JP6765967B2

JP6765967B2 - 特定の組成を有する遺伝子により改変されたｔ細胞製剤

Info

Publication number: JP6765967B2
Application number: JP2016561635A
Authority: JP
Inventors: ジェンセン，マイケル，シー．
Original assignee: シアトルチルドレンズホスピタル，ディービーエーシアトルチルドレンズリサーチインスティテュート
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2015-04-08
Publication date: 2020-10-14
Anticipated expiration: 2035-04-08
Also published as: US20170267742A1; KR102387243B9; NZ725081A; AU2021200007A1; EP3129471A1; SG10201808811QA; MY185678A; US20170152297A1; KR102618955B1; CA2945305C; JP7148580B2; IL248243B1; EP3129405A4; KR20160138298A; RU2016143385A; JP6772068B2; RU2016143384A3; WO2015157384A1; KR102509481B1; SG11201608396YA

Description

関連出願の相互参照
本願は、2014年4月10日に出願された米国仮特許出願61/977,751号、2014年4月30日に出願された米国仮特許出願61/986,479号、2014年10月2日に出願された米国仮特許出願62/058,973号、2014年12月5日に出願された米国仮特許出願62/088,363号、2014年12月9日に出願された米国仮特許出願62/089,730号、および2014年12月11日に出願された米国仮特許出願62/090,845号に係る優先権を主張するものである。前記出願の開示は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。

配列表に関する情報
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI-090WO_SEQUENCE_LISTING.TXTのファイル名で2015年3月23日に作成された2.92kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載された情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明の態様は、キメラ抗原受容体を含む遺伝子改変Ｔ細胞を製造するためのアプローチに関する。本発明により開示される方法は、Ｔ細胞の混合集団からＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞を選択かつ／または単離することに関し、選択かつ／または単離されたＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞は、次いで、該細胞の生存、移植および／または増殖を補助しかつ細胞表面受容体（ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、および／またはＣＤ２７など）の維持を向上する１つ以上のサイトカインの存在下での単離培養において、活性化され、遺伝子改変され、かつ増殖される。

同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を行った後に急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）が再発する場合がある。したがって、ＨＳＣＴのようなアプローチは有効ではないと考えている人も多い。腫瘍細胞または悪性Ｂ細胞の表面上に存在する分子に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子導入により改変されたヒトＴリンパ球を養子免疫細胞移入すれば、様々な進行性がんおよび進行性悪性腫瘍を効果的に治療できる可能性がある。しかしながら、長時間持続する有効な治療法を提供するためには、患者への移入後に高い生存率および増殖率を示すキメラ抗原受容体保有Ｔ細胞を投与することが望ましい。さらに、治療に使用するこのようなＴ細胞は、移植に適合していることが望ましい。当技術分野における多大な努力にもかかわらず、さらなる有効な細胞療法が依然として必要とされている。

本明細書に記載の本発明の態様は、ヒトを治療するための、キメラ抗原受容体を含む遺伝子改変Ｔ細胞を製造する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、Ｔ細胞の混合集団からの、たとえば胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋発現Ｔ細胞の選択、濃縮および／または単離を利用した方法を包含する。選択、濃縮または単離されたＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋発現Ｔ細胞は、次いで、活性化され、遺伝子改変され、増殖されるが、この活性化、遺伝子改変および増殖は、１つ以上のサイトカインの存在下での分離培養、濃縮培養または単離培養において行うことが好ましい。該１つ以上のサイトカインは、たとえば前記Ｔ細胞によって産生されうる任意のサイトカインや培地中に存在しうる任意のサイトカインなどに加えて、前記Ｔ細胞に外因的に提供することができる。該１つ以上のサイトカインは、前記Ｔ細胞の生存、移植および／または増殖を補助、促進または誘導するか、前記Ｔ細胞の生存、移植および／または増殖に寄与する。さらに、該１つ以上のサイトカインは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８および／またはＣＤ２７などの細胞表面受容体の維持を補助、促進または誘導するか、該受容体の維持に寄与することが好ましい。本発明は、さらに、がんを治療、抑制、緩和または排除する方法であって、がんの治療、抑制、緩和または排除を必要とする対象に、１つ以上の前記遺伝子改変Ｔ細胞、または本明細書に記載に従って製造された遺伝子改変Ｔ細胞を含む１つ以上の組成物を投与することを含む方法を包含する。

本明細書に記載の本発明の態様のいくつかは、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法に関する。
いくつかのアプローチでは、上記の方法は、
Ｔ細胞の混合集団から、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を分離、単離または濃縮して、該Ｔ細胞が分離、単離また濃縮された集団を作製すること、
前記分離、単離または濃縮されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を、細胞表面選択マーカーをコードするマーカー配列とキメラ抗原受容体とをコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
たとえば該細胞によって産生されうる任意のサイトカインまたは培地中に存在していてもよい任意のサイトカインに加えて、外因性であってもよい少なくとも１つのサイトカインと、前記形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団とを接触させて、前記形質導入されたサイトカイン刺激性ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を前記マーカー配列による選択によって濃縮して、分離、濃縮または単離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記分離、濃縮または単離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を少なくとも２日増殖させて、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を得ること
によって実施する。
いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、これらの時間以上にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって増殖させることによって、キメラ抗原受容体を有する前記遺伝子改変Ｔ細胞を得ることができる。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の前記分離または濃縮は、ＣＤ８および／またはＣＤ４上に存在するエピトープを有するＴ細胞を親和性により選択することによって行う。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の前記分離または濃縮は、フローサイトメトリーによって行う。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の前記分離または濃縮は、免疫磁気選択によって行う。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子改変ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞は、少なくとも１つの受容体を含み、該少なくとも１つの受容体が、移植適合性を向上、誘導または増強するか、移植適合性に寄与する。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記単離されたＴ細胞集団の刺激は、前記ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞と、ビーズまたは粒子などの、抗体を結合させた支持体とを接触させることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記抗体を結合させた支持体は、抗ＴＣＲ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む。いくつかの実施形態においては、前記抗体を結合させた支持体は、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターは、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列、および選択マーカーをコードする第４の配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはＩｇＧ４のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記マーカー配列は、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含み、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬもしくは１．０ｎｇ／ｍＬ、もしくはこれらの量のいずれか２つによって定義される範囲にある量、および／または１０Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ、６０Ｕ／ｍＬ、７０Ｕ／ｍＬ、８０Ｕ／ｍＬ、９０Ｕ／ｍＬまたは１００Ｕ／ｍＬ、もしくはこれらの量のいずれか２つによって定義される範囲にある量で提供することができる。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含み、０．５ｎｇ／ｍＬおよび／または５０Ｕ／ｍＬの量で提供される。いくつかの実施形態においては、前記接触を、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって行う。いくつかの実施形態においては、前記方法は、単離、精製、濃縮または分離されたＣＤ４^＋細胞を使用し、ＣＤ８^＋細胞の非存在下、ＣＤ８^＋細胞が実質的に除去された条件下、またはＣＤ８^＋細胞よりも該ＣＤ４^＋細胞が多く含まれるように濃縮された条件下において実施する。いくつかの実施形態においては、前記方法は、単離、精製、濃縮または分離されたＣＤ８^＋細胞を使用し、ＣＤ４^＋細胞の非存在下、ＣＤ４^＋細胞が実質的に除去された条件下、またはＣＤ４^＋細胞よりも該ＣＤ８^＋細胞が多く含まれるように濃縮された条件下において実施する。いくつかの実施形態においては、少なくとも１日、たとえば、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって、前記ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を増殖させる。いくつかの実施形態においては、少なくとも１日、たとえば、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増殖させる。いくつかの実施形態においては、前記方法は、ビーズまたは粒子などの、前記抗体を結合させた支持体を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的である。いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記遺伝子改変ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞を凍結保存することをさらに含む。

いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団の前記分離、濃縮または単離は、ＣＤ８および／またはＣＤ４上に存在するエピトープを有するＴ細胞を親和性により選択することによって行う。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団の前記分離、濃縮または単離は、フローサイトメトリーによって行う。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団の前記分離、濃縮または単離は、免疫磁気選択によって行う。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子改変ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／または前記遺伝子改変ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞は、少なくとも１つの受容体を含み、該少なくとも１つの受容体は、移植適合性を向上または誘導するか、移植適合性に寄与する。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上または誘導するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの好ましい実施形態において、移植適合性を向上または誘導するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記単離、濃縮または分離されたＴ細胞集団の前記刺激は、前記ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞と、ビーズまたは粒子などの、抗体を結合させた支持体とを接触させることによって行う。前記実施形態のいくつかにおいては、前記抗体を結合させた支持体は、抗ＴＣＲ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む。
いくつかの好ましい実施形態において、前記抗体を結合させた支持体は、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む。

前記実施形態の多くにおいては、前記ベクターは、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列、および選択マーカー配列をコードする第４の配列をさらに含む。前記実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含み、いくつかの実施形態においては、該スペーサーはＩｇＧ４のヒンジ領域を含んでいてもよい。前記実施形態の多くにおいては、前記ベクターはウイルスベクターまたはミニサークル（minicircle）である。

前記実施形態の多くにおいては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであることが好ましい。前記実施形態の多くにおいては、前記マーカー配列は、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。前記実施形態の多くにおいて使用される前記少なくとも１つのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含み、該サイトカインは、たとえば前記Ｔ細胞によって産生されうる任意のサイトカインまたは培地中に存在しうる任意のサイトカインに加えて、外部から前記Ｔ細胞に供給されたものであってもよい。

望ましい実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。前記実施形態の多くにおいては、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。好ましい実施形態においては、前記接触を、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって行う。前記実施形態の多くにおいては、前記方法は、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞の非存在下、またはＴ細胞集団が分離も濃縮も単離もされていない天然集団と比較してＣＤ８^＋発現Ｔ細胞が低減された条件下において、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、単離、分離または濃縮されたＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を使用して行う。前記実施形態の多くにおいては、前記方法は、ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の非存在下、またはＴ細胞集団が分離も濃縮も単離もされていない天然集団と比較してＣＤ４^＋発現Ｔ細胞が低減された条件下において、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、単離、分離または濃縮されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団を使用して行う。前記実施形態の多くにおいては、少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって、前記ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を増殖させる。前記実施形態の多くにおいては、少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって、前記ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を増殖させる。

前記実施形態の多くにおいては、前記方法は、ビーズまたは粒子などの、抗体を結合させた前記支持体を除去することをさらに含む。前記実施形態の多くにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその結合部分を含む。前記実施形態の多くにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む。前記実施形態の多くにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含み、これらは米国特許第７，４４６，１７９号に従って得ることができる（この文献は参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる）。前記実施形態の多くにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的である。前記実施形態の多くにおいては、前記方法は、前記遺伝子改変ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞を凍結保存することをさらに含む。

本発明のさらなる態様は、遺伝子改変Ｔ細胞集団であって、
たとえば胸腺細胞や遺伝子改変された前駆細胞などに由来し、濃縮された状態、たとえば、ＣＤ８⁻Ｔ細胞およびＣＤ４⁻発現Ｔ細胞が含まれないように濃縮された状態、ＣＤ８⁻Ｔ細胞およびＣＤ４⁻発現Ｔ細胞が存在しない状態、またはＣＤ８⁻Ｔ細胞およびＣＤ４⁻発現Ｔ細胞から単離された状態などで、親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を含み、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ発現細胞が、刺激されたＣＤ２受容体、ＣＤ３受容体、ＣＤ４受容体および／またはＣＤ２８受容体を有していること、
前記濃縮されたまたは親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子と細胞表面選択マーカーをコードする遺伝子とをさらに含むこと、ならびに
前記濃縮されたまたは親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞が、少なくとも１つのサイトカインで再刺激されており、該少なくとも１つのサイトカインが、たとえば該Ｔ細胞によって産生されうる任意のサイトカインまたは培地中に存在しうる任意のサイトカインなどに加えて、外部から前記Ｔ細胞に供給されたものであってもよく、前記再刺激が、たとえば、少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって、前記Ｔ細胞と、外部から加えた前記サイトカインと接触させることによって行うこと
を特徴とする遺伝子改変Ｔ細胞集団に関する。
いくつかの実施形態においては、親和性により選択された前記複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞は、少なくとも１つの受容体をさらに含み、該少なくとも１つの受容体は、移植適合性を向上または誘導するか、移植適合性に寄与する。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、誘導または改善するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、誘導または改善するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞は、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列および選択マーカー配列をコードする第４の配列を有するベクターをさらに含む。

いくつかの実施形態は遺伝子改変Ｔ細胞集団に関する。
いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変Ｔ細胞集団は、
親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞が実質的に除去されているか、またはＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞よりも前記ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されていること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、刺激されたＣＤ２受容体、ＣＤ３受容体、ＣＤ４受容体および／またはＣＤ２８受容体を有していること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体と細胞表面選択マーカーとをコードする遺伝子をさらに含むこと、ならびに
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、少なくとも１つのサイトカインで再刺激されていること
を特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞は、少なくとも１つの受容体をさらに含み、該少なくとも１つの受容体は、移植適合性を向上、増強または改善するか、移植適合性に寄与する。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、増強または改善するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、増強または改善するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞は、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列および選択マーカーをコードする第４の配列を有するベクターをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはＩｇＧ４のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記細胞表面選択マーカーは、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的である。いくつかの実施形態においては、前記集団は、単離、精製、分離または濃縮されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が実質的に除去されているか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態においては、前記集団は、単離、精製、分離または濃縮されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が実質的に除去されているか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態においては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含み、該スペーサーは、たとえば、ＩｇＧ４のヒンジ領域を含むスペーサーである。いくつかの実施形態においては、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはミニサークル（minicircle）である。いくつかの実施形態においては、前記細胞表面選択マーカーは、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含み、これらは米国特許第７，４４６，１７９号に従って得ることができる（この文献は参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的である。いくつかの実施形態においては、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞に由来するＴ細胞などの、前記遺伝子改変Ｔ細胞集団は、単離されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を含んでいないか、Ｔ細胞集団が分離も濃縮も単離もされていない天然集団と比較してＣＤ４^＋発現Ｔ細胞が低減されている。いくつかの実施形態においては、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞に由来するＴ細胞などの、前記遺伝子改変Ｔ細胞集団は、単離されたＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を含んでいないか、Ｔ細胞集団が分離も濃縮も単離もされていない天然集団と比較してＣＤ８^＋発現Ｔ細胞が低減されている。

本発明のさらなる態様は、ヒトを治療するための組成物または組み合わせ製剤であって、医薬品添加剤と、少なくとも１つの前記遺伝子改変Ｔ細胞集団とを含む組成物または組み合わせ製剤に関する。いくつかの実施形態においては、前記組成物または組み合わせ製剤は、遺伝子改変ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団を含む。いくつかの実施形態においては、前記組成物または組み合わせ製剤は、遺伝子改変ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を含む。いくつかの実施形態においては、前記組成物または組み合わせ製剤は、前記遺伝子改変ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団と、前記遺伝子改変ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団とを、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１もしくは１０：１の比率、もしくはこれらの比率のいずれか２つによって定義される範囲にある比率で混合集団中に含むか、またはこれらの比率のいずれかで共投与するものである。

本発明の別の態様は、疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、該疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、少なくとも１つの前記組成物または前記組み合わせ製剤を前記対象に投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を投与する前に、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞に由来するＴ細胞などのＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を含む組成物または組み合わせ製剤を投与することを含み、別の実施形態においては、ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を投与する前に、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞に由来するＴ細胞などのＣＤ８^＋発現細胞を投与する。実施形態の多くにおいて、前記対象は、抗がん療法を受ける対象として同定または選択されている。前記方法の実施形態の多くにおいては、前記方法は、疾患の抑制を測定または評価することをさらに含む。前記方法の実施形態の多くにおいては、前記方法は、前記組成物または組み合わせ製剤の投与前、投与中または投与後に、前記対象に別の抗がん療法を提供することをさらに含む。

前記方法の実施形態の多くにおいては、養子細胞移入によって組成物または組み合わせ製剤を前記対象に投与する。いくつかの実施形態においては、前記対象を別の形態の抗がん療法で処置した後に、組成物または組み合わせ製剤を該対象に投与する。前記方法の実施形態の多くにおいては、前記対象は白血病患者である。前記方法の実施形態の多くにおいては、前記対象は、再発性かつ／または化学療法抵抗性のＣＤ１９^＋小児急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する。前記方法の実施形態の多くにおいては、前記対象は、再発性かつ／または化学療法抵抗性のＣＤ１９^＋急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する。前記方法の実施形態の多くにおいては、前記対象は自己免疫疾患患者である。前記方法の実施形態の多くにおいては、前記対象はＨＳＣＴ後の再発を有する。

したがって、本発明の態様のいくつかは以下に関する。
１．キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を製造する方法であって、
Ｔ細胞の混合集団から、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を分離または濃縮して、該Ｔ細胞が分離または濃縮された集団を作製すること、
前記分離または濃縮されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を、細胞表面選択マーカーをコードするマーカー配列とキメラ抗原受容体とをコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、
たとえば該細胞によって産生されうる任意のサイトカインまたは培地中に存在しうる任意のサイトカインに加えて、外部から供給されたものであってもよい少なくとも１つのサイトカインと、前記形質導入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団とを、たとえば、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を前記マーカー配列による選択によって濃縮し、濃縮されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記濃縮されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を少なくとも１日、たとえば、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって増殖させて、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を得ること
を含む方法。
２．Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の分離または濃縮が、ＣＤ８および／またはＣＤ４上に存在するエピトープを有するＴ細胞を親和性により選択することによって行われる、前記１に記載の方法。
３．Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の分離または濃縮が、フローサイトメトリーによって行われる、前記１または２に記載の方法。
４．Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の分離または濃縮が、免疫磁気選択によって行われる、前記１または２に記載の方法。
５．前記遺伝子改変ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの受容体を含み、該少なくとも１つの受容体が、移植適合性を向上、誘導または増強するか、移植適合性に寄与する、前記１〜４のいずれか一項に記載の方法。
６．前記少なくとも１つの受容体が、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである、前記５に記載の方法。
７．前記少なくとも１つの受容体が、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである、前記５または６に記載の方法。
８．前記単離されたＴ細胞集団の刺激が、前記ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞と、ビーズまたは粒子などの、抗体を結合させた支持体とを接触させることによって行われる、前記１〜７のいずれか一項に記載の方法。
９．前記抗体を結合させた支持体が、抗ＴＣＲ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む、前記８に記載の方法。
１０．前記抗体を結合させた支持体が、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む、前記８または９に記載の方法。
１１．前記ベクターが、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列、および選択マーカーをコードする第４の配列をさらに含む、前記１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．前記ベクターが、スペーサーをコードする配列をさらに含む、前記１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．前記スペーサーがＩｇＧ４のヒンジ領域を含む、前記１２に記載の方法。
１４．前記ベクターがウイルスベクターである、前記１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．前記ウイルスベクターが、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する、前記１４に記載の方法。
１６．前記ウイルスベクターが、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである、前記１４または１５に記載の方法。
１７．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、前記１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．前記マーカー配列が、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする、前記１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．前記少なくとも１つのサイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含む、前記１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含み、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬもしくは１．０ｎｇ／ｍＬ、もしくはこれらの量のいずれか２つによって定義される範囲にある量、および／または１０Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ、６０Ｕ／ｍＬ、７０Ｕ／ｍＬ、８０Ｕ／ｍＬ、９０Ｕ／ｍＬまたは１００Ｕ／ｍＬ、もしくはこれらの量のいずれか２つによって定義される範囲にある量で提供することができる、前記１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含み、０．５ｎｇ／ｍＬおよび／または５０Ｕ／ｍＬの量で提供される、前記１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
２２．前記接触を、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって行う、前記１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．単離、精製、濃縮または分離されたＣＤ４^＋細胞を使用し、ＣＤ８^＋細胞の非存在下、ＣＤ８^＋細胞が実質的に除去された条件下、またはＣＤ８^＋細胞よりも前記ＣＤ４^＋細胞が多く含まれるように濃縮された条件下において実施される、前記１〜２０および２２のいずれか一項に記載の方法。
２４．単離、精製、濃縮または分離されたＣＤ８^＋細胞を使用し、ＣＤ４^＋細胞の非存在下、ＣＤ４^＋細胞が実質的に除去された条件下、またはＣＤ４^＋細胞よりも前記ＣＤ８^＋細胞が多く含まれるように濃縮された条件下において実施される、前記１〜１９、２１および２２のいずれか一項に記載の方法。
２５．少なくとも１日、たとえば、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって、前記ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を増殖させる、前記１〜２０、２２および２３のいずれか一項に記載の方法。
２６．少なくとも１日、たとえば、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増殖させる、前記１〜１９、２１、２２および２４のいずれか一項に記載の方法。
２７．ビーズまたは粒子などの、前記抗体を結合させた支持体を除去することをさらに含む、前記８〜２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインが、抗体またはその結合部分を含む、前記１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインが、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む、前記１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
３０．前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインが、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含む、前記１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
３１．前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインが、ＣＤ１９に特異的である、前記１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
３２．前記遺伝子改変ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞を凍結保存することをさらに含む、前記１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
３３．遺伝子改変Ｔ細胞集団であって、
親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞が実質的に除去されているか、またはＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞よりも前記ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されていること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、刺激されたＣＤ２受容体、ＣＤ３受容体、ＣＤ４受容体および／またはＣＤ２８受容体を有していること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体と細胞表面選択マーカーとをコードする遺伝子をさらに含むこと、ならびに
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、少なくとも１つのサイトカインで再刺激されていること
を特徴とする遺伝子改変Ｔ細胞集団。
３４．前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの受容体をさらに含み、該少なくとも１つの受容体が、移植適合性を向上、増強または改善するか、移植適合性に寄与する、前記３３に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
３５．移植適合性を向上、増強または改善するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体が、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである、前記３３または３４に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
３６．移植適合性を向上、増強または改善するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体が、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである、前記３４または３５に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
３７．前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列および選択マーカーをコードする第４の配列を有するベクターをさらに含む、前記３３〜３６のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
３８．前記ベクターが、スペーサーをコードする配列をさらに含む、前記３７に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
３９．前記スペーサーがＩｇＧ４のヒンジ領域を含む、前記３８に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
４０．前記ベクターがウイルスベクターである、前記３３〜３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
４１．前記ウイルスベクターが、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する、前記４０に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
４２．前記ウイルスベクターが、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである、前記４０または４１に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
４３．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、前記４０〜４２のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
４４．前記細胞表面選択マーカーが、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする、前記３３〜４３のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
４５．前記リガンド結合ドメインが、抗体またはその結合部分を含む、前記３７〜４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
４６．前記リガンド結合ドメインが、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む、前記３７〜４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
４７．前記リガンド結合ドメインが、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含む、前記３７〜４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
４８．前記リガンド結合ドメインが、ＣＤ１９に特異的である、前記３７〜４７のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
４９．前記集団が、単離、精製、分離または濃縮されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が実質的に除去されているか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている、前記３３〜４８のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
５０．前記集団が、単離、精製、分離または濃縮されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が実質的に除去されているか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている、前記３３〜４８のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団。
５１．ヒトを治療するための組成物または組み合わせ製剤であって、医薬品添加剤と、前記３３〜５０のいずれか一項または複数項に記載の少なくとも１つの遺伝子改変Ｔ細胞集団とを含む組成物または組み合わせ製剤。
５２．前記４９に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団を含む、前記５１に記載の組成物または組み合わせ製剤。
５３．前記５０に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団を含む、前記４７に記載の組成物または組み合わせ製剤。
５４．前記４９に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団と、前記５０に記載の遺伝子改変Ｔ細胞集団とを含み、これらのＴ細胞集団が１：１の比率で混合されているかまたは共投与される、前記４７に記載の組成物または組み合わせ製剤。
５５．疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、該疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、前記５１〜５４のいずれか一項または複数項に記載の少なくとも１つの組成物または組み合わせ製剤を前記対象に投与することを含む方法。
５６．前記５２に記載の組成物または組み合わせ製剤を投与することを含む、前記５５に記載の方法。
５７．前記５３に記載の組成物または組み合わせ製剤を投与することを含む、前記５５に記載の方法。
５８．前記５３に記載の組成物または組み合わせ製剤を投与することを含む、前記５６に記載の方法。
５９．前記５２に記載の組成物または組み合わせ製剤を投与することを含む、前記５７に記載の方法。
６０．たとえば前記ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を投与する前に前記ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を投与することなどによって前記５４に記載の組成物または組み合わせ製剤の投与を行うことを含み、該ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞の投与が、たとえば、前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞の投与の１分前、２分前、３分前、４分前、５分前、６分前、７分前、８分前、９分前、１０分前、２０分前、３０分前、４０分前、５０分前もしくは６０分前、またはこれらの時間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間に行われる、前記５５に記載の方法。
６１．前記対象が、抗がん療法を受ける対象として同定または選択されている、前記５５〜６０のいずれか一項または複数項に記載の方法。
６２．疾患の抑制を測定または評価することをさらに含む、前記５５〜６１のいずれか一項または複数項に記載の方法。
６３．前記５１〜５４のいずれか一項または複数項に記載の組成物または組み合わせ製剤の投与前、投与中または投与後に、前記対象に別の抗がん療法を提供することをさらに含む、前記５５〜６２のいずれか一項または複数項に記載の方法。
６４．前記５１〜５４のいずれか一項または複数項に記載の組成物または組み合わせ製剤を養子細胞移入によって前記対象に投与する、前記５５〜６３のいずれか一項または複数項に記載の方法。
６５．前記対象を別の形態の抗がん療法で処置した後に、前記５１〜５４のいずれか一項または複数項に記載の組成物または組み合わせ製剤を該対象に投与する、前記５５〜６４のいずれか一項または複数項に記載の方法。
６６．前記対象を別の形態の抗がん療法で処置した後に、前記５１〜５４のいずれか一項または複数項に記載の組成物または組み合わせ製剤を該対象に投与する、前記５５〜６５のいずれか一項または複数項に記載の方法。
６７．前記対象が白血病患者である、前記５５〜６６のいずれか一項または複数項に記載の方法。
６８．前記対象が、再発性かつ／または化学療法抵抗性のＣＤ１９^＋小児急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する、前記５５〜６７のいずれか一項または複数項に記載の方法。
６９．前記対象が、再発性かつ／または化学療法抵抗性のＣＤ１９^＋急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する、前記５５〜６８のいずれか一項または複数項に記載の方法。
７０．前記対象が自己免疫疾患患者である、前記５５〜６９のいずれか一項または複数項に記載の方法。
７１．前記対象がＨＳＣＴ後の再発を有する、前記５５〜７０のいずれか一項または複数項に記載の方法。

図１Ａは、抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞の養子細胞移入後の１１名の患者における該抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞の０日目から６５日目までの絶対数を示す。図１Ｂは、３種の投与量で治療した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞の絶対数を示す。

図２Ａは、抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞の養子細胞移入後の患者の末梢血における該抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞の０日から６５日目までの持続性を示す。図２Ｂは、３種の投与量で治療した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞の持続性を示す。

図３Ａは、抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞の養子細胞移入後の患者の骨髄における該抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞の０日から６５日目までの持続性を示す。図３Ｂは、３種の投与量で治療した後の患者の骨髄における抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞の持続性を示す。

３種の投与量で治療した後の患者Ｘにおける急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の発症率を示す。

前記試験で使用した患者特性を示した表を示す。

疾患および投与量に関連した、ＣＮＳ中リンパ腫の発症を示す。図中、２つの棒グラフは、抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞を含む治療を受けた患者の数および３種の投与量による治療を受けた後の患者の疾患の重症度を示す。

グレード４の脳症を有するＡＬＬ患者の異常ＭＲＩ所見を示す。最初のパネルは、抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞を用いた治療後の結果を示す。

抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞による治療後の急性皮膚移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を示す。パネルＡに示すとおり、Ｓ０３は、ＣＡＲＴ細胞移植の１７日後にグレード２の急性皮膚ＧＶＨＤを新たに発症した。パネルＢでは、皮膚生検により、皮膚局在Ｔ細胞のうちＥＧＦＲｔ^＋を示したのは９％に過ぎず、循環しているＴ細胞では７９％がＥＧＦＲｔ^＋を示したことが明らかになった。これと同時に、パネルＣでは、末梢血中Ｔ細胞の大多数がＣＡＲ^＋であることが示された。この対象を、１ｍｇ／ｋｇのプレドニゾンで２週間治療したところ、ＧＶＨＤが６週間かけて漸減し、消散した。プレドニゾン治療を行っても、この対象の体内では引き続きＣＡＲ^＋Ｔ細胞が持続している。

抗ＣＤ１９ＣＡＲ保有Ｔ細胞を用いた治療後に微少残存病変（ＭＲＤ）のマーカーとしてＩｇまたはＴＣＲを示した患者をまとめた表を示す。

抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の同種造血幹細胞移植後の患者プロファイルを示す表である。

抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後に末梢血およびＣＳＦから単離された細胞のＦＡＣＳ散乱分析を示す。

３種の投与量で抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞を移植した後の腫瘍量と奏効の比較を示す。

３種の投与量の造血幹細胞移植後の患者の寛解持続期間を示す。

２種の投与量で抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞を移植後した後の７日目の腫瘍量と奏効の比較を示す。

３種の投与量で抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞を移植した後の患者におけるＣＡＲ／ＥＧＦＲｔ^＋Ｔ細胞の持続性のおよび持続期間を示す。

３種の投与量で抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞を移植した後のＢ細胞形成不全の持続期間を示す。

３種の投与量で抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞を移植した後の患者のＣＲＳのプロファイルを示す。

遺伝子改変Ｔ細胞の製造を示す２つのフローチャートを示す。図に示したように、初期の増殖方法では、バルク処理を即座に開始しない場合もあった。Ficoll処理は、成分分離血の一部を常に使用して行った。バルク培養を開始しない場合は、Ficollにより分離された細胞を凍結保存した。

キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の種々の製造方法を比較したフローチャートを示す。

培養開始時において様々な濃度の細胞を用いた細胞増殖における最初の比較を示す。図に示したように、ＰＤ００６４はＰＤ００６３ドナーであるが、ＰＤ００６３ドナー由来の濃縮ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を用いて、開始時のＴ２５フラスコにおける培養開始時の細胞密度を試験した。この実験では、２種の細胞密度を試験したが、実験中に早期に細胞培養物の量を増加させた場合、いずれの細胞密度でも高い生存能および増殖が示された。

細胞増殖の開始時における比較を示す。これは、本発明で使用された改良された製造方法に移行した際に使用した実用スケールのデータであった。

ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞およびＣＤ８^＋発現Ｔ細胞の増殖についての試験に使用したサイトカインのカクテルのバリエーションを表したフローチャートを示す。

図２３Ａ〜Ｆは、ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞およびＣＤ８^＋発現Ｔ細胞の増殖中に試験したサイトカインの比較を示す。

図２４Ａ〜Ｆは、ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞およびＣＤ８^＋発現Ｔ細胞の増殖において試験したサイトカインの比較を示す。

図２５Ａ〜Ｂは、細胞増殖についてサイトカインを比較した結果を示す。新たなＣＤ４およびＣＤ８ドナー（ＰＤ００５７）を使用して試験を行ったこと以外は、ＰＤ００５１での実験と同様にしてＰＤ００５９ドナー試料のサイトカイン実験を行った。

初期の増殖方法と、様々なサイトカイン混合物を試験した実験に基づく本発明の増殖方法とを示すフローチャートを示す。

図２７は、試料ＰＤ００８０、ＰＤ０８４およびＰＤ００８５の増殖を比較した結果を示す。これらの実験は「早期増殖」法の反復試験であった。

遺伝子改変細胞を製造するためにＰＤ００４４を評価した試験を示す。最初のスケールアップを行うため、選択後に凍結保存された細胞から得たＰＬＡＴ−０２（第Ｉ相および第II相試験）「事前評価済み（pre-qual）」細胞を使用した。

ＰＬＡＴ−０２「Ｑｕａｌｒｕｎ＃１」のスケールアップ実験において遺伝子改変細胞を製造するためにＰＤ００４６を評価した試験を示す。

遺伝子改変細胞を製造するためにＰＤ００６３を評価した試験を示す。ＰＬＡＴ−０２「Ｑｕａｌｒｕｎ＃２」またはこのスケールアップ実験において行った。増殖曲線は、２つのＶ−１９７細胞バッグから得た総細胞数（ＴＮＣ）を合わせて示す。次いで、ビーズ除去およびＥＧＦＲｔ濃縮を、ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞は１４日目（D+14）に行い、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞は１５日目（D+15）に行った。ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞をＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）／ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させ、ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞はＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）／ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させた。ビーズ除去およびＥＧＦＲｔ濃縮を、ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞は１２日目に行い、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞は１３日目に行った。

図３１Ａ〜Ｂは、サイトカインの存在下で増殖させたときのバルクＰＢＭＣ培養物の細胞の増殖を示す。図に示したように、ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞（●）をＩＬ−２およびＩＬ−１５の存在下で増殖させた。ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞（■）をＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で増殖させた。

図３２Ａ〜Ｂは、サイトカイン混合物の存在下における濃縮ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および濃縮ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の増殖を示す。試料ＰＤ００４４に示したように、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の存在下で濃縮ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を増殖させた。試料ＰＤ００４４では、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で濃縮ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を２０日間にわたって増殖させた。

図１８のフローチャートに示した早期増殖方法を用いた、濃縮ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞および濃縮ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞の増殖を示す。試料１４６０２−Ｓ０１、試料１４６０２−Ｓ０２および試料１４６０２−Ｓ０３／１４６０２−Ｓ０３−０２中の細胞を用いた実験を示す。

図１８のフローチャートに示した早期増殖方法を用いた、濃縮ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞および濃縮ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞の増殖を示す。試料１４６０２−Ｓ０４／１４６０２−Ｓ０４−０２、試料１４６０２−Ｓ０５、試料１４６０２−Ｓ０６および試料１４６０２−Ｓ０６−２／１４６０２−Ｓ０６−０４中の細胞を用いた実験を示す。

図１８のフローチャートに示した「早期増殖法」を用いた、濃縮ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞および濃縮ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞の増殖を示す。試料１４６０２−Ｓ０７、１４６０２−Ｓ０８、および１４６０２−Ｓ０９中の細胞を用いた実験を示す。

試料１４６０２−Ｓ１０、試料１４６０２−Ｓ１１、試料１４６０２−Ｓ１２、および試料１４６０２−Ｓ１３中の細胞の増殖を示す。

試料１４６０２−Ｓ１４、試料１４６０２−Ｓ１５、および試料１４６０２−Ｓ１６中の細胞の増殖を示す。

濃縮ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞および濃縮ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞が細胞増殖の後でも選択された表現型を発現していたことを示す。

図３９Ａ〜Ｂは、試料ＰＤ０００４４およびＰＤ０００４６から得た細胞を注射したマウスの生存を示す。ＰＤ０００４６細胞は、移植適合性マーカー（ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、およびＣＤ６２Ｌ）を発現することが認められた。

ＰＤ００４４細胞バッチおよびＰＤ００４６細胞バッチから得た細胞で処置したマウスにおける平均腫瘍進行を示す。

移植適合性を有するように製造されたＴ細胞で処置したマウスにおける腫瘍進行を試験するための実験のセットアップを示す。

試料ＰＤ００５１および試料ＰＤ０００５５から得たＣＤ４^＋発現Ｔ細胞とＣＤ８^＋発現Ｔ細胞との動物への投与日における比較、ならびにサイトカイン増殖条件を示す。

ＰＢＳ、ＰＤ００５１（通常増殖細胞）およびＰＤ０００５５（サイトカインの組み合わせの存在下で増殖させた細胞）で処置した３つのマウス群の比較を示す。

ＥＧＦＲｔＣＡＲマーカーの検出によるマウス末梢血におけるＴ細胞の持続性を示す。

インビトロにおいて様々なサイトカイン条件下で増殖させた細胞をインビボで抗原と繰り返し遭遇させた場合に殺傷能力に違いが見られるかどうかを評価するための、３つのマウス群を用いた試験の実験のセットアップを示す。

ＰＤ００５１またはＰＤ００５５で処置したマウスの治療後０日目から１２０日目までの腫瘍進行を示す。

抗原に繰り返し曝露させることによって刺激したＰＤ００５１細胞およびＰＤ００５５細胞を示す。

ＪＭＥ１３−２９において「通常の増殖方法で得た細胞」とサイトカインの組み合わせでパルスしたＴ細胞とをＲａｊｉ腫瘍細胞で繰り返し刺激した場合の比較を示す。

ＰＬＡＴ−０１（第Ｉ相臨床試験）およびＰＬＡＴ−０２（第Ｉ相および第II相臨床試験）と同じ条件下またはこれらの「間」のプロトコルで増殖させた細胞間でインビボにおける殺傷能力に違いが見られるかどうかを評価するため実験のセットアップを示す。

ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞およびＣＤ４^＋発現Ｔ細胞由来の細胞製剤およびそのＥＧＦＲｔレベルを示す表を示す。

特定濃度の用量漸増法においてＴ細胞で処置した後の平均腫瘍進行を示す。

Ｔ細胞治療を受けた投与群内におけるＰＬＡＴの比較を示す。

図５３Ａ〜Ｅは、同等の用量濃度のＰＬＡＴ−１．００製剤、ＰＬＡＴ−１．３３製剤、ＰＬＡＴ−１．６７製剤およびＰＬＡＴ−２．００製剤から得たＴ細胞の比較を示す。これらの図は個々の動物の腫瘍進行を示す。用量漸増法における各折れ線グラフの起点では、各ＰＬＡＴ群の様々な用量がまとまって示されているが、用量が増加するにつれて別々に分かれていく。

ＰＬＡＴ−１．００製剤、ＰＬＡＴ−１．３３製剤、ＰＬＡＴ−１．６７製剤およびＰＬＡＴ−２．００製剤から得たＴ細胞で処置したマウスの用量漸増法による生存率を示す。これらの図は、細胞治療を受けた投与群内におけるＰＬＡＴの比較を示す。

生存曲線によるＰＬＡＴの比較を示す。これらの図は、特定用量でのＴ細胞治療後の平均腫瘍進行を示す。

通常の増殖方法でＴ細胞を増殖させた場合またはサイトカインの存在下で増殖させた場合のＴ細胞治療に応答したマウスの生存率を示す。この図では、Ｔ細胞治療後にマウスが異種移植片対宿主病を発症したかどうかも示されている。

図５８Ａ〜Ｃは、通常の増殖方法でＴ細胞を増殖させた場合またはサイトカインの存在下で増殖させた場合のＴ細胞治療に応答したマウスの生存率を示す。これら図では、Ｔ細胞治療後にマウスが異種移植片対宿主病を発症したかどうかも示されている。

図５９Ａ〜Ｈは、通常の増殖方法でＴ細胞を増殖させた場合またはサイトカインの存在下で増殖させた場合のＴ細胞治療に応答したマウスの生存率を示す。これら図では、Ｔ細胞治療後にマウスが異種移植片対宿主病を発症したかどうかも示されている。

図６０Ａ〜Ｄは、通常の増殖方法でＴ細胞を増殖させた場合またはサイトカインの存在下で増殖させた場合のＴ細胞治療に応答したマウスの生存率を示す。これら図では、Ｔ細胞治療後にマウスが異種移植片対宿主病を発症したかどうかも示されている。

Ｔ細胞治療後の５１日目および９０日目におけるＪＭＥ１４−０３Ｎ群を示した表を示す。

下記の用語の定義は、本明細書に記載の実施形態のいくつかの理解を容易にするために提供される。

本明細書に記載の「１つの（aまたはan）」は、１または１以上を意味しうる。

本明細書に記載の「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指し、たとえば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製されたフラグメント、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、エキソヌクレアーゼ作用および合成のいずれかにより作製されたフラグメントなどが挙げられる。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（たとえば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー）からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されうる。改変ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に改変を有していてもよい。糖部分の改変としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、あるいは、糖部分はエーテル化またはエステル化されてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖および炭素環式糖類似体が挙げられる。改変された塩基部分としては、アルキル化プリンおよびアルキル化ピリミジン、アシル化プリンおよびアシル化ピリミジン、ならびにその他の公知の複素環置換が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合、ホスホロアミデート結合などが挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、天然の核酸塩基または改変された核酸塩基が付加されたポリアミド骨格を含む。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。

本明細書に記載の「遺伝子改変」は、遺伝子工学技術を利用して改変した遺伝子物質（たとえば核酸など）を使用して、細菌、Ｔ細胞、細菌細胞、真核細胞、昆虫、植物哺乳動物などの生物や細胞を改変する方法をいう。たとえば、ＤＮＡなどの核酸を宿主ゲノムに挿入することができ、これは、分子クローニング法を用いて単離した目的の遺伝子物質を複製してＤＮＡ配列を作製するか、あるいは目的のＤＮＡを合成し、次いで得られたこの構築物を宿主生物に挿入することによって行うことができる。遺伝子は、ヌクレアーゼを用いて除去または「ノックアウト」することもできる。遺伝子ターゲティングは、相同組換えにより内在性遺伝子を改変する別の技術であり、遺伝子欠失、エクソンの除去、遺伝子の付加または点突然変異導入を行うために使用されうる。

本明細書では、形質導入による遺伝子改変について述べられている。「形質導入」とは、ベクターを介してＤＮＡやＲＮＡなどの遺伝子物質を細胞に導入する方法をいう。一般的な技術ではウイルスベクター、エレクトロポレーション、および細胞透過性を高める化学試薬を用いる。ＤＮＡは、ウイルスまたはウイルスベクターを介して導入することができる。本明細書に記載されているように、免疫ＣＤ４^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞を改変するための方法が提供される。治療用遺伝子の高発現を達成するため、かつ／または細胞表面上のキメラ抗原受容体の発現量を増加させるために、たとえば、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子物質をＴ細胞に形質導入することができる。Ｔ細胞は、ウイルスを用いて遺伝子改変することができる。遺伝子治療に一般に使用されるウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスおよびレンチウイルスである。

キメラ抗原受容体をコードする核酸の送達のための組換え感染性ウイルス粒子を利用した様々な形質導入技術が開発されてきた。このような形質導入技術は、Ｔリンパ球を形質導入するためのアプローチとして現時点では好ましい。本明細書に記載されているように、形質導入に使用されるウイルスベクターとしては、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスに由来するウイルスベクターが挙げられる。このように、遺伝子導入方法および発現方法としては様々なものが存在するが、このような方法は、哺乳類細胞に遺伝物質を導入して発現させることを本質的な機能とする。前記形質導入技術のいくつかは、造血細胞またはリンパ球に形質導入することを目的として使用することができ、このような形質導入技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、組換えアデノウイルスによる感染、アデノ随伴ウイルスによる感染、レンチウイルスによる感染、およびレトロウイルスベクターによる感染が挙げられる。初代Ｔリンパ球の形質導入は、エレクトロポレーションおよびレトロウイルスまたはレンチウイルスの感染によって成功を収めている。したがって、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを使用することによって、真核細胞への遺伝子導入を非常に効率的に行うことができる。レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを使用することによって、Ｔ細胞への遺伝子導入を非常に効率的に行うことができる。さらに、レトロウイルスまたはレンチウイルスの組み込みは制御下で行うことができ、細胞１個あたり１コピーまたは数コピーの新しい遺伝情報を安定して組み込むことができる。

「発現ベクター」または本明細書に記載のベクターは、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。通常、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、プロモーターの制御下に置かれた遺伝子はプロモーターに「作動可能に連結されている」と言われる。同様に、調節因子がコアプロモーターの活性を調節する場合、調節因子とコアプロモーターは作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
該遺伝子改変Ｔ細胞が、たとえば、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞に由来するＴ細胞などであり、
該方法が、
Ｔ細胞の混合集団から、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を分離、単離または濃縮して、該Ｔ細胞が単離、分離または濃縮された集団を作製すること、
前記単離、分離または濃縮されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を、細胞表面選択マーカーをコードするマーカー配列とキメラ抗原受容体とをコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団と、少なくとも１つのサイトカインとを、少なくとも１日、たとえば１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を前記マーカー配列によりコードされる前記マーカーによる選択によって濃縮、分離または単離して、濃縮、分離、または単離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記濃縮、分離または単離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって増殖させて、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を得ること
を含む方法が提供される。
前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターはウイルスベクターである。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

「５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）」としても知られる「リーダー配列」は、開始コドンの上流に位置するｍＲＮＡ領域であり、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳制御にとって重要である。キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、前記キメラ抗原受容体をコードするベクターは、リーダー配列をコードする配列を含む。

本明細書に記載の「リガンド」とは、別の分子や生体分子とともに複合体を形成して、シグナル誘発などの生物学的作用を引き起こすことが可能な小分子である。リガンドの結合は、分子間力によって行われ、たとえばイオン結合、水素結合、およびファンデルワールス相互作用によって行われうる。リガンドが受容体タンパク質に結合することによって、三次元構造が変化し、その機能的状態が決定されうる。

リガンドとしては、たとえば、基質、タンパク質、小分子、阻害因子、活性化因子および神経伝達物質が挙げられるが、これらに限定されない。リガンドの結合強度は、結合親和性とも呼ばれ、直接的相互作用および解離作用によって決定されうる。リガンドは、「リガンド結合ドメイン」による結合を受ける。「リガンド結合ドメイン」は、特異的リガンドと結合する可能な構造における保存配列を意味しうる。リガンド結合ドメインは、１つまたは複数のリガンドに特異的な特異的タンパク質ドメインでありうるが、これに限定されない。

「特異的」または「特異性」は、結合パートナーに対するリガンドの特性、あるいはリガンドに対する結合パートナーの特性を指すことができ、結合に特異的な相補的形状、電荷性および疎水性が挙げられる。結合に関与する特異性としては、立体特異性、領域選択性、および化学選択性が挙げられる。

「共刺激ドメイン」としても知られている「シグナル伝達ドメイン」は、タンパク質または受容体タンパク質の細胞内ドメインすなわち細胞質ドメインであり、細胞内部と相互作用して、シグナルを中継することにより機能する。細胞の細胞内部分に属するこのようなタンパク質部分は「エンドドメイン（endodomain）」とも称される。上記の相互作用は、エフェクター分子またはエフェクタータンパク質との特異的なタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−リガンド相互作用を介した細胞内ドメインによる伝達によって起こりうり、次いでシグナル連鎖に沿ってシグナルをその目的地へと送ることができる。

「シグナル伝達ドメイン」あるいは「共刺激ドメイン」は、たとえばＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３ζ鎖によって提供される一次シグナルに加えて、たとえば、免疫応答、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞溶解活性、パーフォリン活性および／またはグランザイム活性などのＴ細胞応答を媒介するシグナルをＴ細胞に提供するシグナル伝達部分を指すこともできる。シグナル伝達ドメインあるいは共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３などの分子全体、および／またはＣＤ８３と特異的に結合するリガンド全体、またはこれらの分子やリガンドの一部を含んでいてもよいが、これらに限定されない。

「選択マーカー配列」は、人為的な選択のための特性を付与するために、ベクターまたは細胞に導入される遺伝子である。選択マーカー配列すなわちマーカー配列は、スクリーニング可能なマーカーであってもよく、このようなマーカー配列を使用することによって、研究者が望ましい細胞と望ましくない細胞とを識別すること、または特定の種類の細胞を濃縮することが可能となる。キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、マーカー配列を含むキメラ抗原受容体をコードするベクターが提供され、前記マーカー配列は細胞表面選択マーカーをコードする。

いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
Ｔ細胞の混合集団から、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を分離、単離または濃縮して、該Ｔ細胞が単離、分離または濃縮された集団を作製すること、
前記単離、分離または濃縮されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を、細胞表面選択マーカーをコードするマーカー配列とキメラ抗原受容体とをコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
たとえば該Ｔ細胞によって産生される任意のサイトカインまたは培地中に存在しうる任意のサイトカインに加えて、外部から供給されたものであることが好ましい少なくとも１つのサイトカインと、前記形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団とを、少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を前記マーカー配列によりコードされる前記マーカーによる選択によって分離、濃縮または単離して、濃縮、分離、または単離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記濃縮、分離または単離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって増殖させて、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を得ること
を含む方法が提供される。

前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列、および選択マーカー配列をコードする第４の配列をさらに含む。
前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記スペーサーはＩｇＧ４のヒンジ領域を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターはウイルスベクターである。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記マーカー配列は、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその結合部分を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的である。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、マーカー配列をコードする配列を含む。前記実施形態のいくつかにおいては、前記マーカー配列は末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）である。

本明細書に記載の「コドン最適化」は、タンパク質の発現効率を最大化できることが知られているコドンへと、特定のコドンを変更する設計工程を指す。いくつかの実施形態においては、ヒトにおける発現を目的としたコドンの最適化が述べられており、コドンの最適化は、ヒトにおけるｍＲＮＡおよびタンパク質の収率の増加に最適化された合成遺伝子転写産物を作製するための、当業者に公知のアルゴリズムを使用することによって実施できる。ヒトにおけるコドン最適化のためのアルゴリズムを含んだプログラムは容易に入手可能である。このようなプログラムとしては、たとえば、OptimumGene^TMアルゴリズムまたはGeneGPS（登録商標）アルゴリズムが挙げられる。さらに、ヒトに対してコドンが最適化された配列は、たとえば、Integrated DNA Technologies社から入手できる。

いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
Ｔ細胞の混合集団から、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を分離、単離または濃縮して、該Ｔ細胞が単離、分離または濃縮された集団を作製すること、
前記単離、分離または濃縮されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を、細胞表面選択マーカーをコードするマーカー配列とキメラ抗原受容体とをコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
たとえば該Ｔ細胞によって産生される任意のサイトカインまたは培地中に存在しうる任意のサイトカインに加えて、外部から供給されたものであることが好ましい少なくとも１つのサイトカインと、前記形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団とを、少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を前記マーカー配列によりコードされる前記マーカーによる選択によって濃縮、単離または分離して、濃縮、単離または分離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記濃縮、分離または単離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって増殖させて、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を得ること
を含む方法が提供される。
前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列、および選択マーカー配列をコードする第４の配列をさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターの配列は、ヒトにおける発現を目的としてコドン最適化されている。いくつかの実施形態においては、前記ベクターの配列は、特にヒト細胞におけるタンパク質の発現が最大となる選択されたコドンを有するように最適化されており、このように選択されたコドンによって、Ｔ細胞におけるタンパク質またはＣＡＲの濃度を増加させることができる。

最適化することによって、ポリヌクレオチドの二次構造の形成を低下させることもできる。前記方法の実施形態のいくつかのにおいては、ベクター内の配列を最適化することによって、総ＧＣ／ＡＴ比を低下させることもできる。コドンの最適化を厳密に行うと、望ましくない二次構造が形成されたり、ＧＣ含量が高くなって二次構造が形成されるという望ましくない結果になったりする場合がある。したがって、二次構造は転写効率に影響を与える。コドン使用の最適化を行った後にGeneOptimizerなどのプログラムを使用することによって、二次構造の形成を回避したり、ＧＣ含量を最適化したりすることができる。このようなさらなるプログラムは、最初のコドン最適化を行った後にさらに最適化を実施したり、トラブルシューティングを行うために使用することができ、それによって、１回目の最適化の後で起こりうる二次構造の形成を制限することができる。最適化のための他のプログラムも容易に入手可能である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、ベクターは、二次構造の形成を回避できるように最適化された配列、および／または総ＧＣ／ＡＴ比が低下するように最適化された配列、および／またはヒトにおける発現を目的として最適化された配列を含む。

マーカードメインは、本明細書に記載の実施形態に重要な要素を提供することもできる。細胞表面上のマーカードメインの利用することによって、形質導入Ｔ細胞の投与または存在に伴う毒性といった有害事象が起こった際に形質導入リンパ球を除去することが可能となる。たとえば、ＥＧＦＲｔマーカー配列の場合、ＥＧＦＲに対する完全長抗体を利用して、ＥＧＦＲを発現する細胞に該抗体を結合させ、これらの細胞を抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により殺傷することができる。いくつかの実施形態においては、マーカードメインに特異的な抗体を、放射性核種または毒素などの細胞傷害薬に結合させることができ、このようにして、インビボで形質導入細胞を除去または殺傷することができる治療薬が得られる。いくつかの実施形態において、マーカー配列は、濃縮および細胞選択のために提供される。本明細書に記載の典型的な実施形態においては、ＥＧＦＲｔマーカー配列を使用して精製および濃縮を行い、ＥＧＦＲｔマーカーに対する免疫磁気選択を実施することができる。

本明細書に記載の「スペーサー」は、特定の長さを有するポリペプチド鎖を意味することができ、スペーサーの長さは、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、２１アミノ酸長、２２アミノ酸長、２３アミノ酸長、２４アミノ酸長、２５アミノ酸長、２６アミノ酸長、２７アミノ酸長、２８アミノ酸長、２９アミノ酸長、３０アミノ酸長、３１アミノ酸長、３２アミノ酸長、３３アミノ酸長、３４アミノ酸長、３５アミノ酸長、３６アミノ酸長、３７アミノ酸長、３８アミノ酸長、３９アミノ酸長、４０アミノ酸長、４１アミノ酸長、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、６０アミノ酸長、６１アミノ酸長、６２アミノ酸長、６３アミノ酸長、６４アミノ酸長、６５アミノ酸長、６６アミノ酸長、６７アミノ酸長、６８アミノ酸長、６９アミノ酸長、７０アミノ酸長、７１アミノ酸長、７２アミノ酸長、７３アミノ酸長、７４アミノ酸長、７５アミノ酸長、７６アミノ酸長、７７アミノ酸長、７８アミノ酸長、７９アミノ酸長、８０アミノ酸長、８１アミノ酸長、８２アミノ酸長、８３アミノ酸長、８４アミノ酸長、８５アミノ酸長、８６アミノ酸長、８７アミノ酸長、８８アミノ酸長、８９アミノ酸長、９０アミノ酸長、９１アミノ酸長、９２アミノ酸長、９３アミノ酸長、９４アミノ酸長、９５アミノ酸長、９６アミノ酸長、９７アミノ酸長、９８アミノ酸長、９９アミノ酸長、１００アミノ酸長、１０１アミノ酸長、１０２アミノ酸長、１０３アミノ酸長、１０４アミノ酸長、１０５アミノ酸長、１０６アミノ酸長、１０７アミノ酸長、１０８アミノ酸長、１０９アミノ酸長、１１０アミノ酸長、１１１アミノ酸長、１１２アミノ酸長、１１３アミノ酸長、１１４アミノ酸長、１１５アミノ酸長、１１６アミノ酸長、１１７アミノ酸長、１１８アミノ酸長、１１９アミノ酸長、１２０アミノ酸長、１２１アミノ酸長、１２２アミノ酸長、１２３アミノ酸長、１２４アミノ酸長、１２５アミノ酸長、１２６アミノ酸長、１２７アミノ酸長、１２８アミノ酸長、１２９アミノ酸長、１３０アミノ酸長、１３１アミノ酸長、１３２アミノ酸長、１３３アミノ酸長、１３４アミノ酸長、１３５アミノ酸長、１３６アミノ酸長、１３７アミノ酸長、１３８アミノ酸長、１３９アミノ酸長、１４０アミノ酸長、１４１アミノ酸長、１４２アミノ酸長、１４３アミノ酸長、１４４アミノ酸長、１４５アミノ酸長、１４６アミノ酸長、１４７アミノ酸長、１４８アミノ酸長、１４９アミノ酸長、１５０アミノ酸長、１５１アミノ酸長、１５２アミノ酸長、１５３アミノ酸長、１５４アミノ酸長、１５５アミノ酸長、１５６アミノ酸長、１５７アミノ酸長、１５８アミノ酸長、１５９アミノ酸長、１６０アミノ酸長、１６１アミノ酸長、１６２アミノ酸長、１６３アミノ酸長、１６４アミノ酸長、１６５アミノ酸長、１６６アミノ酸長、１６７アミノ酸長、１６８アミノ酸長、１６９アミノ酸長、１７０アミノ酸長、１７１アミノ酸長、１７２アミノ酸長、１７３アミノ酸長、１７４アミノ酸長、１７５アミノ酸長、１７６アミノ酸長、１７７アミノ酸長、１７８アミノ酸長、１７９アミノ酸長、１８０アミノ酸長、１８１アミノ酸長、１８２アミノ酸長、１８３アミノ酸長、１８４アミノ酸長、１８５アミノ酸長、１８６アミノ酸長、１８７アミノ酸長、１８８アミノ酸長、１８９アミノ酸長、１９０アミノ酸長、１９１アミノ酸長、１９２アミノ酸長、１９３アミノ酸長、１９４アミノ酸長、１９５アミノ酸長、１９６アミノ酸長、１９７アミノ酸長、１９８アミノ酸長、１９９アミノ酸長、２００アミノ酸長、２０１アミノ酸長、２０２アミノ酸長、２０３アミノ酸長、２０４アミノ酸長、２０５アミノ酸長、２０６アミノ酸長、２０７アミノ酸長、２０８アミノ酸長、２０９アミノ酸長、２１０アミノ酸長、２１１アミノ酸長、２１２アミノ酸長、２１３アミノ酸長、２１４アミノ酸長、２１５アミノ酸長、２１６アミノ酸長、２１７アミノ酸長、２１８アミノ酸長、２１９アミノ酸長、２２０アミノ酸長、２２１アミノ酸長、２２２アミノ酸長、２２３アミノ酸長、２２４アミノ酸長、２２５アミノ酸長、２２６アミノ酸長、２２７アミノ酸長、２２８アミノ酸長、２２９アミノ酸長、２３０アミノ酸長、２３１アミノ酸長、２３２アミノ酸長、２３３アミノ酸長、２３４アミノ酸長、２３５アミノ酸長、２３６アミノ酸長、２３７アミノ酸長、２３８アミノ酸長、２３９アミノ酸長または２４０アミノ酸長の範囲にあってもよく、これらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さであってもよい。スペーサーは２０種のアミノ酸のうち任意のものを含むことができ、たとえば、キメラ抗原受容体において望ましい長さのポリペプチド鎖を形成するために任意の順序で任意のアミノ酸を含んでいてもよく、前記２０種のアミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、および／またはトリプトファンが挙げられる。スペーサー配列は、ｓｃＦＶとキメラ抗原受容体の膜貫通ドメインとの間に位置するリンカーであってもよい。キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、スペーサーは、特定の長さの配列を含み、該配列の長さは、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、２１アミノ酸長、２２アミノ酸長、２３アミノ酸長、２４アミノ酸長、２５アミノ酸長、２６アミノ酸長、２７アミノ酸長、２８アミノ酸長、２９アミノ酸長、３０アミノ酸長、３１アミノ酸長、３２アミノ酸長、３３アミノ酸長、３４アミノ酸長、３５アミノ酸長、３６アミノ酸長、３７アミノ酸長、３８アミノ酸長、３９アミノ酸長、４０アミノ酸長、４１アミノ酸長、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、６０アミノ酸長、６１アミノ酸長、６２アミノ酸長、６３アミノ酸長、６４アミノ酸長、６５アミノ酸長、６６アミノ酸長、６７アミノ酸長、６８アミノ酸長、６９アミノ酸長、７０アミノ酸長、７１アミノ酸長、７２アミノ酸長、７３アミノ酸長、７４アミノ酸長、７５アミノ酸長、７６アミノ酸長、７７アミノ酸長、７８アミノ酸長、７９アミノ酸長、８０アミノ酸長、８１アミノ酸長、８２アミノ酸長、８３アミノ酸長、８４アミノ酸長、８５アミノ酸長、８６アミノ酸長、８７アミノ酸長、８８アミノ酸長、８９アミノ酸長、９０アミノ酸長、９１アミノ酸長、９２アミノ酸長、９３アミノ酸長、９４アミノ酸長、９５アミノ酸長、９６アミノ酸長、９７アミノ酸長、９８アミノ酸長、９９アミノ酸長、１００アミノ酸長、１０１アミノ酸長、１０２アミノ酸長、１０３アミノ酸長、１０４アミノ酸長、１０５アミノ酸長、１０６アミノ酸長、１０７アミノ酸長、１０８アミノ酸長、１０９アミノ酸長、１１０アミノ酸長、１１１アミノ酸長、１１２アミノ酸長、１１３アミノ酸長、１１４アミノ酸長、１１５アミノ酸長、１１６アミノ酸長、１１７アミノ酸長、１１８アミノ酸長、１１９アミノ酸長、１２０アミノ酸長、１２１アミノ酸長、１２２アミノ酸長、１２３アミノ酸長、１２４アミノ酸長、１２５アミノ酸長、１２６アミノ酸長、１２７アミノ酸長、１２８アミノ酸長、１２９アミノ酸長、１３０アミノ酸長、１３１アミノ酸長、１３２アミノ酸長、１３３アミノ酸長、１３４アミノ酸長、１３５アミノ酸長、１３６アミノ酸長、１３７アミノ酸長、１３８アミノ酸長、１３９アミノ酸長、１４０アミノ酸長、１４１アミノ酸長、１４２アミノ酸長、１４３アミノ酸長、１４４アミノ酸長、１４５アミノ酸長、１４６アミノ酸長、１４７アミノ酸長、１４８アミノ酸長、１４９アミノ酸長、１５０アミノ酸長、１５１アミノ酸長、１５２アミノ酸長、１５３アミノ酸長、１５４アミノ酸長、１５５アミノ酸長、１５６アミノ酸長、１５７アミノ酸長、１５８アミノ酸長、１５９アミノ酸長、１６０アミノ酸長、１６１アミノ酸長、１６２アミノ酸長、１６３アミノ酸長、１６４アミノ酸長、１６５アミノ酸長、１６６アミノ酸長、１６７アミノ酸長、１６８アミノ酸長、１６９アミノ酸長、１７０アミノ酸長、１７１アミノ酸長、１７２アミノ酸長、１７３アミノ酸長、１７４アミノ酸長、１７５アミノ酸長、１７６アミノ酸長、１７７アミノ酸長、１７８アミノ酸長、１７９アミノ酸長、１８０アミノ酸長、１８１アミノ酸長、１８２アミノ酸長、１８３アミノ酸長、１８４アミノ酸長、１８５アミノ酸長、１８６アミノ酸長、１８７アミノ酸長、１８８アミノ酸長、１８９アミノ酸長、１９０アミノ酸長、１９１アミノ酸長、１９２アミノ酸長、１９３アミノ酸長、１９４アミノ酸長、１９５アミノ酸長、１９６アミノ酸長、１９７アミノ酸長、１９８アミノ酸長、１９９アミノ酸長、２００アミノ酸長、２０１アミノ酸長、２０２アミノ酸長、２０３アミノ酸長、２０４アミノ酸長、２０５アミノ酸長、２０６アミノ酸長、２０７アミノ酸長、２０８アミノ酸長、２０９アミノ酸長、２１０アミノ酸長、２１１アミノ酸長、２１２アミノ酸長、２１３アミノ酸長、２１４アミノ酸長、２１５アミノ酸長、２１６アミノ酸長、２１７アミノ酸長、２１８アミノ酸長、２１９アミノ酸長、２２０アミノ酸長、２２１アミノ酸長、２２２アミノ酸長、２２３アミノ酸長、２２４アミノ酸長、２２５アミノ酸長、２２６アミノ酸長、２２７アミノ酸長、２２８アミノ酸長、２２９アミノ酸長、２３０アミノ酸長、２３１アミノ酸長、２３２アミノ酸長、２３３アミノ酸長、２３４アミノ酸長、２３５アミノ酸長、２３６アミノ酸長、２３７アミノ酸長、２３８アミノ酸長、２３９アミノ酸長もしくは２４０アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さである。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、スペーサーは、ｓｃＦＶとキメラ抗原受容体の膜貫通領域との間に位置する。

本明細書に記載の「ＩｇＧ４のヒンジ領域」は、ＩｇＧ４抗体の重鎖と軽鎖の間に存在するポリペプチドドメインを指す。
いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
Ｔ細胞の混合集団から、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を分離、濃縮または単離して、該Ｔ細胞が単離、分離または濃縮された集団を作製すること、
前記単離、分離または濃縮されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を、細胞表面選択マーカーをコードするマーカー配列とキメラ抗原受容体とをコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
たとえば該Ｔ細胞によって産生される任意のサイトカインまたは培地中に存在しうる任意のサイトカインに加えて、外部から供給されたものであることが好ましい少なくとも１つのサイトカインと、前記形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団とを、少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を前記マーカー配列によりコードされる前記マーカーによる選択によって濃縮して、濃縮、分離、または単離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記濃縮されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって増殖させて、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を得ること
を含む方法が提供される。

前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列、および選択マーカーをコードする第４の配列をさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはヒト抗体のヒンジ領域を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記スペーサーはＩｇＧ４のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態においては、前記ＩｇＧ４ヒンジ領域は改変されたＩｇＧ４ヒンジ領域である。本明細書に記載の「改変されたＩｇＧ４ヒンジ領域」は、配列番号１（配列番号１；ESKYGPPCPPCP）、配列番号２（配列番号２；YGPPCPPCP）、配列番号３（配列番号３；KYGPPCPPCP）または配列番号４（配列番号４；EVVKYGPPCPPCP）で表されるヒンジ領域のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％もしくは１００％の配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲にある配列同一性を有しうるヒンジ領域を指してもよい。上述のように、これらの配列のいずれか１つまたは複数の配列は、ヒトにおける発現を目的としてコドン最適化することができ、二次構造の除去またはＧＣ／ＡＴ比の低減を目的として最適化することができ、かつ少なくとも２つのアイソタイプ遺伝子から作製されたコンセンサス配列であってもよい。

「膜貫通ドメイン」は、細胞の二重層に存在する疎水性タンパク質領域であり、生体膜に埋め込まれるタンパク質をつなぎ止める役割を果たす。膜貫通ドメインのトポロジーは、膜貫通型のαヘリックスであってもよいが、これに限定されない。キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、膜貫通ドメインをコードする配列を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記膜貫通ドメインは、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、２１アミノ酸長、２２アミノ酸長、２３アミノ酸長、２４アミノ酸長、２５アミノ酸長、２６アミノ酸長、２７アミノ酸長もしくは２８アミノ酸長、またはこれらの長さのいずれか２つによって定義される範囲にある長さのＣＤ２８膜貫通配列またはそのフラグメントを含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ＣＤ２８膜貫通配列またはそのフラグメントは、２８アミノ酸長を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記膜貫通ドメインは、配列番号５（配列番号５；MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV）で表される配列を含む。

「共刺激ドメイン」としても知られている「シグナル伝達ドメイン」は、タンパク質または受容体タンパク質の細胞内ドメインすなわち細胞質ドメインであり、細胞内部と相互作用して、シグナルを中継することにより機能する。細胞の細胞内部分に属するこのようなタンパク質部分は「エンドドメイン（endodomain）」とも称される。上記の相互作用は、エフェクター分子またはエフェクタータンパク質との特異的なタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−リガンド相互作用を介した細胞内ドメインによる伝達によって起こりうり、次いでシグナル連鎖に沿ってシグナルをその目的地へと送ることができる。「シグナル伝達ドメイン」あるいは「共刺激ドメイン」は、たとえばＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３ζ鎖によって提供される一次シグナルに加えて、たとえば、免疫応答、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞溶解活性、パーフォリン活性および／またはグランザイム活性などのＴ細胞応答を媒介するシグナルをＴ細胞に提供するシグナル伝達部分を指すこともできる。シグナル伝達ドメインあるいは共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、および／もしくはＢ７−Ｈ３の分子全体、および／もしくはＣＤ８３と特異的に結合するリガンド全体、またはこれらの分子やリガンドの一部を含んでいてもよいが、これらに限定されない。

キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、前記キメラ抗原受容体をコードするベクターは、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含み、該共刺激ドメインは、別の細胞内メディエーターと相互作用して細胞応答を媒介する細胞内シグナル伝達ドメインであり、該細胞応答としては、免疫応答、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞溶解活性、パーフォリン活性および／またはグランザイム活性などが挙げられる。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインおよび／またはＣＤ３ζドメインを含む。いくつかの実施形態においては、前記４−１ＢＢドメインは、配列番号６（配列番号６；KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL）で表される配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ３ζドメインは、配列番号７（配列番号７；RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR）で表される配列を含む。

本明細書に記載の「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、キメラＴ細胞受容体としても知られており、人工のＴ細胞受容体または遺伝子改変受容体を指し、エフェクター免疫細胞に所望の特異性を移植することができる。このような受容体を使用することによって、モノクローナル抗体またはその結合部分の特異性をＴ細胞に移植することができ、たとえば、レトロウイルスベクターを利用して、ＣＡＲのコード配列をレシピエント細胞に移入することよって前記移植を達成することができる。ＣＡＲの構造は、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合された、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含んでいてもよい。このような分子は、ｓｃＦｖによる標的の認識に応答してζシグナルの伝達を誘導する。

いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
Ｔ細胞の混合集団から、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を分離、単離または濃縮して、該Ｔ細胞が単離、分離または濃縮された集団を作製すること、
前記単離、分離または濃縮されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を、細胞表面選択マーカーをコードするマーカー配列とキメラ抗原受容体とをコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団と、少なくとも１つのサイトカインとを、たとえば少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を前記マーカー配列によりコードされる前記マーカーによる選択によって濃縮、分離または単離して、濃縮、分離、または単離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記濃縮、分離または単離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって増殖させて、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を得ること
を含む方法が提供される。
前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記キメラ抗原受容体はＣＤ１９に特異的である。

前記人工Ｔ細胞受容体すなわちＣＡＲは、「養子細胞移入」と呼ばれる技術を使用して、がんまたはウイルス感染症の治療法として使用できる。Ｔ細胞を患者から採取し、がん細胞、ウイルスまたはウイルス感染細胞に提示される分子に特異的な受容体を発現するように該Ｔ細胞を改変する。この遺伝子改変Ｔ細胞は、がん細胞もしくはウイルス感染細胞を認識してこれらを殺傷する能力またはウイルスの排除を促進できる能力を有し、このようにして作製された遺伝子改変Ｔ細胞を前記患者に再度導入する。いくつかの実施形態においては、疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象において該疾患を治療、抑制または緩和する方法が提供される。

いくつかの態様では、前記方法は、少なくとも１つの組成物または組み合わせ製剤を投与することを含むことができ、
該少なくとも１つの組成物または組み合わせ製剤は、遺伝子改変Ｔ細胞集団を含み、
該遺伝子改変Ｔ細胞集団が、親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／もしくはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を含み、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻発現Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻発現Ｔ細胞が含まれないように濃縮されているか、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻発現Ｔ細胞から実質的に分離されているか、またはＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻発現Ｔ細胞から実質的に単離されていること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ発現細胞が、刺激されたＣＤ２受容体、ＣＤ３受容体、ＣＤ４受容体および／またはＣＤ２８受容体を有していること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体と細胞表面選択マーカーとをコードする遺伝子をさらに含むこと、ならびに
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞が、たとえば少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって、少なくとも１つのサイトカインで再刺激されていること
を特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの組成物または組み合わせ製剤を、養子細胞移入によって前記対象に投与する。

本明細書に記載の「抗体」は、免疫系で機能する形質細胞により産生され、細菌やウイルスなどの外来物を特定しそれを中和する役割を果たす大きなＹ字型タンパク質を指す。抗体タンパク質は４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合により連結された同一の重鎖２本と同一の軽鎖２本とを含むことができる。それぞれの重鎖および軽鎖は、免疫グロブリンドメインと呼ばれる構造ドメインから構成される。これらのドメインは７０〜１１０個のアミノ酸を含むことができ、そのサイズおよび機能に従って様々なカテゴリーに分類される。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体フラグメントであり、望ましくはその結合部分である。いくつかの実施形態においては、ＣＡＲ上に存在する前記抗体フラグメントまたはその結合部分はＣＤ１９に特異的である。

「一本鎖可変フラグメント」、すなわちｓｃＦＶは、短いリンカーペプチドで連結された免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む融合タンパク質である。本発明を何ら限定するものではないが、前記リンカーは、フレキシビリティを達成するためグリシンを含んでいてもよく、溶解性を達成するため親水性アミノ酸（たとえばセリンまたはトレオニン）を含んでいてもよい。前記リンカーは、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを連結することができ、あるいはＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端とを連結することもできる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ上に存在するリガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ上に存在する前記ｓｃＦＶドメインは、腫瘍細胞上に存在するＣＤ１９に特異的である。

「ＦＭＣ６３」は、ＣＤ１９特異的モノクローナル抗体である。ＣＤ１９は、白血球の表面上に存在するタンパク質であり、Ｂリンパ球の抗原受容体と会合して抗原受容体依存性刺激の閾値を低下させることができる。ＣＤ１９は、濾胞樹状細胞およびＢ細胞に発現される。ＣＤ１９は、Ｂリンパ芽球へと発達する過程において最も初期に見られるＢ系細胞の段階から見られるが、形質細胞に成熟すると失われる。ＣＤ１９は、ＣＤ２１およびＣＤ８１と一緒になってＢ細胞補助受容体として主に作用する。ＣＤ１９の細胞内尾部は活性化されるとリン酸化され、リン酸化されたＣＤ１９にＳｒｃファミリーキナーゼが結合し、ＰＩ−３キナーゼが動員される。Ｔ細胞の場合と同様に、いくつかのＢ細胞表面分子が抗原受容体を形成し、Ｂリンパ球上で複合体を形成する。

ＣＤ１９の突然変異は、抗体産生の減少を特徴とする重症免疫不全症候群と関連している。たとえば、ＣＤ１９の発現異常は、急性骨髄性白血病における単球系マーカーである。ＣＤ１９はＢ細胞の特徴のひとつであるため、このタンパク質を用いることによって、Ｂ細胞から生じるがん、特にＢ細胞リンパ腫を診断することができる。２０１１年以来、ＣＤ１９を標的とする治療について臨床試験が始められている。現在開発中の実験的抗ＣＤ１９薬のほとんどは、ＣＤ１９の存在を利用して治療をＢ細胞がんに特異的に指向させることにより作用する。また、ＣＤ１９は、ＭＹＣ腫瘍性タンパク質の濃度を安定化させることによって、Ｂ細胞がんの成長の助長に積極的な役割を果たしていることが徐々にわかってきている。したがって、ＣＤ１９およびその下流のシグナル伝達は、治療標的として有望でありうる。

いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
Ｔ細胞の混合集団から、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を分離、濃縮、単離または精製して、該Ｔ細胞が単離、分離、濃縮または精製された集団を作製すること、
前記単離、分離、濃縮または精製されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を、細胞表面選択マーカーをコードするマーカー配列とキメラ抗原受容体とをコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団と、少なくとも１つのサイトカインとを、たとえば少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を前記マーカーによる選択によって濃縮して、濃縮されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記濃縮されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって増殖させて、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を得ること
を含む方法が提供される。

前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列、および選択マーカー配列をコードする第４の配列をさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその結合部分を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的である。

本明細書に記載されているＴ細胞の「精製」とは、治療用Ｔ細胞についての研究または治療用Ｔ細胞の製造方法に使用するために、高度に精製された機能性Ｔ細胞を単離することをいう。本明細書に記載されているＴ細胞の「単離」またはＴ細胞の「分離」は、たとえば間接的パニングなどの技術を用いることにより、不均一な細胞集団または他の成分から所望のＴ細胞、Ｔ細胞集団または亜集団を単離または分離する操作をいう。この方法では、プラスチック表面やポリカーボネート表面、ビーズ、粒子、プレートまたはウェルなどの支持体に結合させた抗体に対する細胞の結合能を利用して、細胞を単離、分離または選択することができる。細胞は、特定の細胞表面マーカーに基づいて結合することができる。場合によっては、所望のＴ細胞集団を「濃縮」するが、これは、濃縮を行った後の所望のＴ細胞集団の細胞数が、このＴ細胞が由来する天然集団における細胞数よりも多いことを意味する。

遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいて、前記ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団は、ＣＤ８特異的抗体および／またはＣＤ４特異的抗体を使用することによって、望ましくない成分から単離、濃縮、精製または分離される。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団は、フローサイトメトリーを使用することによって、単離、濃縮または精製される。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団は、免疫磁気選択を使用することによって、単離、濃縮、精製または分離される。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＣＲ７抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ１２７抗体、抗ＣＤ５７抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ６２Ｌ抗体を使用することによって、単離、濃縮、精製または分離される。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体および／または抗ＣＤ６２Ｌ抗体を使用することによって、単離、濃縮、精製または分離される。いくつかの実施形態において、前記方法は、単離、濃縮または分離されたＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を使用し、該単離、濃縮または精製に使用したＴ細胞混合集団中に含まれていたＣＤ８^＋発現細胞の非存在下、またはＣＤ８^＋発現細胞よりもＣＤ４^＋発現Ｔ細胞が多く存在する条件下で実施される。いくつかの実施形態において、前記方法は、単離、濃縮または分離されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を使用し、該単離、濃縮または精製に使用したＴ細胞混合集団中に含まれていたＣＤ４^＋発現細胞の非存在下、またはＣＤ４^＋発現細胞よりもＣＤ８^＋発現Ｔ細胞が多く存在する条件下で実施される。

Ｔ細胞の「刺激」すなわち「活性化」は、該Ｔ細胞の生存能および免疫機能を維持したまま、シグナル伝達応答（たとえば増殖）などの応答を開始するようにＴ細胞を誘導する方法を指す。たとえば、ＴＣＲ／ＣＤ３およびＣＤ８に対して同時にシグナルが伝達されると、ヒトＴ細胞の生理的活性化および増殖が誘起されうる。適切な刺激を与えると、Ｔ細胞はインビトロで広範囲に増殖しうる。
いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
Ｔ細胞の混合集団から、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を単離、分離、濃縮または精製して、該Ｔ細胞が単離、分離、精製または濃縮された集団を作製すること、
前記単離、分離、精製または濃縮されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を、細胞表面選択マーカーをコードするマーカー配列とキメラ抗原受容体とをコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団と、少なくとも１つのサイトカインとを、たとえば少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を前記マーカー配列によりコードされる前記マーカーによる選択によって濃縮、分離または単離して、濃縮されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記濃縮、単離または分離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団を少なくとも１日、たとえば、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって増殖させて、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を得ること
を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記刺激は、ビーズまたは粒子などの、抗体を結合させた支持体を使用して行われる。いくつかの実施形態においては、前記刺激は、抗ＴＣＲ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む、抗体を結合させた支持体を使用して行われる。いくつかの実施形態においては、前記刺激は、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む、抗体を結合させた支持体を使用して行われる。いくつかの実施形態においては、前記方法は、ビーズまたは粒子などの、前記抗体を結合させた支持体を除去することをさらに含む。

本明細書において「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、どのような哺乳動物から得られたものであってもよいが、サルやヒトなどの霊長類、イヌ、ネコ、ウマなどの愛玩動物、またはヒツジ、ヤギ、ウシなどの家畜であることが好ましい。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はレシピエント対象と同種異系（同種であるが異なるドナーに由来するもの）である。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞は自己由来である（ドナーとレシピエントは同じである）。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は同質遺伝子型である（ドナーとレシピエントは異なるが、一卵性双生児である）。

本明細書を通して同じ意味で使用される「ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞」または「ＣＤ８^＋Ｔ細胞」は、ＴＣ、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞またはキラーＴ細胞としても知られている。本明細書に記載されているように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、がん細胞、ウイルス感染細胞、または損傷した細胞を殺傷することができるＴリンパ球である。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、特定の抗原を認識できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、細胞表面にＣＤ８を発現する。ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞は、数種類のサイトカインを産生する能力を有するが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞により産生されるサイトカインの量は、移植適合性を向上または改善したり、移植適合性に寄与したり、移植適合性を誘導するような濃度ではない。

本明細書を通して同じ意味で使用される「ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞」または「ＣＤ４^＋Ｔ細胞」は、ヘルパーＴ細胞としても知られており、免疫系および適応免疫系において重要な役割を果たしている。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞サイトカインを放出することにより他の免疫細胞の活性を補助する役割も果たす。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、免疫応答を補助し、抑制し、または調節する。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞抗体のクラススイッチ、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化および増殖、ならびにマクロファージなどの食細胞の殺菌活性の最大化において不可欠である。ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞は、数種類のサイトカインを産生する能力を有するが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞により産生されるサイトカインの量は、移植適合性を向上または改善したり、移植適合性に寄与したり、移植適合性を誘導するような濃度ではない。

成熟Ｔ細胞は、表面タンパク質であるＣＤ４を発現し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞と呼ばれる。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、一般に、免疫系においてヘルパーＴ細胞として機能することが運命づけられているものとして扱われる。たとえば、抗原提示細胞がクラスII ＭＨＣ上で抗原を発現する場合、ＣＤ４^＋細胞は細胞間相互作用（たとえばＣＤ４０とＣＤ４０Ｌ）の組み合わせおよびサイトカインを介して抗原提示細胞を補助する。しかしながら、稀に例外があり、たとえば、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞のサブグループはＣＤ４を発現する。これらのＣＤ４^＋発現Ｔ細胞グループは、いずれもヘルパーＴ細胞とは見なされない。

本明細書に記載の「セントラルメモリー」Ｔ細胞（または「Ｔ_ＣＭ」）は、抗原を経験したＣＴＬであり、ナイーブ細胞と比較して、その表面上にＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ−７、およびＣＤ４５ＲＯを発現するが、ＣＤ４５ＲＡを発現していないか、ＣＤ４５ＲＡの発現が低下しているＣＴＬを指す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリー細胞は、ナイーブ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、および／もしくはＣＤ９５の発現が陽性であり、かつＣＤ５４ＲＡの発現が低下している。

本明細書に記載の「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（または「Ｔ_ＥＭ」）は、抗原を経験したＴ細胞であり、セントラルメモリー細胞と比較して、その表面上にＣＤ６２Ｌを発現していないか、ＣＤ６２Ｌの発現が低下しており、ナイーブ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡを発現していないか、ＣＤ４５ＲＡの発現が低下しているＴ細胞を指す。いくつかの実施形態において、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞またはセントラルメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＣＲ７の発現が陰性であり、ＣＤ２８および／またはＣＤ４５ＲＡの発現が陽性であっても陰性であってもよい。

本明細書に記載の「ナイーブ」Ｔ細胞は、抗原を経験していないＴリンパ球であり、セントラルメモリー細胞またはエフェクターメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌおよび／もしくはＣＤ４５ＲＡを発現しており、かつ／またはＣＤ４５ＲＯを発現していないＴリンパ球を指す。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ８^＋Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、および／またはＣＤ４５ＲＡが挙げられる。

本明細書に記載の「エフェクター」Ｔ細胞または「Ｔ_Ｅ」Ｔ細胞は、抗原を経験した細胞傷害性Ｔリンパ球であり、セントラルメモリー細胞またはナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、および／もしくはＣＤ２８を発現していないか、またはＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、および／もしくはＣＤ２８の発現が低下しており、かつグランザイムＢ陽性および／またはパーフォリンに陽性であるＴリンパ球を指す。

本明細書に記載の「移植適合性」は、細胞が養子細胞移入により体内（たとえば血流）に入った後に該細胞が成長および増殖する能力を指す。細胞の定着は、通常、移入後２〜４週間以内に起こりうる。細胞の定着は、特定の細胞について血中細胞数を定期的に確認することによってモニタリングすることができる。いくつかの実施形態においては、対象おける疾患を治療、抑制または緩和する前記方法であって、本明細書に記載の遺伝子改変Ｔ細胞を含む組成物または組み合わせ製剤を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記方法は、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変Ｔ細胞の血球算定、たとえば、移入した前記Ｔ細胞に関連するマーカーの存在または不在の同定などによって、前記対象をモニタリングすることをさらに含むことができる。

移植適合性が改善されたＴ細胞は、Ｔ細胞免疫の生成および長期維持を可能にする特定の細胞表面マーカーを有しうる。Ｔ細胞の活性化および生存に関与するタンパク質がいくつか知られている。ＣＤ２８は、Ｔ細胞上に発現されるタンパク質であり、Ｔ細胞の活性化および生存に必要とされる共刺激シグナルを提供する。ＣＤ２７は、Ｔ細胞免疫の生成および長期維持に必要とされる。ＣＤ２７は、ＣＤ７０リガンドに結合し、Ｂ細胞の活性化および免疫グロブリンの合成の制御において重要な役割を果たしている。ＣＤ６２Ｌとしても知られているＬ−セレクチンは、リンパ球上に見られる細胞接着分子である。Ｌ−セレクチンは、リンパ球またはＴ細胞が高内皮細静脈を通って二次リンパ組織へ入るための「ホーミング受容体」として機能する。内皮細胞上に存在するリガンドは、Ｌ−セレクチンを発現するリンパ球に結合し、血液中のリンパ球の交通を減速させることによって、リンパ球の二次リンパ器官への移動を容易とする。前記キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、前記Ｔ細胞は、少なくとも１つの受容体を含み、該少なくとも１つの受容体は、移植適合性を向上、誘導または改善するか、移植適合性に寄与する。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいては、ベクターの形態の遺伝物質を形質導入することによってＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋発現Ｔ細胞が遺伝子改変され、その結果得られた遺伝子改変ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋発現Ｔ細胞が、特異的なキメラ抗原受容体を発現することを特徴とする方法が提供される。前記遺伝子改変ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の実施形態のいくつかにおいては、該遺伝子改変ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞は、移植適合性の向上または増強を目的としてさらに改変される。

本明細書に記載の「サイトカイン」は、細胞のシグナル伝達に重要な小さいタンパク質（５〜２５ｋＤａ）をいう。サイトカインは、細胞により放出され、他の細胞や、時にはサイトカインを放出した細胞自体（たとえばＴ細胞など）の挙動に影響を及ぼす。サイトカインとしては、たとえば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインおよび腫瘍壊死因子が挙げられる。サイトカインは様々な細胞によって産生され、このような細胞としては、たとえば、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、およびマスト細胞など免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、および様々な間質細胞が挙げられる。

サイトカインは、受容体を介して作用することができる。サイトカインは、液性免疫応答と細胞性免疫応答との間のバランスを調節することができ、さらに特定の細胞集団の成熟、増殖、および応答性を調節することができるため、免疫系において重要である。サイトカインの中には、複雑な方法で他のサイトカインの作用を増強または抑制するものもある。サイトカインとしては、たとえば、アシル化刺激タンパク質、アディポカイン、アルブインターフェロン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ケモカイン、コロニー刺激因子、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ９、エリスロポエチン、Ｇｃ−ＭＡＦ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、肝細胞増殖因子、サイトカインＩＬ−１０ファミリー、サイトカインＩＬ−１７ファミリー、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、インフラマソーム、Interferome、インターフェロン、インターフェロンβ１ａ、インターフェロンβ１ｂ、インターフェロンγ、Ｉ型インターフェロン、II型インターフェロン、III型インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン１ファミリー、インターロイキン１受容体アンタゴニスト、インターロイキン１０、インターロイキン１２、インターロイキン１２サブユニットβ、インターロイキン１３、インターロイキン１５、インターロイキン１６、インターロイキン２、インターロイキン２３、インターロイキン２３サブユニットα、インターロイキン３４、インターロイキン３５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン３６、白血病抑制因子、白血球促進因子、リンホカイン、リンフォトキシン、リンフォトキシンα、リンフォトキシンβ、マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ炎症タンパク質、マクロファージ活性化因子、モノカイン、マイオカイン、マイオネクチン（Myonectin）、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、オンコスタチンＭ、オプレルベキン、血小板第４因子、炎症性サイトカイン、プロメガポエチン、ＲＡＮＫＬ、間質細胞由来因子１、タリモジーン・ラハーパレプベック、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＸＣＲ１を挙げることができるが、これらに限定されない。前記遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、形質導入されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の集団と、少なくとも１つのサイトカインとを接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製する。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、使用される前記少なくとも１つのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態において、サイトカインとの接触時間は、少なくとも１日、たとえば、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間である。

本明細書に記載の「インターロイキン」すなわちＩＬは、免疫系が大きく依存しているサイトカインである。本発明において使用することができるインターロイキンとしては、たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、および／またはＩＬ−３６が挙げられる。Ｔ細胞をインターロイキンと接触させることによって、細胞の移植適合性を向上、補助、誘導、または改善する効果が得られることがある。ＩＬ−１は、たとえばＴ細胞の成熟および増殖において機能することができる。ＩＬ−２は、たとえばＴ細胞応答の増大および分化を刺激することができる。ＩＬ−３は、たとえば骨髄性前駆細胞の分化および増殖を促進することができる。ＩＬ−４は、たとえば増殖および分化を促進することができる。ＩＬ−７は、たとえばＢ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の生存、発達、およびホメオスタシスに関与するリンパ球前駆細胞の分化および増殖を促進することができる。ＩＬ−１５は、たとえばナチュラルキラー細胞の産生を誘導することができる。ＩＬ−２１は、たとえばＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化および増殖を補助刺激し、ＮＫ細胞傷害性を増大させ、ＣＤ４０媒介性のＢ細胞増殖、分化およびアイソタイプスイッチングを増強し、かつＴｈ１７細胞の分化を促進する。

いくつかの実施形態においては、遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
Ｔ細胞の混合集団から、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団を精製、分離、濃縮または単離して、該Ｔ細胞が単離、分離、濃縮または精製された集団を作製すること、
前記単離、分離、濃縮または精製されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を、細胞表面選択マーカーをコードするマーカー配列とキメラ抗原受容体とをコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、
形質導入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団と、少なくとも１つのサイトカインとを接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を前記マーカー配列によりコードされる前記マーカーによる選択によって濃縮、単離または分離して、濃縮、単離または分離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記濃縮、単離または分離されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を少なくとも１日、たとえば、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって増殖させて、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を得ること
を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含む。いくつか実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記サイトカインとの接触を、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって行う。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインを添加することによって、移植適合性が向上、増強、促進または誘導される。いくつかの実施形態においては、前記濃縮されたＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を、５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−７（ｒｈＩＬ−７）および／または０．５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）と接触させることによって、たとえば該細胞を増殖させる。いくつかの実施形態においては、前記濃縮されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を、５０Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）および／または０．５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）と接触させることによって、たとえば該細胞を増殖させる。さらなる実施形態では、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬもしくは１．０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−７、もしくはこれらの量のいずれか２つによって定義される範囲にある量のｒｈＩＬ−７および／または０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬもしくは１．０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１５、もしくはこれらの量のいずれか２つによって定義される範囲にある量のｒｈＩＬ−１５と、前記濃縮されたＣＤ４^＋発現Ｔ細胞とを接触させることによって、たとえば該細胞を増殖させる。さらなる実施形態では、１０Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ、６０Ｕ／ｍＬ、７０Ｕ／ｍＬ、８０Ｕ／ｍＬ、９０Ｕ／ｍＬもしくは１００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２、もしくはこれらの量のいずれか２つによって定義される範囲にある量のｒｈＩＬ−２、および／または０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬもしくは１．０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−７、および／または０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬもしくは１．０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１５、もしくはこれらの量のいずれか２つによって定義される範囲にある量のｒｈＩＬ−１５と、前記濃縮されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞とを接触させることによって、たとえば該細胞を増殖させる。いくつかの実施形態においては、前記複数のサイトカインは、前記の量でＴ細胞に共投与されるが、たとえば、混合物として、または短時間にそれぞれを順次添加することによってＴ細胞に共投与される。あるいは、別の実施形態では、前記複数のサイトカインを別個にＴ細胞と接触させるが、たとえば、１〜１０分間または１〜１０時間の間隔を空けて別個にＴ細胞と接触させる。

本明細書において、混合物中の特定の細胞種の量について述べる際に使用される「濃縮された」および「除去された」という用語は、細胞の混合物中において「濃縮された」細胞種の数を増加させる方法もしくは工程で細胞混合物を処理すること、または細胞の混合物中の「除去された」細胞の数を低減させる方法もしくは工程で細胞混合物を処理することを指す。したがって、濃縮工程に付された細胞の由来に応じて、混合物または組成物において、「濃縮された」細胞は（細胞数で）全体の６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％以上を占めていてもよく、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の値であってもよく、かつ「除去された」細胞は（細胞数で）全体の４０％、３０％、２０％、１０％、５％もしくは１％以下を占めていてもよく、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の値であってもよい。前記遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、親和性により細胞表面マーカーを選択することによって、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を濃縮することも可能であり、この結果、濃縮されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製することができる。

「細胞を増殖させること」すなわち「増殖」は、細胞を増殖、増加、成長および繁殖させる工程を指す。たとえば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の培養は、通常、Ｔリンパ球の成長および増殖に適した条件下でインキュベートすることによって行うことができる。前記キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を少なくとも１日増殖させ、２０日間増殖させてもよく、たとえば、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって増殖させる。前記キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、前記ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を少なくとも１日増殖させ、２０日間増殖させてもよく、たとえば、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって増殖させる。

本明細書に記載の「親和性による選択」は、特異的な分子または目的の細胞の選択を可能とする結合親和性薬物と、特異的な分子もしくは選択可能な細胞表面マーカー、またはこれらの分子やマーカー上に存在するエピトープとを結合させることによって、該特異的な分子または該細胞表面マーカーを有する細胞を選択することを指す。親和性による選択は、たとえば抗体、標識抗体、レクチン、アプタマーおよび／またはペプチドによって行うことができる。前記遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の前記分離は、ＣＤ８および／またはＣＤ４上に存在するエピトープを有するＴ細胞を親和性により選択することによって行う。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、抗ＣＤ８抗体もしくは抗ＣＤ４抗体またはその結合部分を使用して、目的の細胞を選択する。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の前記分離は、フローサイトメトリーによって行う。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の前記分離は、免疫磁気選択によって行う。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記抗ＣＤ８抗体または抗ＣＤ４抗体は、たとえば不活性ビーズまたは不活性粒子などの固相支持体に結合される。

本明細書に記載の「Ｔ細胞前駆細胞」は、胸腺へと遊走して、Ｔ細胞前駆細胞となり得るリンパ球前駆細胞を指し、Ｔ細胞前駆細胞はＴ細胞受容体を発現しない。すべてのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞由来の造血前駆細胞（リンパ球系前駆細胞）は胸腺に移行し、細胞分裂により増殖し、未熟な胸腺細胞の大集団を作り出す。最も初期の胸腺細胞はＣＤ４もＣＤ８も発現せず、したがって、ダブルネガティブ（ＣＤ４⁻ＣＤ８⁻）細胞に分類される。これらは成長により発達し、ダブルポジティブ胸腺細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋）となり、最終的にシングルポジティブ（ＣＤ４^＋ＣＤ８⁻またはＣＤ４⁻ＣＤ８^＋）胸腺細胞に成熟して、その後、胸腺から末梢組織に放出される。胸腺細胞の約９８％は、胸腺での発達過程においてポジティブ選択およびネガティブ選択により選抜されずに死滅し、残りの２％が生存して胸腺を去り、成熟した免疫担当Ｔ細胞になる。

Ｔ細胞前駆細胞は、ダブルネガティブ（ＤＮ）段階においては主に機能的β鎖を産生し、ダブルポジティブ（ＤＰ）段階では主に機能的α鎖を産生し、その結果、最終的に機能性αβ Ｔ細胞受容体を産生する。４つのＤＮ段階（ＤＮ１、ＤＮ２、ＤＮ３およびＤＮ４）を経て胸腺細胞が発達するに従って、Ｔ細胞はインバリアントα鎖を発現するが、β鎖の遺伝子は再編成される。再編成されたβ鎖がインバリアントα鎖と対を為すことに成功した場合、β鎖の再編成を止めるシグナルが産生され（さらに、もう一方のアレルが抑制され）、細胞の増殖が起こる。これらのシグナルが産生されるには、この前駆ＴＣＲが細胞表面上に発現されていなければならないが、これらのシグナル自体は前駆ＴＣＲに結合するリガンドに依存する。このように発達した胸腺細胞はその後、ＣＤ４およびＣＤ８の両方を発現し、α鎖が選択されるダブルポジティブ（ＤＰ）段階を経る。再編成β鎖がシグナル伝達を全くもたらさない場合（たとえば、インバリアントα鎖との対合ができなかった結果）、この細胞は無視され（シグナル伝達を受けることなく）、死滅すると考えられている。

本明細書に記載の「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、骨髄系細胞に分化しうる前駆細胞であり、該骨髄系細胞としては、たとえば、マクロファージ、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞およびリンパ系細胞（たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）が挙げられる。ＨＳＣは３種の幹細胞が存在する異種細胞集団であり、これらの幹細胞は血液中のリンパ系子孫細胞と骨髄系子孫細胞との比（Ｌ／Ｍ）により識別される。

「凍結保存」は、損傷を受けやすい細胞、組織全体、または物質を零下温度に冷却することにより保存する方法である。目的の細胞、組織、または物質に損傷を与えうる酵素的活性または化学的活性はどのようなものでも低温で効果的に阻止される。凍結保存方法は、凍結過程での氷の形成によるさらなる損傷を起こすことなく低温に到達させるための方法である。慣用の凍結保存では、凍結する材料を凍害防御剤と呼ばれる特定の分子でコーティングすることによって行われてきた。凍害防御剤の多くは固有の毒性があるため、新たな方法が絶えず研究されている。凍結保存方法は当業者には公知である。キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変T細胞の製造方法の実施形態のいくつかにおいては、該方法は、遺伝子改変Ｔ細胞を凍結保存することをさらに含んでもよい。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞集団であって、
たとえば、胸腺細胞や遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）などに由来し、親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を含み、ＣＤ８⁻Ｔ細胞およびＣＤ４⁻発現Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８⁻Ｔ細胞およびＣＤ４⁻発現Ｔ細胞よりも前記ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、またはＣＤ８⁻Ｔ細胞およびＣＤ４⁻発現Ｔ細胞から単離されていること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、刺激されたＣＤ２受容体、ＣＤ３受容体、ＣＤ４受容体および／またはＣＤ２８受容体を有していること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体と細胞表面選択マーカーとをコードする遺伝子をさらに含むこと、ならびに
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞が、たとえば少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって、少なくとも１つのサイトカインで再刺激されていること
を特徴とする遺伝子改変Ｔ細胞集団が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記選択されたＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞は、本発明により提供される方法によって製造される。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含む。いくつか実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。前記遺伝子改変Ｔ細胞集団の実施形態のいくつかにおいては、前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞は、少なくとも１つの受容体をさらに含み、該少なくとも１つの受容体は、移植適合性を向上、誘導または増強するか、移植適合性に寄与する。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、増強または誘導するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、増強または誘導するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞は、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列および選択マーカーをコードする第４の配列を有するベクターをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはＩｇＧ４のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記細胞表面選択マーカーは、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的である。いくつかの実施形態においては、前記集団は、単離または濃縮されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が実質的に除去されている。いくつかの実施形態においては、前記集団は、単離または濃縮されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が実質的に除去されている。

いくつかの実施形態では、養子細胞免疫療法組成物は疾患またはがんの治療に有用である。いくつかの実施形態においては、ヒトを治療するための組成物または組み合わせ製剤であって、本明細書に記載に従って製造または入手されるＴ細胞または遺伝子改変Ｔ細胞集団に関する実施形態のいずれか１つまたは複数に記載の、少なくとも１つの遺伝子改変Ｔ細胞集団と医薬品添加剤とを含む組成物または組み合わせ製剤が提供される。ヒトを治療するための前記組成物または組み合わせ製剤の実施形態のいくつかにおいては、該組成物または組み合わせ製剤は、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、遺伝子改変Ｔ細胞集団を含み、該集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が実質的に除去されている。ヒトを治療するための前記組成物または組み合わせ製剤の実施形態のいくつかにおいては、該組成物または組み合わせ製剤は、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、遺伝子改変Ｔ細胞集団を含み、該集団は、単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が実質的に除去されている。ヒトを治療するための前記組成物または組み合わせ製剤の実施形態のいくつかにおいては、該組成物または組み合わせ製剤は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞と単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞とを１：１の比率で含み、前記単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が実質的に除去されており、前記単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が実質的に除去されている。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子改変ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団と前記遺伝子改変ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９もしくは１：１０またはこれらの比率のいずれか２つによって定義される範囲にある比率で混合されて、これらの投与を必要とする対象に投与されるか、あるいは別々の製剤としてこれらの比率のいずれかで該対照に共投与される。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子改変ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団と前記遺伝子改変ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９もしくは１：１０またはこれらの比率のいずれか２つによって定義される範囲にある比率で混合されて、これらの投与を必要とする対象に投与されるか、あるいは別々の製剤としてこれらの比率のいずれかで該対照に共投与される。

本明細書に記載の「医薬品添加剤」または医薬品ビヒクルは、溶媒として使用される担体または不活性媒質を意味することができ、この溶媒中において治療用有効成分すなわちＴ細胞を製剤化し、かつ／または投与する。ビヒクルとしては、ポリマーミセル、リポソーム、リポタンパク質ベースの担体、ナノ粒子担体、デンドリマー、および／または当業者に公知の他のＴ細胞用ビヒクルを挙げることができる。理想的なビヒクルまたは添加剤としては、非毒性、生体適合性、非免疫原性かつ生物分解性のものが挙げられ、宿主の防御機構による認識を回避することができるものが挙げられる。

いくつかの実施形態においては、ヒトを治療するための組成物または組み合わせ製剤であって、本発明の実施形態のいずれかに記載の少なくとも１つの遺伝子改変Ｔ細胞集団と医薬品添加剤とを含む組成物または組み合わせ製剤が提供される。いくつかの実施形態では、前記添加剤は医薬品ビヒクルである。いくつかの実施形態では、前記医薬品ビヒクル中に医薬組成物を含む。

急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、すなわち急性リンパ性白血病は、リンパ芽球としても知られるがん性の未成熟白血球の過剰産生を特徴とする白血球のがんである。ＡＬＬ患者では、リンパ芽球が骨髄で過剰産生されて継続的に増加し、その結果、骨髄における赤血球、白血球、血小板などの正常細胞の産生が阻害され、さらに、リンパ芽球が他の臓器に拡散することによって、損傷が起こり死に至る。ＡＬＬは、小児期に最も多く見られ、発症率のピークは２〜５歳と高齢期である。

ＡＬＬの症状は機能性血液細胞の産生の低減を示すが、これは、通常であれば新しい機能性血液細胞を産生するのに使用される骨髄の供給源がＡＬＬによって消耗するためである。症状としては、発熱、感染症のリスク増大、出血傾向の増加、貧血、頻脈、疲労、および頭痛が挙げられる。初回治療後に疾患が完全に寛解したが、その後に再発した小児の５０〜７０％および成人の４０〜５０％は、２回目の完全寛解に至ることができる。初回寛解後の再発に対する治療としては、標準的化学療法もしくは実験的薬物の使用が挙げられ、さらに積極的な治療としては幹細胞移植などが挙げられる。初回寛解後の再発に対する治療としては、標準的化学療法もしくは実験的薬物の使用が挙げられ、さらに積極的な治療としては幹細胞移植などが挙げられる。しかしながら、急性骨髄性白血病やＡＬＬなどの白血病では、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）ではなく自家移植を使用することによって死亡率を低減させることよりも、がん再発の可能性の増大および治療関連死亡率の上昇の方が懸念されることがあるため、同種異系移植による治療の方が急性骨髄性白血病やＡＬＬなどの白血病では好ましい場合がある。したがって、白血病、骨髄性白血病、およびＡＬＬの治療のために細胞を改善する方法が必要とされている。

いくつかの実施形態においては、がん（たとえばＡＬＬ）などの疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、該疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、
本発明の実施形態のいずれか１つまたは複数に記載の少なくとも１つの組成物または組み合わせ製剤を前記対象に投与することを含み、
前記組成物または組み合わせ製剤が、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変のＴ細胞を含むこと、
該Ｔ細胞が、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞であること
を特徴とする方法が提供される。
前記方法の実施形態のいくつかでは、前記方法は、組成物または組み合わせ製剤を投与することを含み、該組成物または組み合わせ製剤は、遺伝子改変Ｔ細胞集団を含み、該遺伝子改変Ｔ細胞集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が実質的に除去されている。前記方法の実施形態のいくつかでは、前記方法は、組成物または組み合わせ製剤を投与することを含み、該組成物または組み合わせ製剤は、遺伝子改変Ｔ細胞集団を含み、該遺伝子改変Ｔ細胞集団は、単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が実質的に除去されている。いくつかの実施形態では、前記方法は、組成物または組み合わせ製剤を投与することをさらに含み、該組成物または組み合わせ製剤は、遺伝子改変Ｔ細胞集団を含み、該遺伝子改変Ｔ細胞集団は、単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が実質的に除去されている。前記方法の実施形態のいくつかでは、前記方法は、組成物または組み合わせ製剤を投与することをさらに含み、該組成物または組み合わせ製剤は、遺伝子改変Ｔ細胞集団を含み、該遺伝子改変Ｔ細胞集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が実質的に除去されている。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記方法は、前記組成物または組み合わせ製剤を投与することをさらに含み、該組成物または組み合わせ製剤は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞と単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞とを１：１の比率で含み、前記単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が実質的に除去されており、前記単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が実質的に除去されている。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子改変ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団と前記遺伝子改変ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９もしくは１：１０またはこれらの比率のいずれか２つによって定義される範囲にある比率で混合されて、これらの投与を必要とする対象に投与されるか、あるいは別々の製剤としてこれらの比率のいずれかで該対照に共投与される。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子改変ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団と前記遺伝子改変ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９もしくは１：１０またはこれらの比率のいずれか２つによって定義される範囲にある比率で混合されて、これらの投与を必要とする対象に投与されるか、あるいは別々の製剤としてこれらの比率のいずれかで該対照に共投与される。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法を受ける対象として同定または選択されている。いくつかの実施形態において、前記方法は、疾患の抑制を測定または評価することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、本発明の実施形態のいずれか１つまたは複数に記載の組成物または組み合わせ製剤の投与前、投与中または投与後に、前記対象に別の抗がん療法を提供することをさらに含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、本発明の実施形態のいずれか１つまたは複数に記載の組成物または組み合わせ製剤を養子細胞移入によって前記対象に投与する。いくつかの実施形態においては、前記対象を別の形態の抗がん療法で処置した後に、本発明の実施形態のいずれか１つまたは複数に記載の組成物または組み合わせ製剤を該対象に投与する。いくつかの実施形態においては、前記対象を別の形態の抗がん療法で処置した後に、本発明の実施形態のいずれか１つまたは複数に記載の組成物または組み合わせ製剤を該対象に投与する。いくつかの実施形態では、前記対象は白血病患者である。いくつかの実施形態では、前記対象は、再発性かつ／または抵抗性のＣＤ１９^＋小児急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記対象は、再発性かつ／または化学療法抵抗性のＣＤ１９^＋急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記対象は自己免疫疾患患者である。前記方法の実施形態のいくつかにおいては、前記対象はＨＳＣＴ後の再発を有する。

さらなる実施形態
ベクター、細胞および細胞の形質導入方法
本明細書に記載の組成物は、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋発現Ｔリンパ球を提供する。Ｔリンパ球は、公知の技術によって回収することができ、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択のような、抗体との親和性結合などの公知の技術によって濃縮または除去することができる。濃縮工程および／または除去工程を行った後、公知の技術によって所望のＴリンパ球をインビトロで増殖させることができる（このような公知技術としては、たとえばRiddellらに付与された米国特許第6,040,177号に記載の技術が挙げられるが、これに限定されない（この文献は参照によりその全体が明示的に本明細書に援用される））。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は自己由来Ｔ細胞であり、すなわち、前記Ｔ細胞が送達される患者から得られたものである。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。

たとえば、所望のＴ細胞集団またはＴ細胞亜集団の増殖は、増殖前のＴリンパ球集団をインビトロにおいて培地に添加すること、非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などのフィーダー細胞を該培地に添加すること（たとえば、添加後の細胞集団が、増殖培養される最初の集団中の各Ｔリンパ球１個あたり、少なくとも５個、１０個、２０個、または４０個またはそれ以上のＰＢＭＣフィーダー細胞を含むような比率で加える）、および該培地を（たとえばＴ細胞数の増加に十分な時間にわたって）インキュベートすることによって行うことができる。前記非分裂フィーダー細胞は、γ線が照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態においては、細胞分裂を防ぐため、3000rad、3200rad、3300rad、3400rad、3500rad、もしくは3600rad、またはこれらの放射線量（rad）のいずれか２つによって定義される範囲にある放射線量（rad）のγ線を前記ＰＢＭＣに照射する。培地にＴ細胞またはフィーダー細胞を添加する順序は必要に応じて入れ替えてもよい。Ｔリンパ球の増殖に適した条件下で培養物をインキュベートすることができる。ヒトＴリンパ球を増殖させるための温度としては、たとえば、通常、少なくとも２５℃、好ましくは少なくとも３０℃、より好ましくは３７℃であり、またはこれらの温度のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の温度である。

増殖させたＴリンパ球としては、ヒト腫瘍または病原体上に存在する抗原に特異的であってもよく、かつキメラ抗原受容体を発現するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球が挙げられる。

一実施形態において、前記増殖方法または増殖は、ＥＢＶで形質転換された非分裂リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）をフィーダー細胞として加えることをさらに含んでもよい。ＬＣＬには、6000rad、7000rad、8000rad、9000radもしくは10,000radの範囲のγ線を照射してもよく、またはこれらの放射線量（rad）のいずれか２つにより定義される範囲にある放射線量（rad）のγ線を照射してもよい。前記ＬＣＬフィーダー細胞は任意の適切な量で提供することができ、たとえば、ＬＣＬフィーダー細胞と増殖開始時のＴリンパ球との比は少なくとも１０：１であってもよい。

別の一実施形態では、前記増殖方法または増殖は、（たとえば、少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を培地に加えることをさらに含んでもよい。別の一実施形態では、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を培地に加えることをさらに含んでもよい（ＩＬ−２の濃度は、たとえば、少なくとも１０単位／ｍＬである）。別の一実施形態では、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法は、ＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を培地に加えることをさらに含んでもよい（ＩＬ−２の濃度は、たとえば、少なくとも１０単位／ｍＬである）。Ｔリンパ球を単離し、増殖を行う前または増殖を行った後に、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球をそれぞれ、ナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、およびエフェクターＴ細胞亜集団にソートすることができる。

ＣＤ８^＋細胞は、標準的な方法を用いることによって得ることもできる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８^＋細胞は、ナイーブＣＤ８^＋細胞、セントラルメモリーＣＤ８^＋細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋細胞それぞれと関連する細胞表面抗原を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクターメモリー細胞にさらにソートされる。いくつかの実施形態において、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８^＋末梢血リンパ球由来のＣＤ６２Ｌ^＋サブセットおよびＣＤ６２Ｌ⁻サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体で染色した後に、ＣＤ６２Ｌ⁻ＣＤ８^＋画分およびＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ８^＋画分にソートされる。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ_ＣＭの表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、および／またはＣＤ１２７を含み、かつ／またはグランザイムＢおよび／もしくはＣＤ４５ＲＡは陰性であるか、低発現を示す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ２８^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ４５ＲＯ^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、および／またはＣＤ８^＋のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ８^＋Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、および／またはＣＤ４５ＲＡが挙げられる。

細胞または細胞集団が特定の細胞表面マーカーについて陽性であるかどうか、または特定の細胞表面マーカーを発現しているかどうかは、該表面マーカーに特異的な抗体およびアイソタイプを一致させたコントロール抗体を使用したフローサイトメトリーによって判定することができる。細胞集団において特定のマーカーが陰性であることは、アイソタイプコントロールと比べて特異的抗体と強く結合する細胞集団が見られないことを指し、これは、前記マーカーの発現が欠如していることを示す。細胞集団において特定のマーカーが陽性であることは、アイソタイプコントロールと比べて特異的抗体と均一に結合する細胞集団が見られることを指し、これは、前記マーカーが発現していることを示す。いくつかの実施形態において、１つ以上のマーカーの発現の減少は、対照の細胞集団と比較して、平均蛍光強度の低下が1 log₁₀であること、および／またはマーカーを発現する細胞のパーセンテージが細胞全体の少なくとも２０％に低下すること、細胞全体の少なくとも２５％に低下すること、細胞全体の少なくとも３０％に低下すること、細胞全体の少なくとも３５％に低下すること、細胞全体の少なくとも４０％に低下すること、細胞全体の少なくとも４５％に低下すること、細胞全体の少なくとも５０％に低下すること、細胞全体の少なくとも５５％に低下すること、細胞全体の少なくとも６０％に低下すること、細胞全体の少なくとも６５％に低下すること、細胞全体の少なくとも７０％に低下すること、細胞全体の少なくとも７５％に低下すること、細胞全体の少なくとも８０％に低下すること、細胞全体の少なくとも８５％に低下すること、細胞全体の少なくとも９０％に低下すること、細胞全体の少なくとも９５％に低下すること、もしくは細胞全体の少なくとも１００％に低下すること、もしくはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲にある任意のパーセンテージに低下することを指す。いくつかの実施形態において、細胞集団が１つ以上のマーカーについて陽性であることは、対照の細胞集団と比較して、マーカーを発現する細胞のパーセンテージが細胞全体の少なくとも５０％であること、細胞全体の少なくとも５５％であること、細胞全体の少なくとも６０％であること、細胞全体の少なくとも６５％であること、細胞全体の少なくとも７０％であること、細胞全体の少なくとも７５％であること、細胞全体の少なくとも８０％であること、細胞全体の少なくとも８５％であること、細胞全体の少なくとも９０％であること、細胞全体の少なくとも９５％であること、もしくは細胞全体の少なくとも１００％であること、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲にある任意のパーセンテージであることを指す。

ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞にソートされる。ＣＤ４^＋リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４^＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ⁻、ＣＤ４５ＲＡ^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ２８^＋、および／またはＣＤ４^＋のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋および／またはＣＤ４５ＲＯ^＋である。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ⁻および／またはＣＤ４５ＲＯ⁻である。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４^＋細胞はＣＤ２８^＋、ＣＤ２７^＋および／またはＣＤ６２Ｌ^＋である。

いくつかの実施形態において、抗原特異的なＣＤ４^＋集団およびＣＤ８^＋集団は、ナイーブＴリンパ球または抗原特異的Ｔリンパ球を抗原で刺激することによって得ることができる。たとえば、サイトメガロウイルス抗原に対して特異的なＴ細胞株またはＴ細胞クローンは、サイトメガロウイルス抗原に感染した対象からＴ細胞を単離し、インビトロにおいてサイトメガロウイルス抗原で該細胞を刺激することによって作製することができる。
ナイーブＴ細胞を使用することもできる。Ｔ細胞応答を誘導するための標的として使用する、腫瘍細胞に由来する抗原の数は特に限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の養子細胞免疫療法組成物は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、乳がん、または黒色腫を含む疾患または障害の治療に有用である。

Ｔリンパ球集団の改変
いくつかの実施形態においては、本発明の開示による免疫療法に使用する前記Ｔ細胞に機能性遺伝子を導入することが望ましい場合がある。たとえば、単一の遺伝子または複数の遺伝子をＴ細胞に導入することによって、体内に移入された該Ｔ細胞の生存能および／または機能を向上することができ、それによって治療法の有効性を改善することができる。あるいは、上記単一または複数の遺伝子を導入することによって、遺伝子マーカーを提供することができ、この遺伝子マーカーを利用することによって、インビボにおける生存Ｔ細胞および／または移行Ｔ細胞の選択および／または評価が可能となる。あるいは、上記単一または複数の遺伝子をＴ細胞に導入することによって、たとえば、インビボにおいてネガティブセレクションにより除去されるように該Ｔ細胞を改変することができ、それによって免疫療法の安全性を改善することができる。この方法は、Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)に記載されている。さらに、LuptonらによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601も参照されたいが、これらの文献では、ドミナントポジティブ型の選択マーカーとネガティブ選択マーカーとを融合させた選択可能な二機能性融合遺伝子の使用について述べられている（これらの文献は参照によってその全体が本明細書に明示的に組み込まれる）。このような二機能性融合遺伝子の使用は、公知の技術（たとえば、Riddellらに付与された米国特許第６，０４０，１７７号の１４〜１７段落を参照されたい（この文献は参照によってその全体が本明細書に明示的に組み込まれる））、または本明細書の記載を元に当業者によって容易に理解されうる上記技術の変法によって実施することができる。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載されているように、Ｔ細胞はキメラ受容体で改変される。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、処置を受ける対象から得られ、別の実施形態においては、前記リンパ球は同種異系のヒトドナー、好ましくは健常ヒトドナーから得られる。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。

いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、本明細書に記載されているように、細胞上の表面分子と特異的に結合するリガンド結合ドメイン、ポリペプチドスペーサー領域、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）に由来する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＣＤ２８共刺激ドメインおよび／または４−１ＢＢ共刺激ドメインをＣＤ３ζ鎖に融合することによって、前記キメラ受容体を介して共刺激シグナルを提供することもできる。キメラ受容体は、ＨＬＡとは無関係に細胞表面分子に特異的である。したがって、ＨＬＡによる制限や腫瘍細胞におけるＨＬＡの低レベル発現などの、ＴＣＲによる認識に関連する制限事項には縛られない。

いくつかの実施形態において、ＣＤ４^＋Ｔリンパ球集団およびＣＤ８^＋Ｔリンパ球集団のそれぞれに導入されるキメラ受容体は同じでも異なっていてもよい。いくつかの実施形態においては、これらの細胞集団のそれぞれに導入されるキメラ受容体のリガンド結合ドメインは、細胞上の同じリガンドに特異的に結合する。前記細胞シグナル伝達モジュールもそれぞれ異なっていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと同一のものである。別の実施形態では、前記ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと異なるものである。いくつかの実施形態においては、抗ＣＤ１９ＣＡＲを１つのリンパ球集団に導入し、ＥＧＦＲ特異的ＣＡＲを別のリンパ球集団に導入する。

いくつかの実施形態において、ＣＤ４Ｔリンパ球またはＣＤ８Ｔリンパ球はそれぞれ、本明細書に記載の形質導入の前に、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞またはエフェクター細胞にソートする。いくつかの実施形態において、ＣＤ４Ｔリンパ球またはＣＤ８Ｔリンパ球はそれぞれ、形質導入を行った後に、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞またはエフェクター細胞にソートする。

遺伝子送達のための組換え感染性ウイルス粒子を利用した様々な形質導入技術が開発されてきた。このような形質導入技術は、本明細書に記載のＴリンパ球を形質導入するためのアプローチとして現時点では好ましい。この形質導入技術に通常使用されるウイルスベクターとしては、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスに由来するウイルスベクターが挙げられる。このように、遺伝子導入方法および発現方法としては様々なものが存在するが、このような方法は、哺乳類細胞に遺伝物質を導入して発現させることを本質的な機能とする。前記形質導入技術のいくつかは、造血細胞またはリンパ球に形質導入することを目的として使用され、このような形質導入技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、組換えアデノウイルスによる感染、アデノ随伴ウイルスによる感染、およびレトロウイルスベクターによる感染が挙げられる。
初代Ｔリンパ球の形質導入は、エレクトロポレーションおよびレトロウイルスまたはレンチウイルスの感染によって成功を収めている。

レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを使用することによって、真核細胞への遺伝子導入を非常に効率的に行うことができる。さらに、レトロウイルスまたはレンチウイルスの組み込みは制御下で行うことができ、細胞１個あたり１コピーまたは数コピーの新しい遺伝情報を安定して組み込むことができる。

いくつかの実施形態においては、ネガティブ選択可能な表現型を有する細胞のインビトロでの選択を可能にするポジティブマーカーをＴ細胞に導入すると有用である場合がある。このポジティブ選択可能なマーカーは、導入された宿主細胞において、該遺伝子を持つ細胞のポジティブ選択を可能にする表現型を優位に発現する遺伝子であってもよい。このような遺伝子は当技術分野において公知であり、具体的には、ハイグロマイシンＢに対する耐性を与えるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質であるＧ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ポジティブマーカーは、細胞を選択するための末端切断型ＥＧＦＲタンパク質である。

Ｔリンパ球に形質を導入するため、当技術分野において公知の様々な方法を使用することができる。いくつかの実施形態においては、レンチウイルスベクターを用いて形質導入を行う。いくつかの実施形態においては、キメラ受容体をコードする発現ベクターを使用して、ＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞をそれぞれ別々に改変し、所定の集団を形成することができる。いくつかの実施形態においては、これらの細胞は、次いで、前述したナイーブ細胞の亜集団、セントラルメモリー細胞の亜集団、およびエフェクター細胞の亜集団のそれぞれに固有の細胞表面抗原でソートすることによって、これらの亜集団にソートされる。

いくつかの実施形態においては、抗原または腫瘍標的に応答して増殖するＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞が選択される。たとえば、抗原または腫瘍標的で刺激した場合に、偽物形質導入細胞よりも、活発に増殖するＣＤ４^＋細胞またはＣＤ８^＋形質導入細胞が選択される。いくつかの実施形態においては、抗原を有する細胞に対して細胞傷害性を示すＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞が選択される。いくつかの実施形態においては、ＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ８^＋細胞よりも低い細胞傷害性を示すと予想される。

別の一実施形態においては、特定の種類のがんについて確立されたインビボ動物モデルにおいて、細胞を殺傷する能力を発揮する形質導入リンパ球（たとえばＣＤ８^＋セントラルメモリー細胞）が選択される。そのような動物モデルは当業者に知られており、この動物モデルにヒトは包含されない。本明細書に記載されているように、リンパ球に形質導入されたキメラ受容体構築物は、インビトロで活性化され、細胞を殺傷する能力を付与したとしても、そのキメラ受容体構築物のすべてが、インビボにおいて腫瘍細胞を殺傷する能力を付与するとは限らない。

本開示は、組成物においてＣＤ４^＋Ｔ細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞の組み合わせを使用することを包含する。一実施形態において、キメラ受容体により形質導入されたＣＤ４^＋細胞の組み合わせは、同じリガンドに特異的である形質導入キメラ受容体発現ＣＤ８^＋細胞と組み合わせてもよく、あるいは異なる腫瘍リガンドに特異的であるＣＤ８^＋Ｔ細胞と組み合わせてもよい。別の実施形態においては、形質導入キメラ受容体発現ＣＤ８^＋細胞は、腫瘍上に発現された別のリガンドに特異的な形質導入キメラ受容体発現ＣＤ４^＋細胞と組み合わせる。さらに別の実施形態においては、キメラ受容体で改変されたＣＤ４^＋細胞とＣＤ８^＋細胞とを組み合わせる。いくつかの実施形態においては、ＣＤ８^＋細胞とＣＤ４^＋細胞は、様々な比率で組み合わせることができ、たとえば、ＣＤ８^＋とＣＤ４^＋とを１：１の比率で組み合わせることができ、ＣＤ８^＋とＣＤ４^＋とを１０：１の比率で組み合わせることができ、ＣＤ８^＋とＣＤ４^＋とを１００：１の比率で組み合わせることができ、またはこれらの比率のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の別の比率でＣＤ８^＋とＣＤ４^＋とを組み合わせることができる。いくつかの実施形態においては、組み合わされた細胞集団は、インビトロおよび／またはインビボにおいて細胞増殖を試験し、細胞の増殖が見られる細胞比率を選択する。

本明細書に記載されているように、本開示では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞をさらに亜集団に分離することを包含し、たとえば、ナイーブ細胞集団、セントラルメモリー細胞集団およびエフェクターメモリー細胞集団などに分離される。本明細書に記載のように、いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ４５ＲＯ⁻、ＣＤ４５ＲＡ^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ２８^＋、ＣＤ２７^＋、および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋および／またはＣＤ４５ＲＯ^＋である。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ⁻および／またはＣＤ４５ＲＯ^＋である。これらの集団はそれぞれ別個にキメラ受容体で改変することができる。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ２８^＋および／またはＣＤ２７^＋である。

形質導入を行った後および／またはキメラ受容体を有する細胞を選択した後、得られた各細胞集団は、ヒト対象中への少なくとも１回の注入に十分な数に達するまでインビトロにおいて増殖させることが好ましく、少なくとも１回の注入に十分な細胞数としては、典型的には、約１０^４細胞／ｋｇ〜１０^９細胞／ｋｇが挙げられる。いくつかの実施形態においては、前記形質導入細胞は、抗原を有する細胞、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、および／もしくはＩＬ−２１、ならびに／またはそれらの組み合わせの存在下で培養される。いくつかの実施形態においては、ビーズまたは粒子などの抗体結合支持体の存在下で前記Ｔ細胞を刺激する。いくつかの実施形態においては、抗ＴＣＲ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、および／または抗ＣＤ２８抗体を含む抗体結合支持体で前記Ｔ細胞を刺激する。いくつかの実施形態においては、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む抗体結合支持体で前記Ｔ細胞を刺激する。

ＣＤ４^＋細胞の亜集団とＣＤ８^＋細胞の亜集団とを組み合わせてもよい。特定の一実施形態においては、改変されたナイーブＣＤ４^＋細胞またはセントラルメモリーＣＤ４^＋細胞と、改変されたセントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞とを組み合わせることによって、抗原を有する細胞（たとえば細胞表面上にＣＤ１９を有するＢ細胞）に対して相乗的な細胞傷害性効果を提供する。

組成物
本発明の開示は、本明細書に記載の遺伝子改変Ｔリンパ球製剤を含む養子細胞免疫療法組成物を提供する。

いくつかの実施形態においては、前記Ｔリンパ球製剤は、キメラ受容体を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体は、本明細書に記載されているように、前記疾患または障害に関連するリガンドに特異的な細胞外抗体可変ドメイン、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体またはその他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態においては、養子細胞免疫療法組成物は、細胞性免疫応答を提供可能な、キメラ受容体により改変された腫瘍特異的なＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球製剤をさらに含み、前記細胞傷害性Ｔリンパ球製剤は、キメラ受容体を有するＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体は、本明細書に記載されているように、前記疾患または障害に関連するリガンドに特異的な細胞外一本鎖抗体、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

いくつかの実施形態においては、養子細胞免疫療法組成物は、キメラ受容体により改変された腫瘍特異的なＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球製剤、抗原反応性のキメラ受容体で改変されたナイーブＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞、および薬学的に許容される担体を含み、前記細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、細胞性免疫応答を提供し、かつキメラ受容体を有するＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、前記疾患または障害に関連するリガンドに特異的な細胞外一本鎖抗体、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むこと、ならびに前記ナイーブＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞が、ＣＤ４５ＲＯ⁻ＣＤ６２Ｌ^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞に由来することを特徴とする。

別の実施形態においては、養子細胞免疫療法組成物は、抗原特異的ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球製剤と抗原反応性のキメラ受容体で改変されたナイーブＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞との組み合わせを含み、前記ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、患者由来であり、細胞性免疫応答を提供すること、前記ナイーブＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞が、ＣＤ８^＋Ｔリンパ球による免疫応答を増強すること、ならびに前記ヘルパーＴリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、前記疾患または障害に関連する抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン含むことを特徴とする。

さらに別の一実施形態において、養子細胞免疫療法組成物は、抗原反応性キメラ受容体により改変したナイーブＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞含み、該ヘルパーＴリンパ球製剤が、前記ＣＤ８^＋Ｔリンパ球による免疫応答を増強し、キメラ受容体を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、疾患または障害に関連するリガンドに特異的な細胞外抗体可変ドメイン、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。

いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４^＋Ｔヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４^＋Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４^＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ⁻、ＣＤ４５ＲＡ^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ２８^＋、ＣＤ２７^＋および／またはＣＤ４^＋を含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔリンパ球は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８^＋Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ２８^＋および／またはＣＤ８^＋を含む。さらに別の実施形態では、前記ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球はセントラルメモリーＴ細胞であり、前記ＣＤ４^＋ヘルパーＴリンパ球はナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞またはセントラルメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞である。

本発明の開示は、養子免疫療法組成物の製造方法、および、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行うための、該組成物の使用、または疾患または障害を有する対象において組成物を使用して細胞免疫療法を行う方法を提供する。前記キメラ受容体により改変されたＴ細胞の増殖および持続性は、前記疾患または障害の動物モデルを使用し、前記細胞を投与し、移入された細胞の持続能力および／または増殖能力を算出することによって、測定することができる。別の実施形態において、増殖および活性化は、抗原を有する細胞を使用して複数回にわたって活性化することによって、インビトロで試験することができる。

いくつかの実施形態においては、前記組成物の製造方法は、改変されたナイーブＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞を得ることを含み、前記改変されたヘルパーＴリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。

別の一実施形態においては、前記方法は、改変されたＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞を得ることをさらに含み、前記改変された細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ８^＋細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。

別の一実施形態においては、前記方法は、改変されたＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞を得ることを含み、前記改変された細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とし、該方法は、前記改変されたＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞とＣＤ４^＋ヘルパー細胞リンパ球製剤とを組み合わせることをさらに含む。

キメラ受容体で改変されたＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞の調製は、上記および実施例で説明したとおりである。抗原特異的Ｔリンパ球は、疾患または障害を有する患者から得ることができ、また、抗原の存在下、インビトロにおいてＴリンパ球を刺激することによっても調製することができる。抗原特異性によって選択されなかったＣＤ４^＋Ｔリンパ球亜集団およびＣＤ８^＋Ｔリンパ球亜集団も本明細書に記載の方法で単離することができ、前記製造方法に組み込むことができる。いくつかの実施形態においては、このような細胞集団の組み合わせは、細胞表面マーカーの均一性、すなわち少なくとも２世代にわたり増殖する能力を評価して、均一な細胞分化状態を有するかどうかを確認することができる。品質管理は、前記標的リガンドを発現する細胞株とキメラ受容体により改変されたＴ細胞とを共培養し、当技術分野で公知の細胞傷害アッセイ、増殖アッセイまたはサイトカイン産生アッセイを使用して、該キメラ受容体により改変されたＴ細胞が該細胞株を認識するかどうかを確認することによって実施することができる。前記キメラ受容体により改変されたＴ細胞の細胞分化状態および細胞表面マーカーは、フローサイトメトリーによって測定することができる。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ８^＋細胞の前記マーカーおよび細胞分化状態は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４５ＲＯおよび／またはＣＤ４５ＲＡを含む。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ４^＋細胞の前記マーカーおよび細胞分化状態は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＤ４５ＲＯおよび／またはＣＤ４５ＲＡを含む。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌを含む。いくつかの実施形態において、前記マーカーはＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌを含む。

いくつかの実施形態は、がん（たとえばＡＬＬ）などの疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、該疾患を治療、抑制または緩和するアプローチに関し、このようなアプローチには、がんの進行および／もしくは転移を抑制するもしくは遅延させる方法、体内に存在する腫瘍細胞またはがん細胞を抑制または低減する方法、ならびに／またはＣＤ１９発現細胞を含む標的集団の抑制もしくは低減を必要とする患者において、該標的集団を抑制または低減する方法が含まれる。これらの方法は、細胞性免疫応答を提供する遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球製剤を上記の処置を必要とする対象または患者に投与することを含み、該細胞傷害性Ｔリンパ球製剤はキメラ受容体を有するＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドおよび１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むこと、前記リガンドが、腫瘍持異抗原、またはリンパ球による認識および／もしくは排除を媒介するのに適切な標的細胞集団に発現しているその他の分子（たとえばＣＤ１９）であること、前記ポリペプチドスペーサーがカスタマイズされた長さを有すること、前記スペーサーによって、Ｔ細胞の増殖、および／またはサイトカイン産生が対照キメラ受容体よりも増強されることを特徴とする。

また、本発明の開示は、がん（たとえばＡＬＬ）などの疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、本明細書に記載のキメラ受容体を発現するリンパ球を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、前記方法は、遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球製剤と遺伝子改変ヘルパーＴリンパ球製剤とを前記対象に投与することを含み、前記細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、細胞性免疫応答を提供し、かつキメラ受容体を有するＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むこと、前記ヘルパーＴリンパ球製剤が、直接認識を誘導するとともに、前記細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞性免疫応答を媒介する能力を増強し、かつキメラ受容体を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。

本発明の開示の範囲を何ら限定するものではないが、インビボで持続し増殖することができるキメラ受容体改変Ｔ細胞集団を投与前に選択することによって、Ｔ細胞の用量を低減することができ、かつ治療活性をより均一なものとすることができると考えられる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の用量を少なくとも１０％、２０％、３０％、またはそれ以上低減することができる。Ｔ細胞の用量を低減することは、腫瘍崩壊症候群およびサイトカインストームのリスクの低減に有益だと考えられる。

別の一実施形態では、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行う方法は、遺伝子改変ヘルパーＴリンパ球製剤を前記対象に投与することを含み、前記改変されたヘルパーＴリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。いくつかの実施形態においては、前記方法は、遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球製剤を前記対象に投与することをさらに含み、前記改変された細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ４^＋細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする。

別の一実施形態は、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、前記対象の生体試料を分析して、前記疾患または障害に関連する標的分子（たとえばＣＤ１９）の存在を検出すること、および本明細書に記載の養子免疫療法組成物を投与することを含み、前記キメラ受容体が、前記標的分子（ＣＤ１９）に特異的に結合することを特徴とする方法に関する。

いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４^＋Ｔヘルパーリンパ球は、前記キメラ受容体の導入前に、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４^＋Ｔ細胞からなる群から選択される。特定の一実施形態では、前記ＣＤ４^＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ⁻、ＣＤ４５ＲＡ^＋、ＣＤ２８^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋および／またはＣＤ４^＋を含む。さらに別の実施形態においては、前記細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔリンパ球は、前記キメラ受容体の導入前に、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８^＋Ｔ細胞からなる群から選択される。特定の一実施形態では、前記ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ２８^＋、ＣＤ２８^＋および／またはＣＤ８^＋を含む。特定の一実施形態においては、前記ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球はセントラルメモリーＴ細胞であり、前記ＣＤ４^＋ヘルパーＴリンパ球はナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞はいずれも、細胞表面分子に特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含むキメラ受容体で遺伝子改変されている。別の実施形態においては、前記ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと同一のものである。さらに別の実施形態では、前記ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと異なるものである。

本明細書に記載の実施形態が適用されうる対象としては、ヒト、サルや類人猿などの他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマなどの愛玩動物、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどの家畜などが挙げられる。対象は雄性でも雌性でもよく、任意の適切な年齢であってもよく、たとえば、幼児、幼年者、若年者、成人、および高齢者の対象が挙げられる。本発明の方法は、たとえば、ＣＤ１９担持するがんまたは細胞の治療に有用である。

前述のように製造された細胞は、本発明の開示を踏まえ、当業者であれば容易に理解できる公知の技術またはその変法に従って、養子免疫療法のための方法および組成物において使用することができる。

いくつかの実施形態において、前記細胞の製剤化は、まず該細胞を培地から回収し、次いで該細胞を洗浄し、投与に適した培地および容器システム（「薬学的に許容され得る」担体）中において該細胞を治療有効量まで濃縮することによって行われる。適切な注入用培地は、任意の等張性培地製剤であってもよく、典型的には、生理食塩水、Normosol R（アボット）もしくはPlasma-Lyte A（バクスター）、５％デキストロース水溶液、または乳酸リンゲル液を使用することができる。注入用培地にはウシ胎児血清を添加してもよい。次いで、細胞をサイトカインで処理することにより、サイトカインで刺激していないＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団と比べて、移植適合性が増強または改善されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団を得る。改善された所望の移植適合性を示す細胞を作製するため、Ｔ細胞の増殖中に前記サイトカインをインビトロで添加することが望ましい。したがって、分離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞の増殖中にサイトカインを添加することによって刺激される。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、少なくとも１つのサイトカインで刺激され、該少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬー７、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、少なくとも１つのサイトカインで刺激され、該少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２１を含む。

組成物中の細胞の治療有効量または抑制有効量とは、少なくとも２つの細胞サブセット（たとえば、ＣＤ８^＋セントラルメモリーＴ細胞の１つのサブセットとＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞の１つのサブセット）の量を指し、より典型的には、１０^２個を超えかつ１０^６個以下の細胞であり、または１０^８個以下または１０^９個以下の細胞であり、たとえば、１０^８個または１０^９個であってもよく、１０^１０個を超える数の細胞であってもよく、これら２つの値のいずれかによって定義される範囲にある任意の他の値で表される細胞数であってもよい。細胞の数は、前記組成物の最終的な用途や、該組成物に含まれる細胞種などによって決定される。たとえば、特定の抗原に特異的な細胞が所望される場合、前記集団を占める該細胞の割合は７０％を超え、一般的には、８０％を超え、８５％を超え、かつ／または前記集団全体の９０〜９５％を占める。本明細書に記載の用途において、前記細胞の量は通常１Ｌ以下であり、５００ｍｌ以下であってもよく、さらには２５０ｍｌ以下もしくは１００ｍｌ以下であってもよく、これらの値のいずれか２つによって定義される範囲にある任意の他の値で表される量であってもよい。したがって、前記所望の細胞の密度は、典型的には、１０^４細胞／ｍｌよりも大きく、通常１０^７細胞／ｍｌよりも大きく、通常１０^８細胞／ｍｌ以上である。臨床用途に適したこのような数の免疫細胞は、複数の注入に分割して投与してもよく、その累積投与量は１０^６個、１０^７個、１０^８個、１０^９個、１０^１０個、もしくは１０^１１個の細胞、もしくはこれらの細胞数以上の細胞、またはこれらの２つの値のいずれかによって定義される範囲にある任意の他の細胞数に相当する。

いくつかの実施形態において、本発明のリンパ球は、個体に免疫を付与するために使用することができる。「免疫」は、病原体の感染に対する応答またはリンパ球反応の標的となる腫瘍に対する応答に伴う１つ以上の身体症状を軽減することを意味する。前記細胞の投与量は、通常、病原体に対する免疫を備える正常個体の体内に存在する量の範囲内である。したがって、細胞は、通常、注入によって投与され、１回の注入あたり２個以上から少なくとも１０^６個〜３×１０^１０個までの範囲の数の細胞が投与され、少なくとも１０^７個〜１０^９個の細胞を注入することが好ましい。前記Ｔ細胞は、単回の注入によって、または特定の期間における複数回の注入によって投与することができる。しかしながら、個体によって反応性が異なると考えられるため、注入する細胞の種類および細胞の量、ならびに注入の回数および複数回の注入を実施する期間は主治医によって決定され、日常的な検査によっても決定することができる。十分な量のＴリンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパーＴリンパ球を含む）の作製は、本明細書に例示したような、本発明による迅速な増殖方法を用いて容易に行うことができる。たとえば、Riddellらに付与された米国特許第6,040,177号の第１７段落を参照されたい（この文献は参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれるさらなる）。

いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の組成物は、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、骨髄内投与、リンパ節内投与、かつ／または脳脊髄液内投与される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、化学療法剤および／または免疫抑制剤とともに投与される。別の一実施形態においては、まず、本発明の免疫細胞以外の免疫細胞を抑制または殺傷する化学療法剤を患者に投与してから、本明細書に記載の組成物を投与する。場合によっては、化学療法を完全に省いてもよい。

ＡＬＬ患者への投与
治験参加者から得られた成分分離血からＣＤ４Ｔ細胞サブセットおよびＣＤ８Ｔ細胞サブセットを免疫磁気的に単離した。抗ＣＤ３×ＣＤ２８ビーズでの刺激後、選択および追跡のための自殺構築物ＥＧＦＲｔとFMC63scFv:IgG4hinge:CD28tm:4-1BB:ζCARとを共発現させるＳＩＮレンチウイルスベクターでＴ細胞株に形質導入を行った。組換えヒトサイトカインを用いて形質導入細胞を１０〜２０日間培養して臨床使用に適した数まで増殖させ、培養期間中に該形質導入細胞のＥＧＦＲｔ免疫磁気ポジティブセレクションを行った。リンパ球を除去するための化学療法を行った後、直ちに、凍結保存しておいたＣＤ４／ＥＧＦＲｔ^＋Ｔ細胞製剤およびＣＤ８／ＥＧＦＲｔ^＋Ｔ細胞製剤を解凍し、所定のプロトコルに規定された投与量レベル（投与量レベル１＝０．５×１０^６個／ｋｇ；投与量レベル２＝１×１０^６個／ｋｇ；投与量レベル３＝５×１０^６個／ｋｇ）にてＥＧＦＲｔ^＋ＣＤ４Ｔ細胞とＥＧＦＲｔ^＋ＣＤ８Ｔ細胞とが１：１の割合で患者に投与されるように、臨床現場にて前記製剤を注入した。いくつかの実験においては、前記濃縮されたＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を、５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−７（ｒｈＩＬ−７）および／または０．５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）と接触させることによって、たとえば該細胞を増殖させた。また、いくつかの実験においては、前記濃縮されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を、５０Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）および／または０．５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）と接触させることによって、たとえば該細胞を増殖させた。

登録された対象（ｎ＝１６）は、輸液用として精製され、投与計画に適合した細胞製剤の投与を受けた。１３名の対象（男性６名、ＨＳＣＴから３年経過）は、実験の前に様々な投与量レベル（０．５×１０^６／ｋｇ〜５×１０^６／ｋｇの範囲）で治療を既に受けていた。本発明の輸液は、グレード２を超える有害事象（ＤＭＳＯに関連したグレード３のアナフィラキシー）は１件に過ぎず、該輸液の忍容性は良好であった。１３名の対象のうち１２名は、９２％のＯＲＲ（全奏効率）を示した。１３名の対象のうち１１名は、ＭＲＤ陰性のＣＲ（完全奏効）に達した（８５％）。疾病負荷が高かった対象は、ＭＲＤ陰性骨髄を持つ対象と比べて高いピークＰＢＣＡＲＴ細胞レベルを有していた（６２．７％対１９．６％）。骨髄（ｎ＝１２）、末梢血（ｎ＝１２）およびＣＳＦにおけるＣＡＲＴ細胞の増殖による蓄積を観察した。Ｔ細胞移植片が消失した５名の対象における平均持続期間は６３日であった（４２〜１５０日の範囲）。

応答性を示した１２名の対象はいずれも、顕著な症状として発熱および低血圧を伴うある程度のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を発症した。２名の対象Ｓ０２およびＳ０９は、重症サイトカイン放出症候群（ｓＣＲＳ）に対する免疫調節治療を必要とした（２名に対しトシリズマブを投与し、１名にはさらにデキサメタゾンの追加した）。これらの患者１３名のうちの４名は、脳症を発症した（２名がグレード１、１名がグレード３、１名がグレード４）。グレード４の脳症は、ＤＬＴ（用量制限毒性）であり、発作を伴い、ＰＲＥＳに類似した異常なＭＲＩ所見を示した。ＭＲＩ所見は治療後９週間までに正常化したが、この対象は、最終評価の時点で、治療から６か月にわたって発作を起こし続けた。

上述したとおり、調製・精製されたCD4:CD8 CD19CAR/EGFRt⁺T細胞の輸液をｋｇ体重当たりの規定量で投与したところ、ＨＳＣＴ後に再発が起こした小児および若年成人ＡＬＬ患者において、ＭＲＤ陰性のＣＲ（完全奏効）が良好な割合で見られた。したがって、１６名の登録患者の各々からドナー由来の製剤を作製することが可能である。評価可能な１３名の患者について予測される毒性としては、ＩＣＵ入院率が約３０％であるＣＲＳ、および重症度が軽症から重症の範囲に及ぶ脳症が挙げられる。ＭＲＤの陰性応答は、すべての投与量レベルで見られたが、早期のデータからは投与量を増加すると持続性も向上することが示唆された。

１名の患者は、Ｔ細胞による治療後に急性ＧＶＨＤを発症したが、予備的評価では、ＣＡＲＴ細胞がこの応答を媒介したわけではないことが示唆された。興味深いことに、プレドニゾンはＴ細胞移植片の持続性に影響を及ぼさなかった。したがって、ＣＤ２８マーカー、ＣＤ２７マーカー、およびＣＤ６２Ｌマーカーを維持していた細胞は、所定のサイトカイン混合物で処理されなかったため移植適合性に寄与する前記マーカーを欠いていた細胞よりも高い持続性を示した。本発明の治療法では、これらのマーカーを維持するＴ細胞が使用されている。

図１８に、キメラ抗原受容体を含む本遺伝子改変Ｔ細胞の製造に使用される製造方法の工程の進行を表したフローチャートを示す。図示したとおり、この本発明の製造方法はFicoll処理を含まないが、初期の実験的製法ではFicoll処理工程を含んでいた。図１９のフローチャートで示すように、初期培養において細胞濃度を変化させた試験も行った。また、細胞をサイトカインの存在下で増殖させた（図２０）。

図２０に示すように、ドナー試料ＰＤ００６４：ＰＤ００６３由来のＣＤ８^＋濃縮Ｔ細胞を用いて、開始時のＴ２５フラスコにおける出発試料中の細胞密度を試験した。いずれの細胞（ＰＤ００６４、ＰＤ００６３に由来）も通常のＰＬＡＴ−０２培養条件、すなわちＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）＋ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）で試験した。Ｔｘ日における細胞の増殖を試験するため、ドナー試料ＰＤ００８０由来の細胞を培地およびサイトカインに加え、最終細胞濃度０．７×１０^６個／ｍＬまで増殖させた（「早期増殖」）。本明細書において「Ｔｘ」とは、ビーズで刺激した日を０日目（Day+0）と定義したとき、１日目（Day+1）を指す。ＰＤ００６３ＣＤ８^＋細胞を、濃縮出発材料として使用した。ＰＤ００６４：ＰＤ００６３由来ＣＤ８^＋濃縮細胞の場合と同じサイトカイン条件を用いた。この実験では２つの細胞密度を試験しており、サイトカインの存在下で細胞培養物の量を早期に増加させた場合に、いずれの細胞密度の細胞も高い生存能および増殖を示した。ここで「量の増加」とは、Ｔｘ後に最初に供給した培地／サイトカインの添加量を「早期増殖」条件において増加させたことをいい、これによって「早期増殖」条件での培養中に細胞密度が減少する。

図２１に、細胞試料ＰＤ１０４およびＰＤ０１１６の増殖、ならびに実験条件下での細胞増殖の比較を示す。ＰＤ０１０４：ＰＤ００６３由来のＣＤ８^＋濃縮細胞およびＣＤ４^＋濃縮細胞を用いて前記と同様にして実験を再度行い、Ｔｘ日における０．７×１０^６個／ｍＬまでの細胞の増殖を試験した（「早期増殖」）。このとき、添加したサイトカインおよびその濃度は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞については、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）＋ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）とし、ＣＤ４^＋Ｔ細胞については、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）とした。増殖および生存能は劇的に増加した。これらの細胞が示した曲線は、増殖／ビーズ除去／選択／凍結保存のタイミングに関しては臨床製剤で見られるものと類似している。

前記のＰＤ０１１６：ＰＤ００４６由来のＣＤ８^＋濃縮Ｔ細胞およびＣＤ４^＋濃縮Ｔ細胞を用いて実験を再度行い、Ｔｘ日における０．７×１０^６個／ｍＬまでの細胞の増殖を試験した（「早期増殖」）。通常のＰＬＡＴ−０２培養条件、すなわち、ＣＤ８細胞にはＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）＋ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を使用し、ＣＤ４細胞にはＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を使用した。ＰＤ１１６は、Ｖ−１９７バッグ中において１８０×１０^６個から開始し、磁気濃縮およびスピノキュレーションを輸液パック中で行った。図示したとおり、これらの条件において、増殖および生存能は劇的に増加した。これらの細胞が示した曲線は、増殖、ビーズ除去、選択、およびＴ細胞の凍結保存のタイミングに関しては臨床製剤で見られるものと類似している。

また、ＰＤ０１１６：ＰＤ００４６由来のＣＤ８^＋濃縮細胞およびＣＤ４^＋濃縮細胞に培地およびサイトカインを添加して実験を再度行い、Ｔｘ日における最終量０．７×１０^６個／ｍＬまでの細胞の増殖を試験した（「早期増殖」）。通常のＰＬＡＴ−０２培養条件、すなわち、ＣＤ８細胞にはＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）＋ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を添加し、ＣＤ４細胞にはＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を添加した。ＰＤ１１６は、Ｖ−１９７バッグ中において１８０×１０^６個から開始し、磁気濃縮およびスピノキュレーションを輸液パック中で行った。これは、改良した製造方法に移行にした際に使用された実用スケールのデータであった。図２１に示すとおり、増殖の拡大は、ＣＤ４^＋細胞よりもＣＤ８^＋細胞の方が大きかった。ＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞に対して使用したサイトカイン、ならびに使用したサイトカインの組み合わせのバリエーションを図２２のフローチャートに示す。

様々なサイトカイン条件についても、ドナー由来の前記ＣＤ８^＋細胞および前記ＣＤ４^＋細胞で試験した。図２３のパネルＡ〜Ｆに示すとおり、ＰＤ００４７およびＰＤ００４０由来の試料を、ＩＬ２／ＩＬ１５、ＩＬ７／ＩＬ１５、ＩＬ２／ＩＬ７／ＩＬ１５、ＩＬ２でパルス後ＩＬ７／ＩＬ１５、ＩＬ２のみ、ＩＬ２でパルス後ＩＬ７／ＩＬ２１およびＩＬ２／ＩＬ１５で処理した。この実験には、ＩＬ−２単独（パルス）とともに５日間インキュベーションし、次いでＩＬ−７／ＩＬ−２１を加え、これらのサイトカインを除去することなく残りの培養を続けた実験、ならびにＩＬ−２単独（パルス）とともに５日間インキュベーションし、次いでＩＬ−７／ＩＬ−２１およびＩＬ２／ＩＬ１５を加え、これらのサイトカインを除去することなく残りの培養を続けた実験を含んでいた。ＰＤ００４０：ＰＤ００３８由来のＣＤ８^＋濃縮Ｔ細胞を用いて、様々なサイトカインカクテルについて試験した。各条件におけるサイトカインの濃度は、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）であった。条件＃４は、ＩＬ−２で５日間パルスし、次いでＩＬ−７／ＩＬ−１５を加え、これらのサイトカインを除去することなく残りの培養を続けた。増殖倍率および総細胞数（ＴＮＣ）は小規模実験から外挿した。この実験で使用したＩＬ−２／ＩＬ−１５の組み合わせが最も優れた増殖を示した。この試験では、ＩＬ−２／ＩＬ−１５の組み合わせが最も優れた増殖をもたらすことが立証された。

図に示したように、前記ＰＤ００４７：ＰＤ００３８由来のＣＤ８^＋濃縮細胞を用いて、様々なサイトカインカクテルを試験した。最終濃度を１０Ｕ／ｍＬとした「低用量」のＩＬ−２を用いて、同じサイトカインカクテルを試験した。様々な組み合わせで使用された各サイトカインの濃度は、図中の凡例に記載のとおりＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）および（１０Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２１（５ｎｇ／ｍＬ）であった。パルス条件は、ＩＬ−２で５日間パルスし、次いでＩＬ−７／ＩＬ−２１を加え、これらのサイトカインを除去することなく残りの培養を続けた。増殖倍率および総細胞数（ＴＮＣ）は小規模実験から外挿する。ＩＬ−２／ＩＬ−１５の組み合わせは、最も優れた増殖を示し、以降の実験に使用した。「通常」の用量のＩＬ−２が最も優れた増殖を示した。パネルＡは、ＰＤ００４７細胞のインキュベーションによって１５日目（Ｄ１５）に得られた結果、ならびに様々なサイトカインによる増殖の比較、および様々なサイトカイン条件下（ＣＤ３^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ３^＋／ＣＤ６２Ｌ^＋／ＣＤ４５ＲＯ⁻、ＣＤ２８^＋、ＣＤ４５ＲＡ^＋／ＣＤ４ＲＯ⁻、ＣＤ４５ＲＡ^＋／ＣＤ４５ＲＯ＿およびＣＤ４５ＲＡ⁻／ＣＤ４５ＲＯ^＋）でのインキュベーション後の陽性細胞のパーセンテージを示す。

パネルＢは、ＰＤ００４７細胞のインキュベーションによって２１日目（Ｄ２１）に得られた結果、ならびに様々なサイトカインによる増殖の比較および上記で示した条件下での陽性細胞のパーセンテージを示す。パネルＣは、ＰＤ００４０Ｄ２１および様々なサイトカインによる増殖の比較を示し、総細胞数は２２日間の培養増殖後に調べたものである。パネルＤは、ＰＤ００４０Ｄ２１および様々なサイトカインによる増殖の比較を示し、図に示したように、ＣＤ３^＋細胞の増殖を２２日間の培養増殖後に調べたものである。パネルＥは、ＰＤ００４７および様々なサイトカインによる増殖の比較を示し、総細胞数を２２日間の培養増殖後に調べたものである。パネルＦは、ＰＤ００４７および様々なサイトカインによる増殖の比較を示し、図に示したように、ＣＤ３^＋細胞の増殖を２２日間の培養増殖後に調べたものである。上記と同様にして、ＰＤ００４０：ＰＤ００３８由来のＣＤ８^＋濃縮細胞を用いて、様々なサイトカインカクテルを試験した。各条件におけるサイトカインの濃度は、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）であった。条件＃４は、ＩＬ−２で５日間パルスし、次いでＩＬ−７／ＩＬ−１５を加え、これらのサイトカインを除去することなく残りの培養を続けた。増殖倍率および総細胞数（ＴＮＣ）は小規模実験から外挿した。ＩＬ−２／ＩＬ−１５の組み合わせは、最も優れた増殖を示し、以降の実験に使用した。さらに、ＰＤ００４７：ＰＤ００３８由来のＣＤ８^＋濃縮細胞を用いて、様々なサイトカインカクテルを試験した。最終濃度を１０Ｕ／ｍＬとした「低用量」のＩＬ−２を用いて、同じサイトカインカクテルを試験した。各条件におけるサイトカインの濃度は、図中の凡例に記載のとおりＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）および（１０Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２１（５ｎｇ／ｍＬ）であった。パルス条件は、ＩＬ−２で５日間パルスし、次いでＩＬ−７／ＩＬ−２１を加え、これらのサイトカインを除去することなく残りの培養を続けた。次いで、増殖倍率および総細胞数（ＴＮＣ）を小規模実験から外挿した。この試験で使用したＩＬ−２／ＩＬ−１５のサイトカインの組み合わせが、最も優れた増殖を示した。「通常」用量のＩＬ−２でも最も優れた増殖が示された。特定の表現型の増殖を分析するためにフローサイトメトリーを利用することができ、本明細書におけるさらなる実験で示されている。

図２４に、サイトカインの様々な組み合わせについて試験した一連の実験から得られた結果を示す。２名のドナー由来のＰＤ００５１：ＣＤ８^＋細胞を用いて、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を用いた「通常」のサイトカイン条件を試験した。パルス条件は、ＩＬ−２で５日間パルスした後、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２１（５ｎｇ／ｍＬ）を加え、これらのサイトカインを除去することなく残りの培養を続けた。図示した増殖倍率および総細胞数（ＴＮＣ）は、３０×１０^６個の細胞で開始したスケールアップ実験から得られたものである。ここで使用したＩＬ−２／ＩＬ−１５の組み合わせが最も優れた増殖を示したが、ＩＬ−２でパルスした後、ＩＬ−７／ＩＬ−２１に切り替えた培養物でも増殖が見られた。増殖倍率は、ＰＤ００４７で使用したパルス条件におけるものと類似していた。

ＰＤ００５５では、ＰＤ００５１で評価したものと同じサイトカイン条件を試験したが、ＣＤ４^＋ドナー細胞（上記と同じドナーＰＤ００３８に由来）を用いた。この実験のサイトカイン条件は、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）であった。パルス条件は、ＩＬ−２で５日間パルスした後、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２１（５ｎｇ／ｍＬ）を加え、これらのサイトカインを除去することなく残りの培養を続けた。増殖倍率および総細胞数（ＴＮＣ）は、３０×１０^６個の細胞で開始したスケールアップ実験から得られたものである。ここで使用したＩＬ−７／ＩＬ−１５の組み合わせは、通常の増殖を示したが、ＩＬ−２でパルスした後、ＩＬ−７／ＩＬ−２１に切り替えた培養物ではそれよりも良好な増殖が見られた。パネルＡは、１５日目（Ｄ１５）のＰＤ００５１、ならびに様々なサイトカインによる増殖の比較、およびドナー対ドナーのサイトカイン比較における陽性細胞のパーセンテージ（ＥＧＦＲｔ^＋、ＥＧＦＲｔ^＋／ＣＤ４^＋、ＥＧＦＲｔ^＋／ＣＤ８^＋、ＣＤ３^＋、ＣＤ３^＋／ＣＤ４^＋、ＣＤ３^＋／ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋、ＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＤ３^＋／ＣＤ２８^＋、ＣＤ２７^＋、ＣＤ１２７^＋、ＣＤ４５ＲＡ^＋／ＣＤ４５ＲＯ⁻、ＣＤ４５ＲＡ^＋／ＣＤ４５ＲＯ＿／ＣＤ４５ＲＯ＿／ＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ６２^＋／ＣＤ２８^＋）を示す。パネルＢは、１７日目（Ｄ１７）のＰＤ００５５、ならびに様々なサイトカインによる増殖の比較および陽性細胞のパーセンテージを示す。パネルＣは、ＰＤ００５１の増殖曲線および様々なサイトカインによる増殖の比較を示し、総細胞数は２０日間の培養増殖後に調べたものである。パネルＤは、ＰＤ００５１および様々なサイトカインによる増殖の比較を示し、図に示したように、このＣＤ３^＋細胞の増殖は２０日間の培養増殖後に調べたものである。パネルＣおよびＤは、ＰＤ００５１の増殖曲線（全細胞およびＣＤ３^＋細胞）を示し、培養期間２０日間にわたって所定の様々なサイトカインとともに細胞をインキュベートしたときの増殖を比較したものである。パネルＥおよびＦは、所定の様々なサイトカインとともにインキュベートしたときの、培養増殖の１７日目の所定の時点におけるドナーＰＤ００５５の増殖曲線（全細胞およびＣＤ３^＋細胞）を示す。

図２５に、様々なサイトカインの組み合わせが細胞増殖に及ぼす影響について評価したサイトカイン実験を示す。新たなＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ドナー（ＰＤ００５７）を使用して試験を行ったこと以外は、ＰＤ００５１での実験と同様にして試料ＰＤ００５９のサイトカイン実験を行った。ＣＤ４にはＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を使用し、ＣＤ８^＋にはＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を使用した「通常」のサイトカイン条件で試験を実施した。パルス条件は、ＩＬ−２で５日間パルスした後、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２１（５ｎｇ／ｍＬ）を加え、これらのサイトカインを除去することなく残りの培養を続けた。増殖倍率および総細胞数（ＴＮＣ）は、３０×１０^６個の細胞で開始したスケールアップ実験から得られたものである。この試験においては「通常」のサイトカインの組み合わせで増殖が見られ、ＩＬ−２でパルスした後、ＩＬ−７／ＩＬ−２１に切り替えた培養では良好な増殖が見られた。

別のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ドナー（ＰＤ００６３）を使用して実験を行ったこと以外は、ＰＤ００５１と同様にしてＰＤ００７８のサイトカイン試験を実施した。ＣＤ４にはＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を使用し、ＣＤ８^＋にはＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を使用した「通常」のサイトカイン条件と、ＩＬ−２のみを使用した条件とを比較することによってこの試験を実施した。いずれの培養も１４日目（Ｄ１４）までは通常の増殖レベルを示し、次いで培養物においてＥＧＦＲｔ細胞を選択した。ＣＤ８^＋細胞を選択後、生存能および増殖の回復は認められなかった。パネルＡには、細胞を解凍した後の陽性細胞のパーセンテージを示す。パネルＢは、ＰＤ００５９を使用したＰＬＡＴ−０２条件下でのサイトカインの比較を示す。パネルＣは、ＰＤ００５９を使用したＰＬＡＴ−０２条件下でのサイトカインの比較およびＣＤ３^＋細胞の増殖を示す。パネルＤは、ＰＤ００７８の増殖曲線を示す。パネルＤは、ＰＤ００７８の増殖曲線およびＣＤ３^＋細胞の増殖を示す。

図２６は、初期の増殖方法、および実験に基づいて改良された（すなわち「本発明」の）細胞増殖方法を示す２つのフローチャートである。後者を以降の実験に使用した。

図２７に、ＰＤ００８０、ＰＤ００８４、およびＰＤ００８５由来の試料の増殖曲線、ならびにこれら３つ試料の比較を示す。これらの３つの実験は、「早期増殖」法の反復実験であった。これらの実験においては、前記の標準的なサイトカイン条件、すなわち、ＣＤ８^＋Ｔ細胞にはＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）＋ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を使用し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞にはＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を使用した。ＰＤ００８０では、ＰＤ００６３ＣＤ８^＋Ｔ細胞を用いて、２種の開始密度を二連で試験した。二連で試験した細胞培養物の一方では、形質導入を行った日に３時間インキュベートすることによって、約０．７×１０^６個／ｍＬまで細胞が増加した。ＰＤ００８４では、２種のさらなるＣＤ８^＋ドナーＴ細胞を使用して、早期増殖の効果について評価した。３０×１０^６個の細胞での開始条件を各ドナーの対照として使用し、６０×１０^６個の細胞密度での開始を早期増殖の試験条件として使用した。ＰＤ００８５では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を用いたこと以外はＰＤ００８４と同様にして試験を実施して、早期増殖を評価した。この実験でも、３０×１０^６個の開始時細胞密度を「通常」の対照条件として使用し、６０×１０^６個の開始時細胞密度を試験条件として使用した。

図２８に示すように、ＰＤ００３８の出発材料は、選択されたＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいた。増殖曲線は、プールした細胞を含む２つのＶ−１９７バッグから得た総細胞数（ＴＮＣ）を示す。早い段階から、凍結保存前にＣＤ４とＣＤ８とを５０：５０の比率でプールした製剤とすることが計画されていた。フロー分析データは、プール製剤の解凍後を示す。ビーズ除去およびＥＧＦＲｔ濃縮を、ＣＤ４^＋は１４日目（D+14）に行い、ＣＤ８^＋は１５日目（D+15）に行った。ＣＤ８^＋Ｔ細胞はＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）／ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞はＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）／ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させた。この方法の変法として、各細胞を別々の製剤として凍結保存し、解凍後に５０：５０の製剤を調製し、注入を行った。

図２９に、ＰＤ００４６の増殖曲線を示す。増殖曲線は、プールした細胞を含む２つのＶ−１９７バッグから得た総細胞数（ＴＮＣ）を示す。早い段階から、凍結保存前にＣＤ４とＣＤ８とを５０：５０の比率でプールした製剤とすることが計画されていた。フロー分析データは、プール製剤の解凍後を示す。次いで、ビーズ除去およびＥＧＦＲｔ濃縮を、ＣＤ４^＋Ｔ細胞は１４日目（D+14）に行い、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は１５日目（D+15）に行った。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）／ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）／ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させた。しかしながら、ドナー細胞の解凍が不適切であったため、この製剤では良好な結果は得られなかった。１０％ＨＡを添加して解凍を行ったところ、細胞は大幅に改善された試験結果を示した。

図３０に、ＰＤ００６３の増殖曲線を示す。増殖曲線は、プールした細胞を含む２つのＶ−１９７バッグから得た総細胞数（ＴＮＣ）を示す。次いで、ビーズ除去およびＥＧＦＲｔ濃縮を、ＣＤ４は１４日目（D+14）に行い、ＣＤ８は１５日目（D+15）に行った。ＣＤ８^＋細胞はＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）／ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させ、ＣＤ４^＋細胞はＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）／ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させた。次いで、ビーズ除去およびＥＧＦＲｔ濃縮を行った。

図３１に、サイトカインの存在下で増殖させたときのバルクＰＢＭＣ培養物の細胞の増殖を示す。図に示したように、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の存在下でＣＤ４^＋細胞（●）を増殖させた。ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下でＣＤ８^＋細胞（■）を増殖させた。図３１Ａおよび図３１Ｂそれぞれの下方のパネル（表現型の比較）は、様々な条件でのインキュベーション後に、図に示したマーカーを細胞表面に発現した細胞の総パーセンテージを示しており、いずれの実験でも、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡなどの移植適合性を示すマーカーを発現する細胞が得られた。ＩＬ−２／ＩＬ−１５の存在下においてＣＤ８濃縮培養物を培養すること、およびＩＬ−７／ＩＬ−１５の存在下においてＣＤ４濃縮培養物を培養することによって、いずれの培養物でも活発な増殖およびメモリー表現型の強い発現が見られた。

図３２に、サイトカイン混合物の存在下における濃縮ＣＤ８^＋細胞および濃縮ＣＤ４^＋細胞の増殖を示す。試料ＰＤ００４４に示したように、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の存在下で濃縮ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増殖させた（上のパネル）。試料ＰＤ００４４では、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で濃縮ＣＤ４^＋Ｔ細胞を２０日間にわたって増殖させた。図に示したように、ＣＤ４^＋Ｔ細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞とのプールは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯを発現した。また、試料１４６０２−Ｓ１４についても試験した（図３２Ｂ参照）。図に示したように、ＩＬ−２／ＩＬ−１５の存在下においてＣＤ８濃縮培養物を培養すること、およびＩＬ−７／ＩＬ−１５の存在下においてＣＤ４濃縮培養物を培養することによって、いずれの培養物でも活発な増殖およびメモリー表現型の強い発現が見られた。重要なことに、この実験で得られたデータならびに図３１および図３２に示したデータから、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞は、様々なサイトカインの組み合わせの存在下で最適な増殖を示したことが示され、ＣＤ４^＋Ｔ細胞はこの試験においてＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で最もよく増殖し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞はこの試験においてサイトカインＩＬ−２およびＩＬ−１５の存在下で最もよく増殖した。それぞれの細胞に最適なサイトカインの組み合わせを用いて培養したことによって、細胞増殖後に特定の表現型を有する細胞が得られ、これらの細胞は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、およびＣＤ２７の表面マーカーを発現した。このことは、養子免疫細胞移入したときに移植適合性が向上または改善することを示す。

図３３に、改変前のＰＬＡＴ−０２細胞増殖方法（臨床試験の第Ｉ相および第II相）を用いた場合の１４６０２−Ｓ０１〜１４６０２−Ｓ０６の試料を示す。これらの細胞は、凍結保存前にＥＧＦＲｔ陽性を示していた。これらの細胞の生存能について試験した。下の表に示したように、１４６０２−Ｓ０３ＣＤ８^＋細胞および１４６０２−Ｓ０３−ＣＤ８^＋細胞は、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ４５ＲＯ⁻、またはＣＤ４５ＲＡを発現しなかった。

図３４に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方を含む細胞製剤１４６０２−Ｓ０４および１４６０２−Ｓ０４−０２について試験した結果を示す。「早期増殖」法を用いて細胞を培地中で増殖させた。これらの細胞を凍結保存前にＥＧＦＲｔの発現について試験したところ陽性であった。

図３５に、試料１４６０２−Ｓ０７、１４６０２−Ｓ０８、および１４６０２−Ｓ０９から得た細胞を示す。これらのＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞を、早期増殖法を用いて増殖させた。１４６０２−Ｓ０７ＣＤ４^＋細胞および１４６０２−Ｓ０７ＣＤ８^＋細胞について表に示したように、上のパネルは、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡ^＋などの様々なマーカーを発現する細胞の様々な時点でのパーセンテージを示す。下のパネルに示した試料１４６０２−Ｓ０８ＣＤ４^＋濃縮Ｔ細胞およびＣＤ８^＋濃縮Ｔ細胞は、培養１０日後において生存能を維持していたい。

図３６に、１４６０２−Ｓ１０バッチ試料、１４６０２−Ｓ１１バッチ試料、１４６０２−Ｓ１２バッチ試料、および１４６０２−Ｓ１３バッチ試料から得た細胞を生存能について試験した結果を示す。添付した表に示したように、前記細胞はいずれも凍結保存前にＥＧＦＲｔを発現していた。これらの細胞の生存能について、少なくとも１２日間の細胞培養において試験した。

図３７に、１４６０２−Ｓ１４バッチ試料、１４６０２−Ｓ１５バッチ試料および１４６０２−Ｓ１６バッチ試料から得た細胞を生存能について試験した結果を示す。添付した表に示したように、前記細胞はいずれも凍結保存前にＥＧＦＲｔを発現していた。これらの細胞の生存能について、少なくとも１２日間の細胞培養において試験した。

図３８に示したように、１４６０２試料から濃縮されたＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＡ^＋／ＣＤ４５ＲＯ⁻、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯについて陽性であった。これらマーカーは、特定のサイトカインの組み合わせで処理されたＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞が、高い移植適合性を有したことを示す特異的マーカーである。

図３９に、腫瘍接種後にＴ細胞を投与したマウスから得た結果（生存、腫瘍進行）を示す。図に示したように、試料ＰＤ００４６由来の細胞を様々な濃度で注射したマウスは投与後８０日間の生存したことから、これらの細胞が改善または向上された高い移植適合性を有していたことが示された。試料ＰＤ０００４４は、４０日目に生存率（％）が低下し、改善または向上された高い移植適合性を有していなかった（図３９Ｂ）。

図４０に、ＰＤ００４４細胞バッチおよびＰＤ００４６細胞バッチから得た細胞で処置したマウスにおける平均腫瘍進行を示す。これらのグラフに示したように、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞に好適なサイトカイン混合物（ＣＤ４^＋Ｔ細胞にはＩＬ−７／ＩＬ−１５が好適であり、ＣＤ８^＋Ｔ細胞にはＩＬ−２／ＩＬ−１５が好適である）の存在下で当初から培養することによって得られたＰＤ００４６バッチ由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞をマウスに投与した場合、マウスにおける腫瘍進行は低減された。対照としてビヒクルを用いた場合の細胞は、ＰＤ００４４およびＰＤ００４６によるどちらの試験においても腫瘍の進行を阻止することはできなかった。下のパネルに示したとおり、ＰＤ００４４試料から得た細胞で処置したマウスでは腫瘍の進行が増大し、特に最低濃度のＴ細胞で処置した場合に大幅に増大した。腫瘍の進行は、ビヒクルを用いた対照と比べると低下していた。

さらなる試験として、１群あたり５匹のマウスを含む３つのマウス群を試験した。Ａ群のマウスは、プラセボとしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して処置した。Ｂ群では、Ｚｒｘ−０１４で形質導入されたＥＧＦＲｔ^＋ＣＤ４とＥＧＦＲｔ^＋ＣＤ８とを１：１の比率で含む「通常の」増殖方法で得た細胞を使用した。使用したこれらの細胞は、ＰＤ００５５＃１群（ドナーＰＤ００３８ＣＤ４に５ｎｇ／ｍＬＩＬ−７および０．５ｎｇ／ｍＬＩＬ−１５を添加、ＥＧＦＲｔ^＋７５．９％においてＳ１Ｄ１４）およびＰＤ００５１＃１群（ドナーＰＤ００３８ＣＤ８に５０Ｕ／ｍＬＩＬ−２および０．５ｎｇ／ｍＬＩＬ−１５を添加、ＥＧＦＲｔ^＋７６．８％においてＳ１Ｄ２１）から得た。Ｃ群は、Ｚｒｘ−０１４で形質導入されたＥＧＦＲｔ^＋ＣＤ４とＥＧＦＲｔ^＋ＣＤ８とを１：１の比率で含む、サイトカイン処理で「パルスした」細胞を使用した。ＰＤ００５５＃２（ドナーＰＤ００３８ＣＤ４を５０Ｕ／ｍＬＩＬ−２で５日間パルス後、５ｎｇ／ｍＬＩＬ−７および５ｎｇ／ｍＬＩＬ−２１を添加、ＥＧＦＲｔ^＋８１．２％においてＳ１Ｄ１１）およびＰＤ００５１＃２（ドナーＰＤ００３８ＣＤ８を５０Ｕ／ｍＬＩＬ−２で５日間パルス後、５ｎｇ／ｍＬＩＬ−７および５ｎｇ／ｍＬＩＬ−２１を添加、ＥＧＦＲｔ^＋８９．５％においてＳ１Ｄ２１）から得た。

図４２に、ＪＭＥ１３−２５においてマウスへの注射に使用された解凍後の細胞（ＰＤ００５１およびＰＤ０００５５細胞）のＦＡＣＳ解析を示す。図に示したように、これらの細胞試料は、ＥＧＦＲｔを発現するＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞を有していた。

図４３に、Ａ群、Ｂ群およびＣ群からなる３つのマウス群を示す。プラセボとしてのＰＢＳで処置した群（Ａ群）、Ｂ群（ＰＤ０００５１「通常増殖細胞」で処置）およびＣ群（ＰＤ０００５５、サイトカインの組み合わせでパルスした細胞で処置）を含んでいた。図に示したように、プラセボで処置したＡ群のマウスは、２０日目に腫瘍の進行が目視で確認された。ＰＤ００５１（通常増殖細胞）で処置したＢ群マウスは、２匹のマウスにおいて腫瘍の進行が大幅に増大していることが示されている。Ｃ群のマウスでは、ＰＤ０００５５で処置したマウスは、わずかな腫瘍進行しか示さず、したがって、治療に使用する前に前記サイトカインの混合物で処理された細胞は、他の細胞よりも高い移植適合性を有することが示された。

図４４に、３日間の投与後のマウスにおけるＣＡＲ発現Ｔ細胞の持続性を示す。図に示したように、ＣＡＲを発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞は、通常の増殖方法により増殖させた細胞よりも高い持続性を有していた。

ＣＡＲ発現Ｔ細胞によるＴ細胞治療後の腫瘍進行を調べた実験を行った後、インビトロにおいて様々なサイトカイン条件下で増殖させた細胞をインビボで抗原と繰り返し遭遇させた場合に殺傷能力に違いが見られるかどうかを評価するために実験を行った（図４５）。この実験では、１群あたり３匹のマウスを含む３つのマウス群を使用した。Ａ群のマウスはプラセボ（ＰＢＳ）で処置した。Ｂ群は、「通常の増殖方法」により増殖させた細胞で処置した。（「通常」の増殖方法により増殖させたＥＧＦＲｔ^＋ＣＤ４とＥＧＦＲｔ^＋ＣＤ８とを１：１の比率で使用し、これらの細胞をＺｒｘ−０１４で形質導入した。ＰＤ００５５＃１（ドナーＰＤ００３８ＣＤ４に５ｎｇ／ｍＬＩＬ−７および０．５ｎｇ／ｍＬＩＬ−１５を添加、ＥＧＦＲｔ＋７５．９％においてＳ１Ｄ１４）およびＰＤ００５１＃１（ドナーＰＤ００３８ＣＤ８に５０Ｕ／ｍＬＩＬ−２および０．５ｎｇ／ｍＬＩＬ−１５を添加、ＥＧＦＲｔ＋７６．８％においてＳ１Ｄ２１）から得た。）（図１８）Ｃ群は、増殖中にサイトカインでパルスした細胞で処置した。（「パルスした」ＥＧＦＲｔ^＋ＣＤ４とＥＧＦＲｔ^＋ＣＤ８とを１：１の比率で使用し、Ｚｒｘ−０１４で形質導入した。ＰＤ００５５＃２（ドナーＰＤ００３８ＣＤ４を５０Ｕ／ｍＬＩＬ−２で５日間パルス後、５ｎｇ／ｍＬＩＬ−７および５ｎｇ／ｍＬＩＬ−２１を添加、ＥＧＦＲｔ＋８１．２％においてＳ１Ｄ１１）およびＰＤ００５１＃２（ドナーＰＤ００３８ＣＤ８を５０Ｕ／ｍＬＩＬ−２で５日間パルス後、５ｎｇ／ｍＬＩＬ−７および５ｎｇ／ｍＬＩＬ−２１を添加、ＥＧＦＲｔ＋８９．５％においてＳ１Ｄ２１）から得た。）

図４６に示すように、Ａ群のマウスはＰＢＳ注射後２０日目までに死亡した。「通常の増殖方法」により増殖させた細胞で処置したＢ群のマウスでは、１２０日目までに１匹のマウスにおいて腫瘍の進行が見られた。これに対して、サイトカインの存在下で増殖させた細胞で処置したマウスでは、１２０日目まで腫瘍は見られなかった。したがって、これらのデータから、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋に特異的なサイトカインの混合物で処理された細胞は、マウスにおける移植定着率が高く、生存率も高かったことが示された。さらに、これらの細胞は、腫瘍進行をより効率的に阻止した。

図４７に示したように、腫瘍接種後にＰＤ００５１細胞またはＰＤ００５５細胞で処置したマウスは、１００％の生存率を示した。しかしながら、腫瘍の進行は、ＰＤ００５５細胞を用いて処置した場合に減少することが示された。

図４８に示したように、プラセボ、「通常の増殖」方法で増殖させたＴ細胞、およびサイトカインの組み合わせでパルスしたＴ細胞で処置したマウスにおいて平均腫瘍進行を調べた。実験の０日目では、マウスに腫瘍を接種し、６日目に腫瘍を画像化した。次いで、７日目にＴ細胞またはプラセボを投与した。次いで、腫瘍接種を１４日目および２１日目に再度行った。

２８日目、３５日目、４９日目、６３日目、７８日目、９２日目、１０５日目、および１２０日目にマウスの腫瘍の進行について調べ、その際、腫瘍の画像を撮影した。マウスの群で示されたように、腫瘍の進行は、サイトカインでパルスした細胞で処置したマウスでは減少しており、このことから、サイトカインでパルスした細胞は、サイトカインを用いない通常の条件下で増殖させた細胞よりも改善または向上された高い移植適合性を有することが示された。

図４９に示したように、ＰＬＡＴ−０１およびＰＬＡＴ−０２と同じ条件下またはこれらの「間」のプロトコルで増殖させた細胞間でインビボにおける殺傷能力に違いが見られるかどうかを評価するために実験をセットアップした。この実験では、１群あたり５匹のマウスを含む１７個の群を用いて、前記細胞を腫瘍接種後のマウスの処置において試験した。図４９の表に示したように、これらの群には、製剤条件１つにつき１回用量の細胞（１．２５×１０^６個、２．５×１０^６個、５×１０^６個、１０×１０^６個）を投与した。細胞の解凍、カウント、マウスへの注射は同じ日に行った。図５０に、２種の増殖方法により得られた異なる細胞製剤におけるＣＤ４^＋細胞数およびＣＤ８^＋細胞数、ならびにこれらの細胞におけるＥＧＦＲｔ量を示す。

図５１に示したように、１７個のマウス群に腫瘍を接種し、次いで通常増殖方法により増殖させたＴ細胞またはサイトカインの組み合わせでパルスしたＴ細胞を用量漸増法により投与することによって処置した。グラフに示したように、高濃度のＰＬＡＴ−１．００細胞を投与したマウスは、腫瘍進行の低下を呈した。また、ＰＬＡＴ−２．００を投与したマウスは、高濃度の細胞を投与した２５日後に腫瘍進行の低下を示した。これに対して、ＰＬＡＴ−１．３３を投与したマウスでは、細胞濃度とは関係なく腫瘍進行の増加を示したことから、ＰＬＡＴ−１．３３細胞の移植適合性が低いか、あるいは移植適合性が低減したことが示された。ＰＬＡＴ−１．６７細胞を投与したマウスでは、最高投与濃度の細胞で処置した場合に腫瘍進行の低下を呈した。しかしながら、図５０で示したように、ＰＬＡＴ−１．３３細胞はＥＧＦＲｔ細胞数が低かったことから、細胞表面上のＣＡＲの発現量の低下を示している可能性があった。

図５１に、ＰＤ１０４細胞製剤とＰＤ１１６細胞製剤の増殖開始時の比較を示す。このＰＤ０１０４製剤については、ＰＤ００６３ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋濃縮細胞を用いて実験を再度行い、Ｔｘ日における０．７×１０^６個／ｍＬまでの細胞増殖を試験した（「早期増殖」）。通常のＰＬＡＴ−０２培養条件においては、ＣＤ８^＋細胞にはＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）＋ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を使用し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞にはＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を使用した。増殖および生存能は劇的に増加した。これらの細胞が示した曲線は、増殖／ビーズ除去／選択／凍結保存のタイミングに関しては臨床製剤で見られるものと類似している。

図５２に示したように、ＰＬＡＴ−１．００細胞製剤、ＰＬＡＴ−１．３３細胞製剤、ＰＬＡＴ−１．６７細胞製剤、およびＰＬＡＴ−２．００細胞製剤を用いた用量漸増法によりマウスを処置した。これらのグラフすべてで示したように、最低濃度の細胞は、腫瘍進行の治療において有効性が最も低かった。これに対して、移植適合性が最も高かった細胞は、高濃度のＰＬＡＴ−１．００およびＰＬＡＴ−２．００であった。

図５３に示した細胞はいずれも１．２５×１０^６個の濃度では有効性が最も低かった。ＰＬＡＴ−１．００細胞が、腫瘍進行の抑制において最も有効であることが示され、これによって、ＰＬＡＴ−１．００細胞は他の群よりも優れた移植適合性、改善された移植適合性もしくは向上された移植適合性を有していたこと、およびサイトカインによる処理によってもＰＬＡＴ−１．００細胞の移植適合性は向上、改善または増強されたことが示された。５×１０^６個の濃度で示されたように、マウスの処置に使用した他の群の細胞と比べて、腫瘍の進行は２５日目に阻止された。

図５４に示したように、１用量あたり２．５×１０^６個〜１０×１０^６個の細胞用量で処置した場合にマウスはさらに高い生存率を示した。しかしながら、ＰＬＡＴ−１．００製剤の細胞で処置したマウスの生存率はさらに延長されていたことから、ＰＬＡＴ−１．００製剤群のＴ細胞は、さらに活発であり、改善または向上されたさらに高い移植適合性を示したことが示された。

図５５に示したように、マウスの生存率は、細胞の用量濃度に依存していた。いずれの細胞においても、最低用量のＴ細胞で処置した場合、マウスの生存率は低下した。しかしながら、上述のとおり、ＰＬＡＴ−１．００製剤の細胞で処置したマウスの生存率はさらに延長されていたことから、ＰＬＡＴ−１．００製剤群のＴ細胞は、さらに活発であり、改善された移植適合性を有していたことが示された。

さらなる実施形態
いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
Ｔ細胞の混合集団から、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団を分離、単離または濃縮して、該Ｔ細胞が単離された集団を作製すること、
得られた前記Ｔ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を、細胞表面選択マーカーをコードするマーカー配列とキメラ抗原受容体とをコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、
形質導入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団と、少なくとも１つのサイトカインとを接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を前記マーカー配列による選択によって濃縮して、濃縮されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記濃縮されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を少なくとも１日増殖させて、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞を得ること
を含む方法が提供される。

いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の前記分離は、ＣＤ８および／またはＣＤ４上に存在するエピトープを有するＴ細胞を親和性により選択することによって行う。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の前記分離は、フローサイトメトリーによって行う。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の前記分離は、免疫磁気選択によって行う。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子改変ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／または前記遺伝子改変ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、少なくとも１つの受容体を含み、該少なくとも１つの受容体は、移植適合性を向上する。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記単離されたＴ細胞集団の刺激は、前記ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞と、ビーズまたは粒子などの、抗体を結合させた支持体とを接触させることによって行う。いくつかの実施形態においては、前記抗体を結合させた支持体は、抗ＴＣＲ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む。いくつかの実施形態においては、前記抗体を結合させた支持体は、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターは、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列、および選択マーカー配列をコードする第４の配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはＩｇＧ４のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記マーカー配列は、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含む。いくつか実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態においては、前記接触を、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって行う。いくつかの実施形態では、前記方法は、単離されたＣＤ４^＋細胞を使用して、ＣＤ８^＋細胞の非存在下において行われる。いくつかの実施形態では、前記方法は、単離したＣＤ８^＋細胞を使用して、ＣＤ４^＋細胞の非存在下またはＣＤ４^＋細胞よりも該ＣＤ８^＋細胞が多く含まれるように濃縮された条件下において実施する。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を少なくとも１日増殖させ、２０日間増殖させてもよく、たとえば、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって増殖させる。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を少なくとも１日増殖させ、２０日間増殖させてもよく、たとえば、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって増殖させる。いくつかの実施形態においては、前記方法は、ビーズまたは粒子などの、前記抗体を結合させた支持体を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体の前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的である。いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記遺伝子改変ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞を凍結保存することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞集団であって、
該遺伝子改変Ｔ細胞集団が、親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／もしくはＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋および／もしくはＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、またはＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞から単離されていること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、刺激されたＣＤ２受容体、ＣＤ３受容体、ＣＤ４受容体および／またはＣＤ２８受容体を有していること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体と細胞表面選択マーカーとをコードする遺伝子をさらに含むこと、ならびに
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、少なくとも１つのサイトカインで再刺激されていることを特徴とする遺伝子改変Ｔ細胞集団が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含む。いくつか実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態においては、前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞は、少なくとも１つの受容体をさらに含み、該少なくとも１つの受容体は、移植適合性を向上、誘導または増強するか、移植適合性に寄与する。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、誘導または増強するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、誘導または増強するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞は、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列および選択マーカー配列をコードする第４の配列を有するベクターをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはＩｇＧ４のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記細胞表面選択マーカーは、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的である。いくつかの実施形態においては、前記集団は、単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態においては、前記集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。

いくつかの実施形態においては、ヒトを治療するための組成物または組み合わせ製剤であって、少なくとも１つの遺伝子改変Ｔ細胞集団と医薬品添加剤とを含む組成物または組み合わせ製剤が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの遺伝子改変Ｔ細胞集団は、
親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／もしくはＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋および／もしくはＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、またはＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞から単離されていること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、刺激されたＣＤ２受容体、ＣＤ３受容体、ＣＤ４受容体および／またはＣＤ２８受容体を有していること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体と細胞表面選択マーカーとをコードする遺伝子をさらに含むこと、ならびに
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、少なくとも１つのサイトカインで再刺激されていることを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含む。いくつか実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態においては、前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞は、少なくとも１つの受容体をさらに含み、該少なくとも１つの受容体は、移植適合性を向上、誘導または増強するか、移植適合性に寄与する。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、誘導または増強するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、誘導または増強するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞は、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列および選択マーカー配列をコードする第４の配列を有するベクターをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはＩｇＧ４のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記細胞表面選択マーカーは、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的である。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの集団は、単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態においては、前記組成物または組み合わせ製剤は、前記遺伝子改変Ｔ細胞集団を含み、該遺伝子改変Ｔ細胞集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態においては、前記組成物または組み合わせ製剤は、前記遺伝子改変Ｔ細胞集団を含み、該遺伝子改変Ｔ細胞集団は、単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態においては、前記集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞と単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞とを含み、これらＴ細胞が１：１の比率で混合されているかまたは共投与され、該単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されており、該単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。

いくつかの実施形態においては、疾患の治療、抑制または緩和を必要とする対象において該疾患を治療、抑制または緩和する方法であって、少なくとも１つの組成物または組み合わせ製剤を前記対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの組成物または組み合わせ製剤は、少なくとも１つの遺伝子改変Ｔ細胞集団と医薬品添加剤とを含む。
いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの遺伝子改変Ｔ細胞集団は、
親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／もしくはＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋および／もしくはＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されているか、またはＣＤ８⁻および／もしくはＣＤ４⁻Ｔ細胞から単離されていること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、刺激されたＣＤ２受容体、ＣＤ３受容体、ＣＤ４受容体および／またはＣＤ２８受容体を有していること、
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体と細胞表面選択マーカーとをコードする遺伝子をさらに含むこと、ならびに
前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞が、少なくとも１つのサイトカインで再刺激されていることを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含む。いくつか実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。いくつかの実施形態においては、前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞は、少なくとも１つの受容体をさらに含み、該少なくとも１つの受容体は、移植適合性を向上する。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、誘導または増強するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上、誘導または増強するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記親和性により選択された複数のＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞は、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列および選択マーカー配列をコードする第４の配列を有するベクターをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターは、スペーサーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記スペーサーはＩｇＧ４のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態においては、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態においては、前記細胞表面選択マーカーは、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、抗体またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＦＭＣ６３またはその結合部分を含む。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的である。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの集団は、単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態においては、前記少なくとも１つの集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態においては、前記組成物または組み合わせ製剤は、前記遺伝子改変Ｔ細胞集団を含み、該遺伝子改変Ｔ細胞集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態においては、前記組成物または組み合わせ製剤は、前記遺伝子改変Ｔ細胞集団を含み、該遺伝子改変Ｔ細胞集団は、単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態においては、前記集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞と単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞とを含み、これらＴ細胞が１：１の比率で混合されているかまたは共投与され、該単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されており、該単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記組成物または組み合わせ製剤を投与することを含み、該組成物または組み合わせ製剤は少なくとも１つの集団を含み、該少なくとも１つの集団は、単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりもＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記組成物または組み合わせ製剤を投与することを含み、該組成物または組み合わせ製剤は少なくとも１つの集団を含み、該少なくとも１つの集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりもＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記組成物または組み合わせ製剤を投与することを含み、該組成物または組み合わせ製剤は少なくとも１つの集団を含み、該少なくとも１つの集団は、単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞と単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞とを含み、これらのＴ細胞が１：１の比率で混合されているかまたは共投与され、該単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されており、該単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記組成物または組み合わせ製剤を投与することをさらに含み、該組成物または組み合わせ製剤は少なくとも１つの集団を含み、該少なくとも１つの集団は、単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ８^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記組成物または組み合わせ製剤を投与することをさらに含み、該組成物または組み合わせ製剤は少なくとも１つの集団を含み、該少なくとも１つの集団は、単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでいないか、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも該ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く含まれるように濃縮されている。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法を受ける対象として同定または選択されている。いくつかの実施形態において、前記方法は、疾患の抑制を測定または評価することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記組成物または組み合わせ製剤の投与前、投与中または投与後に、前記対象に別の抗がん療法を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記組成物または組み合わせ製剤を、養子細胞移入によって前記対象に投与する。いくつかの実施形態においては、前記対象を別の形態の抗がん療法で処置した後に、前記組成物または組み合わせ製剤を該対象に投与する。いくつかの実施形態においては、前記対象を別の形態の抗がん療法で処置した後に、前記組成物または組み合わせ製剤を該対象に投与する。いくつかの実施形態では、前記対象は白血病患者である。いくつかの実施形態では、前記対象は、再発性かつ／または化学療法抵抗性のＣＤ１９^＋小児急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する。いくつかの実施形態では、前記対象は、再発性かつ／または化学療法抵抗性のＣＤ１９^＋急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する。いくつかの実施形態においては、前記対象は自己免疫疾患患者である。いくつかの実施形態においては、前記対象はＨＳＣＴ後の再発を有する。

本明細書における実質的に複数形および／または単数形の用語の使用に関して、当業者であれば、本明細書の文脈および／または本明細書に記載の用途を踏まえて、複数個のものを単数のものであると解釈することができ、かつ／または単数のものを複数個のものであると解釈することができる。本発明を明確なものとするため、単数から複数または複数から単数へのさまざまな置き換えが本明細書において記載されている。

当業者であれば、通常、本明細書に記載の用語、特に、添付の請求項（たとえば、添付の請求項の本体部）において使用されている用語は「オープンエンドな」用語であることを理解するであろう（たとえば、「含んでいる（including）」という用語は、「含んでいるが、これらに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（having）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（includes）」という用語は「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである）。さらに、当業者であれば、特定の数について請求項に記載する場合、その記載の意図も請求項に明確に記載すべきであり、特定数が記載されない場合はその意図を記載する必要はないことを理解するであろう。分かりやすく説明をすれば、たとえば、後述の特許請求の範囲では、請求項を記載するために、「少なくとも１つ」や「１つ以上」といった前置きが記載されている場合がある。しかしながら、このような前置きが使用されているからといって、不定冠詞「１つ（aまたはan）」で記載された特定の請求項を、１つのみの要素を含む実施形態に限定すべきではなく、たとえ同じ請求項内に「１つ以上」または「少なくとも１つ」といった前置きと「１つ（aまたはan）」といった不定冠詞とが含まれていたとしても、１つのみの要素を含む実施形態に限定すべきではない（たとえば、「１つ（aおよび／またはan）」は、通常、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈されるべきである）。これは、請求項の記載において定冠詞が使用された場合でも同じである。さらに、請求項に特定の数が明確に記載されていたとしても、当業者であれば、通常、「少なくとも」記載されたその数であるということを理解するであろう（たとえば、修飾語を伴わない「２つ」という記載は、「少なくとも」２つまたは「２つ以上」を意味する）。さらに、たとえば「Ａ、ＢおよびＣのうち少なくとも１つ」などの頻用される語句を使用する場合、通常、そのような文構造は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば、「Ａ、ＢおよびＣのうち少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢの両方を有するシステム、ＡとＣの両方を有するシステム、ＢとＣの両方を有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣのすべてを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。「Ａ、ＢまたはＣのうち少なくとも１つ」などの頻用される語句が使用される場合、通常、そのような文構造は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば、「Ａ、ＢまたはＣのうち少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢの両方を有するシステム、ＡとＣの両方を有するシステム、ＢとＣの両方を有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣのすべてを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。さらに、当業者であれば、２つ以上の選択肢を表すための選言的用語および／または選言的語句は、明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、列記された用語のうちの１つ、列記された用語のいずれか、または列記された用語の両方を含む場合があると理解すべきであると理解するであろう。たとえば、「ＡまたはＢ」という表現は、「ＡまたはＢ」または「ＡおよびＢ」を示す場合を包含する。

さらなる実施形態
いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団の前記分離、濃縮または単離は、ＣＤ８および／またはＣＤ４上に存在するエピトープを有するＴ細胞を親和性により選択することによって行う。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団の前記分離、濃縮または単離は、フローサイトメトリーによって行う。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞の混合集団からの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団の前記分離、濃縮または単離は、免疫磁気選択によって行う。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子改変ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞および／または前記遺伝子改変ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞は、少なくとも１つの受容体を含み、該少なくとも１つの受容体は、移植適合性を向上または誘導するか、移植適合性に寄与する。いくつかの実施形態においては、移植適合性を向上または誘導するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの好ましい実施形態において、移植適合性を向上または誘導するか、移植適合性に寄与する前記少なくとも１つの受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである。いくつかの実施形態においては、前記単離、濃縮または分離されたＴ細胞集団の前記刺激は、前記ＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞と、ビーズまたは粒子などの、抗体を結合させた支持体とを接触させることによって行う。前記実施形態のいくつかにおいては、前記抗体を結合させた支持体は、抗ＴＣＲ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記抗体を結合させた支持体は、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を含む。

前記実施形態の多くにおいては、前記ウイルスベクターは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスまたはレトロウイルスに由来する。いくつかの実施形態においては、前記ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクターである。前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであることが好ましい。前記実施形態の多くにおいては、前記マーカー配列は、末端切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）をコードする。前記実施形態の多くにおいて使用される前記少なくとも１つのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｌ−１８、ＩＬ−１５、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１を含み、該サイトカインは、たとえば前記Ｔ細胞によって産生されうる任意のサイトカインまたは培地中に存在しうる任意のサイトカインに加えて、外部から前記Ｔ細胞に供給されたものであってもよい。

望ましい実施形態では、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。前記実施形態の多くにおいては、前記少なくとも１つのサイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１を含む。望ましい実施形態においては、前記少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ−２１および別のサイトカインを含み、かつ／またはＩＬ−７および少なくとも１つの別のサイトカインを含み、かつ／またはＩＬ−１５および少なくとも１つの別のサイトカインを含み、たとえば、ＩＬ−２１およびＩＬ−１５を含むか、ＩＬ−２１およびＩＬ−７を含むか、ＩＬ−１５およびＩＬ−７を含むか、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含むか、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を含む。好ましい実施形態においては、前記接触を、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって行う。前記実施形態の多くにおいては、前記方法は、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞の非存在下、またはＴ細胞集団が分離も濃縮も単離もされていない天然集団と比較してＣＤ８^＋発現Ｔ細胞が低減された条件下において、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、単離、分離または濃縮されたＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を使用して行う。前記実施形態の多くにおいては、前記方法は、ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞の非存在下、またはＴ細胞集団が分離も濃縮も単離もされていない天然集団と比較してＣＤ４^＋発現Ｔ細胞が低減された条件下において、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（望ましくはｉＰＳ細胞）に由来するＴ細胞などの、単離、分離または濃縮されたＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団を使用して行う。前記実施形態の多くにおいては、少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって、前記ＣＤ４^＋発現Ｔ細胞を増殖させる。前記実施形態の多くにおいては、少なくとも１日、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つによって定義される時間範囲にある任意の時間にわたって、前記ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞を増殖させる。

いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
Ｔ細胞の混合集団から、胸腺細胞に由来するＴ細胞、遺伝子改変された前駆細胞（ｉＰＳ細胞であってもよい）に由来するＴ細胞などの、ＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団および／またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を分離または濃縮して、該Ｔ細胞が分離または濃縮された集団を作製すること、
前記分離または濃縮されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を、キメラ抗原受容体をコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製すること、
前記形質導入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団と、外部から供給された少なくとも１つのサイトカインとを、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって接触させて、サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製することを含み、
これらの工程によって、キメラ抗原受容体を有する前記遺伝子改変のＴ細胞を得ることを特徴とする方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記サイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団をマーカーによる選択によって濃縮して、濃縮されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を作製することを含む。いくつかの実施形態では、前記マーカーは前記ベクターによってコードされ、前記マーカーは細胞表面マーカーであってもよい。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記濃縮されたサイトカイン刺激性形質導入ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を少なくとも１日、たとえば、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって増殖させることをさらに含む。

いくつかの実施形態においては、遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
ＣＤ４^＋Ｔ細胞が濃縮されたＴ細胞組成物中の細胞に、組換えタンパク質をコードするベクターを導入すること、および
前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞が濃縮されたＴ細胞組成物中の前記細胞を、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を含むサイトカインとともにインキュベートすることを含み、かつ／または
ＣＤ８^＋Ｔ細胞が濃縮されたＴ細胞組成物中の細胞に、組換えタンパク質をコードするベクターを導入すること、および
前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞が濃縮されたＴ細胞組成物中の前記細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含むサイトカインとともにインキュベートすることを含み、
これらの工程によって、形質導入されたＣＤ４^＋濃縮集団および／または形質導入されたＣＤ８^＋濃縮集団を作製することを特徴とする方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記形質導入されたＣＤ４^＋濃縮集団は、サイトカインの組み合わせの代わりにＩＬ−２を単独で使用すること以外は前記方法と同じである別の方法で調製された対照としての形質導入ＣＤ４^＋細胞濃縮集団よりも、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８の表面発現レベルが高く、かつ／または対象に投与した後の移植適合性の指標、増殖および／または持続性が、対照としての前記形質導入ＣＤ４^＋細胞濃縮集団よりも向上している。いくつかの実施形態においては、前記形質導入されたＣＤ８^＋濃縮集団は、サイトカインの組み合わせの代わりにＩＬ−２を単独で使用すること以外は前記方法と同じである別の方法で調製された対照としての形質導入ＣＤ８^＋細胞濃縮集団よりも、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８の表面発現レベルが高く、かつ／または対象に投与した後の移植適合性の指標、増殖および／または持続性が、対照としての前記形質導入ＣＤ８^＋細胞濃縮集団よりも向上している。

いくつかの実施形態においては、遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法であって、
ＣＤ４^＋Ｔ細胞が濃縮されたＴ細胞組成物中の細胞に、組換えタンパク質をコードするベクターを導入すること、および
前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞が濃縮されたＴ細胞組成物中の前記細胞を、第１のサイトカインの組み合わせとともにインキュベートすること、ならびに
ＣＤ８^＋Ｔ細胞が濃縮されたＴ細胞組成物中の細胞に、組換えタンパク質をコードするベクターを導入すること、および
前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞が濃縮されたＴ細胞組成物中の前記細胞を、前記第１のサイトカインの組み合わせとは異なる第２のサイトカインの組み合わせとともにインキュベートすることを含み、
これらの工程によって、形質導入されたＣＤ４^＋濃縮集団および形質導入されたＣＤ８^＋濃縮集団を作製することを特徴とする方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記形質導入されたＣＤ４^＋濃縮集団は、第１のサイトカインの組み合わせと第２のサイトカインの組み合わせとが同一のものであること以外は前記方法と同じである別の方法で調製された対照としての形質導入ＣＤ４^＋細胞濃縮集団よりも、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８の表面発現レベルが高く、かつ／または対象に投与した後の移植適合性の指標、増殖および／または持続性が、対照としての前記形質導入ＣＤ４^＋細胞濃縮集団よりも向上している。いくつかの実施形態においては、前記形質導入されたＣＤ８^＋濃縮集団は、第１のサイトカインの組み合わせと第２のサイトカインの組み合わせとが同一のものであること以外は前記方法と同じである別の方法で調製された対照としての形質導入ＣＤ８^＋細胞濃縮集団よりも、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８の表面発現レベルが高く、かつ／または対象に投与した後の移植適合性の指標、増殖および／または持続性が、対照としての前記形質導入ＣＤ８^＋細胞濃縮集団よりも向上している。いくつかの実施形態においては、前記第１の組み合わせはＩＬ−７およびＩＬ−１５を含み、前記第２の組み合わせはＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む。いくつかの実施形態においては、前記単一または複数のサイトカインの組み合わせは、形質導入の開始に続けて添加され、形質導入を開始した日に添加してもよい。いくつかの実施形態においては、ＩＬ−２の濃度は５０Ｕ／ｍＬまたは約５０Ｕ／ｍＬであり、ＩＬ−１５が使用可能な場合、その濃度は０．５ｎｇ／ｍＬまたは約０．５ｎｇ／ｍＬであり、かつ／またはＩＬ−７が使用可能な場合、その濃度は５ｎｇ／ｍＬまたは約５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４^＋濃縮組成物および／または前記ＣＤ８^＋濃縮組成物への前記サイトカインの組み合わせの添加は、インキュベートされる前記細胞が含まれる前記組成物の量を増加させて、細胞密度を低下させることを含む。いくつかの実施形態においては、移植適合性の前記指標は、前記組成物中の細胞のパーセンテージ、またはＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８からなる群から選択される細胞表面マーカーの、前記集団の細胞表面における総発現レベルを含む。いくつかの実施形態においては、移植適合性の前記指標は、投与後の対象における持続性を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は前記対象に由来する。いくつかの実施形態においては、形質導入されたＣＤ８^＋および／またはＣＤ４^＋細胞は、この細胞が由来する対象に注射投与後、少なくとも３０日間もしくは６０日間または少なくとも約３０日間もしくは約６０日間にわたって持続する。いくつかの実施形態では、前記組換えタンパク質はキメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記形質導入を行う前に、ＣＤ４発現細胞が多く含まれるようにＴ細胞組成物を濃縮してから、上述のように形質導入を行い、前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞が濃縮されたＴ細胞組成物を作製することをさらに含み、かつ／またはＣＤ８発現細胞が多く含まれるようにＴ細胞組成物を濃縮してから、上述のように形質導入を行い、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞が濃縮されたＴ細胞組成物を作製することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は前記遺伝子改変細胞を凍結保存することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記遺伝子改変細胞を対象に投与することをさらに含み、かつ前記投与の前に、前記形質導入されたＣＤ４^＋濃縮組成物と前記形質導入されたＣＤ８^＋濃縮組成物とをプールすることをさらに含んでもよい。

いくつかの実施形態においては、この「さらなる実施形態」の章において述べた先の段落に記載した、前記方法の実施形態のいずれかによって細胞または組成物が製造される。いくつかの実施形態においては、先の段落に記載した、前記方法の実施形態または前記組成物の実施形態のいずれかによって製造された前記細胞を投与する方法も考えられる。いくつかの実施形態においては、前記細胞または組成物を対象に投与する。いくつかの実施形態においては、前記投与は、前記細胞が由来する対象に対して行われる。

いくつかの実施形態においては、養子細胞療法を行う方法であって、
（ａ）刺激条件下およびＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在下においてＣＤ４^＋濃縮Ｔ細胞組成物をインキュベートして、増殖させたＣＤ４^＋組成物を作製すること、
（ｂ）前記工程とは別に、刺激条件下およびＩＬ−１５およびＩＬ−２の存在下においてＣＤ８^＋濃縮Ｔ細胞組成物をインキュベートして、増殖させたＣＤ８^＋組成物を作製すること、ならびに
（ｃ）前記増殖させたＣＤ４^＋集団および前記増殖させたＣＤ８^＋集団を対象に投与すること（これらの集団を同時に投与してもよい）を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４^＋集団およびＣＤ８^＋集団は、前記対象から得られたものである。いくつかの実施形態においては、前記１つ以上のサイトカインまたはサイトカインの組み合わせは、ＣＤ２１をさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４^＋濃縮集団に含まれるＣＤ４^＋細胞は、少なくとも全体の７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を占め、もしくは前記ＣＤ４^＋濃縮集団中のＴ細胞の総数の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を占め、かつ／または前記ＣＤ８^＋濃縮集団に含まれるＣＤ８^＋細胞は、少なくとも全体の７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を占め、もしくは前記ＣＤ８^＋濃縮集団中のＴ細胞の総数の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を占める。

さらに、本開示の構成要素または態様がマーカッシュ形式で記載されている場合、当業者であれば、マーカッシュ形式で記載された個々のメンバーまたはメンバーのサブグループについても記載されていると理解するであろう。

Claims

移植適合性が改善された遺伝子改変Ｔ細胞集団を製造する方法であって、
Ｔ細胞の混合集団からＣＤ８^＋発現Ｔ細胞集団またはＣＤ４^＋発現Ｔ細胞集団を濃縮して、濃縮されたＴ細胞集団を作製すること、
前記濃縮されたＴ細胞集団を刺激して、刺激されたＴ細胞の集団を作製すること、
前記刺激されたＴ細胞の集団を、キメラ抗原受容体をコードするベクターで形質導入して、形質導入されたＴ細胞の集団を作製すること、
前記形質導入されたＴ細胞の集団を少なくとも１つの組換えサイトカインと接触させて、サイトカインで刺激されたＴ細胞の集団を作製すること、ならびに
前記サイトカインで刺激されたＴ細胞の集団を１日以上かけて増殖させて、移植適合性が改善された遺伝子改変Ｔ細胞集団を得ること
を含み、
前記少なくとも１つの組換えサイトカインと接触させることが、（ｉ）細胞外から供給されたＩＬ−２と接触させ、その後（ｉｉ）細胞外から供給されたＩＬ−７およびＩＬ−２１の組み合わせと接触させることである、方法。
を含む方法。
Ｔ細胞の混合集団からの前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団またはＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の濃縮が、ＣＤ８上もしくはＣＤ４上に存在するエピトープを有するＴ細胞を選択する親和性選択、フローサイトメトリーまたは免疫磁気選択によって行われる、請求項１に記載の方法。
前記遺伝子改変Ｔ細胞が、移植適合性の向上、誘導もしくは増強または移植適合性への寄与のための少なくとも１つの受容体を含む、請求項１または２に記載の方法。
前記刺激が、前記濃縮されたＴ細胞と、抗体を結合させた支持体とを接触させることによって行われ、前記抗体が、抗ＴＣＲ抗体またはＴＣＲに結合するそのフラグメント、抗ＣＤ２抗体またはＣＤ２に結合するそのフラグメント、抗ＣＤ３抗体またはＣＤ３に結合するそのフラグメント、抗ＣＤ４抗体またはＣＤ４に結合するそのフラグメントおよび抗ＣＤ２８抗体またはＣＤ２８に結合するそのフラグメントから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記ベクターが、リーダー配列をコードする第１の配列、リガンド結合ドメインをコードする第２の配列、シグナル伝達ドメインをコードする第３の配列、選択マーカーをコードする第４の配列、およびスペーサーをコードする配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記キメラ抗原受容体のリガンド結合ドメインが、ＣＤ１９に特異的である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞前駆細胞または造血幹細胞（ＨＳＣ）由来である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
移植適合性の向上もしくは誘導または移植適合性への寄与のための前記少なくとも１つの受容体が、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８および／またはＣＤ６２Ｌである、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
前記ベクターがさらにマーカー配列をコードし、該マーカー配列が細胞表面選択マーカーをコードするものであってもよい、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
マーカーを選択することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
前記少なくとも１つの組換えサイトカインが、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲にある期間にわたって提供されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。