CN113039206A

CN113039206A - 包含b7h3嵌合抗原受体的方法和组合物

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Publication number: CN113039206A
Application number: CN201980072807.7A
Authority: CN
Inventors: 亚当·约翰逊; 迈克尔·C·延森
Original assignee: Seattle Childrens Hospital
Current assignee: Seattle Childrens Hospital
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2019-08-29
Publication date: 2021-06-25
Also published as: CA3110858A1; IL281129A; WO2020047257A1; JP2021534784A; EP3844191A4; EP3844191A1; US20210324083A1; AU2019333149A1

Abstract

本文提供的方法和组合物的实施方式涉及特异性结合B7H3的嵌合抗原受体(CAR)。一些实施方式涉及靶向肿瘤(例如包含B7H3+细胞的肿瘤)的基于细胞的免疫疗法。

Description

包含B7H3嵌合抗原受体的方法和组合物

优先权以及相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年8月31日提交的美国临时申请号62/725599的权益，以引用的方式将其在此明确地整体并入。

电子格式的序列表

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技术领域

背景技术

B7同系物3(B7H3，也称为CD276)是人15号染色体编码的I型跨膜蛋白。由于外显子复制，人中细胞外结构域由免疫球蛋白可变结构域和免疫球蛋白恒定结构域的两个相同对组成(4IgB7-H3亚型)。B7H3的细胞内尾部短，并且没有已知的信号转导基序。B7H3在物种间普遍表达。在人血清中也可检测到可溶形式，所述可溶形式由基质金属肽酶MMP从表面切割或通过内含子的可变剪接产生。

B7H3在抗原呈递细胞上被诱导并且在T细胞功能的抑制中起重要作用。重要的是，B7H3在广范围的人实体癌中高度过表达，并且通常与患者中的负面预后和不良的临床结果二者相关。例如，许多研究已经描述了B7H3在人恶性肿瘤中的过表达，所述恶性肿瘤包括黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌和其它癌症。参见例如，WangJ等，J Invest Dermatol.133:2050–8；Hu Y等，Hematology.20:187–95；Sun J等，OncoTargets Ther.7:1979–86；Zang X等，Proc Natl Acad Sci U S A.104:19458–63；Zang X等，Mod Pathol.23:1104–12；Chen Y等，OncoTargets Ther.7:1465–72；以及Ingebrigtsen VA等，BMC Cancer.14:602。通过免疫化学检测，在绝大多数癌症类型中，超过60％并多达93％的患者肿瘤组织显示B7H3的异常表达，而在正常健康组织上看到有限的表达。在大多数情况中，B7H3的高表达与差的预后和不良临床结果相关。因此，需要靶向B7H3的改进的疗法。

发明内容

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含：单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段特异性结合B7H3；跨膜结构域；scFv和跨膜结构域之间的间隔区；以及细胞内信号转导结构域。

在一些实施方式中，所述scFv包含：与氨基酸序列SEQ ID NO：03具有至少95％同一性的重链可变区(VH)CDR3、以及与氨基酸序列SEQ ID NO：06具有至少95％同一性的轻链可变区(VL)CDR3。

在一些实施方式中，所述scFv包含：与氨基酸序列SEQ ID NO：01具有至少95％同一性的VH CDR1、与氨基酸序列SEQ ID NO：02具有至少95％同一性的VH CDR2、与氨基酸序列SEQ ID NO：04具有至少95％同一性的VL CDR1、以及与氨基酸序列SEQ ID NO：05具有至少95％同一性的VL CDR2。

在一些实施方式中，所述scFv包含与氨基酸序列SEQ ID NO：13具有至少95％同一性的VH区。

在一些实施方式中，所述scFv包含与氨基酸序列SEQ ID NO：15具有至少95％同一性的VL区。

在一些实施方式中，所述间隔区包含氨基酸序列X₁PPX₂P。

在一些实施方式中，所述间隔区包含人抗体的铰链区的一部分，或其修饰的变体。

在一些实施方式中，所述间隔区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：18具有至少95％同一性的IgG4铰链间隔区、由与氨基酸序列SEQ ID NO：18具有至少95％同一性的IgG4铰链间隔区组成、或基本上由与氨基酸序列SEQ ID NO：18具有至少95％同一性的IgG4铰链间隔区组成。

在一些实施方式中，所述间隔区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：19具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH3间隔区、由与氨基酸序列SEQ ID NO：19具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH3间隔区组成、或基本上由与氨基酸序列SEQ ID NO：19具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH3间隔区组成。

在一些实施方式中，所述间隔区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：20具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH2-CH3间隔区、由与氨基酸序列SEQ ID NO：20具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH2-CH3间隔区组成、或基本上由与氨基酸序列SEQ ID NO：20具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH2-CH3间隔区组成。

在一些实施方式中，所述间隔区包含IgG4铰链-CH2(L235D，N297Q)-CH3间隔区、由IgG4铰链-CH2(L235D，N297Q)-CH3间隔区组成、或基本上由IgG4铰链-CH2(L235D，N297Q)-CH3间隔区组成。

在一些实施方式中，所述跨膜结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO：30具有至少95％同一性的CD28跨膜结构域(CD28tm)。

在一些实施方式中，所述细胞内信号转导结构域包含初级信号转导结构域和共刺激信号转导结构域，任选地包含CD3ζ的全部或部分与共刺激结构域的组合，所述共刺激结构域选自于由如下物质的信号转导结构域所组成的组：CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C、MyD88和B7-H3，以及它们的组合。

在一些实施方式中，所述细胞内信号转导结构域包含CD3ζ的信号转导部分，所述CD3ζ的信号转导部分由与核苷酸序列SEQ ID NO：31具有至少95％同一性的核酸编码。

在一些实施方式中，所述细胞内信号转导结构域包含4-1BB的信号转导部分，所述4-1BB的信号转导部分由与核苷酸序列SEQ ID NO：32具有至少95％同一性的核酸编码。

一些实施方式还包括编码鉴别标志物的核酸。

在一些实施方式中，所述鉴别标志物为截短的受体。在一些实施方式中，所述截短的受体选自于由截短的EGFR(EGFRt)、截短的HER2(HER2t)和截短的CD19(CD19t)所组成的组。

一些实施方式还包括核糖体跳跃序列。在一些实施方式中，所述核糖体跳跃序列包括P2A或T2A。

一些实施方式还包括适合于选择包含分离的多核苷酸的细胞的选择标志物。在一些实施方式中，所述选择标志物包含二氢叶酸还原酶转基因。在一些实施方式中，二氢叶酸还原酶转基因为二氢叶酸还原酶双突变体(DHFRdm)。在一些实施方式中，二氢叶酸还原酶双突变体包含氨基酸突变L22F和F31S

一些实施方式还包括编码与SEQ ID NO：09具有至少95％同一性的VH CDR3的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NO：12具有至少95％同一性的VL CDR3的核苷酸序列。

一些实施方式还包括编码与SEQ ID NO：07具有至少95％同一性的VH CDR1的核苷酸序列、编码与SEQ ID NO：08具有至少95％同一性的VH CDR2的核苷酸序列、与SEQ ID NO：10具有至少95％同一性的VL CDR1、编码与SEQ ID NO：11具有至少95％同一性的VL CDR2的核苷酸序列。

一些实施方式还包括编码与SEQ ID NO：14具有至少95％同一性的VH可变区氨基酸序列的核苷酸序列。

一些实施方式还包括编码与SEQ ID NO：16具有至少95％同一性的VL可变区氨基酸序列的核苷酸序列。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括由前述涉及分离的多核苷酸的实施方式中任一项所述的多核苷酸所编码的蛋白。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括包含前述涉及分离的多核苷酸的实施方式中任一项所述的分离的多核苷酸的载体。

在一些实施方式中，所述载体为病毒载体。

在一些实施方式中，所述载体为慢病毒载体或腺病毒载体。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括细胞，所述细胞包含前述涉及分离的多核苷酸的实施方式所述的分离的多核苷酸。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括细胞，所述细胞包含前述涉及载体的实施方式中任一项所述的载体。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括细胞，所述细胞包含由前述涉及分离的多核苷酸的实施方式中任一项所述的分离的多核苷酸所编码的蛋白。

在一些实施方式中，所述细胞选自于由CD8+T细胞和CD4+T细胞所组成的组。

在一些实施方式中，所述细胞为CD8+T细胞毒性淋巴细胞，所述CD8+T细胞毒性淋巴细胞选自于由初始CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合(bulk)CD8+T细胞所组成的组。在一些实施方式中，所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中央记忆T细胞，其中，所述中央记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+和CD8+阳性的。

在一些实施方式中，所述细胞为CD4+T辅助淋巴细胞，所述CD4+T辅助淋巴细胞选自于由初始CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞所组成的组。在一些实施方式中，CD4+辅助淋巴细胞是包含CD45RA+、CD62L+和CD4+且缺乏CD45RO的初始CD4+T细胞。

在一些实施方式中，所述细胞为前体T细胞。

在一些实施方式中，所述细胞为造血干细胞。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括药物组合物，所述药物组合物包含前述涉及细胞的实施方式中任一项所述的细胞，以及药学上可接受的赋形剂。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括制备前述涉及细胞的实施方式中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括：将前述涉及分离的核酸的实施方式中任一项所述的分离的核酸引入淋巴细胞中；在选自于由抗CD3抗体、抗CD28抗体和细胞因子所组成的组中的药剂存在下，对包含所述分离的核酸的淋巴细胞进行培养；以及针对包含所述分离的核酸的淋巴细胞进行选择性富集。

在一些实施方式中，选择性富集包括使包含分离的核酸的淋巴细胞与选择试剂接触。在一些实施方式中，选择试剂包括甲氨蝶呤。

在一些实施方式中，所述淋巴细胞具有CD45RA-、CD45RO+和CD62L+表型。

在一些实施方式中，所述淋巴细胞为CD8+淋巴细胞或CD4+淋巴细胞。

在一些实施方式中，所述细胞因子选自于由IL-15、Il-7、IL-2和Il-21所组成的组。

一些实施方式还包括对经选择性富集的淋巴细胞进行分离。

一些实施方式还包括使经选择性富集的淋巴细胞与针对由所述淋巴细胞表达的鉴别标志物的抗体接触。

在一些实施方式中，所述鉴别标志物包括截短的受体。在一些实施方式中，所述截短的受体选自于由截短的EGFR(EGFRt)、截短的HER2(HER2t)和截短的CD19(CD19t)所组成的组。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括治疗或改善患有包含B7H3+细胞的肿瘤的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的前述涉及细胞的实施方式中任一项所述的细胞。

在一些实施方式中，所述细胞从受试者的细胞制备而来。

在一些实施方式中，给予为静脉内给予。

在一些实施方式中，所述给予在受试者中肿瘤位点处局部给予。

在一些实施方式中，所述肿瘤包括选自于由以下所组成的组的癌症：黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、口腔鳞状细胞癌、宫颈癌、非小肺癌、膀胱癌、透明细胞肾细胞癌和胶质瘤。

在一些实施方式中，所述肿瘤包括胶质瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤包括选自于由以下所组成的组的胶质瘤：少突神经胶质瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、室管膜瘤和弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG)。在一些实施方式中，所述肿瘤包括多形性胶质母细胞瘤(GBM)。

一些实施方式还包括给予额外的治疗方案。

在一些实施方式中，额外的治疗方案包括放射疗法。

在一些实施方式中，额外的治疗方案包括化学疗法化合物。在一些实施方式中，所述化学疗法化合物选自于由以下所组成的组：2'-脱氧阿扎胞苷(deoxyazacitidine)、4-表-阿霉素、5-氮杂-胞苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、Ara-C、BMS-214662、硼替佐米、卡培他滨、CHIR-258、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、达卡巴嗪、地西他滨、阿霉素、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉滨、forodesine、FR01228、吉西他滨、羟基脲、KW-2449、lestautinib、lonafarnib、美法仑(melphlan)、midostaurin、丝裂霉素C、奈拉滨、喷司他丁、roscovitine、sapacitabine、semexanib、丙戊酸钠、索拉非尼、舒尼替尼、坦度替尼(tandutinib)、替尼泊苷、thiarabine、替吡法尼(tipifarnib)、曲古抑菌素A、曲沙他滨(troxacitabine)、钒酸盐/酯、维拉帕米、维达扎(vidaza)、以及zosuquidar三盐酸盐。

在一些实施方式中，细胞的给予和额外的治疗方案的给予是顺序的。

在一些实施方式中，细胞的给予和额外的治疗方案的给予是同时的。

在一些实施方式中，所述受试者为哺乳动物。在一些实施方式中，所述受试者为人。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括用于药物的细胞，所述细胞包含由前述涉及分离的多核苷酸的实施方式中任一项所述的分离的多核苷酸编码的蛋白质。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括用于治疗受试者中肿瘤的细胞，所述肿瘤包含B7H3+细胞。

在一些实施方式中，所述肿瘤包括选自于由以下所组成的组的癌症：黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、口腔鳞状细胞癌、宫颈癌、非小肺癌、膀胱癌、透明细胞肾细胞癌和胶质瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤包括胶质瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤包括选自于由以下所组成的组中的胶质瘤：少突神经胶质瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、室管膜瘤和内生性脑桥胶质瘤(DIPG)。在一些实施方式中，所述肿瘤包括多形性胶质母细胞瘤(GBM)。

在一些实施方式中，所述细胞为CD8+T细胞毒性淋巴细胞，所述CD8+T细胞毒性淋巴细胞选自于由初始CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞所组成的组。在一些实施方式中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞为中央记忆T细胞，并且其中，所述中央记忆T细胞为CD45RO+、CD62L+和CD8+阳性的。

在一些实施方式中，所述细胞为CD4+T辅助淋巴细胞，所述CD4+T辅助淋巴细胞选自于由初始CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞所组成的组。在一些实施方式中，CD4+辅助淋巴细胞为初始CD4+T细胞，所述初始CD4+T细胞包含CD45RA+、CD62L+和CD4+，并且缺乏CD45RO。

在一些实施方式中，所述细胞为前体T细胞。

在一些实施方式中，所述细胞为造血干细胞。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码与氨基酸序列SEQ ID NO：03具有至少95％序列同一性的重链可变区(VH)CDR3、和/或与氨基酸序列SEQ ID NO：06具有至少95％序列同一性的轻链可变区(VL)CDR3。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码与氨基酸序列SEQ ID NO：01具有至少95％序列同一性的VH CDR1、与氨基酸序列SEQ ID NO：02具有至少95％序列同一性的VH CDR2、与氨基酸序列SEQ ID NO：04具有至少95％序列同一性的VL CDR1、和/或与氨基酸序列SEQ ID NO：05具有至少95％序列同一性的VL CDR2。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码与氨基酸序列SEQ ID NO：13具有至少95％序列同一性的VH区。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码与氨基酸序列SEQ ID NO：15具有至少95％序列同一性的VL区。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括分离的多肽或包含分离的多肽的组合物，其中，所述多肽与氨基酸序列SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ IDNO：04、SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：06、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15具有至少95％序列同一性。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括细胞，所述细胞包含前述涉及分离的多核苷酸的实施方式中任一项所述的分离的多核苷酸或前述涉及多肽的实施方式中任一项所述的多肽。

附图说明

图1A为编码各种B7H3 CAR的多核苷酸的示意图。

图1B为示出通过包含CAR的B7H3 CAR T细胞的EGFRt进行鉴别的图表，所述CAR具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域。

图1C为蛋白质印迹的照片，示出了转导有编码具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的B7H3 CAR的多核苷酸的T细胞中的CD3-ζ表达。

图1D为示出了B7H3 CAR T细胞的体外特异性裂解百分比和细胞因子释放水平的一系列图表，所述B7H3 CAR T细胞包含具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR，并用Epd-110GH细胞、PNET-109FH细胞系、D283细胞系或Med411FH细胞系进行刺激。所测量的细胞因子包括IFNγ、IL-2和B7H3TNF。

图1E为示出了小鼠中用萤火虫荧光素酶(ffluc)标志物检测的B7H3⁺ U87肿瘤细胞的水平和通过Kaplan Meier曲线而来的存活率的一系列图表，所述小鼠接种有U87细胞并用含有CAR的B7H3 CAR T细胞进行处理，所述CAR具有短(S)间隔区域或中(M)间隔区域。(X)空白；(■)具有短间隔区域的B7H3 CAR；(●)具有中间隔区域的B7H3 CAR。

图2A为示出了CD4+B7H3 CAR T细胞中结合蛋白-L的免疫球蛋白EGFRt和结合抗-Fc的Fc的表达的一系列图表，所述CD4+B7H3 CAR T细胞包含具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR。

图2B为示出CD4+或CD8+细胞的各种克隆中的CD3-ζ表达的蛋白质印迹的照片，所述CD4+或CD8+细胞的各种克隆转导有编码具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的B7H3 CAR的多核苷酸。

图2C为示出B7H3 CAR T细胞的体外特异性裂解百分比的一系列图表，所述B7H3CAR T细胞包含具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR，并用U87细胞、缺乏B7H3表达的修饰的U87细胞、Be2细胞或D283细胞进行刺激。(X)空白；(▲)具有短间隔区域的B7H3 CAR；(○)具有中间隔区域的B7H3 CAR；以及(■)具有长间隔区域的B7H3 CAR。

图2D为示出了CD4+或CD8+B7H3 CAR T细胞的细胞因子释放水平的一系列图表，所述CD4+或CD8+B7H3 CAR T细胞包含具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR，并用Jurkat细胞、Jurkat OKT3细胞、U87细胞、缺乏B7H3表达的修饰U87细胞、Be2细胞和D283细胞进行刺激。所测量的细胞因子包括IFNγ、IL-2和TNF。

图2E为示出了小鼠中用ffluc标志物检测的B7H3⁺U87肿瘤细胞水平和通过KaplanMeier曲线而来的存活率的一系列图表，所述小鼠接种有U87细胞并用包含具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR的CD8+B7H3 CAR T细胞进行处理。(X)空白；(■)具有短间隔区域的B7H3 CAR；(●)具有中间隔区域的B7H3 CAR；以及(▲)具有长间隔区域的B7H3 CAR。

图3A为示出了CD4+细胞中EGFRt、人Fab和Fc(结合抗Fc)的表达的一系列图，所述CD4+细胞转导有编码具有中(M)间隔区域的B7H3 CAR和DHFRdm选择标志物的多核苷酸。

图3B为示出了用如下细胞进行刺激的CD4+B7H3 CAR T细胞的细胞因子释放水平的一系列图表：Jurkat细胞、Jurkat OKT3细胞、U87细胞、缺乏B7H3表达的修饰的U87细胞、Be2细胞和D283细胞。所测量的细胞因子包括IFNγ、IL-2和TNF。

图4为示出了与B7H3阳性靶细胞系被T细胞裂解有关的数据的一系列图表(实施例4)。

图5为示出了与用B7H3阳性靶细胞系共培养的T细胞的细胞因子产生有关的数据的一系列图表(实施例5)。

图6为示出了与体内U87肿瘤细胞的T细胞消除有关的数据的一系列图表(实施例6)。

图7为示出了与体内皮下Be2神经母细胞瘤肿瘤细胞的T细胞消除有关的数据的一系列图表(实施例7)。

图8为示出了与体内皮下Be2神经母细胞瘤肿瘤细胞的T细胞消除有关的数据的一系列图表(实施例8)。

图9为示出了与体内U251T胶质瘤肿瘤细胞的CD8+B7H3CAR T细胞消除有关的数据的一系列图表(实施例9)。

图10为示出了与体内弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG)原发性肿瘤细胞的CD8+B7H3 CAR T细胞消除有关的数据的一系列图表(实施例10)。

具体实施方式

定义

当根据说明书阅读时，本文所使用的“核酸”或“核酸分子”具有其普通和常规的含义，并且可包括但不限于：例如，多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)；寡核苷酸；通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段；和/或通过连接、切断、核酸内切酶作用和/或核酸外切酶作用中任一种产生的片段。核酸分子可由单体组成，所述单体为天然存在的核苷酸(例如DNA或RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的对映体形式)，或两者的组合。经修饰的核苷酸可具有糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分的改变。糖修饰包括例如用卤素、烷基基团、胺类和/或叠氮基基团替换一个或多个羟基基团，或者可将糖官能化为醚或酯。此外，可用空间上和电子上相似的结构(例如氮杂糖和/或碳环糖类似物)替换整个糖部分。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化嘌呤和/或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶或其它公知的杂环置换。核酸单体可通过磷酸二酯键或此类连接的类似物连接。磷酸二酯连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)或氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包含连接至聚酰胺骨架的天然存在的核酸碱基或经修饰的核酸碱基。核酸可为单链核酸或双链核酸。在一些替代方式中，提供了编码蛋白质的核酸序列。在一些替代方式中，核酸为RNA或DNA。

当根据说明书阅读时，本文所使用的“抗体”具有其普通和常规的含义，并且可以包括但不限于例如免疫系统用来识别和中和外来物体(如细菌和病毒)的由浆细胞产生的大Y型蛋白。在一些情况下，术语抗体是指抗体的抗原结合片段。抗体蛋白可包含四条多肽链；通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链。各条链由称为免疫球蛋白结构域的结构性结构域(structural domains)组成。这些结构域可以包含70个-110个氨基酸，并根据它们的大小和功能被分为不同的类别。嵌合抗原受体可包含配体结合结构域，所述配体结合结构域包括抗体片段，优选抗原结合片段。在一些实施方式中，提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述核酸包含：a)编码配体结合结构域的第一多核苷酸，其中，所述配体结合结构域结合至人B7H3蛋白和/或与人B7H3蛋白相互作用；b)编码多肽间隔区的第二多核苷酸，所述多肽间隔区的长度足以允许配体结合结构域与人B7H3蛋白相互作用；c)编码跨膜结构域的第三多核苷酸；以及d)编码细胞内信号转导结构域的第四多核苷酸。在一些替代方式中，配体结合结构域为抗体片段。可以与靶部分缀合的抗体或其结合片段的实例包括单克隆抗体、双特异性抗体、Fab、Fab2、Fab3、scFv、Bis-scFv、微型抗体(minibody)、三抗体(triabody)、双抗体(diabody)、四抗体(tetrabody)、VhH结构域、V-NAR结构域、IgNAR或骆驼Ig(camel Ig)。抗体的其它实例为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgE、IgD或IgA。抗体的实例包括人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

当根据说明书阅读时，本文所使用的“单链可变片段”或scFv具有其普通和常规的含义，并且可包括但不限于例如包含以短接头肽彼此连接的免疫球蛋白的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)的融合蛋白。在一些实施方式中，接头可包含甘氨酸(为了柔性)以及亲水性氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)(为了可溶性)。接头可将V_H的N端与V_L的C端连接，或者可将V_H的C端与V_L的N端连接。在一些实施方式中，CAR上存在的配体结合结构域为单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，CAR上存在的scFv结构域对B7H3蛋白而言具有特异性。

当根据说明书阅读时，本文使用的“载体”、“表达载体”或“构建体”具有其普通和常规的含义，并且可包括但不限于例如用于将异源核酸引入细胞中的核酸，其具有调节元件以提供异源核酸在细胞中的表达。载体包括但不限于质粒、微环、酵母和/或病毒基因组。在一些替代方式中，载体为质粒、微环或病毒基因组。在一些替代方式中，载体为病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体为慢病毒。在一些替代方式中，载体为慢病毒载体。在一些实施方式中，载体为泡沫病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。

当根据说明书阅读时，本文所使用的“嵌合抗原受体”或“CAR”或“嵌合T细胞受体”具有其普通和常规的含义，并且可包括但不限于例如合成的设计的受体，所述受体包含结合至与疾病或病症相关的分子的抗体或其它蛋白质序列的配体结合结构域，并通过间隔区结构域连接至T细胞或其它受体的一个或多个细胞内信号转导结构域(例如共刺激结构域)。嵌合受体也可称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体和嵌合抗原受体(CAR)。CAR是工程化受体，其可以将任意特异性移植到免疫受体细胞上。一些研究人员还认为术语嵌合抗原受体或“CAR”包括抗体或抗体片段、间隔区、信号转导结构域和跨膜区。然而，由于修饰本文所述的CAR的不同组分或结构域(例如配体结合区(如抗体片段，scFv或它们的部分)、间隔区、跨膜结构域和/或信号转导结构域)的惊人效果，在整个本公开中，经常根据独立要素来区分CAR的组分。在一些替代方式中，选择用于嵌合抗原受体的间隔区(例如，间隔区中的特定长度的氨基酸)以实现CAR所期望的结合特性。然后，针对与CAR所导向的靶部分结合或相互作用的能力，对(例如细胞上存在的)具有不同长度的间隔区的CAR进行筛选。

在一些实施方式中，本文所使用的T细胞或T淋巴细胞可包括来自任何哺乳动物(优选灵长类动物物种，包括猴、狗或人)的T细胞。在一些实施方式中，T细胞与接受细胞或待接受细胞(例如所述细胞处于治疗组合物的形式)的接受受试者为同种异体的(来自相同物种但不同的供体)；在一些实施方式中，T细胞为自体的(供体和接受者是相同的)；在一些实施方式中，T细胞为同基因的(syngeneic)(供体和接受者是不同的，但为同卵双胞胎)。

本文所使用的成熟T细胞表达表面蛋白CD4，并被称为CD4+T细胞。通常将CD4+T细胞视为在免疫系统内具有预定作用(如辅助T细胞)。例如，当抗原呈递细胞表达MHC II类上的抗原时，CD4+细胞将通过细胞与细胞的相互作用的结合(例如CD40和/或CD40L)以及通过细胞因子来帮助这些细胞。然而，也有极少数例外；例如自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞或调节性T细胞的亚群表达CD4。所有表达CD4+的后者T细胞组群不被视为T辅助细胞。

当根据说明书阅读时，本文所使用的“中央记忆”T细胞(或“T_CM”)具有其普通和常规的含义，并且可包括但不限于例如经历抗原的CTL，所述CTL在其表面上表达CD62L或CCR-7和/或CD45RO，并且与初始细胞相比不表达CD45RA或CD45RA表达减少。在一些实施方式中，中央记忆细胞在CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和/或CD95的表达方面是阳性的，并且与初始细胞相比CD54RA表达减少。

当根据说明书阅读时，本文所使用的“效应”“T_E”T细胞具有其普通和常规的含义，并且可包括但不限于例如经历抗原的细胞毒性T淋巴细胞，所述细胞毒性T淋巴细胞与中央记忆T细胞或初始T细胞相比不表达CD62L、CCR7或CD28或者CD62L、CCR7或CD28表达减少，和/或是颗粒酶B和/或穿孔蛋白阳性的。

当根据说明书阅读时，本文所使用的“T细胞前体”具有其普通和常规的含义，并且可包括但不限于例如可迁移至胸腺并成为T细胞前体的淋巴样前体细胞，其不表达T细胞受体。所有T细胞均来自骨髓中的造血干细胞。来自造血干细胞的造血祖细胞(淋巴样祖细胞)聚居于胸腺中并通过细胞分裂进行扩增，从而生成大群未成熟的胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，并且因此被归类为双阴性(CD4^-CD8^-)细胞。随着它们的发育它们不断发展，它们成为双阳性胸腺细胞(CD4⁺CD8⁺)，并且最终成熟为单阳性胸腺细胞(CD4⁺CD8^-或CD4^-CD8⁺)，然后从胸腺释放至周围组织。

当根据说明书阅读时，本文所使用的“药物赋形剂”或药物媒介物(vehicle)具有其普通和常规的含义，并且可以包括但不限于例如用作溶剂的非活性介质或运载体(carrier)，在其中配制和/或给予用于治疗的医药活性剂或T细胞。媒介物可包括聚合物胶束、脂质体、基于脂蛋白的运载体、纳米颗粒运载体、树状分子(dendrimers)和/或本领域技术人员已知的用于T细胞的其它媒介物。理想的媒介物或赋形剂可为无毒的、生物相容的、非免疫原性的、可生物降解的，并且能够避免被宿主的防御机制识别。

具体实施方式

本文提供的方法和组合物的一些实施方式涉及特异性结合人B7同系物3(B7H3)的嵌合抗原受体(CAR)。一些实施方式涉及编码特异性结合B7H3的CAR的多核苷酸和表达此类CAR的细胞，以及用此类细胞治疗患有B7H3+肿瘤的受试者。

本文提供的一些实施方式涉及B7H3 CAR和编码此类CAR的多核苷酸。本文提供的B7H3 CAR的一些实施方式具有特别显著的体外和体内活性。例如，证明了在T细胞中表达的B7H3 CAR的某些实施方式具有在体外刺激细胞因子的释放方面的显著增加的活性，具有在抑制体内肿瘤细胞的生长方面的显著增加的活性，并显著增加受试者的存活。还证明了在T细胞中表达的B7H3 CAR的某些实施方式在体外对几种不同类型的中枢神经系统肿瘤细胞具有显著的活性，并且在具有人胶质母细胞瘤细胞的体内异种移植模型中具有显著的活性。

在一些实施方式中，可将编码B7H3 CAR的多核苷酸转导至T细胞中以产生B7H3CAR T细胞。经转导的细胞可表达B7H3 CAR，并且可靶向表达B7H3抗原的细胞。在一些实施方式中，可从受试者中移除T细胞。可对所述细胞进行离体(ex vivo)操纵以表达B7H3 CAR，并重新引入所述受试者中。重新引入的细胞可靶向受试者中表达B7H3抗原的肿瘤细胞。本文提供的B7H3 CAR的一些实施方式包含能够增强CAR稳定性和活性的修饰的IgG4-铰链区。在一些实施方式中，B7H3 CAR包含CD28跨膜区，以及通过细胞内共刺激分子组合的效应物功能。在一些实施方式中，编码B7H3 CAR的多核苷酸可编码第二多肽，例如鉴别标志物(如截短的EGFR(EGFRt))。此类鉴别标志物可对于以下有用：分离共表达鉴别标志物的细胞，以及测量经此类细胞处理的受试者中表达该鉴别标志物的细胞的水平。如本文所述，使用一组体外和体内测定，B7H3CAR已在CD4 T细胞和CD8 T细胞中成功表达，并且赋予了强有力且特异性的抗肿瘤活性。

使用scFv作为靶向部分增加了CAR设计的复杂性，因为它涉及靶标和T细胞识别。TCR及其同源HLA分子之间的经典相互作用是在空间上限定的，而CAR及其识别靶标的能力取决于多个参数，例如表位位置、靶标结构、以及CAR细胞外间隔区的长度和灵活性(elasticity)。尚不清楚可变胞外间隔区长度对CAR参与的影响的确切机制。本公开内容的方面描述了将可变的IgG4重链间隔区长度并入B7H3 CAR中，以发现某些B7H3 CAR具有显著且预料不到的体外和体内活性。

嵌合抗原受体(CAR)

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括B7H3 CAR和编码此类B7H3 CAR的分离的多核苷酸。本文所使用的“B7H3 CAR”涉及靶向B7H3抗原的CAR。在一些实施方式中，CAR可包括合成的设计的蛋白，其包含特异性结合靶标的抗原结合结构域、将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的间隔区结构域、以及细胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，抗原结合结构域可包括抗体、抗体的抗原结合片段、或由此类抗体衍生而来的融合蛋白，例如单链可变片段(scFv)。scFv可包括单链Fv抗体，其中，已将传统两链抗体的重链和轻链的可变结构域连结以形成单个多肽链。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域可包括信号转导结构域和共刺激结构域。

本文提供的CAR的一些实施方式包括特异性结合B7H3抗原的抗原结合结构域。在一些实施方式中，CAR的抗原结合结构域可由特异性结合B7H3的抗体衍生而来。此类抗体的实例公开于Int.Pat.App.Pub.No WO 2011109400；U.S.Pat.Pub.2013/0149236；以及LooD.等，(2012)Clin Cancer Res；18(14)；3834–45，以引用的方式将其整体各自明确地并入。抗体可包含重链可变区(V_H)，所述重链可变区(V_H)可包含互补决定区(CDR)，例如互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)。抗体还可包含轻链可变区(V_L)，所述轻链可变区(V_L)可包含互补决定区，例如互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)。

在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR的抗原结合结构域可至少包含由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_H CDR3、和/或由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_H CDR1、和/或由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_H CDR2。在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR的抗原结合结构域可至少包含由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_H区。在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR的抗原结合结构域可至少包含由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_L CDR3、和/或由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_LCDR1、和/或由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_L CDR2。在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR的抗原结合结构域可至少包含由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_L区。

在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR的抗原结合结构域包含由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的scFv。在一些实施方式中，所述scFv包含由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_H CDR3和/或V_H CDR1和/或V_H CDR2。在一些实施方式中，所述scFv包含由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_H区。在一些实施方式中，所述scFv包含由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_L CDR3和/或V_L CDR1和/或V_L CDR2。在一些实施方式中，所述scFv包含由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_L区。在一些实施方式中，所述scFv包含各自由特异性结合至B7H3的抗体衍生而来的V_H区和V_L区两者，或此类V_H区和V_L区的CDR元件。V_H区和V_L区可以通过接头彼此连结。V_H区和V_L区可以以相对于彼此以V_H-V_L或V_H-V_L取向连结。

表1列出了对本文提供的方法和组合物的实施方式有用的示例氨基酸序列和核苷酸序列。

表1

在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR可包含V_H CDR1，所述V_H CDR1包含与SEQ ID NO：01具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、或由与SEQ ID NO：01具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，V_H CDR1可由与SEQ ID NO：07具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR可包含V_H CDR2，所述V_H CDR2包含与SEQ ID NO：02具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、或由与SEQ ID NO：02具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，V_H CDR2可由与SEQ ID NO：08具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR可包含V_H CDR3，所述V_H CDR3包含与SEQ ID NO：03具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、或由与SEQ ID NO：03具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，V_H CDR3可由与SEQ ID NO：09具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR可包含V_H区，所述V_H区包含与SEQ IDNO：13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、或由与SEQ ID NO：13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，V_H区可由与SEQ ID NO：14具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR可包含V_L CDR1，所述V_L CDR1包含与SEQ ID NO：04具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、或由与SEQ ID NO：04具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，V_L CDR1可由与SEQ ID NO：10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR可包含V_L CDR2，所述V_L CDR2包含与SEQ ID NO：05具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、或由与SEQ ID NO：05具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，V_L CDR2可由与SEQ ID NO：11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR可包含V_L CDR3，所述V_L CDR3包含与SEQ ID NO：06具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、或由与SEQ ID NO：06具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，V_L CDR3可由与SEQ ID NO：12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，特异性结合至B7H3的CAR可包含V_L区，所述V_L区包含与SEQ IDNO：15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列、或由与SEQ ID NO：15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，V_L区可由与SEQ ID NO：16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。

在一些实施方式中，可例如通过为了最佳比较目的(例如可在第一序列的序列中引入空位(gaps))而比对序列来确定两个序列(例如两个氨基酸序列或两个核苷酸序列)之间的同一性百分比。然后比较对应位置的氨基酸或核苷酸，两个序列之间的同一性百分比是这些序列共有的相同位置数的函数，例如，同一性％＝相同位置#/位置总#×100。可通过公知的方法(例如使用数学算法)来完成两个序列的实际比较。此类数学算法的具体的非限制性示例描述于Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877(1993)，以引用的方式将其整体并入本文。此类算法被编入BLASTN和BLASTX程序(2.2版)中，如Schaffer等，Nucleic Acids Res.,29:2994-3005(2001)中所述，以引用的方式将其整体并入本文。在本文提供的方法和组合物的一些实施方式中，编码CAR或其组分的多核苷酸的核酸序列可由与本文提供的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列组成，基本上由与本文提供的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列组成，或包含与本文提供的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在本文提供的方法和组合物的一些实施方式中，CAR多肽或其组分的氨基酸序列可由与本文提供的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成，基本上由与本文提供的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列组成，或包含与本文提供的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，氨基酸序列可包含保守氨基酸置换。保守的氨基酸变化引起所得肽的氨基酸序列中的沉默变化(silent changes)。例如，极性相似的一个或多个氨基酸充当功能等同物，并引起肽的氨基酸序列内的沉默改变。电荷中性以及用较小残基替换残基的置换也可被视为保守置换，即使这些残基位于不同的组中(例如用较小的异亮氨酸替换苯丙氨酸)。在一些实施方式中，保守氨基酸置换可包括氨基酸类似物或变体的使用。表2列出了保守氨基酸置换的示例家族。

表2

家族	氨基酸
		非极性	Trp,Phe,Met,Leu,Ile,Val,Ala,Pro
不带电荷、极性的	Gly,Ser,Thr,Asn,Gln,Tyr,Cys
		酸性/带负电荷	Asp,Glu
碱性/带正电荷	Arg,Lys,His
		β支化	Thr,Val,Ile
影响链取向的残基	Gly,Pro
		芳香族	Trp,Tyr,Phe,His

在一些实施方式中，B7H3 CAR可包含将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的间隔区结构域。在一些实施方式中，适当长度的间隔区结构域可传送抗原结合结构域的移动性，以允许与靶抗原的最佳结合。对本文提供的方法和组合物的一些实施方式有用的示例性间隔区结构域描述于Int.Pat.App.Pub.No.WO 2014031687；U.S.Pat.Pub.20180200298；以及Kunkele A.等，(2015)Cancer Immunol Res；3(4)；368–79，以引用的方式将其各自整体并入。

在一些实施方式中，间隔区结构域可由IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的铰链区的至少部分衍生而来。在一些实施方式中，间隔区结构域可由IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2区和/或CH3区衍生而来。在一些实施方式中，间隔区结构域可包括存在于可变重链和核心之间的上游铰链(upper hinge)氨基酸，以及包含聚脯氨酸区域的核心铰链氨基酸。在一些实施方式中，上游铰链区具有3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸，或者具有约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。在一些实施方式中，间隔区域包含氨基酸序列X₁PPX₂P(SEQ ID NO：17)。在一些实施方式中，X₁为半胱氨酸、甘氨酸或精氨酸，并且X₂为半胱氨酸或苏氨酸。在一些实施方式中，间隔区结构域可包含IgG的经修饰的铰链区。例如，经修饰的铰链区可与IgG的铰链区具有至少90％、92％、95％或100％的序列同一性或在由上述百分比的任何两个所限定的范围内的序列同一性。

在一些实施方式中，间隔区域的长度可为至少10个至229个氨基酸或至少约10个至229个氨基酸、至少10个至200个氨基酸或至少约10个至200个氨基酸、至少10个至175个氨基酸或至少约10个至175个氨基酸、至少10个至150个氨基酸或至少约10个至150个氨基酸、至少10个至125个氨基酸或至少约10个至125个氨基酸、至少10个至100个氨基酸或至少约10个至100个氨基酸、至少10个至75个氨基酸或至少约10个至75个氨基酸、至少10个至50个氨基酸或至少约10个至50个氨基酸、至少10个至40个氨基酸或至少约10个至40个氨基酸、至少10个至30个氨基酸或至少约10个至30个氨基酸、至少10个至20个氨基酸或至少约10个至20个氨基酸、或者至少10个至15个氨基酸或至少约10个至15个氨基酸，并且包括任意所列范围的端点之间的任何整数。在一些实施方式中，间隔区域具有12个氨基酸或更少(但不为零)或者约12个氨基酸或更少(但不为零)、119个氨基酸或更少(但不为零)或者约119个氨基酸或更少(但不为零)、或者229个氨基酸或更少(但不为零)或者约229个氨基酸或更少(但不为零)。

在一些实施方式中，间隔区域可包含人IgG4铰链间隔区、由人IgG4铰链间隔区组成、或基本上由人IgG4铰链间隔区组成。在一些实施方式中，间隔区域可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：18的多肽、由具有氨基酸序列SEQ ID NO：18的多肽组成、或基本上由具有氨基酸序列SEQ ID NO：18的多肽组成。在一些实施方式中，间隔区域可包含人IgG4铰链-CH3间隔区、由人IgG4铰链-CH3间隔区组成或基本上由人IgG4铰链-CH3间隔区组成。在一些实施方式中，间隔区域可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：19的多肽、由具有氨基酸序列SEQID NO：19的多肽组成、或基本上由具有氨基酸序列SEQ ID NO：19的多肽组成。在一些实施方式中，间隔区域可包含人IgG4铰链-CH3-CH4间隔区、由人IgG4铰链-CH3-CH4间隔区组成、或基本上由人IgG4铰链-CH3-CH4间隔区组成。在一些实施方式中，间隔区域可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：20的多肽、由具有氨基酸序列SEQ ID NO：20的多肽组成、或基本上由具有氨基酸序列SEQ ID NO：20的多肽组成。在一些实施方式中，间隔区域可包含人IgG4铰链-CH2(L235D，N297Q)-CHE间隔区、由人IgG4铰链-CH2(L235D，N297Q)-CHE间隔区组成、或基本上由人IgG4铰链-CH2(L235D，N297Q)-CHE间隔区组成。表3列出了对本文提供的方法和组合物的实施方式有用的间隔区结构域的示例氨基酸序列。在一些实施方式中，间隔区域可包含与表3中列出的氨基酸序列中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

表3

在一些实施方式中，B7H3 CAR可包含跨膜结构域。跨膜结构域可提供CAR在细胞膜中的锚定。在一些实施方式中，跨膜结构域可由膜结合蛋白或跨膜蛋白衍生而来。在一些实施方式中，跨膜结构域可具有10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个或28个，或者约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个或28个氨基酸的长度。在一些实施方式中，跨膜结构域可包括T细胞受体(例如CD28、CD3、CD45、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154)的α链、β链或ζ链的跨膜区。在一些实施方式中，跨膜结构域可由CD28跨膜结构域(CD28tm)衍生而来。表4列出了对本文提供的方法和组合物的实施方式有用的CD28tm结构域的示例氨基酸序列和核苷酸序列。在一些实施方式中，跨膜结构域可由与SEQ ID NO：29具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。

表4

在一些实施方式中，B7H3 CAR可包含连接至跨膜结构域的细胞内信号转导结构域。当抗原结合结构域结合靶抗原时，细胞内信号转导结构域可激活细胞的功能。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域可激活表达CAR的细胞(例如表达CAR的T细胞)的功能。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域包含一个或多个细胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域可包括由提供如下功能的细胞内信号转导结构域的至少部分衍生而来的结构域：所述细胞内信号转导域提供对经转导的细胞(例如T细胞)的至少一种功能的激活。T细胞激活可由至少两类细胞内信号转导蛋白介导：启动抗原依赖性初级激活并提供T细胞受体样信号的信号转导蛋白(例如初级胞浆信号转导蛋白)；以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的信号转导蛋白(例如次级胞浆信号转导蛋白)。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域可包括初级胞浆信号转导蛋白的功能结构域。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域可包括初级胞浆信号转导蛋白的功能结构域，以及一种或多种次级胞浆信号转导蛋白的至少一个功能结构域。

在一些实施方式中，信号转导结构域(例如初级信号转导结构域或共刺激结构域)包括与细胞内部的组分相互作用并且能够传递信号或参与传递信号的受体蛋白或蛋白的细胞内结构域或胞浆结构域。在一些实施方式中，此类相互作用可通过细胞内结构域发生，经由特定的蛋白-蛋白或蛋白-配体相互作用与效应分子或效应蛋白进行通信，继而可沿信号链将信号发送至其目的地。在一些实施方式中，信号转导结构域包括共刺激结构域。在一些方面，共刺激结构域包含向T细胞提供信号的信号转导部分，除了由例如TCR/CD3复合物的CD3ζ链提供的初级信号，所述信号还增强应答，例如T细胞效应物应答，例如，如免疫应答、活化、增殖、分化、细胞因子分泌、溶细胞活性、穿孔蛋白或颗粒酶活性等。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域和/或共刺激结构域可包括以下的全部或部分：CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C和/或B7-H3、或与CD83特异性结合的配体。

以刺激方式起作用的初级胞浆信号转导蛋白可包括信号转导基序，所述信号转导基序被称为基于细胞内受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。包含初级胞浆信号转导结构域的ITAM的实例包括由CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d衍生而来的ITAM。

在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域可包括CD3-ζ或其变体的信号转导结构域的全部或部分，以及4-1BB或其变体的信号转导结构域的全部或部分。表5列出了编码CD3-ζ的信号转导结构域和4-1BB的信号转导结构域的示例核苷酸序列。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域可包含由与表5中列出的核苷酸序列中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸所编码的氨基酸序列。

表5

在一些实施方式中，编码B7H3 CAR的多核苷酸可以是多顺反子的，并且编码多于一个的多肽。在一些实施方式中，编码CAR的多核苷酸可包括允许来自单个多核苷酸的多个基因翻译的元件。在一些实施方式中，所述元件可包括内部核糖体进入位点(IRES)或核糖体跳跃序列。核糖体跳跃序列可包括在翻译过程中迫使核糖体“跳过”核糖体跳跃序列并翻译核糖体跳跃序列之后的区域而不形成肽键的序列。例如，若干病毒具有核糖体跳跃序列，其允许在单个核酸上连续翻译数种蛋白，而不使这些蛋白通过肽键连接。在一些替代方式中，核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些替代方式中，核糖体跳跃序列为T2A序列。表5列出了对本文提供的方法和组合物的实施方式有用的示例T2A核苷酸序列。

在一些实施方式中，编码CAR的多核苷酸可在编码CAR的核苷酸序列和编码第二多肽的核苷酸序列之间具有IRES或核糖体跳跃序列。在一些实施方式中，CAR和第二多肽可在细胞中共表达。在一些实施方式中，第二多肽可编码鉴别标志物和/或选择标志物，例如能够用于对表达鉴别标志物和/或选择标志物的细胞进行鉴别、分离和/或富集的蛋白。此类标志物的实例包括能够用于鉴别表达细胞但具有最小活性的截短的受体。示例的截短的受体包括截短的表皮生长因子受体(EGFRt)，所述受体描述于U.S.Pat.No.8,802,374中，以引用的方式将其整体并入。表5列出了编码对本文提供的方法和组合物的实施方式有用的EGFRt的示例核苷酸序列。截短的受体的更多实例包括截短的HER2(HER2t)和截短的CD19(CD19t)。选择标志物的实例包括二氢叶酸还原酶转基因。在一些实施方式中，二氢叶酸还原酶可为二氢叶酸还原酶双突变体(DHFRdm)。在一些此类实施方式中，二氢叶酸还原酶双突变体包含氨基酸突变L22F和F31S。选择标志物的更多实例包括赋予对潮霉素B的耐受性的潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)、来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph，编码对抗生素G418的耐受性)、以及腺苷脱氨酶基因(ADA)。在一些实施方式中，可使用鉴别标志物(例如EGFRt)来分离细胞群。在一些实施方式中，针对鉴别标志物的抗体可捕获表达该鉴别标志物(例如EGFRt)的细胞。抗体可包含第一结合伴侣，例如生物素或链霉亲和素。所述抗体可用附着在基质(例如珠子，如磁珠)上的第二结合伴侣(例如生物素或链霉亲和素)来捕获。在一些实施方式中，可使用鉴别标志物(例如EGFRt)来测量已经给予了CAR T细胞的受试者中CAR T细胞的水平。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式可包括包含分离的多核苷酸的载体，所述分离的多核甘酸编码特异性结合B7H3的CAR。在一些实施方式中，所述载体为病毒载体。在一些实施方式中，所述载体为慢病毒载体或腺病毒载体。

制备CAR T细胞的方法

本文提供的方法和组合物的一些实施方式可包括包含编码B7H3CAR的多核苷酸的细胞和用于制备这些组合物的方法。一些此类实施方式包括：例如，将编码B7H3 CAR的分离的多核苷酸引入淋巴细胞；在促进包含分离的多核苷酸的细胞群扩增的药剂存在下培养所述包含分离的多核苷酸的淋巴细胞，例如所述药剂选自于由抗CD3抗体、抗CD28抗体和细胞因子所组成的组的药剂；以及选择性富集所述包含分离的多核苷酸的淋巴细胞。在一些实施方式中，选择性富集包括使包含分离的核酸的淋巴细胞与选择试剂接触。在一些实施方式中，所述选择试剂包含甲氨蝶呤。在一些实施方式中，所述淋巴细胞具有CD45RA-、CD45RO+和CD62L+表型。在一些实施方式中，所述淋巴细胞为CD8+淋巴细胞或CD4+淋巴细胞。在一些实施方式中，所述细胞因子选自于由IL-15、Il-7、IL-2和Il-21所组成的组。一些实施方式还包括对经选择性富集的淋巴细胞进行分离。在一些实施方式中，使经选择性富集的淋巴细胞与针对由该淋巴细胞表达的鉴别标志物的抗体接触。在一些实施方式中，鉴别标志物包括截短的受体。在一些实施方式中，所述截短的受体选自于由截短的EGFR(EGFRt)、截短的HER2(HER2t)和截短的CD19(CD19t)所组成的组。示例方法描述于U.S.Pat.Pub.20180200298，以引用的方式将其整体并入。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式可包括T淋巴细胞群的选择和分选以及T淋巴细胞群的修饰。在用于T淋巴细胞群的选择和分选的一些实施方式中，可根据已知技术收集T淋巴细胞，并通过已知技术(例如与抗体的亲和结合、如流式细胞术和/或免疫磁性选择)来富集或耗竭T淋巴细胞。富集和/或耗竭步骤后，期望的T淋巴细胞的体外扩增可根据已知技术进行，例如描述于U.S.Pat.No.6,040,177中的技术，以引用的方式将其整体并入。在一些实施方式中，T细胞为获取自患者的自体T细胞。

在一些实施方式中，可通过在体外向培养基中添加起始T淋巴细胞群，然后向培养基中添加饲养细胞(例如非分裂的外周血单核细胞(PBMC))来扩增期望的T细胞群或亚群。所述非分裂饲养细胞可包括经γ-辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方式中，用γ射线对PBMC进行辐照。在一些实施方式中，扩增方法可包括添加非分裂的EBV转化的淋巴母细胞样细胞(lymphoblastoid cells，LCL)作为饲养细胞。LCL可经γ射线进行辐照。在一些实施方式中，扩增方法可包括向培养基添加抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。在一些实施方式中，扩增方法可包括向培养基中添加IL-2和/或IL-15(例如，其中IL-2的浓度为至少约10单位/mL)。在一些实施方式中，扩增的T淋巴细胞可包括能够对人肿瘤或病原体上存在的抗原具有特异性的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4+辅助T淋巴细胞。T淋巴细胞的初始分离后，可在扩增之前或之后将细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞二者分选为初始T细胞、记忆T细胞和效应T细胞亚群。

CD8+细胞可通过使用标准方法来获得。在一些实施方式中，通过鉴别与各种类型的CD8+细胞相关的细胞表面抗原，将CD8+细胞进一步分选为初始细胞、中央记忆细胞和效应记忆细胞。在实施方式中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-子集中。用抗CD8抗体和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和CD62L+CD8+级分。在一些实施方式中，中央记忆T_CM的表型标志物的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127，和/或颗粒酶B阴性或低颗粒酶B的。在一些实施方式中，中央记忆T细胞为CD45RO+、CD62L+和/或CD8+T细胞。在一些实施方式中，效应T_E为CD62L、CCR7、CD28和/或CD127阴性的，和/或颗粒酶B和穿孔蛋白阳性的。在一些实施方式中，初始CD8+T淋巴细胞的特征在于初始T细胞的表型标志物的表达，包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和/或CD45RA。

在一些实施方式中，可使用用针对表面标志物的特异性抗体和同种型匹配的对照抗体进行的染色，通过流式细胞术来确定细胞群表面上特定细胞表面标志物的存在。标志物阴性的细胞群是指不存在特异性抗体超过同种型对照对细胞群显著染色，阳性是指高于同种型对照的细胞群均匀染色。在一些实施方式中，一种或多种标志物的表达的减少是指与参比细胞群相比时，平均荧光强度损失1个log 10，和/或展现细胞标志物的细胞的百分比减少至少所述细胞的20％、所述细胞的25％、所述细胞的30％、所述细胞的35％、所述细胞的40％、所述细胞的45％、所述细胞的50％、所述细胞的55％、所述细胞的60％、所述细胞的65％、所述细胞的70％、所述细胞的75％、所述细胞的80％、所述细胞的85％、所述细胞的90％、所述细胞的95％、所述细胞的100％以及20％与100％之间的任何％，或至少约所述细胞的20％、所述细胞的25％、所述细胞的30％、所述细胞的35％、所述细胞的40％、所述细胞的45％、所述细胞的50％、所述细胞的55％、所述细胞的60％、所述细胞的65％、所述细胞的70％、所述细胞的75％、所述细胞的80％、所述细胞的85％、所述细胞的90％、所述细胞的95％、所述细胞的100％以及20％与100％之间的任何％。在一些实施方式中，对一种或多种标志物呈阳性的细胞群是指与参比细胞群相比时，展现标志物的细胞百分比为：至少50％的细胞、55％的细胞、60％的细胞、65％的细胞、70％的细胞、75％的细胞、80％的细胞、85％的细胞、90％的细胞、95％的细胞、100％的细胞，以及50％和100％之间的任何％，或至少约50％的细胞、55％的细胞、60％的细胞、65％的细胞、70％的细胞、75％的细胞、80％的细胞、85％的细胞、90％的细胞、95％的细胞、100％的细胞，以及50％和100％之间的任何％。

通过鉴别具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分选为初始细胞、中央记忆细胞和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方式中，初始CD4+T淋巴细胞为CD45RO-、CD45RA+、CD62L+或CD4+T细胞。在一些实施方式中，中央记忆CD4+细胞为CD62L+或CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞为CD62L-或CD45RO-。

在一些实施方式中，可通过用抗原刺激初始或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性的CD4+和CD8+的群。例如，可通过从受感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原体外刺激所述细胞来针对巨细胞病毒(Cytomegalovirus)抗原产生抗原特异性T细胞系或克隆。也可使用初始T细胞。可利用来自肿瘤细胞的任意数量的抗原作为靶标来引发T细胞应答。在一些实施方式中，过继细胞免疫疗法组合物在疾病或病症的治疗或改善中有用，所述疾病或病症包括实体瘤、血液恶性肿瘤、乳腺癌或黑色素瘤。

在一些实施方式中，可用编码本文提供的CAR的多核苷酸来修饰分离的T淋巴细胞群。在一些实施方式中，所述T细胞获取自待治疗的受试者。在其它实施方式中，所述淋巴细胞获取自同种异体的人供体，优选健康的人供体。

在一些实施方式中，包含编码CAR的多核苷酸的重组感染性病毒颗粒可用于将基因递送至T细胞。对本文提供的方法和组合物的实施方式有用的病毒载体的实例包括衍生自猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒载体和/或逆转录病毒衍生而来的病毒载体。转导细胞(例如T细胞)的示例技术包括磷酸钙转染、原生质体融合、电穿孔、以及用病毒载体(例如重组腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体)感染。逆转录病毒载体和慢病毒载体为将基因转移到真核细胞中提供了高效的方法。此外，逆转录病毒整合或慢病毒整合以受控的方式发生，并引起每个细胞中新遗传信息的一个或数个拷贝的稳定整合。

在一些实施方式中，包含编码CAR的多核苷酸的载体可包含使得能够在体外选择细胞的阳性标志物。示例基因包括赋予对潮霉素B的耐受性的潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)、来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph，编码对抗生素G418的耐受性)、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因和腺苷脱氨酶基因(ADA)。

在一些实施方式中，可分别用编码CAR的表达载体修饰CD4+细胞和CD8+细胞，以形成所定义的群。在一些实施方式中，如上所述通过如下将这些细胞进一步分选为初始细胞、中央记忆细胞和效应细胞的亚群：关于对各个细胞群而言独特的细胞表面抗原进行分选。另外，可通过它们的细胞因子谱或增殖活性来选择CD4+细胞群或CD8+细胞群。例如，可选择如下的CD4+T淋巴细胞：在用抗原刺激时，与经假转导的细胞或经转导的CD8+细胞相比，具有增强的细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-10、TNFα和/或IFNγ)的产生的CD4+T淋巴细胞。在一些实施方式中，选择具有增强的IL-2和/或TNFα产生的初始或中央记忆CD4+T细胞。同样，选择与经假转导的CD8+细胞相比具有增强的IFNγ产生的CD8+细胞。

在一些实施方式中，选择响应于抗原或肿瘤靶标而增殖的CD4+细胞和CD8+细胞。例如，选择与经假转导的细胞或经转导的CD8+细胞相比，当用抗原或肿瘤靶标刺激时强劲增殖的CD4+细胞。在一些实施方式中，选择对携带抗原的细胞具有细胞毒性的CD4+细胞和/或CD8+细胞。在实施方式中，与CD8+细胞相比，预期CD4+具有弱的细胞毒性。在一些实施方式中，使用针对特定类型癌症建立的动物模型，选择能够在体内持续留存(persist)的转导的表达嵌合受体的T细胞。在实施方式中，已证实具有短间隔区域的转导的嵌合受体CD8+中央记忆细胞在引入动物后在体内持续留存约3天以上、10天以上、20天以上、30天以上、40天以上、或50天以上。

在一些实施方式中，可将CD4+细胞和CD8+细胞可进一步分成亚群，例如初始细胞群、中央记忆细胞群和效应记忆细胞群。在一些实施方式中，初始CD4+细胞为CD45RO-、CD45RA+、CD62L+和/或CD4+阳性T细胞。在一些实施方式中，中央记忆CD4+细胞为CD62L阳性和/或CD45RO阳性。在一些实施方式中，效应CD4+细胞为CD62L阴性和/或CD45RO阳性。如本文所述，可用CAR独立地修饰这些群中的每一个。

在一些实施方式中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+子集和CD62L-子集二者中。用抗CD8抗体和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和CD62L+CD8+级分。在一些实施方式中，中央记忆T细胞(TCM)的表型标志物的表达包括CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127，并且为颗粒酶B阴性或低颗粒酶B的。在一些实施方式中，中央记忆T细胞为CD45RO+、CD62L+和/或CD8+T细胞。在一些实施方式中，效应T细胞(T_E)为CD62L、CCR7、CD28和/或CD127阴性的，以及颗粒酶B和/或穿孔蛋白阳性的。在一些实施方式中，初始CD8+T淋巴细胞的特征在于CD8+、CD62L+、CD45RO+、CCR7+、CD28+、CD127+和/或CD45RO+。可用CAR独立地修饰这些群中的每一个。

在一些实施方式中，在对携带CAR的细胞进行转导和/或选择后，可在体外扩增细胞群，直到获得足够数量的细胞以提供向人受试者中的至少一次输注，通常为约10⁴个细胞/kg至10⁹个细胞/kg。在一些实施方式中，可在携带抗原的细胞、抗CD3、抗CD28、IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21及它们的组合的存在下对转导的细胞进行培养。在一些实施方式中，CD4+和CD8+细胞的亚群可以彼此组合。在一些实施方式中，可将修饰的初始或中央记忆CD4+细胞与修饰的中央记忆CD8+T细胞组合，以提供对携带抗原的细胞(例如肿瘤细胞)的协同细胞毒性作用。

治疗或改善疾病的方法

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括通过进行免疫疗法来治疗或改善患有包含B7H3+细胞的肿瘤的受试者中的癌症。一些此类实施方式可包括向有需要的受试者给予有效量的细胞(例如T细胞)，所述细胞表达靶向B7H3抗原的CAR。有效量的细胞可以指有效数量的某细胞群中的细胞。

本文所使用的“受试者”可包括人或非人哺乳动物(例如狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、非人灵长类动物)或鸟类(例如鸡)，以及任何其它脊椎动物或无脊椎动物。本文所使用的“治疗(treat/treatment/treating)”可包括出于治疗目的向受试者给予药物组合物，并且可包括减轻病症的症状或后果，例如防止从原发性肿瘤的转移的发生，降低转移性肿瘤的肿瘤细胞数量，或抑制转移性肿瘤的肿瘤细胞生长；并且可包括治愈病症，例如消除病症的症状，例如消除受试者中转移性肿瘤的肿瘤细胞。本文所使用的“改善(ameliorate或ameliorating)”可包括在某种程度上缓解病症的症状中的一种或多种的治疗性作用。本文所使用的“预防(prevent/preventing/prevention)”可包括抑制病症的发生(例如抑制原发性肿瘤的转移)，并且可包括预防在受试者开始遭受癌症的再生之前发生的初级作用和/或抑制或降低癌症的严重性。本文所使用的“有效量”可包括足以治疗病症的治疗性化合物的量(例如剂量)。

在一些实施方式中，包含B7H3+细胞的肿瘤包括癌症，例如黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、口腔鳞状细胞癌、宫颈癌、非小肺癌、膀胱癌、透明细胞肾细胞癌和/或胶质瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤包括胶质瘤，例如少突神经胶质瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、室管膜瘤和/或内生性脑桥胶质瘤(DIPG)。在一些实施方式中，所述肿瘤包括GBM。参见，例如Zhou Z.等，(2013),JNeurooncol.111:257-64，以引用的方式将其整体并入。

在一些实施方式中，本文提供的CAR修饰的T细胞可在体内持续留存至少3天、或至少10天。在一些实施方式中，根据通过CFSE染料稀释所确定的，本文提供的CAR修饰的T细胞可在体内增殖至少2代或至少3代。可通过使用疾病或病症的动物模型，给予细胞以及确定转移的细胞的持续留存和/或增殖能力，来确定CAR修饰的T细胞的增殖和持续留存。在其它实施方式中，可通过经历用抗原携带细胞的多轮激活来在体外测试增殖和激活。

在一些实施方式中，受试者中CAR修饰的细胞的存在可通过从受试者获得样品并检测样品中鉴别标志物(例如EGFRt鉴别标志物)的存在来确定。

在一些实施方式中，进行细胞免疫疗法可包括向受试者给予经遗传修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂，其中，经修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂包含具有CAR(例如特异性结合B7H3的CAR)的CD4+T细胞。在一些实施方式中，进行细胞免疫疗法可包括向受试者给予经遗传修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂，其中，经修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包含具有CAR(例如特异性结合B7H3的CAR)的CD8+细胞。在一些实施方式中，在引入CAR之前，从初始CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞或混合CD4+T细胞中选择CD4+T辅助淋巴细胞。在一些实施方式中，所述CD4+辅助淋巴细胞为初始CD4+T细胞，其中，所述初始CD4+T细胞包括CD45RO-、CD45RA+和/或CD62L+CD4+T细胞。在一些实施方式中，在引入CAR之前，从初始CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞中选择CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方式中，所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞为中央记忆T细胞，其中，所述中央记忆T细胞包含CD45RO+、CD62L+和/或CD8+T细胞。在一些实施方式中，所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞为中央记忆T细胞，所述CD4+辅助T淋巴细胞为初始CD4+T细胞。

如本文所述制备的细胞可根据已知技术用在用于过继免疫疗法的方法和组合物，或将对本领域技术人员而言显而易见的变体中。

在一些实施方式中，通过以下配制细胞：首先从细胞的培养基中收获细胞，然后在适合于给予的介质和容器系统(例如药学上可接受的运载体(carrier))中洗涤并以治疗有效量浓缩细胞。合适的输注介质可为任何等渗介质制剂，通常是标准盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)，但也可使用乳酸林格氏试剂或处于水中的5％右旋糖。输注介质可补充有人血清白蛋白、胎牛血清或其它人血清组分。

在一些实施方式中，所述组合物中治疗有效量的细胞为至少2个细胞子集，例如1个CD8+中央记忆T细胞子集和1个CD4+辅助T细胞子集。在一些实施方式中，所述组合物中治疗有效量的细胞较通常大于10²个细胞、高达10⁶个、高达并包括10⁸个或10⁹个细胞，并且可多于10¹⁰个细胞。细胞的数量将取决于所计划的组合物的最终用途，其中所包含的细胞类型也将取决于此。例如，如果期望对特定抗原(例如B7H3)具有特异性的细胞，则所述群将包含大于70％、通常大于80％、85％和/或90-95％的此类细胞。对于本文提供的用途，所述细胞的体积通常为一升或更少(但不为零)，可为500mL或更少(但不为零)，甚至为250mL或100mL或更少(但不为零)。因此，所需的细胞的密度通常大于10⁴个细胞/mL，并且通常大于10⁷个细胞/mL，通常为10⁸个细胞/mL或更高。临床相关数量的免疫细胞可分配为多次输注，累计等于或超过10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个或10¹²个细胞。

在一些实施方式中，包含本文提供的包含CAR的细胞的药物组合物可静脉内给予、腹膜内给予、肿瘤内给予、给予至骨髓内、给予至淋巴结内和/或给予至脑脊髓液内。在一些实施方式中，本文提供的包含CAR的细胞可被递送至肿瘤的位点。在一些实施方式中，包含本文提供的包含CAR的细胞的药物组合物可与将所述细胞靶向至肿瘤或免疫系统区室并避开例如肺的位点的化合物组合。

组合疗法

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括通过免疫疗法与额外的治疗方案组合来治疗或改善受试者的疾病或病症，例如具有B7H3+细胞的癌症。如本文所用，组合给予可包括向受试者给予两种以上的药剂(例如免疫疗法和额外的治疗方案)，以使得所述两种以上的药剂可同时存在于受试者的血流中(无论它们实际上是何时或如何给予的)。例如，受试者可被给予第一药剂(例如表达CAR的细胞)，并且可被给予额外的治疗剂。在一些实施方式中，同时给予所述药剂。在一些此类实施方式中，组合给予通过将所述药剂以单一剂型组合来完成。当将所述药剂以单一剂型组合时，可将它们物理混合。在一些实施方式中，顺序给予所述药剂。在一些实施方式中，通过相同的途径(例如静脉内)给予所述药剂。在一些实施方式中，所述药剂通过不同的途径给予，例如一种口服给予，另一种静脉内给予。

在一些实施方式中，额外的治疗方案可包括放射疗法。在一些实施方式中，额外的治疗方案可包括给予化学治疗剂。在一些实施方式中，化学治疗剂为细胞周期抑制剂。本文所使用的“细胞周期抑制剂”可包括抑制或防止细胞分裂和/或复制的化学治疗剂。在一些实施方式中，细胞周期抑制剂可包括化学治疗剂，例如阿霉素、美法仑、Roscovitine、丝裂霉素C、羟基脲、5-氟尿嘧啶、顺铂、Ara-C、依托泊苷、吉西他滨、硼替佐米、舒尼替尼、索拉非尼、丙戊酸钠、HDAC抑制剂或达卡巴嗪。额外的化学治疗剂的更多实例包括HDAC抑制剂，例如FR01228、曲古抑菌素A、SAHA和/或PDX101。在一些实施方式中，所述细胞周期抑制剂为DNA合成抑制剂。本文所使用的“DNA合成抑制剂”可包括抑制或阻止癌细胞合成DNA的化学治疗剂。DNA合成抑制剂的实例包括AraC(阿糖胞苷)、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、氟尿苷、吉西他滨、地西他滨(decitabine)、维达扎、氟达拉滨、奈拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、喷司他丁、thiarabine、曲沙他滨、sapacitabine或forodesine。额外的化学治疗剂的更多实例包括FLT3抑制剂，例如Semexanib(SU5416)、舒尼替尼(SU11248)、Midostaurin(PKC412)、Lestautinib(CEP-701)、Tandutinib(MLN518)、CHIR-258、索拉非尼(BAY-43-9006)和/或KW-2449。额外的化学治疗剂的更多实例包括法尼基转移酶抑制剂，例如替吡法尼(tipifarnib，R115777，Zarnestra)、lonafarnib(SCH66336，SarasarTM)和/或BMS-214662。额外的化学治疗剂的更多实例包括拓扑异构酶II抑制剂，例如表鬼臼毒素类依托泊苷、替尼泊苷、蒽环类药物阿霉素和/或4-表-阿霉素。额外的化学治疗剂的更多实例包括P-糖蛋白调节剂，例如zosuquidar三盐酸盐(Z.3HCL)、钒酸盐/酯、或维拉帕米。额外的化学治疗剂的更多实例包括去甲基化剂(hypomethylating agents)，例如5-氮杂-胞苷或2'脱氧阿扎胞苷。

试剂盒

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括试剂盒。在一些此类实施方式中，试剂盒可包括用于修饰细胞以表达CAR的试剂。一些此类实施方式可包含本文提供的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码具有特异性结合B7H3的抗原结合结构域的CAR。在一些实施方式中，试剂盒还可包含用于用本文提供的分离的多核苷酸转导细胞的试剂，所述分离的多核苷酸编码具有特异性结合B7H3的抗原结合结构域的CAR。

实施例

实施例1 B7H3 CAR T细胞的体外和体内活性

用各种间隔区结构域构建包含编码靶向人B7H3的CAR的多核苷酸的病毒载体(图1A)。每种多核苷酸编码：包含特异性结合人B7H3的scFv的抗原结合结构域；三种间隔区结构域中的一种；包含CD28tm、41BB、CD3-ζ的信号转导结构域；T2A跳跃序列；以及包含截短的EGFR(EGFRt)的鉴别标志物。scFv包含编码V_H区的核苷酸序列SEQ ID NO：14的和编码V_L区的核苷酸序列SEQ ID NO：16。EGFRt提供了用于CAR-T细胞的选择和体内追踪标志物。间隔区包括：短间隔区(S)，其包含人IgG4铰链区；中间隔区(M)，其包含人IgG4铰链区和CH3结构域；以及长间隔区(L)，其包含人IgG4铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在该实例中，长间隔区包含野生型核苷酸序列。因此，多核苷酸编码具有S间隔区域、M间隔区域和L(野生型)间隔区域的B7H3CAR。

用编码B7H3-CAR的多核苷酸转导CD8+T细胞，以产生含有具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞，方法与Hudecek M等，(2013)ClinCancer Res.19:3153-64中所描述的方法大体上类似，以引用的方式将其整体并入。

用与Hudecek M等，(2013)中描述的方法大体上类似的方法，以CAR T细胞进行细胞毒性、细胞因子释放和增殖测定。图1B示出了通过含有CAR的B7H3 CAR T细胞的EGFRt进行的鉴别，所述CAR具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域。图1C为示出了B7H3 CAR T细胞中CD3-ζ的表达的蛋白质印迹。

用B7H3 CAR T细胞和多种B7H3+细胞系进行细胞裂解测定，所述B7H3+细胞系包括：人髓母细胞瘤细胞系(Med411FH和D283)、原始神经外胚层肿瘤细胞系(PNET-109FH)和室管膜瘤细胞系(Epd-110GH)。含有具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞各自有效地裂解B7H3+细胞(图1D)。响应于用Med411FH细胞、D283细胞、PNET-109FH细胞和Epd-110GH细胞的刺激，含有具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞产生了细胞因子，包括IFNγ、IL-2和TNFα(图1D)。证实了与含有具有短(S)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞相比，含有具有中(M)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞在与Med411FH细胞、PNET-109FH细胞和Epd-110GH细胞一起中具有更高水平的细胞因子的实质趋势。

NOD-SCID小鼠i.v.植入2×10⁶个表达eGFP标志物的B7H3+U87肿瘤细胞。标志物为GFP与ffluc的融合物；ffluc组分可用于体内成像。通过尾静脉将含有具有短(S)间隔区域或中(M)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞注射入无瘤小鼠或植入有U87细胞的小鼠中。如Hudecek M等(2013)所述，来实施生物发光成像。在本实验中不使用含有具有长(L)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞，因为NOD-SCID小鼠中的残留单核细胞活性抑制含有野生型长间隔区的CAR的活性。图1E显示，与对照的小鼠相比，用含有具有短(S)间隔区域或中(M)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞处理的小鼠的U87肿瘤细胞数量显著减少，存活率显著提高。

实施例2 B7H3 CAR T细胞的体外和体内活性

用编码具有短间隔区域(S)、中间隔区域(M)和长间隔区域(L)的B7H3-CAR的多核苷酸转导CD4+T细胞和CD8+T细胞。在该实例中，长间隔区域包含双突变(L235D，N297Q)。测量了各种蛋白质的表达，包括：EGFRt；作为用于蛋白L的结合伴侣的免疫球蛋白；和作为抗-Fc的结合伴侣的人Fc(图2A)。在含有具有长间隔区域、中间隔区域或短间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞中检测EGFRt和免疫球蛋白。与包含具有长间隔区域或中间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞相比，包含具有短间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞中检测到的人Fc水平较低。这与不含某些Fc组分的短间隔区一致。对于经转导的CD4+T细胞和CD8+T细胞的各种群，测量CD3-ζ的表达(图2B)。

用B7H3 CAR T细胞和多种细胞系进行细胞裂解测定，所述细胞系包括：U87细胞(胶质母细胞瘤细胞系)、缺乏B7H3表达的经修饰的U87细胞、Be2细胞(神经母细胞瘤细胞系)和D283细胞(髓母细胞瘤细胞系)。含有具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞各自有效地裂解B7H3+细胞(图2C)。B7H3 CAR T细胞对缺乏B7H3表达的经修饰的U87细胞没有显著的细胞毒性作用。含有具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞针对U87细胞、Be2细胞和D283细胞中的每一种均具有活性。

测量B7H3 CAR T细胞针对多种细胞系的体外细胞因子产生，所述细胞系包括Jurkat细胞(T细胞系)、Jurkat OKT3细胞、U87细胞、缺乏B7H3表达的经修饰的U87细胞、Be2细胞和D283细胞。与同Jurkat细胞、Jurkat OKT3细胞或缺乏B7H3表达的经修饰的U87细胞一起孵育的CD4+B7H3 CAR T细胞相比，响应于用U87细胞、Be2细胞和D283细胞进行的刺激，含有具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR的CD4+B7H3 CAR T细胞分别显示出大量的细胞因子释放(图2D)。与CD4+B7H3 CAR T细胞和CD8+B7H3 CAR T细胞(各含有具有短(S)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR)相比，各自含有具有中(M)间隔区域的CAR的经刺激的CD4+B7H3 CAR T细胞和CD8+B7H3 CAR T细胞显示出显著且实质较高水平的细胞因子释放(图2D)。

用表达ffluc-eGFP标志物的U87细胞接种NOD-SCID小鼠。用含有具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR的CD8+B7H3 CAR T细胞对小鼠进行处理。含有具有短(S)间隔区域、中(M)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR的CD8+B7H3 CAR T细胞各自降低小鼠中检测到的U87细胞的初始水平。然而，与用含有具有长(L)间隔区域的CAR的CD8+B7H3CAR T细胞处理的小鼠相比，用含有具有短(S)间隔区域或中(M)间隔区域的CAR的CD8+B7H3CAR T细胞处理的小鼠表现出实质且巨大得多的U87细胞的初始减少，以及提高的存活率(图2E)。因此，与含有具有短(S)间隔区域或长(L)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞相比，含有具有中(M)间隔区域的CAR的B7H3 CAR T细胞具有高得多的体外和体内活性。

实施例3 B7H3 CAR T细胞的甲氨蝶呤选择

用包含编码B7H3 CAR和DHFR双突变体(DHFRdm)选择标志物的多核苷酸的病毒载体转导CD4+T细胞，所述B7H3 CAR具有中间隔区域。用甲氨蝶呤处理细胞。在培养期间针对不同的转导群体测量了EGFRt、人Fab和人Fc的表达(图3A)。EGFRt、人Fab和人Fc在经处理的细胞中表达。

针对多种细胞系测量了关于B7H3 CAR T细胞的体外细胞因子产生，所述细胞系包括Jurkat细胞(T细胞系)、Jurkat OKT3细胞、U87细胞、缺乏B7H3表达的经修饰的U87细胞、Be2细胞和D283细胞。测量了用U87细胞、Be2细胞和D283细胞刺激的B7H3 CAR T细胞的细胞因子产生(图3B)。药物选择基因(DHFRdm)的添加允许在甲氨蝶呤存在下对表达CAR的T细胞进行富集。

实施例4生产运行的T细胞裂解B7H3阳性靶细胞系。

将靶标⁵¹Cr标记的B7H3-(K562 B7H3 KO)、对照细胞(K562 B7H3 KO+OKT3)或B7H3+细胞系(K562亲本、U87MG、U251TMG、SKNBE2和D283 med)与2GM B7H3CAR T细胞共培养四个小时。使用闪烁计数器测量特异性裂解(图4)。T细胞是>95％EGFRt阳性的CD8 T细胞(总数的44.2％)和CD4 T细胞(总数的55.7％)的混合物。直方图插图显示关于每种靶肿瘤细胞的B7H3阳性。几乎没有或没有检测到针对B7H3-K562 B7H3 KO细胞系的特异性裂解。相反，观测到针对对照和实验细胞系的显著特异性裂解。

因此，数据显示B7H3 CAR T细胞特异性裂解B7H3+对照和实验细胞系。

实施例5生产运行的T细胞在与B7H3阳性靶细胞系共培养时产生细胞因子。

将靶标B7H3-(K562 B7H3 KO)、对照细胞(K562 B7H3 KO+OKT3)或B7H3+细胞系(K562亲本、U87MG、U251TMG、SKNBE2和D283 med)与2GM B7H3 CAR T细胞共培养持续二十四个小时。T细胞是>95％EGFRt阳性的CD8 T细胞(总数的44.2％)和CD4 T细胞(总数的55.7％)的混合物。图表(图5)示出了当通过与多种感兴趣的靶标共培养进行刺激时，空白或B7H3 CAR T细胞的细胞因子释放水平。所测量的细胞因子包括IFNγ、IL-2和TNFα。

数据显示，与对照细胞(K562 B7H3 KO+OKT3)或B7H3+细胞系(K562亲本、U87MG和SKNBE2)共培养产生细胞因子IFNγ、IL-2和TNFα，但B7H3-(K562 B7H3 KO)没有，而与B7H3-(K562 B7H3 KO)共培养的T细胞不产生任何这些细胞因子(图5)。

实施例6生产运行的T细胞能够在体内消除U87肿瘤细胞。

图6示出了小鼠中用ffluc标志物检测的B7H3+U87肿瘤细胞水平以及存活率，所述小鼠接种有U87细胞，并用通过通用的组织培养生产中心(TCPC)T细胞生产方案和先前的PLAT-02生产方案产生的CD4和CD8+B7H3 CAR T细胞进行处理。

在第0天，将约200,000个U87 GFP:ffluc(cJ06289)肿瘤细胞颅内注射到小鼠中(图6)。在第6天，进行通量分析(通过成像)以确认小鼠中肿瘤细胞的存在(图6)。在第7天，在相同坐标下颅内给予2×10⁶个1:1CD4:CD8 T细胞。监测通量分析(通过成像)和存活直至研究结束，即第90天(图6)。

数据显示，在该颅内U87模型中，两种B7H3 CAR T细胞群均能够减少通量并延长存活(图6)。因此，数据显示B7H3 CAR T细胞能够在体内消除U87肿瘤细胞。

实施例7生产运行的T细胞能够在体内消除皮下肿瘤细胞。

图7示出了小鼠中用ffluc标志物检测的B7H3+Be2肿瘤细胞的水平以及存活率，所述小鼠接种有Be2细胞，并分别用通过通用的组织培养生产中心(TCPC)T细胞生产方案或先前的PLAT-02CD19 CAR T细胞生产方案生产的CD4和CD8+B7H3 CAR T细胞或CD19 CAR T细胞进行处理。

在该模型中，在第0天皮下注射约4.3×10⁶个Be2 CD19t GFP:ffluc(cJ06713)肿瘤细胞(图7)。在第4天，进行通量分析(通过成像)以确认小鼠中肿瘤细胞的存在(图7)。在第5天，通过静脉内注射给予约20×10⁶个1:1CD4:CD8 T细胞(图7)。监测通量分析(通过成像)和存活直至研究结束(即第90天)(图7)。

数据显示，在该皮下Be2模型中，B7H3 CAR T细胞和CD19 CAR T细胞均能够减少通量并延长存活(图7)。因此，数据显示B7H3 CAR T细胞和CD19 CAR T细胞均能够在体内消除皮下肿瘤细胞。

实施例8生产运行的T细胞能够在体内消除皮下肿瘤细胞。

图8示出了小鼠中用ffluc标志物检测的B7H3+Be2肿瘤细胞的水平以及存活率，所述小鼠接种有Be2细胞，并用通过通用的组织培养生产中心(TCPC)T细胞生产方案或先前的PLAT-02T细胞生产方案生产的CD4和CD8+B7H3 T细胞进行处理。

在该模型中，在第0天皮下注射约5×10⁶个Be2 CD19t GFP:ffluc(cJ06713)肿瘤细胞(图8)。在第6天，进行通量分析(通过成像)以确认小鼠中肿瘤细胞的存在(图8)。在第5天，通过静脉内注射给予30×10⁶个1:1CD4:CD8 T细胞(图8)。监测通量分析(通过成像)和存活直至研究结束(即第75天)(图8)。

数据显示，在该皮下Be2模型中，两种B7H3 CAR T细胞组群(cell lots)均能够减少通量并延长存活(图8)。因此，数据显示两种B7H3 CAR T细胞组群均能够在体内消除皮下肿瘤细胞。

实施例9 CD8+B7H3 CAR T细胞能够在体内消除U251T胶质瘤肿瘤细胞

图9示出了在接种有U251T细胞并用CD8+B7H3 CAR T细胞处理的小鼠中，使用ffluc标志物检测的B7H3+U251T肿瘤细胞的水平以及存活率。

在该模型中，在第0天颅内注射约200,000个U251T GFP:ffluc(cJ06194)肿瘤细胞(图9)。在第6天，进行通量分析(通过成像)以确认小鼠中肿瘤细胞的存在(图9)。在第7天，以相同坐标给予约2×10⁶个空白或B7H3 CAR T细胞。监测通量分析(通过成像)和存活直至研究结束，即第90天(图9)。

数据显示，在该颅内U251T模型中，B7H3 CAR T细胞群能够减少通量并延长存活(图9)。因此，数据显示CD8+B7H3 CAR T细胞能够在体内消除U251T胶质瘤肿瘤细胞

实施例10 CD8+B7H3 CAR T细胞能够在体内消除弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG) 原发性肿瘤细胞。

图10示出了在接种有DIPG细胞并用CD8+B7H3 CAR T细胞处理的小鼠中，使用ffluc标志物检测的B7H3+DIPG肿瘤细胞的水平以及存活率。

在该模型中，在第0天颅内注射约0.2⁶个Pbt09mcl DIPG mCherry:ffluc肿瘤细胞。在第39天，进行通量分析(通过成像)以确认小鼠中肿瘤细胞的存在(图10)。在第40天，以相同坐标给予约2×10⁶个CD8混合空白或B7H3 CAR T细胞(图10)。监测通量分析(通过成像)和存活直至研究结束，即第90天(图10)。该研究在空白组死于肿瘤之前结束；然而，与空白处理组相比，B7H3 CAR T细胞能够将通量减少至基线。DIPG是目前尚未由细胞免疫疗法靶向的罕见的肿瘤类型。

数据显示，在该颅内DIPG模型中，B7H3 CAR T细胞群能够减少通量并延长存活(图10)。因此，数据显示CD8+B7H3 CAR T细胞能够在体内消除DIPG原发性肿瘤细胞。

本文所使用的术语“包含(comprising)”与“包括(including)”、“含有(containing)”或“特征在于”同义，并且是包括性或开放性的，不排除另外的未叙述的要素或方法步骤。

以上描述公开了本发明的若干种方法和材料。本发明允许对方法和材料进行修改，并且允许对制造方法和设备进行改变。通过考虑本公开或本文公开的发明的实践，这样的修改对于本领域技术人员将变得显而易见。因此，无意将本发明限于本文公开的特定实施方式，相反，本发明涵盖了落入本发明的真实范围和精神内的所有修改和替代方式。

本文引用的所有参考文献(包括但不限于已公开和未公开的申请、专利和文献参考文献)均以引用的方式整体并入本文，并因此成为本说明书的一部分。在以引用的方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相抵触的范围内，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。

序列表

<110> 西雅图儿童医院（DBA西雅图儿童研究所）

<120> 包含B7H3嵌合抗原受体的方法和组合物

<130> SCRI.170WO

<150> US 62/725599

<151> 2018-08-31

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VH CDR1多肽

<400> 1

Phe Gly Met His

1

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VH CDR2多肽

<400> 2

Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VH CDR3多肽

<400> 3

Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VL CDR1多肽

<400> 4

Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VL CDR2多肽

<400> 5

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VL CDR3多肽

<400> 6

Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VH CDR1核酸

<400> 7

tttggaatgc ac 12

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VH CDR2核酸

<400> 8

tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag 48

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VH CDR3核酸

<400> 9

gggagggaaa acatttacta cggtagtagg cttgactac 39

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VL CDR1核酸

<400> 10

aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcc 33

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VL CDR2核酸

<400> 11

tcggcatcct accggtacag t 21

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VL CDR3核酸

<400> 12

cagcaatata acaactatcc attcacg 27

<210> 13

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VH区多肽

<400> 13

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VH区核酸

<400> 14

gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120

ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg acagtagtgc catctactat 180

gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240

ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgg aagagggagg 300

gaaaacattt actacggtag taggcttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360

tcctca 366

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VL区多肽

<400> 15

Asp Ile Ala Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 16

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；VL区核酸

<400> 16

gacattgcga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaatgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacaact atccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa a 321

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；间隔区域

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X = Cys、Gly或Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> X = Cys或Thr

<400> 17

Xaa Pro Pro Xaa Pro

1 5

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；短（S）间隔区

<400> 18

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 19

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；中（M）间隔区

<400> 19

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg

1 5 10 15

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

20 25 30

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

35 40 45

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

50 55 60

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

65 70 75 80

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

85 90 95

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

100 105 110

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

115

<210> 20

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；长（L）间隔区

<400> 20

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；人IgG1铰链

<400> 21

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；人IgG2铰链

<400> 22

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；人IgG3铰链

<400> 23

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro

1 5 10 15

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；人IgG4铰链

<400> 24

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；经修饰的人IgG4铰链

<400> 25

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；经修饰的人IgG4铰链

<400> 26

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；经修饰的人IgG4铰链

<400> 27

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；经修饰的人IgG4铰链

<400> 28

Glu Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 29

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；CD28tm核苷酸序列

<400> 29

atgttctggg tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc 60

gtggccttca tcatcttttg ggtg 84

<210> 30

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；CD28tm氨基酸序列

<400> 30

Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 31

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；CD3-ζ信号转导结构域核苷酸序列

<400> 31

cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaatcagctg 60

tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120

cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180

gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240

aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336

<210> 32

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；4-1BB信号转导结构域核苷酸序列

<400> 32

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 33

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；T2A核苷酸序列

<400> 33

ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60

cccggcccta gg 72

<210> 34

<211> 1071

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的；EGFRt核苷酸序列

<400> 34

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120

aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180

ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240

ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300

gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360

caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420

tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480

gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540

agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600

cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660

ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720

aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780

acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840

gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900

gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960

ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020

ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat g 1071

Claims

1.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含：

单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段特异性结合B7H3；

跨膜结构域；

所述scFv和所述跨膜结构域之间的间隔区；以及

细胞内信号转导结构域。

2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中，所述scFv包含：与氨基酸序列SEQ IDNO：03具有至少95％同一性的重链可变区(V_H)CDR3、以及与氨基酸序列SEQ ID NO：06具有至少95％同一性的轻链可变区(V_L)CDR3。

3.如权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中，所述scFv包含：与氨基酸序列SEQ IDNO：01具有至少95％同一性的V_H CDR1、与氨基酸序列SEQ ID NO：02具有至少95％同一性的V_H CDR2、与氨基酸序列SEQ ID NO：04具有至少95％同一性的V_L CDR1、以及与氨基酸序列SEQ ID NO：05具有至少95％同一性的V_L CDR2。

4.如权利要求1-3中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述scFv包含与氨基酸序列SEQ ID NO：13具有至少95％同一性的V_H区。

5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述scFv包含与氨基酸序列SEQ ID NO：15具有至少95％同一性的V_L区。

6.如权利要求1-5中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述间隔区包含氨基酸序列X₁PPX₂P。

7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述间隔区包含人抗体的铰链区的一部分，或其修饰的变体。

8.如权利要求1-7中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述间隔区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：18具有至少95％同一性的IgG4铰链间隔区，由与氨基酸序列SEQ ID NO：18具有至少95％同一性的IgG4铰链间隔区组成，或者基本上由与氨基酸序列SEQ ID NO：18具有至少95％同一性的IgG4铰链间隔区组成。

9.如权利要求1-8中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述间隔区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：19具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH3间隔区，由与氨基酸序列SEQ ID NO：19具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH3间隔区组成，或者基本上由与氨基酸序列SEQ IDNO：19具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH3间隔区组成。

10.如权利要求1-9中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述间隔区包含与氨基酸序列SEQ ID NO：20具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH2-CH3间隔区，由与氨基酸序列SEQID NO：20具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH2-CH3间隔区组成，或者基本上由与氨基酸序列SEQ ID NO：20具有至少95％同一性的IgG4铰链-CH2-CH3间隔区组成。

11.如权利要求1-10中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述间隔区包含IgG4铰链-CH2(L235D，N297Q)-CH3间隔区，由IgG4铰链-CH2(L235D，N297Q)-CH3间隔区组成，或者基本上由IgG4铰链-CH2(L235D，N297Q)-CH3间隔区组成。

12.如权利要求1-11中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述跨膜结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO：30具有至少95％同一性的CD28跨膜结构域(CD28tm)。

13.如权利要求1-12中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述细胞内信号转导结构域包含初级信号转导结构域和共刺激信号转导结构域，任选地包含CD3ζ的全部或部分与共刺激结构域的组合，所述共刺激结构域选自于如下物质的信号转导结构域所组成的组：CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3，以及它们的组合。

14.如权利要求1-13中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述细胞内信号转导结构域包含由与核苷酸序列SEQ ID NO：31具有至少95％同一性的核酸编码的CD3ζ的信号转导部分。

15.如权利要求1-14中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述细胞内信号转导结构域包含由与核苷酸序列SEQ ID NO：32具有至少95％同一性的核酸编码的4-1BB的信号转导部分。

16.如权利要求1-15中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸进一步包含编码鉴别标志物的核酸。

17.如权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中，所述鉴别标志物为截短的受体。

18.如权利要求17所述的分离的多核苷酸，其中，所述截短的受体选自于由截短的EGFR(EGFRt)、截短的HER2(HER2t)和截短的CD19(CD19t)所组成的组。

19.如权利要求1-18中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸进一步包含核糖体跳跃序列。

20.如权利要求19所述的分离的多核苷酸，其中，所述核糖体跳跃序列包括P2A或T2A。

21.如权利要求1-20中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸进一步包含适合于选择包含所述分离的多核苷酸的细胞的选择标志物。

22.如权利要求21所述的分离的多核苷酸，其中，所述选择标志物包括二氢叶酸还原酶转基因。

23.如权利要求22所述的分离的多核苷酸，其中，所述二氢叶酸还原酶转基因为二氢叶酸还原酶双突变体(DHFRdm)。

24.如权利要求23所述的分离的多核苷酸，其中，所述二氢叶酸还原酶双突变体包含氨基酸突变L22F和F31S。

25.如权利要求1-24中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：09具有至少95％同一性的V_H CDR3的核苷酸序列、和编码与SEQ ID NO：12具有至少95％同一性的V_L CDR3的核苷酸序列。

26.如权利要求1-25中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：07具有至少95％同一性的V_H CDR1的核苷酸序列、编码与SEQ ID NO：08具有至少95％同一性的V_H CDR2的核苷酸序列、与SEQ ID NO：10具有至少95％同一性的V_L CDR1、编码与SEQ ID NO：11具有至少95％同一性的V_L CDR2的核苷酸序列。

27.如权利要求1-26中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：14具有至少95％同一性的V_H可变区氨基酸序列的核苷酸序列。

28.如权利要求1-27中任一项所述的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码与SEQ ID NO：16具有至少95％同一性的V_L可变区氨基酸序列的核苷酸序列。

29.由如权利要求1-28中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。

30.一种载体，所述载体包含如权利要求1-28中任一项所述的分离的多核苷酸。

31.如权利要求30所述的载体，其中，所述载体为病毒载体。

32.如权利要求30或31所述的载体，其中，所述载体为慢病毒载体或腺病毒载体。

33.一种细胞，所述细胞包含如权利要求1-28中任一项所述的分离的多核苷酸。

34.一种细胞，所述细胞包含如权利要求30-32中任一项所述的载体。

35.一种细胞，所述细胞包含由如权利要求1-28中任一项所述的分离的多核苷酸所编码的蛋白质。

36.如权利要求35所述的细胞，其中，所述细胞选自于由CD8+T细胞和CD4+T细胞所组成的组。

37.如权利要求36所述的细胞，其中，所述细胞为CD8+T细胞毒性淋巴细胞，所述CD8+T细胞毒性淋巴细胞选自于由初始CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞所组成的组。

38.如权利要求37所述的细胞，其中，所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞为中央记忆T细胞，并且其中，所述中央记忆T细胞为CD45RO+、CD62L+和CD8+阳性的。

39.如权利要求36所述的细胞，其中，所述细胞为CD4+T辅助淋巴细胞，所述CD4+T辅助淋巴细胞选自于由初始CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞所组成的组。

40.如权利要求39所述的细胞，其中，所述CD4+辅助淋巴细胞为包含CD45RA+、CD62L+和CD4+且缺乏CD45RO的初始CD4+T细胞。

41.如权利要求33-40中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为前体T细胞。

42.如权利要求33-41中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为造血干细胞。

43.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求33-42中任一项所述的细胞和药学上可接受的赋形剂。

44.一种制备如权利要求33-42中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括：

将如权利要求1-28中任一项所述的分离的核酸引入淋巴细胞中；

在选自于由抗CD3抗体、抗CD28抗体和细胞因子所组成的组中的药剂存在下，对包含所述分离的核酸的淋巴细胞进行培养；以及

针对包含所述分离的核酸的淋巴细胞进行选择性富集。

45.如权利要求44所述的方法，其中，选择性富集包括使包含所述分离的核酸的淋巴细胞与选择试剂接触。

46.如权利要求45所述的方法，其中，所述选择试剂包括甲氨蝶呤。

47.如权利要求44-46中任一项所述的方法，其中，所述淋巴细胞具有CD45RA-、CD45RO+和CD62L+表型。

48.如权利要求44-47中任一项所述的方法，其中，所述淋巴细胞为CD8+淋巴细胞或CD4+淋巴细胞。

49.如权利要求44-48中任一项所述的方法，其中，所述细胞因子选自于由IL-15、Il-7、IL-2和Il-21所组成的组。

50.如权利要求44-49中任一项所述的方法，所述方法进一步包括对经选择性富集的淋巴细胞进行分离。

51.如权利要求50所述的方法，所述方法包括使所述经选择性富集的淋巴细胞与针对由所述淋巴细胞表达的鉴别标志物的抗体接触。

52.如权利要求51所述的方法，其中，所述鉴别标志物包括截短的受体。

53.如权利要求52所述的方法，其中，所述截短的受体选自于由截短的EGFR(EGFRt)、截短的HER2(HER2t)和截短的CD19(CD19t)所组成的组。

54.一种治疗或改善患有包含B7H3⁺细胞的肿瘤的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的如权利要求33-42中任一项所述的细胞。

55.如权利要求54所述的方法，其中，所述细胞从所述受试者的细胞制备而来。

56.如权利要求54或55所述的方法，其中，所述给予为静脉内给予。

57.如权利要求54-56中任一项所述的方法，其中，所述给予为在所述受试者的所述肿瘤位点处局部给予。

58.如权利要求54-57中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤包括癌症，所述癌症选自于由以下所组成的组：黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、口腔鳞状细胞癌、宫颈癌、非小肺癌、膀胱癌、透明细胞肾细胞癌和胶质瘤。

59.如权利要求54-58中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤包括胶质瘤。

60.如权利要求54-59中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤包括选自于由以下所组成的组中的胶质瘤：少突神经胶质瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、室管膜瘤和内生性脑桥胶质瘤(DIPG)。

61.如权利要求54-60中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤包括多形性胶质母细胞瘤(GBM)。

62.如权利要求54-61中任一项所述的方法，所述方法进一步包括给予额外的治疗方案。

63.如权利要求62所述的方法，其中，所述额外的治疗方案包括放射疗法。

64.如权利要求62或63所述的方法，其中，所述额外的治疗方案包括化学治疗化合物。

65.如权利要求64所述的方法，其中，所述化学治疗化合物选自于由以下所组成的组：2'-脱氧阿扎胞苷、4-表-阿霉素、5-氮杂-胞苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、Ara-C、BMS-214662、硼替佐米、卡培他滨、CHIR-258、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、达卡巴嗪、地西他滨、阿霉素、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉滨、forodesine、FR01228、吉西他滨、羟基脲、KW-2449、lestautinib、lonafarnib、美法仑、midostaurin、丝裂霉素C、奈拉滨、喷司他丁、roscovitine、sapacitabine、semexanib、丙戊酸钠、索拉非尼、舒尼替尼、坦度替尼、替尼泊苷、thiarabine、替吡法尼、曲古抑菌素A、曲沙他滨、钒酸盐/酯、维拉帕米、维达扎和zosuquidar三盐酸盐。

66.如权利要求62-65中任一项所述的方法，其中，所述细胞的给予和所述额外的治疗方案的给予是顺序的。

67.如权利要求62-65中任一项所述的方法，其中，所述细胞的给予和所述额外的治疗方案的给予是同时的。

68.如权利要求54-67中任一项所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物。

69.如权利要求54-68中任一项所述的方法，其中，所述受试者为人。

70.一种用于药物的细胞，所述细胞包含由如权利要求1-28中任一项所述的分离的多核苷酸编码的蛋白质。

71.一种用于治疗受试者中的肿瘤的细胞，所述肿瘤包含B7H3+细胞。

72.如权利要求71所述的细胞，其中，所述肿瘤包括癌症，所述癌症选自于由以下所组成的组：黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、口腔鳞状细胞癌、宫颈癌、非小肺癌、膀胱癌、透明细胞肾细胞癌和胶质瘤。

73.如权利要求71或72所述的细胞，其中，所述肿瘤包括胶质瘤。

74.如权利要求71-73中任一项所述的细胞，其中，所述肿瘤包括选自于由以下所组成的组中的胶质瘤：少突神经胶质瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、室管膜瘤和内生性脑桥胶质瘤(DIPG)。

75.如权利要求71-74中任一项所述的细胞，其中，所述肿瘤包括多形性胶质母细胞瘤(GBM)。

76.如权利要求71-75中任一项所述的细胞，其中，所述细胞选自于由CD8+T细胞和CD4+T细胞所组成的组。

77.如权利要求76所述的细胞，其中，所述细胞为CD8+T细胞毒性淋巴细胞，所述CD8+T细胞毒性淋巴细胞选自于由初始CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞所组成的组。

78.如权利要求77所述的细胞，其中，所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞为中央记忆T细胞，并且其中，所述中央记忆T细胞为CD45RO+、CD62L+和CD8+阳性的。

79.如权利要求76所述的细胞，其中，所述细胞为CD4+T辅助淋巴细胞，所述CD4+T辅助淋巴细胞选自于由初始CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞所组成的组。

80.如权利要求79所述的细胞，其中，所述CD4+辅助淋巴细胞为包含CD45RA+、CD62L+和CD4+且缺乏CD45RO的初始CD4+T细胞。

81.如权利要求71-80中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为前体T细胞。

82.如权利要求71-81中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为造血干细胞。

83.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码与氨基酸序列SEQ ID NO：03具有至少95％序列同一性的重链可变区(V_H)CDR3、和/或与氨基酸序列SEQ ID NO：06具有至少95％序列同一性的轻链可变区(V_L)CDR3。

84.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码与氨基酸序列SEQ ID NO：01具有至少95％序列同一性的V_H CDR1、与氨基酸序列SEQ ID NO：02具有至少95％序列同一性的V_HCDR2、与氨基酸序列SEQ ID NO：04具有至少95％序列同一性的V_L CDR1、和/或与氨基酸序列SEQ ID NO：05具有至少95％序列同一性的V_L CDR2。

85.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码与氨基酸序列SEQ ID NO：13具有至少95％序列同一性的V_H区。

86.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码与氨基酸序列SEQ ID NO：15具有至少95％序列同一性的V_L区。

87.一种分离的多肽或包含分离的多肽的组合物，其中，所述多肽与氨基酸序列SEQ IDNO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：06、SEQ IDNO：13或SEQ ID NO：15具有至少95％序列同一性。

88.一种细胞，所述细胞包含如权利要求83-86中任一项所述的分离的多核苷酸或者如权利要求87所述的多肽。