KR20220051024A - 트랜스진 유전자 태그 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 유전자 태그를 제공한다. 유전자 태그의 발현은 트랜스진 및 유전자 태그를 발현하는 세포의 확인, 검출, 선택 및 제거를 가능하게 한다. 일부 대안에서 유전자 변형된 숙주 세포는 리간드 결합 도메인, 스페이서 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 막횡단 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스진을 포함한다. 일부 대안에서 유전자 변형된 숙주 세포는 리간드 결합 도메인, 스페이서 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 막횡단 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스진을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 가요성 링커를 추가로 포함한다. 또한, 상기 방법에 의해 생산된 제약 제제, 및 그의 사용 방법이 기재되어 있다.

Description

트랜스진 유전자 태그 및 사용 방법 {TRANSGENE GENETIC TAGS AND METHODS OF USE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 10월 2일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/058,973, 2014년 4월 10일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/977,751, 2014년 4월 30일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/986,479, 2014년 12월 9일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/089,730, 2014년 12월 11일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/090845, 및 2014년 12월 5일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/088,363 에 대한 우선권의 이익을 청구한다. 상기 언급된 출원의 전체 개시내용은 그 전문이 참조로 명백히 포함된다.
서열 목록, 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 포맷의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2015년 4월 7일에 작성된 47kb 크기의 SCRI-066WO-SEQUENCE_LISTING.TXT 제목의 파일로서 제공된다. 전자 포맷의 서열 목록 내 정보는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 세포에서 트랜스진 발현을 검출하는데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
세포에서의 트랜스진의 발현은 다양한 상태를 위한 중요한 치료 접근법이 되어 왔다. 예를 들어, 입양 면역요법에서, 인간 T 림프구는 종양 세포 상에 발현된 표면 분자에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 전달에 의해 조작된다. 키메라 수용체는 가장 통상적으로는 CD3ζ 단독 또는 1개 이상의 공동자극 도메인과 조합된 세포내 신호전달 구성요소에 연결된 세포외 리간드 결합 도메인, 가장 통상적으로는 모노클로날 항체의 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는 합성 수용체이다. 트랜스진 변형된 세포에 의해 치료되는 상태의 다른 예는 지중해빈혈, 혈우병, 심근경색 및 중증 복합 면역결핍을 포함한다. 그러나, 주요 현안은 여전히 내인성 유전자와 대등한 수준으로 트랜스진 발현의 안정한 발현을 수득하는 것이다. 트랜스진을 높은 수준으로 발현하는 세포를 선택 및/또는 검출하기 위한 조성물 및 방법을 확인할 필요가 존재한다.
균질 생성물의 사용 및 선택은 유전자 요법 전략의 임상 성공 및 재현성에 대한 제한 인자이다. 본원에 제공된 바와 같이, 세포 조작을 위한 후보 유전자 태그 및 도구가 설계되었다. 일부 대안에서, 유전자 태그는 Her2t로 지정된, 인간 Her2를 기반으로 한 에피토프를 포함한다. 구체적 대안에서, Her2t는 모든 Her2 세포내 구성요소가 결여되어 있지만, 모노클로날 항체 트라스투주맙 (헤르셉틴(Herceptin))에 의해 인식되는 입체형태적으로 무손상 에피토프인 Her2 막횡단 영역 및 표면 발현을 촉진하기 위한 펩티드를 여전히 함유한다. 1종은 전체 Her2 도메인 IV를 함유하고 2종은 헤르셉틴과 복합체화된 Her2의 3차원 구조를 기반으로 하여 설계된 입체형태적 에피토프를 함유하는 Her2t 구축물의 3종의 변이체 (Garrett et al. J. Immunology 178:7120 (2007); Cho et al. 2003)가 렌티바이러스 패키징 플라스미드 epHIV7 내에 혼입되었고 CHO 세포에서 특징화되었다.
일부 측면에서, 유전자 태그로서 Her2t의 이용은 관심 트랜스진을 발현하는 세포 치료제의 균질 집단의 생체외 선택 및 정제를 가능하게 한다. 또한, Her2t는 생체내에서 세포 치료제를 트래킹하는데 사용될 수 있고; 예를 들어, Her2t는 트랜스진-발현 세포 치료제의 지속성을 체크하여 환자에서 암 완화 대 치료 지속성을 추적하기 위해 혈액, 골수 및 뇌척수액 흡인물의 헤르셉틴 염색을 위한 표적으로서 사용될 수 있다. Her2t는 또 다른 유전자 태그, 예컨대 EGFRt와 함께 사용되는 경우에 다중 트랜스진을 발현하는 세포의 연합 정제를 가능하게 함으로써 CAR 요법의 치료 범위를 확장한다.
일부 대안에서, 본 개시내용은 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호(SEQ ID NO): 23의 511 내지 652 또는 563 내지 652의 아미노산 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2를 제외한다. 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 본원에 포함된다.
다른 대안에서, 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 511 내지 562 또는 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합한다. 숙주 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, CD4 나이브 T 세포, CD8 나이브 T 세포, CD8 중심 기억 세포, CD4 중심 기억 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 숙주 세포는 제2 유전자 태그에 연결된 제2 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 511 내지 562 또는 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 동일한 숙주 세포에 도입될 수 있고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합한다. 다른 대안에서, 제2 핵산은 제2 숙주 세포 집단에 도입되고, 적어도 2종의 숙주 세포 집단은 단일 조성물로 조합된다. 일부 대안에서, T 세포는 전구체 T 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 대안에서, 방법은 단리된 핵산, 예컨대 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 511 내지 652 또는 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인 (ECD)의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입시키는 단계이며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 것인 단계; 및 숙주 세포를 적어도 1종의 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 배양하는 단계 전 또는 후 또는 전 및 후 둘 다에 ECD의 발현에 대해 숙주 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 대안에서, 제조하는 방법은 제2 키메라 항원 수용체 및 제2 유전자 태그를 코딩하는 제2 핵산을 숙주 세포에 도입시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 배양하는 단계 전 또는 후 또는 전 및 후 둘 다에 제2 유전자 태그의 발현에 대해 숙주 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 대안에서, 제1 단리된 핵산, 예컨대 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 511 내지 652 또는 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제1 숙주 세포에 도입시키는 단계이며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 것인 단계; ECD를 발현하는 제1 숙주 세포를 선택하는 단계, 제2 키메라 항원 수용체 및 제2 유전자 태그를 코딩하는 제2 핵산을 제2 숙주 세포에 도입시키는 단계, 제2 유전자 태그의 발현에 대해 제2 숙주 세포를 선택하는 단계, 및 임의로, 제1 및 제2 숙주 세포를 적어도 1종의 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 조성물은 제1 및 제2 숙주 세포 집단을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 암을 치료하고, 생체내에서 조성물의 세포를 트래킹하고, 생체내에서 조성물의 세포를 사멸시키기 위한 방법 및 조성물의 사용에 관한 것이다. 일부 대안에서, 암을 갖고 종양 항원을 발현하는 환자를 치료하는 것을 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 유전자 태그에 연결된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함하는 숙주 세포의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 조성물의 숙주 세포는 제1 유전자 태그에 연결된 제1 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제1 핵산 및 제2 유전자 태그에 연결된 제2 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 유전자 태그에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제1 유전자 태그에 결합하는 항체가 투여되거나, 제2 유전자 태그에 특이적으로 결합하는 항체가 투여되거나, 또는 둘 다가 투여된다. 일부 대안에서, 항체는 검출가능한 표지, 세포독성제 또는 둘 다로 표지된다.
일부 대안에서, 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다.
일부 대안에서, 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다.
일부 대안에서, 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 트랜스진을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 1종의 자극 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자기-절단 링커에 의해 HER2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, 자기-절단 링커는 LEGGGEGRGSLLTCG의 서열 (서열식별번호: 26)을 갖는 T2A 링커이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 2의 아미노산을 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 25 (CD20CAR)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 대안에서, 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 여기서 단리된 핵산은 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 트랜스진을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 1종의 자극 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자기-절단 링커에 의해 HER2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, 자기-절단 링커는 L E G G G E G R G S L L T C G의 서열 (서열식별번호: 26)을 갖는 T2A 링커이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 2의 아미노산을 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 25 (CD20CAR)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, CD4 나이브 T 세포, CD8 나이브 T 세포, CD8 중심 기억 세포, CD4 중심 기억 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 자가이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 항원 특이적이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 숙주 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 숙주 세포는 단리된 핵산을 포함하고, 여기서 단리된 핵산은 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 트랜스진을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 1종의 자극 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자기-절단 링커에 의해 HER2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, 자기-절단 링커는 L E G G G E G R G S L L T C G의 서열 (서열식별번호: 26)을 갖는 T2A 링커이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 2의 아미노산을 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 25 (CD20CAR)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, CD4 나이브 T 세포, CD8 나이브 T 세포, CD8 중심 기억 세포, CD4 중심 기억 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 자가이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 항원 특이적이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서, 단리된 핵산을 숙주 세포에 도입시키는 단계 및 숙주 세포를 적어도 1종의 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 트랜스진을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 1종의 자극 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자기-절단 링커에 의해 HER2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, 자기-절단 링커는 L E G G G E G R G S L L T C G의 서열 (서열식별번호: 26)을 갖는 T2A 링커이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 2의 아미노산을 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 25 (CD20CAR)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, CD4 나이브 T 세포, CD8 나이브 T 세포, CD8 중심 기억 세포, CD4 중심 기억 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 자가이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 항원 특이적이다. 일부 대안에서, 성장 인자는 IL-15, IL-7, IL-21, IL-2, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 방법은 Her2t 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 세포는 세포를 배지에서 배양하기 전에 선택된다. 일부 대안에서, 세포는 Her2의 도메인 IV에 결합하는 항체를 사용하여 선택된다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 방법은 제2 유전자 태그에 연결된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2 단리된 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 제2 유전자 태그를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 유전자 태그는 EGFRt를 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다.
도 1. Her2t의 구조적 개략도. (패널 a) Her2t (중앙) 대 Her2 (ErbB2; 좌측)의 세포외 및 막횡단 영역의 분자 모델. 헤르셉틴 Fab와 복합체화된 Her2t (우측). (패널 b) 표면 발현을 가능하게 하는 GMCSF 수용체-α 쇄 신호 서열 (GMCSFRss)로 구성된 리더 펩티드를 함유하는 Her2t의 개략도. 나머지 Her2t 서열은 Her2 (ErbB2) 도메인 IV의 에피토프 (89 aa) 및 23-aa 막횡단 영역으로 구성된다. (패널 c) Her2t를 CAR 및 T2A의 하류에 인 프레임으로 클로닝하여 공동-발현되게 하였다.
도 2. Her2t는 Her2t-발현 세포를 면역자기적으로 풍부화하기 위해 트라스투주맙 (헤르셉틴)과 파트너가 된다. (패널 a) Her2-발현 세포주에 대한 비오티닐화 헤르셉틴의 적정. (패널 b) 비오티닐화 헤르셉틴 및 항비오틴 마이크로비드 (밀테니(Miltenyi))를 사용한 Her2t-형질도입된 K562 세포 선택-전 및 선택-후. 세포를 95% Her2t 양성까지 정제하였다. (패널 c) Her2t의 에피토프는 헤르셉틴에 의해 특이적으로 인식되고, 상업적 Her2t 항체에 의해 인식되지 않는다. (패널 d) Her2t (25kDa) 및 ErbB2 (250kDa) 사이의 kDa 크기에서의 차이를 예시하는, 상업적 항체 (상단) 또는 비오티닐화 헤르셉틴 (하단)을 사용한 웨스턴 블롯 분석. 좌측에서 우측으로 레인 (1-4): MW 래더, K562 모, K562 Her2t, K562 ErbB2 (Her2).
도 3. Her2t는 중심 기억 T 세포 (Tcm)에서 EGFRt와 연합하여 효과적인 선택 마커이다. (패널 a) 2-단계 칼럼 정제 스킴을 사용한 PBMC로부터의 CD8 Tcm의 정제. CD8+CD45RA- 세포는 처음에 CD8 단리 키트를 사용하여 선택되고 (CD8 양성 세포의 풍부화를 위함) CD45RA 마이크로비드를 사용하여 선택된다 (CD45RA 양성 세포의 제거를 위함). 이어서 세포는 CD62L 마이크로비드를 사용하여 양성적으로 선택된다. (패널 b) 비오티닐화 헤르셉틴 또는 에르비툭스 및 항비오틴 마이크로비드를 사용하여 선택된, CD19CAR-T2A-Her2, CD20CAR-T2A-EGFRt, 또는 둘 다로 형질도입된 CD8 Tcm. CD19CAR-T2A-Her2t 및 CD20CAR-T2A-EGFRt (둘 다)로 형질도입된 CD8 Tcm은 CAR 요법을 위한 이중-특이적 T 세포가 가능하도록 순차적으로 정제될 수 있다. 5번째 패널은 이중 정제된 Tcm 히스토그램 (둘 다)을 동반한다. 상단 히스토그램은 이중 정제된 Tcm에 대한 헤르셉틴 SA-PE 염색 (Her2t+)을 제시하고, 하단 히스토그램은 에르비툭스 SA-PE 염색 (EGFRt+)을 제시한다. (패널 c) Her2t 또는 EGFRt 정제된 CD8 Tcm의 세포 용해물에 대한 CD3ζ 특이적 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석. 좌측에서 우측으로 레인 (1-4): MW 래더, 모의 형질도입된 것, CD19CAR-T2A-Her2t 형질도입된 것, CD19CAR-T2A-EGFRt 형질도입된 것. 밴드 강도는 패널 b에서의 MFI가 Her2t 염색된 세포에 대해 더 낮고, Her2t 정제된 세포는 EGFRt 정제된 세포보다 더 높은 트랜스진 발현 수준을 가짐을 증명한다. 상부 밴드 = CD19CAR ; 하부 밴드 = 내인성 CD3ζ. CAR 제타 쇄 (상부 패널-50kDa) 및 숙주 T 세포의 내부 제타 쇄 (하부 패널 -15kDa) 사이의 밴드 강도의 비교는 CARher2t 구축물을 발현하는 세포가 CAREGFRt 구축물과 비교하여 약 2 배 더 높은 CAR의 발현을 가짐을 제시한다.
도 4. Her2t 및 Her2t/EGFRt 형질도입된 세포는 이펙터 표현형 및 표적 특이성을 유지한다. (패널 a) 좌측에서 우측으로 K562 표적 패널의 특징화: K562 모, K562 CD19, K562 CD20, 및 K562 CD19/CD20 (X-축: CD19+; Y-축: CD20+). (패널 b) K562 표적 패널 세포에 대한 CD19- 및 CD20-CAR T 세포 특이성을 제시하는 4-시간 크로뮴 방출 검정. CD8 Tcm을 K562 표적 세포와 50:1, 25:1, 12.5:1 또는 6.25:1 비로 공동-배양하였다. 이중 형질도입된 T 세포 만이 모든 항원 발현 K562 세포를 표적화할 수 있었다. CD19CAR-T2A-Her2t 및 CD19CAR-T2A-EGFRt CD8 Tcm은 유사한 용해 능력을 증명한다. (패널 c) 24-시간 시토카인 방출 검정. CD8 Tcm을 K562 표적 세포와 2:1 T 세포-대-표적 세포 비로 24시간 동안 공동-배양한 다음, 상청액을 이펙터 시토카인의 존재에 대해 분석하였다. CD19CAR-T2A-Her2t 형질도입된 CD8 Tcm은 CD19CAR-T2A-EGFRt 형질도입된 CD8 Tcm에 비해 보다 다양한 레퍼토리 및 더 높은 수준의 이펙터 시토카인을 생산하였다. 패널은 a와 b가 동일하다 (좌측에서 우측으로: K562 모, K562 CD19, K562 CD20 및 K562 CD19/CD20). CD4 Tcm에 대해 유사한 결과가 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). (패널 d) 24hr 시토카인 방출 검정으로부터의 대표적인 배수 시토카인 생산. Her2t (CD19CAR-Her2t)에 의해 정제된 CD8 Tcm은 CD19 발현 K562 (상기)와 공동-배양한 경우에 CD19CAR-EGFRt와 비교하여 유의하게 더 높은 IL2, IFNy 및 TNFa 이펙터 시토카인 수준을 생산한다. 스튜던트 t 검정 p > 0.05.
도 5. 조작된 세포의 생체내 검출 및 형광 염색을 위한 마커로서 Her2t의 사용. (패널 a) CD19CAR-T2A-Her2t 또는 CD19CAR-T2A-EGFRt-발현 CD4 및 CD8 Tcm (107개)을 NOD/scid IL-2RγC null 마우스 내로 5 x 106 NS
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-IL15 세포의 피하 주사와 함께 정맥내로 주사하여 인간 IL-15의 전신 공급을 제공하였다. 주사 후 14일에 골수를 수거하고, 유동 세포측정법에 의해 세포 현탁액을 분석하였다. (패널 b) 생존 (93.6% 림프구), 단일 (98.8%), 및 살아있는 세포 (99.9%)에 대해 게이팅된 세포를 제시하는 3개의 패널. (b) 좌측에서 우측으로 CD8 및 CD45 염색 (모의, CD19CAR-T2A-Her2t, CD19CAR-T2A-EGFRt Tcm). 생존, 단일 세포 및 살아있는 게이트의 내부에서 적어도 1x107개의 세포가 기록되었다. 따라서 CD45+ 세포가 집단의 약 1%를 나타내더라도, 이는 1x105개의 세포와 등가이다. 나머지 세포는 마우스 골수 세포이다. (패널 c) 인간 CD45+ 세포를 비오티닐화 헤르셉틴 또는 에르비툭스 및 SA-APC로 공동-염색하였다. 골수로부터 Her2t- 또는 EGFRt-발현 Tcm이 확인되었다. (패널 d) TM-LCL 모, Her2(ErbB2) 또는 Her2t 발현 세포를 폴리-L-리신을 사용하여 슬라이드에 부착시킨 다음, 비오티닐화 헤르셉틴 및 SA-AF647을 사용하여 염색하였다. 비오티닐화 헤르셉틴 및 SA-AF647로 염색한 경우에, 염색은 Her2 또는 Her2t를 발현하는 세포에 대해서만 존재하였다.
도 6. Her2t 및 EGFRt 양성 T 세포의 다중소트 정제. H9 세포 (5x106개 모, Her2t+, EGFRt+, 또는 Her2t+/EGFRt+)를 함께 혼합한 다음, 정제에 적용하였다. 세포를 먼저 비오티닐화 헤르셉틴 및 항비오틴 다중소트 비드를 기반으로 하여 정제하였다. 이어서 다중소트 비드를 제거하고, 후속해서 양성 분획을 에르비툭스-APC 및 항-APC 마이크로비드를 기반으로 한 정제에 적용하였다. 최종 양성 분획은 Her2t 및 EGFRt에 대해 이중 양성이었다.
도 7. 항체 헤르셉틴에 대한 결합을 증진시키기 위해 Her2t의 3종의 변이체 (CD28힌지, IgG4힌지 또는 Her2tG)가 설계되었다. 새로운 서열이 Her2t 내로 삽입된 위치를 나타내는 일반적인 개략도가 제시된다.
도 8. Her2tG는 헤르셉틴에 대해 증진된 결합을 나타낸다. H9 세포는 Her2t 또는 Her2tG를 갖는 렌티바이러스로 1의 MOI에서 형질도입되었다. 이어서 형질도입된 세포를 비오티닐화 헤르셉틴 및 항비오틴 마이크로비드에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 정제하였다. 정제된 집단을 이후 비오티닐화 헤르셉틴 및 스트렙타비딘-PE를 사용하여 Her2t 또는 Her2tG에 대해 염색하였다. 히스토그램은 Her2tG에 대한 더 큰 결합을 보여준다.
도 9. Her2tG는 헤르셉틴에 결합하는 최대의 능력을 보여준다. H9 세포는 렌티바이러스에 의해 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1 및 3ul로 형질도입된 다음 (좌측에서 우측으로), 5일 후 헤르셉틴 결합에 대해 분석되었다. Her2t 변이체 Her2t(CD28힌지)는 원래의 Her2t와 유사한 수준으로 헤르셉틴에 결합할 수 있었다 (Her2t 염색은 제시되지 않으나 이전 실험을 기반으로 함). Her2t(IgG4힌지)는 Her2t 또는 Her2t(CD28힌지)에 비해 헤르셉틴 결합을 증진시켰고, Her2tG 변이체는 헤르셉틴에 결합하고 형질도입된 H9 세포를 염색하는 최대의 능력을 가졌다.
정의.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 "약"은 측정가능한 값을 지칭할 때 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 보다 더 바람직하게는 ±1% 및 보다 더 바람직하게는 ±0.1%의 변화를 포괄하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생산 또는 특이적 면역학적-적격 세포의 활성화 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 항원이 재조합적으로 생성, 합성, 생산될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있는 것은 용이하게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은, 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체, 예컨대, 예를 들어, 혈액, 혈장 또는 복수액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "항종양 효과"는 종양 부피의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가 또는 암성 상태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 감소에 의해 명시될 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항종양 효과"는 또한 재발의 감소 또는 재발 전 시간의 증가에 의해 명시될 수 있다. 일부 대안에서, 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 조성물은 세포를 포함하고, 여기서 조성물의 세포는 암 세포 상에 발현된 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 및 유전자 태그를 발현한다. 일부 대안에서, 조성물은 항종양 효과를 갖는다.
본원에 사용된 "키메라 수용체"는 질환 또는 장애와 연관된 분자에 결합하고, 스페이서 도메인을 통해 T 세포 또는 다른 수용체의 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 공동자극 도메인에 연결된, 항체 또는 다른 단백질 서열의 리간드 결합 도메인을 포함하는 합성적으로 설계된 수용체를 지칭한다. 키메라 수용체는 또한 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체 및 키메라 항원 수용체 (CAR)로서 지칭될 수 있다. 이들 CAR은 면역 수용체 세포 상에 임의적인 특이성을 그라프팅할 수있는 조작된 수용체이다. 키메라 항원 수용체 또는 "CAR"은 일부 조사자에 의해 항체 또는 항체 단편, 스페이서, 신호전달 도메인 및 막횡단 영역을 포함하는 것으로 지칭된다. 그러나, CAR의 상이한 구성요소 또는 도메인, 예컨대 에피토프 결합 영역 (예를 들어, 항체 단편, scFv 또는 그의 부분), 스페이서, 막횡단 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 변형시키는 것의 놀라운 효과로 인해, CAR의 구성요소는 본원의 일부 문맥에서 독립적인 요소로서 기재된다. CAR의 상이한 요소의 변이는, 예를 들어, 특이적 에피토프에 대한 더 강한 결합 친화도로 이어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "공동-자극 도메인"은 예를 들어 TCR/CD3 복합체의 CD3 제타 쇄에 의해 제공되는 1차 신호에 더하여 활성화, 증식, 분화, 시토카인 분비 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 T 세포에게 제공하는 신호전달 모이어티를 지칭한다. 공동-자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-l (LFA-l), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및/또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드의 모두 또는 일부를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 대안에서, 공동-자극 도메인은 다른 세포내 매개자와 상호작용하여 활성화, 증식, 분화 및 시토카인 분비 등을 포함하는 세포 반응을 매개하는 세포내 신호전달 도메인이다. 본원에 기재된 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 공동-자극 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 "을 코딩하는"은 다른 거대분자 예컨대 아미노산의 규정된 서열의 합성을 위한 주형으로서 작용하는, 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드의 특정한 서열, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA의 속성을 지칭한다. "을 코딩하는"은 용어 "코딩하는"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 따라서, 유전자는 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우에 단백질을 코딩한다. "폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열"은 서로의 축중성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "세포독성 T 림프구" (CTL)는 그의 표면 상에 CD8을 발현하는 T 림프구 (즉, CD8+ T 세포)를 지칭한다. 일부 대안에서, 이러한 세포는 바람직하게는 항원-경험 "기억" T 세포 (TM 세포)이다.
본원에 사용된 "중심 기억" T 세포 (또는 "TCM")는 그의 표면 상에 CD62L 또는 CCR-7 및 CD45RO를 발현하고, 나이브 세포와 비교 시 CD45RA를 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖는 항원 경험 CTL을 지칭한다. 일부 대안에서, 중심 기억 세포는 나이브 세포와 비교 시 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO 및/또는 CD95의 발현에 대해 양성이고/거나, CD54RA의 감소된 발현을 갖는다. 일부 대안에서, 숙주 세포가 제공되며, 여기서 숙주 세포는 항원 특이적이다. 일부 대안에서, 세포는 중심 기억 T 세포이다.
본원에 사용된 "이펙터 기억" T 세포 (또는 "TEM")는 중심 기억 세포와 비교 시 그의 표면 상에 CD62L을 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖고, 나이브 세포와 비교 시 CD45RA를 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖는 항원 경험 T 세포를 지칭한다. 일부 대안에서, 이펙터 기억 세포는 나이브 세포 또는 중심 기억 세포와 비교 시 CD62L 및 CCR7의 발현에 대해 음성이고, CD28 및 CD45RA의 가변 발현을 갖는다. 일부 대안에서, 숙주 세포가 제공되며, 여기서 숙주 세포는 항원 특이적이다. 일부 대안에서, 세포는 이펙터 기억 T 세포이다.
본원에 사용된 "나이브" T 세포는 중심 또는 이펙터 기억 세포와 비교 시 CD62L 및 CD45RA는 발현하고 CD45RO-는 발현하지 않는 비-항원 경험 T 림프구를 지칭한다. 일부 대안에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD127, 및/또는 CD45RA를 포함하는 나이브 T 세포의 표현형 마커의 발현에 의해 특징화된다. 일부 대안에서, 숙주 세포가 제공되며, 여기서 숙주 세포는 항원 특이적이다. 일부 대안에서, 세포는 나이브 T 세포이다.
본원에 사용된 "이펙터" "TE" T 세포는 중심 기억 또는 나이브 T 세포와 비교 시 CD62L, CCR7, 및/또는 CD28을 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖고, 그랜자임 B 및/또는 퍼포린에 대해 양성인 항원 경험 세포독성 T 림프구 세포를 지칭한다. 일부 대안에서, 숙주 세포가 제공되며, 여기서 숙주 세포는 항원 특이적이다. 일부 대안에서, 세포는 이펙터 T 세포이다.
본원에 기재된 "T 세포 전구체"는 흉선으로 이동하고 T 세포 수용체를 발현하지 않는 T 세포 전구체가 될 수 있는 림프성 전구체 세포를 지칭한다. 모든 T 세포는 골수의 조혈 줄기 세포로부터 기원한다. 조혈 줄기 세포로부터의 조혈 전구세포 (림프성 전구 세포)는 흉선으로 이주하고, 세포 분열에 의해 확장되어 미성숙 흉선세포의 큰 집단을 생성한다. 가장 조기 흉선세포는 CD4도 CD8도 발현하지 않고, 따라서 이중-음성 (CD4-CD8-) 세포로 분류된다. 그것이 그의 발생을 통해 진행됨에 따라, 그는 이중-양성 흉선세포 (CD4+CD8+)가 되고, 최종적으로 단일-양성 (CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+) 흉선세포로 성숙하며, 이어서 이는 흉선으로부터 말초 조직으로 방출된다.
흉선세포의 약 98%는 양성 선택 또는 음성 선택을 실패함으로써 흉선에서의 발생 과정 동안 사멸되는 반면에, 다른 2%는 생존하고 흉선에 남겨져서 성숙한 면역적격 T 세포가 된다.
전구체 T 세포의 이중 음성 (DN) 단계는 기능적 β-쇄를 생산하는 것에 초점을 맞추는 반면에, 이중 양성 (DP) 단계는 기능적 α-쇄를 생산하여 궁극적으로 기능적 αβ T 세포 수용체를 생산하는 것에 초점을 맞춘다. 발생 중인 흉선세포가 4 DN 단계 (DN1, DN2, DN3 및 DN4)를 통해 진행함에 따라, T 세포는 불변 α-쇄를 발현하지만, β-쇄 로커스를 재배열한다. 재배열된 β-쇄가 불변 α-쇄와 성공적으로 쌍형성한 경우에, β-쇄의 재배열을 중지시키고 (및 대안적 대립유전자를 침묵시키고) 세포의 증식을 발생시키는 신호가 생성된다. 이들 신호가 세포 표면에서 이러한 프리-TCR을 필요로 하더라도, 이들은 프리-TCR에 대한 리간드 결합에 의존성이다. 이들 흉선세포는 이어서 CD4 및 CD8 둘 다를 발현할 것이고, α-쇄의 선택이 일어나는 이중 양성 (DP) 단계로 진행한다. 재배열된 β-쇄가 어떠한 신호전달로도 이어지지 않으면 (예를 들어 불변 α-쇄와 쌍형성하지 못하는 결과로서), 세포는 무시 (신호전달의 결여)에 의해 사멸할 수 있다.
본원에 기재된 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 골수 세포 예컨대, 예를 들어, 대식세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포 및 림프계 (예컨대, 예를 들어, T-세포, B-세포, NK-세포)로 발생할 수 있는 전구체 세포이다. HSC는 줄기 세포의 3개 클래스가 존재하는 이종 집단을 가지며, 이는 혈액 내 림프성 대 골수성 자손의 그들의 비 (L/M)에 의해 구별된다.
혼합물 중 세포 유형의 양을 기재하기 위해 본원에 사용된 "풍부화된" 및 "고갈된"은 세포의 혼합물에 대해 "풍부화된" 유형의 수의 증가 및 "고갈된" 세포의 수의 감소를 발생시키는 과정 또는 단계를 적용하는 것을 지칭한다. 따라서, 풍부화 과정에 적용된 원래의 세포 집단의 공급원에 따라, 혼합물 또는 조성물은 "풍부화된" 세포 60, 70, 80, 90, 95 또는 99 퍼센트 또는 그 초과 (수 또는 카운트 단위) (임의의 열거된 값 중 임의의 2개의 종점 사이의 임의의 정수 포함) 및 "고갈된" 세포 40, 30, 20, 10, 5 또는 1 퍼센트 또는 그 미만 (수 또는 카운트 단위) (임의의 열거된 값 중 임의의 2개의 종점 사이의 임의의 정수 포함)을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "에피토프"는 항체, T 세포 및/또는 B 세포를 포함한 면역계에 의해 인식되는 항원 또는 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 통상적으로 적어도 7개 아미노산을 갖고, 선형 또는 입체형태적일 수 있다.
"Her2" 또는 "ERBB2"는 리간드 결합을 위해 보조-수용체를 필요로 하는 막 결합 단백질 키나제 수용체를 지칭한다. Her2에 대한 예시적인 폴리펩티드 참조 서열은 유니프롯 기록 P04626 및 서열식별번호: 23 (표 8)에서 확인된다. 전장 참조 서열은 표 8에 제시된 바와 같이 1-22 아미노산 신호 서열, 23-652 아미노산 세포외 도메인, 653-675 아미노산 막횡단 도메인, 및 676-1255 아미노산 세포질 도메인을 포함하는 1255개 아미노산을 갖는다. 전장 성숙 폴리펩티드 서열은 리더 서열이 성숙 폴리펩티드에 포함되지 않기 때문에 1233개 아미노산을 갖는다. 수많은 자연 발생 변이체 및 이소형이 공지되어 있다. 핵산 참조 서열은 진뱅크(Genbank) X03363/gI 31197에서 확인된다. 세포외 도메인은 서열식별번호: 23의 도메인 I 아미노산 23-217; 도메인 II 아미노산 218 내지 341; 도메인 III 아미노산 342 내지 510; 및 도메인 IV 아미노산 511 내지 562에 상응하는 4개의 영역을 갖는다.
"Her2t"는 Her2의 서열의 단편을 지칭하고, 트랜스진 발현에 대한 유전자 태그로서 유용하다. 일부 대안에서, Her2t는 Her2의 세포외 도메인의 도메인 IV를 포함하고, 전장 Her2는 제외한다. 일부 대안에서, Her2t는 Her2의 도메인 IV에 특이적인 항체에 특이적으로 결합한다. 다른 대안에서, Her2t는 서열식별번호: 23의 아미노산 511 내지 562 또는 563-652를 포함한다.
"단리된"이 본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기재하는데 사용되고, 이는 그의 자연 환경의 구성요소로부터 확인 및 분리되고/거나 회수된 폴리펩티드 또는 핵산을 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드 또는 핵산은 그것이 자연적으로 회합되는 모든 구성요소와의 회합을 함유하지 않는다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 전형적으로 폴리펩티드 또는 핵산에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "세포내 신호전달 도메인"은 림프구의 활성화를 제공하는 분자 (여기서 키메라 수용체 분자)의 1개 이상의 도메인의 모두 또는 일부를 지칭한다. 이러한 분자의 세포내 도메인은 세포 매개자와 상호작용함으로써 신호를 매개하여 증식, 분화, 활성화 및 다른 이펙터 기능을 발생시킨다. 일부 대안에서, 이러한 분자는 CD28, CD3 및/또는 4-1BB의 모두 또는 일부, 또는 그의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 "리간드"는 또 다른 물질에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 물질을 지칭한다. 리간드의 예는 항원 상의 에피토프, 수용체에 결합하는 분자, 기질, 억제인자, 호르몬 및 활성화인자를 포함한다. 본원에 사용된 "리간드 결합 도메인"은 리간드에 결합하는 물질 또는 물질의 부분을 지칭한다. 리간드 결합 도메인의 예는 항체의 항원 결합 부분, 수용체의 세포외 도메인, 및 효소의 활성 부위를 포함한다.
본원에 사용된 "작동가능하게 연결된"은 이종 핵산 서열의 발현을 발생시키는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 위치할 때제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하고, 필요한 경우에 2개의 단백질 코딩 영역을 동일한 리딩 프레임 내에 연결한다.
본원에 확인된 유전자 태그 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후에 참조 서열 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되며, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 부분으로서 간주하지 않는다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈라인 (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여, 관련 기술분야의 기술 내의 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)]을 사용하여 생성된 % 아미노산 서열 동일성 값은 여러 검색 파라미터를 사용하며, 그의 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 디폴트 값 (즉, 조정가능한 파라미터)으로 설정되지 않은 것은 하기 값으로 설정된다: 오버랩 스팬=1, 오버랩 분획=0.125, 단어 역치 (T)=11 및 스코어링 매트릭스=BLOSUM62. % 아미노산 서열 동일성 값은 (a) WU-BLAST-2에 의해 결정되는 바와 같이 서열식별번호: 15에 제공된 참조 Her2 서열 또는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652의 각각의 또는 모든 폴리펩티드 아미노산 서열과, 관심 비교 아미노산 서열 사이에 매칭되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 (b) 관심 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총 수로 나누는 것에 의해 결정된다.
본원에 사용된 "유전자 태그 변이체 폴리뉴클레오티드"는 서열식별번호: 15에 제시된 폴리뉴클레오티드 산 서열 또는 그의 뉴클레오티드 또는 특이적으로 유래된 단편과 적어도 약 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 하기 정의된 바와 같은 폴리펩티드-코딩 핵산 분자를 지칭한다. 통상적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편의 변이체는 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 핵산 서열 또는 그의 유래된 단편과 적어도 약 80% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 81% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 82% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 83% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 84% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 85% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 86% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 87% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 88% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 89% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 91% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 92% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 93% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 94% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 96% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 97% 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 핵산 서열 동일성 및 보다 바람직하게는 적어도 약 99% 핵산 서열 동일성, 또는 열거된 퍼센트 핵산 서열 동일성의 값의 임의의 2개 사이의 임의의 퍼센트 핵산 서열 동일성을 가질 것이다. 변이체는 천연 뉴클레오티드 서열을 포괄하지 않는다. 이와 관련하여, 유전자 코드의 축중성으로 인해, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 서열식별번호: 14의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드와 적어도 약 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 다수의 키메라 수용체 변이체 폴리뉴클레오티드를 즉시 인식할 것이다.
"실질적으로 정제된"은 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 또는 그 미만, 또는 열거된 퍼센트 정제 값의 임의의 2개 사이의 임의의 값의 다른 분자 유형 또는 다른 세포 유형을 갖는 분자를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 그것이 그의 자연 발생 상태에서 정상적으로 회합되는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 세포의 동종 집단을 지칭한다.
"실질적으로 발견되지 않는"이 정상 세포 상의 종양 항원 또는 다른 분자의 존재와 관련하여 사용되는 경우에, 이는 항원 또는 분자를 갖는 정상 세포 유형의 백분율 및/또는 세포 상의 항원의 밀도를 지칭한다. 일부 대안에서, 실질적으로 발견되지 않는은 항원 또는 분자가 종양 세포 또는 다른 이환 세포 상에서 발견되는 세포 또는 항원의 양과 비교 시 정상 세포 유형의 50% 미만 상에서 및/또는 50% 미만의 밀도로 발견된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "T 세포" 또는 "T 림프구"는 임의의 포유동물, 바람직하게는 원숭이, 개 및 인간을 포함한, 영장류 종으로부터의 것일 수 있다. 일부 대안에서 T 세포는 수용자 대상체와 동종이고 (동일한 종이지만 상이한 공여자로부터); 일부 대안에서 T 세포는 자가이고 (공여자와 수용자가 동일); 일부 대안에서 T 세포는 동계이다 (공여자와 수용자가 상이하지만, 일란성 쌍둥이임).
"벡터" 또는 "구축물"은 세포에서의 이종 핵산의 발현을 제공하기 위한 조절 요소를 갖는, 세포에 이종 핵산을 도입시키는데 사용되는 핵산이다. 벡터는 플라스미드, 미니서클, 효모 및 바이러스 게놈을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상세한 설명
본 개시내용은 트랜스진 발현 세포에 대한 선택 마커 및/또는 확인 마커를 제공하는데 유용한 유전자 태그 폴리펩티드 또는 그의 변이체 및 유전자 태그를 코딩하는 핵산을 제공한다.
트랜스진 유전자 태그 및 폴리펩티드 및 변이체.
본 개시내용의 한 측면은 세포 내에서 트랜스진 발현의 안정한 발현을 제공하는 트랜스진 발현을 위한 유전자 태그를 제공한다. 일부 대안에서, 유전자 태그는 내인성 유전자와 대등한 수준에서 트랜스진을 발현하는 형질도입된 세포의 선택을 제공한다. 일부 대안에서, 유전자 태그는 세포 표면 상에서 발현되고/거나, 감소된 면역원성을 갖고/거나, 벡터에 유전자 페이로드를 실질적으로 증가시키지 않고/거나, 다양한 세포에서 트랜스진 발현을 제공한다.
일부 대안에서, 유전자 태그는 항-Her2 항체에 의해 인식되는 에피토프를 적어도 포함하는 Her2t로 지정된 Her2의 단편이다. 일부 대안에서, 항체는 Her2의 도메인 IV에 특이적으로 결합한다. 다른 대안에서, 항체는 Her2의 도메인 IV에 특이적으로 결합하고, Her2의 도메인 I, II, 및/또는 III 내의 에피토프에는 결합하지 않는다. 일부 대안에서, 항-Her2 항체는 암을 치료하는데 치료상 유용한 항체이다. 일부 대안에서, 에피토프는 트라스투주맙 (헤르셉틴)에 의해 인식된다. 일부 대안에서, 에피토프는 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙과 결합에 대해 경쟁하지만 예를 들어, Her2의 도메인 I, II, 및/또는 III 내의 에피토프에 결합하는 다른 항-Her2 항체가 아닌 항체에 의해 인식된다.
구체적 대안에서, 에피토프는 헤르셉틴 Fab와 복합체화된 Her2의 결정 구조에 의해 결정된 바와 같은 아미노산을 포함한다 (Cho et al., Nature (2003) 421:756). Her2와 헤르셉틴 사이의 상호작용은 도메인 IV 내의 3개의 루프 영역 (2개는 정전기적 및 1개는 소수성) 사이에서 발생한다. 헤르셉틴에 대한 HER2 내의 주요 상호작용 아미노산은 다음과 같다: 아미노산 서열 580-584 EADQC (Glu 580 및 Asp 582 포함) (서열식별번호: 42)를 포함하는 루프 1 (정전기적), 아미노산 서열 592-595 DPPF (Asp 592 및 Phe 595 포함) (서열식별번호: 43)를 포함하는 루프 2 (소수성), 및 아미노산 서열 616-625 FPDEEGACQP (Gln 624 포함) (서열식별번호: 44)를 포함하는 루프 3 (정전기적) (aa 넘버링 시스템은 신호전달 서열을 포함하는 표 8에 제시된 바와 같은 서열식별번호: 23의 전체 ErbB2(Her2) 서열을 기반으로 함). 신호 서열로부터 22aa를 제거하는 조(Cho) 등의 넘버링 시스템을 사용하면 헤르셉틴 : 루프 1 Glu 558 및 Asp 560, 루프 2 Asp 570 및 Phe 573, 및 루프 3 Gln 602를 수반하는 HER2의 하기 아미노산이 생성된다. 일부 대안에서, Her2의 단편은 적어도 이들 아미노산 잔기를 함유하고, 세포 표면 상에서 발현된 경우에 트라스투주맙 또는 트라스투주맙과 결합에 대해 경쟁하는 항체에 대한 결합에 대해 추가로 선택된다. 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니지만, 아미노산 578 내지 652를 함유하는 보다 작은 에피토프는 트라스투주맙에 결합하지 않았기 때문에, 적어도 아미노산 563-652를 함유하는 Her2t 단편은 트라스투주맙에 결합할 수 있는 에피토프를 포함하는 것으로 여겨진다. 일부 대안에서, Her2t 단편은 Her2t의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, Her2t 단편은 Her2t의 아미노산 서열 580-584, Her2t의 아미노산 서열 592-595 및 Her2t의 아미노산 서열 616-625를 포함한다.
구체적 대안에서, Her2의 단편은 표 6 (서열식별번호: 18)에 제시된 바와 같은 아미노산 511-652 (도메인 IV) 또는 563-652를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다. 일부 대안에서, Her2 단편의 변이체는 서열식별번호: 18의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 사이인 백분율 서열 동일성을 갖고, 세포 표면 상에서 발현된 경우에 트라스투주맙에 결합한다. 일부 대안에서, 변이체 단편은 적어도 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 이러한 치환은 헤르셉틴 Fab와 복합체화된 Her2의 결정 구조를 사용하여 확인될 수 있다 (Cho et al., Nature (2003)). 일부 대안에서, 변이체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 트라스투주맙에의 결합에 수반되는 잔기에서의 아미노산 치환은 포함하지 않는다. 일부 대안에서, 단편은 Her2의 도메인 IV 내의 잔기를 포함하고, 도메인 1, 도메인 II, 도메인 III을 포함하는 Her2의 1개 이상의 다른 도메인, 및/또는 세포내 도메인은 제외한다.
일부 대안에서, 유전자 태그는 면역 반응을 거의 또는 전혀 생성하지 않는다. 일부 대안에서, 유전자 태그는 내인성 단백질에 대한 대상체의 관용을 이용하기 위해 내인성으로 발생한 단백질로부터 선택된다. 일부 대안에서, 유전자 태그는 항원 에피토프를 예측하기 위한 소프트웨어, 예컨대 MHC-I 항원 펩티드 프로세싱 예측 알고리즘에 의해 분석된다. 서열: MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPCHPECQPQNGSVT (서열식별번호: 16)는 항원 결정기에 대해 분석된다. 일부 대안에서, 유전자 태그의 핵산 서열은 인공 또는 합성 트랜스진 구축물에의 혼입을 위해 배선 서열로부터 유래 및/또는 변형된다.
일부 대안에서, 유전자 태그는 막횡단 도메인을 추가로 포함한다. 막횡단 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우에, 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 막횡단 영역은 적어도 T-세포 수용체, CD28, CD3, CD45, CD4, CD8, CD9, CD16, CD22; CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및/또는 CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막횡단 영역(들)을 포함한다. 구체적 대안에서, 막횡단 도메인은 표 6에 제시된 바와 같은 Her2 막횡단 도메인의 아미노산 서열 (예를 들어, 아미노산 653-675 (서열식별번호: 20)을 포함한다. Her2 막횡단 도메인을 코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 19)은 표 6에 제시된다.
일부 대안에서, 합성 또는 변이체 막횡단 도메인은 우세하게 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 표 6에 제시된 바와 같은 막횡단 도메인과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성 또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 사이인 백분율 서열 동일성을 가질 수 있다. 변이체 막횡단 도메인은 바람직하게는 카이트 둘리틀에 의해 계산 시 적어도 50의 소수성 점수를 갖는다.
일부 대안에서, 유전자 태그는 유전자 태그의 표면 발현을 증진시키는 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드는, 예를 들어 과립구 대식세포 자극 인자 신호 서열, 내인성 Her2 리더 펩티드 (aa 1-22), 유형 I 신호 펩티드, IgGκ 신호 펩티드 및/또는 CD8 리더 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 리더 서열은 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다.
구체적 대안에서, 유전자 태그는 트라스투주맙에 결합하는 Her2의 단편, 및 서열식별번호: 20에 의해 예시된 바와 같은 막횡단 도메인을 포함한다. 또 다른 구체적 대안에서, 유전자 태그는 표면 발현을 증진시키는 펩티드, 트라스투주맙에 결합하는 Her2의 단편, 및 서열식별번호: 15에 의해 예시된 바와 같은 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 태그의 변이체는 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 20의 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 사이인 백분율 서열 동일성을 갖고, 세포 표면 상에서 발현된 경우에 트라스투주맙에 결합한다. 일부 대안에서, 변이체 단편은 적어도 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 대안에서, 변이체 단편은 트라스투주맙에의 결합에 수반되는 잔기에서의 아미노산 치환은 포함하지 않는다.
임의로, 링커 서열이 유전자 태그 서열을 선행할 수 있고/거나 유전자 태그의 1개 이상의 기능적 도메인 (예를 들어 표면 발현을 증진시키기 위한 펩티드, 유전자 태그, 막횡단 도메인)을 분리할 수 있다. 링커 서열은 임의로 절단가능한, 예를 들어 T2A 서열 (표 1에 제시된 바와 같음) 또는 IRES 서열이다. 절단가능한 링커 서열은 전형적으로 핵산 구축물 내에서 유전자 태그 서열을 선행하여 위치한다. 다른 링커 서열은 약 2 내지 15개 아미노산의 전형적으로 짧은 펩티드이고, 표면 발현을 증진시키기 위한 펩티드, 유전자 태그, 및 막횡단 도메인을 포함하는 유전자 태그의 기능적 도메인 사이에 위치한다. 일부 대안에서, 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 사이이고, 표면 발현을 증진시키기 위한 펩티드, 유전자 태그, 및 막횡단 도메인을 포함하는 유전자 태그의 기능적 도메인 사이에 위치한다. 일부 대안에서 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 대안에서 링커는 절단가능한 T2A 서열이다. 일부 대안에서, 링커는 IRES 서열을 포함한다.
일부 대안에서, 시스템은 1개 이상의 추가의 유전자 태그를 추가로 포함한다. 한 대안에서, 추가의 유전자 태그 서열은 표피 성장 인자 수용체 (EGFRt) 서열의 단편이다. 이러한 서열의 예는 표 7에 제공되다. 전형적으로 유전자 태그 서열은 형질도입된 세포의 선택 및/또는 형질도입된 세포의 검출을 가능하게 하는 기능적 특징을 갖는다. 일부 대안에서, 유전자 태그 서열은 인간 림프구의 형질도입과 상용성이다.
다른 대안에서, 추가의 유전자 태그는 양성 선택 마커이다. 양성 선택 유전자 태그는 숙주 세포에의 도입 시 유전자를 보유하는 세포의 양성 선택을 허용하는 우성 표현형을 발현하는 유전자일 수 있다. 이 유형의 유전자는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 특히 히그로마이신 B에 대한 저항성을 부여하는 히그로마이신-B 포스포트랜스퍼라제 유전자 (hph), 항생제 G418에 대한 저항성을 코딩하는 Tn5로부터의 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자 (neo 또는 aph), 메토트렉세이트에 대한 저항성을 제공하는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자, DHFR dm, 퓨로마이신에 대한 저항성을 제공하는 pac 유전자, 제오신을 불활성화시키는 Sh ble 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자 (ADA), 및 다중-약물 저항성 (MDR) 유전자를 포함한다. 이들 작용제의 존재 하에 배양된 형질도입된 세포는 생존하고 선택될 것이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다.
한 대안에서, 제1 핵산은 유전자 태그 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 태그 서열은 Her2t 서열이다. Her2t 서열에 대한 예시적인 폴리뉴클레오티드 및 아미노산은 표 6에 제시되고, 각각 서열식별번호: 14 및 서열식별번호: 15에 의해 제공된다. 한 대안에서, 유전자 태그 서열은 표 7에 제시된 바와 같은 표피 성장 인자 수용체 단편 (EGFRt)이다. 말단절단된 표피 성장 인자 수용체에 대한 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 22이다.
유전자 태그 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열로부터 합성 또는 재조합 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 일부 대안에서, 유전자 태그 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 링커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 유전자 태그 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한, 용이한 절제 및 상이한 유전자 태그 서열을 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 의한 태그 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1개 이상의 제한 효소 부위를 가질 수 있다. 일부 대안에서, 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
일부 대안에서, 2개 이상의 유전자 태그 서열이 사용될 수 있다. 일부 대안에서, 제1 유전자 태그 서열은 제1 키메라 항원 수용체에 작동가능하게 연결되고, 형질도입된 세포가 제1 CAR을 발현하고 있다는 표시를 제공한다. 다른 대안에서, 제2 유전자 태그 서열은 제2 및 상이한 CAR에 작동가능하게 연결되고, 형질도입된 세포가 제2 CAR을 발현하고 있다는 표시를 제공한다.
핵산 및 벡터.
본 개시내용의 또 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 유전자 태그를 코딩하는 핵산 구축물 및 그의 변이체를 포함한다.
일부 대안에서, 핵산은 단편 Her2 또는 그의 변이체의 아미노산 서열을 코딩한다. 구체적 대안에서, 핵산은 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 구체적 대안에서, 핵산은 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 한 대안에서, 유전자 태그 서열은 표 7에 제시된 바와 같은 표피 성장 인자 수용체 단편 (EGFRt)이다. 말단절단된 표피 성장 인자 수용체에 대한 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 21이다. 핵산은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 핵산 서열, 축중성 서열 및 변이체 서열을 포함한다.
벡터.
일부 대안에서, 벡터는 유전자 태그를 코딩하는 핵산을 포함한다. 유전자 태그를 코딩하는 핵산은 별개의 구축물로서 벡터 내에 패키징될 수 있거나, 또는 트랜스진을 코딩하는 핵산에 연결될 수 있다. 일부 대안에서, 유전자 태그를 코딩하는 핵산은 별개의 구축물로서 벡터 내에 패키징되거나, 또는 트랜스진을 코딩하는 핵산에 연결된다.
형질도입 및 트랜스진 발현의 효율을 제공하기 위해 다양한 벡터 조합이 구축될 수 있다. 일부 대안에서, 벡터는 이중 패키징 또는 단일 (하나에 모두) 바이러스 벡터이다. 다른 대안에서, 벡터는 바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터의 조합을 포함할 수 있다. 다른 바이러스 벡터는 포말 바이러스, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 일부 대안에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 대안에서, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터는 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 유전자 태그는 Her2t를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 추가로 프로모터, 표면 발현을 증진시키기 위한 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 구체적 대안에서, 제1 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 15의 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 코딩한다.
일부 대안에서, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 CD19 또는 CD20에 대해 지시되고, 유전자 태그는 Her2t 단편을 포함한다. 일부 대안에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자기-절단가능한 링커에 의해 유전자 태그에 작동가능하게 연결된다. 다른 대안에서, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 Her2t 또는 EGFRt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 CD19 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 다른 대안에서, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 Her2t 또는 EGFRt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 CD20 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.
핵산의 각각의 요소는 링커 서열, 바람직하게는 자기-절단 링커, 예컨대 T2A 자기-절단 서열에 의해 서로 분리될 수 있다.
다른 대안에서, 이종 (벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터에 대해 이종) 핵산 서열은 벡터 내에 패키징될 수 있는 추가의 유전적 구성요소의 양에 의해 제한된다. 일부 대안에서, 구축물은 바이러스 벡터에 이종인 적어도 2종의 유전자를 함유한다. 일부 대안에서, 구축물은 바이러스 벡터에 이종인 4종 이하의 유전자를 함유한다. 벡터 내에 패키징될 수 있는 바이러스 벡터에 이종인 유전자의 수는 1종 이상의 트랜스진의 발현을 검출하고, 적어도 10%의 세포의 형질도입 및/또는 적어도 10%의 세포에서 트랜스진의 검출가능한 발현 수준을 제공하는 벡터 구축물을 선택하는 것에 의해 결정될 수 있다.
일부 대안에서, 렌티바이러스는 이중 패키징된 바이러스이다. 이중 패키징된 바이러스는 키메라 항원 수용체 및 제1 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 1종의 핵산을 함유한다. 임의로 핵산은 시토카인, 및/또는 케모카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 이중 패키징된 바이러스는 키메라 항원 수용체 및 제2 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 1종의 핵산을 함유한다. 임의로 핵산은 시토카인, 및/또는 케모카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 2개의 구축물을 갖는 시스템의 일부 대안에서, 각 구축물은 별개의 바이러스 벡터 내에 패키징될 수 있고, 바이러스 벡터는 세포 집단에서 형질도입을 위해 함께 혼합될 수 있다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 유전자 태그는 서로 상이하다.
일부 대안에서, 이중 패키징된 바이러스는 단일 세포 유형 내에서 적어도 2종의 상이한 트랜스진, (예를 들어 CAR 구축물)의 발현을 제공한다. 상이한 유전자 태그를 사용하는 것은 이중 형질도입된 세포의 선택을 제공한다. 구체적 대안에서, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 Her2t를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 CD19 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 다른 대안에서, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 EGFRt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 CD20 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다.
일부 대안에서, 벡터는 미니서클이다. 미니서클은 임의의 박테리아 플라스미드 DNA 백본이 결여된 원형 발현 카세트로서 생산된 에피솜 DNA 벡터이다. 그의 보다 작은 분자 크기는 보다 효율적인 형질감염을 가능하게 하고, 단지 며칠동안 작용하는 표준 플라스미드 벡터와 비교 시 수주의 기간에 걸친 지속 발현을 제공한다. 일부 대안에서, 미니서클은 유전자 태그에 작동가능하게 연결된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 프로모터를 함유한다. 1종 이상의 미니서클이 사용될 수 있다. 일부 대안에서, 미니서클은 키메라 항원 수용체 및 제1 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 프로모터를 포함하고, 또 다른 미니서클은 키메라 항원 수용체 및 제2 및 상이한 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 대안에서, 구축물의 각각의 요소는 핵산, 예컨대 자기-절단 T2A 서열을 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 일부 대안에서 각각의 미니서클은 스페이서 길이 및 서열, 세포내 신호전달 도메인 및/또는 유전자 태그 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는 키메라 항원 수용체에서 서로 상이하다.
일부 대안에서, 벡터는 피기백 트랜스포손이다. 피기백 (PB) 트랜스포손은 "컷 및 페이스트" 메카니즘을 통해 벡터와 염색체 사이에 효율적으로 전위하는 이동성 유전 요소이다. 전위 동안, PB 트랜스포사제는 트랜스포손 벡터의 양쪽 말단에 위치한 트랜스포손-특이적 역전된 말단 반복부 서열 (ITR)을 인식하고, 내용물을 원래 부위로부터 효율적으로 이동시키고, 그들을 TTAA 염색체 부위에 효율적으로 통합시킨다. 피기백 트랜스포손 시스템의 강력한 활성은 PB 벡터의 2개의 ITR 사이의 관심 유전자가 표적 게놈 내로 용이하게 이동되는 것을 가능하게 한다.
일부 대안에서, PB는 유전자 태그에 작동가능하게 연결된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 프로모터를 함유한다. 1종 이상의 PB 트랜스포손이 사용될 수 있다. 일부 대안에서, PB는 키메라 항원 수용체 및 제1 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 프로모터를 포함하고, 또 다른 PB는 키메라 항원 수용체, 및 제2 및 상이한 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 프로모터를 포함한다. 구축물의 각각의 요소는 핵산, 예컨대 자기-절단 T2A 서열을 코딩하는 핵산에 의해 분리된다. 일부 대안에서 각각의 PB는 스페이서 길이 및 서열, 세포내 신호전달 도메인 및/또는 유전자 태그 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는 키메라 항원 수용체에서 서로 상이하다.
일부 대안에서, 제1 핵산은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 결합하고, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식 및 제거를 매개하는데 적합한 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자임); 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (여기서 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 제공함); 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 핵산은 유전자 태그를 추가로 포함한다.
일부 대안에서, 제2 핵산은 제2 및 상이한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 제1 및 제2 키메라 항원 수용체는 리간드 결합 도메인, 표적 항원, 표적 항원의 에피토프, 스페이서 도메인의 길이 및 서열 (짧은, 중간 또는 긴), 및 세포내 신호전달 도메인에서 서로 상이할 수 있다. 일부 대안에서, 제2 핵산은 제2, 및 제1 핵산의 그것과 상이한 유전자 태그를 추가로 포함한다.
일부 대안에서, 단일 렌티바이러스 구축물에서 제1 및 제2 핵산은 게놈 인슐레이터 핵산 예컨대 성게 인슐레이터 염색질 도메인에 의해 분리될 수 있다.
일부 대안에서, 본원에 사용된 프로모터는 유도성 또는 구성적 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터는 타목시펜 유도성 프로모터, 테트라시클린 유도성 프로모터, 및 독시시클린 유도성 프로모터 (예를 들어 tre) 프로모터를 포함한다. 구성적 프로모터는 SV40, CMV, UBC, EF1알파, PGK 및 CAGG를 포함한다.
이들 벡터 중 1종 이상을 서로 함께 사용하여 표적 세포를 형질도입시키고 키메라 항원 수용체의 발현을 제공할 수 있다.
트랜스진.
여러 트랜스진이 또한 본 발명의 측면이다.
본원에 기재된 유전자 태그는 트랜스진으로 형질도입되고 이를 발현하는 세포의 선택, 트래킹 및 사멸에 유용하다. 유전자 태그는 임의의 수의 상이한 트랜스진과 함께 이용될 수 있다. 본 개시내용에서, 키메라 항원 수용체 트랜스진이 예시되지만, 형질도입된 세포에서 발현되는 다른 트랜스진의 설계, 확인 및 선택에 유사한 원칙이 적용된다.
키메라 항원 수용체.
여러 키메라 항원 수용체가 본원에 기재된 대안에서 이용될 수 있다.
키메라 항원 수용체의 발현을 위한 시스템은 리간드 결합 도메인 (여기서 리간드 결합 도메인은 리간드에 결합하고, 여기서 리간드는 림프구에 의한 인식 및 제거를 매개하는데 적합한 종양 특이적 분자, 바이러스 분자 또는 표적 세포 집단 상에 발현된 임의의 다른 분자임); 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (여기서 스페이서는 참조 키메라 수용체와 비교 시 리간드에 반응하여 증가된 T 세포 증식 및/또는 시토카인 생산을 제공함); 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 d) 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 핵산을 포함한다. 다른 대안에서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드는 구성적 프로모터의 제어 하에 있다.
리간드 결합 도메인.
많은 리간드 결합 도메인이 본원에 기재된 대안에서 이용될 수 있다.
일부 대안에서, 키메라 수용체 핵산은 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 종양 또는 바이러스 특이적 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 수용체 또는 그의 부분, 작은 펩티드, 펩티드모방체, 기질, 시토카인 등을 제한 없이 포함한다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인은 항체 또는 그의 단편이다. 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산 서열은 용이하게 결정될 수 있다. 구체적 대안에서, 폴리뉴클레오티드는 CD19에 특이적으로 결합하는 단일 쇄 Fv를 코딩한다. 다른 구체적 일부 대안에서, 폴리뉴클레오티드는 CD20, HER2, CE7, hB7H3, 또는 EGFR에 특이적으로 결합하는 단일 쇄 Fv를 코딩한다. 이들 항체의 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있거나 또는 그에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
종양 항원은 면역 반응을 도출하는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 본 개시내용의 리간드 결합 도메인의 선택은 치료될 암의 유형에 따라 달라질 것이고, 종양 항원 또는 다른 종양 세포 표면 분자를 표적화할 수 있다. 대상체로부터의 종양 샘플은 특정 바이오마커 또는 세포 표면 마커의 존재에 대해 특징화될 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터의 유방암 세포는 각각의 Her2Neu, 에스트로겐 수용체 및/또는 프로게스테론 수용체에 대해 양성 또는 음성일 수 있다. 개별 대상체의 종양 세포 상에서 발견된 종양 항원 또는 세포 표면 분자가 선택된다. 종양 항원 및 세포 표면 분자는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 암배아성 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD19, CD171, EGFR, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, CE7, hB7H3, ROR1, 메소텔린, c-Met, GD-2 및/또는 MAGE A3 TCR을 포함한다. 일부 대안에서 표적 분자는 종양 세포에서 발견되고 정상 조직에서는 실질적으로 발견되지 않거나, 그의 발현이 비-생체 정상 조직으로 제한되는 세포 표면 분자이다.
하나의 대안에서, 종양 상의 표적 분자는 악성 종양과 연관된 1종 이상의 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 T 세포 수용체 또는 키메라 수용체 매개되는 인식에 대한 표적 항원으로서 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 다른 표적 분자는 세포 형질전환-관련 분자, 예컨대 CD19 또는 CD20의 군에 속한다. 일부 대안에서, 종양 항원은 동일한 조직 유형의 대조군 세포와 비교 시 종양 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과다발현된다. 다른 대안에서, 종양 항원은 세포 표면 폴리펩티드이다.
일단 키메라 수용체로 표적화될 수 있는 종양 세포 표면 분자가 확인되면, 표적 분자의 에피토프가 선택되고 특징화된다. 종양 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 모노클로날 항체를 수득하는 방법, 파지 디스플레이의 방법, 인간 또는 인간화 항체를 생성하는 방법, 또는 인간 항체를 생산하기 위해 조작된 트랜스제닉 동물 또는 식물을 사용하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 부분 또는 완전 합성 항체의 파지 디스플레이 라이브러리가 이용가능하고, 표적 분자에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편에 대해 스크리닝될 수 있다. 인간 항체의 파지 디스플레이 라이브러리가 또한 이용가능하다. 일부 대안에서, 항체는 종양 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하고, 비특이적 구성요소 예컨대 소 혈청 알부민 또는 다른 비관련 항원과 교차 반응하지 않는다. 일단 확인되면, 항체를 코딩하는 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 단리 및/또는 결정될 수 있다. 일부 대안에서, 부분 또는 완전 합성 항체의 파지 디스플레이 라이브러리가 표적 분자에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편에 대해 스크리닝된다.
항체 또는 항원 결합 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 미니바디와 선형 항체의 모두 또는 일부를 포함한다. 항체 단편은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하고, 용이하게 제조될 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
일부 대안에서, 특정한 종양 세포 표면 분자에 결합하는 다수의 상이한 항체는 단리되고 특징화될 수 있다. 일부 대안에서, 항체는 표적화된 분자의 에피토프 특이성을 기반으로 하여 특징화된다. 또한, 일부 대안에서, 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 그 에피토프에 대한 항체의 친화도를 기반으로 하여 선택될 수 있다. 일부 대안에서, 항체는 적어도 1 mM, 및 바람직하게는 <50 nM의 친화도를 갖는다. 일부 대안에서, 다른 항체와 비교 시 에피토프에 대해 더 높은 친화도를 갖는 항체가 선택된다. 예를 들어, 동일한 에피토프에 결합하는 참조 항체보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 또는 적어도 50배 더 큰 친화도를 갖는 항체가 선택된다. 일부 대안에서, 동일한 에피토프에 결합하는 참조 항체보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 또는 적어도 50배 더 큰 친화도 또는 열거된 임의의 규정된 값 사이의 임의의 값의 더 큰 친화도를 갖는 항체가 선택된다.
일부 대안에서, 표적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CE7, hB7H3, EGFR, CD123, CS-1, ROR1, 메소텔린, Her2, c-Met, PSMA, GD-2, 및/또는 MAGE A3 TCR 및 그의 조합으로부터 선택된다. 일부 대안에서, Her2 CAR 구축물을 목적으로 하는 경우에, 유전자 태그는 CAR 구축물에 사용된 Her2에 대한 scFv에 결합하지 않는 에피토프를 포함한다. 일부 대안에서, EGFR CAR 구축물을 목적으로 하는 경우에, 유전자 태그는 CAR 구축물에 사용된 EGFR에 대한 scFv에 결합하지 않는 에피토프를 포함한다.
구체적 대안에서, 표적 항원은 CD19이다. CD19에 특이적인 다수의 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특징화될 수 있다. 구체적 대안에서, 키메라 수용체 구축물은 FMC63 항체로부터의 scFV 서열을 포함한다. 다른 대안에서, scFV는 RASQDISKYLN의 CDRL1 서열 (서열식별번호: 27), SRLHSGV의 CDRL2 서열 (서열식별번호: 28), 및 GNTLPYTFG의 CDRL3 서열 (서열식별번호: 29)을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화 ScFv이다. 다른 대안에서, scFV는 DYGVS의 CDRH1 서열 (서열식별번호: 30), VIWGSETTYYNSALKS의 CDRH2 서열 (서열식별번호: 31), 및 YAMDY의 CDRH3 서열 (서열식별번호: 32)을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화 ScFv이다. 본 개시내용은 또한 FMC63에 대한 scFv의 것에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성 또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 사이인 백분율 서열 동일성을 갖고, CD19에 대해 적어도 동일한 친화도를 갖는 가변 영역을 고려한다.
일부 대안에서, CDR 영역은 다음과 같은 카바트(Kabat)에 의해 넘버링된 바와 같은 항체 영역 내에서 발견된다: 경쇄의 경우에; CDRL1 아미노산 24-34;CDRL2 아미노산 50-56; CDRL3 아미노산 89-97; 중쇄의 경우에 CDRH1 아미노산 31-35; CDRH2 아미노산 50-65; 및 CDRH3 아미노산 95-102. 항체 내 CDR 영역은 용이하게 결정될 수 있다.
구체적 대안에서, 표적 항원은 CD20이다. CD20에 특이적인 다수의 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특징화될 수 있다. 구체적 대안에서, 키메라 수용체 구축물은 표 9에 제시된 바와 같은 scFV 서열을 포함한다. 다른 대안에서, scFV는 R A S S S V N Y M D의 CDRL1 서열 (서열식별번호: 33), A T S N L A S의 CDRL2 서열 (서열식별번호: 34), 및 Q Q W S F N P P T의 CDRL3 서열 (서열식별번호: 35)을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화 ScFv이다. 다른 대안에서, scFV는 S Y N M H의 CDRH1 서열 (서열식별번호: 36), A I Y P G N G D T S Y N Q K F K G의 CDRH2 (서열식별번호: 37), 및 S N Y Y G S S Y W F F D V의 CDRH3 서열 (서열식별번호: 38)을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화 ScFv이다. CDR 서열은 scFv의 아미노산 서열로부터 용이하게 결정될 수 있다. 본 개시내용은 또한 CD20에 대한 scFv의 것에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성 또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 사이인 백분율 서열 동일성을 갖고, CD20에 대해 적어도 동일한 친화도를 갖는 가변 영역을 고려한다.
일부 대안에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한, 용이한 절제 및 상이한 항원을 코딩하거나 또는 상이한 결합 특성을 갖는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 의한 폴리뉴클레오티드의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1개 이상의 제한 효소 부위를 가질 수 있다. 예를 들어, 제한 부위, NheI는 리더 서열의 상류를 코딩하고; 힌지 영역 내에 위치한 3' RsrII는 키메라 수용체 벡터 내로의 임의의 바람직한 scFv의 서브클로닝을 허용한다. 일부 대안에서, 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
일부 대안에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 신호 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서 신호 펩티드는 과립구 콜로니 자극 인자에 대한 신호 펩티드이다. 다른 신호 펩티드 예컨대 CD8 알파를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 이용될 수 있다.
일부 대안에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 포유동물 세포에서 키메라 항원 수용체의 발현을 제공하는 프로모터가 선택된다. 구체적 대안에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다.
리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 구체적 대안은 CD19에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 FMC63으로부터의 scFv로서 표 1에 제시된다. 아미노산 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 39)를 포함하는 가요성 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 scFV에서 VH 및 VL 쇄를 분리한다. 링커를 포함한 scFv의 아미노산 서열은 표 1에 제시된다. (서열식별번호: 2) 다른 CD19-표적화 항체 예컨대 SJ25C1 및 HD37이 공지되어 있다. (SJ25C1: Bejcek et al. Cancer Res 2005, PMID 7538901; HD37: Pezutto et al. JI 1987, PMID 2437199).
리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 구체적 대안은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체로부터의 scFv로서 표 9에 제시된다. 아미노산 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 39)를 포함하는 가요성 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 scFV에서 VH 및 VL 쇄를 분리한다. scFv의 아미노산 서열은 표 9에 제시된다 (서열식별번호: 25). 다른 CD20-표적화 항체, 예컨대 1F5 (Budde et al. 2013, PLOS One)이 공지되어 있다.
스페이서.
일부 대안에서, 키메라 수용체 핵산은 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 전형적으로 스페이서 영역은 키메라 수용체의 리간드 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에서 발견된다. 일부 대안에서, 스페이서 영역은 리간드 결합 도메인의 가요성을 제공하고, 림프구에서의 높은 발현 수준을 허용한다. 약 229개 아미노산의 스페이서 도메인을 갖는 CD19-특이적 키메라 수용체는 단지 변형된 IgG4 힌지로 구성된 짧은 스페이서 영역을 갖는 CD19-특이적 키메라 수용체보다 더 낮은 항종양 활성을 가졌다.
일부 대안에서, 스페이서 영역은 적어도 10 내지 229개 아미노산, 10 내지 200개 아미노산, 10 내지 175개 아미노산, 10 내지 150개 아미노산, 10 내지 125개 아미노산, 10 내지 100개 아미노산, 10 내지 75개 아미노산, 10 내지 50개 아미노산, 10 내지 40개 아미노산, 10 내지 30개 아미노산, 10 내지 20개 아미노산, 또는 10 내지 15개 아미노산, 또는 상기 언급된 아미노산 길이 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내인 길이를 갖는다. 일부 대안에서, 스페이서 영역은 12개 아미노산 이하이지만 1개 아미노산 초과, 119개 아미노산 이하이지만 1개 아미노산 초과, 또는 229개 아미노산 이하이지만 1개 아미노산 초과를 갖는다.
일부 대안에서, 스페이서 영역은 이뮤노글로불린 유사 분자의 힌지 영역으로부터 유래된다. 일부 대안에서, 스페이서 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4로부터의 힌지 영역의 모두 또는 일부를 포함하고, 1개 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 힌지 영역의 예시적인 서열은 표 5에 제공된다. 일부 대안에서, 힌지 영역의 일부는 가변 중쇄와 코어 사이에서 발견되는 상부 힌지 아미노산, 및 폴리프롤린 영역을 포함하는 코어 힌지 아미노산을 포함한다.
일부 대안에서, 힌지 영역 서열은 바람직하지 않은 구조적 상호작용 예컨대 이량체화를 회피하기 위해 1개 이상의 아미노산에서 변형될 수 있다. 구체적 대안에서, 스페이서 영역은, 예를 들어, 표 1 또는 표 5에 제시된 바와 같은 IgG4로부터 변형된 인간 힌지 영역의 일부를 포함한다 (서열식별번호: 10). 변형된 IgG4 힌지 영역의 일부를 코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오티드가 표 1에 제공된다. (서열식별번호: 1). 일부 대안에서, 힌지 영역은 표 1 또는 표 5에서 확인되는 힌지 영역 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 92%, 95%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 구체적 대안에서, IgG4로부터의 인간 힌지 영역의 일부는 CPSP에서부터 CPPC까지의 코어 아미노산에서 아미노산 치환을 갖는다.
일부 대안에서, 힌지 영역의 모두 또는 일부는 이뮤노글로불린의 불변 영역의 1개 이상의 도메인과 조합된다. 예를 들어, 힌지 영역의 일부는 CH2 또는 CH3 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부와 조합될 수 있다. 일부 대안에서, 스페이서 영역은 CD8알파로부터의 47-48 아미노산 힌지 영역 서열 또는 CD28분자의 세포외 부분을 포함하는 스페이서 영역을 포함하지 않는다.
일부 대안에서, 짧은 스페이서 영역은 약 12개 아미노산 이하이지만 1개 아미노산 초과를 갖고, IgG4 힌지 영역 서열 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함하고, 중간형 스페이서 영역은 약 119개 아미노산 이하이지만 1개 아미노산 초과를 갖고 IgG4 힌지 영역 서열 및 CH3 영역 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함하고, 긴 스페이서는 약 229개 아미노산 이하이지만 1개 아미노산 초과를 갖고 IgG4 힌지 영역 서열, CH2 영역 및 CH3 영역 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함한다.
스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열로부터 합성 또는 재조합 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 일부 대안에서, 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 막횡단 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한, 용이한 절제 및 상이한 스페이서 영역을 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 의한 폴리뉴클레오티드의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1개 이상의 제한 효소 부위를 가질 수 있다. 일부 대안에서, 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
한 대안에서, 스페이서 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 그의 일부로부터의 힌지 영역 서열, CH2 영역 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부와 조합된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 힌지 영역 서열, CH3 영역 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부와 조합된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 힌지 영역 서열, 및 CH2 영역 또는 그의 변이체 및 CH3 영역 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부와 조합된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 힌지 영역 서열로부터 선택된다. 일부 대안에서, 짧은 스페이서 영역은 12개 아미노산 이하이지만 1개 아미노산 초과를 갖는 변형된 IgG4 힌지 서열이고 (서열식별번호: 10), 중간형 서열은 119개 아미노산 이하이지만 1개 아미노산 초과를 갖는 CH3 서열을 갖는 IgG4 힌지 서열; 또는 229개 아미노산 이하이지만 1개 아미노산 초과를 갖는 CH2 및 CH3 영역을 갖는 IgG4 힌지 서열이다. 일부 대안에서, 짧은 스페이서 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 아미노산 또는 상기 언급된 아미노산 길이 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 크기를 갖는다. 일부 대안에서, 중간 스페이서 영역은 13, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 119개 아미노산 또는 상기 언급된 아미노산 길이 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 크기를 갖는다. 일부 대안에서, 스페이서 영역은 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210 또는 219개 아미노산 또는 상기 언급된 아미노산 길이 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 크기를 갖는다.
막횡단 도메인.
일부 대안에서, 키메라 수용체 핵산은 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 막횡단 도메인은 막에서의 키메라 수용체의 고정을 제공한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체의 막횡단 도메인은 유전자 태그의 것과 상이하다.
한 대안에서, 키메라 수용체 내 도메인 중 1개와 자연적으로 회합된 막횡단 도메인이 사용된다. 일부 경우에서, 막횡단 도메인은 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 결합하는 것을 회피하여 다른 수용체 복합체의 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 선택되거나 또는 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다.
막횡단 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우에, 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 막횡단 영역은 적어도 T-세포 수용체, CD28, CD3, CD45, CD4, CD8, CD9, CD16, CD22; CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및/또는 CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막횡단 영역(들)을 포함한다. 구체적 대안에서, 막횡단 도메인은 표 2에 제시된 바와 같은 CD28 막횡단 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. CD28 막횡단 도메인을 코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시된다 (서열식별번호: 2 내).
막횡단 도메인은 합성 또는 자연 발생 막횡단 도메인의 변이체일 수 있다. 일부 대안에서, 합성 또는 변이체 막횡단 도메인은 우세하게 소수성 잔기 예컨대 류신 및 발린을 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 표 2 또는 표 6에 제시된 바와 같은 막횡단 도메인과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성 또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 백분율인 서열 동일성을 가질 수 있다. 변이체 막횡단 도메인은 바람직하게는 카이트 둘리틀에 의해 계산 시 적어도 50의 소수성 점수를 갖는다.
막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 합성 또는 재조합 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포내 신호전달 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한, 용이한 절제 및 상이한 막횡단 도메인을 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 의한 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1개 이상의 제한 효소 부위를 가질 수 있다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
세포내 신호전달 도메인.
일부 대안에서, 키메라 수용체 핵산은 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 종양 세포 상에 발현된 리간드에의 결합 시 키메라 수용체를 발현하는 형질도입된 세포의 1종의 기능의 활성화를 제공한다. 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 형질도입된 세포의 적어도 1종의 기능의 활성화를 제공하는 세포내 신호전달 도메인의 일부 및/또는 변이체이다.
본 개시내용의 키메라 수용체에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 CD3 제타 쇄 및/또는 키메라 수용체 관여 후 연합하여 신호 전달을 개시하는 작용을 하는 보조-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다. T 세포 활성화는 2종의 구분되는 부류의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개되는 것으로 언급될 수 있다: 항원-의존성 1차 활성화를 개시하고 T 세포 수용체 유사 신호를 제공하는 것 (1차 세포질 신호전달 서열) 및 항원-비의존성 방식으로 작용하여 2차 또는 공동-자극 신호를 제공하는 것 (2차 세포질 신호전달 서열). 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및/또는 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 일부 대안에서, 1차 신호전달 세포내 도메인은 표 4에 제공된 서열을 갖는 CD3제타에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성 또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내인 백분율 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 대안에서, CD3 제타의 변이체는 표 4에 제시된 바와 같은 적어도 1, 2, 3개 또는 모든 ITAM 영역을 보유한다.
바람직한 대안에서, 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인을 단독으로 또는 임의의 다른 목적하는 세포질 도메인(들)과 조합하여 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 CD3제타 쇄 및 공동자극 신호전달 영역을 포함할 수 있다.
공동-자극 신호전달 영역은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체의 일부를 지칭한다. 공동-자극 분자는 항원에 대한 림프구의 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 그들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40, CD30, CD40, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-l), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 제타 쇄 회합 단백질 키나제 (ZAP70) 및/또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 일부 대안에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 표 2에 제시된 바와 같은 CD28의 세포내 도메인에 대해 또는 표 3에 제공된 서열을 갖는 4-1BB에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성 또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내인 임의의 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 한 대안에서, CD28 세포내 도메인의 변이체는 위치 186-187에서 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 LL은 GG로 치환된다.
키메라 수용체의 세포내 신호전달 서열은 무작위 또는 명시된 순서로 서로에 연결될 수 있다. 임의로, 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 연결을 형성할 수 있다. 일부 대안에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산 또는 상기 언급된 크기 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내인 크기를 포함한다. 하나의 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부 및 CD28의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함한다. 또 다른 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부 및 4-lBB의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함한다. 또 다른 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부, CD28의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부, 및 4-lBB의 신호전달 도메인 또는 그의 변이체의 모두 또는 일부를 포함한다. 구체적 대안에서, CD3제타의 변이체 및 4-1BB 세포내 신호전달 도메인의 일부를 포함하는 세포내 신호전달 도메인의 아미노산 서열은 표 1에 제공된다. 대표적인 핵산 서열이 표 1에 제공된다 (서열식별번호: 2 내).
한 대안에서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CD3제타 도메인의 일부에 연결된 4-1BB 세포내 도메인을 포함한다. 다른 대안에서, 4-1BB 세포내 도메인 및 CD28 세포내 도메인은 CD3 제타 도메인의 일부에 연결된다.
세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열로부터 합성 또는 재조합 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한, 용이한 절제 및 상이한 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 의한 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 1개 이상의 제한 효소 부위를 가질 수 있다. 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
링커 도메인.
일부 대안에서 CAR 구축물 내의 도메인 사이의 가요성을 위해 링커 도메인이 제공된다. 하기 제시된 바와 같이, Her2t의 도메인 IV와 막횡단 도메인 사이의 링커 (서열식별번호: 45)는 구축물 Her2tG로 이어졌다. 링커는 단백질 도메인 사이에 가요성을 유도하기 위해 사용된다. 다른 예에서, 많은 CAR의 scFv는 CAR의 scFv의 Vh와 Vl 도메인 사이에 위치한 4개의 연속 G3S 서브유닛을 함유한다. 이는 2개의 scFv 도메인의 폴딩에 있어서 가요성을 허용한다. 예시적인 대안에서, 2개의 G3S 링커 서브유닛의 합리적인 사용은 Her2tG에 대해 증가된 양의 가요성을 유도할 수 있는데 충분할 것이다.
1개로 연결된 2개의 G3S 링커 서브유닛 (서열식별번호: 45)은 또한 CD28힌지 및 IgG4 힌지의 스페이서 길이를 모방하기 위해 사용되었다. CD28 힌지 및 IgG4 힌지 둘 다는 이전에 기능적인 CAR에서 scFv와 막횡단 영역 사이의 스페이서로서 사용된 바 있다. CD28힌지 및 IgG4힌지 둘 다는 이량체화를 용이하게 하는 시스테인을 함유한다. CAR에 유익한 한편, 이러한 이량체화는 Her2t의 가요성을 억제할 수 있고, 따라서 헤르셉틴에 대한 유의한 인식을 가능하게 하지 않는다. 3개 또는 4개보다 2개의 G3S 링커 (서열식별번호: 45)를 사용하는 것의 이점은 벡터 페이로드를 제한하고, 잠재적으로 불필요한 서열을 제거하고, 동시에 증진된 기능성을 달성한다는 것이다.
일부 대안에서, 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다.
숙주 세포 및 조성물: T 림프구 집단.
본원에 기재된 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 벡터 및/또는 구축물을 갖는 유전자 변형된 숙주 세포를 제공한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 림프구이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다.
T 림프구는 공지된 기술에 따라 수집되고, 공지된 기술 예컨대 항체에 결합하는 친화도 예컨대 유동 세포측정법 및/또는 면역자기 선택에 의해 풍부화 또는 고갈될 수 있다. 풍부화 및/또는 고갈 단계 후에, 목적하는 T 림프구의 시험관내 확장은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 공지된 기술 또는 그의 변경에 따라서 실행될 수 있다. 일부 대안에서, T 세포는 환자로부터 수득된 자가 T 세포이다.
예를 들어, 목적하는 T 세포 집단 또는 하위집단은 시험관내 배양 배지에 초기 T 림프구 집단을 첨가하고, 이어서 배양 배지에 피더 세포, 예컨대 비-분열 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 첨가하고 (예를 들어, 생성된 세포의 집단이 확장되는 초기 집단 내 각각의 T 림프구에 대해 적어도 5, 10, 20 또는 40 또는 그 초과의 PBMC 피더 세포 또는 상기 언급된 양 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내인 양을 함유하도록); 배양물을 인큐베이션하는 것 (예를 들어 T 세포의 수를 확장시키기에 충분한 시간 동안)에 의해 확장될 수 있다. 비-분열 피더 세포는 감마-조사된 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 대안에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 대안에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500 또는 3600 rad 또는 임의의 열거된 값 중 임의의 2개의 종점 사이의 임의의 rad 값의 감마선으로 조사된다. 배양 배지에의 T 세포 및 피더 세포의 첨가 순서는 원하는 경우에 역전될 수 있다. 배양물은 전형적으로 T 림프구의 성장에 적합한 온도 등의 조건 하에 인큐베이션될 수 있다. 인간 T 림프구의 성장을 위해, 예를 들어, 온도는 일반적으로 적어도 25℃, 바람직하게는 적어도 30℃, 보다 바람직하게는 약 37℃일 것이다. 일부 대안에서, 인간 T 림프구의 성장을 위한 온도는 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37℃ 또는 임의의 열거된 값 중 임의의 2개의 종점 사이의 임의의 다른 온도이다.
확장된 T 림프구는 인간 종양 또는 병원체 상에 존재하는 항원에 특이적일 수 있는 CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL) 및 CD4+ 헬퍼 T 림프구를 포함한다.
임의로, 확장 방법은 피더 세포로서 비-분열 EBV-형질전환된 림프모구성 세포 (LCL)를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. LCL은 6000 내지 10,000 rad 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 대안에서, LCL은 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500 또는 10,000 rad 내 또는 임의의 열거된 값 중 2개의 종점 사이의 임의의 rad 양의 감마선으로 조사된다. LCL 피더 세포는 임의의 적합한 양, 예컨대 적어도 약 10:1의 LCL 피더 세포 대 초기 T 림프구의 비로 제공될 수 있다.
임의로, 확장 방법은 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체를 배양 배지에 첨가하는 단계 (예를 들어, 적어도 약 0.5 ng/ml의 농도로)를 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 확장 방법은 IL-2 및/또는 IL-15를 배양 배지에 첨가하는 단계 (예를 들어, 여기서 IL-2의 농도는 적어도 약 10 단위/ml임)를 추가로 포함할 수 있다.
T 림프구의 단리 후에 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘 다는 확장 전 또는 후에 나이브, 기억 및 이펙터 T 세포 하위집단으로 소팅될 수 있다.
CD8+ 세포는 표준 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 일부 대안에서, CD8+ 세포는 각각의 유형의 CD8+ 세포와 연관된 세포 표면 항원을 확인함으로써 나이브, 중심 기억 및 이펙터 기억 세포로 추가로 소팅된다. 일부 대안에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 하위세트 둘 다에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색한 후 CD62L-CD8+ 및 CD62L+CD8+ 분획으로 소팅된다. 일부 대안에서, 중심 기억 TCM의 표현형 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및 CD127을 포함하고, 그랜자임 B에 대해 음성이거나 낮다. 일부 대안에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다. 일부 대안에서, 이펙터 TE는 CD62L, CCR7, CD28, 및 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다. 일부 대안에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127, 및 CD45RA를 포함하는 나이브 T 세포의 표현형 마커의 발현에 의해 특징화된다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 확인함으로써 나이브, 중심 기억 및 이펙터 세포로 소팅된다. CD4+ 림프구는 표준 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 대안에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 대안에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 대안에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
세포 또는 세포 집단이 특정한 세포 표면 마커에 대해 양성인지 여부는 표면 마커에 특이적인 항체 및 이소형 매칭 대조군 항체에 의한 염색을 사용하는 유동 세포측정법에 의해 결정될 수 있다. 마커에 대해 음성인 세포 집단은 이소형 대조군에 비해 특이적 항체에 의한 세포 집단의 유의한 염색의 부재를 지칭하고, 양성은 이소형 대조군에 비해 세포 집단의 균일한 염색을 지칭한다. 일부 대안에서, 마커 중 1종의 발현의 감소는 참조 세포 집단과 비교 시 평균 형광 강도에서의 1 log10의 손실 및/또는 적어도 세포의 20%, 세포의 25%, 세포의 30%, 세포의 35%, 세포의 40%, 세포의 45%, 세포의 50%, 세포의 55%, 세포의 60%, 세포의 65%, 세포의 70%, 세포의 75%, 세포의 80%, 세포의 85%, 세포의 90%, 세포의 95%, 및 세포의 100% 및 20과 100% 사이의 임의의 % 또는 참조 세포 집단과 비교 시 상기 언급된 임의의 값의 퍼센트 값 사이의 세포의 임의의 퍼센트 범위의 마커를 나타내는 세포의 백분율의 감소를 지칭한다. 일부 대안에서, 마커 중 1개에 대해 양성인 세포 집단은 참조 세포 집단과 비교 시 적어도 세포의 50%, 세포의 55%, 세포의 60%, 세포의 65%, 세포의 70%, 세포의 75%, 세포의 80%, 세포의 85%, 세포의 90%, 세포의 95%, 및 세포의 100% 및 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 임의의 백분율의 마커를 나타내는 세포의 백분율을 지칭한다.
일부 대안에서, 항원 특이적인 CD4+ 및 CD8+의 집단은 항원으로 나이브 또는 항원 특이적 T 림프구를 자극함으로써 수득될 수 있다. 예를 들어, 항원-특이적 T 세포주 또는 클론은 시토메갈로바이러스 항원에 대해, 감염된 대상체로부터 T 세포를 단리하고 동일한 항원으로 세포를 시험관내 자극함으로써 생성될 수 있다. 나이브 T 세포가 또한 사용될 수 있다. 종양 세포로부터의 임의의 수의 항원은 T 세포 반응을 도출하기 위한 표적으로 이용될 수 있다. 일부 대안에서, 입양 세포 면역요법 조성물은 고형 종양, 혈액 악성종양, 유방암 또는 흑색종을 포함하는 질환 또는 장애의 치료에 유용하다.
T 림프구 집단의 변형.
일부 대안에서 본 개시내용에 따라 면역요법에 사용될 T 세포에 기능적 유전자를 도입시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 도입된 유전자 또는 유전자들은 전달된 T 세포의 생존율 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선시킬 수 있거나; 또는 이는 생체내 생존 또는 이동의 선택 및/또는 평가를 허용하는 유전자 마커를 제공할 수 있거나; 또는 이는 예를 들어 세포가 트랜스진의 제어된 발현에 감수성이게 함으로써 면역요법의 안전성을 개선시키는 기능을 혼입시킬 수 있다. 이는 본 개시내용을 기반으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 공지된 기술에 따라 수행될 수 있다.
일부 대안에서, T 세포는 본원에 기재된 바와 같은 유전자 태그를 코딩하는 벡터로 변형된다. 일부 대안에서, 세포는 유전자 태그에 작동가능하게 연결된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 변형된다. 다른 대안에서, 세포는 유전자 태그 단독을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 변형된다. 일부 대안에서, T 세포는 치료될 대상체로부터 수득되고, 다른 대안에서, 림프구는 동종 인간 공여자, 바람직하게는 건강한 인간 공여자로부터 수득된다.
키메라 수용체는 예를 들어 항체 분자의 항원 결합 단편 또는 항체 가변 도메인을 이용함으로써 임의의 세포 표면 마커에 대한 특이성을 갖고 구축될 수 있다. 항원 결합 분자는 1종 이상의 세포 신호전달 모듈에 연결될 수 있다. 일부 대안에서, 세포 신호전달 모듈은 CD3 막횡단 도메인, CD3 세포내 신호전달 도메인 및 CD28 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 CD28 막횡단 및 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 대안에서, 동일하거나 상이한 키메라 수용체는 CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 각각의 집단에 도입될 수 있다. 일부 대안에서, 각각의 이들 집단의 키메라 수용체는 종양 또는 감염된 세포 상의 동일한 리간드 또는 상이한 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 리간드 결합 도메인을 갖는다. 세포 신호전달 모듈은 상이할 수 있다. 일부 대안에서, CD8+ 세포독성 T 세포의 세포내 신호전달 도메인은 CD4+ 헬퍼 T 세포의 세포내 신호전달 도메인과 동일하다. 다른 대안에서, CD8+ 세포독성 T 세포의 세포내 신호전달 도메인은 CD4+ 헬퍼 T 세포의 세포내 신호전달 도메인과는 상이하다. 각 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체 둘 다를 발현하는 형질도입된 세포의 선택 및 확인을 가능하게 하는 상이한 유전자 태그에 작동가능하게 연결된다.
대안은 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 단리된 핵산, 예컨대 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 511 내지 652 또는 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합함)을 숙주 세포에 도입시키는 단계; 및 숙주 세포를 적어도 1종의 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 배양하는 단계 전 또는 후 또는 전 및 후 둘 다에 Her2t의 발현에 대해 숙주 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 대안에서, 제조하는 방법은 제2 키메라 항원 수용체 및 제2 유전자 태그를 코딩하는 제2 핵산을 숙주 세포에 도입시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 배양하는 단계 전 또는 후 또는 전 및 후 둘 다에 제2 유전자 태그의 발현에 대해 숙주 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다.
다른 대안에서, 방법은 제1 단리된 핵산, 예컨대 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 511 내지 652 또는 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합함)을 제1 숙주 세포에 도입시키는 단계; Her2t를 발현하는 제1 숙주 세포를 선택하는 단계, 제2 키메라 항원 수용체 및 제2 유전자 태그를 코딩하는 제2 핵산을 제2 숙주 세포에 도입시키는 단계, 제2 유전자 태그의 발현에 대해 제2 숙주 세포를 선택하는 단계, 및 임의로, 제1 및 제2 숙주 세포를 적어도 1종의 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부 대안에서, 조성물은 제1 및 제2 숙주 세포 집단을 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 대안에서 각각의 CD4 또는 CD8 T 림프구는 본원에 기재된 바와 같이 형질도입 전에 나이브, 중심 기억, 이펙터 기억 또는 이펙터 세포로 소팅될 수 있다. 일부 대안에서, 각각의 CD4 또는 CD8 T 림프구는 형질도입 후에 나이브, 중심 기억, 이펙터 기억 또는 이펙터 세포로 소팅될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 일부 대안에서, 나이브 CD4+ 세포는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, 및/또는 CD4+ 양성 T 세포이다. 일부 대안에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L 양성 및/또는 CD45RO 양성이다. 일부 대안에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L 음성 및/또는 CD45RO 양성이다. 각각의 이들 집단은 독립적으로 키메라 수용체로 변형될 수 있다.
기재된 바와 같이, 일부 대안에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및/또는 CD62L- 하위세트 둘 다에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색한 후 CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획으로 소팅된다. 일부 대안에서, 중심 기억 T 세포 (TCM)의 표현형 마커의 발현은 CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD127을 포함하고, 그랜자임 B에 대해 음성이거나 낮다. 일부 대안에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+ 및/또는 CD8+ T 세포이다. 일부 대안에서, 이펙터 T 세포 (TE)는 CD62L, CCR7, CD28 및/또는 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B 및/또는 퍼포린에 대해 양성이다. 일부 대안에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD8+, CD62L+, CD45RO+, CCR7+, CD28+ CD127+, 및/또는 CD45RO+에 의해 특징화된다. 각각의 이들 집단은 독립적으로 키메라 수용체로 변형될 수 있다.
유전자 전달을 위한 재조합 감염성 바이러스 입자를 이용하는 다양한 형질도입 기술이 개발된 바 있다. 이는 본 발명의 T 림프구의 형질도입에 대한 현재 바람직한 접근법을 나타낸다. 이 방법에 사용된 바이러스 벡터는 원숭이 바이러스 40, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터를 포함한다. 따라서, 유전자 전달 및 발현 방법은 수없이 많지만, 본질적으로 포유동물 세포에 유전 물질을 도입시키고 발현시키기 위해 기능한다. 인산칼슘 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 및 재조합 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 레트로바이러스 벡터를 사용한 감염을 포함하는 여러 상기 기술은 조혈 또는 림프성 세포를 형질도입시키는데 사용된 바 있다. 1차 T 림프구는 전기천공에 의해 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 감염에 의해 성공적으로 형질도입된 바 있다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터는 진핵 세포에의 유전자 전달을 위한 고도로 효율적인 방법을 제공한다. 더욱이, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 통합은 제어된 방식으로 일어나고, 세포당 하나 또는 소수의 카피의 새로운 유전자 정보의 안정한 통합을 발생시킨다. 일부 대안에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터는 진핵 세포에의 유전자 전달에 사용된다. 일부 대안에서, 세포는 인간 세포이다.
자극 인자 (예를 들어, 림포카인 또는 시토카인)의 과다발현이 치료된 개체에 대해 독성일 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명의 T 세포가 생체내 음성 선택에 감수성이 되도록 하는 유전자 절편을 포함하는 것은 본 발명의 범주 내이다. "음성 선택"은 주입된 세포가 개체의 생체내 조건에서의 변화의 결과로서 제거될 수 있음을 의미한다. 음성 선택 표현형은 투여된 작용제, 예를 들어, 화합물에 대한 감수성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 발생할 수 있다. 일부 대안에서, 유전자 태그 Her2t는 또한 생체내 음성 선택을 제공한다. 예를 들어, 유전자 태그 Her2t를 갖는 CAR 발현 세포를 제거하는 것을 목적하는 하는 경우에, Her2의 도메인 IV에 결합하는 항체 (예를 들어트라스투주맙) 또는 Her2의 도메인 IV에 결합하는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체를 대상체에게 투여한다. 형질도입된 세포를 제거하는 것에 대한 바람직한 대안에서, 항체는 항체 의존성 세포성 세포독성 반응을 활성화하여 형질도입된 세포를 사멸시키기 위해 Fc 영역을 함유한다. 다른 대안에서, 항체 또는 그의 단편은 세포독성제에 연결된다. 세포독성 접합체는 CAR 및 her2t를 발현하는 세포에 결합하고 세포를 사멸시킨다. 이러한 방법은 독성 또는 유해 부작용과 연관된 투여된 세포를 제거하는 방법을 제공한다.
다른 음성 선택 유전자는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 특히 하기를 포함한다: 간시클로비르 감수성을 부여하는 단순 포진 바이러스 유형 I 티미딘 키나제 (HSV-I TK) 유전자; 세포성 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT) 유전자, 세포성 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (APRT) 유전자 및 박테리아 시토신 데아미나제.
다양한 방법이 관련 기술분야에서 널리 공지된 바와 같이, T 림프구를 형질도입시키는데 사용될 수 있다. 일부 대안에서, 형질도입은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 수행된다.
일부 대안에서, CD4+ 및 CD8+ 세포 각각은 개별적으로 키메라 수용체를 코딩하는 발현 벡터로 변형되어 규정된 집단을 형성할 수 있다. 일부 대안에서, 세포는 CAR 및 제1 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및/또는 및 CAR 및 제2 및 상이한 유전자 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 개별적으로 변형될 수 있다. 일부 대안에서, CAR 구축물은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, CD8 T 세포는 제1 유전자 태그를 갖는 CAR 구축물로 형질도입되고, CD4 T 세포는 제2 유전자 태그를 갖는 동일한 CAR로 형질도입된다.
일부 대안에서, 이들 세포는 이어서 각각의 세포 집단에 고유한 세포 표면 항원에 대해 소팅함으로써 상기 기재된 바와 같이 나이브, 중심 기억 및 이펙터 세포의 하위집단으로 추가로 소팅된다. 또한, CD4+ 또는 CD8+ 세포 집단은 그들의 시토카인 프로파일 또는 증식 활성에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 항원에 의해 자극될 때 가형질도입된 세포 또는 형질도입된 CD8+ 세포와 비교 시 시토카인 예컨대 IL-2, IL-4, IL-10, TNFα, 및/또는 IFNγ의 증진된 생산을 갖는 CD4+ T 림프구가 선택될 수 있다. 다른 대안에서, IL-2 및/또는 TNFα의 증진된 생산을 갖는 나이브 또는 중심 기억 CD4+ T 세포가 선택된다. 마찬가지로, 가형질도입된 CD8+ 세포와 비교 시 증진된 IFNγ 생산을 갖는 CD8+ 세포가 선택된다. 일부 대안에서, CD4+ 또는 CD8+ 세포 집단은 그들의 시토카인 프로파일 또는 증식 활성에 의해 선택된다. 일부 대안에서, 항원에 의해 자극될 때 가형질도입된 세포 또는 형질도입된 CD8+ 세포와 비교 시 시토카인 예컨대 IL-2, IL-4, IL-10, TNFα, 및/또는 IFNγ의 증진된 생산을 갖는 CD4+ T 림프구가 선택된다.
일부 대안에서, 항원 보유 세포에 대해 세포독성인 CD4+ 및 CD8+ 세포가 선택된다. 일부 대안에서, CD4+는 CD8+ 세포와 비교 시 약하게 세포독성일 것으로 예상된다. 바람직한 대안에서, 특정한 유형의 암에 대해 확립된 동물 모델을 사용하여 생체내 종양 세포 사멸을 제공하는 형질도입된 림프구, 예컨대 CD8+ 중심 기억 세포가 선택된다.
다른 대안에서, 형질도입된 세포는 유전자 태그의 발현에 대해 선택된다. 일부 대안에서, 형질도입 후, 예를 들어 Her2t 또는 EGFRt를 발현하는 세포는 유전자 태그에 결합하는 항체를 사용하여 선택된다. 일부 대안에서, 항체는 유전자 태그에 대해 양성인 적어도 80-100% 세포를 함유하는 세포 집단의 선택을 제공한다.
선택된 세포는 웨스턴 블롯 또는 유동 세포측정법과 같은 기술을 사용하여 트랜스진 발현에 대해 평가될 수 있다. 일부 대안에서 유전자 태그의 발현에 대해 선택된 세포는 또한 예를 들어 자극 도메인 (예를 들어 CD3제타)의 양, 단백질 L, 및 T2A를 분석하는 것에 의해 CAR의 발현에 대해 추가로 특징화된다. 일부 대안에서, CAR 대 유전자 태그의 발현의 약 1:0.1 내지 10:0.1의 비를 갖는 세포가 선택된다. 일부 대안에서, CAR 대 유전자 태그의 발현의 약 1:0.1, 2: 0.1, 3: 0.1, 4: 0.1, 5:01, 6:0.1, 7:0.1, 8:0.1, 9:01, 또는 10:0.1의 비, 또는 임의의 열거된 비 사이인 CAR 대 유전자 태그의 임의의 다른 비를 갖는 세포가 선택된다. 일부 대안에서, Her2t 유전자 태그는 EGFRt보다 더 나은 트랜스진 발현 수준을 제공하기 때문에 CAR의 발현이 낮은 경우에 이용될 수 있다. 일부 대안에서, Her2t 유전자 태그는 EGFRt 유전자 태그와 비교 시 트랜스진 발현에서 적어도 1.5배수, 2배수, 5배수, 또는 10배수 증가, 또는 열거된 값 중 임의의 2개 사이의 임의의 다른 배수 증가를 제공한다.
또 다른 대안에서, 특정한 유형의 암에 대해 확립된 동물 모델을 사용하여 생체내에서 지속될 수 있는 형질도입된 키메라 수용체 발현 T 세포가 선택된다. 일부 대안에서, 형질도입된 키메라 수용체 CD8+ 중심 기억 세포는 동물에의 도입 후 약 3일 이상, 10일 이상, 20일 이상, 30일 이상, 40일 이상, 또는 50일 이상, 또는 열거된 값 중 임의의 2개 사이의 임의의 다른 시간 동안 생체내에서 지속되는 것으로 제시된 바 있다. 생체내 지속성은 유전자 태그, 예컨대 Her2t 또는 EGFRt에 결합하는 검출가능하게 표지된 항체로 영상화하는 것에 의해 결정될 수 있다.
본 개시내용은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조합물이 조성물에서 이용될 것을 고려한다. 하나의 대안에서, 키메라 수용체 형질도입된 CD4+ 세포의 조합물은 동일한 리간드 특이성의 키메라 수용체 형질도입된 CD8+ 세포와 조합될 수 있거나, 또는 별개의 종양 리간드 및 상이한 유전자 태그에 특이적인 CD8+ T 세포와 조합될 수 있다. 다른 대안에서, 키메라 수용체 형질도입된 CD8+ 세포는 종양 상에서 발현된 상이한 리간드에 특이적인 키메라 수용체 형질도입된 CD4+ 세포와 조합된다. 또 다른 대안에서, 키메라 수용체 변형된 CD4+ 및 CD8+ 세포는 조합된다. 일부 대안에서 CD8+ 및 CD4+ 세포는 상이한 비, 예를 들어 CD8+ 및 CD4+의 1:1 비, CD8+ 대 CD4+의 10:1 비, 또는 CD8+ 대 CD4+의 100:1 비, 또는 열거된 비 값 중 임의의 2개 사이인 CD8+ 대 CD4+의 임의의 다른 비로 조합될 수 있다. 일부 대안에서, 조합된 집단은 시험관내 및/또는 생체내에서 세포 증식에 대해 시험되고, 세포의 증식을 제공하는 세포의 비가 선택된다.
형질도입 및/또는 키메라 수용체 보유 세포에 대한 선택 전 또는 후에, 인간 대상체에의 적어도 1회의 주입을 제공하는데 충분한 수의 세포, 전형적으로 대략 104개 세포/kg 내지 109개 세포/kg이 수득될 때까지 세포 집단을 바람직하게는 시험관내 확장시킨다. 일부 대안에서, 형질도입된 세포는 항원 보유 세포, 항 CD3, 항 CD28, 및 IL 2, IL-7, IL 15, 및/또는 IL-21 및 그의 조합의 존재 하에 배양된다.
CD4+ 및 CD8+ 세포의 각각의 하위집단은 서로 조합될 수 있다. 구체적 대안에서, 변형된 나이브 또는 중심 기억 CD4+ 세포는 변형된 중심 기억 CD8+ T 세포와 조합되어 항원 보유 세포, 예컨대 종양 세포에 대해 상승작용적 세포독성 효과를 제공한다.
조성물.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 T 림프구 세포 제제를 포함하는 입양 세포 면역요법 조성물을 제공한다.
일부 대안에서, T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애와 연관된 리간드에 특이적인 세포외 항체 가변 도메인, 스페이서 영역, 막횡단 도메인, 및 T 세포 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체 및 유전자 태그를 갖는 CD4 + T 세포를 포함한다. 다른 대안에서, 입양 세포 면역요법 조성물은 세포성 면역 반응을 제공하는 키메라 수용체 변형된 종양-특이적 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포 제제를 추가로 포함하며, 여기서 세포독성 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애와 연관된 리간드에 특이적인 세포외 단일 쇄 항체, 스페이서 영역, 막횡단 도메인, 및 T 세포 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체 및 유전자 태그를 갖는 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 본 개시내용의 키메라 수용체 변형된 T 세포 집단은 적어도 약 3일 또는 그 초과 동안 생체내 지속될 수 있다. 대안에서, 각각의 이들 집단은 서로 또는 다른 세포 유형과 조합되어 조성물을 제공할 수 있다.
대안은 본원에 기재된 바와 같은 CD4 및/또는 CD8 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 단리된 핵산, 예컨대 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 511 내지 652 또는 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합함), 및 제2 키메라 항원 수용체 및 제2 유전자 태그를 코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다.
다른 대안에서, 조성물은 제1 단리된 핵산, 예컨대 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 511 내지 652 또는 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 숙주 세포 (여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합함), 및 제2 키메라 항원 수용체 및 제2 유전자 태그를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 제2 숙주 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포는 동일하거나 상이한 유형의 숙주 세포일 수 있고, 예를 들어 제1 숙주 세포는 CD8 중심 기억 세포일 수 있고 제2 숙주 세포는 나이브 CD4 세포일 수 있다. 일부 대안에서, 제1 및 제2 숙주 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포,CD4 나이브 T 세포, CD8 나이브 T 세포, CD8 중심 기억 세포, CD4 중심 기억 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 각각 선택된다.
일부 대안에서, CD4+ T 헬퍼 림프구 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포 또는 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, CD4+ 헬퍼 림프구 세포는 나이브 CD4+ T 세포이며, 여기서 나이브 CD4+ T 세포는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+ T 세포를 포함한다.
일부 대안에서, CD8+ T 세포독성 림프구 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 또는 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중심 기억 T 세포이며, 여기서 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포를 포함한다. 또 다른 대안에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중심 기억 T 세포이고 CD4+ 헬퍼 T 림프구 세포는 나이브 또는 중심 기억 CD4+ T 세포이다.
방법.
본 개시내용은 입양 면역요법 조성물을 제조하는 방법, 및 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 세포 면역요법을 수행하기 위한 이들 조성물의 용도 또는 사용 방법을 제공한다.
대안은 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 단리된 핵산, 예컨대 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 511 내지 652 또는 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합함)을 숙주 세포에 도입시키는 단계; 및 숙주 세포를 적어도 1종의 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 배양하는 단계 전 또는 후 또는 전 및 후 둘 다에 Her2t의 발현에 대해 숙주 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 대안에서, 제조하는 방법은 제2 키메라 항원 수용체 및 제2 유전자 태그를 코딩하는 제2 핵산을 숙주 세포에 도입시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 배양하는 단계 전 또는 후 또는 전 및 후 둘 다에 제2 유전자 태그의 발현에 대해 숙주 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다.
다른 대안에서, 방법은 제1 단리된 핵산, 예컨대 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 511 내지 652 또는 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합함)을 제1 숙주 세포에 도입시키는 단계; Her2t를 발현하는 제1 숙주 세포를 선택하는 단계, 제2 키메라 항원 수용체 및 제2 유전자 태그를 코딩하는 제2 핵산을 제2 숙주 세포에 도입시키는 단계, 제2 유전자 태그의 발현에 대해 제2 숙주 세포를 선택하는 단계, 및 임의로, 제1 및 제2 숙주 세포를 적어도 1종의 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부 대안에서, 조성물은 제1 및 제2 숙주 세포 집단을 포함한다.
일부 대안에서, 조성물을 제조하는 방법은 변형된 나이브 또는 중심 기억 CD4+ T 헬퍼 세포를 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 변형된 헬퍼 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 종양 세포 표면 분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체 및 유전자 태그를 갖는 CD4+ T 세포를 포함한다.
또 다른 대안에서, 방법은 변형된 CD8+ 중심 기억 T 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 변형된 중심 기억 CD8 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 종양 세포 표면 분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체 및 유전자 태그를 갖는 CD8+ 세포를 포함한다. 다른 대안에서, CD8+ 세포는 유도성 프로모터의 제어 하의 시토카인 또는 케모카인 수용체를 갖는다.
둘 다의 변형된 CD4+ T 세포 및 변형된 CD8+ 세포독성 T 세포 내의 키메라 항원 수용체 및 유전자 태그는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 변형된 CD4+ T 세포는 제1 CAR 및 제1 유전자 태그를 갖는 한편, CD8+ 세포독성 T 세포는 제2 및 상이한 CAR 및 제2 및 상이한 유전자 태그를 갖는 CD8+ 세포를 포함한다. 일부 대안에서, 폴리뉴클레오티드는 CD4+ 및 CD8+ 세포 집단 둘 다에서 동일한 키메라 항원 수용체를 코딩할 수 있다. 2개의 CAR 구축물 사이의 차이는 항원 또는 에피토프에 대한 리간드 결합 도메인의 특이성 또는 친화도, 스페이서 영역의 길이 및 서열, 및 세포내 신호전달 구성요소를 포함할 수 있다.
키메라 수용체로 변형된 CD4+ 및 CD8+ 세포의 제조는 상기 뿐만 아니라 실시예에서 기재된 바 있다. 항원 특이적 T 림프구는 질환 또는 장애를 갖는 환자로부터 수득될 수 있거나, 항원의 존재 하에 T 림프구의 시험관내 자극에 의해 제조될 수 있다. 항원 특이성에 대해 선택되지 않은 CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 하위집단이 또한 본원에 기재된 바와 같이 단리되고 제조 방법에서 조합될 수 있다. 세포 집단은 1개 이상의 유전자 태그, 예컨대 Her2t 및/또는 EGFRt의 발현에 대해 유리하게 선택된다.
일부 대안에서, 세포 집단의 조합은 세포 표면 마커의 균일성, 적어도 2 세대를 통해 균일한 세포 분화 상태를 갖도록 증식하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 품질 관리는 CAR의 발현 대 유전자 태그의 발현의 비를 결정하는 것에 의해 수행될 수 있다. 세포 분화 상태 및 키메라 수용체 변형된 T 세포 상의 세포 표면 마커는 유동 세포측정법에 의해 결정될 수 있다. 일부 대안에서, 마커 및 CD8+ 세포의 세포 분화 상태는 CD3, CD8, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4, CD45RO 및/또는 CD45RA를 포함한다. 일부 대안에서, 마커 및 CD4+ 세포의 세포 분화 상태는 CD3, CD4, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4 CD45RO 및/또는 CD45RA를 포함한다.
일부 대안에서, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 수용체 변형된 T 세포는 적어도 3일, 또는 적어도 10일 동안 생체내 지속될 수 있다. 일부 대안에서, 본원에 기재된 바와 같은 키메라 수용체 변형된 T 세포는 적어도 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일 또는 상기 언급된 시간 지점 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 임의의 시간 동안 생체내 지속될 수 있다. 일부 대안에서, 키메라 수용체 변형된 T 세포는 CFSE 염료 희석에 의해 결정된 바와 같이 적어도 2 또는 적어도 3 세대를 통해 생체내 증식할 수 있다. 키메라 수용체 변형된 T 세포의 증식 및 지속성은 질환 또는 장애의 동물 모델을 사용하고, 세포를 투여하고, 유전자 태그, 예컨대 에르비툭스(EGFRt) 및/또는 헤르셉틴 (Her2t)에 결합하는 검출가능하게 표지된 항체를 사용하여 세포를 검출함으로써 전달된 세포의 지속성 및/또는 증식 능력을 결정하는 것에 의해 결정될 수 있다. 생체내에서 트랜스진 발현 세포를 검출하기 위해 항체 또는 항원 결합 단편을 사용하는 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 임의의 ADCC 반응을 최소화하기 위해 바람직하게는 Fc 부분을 포함하지 않는다. 다른 일부 대안에서, 증식 및 활성화는 항원 보유 세포를 사용하여 활성화의 다중 순환을 거침으로써 시험관내 시험될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 키메라 항원 수용체 및 유전자 태그를 발현하는 림프구의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 세포 면역요법을 수행하는 방법을 제공한다. 일부 대안에서, 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 세포 면역요법을 수행하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 1개 이상의 키메라 항원 수용체 및 유전자 태그를 발현하는 림프구의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
대안은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는 종양 항원을 발현하는 암을 갖는 환자를 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 조성물의 세포는 암 세포 상에 발현된 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 및 유전자 태그를 발현한다. 일부 대안에서, 암은 세포 상의 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 종양 항원을 갖는다. 일부 대안에서, 암은 유방암, 미만성 대 B 세포 림프종, 림프종, ALL, CLL, 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 대안에서, 종양 항원을 발현하는 암을 갖는 환자를 치료하는 방법은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조성물의 세포는 암 세포 상에 발현된 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 키메라 항원 수용체 및 제1 유전자 태그 및 암 세포 상에 발현된 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 키메라 항원 수용체 및 제2 유전자 태그를 발현한다.
일부 대안에서, 종양 항원을 발현하는 암을 갖는 환자를 치료하는 방법은 암 세포 상에 발현된 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 키메라 항원 수용체 및 제1 유전자 태그를 발현하는 제1 숙주 세포 및 암 세포 상에 발현된 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 키메라 항원 수용체 및 제2 유전자 태그를 포함하는 제2 숙주 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다.
다른 대안에서, 암을 갖고/거나 종양 항원을 발현하는 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 조성물 및 유전자 태그에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 조성물의 세포는 암 세포 상에 발현된 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 및 유전자 태그를 발현한다. 일부 대안에서, 항체는 Her2의 도메인 IV에 결합하거나, 또는 EGFRt에 결합한다. 일부 대안에서, 항체는 헤르셉틴 또는 에르비툭스이다.
일부 대안에서, 조성물의 독성 효과가 관찰되는 경우에, 유전자 태그에 결합하는 항체가 투여된다. 항체는 독성 및/또는 치명적 부작용을 회피하기 위해 조성물의 CAR 발현 세포에 결합하고 이를 사멸시킬 수 있다. 일부 대안에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 ADCC 반응을 활성화시키기 위해 Fc 단편을 바람직하게 함유한다. 다른 대안에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 세포독성제에 접합된다. 세포독성제는 칸탄시노이드, 칼리케아미신 및/또는 아우리스타틴을 포함한다. 일부 대안에서, 세포독성제는 칸탄시노이드, 칼리케아미신 및/또는 아우리스타틴을 포함한다.
일부 대안에서, 항체는 생체내 세포의 트래킹을 가능하게 하기 위해 검출가능하게 표지된다. 일부 대안에서, 항체가 생체내 검출을 위해 사용될 때, 항체 또는 항원 결합 단편은 ADCC 반응을 회피하기 위해 Fc 영역의 모두 또는 일부가 결여되어 있는 것이 바람직하다. 검출가능한 표지는 비오틴, His 태그, myc 태그, 방사성표지 및/또는 형광 표지를 포함한다. 일부 대안에서 검출가능한 표지는 비오틴, His 태그, myc 태그, 방사성표지 및/또는 형광 표지를 포함한다.
다른 대안에서, 방법은 대상체에게 세포성 면역 반응을 제공하는 유전자 변형된 세포독성 T 림프구 세포 제제 (여기서 세포독성 T 림프구 세포 제제는 본원에 기재된 바와 같은 종양 세포 표면 분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체 및 제1 유전자 태그를 갖는 CD8 + T 세포를 포함함) 및/또는 직접 종양 인식을 도출하고 세포성 면역 반응을 매개하는 유전자 변형된 세포독성 T 림프구 세포 제제 능력을 증대시키는 유전자 변형된 헬퍼 T 림프구 세포 제제 (여기서 헬퍼 T 림프구 세포 제제는 종양 세포 표면 분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체 및 제2 유전자 태그를 갖는 CD4+ T 세포를 포함함)를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 대안은 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 생물학적 샘플을 질환 또는 장애와 연관된 표적 분자의 존재에 대해 분석하는 단계 및 본원에 기재된 입양 면역요법 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 세포 면역요법을 수행하는 방법을 기재하며, 여기서 키메라 수용체는 표적 분자에 특이적으로 결합한다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 대상체는 일반적으로 인간 및 다른 영장류 대상체, 예컨대 원숭이 및 수의학적 의약 목적을 위한 유인원이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있고, 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함한, 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 대안에서, 대상체는 영장류 대상체 또는 인간이다.
방법은, 예를 들어, 혈액 악성종양, 흑색종, 유방암 및 다른 상피 악성종양 또는 고형 종양의 치료에 유용하다. 일부 대안에서, 질환 또는 장애와 연관된 분자는 고아 티로신 키나제 수용체 ROR1, Her2, EGFR, CE7, hB7H3, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
치료될 수 있는 대상체는 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 신암, 전립선암, 난소암, 피부암 (흑색종 포함), 골암 및 뇌암 등을 포함하나 이에 제한되지는 않은 암에 걸린 대상체를 포함한다. 일부 대안에서, 항원 또는 분자와 연관된 종양, 예컨대 흑색종, 유방암, 편평 세포 암종, 결장암, 백혈병, 골수종 및 전립선암이 공지되어 있다. 다른 대안에서 분자와 연관된 종양은 조작된 키메라 수용체를 발현하는 유전자 변형된 T 세포에 의해 표적화될 수 있다. 예는 B 세포 림프종, 유방암, 전립선암 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 대안에서, 대상체는 B 세포 림프종, 유방암, 전립선암 및/또는 백혈병을 갖는다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 세포는 본 발명의 개시내용을 기반으로 하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 공지된 기술 또는 그의 변경에 따라 입양 면역요법을 위한 방법 및 조성물에서 이용될 수 있다.
일부 대안에서, 세포는 먼저 그의 배양 배지로부터 세포를 수거한 다음, 세척하고, 세포를 투여에 적합한 배지 및 용기 시스템 ("제약상 허용되는" 담체) 내에서 치료-유효량으로 농축시킴으로써 제제화된다. 적합한 주입 배지는 임의의 등장성 배지 제제, 전형적으로 생리 염수, 노르모졸 R (애보트) 또는 플라즈마-라이트 A (백스터)일 수 있지만, 또한 물 중 5% 덱스트로스 또는 링거 락테이트가 이용될 수 있다. 주입 배지는 인간 혈청 알부민, 태아 소 혈청 또는 다른 인간 혈청 성분에 의해 보충될 수 있다.
일부 대안에서, 조성물 중 세포의 치료 유효량은 형질도입된 CD4 또는 CD8 세포 또는 적어도 2개 세포 하위세트 (예를 들어, 1개 CD8+ 중심 기억 T 세포 하위세트 및 1개 CD4+ 헬퍼 T 세포 하위세트)이거나, 보다 전형적으로 102개 세포 초과, 및 106개 이하, 108 또는 109개 세포 이하이고, 1010개 세포 초과 또는 임의의 열거된 값 중 임의의 2개의 종점 사이에 규정된 임의의 세포의 양일 수 있다.
세포의 수는 조성물 내에 포함될 세포의 유형에 따라 의도되는 조성물에 대한 궁극적 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 특정한 항원에 특이적인 세포를 목적으로 하는 경우에, 집단은 이러한 세포를 70% 초과로, 일반적으로 80%, 85% 및 90-95% 초과로, 또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 규정된 범위 내의 임의의 퍼센트의 세포의 양으로 함유할 것이다.
본원에 제공된 용도를 위해, 세포는 일반적으로 리터 이하이지만 1nl 초과의 부피로 존재하고, 500 ml 이하이지만 1nl 초과, 심지어 250 ml 또는 100 ml 또는 그 미만이지만 1nl 초과, 또는 임의의 열거된 값 중 2개의 종점 사이에 규정된 임의의 부피일 수 있다.
따라서 목적 세포의 밀도는 전형적으로 104개 세포/ml 초과이고, 일반적으로 107개 세포/ml 초과, 일반적으로 108개 세포/ml 이상이다. 누적해서 106, 107, 108, 108, 109, 1010 또는 1011개 세포 또는 상기 언급된 양 중 2개에 의해 규정된 범위 내의 임의의 세포의 양과 동일하거나 그를 초과하는 면역 세포의 임상적으로 적절한 수는 다중 주입으로 배분될 수 있다.
일부 대안에서, 림프구는 개체에게 면역을 부여하는데 사용될 수 있다. "면역"은 병원체에 의한 감염에 대한, 또는 림프구 반응이 지시되는 종양에 대한 반응과 연관된 1종 이상의 신체 증상의 감소를 의미한다. 투여된 세포의 양은 통상적으로 병원체에 대한 면역을 갖는 정상 개체에 존재하는 범위 내이다. 따라서, 세포는 통상적으로 주입에 의해 투여되며, 각각의 주입은 2개 세포로부터, 적어도 106 내지 3x1010개 세포까지의 범위, 바람직하게는 적어도 107 내지 109개 세포의 범위 또는 상기 언급된 양 중 2개에 의해 규정된 범위 내의 임의의 세포의 양이다.
T 세포는 단일 주입에 의해, 또는 다중 주입에 의해 소정 시간 범위에 걸쳐 투여될 수 있다. 그러나, 상이한 개체가 반응성이 다양할 것으로 예상되기 때문에, 주입되는 세포의 유형 및 양, 뿐만 아니라 주입 횟수 및 다중 주입이 주어지는 시간 범위가 담당 의사에 의해 결정되고, 이는 상용 검사에 의해 결정될 수 있다. 충분한 수준의 T 림프구 (세포독성 T 림프구 및/또는 헬퍼 T 림프구 포함)의 생성은 본원에 예시된 바와 같은 본 발명의 신속한 확장 방법을 사용하여 용이하게 달성가능하다.
일부 대안에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 정맥내로, 복강내로, 종양내로, 골수 내로, 림프절 내로, 및/또는 뇌척수액 내로 투여된다. 일부 대안에서, 키메라 수용체 조작된 조성물은 종양 부위에 전달된다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 세포를 종양 또는 면역계 구획으로 표적화하고 폐와 같은 부위는 회피하는 화합물과 조합될 수 있다.
일부 대안에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 화학요법제 및/또는 면역억제제와 함께 투여된다. 한 대안에서, 환자는 다른 면역 세포를 억제 또는 파괴하는 화학요법제로 먼저 치료된 다음, 본원에 기재된 조성물에 의해 치료된다. 일부 경우에서, 화학요법은 전적으로 회피될 수 있다. 본 발명은 하기 제시된 예에서 추가로 예시된다.
추가의 대안
일부 대안에서, 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다.
일부 대안에서, 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다.
일부 대안에서, 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 트랜스진을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 1종의 자극 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자기-절단 링커에 의해 HER2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, 자기-절단 링커는 L E G G G E G R G S L L T C G의 서열 (서열식별번호: 26)을 갖는 T2A 링커이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 2의 아미노산을 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 25 (CD20CAR)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 핵산의 크기는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 14.9 Kb의 크기, 또는 열거된 구축물 크기 중 임의의 2개 사이의 임의의 크기를 포함한다.
일부 대안에서, 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 여기서 단리된 핵산은 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 트랜스진을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 1종의 자극 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자기-절단 링커에 의해 HER2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, 자기-절단 링커는 L E G G G E G R G S L L T C G의 서열 (서열식별번호: 26)을 갖는 T2A 링커이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 2의 아미노산을 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 25 (CD20CAR)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, CD4 나이브 T 세포, CD8 나이브 T 세포, CD8 중심 기억 세포, 및 CD4 중심 기억 세포, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 자가이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 항원 특이적이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 단리된 핵산의 크기는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 14.9 Kb의 크기, 또는 열거된 구축물 크기 중 임의의 2개 사이의 임의의 크기를 포함한다.
일부 대안에서, 숙주 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 숙주 세포는 단리된 핵산을 포함하고, 여기서 단리된 핵산은 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 트랜스진을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 1종의 자극 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자기-절단 링커에 의해 HER2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, 자기-절단 링커는 L E G G G E G R G S L L T C G의 서열 (서열식별번호: 26)을 갖는 T2A 링커이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 2의 아미노산을 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 25 (CD20CAR)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, CD4 나이브 T 세포, CD8 나이브 T 세포, CD8 중심 기억 세포, 및 CD4 중심 기억 세포, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 자가이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 항원 특이적이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 전구체 T 세포이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 대안에서, 단리된 핵산의 크기는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 14.9 Kb의 크기, 또는 열거된 구축물 크기 중 임의의 2개 사이의 임의의 크기를 포함한다.
일부 대안에서, 단리된 핵산을 숙주 세포에 도입시키는 단계 및 숙주 세포를 적어도 1종의 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17의 서열을 갖는다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595, 및 글루타민 624를 포함한다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함한다. 일부 대안에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 폴리펩티드는 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 핵산은 트랜스진을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진은 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 1종의 자극 도메인을 포함한다. 일부 대안에서, 트랜스진을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 자기-절단 링커에 의해 HER2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 연결된다. 일부 대안에서, HER2 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한다. 일부 대안에서, 자기-절단 링커는 L E G G G E G R G S L L T C G의 서열 (서열식별번호: 26)을 갖는 T2A 링커이다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 2의 아미노산을 포함한다. 일부 대안에서, 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 25 (CD20CAR)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, CD4 나이브 T 세포, CD8 나이브 T 세포, CD8 중심 기억 세포, 및 CD4 중심 기억 세포, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 자가이다. 일부 대안에서, 숙주 세포는 항원 특이적이다. 일부 대안에서, 성장 인자는 IL-15, IL-7, IL-21, 또는 IL-2, 및 그의 조합으로부터 선택된다. 일부 대안에서, 방법은 Her2t 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 세포는 세포를 배지에서 배양하는 단계 전에 선택된다. 일부 대안에서, 세포는 Her2의 도메인 IV에 결합하는 항체를 사용하여 선택된다. 일부 대안에서, 항체는 트라스투주맙이다. 일부 대안에서, 방법은 제2 유전자 태그에 연결된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2 단리된 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 제2 유전자 태그를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 제2 유전자 태그는 EGFRt를 포함한다.
her2t 마커 서열과 함께 CAR을 함유하는 형질도입된 세포의 제제가 하기 기재된다.
항체 및 유동 세포측정법.
형광색소-접합된 이소형 대조군, 항-CD3, CD4, CD8, CD45, Her2, 및 스트렙타비딘을 BD 바이오사이언시스(BD Biosciences)에서 입수하였다. 세툭시맙 (에르비툭스) 및 트라스투주맙 (헤르셉틴)은 시애틀 아동 병원에서 구입하였다. 에르비툭스 및 헤르셉틴을 제조업체의 지침에 따라 비오티닐화화거나 (피어스(Pierce)) 또는 APC (솔루링크(Solulink))에 직접 접합시켰다. 데이터 획득은 LSR포르테사(LSRFortessa) (BD 바이오사이언시스) 상에서 수행하고, 분석 영역 내의 세포의 백분율은 플로우조 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
세포주.
모든 세포주를 달리 나타내지 않는 한 2 mM L-글루타민, 25 mM HEPES (어바인 사이언티픽(Irvine Scientific)), 및 10% 열-불활성화 태아 소 혈청 (하이클론(Hyclone) 또는 아틀라스(Atlas))으로 보충된 RPMI 1640 중에 유지시켰다. K562 적백혈병 표적 세포주는 스탠리 리델(Stanley Riddell) 박사가 친절히 제공하였다 (프레드 허친슨 암 연구 센터). 다른 세포주 H9 T 림프모구, Raji (인간 버킷 림프종), 및 293T (인간 배아 신장 293 세포의 고도로 형질감염가능한 유도체)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 의해 공급되었다. 엡스타인-바르 바이러스-형질전환된 림프모구성 세포주 (TM-LCL)는 이전에 기재된 바와 같이 (Pelloquin et al. 1986) 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 제조하였다. GFP:ffluc-발현 세포주를 GFP:ffluc_epHIV7로 형질도입시키고, BD FACS재즈(FACSJazz) 소터를 사용하여 소팅하였다.
벡터 구축 및 Her2t 또는 EGFRt-코딩 렌티바이러스의 제조.
제2-세대 41BB-제타 CD19CAR-T2A-EGFRt_epHIV7 렌티바이러스 구축물은 이전에 기재되어 있다 (Hudecek et al. 2013). (표 1)
CD20CAR-T2A-EGFRt_epHIV7은 CD19CAR의 동일한 신호전달 구성요소 (4-1BB-제타)와 함께, IgG4의 인간 IgG4힌지-CH3 (119 aa) 스페이서 도메인 부분에 융합된 Leu16 (뮤린 항-인간 CD20) scFv를 함유한다. (표 9)
Her2t를 주형으로서 pDONR223-ErbB2 (애드진(Addgene)) 및 수용자로서 epHIV7 렌티바이러스 벡터를 사용하여 PCR에 의해 합성하였다. (표 6 및 8) 최종 생성물, Her2t_epHIV7은 도메인 IV (aa 563-652) 및 Her2의 막횡단 스패닝 구성요소 (aa 653-675)에 인 프레임으로 융합된 인간 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 수용체 리더 펩티드 (GMCSFRss)를 함유한다. PCR 및 깁슨 클로닝에 의해 CD19CAR-T2A-EGFRt_epHIV7 구축물 내 EGFRt를 Her2t로 대체하였다. EGFRt는 이전에 기재된 바와 같이 합성하였다 (Wang et al. 2011). (표 7)
CD19CAR-T2A-Her2t-, CD19CAR-T2A-EGFRt-, CD20CAR-T2A-EGFRt-, Her2t-, 및 EGFRt-코딩 렌티바이러스를 패키징 벡터 pCHGP-2, pCMV-Rev2, 및 pCMV-G를 사용하여 293T 세포에서 생산하였다.
CAR-, Her2t-, 및/또는 EGFRt-발현 세포주의 생성.
CD4 또는 CD8 중심 기억 T 세포를 생성하기 위해, 인간 PBMC를 피콜-파크 (파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)) 상에서 건강한 공여자의 혈액 폐기 키트 (퓨젯 사운드 블러드 센터)로부터 단리하였다. 각 공여자로부터의 PBMC를 2개의 군으로 분할하고 (CD4 또는 CD8 중심 기억 T 세포 단리), 후속해서 CD4 또는 CD8 단리 키트 및 항-CD45RA 마이크로비드 (밀테니 바이오텍)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 AutoMACS 고갈시켰다. 이어서 고갈된 분획을 항-CD62L 마이크로비드를 사용하여 AutoMACS 상에서 양성적으로 선택하여 CD4+CD45RO+CD62L+ 또는 CD8+CD45RO+CD62L+ 중심 기억 T 세포를 생산하였다. 이어서 단리된 세포를 50U/ml 인터류킨-2 (IL-2), 2 ng/ml 인터류킨-15 (IL-15), 및 항-CD3/CD28 비드 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))로 자극하였다. 1차 T 세포주를 프로타민 술페이트 (1:100 희석)를 사용한 활성화 후 제3일에, 1의 바이러스 MOI로 형질도입시킨 다음, 32℃에서 45분 동안 800 x g에서 원심분리하였다. 모든 다른 세포주를 낮은 세포 계대배양 횟수로 유사하게 형질도입시켰다.
각 세포주의 Her2t+ 또는 EGFRt+ 하위세트를 비오틴-접합된 헤르셉틴 또는 에르비툭스 및 항비오틴 마이크로비드 (밀테니)를 사용한 면역자기 선택에 의해 풍부화시켰다. 선택된 CD19 또는 CD20CAR+ T 세포를 50U/ml IL-2 및 2ng/ml IL-15의 존재 하에 방사선조사된 (8000 rad) TM-LCL로 1:7의 T 세포:TM-LCL 비에서 자극하여, 형질도입 후 12-18일 확장시켰다. CD19CAR-T2A-Her2t+ /CD20CAR-T2A-EGFRt+ T 세포를 비오티닐화 헤르셉틴 및 항비오틴 멀티소트 마이크로비드 (밀테니)를 사용하여 소팅한 다음 비드를 제거하고, 이어서 에르비툭스-APC 세포 표지, 및 항-APC 마이크로비드 (밀테니)를 기반으로 한 정제에 적용시켰다.
단백질 분석.
세포 용해를 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충제 중에서 실시하였다. 세포 용해물을 BCA 검정 (피어스)에 의해 분석하고, 겔 상에 동등하게 로딩하고, 웨스턴 블롯을 1차 항체 Her2 및 포스포-Her2 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)), 항 CD247 (CD3ζ), 비오티닐화 헤르셉틴, 또는 항-β-액틴 (로딩 대조군)으로 프로빙하였다. 2차 IRDye 800CW 접합된 스트렙타비딘 또는 염소 항-마우스 또는 토끼 (LI-COR)를 제조업체의 지침에 따라 첨가하였다. 블롯을 오디세이 적외선 영상화 시스템 (LI-COR) 상에서 영상화하였다.
세포독성, 시토카인 분비 및 증식 검정.
세포독성: 4-시간 크로뮴 방출 검정을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Wang et al. 2011). 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 CD19 또는 CD20을 발현하는 5 x 103개 Cr51-표지된 K562 세포와의 공동-배양물 중 이펙터 세포로서 Her2t 마커를 갖는 CD19CAR, EGFRt 마커를 갖는 CD20CAR, CD19CAR-Her2t 및 CD20CAREGFRt, 및 마커 서열로서 EGFRt를 갖는 CD19CAR을 발현하는 최대 2.5 x 105개 Tcm 세포를 사용하여 결정하였다.
시토카인 분비: T 세포 (5 x 105개)를 96-웰 플레이트에 표적 세포와 2:1의 E:T 비로 3중으로 플레이팅하고, 상청액을 바이오-플렉스 인간 시토카인 패널 (바이오-라드(Bio-Rad))을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 세포측정 비드 어레이에 의해 분석하였다.
증식: T 세포를 0.2 μM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE; 인비트로젠(Invitrogen))로 표지하고, 세척하고, 외인성 시토카인이 없는 배지에서 자극 세포와 함께 3중으로 플레이팅하였다. 인큐베이션 72시간 후에, 세포를 항-CD3으로 표지하고 생존/사멸 염색한 다음, 유동 세포측정법에 의해 분석하여 생존 CD3+ 세포의 세포 분열을 평가하였다.
생체내 T-세포 생착 및 ADCC.
모든 마우스 실험은 시애틀 아동 연구소의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인받았다. NOD/Scid IL2RγCnull 마우스를 더 잭슨 래보러토리(The Jackson Laboratory)에서 입수하거나 또는 사내 사육하였다.
생착: 6- 내지 10-주령 NOD/Scid IL2RγCnull 마우스에 제0일에 107개의 Her2t/EGFRt-음성 (모의) 또는 Her2t 또는 EGFRt-선택된 T 세포를 정맥내로 주사하고, 5 x 106개 생존 NS0-IL15 세포를 피하로 주사하여 인간 IL-15의 생체내 전신 공급을 제공하였다. 14일 후 사망시킨 동물로부터 골수를 수거하고, BD 바이오사이언시스에서 제공된 항-CD45, 생존/사멸, CD4, CD8, 비오티닐화 헤르셉틴 또는 에르비툭스, 및 스트렙타비딘-APC를 사용한 유동 세포측정법에 의해 세포 현탁액을 분석하였다. 대안적으로, 대퇴골을 10% 포르말린 중에서 24시간 동안 고정시키고, 2시간 동안 탈석회화하고 (리차드-알란 사이언티픽(Richard-Allan Scientific)), 제조업체의 지침에 따른 항-CD45 (다코(DAKO)), 항-EGFR (클론 31G7; 인비트로젠), 또는 비오티닐화 헤르셉틴 및 SA-AF647에 의한 면역조직화학적 염색에 이어 훽스트에 의한 대조염색을 위해 파라핀 포매시켰다. 유사하게, Her2+ 또는 Her2t+ 세포주를 폴리-L-리신을 사용하여 슬라이드에 부착시킨 다음 비오티닐화 헤르셉틴 및 SA-AF647을 사용하여 염색하였다. 누앙스 FX 바이오마커 영상화 시스템을 사용하여 형광 영상을 획득하였다.
통계적 분석.
통계적 분석은 프리즘 소프트웨어 (그래프패드(GraphPad))를 사용하여 수행하였다. 스튜던트 t-검정을 95%의 신뢰 구간을 갖는 양측 대응표본 검정으로서 수행하였고, 0.05 미만의 P 값을 갖는 결과를 유의한 것으로 간주하였다. 생존의 통계적 분석은 로그-순위 검정에 의해 실시하였고, 0.05 미만의 P 값을 갖는 결과를 유의한 것으로 간주하였다.
인간 ErbB2 (Her2)를 기반으로 한 다중기능적 표면 에피토프의 설계 및 초기 특징화.
균질 면역 세포 생성물의 사용 및 선택은 임상 성공 및 입양 요법 전략의 재현성에 대한 제한 인자이다. 이 때문에, Her2t로 지칭되는 인간 Her2를 기반으로 한 비-면역원성 에피토프를 세포 조작을 위한 후보 유전자 태그 및 도구로서 설계하였다 (도 1 패널 a). Her2t는 모든 Her2 세포내 구성요소가 결여되어 있지만, 모노클로날 항체 트라스투주맙 (헤르셉틴)에 의해 인식되는 입체형태적으로 무손상 결합 에피토프인 Her2 막횡단 영역 및 표면 발현을 촉진하기 위한 GMCSFRss를 여전히 함유한다 (도 1 패널 b). 1종은 전체 Her2 도메인 IV를 함유하고 2종은 헤르셉틴과 복합체화된 Her2의 3차원 구조를 기반으로 하여 설계된 최소 입체형태적 에피토프를 함유하는 Her2t 구축물의 3종의 변이체 (Garrett et al. 2007; Cho et al. 2003)가 렌티바이러스 패키징 플라스미드 epHIV7 내에 초기에 혼입되었고 CHO 세포에서 특징화되었다. 표 1 패널 b에 개략된 아미노산 563-652를 포함하는 Her2t 구축물은 비오티닐화 헤르셉틴 및 스트렙타비딘-접합된 형광단을 사용한 유동 분석을 기반으로 하여 최대의 일시적 표면 발현을 나타내었고, 따라서 추가의 하류 특징화를 위해 선택되었다 (데이터는 제시되지 않음).
Her2t는 실용적이고 기능적으로 불활성인 유전자 태그이다.
초기 일시적 발현 분석에 따라, Her2t-함유 epHIV7을 VSV-g 유사형화 자기-불활성화 렌티바이러스 생산에 적용시켰다. 이어서 생성된 바이러스를 다중 세포 유형 내로 형질도입시켜 8.2-65% Her2t+ 집단을 발생시켰고 (데이터는 제시되지 않음), 형질도입된 K562 적백혈병 세포 (13.8% Her2t+)가 대표적이다 (도 2 패널 a). 트랜스진-부여된 세포 집단의 선택적 풍부화를 위한 표적으로서 Her2t의 유용성을 평가하기 위해, 형질도입된 K562 집단을 비오티닐화 헤르셉틴 및 항비오틴 마이크로비드를 사용하는 2-단계 면역자기 정제 과정에 적용시켰다. 이 과정은 일관되게 ≥95% Her2t+인 세포 집단을 발생시켰다 (도 2 패널 b). 이후 적정 실험은 1.2ng 이하의 비오티닐화 헤르셉틴이 106개 Her2t+ 세포를 최대로 표지하는데 충분하다는 것을 밝혀내었다. (도 2 패널 a).
본 발명자들의 분자 모델에서 나타내어지는 바와 같이 (도 1 패널 a), Her2t는 세포외 도메인 I-III이 결여되어 있고, 항체 인식에 필요한 도메인 IV 결합 에피토프를 함유한다. 따라서 Her2t는 상업적 Her2 항체에 결합할 수 없을 것이고, 헤르셉틴에 의해 고유하게 인식될 것으로 예측되었다. 유동 분석은 헤르셉틴이 Her2t 및 전장 Her2-발현 K562 세포를 효율적으로 인식 및 염색할 수 있지만, 상업적 항체는 단지 전장 Her2 만을 인식할 수 있다는 것을 확인시켜주었다 (도 2 패널 c).
Her2t 및 전장 Her2에 대한 웨스턴 이뮤노블롯 분석은 헤르셉틴-선택된 Her2t+ 또는 전장 Her2+ 발현 세포에 대해 각각 유사하게 실시하였다. 예상된 바와 같이, 상업적 Her2 항체를 사용한 경우에 전장 Her2-발현 세포로부터의 용해물에서 단지 전장 185kDa Her2 단백질 만이 검출되었다. 마찬가지로, Her2 인산화는 뉴레귤린으로 처리된 전장 Her2-발현 세포로부터의 용해물에서만 검출되었다. Her2t에 대한 밴드는 Her2t+ 세포 용해물에서 비오티닐화 헤르셉틴으로 프로빙한 경우에만 검출되었다 (도 2 패널 d).
Her2t는 T 세포 요법을 위한 고도로 엄격하고 상보적인 선택 에피토프이다.
EGFRt로 지칭되는 키메라 항원 수용체 (CAR) 발현 T 세포 치료제를 위한 고도로 효율적인 선택 에피토프가 이전에 확인되었다 (Wang et al. 2011). CAR-함유 바이러스 벡터에서의 Her2t의 협동 발현이 생체외 조작된, 넓은-범주의 CAR 치료제의 임상 용도를 촉진할 수 있는지 여부를 검사하였다. 또한, Her2t는 CAR-재지시된 T 세포 치료제에 대한 이용가능한, 비-면역원성 선택 마커의 레퍼토리를 다양화하고, EGFRt 선택 전략에 대한 대안 또는 보충제로서 작용할 수 있다 (즉 T 세포를 다중 후보 종양 항원에 대해 이중특이적이게 함).
CAR 요법에서 Her2t의 유용성을 평가하기 위해, Her2t와의 공동-발현을 지시하도록 이전에 기재된 CD19CAR (Hudecek et al. 2013) 및 리보솜 스킵 T2A 서열로 구성된 다중도메인 DNA 구축물을 구축하였다 (도 1 패널 c). 이어서 생성된 CD19CAR-T2A-Her2t 구축물을 epHIV7 내로 혼입시키고, 앞서 기재된 바와 같이 바이러스 생산에 적용시켰다.
EGFRt 발현 대비 또는 그와 연합하여 선택 마커로서의 Her2t의 기능성을 평가하기 위해, CD4+ 또는 CD8+ 중심 기억 (Tcm) 세포 (도 3 패널 a)를 CAR-T2A-Her2t 및/또는 CAR-T2A-EGFRt 함유 바이러스 벡터의 패널로 형질도입시켰다 (도 3 패널 b). 단일 CAR-함유 벡터로 형질도입시킨 CD4+ 또는 CD8+ Tcm은 비오티닐화 헤르셉틴 (Her2t) 또는 에르비툭스 (EGFRt) 및 항비오틴 마이크로비드를 사용한 면역자기 선택 전 22-72% Her2t+ 또는 EGFRt+였지만, 선택 후 균일한 순도 (>90%)로 일관되게 풍부화되었다 (도 3 b). 이중 Her2t+ 및 EGFRt+ 형질도입된 세포를 대안적으로 멀티소트 및 항-APC 비드 (물질 및 방법)의 조합을 사용하여 면역자기적으로 소팅하여, >90% 이중 트랜스진-양성 세포를 발생시켰다 (도 6).
대안적으로, 이중-형질도입된 세포주를 비드 제거에 대한 대안으로서 유리 비오틴 또는 스트렙타비딘을 사용하여 소팅할 수 있다. 유동 평균 형광 강도 (MFI) 분석이, Her2t-선택된 Tcm 집단이 EGFRt-선택된 집단에 비해 더 낮은 트랜스진 수준을 발현할 수 있다고 나타내었기 때문에 (도 3 패널 b), 본 발명자들은 다음으로 Her2t 수준이 보다 낮은 CAR 발현과 직접 상관관계가 있는지 여부에 의문을 가졌다. 이를 위해, Her2t 또는 EGFRt에 의해 선택된 CD19CAR-발현 Tcm을 용해시키고, 세포 용해물을 CD3ζ 표적화된 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다. 결과는 Her2t-부가된 트랜스진이 EGFRt-부가된 트랜스진보다 더 높은 발현 수준 (예를 들어 약 2배)으로 선택된다는 것을 증명하였다 (도 3 패널 c). 이들 결과는 Her2t가 EGFRt 선택에 비해 보다 엄격한 선택 방법을 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 웨스턴 블롯 분석은 또한 이중-선택된 Tcm에서의 CD19CAR 및 CD20CAR 공동-발현을 증명하였다 (도 3 패널 c).
이중-선택된 Tcm은 시험관내에서 이펙터 표현형 및 표적 특이성을 유지한다.
다중 암 유형은 요법을 회피하고자 하는 수단으로서 표적 항원을 하향조절하거나 돌연변이시킨다. 따라서 다중 종양-연관 항원의 동시 표적화는 종양 회피를 극복하기 위한 유망한 치료 접근법이고, T 세포 치료제의 치료 범위를 넓힐 수 있다. 표면 마커 (Her2t 및 EGFRt) 선택에 의해 매개되는 2개의 CAR (CD19- 및 CD20-CAR)의 공동-발현이 CAR 재지시된 T 세포의 기능적 속성을 증진시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 그의 단일 CAR-발현 대응물 대비 이중 CAR-발현 Tcm의 시험관내 기능을 분석하였다. 세포독성 분석은 각각의 CAR-재지시된 Tcm 하위세트 (CD19-, CD20- 또는 CD19- 및 CD20-CAR 발현)가 CD19, CD20, 또는 둘 다를 발현하는 K562 세포에 대해 유사한 수준의 특이적 용해를 부여하지만 (도 4 패널 a) CD19-/CD20- 모 K562 표적의 인식은 매개하지 않는다는 것을 제시하였다 (도 4 패널 b).
다음으로 K562 표적 패널에 대한 이중 CAR-발현 Tcm의 쌍형성된 기능성을 시험하였고 (도 4 패널 b), 오직 이중 CAR-발현 Tcm 만이 모든 표적 발현 K562 세포에 대해 특이적 용해를 부여할 수 있다는 것이 증명되었다. 대조적으로, CD19- 또는 CD20-특이적 CAR 발현 Tcm 세포 만이 그의 동족 표적 항원을 발현하는 K562 세포에 대해 세포용해 활성을 촉발할 수 있었다 (도 4 패널 b).
K562 표적 패널에 의한 자극에 반응한 시토카인 생산의 정량 분석은 유사한 특이성을 증명한다. 어떠한 CAR-발현 Tcm도 K562 모 세포와의 공동-배양에 반응하여 시토카인을 생산할 수 없었지만, 이중 CAR-발현 Tcm은 모든 표적-발현 세포와의 공동-배양에 반응하여 IL2, IFNγ 및 TNFα를 생산하였고, 시토카인 생산은 단일 CAR-발현 Tcm의 경우에 K562/CD19-CD20 및 K562/CD19 또는 K562/CD20 표적 세포로 제한되었다. (도 4 패널 c). 이들 결과는 오직 이중 CAR-발현 Tcm 만이 CD19 및 CD20에 대해 이중특이적이고, 어느 하나의 항원 단독과의 직면 시 T 세포의 활성화 및 표적화를 매개한다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, Her2t-선택된 CD19CAR-발현 Tcm은 그의 EGFRt-선택된 대응물에 비해 보다 다양하고 증진된 시토카인 프로파일을 생산하였다 (예를 들어 약 2-3배 초과). (도 3 패널 d) 이는 Her2t 선택의 엄격한 속성 및 Her2t-선택된 Tcm에서의 총 CAR 발현의 결과적 증진으로 인한 것일 수 있다.
CAR 항종양 활성이 전달된 T 세포의 증식 및 생존과 상관관계가 있기 때문에, 본 발명자들은 그의 각각의 표적(들)에 의한 관여 후 CAR 변형된 Tcm의 증식을 분석하기 위해 CFSE 희석 검정을 수행할 것을 선택하였다. 이중 CAR 발현은 자극 후 Tcm 증식을 CD19CAR-발현 Tcm과 유사한 수준으로 촉진하는 것으로 발견되었다.
유동 세포측정법 및 면역조직화학에 의한 입양 전달된 Her2t+ T 세포의 트래킹
지금까지의 대부분의 CAR 요법 임상 시험은 치료제 투여 후 유전자-변형된 세포 지속성을 정량화하기 위해 PCR-기반 기술에 의존해왔다. 요법 특이적 유전자 태그, 예컨대 Her2t의 사용은, 다중파라미터 표현형 분석을 추가로 허용하고 치료 반응과 상관관계가 있을 수 있는 주입된 CAR T 세포 하위세트를 확인할 수 있다.
생체내 트래킹 작용제로서 Her2t의 유용성을 시험하기 위해, CD19CAR+Her2t+ CD4 및 CD8 Tcm을 생착시킨 NOD/Scid IL-2RγCnull 마우스로부터 골수 시편을 수거하고, 프로세싱된 샘플을 유동 세포측정 분석에 적용하였다. (도 5 패널 a). 유사한 수준의 CD45+ T 세포 생착이 마커-음성, Her2t+, 및 EGFRt+ 세포가 투여된 마우스에서 발견되었다 (도 5 패널 b). CD45+ T 세포 하위세트 중에서, 11.7-45.7%가 CD8에 대해 이중 염색되었고, 이는 CD4+ T 세포의 우선적 확장을 나타낸다. 또한, 비오티닐화 헤르셉틴 및 APC-접합된 스트렙타비딘을 사용한 Her2t에 대한 공동-염색은 Her2t+ T 세포의 그의 Her2t-음성 대응물로부터의 분해를 가능하게 하였다 (도 5 패널 c). 이들 결과는 Her2t가 입양 전달된 T 세포에 대한 실용적 트래킹 마커임을 증명한다.
다음으로 Her2t가 면역조직화학적 (IHC) 염색을 위한 실용적 표적인지 여부를 결정하였다. 예비 연구로서, Her2t+ 세포를 슬라이드에 부착시키고, 비오티닐화 헤르셉틴 및 형광색소-접합된 스트렙타비딘으로 염색하였다 (도 5 패널 d).
Her2t에의 헤르셉틴 결합은 인간 T 세포가 ADCC에 감수성이게 한다.
투여되는 T 세포에 안전성 메카니즘을 혼입시키는 것은 요법 동안 발생할 유해 임상 사건에 대한 가치있는 특색이다. GMCSF 자극된 PBMC 및 헤르셉틴 또는 에르비툭스와의 공동-배양 시 Her2t+ 또는 EGFRt+ T 세포의 시험관내 세포독성 분석을 실시할 것이다.
H9 (T 세포) 세포 (5x106개 모, Her2t+, EGFRt+, 또는 Her2t+/EGFRt+)를 함께 혼합한 다음, 정제에 적용시켰다. (도 6). 세포를 초기에 비오티닐화 헤르셉틴 및 항비오틴 멀티소트 비드를 기반으로 하여 정제하였다. 이어서 멀티소트 비드를 제거한 다음, 양성 분획을 에르비툭스-APC 및 항-APC 마이크로비드를 기반으로 한 정제에 적용시켰다. 최종 양성 분획은 Her2t 및 EGFRt에 대해 이중 양성이었다. (도 6).
이러한 시스템에서, 자극된 PBMC는 항체의 존재 하에 항체 의존성 세포성 세포독성을 유도할 수 있는 이펙터의 공급원으로서 작용할 것이다. 목표는 헤르셉틴 또는 에르비툭스를 각각 공동-배양물에 첨가한 경우에 Her2t+ 또는 EGFRt+ 세포를 선택적으로 제거하는 것일 것이다. 이들 시험은 Her2t 또는 EGFRt를 공동-발현하는 ffluc+ Tcm을 사용하여 생체내로 확장될 것이다. 이러한 설정에서, Tcm은 NOD/Scid IL-2RγCnull 마우스 내로 생착된 다음 헤르셉틴 또는 에르비툭스 및 새로이 활성화된 PBMC가 투여될 것이다. 생체내 생착 및 전달된 Tcm의 항체-매개된 제거는 생체내 생체광자 영상화에 의해 측정될 것이다. 헤르셉틴 또는 에르비툭스-매개된 제거는 Her2t, EGFRt 또는 둘 다의 마커를 발현하는 Tcm에 대해 특이적일 것이다.
조합된 Her2t 및 EGFRt 선택은 생체내 이중 CAR 특이성을 부여한다.
이들 실험의 목표는 생체내 선택적 항종양 활성을 제시하는 것이다. CD19+, CD20+ 또는 CD19/CD20+인 K562 ffluc+ 종양 세포는 NOD/Scid IL-2RγCnull 마우스의 좌측 또는 우측 측복부 내로의 s.c. 주사에 의해 확립될 것이다. CD19CAR-Her2t, CD19CAR-EGFRt, CD20CAR-EGFRt 또는 CD19CAR-Her2t 및 CD20CAR 발현 Tcm은 종양 확립 후 정맥내로 주사될 것이고, T 세포 특이성은 생체광자 영상화에 의해 결정될 것이다. 종양 루시페라제 활성 (총 광자 플럭스)의 손실은 종양 퇴행을 나타낼 것이다.
종양 퇴행은 마우스를 이중 CAR-발현 Tcm으로 처리한 경우에 모든 종양 표적에 대해 발생할 것이고, 마우스를 그의 동족 CAR을 발현하는 Tcm으로 처리한 경우에는 CD19 또는 CD20-발현 K562 종양만이 퇴행할 것이다. 대안적으로, CD19+, CD20+ 또는 CD19/CD20+ K562 세포가 앞에서와 같이 확립될 것이고, ffluc+CAR+ Tcm이 종양 확립 후 투여될 것이다. CAR-특이성을 기반으로 한 Tcm 국재화는 생체광자 영상화에 의해 결정될 것이다. 이중-선택된 Her2t+EGFRt+ T 세포는 K562 종양 상에서 표적 항원과 무관하게 양쪽 측면에 국재화될 것이고, CD19 또는 CD20CAR 발현 세포는 그의 표적 항원 특이적 K562 종양에 국재화될 것이다.
Her2 도메인 IV와 막횡단 도메인 사이에의 링커 도메인 (Her2tG)의 도입은 항체 헤르셉틴에의 증진된 결합을 가능하게 한다.
도 7은 Her2t 및 Her2tG의 1차 서열의 개략도이다. Her2tG는 Her2 도메인 IV와 막횡단 영역 사이에의 링커 서열의 부가에 의해 Her2t와 상이하고, 서열 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하고, 구축물은 Her2tG로 지정된다. H9 세포를 Her2t 또는 Her2tG를 갖는 렌티바이러스에 의해 1의 MOI로 형질도입시켰다. 이어서 형질도입된 세포를 비오티닐화 헤르셉틴 및 항비오틴 마이크로비드에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 정제하였다. 이후 정제된 집단을 비오티닐화 헤르셉틴 및 스트렙타비딘-PE를 사용하여 Her2t 또는 Her2tG에 대해 염색하였다. 히스토그램은 Her2tG에의 보다 큰 결합을 나타낸다 (도 8). 도 9에 제시된 바와 같이, H9 세포를 렌티바이러스에 의해 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1 및 3ul (좌측에서 우측으로)로 형질도입시킨 다음, 5일 후 헤르셉틴 결합에 대해 분석하였다. Her2t 변이체 Her2t(CD28힌지)는 헤르셉틴에 대해 원래의 Her2t와 유사한 수준으로 결합할 수 있었다 (Her2t 염색은 제시되지 않으나 이전 실험을 기반으로 함). Her2t(IgG4힌지)는 Her2t 또는 Her2t(CD28힌지)에 비해 헤르셉틴 결합을 증진시켰고, Her2tG 변이체는 헤르셉틴에 결합하고 형질도입된 H9 세포를 염색하는 최대 능력을 가졌다.
실험으로부터 제시되는 바와 같이, Her2t의 도메인 IV와 막횡단 도메인 사이의 링커 (서열식별번호: 45)는 구축물 Her2tG로 이어졌다. 링커는 단백질 도메인 사이에 가요성을 유도하기 위해 사용된다. 다른 예에서, 많은 CAR의 scFv는 CAR의 scFv의 Vh와 Vl 도메인 사이에 위치한 4개의 연속 G3S 서브유닛을 함유한다. 이는 2개의 scFv 도메인의 폴딩에 있어서 가요성을 허용한다. 2개의 G3S 링커 서브유닛은 Her2tG에 대해 동일한 양의 가요성을 유도할 수 있는데 충분할 것임이 여기서 합리적이다.
2개의 G3S 링커 서브유닛 (서열식별번호: 45)은 또한 CD28힌지 및 IgG4 힌지의 스페이서 길이를 모방하기 위해 사용되었다. CD28 힌지 및 IgG4 힌지 둘 다는 기능적인 CAR에서 scFv와 막횡단 영역 사이의 스페이서로서 사용된 바 있다. CD28힌지 및 IgG4힌지 둘 다는 이량체화를 돕는 시스테인을 함유한다. CAR에 유익한 한편, 이러한 이량체화는 Her2t의 가요성을 억제할 수 있고, 따라서 헤르셉틴에 대한 유의한 인식을 가능하게 하지 않는다. 3개 또는 4개보다 2개의 G3S 링커 (서열식별번호: 45)를 사용하는 것의 이점은 벡터 페이로드를 제한하고, 잠재적으로 불필요한 서열을 제거하고, 동시에 증진된 기능성을 달성한다는 것이었다.
Her2t로 지정된 다목적 세포 표면 마커가 기재된다. 이러한 신규 마커는 전장 Her2를 구성하는 1255개 아미노산 중 단지 113개 만을 함유하고, 무손상 Her2 세포 신호전달을 담당하는 모든 세포외 또는 세포내 도메인이 결여되어 있다. 조혈 세포는 Her2 발현이 결여되고, 이는 기능적으로 무손상이면서 또 공여자 T 세포를 균질한, 트랜스진-발현 치료 생성물로 정밀화할 수 있게 하는 설계에 의해 Her2t를 주요 후보 트랜스진 선택 마커로 만든다. Her2t의 설계는 인간 GM-CSF 수용체-α 쇄의 리더 펩티드에 대한 N-말단 Her2t 단편의 융합을 포함한다. 이러한 융합은 Her2t 표면 발현의 촉진을 돕고, 최소 결합 에피토프가 제약 등급 모노클로날 항체 트라스투주맙 (헤르셉틴)에 의해 고유하게 인식되게 한다
그의 최소 cDNA 풋프린트로 인해, Her2t는 단독으로 발현될 수 있거나 또는 생물학적 활성 트랜스진, 즉 키메라 항원 수용체 (CAR)와 함께 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터 내로 협동 혼입될 수 있는 것이 증명되었다. 협동 트랜스진 발현 수준은 Her2t를 CAR에 T2A 리보솜 스킵 링커를 통해 부가함으로써 달성되고, Her2t-정제된 CD8 중심 기억 T 세포의 유동 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다. 또한, Her2t는, EGFRt 선택 전략과 비교 시, 보다 큰 CAR 발현 및 이펙터 시토카인 생산을 갖는 T 세포의 생체외 선택을 가능하게 하는 고도로 엄격한 선택 에피토프인 것이 또한 증명되었다. 이러한 특징은 CAR 요법을 다중 종양 유형의 치료로 확장하는 경우와 같은, 보다 높은 트랜스진 발현 수준을 목적으로 하는 경우에 유리할 수 있다.
T 세포가 상승된 트랜스진 발현 수준을 갖추는 것에 더하여, 개별 T 세포를 다중 종양 항원에 대해 이중특이적이게 하는 것은 임상적으로 유익한 것으로 증명될 수 있다. 사실상, 표적 항원의 하향 조절 또는 돌연변이가 다중 암 유형에서 통상적으로 관찰되고, 단일 CAR에 의해 구동되는 것을 넘어선 전략의 실행이 필요하다. 이러한 점에서, Her2t는 EGFRt에 대한 보완적 선택 마커인 것으로 증명되었고, 각각의 선택 에피토프가 CAR에 부착되는 경우에 이중-CAR 발현 T 세포의 멀티소트 정제를 용이하게 할 수 있다. 단일 및 이중-CAR 발현 T 세포 사이에서의 유사한 세포독성 활성 및 이펙터 시토카인 생산은 Her2t 및 EGFRt의 개별 또는 연합 발현이 임의의 분명한 기능적 손상을 야기하지 않는다는 것을 증명한다.
헤르셉틴은 비오티닐화 또는 화학적 접합에 우호적이다. 상업적 용도를 위한 제제화에 따라, 헤르셉틴은 임상 등급 H2O 중에 재구성되고, 비오티닐화 후 Her2-특이적 고 친화도 결합을 보유한다. 이는, cGMP 등급 항비오틴 마이크로비드 (밀테니 바이오텍)의 유용성과 조합되어, CliniMACS 디바이스 상에서의 치료상 적절한 Her2t+ 세포의 선택을 가능하게 한다. Her2t에 대해 양성인 13.8%만큼 낮은 세포가 >90% 순도로 면역자기적으로 풍부화될 수 있는 것으로 증명되었다. 또한, 결과는 비오티닐화된 헤르셉틴이 T 세포 마커에 대해 표적화된 항체와 커플링되어 다중파라미터 표현형 분석을 허용하고, 치료제, CAR 발현 T 세포의 생체내 분포를 트래킹할 수 있다는 것을 증명한다.
CAR 면역요법의 치료 범위는 혈액계 종양의 치료와 함께 그의 초기 성공을 넘어 신속하게 확장되고 있다. 선천적으로 비-면역원성이고, T 세포 집단에 대해 고유하고, 선택에서 고도로 효율적인 대안적 유전자 태그가 분명히 필요하다. Her2t는 이들 상기 언급된 특징을 포괄하고, CAR 요법을 위해 사용되는 선택 에피토프의 레퍼토리를 다양화한다. 또한, Her2t는 멀티플렉스화 유전자 시스템을 갖춘 CAR 치료제의 연합 선택을 위한 중요한 후보이다.
Her2t를 사용하는 것의 이점은 그의 소형의 크기로 인한 것이다. 이와 같이 Her2t는 심지어 더 큰 구축물과 함께 패킹 효율의 이점을 갖는다. 시스템을 이용하기 위해서는 5kb 미만의 구축물을 갖는 것이 바람직하다. 일부 대안에서, 구축물의 크기는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 14.9 Kb, 또는 열거된 임의의 2개의 구축물 크기 사이의 임의의 크기이다. 15kb 초과의 구축물은 낮은 역가를 가질 위험이 있을 수 있기 때문에 작은 크기가 필요하다.
앞서 언급한 것은 본 발명의 예시이지, 그를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명은 하기 청구범위에 의해 정의되며, 청구범위의 등가물은 그에 포함되어야 한다. 본원에 언급된 모든 참고문헌 및 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
<표 1> CD19CAR
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
<표 2> 유니프롯 P10747 CD28 (서열식별번호: 3)
Figure pat00005
<표 3> 유니프롯 Q07011 4-1BB (서열식별번호: 4)
Figure pat00006
<표 4> 유니프롯 P20963 인간 CD3ζ 이소형 3 (서열식별번호: 5)
Figure pat00007
<표 5> 예시적인 힌지 영역 서열
Figure pat00008
<표 6> Her2t 핵산 (서열식별번호: 14) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 15)
Figure pat00009
<표 7> EGFRt 뉴클레오티드 (서열식별번호: 21) 및 아미노산 (서열식별번호: 22)
Figure pat00010
Figure pat00011
<표 8> 전장 Her2 이소형 1 (유니프롯 PO4626-1) (서열식별번호: 23)
Figure pat00012
<표 9> CD20CAR 핵산 (서열식별번호: 24) 및 폴리펩티드 (서열식별번호: 25)
Figure pat00013
CD20CAR 구축물 (CD28tm-41BB-제타-T2A-EGFRt)의 나머지는 CD19CAR-T2A-EGFRt 구축물과 같다.
SEQUENCE LISTING <110> Seattle Children's Hospital dba Seattle Children's Research Institute Jensen, Michael C. Johnson, Adam <120> TRANSGENE GENETIC TAGS AND METHODS OF USE <130> SCRI.066WO <150> 62/058,973 <151> 2014-10-02 <150> 61/977,751 <151> 2014-04-10 <150> 61/986,479 <151> 2014-04-30 <150> 62/089,730 <151> 2014-12-09 <150> 62/090,845 <151> 2014-12-11 <150> 62/088,363 <151> 2014-12-05 <160> 50 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19CAR DNA encoding a portion of modified IgG4 hinge region <400> 1 gacgtggagg agaatcccgg ccctagg 27 <210> 2 <211> 476 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 CAR <400> 2 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 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Ile 290 295 300 Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln 305 310 315 320 Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser 325 330 335 Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys 340 345 350 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 355 360 365 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 370 375 380 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 385 390 395 400 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 405 410 415 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 420 425 430 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 435 440 445 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly 450 455 460 Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly 465 470 475 <210> 3 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 domain <400> 3 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 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Her2t (truncated Her2 protein) <400> 15 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly 20 25 30 Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala 35 40 45 His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val 50 55 60 Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu 65 70 75 80 Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp 85 90 95 Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr 100 105 110 Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly 115 120 125 Val Val Phe Gly Ile Leu Ile 130 135 <210> 16 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic genetic tag <400> 16 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly 20 25 30 Ser Val Thr 35 <210> 17 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader sequence for protein localization <400> 17 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro 20 <210> 18 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of Her2 protein recognized by an antiHer2 antibody <400> 18 Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly 1 5 10 15 Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro 20 25 30 Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr 35 40 45 Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys 50 55 60 Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys 65 70 75 80 Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr 85 90 <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of Her2 transmembrane domain, the transmembrane domain of Her2 <400> 19 Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Val Val Phe Gly Ile Leu Ile Ile 20 <210> 20 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Her2 transmembrane domain as amino acids 653-675 <400> 20 Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly 1 5 10 15 Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro 20 25 30 Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr 35 40 45 Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys 50 55 60 Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys 65 70 75 80 Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val 85 90 95 Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu 100 105 110 Ile <210> 21 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encoding a truncated epidermal growth factor receptor <400> 21 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120 aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180 ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240 ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300 gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360 caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420 tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480 gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540 agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600 cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660 ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720 aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780 acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840 gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900 gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960 ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020 ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 1074 <210> 22 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated epidermal growth factor receptor <400> 22 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly 20 25 30 Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe 35 40 45 Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala 50 55 60 Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu 65 70 75 80 Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile 85 90 95 Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu 100 105 110 Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala 115 120 125 Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 130 135 140 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr 145 150 155 160 Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys 165 170 175 Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly 180 185 190 Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu 195 200 205 Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys 210 215 220 Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu 225 230 235 240 Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met 245 250 255 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala 260 265 270 His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val 275 280 285 Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His 290 295 300 Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro 305 310 315 320 Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala 325 330 335 Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly 340 345 350 Ile Gly Leu Phe Met 355 <210> 23 <211> 1255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full length Her2 isoform 1 human <400> 23 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45 Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 100 105 110 Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 115 120 125 Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser 130 135 140 Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln 145 150 155 160 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn 165 170 175 Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys 180 185 190 His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 195 200 205 Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys 210 215 220 Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys 225 230 235 240 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu 245 250 255 His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val 260 265 270 Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg 275 280 285 Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu 290 295 300 Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln 305 310 315 320 Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys 325 330 335 Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu 340 345 350 Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys 355 360 365 Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 370 375 380 Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe 385 390 395 400 Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro 405 410 415 Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg 420 425 430 Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu 435 440 445 Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly 450 455 460 Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val 465 470 475 480 Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr 485 490 495 Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His 500 505 510 Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys 515 520 525 Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys 530 535 540 Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys 545 550 555 560 Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys 565 570 575 Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp 580 585 590 Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu 595 600 605 Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln 610 615 620 Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys 625 630 635 640 Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser 645 650 655 Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly 660 665 670 Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg 675 680 685 Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly 690 695 700 Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu 705 710 715 720 Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys 725 730 735 Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile 740 745 750 Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu 755 760 765 Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg 770 775 780 Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu 785 790 795 800 Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg 805 810 815 Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly 820 825 830 Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala 835 840 845 Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe 850 855 860 Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp 865 870 875 880 Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg 885 890 895 Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val 900 905 910 Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala 915 920 925 Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro 930 935 940 Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met 945 950 955 960 Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe 965 970 975 Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu 980 985 990 Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu 995 1000 1005 Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu 1010 1015 1020 Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly 1025 1030 1035 1040 Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly 1045 1050 1055 Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg 1060 1065 1070 Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly 1075 1080 1085 Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His 1090 1095 1100 Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu 1105 1110 1115 1120 Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln 1125 1130 1135 Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro 1140 1145 1150 Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu 1155 1160 1165 Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val 1170 1175 1180 Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln 1185 1190 1195 1200 Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala 1205 1210 1215 Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala 1220 1225 1230 Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr 1235 1240 1245 Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 1255 <210> 24 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD20CAR DNA chimeric antigen receptor <400> 24 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60 gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120 atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 180 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 360 accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420 ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660 agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 720 gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 780 acggtcaccg tctcctca 798 <210> 25 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD20CAR sythetic construct <400> 25 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys 50 55 60 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe 100 105 110 Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp 245 250 255 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 265 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving linker T2A <400> 26 Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly 1 5 10 15 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain comprising a CDRL1 <400> 27 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain comprising CDRL2 <400> 28 Ser Arg Leu His Ser Gly Val 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain comprising CDRL3 <400> 29 Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain comprising CDRH1 <400> 30 Asp Tyr Gly Val Ser 1 5 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain comprising CDRH2 <400> 31 Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain comprising CDRH3 <400> 32 Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain comprising CDRL1 <400> 33 Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp 1 5 10 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain comprising CDRL2 <400> 34 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain comprising CDRL3 <400> 35 Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain comprising CDRH1 sequence, a synthetic humanized or human sequence <400> 36 Ser Tyr Asn Met His 1 5 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2, variable heavy chain comprising a synthetic humanized or human sequence <400> 37 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain comprising CDRH3, a synthetic humanized or human sequence <400> 38 Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val 1 5 10 <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker amino acids <400> 39 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 40 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Her2Domain IV and 7 amino acid linker <400> 40 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atcccatgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 120 gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 180 cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 240 ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 300 ggctgccccg ccgagcagag agccagcccg ttaacgggtg gaggcagcgg aggtggctcc 360 atcatctctg cggtggttgg cattctgctg gtcgtggtct tgggggtggt ctttgggatc 420 ctcatctga 429 <210> 41 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Her2Domain IV and 7 amino acid linker <400> 41 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly 20 25 30 Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala 35 40 45 His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val 50 55 60 Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu 65 70 75 80 Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp 85 90 95 Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile 115 120 125 Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile 130 135 140 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop 1 of Her2 protein, protein region, human protein <400> 42 Glu Ala Asp Gln Cys 1 5 <210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop 2 of Her2 protein, protein region, human protein <400> 43 Asp Pro Pro Phe 1 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop 3 of Her2 protein, protein region, human protein <400> 44 Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro 1 5 10 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker <400> 45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 46 <211> 1428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 CAR <400> 46 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120 gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180 aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240 cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300 gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360 ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420 ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc 480 cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540 gtgagctgga tccggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600 agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660 agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720 tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780 accagcgtga ccgtgagcag cgagagcaag tacggaccgc cctgcccccc ttgccctatg 840 ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg 900 gccttcatca tcttttgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 960 ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1020 gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc cgacgcccct 1080 gcctaccagc agggccagaa tcagctgtac aacgagctga acctgggcag aagggaagag 1140 tacgacgtcc tggataagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa gcctcggcgg 1200 aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1260 agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cggggcaagg gccacgacgg cctgtatcag 1320 ggcctgtcca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgccccca 1380 aggctcgagg gcggcggaga gggcagagga agtcttctaa catgcggt 1428 <210> 47 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4-Hinge <400> 47 gagagcaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36 <210> 48 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 hinge region <400> 48 ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcctccct cccaggaaga gatgaccaag 60 aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggacagc 180 gacggcagct tcttcctgta cagccggctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 240 aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 300 ctgagcctgt ccctgggcaa g 321 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4-Hinge <400> 49 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 hinge region <400> 50 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105

Claims (48)

  1. 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드이며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER2는 제외한 것인 단리된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, HER2 폴리펩티드가 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595 및 글루타민 624를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, HER2 폴리펩티드가 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인이 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 리더 펩티드가 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 트라스투주맙인 단리된 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 및 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는 단리된 핵산.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 트랜스진을 추가로 포함하는 단리된 핵산.
  11. 제10항에 있어서, 트랜스진이 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 항원 결합 도메인, 스페이서 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 1개의 자극 도메인을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 자기-절단 링커에 의해 제1항의 HER2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 연결된 것인 단리된 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 자기-절단 링커가 L E G G G E G R G S L L T C G의 서열 (서열식별번호: 26)을 갖는 T2A 링커인 단리된 핵산.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  16. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 25 (CD20CAR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서, CD8 T 세포, CD4 T 세포, CD4 나이브 T 세포, CD8 나이브 T 세포, CD8 중심 기억 세포, CD4 중심 기억 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 숙주 세포.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 자가인 단리된 숙주 세포.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 특이적인 단리된 숙주 세포.
  21. 제17항 내지 제20항, 제45항 및 제46항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  22. a) 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 숙주 세포에 도입시키는 단계; 및
    b) 숙주 세포를 적어도 1종의 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 단계
    를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 성장 인자가 IL-15, IL-7, IL-21, IL-2, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, Her2t 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 배지에서 배양하기 전에 세포를 선택하는 것인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 세포를 Her2의 도메인 IV에 결합하는 항체를 사용하여 선택하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 항체가 트라스투주맙인 방법.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 유전자 태그에 연결된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2 단리된 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 제2 유전자 태그를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 제2 유전자 태그가 EGFRt를 포함하는 것인 방법.
  31. 유효량의 제21항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 종양 항원을 발현하는 암을 갖는 환자를 치료하는 방법이며, 여기서 조성물의 세포는 암 세포 상에 발현된 종양 항원 및 유전자 태그에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 것인 방법.
  32. 세포 상의 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 종양 항원을 갖는 암을 치료하기 위한 제21항의 조성물의 용도.
  33. 유효량의 제21항의 조성물 및 유전자 태그에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는 종양 항원을 발현하는 암을 갖는 환자를 치료하는 방법이며, 여기서 조성물의 세포는 암 세포 상에 발현된 종양 항원 및 유전자 태그에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 것인 방법.
  34. 조성물의 세포 상의 키메라 항원 수용체 및 유전자 태그에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 인식되는 종양 항원을 갖는 암을 치료하기 위한 제21항의 조성물의 용도.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 헤르셉틴 또는 에르비툭스인 방법 또는 용도.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 세포독성제에 접합된 것인 방법 또는 용도.
  37. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 검출가능하게 표지된 것인 방법 또는 용도.
  38. 막횡단 도메인에 연결된 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인의 폴리펩티드에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드이며, 여기서 단리된 폴리펩티드는 Her2의 도메인 IV 내의 에피토프에 결합하는 항체에 특이적으로 결합하고, 여기서 단리된 폴리펩티드는 전장 성숙 HER은 제외하며, 여기서 서열식별번호: 23의 아미노산 563 내지 652의 서열을 갖는 HER2 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 GGGSGGGS (서열식별번호: 45)를 포함하는 서열에 의해 막횡단 도메인에 연결된 것인 단리된 폴리펩티드.
  39. 제38항에 있어서, HER2 폴리펩티드가 서열식별번호: 23의 아미노산 글루탐산 580, 아스파르트산 582, 아스파르트산 592, 페닐알라닌 595 및 글루타민 624를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  40. 제39항에 있어서, HER2 폴리펩티드가 서열식별번호: 23의 아미노산 563-652를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인이 서열식별번호: 23의 아미노산 653-675를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 발현을 제공하는 리더 펩티드를 추가로 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  43. 제42항에 있어서, 리더 펩티드가 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 트라스투주맙인 단리된 폴리펩티드.
  45. 제17항에 있어서, 전구체 T 세포인 숙주 세포.
  46. 제17항에 있어서, 조혈 줄기 세포인 숙주 세포.
  47. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 전구체 T 세포인 숙주 세포.
  48. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포인 숙주 세포.
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