KR20200010186A - 극저온 보관 방법 - Google Patents

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KR20200010186A
KR20200010186A KR1020197029850A KR20197029850A KR20200010186A KR 20200010186 A KR20200010186 A KR 20200010186A KR 1020197029850 A KR1020197029850 A KR 1020197029850A KR 20197029850 A KR20197029850 A KR 20197029850A KR 20200010186 A KR20200010186 A KR 20200010186A
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사라 엘리자베스 처취
존 챨스 군터
카트린 폴록
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주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
존 챨스 군터
카트린 폴록
사라 엘리자베스 처취
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Abstract

본 개시는, 예컨대 도너의 혈액으로부터의 세포를 극저온으로 냉동하고 보관하기 위한 극저온 보관에 관련된 방법 및 조성물 및 제조 물품, 및 성분채집 샘플을 가공하는 방법에 관한 것이다.

Description

극저온 보관 방법
관련 출원 정보
본 출원은 2017년 3월 14일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/471,343에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 극저온 보관 방법에 관한 것이다.
세포 치료법은 세포가 치료 목적을 달성하기 위하여 수령체(recipient)에게 투여되는 기법이다. 임의의 제공된 수령체의 경우, 투여된 세포는 또 다른 사람으로부터 또는 수령체 자신으로부터 기원할 수 있다. 후자의 경우는 자가 세포 치료법으로 불릴 수 있는데, 즉, 세포가 수집된 수령체로 세포가 다시 투여된다. 자가 세포 치료법의 장점은, 세포가 수집되는 도너(donor)가 수령체이기 때문에, 수령체의 신체가 투여된 세포를 거부할 수 있을 기회의 감소를 포함할 수 있다.
세포 치료법에 대해, 세포를 도너로부터 어떻게 그리고 언제 수집하는지, 및 세포가 수집 후 및 투여 전에 어떻게 처리되는지가 치료법의 효율 및 유용성, 예컨대 필요할 때 세포가 수령체에게 어떻게 신속하게 투여될 수 있는지에 영향을 미칠 수 있다.
이런 목적에 대해, 수령체와 같은 대상체에게 세포 및 세포 조성물의 극저온 보관(cryogenic storage) 및/또는 그것의 조작 및/또는 투여를 위한 방법, 시스템 및 조성물, 및 제조 물품이 제공된다. 일부 측면으로, 구체예의 장점들 중에는, 다른 것들 중에서도, 세포 치료법의 유용성, 효능, 및/또는 다른 측면을 증강시키는 것이다. 방법은 또한 또는 대안적으로 도너로부터 수집된 세포를 사용하는 다른 의학적 또는 연구 과정에 이익을 제공할 수 있다.
일부 측면으로, 본 개시는 환자가 세포 치료법을 필요로 하기 전에 수집되고, 나중의 사용을 위해 극저온 보존된(cryopreserved) 성분채집술(apheresis)을 포함하는 세포, 및 관련된 물품, 조성물 및 시스템의 극저온 보관, 가공, 조작, 및 투여 방법에 관련된다.
일부 측면으로, 본 개시의 세포 및 조성물 및 물품은, 예를 들어, 도너 및/또는 또 다른 수령체에서와 같은 질환 또는 상태의 후속 치료적 처치를 위해 사용될 수 있는 것들이다. 일부 구체예에서, 방법은 도너의 혈액으로부터 세포를 극저온 보관하는 것을 포함한다. 극저온 보관된 세포는, 일부 구체예에서, 그런 후 질환 또는 상태를 치료하기 위한 세포 치료법에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 도너가 질환 또는 상태로 진단된 후에, 및 도너가 다음: 질환 또는 상태에 대한 임의의 초기 치료, 질환 또는 상태에 대한 임의의 표적화된 치료 또는 임의의 표지화된 치료, 또는 방사선요법 및/또는 화학요법 이외의 임의의 치료 중 한 가지 이상을 받기 전에 수집된다. 일부 구체예에서, 세포는 질환에 대한 초기 치료 후에 질환의 첫 번째 재발 후에, 및 도너 또는 대상체가 질환에 대한 후속 치료를 받기 전에 수집된다. 초기 및/또는 후속 치료는, 특정 구체예에 따르면, 세포 치료법 이외의 치료법일 수 있다. 일부 구체예에서, 수집된 세포는 초기 및/또는 후속 치료 후에 세포 치료법에서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 질환의 치료의 제2선 후에 질환의 두 번째 재발 후에, 및 도너 또는 대상체가 질환에 대한 후속 치료를 받기 전에 수집된다. 일부 구체예에서, 환자는 치료의 제2선 후에, 예를 들어, 특정 위험 인자를 평가함으로써 재발할 가능성이 있는 것으로서 확인된다. 일부 구체예에서, 위험 인자는 질환 유형 및/또는 유전학, 예컨대 이중유전자이상 림프종(double-hit lymphoma), 원발성 난치성 암(primary refractory cancer), 또는 활성화된 B-세포 림프종을 근거로 한다. 일부 구체예에서, 위험 인자는 임상적 표시, 예컨대 제1선 치료 후 초기 재발, 또는 치료 후 다른 불량한 예후 지표 (예컨대, IPI > 2)를 근거로 한다.
일부 구체예에서, 세포는 도너 또는 대상체가 질환으로 진단되기 전에 수집된다. 일부 측면으로, 도너 또는 대상체는 질환이 발병할 위험이 있는 것으로 측정되거나, 또는 세포 치료법이 인생의 후반기에 필요한 경우에 질환이 발병하거나 질환으로 진단받을 위험이 있는 것으로 간주되지 않으면서 세포를 예치하거나 보관하는 것이 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 도너 또는 대상체는 유전자 돌연변이, 유전자 이상, 유전자 파괴, 가족력, 단백질 이상 (예컨대 단백질 생성 및/또는 프로세싱의 결핍), 및 질환이 발병할 위험을 증가시킬 수 있는 라이프스타일 선택과 같은 인자들을 근거로 질환이 발병할 위험이 있는 것으로 여겨질 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 예방제로서 수집된다.
일부 구체예에서, 세포는 12시간, 24시간, 36시간, 또는 48시간 또는 그 이상의 일정 기간 동안 보관되거나 예치된다. 일부 구체예에서, 세포는 1주, 2주, 3주, 또는 4주 또는 그 이상의 일정 기간 동안 보관되거나 예치된다. 일부 구체예에서, 세포는 장기간 보관 또는 장기간 예치에 놓인다. 일부 측면으로, 세포는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 40년, 또는 그 이상의 일정 기간 동안 보관된다.
개시는 또한 일부 측면으로 성분채집 샘플을 가공하는 방법에 관련된다. 일부 구체예에서, 방법은 도너로부터 채집한 성분채집 샘플을 보관 시설(storage facility)에 냉장 환경에서 배송하는 것, 및 보관 시설에서 성분채집 샘플을 극저온 보관하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 배송 전에, 샘플은, 예를 들어, T 세포, 예컨대 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 선택함으로써 가공된다. 일부 구체예에서, 이러한 가공은 샘플을 배송한 후에 및 샘플을 극저온 보관하기 전에 수행된다. 일부 구체예에서, 가공은 극저온 보관한 후에 샘플을 해동한 후에 수행된다.
일부 구체예에서, 기술된 구체예들에 따르는 방법의 장점은 세포 치료법의 개선된 효율 및/또는 유효성을 포함한다. 도너가 그들의 세포를, 도너, 및 그로써 그들의 세포가 질환에 대해 집중적인 치료를 수행하지 않았을 때 및/또는 질환 또는 상태의 위축 또는 그것의 진단 전의 단계에서 보관하는 것이 허용됨으로써, 이러한 세포는 한 회기 또는 다수 회기의 치료 후에 수득된 세포와 비교하여 세포 치료법에 사용하기 위한 특정 장점을 가질 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 회기의 치료 전에 수득된 세포는 여러 회기의 치료가 진행된 세포보다 더 건강할 수 있거나, 더 높은 수준의 특정 세포 활성을 나타낼 수 있거나, 더 신속하게 성장할 수 있거나, 및/또는 유전자 조작에 대해 더 수용적일 수 있다. 본원에서 기술된 구체예들에 따르는 장점의 또 다른 예로는 편리성을 들 수 있다. 예를 들어, 도너의 세포가 세포 치료법에 필요하게 되기 전에 그것을 수집, 선택적으로 가공, 및 보관함으로써, 세포는 수령체가 나중에 그 세포를 필요로 하게 된다면 및 필요로 하게 되는 경우에 쉽게 이용될 수 있을 것이다. 이것은 성분채집 실험실 용량을 증가시킬 수 있어서, 성분채집 수집 과정의 계획을 세우기 위한 보다 큰 융통성을 숙련자에게 제공할 수 있을 것이다.
일부 구체예에서, 세포 및/또는 조성물 및/또는 제조 물품, 예컨대 세포를 함유하는 용기 (예컨대, 세포 바이알 또는 주머니)는, 예컨대 가공, 극저온 보존, 및/또는 보관 중에, 예컨대 장기간 보관 중에, 세포 및 샘플의 목록작성을 위해 하나 이상의 코드 또는 다른 식별자로 표시된다. 일부 구체예에서, 시스템 및 물품은 다수의 용기를 포함하며, 각각의 용기는 극저온 보존된 세포 조성물, 예컨대 제공된 방법의 구체예들에 따라 생성된 세포 조성물을 포함하며, 다수의 용기는 각각 상이한 도너로부터 얻어진 극저온 보존된 샘플을 함유한다. 일부 구체예에서, 용기는 하나 이상의 식별자, 예컨대 바코드, 무선 주파수 식별 (RFID) 태그, 또는 다음: 도너, 샘플, 조성물, 바이알, 용기, 상태, 질환, 수집 시설, 병원, 및/또는 수령체 중 하나 이상의 정체성에 상응하는 또는 나타내는 다른 식별자로 표시된다. 일부 측면으로, 용기에 포함된 또는 부착된 추가적인 정보로는 성분채집 수집일 및/또는 극저온 보존일 및/또는 유효 기한 및/또는 뱅크 또는 보관 시설 내에서의 위치에 관련된 정보를 포함한다. 일부 구체예에서, 코드는 환자 정체성 팔찌 또는 병원 또는 의료 또는 수집 시설 시스템 또는 서류작업, 예컨대 도너 또는 관련된 시설을 나타내는 코드에 상응한다.
적합한 코딩 또는 표시 방법 또는 시스템으로는, 한정하는 것은 아니지만, 광, 전자, 또는 자기 수단에 의해 판독될 수 있는 인쇄된, 자기, 또는 전자 형태로 태그를 사용하는 인코딩(encoding), 예컨대 바코드, QR 코드, RFID, 또는 트랜스폰더, 예컨대 광 활성화된 마이크로-트랜스폰더, 특유한 30 비트 판독-단독 정체성 코드를 저장하고 발광 판독기 소자로 파워링되고 정보를 얻을 때 무선 주파수 신호로서 코드를 방출하는 저가의 실리콘 소자를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 모든 가공 부품 (샘플 수집관, 세포 정제 부품, 세포 배양 및 팽창 부품, 등)은 각 부품의 기능 및 가공 작업흐름에서의 의도된 사용 단계가 부품의 특유한 식별자 코드에 대해 기록되어 있는 시설 부품 등록소에 사전 등록된다. 일부 구체예에서, 트랜스폰도가 사용되고, 일부 측면으로 판독될 수 있는 특유한 샘플 정체성을 인코딩하기 위한 임의의 방법 또는 물품을 나타낸다.
일부 구체예에서, 방법, 예컨대 가공 작업흐름에서, 예컨대 각 단계의 다양한 단계에서 및/또는 수령체에게 투여되기 전 또는 투여될 때, 하나 이상의 식별자 코드는 기록으로, 예컨대 중심 데이터베이스의 특유한 환자 특이적 기록으로서 판독되거나, 및/또는 샘플 및/또는 그것이 유래된 또는 투여될 환자의 정체성, 및/또는 샘플 및/또는 그것의 수집 또는 가공에 관한 다른 정보를 확인하기 위하여, 및/또는 정확한 관리 연속성을 확인하기 위하여 사용된다.
다음의 상세한 설명 및 실시예는 본 개시의 특정 구체예들을 예시한다. 당업자들은 본 개시의 범주에 의해 포함되는 본 개시의 수많은 변이 및 변형이 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 특정 구체예의 설명은 제한하는 것으로서 여겨지지 않아야 한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "극저온으로 보관" 또는 "극저온 보관"은 일반적으로 샘플, 예를 들어, 세포를 함유하는 샘플이 -210℃ 내지 -80℃에서 및 세포가 그러한 보관 기간 후 해동될 수 있도록 하는 조건에서 보관되어서, 해동시 또는 해동 후에, 샘플 중의 적어도 일부 또는 실질적인 부분의 세포가 생존할 수 있고 및/또는 그것의 생물학적 기능의 적어도 일부를 보유하게 되는 것을 나타낸다. 한 측면으로, 세포 샘플은 적어도 특정 백분율, 예컨대 샘플 중의 세포의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 또는 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 또는 그 이상이 생존성을 유지하고 및/또는 세포자멸성 마커 또는 그것의 지표, 예컨대 절단된 카스파제 및/또는 아넥신V 염색에 대해 음성을 유지하도록 해동될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 극저온으로 냉동하는 것은 샘플, 예를 들어 세포를 함유한 샘플의 온도를 -210 내지 -80℃의 온도로 저하시키는 것을 의미한다.
일부 구체예에서, 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 풍부하게 하다 또는 풍부화는 세포를 함유한 샘플의 맥락에서 세포 유형 또는 유형들을 샘플로부터 분리, 선택, 또는 정제하여서, 그 세포 유형 또는 유형들의 고농도가 얻어지게 되는 것을 의미한다. 용어 "풍부하게 하다"는 필수적인 것은 아니지만, 일부 구체예에서는 필수적일 수 있고, 세포의 절대 또는 거의 절대 순도를 이루는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 대상체 또는 도너는 포유류, 예컨대 인간 또는 다른 동물, 전형적으로 인간이다. 일부 구체예에서, 세포, 세포 집단, 또는 조성물이 투여되는 대상체, 예컨대 환자는 포유류, 전형적으로 영장류, 예컨대 인간이다. 일부 구체예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있고 임의의 적합한 연령, 이를테면 유아, 아동, 청소년, 성인, 및/또는 노인 대상체일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 비영장류 포유류, 예컨대 설치류이다.
일부 구체예에서, 용어 "냉동 용액(freezing solution)"은, 세포를 함유한 샘플, 예를 들어, 성분채집 샘플과 조합될 때, 샘플 또는 세포를 냉각, 극저온으로 냉동, 및/또는 극저온으로 보관하는 과정 중에 세포의 하나 이상의 생물학적 기능을 보존하는 것을 보조하는 용액을 의미한다. 일부 구체예에서, 용어 냉동 용액 및 극저온 배지는 상호교환 가능하다.
일부 구체예에서, 세포를 함유한 극저온으로 보관된 샘플의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "후-극저온으로 변형" 또는 "후-극저온 변형"은 세포를 해동한 후 샘플에 적용된 과정을 의미한다.
일부 구체예에서, 본원에서 사용되는 용어 "재발"은 일반적으로 개선 기간 후 질환의 신호 또는 증상의 복귀를 의미한다.
성분채집술은 일반적으로 도너 또는 대상체의 혈액을 수집하기 위한 과정을 나타낸다. 그 과정은 도너의 혈액으로부터 세포를 수집하기 위한 과정을 포함할 수 있다. 백혈구성분채집술(Leukapheresis)은 도너 혈액으로부터의 백혈구를 수집하는 이러한 과정을 나타내기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 제공된 구체예 및 조성물은 도너로부터의 혈액 샘플의, 예컨대 성분채집술을 통한 수집과 관련된다; 일부 구체예에서, 방법 및 조성물은 조성물, 예컨대 세포 치료법 조성물의 수령체에의 투여에 관련된다. 일부 구체예에서, 도너 및 수령체는 동일한 개체이다. 일부 구체예에서, 도너로부터의 세포가 상이한 대상체인 수령체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 방법은 도너의 혈액으로부터의 세포를 극저온에서 분류하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 극저온에서 분류된 세포는 계속해서 질환을 치료하기 위하여 수령체에 투여된다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 포함된 미국 특허 출원 공개공보 번호 2016/0158359 및 2016/0206656 및 PCT 공개 번호 WO　2016/064929 및 WO 2016/033570에서 기술된 것과 같이, 세포는 T 세포 치료법과 같은 세포 요법 치료의 일부로서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 도너는 대상체, 예컨대 나중에 수집된 세포를 받는 사람, 즉, 수령체이다. 이러한 구체예에서, 치료법은 자가 세포 치료법으로 명명된다. 본원에서 논의되는 것과 같이, 자가 세포 치료법의 장점으로는, 세포가 수집되는 도너가 수령체이기 때문에, 수령체의 신체가 투여된 세포를 거부하게 될 기회의 감소를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 도너 및 수령체는 상이한 사람이다. 이러한 구체예에서, 치료법은 동종 세포 치료법으로 명명될 수 있다. 동종 치료법의 장점으로는 세포 샘플을 가로지르는 균일성 및 일관성을 들 수 있다. 다른 장점으로는, 일부 측면으로, 예를 들어, 수령체로부터의 세포가 있을 수 없을 때, 예컨대 수령체가 이러한 세포를 제공할 수 없거나 및/또는 성분채집술을 진행할 수 없을 때, 예컨대 수령체가 너무 아플 때 도너 세포가 이용 가능한 맥락에서, 자가 세포 치료법과 비교하여 세포의 더 큰 유용성을 들 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 성분채집술에 의해, 예컨대 많은 공지된 성분채집술 기법 중 임의의 것에 의해 수집된다. 예시의 성분채집술 수집 방법은 의료 전문가에 의해 수행된 일반적으로 허용된 실제를 사용하여 도너로부터 채혈하는 것을 포함한다. 의료 전문가는, 예를 들어, 도너 신체 상의 부위, 전형적으로 팔을 선택하고, 그 부위를 살균하고, 정맥절개를 수행하고, 혈액을 보존하기에 적합한 용기, 예컨대 항응고제가 들어있는 멸균된 혈액 주머니로 혈액을 뽑아낼 수 있다. 예를 들어, 의료 전문가는 세계 보건 기구 ("WHO")에서 제시한 실제, WHO guidelines on drawing blood: best practices in phlebotomy (2010)를 수행할 수 있다. 전문가는 하기에서 기술되는 것과 같이, 도너의 질환을 진단하는 전문가일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 혈액의 수집 후, 혈액의 구성요소들, 예컨대 혈장 및 상이한 혈액 세포는 원심분리에 의하여 분리될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 도너가 질환에 걸린 것으로 진단된 후에, 및 도너가 질환에 대한 임의의 치료를 받기 전 및/또는 도너가 표적화된 치료, 예컨대, 질환 또는 상태와 관련된 항원 또는 다른 리간드를 특이적으로 인식하는 또는 그것에 결합하는 치료를 받기 전에 수집된다. 일부 구체예에서, 세포는 도너가 질환 또는 상태로 진단받기 전의 때에 수집된다. 이러한 구체예의 장점으로는 도너가 질환에 대한 치료를 받은 후에 수집된 세포와 비교하여, 개선된 세포 생존성, 활성, 및 유전자 조작에 대한 수용성을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 질환에 대한 초기 치료 후 질환이 첫 번째 재발한 후에, 및 도너가 질환에 대한 후속 치료를 받기 전에 도너로부터 수집된다. 이러한 구체예의 장점으로는 도너가 질환에 대해 2회기 이상의 치료를 받은 후에 수집된 세포와 비교하여, 개선된 세포 생존성, 활성, 및 유전자 조작에 대한 반응성을 들 수 있다. 다른 구체예에서, 세포는 질환이 두 번째 재발한 후에, 및 도너가 질환에 대한 후속 치료를 받기 전에 도너로부터 수집된다.
도너 및/또는 수령체, 및/또는 본원에서 질환을 가졌거나 가진 것으로 의심되는 도너 및/또는 수령체의 질환, 상태, 및 장애, 및/또는 재조합 수용체에 의해 표적화된 질환, 상태, 및 장애 중에는 고체 종양, 혈액 악성종양, 및 흑색종을 포함한, 그리고 국소화된 및 전이성 종양을 포함한 종양이 있다. 또한 질환, 상태 및 장애 중에는 감염성 질환, 예컨대 바이러스 또는 기타 병원체, 예컨대, HIV, HCV, HBV, CMV, HPV로의 감염, 및 기생충 질환이 있다. 또한 질환, 상태 및 장애 중에는 자가면역 및 염증성 질환이 있다. 일부 구체예에서, 질환 또는 상태는 종양, 암, 악성종양, 신생물형성, 또는 다른 증식성 질환 또는 장애이다. 그러한 질환으로는, 한정하는 것은 아니지만, 백혈병, 림프종, 예컨대, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 작은 림프구성 백혈병 (SLL), 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 난치성 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 무통증 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 결장, 폐, 간, 유방, 전립선, 난소, 피부, 흑색종, 뼈, 및 뇌의 암, 난소암, 상피암, 망막 세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 경부 암종, 대장암, 교모세포종, 신경모세포종, 유잉 육종, 수모세포종, 골육종, 활막 육종, 및/또는 중피종을 들 수 있다. 일부 구체예에서 질환 또는 상태는 DLBCL, 달리 명시되지 않는 (NOS; 여포성 림프종으로부터의 전환된 DLBCL을 포함함), MYC를 포함한 고급 B-세포 림프종 및 DLBCL 조직학으로의 BCL2 및/또는 BCL6 재배열이다.
일부 구체예에서, 대상체는 iwCLL 가이드라인 및 임상적인 측정 가능한 질환을 기반으로 한 치료를 위한 적응증이 있는 CLL, 또는 생검으로 증명된 SLL인 SLL을 나타낸다. 일부 측면으로, 대상체는 브루톤의 티로신 키나아제 억제제 (BTKi) 치료를 받았고 실패하였거나 BTKi 치료법에 대해 부적격인 것으로 여겨졌다.
일부 구체예에서, CLL 또는 SLL 및 고위험 특징을 가진 대상체, 예를 들어 복합적인 세포유전학적 이상 (3가지 이상의 염색체 이상), 17p 삭제, TP53 돌연변이, 또는 돌연변이되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (IGHV)을 가지는 대상체는 BTKi를 포함하여 적어도 2 라인의 선행 치료가 실패하였다. 일부 구체예에서, CLL 또는 SLL 및 표준 위험 특징을 가진 대상체는 BTKi를 포함하여 적어도 3 라인의 선행 치료가 실패하였다. 일부 구체예에서, BTKi를 허용하지 못하고 적어도 6개월의 BTKi 치료법을 받았거나 BTKi에 대해 부적격인, CLL 또는 SLL을 가진 대상체는 적어도 1 (고위험) 또는 2 (표준 위험) 라인의 비-BTKi 치료법이 실패하였다.
일부 구체예에서, 대상체는 하나 이상의 임상 실험 및/또는 승인된 조작된 세포 면역치료법에 대해 적격이 아니다. 일부 구체예에서, 대상체는 아직은 하나 이상의 임상 실험 및/또는 승인된 조작된 세포 면역치료법에 대해 적격이 아니지만, 적격이 될 위험이 있거나 적격이 될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 하나 이상의 이전 치료 라인에 대한 또는 자가-HSCT 후의 예상된 또는 실제 반응으로 인해 하나 이상의 임상 실험 및/또는 승인된 조작된 세포 면역치료법에 대해 적격이 아니다. 일부 구체예에서, 대상체는 만약 대상체가 재발되지 않았거나 및/또는 하나 이상의 이전 치료 라인 (예를 들어, 둘 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 이전 치료 라인)에 대해 또는 자가-HSCT 후에 난치성이 아니라면 하나 이상의 임상 실험 및/또는 승인된 조작된 세포 면역치료법에 대해 적격이 아니다. 일부 구체예에서, 대상체는 고위험 세포유전학의 부재로 인해 하나 이상의 임상 실험 및/또는 승인된 조작된 세포 면역치료법에 대해 적격이 아니다.
일부 측면으로, 대상체는 다수의 전이 및/또는 전이의 광범위한 국지화를 가진다. 일부 측면으로, 대상체에서 종양 부담은 낮고 대상체는 약간의 전리를 가진다. 일부 구체예에서, 용량의 크기 또는 타이밍은 대상체에서 초기 질환 부담에 의해 결정된다. 예를 들어, 일부 측면으로 대상체는 제1 용량에서 상대적으로 적은 수의 세포가 투여될 수 있는 반면, 더 낮은 질환 부담의 맥락에서 용량은 높아질 수 있다.
일부 구체예에서, 질환 또는 상태는 감염성 질환 또는 상태, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아, 및 프로토조아 감염, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스 등의 감염이다.
일부 구체예에서, 질환 또는 상태는 자가면역 질환 또는 상태, 예컨대 관절염, 예컨대, 류머티스성 관절염 (RA), 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 염증성 장 질환, 건선, 피부경화증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브즈병, 크론병, 다발성 경화증, 천식, 면역결핍증, 및/또는 이식과 관련된 질환 또는 상태이다.
일부 구체예에서, 질환 또는 상태는 이식편-대-숙주 질환 (GVHD), 예컨대 이식, 예컨대 동종이계 기관 이식 및/또는 골수 및/또는 조혈 줄기 세포 이식이 진행중이거나 이식을 받았던 대상체에서의 GVHD이다. 자연 분리된 CD4+CD25+ T 세포, 예컨대 시험관내 팽창된 Treg 세포의 첨가는 일부 맥락에서 이식편-대-숙주 질환을 지연 및/또는 예방할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 Treg 조성물 및 방법은 GVHD의 위험 또는 그것의 증상 또는 신호를 예방 및/또는 감소시킨다. 일부 구체예에서, 질환 또는 상태는 기관 이식, 예컨대 심장, 간, 각막, 신장, 폐, 췌장, 또는 다른 기관 이식 거부반응, 또는 그것의 위험이다.
일부 구체예에서, 자가면역 또는 염증성 질환은 만성 및/또는 급성 염증성 질환이다. 일부 측면으로, 질환 또는 장애는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 류머티스성 관절염 (RA), 다발근육염(polymyositis), 다발성 경화증 (MS), 당뇨병, 염증성 장 질환 (IBD), 제1형 진성 당뇨병 또는 자가면역 인슐린염, 자가면역 갑상선염, 자가면역 포도막염 또는 포도막망막염(uveoretinitis), 자가면역 고환염(orchitis), 자가면역 난소염(oophoritis), 건선, 백반증(vitiligo), 자가면역 전립선염, 임의의 바람직하지 않은 면역 반응 또는 기타 염증성 또는 자가면역 질환 또는 상태, 예컨대 원치 않는 면역 반응 및/또는 바이러스-유도된 면역병리이거나 이것들을 포함한다. 일부 측면으로, 항원, 예컨대 T 세포 및/또는 재조합 수용체에 의해 특이적으로 결합된 항원은 자체 또는 자가 항원, 예컨대 정상 또는 질환이 없는 조직에서 발현된 인간 항원이다. 일부 측면으로, 항원은 암에 발현된 항원이 아니거나 대상체의 암에서 발현되지 않는다. 일부 측면으로, 대상체는 암을 가진 것으로 알려지지 않거나 및/또는 암을 가진 것으로 의심되지 않는다.
일부 구체예에서, 세포, 키메릭 항원 수용체 (CAR) 또는 T-세포 수용체 (TCR), 또는 다른 재조합 수용체에 의해 인식된 항원은 자가항원 또는 자가항원과 교차 반응서인 항원, 예컨대 자가면역 질환의 병리에서의 병원체성 항원이거나 그것을 포함한다. 일부 구체예에서, 예컨대 질환 또는 상태가 염증성 장 질환 (IBD)인 경우에, 항원은 질환에 걸린 결장 또는 회장에서 발현되는 것이다. 일부 구체예에서, 예컨대 RA의 맥락에서, 항원 또는 리간드는 콜라겐의 에피토프이거나 관절에 존재하는 항원이다. 일부 구체예에서, 예컨대 제1형 진성 당뇨병 또는 자가면역 인슐린염의 치료 또는 예방의 경우에, 항원은 췌장의 β 세포 항원이다. 일부 구체예에서, 예컨대 MS의 경우, 항원은 미엘린 염기성 단백질 항원, MOG-1, MOG-2 또는 또 다른 뉴런성 항원이다. 일부 구체예에서, 예컨대 질환 또는 상태가 자가면역 갑상선염인 경우, 항원 또는 리간드는 갑상선 항원이다. 일부 구체예에서, 예컨대 질환 또는 상태가 자가면역 위염인 경우, 항원은 위의 항원이다. 일부 구체예에서, 예컨대 자가면역 포도막염 또는 포도막망막염의 치료의 경우, 항원은 S- 항원 또는 또 다른 포도막 또는 망막 항원이다. 일부 구체예에서, 예컨대 질환 또는 상태가 고환염인 경우, 항원은 고환 항원이다. 일부 구체예에서, 예컨대 자가면역 난소염의 치료 또는 예방에서, 항원은 난소 항원이다. 일부 구체예에서, 예컨대 건선의 치료 또는 예방의 경우, 항원은 케라틴생성세포 항원 또는 또 다른 진피 또는 표피 항원이다. 일부 구체예에서, 예컨대 백반증의 치료 또는 예방의 경우, 항원은 멜라닌세포 항원이다. 일부 구체예에서, 예컨대 자가면역 전립선염의 치료 또는 예방의 경우, 항원은 전립선 항원이다. 일부 구체예에서, 항원은 원하지 않는 면역 반응 부위에 존재하는 T 이펙터 세포에서 발현된 활성화 항원을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 항원은 순환된 비멘틴(vimentin)이다.
일부 구체예에서, 예컨대 질환 또는 상태가 조직 또는 기관 거부반응이거나 그것을 포함하는 경우, 항원은 이식된 조직의 하플로타입을 가지는 MHC 분자 또는 이것의 단백질을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 질환 또는 장애와 관련된 항원은 GPRC5D, 신경교종-관련 항원, β-인간 융모막 고나도트로핀, 알파태아단백질 (AFP), B-세포 성숙 항원 (BCMA, BCM), B-세포 활성화 인자 수용체 (BAFFR, BR3), 경막 활성화제 및 CAML 인터렉터(interactor) (TACI), Fc 수용체-유사 5 (FCRL5, FcRH5), 고아 티로신 키나아제 수용체 ROR1, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린(mesothelin), CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암종배아 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1 (WT-1), 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1), 및/또는 비오티닐화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자이다.
일부 구체예에서, 질환은 암이다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 포함된, 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0158359 및 2016/0206656 및 PCT 특허 출원 공개 번호 WO　2016/064929에서 기술된 것과 같이, 세포는 T 세포 치료법과 같은 암 치료 처치의 일부로서 사용될 수 있다.
암은, 예를 들어, 양성이거나 악성일 수 있다. 암은, 예를 들어, 원발성 암 또는 전이성 암을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 임의의 단계, 예컨대 단계 TX, 단계 T0, 단계 T1, 단계 T1a, 단계 T1b, 단계 T2, 단계 T2a, 단계 T2b, 단계 T3, 단계 T3a, 단계 T3b, 단계 T4, 단계 T4a, 단계 T4b, 단계 NX, 단계 N0, 단계 N1, 단계 N1a, 단계 N1b, 단계 N2, 단계 N2a, 단계 N2b, 단계 N2c, 단계 N3, 단계 MX, 단계 M0, 단계 M1, 단계 M1a, 단계 M1b, 단계 M1c, 단계 M2, 단계 M3, 단계 M3V, 단계 M4, 단계 M4E, 단계 M5, 단계 M6, 또는 단계 M7의 것일 수 있다.
일부 구체예에서, 암은 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 카포시 육종, 성상세포종, 기저 세포 암종, 담도암, 방광암, 유잉 육종, 골육종, 악성 섬유조직구종, 뇌암, 유방암, 기관지암, 버킷 림프종, 발암성 암, 심장암, 비정형 기형종 또는 라브도이드 종양, 배아성 종양, 생식 세포 종양, 원발성 중추신경계 림프종, 경부암, 담관암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 신생물형성, 대장암, 두개인두종(craniopharyngioma), 피부의 T 세포 림프종, 자궁내막암, 뇌실막세포종(ependymoma), 식도암, 감각신경모세포종(esthesioneuroblastoma), 두개외(extracranial) 생식 세포 종양, 고환외(extragonadal) 생식 세포 종양, 안내 흑색종, 망막모세포종, 나팔관암, 담낭암, 위장관 유암종, 위장관 간질 종양, 교모세포종, 난소 생식 세포 종양, 고환암, 임신성 영양막 질환, 털세포 백혈병, 두경부암, 간세포암, 호지킨 림프종, 안내 흑색종, 섬세포 종양, 췌장성 신경내분비 종양, 신장암, 폐암 (비-소세포성 및 소세포성), 악성 섬유조직구종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 정중관 암종(midline tract carcinoma), 구강암, 다중 내분비 신생물형성, 균상 식육종(mycosis fungoides), 골수형성이상 또는 골수증식성 신생물형성, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 신생물형성, 비인두암, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 유두종증, 부신경절종(paraganglioma), 부비동암(paranasal sinus and nasal cavity cancer), 부갑상선암, 음경암, 인두암(pharyngeal cancer), 크롬친화세포종(pheochromocytoma), 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물형성, 다발성 골수종, 흉막폐 모세포종(pleuropulmonary blastoma), 복막암(peritoneal cancer), 전립선암, 직장암, 망막모세포종, 침샘암, 횡문근육종, 세자리 증후군(sezary syndrome), 소장암, 작은 림프구성 백혈병, 편평세포 암종, 경부 편평세포암, 고환암, 인후암, 비인두암, 구인두암(oropharyngeal cancer), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 가슴샘종, 흉선 암종, 갑상선암, 요도암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 또는 빌름스 종양이다.
일부 구체예에서, 암은 만성 림프구성 백혈병, 작은 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 전-림프구성 백혈병, 털세포 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 널(null)-급성 림프모세포성 백혈병, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 큰 B 세포 림프종, 다발성 골수종, 여포성 림프종, 비장의, 변연 지대 림프종, 맨틀 세포 림프종, 무통증 B 세포 림프종, 또는 급성 골수성 백혈병이다.
일부 구체예에서, 암은 고아 티로신 키나아제 수용체 ROR1, EGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, B 세포 성숙 항원 (BCMA), FCRL5/FCRH5, GPRC5D, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암종배아 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1 (WT-1), 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1), 및/또는 비오티닐화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자 중 적어도 하나 이상을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 CD19를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 BCMA를 발현하는 세포를 포함한다.
일부 구체예에서, 질환은 의료 전문가 (예컨대, 국가, 주, 지방, 카운티, 지방자치제, 또는 거주지의 의료 규제 기관 하에서 면허를 받은 사람)에 의해 진단되며, 그는 도너를 조사하고 도너에서의 구조 또는 기능의 장애를 관찰함으로써 도너에서 질환의 존재를 확인한다. 의료 전문가로는, 예를 들어, 의사, 예컨대 혈액학자, 면역학자, 종양학자, 또는 간호 전문가를 들 수 있다.
일부 구체예에서, 진단은 도너에 의한 자가 진단을 배제하고 및/또는 유전자 검사 서비스에 의한 진단을 배제한다.
일부 구체예에서, 초기 치료 및 후속 치료는 각각, 서로 독립적으로, 암 치료법, 예컨대 화학요법, 방사선요법, 면역치료, 호르몬 요법, 및/또는 수술을 포함할 수 있다. 화학요법으로는, 예를 들어, 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 무스틴, 빈크리스틴, 프로카르바진, 프레드니솔론, 블레오마이신, 빈블라스틴, 다카르바진, 에토포시드, 시스플라틴, 에피루비신, 카페시타빈, 폴린산, 옥살리플라틴, 및 다른 작은 분자 키나아제 억제제 중 적어도 하나를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 면역요법은, 예를 들어, 항체 및 면역 세포, 예컨대 천연 살해 세포, 림포카인-활성화된 살해 세포, 세포독성 T 세포, 및 수지상 세포 중 적어도 하나를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 치료 (초기 또는 후속)는 방사선 요법 (예컨대 4000 cGy 방사선), 자율적 줄기 세포 구제, 줄기 세포 이식, 골수 이식, 및 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 치료는 CAR T 세포 치료법을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 치료는 Tisagenlecleucel (Kymriah)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 치료는 Axicabtagene ciloleucel (Yescarta)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 초기 및/또는 후속 치료는 시타라빈 (ara-C; 고용량 시타라빈을 포함함), 다우노루비신 (다우노마이신), 이다루비신, 또는 클라드리빈 (Leustatin, 2-CdA) 중 임의의 것 또는 전부를, 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 초기 및/또는 후속 치료법은 보르테조밉, 카르필조밉, 탈리도미드, 게날리도미드, 포말리도미드, 및 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손 및 덱사메타손 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 초기 및/또는 후속 치료법은 알킬화제, 예컨대 사이클로포스파미드, 클로람부실, 벤다무스틴, 및 이포스파미드; 백금 약물, 예컨대 시스플라틴, 카르보플라틴, 및 옥살리플라틴; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 펜토스타틴, 및 클라드리빈, 시타라빈; 항-대사물, 예컨대 겜시타빈, 메토트렉세이트, 및 프랄라트렉세이츠; 및 기타 작용제, 예컨대 빈크리스틴, 독소루비신, 미토크산트론, 에토포시드, 및 블레오마이신 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 초기 및/또는 후속 치료법은 프로테아좀 억제제, 예컨대 보르테조밉; 히스톤 탈아세틸화제 억제제, 예컨대 로미뎁신 및 벨리노스타트; 키나아제 억제제, 예컨대 이브루티닙 및 이델라리십 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 초기 및/또는 후속 치료법은 CD20을 표적으로 하는 항체, 예컨대 리툭시맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 및 이브리투모맙 티욱세탄; CD52를 표적으로 하는 항체, 예컨대 알렘투주맙; CD30을 표적으로 하는 항체, 예컨대 브렌툭시맙 베도틴; 인터페론; 및 면역조절제, 예컨대 탈리도미드 및 레날리도미드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 초기 및/또는 후속 치료법은 병용 치료법, 예컨대 CHOP, CHOP+R (또는 R-CHOP), CVP. EPOCH, EPOCH+R, DHAP, 및 DHAP+R (또는 R-DHAP)일 수 있다. CHOP는 약물 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손을 포함한다. R-CHOP (또는 CHOP+R)는 추가로 리툭시맙으로의 치료를 포함한다. CVP는 사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손을 포함한다. CVP는 또한 리툭시맙과 함께 투여될 수 있다. EPOCH는 약물 에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 사이클로포스파미드, 및 독소루비신을 포함한다. EPOCH-R은 추가로 리툭시맙으로의 치료를 포함한다. DHAP는 약물 덱사메타손, 고용량 시타라빈, 및 시스플라틴을 포함한다. DHAP+R (또는 R-DHAP)는 추가로 리툭시맙으로의 치료를 포함한다. 본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 추가적인 조합 처방은 벤다무스틴 플러스 리툭시맙 (BR); 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 프로카르바진, 및 프레드니손 (R-CEPP); 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 에피루비신, 및 프레드니손 (R-CEOP); 리툭시맙, 겜시타빈, 시스플라틴, 및 덱사메타손 (R-GDP); 리툭시맙 및 레날리도미드 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 추가적인 항암 치료법은 클로람부실, 벤다무스틴, 사이클로포스파미드, 플루다라빈, 오파투무맙, 오비누투주맙, 리툭시맙, 이델라리십, 베네토클락스, 레날리도미드, 및 메틸프레드니솔론 중 임의의 하나 이상 또는 조합을 포함한다.
일부 구체예에서, 도너는 질환의 초지 치료 및 개선 기간 후에 제1 재발에 들어갈 수 있다. 일부 구체예에서, 개선 기간은 질환의 신호 및 증상의 완전한 부재에 의해 표시된다. 일부 구체예에서, 개선 기간 중에, 질환의 신호 및 증상은 완화되거나 감소하지만, 완전히 부재하는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 질환의 신호 및 증상의 완전한 부재, 또는 신호 및 증상의 완화 또는 감소는 초기 치료의 결과이다.
일부 구체예에서, 도너는 질환의 1회 이상의 선행 치료 및 1회 이상의 개선 기간 후에 제2 재발에 들어갈 수 있다. 일부 구체예에서, 개선 기간(들)은 질환의 신호 및 증상의 완전한 부재에 의해 표시된다. 일부 구체예에서, 개선 기간(들) 중에, 질환의 신호 및 증상은 완화되거나 감소하지만, 완전이 부재하는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 질환의 신호 및 증상의 완전한 부재, 또는 신호 및 증상의 완화 또는 감소는 선행 치료(들)의 결과이다.
일부 구체예에서, 재발은 의료 전문가에 의해 진단되며, 그는 도너를 조사하고 도너에서 질환의 신호 및 증상의 회복을 확인한다. 일부 구체예에서, 의료 전문가는 국가, 주, 지방, 카운티, 지방자치제, 또는 거주지의 의료 규제 기관 하에서 면허를 받은 사람이다. 의료 전문가로는, 예를 들어, 의사, 예컨대 혈액학자, 면역학자, 또는 종양학자, 또는 간호 전문가를 들 수 있다. 질환을 진단하는 의료 전문가와 재발을 진단하는 의료 전문가는 동일한 사람일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
일부 구체예에서, 도너의 혈액으로부터의 세포는 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 얻어진다. 일부 구체예에서, 세포의 수는, 도너로부터 수집될 때, 및/또는 성분채집 샘플에서 총, 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 또는 그 이상의 총 세포 또는 총 핵화 세포이거나 약 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 또는 그 이상의 총 세포 또는 총 핵화 세포이거나 그 이하이다. 일부 구체예에서, 대상체에게 투여될 때 샘플은 도너 체중의 각 킬로그램당 105 내지 106개의 또는 약 105 내지 106개의 세포 또는 T 세포 또는 조작된 세포 및/또는 5 x 106개 또는 10 x 106개 또는 약 5 x 106개 또는 10 x 106개의 총 세포 또는 T 세포 또는 조작된 세포 또는 이것들의 하위세트를 함유한다. 일부 구체예에서, 혈액의 부피는, 도너로부터 수집될 때, 도너 체중의 각 킬로그램에 대해 0.5 내지 5 밀리리터이다.
일부 구체예에서, 세포는 T 세포 및/또는 이것의 집단의 존재를 포함하거나 및/또는 존재에 대해 풍부화된다. 일부 구체예에서, 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를, 별도로 또는 조합하여 포함한다. T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위유형 및 하위집단에는 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포 및 이것의 하위유형, 예컨대 줄기 중추 기억 T 세포 (TSCM), 중추 기억 T 세포 (TCM), 이펙터 기억 T 세포 (TEM), 또는 말단 분화된 이펙터 기억 T 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-관련 불변 T (MAIT) 세포, 자연적으로 발생하는 및 적응성 조절 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다. 일부 구체예에서, 세포는 천연 살해 (NK) 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 단핵세포 또는 과립세포, 예컨대, 골수성 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, 및/또는 호염기성 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 벌크 T 세포, 예컨대 CD3 발현, CD4 또는 CD8 발현, 또는 혈액 세포에서 발견된 비-T 세포 마커에 대한 음성을 기반으로 선택된 것들을 포함하거나 선택된 것들이다.
일부 구체예에서, 세포는 T 세포, 예컨대, CD8+ T 세포 (예컨대, CD8+ 나이브 T 세포, 중추 기억 T 세포, 또는 이펙터 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 천연 살해 T 세포 (NKT 세포), 조절 T 세포 (Treg), 줄기 세포 기억 T 세포, 림프성 전구체 세포, 조혈 줄기 세포, 천연 살해 세포 (NK 세포), 또는 수지상 세포이거나 그런 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 단핵세포 또는 과립구, 예컨대 골수성 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, 및/또는 호염기성 세포이다. 구체예에서, 세포는 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포 또는 iPS 세포로부터 유래된 세포, 예컨대, 대상체로부터 생성되고, 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 변경시키거나 (예컨대, 그 안에 돌연변이를 유도하기 위한) 또는 조작을 위해 조작된, 및 예컨대 T 세포, 예컨대, CD8+ T 세포 (예컨대, CD8+ 나이브 T 세포, 중추 기억 T 세포, 또는 이펙터 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 림프성 전구체 세포, 또는 조혈 줄기 세포로 분화된 iPS 세포이다.
일부 구체예에서, 세포는 T 세포 또는 다른 세포 유형, 예컨대 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 이것의 하위집단, 예컨대 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 가능성, 팽창, 재순환, 국지화, 및/또는 지속성 용량, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획에의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화 정도의 하나 이상의 하위세트를 포함한다.
일부 구체예에서, T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위유형 및 하위집단에는 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포 및 이것들의 하위유형, 예컨대 줄기 세포 기억 T (TSCM), 중추 기억 T (TCM), 이펙터 기억 T (TEM), 또는 말단에 분화된 T 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙한 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-관련 불변 T (MAIT) 세포, 자연적으로 발생하는 및 적응성 조절 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다. 일부 구체예에서, 세포는 도너로부터 수집된 후에, 추가의 가공 없이 극저온으로 냉동되고 및/또는 극저온으로 보관된다. 일부 구체예에서, 세포는 극저온으로 냉동되거나 및/또는 보관되기 전에 1회 이상 풍부화된다. 일부 구체예에서, 세포는 극저온으로 보관된 후에 1회 이상 풍부화된다. 일부 경우에, 극저온으로 냉동 및/또는 보관 전에 세포를 풍부화하지 않거나 추가로 가공하지 않는 것은 비용을 절감하고 및/또는 시간을 절약하는 장점을 제공한다. 일부 경우에, 극저온으로 냉동 및/또는 보관 전에 세포를 풍부화하지 않거나 추가로 가공하지 않는 것은 또한 세포 풍부화 및/또는 가공을 수행할 수 있는 시설에 접근하지 못하는 도너에게 더 폭넓은 수집 시설 선택권을 허용할 수 있다. 풍부화는, 예를 들어, 그 전문이 본원에 포함된, PCT 출원 공개 번호 WO　2015/164675에서 기술된 것과 같을 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 극저온으로 냉동 및/또는 보관 전에 가공된다.
특정 구체예에서, 세포는, 예컨대 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 냉동된다. 일부 구체예에서, 세포는 재조합 리포터 수용체, 예컨대, CAR을 발현하는 세포, 예컨대, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 제조하는 것 및/또는 생성하는 것과 관련된 임의의 단계 전에, 후에, 및/또는 중에 냉동된다. 특정 구체예에서, 이러한 단계는, 한정하는 것은 아니지만, 세포, 예컨대, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위세트의 선택 및/또는 분리, 세포, 예컨대 T 세포 또는 이것의 하위세트의 자극 및/또는 팽창, 또는 세포의 트랜스펙션 또는 변환을 포함한, 조작된 세포의 생성과 관련된 임의의 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 세포의 선택 및/또는 분리, 세포의 자극 및/또는 팽창, 또는 세포의 트랜스펙션 또는 변환 전에, 대상체로부터 수집된 성분채집 샘플의 세포이다.
세포 가공 방법
일부 구체예에서, 대상체로부터 수집된 세포는, 예컨대 혈장 부분을 제거하고 적절한 완충액 또는 배지 중의 세포를 후속 가공 단계를 위해 교체하기 위하여 세척된다. 일부 구체예에서, 세포는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척된다. 일부 구체예에서, 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 이가 양이온이 없다. 일부 측면으로, 세척 단계는 반자동 "병류(flow-through)" 원심분리기 (예를 들어, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)를 사용하여 제조사의 설명을 따라 이루어진다. 일부 측면으로, 세척 단계는 원심분리 챔버, 예를 들어, A-200/F 및 A-200 원심분리 챔버를 포함한, Sepax® 및 Sepax® 2 시스템과 사용하기 위한 것들을 포함한, Biosafe SA에 의해 제조되고 시판된 것들에서, 제조사의 설명을 따라 수행된다. 일부 측면으로, 세척 단계는 십자류 여과(tangential flow filtration, TFF)에 의해 제조사의 설명을 따라 이루어진다. 일부 구체예에서, 세포는 세척 후에, 다양한 생체부합성 완충액, 예를 들어, Ca++/Mg++-유리 PBS에 재현탁된다. 특정 구체예에서, 혈액 세포 샘플의 구성요소는 제거되고 세포는 직접 배양 배지에 재현탁된다.
일부 구체예에서, 방법은 밀도 기반 세포 분리 방법, 예컨대 적혈구를 용해시키고 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리에 의한 말초 혈액으로부터 백혈구의 제조를 포함한다.
일부 구체예에서, 분리 방법은 세포에서 하나 이상의 특이적 분자, 예컨대 표면 마커, 예컨대 표면 단백질, 세포내 마커, 또는 핵산의 발현 또는 존재를 기반으로 한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 마커를 기반으로 한 분리에 대해 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 친화도- 또는 면역친화도-기반 분리이다. 예를 들어, 분리는, 일부 측면으로, 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포의 발현 또는 발현 수준을 기반으로 한 세포 및 세포 집단의, 예를 들어, 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션과, 이어서 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 그런 세포로부터의 결합된 항체 또는 결합 파트너를 가지는 세포의 분리에 의한 분리를 포함한다.
이러한 분리 단계는 결합된 시약을 가지는 세포가 추가의 사용을 위해 보유되는 양성 선택, 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포가 보유되는 음성 선택을 기반으로 할 수 있다. 일부 실례에서, 두 분획 모두 추가의 사용을 위해 보유된다. 일부 측면으로, 음성 선택은 이질성 집단에서 세포 유형을 특이적으로 확인하는 항체를 이용할 수 없어서, 분리가 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 마커를 기반으로 최상으로 수행되는 경우에 특히 유용할 수 있다.
분리는 특정 마커를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100% 풍부화 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 일부 구체예에서, 풍부화된 집단은 집단의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 함유한다. 예를 들어, 특정 유형의 세포, 예컨대 마커를 발현하는 것들에 대한 양성 선택 또는 풍부화는, 이러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 나타내지만, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 초래할 필요는 없다. 마찬가지로, 특정 유형의 세포, 예컨대 마커를 발현하는 것들에 대한 음성 선택, 제거, 또는 고갈은 이러한 세포의 수 또는 백붕뉼을 감소시키는 것을 나타내지만, 모든 이러한 세포의 완전한 제거를 초래할 필요는 없다.
일부 실례에서, 다중 회기의 분리 단계가 수행되는데, 이때 한 단계로부터 양성적으로 또는 음성적으로 선택된 분획은 또 다른 분리 단계, 예컨대 후속 양성 또는 음성 선택의 대상이 된다. 일부 실례에서, 예컨대 세포를, 각각이 음성 선택에 대해 표적화된 마커에 대해 특이적인, 다수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 인큐베이션함으로써 단일 분리 단계가 다중 마커를 발현하는 세포를 동시에 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다중 세포 유형은 다양한 세포 유형에서 발현된 다수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 인큐베이션함으로써 동시에 양성적으로 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 측면으로, T 세포, 예컨대 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 마커를 고수준으로 발현하는 세포, 예컨대, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 분리된다.
예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 콘쥬게이트된 자기 비즈 (예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 세포 팽창기)를 사용하여 양성적으로 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 분리는 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 풍부화, 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구체예에서, 양성 또는 음성 선택은 세포를 하나 이상의 항체 또는 각각 양성적으로 또는 음성적으로 선택된 세포 상에서 상대적으로 발현된 (마커+) 또는 상대적으로 고수준으로 발현된 (고 마커) 하나 이상의 표면 마터에 특이적으로 결합하는 다른 결합제와 함께 인큐베이션함으로써 이루어진다.
일부 구체예에서, T 세포는 비-T 세포, 예컨대 B 세포, 단핵세포, 또는 다른 백혈구 상에 발현된 마커, 예컨대 CD14의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면으로, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리하기 위해 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 하나 이상의 나이브, 기억, 및/또는 이펙서 T 세포 하위집단에서 발현된 또는 상대적으로 더 높은 정도로 발현된 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가로 분류될 수 있다.
일부 구체예에서, CD8+ 세포는 나이브, 중추 기억, 이펙터 기억, 및/또는 줄기 중추 기억 세포에 대해, 예컨대 각각의 하위집단과 관련된 표면 항원을 기반으로 한 양성 또는 음성 선택에 의해 추가로 풍부화되거나 고갈된다. 일부 구체예에서, 중추 기억 T (TCM) 세포에 대한 풍부화는 효능을 증가시키기 위하여, 예컨대, 일부 측면으로 이러한 하위 집단에서 특히 활발한, 투여 후의 장기간 생존, 팽창, 및/또는 접목(engraftment)을 개선하기 위하여 수행된다. Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701 참조. 일부 구체예에서, TCM-풍부화된 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 조합하는 것은 효능을 추가로 증강시킨다.
구체예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초혈 림프구의 두 CD62L+ 및 CD62L- 하위세트에 존재한다. PBMC는 CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획에 대해, 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하여 풍부화되거나 고갈될 수 있다.
일부 구체예에서, 중추 기억 T (TCM) 세포에 대한 풍부화는 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD127의 양성 또는 고표면 발현을 기반으로 한다; 일부 측면으로, 이것은 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현하는 또는 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택을 기반으로 한다. 일부 측면으로, TCM 세포에 대해 풍부화된 CD8+ 집단의 분리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈, 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 풍부화에 의해 수행된다. 한 측면으로, 중추 기억 T (TCM) 세포에 대한 풍부화는 CD4 발현을 기반으로 선택된 세포의 음성 선택으로 시작하여 수행되고, CD14 및 CD45RA의 발현을 기반으로 한 음성 선택, 및 CD621을 기반으로 한 양성 선택이 실행된다. 이러한 선택은 일부 측면으로 동시에 수행되고 다른 측면으로는 어느 순서든지 순차적으로 수행된다. 일부 측면으로, CD8+ 세포 집단 또는 하위집단을 제조하는 데 사용된 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계는 또한 CD4+ 세포 집단 또는 하위집단을 생성하기 위해 사용되어서, CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획은 모두 보유되며, 선택적으로 하나 이상의 추가의 양성 또는 음성 선택 단계 후에 방법의 후속 단계에 사용된다.
특정 실례에서, PBMC의 샘플 또는 다른 백혈구 샘플은 CD4+ 세포의 선택이 실행되는데, 이때 음성 및 양성 분획 둘 다 보유된다. 그런 후 음성 분획은 CD14 및 CD45RA 또는 ROR1의 발현을 기반으로 한 음성 선택, 및 중추 기억 T 세포의 특징적인 마커, 예컨대 CD62L 또는 CCR7을 기반으로 한 양성 선택이 실행되며, 이때 양성 및 음성 선택은 어느 순서로든지 수행된다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 가지는 세포 집단의 확인에 의해 나이브, 중추 기억, 및 이펙터 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법에 의해 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구체예에서, 중추 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구체예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
한 실례에서, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포에 대해 풍부화하기 위하여, 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 결합 파트너는 고체 지지체 또는 매트릭스, 예컨대 자성(magnetic) 비드 또는 상자성 비드에 결합되어, 양성 및/또는 음성 선택에 대한 세포의 분리가 허용된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 세포 및 세포 집단은 면역자성 (또는 친화성자성) 분리 기법을 사용하여 분리되거나 격리된다 (Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ에서 리뷰됨).
일부 측면으로, 둘 이상의 선택 단계가 순차적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 분리될 세포의 샘플 또는 조성물은 CD8+ 세포의 선택이 실행되는데, 이때 음성 및 양성 분획이 둘 다 보유된다. CD8 음성 분획은 추가로 CD4+ 세포의 선택이 실행될 수 있다. 일부 측면으로, 분리될 세포의 샘플 또는 조성물은 CD4+ 세포의 선택이 실행되며, 이때 음성 및 양성 분획이 둘 다 보유되고 CD4 음성 분획은 CD8+ 세포의 선택이 실행될 수 있다. 세포 선택에 대한 예시의 방법은 그 전문이 참조로 포함된 PCT 특허 출원 번호 WO 2015/157384 및/또는 WO 2015/164675에서 기술되며, 이것의 전부 또는 일부는 본원에 기술된 방법과 관련하여 사용될 수 있을 것이다.
일부 측면으로, 분리될 세포의 샘플 또는 조성물은 작은, 자기화 가능한 또는 자성적으로 방응성인 물질, 예컨대 자성적으로 반응성인 입자 또는 미세입자, 예컨대 상자성 비즈 (예컨대, Dynalbeads 또는 MACS 비즈)와 인큐베이션된다. 자성적으로 방응성인 물질, 예컨대, 입자는 일반적으로, 분리되기를 원하는, 예컨대 음성적으로 또는 양성적으로 선택되기를 원하는 세포, 세포들, 또는 세포 집단에 존재하는 분자, 예컨대, 표면 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너, 예컨대, 항체에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 구체예에서, 자기 입자 또는 비드는 특이적 결합 구성원, 예컨대 항체 또는 다른 결합 파트너에 결합된 자성적으로 반응성인 물질을 포함한다. 자성 분리 방법에 사용되는 잘 알려진 자성적으로 반응성인 물질이 많이 있다. 적합한 자기 입자로는 본원에 참조로 포함된, Molday의 미국 특허 제 4,452,773호, 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B에 기술된 것들을 들 수 있다. 콜로이드 크기 입자, 예컨대 본원에 참조로 포함된, Owen의 미국 특허 제 4,795,698호, 및 Liberti 등의 미국 특허 제 5,200,084호에 기술된 것들이 다른 실례이다.
인큐베이션은 일반적으로 항체 또는 결합 파트너, 또는 분자, 예컨대 자기 입자 또는 비드에 부착된 이러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 이차 항체 또는 다른 시약이, 존재한다면 샘플 내의 세포상의 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하게 되는 조건 하에서 수행된다.
일부 측면으로, 샘플은 자기장에 배치되고, 거기에 부착된 자성적으로 반응성인 또는 자기화 가능한 입자를 가진 세포들이 자석에 이끌릴 것이고 미표지 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택의 경우, 자석에 이끌리는 세포가 보유된다; 음성 선택의 경우, 이끌리지 않는 세포 (미표지 세포)가 보유된다. 일부 측면으로, 양성 및 음성 선택의 조합이 동일한 선택 단계 중에 수행되고, 이때 양성 및 음성 분획이 보유되며 추가로 처리되거나 추가의 분리 단계가 실행된다.
특정 구체예에서, 자성적으로 반응성인 입자는 일차 항체 또는 다른 결합 파트너, 이차 항체, 렉틴, 효소, 또는 스트렙트아비딘으로 코팅된다. 특정 구체예에서, 자기 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 일차 항체의 코팅을 통해 세포에 부탁된다. 특정 구체예에서, 비즈보다는 세포가 일차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 그런 후 세포-유형 특이적 이차 항체- 또는 다른 결합 파트너 (예컨대, 스트렙트아비딘)-코팅된 자기 입자가 첨가된다. 특정 구체예에서, 스트렙트아비딘-코팅된 자기 입자는 비오티닐화된 일차 또는 이차 항체와 함께 사용된다.
일부 구체예에서, 자성적으로 반응성인 입자는 세포에 부착된 채로 유지되고, 계속해서 인큐베이션되고, 배양되고 및/또는 조작된다; 일부 측면으로, 입자는 환자에게 투여하기 위해 세포에 부착된 채로 유지된다. 일부 구체예에서, 자기화 가능한 또는 자성적으로 반응성인 입자는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자기화 가능한 입자를 제거하는 방법은 알려져 있고, 예컨대 경합 미표지 항체, 자기화 가능한 입자 또는 링커를 절단하기 위해 콘쥬게이트된 항체, 등의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 자기화 가능한 입자는 생체분해성이다.
일부 구체예에서, 친화성-기반 선택은 자성-활성화된 세포 분류 (MACS)를 통한다 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). 자성 활성화된 세포 분류 (MACS) 시스템은 그것에 부착된 자기화된 입자를 가진 세포의 고순도 선택을 할 수 있다. 특정 구체예에서, MACS는 비표적 및 표적 종이 외부 자기장의 적용 후에 순차적으로 용출되는 방식으로 작동한다. 즉, 자기화된 입자에 부착된 세포가 제자리에서 유지되는 한편 미부착 종들은 용출된다. 그런 후, 이 제1 용출 단계가 완료된 후에, 자기장에 포획되고 용출되지 못한 종들은 그것들이 용출되고 회수되도록 하는 일부 방식으로 자유롭게 된다. 특정 구체예에서, 비표적 세포가 표지되고 세포의 이질성 집단으로부터 고갈된다.
특정 구체예에서, 격리 또는 분리는 방법의 격리, 세포 제조, 분리, 가공, 인큐베이션, 배양, 및/또는 제형화 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 장치, 또는 기구를 사용하여 수행된다. 일부 측면으로, 시스템은 폐쇄된 또는 멸균된 환경에서, 예를 들어, 오차, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위하여, 이들 단계들 각각을 수행하기 위해 사용된다. 한 실례에서, 시스템은 본원에 참조로 포함되는, PCT 특허 출원 공개 번호 WO　2009/072003, 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0003380 A1에서 기술되는 것과 같은 시스템이다. 일부 측면으로, 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 생성물, 또는 그것으로부터 유래된 샘플은 가공되거나 및/또는 그 내용이 전문으로 참조로 포함된 PCT 특허 출원 공개 번호 WO　2016/073602 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0122782에 기술된 것과 같은 시스템, 장치, 기구, 및/또는 방법을 사용하여 격리 또는 선택이 수행된다. 일부 구체예에서, 격리 또는 분리는 그 내용이 전문으로 참조로 포함된 PCT 특허 출원 공개 번호 WO 2015/164675에 기술된 방법에 따라 수행된다.
일부 구체예에서, 시스템 또는 장치는 통합된 또는 자체 함유된 시스템에서, 및/또는 자동화 또는 프로그램 가능한 양상으로, 격리, 가공, 조작, 및 제형화 단계 중 하나 이상, 예컨대 전부를 수행한다. 일부 측면으로, 시스템 또는 장치는 사용자가 가공, 격리, 조작, 및 제형화 단계의 결과를 프로그래밍, 제어, 평가하는 것, 및/또는 그런 단계들의 다양한 측면을 조정하는 것을 가능하게 하는 시스템 또는 장치와 연계되는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일부 측면으로, 분리 및/또는 다른 단계는, 예를 들어, 폐쇄된 및 멸균된 시스템에서 임상 규모 수준으로 세포의 자동화된 분리를 위해, CliniMACS 시스템 (Miltenyi Biotic)을 사용하여 수행된다. 구성요소로는 일체화된 마이크로컴퓨터, 자성 분리 장치, 연동식 펌프, 및 다양한 핀치 밸브를 들 수 있다. 일체화된 컴퓨터는 일부 측면으로 기기의 모든 구성요소를 제어하고 시스템이 표준화된 순서로 반복된 과정을 수행하도록 지시한다. 자성 분리 장치는 일부 측면으로 이동성 영구 자석 및 선택 칼럼을 위한 홀더를 포함한다. 연동식 펌프는 튜빙 세트 전체를 통한 유량을 제어하고, 핀치 밸브와 함께, 시스템을 통한 완충액의 제어된 흐름 및 세포의 연속적인 현탁을 보장한다.
CliniMACS 시스템은 일부 측면으로 멸균된, 비-발열성 용액으로 공급되는 항체-결합된 자기화 가능한 입자를 사용한다. 일부 구체예에서, 자기 입자로의 세포의 표지화 후에, 세포는 과잉 입자를 제거하기 위해 세척된다. 그런 후 세포 제조 주머니가 튜빙 세트에 연결되고, 차례로 완충액을 함유한 주머니 및 세포 수집 주머니에 연결된다. 튜빙 세트는 예비 칼럼 및 분리 칼럼을 포함한, 사전 조립된 멸균 튜빙으로 구성되며, 1회 사용만을 위한 것이다. 분리 프로그램이 시작된 후에, 시스템은 자동적으로 세포 샘플을 분리 칼럼 위로 적용한다. 표지된 세포는 칼럼 내에 보유되는 한편, 미표지 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 방법으로 사용하기 위한 세포 집단은 미표지되고 칼럼에 보유되지 않는다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 방법으로 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 칼럼에 보유된다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 방법으로 사용하기 위한 세포 집단은 자기장이 제거된 후에 칼럼으로부터 용출되고, 세포 수집 주머니 내에 수집된다.
특정 구체예에서, 분리 및/또는 다른 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. CliniMACS Prodigy 시스템은 일부 측면으로 자동화된 세척 및 원심분리에 의한 세포의 분획화를 허용하는 세포 가공 유니티가 장착된다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 온보드 카메라(onboard camera) 및 공급 세포 생성물의 육안으로 보이는 층을 식별함으로써 최적의 세포 분획화 종점을 결정하는 이미지 인식 소프트웨어를 포함한다. 예를 들어, 말초 혈액은 적혈구, 백혈구, 및 혈장 층으로 자동적으로 분리될 수 있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 세포 배양 프로토콜, 예컨대 세포 분화 및 팽창, 항원 로딩, 및 장기간 세포 배양을 이루는 통합된 세포 컬티베이션(cultivation) 챔버를 포함할 수 있다. 입력부는 배지의 멸균된 제거 및 보충을 가능하게 할 수 있고 세포는 통합된 현미경을 사용하여 모니터링될 수 있다. 예컨대, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82, 및 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701 참조.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 유동 세포분석을 통해 수집 및 풍부화 (또는 고갈)되는데, 이 방법에서 다중 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포가 유동성 스트림으로 운반된다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 제조 규모 (FACS) 분류를 통해 수집 및 풍부화 (또는 고갈)된다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 함께 미세전자기계 시스템 (MEMS) 칩을 사용함으로써 수집 및 풍부화 (또는 고갈)된다. 예컨대, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 및 Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376 참조. 두 경우에 모두, 세포는 다중 마커로 표지되어, 잘 규정된 T 세포 하위세트의 고순도에서의 분리를 허용한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출 가능한 마커로 표지되어, 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어, 분리는 형광 표지된 항체에 대한 결합을 기반으로 할 수 있다. 일부 실례에서, 하나 이상의 세포 표면 마터에 특이적인 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합을 기반으로 한 세포의 분리는, 예컨대 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 수행된다. 예컨대, 유동 세포분석 검출 시스템과 함께, 제조 규모 (FACS), 및/또는 미세전자기계 시스템 (MEMS) 칩을 포함한, 유동성 스트림에서 수행된다. 이러한 방법은 다중 마커를 기반으로 한 양성 및 음성 선택을 동시에 허용한다.
일부 구체예에서, 제조 방법은 격리, 인큐베이션, 및/또는 조작 전이나 후에 세포를 냉동, 예컨대 극저온 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 냉동 및 후속 해동 단계는 세포 집단의 과립구 및, 어느 정도의 단핵세포를 제거한다. 일부 구체예에서, 세포는, 예컨대 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에 냉동 용액에 현탁된다. 일부 측면으로 다양한 공지된 냉동 용액 및 매개변수들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 한 실례는 대략 20%의 다이메틸 설폭사이드 (DMSO) 및 대략 8%의 인간 형청 알부민 (BSA)을 함유한 PBS, 또는 다른 적합한 세포 냉동 배지를 사용하는 것을 포함한다. 일부 측면으로, 용액은 그런 후 DMSO 및 HSA가 각각 10% 및 4%의 최종 농도가 되도록 배지로 1:1로 희석된다. 세포는 그런 후 분당 1℃의 속도로 -80℃로 냉동되고 액체 질소 보관 탱크의 증기 상에 보관된다.
일부 측면으로 공지된 냉동 용액 및 매개변수들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 샘플은 극저온 보존 또는 유리화(vitrification) 배지 또는 동결보호제를 함유한 용액을 함유할 수 있다. 적합한 동결보호제로는, 한정하는 것은 아니지만, DMSO, 글리세롤, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로판다이올, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 1,2-프로판다이올 (PROH) 또는 이것들의 혼합물을 들 수 있다. 일부 실례에서, 극저온 보존 용액은 하나 이상의 비세포 침투 극저온 보존제, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 폴리비닐 피롤리다이온, 하이드록시에틸 전분, 다당, 단당, 알긴산염, 트레할로오스, 라피노오스, 덱스트란, 인간 혈청 알부민, 피콜, 리포단백질, 폴리비닐 피롤리돈, 하이드록시에틸 전분, 자가유래 혈창 또는 이것들의 혼합물을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 부피로 약 1% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 9%, 또는 약 6% 내지 약 9%의 최종 농도의 동결보호제를 포함한 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 냉동 용액 중의 동결보호제의 최종 농도는 부피로 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5%, 또는 약 10%이다.
특정 구체예에서, 세포는 부피로 약 1% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 9%, 또는 약 6% 내지 약 9%의 최종 농도의 DMSO를 포함한 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 냉동 용액 중의 DMSO의 최종 농도는 부피로 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5%, 또는 약 10%이다.
일부 구체예에서, 조성물은 극저온 보존에 적합한 하나 이상의 주머니에 담긴다 (예를 들어, CryoMacs® 냉동 주머니, Miltenyi Biotec). 일부 구체예에서, 조성물은 극저온 보존에 적합한 하나 이상의 바이알에 담긴다 (예를 들어, CellSeal® 바이알, Cook Regentec).
일부 구체예에서, 제공된 방법은 극저온 보존 단계 전이나 후속해서 컬티베이션, 인큐베이션, 배양, 및/또는 유전자 조작 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 유전자 조작 단계는 극저온 보존 단계에 후속해서 수행된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 극저온 보존된 세포 집단을 인큐베이션하거나 및/또는 조작하는 방법이 제공된다.
그러므로, 일부 구체예에서, 세포 집단은 배양-개시 조성물에서 인큐베이션된다. 인큐베이션 및/또는 조작은 배양 용기, 예컨대 장치, 챔버, 웰, 칼럼, 튜브, 튜빙 세트, 밸브, 바이알, 배양 접시, 주머니, 또는 세포를 배양 또는 컬티베이션하기 위한 다른 용기에서 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 유전자 조작 전에 또는 유전자 조작과 관련하여 인큐베이션되거나 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 컬티베이션, 자극, 활성화, 및/또는 증식을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 인큐베이션된다. 이러한 조건은 집단에서 세포의 증식, 팽창, 활성화, 및/또는 생존을 유도하기 위하여, 항원 노출을 모방하기 위하여, 및/또는 세포를 유전자 조작에 대해, 예컨대 재조합 항원 수용체의 도입을 위해 프라임하기 위하여 설계된 것들을 포함한다.
조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예컨대, 영양소, 아미노산, 항생물질, 이온, 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포를 활성화시키기 위하여 설계된 임의의 다른 작용제들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 측면으로, 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 인큐베이션되고 일부 구체예에서 사이토카인 칵테일이, 예를 들어 본원에 참조로 포함된, PCT 특허 출원 공개 번호 WO　2015/157384에서 기술된 것과 같이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 변환 전에, 변환과 동시에, 또는 후속해서 하나 이상의 사이토카인 및/또는 사이토카인 칵테일과 함께 인큐베이션된다.
일부 구체예에서, 자극 조건 또는 작용제는 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 작용제, 예컨대 리간드를 포함한다. 일부 측면으로, 작용제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 캐스케이트드를 켜거나 개시한다. 이러한 작용제로는 항체, 예컨대 TCR에 특이적인 것들, 예컨대 항-CD3을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 자극 조건은 동시자극 수용체, 예컨대, 항-CD28을 자극할 수 있는 하나 이상의 작용제, 예컨대 리간드를 포함한다. 이러한 작용제 및/또는 리간드는 고체 지지체, 예컨대 비드, 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합될 수 있다. 선택적으로, 팽창 방법은 추가로 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체를 배양 배지에 (예컨대, 적어도 약 0.5 ng/ml의 농도에서) 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 자극제는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-7을 포함한다. 일부 측면으로, IL-2 농도는 적어도 약 10 단위/mL이다.
일부 측면으로, 인큐베이션은 Riddell 등에 대한 미국 특허 제 6,040,177호, Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701에서 기술된 것들과 같은 기법에 따라 수행된다. 일부 측면으로, 인큐베이션은 그 내용이 전문으로 참조로 포함된 PCT 특허 출원 공개 번호 WO　2016/073602 또는 US 2016/0122782에서 기술된 시스템, 장치, 기구, 및/또는 방법을 사용하여 수행된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션 및/또는 배양은 그 내용이 전문으로 참조로 포함된 PCT 특허 출원 공개 번호 WO 2015/164675에 기술된 방법에 따라 수행된다.
일부 구체예에서, T 세포는 배양-개시 조성물에 공급기 세포, 예컨대 비분할 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 첨가하고 (예컨대, 그 결과로 얻어지는 세포 집단이 팽창될 초기 집단에서 각 T 림프구에 대하여 약 5, 10, 20, 또는 40개 또는 그 이상의 PBMC 공급기 세포를 함유하도록); 배양을 인큐베이션함 (예컨대 T 세포의 수를 팽창시키기에 충분한 시간 동안)으로써 팽창된다. 일부 측면으로, 비분할 공급기 세포는 감마선 조사된 PBMC 공급기 세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, PBMC는 세포 분할을 방지하기 위하여 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 측면으로, 공급기 세포는 T 세포의 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 구체예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어, 적어도 약 25℃, 일반적으로 적어도 약 30℃, 및 일반적으로 37℃ 또는 약 ℃를 포함한다. 선택적으로, 인큐베이션은 공급기 세포로서 비분할 EBV-형질전환된 림프모세포성 세포 (LCL)을 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rad 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. LCL 공급기 세포는 일부 측면으로 임의의 적합한 양으로, 예컨대 적어도 약 10:1의 LCL 공급기 세포 대 초기 T 림프구의 비율로서 제공된다.
구체예에서, 항원-특이적 T 세포, 예컨대 항원-특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 나이브 또는 항원 특이적 T 림프구를 항원으로 자극함으로써 얻어진다. 예를 들어, 항원-특이적 T 세포주 또는 클론은 감염된 대상체로부터 T 세포를 분리하고 세포를 시험관내에서 동일한 항원으로 자극함으로써 사이토메갈로바이러스 항원으로 생성될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 극저온으로 냉동 및/또는 보관되기 전에 풍부화된다. 세포를 극저온으로 냉동 및/또는 보관하기 전에 세포를 풍부화하는 것의 장점은 시간 절약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 수령체가 새포 재조합 치료법의 일부로서 세포를 필요로 할 때, 세포는 극저온 보관으로부터 해동될 수 있고 추가의 조작 없이 수령체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 세포 유형 또는 유형들의 풍부화를 포함한다. 일부 구체예에서, 풍부화된 세포는 T 세포이다. 일부 구체예에서, CD4+ T 세포가 풍부화된다. 일부 구체예에서, CD8+ T 세포가 풍부화된다. 일부 구체예에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포가 전부 풍부화된다. 일부 구체예에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 별도의 과정으로 풍부화된다. 일부 구체예에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 단일 과정으로 풍부화된다. CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 풍부화는, 예를 들어, 그 전문이 본원에 포함된 PCT 출원 공개 번호 WO 2015/164675에서 기술된 것과 같을 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 극저온으로 보관되기 전에 분석된다. 일부 구체예에서, 세포는 세포 활성을 측정하기 위해 분석될 수 있다. 일부 구체예에서, 활성은 세포의 생물학적 기능이다. 일부 구체예에서, 활성은 B 세포의 형질 세포 및/또는 기억 B 세포로의 성숙, 세포독성 T 세포 및/또는 대식세포의 활성화, 등을 포함한 면역학적 과정을 보조하는 세포의 능력이다. 일부 구체예에서, 활성은 수용체, 수용체-유사 분자, 항체, 또는 항체-유사 분자를 사용하여 특이적 리간드 또는 항원에 결합하는 세포의 능력이다. 일부 구체예에서, 활성은 바이러스-감염 세포 및 종양 세포를 인식하고 파괴하는 세포의 능력이다. 일부 구체예에서, 세포는 세포의 활성에 관련된 또는 그것에 영향을 미치는 세포의 또 다른 생물학적 기능을 측정하기 위하여 분석된다.
세포 선택 및/또는 가공 단계는 또한, 예를 들어, 그 내용이 전문으로 참조로써 본원에 포함된, WO2017214207, 및/또는 그 내용이 전문으로 참조로써 본원에 포함된, WO2016073602에 기술된 것일 수 있다.
극저온 냉동 방법
일부 구체예에서, 세포는, 예컨대, 특정 세포 밀도에서, 예컨대, 공지된 또는 제어된 세포 밀도에서 냉동된다. 특정 구체예에서, 냉동 과정 중의 세포 밀도는 냉동 과정 중에 일어나는 및/또는 냉동 과정으로 인한 세포 사멸 및/또는 세포 손상에 영향을 미칠 수 있다.
예를 들어, 특정 구체예에서, 세포 밀도는 평형, 예컨대 냉동 과정 중에 주변과의 삼투 평형에 영향을 미친다. 일부 구체예에서, 이 평형은 탈수이거나, 탈수를 포함하거나, 및/또는 탈수를 초래한다. 특정 구체예에서, 탈수는 냉동 용액, 예컨대 DMSO 및/또는 DMSO 함유 용액과의 접촉, 조합, 및/또는 인큐베이션으로 일어나는 세포 탈수이거나 세포 탈수를 포함한다. 특정 구체예에서, 탈수는 예컨대 세포에 노출된 유효한 액체 수분 농도를 감소시킴으로써 세포외 공간에서 얼음 결정의 핵생성 및 확대로부터 유발되는 탈수이거나 탈수를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 상이한, 예컨대 더 높거나 더 낮은 세포 밀도에서 냉동되는 세포보다 더 느린 및/또는 덜 빠른 탈수를 초래하는 세포 밀도에서 냉동된다. 일부 구체예에서, 세포는 동일한 또는 유사한 조건 하에서, 상이한 세포 밀도, 예컨대 더 높거나 더 낮은 세포 밀도에서 냉동된 세포보다 약, 적어도, 또는 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 50-배, 또는 100-배 더 느린 탈수를 초래하는 세포 밀도에서 냉동된다.
특정 구체예에서, 세포는 약 1x106 세포/mL 내지 약 1x108 세포/mL, 약 1x106 세포/mL 내지 약 2x107 세포/mL, 약 1x107 세포/mL 내지 약 5 x107 세포/mL, 또는 약 1x107 세포/mL 내지 5x107 세포/mL의 밀도에서 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 약 1x106 세포/mL, 약 2x106 세포/mL, 약 5x106 세포/mL, 약 1x107 세포/mL, 약 1.5x107 세포/mL, 약 2x107 세포/mL, 약 2.5x107 세포/mL, 약 2.5x107 세포/mL, 약 2.5x107 세포/mL, 약 3x107 세포/mL, 약 3.5x107 세포/mL, 약 4x107 세포/mL, 약 4.5x107 세포/mL, 또는 약 5x107 세포/mL (각각 포괄적)의 밀도에서 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 약 1.5x107 세포/mL 내지 약 6x107 세포/mL (각각 포괄적)의 밀도에서 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 적어도 약 1x107 세포/mL의 밀도에서 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 약 5x106 세포/mL 내지 약 150x106 세포/mL (각각 포괄적)의 밀도에서 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 적어도 약 1.5 x 107 세포/mL의 밀도에서 냉동 용액에 현탁된다. 일부 구체예에서, 세포는 생존성 세포이다. 일부 구체예에서, 세포 밀도는 T-세포 직경에 의해 측정된다.
일부 구체예에서, 세포는 하나 이상의 용기에서 냉동된다. 특정 구체예에서, 용기는 냉동 용기 및/또는 동결보호제 용기이다. 극저온에 적합한 용기로는, 한정하는 것은 아니지만, 바이알, 주머니, 예컨대 플라스틱 주머니, 및 캔이다. 특정 구체예에서, 세포, 예컨대, CAR 발현 세포를 함유한 세포 조성물과 같은 동일한 세포 조성물의 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10개, 또는 10개 이상의 별도의 용기에서 냉동된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 세포 및/또는 세포 조성물은 용기에 적합한 부피보다 더 큰 부피로, 예컨대, 용액, 냉동 용액, 및/또는 동결보호제로 현탁되고, 그로써 부피는 둘 이상의 용기에 넣어진다. 일부 구체예에서, 부피는 100 mL, 50 mL, 25 mL, 20 mL, 15 mL, 10 mL, 5 mL, 또는 5 mL 미만이거나, 약 100 mL, 50 mL, 25 mL, 20 mL, 15 mL, 10 mL, 5 mL, 또는 5 mL 미만이거나, 또는 100 mL 미만, 50 mL 미만, 25 mL 미만, 20 mL 미만, 15 mL 미만, 10 mL 미만, 5 mL 미만이며, 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 별도의 바이알에서 냉동된다. 특정 구체예에서, 동일한 부피의 세포가 각 바이알에 넣어진다. 일부 구체예에서, 바이알은 동일한 바이알, 예컨대, 동일한 메이커, 모델, 및/또는 제조 번호의 바이알이다. 특정 구체예에서, 부피는 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 120 mL, 150 mL, 200 mL, 또는 200 mL 이상이거나, 약 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 120 mL, 150 mL, 200 mL, 또는 200 mL 이상이거나, 또는 10 mL 이상, 15 mL 이상, 20 mL 이상, 25 mL 이상, 30 mL 이상, 40 mL 이상, 50 mL 이상, 60 mL 이상, 70 mL 이상, 80 mL 이상, 90 mL 이상, 100 mL 이상, 120 mL 이상, 150 mL 이상, 200 mL 이상이며, 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 별도의 주머니에서 냉동된다. 특정 구체예에서, 동일한 부피의 세포가 각 주머니에 넣어진다. 일부 구체예에서, 주머니는 동일한 주머니, 예컨대, 동일한 메이커, 모델, 및/또는 제조 번호의 주머니이다.
일부 구체예에서, 용기는 바이알이다. 특정 구체예에서, 용기는 다음 부피의, 약 다음 부피의, 또는 적어도 다음 부피의 충전 부피를 가진 바이알이다: 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 11 mL, 12 mL, 13 mL, 14 mL, 15 mL, 16 mL, 17 mL, 18 mL, 19 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 35 mL, 40 mL, 45 mL, 또는 50 mL. 일부 구체예에서, 바이알은 1 mL 내지 120 mL, 1 mL 내지 20 mL, 1 mL 내지 5 mL, 1mL 내지 10 mL, 1 mL 내지 40 mL, 또는 20 mL 내지 40 mL (각각 포괄적)의 충전 부피를 가진다. 일부 구체예에서, 바이알은 냉동 바이알, 동결보호제 바이알, 및/또는 극저온 바이알이다. 적합한 바이알이 알려져 있고 한정하는 것은 아니지만 CellSeal® 바이알 (Cook Regentec), 및 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 US 8,936,905, US 9,565,854 및 US 8,709,797에서 기술된 바이알을 포함한다.
특정 구체예에서, 용기는 주머니이다. 특정 구체예에서, 용기는 다음 부피의, 약 다음 부피의, 또는 적어도 다음 부피의 충전 부피를 가진 주머니이다: 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 11 mL, 12 mL, 13 mL, 14 mL, 15 mL, 16 mL, 17 mL, 18 mL, 19 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 35 mL, 40 mL, 45 mL, 또는 50 mL. 일부 구체예에서, 주머니는 1 mL 내지 120 mL, 1 mL 내지 20 mL, 1 mL 내지 5 mL, 1 mL 내지 40 mL, 20 mL 내지 40 mL, 1 mL 내지 70 mL, 또는 50 mL 내지 70 mL (각각 포괄적)의 충전 부피를 가진다. 일부 구체예에서, 주머니는 100 mL, 75 mL, 70 mL, 50 mL, 25 mL, 20 mL, 또는 10 mL의, 약 100 mL, 75 mL, 70 mL, 50 mL, 25 mL, 20 mL, 또는 10 mL의, 또는 100 mL 미만, 75 mL 미만, 70 mL 미만, 50 mL 미만, 25 mL 미만, 20 mL 미만, 또는 10 mL 미만의 부피로 충전된다. 적합한 주머니가 알려져 있고, 한정하는 것은 아니지만, CryoMacs® 냉동 주머니 (Miltenyi Biotec)를 포함한다. 특정 구체예에서, 부피는 실온에서의 부피이다. 일부 구체예에서, 부피는 37℃ 내지 4℃, 16℃ 내지 27℃ (각각 포괄적)의 부피이거나, 또는 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 또는 37℃, 또는 약 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 또는 37℃, 또는 적어도 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 또는 37℃에서의 부피이다. 일부 구체예에서, 부피는 25℃에서의 부피이다.
일부 구체예에서, 1 mL 내지 20 mL (포괄적)의 배지 또는 용액, 예컨대, 냉동 용액의 부피의 세포가 하나 이상의 바이알에서 냉동된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 바이알은 1 mL 내지 5 mL (포괄적)의 충전 부피를 가진다. 특정 구체예에서, 20 mL 내지 120 mL (포괄적)의 배지 또는 용액, 예컨대, 냉동 용액의 부피의 세포가 하나 이상의 주머니에서 냉동된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 주머니는 20 mL 내지 40 mL (포괄적)의 충전 부피를 가진다. 일부 구체예에서, 120 mL 이상의 배지 또는 용액, 예컨대, 냉동 용액의 부피의 세포가 하나 이상의 주머니에서 냉동된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 주머니는 50 mL 내지 70 mL (포괄적)의 충전 부피를 가진다.
특정 구체예에서, 세포는 용기, 예컨대, 주머니 또는 바이알에 들어있는 용액, 예컨대, 냉동 용액에서 표면적 대 부피 비율로 냉동된다. 특정 구체예에서, 표면적 대 부피 비율은 0.1 cm-1 또는 약 0.1 cm-1 내지 100 cm-1; 1 cm-1 내지 50 cm-1, 1 cm-1 내지 20 cm-1, 1 cm-1 내지 10 cm-1, 2 cm-1 내지 10 cm-1, 3 cm-1 내지 7 cm-1, 또는 3 cm-1 내지 6 cm-1, (각각 포괄적)이다. 특정 구체예에서, 표면적 대 부피 비율은 약 3 cm-1 내지 6 cm-1이다. 일부 구체예에서, 표면적 대 부피 비율은 3 cm-1, 4 cm-1, 5 cm-1, 6 cm-1, 또는 7 cm-1, 약 3 cm-1, 4 cm-1, 5 cm-1, 6 cm-1, 또는 7 cm-1, 또는 적어도 3 cm-1, 4 cm-1, 5 cm-1, 6 cm-1, 또는 7 cm-1이다.
일부 구체예에서, 세포는 분당 1℃ 또는 약 1℃의 속도로 -80℃로 냉동된다. 일부 구체예에서, 세포는 자동 온도 냉각기(controlled rate freezer)를 사용하여 분당 1℃ 또는 약 1℃의 속도로 능동적으로 및/또는 효과적으로 냉각된다. 일부 구체예에서, 세포는 자동 온도 냉각기로 냉동될 수 있다. 일부 측면으로, 세포를 그로그램된 냉각 프로파일, 예컨대 다중 냉각 및/또는 가열 속도를 가진 프로파일로 냉동시키기 위하여 자동 온도 냉각기가 사용된다. 이러한 냉동 프로파일은 핵형성, 예컨대, 얼음 형성을 제어하기 위하여, 예를 들어 세포내 얼음 형성을 감소시키기 위하여 프로그래밍될 수 있다. 일부 구체예에서, 신속한 냉각 프로파일을 시작하기 위해 선택된 온도 및 졸결 온도는 냉동되는 용기의 유형 및 부피와 관련된다. 일부 구체예에서, 만약 부피가 너무 작거나 용기가 너무 높은 표면적 대 부피 비율을 가진다면, 샘플은 온도가 내려가기에는 너무 빠르게 반응할 것이고, 너무 신속하게 냉동하여, 세포내 얼음 형성의 위험이 있다. 다른 구체예에서, 만약 부피가 너무 크거나 용기 직경이 너무 낮은 표면적 대 부피 비율을 가진다면, 샘플은 온도 강하에 반응하지 않을 것이고, 냉동은 너무 느리게 일어날 것이며, 샘플은 프로파일에서 더 나중에 제어되지 않은 핵형성의 위험이 있고 용액은 얼음 결정 형성 전에 극저온 보존제, 예컨대 DMSO에 대한 연장된 노출로부터 손상을 입힌다.
일부 구체예에서, 세포는 다음의 프로파일을 사용하여 냉동된다: 4.0℃에서의 유지 단계와 이어서 샘플이 -6℃의 온도에 도달할 때까지 분당 1.2℃의 냉각 단계. 일부 측면으로, 샘플은 그런 후 샘플을 함유한 챔버가 -65℃에 도달할 때까지 분당 25℃의 속도로 냉각된다. 일부 측면으로, 샘플은 그런 후 샘플을 함유한 챔버가 -30℃에 도달할 때까지 분당 15℃의 속도로 가열된다. 일부 측면으로, 샘플은 그런 후 샘플을 함유한 챔버가 -40℃에 도달할 때까지 분당 1℃의 속도로 냉각된다. 일부 측면으로, 샘플은 그런 후 샘플을 함유한 챔버가 -90℃에 도달할 때까지 분당 1℃의 속도로 냉각된다. 일부 측면으로, 샘플은 그런 후 자동 온도 냉각기로부터 제거될 때까지 -90℃에서 유지된다.
일부 구체예에서, 세포는 다음의 프로파일을 사용하여 냉동된다: 4.0℃에서의 유지 단계와 이어서 샘플이 -6℃의 온도에 도달할 때까지 분당 1.2℃의 냉각 단계. 일부 측면으로, 샘플은 그런 후 샘플을 함유한 챔버가 -65℃에 도달할 때까지 분당 25℃의 속도로 냉각된다. 일부 측면으로, 샘플은 그런 후 샘플을 함유한 챔버가 -30℃에 도달할 때까지 분당 15℃의 속도로 가열된다. 일부 측면으로, 샘플은 그런 후 샘플을 함유한 챔버가 -40℃에 도달할 때까지 분당 1℃의 속도로 냉각된다. 일부 측면으로, 샘플은 그런 후 샘플을 함유한 챔버가 -90℃에 도달할 때까지 분당 10℃의 속도로 냉각된다. 일부 측면으로, 샘플은 그런 후 자동 온도 냉각기로부터 제거될 때까지 -90℃에서 유지된다.
일부 구체예에서, 세포는 극저온으로 냉동 및/또는 보관되기 전에 -80℃ 이상 내지 0℃의 온도로 냉각된다. 예를 들어, 세포는 -20℃로, 또는 -80℃ 이상 내지 -20℃ 아래의 온도로 냉각될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 극저온으로 보관되기 전에 -210℃ 내지 -80℃의 온도로 극저온으로 냉동된다. 예를 들어 세포는 -210℃, 또는 -196℃, 또는 -80℃로 극저온으로 냉동될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 분당 0.1℃ 내지 5℃의 속도로 냉각 및/또는 극저온으로 냉동된다. 일부 구체예에서, 세포는 분당 0.2℃ 내지 4℃의 속도로 냉각 및/또는 극저온으로 냉동된다. 일부 구체예에서, 세포는 분당 0.5℃ 내지 3℃의 속도로 냉각 및/또는 극저온으로 냉동된다. 일부 구체예에서, 세포는 분당 0.5℃ 내지 2℃의 속도로 냉각 및/또는 극저온으로 냉동된다. 일부 구체예에서, 세포는 분당 1℃의 속도로 냉각 및/또는 극저온으로 냉동된다. 예를 들어, 상기 속도에서 세포를 냉각 및/또는 극저온으로 냉동하는 방법은 세포를 그 안에서 세포의 온도를 그러한 속도로 저하시키는 프로그램이 가능한 냉장고에 넣는 것을 포함한다. 그렇게 하는 또 다른 방법은 용기에 아이소프로필 알코올에 둘러싸인 세포 바이알을 넣고, 그 용기를 냉각된 또는 극저온으로 냉동된 환경에 배치하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 그것이 단계식 접근법을 사용하여 냉동되는 온도보다 낮은 온도에서 보관된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 보관은 -80℃ 아래, 예컨대 -100, -110, -120, -130, -140, -150, -160℃ 아래, 또는 그 아래의 온도에서 이루어진다. 일부 측면으로, 이러한 보관은 세포 또는 그것의 생물학적 활성의 더 큰 정도로의 및/또는 장기간의 유지를 제공한다.
일부 구체예에서, 냉각 또는 극저온 냉동 전에, 세포는 세포가 존재하는 샘플 중의 특정 성분들을 제거하기 위하여 세척된다. 예를 들어, 세포는 혈장 및/또는 혈소판을 제거하기 위하여 세척될 수 있다. 세포는, 예를 들어, 본원에 그 전문이 참조로 포함된, PCT 출원 공개 번호 WO 2015/164675에서 기술된 것과 같이 세척될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 냉각, 극저온 냉동, 및/또는 극저온 보관 전에 냉동 용액과 조합된다. 일부 구체예에서, 냉동 용액은 냉각, 극저온 냉동, 또는 극저온 보관 후에, 및 세포를 해동한 후에, 냉동 용액 없이 냉각된, 극저온으로 냉동된, 또는 극저온으로 보관된 세포와 비교하여, 세포의 하나 이상의 생물학적 기능의 더 큰 보유로 이어진다.
일부 구체예에서, 냉동 용액은 부피로 0.1% 내지 50%의 DMSO, 및 중량으로 0.1% 내지 20%의 HSA를 포함한다. 일부 구체예에서, 냉동 용액은 부피로 0.5% 내지 40%의 DMSO, 및 중량으로 0.2% 내지 15%의 HSA를 포함한다. 일부 구체예에서, 냉동 용액은 부피로 1% 내지 30%의 DMSO, 및 중량으로 0.5% 내지 10%의 HSA를 포함한다. 일부 구체예에서, 냉동 용액은 부피로 1% 내지 20%의 DMSO, 및 중량으로 2% 내지 7.5%의 HSA를 포함한다. 일부 구체예에서, 냉동 용액은 부피로 5% 내지 20%의 DMSO, 및 중량으로 1% 내지 5%의 HSA를 포함한다. 일부 구체예에서, 냉동 용액은 부피로 10%의 DMSO 또는 7 또는 7.5 또는 8%의 또는 약 7 또는 7.5 또는 8%의 DMSO, 및 중량으로 4%의 HSA를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 농도는 냉동 용액이 세포와 조합되기 전의 DMSO 및 HSA의 농도이다. 일부 구체예에서, 상기 농도는 냉동 용액이 세포와 조합된 후의 DMSO 및 HSA의 농도이다.
일부 구체예에서, 세포는 -210℃ 내지 -80℃의 온도에서 극저온으로 보관된다. 일부 구체예에서, 세포는 -210℃ 내지 -196℃의 온도에서 극저온으로 보관된다. 일부 구체예에서, 세포는 -196℃ 내지 -80℃의 온도에서 극저온으로 보관된다. 일부 구체예에서, 세포는 액체 질소 탱크의 증기상에서 극저온으로 보관된다.
일부 구체예에서, 세포는 1일 내지 12년의 기간 동안 극저온으로 보관된다. 예를 들어, 세포는 세포 치료법에서 사용하기 위해 세포 생존성을 잃기 전의 및 수령체의 치료를 위해 필요할 때까지의 기간 동안 보관될 수 있다. 수령체의 치료를 위해 필요할 때까지 그렇게 보관된 세포를 가짐으로써, 특정 구체예에서 개시된 방법은 수령체가 세포 치료법을 위해 그것을 필요로 할 때 쉽게 이용할 수 있는 세포를 가지는 장점을 제공한다. 일부 구체예에서, 세포는 12시간, 24시간, 36시간, 또는 48시간 이상의 시간 동안 보관되거나, 예치된다. 일부 구체예에서, 세포는 1주, 2주, 3주, 또는 4주 이상의 시간 동안 보관되거나 예치된다. 일부 구체예에서, 세포는 "장기간 보관" 또는 "장기간 예치"로 들어간다. 일부 측면으로, 세포는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 40년 이상, 또는 그 이상의 시간 동안 보관된다.
일부 구체예에서, 보관 기관 후에, 세포는 해동된다. 일부 구체예에서, 세포는 세포의 생물학적 기능의 적어도 일부를 복원시키기 위하여, 세포의 온도를 0℃ 이상으로 상승시킴으로써 해동된다. 일부 구체예에서, 세포는 세포의 생물학적 기능의 적어도 일부를 복원시키기 위하여, 세포의 온도를 37℃로 상승시킴으로써 해동된다. 특정 구체예에 따르면, 해동은 용기 중의 세포를 37℃ 수조에 60 내지 90초 동안 넣어두는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 세포는 해동된다. 특정 구체예에서, 세포는 신속하게, 예컨대 세포를 과열하거나 세포를 37℃를 초과하는 것과 같은 고온에 노출시키지 않으면서 가능한 신속하게 해동된다. 일부 구체예에서, 신속한 해동은 세포의 고농도의 동결보호제 및/또는 DMSO에의 노출을 감소시키거나 및/또는 방지한다. 특정 구체예에서, 해동이 일어나는 속도는 세포가 그 안에서 냉동되고 해동되는 용기, 예컨대 바이알 및/또는 주머니의 특성에 의해 영향을 받을 수 있다.
특정 구체예에서, 세포는 약 37℃, 35℃, 32℃, 30℃, 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 또는 15℃, 또는 37℃, 35℃, 32℃, 30℃, 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 또는 15℃ 미만, 또는 15℃ 내지 30℃, 23℃ 내지 28℃, 또는 24℃ 내지 26℃ (각각 포괄적)의 온도에서 해동된다.
일부 구체예에서, 세포는 열 블록(heat block) 상에서, 건식 해동기에서, 또는 수조에서 해동된다. 특정 구체예에서, 세포는 열 블록 상에서, 건식 해동기에서, 또는 수조에서 해동되지 않는다. 일부 구체예에서, 세포는 실온에서 해동된다.
일부 구체예에서, 용기 벽의 두께는 세포 해동의 속도에 영향을 주는데, 예를 들어 두꺼운 벽을 가진 용기의 세포는 더 얇은 벽을 가진 용기에서보다 더 느린 속도에서 해동할 수 있다. 일부 구체예에서, 낮은 표면적 대 부피 비를 가진 용기는 느린 및/또는 고르지 않은 해동 속도를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 극저온 냉동 세포는 1 cm-1, 2 cm-1, 3 cm-1, 4 cm-1, 5 cm-1, 6 cm-1, 또는 7 cm-1, 8 cm-1, 9 cm-1, 또는 10 cm-1의, 약 1 cm-1, 2 cm-1, 3 cm-1, 4 cm-1, 5 cm-1, 6 cm-1, 또는 7 cm-1, 8 cm-1, 9 cm-1, 또는 10 cm-1의, 또는 1 cm-1, 2 cm-1, 3 cm-1, 4 cm-1, 5 cm-1, 6 cm-1, 또는 7 cm-1, 8 cm-1, 9 cm-1, 또는 10 cm-1의 표면적 대 부피 비를 가진 용기에서 신속하게 해동된다. 특정 구체예에서, 세포는 120분, 90분, 60분, 45분, 30분, 25분, 20분, 15분, 또는 10분 내에, 약 120분, 90분, 60분, 45분, 30분, 25분, 20분, 15분, 또는 10분 내에, 또는 120분, 90분, 60분, 45분, 30분, 25분, 20분, 15분, 또는 10분 미만에 해동된다. 일부 구체예에서, 세포는 10분 내지 60분, 15분 내지 45분, 또는 15분 내지 25분 (각각 포괄적) 사이 동안에 해동된다. 특정 구체예에서, 세포는 20분 이내에, 약 20분 이내에, 또는 20분 미만에 해동된다.
특정 구체예에서, 해동된 세포는 투여 전에 또는 임의의 후속 조작 및/또는 가공 단계 전에 휴식(resting)이 취해진다, 예컨대 인큐베이션되거나 배양된다. 일부 구체예에서, 세포는 적은 양의 및/또는 검출될 수 없는 양의 동결보호제 중에서, 또는 동결보호제, 예컨대 DMSO의 부재 하에서 휴식된다. 특정 구체예에서, 해동된 세포는, 예컨대, 냉동보호제 및/또는 DMSO를 제거하기 위하여 세척 단계 후 또는 세척 단계 직후에 휴식된다. 일부 구체예에서, 휴식은 37℃에서의 또는 약 37℃에서의 배양 및/또는 인큐베이션이거나 배양 및/또는 인큐베이션을 포함한다. 일부 구체예에서, 휴식은 임의의 가공 또는 조작 단계와 함께 사용된 및/또는 관련된 임의의 시약, 예컨대 자극 시약, 비드 시약, 또는 재조합 사이토카인의 부재 하에 수행된다. 일부 구체예에서, 세포는 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 18시간, 또는 24시간 동안, 약 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 18시간, 또는 24시간 동안, 또는 적어도 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 18시간, 또는 24시간 동안 휴식된다. 특정 구체예에서, 세포는 2시간 동안, 약 2시간 동안, 또는 적어도 2시간 동안 휴식된다.
일부 구체예에서, 보관 단계 후에, 생존 세포의 백분율은 24% 내지 100%이다. 생존 세포의 백분율은, 예를 들어, ViCellTM 세포 생존성 분석기 (Beckman Coulter, Krefeld, Germany)를 사용하는 트립판 블루 축출을 수행하는 것을 개시하는 문헌에 기술된 것과 같이 (Schulz et al., Towards a xeno-free and fully chemically defined cryopreservation medium for maintaining viability, recovery, and antigen-specific functionality of PBMC during long-term storage, 382 J. Immu. Methods 24, 26), 예를 들어, 트립판 블루 염료 축출 기법을 사용함으로써 측정될 수 있다. 트립판 블루 염료 축출 기법 하에서, 예를 들어, 죽은 세포는 청색으로 나타나고 따라서 생존 세포와 구별이 가능하다. 생존 세포의 백분율 또한, 예를 들어, 유동 세포분석기 또는 또 다른 기법 또는 기기를 사용함으로써 측정될 수 있다.
샘플 또는 세포를 냉각, 극저온으로 냉동, 및/또는 극저온으로 보관하는 중에, 세포의 하나 이상의 생물학적 기능이 보존된다. 냉동 용액의 사용은 이들 생물학적 기능을 보존하는 것을 보조한다. 세포가 해동될 때, 이들 생물학적 기능은 복원된다. 상기에서 기술된 생물학적 기능인 생존성 외에, 다른 생물학적 기능으로는 세포의 복제 능력, 유전자 변형에 대한 수용성, 및 B 세포의 형질 세포 및/또는 기억 B 세포로의 성숙, 및 세포독성 T 세포 및/또는 대식세포의 활성화, 등을 포함한 면역학적 과정을 보조하는 능력을 들 수 있다.
일부 구체예에서, 동결보호제의 존재 하에 냉동된 및/또는 특정 부피 또는 표면적 대 부피 비율로 용기에 채워진, 기술된 임의의 세포 및 조성물, 예컨대 특정 농도 또는 세포 밀도에서의 세포 조성물을 포함한 냉동된 세포의 특징으로는, 개선된, 증가된, 및/또는 더 빠른 팽창; 개선된, 증가된, 및/또는 증강된 세포 생존 및 세포 사멸, 예컨대, 괴사, 프로그래밍된 세포 사멸, 및/또는 세포자멸사의 감소된 경우; 개선된, 증강된, 및/또는 증가된 활성, 예컨대, 세포독성 활성; 및/또는 대체 수단에 의해 냉동된 세포보다 해동 후 감소된 노쇠(senescence) 또는 정지(quiescence)의 경우를 들 수 있다.
특정 구체예에서, 세포는 본원에 제공된 세포 밀도 및/또는 표면적 대 부피 비에서 냉동되고 동일하거나 유사한 조건 하에서 상이한 세포 밀도 및/또는 상이한 표면적 대 부피 비에서 냉동된 세포와 비교하여, 냉동, 극저온 냉동, 및/또는 극저온 보존 중에 및/또는 그로 인해 감소된 세포 사멸, 예컨대 괴사 및/또는 세포자멸사를 가진다. 특정 구체예에서, 세포는 본원에 제공된 세포 밀도 및/또는 표면적 대 부피 비에서 냉동되고 냉동, 극저온 냉동, 및/또는 극저온 보존 후 48시간 내에, 예컨대, 냉동된 세포의 해동 후에, 감소된 지연된 세포 사멸, 예컨대, 괴사, 프로그래밍된 세포 사멸, 또는 세포자멸사를 통해 죽는 세포의 양의 감소를 가진다. 특정 구체예에서, 동일하거나 유사한 조건 하에서 상이한 세포 밀도 및/또는 상이한 표면적 대 부피 비에서 냉동된 세포와 비교하여, 적어도 또는 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 미만의 세포가 냉동 및/또는 극저온 보존 중에 및/또는 그로부터 결과적으로 죽는다. 특정 구체예에서, 제공된 세포 밀도 및/또는 표면적 대 부피 비에서 냉동된 세포의 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 또는 0.01% 미만이 냉동, 극저온 냉동, 및/또는 극저온 보존 중에 또는 그 결과로서 죽는다.
일부 구체예에서, 세포는 본원에 제공된 세포 밀도 및/또는 표면적 대 부피 비에서 냉동되고 동일하거나 유사한 조건 하에서 상이한 세포 밀도 및/또는 상이한 표면적 대 부피 비에서 냉동된 세포와 비교하여, 냉동, 극저온 냉동, 및/또는 극저온 보존으로 인한 및/또는 그 결과로 감소된 노화 또는 정지의 경우를 가진다. 특정 구체예에서, 적어도 또는 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 미만의 세포가 동일하거나 유사한 조건 하에서 상이한 세포 밀도 및/또는 상이한 표면적 대 부피 비에서 냉동된 세포와 비교하여 노쇠한 및/또는 정지한 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 제공된 세포 밀도 및/또는 표면적 대 부피 비에서 냉동되고 세포의 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 또는 0.01% 미만이 냉장, 극저온 냉장, 및/또는 극저온 보존의 결과로서 노쇠하거나 및/또는 정지하게 된다.
특정 구체예에서, 세포는 본원에 제공된 세포 밀도 및/또는 표면적 대 부피 비에서 냉동, 예컨대 극저온 냉동되고, 예컨대 본원에서 기술된 자극 시약과의 인큐베이션에 의해서와 같은 자극 조건 하에, 세포가 해동된 후에, 동일하거나 유사한 조건 하에서 상이한 세포 밀도 및/또는 상이한 표면적 대 부피 비에서 냉동된 세포와 비교하여, 개선된, 더 빠른, 및/또는 보다 신속한 팽창을 가진다. 특정 구체예에서, 세포는 동일하거나 유사한 조건 하에서 상이한 세포 밀도 및/또는 상이한 표면적 대 부피 비에서 냉동된 세포와 비교하여, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 1-배, 1.5배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배, 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 1-배, 1.5배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배, 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 1-배, 1.5배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 빠르거나 및/또는 보다 신속한 속도로 팽창한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 해동된 세포는 동일하거나 유사한 조건 하에서 상이한 세포 밀도 및/또는 상이한 표면적 대 부피 비에서 냉동되었던 해동 세포보다, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%, 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%, 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 더 적은 시간 내에 한계값 팽창, 예컨대 예정된 세포 수, 밀도, 또는 인자, 예컨대 2-배 팽창에 도달한다.
일부 구체예에서, 세포는 세포 밀도에서 냉동, 예컨대 극저온 냉동되고, 예컨대 본원에 기술된 세포용해 활성을 측정하기 위한 임의의 검정에 의해 측정되는 바, 세포가 해동된 후에, 동일하거나 유사한 조건 하에, 상이한 세포 밀도, 예컨대 더 높거나 낮은 밀도에서 냉동된 세포와 비교하여, 개선된, 증가된, 및/또는 보다 많은 세포용해 활성을 가진다. 특정 구체예에서, 세포용해 활성은 동일하거나 유사한 조건 하에서 상이한 밀도에서 냉동된 세포와 비교하여 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 1-배, 1.5배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배, 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 1-배, 1.5배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배, 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 1-배, 1.5배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 증가한다.
세포 변형
일부 구체예에서, 세포는 예를 들어, 새로운, 증강된, 변경된, 증가된, 또는 감소된 활성 중 하나 이상을 세포에 부여하기 위해 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 수집 후에 및 극저온 냉동 및/또는 보관 전에 변형된다. 일부 구체예에서, 세포는 극저온 보관에 이어지는 해동 후에 변형된다. 예시의 세포 변형 방법은 그 전문이 본원에 참조로 포함된, PCT 출원 공개 번호 WO　2016/033570 및 WO　2016/115559에서 기술된다. 예시의 세포 변형 방법은 또한 그 내용이 전체가 본원에 참조로 포함된, WO2017214207, 및/또는 WO2016073602에서 기술된다.
일부 구체예에서, 활성은 세포의 생물학적 기능, 예컨대, B 세포의 형질 세포 및/또는 기억 B 세포로의 성숙, 및 세포독성 T 세포 및/또는 대식세포의 활성화, 등을 포함한, 면역학적 과정을 보조하는 세포의 능력이다. 일부 구체예에서, 활성은 수용체, 수용체-유사 분자, 항체, 또는 항체-유사 분자를 사용하여 특이적 리간드 또는 항원에 결합하는 세포의 능력이다. 일부 구체예에서, 활성은 바이러스-감염 세포 및 종양 세포를 인식하고 파괴하는 세포의 능력이다.
세포의 유전자 변형
일부 구체예에서, 세포 변형은 세포를 유전자상에서 변형시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 유전자 변형은 본원에 그 전문이 포함되는, PCT 출원 공개 번호 WO　2016/033570 및 WO　2016/115559에서 기술된 것과 같을 수 있다. 예시의 유전자 변형 방법은 또한 그 내용이 전체가 본원에 참조로 포함된, WO2017214207, 및/또는 WO2016073602에서 기술된다.
일부 구체예에서, 유전자 변형은 세포가 단백질을 인식하기 위하여 단일 사슬 가변 단편 ("svFv")을 포함하는 키메릭 분자를 발현하는 것을 가능하게 하는 방식으로 세포를 유전자상에서 변형시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, scFv는 특이적 단백질에 결합한다. 일부 구체예에서, scFv는 특이적 단백질에 결합하는 항체의 일부로부터 유래된다. 일부 구체예에서, scFv가 세포에 의해 발현될 때, 세포는 암세포를 인식하고 그것을 활성화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, scFv는 고아 티로신 키나아제 수용체 RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, BCMA, IL-13Ra2, FCRL5/FCRH5, GPRC5D, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암종배아 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1 (WT-1), 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1), 및/또는 비오티닐화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자 중 적어도 하나에 결합한다. 일부 구체예에서, scFv는 CD19에 결합한다. 일부 구체예에서, scFv는 BCMA에 결합한다.
CAR
일부 구체예에서, 유전자 변형은 세포를 하나 이상의 키메릭 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형하는 것을 포함한다. CAR을 포함하는, 예시의 항원 수용체 및 이러한 수용체를 조작하는 방법 및 세포로 도입시키는 방법은, 예를 들어, PCT 특허 출원 공개 번호 WO　2000/14257, WO　2013/126726, WO　2012/129514, WO　2014/031687, WO　2013/166321, WO　2013/071154, WO　2013/123061 미국 특허 출원 공개 번호 2002/131960, 2013/287748, 2013/0149337, 미국 특허 제: 6,451,995호, 7,446,190호, 8,252,592호, 8,339,645호, 8,398,282호, 7,446,179호, 6,410,319호, 7,070,995호, 7,265,209호, 7,354,762호, 7,446,191호, 8,324,353호, 및 8,479,118호, 및 유럽 특허 번호 EP　2537416에서 기술된 방법, 및/또는 Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4): 388-398 (2013); Davila et al. PLoS ONE 8(4): e61338 (2013); Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 24(5): 633-39 (2012); Wu et al., Cancer, 18(2): 160-75 (2012)에 기술된 것들을 포함한다. 일부 측면으로, 항원 수용체는 미국 특허 제 7,446,190호에 기술된 CAR, 및 PCT 특허 출원 공개 번호 WO　2014/055668 A1에서 기술된 것들을 포함한다. CAR의 예로는 상기 언급된 공개물 중 임의의 것, 예컨대 WO　2014/031687, U.S. 8,339,645, U.S. 7,446,179, U.S. 2013/0149337, U.S. 7,446,190, U.S. 8,389,282, Kochenderfer et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al., J. Immunother. 35(9): 689-701 (2012); 및 Brentjens et al., Sci Transl Med., 5(177) (2013)에서 개시된 CAR을 들 수 있다. 또한 WO　2014/031687, U.S. 8,339,645, U.S. 7,446,179, U.S. 2013/0149337, U.S. 7,446,190, 및 U.S. 8,389,282 참조. 키메릭 수용체, 예컨대 CAR은 일반적으로 세포외 항원 결합 도메인, 예컨대 항체 분자의 일부, 일반적으로 항체의 가변 중쇄 (VH) 영역 및/또는 가변 경쇄 (VL) 영역, 예컨대, scFv 항체 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메릭 수용체는 항체 분자로부터 유래되지 않은 세포외 항원 결합 도메인, 예컨대 리간드 또는 다른 결합 모이어티를 포함한다.
일부 구체예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 그것은 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구체예에서, 항원은 정상 또는 비표적화 세포 또는 조직과 비교하여, 질환 또는 질병 세포, 예컨대 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과다발현된다. 다른 구체예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되거나 및/또는 조작된 세포 상에서 발현된다.
수용체에 의해 표적화된 항원은 일부 구체예에서 고아 티로신 키나아제 수용체 RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암종배아 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1 (WT-1), 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1), 및/또는 비오티닐화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자를 포함한다.
일부 구체예에서, CAR은 병원체-특이적 항원에 결합한다. 일부 구체예에서, CAR은 바이러스 항원 (예컨대 HIV, HCV, HBV, 등), 박테리아 항원, 및/또는 기생충 항원에 특이적이다.
일부 구체예에서, 재조합 수용체, 예컨대 CAR의 항체 부분은 추가로 면역글로불린 불변 영역의 일부, 예컨대 힌지 영역, 예컨대 IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 불변 영역 또는 부분은 인간 IgG, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 것이다. 일부 측면으로, 불변 영역의 부분은 항원 인식 구성요소, 예컨대, scFv와 경막 도메인 사이의 스페이서 영역으로서 작용한다. 스페이서는 스페이서의 부재시와 비교하여, 항원 결합 후에 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이의 것일 수 있다. 예시의 스페이서, 예컨대, 힌지 영역은 국제 특허 출원 공개 번호 WO　2014/031687에서 기술된 것을 포함한다. 일부 실례에서, 스페이서는 약 12개의 아미노산 길이이거나 12개 이하의 아미노산 길이이다. 예시의 스페이서로는 적어도 약 10 내지 229개 아미노산, 약 10 내지 200개 아미노산, 약 10 내지 175개 아미노산, 약 10 내지 150개 아미노산, 약 10 내지 125개 아미노산, 약 10 내지 100개 아미노산, 약 10 내지 75개 아미노산, 약 10 내지 50개 아미노산, 약 10 내지 40개 아미노산, 약 10 내지 30개 아미노산, 약 10 내지 20개 아미노산, 또는 약 10 내지 15개 아미노산, 및 임의의 열거된 범위의 종점 사이의 임의의 정수를 포함하는 아미노산을 가진 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, 스페이서 영역은 약 12개 이하의 아미노산, 약 119개 이하의 아미노산, 또는 약 229개 이하의 아미노산을 가진다. 예시의 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 예시의 스페이서는, 한정하는 것은 아니지만, Hudecek et al. Clin. Cancer Res., 19:3153 (2013), 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014031687, 미국 특허 제 8,822,647호 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0271635에서 기술된 것들을 포함한다.
일부 구체예에서, 불변 영역 또는 부분은 인간 IgG, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 것이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 서열 ESKYGPPCPPCP를 가진다. 일부 구체예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD이다.
항원 인식 도메인은 일반적으로 하나 이상의 세포내 신호전달 구성요소, 예컨대 항원 수용체 복합체, 예컨대 CAR의 경우에 TCR 복합체를 통해 활성화를 모방하는 신호전달 구성요소, 및/또는 또 다른 세포 표면 수용체를 통해 신호에 연결된다. 그러므로, 일부 구체예에서, 항원 결합 구성요소 (예컨대, 항체)는 하나 이상의 경막 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. 일부 구체예에서, 경막 도메인은 세포외 도메인에 융합된다. 한 구체예에서, 자연적으로 수용체, 예컨대 CAR의 도메인들 중 하나와 회합된 경막 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 경막 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원들과의 상호작용을 모방하기 위하여 이러한 도메인이 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 경막 도메인에 대한 결합을 피하기 위한 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
경막 도메인은 일부 구체예에서 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 일부 측면으로 임의의 막-결합 또는 경막 단백질로부터 유래된다. 경막 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154로부터 유래되는 (즉 이것들의 적어도 경막 영역(들)을 포함하는) 것들을 포함한다. 대안적으로 경막 도메인은 일부 구체예에서 합성된다. 일부 측면으로, 합성 경막 도메인은 류신 및 발린과 같은 우세하게 소수성인 잔기를 포함한다. 일부 측면으로, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛이 합성 경막 도메인의 각 단부에서 발견될 것이다. 일부 구체예에서, 연결은 링커, 스페이서, 및/또는 경막 도메인(들)에 의한다.
세포내 신호전달 도메인 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 동시자극 수용체와 조합된 이러한 수용체를 통한 신호, 및/또는 동시자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 비슷한 것들이 있다. 일부 구체예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예를 들어, 길이가 2 내지 10개 아미노산인 링커, 예컨대 글리신 및 세린을 함유한 링커, 예컨대 글리신-세린 더블렛이 존재하고 CAR의 경막 도메인과 세포질 신호전달 도메인 사이의 연결을 형성한다.
수용체, 예컨대, CAR은 일반적으로 적어도 하나의 세포내 신호전달 구성요소 또는 구성요소들을 포함한다. 일부 구체예에서, 수용체는 TCR 복합체의 세포내 구성요소, 예컨대 T-세포 활성화 및 세포독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예컨대, CD3 제타 사슬을 포함한다. 그러므로, 일부 측면으로, 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호전달 모듈에 연결된다. 일부 구체예에서, 세포 신호전달 모듈은 CD3 경막 도메인, CD3 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 다른 CD 경막 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 수용체, 예컨대, CAR은 추가로 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25, 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가적인 분자의 부분을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면으로, CAR 또는 다른 키메릭 수용체는 CD3-제타 (CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메릭 분자를 포함한다.
일부 구체예에서, CAR 또는 다른 키메릭 수용체의 연결 시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 정상적인 이펙터 기능 또는 면역 세포, 예컨대 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 반응 중 적어도 하나를 활성화한다. 예를 들어, 일부 맥락에서, CAR은 세포용해 활성 또는 T-헬퍼 활성과 같은 T 세포의 기능, 예컨대 사이토카인 또는 다른 인자의 분비를 유도한다. 일부 구체예에서, 항원 수용체 구성요소 또는 동시자극 분자의 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분은, 예를 들어, 그것이 이펙터 기능 신호를 변환시킨다면, 온전한 면역자극 사슬 대신 사용된다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인 또는 도메인은 T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열을 포함하고, 일부 측면으로 또한, 자연적인 맥락에서 항원 수용체 맞물림 후에 신호 변환을 개시하기 위하여 그러한 수용체와 협력하여 작용하는 공동 수용체의 세포질 서열을 포함한다.
자연적인 TCR의 맥락에서, 전체 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호전달뿐만 아니라, 동시자극 신호를 필요로 한다. 그러므로, 일부 구체예에서, 전체 활성화를 촉진하기 위하여, 이차 또는 동시자극 신호를 생성하기 위한 구성요소 또한 CAR에 포함된다. 다른 구체예에서, CAR은 동시자극 신호를 생성하기 위한 구성요소를 포함하지 않는다. 일부 측면으로, 추가적인 CAR이 동일한 세포에서 발현되고 이차 또는 동시자극 신호를 생성하기 위한 구성요소를 제공한다.
T 세포 활성화는 일부 측면으로 두 부류의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개되는 것으로서 기술된다: TCR을 통한 항원-의존성 일차 활성화를 개시하는 서열 (일차 세포질 신호전달 서열), 및 이차 또는 동시자극 신호를 제공하기 위해 항원-무관한 방식으로 작용하는 서열 (이차 세포질 신호전달 서열). 일부 측면으로, CAR은 이러한 신호전달 구성요소 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
일부 측면으로, CAR은 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절하는 일차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 자극적인 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 알려져 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 실례로는 CD3 제타 사슬, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타 및 CD3 엡실론으로부터 유래된 것들을 들 수 있다. 일부 구체예에서, CAR의 세포질 신호전달 분자(들)은 세포질 신호전달 도메인, 이것의 일부, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 함유한다.
일부 구체예에서, CAR은 동시자극 수용체, 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, 및 ICOS의 신호전달 도메인 및/또는 경막 부분을 포함한다. 일부 측면으로, 동일한 CAR은 활성화 및 동시자극 구성요소를 모두 포함한다.
일부 구체예에서, 활성화 도메인은 한 CAR 내에 포함되는 반면, 동시자극 구성요소는 또 다른 항원을 인식하는 또 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구체예에서, CAR은 둘 다 동일한 세포 상에서 발현되는 활성화 또는 자극 CAR, 동시자극 CAR을 포함한다 (WO2014/055668 참조). 일부 측면으로, 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR 및/또는 동시자극 CAR을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 추가로 억제 CAR (iCAR, Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013) 참조), 예컨대 질환 또는 질병과 관련된 또는 질환 또는 질병에 특이적인 항원 이외의 항원을 인식하고 그로써 질환-표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 신호가 억제 CAR의 그것의 리간드에의 결합에 의해, 예컨대, 표적 외 효과를 감소시키기 위해, 감소되거나 또는 억제되는 CAR을 포함한다.
특정 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 (예컨대, CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 CD28 경막 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 키메릭 CD28 및 CD137 (4-1BB, TNFRSF9) 동시자극 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, CAR은 하나 이상의, 예컨대, 둘 이상의 동시자극 도메인 및 활성화 도메인, 예컨대, 일차 활성화 도메인을 세포질 부분에 포함한다. 예시의 CDR은 CD3-제타, CD28, 및 4-1BB의 세포내 구성요소를 포함한다.
일부 구체예에서, CAR 또는 다른 항원 수용체는 추가로 수용체를 발현하기 위한 세포의 형질변환 또는 조작을 확인하기 위해 사용될 수 있는 마커, 예컨대 세포 표면 마커, 예컨대 세포 표면 수용체의 절단된 버전, 예컨대 절단된 EGFR (tEGFR)을 포함한다. 일부 측면으로, 마커는 PSMA, Her2, CD34, NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체 (예컨대, tEGFR)의 전부 또는 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 마커를 암호화하는 핵산은 링커 서열, 예컨대 절단 가능한 링커 서열, 예컨대, T2A를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 마커, 및 선택적으로 링커 서열은 본원에 참조로 포함된 PCT 특허 출원 공개 번호 WO　2014 031687에서 개시된 임의의 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 마커는, 그 내용이 전체로 포함된, PCT 특허 출원 공개 번호 WO　2011/056894에서 기술된 것과 같을 수 있다. 예를 들어, 마커는, 선택적으로, 링커 서열, 예컨대 T2A 절단 가능한 링커 서열에 연결된 절단된 EGFR (tEGFR)일 수 있다.
일부 구체예에서, 마커는 분자, 예컨대, T 세포 상에서 자연적으로 발견되지 않는 또는 T 세포의 표면에서 자연적으로 발견되지 않는 세포 표면 단백질, 또는 이것의 일부분이다. 일부 구체예에서, 분자는 비-자가 분자, 예컨대, 비-자가 단백질, 즉, 세포가 입양적으로(adoptively) 전달될 숙주의 면역 체계에 의해 "자가"로서 인식되지 않는 것이다.
일부 구체예에서, 마커는 치료적 기능을 제공하지 않거나 및/또는 유전자 조작을 위한, 예컨대, 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 마커로서 사용되는 것 이외의 효과를 생성하지 않는다. 다른 구체예에서, 마커는 치료 분자 또는 그렇지 않으면 일부 원하는 효과를 나타내는 분자, 예컨대 생체내에서 만나게 될 세포에 대한 리간드, 예컨대 입양적 전달 및 리간드와의 조우 시에 세포의 반응을 증강 및/또는 약화시키는 동시자극 또는 면역 체크포인트 분자일 수 있다.
일부 경우에, CAR은 제1, 제2, 및/또는 제3 세대 CAR로서 언급된다. 일부 측면으로, 제1 세대 CAR은 항원 결합시 단독으로 CD3-사슬 유도 신호를 제공하는 것이다; 일부 측면으로, 제2 세대 CAR은 이러한 신호 및 동시자극 신호를 제공하는 것, 예컨대 CD28 또는 CD137과 같은 동시자극 수용체로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함한 것이다; 일부 측면으로, 제3 세대 CAR은 상이한 동시자극 수용체의 다중 동시자극 도메인을 포함하는 것이다.
일부 구체예에서, 키메릭 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유한 세포외 부분을 포함한다. 일부 측면으로, 키메릭 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유한 세포외 부분 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함하고 세포내 도메인은 ITAM을 함유한다. 일부 측면으로, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메릭 항원 수용체는 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결시키는 경막 도메인을 포함한다. 일부 측면으로, 경막 도메인은 CD28의 경막 부분을 함유한다. 일부 구체예에서, 키메릭 항원 수용체는 T 세포 동시자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 세포외 도메인 및 경막 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포외 도메인 및 경막 도메인은 스페이서, 예컨대 본원에 기술된 임의의 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, 수용체는 경막 도메인이 유래되는 분자의 세포외 부분, 예컨대 CD28 세포외 부분을 함유한다. 일부 구체예에서, 키메릭 항원 수용체는 경막 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에서와 같이, T 세포 동시자극 분자 또는 이것의 기능성 변이체로부터 유래된 세포내 도메인을 함유한다. 일부 측면으로, T 세포 동시자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
예를 들어, 일부 구체예에서, CAR은 항체, 예컨대, 항체 단편, CD28의 경막 부분 또는 이것의 기능성 변이체이이거나 이것을 함유하는 경막 도메인, 및 CD28의 신호전달 부분 또는 이것의 기능성 변이체 및 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 이것의 기능성 변이체를 함유하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 항체, 예컨대, 항체 단편, CD28의 경막 부분 또는 이것의 기능성 변이체이거나 이것을 함유하는 경막 도메인, 및 4-1BB의 신호전달 부분 또는 이것의 기능성 변이체 및 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 이것의 기능성 변이체를 함유하는 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 이러한 구체예에서, 수용체는 추가로 Ig 분자, 예컨대 인간 Ig 분자의 부분, 예컨대 Ig 힌지, 예컨대 IgG4 힌지, 예컨대 힌지-단독 스페이서를 포함한다.
일부 구체예에서, 재조합 수용체, 예컨대 CAR의 경막 도메인은 인간 CD28 (예컨대 등록 번호 P01747.1)의 경막 도메인 또는 이것의 변이체이거나 이것을 포함한다.
일부 구체예에서, 재조합 수용체, 예컨대 CAR의 세포내 신호전달 구성요소(들)은 인간 CD28의 세포내 동시자극 신호전달 도메인 또는 이것의 기능성 변이체 또는 부분, 예컨대 천연 CD28 단백질의 위치 186 및 187에서 LL의 GG 치환을 가진 도메인을 함유한다. 일부 구체예에서, 세포내 도메인은 4-1BB (예컨대 (등록 번호 Q07011.1)의 세포내 동시자극 신호전달 도메인 또는 이것의 기능성 변이체 또는 부분을 포함한다.
일부 구체예에서, 재조합 수용체, 예컨대 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 자극 신호전달 도메인 또는 이것의 기능성 변이체, 예컨대 인간 CD3ζ (등록 번호: P20963.2)의 아이소폼 3의 112 AA 세포질 도메인 또는 미국 특허 제 7,446,190호 또는 미국 특허 제 8,911,993호에서 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 측면으로, 스페이서는 IgG의 힌지 영역만, 예컨대 IgG4 또는 IgG1만을 함유한다. 다른 구체예에서, 스페이서는 선택적으로 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지, 예컨대 IgG4-유래 힌지이거나 이것을 함유한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지, 예컨대 IgG4 힌지이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 CH3 도메인에만 연결된 Ig 힌지, 예컨대 IgG4 힌지이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 가요성 링커와 같은 다른 가요성 링커이거나 이것을 포함한다.
예를 들어, 일부 구체예에서, CAR은 scFv를 포함하는, 항체 단편과 같은 항체, 스페이서, 예컨대 면역글로불린 분자의 부분, 예컨대 힌지 영역 및/또는 중쇄 분자의 하나 이상의 불변 영역, 예컨대 Ig-힌지 함유 스페이서, CD28-유래 경막 도메인의 전부 또는 일부를 함유하는 경막 도메인, CD28-유래 세포내 신호전달 도메인, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 항체 또는 항체 단편, 예컨대 scFv, 임의의 Ig-힌지 함유 스페이서와 같은 스페이서, CD28-유래 경막 도메인, 4-1BB-유래 세포내 신호전달 도메인, 및 CD3 제타-유래 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 이러한 CAR 구성물을 암호화하는 핵산 분자는 추가로 T2A 리보좀 스킵 요소 및/또는 tEGFR 서열을 암호화하는 서열, 예컨대 CAR을 암호화하는 서열의 하류를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 수용체 (예컨대 CAR)를 발현하는 T 세포는 또한 비-면역원성 선택 에피토프로서 절단된 EGFR (EGFRt)을 발현하기 위해 생성될 수 있고 (예컨대 동일한 구성물로부터 두 단백질을 발현하기 위하여 T2A 리보좀 스위치에 의해 분리된 CAR 및 EGFRt를 암호화하는 구성물의 도입에 의함), 그런 후에 이러한 세포를 검출하기 위한 마커로더 사용될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제 8,802,374호 참조).
대상체에게 투여된 세포에 의해 발현된 재조합 수용체, 예컨대 CAR은 일반적으로 치료되는 질환 또는 질병 또는 그것의 세포에서 발현되는, 그것과 관련된, 및/또는 그것에 특이적인 분자를 인식하거나 또는 분자에 특이적으로 결합한다. 분자, 예컨대 항원에 특이적으로 결합된 때, 수용체는 일반적으로 면역자극 신호, 예컨대 ITAM-변환 신호를 세포에 전달하고, 그로써 질환 또는 질병에 표적화된 면역 반응을 촉진한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 세포는 질환 또는 질병의 세포 또는 조직에 의해 발현된 또는 질환 또는 질병과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현한다.
TCR
일부 구체예에서, 유전자 변형은 표적 폴리펩타이드, 예컨대 항원 또는 종양, 바이러스 또는 자가면역 단백질의 펩타이드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 하나 이상의 T 세포 수용체 (TCR) 또는 이것의 항원-결합 부분을 발현하도록 세포를 유전자 변형시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 사슬 (또한 각각 TCRα 및 TCRβ로서 알려져 있음) 또는 γ 및 δ 사슬 (또한 각각 TCRγ 및 TCRδ로서 알려져 있음), 또는 이것들의 항원-결합 부분을 함유하고, MHC 분자에 결합된 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자이다. 일부 구체예에서, TCR은 αβ 형태이다. 전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이것들을 발현하는 T 세포는 구별되는 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 일반적으로 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 데 기여하는 곳인 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면에서 발견된다.
다르게 진술되지 않는 한, 용어 "TCR"은 전체 TCR뿐만 아니라 이것의 항원-결합 부분 또는 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구체예에서, TCR은 αβ 형태 또는 γδ 형태로 존재하는 TCR을 포함하는, 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 구체예에서, TCR은 전장 TCR보다 적지만 MHC 분자에서 결합된 특이적 펩타이드에 결합하는, 예컨대 MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 항원-결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있지만, 여전히 전체 TCR이 결합하는 펩타이드 에피토프, 예컨대 MHC-펩타이드 복합체에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항원-결합 부분은 특이적 MHC-펩타이드 복합체에의 결합을 위해 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 도메인, 예컨대 TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬을 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩타이드, MHC 및/또는 MHC-펩타이드 복합체의 인식에 관여된 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 구체예에서, TCR의 가변 도메인은 초가변 루프, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하며, 이것은 일반적으로 항원 인식 및 결합 용량 및 특이성에 대한 주요 기여자이다. 일부 구체예에서, TCR의 CDR 또는 이것의 조합은 주어진 TCR 분자의 모든 또는 실질적으로 모든 항원 결합 부위를 형성한다. TCR의 가변 영역 내의 다양한 CDR은 일반적으로 프레임워크 영역 (FR)에 의해 분리되며, FR은 일반적으로 CDR에 비교하여 TCR 분자들 중에서 더 적은 가변성을 나타낸다 (예컨대, Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988 참조; 또한 Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 참조). 일부 구체예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성의 원인이 되는 주요 CDR이거나, 또는 항원 인식, 및/또는 펩타이드-MHC 복합체의 프로세싱된 펩타이드 부분과의 상호작용에 대해 주어진 TCR 가변 영역 상의 3개의 CDR 중 가장 중요하다. 일부 맥락에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원성 펩타이드의 N-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, 베타 사슬의 CDR1은 펩타이드의 C-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, CDR2는 MHC-펩타이드 복합체의 MHC 부분과의 상호작용 또는 인식에 대해 가장 강력하게 기여하거나 또는 기여하는 주된 CDR이다. 일부 구체예에서, β-사슬의 가변 영역은 일반적으로 수퍼 항원 결합에 관여하며 항원 인식에 관여하지 않는 추가의 초가변 영역 (CDR4 또는 HVR4)을 함유할 수 없다 (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구체예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 경막 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다 (예컨대, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997 참조). 일부 측면으로, TCR의 각 사슬은 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 경막 영역, 및 C-말단 단부에 짧은 세포질 꼬리를 가진다. 일부 구체예에서, TCR은 신호 변환을 매개하는 데 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 관련된다.
일부 구체예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 주어진 TCR 사슬 (예컨대, α-사슬 또는 β-사슬)의 세포외 부분은 2개의 면역글로불린-유사 도메인, 예컨대 가변 도메인 (예컨대, Vα 또는 Vβ; 전형적으로 Kabat 넘버링을 기준으로 아미노산 1 내지 116 (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.)) 및 세포 막에 인접한 불변 도메인 (예컨대, α-사슬 불변 도메인 또는 Cα, 전형적으로 Kabat 넘버링을 기준으로 위치 117 내지 259 또는 β 사슬 불변 도메인 또는 Cβ, 전형적으로 Kabat을 기준으로 사슬의 위치 117 내지 295)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 두 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막-근접 불변 도메인, 및 2개의 막-원위 가변 도메인을 함유하며, 가변 도메인은 각각 CDR을 함유한다. TCR의 불변 도메인은 그 안의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고, 그로써 TCR의 2개 사슬을 연결시키는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, TCR은 α 및 β 사슬 각각에 추가적인 시스테인 잔기를 가질 수 있어서, TCR은 불변 도메인에 2개의 이황화 결합을 함유한다.
일부 구체예에서, TCR 사슬은 경막 도메인을 함유한다. 일부 구체예에서, the 경막 도메인은 양전하로 대전된다. 일부 경우에, TCR 사슬은 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에, 구조는 TCR이 CD3과 같은 다른 분자 및 이것의 하위단위와 회합되는 것을 허용한다. 예를 들어, 경막 영역을 가진 불변 도메인을 함유한 TCR은 단백질을 세포마에 고정시킬 수 있고 CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 불변 하위단위와 회합할 수 있다. CD3 신호전달 하위단위 (예컨대 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포내 꼬리는 TCR 복합체의 신호전달 용량에 관여된 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 함유한다.
일부 구체예에서, TCR은 두 사슬 α 및 β (또는 선택적으로 γ 및 δ)의 헤테로다이머이거나 또는 단일 사슬 TCR 구성물일 수 있다. 일부 구체예에서, TCR은, 예컨대 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해 연결된 2개의 별도의 사슬 (α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 함유하는 헤테로다이머이다.
일부 구체예에서, TCR은 실질적으로 전장 코딩 서열이 쉽게 이용될 수 있는 공지의 TCR 서열(들), 예컨대 Vα,β 사슬로부터 생성될 수 있다. 세포 공급원으로부터 V 사슬 서열을 포함한, 전장 TCR 서열을 얻는 방법은 잘 알려져 있다. 일부 구체예에서, TCR을 암호화하는 핵산이 다양한 공급원으로부터, 예컨대 주어진 세포 또는 세포 내의 또는 그것으로부터 분리된 TCR-암호화 핵산의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해, 또는 공공연하게 이용할 수 있는 TCR 서열의 합성에 의해 얻어질 수 있다.
일부 구체예에서, TCR은 생물학적 공급원으로부터, 예컨대 세포로부터, 예컨대 T 세포 (예컨대 세포독성 T 세포), T-세포 하이브리도마 또는 다른 공공연하게 이용할 수 있는 공급원으로부터 얻어진다. 일부 구체예에서, T-세포는 생체내에서 분리된 세포로부터 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, TCR은 흉선에서 선택된 TCR이다. 일부 구체예에서, TCR은 네오에피토프-제한 TCR이다. 일부 구체예에서, T- 세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구체예에서, TCR 또는 이것의 항원-결합 부분은 TCR의 서열의 지식으로부터 합성에 의해 생성될 수 있다.
일부 구체예에서, TCR은 표적 폴리펩타이드 항원, 또는 이것의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR의 라이브러리를 스크리닝하는 것으로부터 확인된 또는 선택된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 다른 림프양 기관에 존재하는 세포를 포함한, 대상체로부터 분리된 T 세포로부터의 Vα 및 Vβ의 레퍼토리의 증폭에 의해 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양-침윤 림프구 (TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR은 건강한 대상체의 정상의 T 세포 공급원, 즉 정상적인 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR은 질환을 가진 대상체의 T 세포 공급원으로부터, 즉 질환에 걸린 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구체예에서, 축퇴성 프라이머가, 예컨대 샘플, 예컨대 인간으로부터 얻어진 T 세포에서의 RT-PCR에 의해 Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, scTv 라이브러리는 링커에 의해 분리될, 증폭된 생성물이 클로닝되고 조립되는 나이브 Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 조립될 수 있다. 대상체 및 세포의 공급원에 따라, 라이브러리는 HLA 대립유전자-특이적일 수 있다. 대안적으로, 일부 구체예에서, TCR 라이브러리는 모 또는 스캐폴드 TCR 분자의 돌연변이생성 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 측면으로, TCR은 예컨대 α 또는 β 사슬의 돌연변이생성에 의해 직접 진화가 실행된다. 일부 측면으로, TCR의 CDR 내의 특정 잔기가 변경된다. 일부 구체예에서, 선택된 TCR은 친화성 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 항원-특이적 T 세포가, 예컨대 펩타이드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위한 스크리닝에 의해 선택될 수 있다. 일부 측면으로, 예컨대 항원-특이적 T 세포 상에 존재하는 TCR이, 예컨대 결합 활성, 예컨대 항원에 대해 특별한 친화성 또는 결합력에 의해 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, TCR 또는 이것의 항원-결합 부분은 변형된 또는 조작된 것이다. 일부 구체예에서, 직접 진화 방법이 특이적 MHC-펩타이드 복합체에 대한 더 높은 친화성을 가지는 것과 같은, 변경된 특성을 가지는 TCR을 생성하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 직접 진화는, 한정하는 것은 아니지만, 효모 디스플레이 (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이 (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), 또는 T 세포 디스플레이 (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)를 포함한 디스플레이 방법에 의해 이루어진다. 일부 구체예에서, 디스플레이 접근법은 공지의, 모 또는 참조 TCR의 조작, 또는 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 야생형 TCR은 돌연변이 생성된 TCR의 제조를 위한 주형으로서 사용될 수 있으며, 여기서 CDR의 하나 이상의 잔기가 돌연변이되고, 원하는 변경된 특성, 예컨대 원하는 표적 항원에 대한 더 높은 친화성을 가진 돌연변이체가 선택된다.
일부 구체예에서, 관심의 TCR을 제조하거나 생성하는 데 사용하기 위한 표적 폴리펩타이드의 펩타이드는 알려져 있거나 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR 또는 항원-결합 부분을 생성하는 데 사용하기에 적합한 펩타이드는 관심의 표적 폴리펩타이드, 예컨대 하기 기술되는 표적 폴리펩타이드에서 HLA-제한 모티프의 존재를 기반으로 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, HLA-A0201 결합 모티프, 프로테아좀 및 면역-프로테아좀에 대한 절단 부위, 및 펩타이드는 당업자에게 알려져 있는 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 확인된다. 일부 구체예에서, MHC 부류 I 결합 부위를 예측하기 위하여, 이러한 모델은, 한정하는 것은 아니지만, ProPred1 (Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237), 및 SYFPEITHI (Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007 참조)를 들 수 있다. 일부 구체예에서, MHC-제한 에피토프는 HLA-A0201이고, 이것은 모든 백인의 대략 39 내지 46%에서 발현되며, 그러므로 TCR 또는 MHC-펩타이드 결합 분자를 제조하는 데 사용하기 위한 MHC 항원의 적합한 선택을 나타낸다.
일부 구체예에서, TCR 또는 이것의 항원 결합 부분은 하나 이상의 특성, 예컨대 특징적인 결합이 변경되어 있는 재조합에 의해 제조된 천연 단백질 또는 이것의 돌연변이된 형태일 수 있다. 일부 구체예에서, TCR은 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 또는 다른 포유류 중 하나로부터 유래될 수 있다. TCR은 세포-결합 또는 가용성 형태로 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 방법의 목적에 대해, TCR은 세포 표면에서 발현된 세포-결합 형태로 있다.
일부 구체예에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 구체예에서, TCR은 항원-결합 부분이다. 일부 구체예에서, TCR은 다이머 TCR (dTCR)이다. 일부 구체예에서, TCR은 단일 사슬 TCR (sc-TCR)이다. 일부 구체예에서, dTCR 또는 scTCR은 본원에 참조로 포함된 WO 03/020763, WO 04/033685, WO　2011/044186에서 기술된 구조를 가진다.
일부 구체예에서, TCR은 경막 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, TCR은 세포질 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, TCR은 CD3과 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는, 임의의 TCR은 T 세포의 표면에서 활성 TCR을 생성하는 신호전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR은 세포 표면에서 발현된다.
일부 구체예에서, dTCR은 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합되어 있는 제1 폴리펩타이드, 및 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR β 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합되어 있는 제2 폴리펩타이드를 함유하며, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 이황화 결합에 의해 연결되어 있다. 일부 구체예에서, 결합은 천연 다이머 αβ TCR로 존재하는 천연 사슬-간 이황화 결합에 상응할 수 있다. 일부 구체예에서, 사슬간 이황화 결합은 천연 TCR에는 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 하나 이상의 시스테인이 dTCR 폴리펩타이드 쌍의 불변 영역 세포외 서열 안으로 통합될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화 결합은 모두 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, TCR은 막에 고정시키기 위하여 경막 서열을 함유한다.
일부 구체예에서, dTCR은 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 불변 α 도메인의 C-말단에 부착된 제1 다이머화 모티프를 함유한 TCR α 사슬, 및 가변 β 도메인, a 불변 β 도메인 및 불변 β 도메인의 C-말단에 부착된 제1 다이머화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬을 함유하며, 여기서 제1 및 제2 다이머화 모티프는 쉽게 상호작용되어 제1 다이머화 모티프의 아미노산과 제2 다이머화 모티프의 아미노산 사이에서 공유 결합을 형성하여 TCR α 사슬과 TCR β 사슬을 함께 연결시킨다.
일부 구체예에서, TCR은 scTCR이다. 전형적으로, scTCR은 당업자들에게 알려져 있는 방법을 사용하여 생성될 수 있다, 예컨대, Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); PCT 출원 공개 번호 WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO　2011/044186; 및 Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996) 참조. 일부 구체예에서, scTCR은 TCR 사슬의 회합을 용이하게 하기 위하여 도입된 비천연 이황화 사슬간 결합을 함유한다 (예컨대 PCT 출원 공개 번호 WO 03/020763 참조, 본원에 참조로 포함됨). 일부 구체예에서, scTCR은 그것의 C-말단에 융합된 이종성 류신 지퍼가 사슬 회합을 용이하게 하는 비-이황화 연결된 절단된 TCR이다 (예컨대, PCT 출원 공개 번호 WO99/60120, 본원에 참조로 포함됨). 일부 구체예에서, scTCR은 TCRβ 가변 도메인에 펩타이드 링커를 통해 공유 연결된 TCRα 가변 도메인을 함유한다 (예컨대, PCT 출원 공개 번호 WO　99/18129 참조, 본원에 참조로 포함됨).
일부 구체예에서, scTCR은 TCR α 사슬 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열에 의해 구성된 제1 분절, TCR β 사슬 불변 도메인 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역에 사응하는 서열에 의해 구성된 제2 분절, 및 제1 분절의 C 말단을 제2 분절의 N 말단에 연결시키는 링커 서열을 함유한다.
일부 구체예에서, scTCR은 α 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열에 의해 구성된 제1 분절, 및 서열 β 사슬 세포외 불변 및 경막 서열의 N 말단에 융합된 β 사슬 가변 영역 서열에 의해 구성된 제2 분절, 및, 선택적으로, 제2 분절의 N 말단에 제1 분절의 C 말단을 연결시키는 링커 서열을 함유한다.
일부 구체예에서, scTCR은 β 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 의해 구성된 제1 분절, 및 서열 α 사슬 세포외 불변 및 경막 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열에 의해 구성된 제2 분절, 및 선택적으로, 제2 분절의 N 말단에 제1 분절의 C 말단을 연결시키는 링커 서열을 함유한다.
일부 구체예에서, 제1 및 제2 TCR 분절을 연결시키는 scTCR의 링커는 단일 폴리펩타이드 가닥을 형성할 수 있는 한편, TCR 결합 특이성을 보유하는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구체예에서, 링커 서열은, 예를 들어, 식 -P-AA-P-를 가질 수 있고, 여기서 P는 프롤린이며 AA는 아미노산이 글리신 및/또는 세린인 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 분절은 이것들의 가변 영역 서열이 이러한 결합에 대해 배향되도록 쌍을 형성한다. 그러므로, 일부 경우에, 링커는 제1 분절의 C 말단과 제2 분절의 N 말단 사이의 거리, 또는 그 역의 거리를 걸치기에 충분한 길이를 갖지만, scTCR의 표적 리간드에 대한 결합을 차단하거나 감소시키기에는 너무 긴 것이 아니다. 일부 구체예에서, 링커는 10 내지 또는 약 10 내지 45개 아미노산, 예컨대 10 내지 30개 아미노산 또는 26 내지 41개 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32개 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 식 -PGGG-(SGGGG)5-P-를 가지며, 여기서 P는 프롤린이고, G는 글리신이며 S는 세린이다. 일부 구체예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS를 가진다.
일부 구체예에서, scTCR은 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를 β 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 연결시키는 공유 이황화 결합을 함유한다. 일부 구체예에서, 천연 TCR에서 사슬간 이황화 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 하나 이상의 시스테인이 scTCR 폴리펩타이드의 제1 및 제2 분절의 불변 영역 세포외 서열로 통합될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화 결합 둘 다 바람직할 수 있다.
도입된 사슬간 이황화 결합을 함유한 dTCR 또는 scTCR의 일부 구체예에서, 천연 이황화 결합은 존재하지 않는다. 일부 구체예에서, 천연 사슬간 이황화 결합을 형성하는 하나 이상의 천연 시스테인이 다른 잔기, 예컨대 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구체예에서, 도입된 이황화 결합은 제1 및 제2 분절 상의 비-시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시의 비천연 이황화 결합은, 본원에 참조로 포함된 PCT 출원 공개 번호 WO　2006/000830에서 기술된다.
일부 구체예에서, TCR 또는 이것의 항원-결합 단편은 표적 항원에 대하여 약 10-5 내지 10-12 M 및 이 안의 모든 개별적인 값 및 범위의 평형 결합 상수를 가진 친화성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 표적 항원은 MHC-펩타이드 복합체 또는 리간드이다.
일부 구체예에서, TCR을 암호화하는 핵산 또는 핵산들, 예컨대 α 및 β 사슬은 PCR 또는 다른 적합한 수단에 의해 증폭될 수 있고 적합한 발현 벡터 또는 벡터들로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주를 형질전환 또는 트랜스펙션시키기 위하여 사용될 수 있다. 적합한 벡터로는 증식 및 팽창을 위해, 또는 발현을 위해, 또는 둘 다를 위해 설계된 것들, 예컨대 플라스미드 및 바이러스를 들 수 있다.
일부 구체예에서, 벡터는 pUC 시리즈 (Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈 (Stratagene, LaJolla, Calif.), pET 시리즈 (Novagen, Madison, Wis.), pGEX 시리즈 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 또는 pEX 시리즈 (Clontech, Palo Alto, Calif.)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에, 박테리오파지 벡터, 예컨대 λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149가 또한 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있고, pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (Clontech)를 예로 들 수 있다. 일부 구체예에서, 동물 발현 벡터로는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo (Clontech)가 있다. 일부 구체예에서, 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 사용된다.
일부 구체예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 벡터는 필요에 따라 조절 서열, 예컨대 벡터가 그 안으로 도입되는 숙주 (예컨대 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물) 유형에 특이적이고, 벡터가 DNA- 또는 RNA-기반인지의 여부가 고려되어 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 벡터는 TCR 또는 항원-결합 부분 (또는 다른 MHC-펩타이드 결합 분자)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 쥐과 줄기 세포 바이러스의 긴 말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 숙련된 당업자에게 알려져 있는 다른 프로모터 또한 고려된다.
일부 구체예에서, TCR을 암호화하는 벡터를 생성하기 위하여, α 및 β 사슬이 관심 있는 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 분리된 총 cDNA로부터 PCR 증폭되고 발현 벡터로 클로닝된다. 일부 구체예에서, α 및 β 사슬은 동일한 벡터로 클로닝된다. 일부 구체예에서, α 및 β 사슬은 상이한 벡터로 클로닝된다. 일부 구체예에서, 생성된 α 및 β 사슬은 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스, 벡터에 통합된다.
다중-표적화
일부 구체예에서, 유전자 변형은 세포 상에서, 각각이 동일하거나 상이한 항원을 인식하고, 일부 구체예에서, 각각 상이한 세포내 신호전달 구성요소를 포함하는, 둘 이상의 유전자 조작된 수용체를 발현하도록 세포를 유전자상에서 변형시키는 것을 포함한다. 이러한 다중 표적화 전략은, 예를 들어, PCT 특허 출원 공개 번호: WO 2014/055668 A1 및 Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013)에서 기술된다.
예를 들어, 일부 구체예에서, 세포는 일반적으로 제1 수용체에 의해 인식된 항원, 예컨대 제1 항원에 특이적으로 결합할 때 세포에 대한 활성화 신호를 유도할 수 있는 제1 유전자 조작된 항원 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR)를 발현하는 수용체를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 일반적으로 제2 수용체에 의해 인식된 제2 항원에 특이적으로 결합할 때 면역 세포에 대한 동시자극 신호를 유도할 수 있는, 제2 유전자 조작된 항원 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR), 예컨대, 키메릭 동시자극 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다. 일부 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다.
일부 구체예에서, the 제1 및/또는 제2 유전자 조작된 항원 수용체 (예컨대 CAR 또는 TCR)는 세포에 대한 활성화 신호를 유도할 수 있다. 일부 구체예에서, 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포내 신호전달 구성요소를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 수용체에 의해 유도된 활성화는 신호 변환 또는 면역 반응의 개시를 초래하는 세포의 단백질 발현의 변화, 예컨대 ITAM 포스포릴화 및/또는 ITAM-매개된 신호 변환 캐스케이드의 개시, 면역학적 시냅스의 형성 및/또는 결합된 수용체 (예컨대 CD4 또는 CD8, 등) 가까이에서 분자의 클러스터링, 하나 이상의 전사 인자, 예컨대 F-κB 및/또는 AP-1의 활성화, 및/또는 사이토카인과 같은 인자의 유전자 발현의 유도, 증식, 및/또는 생존을 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 수용체는 CD28, CD137 (4-1 BB), OX40, 및/또는 ICOS와 같은 동시자극 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 제2 수용체는 상이한 동시자극 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 수용체는 CD28 동시자극 신호전달 영역을 함유하고 제2 수용체는 4-1BB 동시자극 신호전달 영역을 함유하거나 또는 그 역이다.
일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포내 신호전달 도메인 및 동시자극 수용체의 세포내 신호전달 도메인 둘 다를 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포내 신호전달 도메인을 함유하고 제2 수용체는 동시자극 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 동일한 세포에서 유도된 활성화 신호와 조합된 동시자극 신호는 면역 반응, 예컨대 왕성하고 지속적인 면역 반응, 예컨대 증가된 유전자 발현, 사이토카인 및 다른 인자의 분비, 및 세포 사멸과 같은 T 세포 매개된 이펙터 기능을 초래하는 신호이다.
일부 구체예에서, 제1 수용체 단독의 결찰이나 제2 수용체 단독의 결찰은 어느 것도 왕성한 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 측면으로, 만약 하나의 수용체만이 결찰된다면, 세포는 항원에 대해 내성이 되거나 반응하지 않게 되거나, 또는 억제되고, 및/또는 인자를 증식 또는 분비하거나 이펙터 기능을 수행하도록 유도되지 않는다. 그러나, 일부 이러한 구체예에서, 다수의 수용체가 결찰될 때, 예컨대 제1 및 제2 항원을 발현하는 세포를 만나게 될 때, 예컨대 하나 이상의 사이토카인의 분비, 증식, 지속, 및/또는 표적 세포의 세포독성 사멸과 같은 면역 이펙터 기능의 수행에 의해 나타나는 바와 같이, 원하는 반응, 예컨대 전체 면역 활성화 또는 자극이 이루어진다.
일부 구체예에서, 두 수용체는 각각, 세포에 대해 활성화 및 억제 신호를 유도하여서, 한 수용체에 의한 그것의 항원에의 결합이 세포를 활성화하거나 반응을 유도하지만, 제2 억제 수용체에 의한 그것의 항원에의 결합은 그 반응을 억압하거나 약화시키는 신호를 유도한다. 실례는 활성화 CAR과 억제성 CAR 또는 iCAR의 조합이다. 이러한 전략이 사용될 수 있는데, 예를 들어, 이 전략에서는 활성화 CAR은 질환 또는 질병에서 발현되지만 정상 세포에서도 또한 발현되는 항원에 결합하고, 억제 수용체는 정상 세포에서 발현되지만 질환 또는 질병의 세포에서는 발현되지 않는 별도의 항원에 결합하게 된다.
일부 구체예에서, 다중-표적화 전략은 일시적으로나 (예컨대, 유전자 조작과 결부된 자극시) 또는 영구적으로, 특정 질환 또는 질병과 관련된 항원이 비-질환 세포에서 발현되거나 및/또는 조작된 세포 자체에서 발현되는 경우에 사용된다. 이러한 경우에, 두 개의 별도의 및 개별적으로 특이적인 항원 수용체의 결팔을 필요로 함으로써, 특이성, 선택성, 및/또는 효능이 개선될 수 있다.
일부 구체예에서, 다수의 항원, 예컨대, 제1 및 제2 항원이 세포, 조직, 또는 치료되는 질환 또는 질병, 예컨대 암세포에서 발현된다. 일부 측면으로, 세포, 조직, 또는 치료되는 질환 또는 질병은 다발성 골수종 또는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구체예에서, 다수의 항원 중 하나 이상은 일반적으로 또한 세포 치료법으로 표적화되길ㄹ 바라지 않는 세포, 예컨대 정상 또는 비-질환 세포 또는 조직, 및/도는 유전자 조작된 세포 자체에서 발현된다. 이러한 구체예에서, 다중 수용체의 결찰을 필요로 함으로써 세포의 반응, 특이성 및/또는 효능이 이루어진다.
일부 구체예에서, 세포 변형은 수집 후 및 극저온으로 냉동 및/또는 보관되기 전에 세포 분석을 기반으로 수행된다. 세포는, 분석을 기반으로, 극저온 보관 전 및/또는 후에 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 변형은 극저온 보관 후 해동 후에 세포 분석을 기반으로 수행된다. 일부 구체예에서, 분석은 CD8+ 세포에 대한 CD4+ 세포의 비율을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 극저온 보관 후 변형에 대한 조건, 예컨대 세포를 인큐베이션하기 위한 시간, 세포를 인큐베이션하기 위한 온도, 세포 자극제의 사용 및 농도, 및 세포를 유전자 변형시키기 위한 단계는 분석을 토대로 선택되거나 또는 CD8+ 세포에 대한 CD4+ 세포의 비율을 토대로 선택될 수 있다.
세포를 조작하기 위한 벡터
재조합 수용체 및/또는 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (핵산 분자)는 이러한 수용체를 발현하기 위하여 세포를 유전자 조작하기 위한 벡터에 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 벡터 또는 구성물은, 그것의 발현을 구동시키기 위하여 폴리펩타이드 또는 수용체를 암호화하는 뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 함유한다. 일부 구체예에서, 프로모터는 하나 또는 하나 이상의 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된다. 일부 경우에, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 벡터는 배양된 세포를 함유하는 조성물에, 예컨대 레트로바이러스 형질도입, 트랜스펙션, 또는 형질전환에 의해 도입된다.
유전자 조작된 구성요소, 예컨대, 재조합 수용체, 예컨대, CAR 또는 TCR의 도입을 위한 다양한 방법이 잘 알려져 있고 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시의 방법은 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 비-바이러스 벡터 또는 트랜스포존, 예컨대 잠자는 미녀 트랜스포존 시스템 (Sleeping Beauty transposon system)을 통하는 것을 포함한, 폴리펩타이드 또는 수용체를 암호화하는 핵산의 전달 방법을 포함한다. 유전자 전달 방법은 세포로의 유전자 전달을 초래하는 형질 도입, 전기천공 또는 다른 방법을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 유전자 전달은 제1 자극 세포에 의해, 예컨대 그것을, 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정되는 바, 증식, 생존, 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 조합한 후, 활성화된 세포의 형질 도입, 및 배양 중에 임상 적용에 충분한 수로의 팽창에 의해 이루어진다.
일부 맥락에서, 대상체에서 잠재적으로 원하지 않는 결과 또는 저효능을 초래할 수 있을 자극성 인자 (예를 들어, 림포카인 또는 사이토카인), 예컨대 대상체에서 독성과 관련된 인자의 과다발현 가능성에 대해 보호하는 것이 바람직할 수 있다. 그러므로, 일부 맥락에서, 조작된 세포는, 예컨대 입양 면역요법에서 투여시 세포가 생체내에서 음성 선택에 대해 민감하게 되는 것을 유발하는 유전자 분절을 포함한다. 예를 들어 일부 측면으로, 세포는 그것들이 투여되는 환자의 생체 내 상태에서의 변화의 결과로서 그것들이 제거될 수 있도록 조작된다. 음성 선택 가능한 표현형은 투여된 작용제, 예를 들어, 화합물에 대한 민감성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 유발될 수 있다. 음성 선택 가능한 유전자는 간시클로비어 (ganciclovir) 민감성을 부여하는 헤르페스 단순 바이러스 유형 I 티미딘 키나아제 (HSV-I TK) 유전자 (Wigler et al., Cell II :223, I977), 세포의 하이포크산틴 포스포리보실트랜스페라제 (HPRT) 유전자, 세포의 아데닌 포스포리보실트랜스페라제 (APRT) 유전자, 박테리아 시토신 탈아민효소 (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)), 등을 포함한다.
일부 구체예에서, 재조합 핵산이 재조합 감염성 바이러스 입자, 예컨대 유인원 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 등으로부터 유래된 벡터를 사용하여 세포로 전달된다. 일부 구체예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포로 전달된다 (예컨대, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 참조).
일부 구체예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복부 서열 (LTR)을 가지며, 예컨대, 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (MoMLV), 골수증식성 육종 바이러스 (MPSV), 쥐과 배아 줄기 세포 바이러스 (MESV), 쥐과 줄기 세포 바이러스 (MSCV), 비장 병소 형성 바이러스 (SFFV), 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터가 있다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 쥐과 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유래된 것들을 포함한다. 레트로바이러스는 전형적으로 암포트로픽(amphotropic)이며, 이것은 바이러스가 인간을 포함한, 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있다는 것을 의미한다. 한 구체예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 gag, pol, 및/또는 env 서열을 대체한다. 많은 예시적인 레트로바이러스 시스템이 기술되어 있다 (예컨대, 미국 특허 제 5,219,740호; 6,207,453호; 5,219,740호; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109).
렌티바이러스 형질 도입 방법이 알려져 있다. 예시의 방법은, 예컨대, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505에서 기술된다.
일부 구체예에서, 재조합 핵산은 전기천공을 통해 T 세포로 전달된다 (예컨대, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437 참조). 일부 구체예에서, 재조합 핵산은 전위를 통해 T 세포로 전달된다 (예컨대, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126 참조). 유전자 물질을 면역 세포에 도입하고 발현시키는 다른 방법으로는 인산 칼슘 트랜스펙션 (예컨대 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에서 기술된 바와 같음), 원형질 융합, 양이온 리포좀-매개 트랜스펙션; 텅스텐 입자-촉진 미세입자 충격 (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 인산 스트론튬 DNA 동시 침전 (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다. 일부 측면으로, 세척 단계는 원심분리 챔버, 예를 들어 A-200/F 및 A-200 원심분리 챔버를 포함하는, Sepax® 및 Sepax® 2 시스템과 함께 사용하기 위한 것들을 포함한, Biosafe SA에 의해 제조되고 판매되는 챔버에서 제조사의 설명에 따라 수행된다.
재조합 생성물을 암호화하는 핵산의 전달을 위한 다른 접근법 및 벡터는 예컨대, 본원에 참조로 포함된, PCT 특허 출원 공개 번호: WO/2014055668, 및 미국 특허 제 7,446,190호에서 기술된 것들이다.
일부 구체예에서, 세포, 예컨대, T 세포는 팽창 중에 또는 후에, 예컨대 T 세포 수용체 (TCR), 또는 키메릭 항원 수용체 (CAR)로 트랜스펙션될 수 있다. 원하는 폴리펩타이드 또는 수용체의 유전자의 도입을 위한 트랜스펙션은 예를 들어, 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 그런 다음 유전자 변형된 세포 집단이 초기 자극 (예를 들어 CD3/CD28 자극)으로부터 이탈되고 계속해서 제2 유형의 자극 (예컨대 드노보 도입된 수용체를 통한 자극)으로 자극될 수 있다. 이 제2 유형의 자극은 펩타이드/MHC 분자 형태의 항원성 자극, 유전자 도입된 수용체의 동족 (가교 결합) 리간드 (예컨대 CAR의 천연 리간드) 또는 새로운 수용체의 프레임워크 내에서 밴드에 결합하는 (예컨대 수용체 내의 불변 영역을 인식함으로써) 임의의 리간드 (예컨대 항체)를 포함할 수 있다. 예를 들어, Cheadle et al, "Chimeric antigen recetoes for T-Cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 또는 Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014) 참조.
추가적인 핵산, 예컨대 도입을 위한 유전자 중에는 예컨대 다음이 있다: 예컨대 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진함으로써 치료법의 효능을 개선하기 위한 유전자; 세포의 선택 및/또는 평가를 위한, 예컨대 생체내 생존 또는 국지화를 평가하기 위한 유전자 마커를 제공하기 위한 유전자; 및 예를 들어, 문헌에 기술된 것과 같이 세포를 생체내에서 음성 선택에 민감하게 만듦으로써 안전성을 개선하기 위한 유전자: Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); 또한 우세한 양성 선택 가능한 마커를 음성 선택 가능한 마커와 융합시킴으로써 유래된 이중기능성 선택 가능한 융합 유전자의 사용을 기술하고 있는, Lupton 등에 의한 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601의 공개공보 참조. 예컨대, Riddell et al., 미국 특허 제 6,040,177호의 제14열 내지 17열 참조.
일부 구체예에서, 세포는 유전자 조작 전에 또는 유전자 조작과 함께 인큐베이션되거나 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 컬티베이션, 자극, 활성화, 및/또는 증식을 포함할 수 있다. 인큐베이션 및/또는 조작은 배양 용기, 예컨대 유닛, 챔버, 웰, 칼럼, 튜브, 튜빙 세트, 밸브, 바이알, 배양 접시, 주머니, 또는 세포를 배양 또는 컬티베이션하기 위한 다른 용기에서 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제 하에서 인큐베이션된다. 이러한 조건으로는 집단에서 세포의 증식, 팽창, 활성화, 및/또는 생존을 유도하기 위해, 항원 노출을 모방하기 위해, 및/또는 세포를 유전자 조작을 위해, 예컨대 재조합 항원 수용체의 도입을 위해 준비시키기 위하여 설계된 조건을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 인큐베이션 단계는 흔들리는 생체반응기, 예컨대 WAVETM Bioreactor (GE Healthcare) 또는 BIOSTAT® RM (Sartorius)을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 인큐베이션 단계는 고정 생체반응기 또는 인큐베이션 챔버를 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 만약 하나 이상의 인큐베이션 단계에 대해 흔들리는 생체반응기를 사용하면 항-전단제, 예를 들어 폴록사머가 조성물에 첨가될 수 있다.
조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예컨대 영양소, 아미노산, 항생물질, 이온, 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포를 활성화시키기 위해 고안된 임의의 다른 작용제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 측면으로, 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 인큐베이션되고 일부 구체예에서, 예를 들어 참조로 포함되는 PCT 특허 출원 공개 번호 WO　2015/157384에서 기술된 바와 같이, 사이토카인 칵테일이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 형질 도입 전에, 동시에, 또는 후속해서 하나 이상의 사이토카인 및/또는 사이토카인 칵테일과 함께 인큐베이션된다.
일부 구체예에서, 자극 조건 또는 자극제는 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 작용제, 예컨대, 리간드를 포함한다. 일부 측면으로, 작용제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 캐스케이드를 켜거나(turn on) 시작한다. 이러한 작용제는 항생물질, 예컨대 TCR 구성요소에 특이적인 것들, 예컨대 항-CD3을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 자극 조건은 동시자극 수용체, 예컨대, 항-CD28을 자극할 수 있는 하나 이상의 작용제, 예컨대 리간드를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 작용제 및/또는 리간드는 비드와 같은 고체 지지체, 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합될 수 있다. 선택적으로, 팽창 방법은 추가로 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체를 배양 배지에 (예컨대, 적어도 약 0.5 ng/ml의 농도에서) 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 자극제는 IL-2, 및/또는 IL-15, 예를 들어, 적어도 약 10 단위/mL의 IL-2 농도를 포함한다.
일부 측면으로, 인큐베이션은 Riddell 등의 미국 특허 제 6,040,1 77호, Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701에 기술된 것과 같은 기법에 따라 수행된다. 일부 측면으로, 형질 도입은, 그 내용이 전체적으로 참조로 포함되는 PCT 특허 출원 공개 번호 WO　2016/073602 또는 US 2016/0122782에서 기술되는 것과 같은 시스템, 장치, 기기, 및/또는 방법을 사용하여 수행된다. 일부 구체예에서, 형질 도입은 그 내용이 전체적으로 참조로 포함되는 PCT 특허 출원 공개 번호 WO 2015/164675에서 기술된 방법에 따라 수행된다.
일부 구체예에서, T 세포는 배양-개시 조성물 공급기 세포, 예컨대 비분할 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 첨가하고, (예컨대 그로써 초기 집단의 각 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20, 또는 40개 또는 그 이상의 PBMC 공급기 세포를 함유한 결과적으로 얻어진 세포 집단이 팽창될 수 있도록); 배양을 (예컨대 T 세포의 수를 팽창시키기에 충분한 시간 동안) 인큐베이션함으로써 팽창된다. 일부 측면으로, 비분할 공급기 세포는 감마선-조사된 PBMC 공급기 세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, PBMC는 세포 분할을 방지하기 위하여 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 측면으로, 공급기 세포는 T 세포 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 구체예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어, 적어도 약 25℃, 일반적으로 적어도 약 30℃, 및 일반적으로 약 37℃ 이상의 온도를 포함한다. 선택적으로, 인큐베이션은 추가로 공급기 세포로서 비분한 EBV-형질전환된 림프모세포양 세포 (LCL)를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rad의 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. LCL 공급기 세포 일부 측면으로 임의의 적합한 양으로, 예컨대 적어도 약 10:1의 LCL 공급기 세포 대 초기 T 림프구의 비율로 제공되다.
샘플의 가공 방법
일부 구체예에서, 방법은 (a) 도너로부터의 성분채집 샘플을 냉각된 환경에서 보관 시설로 배송하는 단계; 및 (b) 보관 시설에서 성분채집 샘플을 극저온으로 보관하는 단계를 포함하는, 성분채집 샘플을 가공하는 방법을 포함한다. 방법은 추가로, 특정 구체예에 따라, (a) 각각이 동일하거나 상이한 도너로부터 취해지고, 동일한 시간 또는 상이한 시간에 배송된 다수의 성분채집 샘플을 냉각된 환경에서 보관 시설로 배송하는 단계; 및 (b) 보관 시설에서 성분채집 샘플의 각각을 극저온으로 보관하는 단계를 포함하는, 다수의 성분채집 샘플을 가공하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 성분채집 샘플은 상기 기술된 구체예에 따라 도너로부터 혈액 수집된다.
일부 구체예에서, 냉각된 배송 환경의 온도는 -80℃ 이상 내지 0℃이다. 일부 구체예에서, 냉각된 배송 환경의 온도는 -80℃ 이상 내지 -20℃이다. 일부 구체예에서, 냉각된 배송 환경의 온도는 -20℃ 이상 내지 0℃이다.
일부 구체예에서, 시설에서는 도너의 성분채집 샘플이 수집되고 보관 시설은 서로 연계되어 있지만, 이것은 모든 구체예에서 필요한 것은 아니다. 일부 구체예에서, 시설은 도너에 의해 또는 수집 시설에서 수집된 성분채집 샘플을 가지며 보관 시설에서 보관된 성분채집 샘플을 가지는 것으로 선택된 또 다른 실체에 의하여 서로 연계된다. 일부 구체예에서, 수집 시설 및 보관 시설은 동일한 물리적 위치를 공유할 수 있다. 일부 구체예에서, 수집 시설 및 보관 시설은 상이한 위치, 예컨대 상이한 나라 또는 상이한 주(state)에 위치할 수 있다.
일부 구체예에서, 보관 시설은 중심 또는 공통 저장소 보관 시설로, 그곳에서 상이한 수집 시설에서 얻어진 다양한 환자의 성분채집 샘플이 보관된다. 일부 구체예에서, 중심 또는 공통 저장소 보관 시설은 이들 샘플을 하나 이상의 제조 시설로 보내기 전에 성분채집 샘플을 극저온으로 보관할 것이다. 일부 구체예에서 중심 또는 공통 저장소 시설 및 제조 시설은 서로 연계된다. 일부 구체예에서 중심 또는 공통 저장소 시설 및 제조 시설은 서로 연계되지 않는다. 일부 구체예에서, 도너로부터의 모든 샘플은 중심 또는 공통 저장소 시설로부터 제조 시설로 보내진다. 다른 구체예에서, 도너로부터의 일부 샘플은 제조 시설로 보내지고, 다른 샘플은 중심 또는 공통 저장소 시설에서 유지된다. 일부 구체예에서, 도너로부터의 모든 샘플은 중심 또는 공통 저장소 시설로부터 동일한 제조 시설로 보내진다. 다른 구체예에서, 도너로부터의 일부 샘플은 중심 또는 공통 저장소 시설로부터 한 제조 시설로 보내지고, 도너로부터의 다른 샘플은 또 다른 제조 시설로 보내진다.
일부 구체예에서, 세포 유형 또는 유형들은 배송 전에 풍부화되거나 및/또는 성분채집 샘플로부터 분리된다. 다른 경우에, 세포는 배송 후에 풍부화되거나 및/또는 성분채집 샘플로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 세포는 상기 기술된 구체예에 따라 풍부화되거나 및/또는 분리될 수 있다.
일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 풍부화된 및/또는 분리된 세포는 배송되기 전에 분석된다. 일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 풍부화된 및/또는 분리된 세포는 배송된 후에 및 극저온으로 보관되기 전에 분석된다. 성분채집 샘플 또는 풍부화된 및/또는 분리된 세포는 상기 기술된 구체예에 따라 분석될 수 있다.
일부 구체예에서, 성분채집의 부분 또는 부분들, 또는 풍부화된 및/또는 분리된 세포 집단, 또는 조작된 T 세포 집단 또는 조성물은 성분채집, 또는 풍부화된 및/또는 분리된 세포 집단, 또는 조작된 T 세포 집단 또는 조성물의 극저온 냉동 전에 제거된다. 일부 구체예에서 제거된 부분 또는 부분들은, 예를 들어, 성분채집, 또는 풍부화된 및/또는 분리된 세포 집단, 또는 조작된 T 세포 집단 또는 조성물의 극저온 냉동 전 또는 후를 포함하는, 임의의 시점에 분석된다.
일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 세포는 배송 전에 냉동 용액과 조합된다. 일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 세포는 배송된 후에 및 극저온으로 보관되기 전에 냉동 용액과 조합된다. 냉동 용액은 상기 기술된 구체예에서의 냉동 용액과 동일할 수 있다.
일부 구체예에서, 성분채집 샘플은 극저온으로 냉동되기 위하여 냉동 용액과 조합되기 전 또는 후에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개 이상의 개별 용기로 나누어진다. 일부 구체예에서, 성분채집 샘플은 배송되기 전에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개 이상의 개별 용기로 나누어진다. 일부 구체예에서, 성분채집 샘플은 배송된 후에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개 이상의 개별 용기로 나누어진다. 일부 구체예에서 나누어진 성분채집을 운반하는 임의의 수의 개별 용기는 배송되기 전 또는 후에 극저온으로 냉동된다.
일부 구체예에서, 성분채집 샘플은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개 이상의 개별 용기로 나누어지고, 그것들은 보관 시설에서 극저온으로 보관된다. 일부 구체예에서 보관 시설은 중심 또는 공통 저장소 보관 시설이다. 일부 구체예에서 보관 시설은 나누어진 성분채집을 운반하는 임의의 수의 개별 용기를 하나 이상 의 제조 시설로 보낸다.
일부 구체예에서, 성분채집 샘플이 극저온으로 보관되는 곳인 하나 이상의 용기는 극저온 보관으로부터 제거되는 한편, 나머지 용기는 극저온 보관이 유지된다. 일부 구체예에서, 극저온 보관으로부터 제거된 하나 이상의 용기의 세포는 해동된다. 일부 구체예에서, 해동된 세포는 조작된다. 일부 구체예에서, 해동된 세포는 CAR 분자를 발현하도록 조작된다. 일부 구체예에서, 성분채집 샘플이 극저온으로 보관되어 있는 하나 이상의 후속 용기는 극저온 보관으로부터 제거되는 한편 나머지 용기는 극저온 보관으로 유지된다. 일부 구체예에서, 극저온 보관으로부터 제거된 하나 이상의 후속 용기의 세포는 해동된다. 일부 구체예에서, 해동된 세포는 조작된다. 일부 구체예에서, 해동된 세포는 이전에 해동된 세포와 유사하거나 상이한 CAR 분자를 발현하는 세포를 생성하도록 조작된다. 일부 구체예에서 성분채집 샘플이 극저온으로 보관되고 있는 용기는 상이한 시간 동안 극저온 보관 상태로 유지된다.
일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 세포는 상기 기술된 구체예에 따르는 방식으로 냉각될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포의 냉각 전에, 세포는 상기 기술된 구체예에 따르는 방식으로 세척될 수 있다.
일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 세포는 배송되기 전에 -210℃ 내지 -80℃의 온도로 극저온으로 냉동된다. 일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 세포는 배송된 후에 극저온으로 냉동된다. 성분채집 샘플 또는 세포는 상기 기술된 구체예에 따르는 방식으로 극저온으로 냉동될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포의 극저온 냉동 전에, 세포는 상기 기술된 구체예에 따르는 방식으로 해동된다.
일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 세포는 -210℃ 내지 -80℃의 온도에서 극저온으로 보관된다. 예를 들어, 성분채집 샘플 또는 세포는 상기 기술된 구체예에 따르는 방식으로, 예컨대 액체 질소 탱크의 증기상에서, 예컨대 1일 내지 12년의 보관 기간 동안 극저온으로 보관될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 12시간, 24시간, 36시간, 또는 48시간 또는 그 이상의 시간 동안 보관, 또는 예치된다. 일부 구체예에서, 세포는 1주, 2주, 3주, 또는 4주 또는 그 이상의 기간 동안 보관, 또는 예치된다. 일부 구체예에서, 세포는 장기간 보관 또는 장기간 예치에 놓인다. 일부 측면으로, 세포는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 40년, 또는 그 이상의 기간 동안 보관된다.
일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 세포는 -210℃ 내지 -80℃의 온도에서 극저온으로 보관된다. 일부 구체예에서, 세포가 보관되는 온도는 약 -100℃, 또는 -95℃, 또는 -90℃, 또는 -85℃, 또는 -80℃, 또는 -75℃, 또는 -70℃, 또는 -65℃, 또는 -60℃를 초과하지 않는다.
일부 구체예에서, 보관 기간 후에, 성분채집 샘플 또는 세포는 해동된다. 예를 들어, 성분채집 샘플 또는 세포는 상기 기술된 구체예에 따르는 방식으로 해동될 수 있다. 또한, 특정 구체예에 따르며, 보관 기관 후에 생존 세포의 백분율은 24% 내지 100%이다. 생존성 세포의 백분율은, 예를 들어, 상기 기술된 구체예에 따라 측정될 수 있다.
일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 풍부화된 세포는 수집 후에 및 배송 전에 분석된다. 일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 풍부화된 세포는 배송 후에 및 극저온 보관 전에 분석된다. 일부 구체예에서, 성분채집 샘플 또는 풍부화된 세포는 보관 기간 후에 분석된다. 일부 구체예에서, 분석 후에, 성분채집 샘플 또는 세포는 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 변형은 배송 전에 일어난다. 일부 구체예에서, 변형은 배송 후에 및 극저온으로 보관되기 전에 일어난다. 일부 구체예에서, 변형은 극저온으로 보관된 후에 일어난다. 이러한 구체예에서, 변형은 "극저온-후 변형"으로 명명된다. 성분채집 샘플 또는 세포의 분석 및/또는 변형은 상기 기술된 구체예에 따라 수행될 수 있다.
조성물 및 제제
또한 주어진 용량 또는 이것의 분획으로 투여하기 위한, 제약학적 조성물 및 제제를 포함하는, 세포를 포함하는 조성물, 예컨대 일정 수의 세포를 포함하는 단위 용량 형태 조성물이 제공된다. 제약학적 조성물 및 제제는 일반적으로 하나 이상의 선택적인 제약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
용어 "제약학적 제제"는 그 안의 언어진 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이 되는 것을 허용하기 위한 형태로 있고, 그 제제가 투여될 대상체에게 수용할 수 없을 정도로 독성인 추가적인 구성요소를 함유하지 않는 조제물을 나타낸다.
"제약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외의, 대상체에 무독성인, 제약학적 제제 중의 성분을 나타낸다. 제약학적으로 허용되는 담체로는, 한정하는 것은 아니지만, 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 들 수 있다.
일부 측면으로, 담체의 선택은 부분적으로 특정 세포에 의해 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 적합한 제제는 다양하게 있다. 예를 들어, 제약학적 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제로는, 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산 나트륨, 및 염화 벤즈알코늄을 들 수 있다. 일부 측면으로, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이것들의 혼합물은 전형적으로 총 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 기술된다. 제약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수령체에게 무독성이며, 한정하는 것은 아니지만, 다음을 포함한다: 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물, 이를테면 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).
완충제는 일부 측면으로 조성물에 포함된다. 적합한 완충제로는, 예를 들어, 시트르산, 시트르산 나트륨, 인산, 인산 칼륨, 및 다양한 다른 산 및 염을 들 수 있다. 일부 측면으로, 둘 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이것의 혼합물은 전형적으로 총 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 제약학적 조성물의 제조 방법은 알려져 있다. 예시의 방법은, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)에서 보다 상세하게 기술된다.
제제는 수용액을 포함할 수 있다. 제제 또는 조성물은 또한 세포로 치료되는 특정 적응증, 질환, 또는 상태에 유용한 한 가지 이상의 활성 성분, 바람직하게는 세포를 보환하는 활성을 가진 것들을 함유할 수 있으며, 이 경우 각각의 활성은 서로에게 불리한 영향을 주지 않는다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 적합하게 존재한다. 그러므로, 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 추가로 다른 제약학적으로 활성인 작용제 또는 약물, 예컨대 화학요법제, 예컨대 아스파라기나제, 부술판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 및/또는 빈크리스틴을 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 질환 또는 상태의 부담을 감소시키기에 효과적인 양으로, 및/또는 대상체에서 CRS 또는 중증의 CRS를 초래하지 않는 양으로 및/또는 본원에 기술된 방법의 임의의 다른 결과를 이루기에 효과적인 양으로 세포를 포함한다.
일부 구체예에서 제약학적 조성물은 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양, 예컨대 치료적으로 효과적인 또는 예방적으로 효과적인 양으로 세포를 함유한다. 일부 구체예에서 치료적 또는 예방적 효능은 치료된 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 원하는 투여량은 세포의 단일 볼루스 투여에 의해, 세포의 다중 볼루스 투여에 의해, 또는 세포의 연속적인 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
세포 및 조성물은 표준 투여 기법, 제제, 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 세포의 투여는 자가 조직이거나 이종성일 수 있다. 예를 들어, 면역반응성 세포 또는 선조 세포가 한 대상체로부터 얻어지고, 동일한 대상체 또는 상이한, 비슷한 대상체에게 투여될 수 있다. 말초혈 유도 면역반응성 세포 또는 이것들의 선조 세포 (예컨대, 생체내에서, 생체외에서 또는 시험관내 유도됨)는 국소 주사, 이를테면 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사, 또는 비경구 투여를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물 (예컨대, 유전자 변형된 면역반응성 세포를 함유한 제약학적 조성물)이 투여될 때, 일반적으로 그것은 단위 투여 주사가능 형태 (용액, 현탁액, 에멀션)로 제제화될 것이다.
제제는 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 볼, 혀밑, 또는 좌제 투여를 위한 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 집단이 비경구로 투여된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 정맥내, 복강내, 또는 피하 주사에 의한 말초 시스템 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다.
조성물은 일부 구체예에서 멸균된 액체 제제, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀션, 분산액, 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이것들은 일부 측면으로 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 조제물은 정상적으로 겔, 다른 점성 조성물, 및 고체 조성물보다 제조하기가 더 쉽다. 추가적으로, 액체 조성물은, 특히 주사에 의해 투여하는 것이 다소 더 편리하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특정 조직과 더 긴 접촉 기간을 제공하기 위하여 적절한 점도 범위 내에서 제제화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유한 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균된 주사 가능한 용액은 세포를 용매에, 예컨대 적합한 담체, 희석제, 또는 멸균수, 생리 식염수, 글루코오스, 덱스트로오스, 등과 같은 부형제와 혼합 상태로 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 조제물에 따라 습윤제, 분산제, 또는 유화제 (예컨대, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 풍미제, 및/또는 착색제와 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 일부 측면으로 적합한 조제물을 제조하기 위해 표준 텍스트가 참고될 수 있다.
조성물의 안정성 및 멸균성을 증강시키는 다양한 첨가제, 이를테면 항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 완충제가 첨가될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 및 소르브산에 의해 확실하게 될 수 있다. 주사 가능한 제약학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴의 사용에 의해 유발될 수 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균성은, 예컨대, 멸균된 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 이루어질 수 있다.
일부 구체예에서, 치료용 T 세포 조성물은 ml당 약 10x106개 세포 내지 ml당 약 70x106개 세포 또는 mL당 약 10x106개 생존 세포 내지 mL당 약 70x106개 생존 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 치료용 T 세포 조성물은 ml당 약 15x106개 세포 또는 생존 세포 내지 ml당 약 60x106개 세포 또는 생존 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포 조성물은 ml당 10x106개 이상의 세포 또는 생존 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 치료용 T 세포 조성물은 ml당 15x106개 이상의 세포를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원은 치료용 T 세포 조성물을 포함하는 용기를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 일부 구체예에서, 물품은 용기가 표적 수의 치료용 T 세포 조성물 단위를 함유하는 것을 나타내는 정보를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 물품은 다중 용기를 포함하며, 이때 각 용기는 표적 수의 치료용 T 세포 조성물 단위를 포함하는 단위 용량을 포함한다. 일부 구체예에서, 용기는 mL당 약 10x106개 세포 또는 생존 세포 내지 mL당 약 70x106개 세포 또는 생존 세포, mL당 약 15x106개 세포 또는 생존 세포 내지 mL당 약 60x106개 세포 또는 생존 세포, mL당 10x106개 이상의 세포 또는 생존 세포, mL당 15x106개 이상의 세포 또는 생존 세포, 또는 이것들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 동결보호제를 추가로 포함하고 및/또는 물품은 대상체에게 투여되기 전에 조성물을 해동하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 세포는, 예컨대, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에 냉동 용액에 현탁된다. 일부 측면으로 다양한 공지의 냉동 용액 및 변수들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 한 실례는 20% DMSO 및 8% HSA를 함유한 PBS, 또는 다른 적합한 세포 냉동 배지를 포함한다. 그런 후 이것은 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%가 되도록 배지로 1:1로 희석된다.
일부 측면으로 다양한 공지의 냉동 용액 및 변수들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 샘플은 극저온 보존 또는 유리화 배지 또는 동결보호제를 함유한 용액을 함유할 수 있다. 적합한 동결보호제로는, 한정하는 것은 아니지만, DMSO, 글리세롤, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로탄다이올, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 1,2-프로판다이올 (PROH) 또는 이것들의 혼합물을 들 수 있다. 일부 실례에서, 극저온 보존 용액은, 한정하는 것은 아니지만, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시에틸 전분, 다당, 단당, 알긴산염, 트레할로오스, 라피노오스, 덱스트란, 인간 혈청 알부민, 피콜, 리포단백질, 폴리비닐 피롤리돈, 하이드록시에틸 전분, 자가 혈장 또는 이것들의 혼합물을 포함하는, 하나 이상의 비-세포 침투 냉동보존제를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 부피로 약 1% 내지 20%, 약 3% 내지 9%, 또는 약 6% 내지 약 9%의 최종 농도의 동결보호제가 포함된 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 냉동 용액 중의 동결보호제의 최종 농도는 부피로 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5%, 또는 약 10%이다.
일부 구체예에서, 동결보호제는 DMSO이다. 특정 구체예에서, 세포는 부피로 약 1% 내지 20%, 약 3% 내지 9%, 또는 약 6% 내지 약 9%의 최종 농도의 DMSO가 포함된 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 냉동 용액 중의 DMSO의 최종 농도는 부피로 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5%, 또는 약 10%이다.
특정 구체예에서, 세포는 약 1x106개 세포/ml 내지 약 1x108개 세포/mL, 약 1x106개 세포/mL 내지 약 2x107개 세포/mL, 약 1x107개 세포/mL 내지 약 5 x107개 세포/mL, 또는 약 1x107개 세포/mL 내지 5x107개 세포/mL의 밀도로 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 약 1x106개 세포/mL, 약 2x106개 세포/mL, 약 5x106개 세포/mL, 약 1x107개 세포/mL, 약 1.5x107개 세포/mL, 약 2x107개 세포/mL, 약 2.5x107개 세포/mL, 약 2.5x107개 세포/mL, 약 2.5x107개 세포/mL, 약 3x107개 세포/mL, 약 3.5x107개 세포/mL, 약 4x107개 세포/mL, 약 4.5x107개 세포/mL, 또는 약 5x107개 세포/mL의 밀도로 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 약 1.5x107개 세포/mL 내지 약 6x107개 세포/mL의 밀도로 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 약 5x106개 세포/mL 내지 약 150x106개 세포/mL의 밀도로 냉동 용액체 첨가된다. 특정 구체예에서, 세포는 적어도 약 1x107개 세포/mL의 밀도로 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 적어도 약 1.5x107개 세포/mL의 밀도로 냉동 용액에 현탁된다. 일부 구체예에서, 세포는 생존 세포이다.
특정 구체예에서, 세포는 0.1x106개 세포/mL 내지 5,000x106개 세포/mL 또는 약 0.1x106개 세포/mL 내지 약 5,000x106개 세포/mL, 1x106개 세포/mL 내지 500x106개 세포/mL 또는 약 1x106개 세포/mL 내지 약 500x106개 세포/mL, 5x106개 세포/mL 내지 150x106개 세포/mL 또는 약 5x106개 세포/mL 내지 약 150x106개 세포/mL, 15x106개 세포/mL 내지 60x106개 세포/mL 또는 약 15x106개 세포/mL 내지 약 60x106개 세포/mL의 밀도로 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 약 1x106개 세포/mL 내지 약 1x108개 세포/mL, 약 1x106개 세포/mL 내지 약 2x107개 세포/mL, 약 1x107개 세포/mL 내지 약 5 x107개 세포/mL, 또는 약 1x107개 세포/mL 내지 5x107개 세포/mL (각각 포괄적임)의 밀도로 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 약 1x106개 세포/mL, 약 2x106개 세포/mL, 약 5x106개 세포/mL, 약 1x107개 세포/mL, 약 1.5x107개 세포/mL, 약 2x107개 세포/mL, 약 2.5x107개 세포/mL, 약 2.5x107개 세포/mL, 약 2.5x107개 세포/mL, 약 3x107개 세포/mL, 약 3.5x107개 세포/mL, 약 4x107개 세포/mL, 약 4.5x107개 세포/mL, 또는 약 5x107개 세포/mL의 밀도로 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 약 1.5x107개 세포/mL 내지 약 6x107개 세포/mL (각각 포괄적임)의 밀도로 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 적어도 약 1x107개 세포/mL의 밀도로 냉동 용액에 현탁된다. 특정 구체예에서, 세포는 적어도 약 1.5x107개 세포/mL의 밀도로 냉동 용액에 현탁된다. 일부 구체예에서, 세포는 생존 세포이다.
일부 구체예에서, 극저온 보존 배지로의 전달은 적절한 극저온 보존 완충액 또는 후속되는 냉동을 위한 배지에서 배지를 제거하거나 및/또는 세포를 대체하기 위한, 샘플, 예컨대, 세포 및/또는 조작된 세포 조성물의 세척 단계를 포함할 수 있는 하나 이상의 가공 단계와 관련된다. 특정 구체예에서, 극저온 보존 배지로의 전달은 폐쇄되고 멸균된 시스템에서 임상-규모 수준으로 전체적으로 자동화된다. 특정 구체예에서, 극저온 보존 배지로의 전달은 CliniMACS 시스템 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다.
일부 구체예에서, 세포는 세포를 가공 및/또는 조작하기 위한 상기 방법 전에, 중에, 또는 후에 냉동된다, 예컨대 극저온 보존된다. 일부 구체예에서, 냉동 및 후속 해동 단계는 세포 집단의 과립구 및, 어느 정도의 단핵세포를 제거한다. 세포는 분당 1℃의 속도로 -80℃로 냉동될 수 있고 액체 질소 보관 탱크의 증기상에 보관될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 극저온 보존에 적합한 주머니 (예를 들어, CryoMacs® 냉동 주머니, Miltenyi Biotec)에 동봉된다. 일부 구체예에서, 조성물은 극저온 보존에 적합한 바이알 (예를 들어, CellSeal® 바이알, Cook Regentec)에 동봉된다.
적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 가요성 주머니, 예컨대 주입 주머니를 들 수 있다. 특정 구체예에서, 용기는 주머니, 가요성 주머니, 예컨대, 세포의 대상체에의 주입에 적합한 주머니, 예컨대 가요성 플라스틱 또는 PVC 주머니, 및/또는 IV 용액 주머니이다. 주머니는 일부 구체예에서 세포 및 조성물의 멸균 용액 및 전달을 제공하기 위하여 밀봉 가능하고 및/또는 멸균될 수 있다. 일부 구체예에서, 용기, 예컨대 주머니는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1000 mL의 용량 또는 약 또는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1000 mL의 용량, 예컨대 10 내지 100 mL 또는 약 10 내지 약 100 mL 또는 10 내지 500 mL 또는 약 10 내지 약 500 mL (각각 포괄적임)의 용량을 가진다. 일부 구체예에서, 용기, 예컨대 주머니는 예를 들어, 치료 직전에, 예컨대 대상체의 위치 또는 치료 위치, 예컨대 침대 옆에서 해동을 허용하기 위해, 하나 이상의 다양한 온도에서, 예컨대 저온에서, 예컨대 -20℃, -80℃, -120℃, 135℃ 아래 또는 약 -20℃, -80℃, -120℃, 135℃ 아래 또는 -20℃, -80℃, -120℃, 135℃의 온도에서 및/또는 극저온 보존에 적합한 온도에서, 및/또는 다른 온도, 예컨대 해동 및 체온에 적합한 온도, 예컨대 37℃ 또는 약 37℃에서 안정적이거나 및/또는 세포의 안정적인 보관 및/또는 유지를 제공하는 물질이거나 및/또는 그런 물질로부터 제조된다.
용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 용기는 하나 이상의 부분, 예를 들어, 정맥내 또는 다른 주입을 위한 튜빙 또는 하나 이상의 튜브에의 관 삽입의 연결을 위한 및/또는 다른 용기, 예컨대 세포 배양 및/또는 보관 주머니 또는 다른 용기로의 및 용기로부터의 전달을 목적으로 연결하기 위한, 예컨대, 멸균된 접근부를 가진다. 예시의 용기는 주입용 바늘이 꽂힐 수 있는 스토퍼가 달린 것을 포함하여, 주입 주머니, 정맥내 용액 주머니, 및 바이알을 포함한다.
본 발명은 발명의 개별적인 측면들의 단일 예시로서 의도된, 본원에 개시된 구체예들에 의해 그 범주가 제한되지 않아야 하며, 기능적으로 동등한 모든 것이 발명의 범주 내에 있다. 본원에 기술된 것 외에, 발명의 모델 및 방법에 대한 다양한 변형은 당업자들에게 전술한 설명 및 교시로부터 분명해질 것이며, 유사하게 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 변형 또는 다른 구체예들은 발명의 진정한 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 실시될 수 있다.
자극 시약
일부 구체예에서, 자극 조건 하에 풍부화된 세포의 조성물을 인큐베이션하는 것은 풍부화된 세포의 조성물을 T 세포를 활성화 및/또는 팽창시킬 수 있는 자극 시약과 함께 인큐베이션하거나 및/또는 접촉하는 것이거나 포함한다. 일부 구체예에서, 자극 시약은 세포에서 하나 이상의 신호를 자극 및/또는 활성화할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 신호는 수용체에 의해 매개된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 신호는 형질 도입의 신호 및/또는 이차 메신저, 예컨대 cAMP 및/또는 세포내 칼슘의 수준 또는 양의 변화, 하나 이상의 세포 단백질의 양, 세포 국지화, 확인, 인산화, 편재화, 및/또는 절단의 변화, 및/또는 세포 활성, 예컨대 전사, 번역, 단백질 분해, 세포 형태, 활성화 상태, 및/또는 세포 분할의 변화이거나 변화와 관련된다. 특정 구체예에서, 자극 시약은 TCR 복합체의 하나 이상의 구성요소의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 동시자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 활성화하거나 및/또는 활성화할 수 있다.
특정 구체예에서, 자극 시약은 세포, 예컨대, T 세포를 활성화 및/또는 팽창시킬 수 있는 하나 이상의 작용제, 예컨대 생체분자에 콘쥬게이트된 또는 연결된 입자, 예컨대, 비드를 함유한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 작용제는 비드에 결합된다. 일부 구체예에서, 비드는 생체적합적이다, 즉, 생물학적 사용에 적합한 물질로 구성된다. 일부 구체예에서, 비드는 배양된 세포, 예컨대 배양된 T 세포에 대해 무독성이다. 일부 구체예에서, 비드는 작용제와 세포 사이의 상호작용을 허용하는 방식으로 작용제를 부착시킬 수 이TsS 임의의 입자일 수 있다.
일부 구체예에서, 자극 시약은 비드에, 예를 들어 비드 표면에 결합된 또는 그렇지 않으면 부착된 세포, 예컨대, T 세포를 활성화 및/또는 팽창시킬 수 있는 하나 이상의 작용제를 포함한다. 특정 구체예에서, 비드는 비세포 입자이다. 특정 구체예에서, 비드는 콜로이드상 입자, 미소구체, 나노입자, 자성 비드, 등을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 비드는 아가로오스 비드이다. 특정 구체예에서, 비드는 세파로오스 비드이다.
특정 구체예에서, 자극 시약은 단분산성인 비드를 함유한다. 특정 구체예에서, 단분산성인 비드는 서로 5% 미만의 직경 표준 편차를 가지는 크기 분산을 포함한다.
일부 구체예에서, 비드는 하나 이상의 작용제, 예컨대 비드의 표면에 결합된, 콘쥬게이트된, 또는 연결된 (직접 또는 간접적으로) 작용제를 함유한다. 일부 구체예에서, 본원에서 고려되는 작용제로는, 한정하는 것은 아니지만, RNA, DNA, 단백질 (예컨대, 효소), 항원, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 항체 단편, 탄수화물, 지질 렉틴, 또는 원하는 표적에 대한 친화도를 가진 임의의 다른 생체분자를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 원하는 표적은 T 세포 수용체 및/또는 T 세포 수용체의 구성요소이다. 특정 구체예에서, 원하는 표적은 CD3이다. 특정 구체예에서, 원하는 표적은 T 세포 동시자극 분자, 예컨대, CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS이다. 하나 이상의 작용제는 당업계에 알려져 있고 이용 가능한 다양한 방법에 의하여 비드에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 부착은 공유적, 비공유적, 정전기성, 또는 소수성일 수 있고, 예를 들어, 화학적 수단, 기계적 수단, 또는 효소적 수단을 포함한, 다양한 부착 수단에 의해 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 생체분자 (예컨대, 비오티닐화된 항-CD3 항체)가 비드에 직접 부착된 또 다른 생체분자 (예컨대, 항-비오틴 항체)를 통해 비드에 간접적으로 부착될 수 있다.
일부 구체예에서, 자극 시약은 세포 표면에서 거대분자와 직접 상호작용하는 하나 이상의 작용제 및 비드를 함유한다. 특정 구체예에서, 비드 (예컨대, 상자성 비드)는 세포 상의 하나 이상의 거대분자 (예컨대, 하나 이상의 세포 표면 단백질)에 특이적인 하나 이상의 작용제 (예컨대, 항체)를 통하여 세포와 상호작용한다. 특정 구체예에서, 비드 (예컨대, 상자성 비드)는 본원에 기술된 제1 작용제, 예컨대 일차 항체 (예컨대, 항-비오틴 항체) 또는 다른 생체분자로 표지된 후, 제2 작용제, 예컨대 이차 항체 (예컨대, 비오티닐화된 항-CD3 항체) 또는 다른 제2 생체분자 예컨대, 스트렙트아비딘)가 첨가되고, 그로써 이차 항체 또는 다른 제2 생체분자가 입자 상의 이러한 일차 항체 또는 다른 생체분자에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 자극 시약은 비드 (예컨대, 상자성 비드)에 부착되고 세포 (예컨대, T 세포) 상의 다음의 거대분자 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 작용제 (예컨대 항체)를 함유한다: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, CD18/CDI la (LFA-1), CD62L (L-셀렉틴), CD29/CD49d (VLA-4), Notch 리간드 (예컨대 델타-유사 1/4, Jagged 1/2, 등), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, 및 CXCR3 또는 이들 거대분자 또는 이것들의 단편에 상응하는 리간드를 포함하는 이것들의 단편. 일부 구체예에서, 비드에 부착된 작용제 (예컨대 항체)는 세포 (예컨대 T 세포) 상의 다음의 거대분자 중 하나 이상에 특이적으로 결합한다: CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO.
일부 구체예에서, 비드에 부착된 작용제 중 하나 이상은 항체이다. 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체 (면역글로불린 Fc 영역을 가지는 전장 항체를 포함함), 폴리에피토프성 특이성을 가진 항체 조성물, 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체, 디아바디, 및 단일-사슬 분자, 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대, Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 자극 시약은 항체 단편 (항원-결합 단편을 포함함), 예컨대, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하는, 임의의 아이소타입의 불변 영역이 본원에서 고려된 항체에 대해 사용될 수 있고, 이러한 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종 (예컨대, 쥐과 종)으로부터 얻어질 수 있는 것이 인지될 것이다. 일부 구체예에서, 작용제는 T 세포 수용체의 하나 이상의 구성요소에 결합하는 및/또는 그것을 인식하는 항체이다. 특정 구체예에서, 작용제는 항-CD3 항체이다. 특정 구체예에서, 작용제는 공동 수용체에 결합하는 및/또는 그것을 인식하는 항체이다. 일부 구체예에서, 자극 시약은 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 비드는 약 0.001 μm보다 큰, 약 0.01 μm보다 큰, 약 0.1 μm보다 큰, 약 1.0 μm보다 큰, 약 10 μm보다 큰, 약 50 μm보다 큰, 약 100 μm보다 큰 또는 약 1000 μm보다 큰 및 약 1500 μm 이하의 직경을 가진다. 일부 구체예에서, 비드는 약 1.0 μm 내지 약 500 μm, 약 1.0 μm 내지 약 150 μm, 약 1.0 μm 내지 약 30 μm, 약 1.0 μm 내지 약 10 μm, 약 1.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 5.0 μm, 또는 약 3.0 μm 내지 약 5.0 μm의 직경을 가진다. 일부 구체예에서, 비드는 약 3 μm 내지 약 5μm의 직경을 가진다. 일부 구체예에서, 비드는 적어도 또는 적어도 약 또는 약 0.001 μm, 0.01 μm, 0.1 μm, 0.5 μm, 1.0 μm, 1.5 μm, 2.0 μm, 2.5 μm, 3.0 μm, 3.5 μm, 4.0 μm, 4.5 μm, 5.0 μm, 5.5 μm, 6.0 μm, 6.5 μm, 7.0 μm, 7.5 μm, 8.0 μm, 8.5 μm, 9.0 μm, 9.5 μm, 10 μm, 12 μm, 14 μm, 16 μm, 18 μm 또는 20 μm의 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 비드는 4.5 μm 또는 약 4.5 μm의 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 비드는 2.8 μm 또는 약 4.5 μm의 직경을 가진다.
일부 구체예에서, 비드는 0.001 g/cm3보다 큰, 0.01 g/cm3보다 큰, 0.05 g/cm3보다 큰, 0.1 g/cm3보다 큰, 0.5 g/cm3보다 큰, 0.6 g/cm3보다 큰, 0.7 g/cm3보다 큰, 0.8 g/cm3보다 큰, 0.9 g/cm3보다 큰, 1 g/cm3보다 큰, 1.1 g/cm3보다 큰, 1.2 g/cm3보다 큰, 1.3 g/cm3보다 큰, 1.4 g/cm3보다 큰, 1.5 g/cm3보다 큰, 2 g/cm3보다 큰, 3 g/cm3보다 큰, 4 g/cm3보다 큰, 또는 5g/cm3보다 큰 밀도를 가진다. 일부 구체예에서, 비드는 약 0.001 g/cm3 내지 약 100 g/cm3, 약 0.01 g/cm3 내지 약 50 g/cm3, 약 0.1 g/cm3 내지 약 10 g/cm3, 약 0.1 g/cm3 내지 약 .5 g/cm3, 약 0.5 g/cm3 내지 약 1 g/cm3, 약 0.5 g/cm3 내지 약 1.5 g/cm3, 약 1 g/cm3 내지 약 1.5 g/cm3, 약 1 g/cm3 내지 약 2 g/cm3, 또는 약 1 g/cm3 내지 약 5 g/cm3의 밀도를 가진다. 일부 구체예에서, 비드는 약 0.5 g/cm3, 약 0.5 g/cm3, 약 0.6 g/cm3, 약 0.7 g/cm3, 약 0.8 g/cm3, 약 0.9 g/cm3, 약 1.0 g/cm3, 약 1.1 g/cm3, 약 1.2 g/cm3, 약 1.3 g/cm3, 약 1.4 g/cm3, 약 1.5 g/cm3, 약 1.6 g/cm3, 약 1.7 g/cm3, 약 1.8 g/cm3, 약 1.9 g/cm3, 또는 약 2.0 g/cm3의 밀도를 가진다. 특정 구체예에서, 비드는 약 1.6 g/cm3의 밀도를 가진다. 특정 구체예에서, 비드 또는 입자는 약 1.5 g/cm3의 밀도를 가진다. 특정 구체예에서, 입자는 약 1.3 g/cm3의 밀도를 가진다.
특정 구체예에서, 다수의 비드가 균일한 밀도를 가진다. 특정 구체예에서, 균일한 밀도는 평균 비드 밀도의 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만의 밀도 표준 편차를 포함한다.
일부 구체예에서, 비드는 입자의 각 그램당 약 0.001 m2 (m2/g) 내지 약 1,000 m2/g, 약 .010 m2/g 내지 약 100 m2/g, 약 0.1 m2/g 내지 약 10 m2/g, 약 0.1 m2/g 내지 약 1 m2/g, 약 1 m2/g 내지 약 10 m2/g, 약 10 m2/g 내지 약 100 m2/g, 약 0.5 m2/g 내지 약 20 m2/g, 약 0.5 m2/g 내지 약 5 m2/g, 또는 약 1 m2/g 내지 약 4 m2/g의 표면적을 가진다. 일부 구체예에서, 입자 또는 비드는 약 1 m2/g 내지 약 4 m2/g의 표면적을 가진다.
일부 구체예에서, 비드는 작용제에 결합, 연결, 또는 콘쥬게이트될 수 있는 비드 표면에 또는 가까이에 적어도 하나의 물질을 함유한다. 일부 구체예에서, 비드는 표면 기능화된다, 즉, 결합 분자, 예컨대, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 공유 결합을 형성할 수 있는 작용기를 포함한다. 특정 구체예에서, 비드는 표면-노출된 카르복실, 아미노, 하이드록실, 토실, 에폭시, 및/또는 클로로메틸 기를 포함한다. 특정 구체예에서, 비드는 표면 노출된 아가로오스 및/또는 세파로스를 포함한다. 특정 구체예에서, 비드 표면은 결합 분자에 결합하거나 부착시킬 수 있는 부착된 자극 시약을 포함한다. 특정 구체예에서, 생체분자는 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 비드는 표면 노출된 단백질 A, 단백질 G, 또는 비오틴을 포함한다.
일부 구체예에서, 비드는 자기장에서 반응한다. 일부 구체예에서, 비드는 자성 비드이다. 일부 구체예에서, 자성 비드는 상자성이다. 특정 구체예에서, 자성 비드는 초상자성이다. 특정 구체예에서, 비드는 그것이 자기장에 노출되지 않는한 임의의 자석 특성을 나타내지 않는다.
특정 구체예에서, 비드는 자성 코어, 상자성 코어, 또는 초상자성 코어를 포함한다. 일부 구체예에서, 자성 코어는 금속을 함유한다. 일부 구체예에서, 금속은, 한정하는 것은 아니지만, 철, 니켈, 구리, 코발트, 가돌리늄, 망간, 탄탈룸, 아연, 지르코늄 또는 이것들의 임의의 조합일 수 있다. 특정 구체예에서, 자성 코어는 금속 산화물 (예컨대, 철 산화물), 페라이트(ferrite) (예컨대, 망간 페라이트, 코발트 페라이트, 니켁 페라이트, 등), 적철석(hematite) 및 금속 합금 (예컨대, CoTaZn)을 포함한다. 일부 구체예에서, 자성 코어는 페라이트, 금속, 금속 합금, 철 산화물, 또는 크롬 이산화물 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 자성 코어는 원소 철 또는 이것의 화합물을 포함한다. 일부 구체예에서, 자성 코어는 마그네타이트(magnetite, Fe3O4), 마그헤마이트(maghemite, γFe2O3), 또는 그레이지트(greigite, Fe3S4) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 내부 코어는 산화 철 (예컨대, Fe3O4)을 포함한다.
특정 구체예에서, 비드는 표면 기능화된 코트 또는 코팅에 의해 덮인 자성, 상자성, 및/또는 초상자성 코어를 함유한다. 일부 구체예에서, 코트는, 한정하는 것은 아니지만, 중합체, 다당, 실리카, 지방산, 단백질, 탄소, 아가로오스, 세파로오스, 또는 이것들의 조합을 포함할 수 있는 물질을 함유할 수 있다. 일부 구체에에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리 (락트산-글리콜산), 폴리글루타르알데하이드, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 또는 폴리비닐 알코올일 수 있다. 특정 구체예에서, 외부 코트 또는 코팅은 폴리스티렌을 포함한다. 특정 구체예에서, 외부 코팅은 표면 기능화된다.
일부 구체예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어 (예컨대, 철 산화물 코어) 및 코트를 함유하는 비드를 포함하며, 여기서 금속 산화물 코어는 적어도 하나의 다당 (예컨대, 덱스트란)을 포함하고, 코트는 적어도 하나의 다당 (예컨대, 아미노 덱스트란), 적어도 하나의 중합체 (예컨대, 폴리우레탄) 및 실리카를 포함한다. 일부 구체예에서 금속 산화물 코어는 콜로이드상 철 산화물 코어이다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 작용제는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 자극 시약은 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 항-비오틴 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 비드는 약 3 μm 내지 약 10 μm의 직경을 가진다. 일부 구체예에서, 비드는 약 3 μm 내지 약 5 μm의 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 비드는 약 3.5 μm의 직경을 가진다.
일부 구체예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어 (예컨대, 철 산화물 내부 코어) 및 코트 (예컨대, 보호 코트)에 부착된 하나 이상의 작용제를 포함하며, 여기서 코트는 폴리스티렌을 포함한다. 특정 구체예에서, 비드는 상자성 (예컨대, 초상자성) 철 코어, 예컨대 마그네타이트 (Fe3O4) 및/또는 마그헤마이트 (γFe2O3)c 및 폴리스티렌 코트 또는 코팅을 포함하는 코어를 포함하는 단분산성, 상자성 (예컨대, 초상자성) 비드이다. 일부 구체예에서, 비드는 비다공성이다. 일부 구체예에서, 비드는 하나 이상의 작용제가 부탁되는 기능화된 표면을 함유한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 작용제는 표면에서 비드에 공유적으로 결합된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 작용제는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체, 및 표지된 항체 (예컨대, 비오티닐화된 항체)에 결합할 수 있는 항체 또는 이것의 단편, 예컨대 표지된 항-CD3 또는 항-CD28 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 비드는 약 1.5 g/cm3의 밀도 및 약 1 m2/g 내지 약 4 m2/g의 표면적을 가진다. 특정 구체예에서; 비드는 약 4.5 μm의 직경 및 약 1.5 g/cm3의 밀도를 가지는 단분산성 초상자성 비드이다. 일부 구체예에서, 비드는 약 2.8 μm의 평균 직경 및 약 1.3 g/cm3의 밀도를 가지는 단분산성 초상자성 비드이다.
일부 구체예에서, 풍부화된 T 세포의 조성물은 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1 또는 약 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1의 비드 대 세포의 비율로 자극 시약과 함께 인큐베이션된다. 특정 구체예에서, 비드 대 세포의 비율은 2.5:1 내지 0.2;1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 특정 구체예에서, 자극 시약 대 세포의 비율은 약 1:1 또는 1:1이다.
세포로부터 자극 시약의 제거
특정 구체예에서, 자극 시약은 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 이론에 의해 얽매이지 않기를 바라면서, 특정 구체예는 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 회합이, 일부 상황에서, 인큐베이션 중에 시간의 경과에 따라 감소될 수 있는 것으로 예상한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 작용제는 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 회합을 감소시키기 위해 첨가될 수 있다. 특정 구체예에서, 세포 배양 조건, 예컨대 pH의 배지 온도의 변화는 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 회합을 감소시킬 수 있다. 그러므로, 일부 구체예에서, 자극 시약은 세포와 별도로 인큐베이션, 세포 배양 시스템, 및/또는 용액으로부터, 예컨대 인큐베이션, 세포 배양 시스템, 및/또는 용액으로부터 세포를 제거하지 않으면서 또한 제거될 수 있다.
자극 시약 (예컨대 비드 입자 또는 자기화 가능한 입자와 같은 입자이거나 그것을 함유하는 자극 시약)을 세포로부터 제거하는 방법은 알려져 있다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 자극 시약의 일차 항체에 결합하여 그것의 세포 상의 항원에 대한 친화도를 변경시킴으로써 원활한 탈착을 허용하는 경합 항체, 예컨대 미표지된 항체가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 탈착 후에, 경합 항체는 입자 (예컨대 비드 입자)와 회합된 상태를 유지하는 한편 미방응 항체는 세척되거나 세척될 수 있고 세포는 항체의 분리, 선택, 풍부화 및/또는 활성화가 없다. 이러한 시약의 실례는 DETACaBEAD이다 (Friedl et al. 1995; Entschladen et al. 1997). 일부 구체예에서, 입자 (예컨대 비드 입자)는 절단 가능한 링커 (예컨대 DNA 링커)의 존재 하에 제거될 수 있음으로써, 입자-결합된 항체는 링커 (예컨대 CELLection, Dynal)에 콘쥬게이트된다. 일부 경우에, 링커 영역은, 예를 들어 DNase 또는 다른 방출 완충액의 첨가에 의한 분리 후에 세포로부터 입자 (예컨대 비드 입자)를 제거하기 위해 절단 가능한 부위를 제공한다. 일부 구체예에서, 다른 효소적 방법이 또한 세포로부터 입자 (예컨대 비드 입자)의 방출을 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 입자 (예컨대 비드 입자 또는 자기화 가능한 입자)는 생체분해성이다.
일부 구체예에서, 자극 시약은 자성, 상자성, 및/또는 초상자성이거나, 및/또는 자성, 상자성, 및/또는 초상자성인 비드를 함유하고, 자극 시약은 세포를 자기장에 노출시킴으로써 세포로부터 제거될 수 있다. 자기장을 생성하기 위한 자석을 함유한 적합한 장비의 예로는 DynaMag CTS (Thermo Fisher), Magnetic Separator (Takara) 및 EasySep Magnet (Stem Cell Technologies)을 들 수 있다.
특정 구체예에서, 자극 시약은 본원에 제공된 방법에 의하여 생성된 조작된 세포의 수득, 수집, 및/또는 제제화 전에 세포로부터 제거 또는 분리된다. 일부 구체예에서, 자극 시약은 세포를 조작, 예컨대 형질도입 또는 트랜스펙션하기 전에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 특정 구체예에서, 자극 시약은 세포를 조작하는 단계 후에 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 특정 구체예에서, 자극 시약은 증식 및/또는 팽창을 촉진하기 위한 조건 하에서 세포의 컬티베이션 전에, 예컨대 조작된, 예컨대 트랜스펙션된 또는 형질도입된 세포의 컬티베이션 전에 제거된다.
실시예
관심 있는 세포 집단의 선택 또는 분리 전에 성분채집을 극저온 보존하는 효과를 평가하기 위하여, 성분채집 샘플을 조작된 T 세포를 제조하기 위해 설계된 과정의 다양한 단계를 통해 채집하였다. 샘플을 세포 생존성, 세포 수 산출, 세포 표현형, 및 세포 활성에 대해 다양한 지점에서 평가하였다. 이들 연구를 성분채집 물질의 극저온 보존이 (1) 관련된 CD4+ 및 CD8+ T-세포 집단의 표현형 비율에 영향을 미쳤는지, (2) 해동 후 관련된 T-세포 집단을 분류 및 선택하는 능력에 영향을 미쳤는지, 및/또는 (3) 세포 건강, 및/또는 기능성에 영향을 미쳤는지의 여부를 측정하기 위해 설계하였다.
다음의 실시예에서 성분채집은 도너로부터 수집된 성분채집을 나타낸다. 극저온 보존된 성분채집은 샘플 내의 관심 있는 임의의 세포 집단의 수집 후, 그러나 선택 전의 성분채집 샘플의 극저온 보존으로부터 유발되는 세포 생성물을 나타낸다. 휴식된 성분채집은 극저온 보존된 성분채집이 해동된 후 단계로부터 유발되는 세포 생성물을 나타내며, 임의의 추가의 가공 단계 전 일정 시간 동안 휴식을 취하도록 허용되었다. 극저온 보존된 선택된 물질은 관심 있는 세포 (이들 실시예에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포)가 분리된 후, 그것이 분리 후 극저온 보존 단계가 수행된 단계로부터 유발되는 세포 생성물을 나타낸다.
실시예 1: 항-CD19 CAR을 발현하는 CD4+ 및 CD8+ 세포의 치료 조성물을 생성하기 위한 과정.
각각 동일한 항-CD19 키메릭 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포를 본원에서 일반적으로 개관된 과정에 의해 제조하였다. 하기 실시예 2에서 기술되는 것과 같이, 세포를 CD4+ 및 CD8+ 세포의 별도의 조성물이 인간 인간 백혈구 성분채집 샘플로부터 분리되고 극저온 냉동되는 과정에 의해 제조하였다. 선택된 CD4+ 및 CD8+ 조성물을 계속해서 해동하고 별도로 자극, 형질 도입, 및 팽창의 단계들을 진행시켰다. 제2의 예시 과정은 선택 단계 전에 추가적인 극저온 보존 단계를 포함하였다.
분리된 CD4+ 및 CD8+ 세포를 상자성 폴리스티렌-코팅 비드의 존재 하에 1:1의 비드 대 세포 비율로 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체로 별도로 자극하였다. 세포를 IL-2, IL-15, 및 N-아세틸 시스테인 (NAC)을 함유하고 있는 배지에서 자극하였다. CD4+ 세포 배지는 또한 IL-7을 포함하였다.
비드의 도입 후에, CD4+ 및 CD8+ 세포를 동일한 항-CD19 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 별도로 형질도입시켰다. CAR은 쥐과 항체로부터 유래된 항-CD19 scFv, 면역글로불린 스페이서, CD28로부터 유래된 경막 도메인, 4-1BB로부터 유래된 동시자극 영역, 및 CD3-제타 세포내 신호전달 도메인을 함유하였다.
형질 도입 후에, 비드를 자기장에 노출시킴으로써 세포 조성물로부터 제거하였다. 그런 후 CD4+ 및 CD8+ 세포를 별도로 생체반응기 (Xuri W25 Bioreactor)에 의한 연속적인 혼합 및 산소 전달로 팽창을 위해 배양하였다. 폴록사머를 배지에 첨가하였다. 두 세포 조성물을 IL-2 및 IL-15의 존재 하에 배양하였다. CD4+ 세포 배지는 또한 IL-7을 포함하였다. CD4+ 및 CD8+ 세포를 각각, 수득 전에, 원하는 세포 수 및/또는 농도까지 배양하였다. 한계값에 도달한 다음날, 각 조성물로부터의 세포를 별도로 수득하고, 제제화하고, 극저온 냉동하였다.
단계식 냉동 프로파일을 사용하는 자동 온도 냉각기를 하기 실시예에서 기술되는 극저온 보존 단계에 사용하였다.
실시예 2. 연구 설계
2개의 건강한 도너 (즉, 도너 1 및 도너 2)를 이 연구를 위해 사용하였는데, 초기 유입되는 성분채집 (APH) 물질을 각 도너에 대해 5개의 상이한 암으로 나누었다. 유입되는 성분채집 부피의 1/5 (대조군 암 또는 암 5 및 10)을 세척하고 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 분리하기 위하여 분리 단계를 수행하였고, 그때 선택된 세포를 2주 동안 극저온 보존하였다. 각 도너로부터 남아 있는 성분채집을 극저온 보존하기 전에 4개의 샘플로 나누었다 (암 1 내지 4 및 암 6 내지 9). 각각의 극저온 보존된 샘플을 해동하고, 세척하고, 2시간 동안 37℃에서 휴식시킨 후 선택하거나 또는 해동 및 세척 직후에 선택 단계를 수행하였다. 암의 절반을 선택 후에 냉동시켰고 다른 절반을 활성화로 직접 처리하였다.
암 1, 2, 6, 및 7의 샘플을 2주 동안 극저온 보존한 후에 세포를 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단의 분리를 위해 해동시키고 세포 활성화 방법을 수행하였다. 암 1 및 6은 가외 단계, 휴식 단계를 포함하였고, 이 경우 해동 후에, 세포를 2시간 동안 인큐베이터에서 휴식시킨 후 임의의 추가의 처리를 하였다. 암 3, 4, 8 및 9의 샘플을 2 내지 4일 동안 극저온 보존한 후 해동시키고 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단의 선택을 수행하였으며, 그때에 선택된 집단을 1주 동안 극저온 보존한 후에 세포를 해동시키고 계속해서 자극을 받게 하였다. 암 3 및 8은 가외 단계, 휴식 단계를 포함하였고, 이 경우 해동 후에, 세포를 2시간 동안 인큐베이터에서 휴식시킨 후 임의의 추가의 처리를 하였다.
세포를 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 분리하는 선택 단계를 포함한 다양한 가공 단계를 통해 취하였다. 이 선택 단계에서, 각각의 암을 하위암 (즉, CD4+ 및 CD8+ T 세포 하위암)으로 나누었고, 그때에 선택된 세포를 나머지 가공 간계를 통해 처리하였다. 표 1은 각 단계가 수행한 극저온 보존 단계를 포함한, 연구 설계를 나타낸다.
연구 설계
암 성분채집의 극저온 보존 (분리 전) 휴식 단계 극저온 보존 분리 후 도너
1 예 예 아니오 1
2 예 아니오 아니오 1
3 예 예 예 1
4 예 아니오 예 1
5 아니오 아니오 예 1
6 예 예 아니오 2
7 예 아니오 아니오 2
8 예 예 예 2
9 예 아니오 예 2
10 아니오 아니오 예 2
실시예 3: 성분채집 물질의 극저온 보존은 세포 표현형에 의미있게 영향을 미치지 않는다
유동 세포분석을 성분채집 샘플의 극저온 보존 전 및 후에 수행하여 상이한 표현형의 세포 분포에 미치는 냉동의 영향을 평가하였다. 관례적인 흐름 패널을 전개시켜서 T 세포, B 세포, NK 세포, NK-T 세포, 단핵세포, 수지상 세포, 및 기억 T 세포 표현형의 분포를 평가하였다. 결과는 상이한 표현형의 세포의 분포가 극저온 보존 전 및 후의 샘플 사이에서 동등하였음을 시사한다.
극저온 보존된 성분채집 및 신선한 성분채집 샘플을 모두 세포 표면 상의 CD4 및 CD8 분자의 존재에 대하여 유동 세포분석을 사용하여 분석하였다. 이 검정의 결과는 표면 CD4 및 CD8 분자의 수준이 극저온 보존에 의해 영향을 받지 않는 것을 증명하였다. 이들 결과는 또한 이들 세포의 백분율이 두 도너에 대해 극저온 냉동 전과 후에 비슷했기 때문에, 성분채집의 극저온 보존이 샘플 중의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 상대적인 비율에 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
실시예 4: CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 집단의 분리에 미치는 극저온 보존의 영향
추가로 성분채집을 극저온 보존하는 것이 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 가공에 영향을 미치는지를 평가하기 위하여, 생존성 검정을 관심 있는 세포의 선택으로 이어지는 다양한 단계에서 수행하였다. 세포 생존성을 극저온 보존 후 휴식 기간 없이, 선택 단계 전에 극저온 보존이 수행된 세포에 대해 (암 2, 4, 7, 및 9), 극저온 보존 후 휴식 기간이 있으면서, 선택 단계 전에 극저온 보존이 수행된 세포에 대해 (암 1, 3, 6, 및 8), 및 분리 단계 후에 극저온 보존이 수행된 세포에 대해 (암 5 및 10, 또는 대조군 암) 과정의 다양한 단계에서 평가하였다. 구체적으로, 생존성을, 성분채집을 수집한 후에; 성분채집을 극저온 보존을 위해 제제화한 후에; 성분채집을 일정 기간 동안 극저온 보존한 후, 해동하고 희석한 후에; 희석되고 해동된 성분채집을 세척한 후에; 세척한 성분채집을 2시간 동안 인큐베이터에서 휴식시킨 후에; 항체-코팅된 비드를 샘플에 첨가한 후에; 및 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포를 분리한 후에 평가하였다. 모든 암을 가로지르는 세포 생존성 값은 각 가공 단계에서 대조군 암에 대한 세포 생존성 값과 비슷하였다.
총 핵화된 세포 수 (TNC)를 또한 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 분리로 이어지는 다양한 단계 중에 모든 샘플에 대해 측정하였다. 세포 손실은 대부분 제제화 단계에서 일어나는 것으로 나타났다. 분리 후의 세포 수 값을 분리 전 세포 수 값에 대해 표준화함으로써 얻어진 세포 수율 비는 극저온 보존된 성분채집 샘플에서 세포 손실은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단의 분리 전에 일어났고, 분리 과정 내에서 단계 대 단계 세포 수율은 영향을 미치지 않았음을 증명하였다. 그러나, 이 실험에서, 선택된 세포에 상응하는 최종 TNC 값은, 아마도 분리 전에 발생하는 세포 손실로 인하여, 일부 극저온 보존된 성분채집 암과 각 도너에 대한 각 세포 유형의 대조군 암 사이에서 약간 상이한 것으로 나타났다. 그러나, 한 도너에 대한 CD4+ T 세포 수율은 극저온 보존된 성분채집과 대조군 암 사이에서 비슷한 것으로 나타났다.
실시예 5: 분리 및 냉동 단계 후의 세포 표현형 및 생존성의 평가
분리 단계 후에, 극저온 보존 단계를 필요로 한 세포 (암 3, 4, 5, 8, 9, 및 10)를 극저온 보존한 후 추가 분석을 위해 해동하였다. 암 3, 4, 8, 및 9의 세포를 1.5 내지 2주 동안 극저온으로 보관한 후에 추가 분석 및 가공을 위해 해동하였다. 암 5 및 10 (또는 대조군 암)의 세포를 2주 동안 극저온으로 보관한 후에 추가 분석 및 가공을 위해 해동하였다. 임의의 세포 활성화 단계 전에 각 도너의 모든 암으로부터 얻어진 모든 분리된 T 세포 집단에 대해 이 지점에서 검정을 수행하였다. TMEM 검정은 각 도너의 상이한 암으로부터의 선택된 세포 집단에 걸쳐 다양한 T 세포 마커의 존재를 평가하였다. 세포 표현형 분포 (선택된 마커의 검출을 기반으로 함)는 각 도너에 대해 각 세포 유형의 극저온 보존된 성분채집 암과 대조군 암 사이에 크게 다르지 않았다. 분리 후 냉동 단계를 수행하지 않았던 암의 세포는 나이브-유사 세포 (CD45RA+/CCR7+, CD27+/CD28+)로 되는 경향이 있었고 말단 이펙터 세포는 더 적었다 (CD45RA+, CCR7-). CD62L은 분리 후 냉동 단계를 수행한 샘플에 대해 약간 감소하였다.
세포 생존성을 세포 활성화 전에 각 도너로부터의 각 세포 유형의 모든 암에 대해 평가하였다. 세포 생존성은 각 도너로부터의 각 세포 유형의 극저온 보존된 성분채집과 대조군 암 사이에서 크게 다르지 않았다. 추가적으로, 분리 후 냉동 단계의 효과를 평가하기 위하여, 분리 후 냉동 단계 후 얻어진 세포 수를 분리 직후 냉동 전에 얻어진 세포 수에 대해 표준화함으로써 세포 수율 비를 얻었다. 세포 수율 비는 극저온 보존된 성분채집과 대조군 암 사이에서 유사하였다.
카스파제 3의 수준은 모든 암에 걸쳐 낮은 것으로 (약 5% 이하) 나타났다.
실시예 6: 활성화, 형질 도입, 및 팽창 중에 세포 생존성 및 세포 수율의 평가
앞서 논의된 것과 같이, 분리 단계 후에, 분리 후 냉동 단계가 수행될 필요가 있는 연구의 암을 일정 기간 동안 극저온으로 보관한 후에 해동시키고 계속해서 활성화, 형질 도입 및 팽창 단계를 수행하였다. 세포 생존성 및 TNC 값을 극저온 보존된 물질을 해동한 후에 측정하였고; 그런 후 해동된 물질을 상자성 폴리스티렌-코팅된 비드의 존재하에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체로 자극하였고; 그런 후 활성화된 세포를 형질 도입 시켰으며; 그런 후 비드를 세포로부터 제거하였고; 그런 후 세포를 2 또는 3일 동안 팽창시켰다. 세포 생존성은 각 도너에 대한 각 세포 유형의 극저온 보존된 성분채집과 대조군 암 사이에서 비슷한 것으로 나타났다. 자극 단계에서, 극저온 보존된 성분채집 암에 대한 세포 생존성 값은 그것의 상응하는 대조군 암에 대한 값과 비교하여 20% 미만의 차이를 나타냈다. 이런 퍼센트 차이는 모든 다른 단계에서 10% 아래였다. 추가적으로, 각각의 이들 단계에서 얻어진 TNC 값은 극저온 보존된 성분채집과 그것의 상응하는 대조군 암 사이에서 동등하였다. 더욱이, 각 단계에서 계산된 배수 팽창은 또한 극저온 보존된 성분채집과 그것의 상응하는 대조군 암 사이에서 동등한 것으로 나타났다.
이들 결과는 이 실험에서, 분리 직후에 휴식 또는 추가의 극저온 보존 단계가 없는 극저온 보존된 성분채집 샘플 및 휴식 단계가 있지만, 분리 직후 추가의 극저온 보존 단계가 없는 극저온 보존된 성분채집 샘플이 그것들의 상응하는 대조군 암과 비교하여 유사하거나 더 높은 최종 세포 수율을 가지는 것을 나타낸다.
실시예 7: 극저온 보존된 조성물의 제제화 중에 세포 생존성, 세포 수율, 및 세포 활성의 평가
팽창 단계 후에 얻어진 각 암으로부터의 세포를 극저온 보존 배지에서 제제화하고 냉동시켰다. 그런 후 샘플을 추가의 분석을 위해 해동하였다. 세포 생존성 및 세포 수율 값을 이 단계에서 연구의 모든 암에서의 세포에 대해 측정하였다. 평균 생존성 및 세포 수 수율은 이 단계에서 극저온 보존된 성분채집 암 및 그것들의 상응하는 대조군 암 사이에서 동등하였다.
모든 암에 대한 세포 표현형 분포를 평가하기 위한 검정을 또한 수행하였다. 세포 표현형은 극저온 보존된 성분채집 암과 그것들의 상응하는 대조군 암 사이에서 통계적으로 동등한 것으로 나타났다. 분리 후 냉동 단계가 수행되지 않았던 암은 더 큰 백분율의 CD45RA+/CCR7+ 및 CD27+/CD28+ 세포, 및 더 적은 수의 CD45RA+, CCR7- 세포를 함유하는 경향이 있었다. 추가적으로, 이 실험에서, 카스파제 3의 수준은 CD4+ T 세포 암과 비교하여 CD8+ T 세포 암에 대해 약간 더 높은 것으로 나타났고, 이때 암은 이 단계를 포함하지 않은 암보다 더 높은 카스파제 수준을 나타내는 분리 후 냉동 단계를 포함하였다.
인터페론 감마 (IFNγ) 분비를 사용하여 가공 후 T 세포 기능성을 평가하였다. 각 암으로부터의 T 세포를 자극하여 IFNγ를 생성시켰다. 자극 후에 상층액을 수집하고 상층액에 분비된 IFNγ를 측정하였다. 모든 실험 조건에 대한 값은 그것들의 상응하는 대조군에 대한 값과 일치하였고, 이것은 최종 세포 생성물의 세포 활성이 초기 극저온 보존 단계에 의해 영향을 받지 않았음을 증명한다.
세포용해 검정을 또한 수행하여 생성된 CD8+ T 세포의 세포용해 활성을 평가하였다. 세포용해 활성을 다양한 이펙터 세포:표적 세포 비율에서 측정하여 EC50 (표적 세포의 50%를 살해하기 위해 필요한 비율)을 측정하였다. 상응하는 대조군 암에 비교한 극저온 보존된 성분채집 암 사이의 세포용해 EC50 배수 차이는 2배 차이보다 낮은 것으로 나타났고, 이것은 상이한 암 조건이 결과적으로 얻어지는 세포의 세포용해 EC50을 의미있게 변화시키지 않았음을 시사한다.
전형적인 구체예들
1. 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 보관하는 단계를 포함하는 방법, 여기서 세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단된 후에, 및 도너가 다음: 질환 또는 상태에 대한 임의의 초기 치료, 질환 또는 상태에 대한 치료를 위한 임의의 표적화된 치료 또는 임의의 표지화된 치료, 또는 방사선요법 및/또는 화학요법 이외의 임의의 치료 중 한 가지 이상을 받기 전, (ii) 도너에서 질환 또는 상태에 대한 초기 치료 후 질환 또는 상태의 첫 번째 재발 후에, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 재발 후 치료를 받기 전, 또는 (iii) 도너가 질환 또는 상태로 진단되지 않았거나, 질환 또는 상태에 대해 알려지지 않았거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심되지 않은 때인 시점에서 도너로부터 얻어졌다.
2. 생물학적 샘플이 도너의 혈액 샘플이거나 그것으로부터 유래되는 것인, 구체예 1의 방법.
3. 세포가 극저온으로 보관되기 전에, 혈액 세포 집단 및/또는 T 세포 집단 및/또는 T 세포 하위세트에 대하여 선택 단계가 수행되지 않았거나, 및/또는 풍부화되지 않은 것인, 구체예 1 또는 구체예 2의 방법.
4. 세포가 극저온으로 보관되기 전에 혈액 세포 및/또는 T 세포 집단에 대해 선택 단계 및/또는 풍부화가 수행되었고, 선택적으로 방법은 상기 극저온 보관 전에 생물학적 샘플로부터의 세포 집단을 선택하거나 풍부화하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 1 또는 구체예 2의 방법.
5. 선택 단계 및/또는 풍부화가 면역친화도-기반 선택을 포함하거나 및/또는 양성 또는 음성 선택을 포함하는 것인, 구체예 4의 방법.
6. 선택 단계 및/또는 풍부화는 CD4+ 세포 또는 이것의 하위세트 및/또는 CD8+ 세포 또는 이것의 하위세트의 풍부화 및/또는 분리를 포함하고, CD4+ 세포 또는 이것의 하위세트의 풍부화 또는 분리는 CD8+ 세포 또는 이것의 하위세트의 선택 및/또는 분리와 별도로 또는 조합하여 수행되며, 선택적으로 CD8+ 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 구체예 2 내지 5 중 어느 한 구체예의 방법.
7. 세포가 T 세포를 포함하거나 T 세포에 대해 풍부화되는 것인, 구체예 1 내지 6 중 어느 한 구체예의 방법.
8. T 세포가 CD4+ T 세포 또는 이것의 하위세트, CD8+ T 세포 또는 이것의 하위세트, 또는 이것들의 혼합물을 포함하거나 이것들에 대해 풍부화되고, CD8+ T 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ T 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 구체예 7의 방법.
9. 세포를 극저온으로 보관하기 전에 세포를 0℃ 이하의 온도로 냉각시키는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 1 내지 8 중 어느 한 구체예의 방법.
10. 세포를 보관하기 전 및/또는 세포를 냉각하기 전에 세포를 냉동 용액과 조합하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 8의 방법.
11. 냉동 용액은 약 10%의 다이메틸 설폭사이드 (DMSO) 및 혈청 단백질, 선택적으로 인간 혈청 알부민, 선택적으로 약 4%의 인간 혈청 알부민을 포함하고, 및/또는 냉동 용액 및/또는 세포가 극저온 보존되고 보관되는 조성물의 최종 농도는 부피로 약 1% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 9%, 또는 약 6% 내지 약 9%의 DMSO를 포함하거나 및/또는 부피로 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5%, 또는 약 10%의 DMSO를 포함하는 것인, 구체예 10의 방법.
12. 세포를 냉각시키는 단계가 분당 1℃ 또는 약 1℃의 속도로, 선택적으로 온도가 -80℃ 또는 약 -80℃에 도달할 때까지 온도를 저하시키는 것을 포함하는 것인, 구체예 9 내지 11 중 어느 한 구체예의 방법.
13. 세포가 액체 질소의 증기상에 배치된 용기에서 극저온으로 보관되고, 용기는 선택적으로 극저온 보존에 적합한 주머니 또는 바이알인 것인, 구체예 1 내지 11 중 어느 한 구체예의 방법.
14. 세포가 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 또는 40년 이상의 기간 동안 극저온으로 보관되는 것인, 구체예 1 내지 13 중 어느 한 구체예의 방법.
15. 세포가 일정 기간 동안 보관되고, 그 기간 후, 조성물 중의 생존 세포 또는 생존성 T 세포 또는 이것의 아형 또는 하위세트의 백분율이 약 24% 내지 약 100%이거나 또는 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90%인 것인, 구체예 1 내지 14 중 어느 한 구체예의 방법.
16. 질환이 암, 염증성 질환 또는 상태, 자가면역 질환 또는 상태, 또는 감염성 질환 또는 상태인 것인, 구체예 1 내지 15 중 어느 한 구체예의 방법.
17. 암이 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 전-림프구성 백혈병, 털세포 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 널-급성 림프모세포성 백혈병, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 큰 B 세포 림프종, 다발성 골수종, 여포성 림프종, 비장의, 변연 지대 림프종, 맨틀 세포 림프종, 무통증 B 세포 림프종, 또는 급성 골수성 백혈병인 것인, 구체예 16의 방법.
18. 암이 ROR1, EGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, MUC1, MUC16, B 세포 성숙 항원 (BCMA), FCRL5/FCRH5, GPRC5D, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 암종배아 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1 (WT-1), 및 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1) 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 포함하는 것인, 구체예 16 또는 17의 방법.
19. 초기 치료 또는 후속 치료가 화학요법, 방사선요법 및/또는 수술이거나 및/또는 감량 치료 (debulking treatment)인 것인, 구체예 1 내지 18 중 어느 한 구체예의 방법.
20. 초기 치료 또는 후속 치료가 조합 화학요법이거나 조합 화학요법을 포함하는 것인, 구체예 19의 방법.
21. 도너가 인간인 것인, 구체예 1 내지 20 중 어느 한 구체예의 방법.
22. 극저온 보관 전에, 선택적으로 하나 이상의 표현형 마커에 대한 세포의 표면 발현을 평가함으로써, 세포를 분석하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 1 내지 21 중 어느 한 구체예의 방법.
23. 극저온으로 보관된 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 1 내지 21 중 어느 한 구체예의 방법.
24. 세포의 활성을 증가시키기 위하여 극저온 후 변형을 수행하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 23의 방법.
25. 극저온 후 변형이 극저온 보관 전 세포를 분석하는 것을 기반으로 하는 것인, 구체예 24의 방법.
26. 세포의 극저온 보관 및/또는 해동 후에, 선택적으로 재조합 단백질, 선택적으로 재조합 수용체이거나, 선택적으로 T 세포 수용체 (TCR), 키메릭 수용체, 및/또는 키메릭 항원 수용체이거나 이것들을 포함하는 재조합 또는 외인성 분자를 발현하기 위해 세포를 조작하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 23 내지 25 중 어느 한 구체예의 방법.
27. 재조합 분자가 질환 또는 상태에 의해 발현된, 그것에 의해 특이적으로 발현된, 또는 그것과 관련된 항원을 특이적으로 인식하거나 항원에 결합하는 재조합 수용체인 것인, 구체예 26의 방법.
28. 세포의 수는 도너로부터 수집될 때, 및/또는 성분채집 샘플에서 총 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 또는 그 이상의 총 세포 또는 총 핵화된 세포이거나 약 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 또는 그 이상의 총 세포 또는 총 핵화된 세포이거나 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 이하의 총 세포 또는 총 핵화된 세포이거나 약 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 이하의 총 세포 또는 총 핵화된 세포인 것인, 구체예 1 내지 26 중 어느 한 구체예의 방법.
29. (a) 도너로부터 얻어진 성분채집 샘플을 냉각된 환경에서 보관 시설로 배송하는 단계; 및 (b) 성분채집 샘플을, 선택적으로 보관 시설에서 극저온으로 보관하는 단계를 포함하는, 성분채집 샘플의 가공 방법.
30. 성분채집 샘플로부터의 T 세포를 배송 전에 및/또는 샘플을 극저온으로 보관하기 전에 풍부화하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 29의 방법.
31. T 세포가 CD4+ T 세포 또는 이것의 하위세트, CD8+ T 세포 또는 이것의 하위세트, 또는 이것들의 혼합물이거나 이것들을 포함하거나 또는 이것들에 대해 풍부화되며, 선택적으로 CD8+ 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 샘플은 벌크 T 세포에 대해 풍부화되는 것인, 구체예 30의 방법.
32. 배송 전에 성분채집 샘플을 분석하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 29 내지 31 중 어느 한 구체예의 방법.
33. 냉동 용액을 배송 전에 성분채집 샘플에 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 29 내지 32 중 어느 한 구체예의 방법.
34. 냉동 용액을 배송 전에 성분채집 샘플에 첨가하는 단계를 더 포함하고, 냉동 용액은 배송 전에 성분채집 샘플의 분석을 기반으로 선택되는 것인, 구체예 32의 방법.
35. 성분채집 샘플을 배송 전에 극저온으로 냉동하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 29 내지 34 중 어느 한 구체예의 방법.
36. 성분채집 샘플로부터의 T 세포를 배송 후 및 극저온으로 세포를 보관하기 전에 풍부화하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 35의 방법.
37. T 세포가 CD4+ T 세포 또는 이것의 하위세트, CD8+ T 세포 또는 이것의 하위세트, 또는 이것들의 혼합물이거나 이것들을 포함하거나 또는 이것들에 대해 풍부화되며, 선택적으로 CD8+ 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 샘플은 벌크 T 세포에 대해 풍부화되거나, 및/또는 벌크 T 세포를 포함하는 것인, 구체예 36의 방법.
38. 성분채집 샘플 또는 T 세포를 배송 후에 및 세포를 극저온으로 보관하기 전에 분석하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 36 또는 37의 방법.
39. 냉동 용액을 성분채집 샘플 또는 T 세포에 배송 후 및 세포를 극저온으로 보관하기 전에 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 36 내지 38 중 어느 한 구체예의 방법.
40. 냉동 용액을 성분채집 샘플 또는 T 세포에 배송 후 및 세포를 극저온으로 보관하기 전에 첨가하는 단계를 더 포함하고, 냉동 용액은 선택적으로 배송 후 및 세포를 극저온으로 보관하기 전 성분채집 샘플 또는 T 세포의 분석을 기반으로 선택되는 것인, 구체예 38의 방법.
41. 극저온으로 보관된 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 29 내지 40 중 어느 한 구체예의 방법.
42. 세포를 해동 후에 분석하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 41의 방법.
43. 해동 후에 분석을 기반으로 세포의 추가의 변형을 위한 조건을 선택하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 41의 방법.
44. 대상체로부터 유래된, 선택적으로 T 세포를 포함하는, 세포의 극저온으로 냉동된 샘플을 얻고 선택적으로 해동하는 단계, 여기서 상기 세포를 얻기 전에, 세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월의 기간 동안, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년의 기간 동안 극저온으로 냉동되어 있는 단계; 세포를 재조합 항원 수용체를 발현하도록 변형시키는 단계; 및 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
45. 샘플이 구체예 1 내지 43 중 임의의 구체예의 방법에 따라 냉동되었거나 및/또는 보관된 것인, 구체예 44의 방법.
추가적인 전형적인 구체예 I
1. 조작된 세포의 조성물의 제조 방법으로서, (a) 자극 조건 하에서, CD4+ 일차 인간 T 세포에 대해 풍부화된 T 세포를 포함하는 유입 조성물을 인큐베이션하는 단계로, 상기 자극 조건은 (i) TCR 복합체의 하나 이상의 구성요소의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 동시자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 활성화할 수 있는 자극 시약 및 (ii) 하나 이상의 사이토카인의 존재를 포함하며, 그로써 자극된 조성물이 생성되는 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 자극된 조성물에 도입함으로써 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물이 생성되는 단계를 포함하며, 유입 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년의 기간 동안 극저온으로 보관된 샘플이거나 샘플로부터 유래되는 것인, 방법.
2. 자극 시약이 TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합하는, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 일차 작용제를 포함하는 것인, 구체예 1의 방법.
3. 자극 시약이 T 세포 동시자극 분자에 특이적으로 결합하는 이차 작용제를 더 포함하고, 선택적으로 동시자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS로부터 선택되는 것인, 구체예 2의 방법.
4. 일차 및/또는 이차 시약이 항체를 포함하고, 선택적으로 자극 시약이 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 또는 이것들의 항원-결합 단편과의 인큐베이션을 포함하는 것인, 구체예 2 또는 구체예 3의 방법.
5. 일차 시약 및/또는 이차 시약이 고체 지지체의 표면에 존재하는 것인, 구체예 2 내지 4 중 어느 한 구체예의 방법.
6. 고체 지지체는 비드이거나 비드를 포함하는 것인, 구체예 5의 방법.
7. 비드가 3.5 μm 또는 약 3.5 μm보다 크지만 약 9 μm 이하 또는 약 8 μm 이하 또는 약 7 μm 이하 또는 약 6 μm 이하 또는 약 5 μm 이하의 직경을 포함하는 것인, 구체예 6의 방법.
8. 비드가 4.5 μm 또는 약 4.5 μm의 직경을 포함하는 것인, 구체예 6 또는 구체예 7의 방법.
9. 비드가 비활성인 것인, 구체예 6 내지 8 중 어느 한 구체예의 방법.
10. 비드가 폴리스티렌 표면이거나 그것을 포함하는 것인, 구체예 6 내지 9 중 어느 한 구체예의 방법.
11. 비드가 자성이거나 초상자성인 것인, 구체예 6 내지 10 중 어느 한 구체예의 방법.
12. 비드 대 세포의 비율이 3:1 미만인 것인, 구체예 6 내지 11 중 어느 한 구체예의 방법.
13. 비드 대 세포의 비율이 2:1 내지 0.5:1 또는 약 2:1 내지 0.5:1인 것인, 구체예 6 내지 12 중 어느 한 구체예의 방법.
14. 비드 대 세포의 비율이 1:1 또는 약 1:1인 것인, 구체예 6 내지 13 중 어느 한 구체예의 방법.
15. 도입 단계가 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터로 자극된 조성물의 세포를 형질도입시키는 단계를 포함하는 것인, 구체예 1 내지 14 중 어느 한 구체예의 방법.
16. 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 것인, 구체예 15의 방법.
17. 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인 것인, 구체예 15 또는 구체예 16의 방법.
18. 도입 단계가 형질 도입 보조제의 존재 하에 수행되는 것인, 구체예 15 내지 17 중 어느 한 구체예의 방법.
19. 도입 단계가 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 자극된 조성물의 세포를 트랜스펙션하는 단계를 포함하는 것인, 구체예 1 내지 18 중 어느 한 구체예의 방법.
20. 벡터가 트랜스포존, 선택적으로 잠자는 미녀 (SB) 트랜스포존 또는 피기백 (Piggybac) 트랜스포존인 것인, 구체예 19의 방법.
21. 조작된 조성물을 조작된 세포의 증식 또는 팽창을 촉진하는 조건 하에서 배양함으로써, 조작된 T 세포를 포함하는 유출 조성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 1 내지 20 중 어느 한 구체예의 방법.
22. 자극 시약이 컬티베이션 전에 조작된 조성물로부터 제거되는 것인, 구체예 21의 방법.
23. 비드를 제거하는 단계가 조작된 조성물의 세포를 자기장에 노출하는 단계를 포함하는 것인, 구체예 22의 방법.
24. 컬티베이션 단계의 적어도 일부가 연속 혼합 및/또는 관류와 함께 수행되는 것인, 구체예 21 내지 23 중 어느 한 구체예의 방법.
25. 조작된 세포 조성물의 제조 방법으로서, (a) 자극 조건 하에서, CD4+ 및 CD8+ 일차 인간 T 세포 중 하나 또는 둘 다에 대해 풍부화된 일차 T 세포를 포함하는 유입 조성물을 인큐베이션하는 단계로, 상기 자극 조건은 (i) TCR 복합체의 하나 이상의 구성요소의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 동시자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 활성화할 수 있는 자극 시약 및 (ii) 하나 이상의 사이토카인의 존재를 포함하며, 그로써 자극된 조성물이 생성되는 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 자극된 조성물에 도입함으로써 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물이 생성되는 단계를 포함하며, 유입 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년의 기간 동안 극저온으로 보관된 샘플이거나 샘플로부터 유래되는 것인, 방법.
26. 자극 시약이 TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합하는, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 일차 작용제를 포함하는 것인, 구체예 24 또는 구체예 35의 방법.
27. 자극 시약이 T 세포 동시자극 분자에 특이적으로 결합하는 이차 작용제를 더 포함하고, 선택적으로 동시자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS로부터 선택되는 것인, 구체예 26의 방법.
28. 일차 및/또는 이차 작용제가 항체를 포함하고, 선택적으로 자극 시약이 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 또는 이것들의 항원-결합 단편과의 인큐베이션을 포함하는 것인, 구체예 26 또는 구체예 27의 방법.
29. 일차 시약 및/또는 이차 시약이 고체 지지체의 표면에 존재하는 것인, 구체예 26 내지 28 중 어느 한 구체예의 방법.
30. 고체 지지체는 비드이거나 비드를 포함하는 것인, 구체예 29의 방법.
31. 비드가 3.5 μm 또는 약 3.5 μm보다 크지만 약 9 μm 이하 또는 약 8 μm 이하 또는 약 7 μm 이하 또는 약 6 μm 이하 또는 약 5 μm 이하의 직경을 포함하는 것인, 구체예 6의 방법.
32. 비드가 4.5 μm 또는 약 4.5 μm의 직경을 포함하는 것인, 구체예 30 또는 구체예 31의 방법.
33. 비드가 비활성인 것인, 구체예 30 내지 32 중 어느 한 구체예의 방법.
34. 비드가 폴리스티렌 표면이거나 그것을 포함하는 것인, 구체예 30 내지 33 중 어느 한 구체예의 방법.
35. 비드가 자성이거나 초상자성인 것인, 구체예 30 내지 34 중 어느 한 구체예의 방법.
36. 비드 대 세포의 비율이 3:1 미만인 것인, 구체예 30 내지 35 중 어느 한 구체예의 방법.
37. 비드 대 세포의 비율이 2:1 내지 0.5:1 또는 약 2:1 내지 0.5:1인 것인, 구체예 30 내지 36 중 어느 한 구체예의 방법.
38. 비드 대 세포의 비율이 1:1 또는 약 1:1인 것인, 구체예 30 내지 37 중 어느 한 구체예의 방법.
39. 도입 단계가 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터로 자극된 조성물의 세포를 형질도입시키는 단계를 포함하는 것인, 구체예 24 내지 38 중 어느 한 구체예의 방법.
40. 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 것인, 구체예 39의 방법.
41. 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인 것인, 구체예 39 또는 구체예 40의 방법.
42. 도입 단계가 형질 도입 보조제의 존재 하에 수행되는 것인, 구체예 24 내지 41 중 어느 한 구체예의 방법.
43. 도입 단계가 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 자극된 조성물의 세포를 트랜스펙션하는 단계를 포함하는 것인, 구체예 24 내지 38 중 어느 한 구체예의 방법.
44. 벡터가 트랜스포존, 선택적으로 잠자는 미녀 (SB) 트랜스포존 또는 피기백 트랜스포존인 것인, 구체예 43의 방법.
45. 조작된 세포 조성물이 자극 시약을 포함하지 않거나 및/또는 자극 시약이 컬티베이션 단계 전에 조성물로부터 실질적으로 제거되어 있으며, 상기 자극 시약은 TCR 복합체의 하나 이상의 구성요소의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 동시자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 시약을 포함하는 것인, 구체예 24 또는 구체예 25의 방법.
46. 컬티베이션 단계가 적어도 유출 조성물이 T 세포의 한계값 수를 포함할 때까지 수행되는 것인, 구체예 21 내지 45 중 어느 한 구체예의 방법.
47. 컬티베이션 단계가 T 세포의 한계값 수에 도달한 후 적어도 하루 동안 계속되는 것인, 구체예 46의 방법.
48. 컬티베이션 단계에 후속적으로, 유출 조성물의 세포를 수집하는 단계가 이어지는 것인, 구체예 21 내지 47 중 어느 한 구체예의 방법.
49. 유출 조성물의 세포를 극저온 보존 및/또는 대상체에의 투여를 위해, 선택적으로 제약학적으로 허용되는 부형제의 존재 하에 제제화하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 21 내지 48 중 어느 한 구체예의 방법.
50. 유출 조성물의 세포가 동결보호제의 존재 하에 제제화되는 것인, 구체예 49의 방법.
51. 동결보호제가 DMSO를 포함하는 것인, 구체예 50의 방법.
52. 유출 조성물의 세포가 용기, 선택적으로 바이알 또는 주머니에서 제제화되는 것인, 구체예 49 내지 51 중 어느 한 구체예의 방법.
53. CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 인큐베이션 단계 전에 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 1 내지 38 중 어느 한 구체예의 방법.
54. 분리 단계가, 선택적으로 양성 또는 음성 선택에 의하여, CD4 및/또는 CD8의 표면 발현을 기반으로 하여 세포를 선택하는 단계를 포함하는 것인, 구체예 53의 방법.
55. 분리 단계가 면역친화도-기반 선택을 수행하는 것을 포함하는 것인, 구체예 53 또는 구체예 54의 방법.
56. 생물학적 샘플이 대상체로부터 얻어진 일차 T 세포를 포함하는 것인, 구체예 53 내지 55 중 어느 한 구체예의 방법.
57. 대상체가 인간 대상체인 것인, 구체예 56의 방법.
58. 생물학적 샘플이 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초혈 단핵세포 (PBMC) 샘플, 미분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집 생성물, 또는 백혈구성분채집 생성물이거나 이것들을 포함하는 것인, 구체예 53 내지 55 중 어느 한 구체예의 방법.
59. 생물학적 샘플이 극저온 보존된 성분채집 생성물 또는 극저온 보존된 백혈구성분채집 생성물이거나 이것을 포함하는 것인, 구체예 53 내지 55 중 어느 한 구체예의 방법.
60. 재조합 수용체가 질환, 장애 또는 상태의 세포 또는 조직과 관련된, 세포 또는 조직에 특이적인, 및/또는 세포 또는 조직에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것인, 구체예 1 내지 59 중 어느 한 구체예의 방법.
61. 질환, 장애 또는 상태가 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암인 것인, 구체예 60의 방법.
62. 표적 항원이 종양 항원인 것인, 구체예 60 또는 구체예 61의 방법.
63. 표적 항원이 5T4, 8H9, avb6 인티그린, B7-H6, B 세포 성숙 항원 (BCMA), CA9, 암-고환 항원, 탄산 탈수효소 9 (CAIX), CCL-1, CD19, CD20, CD22, CEA, B형 간염 표면 항원, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 암종배아 항원 (CEA), CE7, 사이클린, 사이클린 A2, c-Met, 이중 항원, EGFR, 상피 당단백질 2 (EPG-2), 상피 당단백질 40 (EPG-40), EPHa2, 에프린B2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 다이머, EGFR vIII, 에스트로겐 수용체, 태아 AchR, 엽산 수용체 알파, 엽산 결합 단백질 (FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, G250/CAIX, GD2, GD3, gp100, G 단백질 결합된 수용체 5D (GPCR5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erbB2), HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), 키나아제 비활성 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자 (L1-CAM), 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MART-1, 메소텔린, 쥐과의 CMV, 뮤신 1 (MUC1), MUC16, NCAM, NKG2D, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, O-아세틸화된 GD2 (OGD2), 종양태아 항원, 흑색종의 우선적으로 발현된 항원 (PRAME), PSCA, 프로게스테론 수용체, 서비빈, ROR1, TAG72, tEGFR, VEGF 수용체, VEGF-R2, 빌름스 종양 1 (WT-1), 병원체-특이적 항원 및 보편적 태그와 관련된 항원 중에서 선택되는 것인, 구체예 60 내지 62 중 어느 한 구체예의 방법.
64. 재조합 수용체가 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 이것들의 항원 결합 단편이거나 이것을 포함하는 것인, 구체예 1 내지 63 중 어느 한 구체예의 방법.
65. 재조합 수용체가 키메릭 항원 수용체 (CAR)인 것인, 구체예 1 내지 64 중 어느 한 구체예의 방법.
66. 재조합 수용체가 항-CD19 CAR인 것인, 구체예 1 내지 65 중 어느 한 구체예의 방법.
67. 키메릭 항원 수용체가 항원-결합 도메인을 포함하는 것인, 구체예 65의 방법.
68. 선택적으로 단일 사슬 단편인, 항원-결합 도메인이 항체 또는 이것의 항체 단편이거나 항체 또는 이것의 항체 단편을 포함하는 것인, 구체예 67의 방법.
69. 단편이 가요성 링크에 의해 연결된 항체 가변 영역을 포함하는 것인, 구체예 68의 방법.
70. 단편이 scFv를 포함하는 것인, 구체예 68 또는 구체예 69의 방법.
71. 키메릭 항원 수용체가 추가로 스페이서 및/또는 힌지 영역을 포함하는 것인, 구체예 67 내지 70 중 어느 한 구체예의 방법.
72. 키메릭 항원 수용체가 세포내 신호전달 영역을 포함하는 것인, 구체예 67 내지 71 중 어느 한 구체예의 방법.
73. 세포내 신호전달 영역이 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 구체예 72의 방법.
74. 세포내 신호전달 도메인이 일차 신호전달 도메인, T 세포에서 일차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체 (TCR) 구성요소의 신호전달 도메인, 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 또는 이것들을 포함하는 것인, 구체예 73의 방법.
75. 세포내 신호전달 도메인이 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이것의 신호전달 부분이거나 또는 이것을 포함하는 것인, 구체예 74의 방법.
76. 키메릭 항원 수용체가 추가로 세포외 도메인과 세포내 신호전달 영역 사이에 배치된 경막 도메인을 포함하는 것인, 구체예 72 내지 75 중 어느 한 구체예의 방법.
77. 세포내 신호전달 영역이 추가로 동시자극 신호전달 영역을 포함하는 것인, 구체예 72 내지 76 중 어느 한 구체예의 방법.
78. 동시자극 신호전달 영역이 T 세포 동시자극 분자의 세포내 신호전달 도메인 또는 이것의 신호전달 부분을 포함하는 것인, 구체예 77의 방법.
79. 동시자극 신호전달 영역이 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 이것들의 신호전달 부분을 포함하는 것인, 구체예 77 또는 제78항의 방법.
80. 동시자극 신호전달 영역이 경막 도메인과 세포내 신호전달 영역 사이에 있는 것인, 구체예 77 내지 79 중 어느 한 구체예의 방법.
81. 한계값 수 또는 더 큰 수의 세포를 포함하는 유출 조성물이 85%보다 큰 또는 약 85%보다 큰, 90%보다 큰 또는 약 90%보다 큰 또는 95%보다 큰 또는 약 95%보다 큰 방법의 반복 중에서 제조된 것인, 구체예 46 또는 구체예 47의 방법.
82. 구체예 1 내지 79 중 어느 한 구체예의 방법에 의해 제조된 조작된 세포를 포함하는 조성물.
83. 추가로 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 구체예 82의 조성물.
84. 동결보호제, 선택적으로 DMSO를 포함하는, 구체예 82 또는 구체예 83의 조성물.
85. 구체예 80 내지 82 중 어느 한 구체예의 조성물, 및 대상체에게 유출 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 제조 물품.
86. 대상체가 질환 또는 상태를 가지며, 선택적으로 재조합 수용체가 질환 또는 상태와 관련된, 또는 질환 또는 상태의 세포에서 발현되거나 세포에 존재하는 항원을 특이적으로 인식하거나 특이적으로 결합하는 것인, 구체예 85의 제조 물품.
87. 유출 조성물이 조작된 CD4+ T 세포의 조성물인 것인, 구체예 85 또는 구체예 86의 제조 물품.
88. 유출 조성물이 조작된 CD8+ T 세포의 조성물인 것인, 구체예 85 또는 구체예 86의 제조 물품.
89. 구체예 1 내지 25 또는 26 내지 81 중 어느 한 구체예의 방법에 의해 제조된 조작된 CD4+ T 세포의 조성물, 제2항 내지 제23항, 제25항 또는 제26항 내지 제81항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 조작된 CD8+ T 세포의 조성물, 및 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포를 대상체에게 투여하기 위한 설명서를 포함하는 제조 물품.
90. 설명서가 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 대상체에게 별도로 투여하는 것을 명시하는 것인, 구체예 89의 제조 물품.
91. 설명서가 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 대상체에게 원하는 비율로 별도로 투여하는 것을 명시하는 것인, 구체예 89 또는 구체예 90의 제조 물품.
추가적인 전형적인 구체예 II
1. 생물학적 샘플을 보관하는 방법으로서, 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계, 생물학적 샘플을 둘 이상의 별도의 용기로 나누는 단계, 생물학적 샘플을 극저온 보존하는 단계, 극저온 보존된 생물학적 샘플을 보관하는 단계를 포함하는 방법.
2. 대상체가 인간 대상체인 것인, 구체예 1의 방법.
3. 생물학적 샘플이 성분채집 생성물 또는 백혈구성분채집 생성물인 것인, 구체예 1 또는 구체예 2의 방법.
4. 둘 이상의 별도의 용기가 각각 극저온 주머니 및/또는 극저온 바이알로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 구체예 1 내지 3 중 어느 한 구체예의 방법.
5. 둘 이상의 별도의 용기가 그 위에 특유한 식별자를 함유하는 것인, 구체예 1 내지 4 중 어느 한 구체예의 방법.
6. 특유한 식별자가 문서 정보, RFID 태그, QR 코드, 및/또는 바코드 중 임의로 하나 이상을 포함하는 것인, 구체예 5의 방법.
7. 특유한 식별자 정보가 다음 카테고리 중 임의의 하나 이상에 대한 정보를 포함하는 것인, 구체예 5 또는 구체예 6의 방법: 대상체의 정체성, 샘플 보관의 위치, 보관 및/또는 취급 설명서, 수령일, 극저온 보존일, 유효 기한, 및 의도된 용도.
8. 생물학적 샘플이 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 또는 40년 이상의 기간 동안 보관되는 것인, 구체예 1 내지 7 중 어느 한 구체예의 방법.
9. 생물학적 샘플의 보관 방법으로서, (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (b) 생물학적 샘플을 하나 이상의 용기에 극저온 보존하는 단계; 및 (c) 극저온 보존된 샘플을 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 또는 40년 이상의 기간 동안 보관하는 단계를 포함하는 방법.
10. 대상체가 인간 대상체인 것인, 구체예 9의 방법.
11. 생물학적 샘플이 성분채집 생성물 또는 백혈구성분채집 생성물인 것인, 구체예 9 또는 구체예 10의 방법.
12. 하나 이상의 용기가 각각 극저온 주머니 및/또는 극저온 바이알로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 구체예 9 내지 11 중 어느 한 구체예의 방법.
13. 하나 이상의 별도의 용기가 그 위에 특유한 식별자를 함유하는 것인, 구체예 9 내지 12 중 어느 한 구체예의 방법.
14. 특유한 식별자가 문서 정보, RFID 태그, QR 코드, 및/또는 바코드 중 임의로 하나 이상을 포함하는 것인, 구체예 13의 방법.
15. 특유한 식별자 정보가 다음 카테고리 중 임의의 하나 이상에 대한 정보를 포함하는 것인, 구체예 13 또는 구체예 14의 방법: 대상체의 정체성, 샘플 보관의 위치, 보관 및/또는 취급 설명서, 수령일, 극저온 보존일, 유효 기한, 및 의도된 용도.
16. 대상체에 상응하는 생물학적 샘플을 얻는 방법으로서, (a) 극저온 보존된 샘플을, 샘플을 대상체와 연관시키는 특유한 식별자를 기반으로 중심 시설에 위치시키는 단계; 및 (b) 극저온 보존된 샘플을 얻는 단계를 포함하는 방법.
17. 생물학적 샘플이 대상체에 유전자적으로 매치되고, 대상체에 대한 자가유래 생성물을 생성하기에 적합하며, 및/또는 대상체의 세포를 함유하는 것인, 구체예 16의 방법.
추가적인 전형적인 구체예 III
1. 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 보관하는 단계를 포함하는 방법으로서, 세포는 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 한 가지 이상의 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지고; 세포는 자동 온도 냉각기에서 샘플 및/또는 챔버가 분당 1℃ 이상의 속도로 냉각되는 적어도 한 단계를 포함하는 단계식 냉동 프로파일을 사용하여 냉동되는 것인, 방법.
2. 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 보관하는 단계를 포함하는 방법으로서, 세포는 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전의 시점에 도너로부터 얻어진 것인, 방법.
3. 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 보관하는 단계를 포함하는 방법으로서, 세포는 도너가 질환 또는 상태로 진단되지 않았거나 질환 또는 상태에 대해 알려지지 않거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심되지 않은 시점에 도너로부터 얻어졌고, 세포는 자동 온도 냉각기에서 샘플 및/또는 챔버가 분당 1℃ 이상의 속도로 냉각되는 적어도 한 단계를 포함하는 단계식 냉동 프로파일을 사용하여 냉동되는 것인, 방법.
4. (a) 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 냉동하는 단계, 및 (b) 극저온으로 냉동된 세포를 일정 기간 동안 보관하는 단계를 포함하며, 세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지거나 얻어졌고, 보관 기간 중에 도너는 질환 또는 상태에 대한 적어도 하나의 치료를 받거나 받았던 것인, 방법.
5. (a) 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 냉동하는 단계, 및 (b) 극저온으로 냉동된 세포를 일정 기간 동안 보관하는 단계를 포함하며, 세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지거나 얻어졌고, 세포는 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 또는 40년 이상의 기간 동안, 또는 도너가 세포를 필요로 할 때까지 극저온으로 보관되는 것인, 방법.
6. (a) 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 냉동하는 단계, 및 (b) 극저온으로 냉동된 세포로부터 생성된 조작된 T 세포를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지거나 얻어졌고, 냉동 단계와 투여 단계 사이에, 도너는 질환 또는 상태에 대한 적어도 하나의 치료를 받거나 받았던 것인, 방법.
7. (a) 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 냉동함으로써, 극저온으로 냉동된 세포 조성물을 생성하는 단계, 및 (b) 극저온으로 냉동된 세포 조성물의 세포를 조작하여 조작된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계를 포함하며, 세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지거나 얻어졌고, 냉동 단계와 조작 단계 사이에, 도너는 질환 또는 상태에 대한 적어도 하나의 치료를 받거나 받았던 것인, 방법.
8. 조작된 T 세포의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법으로서, 세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지거나 얻어졌고, 세포가 대상체로부터 얻어지거나 얻어진 후 및 조작된 T 세포의 투여 단계 전에, 대상체는 질환 또는 상태에 대한 적어도 하나의 치료를 받거나 받았던 것인, 방법.
9. 조작된 세포의 조성물의 제조 방법으로서, (a) 극저온으로 보관된 세포를 얻고 선택적으로 해동하는 단계, 및 (b) 재조합 수용체를 극저온으로 보관된 세포에 도입함으로써, 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 포함하며, 세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 수득된 후 극저온으로 보관되고, 극저온 보관 후 및 극저온으로 보관된 세포를 얻기 전에, 도너는 질환 또는 상태에 대한 적어도 하나의 치료를 받거나 받았던 것인, 방법.
10. 생물학적 샘플이 성분채집 샘플, 선택적으로 백혈구 성분채집 샘플이거나 또는 그것으로부터 유래되거나, 및/또는 샘플이 백혈구 및/또는 림프구를 함유하거나 및/또는 샘플 중의 세포 또는 혈액 세포가 본질적으로 백혈구로 구성되거나, 또는 샘플 중의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 샘플 중의 혈액 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 백혈구인 것인, 구체예 1 내지 9 중 어느 한 구체예의 방법.
11. 세포가 극저온으로 보관되기 전에, 혈액 세포 집단 및/또는 T 세포 집단 및/또는 T 세포 하위세트에 대한 면역친화도-기반 및/또는 표적-특이적 선택 및/또는 풍부화 단계가 수행되지 않았던 것인, 구체예 1 내지 10 중 어느 한 구체예의 방법.
12. 세포가 극저온으로 보관되기 전에, 혈액 세포 집단 및/또는 T 세포 집단에 대한 면역친화도-기반 및/또는 표적-특이적 선택 및/또는 풍부화 단계가 수행되었고, 선택적으로 방법이 상기 극저온 보관 전에 상기 선택 또는 풍부화를 수행하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 1 내지 10 중 어느 한 구체예의 방법.
13. 선택 단계 및/또는 풍부화가 면역친화도-기반 선택을 포함하거나 및/또는 양성 또는 음성 선택을 포함하는 것인, 구체예 12의 방법.
14. 선택 단계 및/또는 풍부화가 CD4+ 세포 또는 이것의 하위세트 및/또는 CD8+ 세포 또는 이것의 하위세트의 풍부화 및/또는 분리를 포함하고, CD4+ 세포 또는 이것의 하위세트의 풍부화 또는 분리는 CD8+ 세포 또는 이것의 하위세트의 선택 및/또는 분리와 별도로 또는 조합하여 수행되며, 선택적으로 CD8+ 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 구체예 12 또는 구체예 13의 방법.
15. 세포가 T 세포를 포함하거나 T 세포에 대해 풍부화되는 것인, 구체예 1 내지 14 중 어느 한 구체예의 방법.
16. T 세포가 CD4+ T 세포 또는 이것의 하위세트, CD8+ T 세포 또는 이것의 하위세트, 또는 이것들의 혼합물을 포함하거나 이것들에 대해 풍부화되고, CD8+ T 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ T 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 구체예 15의 방법.
17. 세포를 극저온으로 보관하기 전에, 세포를 극저온 보존 배지와 조합하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 1 내지 16 중 어느 한 구체예의 방법.
18. 극저온 보존 배지는 약 10%의 다이메틸 설폭사이드 (DMSO) 및 혈청 단백질, 선택적으로 인간 혈청 알부민, 선택적으로 약 4%의 인간 혈청 알부민을 포함하고, 및/또는 냉동 용액 및/또는 생물학적 샘플의 최종 농도는 부피로 약 1% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 9%, 또는 약 6% 내지 약 9%의 DMSO를 포함하거나 및/또는 부피로 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5%, 또는 약 10%의 DMSO를 포함하는 것인, 구체예 17의 방법.
19. 극저온 보관이 분당 1℃ 또는 약 1℃의 속도로, 선택적으로 온도가 -80℃ 또는 약 -80℃에 도달할 때까지 온도를 저하시키는 것을 포함하는 것인, 구체예 2 또는 구체예 4 내지 18 중 어느 한 구체예의 방법.
20. 세포가 액체 질소의 증기상에 배치된 용기에서 극저온으로 보관되고, 용기는 선택적으로 주머니 또는 바이알인 것인, 구체예 1 내지 19 중 어느 한 구체예의 방법.
21. 세포가 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 또는 40년 이상의 기간 동안 극저온으로 보관되는 것인, 구체예 1 내지 20 중 어느 한 구체예의 방법.
22. 세포가 일정 기간 동안 보관되고, 그 기간 후, 조성물 중의 생존 세포 또는 생존성 T 세포 또는 이것의 아형 또는 하위세트의 백분율이 약 24% 내지 약 100%이거나 또는 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90%인 것인, 구체예 1 내지 21 중 어느 한 구체예의 방법.
23. 질환이 암, 염증성 질환 또는 상태, 자가면역 질환 또는 상태, 또는 감염성 질환 또는 상태인 것인, 구체예 1 내지 22 중 어느 한 구체예의 방법.
24. 암이 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 전-림프구성 백혈병, 털세포 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 널-급성 림프모세포성 백혈병, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 큰 B 세포 림프종, 다발성 골수종, 여포성 림프종, 비장의, 변연 지대 림프종, 맨틀 세포 림프종, 무통증 B 세포 림프종, 또는 급성 골수성 백혈병인 것인, 구체예 23의 방법.
25. 암이 ROR1, EGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, MUC1, MUC16, B 세포 성숙 항원 (BCMA), FCRL5/FCRH5, GPRC5D, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 암종배아 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1 (WT-1), 및 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1) 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 포함하는 것인, 구체예 23 또는 24의 방법.
26. 치료가 화학요법, 방사선요법, 수술, 세포 요법, 및/또는 감량 치료인 것인, 구체예 1 내지 25 중 어느 한 구체예의 방법.
27. 치료가 다음의 치료 중 하나 이상을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 것인, 구체예 26의 방법: 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 무스틴, 빈크리스틴, 프로카르바진, 프레드니솔론, 블레오마이신, 빈블라스틴, 다카르바진, 에토포시드, 시스플라틴, 에피루비신, 카페시타빈, 폴린산, 오살리플라틴, 작은 분자 억제제, 면역 세포, 천연 살해 세포, 림포카인-활성화된 살해 세포, 세포독성 T 세포, 수지상 세포, 4000 cGy 방사선, 자가유래 줄기 세포 구제, 줄기 세포 이식편, 골수 이식편, 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT), CAR T 세포 요법, 티스아겐레클레우셀(Tisagenlecleucel), 악시카브타진 실로류셀(Axicabtagene ciloleucel), 시타라빈, 고용량 시타라빈, 다우노루비신 (다우노마이신), 이다루비신, 클라드리빈, 보르테조밉, 카르필조밉, 탈리도미드, 레날리도미드, 포말리도미드, 코르티코스테로이드, 프레드니손, 덱사메타손, 알킬화제, 클로람부실, 벤다무스틴, 이포스파미드, 백금 약물, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 퓨린 유사체, 플루다라빈, 펜토스타틴, 클라드리빈, 항-대사산물, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 프랄라트렉세이트, 빈크리스틴, 독소루비신, 미토크산트론, 블레오마이신, 프로테아좀 억제제, 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제, 로미뎁신, 벨리노스타트, 키나아제 억제제, 이브루티닙, 이델라리십, 항체, 항-CD20 항체, 리툭시맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 항-CD52 항체, 알렘투주맙, 항-CD30 항체, 브렌툭시맙, 베도틴, 인터페론, 면역조절제, 탈리도미드, CHOP, CHOP+R (또는 R-CHOP), CVP, EPOCH, EPOCH+R, DHAP, DHAP+R (또는 R-DHAP), 베네토클락스, 메틸프레드니솔론, 또는 브루톤스 티로신 키나아제 억제제 (BTKi).
28. 도너 또는 대상체가 인간인 것인, 구체예 1 내지 27 중 어느 한 구체예의 방법.
29. 극저온 보관 전에, 선택적으로 하나 이상의 표현형 마커에 대한 세포의 표면 발현을 평가함으로써 세포를 분석하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 1 내지 28 중 어느 한 구체예의 방법.
30. 극저온으로 보관된 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 1 내지 29 중 어느 한 구체예의 방법.
31. 세포의 극저온 보관 및/또는 해동 후에, 선택적으로 재조합 단백질, 선택적으로 재조합 수용체, 선택적으로 T 세포 수용체 (TCR), 키메릭 수용체, 및/또는 키메릭 항원 수용체이거나 이것들을 포함하는 재조합 또는 외인성 분자를 발현하기 위해 세포를 조작하는 단계를 더 포함하는 것인, 구체예 1 내지 30 중 어느 한 구체예의 방법.
32. 재조합 분자가 질환 또는 상태에 의해 발현된, 그것에 의해 특이적으로 발현된 항원, 또는 그것과 관련된 세포를 특이적으로 인식하거나 결합하는 재조합 수용체인 것인, 구체예 31의 방법.
33. 세포의 수는 도너 또는 대상체로부터 수집될 때, 및/또는 성분채집 샘플에서 총 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 또는 그 이상의 총 세포 또는 총 핵화된 세포이거나 약 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 또는 그 이상의 총 세포 또는 총 핵화된 세포이거나 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 이하의 총 세포 또는 총 핵화된 세포이거나 약 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 이하의 총 세포 또는 총 핵화된 세포인 것인, 구체예 1 내지 32 중 어느 한 구체예의 방법.
34. 샘플을 극저온으로 보관하기 전에 샘플로부터의 T 세포를 풍부화하는 단계를 더 포함하는, 구체예 1 내지 33 중 어느 한 구체예의 방법.
35. T 세포가 CD4+ T 세포 또는 이것의 하위세트, CD8+ T 세포 또는 이것의 하위세트, 또는 이것들의 혼합물이거나 이것들을 포함하거나 이것들에 대해 풍부화되고, CD8+ T 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ T 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되며 및/또는 샘플은 벌크 T 세포에 대해 풍부화되는 것인, 구체예 34의 방법.
36. 샘플을 극저온으로 보관하기 전에 극저온 배지에 샘플을 제제화하는 단계를 더 포함하는, 구체예 1 내지 35 중 어느 한 구체예의 방법.
37. 세포를 극저온 냉동 전이나 후에 보관 시설에 배송하는 단계를 더 포함하는, 구체예 1 내지 36 중 어느 한 구체예의 방법.
38. 보관 시설이 중심 또는 공통 저장소 보관 시설인 것인, 구체예 37의 방법.
39. 샘플이 냉각된 환경에서 보관 시설로 배송되는 것인, 구체예 37 또는 38의 방법.
40. 세포를 배송한 후 및 세포를 극저온으로 보관하기 전에 샘플로부터의 T 세포를 풍부화하는 단계를 더 포함하는, 구체예 36 내지 39 중 어느 한 구체예의 방법.
41. T 세포가 CD4+ T 세포 또는 이것의 하위세트, CD8+ T 세포 또는 이것의 하위세트, 또는 이것들의 혼합물이거나 이것들을 포함하거나 이것들에 대해 풍부화되고, CD8+ T 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ T 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 및/또는 벌크 T 세포를 포함하는 것인, 구체예 40의 방법.
42. 세포를 배송한 후 및 극저온으로 보관하기 전에 샘플 및/또는 T 세포를 극저온 배지에 제제화하는 단계를 더 포함하는, 구체예 40 또는 구체예 41의 방법.
43. 극저온으로 보관된 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는, 구체예 1 내지 42 중 어느 한 구체예의 방법.
44. 샘플이 가공, 극저온 보존, 및/또는 보관 중에 세포의 카탈로그를 작성하기 위한 하나 이상의 코드 또는 식별자로 표시된 용기에 넣어지는 것인, 구체예 1 내지 43 중 어느 한 구체예의 방법.
45. 하나 이상의 코드 또는 식별자가 문서 식별자, 바코드, QR 코드, RFID, 또는 트랜스폰더를 포함하는 것인, 구체예 44의 방법.
46. 하나 이상의 코드 또는 식별자가 도너, 샘플, 바이알, 용기, 질환, 및/또는 보관 시설 중 하나 이상의 정체성에 상응하거나 그것을 나타내는 것인, 구체예 44 또는 구체예 45의 방법.
47. 하나 이상의 코드 또는 식별자가 환자 정체성 팔찌 또는 병원 또는 의료 또는 수집 시설 시스템 또는 문서 업무 상에 나타나는 코드에 상응하는 것인, 구체예 44 내지 46 중 어느 한 구체예의 방법.
48. 극저온으로 보관된 세포를 구체예 1 내지 47 중 어느 한 구체예의 방법을 통해 얻고 선택적으로 해동하는 단계로서, 세포는 적어도 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 또는 40년의 기간 동안 극저온으로 보관되어 있었던 단계; 재조합 수용체를 자극된 조성물에 도입함으로써, 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계, 및 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
49. 치료가 조작된 T 세포 또는 극저온으로 냉동된 조성물의 세포를 포함하지 않는 것인, 구체예 1 내지 48 중 어느 한 구체예의 방법.

Claims (49)

  1. 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 보관하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    세포는 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 한 가지 이상의 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지고; 및
    세포는 자동 온도 냉각기에서 샘플 및/또는 챔버가 분당 1℃ 이상의 속도로 냉각되는 적어도 한 단계를 포함하는 단계식 냉동 프로파일을 사용하여 냉동되는 것인, 방법.
  2. 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 보관하는 단계를 포함하는 방법으로서, 세포는 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전의 시점에 도너로부터 얻어진 것인, 방법.
  3. 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 보관하는 단계를 포함하는 방법으로서, 세포는 도너가 질환 또는 상태로 진단되지 않았거나 질환 또는 상태에 대해 알려지지 않거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심되지 않은 시점에 도너로부터 얻어졌고, 및
    세포는 자동 온도 냉각기에서 샘플 및/또는 챔버가 분당 1℃ 이상의 속도로 냉각되는 적어도 한 단계를 포함하는 단계식 냉동 프로파일을 사용하여 냉동되는 것인, 방법.
  4. - 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 냉동하는 단계, 및
    - 극저온으로 냉동된 세포를 일정 기간 동안 보관하는 단계를 포함하며,
    세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지거나 얻어졌고, 및
    보관 기간 중에, 도너는 질환 또는 상태에 대한 적어도 하나의 치료를 받거나 받았던 것인, 방법.
  5. - 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 냉동하는 단계, 및
    - 극저온으로 냉동된 세포를 일정 기간 동안 보관하는 단계를 포함하며,
    세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지거나 얻어졌고, 및
    세포는 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 또는 40년 이상의 기간 동안, 또는 도너가 세포를 필요로 할 때까지 극저온으로 보관되는 것인, 방법.
  6. - 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 냉동하는 단계, 및
    - 극저온으로 냉동된 세포로부터 생성된 조작된 T 세포를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지거나 얻어졌고, 및
    냉동 단계와 투여 단계 사이에, 도너는 질환 또는 상태에 대한 적어도 하나의 치료를 받거나 받았던 것인, 방법.
  7. - 도너로부터 유래된 생물학적 샘플로부터의 세포를 극저온으로 냉동함으로써, 극저온으로 냉동된 세포 조성물을 생성하는 단계, 및
    - 극저온으로 냉동된 세포 조성물의 세포를 조작하여 조작된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계를 포함하며,
    세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지거나 얻어졌고,
    냉동 단계와 조작 단계 사이에, 도너는 질환 또는 상태에 대한 적어도 하나의 치료를 받거나 받았던 것인, 방법.
  8. 조작된 T 세포의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법으로서,
    세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 얻어지거나 얻어졌고,
    세포가 대상체로부터 얻어지거나 얻어진 후 및 조작된 T 세포의 투여 단계 전에, 대상체는 질환 또는 상태에 대한 적어도 하나의 치료를 받거나 받았던 것인, 방법.
  9. 조작된 세포의 조성물의 제조 방법으로서,
    - 극저온으로 보관된 세포를 얻고 선택적으로 해동하는 단계, 및
    - 재조합 수용체를 극저온으로 보관된 세포에 도입함으로써, 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 포함하며,
    세포는 (i) 도너가 질환 또는 상태로 진단되거나, 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 여겨지거나 또는 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심된 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 치료를 받기 전; 또는 (ii) 도너가 질환 또는 상태에 대해 난치성인 것으로 여겨졌거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 치료 양생법 후에 재발을 경험한 후, 및 도너가 질환 또는 상태에 대한 후속 치료를 받기 전인 시점에 도너로부터 수득된 후 극저온으로 보관되고,
    극저온 보관 후 및 극저온으로 보관된 세포를 얻기 전에, 도너는 질환 또는 상태에 대한 적어도 하나의 치료를 받거나 받았던 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 성분채집 샘플, 선택적으로 백혈구 성분채집 샘플이거나 또는 그것으로부터 유래되거나, 및/또는 샘플이 백혈구 및/또는 림프구를 함유하거나 및/또는 샘플 중의 세포 또는 혈액 세포가 본질적으로 백혈구로 구성되거나, 또는 샘플 중의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 샘플 중의 혈액 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 백혈구인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세는 극저온으로 보관되기 전에, 혈액 세포 집단 및/또는 T 세포 집단 및/또는 T 세포 하위세트에 대한 면역친화도-기반 및/또는 표적-특이적 선택 및/또는 풍부화 단계가 수행되지 않았던 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 극저온으로 보관되기 전에 혈액 세포 집단 및/또는 T 세포 집단에 대한 면역친화도-기반 및/또는 표적-특이적 선택 및/또는 풍부화 단계가 수행되었고, 선택적으로 방법이 상기 극저온 보관 전에 상기 선택 또는 풍부화를 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 선택 단계 및/또는 풍부화는 면역친화도-기반 선택을 포함하거나 및/또는 양성 또는 음성 선택을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    선택 단계 및/또는 풍부화는 CD4+ 세포 또는 이것의 하위세트 및/또는 CD8+ 세포 또는 이것의 하위세트의 풍부화 및/또는 분리를 포함하고, CD4+ 세포 또는 이것의 하위세트의 풍부화 또는 분리는 CD8+ 세포 또는 이것의 하위세트의 선택 및/또는 분리와 별도로 또는 조합하여 수행되며,
    선택적으로 CD8+ 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 T 세포를 포함하거나 T 세포에 대해 풍부화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 세포가\는 CD4+ T 세포 또는 이것의 하위세트, CD8+ T 세포 또는 이것의 하위세트, 또는 이것들의 혼합물을 포함하거나 이것들에 대해 풍부화되고, CD8+ T 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ T 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 극저온으로 보관하기 전에, 세포를 극저온 보존 배지와 조합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 극저온 보존 배지는 약 10%의 다이메틸 설폭사이드 (DMSO) 및 혈청 단백질, 선택적으로 인간 혈청 알부민, 선택적으로 약 4%의 인간 혈청 알부민을 포함하고, 및/또는 냉동 용액 및/또는 생물학적 샘플의 최종 농도는 부피로 약 1% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 9%, 또는 약 6% 내지 약 9%의 DMSO를 포함하거나 및/또는 부피로 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5%, 또는 약 10%의 DMSO를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제2항 또는 제4항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 극저온 보관은 분당 1℃ 또는 약 1℃의 속도로, 선택적으로 온도가 -80℃ 또는 약 -80℃에 도달할 때까지 온도를 저하시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 액체 질소의 증기상에 배치된 용기에서 극저온으로 보관되고, 용기는 선택적으로 주머니 또는 바이알인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 또는 40년 이상의 기간 동안 극저온으로 보관되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 일정 기간 동안 보관되고, 그 기간 후, 조성물 중의 생존 세포 또는 생존성 T 세포 또는 이것의 아형 또는 하위세트의 백분율이 약 24% 내지 약 100%이거나 또는 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90%인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 질환은 암, 염증성 질환 또는 상태, 자가면역 질환 또는 상태, 또는 감염성 질환 또는 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 암은 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 전-림프구성 백혈병, 털세포 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 널-급성 림프모세포성 백혈병, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 큰 B 세포 림프종, 다발성 골수종, 여포성 림프종, 비장의, 변연 지대 림프종, 맨틀 세포 림프종, 무통증 B 세포 림프종, 또는 급성 골수성 백혈병인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 암은 ROR1, EGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, MUC1, MUC16, B 세포 성숙 항원 (BCMA), FCRL5/FCRH5, GPRC5D, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 암종배아 항원 (CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1 (WT-1), 및 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1) 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 화학요법, 방사선요법, 수술, 세포 요법, 및/또는 감량 치료인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 치료는 다음의 치료 중 하나 이상을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 무스틴, 빈크리스틴, 프로카르바진, 프레드니솔론, 블레오마이신, 빈블라스틴, 다카르바진, 에토포시드, 시스플라틴, 에피루비신, 카페시타빈, 폴린산, 오살리플라틴, 작은 분자 억제제, 면역 세포, 천연 살해 세포, 림포카인-활성화된 살해 세포, 세포독성 T 세포, 수지상 세포, 4000 cGy 방사선, 자가유래 줄기 세포 구제, 줄기 세포 이식편, 골수 이식편, 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT), CAR T 세포 요법, 티스아겐레클레우셀, 악시카브타진 실로류셀, 시타라빈, 고용량 시타라빈, 다우노루비신 (다우노마이신), 이다루비신, 클라드리빈, 보르테조밉, 카르필조밉, 탈리도미드, 레날리도미드, 포말리도미드, 코르티코스테로이드, 프레드니손, 덱사메타손, 알킬화제, 클로람부실, 벤다무스틴, 이포스파미드, 백금 약물, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 퓨린 유사체, 플루다라빈, 펜토스타틴, 클라드리빈, 항-대사산물, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 프랄라트렉세이트, 빈크리스틴, 독소루비신, 미토크산트론, 블레오마이신, 프로테아좀 억제제, 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제, 로미뎁신, 벨리노스타트, 키나아제 억제제, 이브루티닙, 이델라리십, 항체, 항-CD20 항체, 리툭시맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 항-CD52 항체, 알렘투주맙, 항-CD30 항체, 브렌툭시맙, 베도틴, 인터페론, 면역조절제, 탈리도미드, CHOP, CHOP+R (또는 R-CHOP), CVP, EPOCH, EPOCH+R, DHAP, DHAP+R (또는 R-DHAP), 베네토클락스, 메틸프레드니솔론, 또는 브루톤스 티로신 키나아제 억제제 (BTKi).
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 도너 또는 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 극저온 보관 전에, 선택적으로 하나 이상의 표현형 마커에 대한 세포의 표면 발현을 평가함으로써 세포를 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 극저온으로 보관된 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 극저온 보관 및/또는 해동 후에, 선택적으로 재조합 단백질, 선택적으로 재조합 수용체, 선택적으로 T 세포 수용체 (TCR), 키메릭 수용체, 및/또는 키메릭 항원 수용체이거나 이것들을 포함하는 재조합 또는 외인성 분자를 발현하기 위해 세포를 조작하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 재조합 분자는 질환 또는 상태에 의해 발현된, 그것에 의해 특이적으로 발현된 항원, 또는 그것과 관련된 세포를 특이적으로 인식하거나 결합하는 재조합 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 수는 도너 또는 대상체로부터 수집될 때, 및/또는 성분채집 샘플에서 총 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 또는 그 이상의 총 세포 또는 총 핵화된 세포이거나 약 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 또는 그 이상의 총 세포 또는 총 핵화된 세포이거나 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 이하의 총 세포 또는 총 핵화된 세포이거나 약 500 x 106, 1000 x 106, 2000 x 106, 3000 x 106, 4000 x 106, 또는 5000 x 106 이하의 총 세포 또는 총 핵화된 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 극저온으로 보관하기 전에 샘플로부터의 T 세포를 풍부화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 이것의 하위세트, CD8+ T 세포 또는 이것의 하위세트, 또는 이것들의 혼합물이거나 이것들을 포함하거나 이것들에 대해 풍부화되고, 선택적으로 CD8+ T 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ T 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되며 및/또는 샘플은 벌크 T 세포에 대해 풍부화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 극저온으로 보관하기 전에 극저온 배지에 샘플을 제제화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 극저온 냉동 전이나 후에 보관 시설에 배송하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 보관 시설은 중심 또는 공통 저장소 보관 시설인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 샘플은 냉각된 환경에서 보관 시설로 배송되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 배송한 후 및 세포를 극저온으로 보관하기 전에 샘플로부터의 T 세포를 풍부화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 이것의 하위세트, CD8+ T 세포 또는 이것의 하위세트, 또는 이것들의 혼합물이거나 이것들을 포함하거나 이것들에 대해 풍부화되고, CD8+ T 세포의 하위세트 및/또는 CD4+ T 세포의 하위세트는 선택적으로 기억 세포, 중추 기억 T (TCM) 세포, 이펙터 기억 세포 (TEM), 줄기 중추 기억 (TSCM) 세포, T 이펙터 (TE) 세포, 이펙터 기억 RA T (TEMRA) 세포, 나이브 T (TN) 세포 및/또는 조절 T (TREG) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 및/또는 벌크 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 세포를 배송한 후 및 극저온으로 보관하기 전에 샘플 및/또는 T 세포를 극저온 배지에 제제화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 극저온으로 보관된 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 가공, 극저온 보존, 및/또는 보관 중에 세포의 카탈로그를 작성하기 위한 하나 이상의 코드 또는 식별자로 표시된 용기에 넣어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 하나 이상의 코드 또는 식별자는 문서 식별자, 바코드, QR 코드, RFID, 또는 트랜스폰더를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 하나 이상의 코드 또는 식별자는 도너, 샘플, 바이알, 용기, 질환, 및/또는 보관 시설 중 하나 이상의 정체성에 상응하거나 그것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 코드 또는 식별자가 환자 정체성 팔찌 또는 병원 또는 의료 또는 수집 시설 시스템 또는 문서 업무 상에 나타나는 코드에 상응하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 극저온으로 보관된 세포를 구체예 1 내지 47 중 어느 한 구체예의 방법을 통해 얻고 선택적으로 해동하는 단계로서, 세포는 적어도 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 또는 40년의 기간 동안 극저온으로 보관되어 있었던 단계;
    재조합 수용체를 자극된 조성물에 도입함으로써, 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계, 및
    세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 조작된 T 세포 또는 극저온으로 냉동된 조성물의 세포를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
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