과 같은 유전자, 및 구성적 프로모터의 제어 하의 키메라 항원 수용체를 포함하는 구축물과 함께 제조될 수 있다. 이러한 구축물은 형질도입된 세포, 예를 들어 키메라 항원 수용체를 발현하는 림프구의 세포 생존 및 증식을 제공하는데 유용하다.
구성적 프로모터 시스템.
다른 대안에서, 시스템은 전사 활성화인자에 연결된 구성적 프로모터 또는 제2 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 다른 대안에서, 시스템은 전사 활성화인자에 연결된 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터이다. 일부 대안에서, 구성적 프로모터는 EF1α 프로모터, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함한다. 일부 대안에서, 바이러스 프로모터 예컨대 CMV 프로모터는 제외된다. 일부 대안에서, 구성적 프로모터는 본원에 기재된 바와 같은 마커 또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 1개 이상에 연결될 수 있다.
구성적 프로모터.
구성적 프로모터는 프로모터의 제어 하의 유전자의 연속 유전자 발현을 제공한다. 일부 대안에서, 구성적 프로모터는 렌티바이러스 구축물에서 및/또는 림프구에서 유전자 발현을 제공하는 프로모터이다. 일부 대안에서, 프로모터는 이종 공급원 예컨대 식물 또는 바이러스로부터 유래되지 않는다.
구체적 대안에서, 구성적 프로모터는 EF1α 프로모터, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및/또는 크레아틴 키나제 프로모터를 포함한다. 일부 대안에서, 바이러스 프로모터 예컨대 CMV 프로모터는 제외된다.
전사 활성화인자.
일부 대안에서, 구성적 프로모터는 전사 활성화인자에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 유도인자 (예를 들어 약물)의 존재 하에 유도성 프로모터를 활성화시킨다.
일부 대안에서, 유도성 프로모터는 전사 활성화인자의 존재 하에 유도된다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 약물의 존재 하에 프로모터에 우선적으로 결합한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 TamR-tf(HEA3)이다. 전사 활성화인자의 변형은 약물, 프로모터 또는 둘 다에 결합하는 활성화인자의 능력에 영향을 미칠 수 있는 아미노산 서열에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, ER 리간드 결합 도메인에서의 결합은 전사 활성화인자에 대한 약물의 결합에 영향을 미칠 것이다.
일부 대안에서, 시스템은, 약물 (예를 들어 타목시펜)의 존재 하에, 트랜스진의 상류의 합성 프로모터에 결합하여 발현을 유도하는 합성 전사 활성화인자를 사용한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 TamR-tf (HEA3)이다. 타목시펜 조절된 전사 인자 ("TamR-tf", 또한 "HEA3"으로도 지정됨)는 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ER-LBD)의 돌연변이체 타목시펜-특이적 리간드 결합 도메인에 인 프레임으로 융합되고, 다시 NF-κB의 p65 활성화 도메인 (p65)에 융합된, 간세포 핵 인자 1-알파 (HNF-1α)의 N-말단 DNA 결합 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 40의 아미노산 1-281)을 포함하는 인간 서브유닛으로 구성된 키메라 전사 인자이다. 예시적인 아미노산 서열은 표 10에 제공되고, 서열식별번호: 40으로 확인된다. 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ER-LBD)의 돌연변이체 타목시펜-특이적 리간드 결합 도메인은 TamR-tf의 아미노산 282-595에서 발견되고, 위치 521에서 돌연변이를 갖는다. NF-κB의 p65 활성화 도메인 (p65 또는 TAD)은 아미노산 596 내지 862에서 발견된다.
전사 인자의 특성을 증가시키기 위해 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인에서 1개 이상의 아미노산을 변경시키는 것 및/또는 p65 전사활성화 도메인에서 1개 이상의 아미노산을 변경시키는 것을 제한 없이 포함하는 추가의 변화가 전사 활성화인자에 대해 이루어질 수 있다. 에스트로겐 수용체 결합 도메인의 아미노산을 변경시키는 것은 전사 활성화인자에 대한 약물의 보다 특이적인 결합을 제공할 수 있다. ER-LBD 내 변경된 서열을 갖는 전사 활성화인자의 예는 표 11에 제시된다 (서열식별번호: 43). 돌연변이는 서열식별번호: 40의 아미노산 위치 400, 543 및 544에서 만들어진다. 변경된 서열을 갖는 전사 활성화인자는 타목시펜 또는 4-OHT에 대한 증가된 친화도를 갖는다. p65 전사활성화 도메인 내 아미노산을 변경시키는 것은 형질도입된 세포의 활성화의 부재 하의 트랜스진의 증가된 발현을 제공할 수 있다.
마커.
일부 대안에서, 구성적 프로모터는 마커 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 이러한 마커 폴리펩티드는 본원에 기재되어 있고, EGFRt, Her2t 및/또는 DHFRdm을 포함한다.
키메라 항원 수용체.
일부 대안에서, 구성적 프로모터는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이며, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 제공하기 위해 최적화된다. 키메라 항원 수용체의 예가 본원에 기재되어 있다.
벡터.
형질도입 및 트랜스진 발현의 효율을 제공하기 위해 다양한 벡터 조합이 구축될 수 있다. 일부 대안에서, 벡터는 이중 패키징 또는 단일 (하나에 모두) 바이러스 벡터이다. 다른 대안에서, 벡터는 바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터의 조합을 포함할 수 있다. 다른 바이러스 벡터는 포말 바이러스, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 일부 대안에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 대안에서, 벡터는 포말 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 대안에서, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 제1 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터는 세포 생존 또는 증식을 증진시키는 유전자, 아폽토시스를 조절하는 유전자 및/또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달의 조정은 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 시토카인 또는 케모카인 수용체를 코딩한다. 일부 대안에서, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터는 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 제1 핵산을 포함한다. 마커 서열이 본원에 기재되어 있다. 일부 대안에서, 마커 서열은 인간 림프구의 형질도입과 상용성이다. 일부 대안에서, 마커 서열은 형질도입된 세포의 선택 및/또는 형질도입된 세포의 검출을 허용한다. 일부 대안에서, 마커는 특히 히그로마이신 B에 대한 저항성을 부여하는 히그로마이신-B 포스포트랜스퍼라제 유전자 (hph), 항생제 G418에 대한 저항성을 코딩하는 Tn5로부터의 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자 (neo 또는 aph), 메토트렉세이트에 대한 저항성을 제공하는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자, DHFR dm (표 14, 서열식별번호: 46 및 서열식별번호: 47의 예시적인 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열), 퓨로마이신에 대한 저항성을 제공하는 pac 유전자, 제오신을 불활성화시키는 Sh ble 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자 (ADA), 및/또는 다중-약물 저항성 (MDR) 유전자를 포함할 수 있는 유전자이다. 제1 핵산은 모두 유도성 프로모터의 제어 하의 다수의 상이한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 마커 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 시토카인 또는 케모카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결될 수 있다.
일부 대안에서, 렌티바이러스 벡터는 약물에 결합하고 유도성 프로모터의 발현을 활성화시키는 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산 서열에 연결된 구성적 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 구성적 프로모터를 갖는 렌티바이러스 벡터는 또한 마커 유전자, 피기백 트랜스포사제 및/또는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 핵산의 각각의 요소는 서열 예컨대 T2A 자기-절단 서열에 의해 서로 분리될 수 있다. 일부 대안에서, 핵산의 요소는 서열 자기-절단 서열에 의해 서로 분리된다. 일부 대안에서, 자기-절단 서열은 T2A이다.
다른 대안에서, 이종 (벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터에 대해 이종) 핵산 서열은 벡터 내에 패키징될 수 있는 추가의 유전적 구성요소의 양에 의해 제한된다. 일부 대안에서, 구축물은 바이러스 벡터에 이종인 적어도 2종의 유전자를 함유한다. 일부 대안에서, 구축물은 바이러스 벡터에 이종인 4종 이하의 유전자를 함유한다. 벡터 내에 패키징될 수 있는 바이러스 벡터에 이종인 유전자의 수는 1종 이상의 트랜스진의 발현을 검출하고, 적어도 10%의 세포의 형질도입 및/또는 적어도 10%의 세포에서 트랜스진의 검출가능한 발현 수준을 제공하는 벡터 구축물을 선택하는 것에 의해 결정될 수 있다.
일부 대안에서, 렌티바이러스는 이중 패키징된 바이러스이다. 이중 패키징된 바이러스는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 적어도 1개의 조건부 구축물을 함유한다. 임의로 조건부 구축물은 마커 유전자, 시토카인에 대한 핵산, 케모카인 수용체에 대한 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 이중 패키징된 렌티바이러스는 구성적 프로모터를 포함하는 구성적 구축물을 함유한다. 한 대안에서, 구성적 구축물은 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자에 연결된 구성적 프로모터를 포함한다. 일부 대안에서, 구성적 구축물은 또한 마커 유전자 및/또는 시토카인 또는 케모카인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 2개의 구축물을 갖는 시스템의 일부 대안에서, 각 구축물은 별개의 바이러스 벡터 내에 패키징될 수 있고, 바이러스 벡터는 세포 집단에서 형질도입을 위해 함께 혼합될 수 있다.
구성적 및 조건부 구축물 둘 다가 마커 유전자를 함유하는 경우에, 각 구축물의 마커 유전자는 서로 동일하거나 상이하다. 일부 대안에서, 구성적 및 조건부 구축물 둘 다가 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 경우에, 키메라 항원 수용체는 동일한 항원을 표적화할 수 있지만 상이한 리간드 결합 도메인을 가질 수 있거나, 동일한 항원이지만 상이한 에피토프를 표적화할 수 있거나, 또는 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
일부 대안에서, 벡터는 미니서클이다. 미니서클은 임의의 박테리아 플라스미드 DNA 백본이 결여된 원형 발현 카세트로서 생산된 에피솜 DNA 벡터이다. 그의 보다 작은 분자 크기는 보다 효율적인 형질감염을 가능하게 하고, 단지 며칠동안 작용하는 표준 플라스미드 벡터와 비교 시 수주의 기간에 걸친 지속 발현을 제공한다. 일부 대안에서, 미니서클은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 약물 유도성 프로모터를 함유한다. 일부 대안에서, 유도성 프로모터는 케모카인 수용체, 마커 유전자 및/또는 시토카인에 연결될 수 있다. 1종 이상의 미니서클이 사용될 수 있다. 일부 대안에서, 미니서클은 제1 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 유도성 프로모터를 포함하고/거나, 또 다른 미니서클은 제2 및 상이한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 유도성 프로모터를 포함하고/거나, 미니서클은 케모카인 수용체, 키메라 항원 수용체 및 마커 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 유도성 프로모터를 포함한다. 구축물의 각각의 요소는 핵산, 예컨대 자기-절단 T2A 서열을 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 일부 대안에서, 구축물의 각각의 요소는 핵산, 예컨대 자기-절단 T2A 서열을 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 일부 대안에서 각각의 미니서클은 스페이서 길이 및 서열, 세포내 신호전달 도메인 및/또는 마커 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는 키메라 항원 수용체에서 서로 상이하다. 미니서클 벡터는 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 구성적 렌티바이러스 벡터와 함께 사용될 수 있다. 일부 대안에서, 미니서클 벡터는 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 구성적 렌티바이러스 벡터와 함께 사용된다.
일부 대안에서, 벡터는 피기 백 트랜스포손이다. 피기백 (PB) 트랜스포손은 "컷 및 페이스트" 메카니즘을 통해 벡터와 염색체 사이에 효율적으로 전위하는 이동성 유전 요소이다. 전위 동안, PB 트랜스포사제는 트랜스포손 벡터의 양쪽 말단에 위치한 트랜스포손-특이적 역전된 말단 반복부 서열 (ITR)을 인식하고, 내용물을 원래 부위로부터 효율적으로 이동시키고, 그들을 TTAA 염색체 부위에 효율적으로 통합시킨다. 피기백 트랜스포손 시스템의 강력한 활성은 PB 벡터의 2개의 ITR 사이의 관심 유전자가 표적 게놈 내로 용이하게 이동되는 것을 가능하게 한다.
일부 대안에서, PB는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 약물 유도성 프로모터를 함유한다. 일부 대안에서, 유도성 프로모터는 케모카인 수용체, 마커 유전자 및/또는 시토카인에 연결될 수 있다. 1종 이상의 PB 트랜스포손이 사용될 수 있다. 일부 대안에서, PB는 제1 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 유도성 프로모터를 포함하고/거나, 또 다른 PB는 제2 및 상이한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 유도성 프로모터를 포함하고/거나, PB는 케모카인 수용체, 키메라 항원 수용체 및 마커 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 유도성 프로모터를 포함한다. 구축물의 각각의 요소는 핵산, 예컨대 자기-절단 T2A 서열을 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 일부 대안에서 각각의 PB는 스페이서 길이 및 서열, 세포내 신호전달 도메인 및/또는 마커 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는 키메라 항원 수용체에서 서로 상이하다. PB 벡터는 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 구성적 렌티바이러스 벡터 및 구성적 프로모터에 연결된 피기백 트랜스포사제를 포함하는 구성적 벡터와 함께 사용될 수 있다.
일부 대안에서, 제1 핵산은 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고; 제2 핵산은 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 단일 렌티바이러스 벡터 내에 있다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다.
일부 대안에서, 제1 핵산은 마커 유전자를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 제2 및 상이한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 제1 및 제2 키메라 항원 수용체는 리간드 결합 도메인, 표적 항원, 표적 항원의 에피토프, 스페이서 도메인의 길이 및 서열 (짧은, 중간 또는 긴), 및 세포내 신호전달 도메인에서 서로 상이할 수 있다.
일부 대안에서, 단일 렌티바이러스 구축물에서 제1 및 제2 핵산은 게놈 인슐레이터 핵산 예컨대 성게 인슐레이터 염색질 도메인에 의해 분리될 수 있다. 다른 대안에서, 제1 핵산의 유도성 프로모터 및 제2 핵산의 구성적 프로모터는 반대 배향에 있다.
이들 벡터 중 1종 이상을 서로 함께 사용하여 표적 세포를 형질도입시키고 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 제공할 수 있다.
숙주 세포 및 조성물: T 림프구 집단.
본원에 기재된 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 벡터 및/또는 구축물을 갖는 유전자 변형된 숙주 세포를 제공한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 림프구이다.
T 림프구는 공지된 기술에 따라 수집되고, 공지된 기술 예컨대 항체에 결합하는 친화도 예컨대 유동 세포측정법 및/또는 면역자기 선택에 의해 풍부화 또는 고갈될 수 있다. 풍부화 및/또는 고갈 단계 후에, 목적하는 T 림프구의 시험관내 확장은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 공지된 기술 또는 그의 변경에 따라서 실행될 수 있다. 일부 대안에서, T 세포는 환자로부터 수득된 자가 T 세포이다.
예를 들어, 목적하는 T 세포 집단 또는 하위집단은 시험관내 배양 배지에 초기 T 림프구 집단을 첨가하고, 이어서 배양 배지에 피더 세포, 예컨대 비-분열 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 첨가하고 (예를 들어, 생성된 세포의 집단이 확장되는 초기 집단 내 각각의 T 림프구에 대해 적어도 5, 10, 20 또는 40 또는 그 초과의 PBMC 피더 세포를 함유하도록); 배양물을 인큐베이션하는 것 (예를 들어 T 세포의 수를 확장시키기에 충분한 시간 동안)에 의해 확장될 수 있다. 비-분열 피더 세포는 감마-조사된 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 대안에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 대안에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500 또는 3600 rad 또는 임의의 열거된 값 중 임의의 2개의 종점 사이의 임의의 rad 값의 감마선으로 조사된다. 배양 배지에의 T 세포 및 피더 세포의 첨가 순서는 원하는 경우에 역전될 수 있다. 배양물은 전형적으로 T 림프구의 성장에 적합한 온도 등의 조건 하에 인큐베이션될 수 있다. 인간 T 림프구의 성장을 위해, 예를 들어, 온도는 일반적으로 적어도 25℃, 바람직하게는 적어도 30℃, 보다 바람직하게는 37℃일 것이다. 일부 대안에서, 인간 T 림프구의 성장을 위한 온도는 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37℃ 또는 임의의 열거된 값 중 임의의 2개의 종점 사이의 임의의 다른 온도이다.
확장된 T 림프구는 인간 종양 또는 병원체 상에 존재하는 항원에 특이적일 수 있는 CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL) 및 CD4+ 헬퍼 T 림프구를 포함한다. 일부 대안에서, 세포는 전구체 T 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 확장 방법은 피더 세포로서 비-분열 EBV-형질전환된 림프모구성 세포 (LCL)를 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. LCL은 6000 내지 10,000 rad 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 대안에서, LCL은 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500 또는 10,000 rad 내 또는 임의의 열거된 값 중 2개의 종점 사이의 임의의 rad 양의 감마선으로 조사된다. LCL 피더 세포는 임의의 적합한 양, 예컨대 적어도 10:1의 LCL 피더 세포 대 초기 T 림프구의 비로 제공될 수 있다.
일부 대안에서, 확장 방법은 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체를 배양 배지에 첨가하는 것 (예를 들어, 적어도 0.5 ng/ml의 농도로)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 확장 방법은 IL-2 및/또는 IL-15를 배양 배지에 첨가하는 것 (예를 들어, 여기서 IL-2의 농도는 적어도 10 유닛/ml임)을 추가로 포함할 수 있다.
T 림프구의 단리 후에 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘 다는 확장 전 또는 후에 나이브, 기억 및 이펙터 T 세포 하위집단으로 소팅될 수 있다.
CD8+ 세포는 표준 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 일부 대안에서, CD8+ 세포는 각각의 유형의 CD8+ 세포와 연관된 세포 표면 항원을 확인함으로써 나이브, 중심 기억 및 이펙터 기억 세포로 추가로 소팅된다. 일부 대안에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 하위세트 둘 다에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색한 후 CD62L-CD8+ 및 CD62L+CD8+ 분획으로 소팅된다. 일부 대안에서, 중심 기억 TCM의 표현형 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD127을 포함하고, 그랜자임 B에 대해 음성이거나 낮다. 일부 대안에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+ 및/또는 CD8+ T 세포이다. 일부 대안에서, 이펙터 TE는 CD62L, CCR7, CD28 및/또는 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B 및/또는 퍼포린에 대해 양성이다. 일부 대안에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 및/또는 CD45RA를 포함한 나이브 T 세포의 표현형 마커의 발현에 의해 특징화된다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 확인함으로써 나이브, 중심 기억 및 이펙터 세포로 소팅된다. CD4+ 림프구는 표준 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 대안에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ 및/또는 CD4+ T 세포이다. 일부 대안에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및/또는 CD45RO+이다. 일부 대안에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및/또는 CD45RO-이다.
세포 또는 세포 집단이 특정한 세포 표면 마커에 대해 양성인지 여부는 표면 마커에 특이적인 항체 및 이소형 매칭 대조군 항체에 의한 염색을 사용하는 유동 세포측정법에 의해 결정될 수 있다. 마커에 대해 음성인 세포 집단은 이소형 대조군에 비해 특이적 항체에 의한 세포 집단의 유의한 염색의 부재를 지칭하고, 양성은 이소형 대조군에 비해 세포 집단의 균일한 염색을 지칭한다. 일부 대안에서, 마커 중 1종의 발현의 감소는 참조 세포 집단과 비교 시 평균 형광 강도에서의 1 log10의 손실 및/또는 적어도 세포의 20%, 세포의 25%, 세포의 30%, 세포의 35%, 세포의 40%, 세포의 45%, 세포의 50%, 세포의 55%, 세포의 60%, 세포의 65%, 세포의 70%, 세포의 75%, 세포의 80%, 세포의 85%, 세포의 90%, 세포의 95% 및 세포의 100% 또는 20 내지 100% 사이의 임의의 %의 마커를 나타내는 세포의 백분율의 감소를 지칭한다. 일부 대안에서, 마커 중 1개에 대해 양성인 세포 집단은 참조 세포 집단과 비교 시 적어도 세포의 50%, 세포의 55%, 세포의 60%, 세포의 65%, 세포의 70%, 세포의 75%, 세포의 80%, 세포의 85%, 세포의 90%, 세포의 95% 또는 세포의 100% 또는 50 내지 100% 사이의 임의의 %의 마커를 나타내는 세포의 백분율을 지칭한다.
세포 또는 세포 집단이 특정한 세포 표면 마커에 대해 양성인지 여부는 표면 마커에 특이적인 항체 및 이소형 매칭 대조군 항체에 의한 염색을 사용하는 유동 세포측정법에 의해 결정될 수 있다. 마커에 대해 음성인 세포 집단은 이소형 대조군에 비해 특이적 항체에 의한 세포 집단의 유의한 염색의 부재를 지칭하고, 양성은 이소형 대조군에 비해 세포 집단의 균일한 염색을 지칭한다. 일부 대안에서, 마커 중 1종의 발현의 감소는 참조 세포 집단과 비교 시 평균 형광 강도에서의 1 log10의 손실 및/또는 적어도 세포의 20%, 세포의 25%, 세포의 30%, 세포의 35%, 세포의 40%, 세포의 45%, 세포의 50%, 세포의 55%, 세포의 60%, 세포의 65%, 세포의 70%, 세포의 75%, 세포의 80%, 세포의 85%, 세포의 90%, 세포의 95% 및 세포의 100% 또는 20 내지 100% 사이의 임의의 %의 마커를 나타내는 세포의 백분율의 감소를 지칭한다. 일부 대안에서, 증가는 예를 들어 참조 세포 집단과 비교 시 평균 형광 강도에서의 증가 및/또는 주어진 마커 중 1종에 대해 양성인 세포 집단 내 세포의 수에서의 증가를 지칭하고, 예컨대 세포 집단 내 적어도 세포의 50%, 세포의 55%, 세포의 60%, 세포의 65%, 세포의 70%, 세포의 75%, 세포의 80%, 세포의 85%, 세포의 90%, 세포의 95% 또는 세포의 100% 또는 50 내지 100% 사이의 임의의 %의 마커를 나타내는 세포의 백분율을 지칭한다.
일부 대안에서, 항원 특이적인 CD4+ 및 CD8+의 집단은 항원으로 나이브 또는 항원 특이적 T 림프구를 자극함으로써 수득될 수 있다. 예를 들어, 항원-특이적 T 세포주 또는 클론은 시토메갈로바이러스 항원에 대해, 감염된 대상체로부터 T 세포를 단리하고 동일한 항원으로 세포를 시험관내 자극함으로써 생성될 수 있다. 나이브 T 세포가 또한 사용될 수 있다. 종양 세포로부터의 임의의 수의 항원은 T 세포 반응을 도출하기 위한 표적으로 이용될 수 있다. 일부 대안에서, 입양 세포 면역요법 조성물은 고형 종양, 혈액 악성종양, 유방암 또는 흑색종을 포함하는 질환 또는 장애의 치료에 유용하다.
T 림프구 집단의 변형.
일부 대안에서 본 개시내용에 따라 면역요법에 사용될 T 세포에 기능적 유전자를 도입시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 도입된 유전자 또는 유전자들은 전달된 T 세포의 생존율 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선시킬 수 있거나; 또는 이는 생체내 생존 또는 이동의 선택 및/또는 평가를 허용하는 유전자 마커를 제공할 수 있거나; 또는 이는 예를 들어 세포가 트랜스진의 제어된 발현에 감수성이게 함으로써 면역요법의 안전성을 개선시키는 기능을 혼입시킬 수 있다. 이는 본 개시내용을 기반으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 공지된 기술에 따라 수행될 수 있다.
일부 대안에서, T 세포는 본원에 기재된 바와 같은 약물 유도성 키메라 수용체를 코딩하는 벡터로 변형된다. 일부 대안에서, 세포는 유도성 프로모터의 제어 하의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 변형된다. 다른 대안에서, 세포는 유도성 프로모터의 제어 하의 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 유전자 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 변형된다. 일부 대안에서, T 세포는 치료될 대상체로부터 수득되고, 다른 대안에서, 림프구는 동종 인간 공여자, 바람직하게는 건강한 인간 공여자로부터 수득된다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달의 조정은 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다.
키메라 수용체는 예를 들어 항체 분자의 항원 결합 단편 또는 항체 가변 도메인을 이용함으로써 임의의 세포 표면 마커에 대한 특이성을 갖고 구축될 수 있다. 항원 결합 분자는 1종 이상의 세포 신호전달 모듈에 연결될 수 있다. 일부 대안에서, 세포 신호전달 모듈은 CD3 막횡단 도메인, CD3 세포내 신호전달 도메인 및/또는 CD28 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 CD28 막횡단 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 수용체는 또한 형질도입 마커 예컨대 tEGFR을 포함할 수 있다.
일부 대안에서, 동일하거나 상이한 키메라 수용체는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 림프구의 각각의 집단에 도입될 수 있다. 일부 대안에서, 각각의 이들 집단의 키메라 수용체는 종양 또는 감염된 세포 상의 동일한 리간드 또는 상이한 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 리간드 결합 도메인을 갖는다. 세포 신호전달 모듈은 상이할 수 있다. 일부 대안에서, CD8+ 세포독성 T 세포의 세포내 신호전달 도메인은 CD4+ 헬퍼 T 세포의 세포내 신호전달 도메인과 동일하다. 다른 대안에서, CD8+ 세포독성 T 세포의 세포내 신호전달 도메인은 CD4+ 헬퍼 T 세포의 세포내 신호전달 도메인과는 상이하다.
일부 대안에서 각각의 CD4 또는 CD8 T 림프구는 본원에 기재된 바와 같이 형질도입 전에 나이브, 중심 기억, 이펙터 기억 또는 이펙터 세포로 소팅될 수 있다. 일부 대안에서, 각각의 CD4 또는 CD8 T 림프구는 형질도입 후에 나이브, 중심 기억, 이펙터 기억 또는 이펙터 세포로 소팅될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 일부 대안에서, 나이브 CD4+ 세포는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ 및/또는 CD4+ 양성 T 세포이다. 일부 대안에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L 양성 및/또는 CD45RO 양성이다. 일부 대안에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L 음성 및/또는 CD45RO 양성이다. 각각의 이들 집단은 독립적으로 키메라 수용체로 변형될 수 있다.
기재된 바와 같이, 일부 대안에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 하위세트 둘 다에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색한 후 CD62L-CD8+ 및 CD62L+CD8+ 분획으로 소팅된다. 일부 대안에서, 중심 기억 T 세포 (TCM)의 표현형 마커의 발현은 CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD127을 포함하고, 그랜자임 B에 대해 음성이거나 낮다. 일부 대안에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+ 및/또는 CD8+ T 세포이다. 일부 대안에서, 이펙터 T 세포 (TE)는 CD62L, CCR7, CD28 및/또는 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B 및/또는 퍼포린에 대해 양성이다. 일부 대안에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD8+, CD62L+, CD45RO+, CCR7+, CD28+ CD127+ 및/또는 CD45RO+에 의해 특징화된다. 각각의 이들 집단은 독립적으로 키메라 수용체로 변형될 수 있다.
유전자 전달을 위한 재조합 감염성 바이러스 입자를 이용하는 다양한 형질도입 기술이 개발된 바 있다. 이는 본 발명의 T 림프구의 형질도입에 대한 현재 바람직한 접근법을 나타낸다. 이 방법에 사용된 바이러스 벡터는 원숭이 바이러스 40, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 벡터 및/또는 레트로바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터를 포함한다. 따라서, 유전자 전달 및 발현 방법은 수없이 많지만, 본질적으로 포유동물 세포에 유전 물질을 도입시키고 발현시키기 위해 기능한다. 인산칼슘 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 및 재조합 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 레트로바이러스 벡터를 사용한 감염을 포함하는 여러 상기 기술은 조혈 또는 림프성 세포를 형질도입시키는데 사용된 바 있다. 1차 T 림프구는 전기천공에 의해 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 감염에 의해 성공적으로 형질도입된 바 있다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터는 진핵 세포 내로의 유전자 전달을 위한 고도로 효율적인 방법을 제공한다. 더욱이, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 통합은 제어된 방식으로 일어나고, 세포당 하나 또는 소수의 카피의 새로운 유전자 정보의 안정한 통합을 발생시킨다.
자극 인자 (예를 들어, 림포카인 또는 시토카인)의 과다발현이 치료된 개체에 대해 독성일 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명의 T 세포가 생체내 음성 선택에 감수성이 되도록 하는 유전자 절편을 포함하는 것은 본 발명의 범주 내이다. "음성 선택"은 주입된 세포가 개체의 생체내 조건에서의 변화의 결과로서 제거될 수 있음을 의미한다. 음성 선택 표현형은 투여된 작용제, 예를 들어, 화합물에 대한 감수성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 발생할 수 있다. 음성 선택 유전자는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 특히 하기를 포함한다: 간시클로비르 감수성을 부여하는 단순 포진 바이러스 유형 I 티미딘 키나제 (HSV-I TK) 유전자; 세포성 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT) 유전자, 세포성 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (APRT) 유전자 및 박테리아 시토신 데아미나제.
일부 대안에서 시험관내 음성 선택 표현형 세포의 선택을 가능하게 하는 양성 마커를 T 세포에 포함시키는 것은 유용할 수 있다. 양성 선택 마커는 숙주 세포에의 도입 시 유전자를 보유하는 세포의 양성 선택을 허용하는 우성 표현형을 발현하는 유전자일 수 있다. 이 유형의 유전자는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 특히 히그로마이신 B에 대한 저항성을 부여하는 히그로마이신-B 포스포트랜스퍼라제 유전자 (hph), 항생제 G418에 대한 저항성을 코딩하는 Tn5로부터의 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자 (neo 또는 aph), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자 (ADA) 및/또는 다중-약물 저항성 (MDR) 유전자를 포함한다.
다양한 방법이 관련 기술분야에서 널리 공지된 바와 같이, T 림프구를 형질도입시키는데 사용될 수 있다. 일부 대안에서, 형질도입은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 수행된다.
일부 대안에서, CD4+ 및 CD8+ 세포 각각은 개별적으로 키메라 수용체를 코딩하는 발현 벡터로 변형되어 규정된 집단을 형성할 수 있다. 일부 대안에서, 세포는 구성적 프로모터의 제어 하의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 유도성 프로모터의 제어 하의 시토카인 또는 케모카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 개별적으로 변형될 수 있다.
일부 대안에서, 이들 세포는 이어서 각각의 세포 집단에 고유한 세포 표면 항원에 대해 소팅함으로써 상기 기재된 바와 같이 나이브, 중심 기억 및 이펙터 세포의 하위집단으로 추가로 소팅된다. 또한, CD4+ 또는 CD8+ 세포 집단은 그들의 시토카인 프로파일 또는 증식 활성에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 항원에 의해 자극될 때 가형질도입된 세포 또는 형질도입된 CD8+ 세포와 비교 시 시토카인 예컨대 IL-2, IL-4, IL-10, TNFα 및/또는 IFNγ의 증진된 생산을 갖는 CD4+ T 림프구가 선택될 수 있다. 다른 대안에서, IL-2 및/또는 TNFα의 증진된 생산을 갖는 나이브 또는 중심 기억 CD4+ T 세포가 선택된다. 마찬가지로, 가형질도입된 CD8+ 세포와 비교 시 증진된 IFNγ 생산을 갖는 CD8+ 세포가 선택된다.
일부 대안에서, 항원 보유 세포에 대해 세포독성인 CD4+ 및 CD8+ 세포가 선택된다. 일부 대안에서, CD4+는 CD8+ 세포와 비교 시 약하게 세포독성일 것으로 예상된다. 바람직한 대안에서, 특정한 유형의 암에 대해 확립된 동물 모델을 사용하여 생체내 종양 세포 사멸을 제공하는 형질도입된 림프구, 예컨대 CD8+ 중심 기억 세포가 선택된다.
또 다른 대안에서, 특정한 유형의 암에 대해 확립된 동물 모델을 사용하여 생체내에서 지속될 수 있는 형질도입된 키메라 수용체 발현 T 세포가 선택된다. 일부 대안에서, 짧은 스페이서 영역을 갖는 형질도입된 키메라 수용체 CD8+ 중심 기억 세포는 동물에의 도입 후 3일 이상, 10일 이상, 20일 이상, 30일 이상, 40일 이상, 또는 50일 이상 동안 생체내에서 지속되는 것으로 제시된 바 있다.
본 개시내용은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조합물이 조성물에서 이용될 것을 고려한다. 하나의 대안에서, 키메라 수용체 형질도입된 CD4+ 세포의 조합물은 동일한 리간드 특이성의 키메라 수용체 형질도입된 CD8+ 세포와 조합될 수 있거나, 또는 별개의 종양 리간드에 특이적인 CD8+ T 세포와 조합될 수 있다. 다른 대안에서, 키메라 수용체 형질도입된 CD8+ 세포는 종양 상에서 발현된 상이한 리간드에 대해 특이적인 키메라 수용체 형질도입된 CD4+ 세포와 조합된다. 또 다른 대안에서, 키메라 수용체 변형된 CD4+ 및 CD8+ 세포는 조합된다. 일부 대안에서 CD8+ 및 CD4+ 세포는 상이한 비, 예를 들어 CD8+ 및 CD4+의 1:1 비, CD8+ 대 CD4+의 10:1 비, 또는 CD8+ 대 CD4+의 100:1 비, 또는 임의의 열거된 비 사이인 CD8+ 대 CD4+의 임의의 다른 비로 조합될 수 있다. 일부 대안에서, 조합된 집단은 시험관내 및/또는 생체내 세포 증식에 대해 시험되고, 세포의 증식을 제공하는 세포의 비가 선택된다.
형질도입 및/또는 키메라 수용체 보유 세포에 대한 선택 후에, 인간 대상체에의 적어도 1회의 주입을 제공하는데 충분한 수의 세포, 전형적으로 대략 104개 세포/kg 내지 109개 세포/kg가 수득될 때까지 세포 집단을 바람직하게는 시험관내 확장시킨다. 일부 대안에서, 형질도입된 세포는 항원 보유 세포, 항 CD3, 항 CD28, 및 IL 2, IL-7, IL 15, 또는 IL-21 또는 그의 조합의 존재 하에 배양된다.
일부 대안에서, 시험관내 또는 생체내에서 시토카인 자극, 항원 또는 종양 표적에 반응하여 증식하는 CD4+ 및 CD8+ 세포가 선택된다. 예를 들어, 항CD3 및/또는 항-CD28에 의한 자극 시 격렬하게 증식하는 CD4+ 또는 CD8+ 형질도입된 세포가 선택된다. 일부 대안에서, 형질도입된 세포의 자극은 유도성 프로모터의 제어 하의 트랜스 유전자의 유도인자 (예를 들어 약물)의 존재 하에 증진된 트랜스진 발현을 제공한다.
CD4+ 및 CD8+ 세포의 각각의 하위집단은 서로 조합될 수 있다. 구체적 대안에서, 변형된 나이브 또는 중심 기억 CD4+ 세포는 변형된 중심 기억 CD8+ T 세포와 조합되어 항원 보유 세포, 예컨대 종양 세포에 대해 상승작용적 세포독성 효과를 제공한다.
조성물.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 T 림프구 세포 제제를 포함하는 입양 세포 면역요법 조성물을 제공한다. 일부 대안에서, T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같이 약물 유도성 프로모터의 제어 하의 질환 또는 장애와 연관된 리간드에 특이적인 세포외 항체 가변 도메인, 스페이서 영역, 막횡단 도메인, 및 T 세포 수용체 또는 다른 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 갖는 CD4 + T 세포를 포함한다. 다른 대안에서, 입양 세포 면역요법 조성물은 세포성 면역 반응을 제공하는 키메라 수용체 변형된 종양-특이적 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포 제제를 추가로 포함하며, 여기서 세포독성 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 약물 유도성 프로모터의 제어 하의 질환 또는 장애와 연관된 리간드에 특이적인 세포외 단일 쇄 항체, 스페이서 영역, 막횡단 도메인, 및 T 세포 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 갖는 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 본 개시내용의 키메라 수용체 변형된 T 세포 집단은 적어도 3일 또는 그 초과 동안 생체내 지속될 수 있다. 한 대안에서, 각각의 이들 집단은 서로 또는 다른 세포 유형과 조합하여 조성물을 제공할 수 있다.
일부 대안에서, CD4+ T 헬퍼 림프구 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포 또는 벌크 CD4+ T 세포이다. 일부 대안에서, CD4+ 헬퍼 림프구 세포는 나이브 CD4+ T 세포이며, 여기서 나이브 CD4+ T 세포는 CD45RO-, CD45RA+를 포함하고/거나 CD62L+ CD4+ T 세포이다.
일부 대안에서, CD8+ T 세포독성 림프구 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및/또는 벌크 CD8+ T 세포이다. 일부 대안에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중심 기억 T 세포이며, 여기서 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 또 다른 대안에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중심 기억 T 세포이고 CD4+ 헬퍼 T 림프구 세포는 나이브 또는 중심 기억 CD4+ T 세포이다.
일부 대안에서, 조성물은 T 세포 전구체를 포함한다. 일부 대안에서, 조성물은 조혈 줄기 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포, 또는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 숙주 세포, 및 전구체 T 세포인 제2 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
방법.
본 개시내용은 입양 면역요법 조성물을 제조하는 방법, 및 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 세포 면역요법을 수행하기 위한 이들 조성물의 용도 또는 사용 방법을 제공한다. 일부 대안에서, 조성물을 제조하는 방법은 변형된 나이브 또는 중심 기억 CD4+ T 헬퍼 세포를 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 변형된 헬퍼 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 유도성 프로모터의 제어 하의 종양 세포 표면 분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 갖는 CD4+ T 세포를 포함한다. 다른 대안에서, CD4+ 세포는 유도성 프로모터의 제어 하의 시토카인 또는 케모카인 수용체를 갖는다.
또 다른 대안에서, 방법은 변형된 CD8+ 중심 기억 T 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 변형된 중심 기억 CD8 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 유도성 프로모터의 제어 하의 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음), 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 갖는 CD8+ 세포를 포함한다. 다른 대안에서, CD4+ 세포는 유도성 프로모터의 제어 하의 시토카인 또는 케모카인 수용체를 갖는다.
둘 다의 변형된 CD4+ T 세포 및 변형된 CD8+ 세포독성 T 세포의 약물 유도성 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 대안에서, 세포의 한 집단에서 키메라 항원 수용체에 연결된 프로모터는 구성적 프로모터이고, 다른 집단에서 그것은 유도성 프로모터이다. 예를 들어, 변형된 CD4+ T 세포는 구성적 프로모터의 제어 하의 종양 세포 표면 분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 갖는 한편, CD8+ 세포독성 T 세포는 유도성 프로모터의 제어 하의 종양 세포 표면 분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 갖는 CD8+ 세포를 포함한다.
일부 대안에서, 폴리뉴클레오티드는 CD4+ 대 CD8+ 세포 집단에서 상이한 키메라 항원 수용체를 코딩할 수 있다. 2개의 구축물 사이의 차이는 항원 또는 에피토프에 대한 리간드 결합 도메인의 특이성 또는 친화도, 스페이서 영역의 길이 및 서열, 및 세포내 신호전달 구성요소를 포함할 수 있다.
키메라 수용체로 변형된 CD4+ 및 CD8+ 세포의 제조는 본 개시내용을 통해 기재된다. 항원 특이적 T 림프구는 질환 또는 장애를 갖는 환자로부터 수득될 수 있거나, 항원의 존재 하에 T 림프구의 시험관내 자극에 의해 제조될 수 있다. 항원 특이성에 대해 선택되지 않은 CD4+ 및/또는 CD8+ T 림프구의 하위집단이 또한 본원에 기재된 바와 같이 단리되고 제조 방법에서 조합될 수 있다.
일부 대안에서, 세포 집단의 조합은 세포 표면 마커의 균일성, 적어도 2 세대를 통해 균일한 세포 분화 상태를 갖도록 증식하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 품질 관리는 표적 리간드를 발현하는 세포주를 키메라 수용체 변형된 T 세포 및 키메라 항원 수용체의 발현을 유도하는 약물과 공동-배양하여 관련 기술분야에 공지된 유도인자의 존재 하의 세포독성, 증식 또는 시토카인 생산 검정을 사용하여 키메라 수용체 변형된 T 세포가 세포주를 인식하는지 여부를 결정함으로써 수행될 수 있다. 세포 분화 상태 및 키메라 수용체 변형된 T 세포 상의 세포 표면 마커는 유동 세포측정법에 의해 결정될 수 있다. 일부 대안에서, 마커 및 CD8+ 세포의 세포 분화 상태는 CD3, CD8, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4, CD45RO 및/또는 CD45RA를 포함한다. 일부 대안에서, 마커 및 CD4+ 세포의 세포 분화 상태는 CD3, CD4, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4 CD45RO 및/또는 CD45RA를 포함한다.
일부 대안에서, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 수용체 변형된 T 세포는 적어도 3일, 또는 적어도 10일 동안 생체내 지속될 수 있다. 일부 대안에서, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 수용체 변형된 T 세포는 CFSE 염료 희석에 의해 결정된 바와 같이 적어도 2 또는 적어도 3 세대를 통해 생체내 증식할 수 있다. 키메라 수용체 변형된 T 세포의 증식 및 지속성은 질환 또는 장애의 동물 모델을 사용하여 세포를 투여하고 전달된 세포의 지속성 및/또는 증식 능력을 결정하는 것에 의해 결정될 수 있다. 다른 대안에서, 증식 및 활성화는 항원 보유 세포를 사용하여 활성화의 다중 순환을 거침으로써 시험관내 시험될 수 있다.
본 개시내용은 또한 상기 기재된 바와 같이 약물 유도성 프로모터의 제어 하에 키메라 수용체를 발현하는 림프구의 조성물을 투여하는 것 및 약물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 세포 면역요법을 수행하는 방법을 제공한다.
일부 대안에서, 약물은 타목시펜, 본원에 기재된 바와 같은 그의 변이체, 유도체, 제약상 염, 용매화물 및 수화물이다. 일부 대안에서, 약물은 조성물 전에, 조성물과 동시에, 또는 조성물이 투여된 후 후속 시점에 전달된다.
일부 대안에서, 약물은 조성물과 함께 투여되고 조성물의 독성 효과가 관찰되면 약물은 독성 효과가 감소할 때까지 중단된다. 독성의 증상이 감소한 후, 약물은 다시 투여된다. 일부 대안에서, 약물은 독성의 증상이 감소하면 다시 투여될 수 있다.
일부 대안에서, 약물은 조성물과 함께 투여되지만, 대상체가 종양 부하 또는 암 세포에서 감소를 가지면, 약물은 변형된 세포가 휴지되도록 소정의 기간 동안 중단되고, 변형된 세포의 어떠한 활성도 존재하지 않는 경우에 변형된 세포는 암의 완화로 인해 필요하지 않다.
다른 대안에서, 방법은 대상체에게 세포성 면역 반응을 제공하는 유전자 변형된 세포독성 T 림프구 세포 제제 (여기서 세포독성 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 약물 유도성 프로모터의 제어 하의 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음), 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 갖는 CD8 + T 세포를 포함함) 및/또는 직접 종양 인식을 도출하고 세포성 면역 반응을 매개하는 유전자 변형된 세포독성 T 림프구 세포 제제 능력을 증대시키는 유전자 변형된 헬퍼 T 림프구 세포 제제 (여기서 헬퍼 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 구성적 또는 약물 유도성 프로모터의 제어 하의 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음), 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 갖는 CD4+ T 세포를 포함함)를 투여하는 것 및 유도성 프로모터를 유도하는 약물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 약물을 투여하는 것은 조성물 또는 숙주 세포의 투여 후에 수행되고, 여기서 투여는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 4주 또는 2개월, 또는 열거된 시간 중 임의의 2개의 값 사이의 임의의 시간에 수행된다.
다른 대안에서, 방법은 대상체에게 세포성 면역 반응을 제공하는 유전자 변형된 세포독성 T 림프구 세포 제제 (여기서 세포독성 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 구성적 프로모터의 제어 하의 종양 세포 표면 분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 갖는 CD8 + T 세포를 포함함) 및/또는 직접 종양 인식을 도출하고 세포성 면역 반응을 매개하는 유전자 변형된 세포독성 T 림프구 세포 제제 능력을 증대시키는 유전자 변형된 헬퍼 T 림프구 세포 제제 (여기서 헬퍼 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 구성적 또는 약물 유도성 프로모터의 제어 하의 종양 세포 표면 분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 갖는 CD4+ T 세포를 포함함)를 투여하는 것 및 유도성 프로모터를 유도하는 약물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 종양 표면 분자이다.
다른 대안에서, 방법은 대상체에게 세포성 면역 반응을 제공하는 유전자 변형된 세포독성 T 림프구 세포 제제 (여기서 세포독성 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 유도성 프로모터의 제어 하에 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 및/또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 발현하는 CD8 + T 세포를 포함함) 및/또는 직접 종양 인식을 도출하고 세포성 면역 반응을 매개하는 유전자 변형된 세포독성 T 림프구 세포 제제 능력을 증대시키는 유전자 변형된 헬퍼 T 림프구 세포 제제 (여기서 헬퍼 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 구성적 또는 약물 유도성 프로모터의 제어 하에 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 및/또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 발현하는 CD4+ T 세포를 포함함)를 투여하는 것 및 유도성 프로모터를 유도하는 약물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 세포 집단 중 하나 이상은 구성적 프로모터의 제어 하에 키메라 항원 수용체를 발현한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달의 조정은 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다.
유도를 위한 약물의 유효량은 형질도입된 세포의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 임의의 열거된 퍼센트 값 사이의 임의의 수에서 키메라 항원 수용체의 유도를 제공하는 약물의 양이다.
또 다른 대안은 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 생물학적 샘플을 질환 또는 장애와 연관된 표적 분자의 존재에 대해 분석하는 것 및 본원에 기재된 입양 면역요법 조성물을 투여하는 것 및 유도성 프로모터를 유도하는 약물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 세포 면역요법을 수행하는 방법을 기재하며, 여기서 키메라 수용체는 표적 분자에 특이적으로 결합한다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 대상체는 일반적으로 인간 및 다른 영장류 대상체, 예컨대 원숭이 및 수의학적 의약 목적을 위한 유인원이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있고, 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함한, 임의의 적합한 연령일 수 있다.
방법은, 예를 들어, 혈액 악성종양, 흑색종, 유방암, 뇌암 및 다른 상피 악성종양 또는 고형 종양의 치료 또는 억제에 유용하다. 일부 대안에서, 질환 또는 장애와 연관된 분자는 고아 티로신 키나제 수용체 ROR1, Her2, EGFR, CE7, hB7H3, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA 또는 B형 간염 표면 항원이다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 다룰 수 있는 대상체는 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 신암, 전립선암, 난소암, 피부암 (흑색종 포함), 골암 및 뇌암 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암을 갖는 것으로서 확인되거나 선택된 대상체를 포함한다. 이러한 확인 및/또는 선택은 임상 또는 진단 평가에 의해 이루어질 수 있다. 일부 대안에서 종양 연관 항원 또는 분자가 예컨대 흑색종, 유방암, 뇌암, 편평 세포 암종, 결장암, 백혈병, 골수종 및/또는 전립선암에서 공지되어 있다. 다른 대안에서 종양 연관 분자는 조작된 키메라 수용체를 발현하는 유전자 변형된 T 세포로 표적화될 수 있다. 예는 B 세포 림프종, 유방암, 뇌암, 전립선암 및/또는 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 세포는 본 발명의 개시내용을 기반으로 하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 공지된 기술 또는 그의 변경에 따라 입양 면역요법을 위한 방법 및 조성물에서 이용될 수 있다.
일부 대안에서, 세포는 먼저 그의 배양 배지로부터 세포를 수거한 다음, 세척하고, 세포를 투여에 적합한 배지 및 용기 시스템 ("제약상 허용되는" 담체) 내에서 치료-유효량으로 농축시킴으로써 제제화된다. 적합한 주입 배지는 임의의 등장성 배지 제제, 전형적으로 생리 염수, 노르모졸 R (애보트) 또는 플라즈마-라이트 A (백스터)일 수 있지만, 또한 물 중 5% 덱스트로스 또는 링거 락테이트가 이용될 수 있다. 주입 배지는 인간 혈청 알부민, 태아 소 혈청 또는 다른 인간 혈청 성분에 의해 보충될 수 있다.
일부 대안에서, 조성물 중 세포의 치료 또는 억제 유효량은 형질도입된 CD4 또는 CD8 세포 또는 적어도 2개 세포 하위세트 (예를 들어, 1개 CD8+ 중심 기억 T 세포 하위세트 및 1개 CD4+ 헬퍼 T 세포 하위세트)이거나, 보다 전형적으로 102개 세포 초과, 및 106개 이하, 108 또는 109개 세포 이하이고, 1010개 세포 초과일 수 있다. 세포의 수는 조성물 내에 포함될 세포의 유형에 따라 의도되는 궁극적 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 특정한 항원에 특이적인 세포를 원하는 경우에, 집단은 이러한 세포를 70% 초과로, 일반적으로 80%, 85% 및 90-95% 초과로 함유할 것이다. 본원에 제공된 용도를 위해, 세포는 일반적으로 리터 이하의 부피이고, 500 ml 이하, 심지어 250 ml 또는 100 ml 또는 그 미만 또는 임의의 2개의 열거된 부피 값의 사이의 부피일 수 있다. 따라서 목적 세포의 밀도는 전형적으로 104개 세포/ml 초과이고, 일반적으로 107개 세포/ml 초과, 일반적으로 108개 세포/ml 이상이다. 누적해서 106, 107, 108, 108, 109, 1010 또는 1011개 세포 또는 임의의 열거된 값 중 임의의 2개의 종점 사이에 규정된 임의의 세포의 양과 동일하거나 그를 초과하는 면역 세포의 임상적으로 적절한 수는 다중 주입으로 배분될 수 있다.
일부 대안에서, 본 발명의 림프구는 개체에게 면역을 부여하는데 사용될 수 있다. "면역"은 병원체에 의한 감염에 대한, 또는 림프구 반응이 지시되는 종양에 대한 반응과 연관된 1종 이상의 신체 증상의 감소를 의미한다. 투여되는 세포의 양은 통상적으로 병원체에 대한 면역을 갖는 정상 개체에 존재하는 범위 내이다. 따라서, 세포는 통상적으로 주입에 의해 투여되며, 각각의 주입은 2개 세포로부터, 적어도 106 내지 3x1010개 세포까지의 범위, 바람직하게는 적어도 107 내지 109개 세포의 범위이다. T 세포는 단일 주입에 의해, 또는 다중 주입에 의해 소정 시간 범위에 걸쳐 투여될 수 있다. 그러나, 상이한 개체가 반응성이 다양할 것으로 예상되기 때문에, 주입되는 세포의 유형 및 양, 뿐만 아니라 주입 횟수 및 다중 주입이 주어지는 시간 범위가 담당 의사에 의해 결정되고, 이는 상용 검사에 의해 결정될 수 있다. 충분한 수준의 T 림프구 (세포독성 T 림프구 및/또는 헬퍼 T 림프구 포함)의 생성은 본원에 예시된 바와 같은 본 발명의 신속한 확장 방법을 사용하여 용이하게 달성가능하다.
일부 대안에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 확인 또는 선택된 대상체, 예컨대 흑색종, 유방암, 뇌암, 편평 세포 암종, 결장암, 백혈병, 골수종 및/또는 전립선암을 갖는 것으로 확인 또는 선택된 대상체에게 정맥내로, 복강내로, 종양내로, 골수 내로, 림프절 내로, 및/또는 뇌척수액 내로 투여된다. 일부 대안에서, 키메라 수용체 조작된 조성물은 종양 부위에 전달된다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 세포를 종양 또는 면역계 구획으로 표적화하고 폐와 같은 부위는 회피하는 화합물과 조합될 수 있다.
일부 대안에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 화학요법제 및/또는 면역억제제와 함께 투여된다. 한 대안에서, 환자는 다른 면역 세포를 억제 또는 파괴하는 화학요법제를 먼저 투여받은 다음, 본원에 기재된 조성물을 투여받는다. 일부 경우에서, 화학요법은 전적으로 회피될 수 있다.
일부 대안에서, 방법은 종양 부담이 감소될 때까지 유도인자 (예를 들어 유도성 약물)와 조합하여 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포를 투여하는 것을 포함한다. 종양 부담이 감소되면, 유도인자 약물은 키메라 항원 수용체의 발현을 스위치 오프하고 수용체를 발현하는 T 세포의 수를 감소시키기 위해 중단될 수 있다. 다른 대안에서, 유도인자 약물은 재발 또는 종양 성장의 증가의 경우에 키메라 항원 수용체의 발현을 스위치 온 하기 위해 상이한 시간에 투여될 수 있다.
다른 대안에서, 유도인자 약물은 수일, 수주 또는 수개월의 기간 동안 주어진 다음 수일, 수주 또는 수개월 동안 중단되고, 이어서 수일, 수주 또는 수개월 동안 유도인자 약물을 재-투여하여 키메라 항원 수용체의 발현의 주기가 세포의 만성 자극으로 인해 무반응 또는 비반응성을 회피하도록 할 수 있다.
벡터 구축 및 이중 패키징된 렌티바이러스의 제조.
7xHBD/mE1b-CD19t-her2t-T2A-epHIV7을 코딩하는 유도성 렌티바이러스 벡터를 구축하였다. CD19t 특이적 키메라 수용체는 (1) (G4S)3 링커 (서열식별번호: 12) 펩티드에 의해 연결된 CD19-특이적 mAb FMC63 (서열식별번호: 3)의 VL 및 VH 쇄 절편 (VL-링커-VH); (2) 오직 IgG4-Fc 힌지로부터 유래된 스페이서 도메인 ((서열식별번호: 4)에 의해 코딩된 12 AA)을 사용하여 구축하였다. 스페이서는 천연 IgG4-Fc 단백질의 위치 108에 위치한 힌지 도메인 내에 S → P 치환; 인간 CD28 (유니프롯 데이터베이스: P10747, (서열식별번호: 14))의 27 AA 막횡단 도메인; (4) (iii) 인간 CD3ζ (유니프롯 데이터베이스: P20963, (서열식별번호: 16))의 이소형 3의 112 AA 세포질 도메인에 연결된 (i) 천연 CD28 단백질 (서열식별번호: 14)의 위치 186-187에 위치한 LL → GG 치환을 갖는 인간 CD28의 41 AA 세포질 도메인; 및/또는 (ii) 인간 4-1BB (유니프롯 데이터베이스: Q07011, (서열식별번호: 15))의 42 AA 세포질 도메인을 포함하는 신호전달 모듈을 함유하였다.
CD19t를 코딩하는 핵산 서열은 Her2t (서열식별번호: 44); 및 자기-절단 T2A 서열 (서열식별번호: 8)을 코딩하는 서열과 연결되었다.
7xHBD/mEF1ap-ZsGreen- epHIV7을 코딩하는 조건부 렌티바이러스 벡터를 구축하였다. 합성 프로모터 7xHBD/mEF1ap는 인간 알부민 프로모터 및 huEF1α 프로모터 TATA 박스로부터 클로닝된 7개의 최소 간세포 핵 패밀리-1 (HNF-1) 결합 부위를 조합함으로써 구축되었고, 서열식별번호: 41의 서열을 갖는다. 이러한 방식으로, 오직 타목시펜의 존재 하에 7xHBD/EF1mp 프로모터에 대한 HEA-3의 결합은 트랜스진 발현의 "온" 상태를 유도한다.
7xHBD/mEF1ap-CD19t--T2A-DHFRdm_epHIV7을 코딩하는 조건부 렌티바이러스 벡터를 구축하였다. CD19t 특이적 키메라 수용체는 (1) (G4S)3 링커 (서열식별번호: 12) 펩티드에 의해 연결된 CD19-특이적 mAb FMC63 (서열식별번호: 3)의 VL 및 VH 쇄 절편 (VL-링커-VH); (2) 오직 IgG4-Fc 힌지로부터 유래된 스페이서 도메인 ((서열식별번호: 4)에 의해 코딩된 12 AA)을 사용하여 구축하였다. 스페이서는 천연 IgG4-Fc 단백질의 위치 108에 위치한 힌지 도메인 내에 S → P 치환; 인간 CD28 (유니프롯 데이터베이스: P10747, (서열식별번호: 14))의 27 AA 막횡단 도메인; (4) (iii) 인간 CD3ζ (유니프롯 데이터베이스: P20963, (서열식별번호: 16))의 이소형 3의 112 AA 세포질 도메인에 연결된 (i) 천연 CD28 단백질 (서열식별번호: 14)의 위치 186-187에 위치한 LL → GG 치환을 갖는 인간 CD28의 41 AA 세포질 도메인; 및/또는 (ii) 인간 4-1BB (유니프롯 데이터베이스: Q07011, (서열식별번호: 15))의 42 AA 세포질 도메인을 포함하는 신호전달 모듈을 함유하였다.
CD19t를 코딩하는 핵산 서열은 자기-절단 T2A 서열 (서열식별번호: 8); 및 DHFRdm (서열식별번호: 46)을 코딩하는 서열과 연결되었다.
전사 조절인자, HEA-3은 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ER-LBD)의 돌연변이체 타목시펜-특이적 리간드 결합 도메인에 인 프레임으로 융합되고, 다시 NF-κβ의 p65 활성화 도메인 (p65)에 융합된, 간세포 핵 인자 1-알파 (HNF-1α)의 N-말단 DNA 결합 도메인을 포함하는 인간 서브유닛으로 구성된 키메라 전사 인자이다. 타목시펜의 부재 하에, HEA-3은 시토졸 열-쇼크 단백질 90 (HSP90)의 타목시펜 결합 활성 부위에의 결합에 의해 핵으로부터 제외되고, 트랜스진 발현은 "오프" 상태가 된다. 나노몰 농도의 시토졸 타목시펜은 ER-LBD 결합에 대해 HSP90을 적극적으로 능가하며, 핵으로의 HEA-3 전위를 발생시킨다. 핵 전위 시, HEA-3은 그의 제한된 합성 프로모터에 결합하는데 용이하게 이용가능하다. 타목시펜의 존재 하의 HEA-3에 대한 전사 반응성은 트랜스진이 HEA-3 반응성 합성 프로모터 (7xHBD/EF1mp) 뒤에 위치될 때 달성된다.
구성적 구축물은 전사 활성화인자 HEA3 (서열식별번호: 39) 및 마커 서열 EGFRt (서열식별번호: 9)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 구성적 프로모터 EF-1 α로 구축하였다.
각각의 트랜스진을 코딩하는 인간 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열이 합성되어 있고 (라이프테크놀로지스(LifeTechnologies), 캘리포니아주 칼스배드), NheI 및 Not1 제한 부위를 사용하여 epHIV7 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하였다. epHIV7 렌티바이러스 벡터는 pHIV7의 시토메갈로바이러스 프로모터를 EF-1 프로모터로 대체함으로써 pHIV7 벡터로부터 유래되었다.
유도성 CD19 키메라 수용체-코딩 및 구성적 렌티바이러스는 칼포스(Calphos) 형질감염 시약 (클론테크)을 사용하여 렌티바이러스 벡터 및 패키징 벡터 pCHGP-2, pCMV-Rev2 및 pCMV-G로 공동-형질감염된 293T 세포에서 생산되었다. 배지를 형질감염 16시간 후에 교체하고, 렌티바이러스를 24, 48 및 72시간 후에 수집하였다.
타목시펜을 사용한 유도 시 CD19 키메라 수용체 및 ZsGreen을 발현하는 Jurkat T-세포주의 생성.
Jurkat 세포는 32℃에서 45분 동안의 2,100 rpm에서의 원심분리에 의한 활성화 후에 제3일에 1 μg/mL 폴리브렌 (밀리포어)으로 보충된 렌티바이러스 상청액 (MOl = 3)으로 형질도입되었다. T 세포는 재조합 인간 (rh) lL-2에 의해 48시간 마다 50 U/mL의 최종 농도로 보충되는 RPMl, 10% 인간 혈청, 2 mM L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (CTL 배지) 중에서 확장되었다.
추가의 대안.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음), 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산, 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템은, 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 및/또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 예시적인 대안에서, 제2 핵산은 구성적 프로모터의 제어 하의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포 면역요법에 의해, 예컨대 종양-특이적, 하위세트 특이적 유전자 변형된 CD4+ T 세포를 입양 전달하는 것에 의해 매개되는 면역 반응을 부여하고/거나 증대시키는 조성물을 제공하며, 여기서 CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포가 항종양 반응성을 유지하고 종양-특이적 증식을 증가 및/또는 최대화하는 능력을 부여하고/거나 증대시킨다. 일부 대안에서, CD4+ 세포는 본원에 기재된 바와 같이 조절된 프로모터의 제어 하에 키메라 수용체 핵산 및/또는 키메라 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 변형된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포 면역요법에 의해, 예컨대 종양-특이적, 하위세트 특이적 유전자 변형된 CD8+ T 세포를 입양 전달하는 것에 의해 매개되는 면역 반응을 부여하고/거나 증대시키기 위한 조성물을 제공한다. 일부 대안에서, CD8+ T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 조절된 프로모터의 제어 하에 키메라 수용체 핵산 및/또는 키메라 수용체 폴리펩티드를 발현한다.
하나의 대안에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 세포성 면역 반응을 제공하는 유전자 변형된 T 림프구 세포 제제를 투여하고 유전자 변형된 T 림프구 세포에서 트랜스진을 유도하는 약물을 투여함으로써 상기 대상체에서 세포 면역요법을 수행하는 방법을 제공한다.
일부 대안에서, 유전자 변형된 CD8+ 및 유전자 변형된 CD4+ 세포 집단은 공-투여된다. 일부 대안에서, T 세포는 자가 또는 동종 T 세포이다. 상기 방법의 다양한 변형이 가능하다. 예를 들어, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 의해 발현된 키메라 수용체는 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 또는 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 유도성 프로모터 또는 구성적 프로모터이다.
일부 대안에서, 키메라 수용체 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 키메라 수용체 폴리펩티드는 시스템에 의해 코딩된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다.
일부 대안에서, 시스템을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 제약상 허용되는 부형제 중 숙주 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 시스템을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포인 숙주 세포를 포함하고, 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 또 다른 숙주 세포를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포, 또는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 숙주 세포, 및 전구체 T 세포인 제2 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 숙주 세포를 제조하는 시험관내 방법이 제공되며, 여기서 방법은 a) 시스템을 제공하는 단계 및 b) 시스템을 별개의 단리된 T 림프구 집단에 도입시키고 각각의 T 림프구 집단을 시험관내에서 확장시키는 단계를 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, T 림프구가 확장되며, 방법은 세포를 항-CD3 및/또는 항 CD28, 및 적어도 1종의 항상성 시토카인의 존재 하에 세포가 세포 주입물로서 사용하기에 충분히 확장될 때까지 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 림프구는 CD8+ 또는 CD4+이다. 일부 대안에서, 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포, 또는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 숙주 세포, 및 전구체 T 세포인 제2 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 암 또는 바이러스 감염의 치료를 위한 숙주 세포 또는 조성물에서 트랜스진의 발현을 유도하는 약물과 조합된 숙주 세포 또는 조성물의 용도가 제공된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 시스템을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제 중 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 시스템을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이며, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이며, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 단리된 T 림프구 집단은 전구체 T 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포인 숙주 세포, 및 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 또 다른 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양이다. 일부 대안에서, 고형 종양은 유방암, 뇌암, 폐암, 결장암, 신암, 췌장암, 전립선암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포, 또는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 숙주 세포, 및 전구체 T 세포인 제2 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 조성물 또는 숙주 세포를 암 또는 바이러스 감염을 갖는 대상체에게 투여하는 것 및 조성물 또는 숙주 세포에서 트랜스진의 발현을 유도하는 약물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 세포 면역요법을 수행하는 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 시스템을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 위해 최적화된다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제 중 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 시스템을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이고, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 약물은 타목시펜 및/또는 그의 대사물이다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1αp이다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터를 추가로 구성하고 제2 핵산은 제2 벡터를 추가로 구성한다. 일부 대안에서, 둘 다의 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 핵산은 벡터를 구성한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 특이적이며, 여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산이며, 여기서 제1 핵산은 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 조절하는 폴리펩티드 또는 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산; 및 b) 유도성 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 또는 유도성이다. 일부 대안에서, 체크포인트 신호전달을 조정하는 폴리펩티드는 음성 체크포인트 조절인자를 억제한다. 일부 대안에서, 음성 체크포인트 조절인자는 VISTA, LAG-3 및/또는 TIM3을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자이며, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식, 조정, 억제 및/또는 제거를 도출할 수 있음); 최적화된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포인 숙주 세포, 및 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 또 다른 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 고형 종양은 유방암, 뇌암, 폐암, 결장암, 신암, 췌장암, 전립선암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 단리된 T 림프구 집단은 전구체 T 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포, 또는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 숙주 세포, 및 전구체 T 세포인 제2 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
추가 대안.
일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 유도성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산, 및 b) 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 제1 프로모터로부터 전사를 활성화시킬 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 유도성 프로모터, b) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 c) 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 유도성 프로모터로부터 전사를 활성화시킬 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 시스템은 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 약물 또는 그의 대사물은 (i) 매일 또는 매주 인간 대상체에게 투여 시 허용되는 약물 또는 그의 대사물; (ii) 인간 수용체, 임의로 에스트로겐 수용체에 특이적으로 결합하는 분자 또는 그의 대사물; 및/또는 (iii) 타목시펜 및/또는 타목시펜의 대사물 또는 유사체를 포함한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 임의로 그러한 순서로 연결되고/거나 융합되는 (a) DNA-결합 도메인; (b) 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인; 및 (c) 전사활성화 도메인을 포함한다. 시스템의 일부 대안에서, (a) DNA-결합 도메인은 림프구에서 자연 발현된 단백질 내에 존재하지 않거나 T 세포에서 자연 발현된 단백질 내에 존재하지 않는 DNA 결합 부위를 포함하고/거나; (b) 약물 또는 대사물은 인간 수용체, 임의로 에스트로겐 수용체, 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하는 분자이고, 약물 또는 대사물과 리간드-결합 도메인 사이에서의 결합은 인간 수용체보다 리간드-결합 도메인에 대해 선택적이어서 약물 또는 대사물에 대한 리간드-결합 도메인에 의한 결합은 인간 수용체에 의한 결합보다 더 강하고, 임의로 적어도 1.5, 2, 3, 또는 4배이고/거나; (c) 전사활성화 도메인은 p65 전사활성화 도메인 또는 그의 기능적 변이체를 포함하고/거나; (d) 제1 프로모터는 DNA 결합 도메인에 대해 1개 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 전사 활성화인자 내에 존재하는 DNA-결합 도메인 또는 도메인들 이외의 임의의 인간 DNA 결합 도메인에 대한 또 다른 결합 부위를 포함하지 않고/거나; 여기서 제1 프로모터는 합성 키메라 프로모터이고/거나 전사 활성화인자는 합성 키메라 전사 활성화인자이고/거나; 여기서 DNA 결합 도메인은, 임의로 HNF1-알파 또는 HNF1-베타인 간세포 핵 인자에 존재하는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 시스템의 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1α 프로모터 또는 그의 기능적 부분이거나 또는 그를 포함한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함되며, 제2 핵산은 제2 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함된다. 일부 대안에서, 제1 핵산 및 제2 핵산 또는 제1 프로모터, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제2 프로모터, 및 전사활성인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함된다. 시스템의 일부 대안에서, 시스템은 단일 바이러스 패키징 벡터를 포함한다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하거나, 또는 여기서 시스템이 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택 마커를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하거나, 또는 여기서 시스템이 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택 마커를 추가로 포함한다.
일부 대안에서, 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 억제하는 폴리펩티드 또는 음성 체크포인트 신호전달을 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 유도성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산, 및 b) 약물 또는 그의 대사물 또는 유사체의 존재 하에 제1 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 구성적 또는 유도성 프로모터인 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 임의로 키메라 항원 수용체인 재조합 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 a) 림프구에 의한 인식 및 제거를 매개하는데 적합한 임의로 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자인 리간드에 결합하는 리간드 결합 도메인 b) 임의로 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 제공하는 폴리펩티드 스페이서, c) 막횡단 도메인 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, MAGE A3 TCR 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 대안에서, 시스템에 의해 코딩된 키메라 수용체 폴리펩티드가 제공된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 유도성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산, 및 b) 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 제1 프로모터로부터 전사를 활성화시킬 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 유도성 프로모터, b) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 c) 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 유도성 프로모터로부터 전사를 활성화시킬 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 시스템은 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 약물 또는 그의 대사물은 (i) 매일 또는 매주 인간 대상체에게 투여 시 허용되는 약물 또는 그의 대사물; (ii) 인간 수용체, 임의로 에스트로겐 수용체에 특이적으로 결합하는 분자 또는 그의 대사물; 및/또는 (iii) 타목시펜 및/또는 타목시펜의 대사물 또는 유사체를 포함한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 임의로 그러한 순서로 연결되고/거나 융합되는 (a) DNA-결합 도메인; (b) 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인; 및 (c) 전사활성화 도메인을 포함한다. 시스템의 일부 대안에서, (a) DNA-결합 도메인은 림프구에서 자연 발현된 단백질 내에 존재하지 않거나 T 세포에서 자연 발현된 단백질 내에 존재하지 않는 DNA 결합 부위를 포함하고/거나; (b) 약물 또는 대사물은 인간 수용체, 임의로 에스트로겐 수용체, 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하는 분자이고, 약물 또는 대사물과 리간드-결합 도메인 사이에서의 결합은 인간 수용체보다 리간드-결합 도메인에 대해 선택적이어서 약물 또는 대사물에 대한 리간드-결합 도메인에 의한 결합은 인간 수용체에 의한 결합보다 더 강하고, 임의로 적어도 1.5, 2, 3, 또는 4배이고/거나; (c) 전사활성화 도메인은 p65 전사활성화 도메인 또는 그의 기능적 변이체를 포함하고/거나; (d) 제1 프로모터는 DNA 결합 도메인에 대해 1개 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 전사 활성화인자 내에 존재하는 DNA-결합 도메인 또는 도메인들 이외의 임의의 인간 DNA 결합 도메인에 대한 또 다른 결합 부위를 포함하지 않고/거나; 여기서 제1 프로모터는 합성 키메라 프로모터이고/거나 전사 활성화인자는 합성 키메라 전사 활성화인자이고/거나; 여기서 DNA 결합 도메인은, 임의로 HNF1-알파 또는 HNF1-베타인 간세포 핵 인자에 존재하는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 청구범위 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 시스템에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1α 프로모터 또는 그의 기능적 부분이거나 또는 그를 포함한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함되며, 제2 핵산은 제2 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함된다. 일부 대안에서, 제1 핵산 및 제2 핵산 또는 제1 프로모터, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제2 프로모터, 및 전사활성인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함된다. 시스템의 일부 대안에서, 시스템은 단일 바이러스 패키징 벡터를 포함한다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하거나, 또는 여기서 시스템이 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택 마커를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하거나, 또는 여기서 시스템이 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택 마커를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 억제하는 폴리펩티드 또는 음성 체크포인트 신호전달을 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 유도성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산, 및 b) 약물 또는 그의 대사물 또는 유사체의 존재 하에 제1 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 구성적 또는 유도성 프로모터인 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 임의로 키메라 항원 수용체인 재조합 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 a) 림프구에 의한 인식 및 제거를 매개하는데 적합한 임의로 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자인 리간드에 결합하는 리간드 결합 도메인 b) 임의로 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 제공하는 폴리펩티드 스페이서, c) 막횡단 도메인 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 대안에서, 시스템 또는 바이러스 패키징 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 유도성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산, 및 b) 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 제1 프로모터로부터 전사를 활성화시킬 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 유도성 프로모터, b) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 c) 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 유도성 프로모터로부터 전사를 활성화시킬 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 시스템은 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 약물 또는 그의 대사물은 (i) 매일 또는 매주 인간 대상체에게 투여 시 허용되는 약물 또는 그의 대사물; (ii) 인간 수용체, 임의로 에스트로겐 수용체에 특이적으로 결합하는 분자 또는 그의 대사물; 및/또는 (iii) 타목시펜 및/또는 타목시펜의 대사물 또는 유사체를 포함한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 임의로 그러한 순서로 연결되고/거나 융합되는 (a) DNA-결합 도메인; (b) 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인; 및 (c) 전사활성화 도메인을 포함한다. 시스템의 일부 대안에서, (a) DNA-결합 도메인은 림프구에서 자연 발현된 단백질 내에 존재하지 않거나 T 세포에서 자연 발현된 단백질 내에 존재하지 않는 DNA 결합 부위를 포함하고/거나; (b) 약물 또는 대사물은 인간 수용체, 임의로 에스트로겐 수용체, 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하는 분자이고, 약물 또는 대사물과 리간드-결합 도메인 사이에서의 결합은 인간 수용체보다 리간드-결합 도메인에 대해 선택적이어서 약물 또는 대사물에 대한 리간드-결합 도메인에 의한 결합은 인간 수용체에 의한 결합보다 더 강하고, 임의로 적어도 1.5, 2, 3, 또는 4배이고/거나; (c) 전사활성화 도메인은 p65 전사활성화 도메인 또는 그의 기능적 변이체를 포함하고/거나; (d) 제1 프로모터는 DNA 결합 도메인에 대해 1개 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 전사 활성화인자 내에 존재하는 DNA-결합 도메인 또는 도메인들 이외의 임의의 인간 DNA 결합 도메인에 대한 또 다른 결합 부위를 포함하지 않고/거나; 여기서 제1 프로모터는 합성 키메라 프로모터이고/거나 전사 활성화인자는 합성 키메라 전사 활성화인자이고/거나; 여기서 DNA 결합 도메인은, 임의로 HNF1-알파 또는 HNF1-베타인 간세포 핵 인자에 존재하는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1α 프로모터 또는 그의 기능적 부분이거나 또는 그를 포함한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함되며, 제2 핵산은 제2 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함된다. 일부 대안에서, 제1 핵산 및 제2 핵산 또는 제1 프로모터, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제2 프로모터, 및 전사활성인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함된다. 일부 대안에서, 상기 기재된 시스템은 단일 바이러스 패키징 벡터를 포함한다. 일부 이러한 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하거나, 또는 여기서 시스템이 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택 마커를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하거나, 또는 여기서 시스템이 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택 마커를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 억제하는 폴리펩티드 또는 음성 체크포인트 신호전달을 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 유도성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산, 및 b) 약물 또는 그의 대사물 또는 유사체의 존재 하에 제1 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 구성적 또는 유도성 프로모터인 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 임의로 키메라 항원 수용체인 재조합 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 a) 림프구에 의한 인식 및 제거를 매개하는데 적합한 임의로 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자인 리간드에 결합하는 리간드 결합 도메인 b) 임의로 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 제공하는 폴리펩티드 스페이서, c) 막횡단 도메인 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 대안에서, 1차 인간 림프구인 숙주 세포가 제공되며, 여기서 숙주 세포는 a) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 결합 도메인에 대한 결합 부위를 함유하는 유도성 합성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 핵산 및 b) i) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하지 않는 DNA 결합 도메인; ii) 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하고, 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 임의의 분자에 결합하지 않거나 또는 큰 정도의 친화도로 결합하지 않는 도메인 및 iii) 전사활성화 도메인을 포함하는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 전사 활성화인자는 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 및/또는 (ii) 내 도메인에의 약물 또는 그의 대사물의 결합 시 제1 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있다. 일부 대안에서, 세포는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 이는 임의로 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 세포는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 제2 프로모터는 임의로 구성적이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다.
일부 대안에서, 제약상 허용되는 부형제 중 숙주 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 1차 인간 림프구이고, 여기서 숙주 세포는 a) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 결합 도메인에 대한 결합 부위를 함유하는 유도성 합성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 핵산 및 b) i) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하지 않는 DNA 결합 도메인; ii) 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하고, 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 임의의 분자에 결합하지 않거나 또는 큰 정도의 친화도로 결합하지 않는 도메인 및 iii) 전사활성화 도메인을 포함하는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 전사 활성화인자는 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 및/또는 (ii) 내 도메인에의 약물 또는 그의 대사물의 결합 시 제1 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있다. 일부 대안에서, 세포는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 이는 임의로 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 세포는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 제2 프로모터는 임의로 구성적이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포 및 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포를 포함한다.
일부 대안에서, 숙주 세포를 제조하는 시험관내 방법이 제공되고, 이는 시스템을 별개의 단리된 T 림프구 집단에 도입시키고 각각의 T 림프구 집단을 시험관내에서 확장시키는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 1차 인간 림프구이고, 여기서 숙주 세포는 a) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 결합 도메인에 대한 결합 부위를 함유하는 유도성 합성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 핵산 및 b) i) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하지 않는 DNA 결합 도메인; ii) 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하고, 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 임의의 분자에 결합하지 않거나 또는 큰 정도의 친화도로 결합하지 않는 도메인 및 iii) 전사활성화 도메인을 포함하는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 전사 활성화인자는 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 및/또는 (ii) 내 도메인에의 약물 또는 그의 대사물의 결합 시 제1 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있다. 일부 대안에서, 세포는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 이는 임의로 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 세포는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 제2 프로모터는 임의로 구성적이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 유도성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산, 및 b) 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 제1 프로모터로부터 전사를 활성화시킬 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 a) 유도성 프로모터, b) 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 c) 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 유도성 프로모터로부터 전사를 활성화시킬 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 시스템은 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 약물 또는 그의 대사물은 (i) 매일 또는 매주 인간 대상체에게 투여 시 허용되는 약물 또는 그의 대사물; (ii) 인간 수용체, 임의로 에스트로겐 수용체에 특이적으로 결합하는 분자 또는 그의 대사물; 및/또는 (iii) 타목시펜 및/또는 타목시펜의 대사물 또는 유사체를 포함한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 임의로 그러한 순서로 연결되고/거나 융합되는 (a) DNA-결합 도메인; (b) 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인; 및 (c) 전사활성화 도메인을 포함한다. 시스템의 일부 대안에서, (a) DNA-결합 도메인은 림프구에서 자연 발현된 단백질 내에 존재하지 않거나 T 세포에서 자연 발현된 단백질 내에 존재하지 않는 DNA 결합 부위를 포함하고/거나; (b) 약물 또는 대사물은 인간 수용체, 임의로 에스트로겐 수용체, 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하는 분자이고, 약물 또는 대사물과 리간드-결합 도메인 사이에서의 결합은 인간 수용체보다 리간드-결합 도메인에 대해 선택적이어서 약물 또는 대사물에 대한 리간드-결합 도메인에 의한 결합은 인간 수용체에 의한 결합보다 더 강하고, 임의로 적어도 1.5, 2, 3, 또는 4배이고/거나; (c) 전사활성화 도메인은 p65 전사활성화 도메인 또는 그의 기능적 변이체를 포함하고/거나; (d) 제1 프로모터는 DNA 결합 도메인에 대해 1개 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 전사 활성화인자 내에 존재하는 DNA-결합 도메인 또는 도메인들 이외의 임의의 인간 DNA 결합 도메인에 대한 또 다른 결합 부위를 포함하지 않고/거나; 여기서 제1 프로모터는 합성 키메라 프로모터이고/거나 전사 활성화인자는 합성 키메라 전사 활성화인자이고/거나; 여기서 DNA 결합 도메인은, 임의로 HNF1-알파 또는 HNF1-베타인 간세포 핵 인자에 존재하는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 서열식별번호: 41의 핵산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 대안에서, 제2 프로모터는 EF1α 프로모터 또는 그의 기능적 부분이거나 또는 그를 포함한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 서열식별번호: 40의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 제1 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함되며, 제2 핵산은 제2 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함된다. 일부 대안에서, 제1 핵산 및 제2 핵산 또는 제1 프로모터, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제2 프로모터, 및 전사활성인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 벡터 내에 포함되고, 이는 추가로 시스템에 의해 포함된다. 일부 대안에서, 시스템은 단일 바이러스 패키징 벡터를 포함한다. 일부 대안에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하거나, 또는 여기서 시스템이 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택 마커를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 선택 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하거나, 또는 여기서 시스템이 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 선택 마커를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 a) 시토카인, 케모카인 수용체, 아폽토시스를 억제하는 폴리펩티드 또는 음성 체크포인트 신호전달을 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 유도성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산, 및 b) 약물 또는 그의 대사물 또는 유사체의 존재 하에 제1 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 구성적 또는 유도성 프로모터인 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 임의로 키메라 항원 수용체인 재조합 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 a) 림프구에 의한 인식 및 제거를 매개하는데 적합한 임의로 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자인 리간드에 결합하는 리간드 결합 도메인 b) 임의로 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 제공하는 폴리펩티드 스페이서, c) 막횡단 도메인 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터에 반대 배향에 있다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 단편이다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 단일 쇄 가변 단편이다. 일부 대안에서, 종양 특이적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, MAGE A3 TCR 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 집단 내 T 림프구는 확장되며, 방법은 세포를 항-CD3 및/또는 항 CD28, 및 적어도 1종의 항상성 시토카인의 존재 하에 세포가 세포 주입물로서 사용하기에 충분히 확장될 때까지 배양하는 것을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 항-CD3 및/또는 항 CD28, 및 적어도 1종의 항상성 시토카인의 존재 하에 배양하는 것은 시스템의 도입 전 또는 후에 수행될 수 있다.
일부 대안에서, 암 또는 바이러스 감염의 치료를 위한 약물 또는 그의 대사물과 조합된 숙주 세포 또는 조성물의 용도가 제공된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 1차 인간 림프구이고, 여기서 숙주 세포는 a) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 결합 도메인에 대한 결합 부위를 함유하는 유도성 합성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 핵산 및 b) i) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하지 않는 DNA 결합 도메인; ii) 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하고, 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 임의의 분자에 결합하지 않거나 또는 큰 정도의 친화도로 결합하지 않는 도메인 및 iii) 전사활성화 도메인을 포함하는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 전사 활성화인자는 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 및/또는 (ii) 내 도메인에의 약물 또는 그의 대사물의 결합 시 제1 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있다. 일부 대안에서, 세포는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 이는 임의로 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 세포는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 제2 프로모터는 임의로 구성적이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제 중 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 1차 인간 림프구이고, 여기서 숙주 세포는 a) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 결합 도메인에 대한 결합 부위를 함유하는 유도성 합성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 핵산 및 b) i) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하지 않는 DNA 결합 도메인; ii) 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하고, 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 임의의 분자에 결합하지 않거나 또는 큰 정도의 친화도로 결합하지 않는 도메인 및 iii) 전사활성화 도메인을 포함하는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 전사 활성화인자는 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 및/또는 (ii) 내 도메인에의 약물 또는 그의 대사물의 결합 시 제1 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있다. 일부 대안에서, 세포는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 이는 임의로 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 세포는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 제2 프로모터는 임의로 구성적이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포 및 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포를 포함한다.
일부 대안에서, 암 또는 바이러스 감염의 치료 또는 억제에 사용하기 위한 세포 및 약물이 제공되며, 여기서 세포는 (a) 암 또는 바이러스 감염과 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (b) 유도성 합성 프로모터, 및 (c) 합성 프로모터에 특이적으로 결합하는 DNA 결합 도메인 및 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하는 도메인을 함유하고, 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 합성 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있는 전사 활성화인자를 포함한다. 일부 대안에서, 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양이다. 일부 대안에서, 고형 종양은 유방암, 폐암, 결장암, 신암, 췌장암, 전립선암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 대안에서, 조성물 또는 숙주 세포를 암 또는 바이러스 감염을 갖는 대상체에게 투여하고 약물 또는 그의 대사물을 투여하여, 프로모터로부터 발현을 유도하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 세포 면역요법을 수행하는 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 1차 인간 림프구이고, 여기서 숙주 세포는 a) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 결합 도메인에 대한 결합 부위를 함유하는 유도성 합성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 핵산 및 b) i) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하지 않는 DNA 결합 도메인; ii) 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하고, 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 임의의 분자에 결합하지 않거나 또는 큰 정도의 친화도로 결합하지 않는 도메인 및 iii) 전사활성화 도메인을 포함하는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 전사 활성화인자는 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 및/또는 (ii) 내 도메인에의 약물 또는 그의 대사물의 결합 시 제1 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있다. 일부 대안에서, 세포는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 이는 임의로 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 세포는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 제2 프로모터는 임의로 구성적이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제 중 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 1차 인간 림프구이고, 여기서 숙주 세포는 a) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 결합 도메인에 대한 결합 부위를 함유하는 유도성 합성 프로모터인 제1 프로모터를 포함하는 핵산 및 b) i) 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하지 않는 DNA 결합 도메인; ii) 약물 또는 그의 대사물에 특이적으로 결합하고, 1차 인간 림프구에 자연적으로 존재하는 임의의 분자에 결합하지 않거나 또는 큰 정도의 친화도로 결합하지 않는 도메인 및 iii) 전사활성화 도메인을 포함하는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 전사 활성화인자는 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 및/또는 (ii) 내 도메인에의 약물 또는 그의 대사물의 결합 시 제1 프로모터로부터 전사를 유도할 수 있다. 일부 대안에서, 세포는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 이는 임의로 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 세포는 전사 활성화인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 제2 프로모터는 임의로 구성적이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 일부 대안에서, 조성물은 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포 및 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 고형 종양은 유방암, 폐암, 결장암, 신암, 췌장암, 전립선암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 세포 내에 약물-조절된 트랜스진 발현, 예컨대 재조합 단백질 예컨대 재조합 항원 수용체 및/또는 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포에 의해 발현되는 분자의 약물-조절된 발현을 전달하기 위한 유전자 시스템을 포함한다. 한 대안에서, 조절된 트랜스진 발현은 예를 들어 입양 세포 요법, 예컨대 입양 면역요법에서의 사용을 위해 세포, 예컨대 림프구 내로 조작되고/거나 그 내에 함유된다. 이러한 시스템은 일반적으로 치유 의도를 단념시키지 않으면서, 세포 요법, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) 입양 치료 전략에 대해 엄격한 안전성 속성을 제공한다. 일부 측면에서, 이러한 특색은 재조합 단백질 발현, 예를 들어, 생체내 CAR 발현의 실시간 임상 제어를 허용한다. 재조합 유전자, 예를 들어 CAR 발현의 약물 반응성 전사 제어를 가능하게 하는 벡터를 조작함으로써, 재조합 유전자, 예를 들어 CAR 및/또는 다른 세포 매개자의 활성은 예를 들어 임상적으로 허용되는 약동학, 조직 분포, 및 림프구의 세포외 공간과 시토졸 사이의 분배를 나타내는 임상의가 처방한 제약 약물 투입을 기반으로 하여 생체내에서 턴 "온" 및 "오프"될 수 있다. 유전자 시스템은 약물의 부재 하에 기능적 "오프" 상태 및 약물의 존재 하에 기능적 "온" 상태 트랜스진 발현을 시행하기 위한 약물 조절된 트랜스진 발현을 제공한다.
이러한 약물의 하나의 대안은 타목시펜이다. 타목시펜은 FDA-승인되고 상업적으로 입수가능한 약물인 에스트로겐 길항제/부분 효능제이다. 이것은 경구로 섭취되고, 연장된 기간에 걸쳐 매일 기준으로 투여될 수 있다. 타목시펜은 증명된 안전성 기록, 유리한 약동학적 프로파일, 탁월한 조직 분포 및 세포외 공간과 시토졸 사이의 낮은 분배 계수를 갖는다. 타목시펜의 기능적 유사체가 또한 사용될 수 있다. 다른 약물은 안전성 기록, 유리한 약동학적 프로파일, 탁월한 조직 분포, 세포외 공간과 시토졸 사이의 낮은 분배 계수, 및/또는 낮은 독성을 기반으로 하여 선택될 수 있다.
일부 대안에서, 시스템은, 타목시펜의 존재 하에, 트랜스진의, 예를 들어 상류에 작동가능하게 연결된 합성 프로모터에의 결합을 유도하여 프로모터로부터의, 예를 들어 트랜스진의 발현을 유도할 수 있는 합성 전사 조절인자, 예를 들어 합성 전사 활성화인자를 사용한다. 본원에 제공된 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 약물 또는 그의 대사물에 의해 조절되며, 예컨대 타목시펜-조절된 전사 활성화인자 또는 전사 인자는 타목시펜 또는 그의 유사체 또는 대사물에 의해 조절, 예를 들어, 유도될 수 있다. 예시적인 타목시펜-조절된 전사 인자는 키메라 전사 인자, 예컨대 시스템의 합성 프로모터에 특이적인 DNA 결합 도메인, 예를 들어 천연 분자 예컨대 에스트로겐에 대한 도메인의 친화도보다 더 높은 친화도로 타목시펜 및/또는 그의 대사물(들)에 특이적으로 결합하는 도메인, 및 전사활성화 도메인, 예컨대 강력한 전사활성화 도메인을 포함하는 것이다. 하나의 타목시펜 조절된 전사 인자 ("TamR-tf", 또한 "HEA3"으로도 지정됨)는 에스트로겐과 비교 시 높은 친화도로 타목시펜 대사물에 결합하는 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ER-LBD)의 돌연변이체 (G521R) 타목시펜-특이적 형태에 인 프레임으로 융합되고, 다시 NF-κB의 p65 활성화 도메인 (p65)에 융합된, 간세포 핵 인자 1-알파 (HNF-1α)의 N-말단 DNA 결합 도메인을 포함하는 인간 서브유닛으로 구성된 키메라 전사 인자이다. TamR-tf의 예시적인 아미노산 서열은 표 10에 제공되고, 서열식별번호: 40으로 확인된다. 이 서열에서, 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ER-LBD)의 리간드 결합 도메인의 돌연변이체 타목시펜-특이적 형태는 TamR-tf의 아미노산 282-595에서 발견되고, 야생형 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인과 비교하여 위치 521에서 돌연변이를 갖는다. NF-κB의 p65 활성화 도메인 (p65)은 서열식별번호: 40의 아미노산 596-862에서 발견된다. 에스트로겐 유사체에 대한 인자의 친화도를 증가시키기 위해 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인에서 1개 이상의 아미노산을 변경시키는 것 및 p65 전사활성화 도메인에서 1개 이상의 아미노산을 변경시키는 것을 제한 없이 포함하는 변화가, 예를 들어 전사 인자의 특성을 증가시키기 위해 전사 활성화인자에 대해 이루어질 수 있다. 일부 대안에서, tamR-tf의 1종 이상의 기능, 예컨대 타목시펜-특이적 결합 및/또는 임의의 천연 분자와 비교 시 타목시펜 또는 대사물에 대한 동일하거나 실질적으로 동일하거나 적어도 동일한 특이성, 적어도 동일하거나 거의 동일한 특이적 DNA 결합 기능, 및/또는 동일하거나 적어도 동일한 정도의 전사활성화 활성을 보유하거나 실질적으로 보유하는 변경된 전사 인자를 발생시키는 변화가 전사 활성화인자에 대해 이루어진다.
타목시펜의 부재 하에, 전사 활성화인자, 예를 들어 TamR-tf는 일반적으로 시토졸 히트-쇼크 단백질 90 (HSP90)의 타목시펜-결합 활성 부위에의 결합에 의해 핵으로부터 제외되고, tamR-tf-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스진의 발현을 "오프" 상태가 되게 한다. 나노몰 농도의 시토졸 타목시펜은 ER-LBD 결합에 대해 HSP90을 적극적으로 능가하며, 핵으로의 TamR-tf 전위를 발생시킨다. 핵 전위 시, TamR-tf는 제한된 합성 프로모터 (예를 들어 7xHBD/EF1αp)에 결합하는데 용이하게 이용가능하다. 타목시펜의 존재 하에, 합성 프로모터, 예를 들어, 7xHBD/EF1αp 프로모터에의 TamR-tf의 결합은 합성 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스진에 대해 발현의 "온" 상태를 유도한다. 일부 대안에서, 이러한 전사 조절인자는 다양한 수준의 트랜스진 발현 제어를 제공하도록 변형될 수 있다. TamR-tf의 LBD에서의 아미노산 치환은 타목시펜 및 그의 대사물에 대한 선택적 반응성을 허용하며, 여기서 4-히드록시 타목시펜 (4-OHT)은 내인성 에스트로겐과의 상호작용이 결여된 한편 TamR-tf 활성과 관련하여 가장 약리적으로 활성인 대사물이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 유도성 발현을 위한 시스템이 제공되며, 여기서 시스템은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 임의로 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 결합하고, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식 및 제거를 매개하는데 적합한 종양 특이적 분자, 바이러스 분자, 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자임), 임의로 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 제공하는 폴리펩티드 스페이서, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 것에 작동가능하게 연결된 약물에 의해 유도가능한 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 시스템은 예컨대 약물 또는 그의 대사물의 존재 하에 제1 프로모터로부터의 전사를 조정, 예를 들어 활성화시킬 수 있는, 유도성 프로모터에 대한 전사 조정인자를 코딩하는 제2 핵산을 추가로 포함하고; 전형적으로 시스템은 전사 조정인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함한다.
유도성 시스템의 일부 대안에서, 제1 프로모터는 세포 생존 및 증식을 촉진하는 유전자, 아폽토시스를 방지하는 유전자 및/또는 음성 체크포인트 신호전달을 억제하는 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 이러한 유전자는 IL-2, IL-15, 케모카인 수용체, Bcl2, CA-Akt, dn-TGF베타RIII, dn-SHP1/2 및/또는 PD-1CD28 키메라를 코딩하는 유전자를 포함한다.
일부 대안에서, 시스템은, 약물 (예를 들어 타목시펜) 또는 그의 대사물의 존재 하에, 예컨대 약물의 투여 후에 트랜스진의 상류의 합성 프로모터에의 결합을 유도하여 발현을 유도하는 합성 전사 활성화인자를 사용한다. 일부 대안에서, 전사 활성화인자는 TamR-tf (HEA3) 또는 유사한 도메인을 갖는 다른 타목시펜-유도성 전사 활성화인자이다. 타목시펜 조절된 전사 인자 ("TamR-tf", 또한 "HEA3"으로도 지정됨)는 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ER-LBD)의 돌연변이체 타목시펜-특이적 리간드 결합 도메인에 인 프레임으로 융합되고, 다시 NF-κB의 p65 활성화 도메인 (p65)에 융합된, 간세포 핵 인자 1-알파 (HNF-1α)의 N-말단 DNA 결합 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 40의 아미노산 1-281)을 포함하는 인간 서브유닛으로 구성된 키메라 전사 인자이다.
본원의 조성물의 일부 대안에서, CD4+ T 헬퍼 림프구 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포 또는 벌크 CD4+ T 세포이다. 일부 대안에서, CD4+ 헬퍼 림프구 세포는 나이브 CD4+ T 세포이며, 여기서 나이브 CD4+ T 세포는 CD45RO-, CD45RA+를 포함하고/거나 CD62L+ CD4+ T 세포이다. 일부 대안에서, 조성물 중 세포의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 100%는 CD4+이고; 일부 대안에서, 조성물 중 세포 또는 조성물 중 CD4+ 세포의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 100%는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포 또는 벌크 CD4+ T 세포이다.
본원의 조성물의 일부 대안에서, CD8+ T 세포독성 림프구 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및/또는 벌크 CD8+ T 세포이다. 일부 대안에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중심 기억 T 세포이며, 여기서 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 또 다른 대안에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중심 기억 T 세포이고 CD4+ 헬퍼 T 림프구 세포는 나이브 또는 중심 기억 CD4+ T 세포이다. 일부 대안에서, 조성물 중 세포의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 100%는 CD8+이고; 일부 대안에서, 조성물 중 세포 또는 조성물 중 CD8+ 세포의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 100%는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 또는 벌크 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 세포 및/또는 조성물 중 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99, 또는 100%는 트랜스진 또는 재조합 분자, 예컨대 CAR을 발현하고/거나 발현 시스템을 함유한다.
추가적으로 입양 면역요법 조성물, 예컨대 시스템을 함유하는 것을 포함하는 조성물을 제조하는 방법, 및 예컨대 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 세포 면역요법을 수행하기 위한 이들 조성물의 용도 또는 사용 방법이 제공된다.
일부 대안에서, 조성물을 제조하는 방법은 변형된 나이브 또는 나이브-유래 또는 중심 기억 또는 중심 기억-유래 CD4+ T 헬퍼 세포 또는 이를 함유하는 집단을 수득 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 변형된 헬퍼 T 림프구 세포 제제는 키메라 수용체, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 유도성 프로모터의 제어 하의 종양 세포 표면 분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것을 갖는 CD4+ T 세포를 포함한다. 다른 일부 대안에서, CD4+ 세포는 유도성 프로모터의 제어 하의 시토카인 또는 케모카인 수용체를 갖는다.
본원에 기재된 방법의 일부 대안에서, T-세포는 비-CAR 발현하고/거나 Tam-유도성 단백질을 생산하는 다른 T-세포와 함께 투여된다. 일부 대안에서, CAR에 대한 전사 활성화인자는 DNA-결합 도메인, 타목시펜/대사물 결합 도메인 또는 전사활성화 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 합성 전사 활성화인자로부터의 1개 이상, 일반적으로 모든 도메인은 인간 단백질, 예컨대 인간 또는 실질적으로 인간 도메인이거나 또는 그로부터 유래된다. 이러한 특색은, 예를 들어, 세포 요법에서 인간 대상체에게 투여 시 구축물의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
Jurkat 세포에서의 발현.
TamR ZsGreen을 발현하는 Jurkat T 세포의 "온" 및 "오프" 상태를 연구하였다.
구축물.
일부 대안에서, 이 시스템은 2종의 구성요소를 수반한다: 1) T2A 스킵-링커 도메인에 의해 단일 트랜스진 또는 트랜스진의 세트에 연결된 HEA-3의 구성적 발현 및 2) 트랜스진의 유도가 타목시펜에 반응하여 발생하는 HEA-3 제한된 합성 프로모터 7xHBD/mEF1ap의 제어 하에 있는 트랜스진의 조건부 발현. TamRLV 유전자 제어의 목적하는 용도에 따라, 전달 시스템 및 벡터 조성물의 조합이 사용될 수 있다. 구축물의 구축은 상기 기재되어 있다.
TamR-LV 시스템의 대안은 동역학적 분석 및 타목시펜의 존재 또는 부재에 의해 "온" 및 "오프" 방식으로 제어되는 생물학적 효과를 허용하는, ZsGreen 또는 키메라 항원 수용체의 구성적 HEA3 발현 및 유도성 발현을 가능하게 한다. 이를 위해, 2종의 구축물을 사용하였다: 1) HEA-3은 인간 EF1a 프로모터에 의해 가동되고, T2A 스킵-링커 서열에 의해 구축된 말단절단된 EGFR (EGFRt) 막횡단 마커 단백질에 연결되고, 제3 세대 epHIV7 자기-불활성화 렌티바이러스 패키징 플라스미드 내로 클로닝되고 (구축물 A) (표 10; 서열식별번호: 39; 표 1: 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 9 참조), 2) 7xHBD/mEF1ap는 상업적으로 사용되는 CMV 프로모터를 결여시키기 위해 조작한 pcDNA3.1(-) 내로 클로닝된 ZsGreen의 타목시펜-의존성 발현을 제어한다 (구축물 B) (표 12; 서열식별번호: 41 참조). ZsGreen1은 가장 밝은 상업적으로 입수가능한 녹색 형광 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화된 ZsGreen 변이체이다. (클론테크로부터 입수가능).
방법.
Jurkat 세포를, 렌티바이러스 생산 동안 각각의 플라스미드로 293T 세포를 공동-형질감염시키는 이중 패키징 접근법에 상기 기재된 렌티바이러스 패키징 구축물로, 5의 MOI에서 형질도입시켰다. 이 구축물은 1:2의 구축물 A 대 구축물 B의 몰비를 이용하였다. 구축물 A는 트래킹 및 선택 마커 EGFRt에 리보솜 절단 서열, T2A를 통해 연결된 키메라 전사 인자 HEA3을 코딩한다. 구축물 B는 트랜스진 ZsGreen-DR1, 짧은 반감기 녹색 형광 리포터 유전자의 발현을 조절하는 합성, HEA3-반응성 프로모터, 7xHBD/mE1b를 코딩한다.
형질도입 후에, 세포를 배양하여 확장시키고, 밀테니 자기 비드 선택을 이용하여 EGFRt 발현을 순도 >99%로 풍부화하였다. 배양에서의 추가 확장 후에, 세포를 수거하고, 24시간 동안 음성 대조군으로서 에탄올 (비히클) 또는 500 nM 4-히드록시타목시펜 (4OHT)으로 처리한 다음, 수거하고, 에르비툭스-비오틴에 이어 SA-APC로 염색하고, 유동 세포측정법을 통해 APC 발현 및 ZsGreen 발현을 분석하였다. 결과는 도 1에 제시되어 있다.
용량 반응.
세포를 수거한 다음, 제시된 바와 같은 0 nM-1000 nM 범위의 농도로의 4OHT에 의한 처리에 적용하였다. 샘플을 수거하고, 세척하고, EGFRt-비오틴, 이어서 스트렙타비딘-APC로 염색한 다음, ZsGreen 발현에 대해 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 결과는 도 2에 제시되어 있다.
온 및 오프 레이트 동역학.
집단을 48시간 동안 500 nM 4OHT 자극에 적용시킨 다음, FACS를 이용하여 ZsGreen + 세포를 소팅하였고, 소팅 직후 분석 시 >99% ZsGreen + 집단이 생성되었다. 세포를 후속적으로 3주 동안 배양하여 확장시킨 다음, 동역학적 연구를 위해 준비하였다. 세포는 3종의 처리군으로 나뉘어졌다: (1) 4OHT 없음 (2) 200 nM 4OHT (48시간마다 첨가) (3) 24시간 200 nM 4OHT에 이어서 PBS 중 1x 세척제거, 이어서 14일 동안 4OHT 무함유 배지 중 배양에 이어서 200 nm 4OHT에 의한 24시간 재자극, 이어서 1x PBS 중 세척제거. 각 시점에서, 샘플을 수거하고 ZsGreen 발현에 대해 유동 세포측정법을 통해 분석하였다. 결과는 도 3에 제시되어 있고, % ZsGreen+로서 나타낸다.
결과.
도 1의 결과는 4-히드록시 타목시펜 (4-OHT)의 존재 하에 세포의 약 50%가 ZsGreen을 발현한다는 것을 제시하며, 이는 이들 세포가 구축물 A 및 B 둘 다를 갖고 4-OHT가 구축물 B의 발현을 유도한다는 것을 나타낸다. 용량 반응 곡선의 결과는 200 nM 이상의 농도의 4-OHT가 형질도입된 세포에서 트랜스진의 발현을 유도하는데 효과적이었다는 것을 제시한다 (도 2). 도 3에서의 결과는 4-OHT가 배양물로부터 세척됨에 따라, Zs Green 발현이 5일 내에 최대 ZsGReen 활성의 10% 미만으로 감소한다는 것을 제시한다. 4-OHT가 다시 첨가될 때, ZsGreen 활성은 2일 내에 약 100% 최대 활성으로 복귀한다.
논의.
이들 실험은 인간 T Jurkat 세포가 구성적 구성요소 및 유도성 구성요소를 갖는 이중 패키징된 렌티바이러스로 형질도입될 수 있다는 것을 제시한다. ZsGreen 유전자의 발현은 용량 반응 방식으로 4-OHT의 존재 하에 유도된다. 또한, 세포 배양물로부터 4-OHT를 세척하는 것은 ZsGreen의 발현에서의 감소를 발생시켰고, 이는 세포에 4-OHT를 다시 첨가하는 것에 의해 재자극될 수 있었다.
1차 CD4 중심 기억 세포 및 CD8 중심 기억 세포에서의 발현.
TamR ZsGreen을 발현하는 CD4 및 CD8 중심 기억 T 세포의 "온" 및 "오프" 상태를 연구하였다.
구축물.
일부 대안에서, 이 시스템은 2종의 구성요소를 수반한다: 1) T2A 스킵-링커 도메인에 의해 단일 트랜스진 또는 트랜스진의 세트에 연결된 HEA-3의 구성적 발현 (구축물 A) (표 10; 서열식별번호: 39; 표 1 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 9 참조) 및 2) 트랜스진의 유도가 타목시펜에 반응하여 발생하는 HEA-3 제한된 합성 프로모터 7xHBD/mEF1ap의 제어 하에 있는 트랜스진의 조건부 발현 (구축물 B) (표 12; 서열식별번호: 41 참조). TamRLV 유전자 제어의 목적하는 용도에 따라 전달 시스템 및 벡터 조성물의 조합이 사용될 수 있다. 구축물은 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
방법.
CD4 중심 기억 세포는 마커 CD4, 및 CD62L 및 CD45RO에 대해 유동 세포측정법을 통해 세포를 선택함으로써 말초 혈액으로부터 수득하였다. 세포를 3일 동안 항-CD3/항-CD28 비드와 함께 배양하였다.
CD8 중심 기억 세포는 마커 CD8, 및 CD62L 및 CD45RO에 대해 유동 세포측정법을 통해 세포를 선택함으로써 말초 혈액으로부터 수득하였다. 세포를 3일 동안 항-CD3/항-CD28 비드와 함께 배양하였다.
3일 후에, CD4 또는 CD8 중심 기억 세포를, 렌티바이러스 생산 동안 각각의 플라스미드로 293T 세포를 공동-형질감염시키는 이중 패키징 접근법에 상기 기재된 렌티바이러스 패키징 구축물로, 5의 MOI에서 형질도입시켰다. 이 구축물은 1:2의 구축물 A 대 구축물 B의 몰비를 이용하였다. 구축물 A는 트래킹 및 선택 마커 EGFRt에 리보솜 절단 서열, T2A를 통해 연결된 키메라 전사 인자 HEA3을 코딩한다. 구축물 B는 트랜스진 ZsGreen-DR1, 짧은 반감기 녹색 형광 리포터 유전자의 발현을 조절하는 합성, HEA3-반응성 프로모터, 7xHBD/mE1b를 코딩한다.
형질도입 후 제21일에, 세포를 EGFRt에 대해 풍부화시키고, 후속적으로 피더 세포, IL2 및 IL15로 확장시켰다. 확장 후에, 세포는 3종의 처리군, 4OHT 단독 (a), CD3/CD28 비드 공동처리와 조합된 4OHT (b) 또는 48시간 동안 4OHT 단독에 이어 CD3/CD28 비드의 첨가 (c)로 나뉘었다. 4OHT 부재 하의 상응하는 샘플을 또한 비교를 위해 입수하였다. 모든 샘플은 4OHT 처리 후 지정된 시점에서 수거하고, EGFRt-비오틴 항체, 이어서 SA-APC로 염색하고, 유동 세포측정법에 대해 분석하였다. 결과는 도 4 (CD4 중심 기억) 및 도 5 (CD8 중심 기억)에 제시된다.
결과.
결과는 이중 플라스미드 벡터로 형질도입된 CD4 세포가 심지어 타목시펜의 존재 하에서도 ZsGreen을 발현하기 위해 활성화 자극의 존재를 필요로 한다는 것을 제시한다. 도 4b를 참조한다. 타목시펜 및 항CD3/항-CD28 비드의 존재 하의 1차 형질도입된 CD4 세포의 약 70%는 ZsGreen을 발현하였다. 유전자 발현은 활성화가 타목시펜으로의 처리 48시간 후에 발생했을 때 관찰되었다. 도 4c를 참조한다.
결과는 이중 플라스미드 벡터로 형질도입된 CD8 세포가 또한, 심지어 타목시펜의 존재 하에서도 ZsGreen을 발현하기 위해 활성화 자극의 존재를 필요로 한다는 것을 제시한다. 도 5b를 참조한다. 타목시펜 및 항CD3/항-CD28 비드의 존재 하의 1차 형질도입된 CD8 세포의 약 37%는 ZsGreen을 발현하였다. 유전자 발현은 활성화가 타목시펜으로의 처리 48시간 후에 발생했을 때 제시한다. 도 5c를 참조한다.
이들 결과는 유도성 구축물로 형질도입된 1차 중심 기억 T 세포가 유도인자의 존재 하에 항CD3/CD28 세포에 의한 활성화 시 트랜스진을 발현할 수 있음을 제시한다. 그러나, 트랜스진을 발현하는 비활성화된 세포는 면역자기 또는 유동 세포측정법 소팅을 사용하여 용이하게 단리될 수 있다.
TamR---CD19CAR LV의 구축.
벡터의 구축은 1:1의 플라스미드 몰비에서 상기 기재된 바와 같은 구축물을 수용하는 전달 플라스미드의 이중 패키징에 의해 달성하였다 (도 6c 및 7c 참조). 구성적 EF-1알파 프로모터 하의 구축물 A는 리보솜 절단 서열, T2A를 통해 트래킹 및 선택 마커 EGFRt에 연결된 TamR-tf (HEA3)를 코딩한다 (표 10; 서열식별번호: 39, 표 1: 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 9 참조). 구축물 B는 7xHBD/mE1b 프로모터와 그 하류의, 2a 절단 서열을 통해 Her2t, 트래킹 및 선택 마커에 연결된 CD19CAR을 포함하는 트랜스진 cDNA를 함유한다 (표 12; 서열식별번호: 41; 표 2 서열식별번호: 10; 표 13; 서열식별번호: 44 참조). 또 다른 구축물은 추가의 선택 마커 DHFRdm을 첨가하여 제조하였다 (표 14; 서열식별번호: 46 참조).
인간 Jurkat 세포를 2의 MOI에서 형질도입시킨 다음, 배양하여 확장시키고, 자기 비드 선택을 통해 EGFRt+ 세포에 대해 선택하였다. 추가 확장 후에, 세포를 비히클 단독 (EtOH) 또는 500 nM 4OHT로 처리하고, 유동 세포측정법을 위해 수거하였다. 샘플은 EGFRt-APC 항체 및 헤르셉틴-비오틴, 이어서 SA PE로 염색하였다. 샘플을 또한 웨스턴 블롯을 위해 제조하고, 사용된 1차 항체는 CD19CAR 상의 세포내 CD3 제타 쇄 (~48 kDa)를 인식하는 항-CD247 마우스 mAb이다. 내인성 CD3 제타는 ~23 kDa에서 이동한다. 결과는 도 6에 제시되어 있다.
선택 마커를 함유하는 TamR CD19CAR LV로 형질도입된 Jurkat T 세포.
TamR CD19CAR LV의 구축은 구축물 A 및 B의 이중 패키징을 통해 이루어졌다. 구축물 A는 트래킹 및 선택 마커 EGFRt에 리보솜 절단 서열, T2A를 통해 연결된 HEA3을 함유한다. 구축물 B는 또 다른 2a 절단 서열 (P2A)을 통해 DHFRdm, 메토트렉세이트 선택 유전자에 연결된, 2a 절단 서열을 통해 Her2t, 트랙킹 및 선택 마커에 연결된 CD19CAR로 이루어진 하류 트랜스진과 함께 7xHBD/mE1b 프로모터를 함유한다.
세포를 1의 MOI에서 TamR CD19CAR LV로 형질도입시키고, 배양하여 확장시키고, 자기 비드 선택을 통해 EGFRt에 대해 선택하였다. 추가 확장 후에 세포를 벡터 단독 (EtOH) 또는 500 nM 4OHT로 처리하고, 유동 세포측정법을 위해 수거하였다 (상부 패널). 도 7. 샘플은 EGFRt-APC 항체 및 헤르셉틴-비오틴, 이어서 SA-PE로 염색하였다. 모 (비형질도입된 Jurkat)는 비교를 위해 제시된다. 샘플을 또한 웨스턴 블롯을 위해 제조하고, 사용된 1차 항체는 CD19CAR 상의 세포내 CD3 제타 쇄 (~48 kDa)를 인식하는 항-CD247 마우스 mAb이다. 내인성 CD3 제타는 ~23 kDa에서 이동한다.
결과.
결과는 EGFRt가 추가의 선택 마커 DHFRdm을 포함하지 않는 구축물로 형질도입된 세포의 94.6%에서 검출되었음을 제시한다. 도 6b를 참조한다. 도 6c는 타목시펜의 존재 하에, DHFRdm을 포함하지 않는 구축물로 형질도입된 세포의 약 42.6%가 EGFRt 및 Her2t 둘 다를 발현하였다는 것을 제시한다. 둘 다의 마커를 발현하는 세포는 웨스턴 블롯에서 검출 시 CAR 구축물의 일부 (48 kDa)로서 CD3제타 쇄를 발현하였다. 도 6b를 참조한다.
도 7은 타목시펜의 부재 하에 DHFRdm에 대한 또 다른 2a 절단 서열 (P2A)을 포함하는 구축물로 형질도입된 85.9% Jurkat 세포가 EGFRt를 발현한다는 것을 제시한다. 타목시펜의 존재 하에, 세포의 약 7.5%가 EGFRt 및 Her2t 둘 다를 발현하였다. 둘 다의 마커를 발현하는 세포는 웨스턴 블롯에서 검출 시 CAR 구축물의 일부 (48 kDa)로서 CD3제타 쇄를 발현하였다. 도 7b를 참조한다.
CD19 CAR의 유도성 발현은 형질도입된 Jurkat 세포에서 제시된다. 유도는 웨스턴 블롯을 사용하여 마커 Her2t의 발현을 검출하는 것 뿐만 아니라 CD19CAR의 발현을 검출함으로써 측정될 수 있다. 유도성 구축물에 추가의 선택 마커, DHFRdm을 부가하는 것은 유도성 유전자 발현을 개선시키지 않았다.
TamR CD19CAR LV 형질도입된 인간 CD4 TCM T 세포.
CD4 중심 기억 세포는 마커 CD4, 및 CD62L 및 CD45RO에 대해 유동 세포측정법을 통해 세포를 선택함으로써 말초 혈액으로부터 수득하였다. 세포를 3일 동안 항-CD3/항-CD28 비드와 함께 배양하였다. 3일 후에, CD4 중심 기억 세포는 구축물 A 및 B를 패키징하는 렌티바이러스로 5의 MOI에서 형질도입시켰다 (도 8b). 구축물 A는 트래킹 및 선택 마커 EGFRt에 리보솜 절단 서열, T2A를 통해 연결된 키메라 전사 인자 HEA3을 코딩한다. (표 10; 서열식별번호: 39; 표 1; 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 9 참조). 구축물 B는 T2A를 통해 트랙킹 및 선택을 위한 Her2t에, 및 제2 2a 서열, P2A를 통해 메토트렉세이트 선택 유전자 DHFRdm에 연결된 트랜스진 CD19CAR-의 발현을 조절하는 합성, HEA3-반응성 프로모터, 7xHBD/mE1b를 코딩한다. (표 12; 서열식별번호: 41; 표 2 서열식별번호: 10; 표 13; 서열식별번호: 44; 표 14; 서열식별번호: 46 참조).
형질도입 후 제21일에, 세포를 자기 비드 선택을 이용하여 EGFRt에 대해 풍부화시키고, 후속적으로 조사된 피더 세포, IL2 및 IL15로 확장시켰다. 확장 2주 후, 세포를 동결보존하였다. 상기 설명된 실험에서, 모의 형질도입된 CD4+ CEM 세포, 또는 CD4 +TamR CD19CAR LV를 해동시키고, CD3/CD28 비드, IL-2, IL-15를 갖는 배양물에 넣었다. CD4+TamRCD19CAR LV를 500 nM 4OHT로 24시간 동안 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 모든 샘플은 수거하고, 세척한 다음, EGFRt-APC 항체 및 Her2t-비오틴, 이어서 SA-PE로 염색하고, 유동 세포측정법을 통해 분석하였다. 결과는 도 8에 제시되어 있다.
결과.
도 8의 결과는 타목시펜의 부재 하에 형질도입된 1차 CD4 중심 기억 세포의 75.6%가 EGFRt를 발현한다는 것을 제시하며, 이는 구축물 A의 구성적 발현을 나타낸다. 타목시펜 및 활성화 자극 (예를 들어 항CD3/ 항CD28 비드)의 존재 하에, 1차 세포의 약 14.7%는 EGFRt 및 Her2t 둘 다를 발현한다.
유도인자 및 활성화 자극의 존재 하에 유도성 벡터로 형질도입된 1차 CD4 세포는 마커 유전자 Her2t의 발현에 의해 검출된 바와 같이 유도성 프로모터의 제어 하에 트랜스진을 발현한다. 그러나, 트랜스진을 발현하는 비활성화된 세포는 면역자기 또는 유동 세포측정법 소팅을 사용하여 용이하게 단리될 수 있다. 이들 세포의 추가의 특징화는 CD19CAR의 발현의 검출을 수반할 것이다.
앞서 언급한 것은 본 발명의 예시이지, 그를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명은 하기 청구범위에 의해 정의되며, 청구범위의 등가물은 그에 포함되어야 한다. 본원에 언급된 모든 참고문헌 및 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
<표 1>
항-CD19 짧은 스페이서 키메라 수용체의 서열
Figure 112016108456836-pct00002
Figure 112016108456836-pct00003
<표 2>
Figure 112016108456836-pct00004
Figure 112016108456836-pct00005
Figure 112016108456836-pct00006
<표 3>
ZXR-014 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (섹션의 지도)
Figure 112016108456836-pct00007
<표 4> 유니프롯 P0861 IgG4-Fc(서열식별번호: 13)
Figure 112016108456836-pct00008
<표 5> 유니프롯 P10747 CD28(서열식별번호: 14)
Figure 112016108456836-pct00009
<표 6> 유니프롯 Q07011 4-1BB(서열식별번호: 15)
Figure 112016108456836-pct00010
<표 7> 유니프롯 P20963 인간 CD3ζ 이소형 3 (서열식별번호: 16)
Figure 112016108456836-pct00011
<표 8> 예시적인 힌지 영역 서열
Figure 112016108456836-pct00012
<표 9> Her 2 구축물-짧은 스페이서 (서열식별번호: 1)
Figure 112016108456836-pct00013
Figure 112016108456836-pct00014
<표 10> TamR-tf (HEA3) 핵산 (서열식별번호: 39)
Figure 112016108456836-pct00015
Figure 112016108456836-pct00016
<표 11> TamR-tf (HEA4) 핵산 (서열식별번호: 42) 아미노산 서열 (서열식별번호: 43)
Figure 112016108456836-pct00017
Figure 112016108456836-pct00018
Figure 112016108456836-pct00019
<표 12> 7xHBD/mEF1α 핵산 서열 (서열식별번호: 41)
Figure 112016108456836-pct00020
<표 13> Her2t 핵산 (서열식별번호: 44) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 45)
Figure 112016108456836-pct00021
<표 14> DHFRdm 핵산 (서열식별번호: 46) 및 아미노산 (서열식별번호: 47)
Figure 112016108456836-pct00022
SEQUENCE LISTING <110> Seattle Children's Hospital dba Seattle Children's Research Institute Jensen, Michael C. <120> DRUG REGULATED TRANSGENE EXPRESSION <130> SCRI.053WO <150> 62/058,973 <151> 2014-10-02 <150> 61/977,751 <151> 2014-04-10 <150> 61/986,479 <151> 2014-04-30 <150> 62/089,730 <151> 2014-12-09 <150> 62/090,845 <151> 2014-12-11 <150> 62/088,363 <151> 2014-12-05 <160> 94 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2528 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GMCSFss-Her2scFv-IgG4hinge-CD28tm-41BB-Zeta-T2A-EG FRt <400> 1 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atccccgata tccagatgac ccagtccccg agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg 120 gtcaccatca cctgccgtgc cagtcaggat gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag 180 aaaccaggaa aagctccgaa actactgatt tactcggcat ccttcctcta ctctggagtc 240 ccttctcgct tctctggttc cagatctggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg 300 cagccggaag acttcgcaac ttattactgt cagcaacatt atactactcc tcccacgttc 360 ggacagggta ccaaggtgga gatcaaaggc agtactagcg gcggtggctc cgggggcgga 420 tccggtgggg gcggcagcag cgaggttcag ctggtggagt ctggcggtgg cctggtgcag 480 ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca gcttctggct tcaacattaa agacacctat 540 atacactggg tgcgtcaggc cccgggtaag ggcctggaat gggttgcaag gatttatcct 600 acgaatggtt atactagata tgccgatagc gtcaagggcc gtttcactat aagcgcagac 660 acatccaaaa acacagccta cctgcagatg aacagcctgc gtgctgagga cactgccgtc 720 tattattgtt ctagatgggg aggggacggc ttctatgcta tggactactg gggtcaagga 780 accctggtca ccgtctcgag gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccctatgt 840 tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg 900 ccttcatcat cttttgggtg aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac 960 catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag 1020 aagaagaaga aggaggatgt gaactgcggg tgaagttcag cagaagcgcc gacgcccctg 1080 cctaccagca gggccagaat cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga agggaagagt 1140 acgacgtcct ggataagcgg agaggccggg accctgagat gggcggcaag cctcggcgga 1200 agaaccccca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca 1260 gcgagatcgg catgaagggc gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc ctgtatcagg 1320 gcctgtccac cgccaccaag gatacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccaa 1380 ggctcgaggg cggcggagag ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga 1440 atcccggccc taggatgctt ctcctggtga caagccttct gctctgtgag ttaccacacc 1500 cagcattcct cctgatccca cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag 1560 actcactctc cataaatgct acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg 1620 gcgatctcca catcctgccg gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc 1680 tggatccaca ggaactggat attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga 1740 ttcaggcttg gcctgaaaac aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac 1800 gcggcaggac caagcaacat ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat 1860 ccttgggatt acgctccctc aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca 1920 aaaatttgtg ctatgcaaat acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga 1980 aaaccaaaat tataagcaac agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc 2040 atgccttgtg ctcccccgag ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc 2100 ggaatgtcag ccgaggcagg gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa 2160 gggagtttgt ggagaactct gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca 2220 tgaacatcac ctgcacagga cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg 2280 acggccccca ctgcgtcaag acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg 2340 tctggaagta cgcagacgcc ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg 2400 gatgcactgg gccaggtctt gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg 2460 ccactgggat ggtgggggcc ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct 2520 tcatgtga 2528 <210> 2 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GMCSFRss <400> 2 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atcccc 66 <210> 3 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19scFv DNA <400> 3 gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60 atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120 gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240 gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300 ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360 ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420 cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480 tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540 accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600 agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660 gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720 gtgaccgtga gcagc 735 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4hinge <400> 4 gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36 <210> 5 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 transmembrane domain <400> 5 atgttctggg tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc 60 gtggccttca tcatcttttg ggtg 84 <210> 6 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding 41BB domain <400> 6 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 7 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding CD3Zeta domain <400> 7 cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaatcagctg 60 tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120 cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180 gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240 aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300 tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336 <210> 8 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Self cleaving T2A <400> 8 ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60 cccggcccta gg 72 <210> 9 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFRt <400> 9 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120 aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180 ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240 ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300 gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360 caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420 tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480 gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540 agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600 cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660 ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720 aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780 acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840 gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900 gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960 ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020 ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 1074 <210> 10 <211> 2529 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein that has domains linked as such GMCSFRss - CD19scFv - IgG4hinge - CD28tm - 41BB - CD3Zeta - T2A - EGFRt <400> 10 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120 gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180 aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240 cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300 gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360 ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420 ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc 480 cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540 gtgagctgga tccggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600 agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660 agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720 tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780 accagcgtga ccgtgagcag cgagagcaag tacggaccgc cctgcccccc ttgccctatg 840 ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg 900 gccttcatca tcttttgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 960 ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1020 gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc cgacgcccct 1080 gcctaccagc agggccagaa tcagctgtac aacgagctga acctgggcag aagggaagag 1140 tacgacgtcc tggataagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa gcctcggcgg 1200 aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1260 agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cggggcaagg gccacgacgg cctgtatcag 1320 ggcctgtcca 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peptide <400> 69 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser 20 <210> 70 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Extracellular domain <400> 70 Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe 1 5 10 15 Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser 20 25 30 Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys 35 40 45 Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala 50 55 60 Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser 65 70 75 80 Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly 85 90 95 Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile 100 105 110 Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val 115 120 125 Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp 130 135 140 Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu 145 150 155 160 Pro Gly His Ser Pro Gln 165 <210> 71 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transmembrane domain <400> 71 Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu 1 5 10 15 Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val 20 25 <210> 72 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Intracellular domain <400> 72 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 73 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide <400> 73 Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu 1 5 10 15 Pro Ile Thr Glu Ala 20 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Extracellular domain <400> 74 Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys 1 5 <210> 75 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transmembrane domain <400> 75 Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu 1 5 10 15 Thr Ala Leu Phe Leu 20 <210> 76 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Intracellular domain <400> 76 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg <210> 77 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM I <400> 77 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 20 25 <210> 78 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM 2 <400> 78 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 1 5 10 15 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 20 25 <210> 79 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM 3 <400> 79 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 20 25 <210> 80 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader <400> 80 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atccca 66 <210> 81 <211> 734 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Her2scFV <400> 81 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggaaaagctc cgaaactact gatttactcg gcatccttcc tctactctgg agtcccttct 180 cgcttctctg gttccagatc tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240 gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cattatacta ctcctcccac gttcggacag 300 ggtaccaagg tggagatcaa aggcagtact agcggcggtg gctccggggg cggatccggt 360 gggggcggca gcagcgaggt tcagctggtg gagtctggcg gtggcctggt gcagccaggg 420 ggctcactcc gtttgtcctg tgcagcttct ggcttcaaca ttaaagacac ctatatacac 480 tgggtgcgtc aggccccggg taagggcctg gaatgggttg caaggattta tcctacgaat 540 ggttatacta gatatgccga tagcgtcaag ggccgtttca ctataagcgc agacacatcc 600 aaaaacacag cctacctgca gatgaacagc ctgcgtgctg aggacactgc cgtctattat 660 tgttctagat ggggagggga cggcttctat gctatggact actggggtca aggaaccctg 720 gtcaccgtct cgag 734 <210> 82 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge spacer <400> 82 gagagcaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36 <210> 83 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28tm <400> 83 atgttctggg tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc 60 gtggccttca tcatcttttg ggtg 84 <210> 84 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB <400> 84 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 85 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 zeta <400> 85 cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaatcagctg 60 tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120 cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180 gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240 aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300 tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336 <210> 86 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 86 ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60 cccggcccta gg 72 <210> 87 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tEGFR <400> 87 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120 aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180 ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240 ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300 gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360 caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420 tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480 gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540 agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600 cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660 ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720 aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780 acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840 gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900 gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960 ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020 ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 1074 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized ScFv comprising a variable light chain comprising a CDRL1 sequence <400> 88 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 89 Ser Arg Leu His Ser Gly Val 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 90 Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly 1 5 <210> 91 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 91 Asp Tyr Gly Val Ser 1 5 <210> 92 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 92 Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 93 Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 1 5 <210> 94 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker between the VH and VL chains in the scFv <400> 94 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly

Claims (45)

  1. (a) 서열식별번호: 41에 제시된 핵산 서열을 포함하는 제1 프로모터를 포함하고 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것인 제1 핵산;
    (b) 제1 프로모터에 대한 전사 활성화인자를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 핵산; 및
    (c) 타목시펜, 타목시펜의 대사물, 및 타목시펜의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제
    를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 유도성 발현을 위한 시스템.
  2. 제1항에 있어서, (d) 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성화 자극인자를 추가로 포함하는 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 작용제가 4-히드록시타목시펜 또는 4-히드록시-N-데스메틸타목시펜인 것인 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 제2 프로모터가 구성적 프로모터인 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 제2 프로모터가 EF1αp 프로모터인 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 전사 활성화인자가 4-히드록시타목시펜(4-OHT)-의존성 전사 조절인자(HEA-3) 폴리펩티드를 포함하는 것인 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 전사 활성화인자가 서열식별번호: 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 제1 벡터가 제1 핵산을 포함하고 제2 벡터가 제2 핵산을 포함하는 것인 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 제1 벡터 및 제2 벡터가 바이러스 벡터에 패키징된 것인 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터를 포함하는 것인 시스템.
  11. 제1항에 있어서, 제1 핵산 또는 제2 핵산이 선택 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 시스템.
  12. 제1항에 있어서, 제1 프로모터가 제2 프로모터에 반대 배향에 있는 것인 시스템.
  13. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 시토카인, 케모카인 수용체, 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하고, 여기서 CAR은 리간드 결합 도메인, 스페이서, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 시스템.
  14. 제13항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 CAR을 코딩하는 것인 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 항체 단편인 것인 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 단일 쇄 가변 단편인 것인 시스템.
  17. 제13항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, 및 MAGE A3 TCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 리간드에 결합할 수 있는 것인 시스템.
  18. 제13항에 있어서,
    리간드 결합 도메인이 CD19-결합 도메인 또는 Her2-결합 도메인이거나;
    스페이서가 IgG4 힌지 스페이서이거나;
    막횡단 도메인이 CD28 막횡단 도메인을 포함하거나; 또는
    세포내 신호전달 도메인이 4-1BB 도메인, CD3 제타 도메인, 또는 둘 모두를 포함하는 것인,
    시스템.
  19. 제18항에 있어서,
    리간드 결합 도메인이 서열식별번호: 03 또는 서열식별번호: 81에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나;
    스페이서가 서열식별번호: 04에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나;
    막횡단 도메인이 서열식별번호: 05에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나; 또는
    세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 06, 서열식별번호: 07, 또는 둘 모두에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 도메인을 포함하는 것인,
    시스템.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 및 제2 핵산을 포함하는 생체외(ex vivo) 숙주 세포를 추가로 포함하는 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 숙주 세포가 T 세포인 시스템.
  22. 제20항에 있어서, 숙주 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 전구체 T 세포, 및 조혈 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  23. 제20항에 있어서, 숙주 세포가 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포, 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포인 시스템.
  24. 제20항에 있어서, 숙주 세포가 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4+ 헬퍼 T 림프구 세포인 시스템.
  25. 제20항의 시스템 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, 암 또는 바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 암이 고형 종양을 포함하는 것인 제약 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 암이 유방암, 뇌암, 폐암, 결장암, 신암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 또는 혈액 악성종양인 제약 조성물.
  28. (a) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 시스템을 제공하는 단계;
    (b) 제1 핵산 및 제2 핵산을 단리된 T 세포 집단에 도입시키는 단계; 및
    (c) T 세포 집단을 작용제의 존재 하에 배양하는 단계
    를 포함하는, 주입용 세포 집단을 제조하는 시험관내 방법.
  29. 제28항에 있어서, 단계 (c)가 T 세포 집단을 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성화 자극인자의 존재 하에 배양하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 전사 활성화인자가 서열식별번호: 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 활성화 자극인자가 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함하는 것인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현 수준이, 활성화 자극인자의 존재 하에 배양되지 않은 T 세포 집단에 비해 증가되는 것인 방법.
  33. 제28항에 있어서, T 세포 집단이 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 전구체 T 세포, 및 조혈 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 세포가 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포, 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 세포가 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD4+ 헬퍼 T 림프구 세포인 방법.
  36. 제28항에 있어서, 폴리펩티드가 키메라 항원 수용체 (CAR)인 방법.
  37. 제36항에 있어서, CAR이
    CD19-결합 도메인 또는 Her2-결합 도메인인 리간드 결합 도메인;
    IgG4 힌지 스페이서인 스페이서;
    CD28 막횡단 도메인인 막횡단 도메인; 또는
    4-1BB 도메인, CD3 제타 도메인, 또는 둘 모두인 세포내 신호전달 도메인
    을 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    리간드 결합 도메인이 서열식별번호: 03 또는 서열식별번호: 81에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나;
    스페이서가 서열식별번호: 04에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나;
    막횡단 도메인이 서열식별번호: 05에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나; 또는
    세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 06, 서열식별번호: 07, 또는 둘 모두에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  39. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 시스템을 포함하는, 암 또는 바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한 생체외 숙주 세포.
  40. 제39항에 있어서, 암이 고형 종양을 포함하는 것인 숙주 세포.
  41. 제39항에 있어서, 암이 유방암, 뇌암, 폐암, 결장암, 신암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 또는 혈액 악성종양인 숙주 세포.
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