CN117210457A - 具有启动子活性的核酸及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及遗传学、基因疗法和分子生物学领域。更具体地，本发明涉及具有启动子活性的核酸(变体)、基于其的表达盒和载体、用于生产靶产物或表达载体的宿主细胞。

Description

具有启动子活性的核酸及其用途
技术领域
本申请涉及遗传学、基因疗法和分子生物学领域。更具体地，本发明涉及具有启动子活性的核酸(变体)、基于其的表达盒和载体、用于生产靶产物或表达载体的宿主细胞。
背景技术
启动子是一种DNA元件，其促进与启动子可操作地连接的多核苷酸的转录。启动子也可以是启动子/增强子元件的一部分。尽管启动子和增强子元件之间的物理边界并不总是清楚的，启动子通常是指核酸分子上的位点，RNA聚合酶和/或任何相关因子结合到该位点，并且在该位点启动转录。增强子在时间上以及空间上增强启动子活性。已知许多启动子在广泛的细胞类型中具有转录活性。启动子可以分为两类，组成型发挥功能的启动子和通过诱导或去阻抑来调节的启动子。这两类都适用于蛋白质表达。用于在真核细胞中(并且特别是在哺乳动物细胞中)高水平生产多肽的启动子应该是强的，并且优选在广泛的细胞类型中是有活性的。能够在许多细胞类型中驱动表达的强组成型启动子是本领域公知的，并因此在此不必详细描述它们。
启动子和/或增强子的实例是衍生自逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、CAG启动子以及强哺乳动物启动子(例如TTR启动子或EF1-α启动子)的启动子和/或增强子。
根据亚型，CMV启动子的长度为589-1650bp(Changyu Zheng ET ALL.,All HumanEF1αPromoters Are Not Equal：Markedly Affect Gene Expression in Constructsfrom Different Sources,Int J Med Sci.2014；11(5):404-408,doi:10.7150/ijms.8033)。CAG启动子(CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白)的长度为868bp(Nieuwenhuis,B.,Haenzi,B.,Hilton,S.等人.Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract:comparison of fourpromoters.Gene Ther.2021；28:56–74,https://doi.org/10.1038/s41434-020-0169-1)。
所有上述启动子的长度都超过588bp。表达盒中长度超过588bp的启动子不是使用多种表达载体表达大转基因的最佳选择。
因此，需要产生短启动子。
许多启动子(包括CMV启动子)不是组织特异性的，即，它们不提供治疗性转基因在某些器官的细胞中的选择性表达，当用于产生基因疗法产物时，这个事实是这些启动子的明显缺点。
因此，需要产生组织特异性启动子，其提供治疗性转基因在某些器官的细胞中的选择性表达。
发明内容
本发明的作者惊奇地发现具有选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的核酸具有启动子活性。具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的启动子的长度在123-252bp的范围内。此外，本发明的作者惊奇地发现具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的启动子在肝细胞来源的细胞中具有组织特异性启动子活性。
定义和一般方法
除非本文另有定义，否则与本发明结合使用的所有技术和科学术语将具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。
此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数术语，并且复数术语应包括单数术语。通常，本文所述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药物化学以及蛋白质和核酸的杂交和化学的本分类和方法是本领域技术人员公知的并且广泛用于本领域。酶反应和纯化方法根据制造商的指导方针进行，如本领域常见的，或如本文所述。
如本说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另有规定，否则词语“包括(include)”和“包含(comprise)”或其变体(例如“包括(includes)”、“包括(including)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”)将被理解为暗示包括所述的整体或整体组，但不排除任何其它整体或整体组。
核酸分子
术语“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acidsequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本说明书中可互换使用，是指核苷酸的精确序列，其经修饰或未经修饰，确定核酸的片段或区，含有或不含非天然核苷酸，并且是双链DNA或RNA、单链DNA或RNA、或所述DNA的转录产物。
如本说明书中所用，通过非限制性实例，多核苷酸包括通过本领域可找到的任何方法获得的所有核酸序列，作为非限制性实例，包括重组方法，即，使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，和通过合成方法。
本发明不涉及其天然染色体环境中(即天然状态下)的核苷酸序列，这也应包括在此。本发明的序列已经被分离和/或纯化，即，它们被直接或间接取样，例如通过复制，从而其环境已经至少部分地被修饰。因此，本文还应提及通过重组遗传学(例如使用宿主细胞)获得的或通过化学合成获得的分离的核酸。
除非另有指示，否则术语核苷酸序列包括其互补序列。因此，具有特定序列的核酸应理解为包括其互补链及其互补序列的核酸。
载体
如本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。此外，术语“载体”在本文中是指能够转运核酸的重组病毒颗粒。
如本说明书中所用，术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
具体实施方式
核酸
一方面，本发明涉及具有启动子活性并且包括选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的核酸。
在本发明的一些实施方案中，核酸是分离的核酸。
“分离的”核酸分子是从至少一种核酸分子-杂质中鉴定和分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于其在天然条件下所发现的形式或集合。因此，分离的核酸分子不同于在天然条件下存在于细胞中的核酸分子。
具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的所有核酸都具有启动子活性。
具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的所有启动子在肝细胞来源的细胞中具有组织特异性启动子活性。
具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的所有启动子都是强启动子，并且其作为表达载体的一部分的使用导致靶蛋白的生产和活性水平的增加。
表达盒。表达载体。
一方面，本发明涉及包含具有启动子活性的任何上述核酸的表达盒。
如本文所用，术语“表达的盒”或“表达盒”特别指在适当的环境下能够触发编码目的多肽的多核苷酸表达的DNA片段，所述目的多肽的序列包括在所述表达盒中。当将表达盒引入宿主细胞时，表达盒尤其能够参与细胞机制以将编码目的多肽的多核苷酸转录成RNA，然后通常进一步加工RNA并最终翻译成目的多肽。表达盒可以包含在表达载体中。
在一些实施方案中，表达盒在5'-末端至3'-末端方向包括以下元件：
左手(第一)ITR(反向末端重复)；
具有启动子活性的上述核酸中的任一种；
转基因；
聚腺苷酸化信号；
右手(第二)ITR。
表达盒的上述结构元件彼此可操作地连接。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸(或多肽)元件功能关系地连接。当核酸与另一核酸序列在功能关系条件下存在时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果转录调节序列影响编码序列的转录，则转录调节序列可操作地连接至所述编码序列。术语“可操作地连接”是指连接的DNA序列通常是连续的，并且在需要连接两个蛋白编码区的情况下，也是连续的并存在于阅读框中。
在一些实施方案中，表达盒包括具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列的左手(第一)ITR。
在一些实施方案中，表达盒包括具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，表达盒包括具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的右手(第二)ITR。
在一些实施方案中，表达盒在5'-末端至3'-末端方向包括以下元件：
具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列的左手(第一)ITR(反向末端重复)；
具有选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列的启动子；
转基因；
具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的聚腺苷酸化信号；
具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的右手(第二)ITR。
在一些实施方案中，表达盒包括编码蛋白质或小抑制性核酸的转基因。
在一些实施方案中，表达盒包括编码选自因子VIII或其功能变体、因子IX或其功能变体、SMN1蛋白(存活运动神经元蛋白)、SARS-CoV2的RBD-S多肽或治疗性抗体的蛋白质的转基因。
一方面，本发明涉及表达载体，其包括具有启动子活性的任何上述核酸或任何上述表达盒。
在本发明的一些实施方案中，载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有复制来源的细菌位点的细菌载体和附加型载体)。在本发明的进一步的实施方案中，载体(例如非附加型载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒(例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒)、粘粒、YAC、EBV等。DNA分子可以插入载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节DNA的转录和翻译的预期功能。可以选择与所用表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。可以通过标准方法(例如连接互补限制性位点，或如果不存在限制性位点，则进行平端连接)将DNA分子引入表达载体中。
在本发明的一些实施方案中，载体是质粒、AAV、腺病毒或慢病毒。
在本发明的一些实施方案中，载体是质粒，即，其中可以插入另外的DNA片段的环状双链DNA。
在本发明的一些实施方案中，载体是病毒(表达)载体，其中可以将另外的DNA片段插入到病毒基因组中。
在一些实施方案中，表达载体是重组腺相关病毒(AAV)。
在一些实施方案中，AAV选自以下AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、rAAV.rh8、rAAV.rhlO、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-l、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2.6、rAAV2.8、rAAV2.9、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在本发明的一些实施方案中，除了启动子之外，载体或盒还可以包括其它表达控制序列。如本说明书中使用的术语“其它表达控制序列”是指实现插入它们的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。本领域技术人员应当理解，表达载体或盒的设计(包括表达控制序列的选择)可以取决于例如待转化宿主细胞类型的选择、所需的蛋白质表达水平等因素。除了启动子之外，表达控制序列包括相应的转录起始、终止和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和当需要时，增强蛋白质分泌的序列。这样的控制序列的性质根据宿主生物而不同；在原核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点以及转录终止序列；在真核生物中，这样的控制序列通常包括启动子和转录终止序列。表达控制序列包括至少所有其存在对于表达和加工是重要的组分。
除了上述基因和表达控制序列之外，根据本发明的重组表达载体可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制来源)和可选择的标记基因。可选择的标记基因促进选择已经引入载体或盒的宿主细胞。
在本发明的一个实施方案中，表达载体涉及包含侧翼为细小病毒序列或反向末端重复(ITR)序列的一个或多个目的多核苷酸序列、目的基因或转基因的载体。
本发明的盒和载体都不包含编码腺相关病毒的非结构蛋白(Rep)和结构蛋白(Cap)的基因的核苷酸序列。
宿主细胞
一方面，本发明涉及用于生产靶产物或用于生产任何一种上述表达载体的宿主细胞，其包含具有启动子活性的上述核酸的任一种。
如本文所用的术语“宿主细胞”是指已经引入根据本发明的重组表达载体或表达盒的细胞。应当理解，“宿主细胞”不仅指特定的受试细胞，而且还指这样的细胞的后代。由于突变或环境影响，修饰可能发生在随后的世代中，这样的后代实际上可能与亲本细胞不同；然而，这样的细胞仍然包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
根据本发明的表达载体或盒可以用于转染哺乳动物细胞、植物细胞、细菌或酵母宿主细胞。转染可以通过将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知的方法进行。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法是本领域公知的并且包括葡聚糖-介导的转染、阳离子聚合物-核酸复合物转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺-介导的转染、原生质体融合、多核苷酸在脂质体中的封装，以及DNA向细胞核中的直接显微注射。此外，核酸分子可以通过病毒(表达)载体引入哺乳动物细胞。
用作转染宿主的哺乳动物细胞系是本领域公知的，并且包括许多可获得的永生化细胞系。这些细胞系包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、FreeStyle 293细胞(Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞性癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、SK-HEP1、HUH7、Hep-RG和许多其它细胞系。通过确定哪些细胞系具有高表达水平并提供所生产的蛋白质的必要特征来选择细胞系。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9或Sf21细胞。当将根据本发明的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段时间来生产靶蛋白，所述时间足以在宿主细胞中表达靶蛋白，或者更优选地，将靶蛋白分泌到培养宿主细胞的培养基中。可以使用标准蛋白质纯化技术从培养基中分离靶蛋白。植物宿主细胞包括例如烟草属、拟南芥属、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括埃希氏菌属和链霉菌属物种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。
上述宿主细胞不涉及使用人胚胎生产的宿主细胞。
上述宿主细胞不涉及通过修饰人种系细胞的遗传完整性而生产的宿主细胞。
附图说明
图1是显示在对应于SEQ ID NO:1和2的核酸序列的启动子控制下表达EGFP报告蛋白的细胞的荧光比例增加的图。
转染后表达EGFP的细胞的比例：
1-具有EGFP转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-具有EGFP转基因并补充有巨细胞病毒(CMV)病毒启动子区的表达盒(对照)；
3-在对应于SEQ ID NO:2的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
4-在对应于SEQ ID NO:1的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒。
图2是显示在对应于SEQ ID NO:3-7和SEQ ID NO:11-14的核酸序列的启动子控制下表达EGFP报告蛋白的细胞的荧光比例增加的图。
转染后表达EGFP的细胞的比例：
1-具有EGFP转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-在对应于SEQ ID NO:4的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
3-在对应于SEQ ID NO:5的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
4-在对应于SEQ ID NO:6的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
5-在对应于SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
6-在对应于SEQ ID NO:13的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
7-在对应于SEQ ID NO:14的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
8-在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
9-在对应于SEQ ID NO:12的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
10-在对应于SEQ ID NO:3的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒。
图3是显示在对应于SEQ ID NO:8-10和15的核酸序列的启动子控制下表达EGFP报告蛋白的细胞的荧光比例增加的图。
转染后表达EGFP的细胞的比例：
1-具有EGFP转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-在对应于SEQ ID NO:8的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
3-在对应于SEQ ID NO:10的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
4-在对应于SEQ ID NO:9的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
5-在对应于SEQ ID NO:15的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒。
图4是显示在对应于SEQ ID NO:3-7和SEQ ID NO:11-14的核酸序列的启动子控制下表达EGFP报告蛋白的细胞的荧光强度增加的图。
转染后表达EGFP的细胞的荧光强度：
1-具有EGFP转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-在对应于SEQ ID NO:4的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
3-在对应于SEQ ID NO:5的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
4-在对应于SEQ ID NO:6的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
5-在对应于SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
6-在对应于SEQ ID NO:13的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
7-在对应于SEQ ID NO:14的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
8-在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
9-在对应于SEQ ID NO:12的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
10-在对应于SEQ ID NO:3的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒。
图5是显示在对应于SEQ ID NO:8-10和15的核酸序列的启动子控制下表达EGFP报告蛋白的细胞的荧光强度增加的图。
转染后表达EGFP的细胞的荧光强度：
1-具有EGFP转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-在对应于SEQ ID NO:8的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
3-在对应于SEQ ID NO:10的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
4-在对应于SEQ ID NO:9的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
5-在对应于SEQ ID NO:15的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒。
图6是显示在使用表现出启动子活性并对应于SEQ ID NO:3、11和14的序列的核酸时凝固蛋白的生产水平增加的图。
转染时凝固蛋白的生产水平：
1-具有凝固因子转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:3的核酸序列的启动子控制下的表达盒；
3-其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下的表达盒；
4-其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:14的核酸序列的启动子控制下的表达盒。
图7是显示在使用表现出启动子活性并对应于SEQ ID NO:3、11和14的序列的核酸时凝固蛋白的活性水平增加的图。
转染时凝固蛋白的活性水平：
1-具有凝固因子转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:3的核酸序列的启动子控制下的表达盒；
3-其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下的表达盒；
4-其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:14的核酸序列的启动子控制下的表达盒。
图8是在Huh7和U87细胞系上新生产的序列的组织特异性的测量的图，其显示在对应于SEQ ID NO:3-7和SEQ ID NO:11-14的核酸序列的启动子控制下表达EGFP报告蛋白的细胞的比例增加。
转染后表达EGFP的细胞的比例：
1-具有EGFP转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-在对应于SEQ ID NO:4的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
3-在对应于SEQ ID NO:5的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
4-在对应于SEQ ID NO:6的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
5-在对应于SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
6-在对应于SEQ ID NO:13的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
7-在对应于SEQ ID NO:14的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
8-在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
9-在对应于SEQ ID NO:12的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
10-在对应于SEQ ID NO:3的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒。
图9是在Huh7、HepG2和HEK293细胞系上新生产的序列的组织特异性的测量的图，其显示在对应于SEQ ID NO:7和11的核酸序列的启动子控制下表达EGFP报告蛋白的细胞的比例增加。
转染后表达EGFP的细胞的比例：
1-具有EGFP转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-在对应于SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
3-在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒。
图10是在CHO细胞系上生产的序列的组织特异性的测量的图，其显示在对应于SEQID NO:1和2的核酸序列的启动子控制下表达EGFP报告蛋白的细胞的荧光强度增加。
转染后表达EGFP的细胞的荧光强度：
1-具有EGFP转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-具有EGFP转基因并补充有巨细胞病毒(CMV)病毒启动子区的表达盒(对照)；
3-在对应于SEQ ID NO:2的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
4-在对应于SEQ ID NO:1的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒。
图11是在HepG2细胞系上生产的序列的组织特异性的测量的图，其显示在对应于SEQ ID NO:1和2的核酸序列的启动子控制下表达EGFP报告蛋白的细胞的荧光强度增加。
转染后表达EGFP的细胞的荧光强度：
1-具有EGFP转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-具有EGFP转基因并补充有巨细胞病毒(CMV)病毒启动子区的表达盒(对照)；
3-在对应于SEQ ID NO:2的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
4-在对应于SEQ ID NO:1的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒。
图12是在Huh7和U87细胞系上生产的序列的组织特异性的测量的图，其显示在对应于SEQ ID NO:3-7和SEQ ID NO:11-14的核酸序列的启动子控制下表达EGFP报告蛋白的细胞的荧光强度增加。
转染后表达EGFP的细胞的荧光强度：
1-具有EGFP转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-在对应于SEQ ID NO:4的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
3-在对应于SEQ ID NO:5的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
4-在对应于SEQ ID NO:6的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
5-在对应于SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
6-在对应于SEQ ID NO:13的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
7-在对应于SEQ ID NO:14的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
8-在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
9-在对应于SEQ ID NO:12的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
10-在对应于SEQ ID NO:3的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒。
图13是在Huh7、HepG2和HEK293细胞系上生产的序列的组织特异性的测量的图，其显示在对应于SEQ ID NO:7和11的核酸序列的启动子控制下表达EGFP报告蛋白的细胞的荧光强度增加。转染后表达EGFP的细胞的荧光强度：
1-具有EGFP转基因但没有启动子区的表达盒(对照)；
2-在对应于SEQ ID NO:7的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒；
3-在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下具有EGFP转基因的表达盒。
图14是显示当在对应于SEQ ID NO:3、8、11和14的启动子区控制下递送基于AAV的表达载体形式的包含凝固因子序列的表达盒时凝固蛋白生产水平增加的图。
转导时凝固蛋白的生产水平：
1-包含具有凝固因子转基因但没有启动子区的盒的表达载体(对照)；
2-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:8的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体；
3-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体；
4-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:14的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体；
5-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:3的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体；
图15是显示当在对应于SEQ ID NO:3、8、11和14的启动子区控制下递送基于AAV的表达载体形式的包含凝固因子序列的表达盒时凝固蛋白活性水平增加的图。
转导时凝固蛋白的活性水平：
1-包含具有凝固因子转基因但没有启动子区的盒的表达载体(对照)；
2-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:8的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体；
3-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体；
4-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:14的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体；
5-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:3的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体；
图16是显示当在对应于SEQ ID NO:8和11的启动子区控制下递送基于rAAV5或rAAV6的表达载体形式的包含凝固因子序列的表达盒时凝固蛋白生产水平增加的图。
转导时凝固蛋白的生产水平：
1-包含具有凝固因子转基因但没有启动子区的盒的表达载体(对照)；
2-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体；
3-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:8的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体。
图17是显示当在对应于SEQ ID NO:8和11的启动子区控制下递送基于rAAV5或rAAV6的表达载体形式的包含凝固因子序列的表达盒时凝固蛋白活性水平增加的图。
转导时凝固蛋白的活性水平：
1-包含具有凝固因子转基因但没有启动子区的盒的表达载体(对照)；
2-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体；
3-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:8的核酸序列的启动子控制下的盒的表达载体。
图18是显示当作为基于AAV的表达载体体内递送至В6.129S-F8tm1Smoc小鼠时在对应于SEQ ID NO:8和11的核酸的启动子区控制下凝固因子蛋白水平增加的图。
注射后动物血浆中凝固因子蛋白的水平：
1-没有AAV的对照溶液(阴性对照)。
2-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:8的核酸序列的启动子控制下的盒的基于AAV的表达载体。
3-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下的盒的基于AAV的表达载体。
图19是显示当作为基于AAV的表达载体体内递送至В6.129S-F8tm1Smoc小鼠时在对应于SEQ ID NO:8和11的核酸的启动子区控制下凝固因子的活性水平增加的图。
注射后动物血浆中凝固因子蛋白的水平：
1-没有AAV的对照溶液(阴性对照)。
2-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:8的核酸序列的启动子控制下的盒的基于AAV的表达载体。
3-包含其中凝固因子转基因在对应于SEQ ID NO:11的核酸序列的启动子控制下的盒的基于AAV的表达载体。
实施例
提供以下实施例以更好地理解本发明。这些实施例仅用于说明的目的，而不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文。尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例的方式相当详细地描述了前述发明，本领域普通技术人员根据本发明的教导将容易显而易见的是，在不背离所附实施方案的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。
材料和一般方法
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如在Sambrook,J.等人,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,2012中所述。根据制造商的方案使用分子生物学试剂。简言之，生产质粒DNA用于在选择性抗生素压力下生长的大肠杆菌细胞中进一步操作，使得质粒不在细胞群中丢失。我们使用商业试剂盒从细胞分离质粒DNA，测量浓度，并将其用于通过限制性内切核酸酶处理或PCR扩增进行克隆。使用连接酶将DNA片段彼此连接，并转化到细菌细胞中，用于克隆的选择和进一步的生产。所有所得基因构建体通过限制性图谱和完全Sanger测序来确认。
DNA序列测定
通过Sanger测序测定DNA序列。在Snapgene Viewer 4.2或更高版本中分析DNA和蛋白质序列并处理序列数据，用于序列产生、作图、分析、注释和说明。
培养细胞培养物
实验使用HEK293(人胚胎肾克隆293细胞系)、HUH7(人肝细胞癌细胞系)、U87-MG(Uppsala 87恶性神经胶质瘤细胞系)、CHO-K1-S(中国仓鼠卵巢细胞系)和HepG2(人肝细胞癌细胞系)。将用于生产AAV的悬浮的HEK293细胞在标准条件下在37℃和5％ CO2下在不含FBS和抗生素的完全培养基上培养。用于测试EGFP和AAV产物表达功效的粘附HEK293、HUH7和HepG2细胞在标准条件下在37℃和5％CO2下在补充有10％FBS、抗生素/抗真菌剂的完全DMEM培养基上培养。用于组织特异性测试的粘附U87-MG和CHO-K1-S细胞在标准条件下在37℃和5％ CO2下在分别补充有10％ FBS、抗生素/抗真菌剂的完全EMEM营养培养基和补充有5％ FBS、抗生素/抗真菌剂的DMEM/F12培养基上培养。
在达到80-90％汇合时传代培养细胞。用TrypLE选择酶(10x)解离细胞单层。使用锥虫蓝染色和使用自动计数II计数器的一次性细胞计数室评估细胞活力。
细胞培养物的转染
为了评估转染时新启动子变体的功能活性，我们使用包含表达盒的质粒来表达EGFP和凝固因子的转基因的各种变体。将模型细胞系以10000个细胞/cm2的密度预接种到12孔板的孔中。一天后，我们加入相等拷贝数的测试和对照样品的质粒DNA，作为与Lipofectamine3000的复合物的一部分。对于基于编码绿色荧光蛋白(EGFP)的基因的转基因变体，在转染后第3天，我们通过流式细胞术测定表达EGFP的细胞的比例和细胞荧光强度。对于基于凝固因子的转基因变体，在转染后第7天，我们通过ELISA和显色测定来测定培养基中凝固蛋白的含量及其活性。完整的模型细胞系用作阴性对照。
AAV重组载体的病毒颗粒的产生和纯化
为了生产包含基于凝固因子的转基因的重组AAV病毒颗粒，我们使用用3种质粒转染的HEK293生产细胞：
·包含用于表达凝固因子的AAV表达盒的质粒；
·包含血清型AAV6/AAV5的Cap基因和血清型AAV2的Rep基因的质粒。使用可变阅读框，每个基因编码若干蛋白质产物；
·包含AAV衣壳组装和包装所需的Ad2腺病毒基因的质粒。
转染后72小时，裂解细胞，然后使用过滤、层析法和超离心方法纯化和浓缩病毒颗粒。病毒颗粒的滴度通过定量PCR用对重组病毒基因组区特异的引物和样品测定，并表示为每1ml病毒基因组的拷贝数。
细胞培养物的转导
将HUH7细胞系以10,000个细胞/cm2的密度预接种到12孔板的孔中。在细胞附着于粘附底物后，以500,000vg/细胞的MOI引入AAV制剂。在转导后第7天，通过ELISA和显色测定来测定培养流体中凝固蛋白的水平和活性。在6个独立的实验中进行涉及评估培养流体中凝固蛋白的水平和活性的研究。完整细胞用作阴性对照。
使用流式细胞术测定表达EGFP报告蛋白的细胞的比例和细胞荧光强度
为了评估EGFP报告蛋白在流式细胞荧光计上的表达，在转染后第3天，将预先制备的缓冲液和碘化丙啶(PI)的混合物以1μl PI的速率以每1ml缓冲液10μg/ml的浓度加入到细胞沉淀中。将未用PI染色的和未用质粒DNA(同种型)转染的细胞转移到96孔微板的孔中以评估补偿，将缓冲液/PI混合物加入到微板的剩余孔中以测量具有PI的对照和样品。将细胞样品转移到微板后，在无光条件下孵育5分钟。孵育后，将具有测试细胞样品的微板加载到流式细胞仪中用于分析。流式细胞术用于测定包含EGFP的细胞的百分比，以及荧光信号的平均强度。每个样品以三个技术重复(分析事件的数目不小于10,000)测量。
通过ELISA测定凝固因子蛋白的量
通过非竞争性固相酶免疫测定(ELISA)的夹心法评估HUH7细胞用靶候选物转染和转导后培养流体中凝固因子蛋白的含量。简言之，将稀释在商业缓冲液中的培养流体样品转移到用一级凝固因子特异性抗体敏化的96孔微板。相同的微板装载用于绘制校准曲线的标准品，对照。将板在37℃的温度下孵育1小时。在引入生物素化的抗体、辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白溶液和四甲基联苯胺(TMB)底物之前，用缓冲液洗涤微板孔。接着，引入具有生物素化的检测凝固因子特异性抗体的溶液，并将微板在37℃的温度下孵育30分钟。将链霉抗生物素蛋白辣根过氧化物酶缀合物溶液加入到所得复合物中，并将板在37℃的温度下孵育30分钟。引入TMB溶液以显现酶反应。在达到所需程度的染色强度后，将终止溶液加入到所有孔中以终止反应。停止反应后，测量光密度。通过标准样品校准曲线将显色染色标准化，考虑预稀释因子，来测量测试样品中凝固因子的浓度。
通过ELISA测定凝固因子蛋白的活性水平
使用显色测定评估HUH7细胞用靶候选物和对照样品转染和转导后培养基中凝固因子蛋白的活性。该测定基于这样的事实，即，在钙离子、磷脂和因子IXa存在下，因子X转化为活化形式Xa，因子VIII在反应中起辅因子的作用，并且因子X活化的速率与因子VIII的水平线性相关。简言之，将在商业缓冲液中稀释的培养基样品、用于绘制校准曲线的标准品和对照物转移至96孔微板。接着，使样品在37℃的温度下经受孵育3分钟，接着将包含因子IXa、因子X、凝血酶、СаCl2和磷脂的因子试剂溶液引入到微板孔中。然后，在37℃的温度下将微板孵育4分钟，接着将显色底物溶液S-2765+I-2581引入孔中。然后将板在37℃的温度下孵育7分钟。在达到所需的染色强度程度后，将20％乙酸溶液加入到所有孔中以终止反应。然后测量微板孔中溶液的光密度。通过标准样品校准曲线将显色染色标准化，考虑初步稀释，测量测试样品中凝固因子的活性。
实验室动物的体内研究
В6.129S-F8tm1Smoc凝固因子缺陷小鼠(年龄6-8周的雄性)用于实验。通过单次静脉内注射到尾静脉中将产物施用于动物。将不含AAV的缓冲液溶液施用于阴性对照组动物。在注射当天，在施用产物之前，然后在引入表达载体之后第70天，进行血浆取样。所有动物测试都完全遵循ARRIVE指导方针进行。
统计数据分析
结果指示平均值±标准偏差(SD)，单向方差分析(ANOVA)随后Dunnett's多重配对比较用于比较实验结果，并且确定它们是统计学显著的。
实施例1。
为了增加目的基因的表达水平，在设计遗传构建体时，我们使用一组基于转录因子结合位点开发的启动子(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)。这些核苷酸序列作为表达盒的一部分，通过转染模型细胞系(HEK293、HUH7、U87-MG、CHO-K1-S和HepG2)在体外测试，所述表达盒由对应于SEQ ID NO:16的序列的左手(第一)ITR(反向末端重复)、选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的启动子、目的基因、聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:17)、右手(第二)ITR(SEQ ID NO:18)组成，其中目的基因可以是绿色荧光蛋白(GFP)序列或凝固级联蛋白序列。将包含左手(第一)ITR(SEQ ID NO:16)、目的基因、聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:17)、右手(第二)ITR(SEQ ID NO:18)的表达盒用作对照。图1和图2还显示包含补充有组成型巨细胞病毒(CMV)病毒启动子的表达盒的相同元件的另外的对照。
当绿色荧光蛋白序列用作目的基因时，作为启动子区的SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的所有核酸提供表达EGFP报告蛋白的细胞的比例增加(图1-3)和EGFP荧光强度增加(图4-5)。当使用凝固因子序列作为目的基因时，我们还观察到与使用不含启动子区的目的基因的核酸相比，凝固蛋白的生产(图6)和活性(图7)水平增加。因此，核酸(SEQ ID NO:1-15)在转染模型细胞系(Huh7、CHO-K1-S和HepG2)时，作为具有各种转基因变体的表达盒的一部分表现出启动子活性。
实施例2。
为了测量具有启动子活性的开发的核酸序列(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)的组织特异性，在模型细胞系(HEK293、HUH7、U87-MG、CHO-K1-S和HepG2)上转染时，体外测试核苷酸序列，作为由对应于SEQ ID NO:16的序列的左手(第一)ITR(反向末端重复)、启动子(SEQ ID NO:1-15)、目的基因、聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:17)、右手(第二)ITR(SEQ ID NO:18)组成的表达盒的一部分，其中目的基因可以由EGFP蛋白序列或编码凝固级联蛋白的核酸表示。包含左手(第一)ITR(SEQ ID NO:16)、目的基因、聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:17)、右手(第二)ITR(SEQ ID NO:18)的表达盒用作对照。此外，在图8、10、11和12中，使用包含补充有巨细胞病毒(CMV)病毒启动子区的表达盒的相同元件的对照。
与使用不含启动子区的核酸相比，为启动子区的SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的所有核酸提供表达EGFP报告蛋白的细胞的比例增加(图8和9)以及在肝细胞来源细胞系中EGFP荧光强度增加(图10-13)。因此，核酸(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)在肝细胞来源的细胞中具有组织特异性启动子活性。
实施例3。
我们生产了基于AAV的表达载体，其在SEQ ID NO:8、11和14的核酸的控制下包含编码转基因(凝固因子)的表达盒，所述表达盒具有启动子活性。通过体外转导Huh7细胞检查所述表达载体。使用不含启动子区的基于AAV的表达载体作为对照。
与使用不含启动子区的表达载体相比，使用包含SEQ ID NO:8、11和14的核酸的表达载体导致凝固蛋白的生产(图14)和活性(图15)水平增加。与对照相比，使用包含SEQ IDNO:8和11的核酸的基于不同血清型的AAV的表达载体表现出凝固蛋白的生产(图16)和活性(图17)水平增加。结果对应于转染Huh7细胞时获得的数据(图6和7)。因此，在模型细胞系转导时，核酸(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)在作为具有各种转基因变体的表达载体递送时表现出启动子活性。
实施例4。
为了测量作为体内表达载体一部分的SEQ ID NO:8和11的核酸的启动子活性，我们生产了基于AAV的产物，其中转基因是在SEQ ID NO:8或11的核酸的控制下的凝固因子。接着，将测试产物施用于В6.129S-F8tm1Smoc实验室小鼠。用于稀释病毒产物的不含AAV颗粒的缓冲液用作阴性对照。AAV产物通过静脉内流体注射到尾静脉的方式一次性施用于动物。在注射当天施用产物前(第0天)，然后在施用后第70天进行血浆取样。
体内研究显示，在使用在SEQ ID NO:8和11的核酸的控制下包含凝固因子基因序列的测试药物的情况下，在施用产物后第70天，在动物血浆中观察到凝固因子及其活性的量显著增加(图18-19)。因此，当作为基于AAV的表达载体在体内递送时，SEQ ID NO:8和11的核酸表现出启动子活性。

Claims (8)

1.具有启动子活性的核酸，其包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的核苷酸序列。
2.表达盒，其包含根据权利要求1所述的核酸分子和可操作地连接的转基因。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其中所述转基因编码蛋白质或小抑制性核酸。
4.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述转基因编码选自因子VIII或其功能变体、因子IX或其功能变体、SMN1蛋白(存活运动神经元蛋白)、SARS-cov2的RBD-S多肽或治疗性抗体的蛋白质。
5.表达载体，其包含根据权利要求1所述的核酸或根据权利要求2-4中任一项所述的表达盒。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其是质粒、AAV、慢病毒或腺病毒。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其是选自以下AAV血清型的AAV：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、rAAV.rh8、rAAV.rhlO、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-l、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2.6、rAAV2.8、rAAV2.9、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
8.用于生产靶产物或根据权利要求5-7所述的表达载体的宿主细胞，其包含根据权利要求1所述的核酸或根据权利要求2-4中任一项所述的表达盒。
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