CN110199016A - 残余肿瘤浸润淋巴细胞及其制备和使用方法 - Google Patents

残余肿瘤浸润淋巴细胞及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

在一些实施方式中，本发明公开了将治疗有效量的数量扩增的肿瘤浸润淋巴细胞递送至有需要的患者用于治疗癌症的方法，该数量扩增的肿瘤浸润淋巴细胞从肿瘤残余物获得。

Description

残余肿瘤浸润淋巴细胞及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本国际申请要求2016年11月17日提交的美国临时申请号62/423,750和2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460,441的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明的一些实施方式公开了用肿瘤残余物(tumor remnant)扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法和组合物。
背景技术
使用肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating Lymphocyte,TIL)的过继性转移(adoptive transfer)治疗体积大、难治性癌症代表了预后不良的患者的有效疗法。Gattinoni等Nat.Rev.Immunol.2006，6，383-393。使用自体TIL的过继T细胞疗法在>25％转移性黑色素瘤患者中提供了高达55％的客观缓解率(objective response rate)和持久消退(durable regression)。成功的免疫疗法需要大量的TIL，以及商业化需要稳健和可靠的方法。由于细胞扩增的技术、物流和监管问题，这是一项需要实现的挑战。由于其速度和效率，基于IL-2的TIL扩增后进行“快速扩增过程(rapid expansion process，REP)”已成为TIL扩增的优选方法。Dudley等Science 2002，298，850-54；Dudley等J.Clin.Oncol.2005，23，2346-57；Dudley等J.Clin.Oncol.2008，26，5233-39；Riddell等Science 1992，257，238-41；Dudley等J.Immunother.2003，26，332-42。从切除的肿瘤产生TIL包括：将肿瘤切碎成1-3mm3的碎片的步骤，和在pre-快速扩增方案(pre-REP或启动)步骤中在白细胞介素2(IL-2)的存在下扩增TIL的步骤。在pre-REP步骤期间，肿瘤驻留(tumor-resident)的免疫细胞迁移并增殖，并且使用经辐照的外周血单核细胞(PBMC)饲养细胞、抗CD3抗体(OKT-3，muromonab)和IL-2对这些TIL进行第二次REP过程，该过程大大增加了它们的数量。迄今为止，所有TIL扩增过程都在pre-REP过程后丢弃了残余的肿瘤碎片。
先前已探索了直接酶消化切除的肿瘤作为pre-REP的替代方案，但据报道其产生更少的TIL培养物，导致其相较于使用IL-2的pre-REP启动过程获得TIL的能力降低。Dudley等J.Immunother.2003，26，332-42。因此，在TIL用于癌症治疗的发展中，并未进一步探索消化。
目前为止，由pre-REP和REP过程获得的TIL在TIL的临床研究中占主导地位，其提供了适度的临床反应，该领域仍具有挑战性，尤其是在将TIL疗法从黑色素瘤向其他肿瘤类型延伸方面。Goff等J.Clin.Oncol.2016，34，2389-97；Dudley等J.Clin.Oncol.2008，26，5233-39；Rosenberg等Clin.Cancer Res.2011，17，4550-57.在扩增期间，重点放在TIL的选择上以选择特定子集(例如CD8+T细胞)或靶向司机突变(driver mutation)，例如突变的ERBB2IP表位，或者KRAS原癌基因中的司机突变。Tran等N.Engl.J.Med.2016，375，2255-62；Tran等Science 2014，344，641-45.然而，这种选择方法，即使它们可以被开发为在更大的临床试验中显示效力，但是它们也显著增加了进行TIL治疗的持续时间、复杂性和成本，并且限制了在不同癌症类型中广泛应用TIL疗法的可能性。因此，迫切需要发展能够提供具有改善性能的TIL以用于癌症治疗的方法。
本发明提供了意想不到的发现：具有改善性能的TIL可以从基于肿瘤残余细胞的过程获得，并且这种残余TIL(rTIL，remnant TIL)在表现型和功能方面显著不同于正常迁移性TIL(eTIL，emigrant TIL)。与现有的基于eTIL的疗法相比，在癌症免疫疗法中使用rTIL和rTIL与eTIL的组合提供了显著优势。
发明内容
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL，emergent TIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞(tumor remnant cell)；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物(T cell exhaustion marker)的水平降低，并且其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1、CTLA-4及其组合。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1、CTLA-4及其组合，以及
其中，肿瘤组织选自黑色素瘤组织、头颈部肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、卵巢肿瘤组织和急性髓样白血病骨髓或肿瘤组织。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1、CTLA-4及其组合，以及
其中，经辐照的饲养细胞包含经辐照的同种异体外周血单核细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，IL-2以3000IU/mL的初始浓度存在于第二细胞培养基中，并且OKT-3抗体以30ng/mL的初始浓度存在于第二细胞培养基中。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，相对于eTIL，rTIL中的CD8+和CD4+T细胞的至少一种T细胞衰竭标志物减少至少10％。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，T细胞衰竭标志物是CD8+T细胞中的LAG3标志物，并且其中，相对于eTIL，rTIL中的LAG3标志物减少至少2倍。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，T细胞衰竭标志物是CD8+T细胞中的LAG3标志物，并且其中，相对于eTIL，rTIL中的LAG3标志物减少至少3倍。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，T细胞衰竭标志物是CD4+T细胞中的TIM3标志物，并且其中，相对于eTIL，rTIL中的TIM3标志物减少至少2倍。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，通过流式细胞术检测不到rTIL中的TIM3标志物和LAG3标志物。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，相对于eTIL中CD56+的表达，rTIL中CD56+的表达减少至少3倍。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，相对于eTIL中CD69+的表达，rTIL中CD69+的表达减少至少2倍。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，消化混合物包含脱氧核糖核酸酶、胶原酶和透明质酸酶。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，第一细胞培养基还包含细胞因子，该细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21，以及它们的组合。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，第二细胞培养基还包含细胞因子，该细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21，以及它们的组合。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，其中，该治疗包括向患者递送治疗有效量的rTIL，其中，该rTIL根据包括以下步骤的方法制备：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，第二细胞培养基还包含细胞因子，该细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21，以及它们的组合。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，第二细胞培养基还包含细胞因子，该细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21，以及它们的组合，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭(non-myeloablativeLymphodepletion)方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，第二细胞培养基还包含细胞因子，该细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21，以及它们的组合，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用给患者；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，第二细胞培养基还包含细胞因子，该细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21，以及它们的组合，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用给患者；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者，
其中，癌症选自黑色素瘤、双重难治性黑色素瘤(double-refractory melanoma)、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、急性髓样白血病、结直肠癌、肉瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)和三阴性乳腺癌。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，第二细胞培养基还包含细胞因子，该细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21，以及它们的组合，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者，其中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以60mg/m2/天的剂量持续2天施用环磷酰胺、然后以25mg/m2/天的剂量持续5天施用氟达拉滨的步骤；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用给患者；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，以及
其中，第二细胞培养基还包含细胞因子，该细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21，以及它们的组合，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用给患者；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者，
其中，所述高剂量IL-2方案包括每8小时静脉推注(bolus)600,000或720,000IU/kg阿地白介素或其生物仿制药或变体15分钟，直至耐受。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，并且其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1、CTLA-4及其组合。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1、CTLA-4及其组合，
其中，肿瘤组织选自黑色素瘤组织、头颈部肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、卵巢肿瘤组织和急性髓样白血病骨髓或肿瘤组织。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1、CTLA-4及其组合，
其中，经辐照的饲养细胞包括经辐照的同种异体外周血单核细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，
其中，IL-2以约3000IU/mL的初始浓度存在于第二细胞培养基中，并且OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在于第二细胞培养基中。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织以提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，
其中，相对于eTIL，rTIL中的CD8+和CD4+T细胞的至少一种T细胞衰竭标志物减少至少10％。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，
其中，T细胞衰竭标志物是CD8+T细胞中的LAG3标志物，并且其中，相对于eTIL，rTIL中的LAG3标志物减少至少2倍。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，
其中，T细胞衰竭标志物是CD8+T细胞中的LAG3标志物，并且其中，相对于eTIL，rTIL中的LAG3标志物减少至少3倍。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，
其中，T细胞衰竭标志物是CD4+T细胞中的TIM3标志物，并且其中，相对于eTIL，rTIL中的LAG3标志物减少至少2倍。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，通过流式细胞术检测不到rTIL中的TIM3标志物和LAG3标志物。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，相对于eTIL中的CD56+表达，rTIL中的CD56+表达降低至少3倍。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，相对于eTIL中的CD69+表达，rTIL中的CD69+表达增加至少2倍。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，消化混合物包含脱氧核糖核酸酶、胶原酶和透明质酸酶。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第一细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子。
在一个实施方式中，本发明包括一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，其中，所述治疗包括向患者递送治疗有效量的rTIL，其中，所述rTIL是根据包括以下步骤的方法制备的：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用给患者；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用给患者；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者，
其中，癌症选自黑色素瘤、双重难治性黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、肾细胞癌、急性髓样白血病、结直肠癌、肉瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)和三阴性乳腺癌。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者，其中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以60mg/m2/天的剂量持续2天施用环磷酰胺、然后以25mg/m2/天的剂量持续5天施用氟达拉滨的步骤；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用给患者；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用给患者；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者，
其中，所述高剂量IL-2方案包括每8小时静脉推注600,000或720,000IU/kg阿地白介素或其生物仿制药或变体15分钟，直至耐受。
在一个实施方式中，本发明包括一种产生数量扩增的肿瘤残余细胞的方法，所述肿瘤残余细胞包括用于过继性T细胞疗法的来自患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方式中，本发明的方法可包括从患者获得肿瘤组织的步骤，其中，肿瘤组织包含TIL。在一些实施方式中，本发明的方法可包括破碎肿瘤组织的步骤。在一些实施方式中，本发明的方法可包括以下步骤：在透气性容器中，用细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)和其他T细胞生长因子或激动性抗体处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和数量扩增的TIL。在一些实施方式中，本发明的方法可包括移除数量扩增的TIL的步骤。在一些实施方式中，本发明的方法可包括将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞的步骤。在一些实施方式中，本发明的方法可包括用细胞培养基、经辐照的饲养细胞、抗CD3单克隆抗体(muromonab或OKT-3)和IL-2处理肿瘤残余细胞以提供数量扩增的肿瘤残余细胞的步骤。在一些实施方式中，根据本发明的方法制备的肿瘤残余细胞可包括：至少一种选自TIM3、LAG3、PD-1及其组合的标志物表达水平降低的TIL。在一些实施方式中，肿瘤组织可选自黑素瘤肿瘤组织、头颈部肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、肺肿瘤组织和结直肠肿瘤组织。
在一个实施方式中，本发明可包括一种治疗需要这种治疗的患者的肿瘤的方法。在一些实施方式中，治疗可以包括向患者递送治疗有效量的数量扩增的肿瘤残余细胞，其中，可以根据本文描述的任何方法来制备数量扩增的肿瘤残余细胞。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本发明的以下详细描述。
图1显示了制备肿瘤消化溶液的示例图。
图2显示了肿瘤消化过程的示例性流程图。在该示例中，两种消化方法同时进行，并作为两种不同的pre-REP的一部分分别接种，用于比较各消化方法的功效。
图3显示了eTIL和rTIL中关键标志物的差异表型表达。
图4显示了在快速扩增之前通过(A)2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)和(B)Mitotracker对eTIL和rTIL的研究以评估代谢能力。
图5显示了实验结果，其中，关于CD4+和CD8+T细胞，用具有布雷菲德菌素A的CD3/CD28/4-1BB磁珠刺激eTIL和rTIL过夜。加入PMA和离子霉素，处理4-5小时。通过细胞内流式细胞术分析来评估干扰素-γ(n＝3)。
图6显示了结果：在快速扩增期间(A)rTIL扩增并且(B)保持表型上不同于eTIL。
图7显示了使用本发明的rTIL治疗患者的示例性方法。
图8显示了使用本发明的rTIL治疗患者的方法的示例性时间线。
图9显示了eTIL和rTIL中TCRvβ谱系(repetoire)的多样性(即多样性得分)。
图10显示了eTIL和rTIL中共有CDR3的百分比。
图11显示了三阴性乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾癌和黑素瘤中的细胞增殖分析，其中，与单独的eTIL相比，当用抗CD3抗体与rTIL共培养时，来自CD4+或CD8+群的eTIL在所有五种肿瘤中都表现出增殖能力的增强，如通过Cell Trace染料中的移位(或染料稀释)所证明的。红色代表eTIL，蓝色代表与rTIL共培养时的eTIL。
图12显示了通过Nanostring分析制作的热图(heat map)，其显示eTIL和rTIL的基因表达谱显著不同。
图13显示了通过Nanostring分析制作的图，其显示与eTIL相比，rTIL中几个基因显著上调或下调。
图14显示了克隆型(clonotype)图，其显示来自卵巢癌的eTIL和rTIL(三个eTIL/rTIL对)之间的前50个共有CDR3。
图15显示了克隆型图，其显示来自肾癌的eTIL和rTIL(三个eTIL/rTIL对)之间的前50个共有CDR3。
图16显示了克隆型图，其显示来自三阴性乳腺癌的eTIL和rTIL(三个eTIL/rTIL对)之间的前50个共有CDR3。
序列表说明
SEQ ID NO：1是muromonab重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是muromonab轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是重组人IL-2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是阿地白介素的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是重组人IL-4蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是重组人IL-7蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是重组人IL-15蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是重组人IL-21蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。本文提及的所有专利和出版物均以引用的方式整体并入本文。
定义
术语“衰竭的表型”和“衰竭标志物”是指表征T细胞衰竭的细胞表面标志物，该T细胞衰竭响应于抗原对慢性T细胞受体(TCR)的刺激。表现出衰竭的表型的T细胞表达抑制性受体，例如T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(TIM3或TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG3或LAG-3)、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(TIGIT)以及程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，并且缺乏效应细胞因子的产生和增加有效免疫反应的能力。在Yi等，Immunology 2010，129，474-81中描述了T细胞中的衰竭，其公开内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“共同施用”，“共同给药”，“与...组合施用”，“与...组合给药”，“同时地”和“共同地”包括向人受试者施用两种以上活性药物成分，使得活性药物成分和/或其代谢物同时存在于人受试者中。共同施用包括以单独的组合物同时施用，以单独的组合物在不同时间施用，或施用有两种以上活性药物成分的组合物。以单独的组合物同时施用和施用有两种药剂的组合物也包括在本发明的方法中。
术语“体内”是指在受试者体内发生的事件。
术语“体外”是指在受试者体外发生的事件。体外测定包括使用活细胞或死细胞的基于细胞的测定，并且还可以包括不使用完整细胞的无细胞测定。
术语“抗原”是指诱导免疫应答的物质。在一些实施方式中，抗原是能够被抗体或TCR(如果由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递)结合的分子。如本文所用，术语“抗原”还包括T细胞表位。另外，抗原能够被免疫系统识别。在一些实施方式中，抗原能够诱导体液免疫应答或细胞免疫应答，导致B淋巴细胞和/或T淋巴细胞的活化。在某些情况下，这可能需要抗原含有Th细胞表位或与Th细胞表位连接。抗原还可以具有一个以上表位(例如B-表位和T-表位)。在一些实施方式中，抗原优选通常以高度特异性和选择性的方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可由其他抗原诱导的多种其他抗体或TCR反应。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指如本文所述的化合物或化合物组合的量足以实现预期应用，包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可以根据预期应用(体外或体内)，或受治疗的人类受试者和疾病状况(例如受试者的体重、年龄和性别)、疾病状况的严重程度、给药方式等而变化，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。该术语还适用于将在靶细胞中诱导特定应答(例如血小板粘附和/或细胞迁移的减少)的剂量。具体剂量将根据所选定的具体化合物、要遵循的施用方案、化合物是否与其他化合物联合施用、施用时间、施用组织，以及携带化合物的物理递送系统而变化。治疗有效量可以是“抗肿瘤有效量”和/或“肿瘤抑制有效量”，其可以是待施用的本发明组合物的精确量，可以由医生在考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)状况的个体差异的情况下确定。通常可以说，包含本文所述的细胞毒性淋巴细胞或rTIL的药物组合物的施用剂量可以为104至1011细胞/kg体重(例如105至106、105至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011，或109至1010细胞/kg体重)，包括在这些范围内的所有整数值。细胞毒性淋巴细胞或rTIL组合物也可以这些剂量多次施用。细胞毒性淋巴细胞或rTIL可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用(参见例如Rosenberg等，N.Eng.J.Med.319:1676，1988)。通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
本文使用的术语“治疗效果”包括人受试者的治疗益处和/或预防益处。预防效果包括延迟或消除疾病或病症的出现，延迟或消除疾病或病症的症状的发作，减缓、停止或逆转疾病或病症的进展，或其任何组合。
“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”旨在包括任何和所有溶剂、分散培养基、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，以及惰性成分。这种药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂在活性药物成分中的用途是本领域熟知的。除非任何常规的药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则考虑其在本发明的治疗组合物中的应用。其他活性药物成分，例如其他药物，也可以掺入所述组合物和方法中。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等是指获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良作用而言，该效果可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人类中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中，预防疾病的发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展或进展；(c)缓解疾病，即引起疾病消退和/或缓解一种以上疾病症状。“治疗”还意味着包括递送药剂以提供药理学作用，即使在没有疾病或病症的情况下也是如此。例如“治疗”包括递送可在没有疾病的情况下引发免疫应答或赋予免疫力的组合物，例如在疫苗的情况下。
当涉及核酸或蛋白质的部分使用时，术语“异源”表示核酸或蛋白质包含两个以上在自然界中彼此不存在相同关系的子序列。例如核酸通常是重组产生的，具有来自无关基因的两个以上序列，其被排列以产生新的功能性核酸，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区，或来自不同来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示该蛋白质包含两个以上在自然界中彼此不存在相同关系的子序列(例如融合蛋白)。
术语“快速扩增”是指抗原特异性TIL的数量在一周的时间内增加至少约3倍(或4倍，5倍，6倍，7倍，8倍或9倍)，更优选在一周的时间内增加至少约10倍(或20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，或90-倍)，或最优选在在一周的时间内增加至少约100倍。本文概述了许多快速扩增方案。
本文中的“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”是指最初作为白细胞获得的细胞群，其已经离开受试者的血流并迁移至肿瘤中。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17CD4+T细胞、天然杀伤细胞、树突细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代和次代TIL。“原代TIL”是如本文所述从患者组织样品中获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，并且“次代TIL”是如本文所讨论的已经扩增或增殖的任何TIL细胞群，包括但不限于大量TIL(bulkTIL)和扩增的TIL(“REP TIL”或“后REP(post-REP)TIL”)。在某些实施方式中，术语“原代TIL”可包括rTIL，以及eTIL和rTIL的混合物。
本文的“细胞群”(包括TIL)是指许多具有共同特征的细胞。一般而言，群的数量通常在1×106至1×1010，不同的TIL群包括不同的数量。例如在IL-2存在下原代TIL的初始增长导致大量TIL群大约为1×108个细胞。通常进行REP扩增以提供1.5×109至1.5×1010个细胞用于输注。
术语“外周血单核细胞”和“PBMC”是指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(例如T细胞、B细胞和NK细胞)和单核细胞。优选地，外周血单核细胞是同种异体外周血单核细胞。PBMC是一种抗原呈递细胞。
本文的“冷冻保存的TIL”是指原代TIL、大量TIL或扩增的TIL(REP TIL)在约-150℃至-60℃的范围内进行处理和储存。用于冷冻保存的一般方法也在本文其他地方描述。为清楚起见，可区分“冷冻保存的TIL”与冷冻组织样品(其可用作包括rTIL的原代TIL的来源)。
“解冻的冷冻保存的TIL”在本文中是指先前冷冻保存然后处理以恢复至室温或更高温度(包括但不限于细胞培养温度或可以将TIL施用于患者的温度)的TIL(例如rTIL)群。
在两个以上核酸或多肽的上下文中，术语“序列同一性”、“百分比同一性”和“序列百分比同一性”是指：当进行比较和比对(如果需要的话，引入间隔)以获得最大对应性时，不考虑任何保守性氨基酸取代作为序列同一性的一部分，两个以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量同一性百分比。本领域已知各种算法和软件可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的合适程序包括例如可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站获得的BLAST程序套件。可以使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(Genentech，加利福尼亚州南旧金山)或可从DNASTAR获得的MegAlign是可用于比对序列的其他公共可用软件程序。本领域技术人员可以通过特定的比对软件确定用于最大比对的适当参数。在某些实施例中，使用比对软件的默认参数。
术语“保守性氨基酸取代”是指不消除抗体与抗原结合的氨基酸序列修饰。保守性氨基酸取代包括用同一类的氨基酸取代这一类中的氨基酸，其中，类由共同的物理化学氨基酸侧链性质和在自然界中发现的同源蛋白质中(例如通过标准的Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵)所测定的高取代频率定义。已经对六类一般氨基酸侧链进行了分类，包括：I类(Cys)；II类(Ser，Thr，Pro，Ala，Gly)；III类(Asn，Asp，Gln，Glu)；IV类(His，Arg，Lys)；V类(Ile，Leu，Val，Met)；和VI类(Phe，Tyr，Trp)。例如用Asp取代另一种III类残基(如Asn、Gln或Glu)是保守性取代。因此，蛋白质中预计为非必需氨基酸残基优选被来自相同类别的另一种氨基酸残基替换。鉴定不消除抗原结合的氨基酸保守性取代的方法是本领域熟知的(参见，例如Brummell等，Biochemistry 1993，32，1180-1187；Kobayashi等，ProteinEng.1999，12，879-884(1999)；和Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国1997，94，412-417)。
“聚乙二醇化”是指经修饰的抗体或融合蛋白或其片段，其通常在一个以上PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下与聚乙二醇(PEG)(如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。聚乙二醇化可以例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。优选地，聚乙二醇化通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。待聚乙二醇化的蛋白质或抗体可以是非糖基化蛋白质或抗体。聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体，如例如欧洲专利号EP 0154316和EP 0401384以及美国专利号5,824,778中所述，其公开内容通过引用并入本文。
术语“OKT-3”(在本文中也称为“OKT3”)是指单克隆抗体或其生物仿制药或变体，包括针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中CD3受体的人、人源化、嵌合或鼠抗体，并且包括商业上可获得的形式，例如OKT-3(30ng/mL，MACS GMP CD3纯，Miltenyi Biotech，Inc.，圣地亚哥，CA，美国)和muromonab或其变体、保守性氨基酸取代、糖型(glycoform)或生物仿制药。Muromonab的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。能够产生OKT-3的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，American Type CultureCollection)，且分配了ATCC登录号CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也保藏在欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC，European Collection of Authenticated Cell Cultures)且分配了目录号86022706。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆(可从BioLegend，圣地亚哥，CA，美国商购)，也称为T3和CD3ε。
表1：Muromonab的氨基酸序列
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)是指称为白细胞介素-2的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式，其保守性氨基酸取代、糖型、生物仿制药及变体。IL-2描述于例如Nelson，J.Immunol.2004，172，3983-88和Malek，Annu.Rev.Immunol.2008，26，453-79，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的重组人IL-2的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：3)。例如术语IL-2包括人重组形式的IL-2，例如阿地白介素(PROLEUKIN，可从多个供应商商购，各个单独使用的小瓶2200万IU)，以及由CellGenix，Inc.，Portsmouth，NH，美国(CELLGROgMP)或ProSpec-Tany TechnoGeneLtd.，东布朗士维克(East Brunswick)，NJ，美国(目录号CYT-209-b)商业供应的重组IL-2的形式，以及其他供应商提供的其他商业等同物。阿地白介素(脱-丙氨酰-1(des-alanyl-1)，丝氨酸-125人IL-2)是IL-2的非糖基化人重组形式，分子量约为15kDa。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：4)。术语IL-2还包括如本文所述的聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化的IL2前药NKTR-214，可从Nektar Therapeutics，南旧金山，CA，美国获得。适用于本发明的NKTR-214和聚乙二醇化IL-2描述于美国专利申请公开号US2014/0328791A1和国际专利申请公开号WO2012/065086A1中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的缀合的IL-2的替代形式描述于美国专利号4,766,106、5,206,344、5,089,261和4,902,502中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利号6,706,289中，其公开内容通过引用并入本文。
表2：白细胞介素的氨基酸序列
术语“IL-4”(在本文中也称为“IL4”)是指称为白细胞介素4的细胞因子，其由Th2T细胞和嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。IL-4调节幼稚辅助性T细胞(Th0细胞)向Th2T细胞的分化。Steinke和Borish，Respir.Res.2001，2，66-70.在被IL-4激活之后，Th2T细胞随后在正反馈环中产生另外的IL-4。IL-4还刺激B细胞增殖和II类MHC表达，并诱导B细胞转换为IgE和IgG1表达。适用于本发明的重组人IL-4可从多个供应商商购，包括ProSpec-Tany TechnoGeneLtd.，东布朗士维克，NJ，美国(目录号CYT-211)和ThermoFisherScientific，Inc.，沃尔瑟姆，MA，美国(人IL-4重组蛋白，目录号Gibco CTP0043)。适用于本发明的重组人IL-4的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：5)。
术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)是指称为白细胞介素7的糖基化组织衍生细胞因子，其可以从基质细胞和上皮细胞以及树突状细胞中获得。Fry和Mackall，Blood2002，99，3892-904。IL-7可以刺激T细胞的生长。IL-7与IL-7受体结合，IL-7受体是由IIL-7受体α和常见γ链受体(common gamma chain receptor)组成的异二聚体，其在一系列信号中对胸腺内的T细胞发育和外周存活具有重要意义。适用于本发明的重组人IL-4可从多个供应商商购获得，包括ProSpec-Tany TechnoGeneLtd.，东布朗士维克，NJ，美国(目录号CYT-254)和ThermoFisher Scientific，Inc.，沃尔瑟姆，MA，美国(人IL-7重组蛋白，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人IL-7的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：6)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)是指称为白细胞介素-15的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式，其保守性氨基酸取代、糖型、生物仿制药及变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri，Blood 2001，97，14-32中，其公开内容通过引用并入本文。IL-15与IL-2共享β和γ信号传导受体亚单位。重组人IL-15是非糖基化多肽单链，含有114个氨基酸(和N-末端甲硫氨酸)，分子量为12.8kDa。重组人IL-15可从多个供应商商购，包括ProSpec-Tany TechnoGeneLtd.，东布朗士维克，NJ，美国(目录号CYT-230-b)和ThermoFisher Scientific，Inc.，沃尔瑟姆，MA，美国(人IL-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人IL-15的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：7)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)是指称为白细胞介素-21的多效细胞因子蛋白，包括所有形式的IL-21，包括人和哺乳动物形式，其保守性氨基酸取代、糖形式、生物仿制药及变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard，Nat.Rev.Drug.Disc.2014，13，379-95，其公开内容通过引用并入本文。IL-21主要由天然杀伤T细胞和活化的人CD4+T细胞产生。重组人IL-21是非糖基化多肽单链，含有132个氨基酸，分子量为15.4kDa。重组人IL-21可从多个供应商商购，包括ProSpec-Tany TechnoGeneLtd.，东布朗士维克，NJ，美国(目录号CYT-408-b)和ThermoFisher Scientific，Inc.，沃尔瑟姆，MA，美国(人IL-21重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人IL-21的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：8)。
术语“生物仿制药”是指生物制品，包括单克隆抗体或融合蛋白，尽管临床上非活性成分存在细微差别，但是其与美国许可的参考生物制品非常相似，并且就产品的安全性、纯度和效力而言，该生物制品和参考产品没有临床意义上的差异。此外，生物类似(similarbiological)或“生物仿制(biosimilar)”药是一种生物药(biological medicine)，其类似于已经被欧洲药品管理局(EMA，European Medicines Agency)授权使用的另一种生物药。“生物仿制药”一词也被其他国家和地区监管机构同义使用。生物制品或生物药是由生物来源(例如细菌或酵母)制造或衍生的药物。它们可以由相对小的分子组成，例如人胰岛素或促红细胞生成素，或复杂分子例如单克隆抗体。例如如果参考IL-2蛋白是阿地白介素(PROLEUKIN)，则药物监管机构批准的关于阿地白介素的蛋白质是与阿地白介素“生物类似的”或者是阿地白介素的“生物仿制药”。在欧洲，生物类似或“生物仿制”药是一种生物药，其类似于已经被欧洲药品管理局(EMA)授权使用的另一种生物药。经修订，欧洲生物类似(药)应用的相关法律依据是法规(EC)No 726/2004第6条和指令2001/83/EC第10(4)条，因此在欧洲，根据法规(EC)No 726/2004第6条和指令2001/83/EC第10(4)条的规定，生物仿制药可以获得授权、批准授权或申请主题被授权。已经授权的原始生物药产品在欧洲可称为“参考药品”。CHMP生物仿制药产品指南(Guideline on Similar Biological MedicinalProducts)中概述了将产品视为生物仿制药的一些要求。此外，产品特定指南(包括与单克隆抗体生物仿制药有关的指南)由EMA以产品为基础提供，并在其网站上公布。在质量特征、生物活性、作用机制、安全性和/或功效方面，本文所述的生物仿制药可以与参考药品类似。另外，生物仿制药可以用于或旨在用于治疗与参考药物产品相同的病症。因此，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药品相似或高度相似的质量特征。或者，或另外，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药品相似或高度相似的生物活性。或者，或另外，如本文所述的生物仿制药可被认为具有与参考药品相似或高度相似的安全性。或者，或另外，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药物产品类似或高度相似的功效。如本文所述，将欧洲的生物仿制药与已经由EMA授权的参考药品进行比较。然而，在某些情况下，可以将生物仿制药与在某些研究中已经在欧洲经济区之外授权的生物医药产品(非欧洲经济区授权的“比较物”)进行比较。这些研究包括例如某些临床和体内非临床研究。如本文所用，术语“生物仿制药”还涉及已经或可以与非EEA授权的比较物比较的生物医药产品。某些生物仿制药是蛋白质，例如抗体、抗体片段(例如抗原结合部分)和融合蛋白。蛋白质生物仿制药可以具有在氨基酸结构中具有不显著影响多肽功能的微小修饰(包括例如氨基酸的缺失、添加和/或取代)的氨基酸序列。生物仿制药可包含与其参考药品的氨基酸序列具有97％以上序列同一性的氨基酸序列，例如97％，98％，99％或100％。生物仿制药可包含与参考药物翻译后修饰不同的一种以上翻译后修饰，例如但不限于糖基化、氧化、脱酰胺和/或截短，条件是该差异不会导致药品的安全性和/或功效发生变化。生物仿制药可具有与参考药品相同或不同的糖基化模式。特别地，尽管不是唯一的，如果差异涉及或旨在解决与参考医药产品相关的安全问题，则生物仿制药可具有不同的糖基化模式。另外，生物仿制药可以在例如其强度、药物形式、制剂、赋形剂和/或呈递方面偏离参考药物产品，条件是不损害药物产品的安全性和功效。与参考药物产品相比，生物仿制药可包括例如药代动力学(PK)和/或药效学(PD)概况的差异，但仍被认为与参考药物产品足够相似，以获得授权或认为适合授权。在某些情况下，与参考药品相比，生物仿制药表现出不同的结合特性，其中，管理机构如EMA认为不同的结合特性不是生物仿制产品授权的障碍。“生物仿制药”一词也被其他国家和地区监管机构同义使用。
如本文所用，术语“变体”包括但不限于如下的抗体或融合蛋白：其通过在参考抗体的氨基酸序列内或附近的某些位置处的一个以上取代、缺失和/或添加而包含不同于参考抗体的氨基酸序列。与参考抗体的氨基酸序列相比，变体在其氨基酸序列中可包含一个以上保守性取代。保守性取代可涉及例如取代相似带电荷或不带电荷的氨基酸。该变体保留了特异性结合参考抗体的抗原的能力。术语变体还包括聚乙二醇化的抗体或蛋白质。
“聚乙二醇化”是指修饰的抗体或其片段，其通常在一个或多个PEG基团与抗体、抗体片段或蛋白质连接的条件下与聚乙二醇(PEG)(如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。聚乙二醇化可以例如增加抗体或蛋白质(例如血清)的生物学半衰期。优选地，聚乙二醇化通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。待聚乙二醇化的蛋白质或抗体可以是非糖基化蛋白质或抗体。聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体，如例如欧洲专利号EP 0154316和EP 0401384中所述。
术语“血液恶性肿瘤”是指造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的哺乳动物癌症和肿瘤。血液恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。血液恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、急性髓样白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。术语“B细胞血液恶性肿瘤”是指影响B细胞的血液恶性肿瘤。
术语“实体瘤”是指通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。术语“实体瘤癌”是指恶性、肿瘤性或癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于肉瘤、恶性上皮肿瘤(carcinoma)和淋巴瘤，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持的基质细胞(癌细胞分散在其中并且可以提供支持的微环境)。
术语“液体肿瘤”是指本质上是流体的异常细胞团。液体肿瘤癌症包括但不限于白血病、骨髓瘤和淋巴瘤，以及其他血液恶性肿瘤。从液体肿瘤获得的TIL在本文中也可称为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。
如本文所用，术语“微环境”可以指整个实体或血液学肿瘤微环境，或指微环境内的单个细胞亚群。如本文所用，肿瘤微环境是指“细胞，可溶性因子，信号分子，细胞外基质，以及促进肿瘤转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤免受宿主免疫、促进治疗抵抗力并为显性转移灶的繁殖提供利基的机制诱因”的复杂混合物，如Swartz等，Cancer Res.，2012，72，2473中所述。虽然肿瘤表达应被T细胞识别的抗原，但由于微环境的免疫抑制，免疫系统对肿瘤的清除很少。
本文用于描述破坏肿瘤的方法的术语“破碎(fragmenting)”、“破碎(fragment)”和“破碎的(fragmented)”包括机械破碎方法，例如压碎、切片、分裂和粉碎肿瘤组织以及任何其他破坏肿瘤组织的物理结构的方法。
术语“约”和“大约”表示在统计上有意义的数值范围内。这样的范围可以在给定值或范围的一个数量级内，优选在50％内，更优选在20％内，更优选在10％内，甚至更优选在5％内。术语“约”或“大约”所包含的可允许变化取决于所研究的特定系统，并且本领域普通技术人员可以容易地理解。此外，如本文所用，术语“约”和“大约”表示大小、尺寸、配方、参数、形状和其他性质和特性不是且不必是精确的，但是根据需要可以是近似的和/或更大的或更小的，反映公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素。通常，大小、尺寸、配方、参数、形状和其他性质和特性是“约”或“近似的”，无论是否明确说明如此。应注意，具有非常不同尺寸、形状和大小的实施方式可采用所述的布置。
当在所附权利要求中以原始和修改的形式使用时，过渡术语“包括”、“基本上由…组成”和“由…组成”，定义了关于被排除在权利要求范围之外的未列举的另外的权利要求要素或步骤(如果有的话)的权利要求范围。术语“包含”旨在是包含性的或开放式的，并且不排除任何另外的、未列举的要素、方法、步骤或材料。术语“由…组成”不包括权利要求中指定的那些之外的任何元素、步骤或材料，并且在材料的情况下，术语“由...组成”不包括与指定材料相关的普通杂质。术语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制为特定元件、步骤或材料以及不会对所要求保护的发明的基本和新颖特征产生实质影响的那些。在替代实施方式中，体现本发明的本文所述的所有组合物、方法和试剂盒可以更具体地由任何过渡术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”来定义。
为避免疑义，本文旨在将结合本发明的特定方面、实施方式或实施例描述的特定特征(例如整数、特征、值、用途、疾病、配方、化合物或组)理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方式或实施例，除非与其不相容。因此，这些特征可以结合本文定义的任何定义、权利要求或实施例适当使用。本说明书中公开的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合进行组合，除了至少一些特征和/或步骤互斥的组合。本发明不限于任何公开的实施例的任何细节。本发明延伸到本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖的或新颖的组合，或者延伸到如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖的或任何新颖的组合。
扩增残余肿瘤浸润淋巴细胞的方法
在一个实施方式中，本发明包括一种在消化肿瘤后扩增残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)的方法，如本文所述。
在一个实施方式中，本发明包括一种扩增rTIL的方法，该方法包括使包含至少一种rTIL的rTIL群与IL-2接触，从而扩增rTIL。
在一个实施方式中，本发明提供了扩增rTIL群的方法，该方法包括如Jin等，J.Immunotherapy 2012，35，283-292中描述的步骤，其公开内容通过引用并入本文。例如可将肿瘤置于酶培养基中并机械破碎约1分钟。然后可将混合物在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后再次机械破碎约1分钟。在37℃、5％CO2中孵育30分钟后，肿瘤可以第三次机械破碎约1分钟。如果在第三次机械破碎后存在大块组织，可以对样品施加1或2次另外的机械解离，进行或不进行在37℃、5％CO2中的另外30分钟孵育。在最终孵育结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，可以使用Ficoll进行密度梯度分离以移除这些细胞。在24孔板(Costar 24孔细胞培养簇，平底；Corning Incorporated，Corning，NY)中开始TIL培养，各个孔可以在2mL含有IL-2(6000IU/mL；Chiron Corp.，埃默里维尔，CA)的完全培养基(CM)中接种1×106个肿瘤消化细胞或大小约1-8mm3的一个肿瘤碎片。CM由含有GlutaMAX的RPMI1640组成，补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素。可以在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气烧瓶(G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing，新布莱顿)中开始培养，各个烧瓶可以在10-40mL含有IL-2的CM中装载10-40×106个活肿瘤消化细胞或5-30个肿瘤碎片。G-Rex 10和24孔板可以在37℃、5％CO2的湿润培养箱中培养，并且在培养开始后5天，可以移除一半的培养基并用新鲜的CM和IL-2替换，并且在第5天之后，可以每2-3天更换一半培养基。如本文其他地方所述，可以使用T-175烧瓶和透气袋或透气性G-Rex烧瓶进行TIL的快速扩增方案(REP)。对于T-175烧瓶中的REP，可以将1×106个rTIL悬浮在各个烧瓶中的150mL培养基中。rTIL可以在CM和AIM-V培养基的1：1混合物(50/50培养基)中培养，培养基补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3抗体(OKT-3)。T-175烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。在第5天可以使用含有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在第7天，可以将来自2个T-175烧瓶的细胞合并在一个3L袋中，并且可以将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至300mL TIL悬浮液中。可以每天或每两天计数各个袋中的细胞数，并且可以添加新鲜培养基以使细胞计数保持在0.5-2×106个细胞/mL。对于具有100cm2透气性硅底部的500mL容量烧瓶(例如G-Rex 100，Wilson Wolf Manufacturing，如本文其他地方所述)中的REP，可以在400mL 50/50培养基中培养5×106或10×106TIL，培养基补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3抗体(OKT-3)。G-Rex100烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。在第5天，可以取出250mL上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(491g)离心10分钟。可以用150mL含有3000IU/mL IL-2的新鲜50/50培养基重新悬浮获得的TIL沉淀，并加回G-Rex 100烧瓶中。当用G-Rex 100烧瓶连续扩增TIL时，在第7天，将各个G-Rex 100中的TIL悬浮于各个烧瓶中存在的300mL培养基中，并将细胞悬浮液分成三个100mL等分试样，其可以用于接种3个G-Rex100烧瓶。然后可以向各个烧瓶中添加约150mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。然后可以使G-Rex 100烧瓶在37℃、5％CO2下孵育，并且在4天后，可以向各个G-Rex100烧瓶中添加150mL含有3000IU/mL IL-2的AIM-V。此后，可以在培养的第14天收获细胞，完成REP。
在一个实施方式中，扩增或治疗癌症的方法包括从患者肿瘤样品获得TIL的步骤。可以使用本领域已知的方法获得患者肿瘤样品。例如可以从酶促肿瘤消化物和来自锐剥离的肿瘤碎片(大小为约1至约8mm3)培养出TIL。可以通过在酶培养基(例如Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素、30U/mL DNase和1.0mg/mL胶原酶)中孵育，然后机械解离(例如使用组织解离器或破碎机)，来产生这种肿瘤消化物。通过将肿瘤置于酶培养基中并将肿瘤机械破碎约1分钟，然后在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后在上述条件下进行重复循环机械解离和孵育，直至仅存在小的组织碎片，可以产生肿瘤消化物。在该过程结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可以使用FICOLL支链型(branched)亲水性多糖进行密度梯度分离以移除这些细胞。可以使用本领域已知的替代方法，例如美国专利申请公开号2012/0244133A1中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。任何前述方法可以用于本文所述的任何实施方式中，用于扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
在一个实施方式中，可以使用任何合适的方法在透气性容器中进行rTIL的REP。例如可以在白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-15(IL-15)和/或白细胞介素-21(IL-21)存在下，使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增rTIL，例如如国际专利申请公开号WO2015/189356A1和WO2015/189356A1中所述，在此引入作为参考。非特异性T细胞受体刺激可包括，例如约30ng/mL的OKT-3，一种单克隆抗CD3抗体(可从Ortho-McNeil，拉里坦，NJ或MiltenyiBiotech，Inc.，圣地亚哥，CA，美国商购获得)。可选地在T细胞生长因子如300IU/mL IL-2或IL-15存在下，可以通过在体外用一种以上癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位)进一步刺激TIL来快速扩增TIL，所述抗原可任选地由载体表达，例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-L26-35(27L)或gp 100：209-217(210M)。其他合适的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2，或其抗原性部分。也可以通过用表达HLA-A2的抗原呈递细胞脉冲的相同癌症抗原再刺激，来快速扩增TIL。或者，可以用例如经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2进一步再刺激TIL。
在一个实施方式中，扩增TIL的方法可包括使用约5000mL至约25000mL的细胞培养基，约5000mL至约10000mL的细胞培养基，或约5800mL至约8700mL的细胞培养基。在一个实施方式中，扩增TIL的方法可包括使用约1000mL至约2000mL的细胞培养基，约2000mL至约3000mL的细胞培养基，约3000mL至约4000mL的细胞培养基，约4000mL至约5000mL细胞培养基，约5000mL至约6000mL细胞培养基，约6000mL至约7000mL细胞培养基，约7000mL至约8000mL细胞培养基，约8000mL至约9000mL细胞培养基，约9000mL至约10000mL细胞培养基，约10000mL至约15000mL细胞培养基，约15000mL至约20000mL细胞培养基，或约20000mL至约25000mL细胞培养基。在一个实施方式中，扩增TIL的数量使用不超过一种类型的细胞培养基。可以使用任何合适的细胞培养基，例如AEVI-V细胞培养基(L-谷氨酰胺，50μM硫酸链霉素和10μM硫酸庆大霉素)细胞培养基(Invitrogen，Carlsbad CA)。在这方面，本发明的方法有利地减少了扩增TIL数量所需培养基的量和培养基类型的数量。在一个实施方式中，扩增TIL的数量可以包括以不超过每三天一次或每四天一次的频率来喂养(feeding)细胞。在透气性容器中扩增细胞的数量通过降低扩增细胞所需的喂养频率而简化了扩增细胞数量所需的步骤。
在一个实施方式中，使用透气性容器进行快速扩增。此类实施方式允许细胞群从约5×105个细胞/cm2扩增至在10×106与30×106个细胞/cm2之间。在一个实施方式中，这种扩增发生在没有喂养的情况下。在一个实施方式中，只要培养基在透气烧瓶中位于约10cm的高度，这种扩增就不进行喂养。在一个实施方式中，没有喂养但是添加一种以上细胞因子。在一个实施方式中，细胞因子可以作为丸剂(bolus)添加而无需将细胞因子与培养基混合。这种容器、装置和方法在本领域中是已知的并且已经用于扩增TIL，并且包括在美国专利申请公开号US2014/0377739A1、国际专利申请公开号WO2014/210036A1、美国专利申请公开号US2013/0115617Al、国际公开号WO2013/188427A1、美国专利申请公开号US2011/0136228A1、美国专利号8,809,050、国际专利申请公开号WO2011/072088A2、美国专利申请公开号US 2016/0208216A1、美国专利申请公开号US2012/0244133A1、国际专利申请公开号WO2012/129201A1、美国专利申请公开号US2013/0102075A1、美国专利号8,956,860、国际专利申请公开号WO2013/173835A1和美国专利申请公开号US2015/0175966Al中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。这些方法也描述于Jin等，J.Immunotherapy 2012，35，283-292中，其公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 10烧瓶(Wolf ManufacturingCorporation,新布赖顿,MN,美国)。在一个实施方式中，透气性容器包括10cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器包括40mL的细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在2次培养基更换后提供1亿至3亿个TIL。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 100烧瓶(Wolf ManufacturingCorporation,新布赖顿,MN,美国)。在一个实施方式中，透气性容器包括100cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器包括450mL的细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在2次培养基更换后提供10亿至30亿个TIL。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 100M烧瓶(Wolf ManufacturingCorporation,新布赖顿,MN,美国)。在一个实施方式中，透气性容器包括100cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器包括1000mL的细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在无需更换培养基的情况下提供10亿至30亿个TIL。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 100L烧瓶(Wolf ManufacturingCorporation,新布赖顿,MN,美国)。在一个实施方式中，透气性容器包括100cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器包括2000mL的细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在无需更换培养基的情况下提供10亿至30亿个TIL。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 24孔板(Wolf ManufacturingCorporation,新布赖顿,MN,美国)。在一个实施方式中，透气性容器包括具有孔的板，其中，各个孔包括2cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器包括具有孔的板，其中，各个孔包括8mL的细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在2次培养基更换后每孔提供2千万至6千万个细胞。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 6孔板(Wolf ManufacturingCorporation,新布赖顿,MN,美国)。在一个实施方式中，透气性容器包括具有孔的板，其中，各个孔包括10cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器包括具有孔的板，其中，各个孔包括40mL的细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在2次培养基更换后每孔提供1亿至3亿个细胞。
在一个实施方式中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基未经过滤。使用未经过滤的细胞培养基可以简化扩增细胞数量所需的步骤。在一个实施方式中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基没有β-巯基乙醇(BME)。
在一个实施方式中，该方法的持续时间包括从哺乳动物获得肿瘤组织样品；在含有细胞培养基的第一透气性容器中培养肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品中获得TIL；在含有细胞培养基的第二透气容器中扩增TIL的数量持续约14至约42天，例如约28天。
在一个实施方式中，快速扩增中rTIL对PBMC的比率为约1：25，约1：50，约1：100，约1：125，约1：150，约1：175，约1：200，约1：225，约1：250，约1：275，约1：300，约1：325，约1：350，约1：375，约1：400，或约1：500。在一个实施方式中，快速扩增中rTIL对PBMC的比率为1：50至1：300。在一个实施方式中，快速扩增中rTIL对PBMC的比率为1：100至1：200。
在一个实施方式中，rTIL对PBMC的比率(rTIL：PBMC)选自1：5，1：10，1：15，1：20，1：25，1：30，1：35，1：40，1：45，1：50，1：55，1：60，1：65，1：70，1：75，1：80，1：85，1：90，1：95，1：100，1：105，1：110，1：115，1：120，1：125，1：130，1：135，1：140，1：145，1：150，1：155，1：160，1：165，1：170，1：175，1：180，1：185，1：190，1：195，1：200，1：225，1：250，1：275，1：300，1：350，1：400，1：450和1：500。在一个优选的实施方式中，rTIL对PBMC的比率(rTIL：PBMC)为约1：90。在优选的实施方式中，TIL对PBMC的比率(rTIL：PBMC)为约1：95。在优选的实施方式中，rTIL对PBMC的比率(TIL：PBMC)约为1：100。在优选的实施方式中，rTIL对PBMC的比率(TIL：PBMC)约为1：105。在优选的实施方式中，rTIL对PBMC的比率(TIL：PBMC)约为1：110。
在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-2。在优选的实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含约1000IU/mL，约1500IU/mL，约2000IU/mL，约2500IU/mL，约3000IU/mL，约3500IU/mL，约4000IU/mL，约4500IU/mL，约5000IU/mL，约5500IU/mL，约6000IU/mL，约6500IU/mL，约7000IU/mL，约7500IU/mL，或约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含1000至2000IU/mL，2000至3000IU/mL，3000至4000IU/mL，4000至5000IU/mL，5000至6000IU/mL，6000至7000IU/mL，7000至8000IU/mL，或8000IU/mL的IL-2。
在一个实施方式中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在优选的实施方式中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/mL，约0.5ng/mL，约1ng/mL，约2.5ng/mL，约5ng/mL，约7.5ng/mL，约10ng/mL，约15ng/mL，约20ng/mL，约25ng/mL，约30ng/mL，约35ng/mL，约40ng/mL，约50ng/mL，约60ng/mL，约70ng/mL，约80ng/mL，约90ng/mL，约100ng/mL，约200ng/mL，约500ng/mL或约1μg/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含0.1ng/mL至1ng/mL，1ng/mL至5ng/mL，5ng/mL至10ng/mL，10ng/mL至20ng/mL，20ng/mL至30ng/mL，30ng/mL至40ng/mL，40ng/mL至50ng/mL，或50ng/mL至100ng/mL的OKT-3抗体。
在一个实施方式中，可以使用如前所述的T-175烧瓶和透气袋(Tran等，J.Immunother.2008,31,742-51；Dudley等，J.Immunother.2003,26,332-42)或透气性培养器皿(G-Rex烧瓶，可从Wilson Wolf Manufacturing Corporation,新布赖顿,MN,美国商购)，来进行TIL的快速扩增过程。对于T-175烧瓶中的TIL快速扩增，可以将悬浮在150mL培养基中的1×106个TIL添加至各个T-175烧瓶中。TIL可以在CM与AIM-V培养基的1：1混合物中培养，补充有3000IU(注射单位)/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3抗体(例如OKT-3)。T-175烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。可以在第5天使用具有3000IU/mL的IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在第7天，将来自两个T-175烧瓶的细胞合并在3L袋中，并将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至300mL的TIL悬浮液中。每天或每两天计数各个袋中的细胞数，并添加新鲜培养基以使细胞计数保持在0.5×106～2.0×106个细胞/mL之间。
在一个实施方式中，对于具有100cm2透气性硅底的500mL容量透气性烧瓶中的TIL快速扩增(G-Rex 100，可从Wolf Manufacturing Corporation,新布赖顿,MN,美国商购)，5×106或10×106个TIL可以在50/50培养基中培养，补充有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3(OKT-3)。G-Rex 100烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。在第5天，可以取出250mL上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(每分钟转数；491×g)离心10分钟。可以用150mL含有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2的新鲜培养基重新悬浮TIL沉淀，并将其加回原G-Rex100烧瓶中。当在G-Rex 100烧瓶中连续扩增TIL时，在第7天，可以将各个G-Rex 100中的TIL悬浮于各个烧瓶中存在的300mL培养基中，并且可以将细胞悬浮液分成3个100mL等分试样，用于接种3个G-Rex 100烧瓶。然后可以向每个烧瓶中添加150mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。G-Rex 100烧瓶可以在37℃下在5％CO2中孵育，4天后，可以向每个G-Rex 100烧瓶中添加150mL含有3000IU/mL IL-2的AIM-V。可以在培养的第14天收获细胞。
在一个实施方式中，可以如下制备TIL。在包含补充有2mM谷氨酰胺(Mediatech,Inc.马纳萨斯,VA)、100U/mL青霉素(InvitrogenLife Technologies)、100μg/mL链霉素(InvitrogenLife Technologies)、5％热灭活的人AB血清(Valley Biomedical,Inc.温彻斯特,VA)和600IU/mL rhIL-2(Chiron,埃默里维尔,CA)的AIM-V培养基(InvitrogenLifeTechnologies,卡尔斯巴德,CA)的完全培养基(CM)中培养2mm3肿瘤碎片。对于实体肿瘤的酶消化，肿瘤标本被切割添加至RPMI-1640，洗涤并在15-22℃下以800rpm离心5分钟，并重新悬浮于酶消化缓冲液(RPMI-1640中含有0.2mg/mL胶原酶和30U/mL DNase)中，然后在室温下旋转过夜。由碎片建立的TIL可以在CM中生长3-4周并新鲜扩增，或冷冻保存于含10％二甲基亚砜(DMSO)的热灭活HAB血清中，并储存于-180℃直至研究时间。将从腹水收集物获得的肿瘤相关淋巴细胞(TAL)以3×106个细胞/孔接种于CM中的24孔板中。使用低功率倒置显微镜每隔一天检查TIL生长。
在一个实施方式中，在透气性容器中扩增TIL。使用透气性容器，使用PBMC，使用本领域已知的方法、组合物和装置来扩增TIL，包括在美国专利申请公开号US2005/0106717A1中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，在透气袋中扩增TIL。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如Xuri细胞扩增系统W25(Xuri Cell Expansion System W25)(GE Healthcare)。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如WAVE生物反应器系统，也称为Xuri细胞扩增系统W5(GE Healthcare)。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积选自约100mL，约200mL，约300mL，约400mL，约500mL，约600mL，约700mL，约800mL，约900mL，约1L，约2L，约3L，约4L，约5L，约6L，约7L，约8L，约9L，约10L，约11L，约12L，约13L，约14L，约15L，约16L，约17L，约18L，约19L，约20L，约25L，以及约30L。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积范围选自50至150mL，150至250mL，250至350mL，350至450mL，450至550mL，550至650mL，650至750mL，750至850mL，850至950mL，以及950至1050mL。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积范围选自1L至2L，2L至3L，3L至4L，4L至5L，5L至6L，6L至7L，7L至8L，8L至9L，9L至10L，10L至11L，11L至12L，12L至13L，13L至14L，14L至15L，15L至16L，16L至17L，17L至18L，18L至19L，以及19L至20L。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积范围选自0.5L至5L，5L至10L，10L至15L，15L至20L，20L至25L，以及25L至30L。在一个实施方式中，细胞扩增系统采用约30分钟，约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约24小时，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，约10天，约11天，约12天，约13天，约14天，约15天，约16天，约17天，约18天，约19天，约20天，约21天，约22天，约23天，约24天，约25天，约26天，约27天和约28天的摇动时间。在一个实施方式中，细胞扩增系统采用30分钟至1小时，1小时至12小时，12小时至1天，1天至7天，7天至14天，14天至21天，21天至28天的摇动时间。在一个实施方式中，细胞扩增系统采用约2次摇动/分钟，约5次摇动/分钟，约10次摇动/分钟，约20次摇动/分钟，约30次摇动/分钟以及约40次摇动/分钟的摇动速率。在一个实施方式中，细胞扩增系统采用2次摇动/分钟至5次摇动/分钟，5次摇动/分钟至10次摇动/分钟，10岩石/分钟至20次摇动/分钟，20次摇动/分钟至30次摇动/分钟，以及30次摇动/分钟至40次摇动/分钟的摇动速率。在一个实施方式中，细胞扩增系统采用约2°，约3°，约4°，约5°，约6°，约7°，约8°，约9°，约10°，约11°，约12°的摇动角度。在一个实施方式中，细胞扩增系统采用2°至3°，3°至4°，4°至5°，5°至6°，6°至7°，7°至8°，8°至9°，9°至10°，10°至11°，以及11°至12°的摇动角度。
在一个实施方式中，扩增rTIL的方法还包括选择rTIL以获得优异的肿瘤反应性的步骤。可以使用本领域已知的任何选择方法。例如美国专利申请公开号2016/0010058A1中描述的方法(其公开内容通过引用并入本文)可用于选择TIL以获得优异的肿瘤反应性。
rTIL的特征
在一个实施方式中，本发明的rTIL表现出由一种以上T细胞衰竭标志物表征的衰竭的T细胞表型。在一个实施方式中，本发明的rTIL表现出由使用流式细胞术分析的一种以上T细胞衰竭标志物表征的衰竭的T细胞表型。在一个实施方式中，T细胞衰竭标志物是PD-1。在一个实施方式中，T细胞衰竭标志物是LAG3。在一个实施方式中，T细胞衰竭标志物是TIM3。
在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的PD-1表达降低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，或至少150％。在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的PD-1表达降低至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，或至少10倍。
在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的LAG3表达降低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，或至少150％。在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的LAG3表达降低至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，或至少10倍。在一个实施方式中，通过流式细胞术检测不到rTIL中的LAG3表达。
在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的TIM3表达降低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，或至少150％。在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的TIM3表达降低至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，或至少10倍。在一个实施方式中，通过流式细胞术检测不到rTIL中的TIM3表达。
在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的TIGIT表达降低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，或至少150％。在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的TIGIT表达降低至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，或至少10倍。在一个实施方式中，通过流式细胞术检测不到rTIL中的TIGIT表达。
在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的CTLA-4表达降低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，或至少150％。在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的CTLA-4表达降低至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，或至少10倍。在一个实施方式中，通过流式细胞术检测不到rTIL中的CTLA-4表达。
在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的CD69表达增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，或至少150％。在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的CD69表达增加至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，或至少10倍。
在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的S1PR1(鞘氨醇-1-磷酸受体1)表达降低至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，或至少150％。在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的S1PR1表达降低至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，或至少10倍。
在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的端粒长度增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，或至少150％。在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的端粒长度增加至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，或至少10倍。
在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的CD28表达增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，或至少150％。在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的CD28表达增加至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，或至少10倍。
在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的CD27表达增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少110％，至少120％，至少130％，至少140％，或至少150％。在一个实施方式中，相对于eTIL，rTIL中的CD27表达增加至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，或至少10倍。
在一些实施方式中，本文所述的方法可包括在进行本文所述的另外步骤之前或在完成本文所述的REP步骤之后，在运输、解冻和/或施用于患者之前，可选地在储存培养基(例如含有5％DMSO的培养基)中冷冻保存eTIL和/或rTIL。在一些实施方式中，本文所述的方法可包括在进行本文所述的另外步骤之前，解冻冷冻保存的TIL(例如，冷冻保存的eTIL、冷冻保存的rTIL，或它们的组合或混合物)的步骤。在一些实施方式中，另外的步骤可以是eTIL和/或rTIL的另外或重复扩增(例如reREP)，该扩增可以在解冻的细胞上使用例如补充细胞培养基进行，该补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和/或饲养细胞(例如抗原呈递细胞)，通常包含外周血单核细胞(PBMC；或者，可选地使用抗原呈递细胞)，其中，另外的扩增步骤可以进行至少14天。在一些实施方式中，这种培养基还可以包含IL-2、IL-15和/或IL-23的组合，而不是仅仅含有IL-2。
如本文所讨论的，冷冻保存可以发生于整个TIL扩增过程中的许多点。在一些实施方式中，可以冷冻保存扩增后的大量TIL群(例如eTIL、rTIL或它们的组合或混合物)。通常可以通过将TIL群置于冷冻溶液中来实现冷冻保存，例如85％补体灭活的AB血清和15％二甲基亚砜(DMSO)。将溶液中的细胞置于冻存管(cryogenic vial)中并在-80℃下储存24小时，任选转移至气态氮冷冻机进行冷冻保存。参见Sadeghi等，Acta Oncologica 2013,52,978-986。在一些实施方式中，本文所述的TIL可以在5％DMSO中冷冻保存。在一些实施方式中，本文所述的TIL可以在细胞培养基加5％DMSO中冷冻保存。
适当时，将本文所述的冷冻保存的细胞(例如冷冻保存的rTIL)从冰箱中取出，并在37℃水浴中解冻，直至约4/5的溶液被解冻。通常将细胞重新悬浮于完全培养基中并任选洗涤一次以上。在一些实施方式中，如本领域已知的，可以对解冻的TIL进行计数并评估活力(viability)。
消化肿瘤以获得rTIL的方法
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用一种以上酶消化肿瘤的步骤。适用于消化肿瘤的酶描述于Volvitz等，BMC Neuroscience 2016,17,30，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，本发明可包括获得rTIL的方法，所述方法包括使用脱氧核糖核酸酶、胶原酶、透明质酸酶或它们的组合来消化肿瘤(可包括肿瘤组织或其部分)的步骤。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用催化DNA骨架中磷酸二酯键水解切割的任何酶来消化肿瘤从而降解DNA的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用脱氧核糖核酸酶(DNase)消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用脱氧核糖核酸酶和至少一种其他酶消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，脱氧核糖核酸酶是脱氧核糖核酸酶I。在一个实施方式中，脱氧核糖核酸酶是脱氧核糖核酸酶II。在一个实施方式中，脱氧核糖核酸酶是来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I(Sigma D5025或等同物)。在一个实施方式中，脱氧核糖核酸酶是来自牛的重组脱氧核糖核酸酶I，在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达(Sigma D2821或等同物)。在一个实施方式中，脱氧核糖核酸酶是重组人脱氧核糖核酸酶I(rhDNAase I，也称为Dornase Alfa(阿法链道酶)，可从Genentech,Inc.以PULMOZYME商购获得)。在一个实施方式中，脱氧核糖核酸酶是来自牛脾的脱氧核糖核酸酶II(Sigma D8764或等同物)。在一个实施方式中，脱氧核糖核酸酶是来自猪脾的脱氧核糖核酸酶II(Sigma D4138或等同物)。在一个实施方式中，任一前述脱氧核糖核酸酶存在于肿瘤消化物中。在一个实施方式中，适用于本发明的脱氧核糖核酸酶的制备和性质描述于美国专利号5,783,433、6,391,607、7,407,785和7,297,526，以及国际专利申请公开号WO2016/108244A1中，其公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用催化胶原中肽键断裂的任何酶来消化肿瘤从而降解胶原蛋白的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用胶原酶消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用胶原酶和至少一种其他酶消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，胶原酶是来自溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)的胶原酶。在一个实施方式中，胶原酶是梭菌肽酶A(ClostridiopeptidaseA)。在一个实施方式中，胶原酶是胶原酶I。在一个实施方式中，胶原酶是胶原酶II。在一个实施方式中，胶原酶是来自溶组织梭菌的胶原酶(Sigma C5138或等同物)。适用于本发明的胶原酶的制备和性质描述于美国专利号3,201,325；3,705,083；3,821,364；5,177,017；5,422,261；5,989,888；9,211,316；其中，每一个的公开内容均以引用方式并入本文。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用催化透明质酸降解的任何酶来消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用透明质酸酶消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用透明质酸葡糖苷酶消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，透明质酸酶是来自牛睾丸的I型透明质酸酶(Sigma H3506或等同物)。在一个实施方式中，透明质酸酶是来自绵羊睾丸的II型透明质酸酶(Sigma H2126或等同物)。在一个实施方式中，透明质酸酶是III型透明质酸酶。在一个实施方式中，透明质酸酶是来自牛睾丸的IV型透明质酸酶(IV-S型)(Sigma H3884或等同物)。在一个实施方式中，透明质酸酶是来自绵羊睾丸的V型透明质酸酶(Sigma H6254或等同物)。在一个实施方式中，透明质酸酶是来自牛睾丸的VIII型透明质酸酶(Sigma H3757或等同物)。在一个实施方式中，透明质酸酶是重组人透明质酸酶(可从Halozyme,Inc.以HYLENEX商购获得)。适用于本发明的透明质酸酶的制备和性质描述于美国专利号4,820,516；5,593,877；6,057,110；6,123,938；7,767,429；8,202,517；8,431,124；和8,431,380；其中，每一个的公开内容均以引用方式并入本文。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用脱氧核糖核酸酶和透明质酸酶消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用脱氧核糖核酸酶和胶原酶消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用透明质酸酶和胶原酶消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶和胶原酶消化肿瘤的步骤。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用脱氧核糖核酸酶和透明质酸酶以及至少一种另外的酶消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用脱氧核糖核酸酶和胶原酶以及至少一种另外的酶消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用透明质酸酶和胶原酶以及至少一种另外的酶消化肿瘤的步骤。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶和胶原酶以及至少一种另外的酶消化肿瘤的步骤。在任何前述实施方式中，另外的酶选自酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶及其组合。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用上述任何酶来消化肿瘤的步骤，并且还包括在消化之前、期间或之后，机械破坏或破碎肿瘤的步骤。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用上述任何酶来消化肿瘤的步骤，其中，消化进行的时间选自15分钟，30分钟，45分钟，1小时，90分钟，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时，12小时，18小时，24小时，36小时和48小时。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用上述任何酶来消化肿瘤的步骤，其中，消化进行的时间选自约15分钟，约30分钟，约45分钟，约1小时，约90分钟，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约18小时，约24小时，约36小时，以及约48小时。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用上述任何酶来消化肿瘤的步骤，其中，消化进行的时间选自少于15分钟，少于30分钟，少于45分钟，少于1小时，少于90分钟，少于2小时，少于3小时，少于4小时，少于5小时，少于6小时，少于7小时，少于8小时，少于9小时，少于10小时，少于11小时，少于12小时，少于18小时，少于24小时，少于36小时，以及少于48小时。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用上述任何酶来消化肿瘤的步骤，其中，消化进行的时间选自大于15分钟，大于30分钟，大于45分钟，大于1小时，大于90分钟，大于2小时，大于3小时，大于4小时，大于5小时，大于6小时，大于7小时，大于8小时，大于9小时，大于10小时，大于11小时，大于12小时，大于18小时，大于24小时，大于36小时，以及大于48小时。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用上述任何酶来消化肿瘤的步骤，其中，消化进行的时间选自30分钟至1小时，1小时至2小时，2小时至3小时，3小时至4小时，4小时至5小时，5小时至6小时，6小时至12小时，12小时至18小时，18小时至24小时，以及24小时至48小时。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用上述任何酶来消化肿瘤的步骤，其中，消化进行的温度选自约20℃，约25℃，约30℃，约35℃，约40℃，约45℃，约50℃，约55℃，约60℃，约65℃，约70℃，约75℃，以及约80℃。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用上述任何酶来消化肿瘤的步骤，其中，消化进行的温度选自20℃至25℃，25℃至30℃，30℃至35℃，35℃至40℃，40℃至45℃，45℃至50℃，50℃至55℃，55℃至60℃，60℃至65℃，65℃至70℃，70℃至75℃，以及75℃至80℃。
在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用上述任何酶来消化肿瘤的步骤，其中，如果消化肿瘤残余物(在pre-REP之后)，则消化的时间和温度均降低。在一个实施方式中，获得rTIL的方法包括使用上述任何酶来消化肿瘤的步骤，其中，如果消化完整的肿瘤碎片(没有pre-REP)，则消化的时间和温度均增加。
调节rTIL对eTIL的比率的方法
在一个实施方式中，可以通过使用如本文所述的任何扩增和消化步骤(包括pre-REP)，来调节或控制rTIL相对于eTIL的浓度，使得用于治疗本文所述的癌症的治疗性TIL产物可以包含理想的rTIL对eTIL的比率。在一个实施方式中，本发明提供了从eTIL和rTIL的混合物中移除eTIL的方法。在一个实施方式中，本发明提供了从eTIL和rTIL的混合物中移除rTIL的方法。
在本发明方法的一些实施方式中，可以在初始扩增步骤之前，在第一次扩增步骤(例如pre-REP)和/或在第二次扩增步骤(例如REP)，将eTIL和/或rTIL添加至培养基。在本发明方法的一些实施方式中，可以根据本文所述的培养或扩增步骤通过一次、两次、三次或更多次扩增单独培养eTIL，并将eTIL以选定的rTIL对eTIL的比率添加至rTIL和eTIL群中。在本发明方法的一些实施方式中，可以根据本文所述的培养或扩增步骤通过一次、两次、三次或更多次扩增单独培养rTIL，并将rTIL添加至eTIL群中以提供选定的rTIL对eTIL的比率的rTIL和eTIL混合物。
在一个实施方式中，可以将根据本文所述方法制备的eTIL添加至rTIL群中，以在所得rTIL/eTIL混合物中提供选定的rTIL对eTIL的比率。在一个实施方式中，可以将根据本文所述方法制备的rTIL添加至eTIL群中，以在所得rTIL/eTIL混合物中提供选定的rTIL对eTIL的比率。
在一个实施方式中，本发明提供一种治疗癌症的方法，其中，所述治疗包括向患者递送治疗有效量的TIL，其中，TIL中rTIL对eTIL的比率(例如选定的rTIL对eTIL的比率)选自约0：100，约1：99，约5：95，约10：90，约15：85，约20：80，约25：75，约30：70，约35：65，约40：60，约45：55，约50：50，约55：45，约60：40，约65：35，约70：30，约75：25，约80：20，约85：15，约90：10，约95：5，约99：1，以及约100：0rTIL比eTIL。
在一个实施方式中，使用选择方法调节rTIL对eTIL的比率，所述选择方法可用于富集或减少eTIL相对于rTIL(的量)，如本领域技术人员所要求的。在一个实施方式中，选择方法基于衰竭标志物(包括TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1和CTLA-4)的缺乏。在一个实施方式中，选择方法基于增强的CD69表达。在一个实施方式中，选择方法基于优异的线粒体质量。在一个实施方式中，选择方法基于细胞表面蛋白的子集。在一个实施方式中，选择方法基于表型。在一个实施例中，选择方法基于功能。
在一个实施方式中，通过在相同细胞培养基中共培养rTIL和eTIL来调节rTIL对eTIL的比率，直至获得所需比率。在一个实施方式中，通过在相同细胞培养基中共培养rTIL和eTIL来调节rTIL对eTIL的比率，包括在扩增期间的不同时间点向细胞培养基中添加rTIL或eTIL，直至获得所需比率。在一个实施方式中，通过添加除IL-2之外的细胞因子(包括IL-4、IL-7、IL-15和/或IL-21)，在细胞培养基中优先扩增rTIL生长。
在一个实施方式中，通过本文描述的方法提供的rTIL对eTIL的比率(例如选定的rTIL对eTIL的比率)可以是至少1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％，或99.9％rTIL比eTIL。
在一个实施方式中，通过本文描述的方法提供的rTIL对eTIL的比率(例如选定的rTIL对eTIL的比率)可以为至多1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，eTIL的91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％，或99.9％rTIL比eTIL。
在一个实施方式中，通过本文描述的方法提供的rTIL对eTIL的比率(例如选定的rTIL对eTIL的比率)可以为约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91对于eTIL，％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％，或99.9％rTIL比eTIL。
治疗癌症和其他疾病的方法
本文所述的rTIL，以及rTIL和eTIL的组合可用于治疗人类疾病的方法中。在一个实施方式中，它们用于治疗过度增殖性疾病。在一些实施方式中，过度增殖性疾病是癌症。在一些实施方式中，过度增殖性疾病是实体瘤癌症。在一些实施方式中，实体瘤癌症选自黑素瘤，双重难治性黑素瘤(即至少两种先前治疗(包括化疗和检查点阻滞)难以治疗的黑素瘤)，卵巢癌，宫颈癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，肺癌，膀胱癌，乳腺癌，人乳头瘤病毒引起的癌症，头颈癌，肾癌，肾细胞癌和肉瘤。在一些实施方式中，过度增殖性疾病是血液恶性肿瘤(或液体肿瘤癌)。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤选自急性髓样白血病，慢性淋巴细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，弥漫性大B细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。本文所述的rTIL，以及rTIL和eTIL的组合也可用于治疗本文和以下段落中描述的其他病症。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，其中，所述治疗包括向患者递送治疗有效量的rTIL，其中，所述rTIL根据包括以下步骤的方法制备：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL；和
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，
其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用于患者；
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用于患者
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者，
其中，癌症选自黑素瘤、双重难治性黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、肾细胞癌、急性髓样白血病、结直肠癌、肉瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)和三阴性乳腺癌。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者，其中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以60mg/m2/天的剂量持续2天施用环磷酰胺、然后以25mg/m2/天的剂量持续5天施用氟达拉滨的步骤；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用于患者；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
在本文所述方法的一些实施方式中，移除至少多个eTIL的步骤包括：移除至少1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％，99.9％，或100％的eTIL。
本文所述的化合物和化合物组合在治疗、预防和/或控制所示疾病或病症中的功效可使用本领域已知的各种模型进行测试，为治疗人类疾病提供指导。例如用于测定卵巢癌治疗功效的模型描述于例如Mullany等，Endocrinology 2012,153,1585-92；以及Fong等，J.Ovarian Res.2009,2,12。用于测定胰腺癌治疗功效的模型描述于Herreros-Villanueva等，World J.gastroenterol.2012,18,1286-1294。用于测定乳腺癌治疗功效的模型描述于例如Fantozzi,Breast Cancer Res.2006,8,212。用于测定黑素瘤治疗功效的模型描述于例如Damsky等，Pigment Cell&Melanoma Res.2010,23,853–859。用于测定肺癌治疗功效的模型描述于例如Meuwissen等，Pigment Cell&Melanoma Res.2010,23,853–859。用于测定肺癌治疗功效的模型描述于例如Kim,Clin.Exp.Otorhinolaryngol.2009,2,55-60；以及Sano,Head Neck Oncol.2009,1,32。
IL-2的共同施用
在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，包括以下步骤：
(a)根据本文所述的方法从患者切除的肿瘤中获得rTIL；
(b)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(c)给患者施用治疗有效量的rTIL；以及
(d)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用IL-2方案治疗患者。
在一个实施方式中，IL-2方案包括高剂量IL-2方案，其中，高剂量IL-2方案包括：在施用第三TIL群的治疗有效部分之后的第二天开始静脉内施用阿地白介素或其生物仿制药或变体，其中，阿地白介素或其生物仿制药或变体以600,000或720,000IU/kg(患者体重)的剂量施用，每8小时静脉推注15分钟，直至耐受，最多14剂。休息9天后，可以重复该时间表另外14个剂量，总共最多28个剂量。
在一个实施方式中，IL-2方案包括高剂量IL-2方案，其中，高剂量IL-2方案包括：在施用第三TIL群的治疗有效部分之后的第二天开始静脉内施用阿地白介素或其生物仿制药或变体，其中，阿地白介素或其生物仿制药或变体以0.037mg/kg或0.044mg/kg IU/kg(患者体重)的剂量，每8小时静脉推注15分钟，直至耐受，最多14剂。休息9天后，可以重复该时间表另外14个剂量，总共最多28个剂量。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用于患者；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者，
其中，所述高剂量IL-2方案包括每8小时静脉推注600,000或720,000IU/kg阿地白介素或其生物仿制药或变体15分钟，直至耐受。
在一个实施方式中，IL-2方案包括递减型(decrescendo)IL-2方案。递减型IL-2方案已描述于O'Day等，J.Clin.Oncol.1999,17,2752-61和Eton等，Cancer 2000,88,1703-9，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，递减型IL-2方案包括在6小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在12小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在24小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在72小时内静脉内施用4.5×106IU/m2。该治疗循环可每28天重复一次，最多四个循环。在一个实施方式中，递减型IL-2方案包括在第1天18,000,000IU/m2，在第2天9,000,000IU/m2，在第3和4天4,500,000IU/m2。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，
并且其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用于患者；以及
(i)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用递减型IL-2方案治疗患者，
其中，递减型IL-2方案包括在6小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在12小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在24小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在72小时内静脉内施用4.5×106IU/m2，每28天重复一次，最多4个循环。
在一个实施方式中，IL-2方案包括施用聚乙二醇化的IL-2，包括聚乙二醇化的阿地白介素。在一个实施方式中，IL-2方案包括以0.10mg/天至50mg/天的剂量每1、2、4、6、7、14或21天施用聚乙二醇化的IL-2。
在一个实施方式中，本发明包括一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，该方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；
(b)破碎肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞(rTIL)；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，
其中，T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1及其组合，并且
其中，第二细胞培养基还包含选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21以及它们的组合的细胞因子，
(g)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(h)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用于患者；以及
(i)在给患者施用rTIL的第二天开始用聚乙二醇化IL-2方案治疗患者，
其中，聚乙二醇化IL-2方案包括以0.10mg/天至50mg/天的剂量每1、2、4、6、7、14或21天施用聚乙二醇化的IL-2。
非清髓性淋巴细胞耗竭与化疗
在一个实施方式中，本发明包括用rTIL群治疗癌症的方法，其中，在输注根据本发明的rTIL之前，用非清髓性化疗预处理患者。在一些实施方式中，rTIL群可以提供有eTIL群，其中，在输注根据本发明的rTIL和eTIL之前，用非清髓性化疗预处理患者。在一个实施方式中，非清髓性化疗是持续2天的环磷酰胺60mg/kg/天(rTIL输注之前的第27和26天)和持续5天的氟达拉滨25mg/m2/天(rTIL输注之前的第27至23天)。在一个实施方式中，在根据本发明的非清髓性化疗和rTIL输注(在第0天)之后，每8小时患者接受一次720,000IU/kgIL-2的静脉内输注至生理耐受。
实验结果表明，肿瘤特异性T淋巴细胞的过继性转移前的淋巴细胞耗竭通过消除调节性T细胞和免疫系统的竞争元件(“细胞因子沉降”)而在增强治疗功效中起关键作用。因此，本发明的一些实施方式在引入本发明的rTIL之前对患者使用淋巴细胞耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制调节”)。
通常，通过施用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称为马磷酰胺)及其组合来实现淋巴细胞耗竭。这些方法描述于Gassner等，Cancer Immunol.Immunother.2011,60,75–85；Muranski等，Nat.Clin.Pract.Oncol.,2006,3,668–681；Dudley等，J.Clin.Oncol.2008,26,5233-5239；以及Dudley等，J.Clin.Oncol.2005,23,2346–2357，所有这些文献都通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，以0.5μg/mL-10μg/mL氟达拉滨的浓度施用氟达拉滨。在一些实施方式中，以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用氟达拉滨。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗施用1天，2天，3天，4天，5天，6天，或7天或更长时间。在一些实施方式中，以10mg/kg/天，15mg/kg/天，20mg/kg/天，25mg/kg/天，30mg/kg/天，35mg/kg/天，40mg/kg/天，或45mg/kg/天的剂量施用氟达拉滨。在一些实施方式中，以35mg/kg/天施用氟达拉滨治疗2-7天。在一些实施方式中，以35mg/kg/天施用氟达拉滨治疗4-5天。在一些实施方式中，以25mg/kg/天施用氟达拉滨治疗4-5天。
在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺以0.5μg/mL-10μg/mL的浓度获得马氟酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺以1μg/mL的浓度获得马来酰胺(活性形式的环磷酰胺)。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗施用1天，2天，3天，4天，5天，6天，或7天或更长时间。在一些实施方式中，以100mg/m2/天，150mg/m2/天，175mg/m2/天，200mg/m2/天，225mg/m2/天，250mg/m2/天，275mg/m2/天，或300mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺。在一些实施方式中，静脉内(i.v.)施用环磷酰胺。在一些实施方式中，以35mg/kg/天施用环磷酰胺治疗2-7天。在一些实施方式中，以250mg/m2/天静脉内施用环磷酰胺治疗4-5天。在一些实施方式中，以250mg/m2/天静脉内施用环磷酰胺治疗4天。
在一些实施方式中，通过将氟达拉滨和环磷酰胺一起施用于患者来进行淋巴细胞耗竭。在一些实施方式中，持续4天以25mg/m2/天静脉内施用氟达拉滨并且以250mg/m2/天静脉内施用环磷酰胺。
在一个实施方式中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续5天，进行淋巴细胞耗竭。
药物组合物、剂量和施用方案
在一个实施方式中，使用本发明方法扩增的rTIL作为药物组合物施用于患者。在一个实施方式中，药物组合物是rTIL在无菌缓冲液中的悬浮液。使用本发明方法扩增的rTIL可以通过本领域已知的任何合适途径施用。优选地，rTIL以单次动脉内或静脉内输注施用，输注优选持续约30～60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
在一个实施方式中，使用本发明方法扩增的rTIL和eTIL作为药物组合物施用于患者。在一个实施例中，药物组合物是rTIL和eTIL在无菌缓冲液中的悬浮液。使用本发明方法扩增的rTIL和eTIL可以通过本领域已知的任何合适途径施用。优选地，rTIL和eTIL以单次动脉内或静脉内输注施用，输注优选持续约30～60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可以施用任何合适剂量的rTIL。优选地，施用约2.3×1010至约13.7×1010个rTIL，平均约7.8×1010个rTIL，特别是当癌是黑素瘤时。在一个实施方式中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个rTIL。
可以施用任何合适剂量的rTIL和eTIL。优选地，施用约2.3×1010至约13.7×1010个rTIL和eTIL，平均约7.8×1010个rTIL和eTIL，特别是当癌是黑素瘤时。在一个实施方式中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个rTIL和eTIL。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL的数量为约1×106，2×106，3×106，4×106，5×106，6×106，7×106，8×106，9×106，1×107，2×107，3×107，4×107，5×107，6×107，7×107，8×107，9×107，1×108，2×108，3×108，4×108，5×108，6×108，7×108，8×108，9×108，1×109，2×109，3×109，4×109，5×109，6×109，7×109，8×109，9×109，1×1010，2×1010，3×1010，4×1010，5×1010，6×1010，7×1010，8×1010，9×1010，1×1011，2×1011，3×1011，4×1011，5×1011，6×1011，7×1011，8×1011，9×1011，1×1012，2×1012，3×1012，4×1012，5×1012，6×1012，7×1012，8×1012，9×1012，1×1013，2×1013，3×1013，4×1013，5×1013，6×1013，7×1013，8×1013，以及9×1013。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL的数量范围为1×106至5×106，5×106至1×107，1×107至5×107，5×107至1×108，1×108至5×108，5×108至1×109，1×109至5×109，5×109至1×1010，1×1010至5×1010，5×1010至1×1011，5×1011至1×1012，1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL和eTIL的数量约1×106，2×106，3×106，4×106，5×106，6×106，7×106，8×106，9×106，1×107，2×107，3×107，4×107，5×107，6×107，7×107，8×107，9×107，1×108，2×108，3×108，4×108，5×108，6×108，7×108，8×108，9×108，1×109，2×109，3×109，4×109，5×109，6×109，7×109，8×109，9×109，1×1010，2×1010，3×1010，4×1010，5×1010，6×1010，7×1010，8×1010，9×1010，1×1011，2×1011，3×1011，4×1011，5×1011，6×1011，7×1011，8×1011，9×1011，1×1012，2×1012，3×1012，4×1012，5×1012，6×1012，7×1012，8×1012，9×1012，1×1013，2×1013，3×1013，4×1013，5×1013，6×1013，7×1013，8×1013，以及9×1013。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL和eTIL的数量的范围为1×106至5×106，5×106至1×107，1×107至5×107，5×107至1×108，1×108至5×108，5×108至1×109，1×109至5×109，5×109至1×1010，1×1010至5×1010，5×1010至1×1011，5×1011至1×1012，1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL的浓度小于例如药物组合物的100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％。，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％，0.1％，0.09％，0.08％，0.07％，0.06％，0.05％，0.04％，0.03％，0.02％，0.01％，0.009％，0.008％，0.007％，0.006％，0.005％，0.004％，0.003％，0.002％，0.001％，0.0009％，0.0008％，0.0007％，0.0006％，0.0005％，0.0004％，0.0003％，0.0002％或0.0001％w/w，w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL和eTIL的浓度小于例如药物组合物的100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％，0.1％，0.09％，0.08％，0.07％，0.06％，0.05％，0.04％，0.03％，0.02％，0.01％，0.009％，0.008％，0.007％，0.006％，0.005％，0.004％，0.003％，0.002％，0.001％，0.0009％，0.0008％，0.0007％，0.0006％，0.0005％，0.0004％，0.0003％，0.0002％或0.0001％w/w，w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL的浓度大于药物组合物的90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，19.75％，19.50％，19.25％19％，18.75％，18.50％，18.25％18％，17.75％，17.50％，17.25％17％，16.75％，16.50％，16.25％16％，15.75％，15.50％，15.25％15％，14.75％，14.50％，14.25％，14％，13.75％，13.50％，13.25％，13％，12.75％，12.50％，12％，11.75％，11.50％，11.25％，11％，10.75％，10.50％，10.25％，10％，9.75％，9.50％，9.25％，9％，8.75％，8.50％，8.25％，8％，7.75％，7.50％，7.25％，7％，6.75％，6.50％，6.25％，6％，5.75％，5.50％，5.25％，5％，4.75％，4.50％，4.25％，4％，3.75％，3.50％，3.25％，3％，2.75％，2.50％，2.25％，2％，1.75％，1.50％，125％，1％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％，0.1％，0.09％，0.08％，0.07％，0.06％，0.05％，0.04％，0.03％，0.02％，0.01％，0.009％，0.008％，0.007％，0.006％，0.005％，0.004％，0.003％，0.002％，0.001％，0.0009％，0.0008％，0.0007％，0.0006％，0.0005％，0.0004％，0.0003％，0.0002％或0.0001％w/w，w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL和eTIL的浓度大于药物组合物的90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，19.75％，19.50％，19.25％19％，18.75％，18.50％，18.25％18％，17.75％，17.50％，17.25％17％，16.75％，16.50％，16.25％16％，15.75％，15.50％，15.25％15％，14.75％，14.50％，14.25％，14％，13.75％，13.50％，13.25％，13％，12.75％，12.50％，12％，11.75％，11.50％，11.25％，11％，10.75％，10.50％，10.25％，10％，9.75％，9.50％，9.25％，9％，8.75％，8.50％，8.25％，8％，7.75％，7.50％，7.25％，7％，6.75％，6.50％，6.25％，6％，5.75％，5.50％，5.25％，5％，4.75％，4.50％，4.25％，4％，3.75％，3.50％，3.25％，3％，2.75％，2.50％，2.25％，2％，1.75％，1.50％，125％，1％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％，0.1％，0.09％，0.08％，0.07％，0.06％，0.05％，0.04％，0.03％，0.02％，0.01％，0.009％，0.008％，0.007％，0.006％，0.005％，0.004％，0.003％，0.002％，0.001％，0.0009％，0.0008％，0.0007％，0.0006％，0.0005％，0.0004％，0.0003％，0.0002％或0.0001％w/w，w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL的浓度范围为药物组合物的约0.0001％至约50％，约0.001％至约40％，约0.01％至约30％，约0.02％至约29％，约0.03％至约28％，约0.04％至约27％，约0.05％至约26％，约0.06％至约25％，约0.07％至约24％，约0.08％至约23％，约0.09％至约22％，约0.1％至约21％，约0.2％至约20％，约0.3％至约19％，约0.4％至约18％，约0.5％至约17％，约0.6％至约16％，约0.7％至约15％，约0.8％至约14％，约0.9％至约12％，或约1％至约10％w/w，w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL和eTIL的浓度范围为药物组合物的约0.0001％至约50％，约0.001％至约40％，约0.01％至约30％，约0.02％至约29％，约0.03％至约28％，约0.04％至约27％，约0.05％至约26％，约0.06％至约25％，约0.07％至约24％，约0.08％至约23％，约0.09％至约22％，约0.1％至约21％，约0.2％至约20％，约0.3％至约19％，约0.4％至约18％，约0.5％至约17％，约0.6％至约16％，约0.7％至约15％，约0.8％至约14％，约0.9％至约12％，或约1％至约10％w/w，w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL的浓度范围为药物组合物的约0.001％至约10％，约0.01％至约5％，约0.02％至约4.5％，约0.03％至约4％，约0.04％至约3.5％，约0.05％至约3％，约0.06％至约2.5％，约0.07％至约2％，约0.08％至约1.5％，约0.09％至约1％，约0.1％至约0.9％w/w，w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL和eTIL的浓度范围为药物组合物的约0.001％至约10％，约0.01％至约5％，约0.02％至约4.5％，约0.03％至约4％，约0.04％至约3.5％，约0.05％至约3％，约0.06％至约2.5％，约0.07％至约2％，约0.08％至约1.5％，约0.09％至约1％，约0.1％至约0.9％w/w，w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL的量等于或小于10g，9.5g，9.0g，8.5g，8.0g，7.5g，7.0g，6.5g，6.0g，5.5g，5.0g，4.5g，4.0g，3.5g，3.0g，2.5g，2.0g，1.5g，1.0g，0.95g，0.9g，0.85g，0.8g，0.75g，0.7g，0.65g，0.6g，0.55g，0.5g，0.45g，0.4g，0.35g，0.3g，0.25g，0.2g，0.15g，0.1g，0.09g，0.08g，0.07g，0.06g，0.05g，0.04g，0.03g，0.02g，0.01g，0.009g，0.008g，0.007g，0.006g，0.005g，0.004g，0.003g，0.002g，0.001g，0.0009g，0.0008g，0.0007g，0.0006g，0.0005g，0.0004g，0.0003g，0.0002g，或0.0001g。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL和eTIL的量等于或小于10g，9.5g，9.0g，8.5g，8.0g，7.5g，7.0g，6.5g，6.0g，5.5g，5.0g，4.5g，4.0g，3.5g，3.0g，2.5g，2.0g，1.5g，1.0g，0.95g，0.9g，0.85g，0.8g，0.75g，0.7g，0.65g，0.6g，0.55g，0.5g，0.45g，0.4g，0.35g，0.3g，0.25g，0.2g，0.15g，0.1g，0.09g，0.08g，0.07g，0.06g，0.05g，0.04g，0.03g，0.02g，0.01g，0.009g，0.008g，0.007g，0.006g，0.005g，0.004g，0.003g，0.002g，0.001g，0.0009g，0.0008g，0.0007g，0.0006g，0.0005g，0.0004g，0.0003g，0.0002g，或0.0001g。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL的量大于0.0001g，0.0002g，0.0003g，0.0004g，0.0005g，0.0006g，0.0007g，0.0008g，0.0009g，0.001g，0.0015g，0.002g，0.0025g，0.003g，0.0035g，0.004g，0.0045g，0.005g，0.0055g，0.006g，0.0065g，0.007g，0.0075g，0.008g，0.0085g，0.009g，0.0095g，0.01g，0.015g，0.02g，0.025g，0.03g，0.035g，0.04g，0.045g，0.05g，0.055g，0.06g，0.065g，0.07g，0.075g，0.08g，0.085g，0.09g，0.095g，0.1g，0.15g，0.2g，0.25g，0.3g，0.35g，0.4g，0.45g，0.5g，0.55g，0.6g，0.65g，0.7g，0.75g，0.8g，0.85g，0.9g，0.95g，1g，1.5g，2g，2.5g，3g，3.5g，4.5g，4.5g，5g，5.5g，6g，6.5g，7g，7.5g，8gg，8.5g，9g，9.5g或10g。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的rTIL和eTIL的量大于0.0001g，0.0002g，0.0003g，0.0004g，0.0005g，0.0006g，0.0007g，0.0008g，0.0009g，0.001g，0.0015g，0.002g，0.0025g，0.003g，0.0035g，0.004g，0.0045g，0.005g，0.0055g，0.006g，0.0065g，0.007g，0.0075g，0.008g，0.0085g，0.009g，0.0095g，0.01g，0.015g，0.02g，0.025g，0.03g，0.035g，0.04g，0.045g，0.05g，0.055g，0.06g，0.065g，0.07g，0.075g，0.08g，0.085g，0.09g，0.095g，0.1g，0.15g，0.2g，0.25g，0.3g，0.35g，0.4g，0.45g，0.5g，0.55g，0.6g，0.65g，0.7g，0.75g，0.8g，0.85g，0.9g，0.95g，1g，1.5g，2g，2.5,3g，3.5,4g，4.5g，5g，5.5g，6g，6.5g，7g，7.5g，8g，8.5g，9g，9.5g，或10g。
本发明的药物组合物中提供的rTIL在宽剂量范围内有效。确切的剂量取决于施用途径、施用化合物的形式、待治疗对象的性别和年龄、待治疗对象的体重，以及主治医师的偏好和经验。如果合适，也可以使用临床确定的rTIL剂量。使用本文方法施用的药物组合物的量(例如rTIL的剂量)将取决于所治疗的人或哺乳动物、疾病或病症的严重程度、施用率、活性药物成分的配置以及主治医生的自由裁量权。
本发明的药物组合物中提供的rTIL和eTIL在宽剂量范围内是有效的。确切的剂量将取决于施用途径、施用化合物的形式、待治疗对象的性别和年龄、待治疗对象的体重以及主治医师的偏好和经验。如果合适，也可以使用临床确定的rTIL和eTIL剂量。使用本文方法施用的药物组合物的量(例如rTIL和eTIL的剂量)将取决于所治疗的人或哺乳动物、疾病或病症的严重程度、施用率、活性药物成分的配置以及主治医生的自由裁量权。
在一些实施方式中，rTIL可以单剂量施用。这种施用可以通过注射，例如静脉内注射。在一些实施方式中，rTIL可以多剂量施用。剂量可以是每年一次，两次，三次，四次，五次，六次或超过六次。剂量可以是每月一次，每两周一次，每周一次，或每两天一次。只要有必要，可以继续施用rTIL。
在一些实施方式中，rTIL和eTIL可以单剂量施用。这种施用可以通过注射，例如静脉内注射。在一些实施方式中，rTIL可以多剂量施用。剂量可以是每年一次，两次，三次，四次，五次，六次或超过六次。剂量可以是每月一次，每两周一次，每周一次，或每两天一次。只要有必要，可以继续施用rTIL和eTIL。
在一些实施方式中，rTIL的有效剂量为约1×106，2×106，3×106，4×106，5×106，6×106，7×106，8×106，9×106，1×107，2×107，3×107，4×107，5×107，6×107，7×107，8×107，9×107，1×108，2×108，3×108，4×108，5×108，6×108，7×108，8×108，9×108，1×109，2×109，3×109，4×109，5×109，6×109，7×109，8×109，9×109，1×1010，2×1010，3×1010，4×1010，5×1010，6×1010，7×1010，8×1010，9×1010，1×1011，2×1011，3×1011，4×1011，5×1011，6×1011，7×1011，8×1011，9×1011，1×1012，2×1012，3×1012，4×1012，5×1012，6×1012，7×1012，8×1012，9×1012，1×1013，2×1013，3×1013，4×1013，5×1013，6×1013，7×1013，8×1013，以及9×1013。在一个实施方式中，rTIL的有效剂量的范围为1×106至5×106，5×106至1×107，1×107至5×107，5×107至1×108，1×108至5×108，5×108至1×109，1×109至5×109，5×109至1×1010，1×1010至5×1010，5×1010至1×1011，5×1011至1×1012，1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。
在一些实施方式中，rTIL和eTIL的有效剂量为约1×106，2×106，3×106，4×106，5×106，6×106，7×106，8×106，9×106，1×107，2×107，3×107，4×107，5×107，6×107，7×107，8×107，9×107，1×108，2×108，3×108，4×108，5×108，6×108，7×108，8×108，9×108，1×109，2×109，3×109，4×109，5×109，6×109，7×109，8×109，9×109，1×1010，2×1010，3×1010，4×1010，5×1010，6×1010，7×1010，8×1010，9×1010，1×1011，2×1011，3×1011，4×1011，5×1011，6×1011，7×1011，8×1011，9×1011，1×1012，2×1012，3×1012，4×1012，5×1012，6×1012，7×1012，8×1012，9×1012，1×1013，2×1013，3×1013，4×1013，5×1013，6×1013，7×1013，8×1013，以及9×1013。在一些实施方式中，rTIL和eTIL的有效剂量范围为1×106至5×106，5×106至1×107，1×107至5×107，5×107至1×108，1×108至5×108，5×108至1×109，1×109至5×109，5×109至1×1010，1×1010至5×1010，5×1010至1×1011，5×1011至1×1012，1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。
在一些实施方式中，rTIL的有效剂量的范围为约0.01mg/kg至约4.3mg/kg，约0.15mg/kg至约3.6mg/kg，约0.3mg/kg至约3.2mg/kg，约0.35mg/kg至约2.85mg/kg，约0.15mg/kg至约2.85mg/kg，约0.3mg至约2.15mg/kg，约0.45mg/kg至约1.7mg/kg，约0.15mg/kg至约1.3mg/kg，约0.3mg/kg至约1.15mg/kg，约0.45mg/kg至约1mg/kg，约0.55mg/kg至约0.85mg/kg，约0.65mg/kg至约0.8mg/kg，约0.7mg/kg至约0.75mg/kg，约0.7mg/kg至约2.15mg/kg，约0.85mg/kg至约2mg/kg，约1mg/kg至约1.85mg/kg，约1.15mg/kg至约1.7mg/kg，约1.3mg/kg mg至约1.6mg/kg，约1.35mg/kg至约1.5mg/kg，约2.15mg/kg至约3.6mg/kg，约2.3mg/kg至约3.4mg/kg，约2.4mg/kg至约3.3mg/kg，约2.6mg/kg至约3.15mg/kg，约2.7mg/kg至约3mg/kg，约2.8mg/kg至约3mg/kg，或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg。
在一些实施方式中，rTIL和eTIL的有效剂量的范围为约0.01mg/kg至约4.3mg/kg，约0.15mg/kg至约3.6mg/kg，约0.3mg/kg至约3.2mg/kg。kg，约0.35mg/kg至约2.85mg/kg，约0.15mg/kg至约2.85mg/kg，约0.3mg至约2.15mg/kg，约0.45mg/kg至约1.7mg/kg，约0.15mg/kg至约1.3mg/kg，约0.3mg/kg至约1.15mg/kg，约0.45mg/kg至约1mg/kg，约0.55mg/kg至约0.85mg/kg，约0.65mg/kg至约0.8mg/kg，约0.7mg/kg至约0.75mg/kg，约0.7mg/kg至约2.15mg/kg，约0.85mg/kg至约2mg/kg，约1mg/kg至约1.85mg/kg，约1.15mg/kg至约1.7mg/kg，约1.3mg/kg mg至约1.6mg/kg，约1.35mg/kg至约1.5mg/kg，约2.15mg/kg至约3.6mg/kg，约2.3mg/kg至约3.4mg/kg，约2.4mg/kg至约3.3mg/kg，约2.6mg/kg至约3.15mg/kg，约2.7mg/kg至约3mg/kg，约2.8mg/kg至约3mg/kg，或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg。
在一些实施方式中，rTIL的有效剂量范围为约1mg至约500mg，约10mg至约300mg，约20mg至约250mg，约25mg至约200mg，约1mg至约50mg，约5mg至约45mg，约10mg至约40mg，约15mg至约35mg，约20mg至约30mg，约23mg至约28mg，约50mg至约150mg，约60mg至约140mg，约70mg至约130mg，约80mg至约120mg，约90mg至约110mg，约95mg至约105mg，约98mg至约102mg，约150mg至约250mg，约160mg至约240mg，约170mg至约230mg，约180mg至约220mg，约190mg至约210mg，约195mg至约205mg，或约198至约207mg。
在一些实施方式中，rTIL和eTIL的有效剂量的范围为约1mg至约500mg，约10mg至约300mg，约20mg至约250mg，约25mg至约200mg，约1mg至约50mg，约5mg至约45mg，约10mg至约40mg，约15mg至约35mg，约20mg至约30mg，约23mg至约28mg，约50mg至约150mg，约60mg至约140mg，约70mg至约130mg，约80mg至约120mg，约90mg至约110mg，或约95mg至约105mg，约98mg至约102mg，约150mg至约250mg，约160mg至约240mg，约170mg至约230mg，约180mg至约220mg，约190mg至约210mg，约195mg至约205mg，或约198至约207mg。
有效量的rTIL和/或eTIL可以通过具有类似用途的任何可接受的施用方式以单剂量或多剂量施用，包括通过输注到血流中，输注到肿瘤中，动脉内注射，静脉内，腹膜内，肠胃外，肌内，皮下，局部，通过鼻内施用，通过移植，或通过吸入。
实施例
现在参考以下实施例描述本文包括的实施方式。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且本文包括的公开内容决不应被解释为限于这些实施例，而是应该被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
实施例1-肿瘤消化物中rTIL的扩增
根据以下示例性步骤，消化肿瘤残余物。该步骤描述了将新鲜人肿瘤样品消化成活细胞单细胞悬液，以获得并分离肿瘤浸润淋巴细胞，并且可以使用DNase-胶原酶-透明质酸酶(DCH)方法(如本文所述)或MACS人肿瘤解离试剂盒(TDK)(Miltenyi Biotech,Inc.,San Diego,CA,美国)消化方案用于解离人肿瘤。
CM1+IL-2工作培养基的制备如下。将500mL RPMI 1640、200m ML-谷氨酰胺和100mL人AB血清置于37℃水浴中平衡至少30分钟。将来自水浴的该混合物的内容物与来自冰箱的1000Xβ-EG储备液和50mg/mL庆大霉素储备溶液一起转移至生物安全柜。从RPMI1640中取出50mL，添加：50mL人AB血清，5mL 200mM的L-谷氨酰胺，500μL1000Xβ-SPE和500μL50mg/mL的庆大霉素。为了使培养基1完全，添加500μL 6000U/mL的重组人rhIL-2(CellGenix,Inc.,朴茨茅斯,NH,美国)。
使用以下步骤，制备10×DCH储备溶液，如图1所示。首先，计算重构(reconstitute)各个酶以获得所需工作溶液浓度所需的体积。例如重构15mL 150,000U(国际单位)的脱氧核糖核酸酶以获得10,000U/mL的工作溶液。等分剩余的工作溶液。在室温下预先计算的一定量的无菌Hanks'平衡盐溶液(HBSS，Sigma H6648,Sigma-Aldrich Co.,圣路易斯,MO,美国，或等同物)中，重构冻干酶。清除瓶子侧面和保护膜上的残余粉末。上下移液几次并旋转以确保完全重构。将100,000U DNase(来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I，SigmaD5025或同等物)、1g胶原酶(来自溶组织梭菌的Sigma C5138，或等同物)和100mg透明质酸酶(来自绵羊睾丸的V型，Sigma H6254或等同物)加至终体积为100mL的无菌HBSS中，以获得用于人肿瘤的10×三酶消化储备溶液。将剩余的酶工作溶液等分成10,000U/mL Dnase、10mg/mL胶原酶和1mg/mL透明质酸酶。终体积为100mL的10×DCH储备溶液具有以下浓度：DNase I 1000U/mL、胶原酶10mg/mL和透明质酸酶1mg/mL。用HBSS将10×DCH储备溶液稀释至1×DCH用于肿瘤消化。
同时，为了比较DCH消化物与MACS TDK，如果需要，将MACS TDK中包含的试剂制备成制造商规格。在室温下解冻保存于-20℃的等分试样。
可以如下制备肿瘤用于消化。取出来自原代和次代包装的肿瘤，称量小瓶，记录质量，然后转移至生物安全柜中。将肿瘤切成碎片，或粉碎肿瘤。选择几个碎片用于消化方案，并且如果需要，保留另外的碎片用于组织学和DNA提取。
基于DCH的示例性肿瘤消化步骤描述于图2中，并且包括以下步骤。必须将10×DCH储备溶液稀释至1×工作浓度以用于消化。计算消化肿瘤所需的总体积，即每cm2肿瘤约5mL溶液。通过将1份DCH添加至9份HBSS，将DCH工作溶液稀释至1×。以上述计算的HBSS体积将肿瘤碎片转移至50mL Flacon锥形管。添加上述计算的10×DCH的量，盖上管，可选地密封。转移至MACS管旋转器(Miltenyi Biotech,Inc.,圣地亚哥,CA,美国)，在37℃、5％CO2湿化的培养箱中恒定旋转1至2小时。或者，可以使肿瘤碎片在室温下以恒定旋转消化过夜。将0.70μm过滤器连接至无菌Falcon锥形管。从培养箱中取出消化液，并使用移液管将所有消化内容物添加至过滤器。使用无菌注射器柱塞的针头将任何固体推过过滤器。将管加盖且管内装有DCH消化的rTIL。如本文其他地方所述，细胞可以被洗涤来移除消化混合物(digest cocktail)、计数，并将重新悬浮于培养基中用于REP扩增。
如需pre-REP步骤以提供eTIL用于与rTIL相比较(如在下述实施例中)，使用DCH消化的rTIL接种G-REX烧瓶用于pre-REP。标记所需G-REX 10烧瓶的数量并添加消化物。添加CM1+IL-2至获得40mL终体积。将烧瓶置于37℃、5％CO2的加湿培养箱中。可以使用NexcelomCellometer K2进行细胞计数和活力测定，将40μL样品添加至40μL吖啶橙和碘化丙锭(AOPI)双染色溶液，根据需要稀释样品并且对各个消化物或条件重复2次计数。充分混合样品以避免结块，并在检测各个样品之前迅速移液混匀AOPI，以确保活力不受碘化丙锭的细胞毒性作用影响。
据发现，由于若干原因，发现上述DCH步骤令人惊讶地优于MACS TDK酶消化混合物和步骤。使用MACS TDK混合物进行了三次独立实验。使用黑素瘤进行第一个实验，通过使用MACS系统的流式细胞术观察到rTIL中CD4+/CD8+群的显著下调。在DCH消化的rTIL中未观察到这种作用，表明MACS消化过程可能不利地影响表面标志物的表达。在第二个实验中，使用雌激素受体阳性(ER+)/孕酮受体阳性(PR+)乳腺肿瘤，并且MACS消化使24孔G-REX板中出现碎片，而DCH消化确实导致了明显的物质，表明MACS酶混合物消化不良。最后，使用MACS TDK酶消化混合物和步骤对不同ER+/PR+乳腺肿瘤的第二次消化导致了rTIL的不良产率和活力。
实施例2-来自肿瘤消化物的rTIL的表型特征
在pre-REP期间，肿瘤常驻(tumor-resident)的TIL以eTIL的形式迁移(emigrate)并增殖。用于制备eTIL用于与rTIL相比较的pre-REP时长可在11至21天之间变化，取决于细胞生长。通常丢弃残余的肿瘤碎片(残余物)，并用经辐照的PBMC饲养细胞、抗CD3和IL-2对扩增的eTIL进行REP。根据如上所述的实施例1消化后，研究pre-REP后保留在肿瘤残余物(rTIL)中的存活TIL，以评估它们与eTIL相比的功能和表型。
评估并比较来自黑色素瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤和结直肠肿瘤(n＝17)中的肿瘤残余物和pre-REP悬浮液(即扩增的细胞群)的细胞群。有趣的是，如本文所测定的，rTIL始终在表型上不同于eTIL，并且由各种标志物(包括LAG3、TIM-3、PD-1、CD69、CD45RO、CD27、CD56、CD57和HLA-DR)的差异表达而呈现。肿瘤残余物和pre-REP群的REP导致可比较的扩增，但与pre-REP结果相似，两个群之间关于LAG3、TFM-3、HLA-DR和CD28的表型特征具有差异。
评估并比较从黑色素瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤和结直肠肿瘤(n＝9)获得的rTIL和eTIL。如通过各种标志物的差异表达测定的，肿瘤rTIL始终在表型上不同于eTIL(表3和图3)。
表3：九种肿瘤的表型特征结果总结
*P-值表示使用学生非配对T检验的rTIL和eTIL之间的差异。
rTIL与eTIL相比的基本差异是：CD69表达增加(CD4+中的7倍中值荧光强度(MFI))(p<0.0001)，LAG3表达减少(CD8+T细胞中的2倍MFI)(p<0.05)和TIM3表达减少(分别在CD8+和CD4+T细胞中的3倍和2倍MFI)(p<0.05/0.01)，CD154表达减少(CD4+T细胞中的3倍MFI)(p<0.01)，以及CD56表达减少(5％)(p<0.05)。令人惊讶的是，rTIL和eTIL的REP导致了可比较的扩增，类似于实施例4中描述的pre-REP结果。在REP之后rTIL的表型特征维持，具有表达至LAG3、TIM3和CD28的个体水平的保真度(fidelity)，如在实施例4中描述的。此外，由于CD57是终末分化(terminal differentiation)相关的受体，因此结果表明rTIL的终末分化程度低于eTIL(即，更不容易死亡)。
在图3和表3中报告的结果显示，eTIL和rTIL在各种肿瘤组织学中表现出明显且一致的表型差异。最值得注意的是，rTIL中所谓的“衰竭标志物”(LAG3和TIM3)的表达减少了。有趣的是，在eTIL和rTIL中PD-1的表达相似。此外，与eTIL相比，rTIL中CD69表达增强，但两个群之间的KLRG1表达相似(数据未显示)。这提供了进一步的证据表明rTIL可能不是终末分化的，而是在表型上类似于组织常驻的效应记忆T细胞。
总的来说，这些结果已经确定了：保留在肿瘤中或在肿瘤外扩增或发展的细胞群在生物学以及与迁移和保留相关的信号方面具有显著差异。
实施例3-来自肿瘤消化物的rTIL的功能表征
T细胞功能障碍与线粒体功能丧失直接相关。Sharping等，Immunity 2016,45,374-88。此外，重编程T细胞以促进线粒体生物发生(mitochondrial biogenesis)可以增加瘤内T细胞的持久性和功能。因此，更具代谢活性的T细胞在对肿瘤产生有效免疫应答中起关键作用。为了在功能上评估eTIL和rTIL，通过Mitotracker和2-(N-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)比较eTIL和rTIL的代谢能力。2-NBDG可用于测量葡萄糖摄取，但不能详细说明主要代谢过程；即，线粒体中的完全氧化或仅糖酵解和产生乳酸。Mitotracker染料(ThermoFisher Scientific,Inc.,沃尔瑟姆,MA,美国)可用于测量线粒体质量。如图4所示，通过该方法比较eTIL和rTIL证明了rTIL中葡萄糖摄取的增强。这个结果令人惊讶，因为预期直接从肿瘤中释放的rTIL会糖酵解更强；然而，当评估rTIL的线粒体质量时，与eTIL相比，rTIL表现出稍微增强的Mitotracker水平。这些结果表明，当预期rTIL活性较低时，rTIL与eTIL相比具有更高的代谢活性，并且表明与eTIL相比，rTIL可能具有更高的肿瘤免疫应答能力。
为了进一步评估rTIL的功能，用布雷菲德菌素A和涂有抗CD3、抗CD28和抗CD137抗体(DYNABEADS，目录号11162D，可从ThermoFisher Scientific,Inc.,沃尔瑟姆,MA,美国商购获得)的磁珠刺激rTIL过夜，并测量IFN-γ。收获细胞，透化，然后对IFN-γ进行细胞内染色，并通过流式细胞术评估。结果如图5所示。
还用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素刺激细胞，评估TIL产生细胞因子的能力。结果也显示在图5中。还评估了颗粒酶B、TNF-α和IL-17A水平。IL-17A可忽略不计，rTIL和eTIL之间的TNFα或颗粒酶B无差异(数据未显示)。令人惊讶的是，在抗CD3/抗CD28/抗CD137磁珠PMA/离子霉素的条件下，观察到与eTIL相比，rTIL中CD4+亚群的IFN-γ水平略微升高(但在CD8+T细胞中没有)(n＝3)。该数据表明rTIL是功能上具有活力的细胞，并且显示出比eTIL更强的功能能力。
实施例4-来自肿瘤消化物的rTIL和eTIL的REP的比较
用经辐照的PBMC饲养细胞、抗CD3抗体(OKT3)和IL-2对eTIL和rTIL进行14天的快速扩增方案(REP)。在3个独立肿瘤(n＝3)中评估活力和细胞计数，重复2次。通过流式细胞术评估表型表达。观察到rTIL和eTIL的微型-REP(mini-REP)实验成功启动。用抗CD3抗体和饲养细胞的TIL具有相似的REP表现(图6A)，尽管与eTIL相比，rTIL惊人地表现出略微增强的细胞数(p<0.08)。如在REP之前观察到的(参见实施例2)，后REP(post-REP)所得eTIL和rTIL在表型上是不同的。在pre-REP中观察到的许多表型差异在REP期间被保留，例如rTIL中LAG3和TIM3表达的减少(图6B)。
eTIL和rTIL的其他性质的比较可以基于以下结果：(1)深TCR测序，(2)共培养增殖(rTIL/eTIL与细胞因子混合物共培养)和其他功能测定，(3)转录分析测定(例如使用NanoString Technologies NCOUNTER系统)。TCR测序可以评估TCR谱系(包括Vb谱系)的克隆性和/或多样性。还可以评估端粒长度以比较rTIL与eTIL。
实施例5-用rTIL和rTIL与eTIL的组合治疗人类疾病
本发明的rTIL可用于治疗如本文所述的癌症。图7中描述了扩增来自患者肿瘤的rTIL和治疗患者的总体方法流程图。如图所示，该方法允许定制输注给患者的TIL产品中的rTIL对eTIL的比率。可以基于rTIL和eTIL中CD69和/或T细胞衰竭标志物的差异表达，通过本领域普通技术人员已知的亲和力测定或其他细胞分选测定，来选择rTIL对eTIL的比率。
在图8中，时间线显示了从患者肿瘤获得rTIL、在pre-REP之后利用REP阶段扩增来自肿瘤残余物的rTIL、进行淋巴细胞耗竭，以及将rTIL输注至患者体内的示例性方法，与并行的eTIL过程一起示出。
实施例6-评估eTIL和rTIL中的Vβ谱系的研究
评估了eTIL和rTIL在多样性和频率方面的VβT细胞受体谱系的差异。
在该研究中，从以下组织中收获6个pre-REP eTIL/rTIL对：卵巢癌；肾癌(n＝2)以及乳腺癌(TNBC n＝2，ER+PR+n＝1)。将细胞沉淀物置于干冰上运输至iRepertoire(Huntsville，AL，美国)用于RNA提取和Vβ测序。
该研究的结果如图9-10和图14-16所示。特别地，图9和10分别显示了多样性得分和共有CDR3的％。此外，图14、15和16分别显示了卵巢癌、肾癌和三阴性乳腺癌的三个克隆型图，所述克隆型图显示了前50个共有CDR3。
令人惊讶的是，rTIL中的TCRvβ谱系多样性大于eTIL中(图9)。eTIL和rTIL中约30-50％的总CDR3是共有的(图10)，证明总CDR3的大部分在两个群中差异表达。然而，在共有的CDR3中，在两个群中前50个克隆的共有程度最高，表明eTIL和rTIL具有抗原特异性相似的克隆(参见图14-16)。此外，前50个克隆的频率不同，再次表明eTIL和rTIL是显著不同的T细胞群。
实施例7-共培养增殖测定的研究
评估eTIL和rTIL以确定rTIL是否可以在共培养时改变eTIL的增殖状态(反之亦然)。
在该研究中，从以下组织中收获5个pre-REP eTIL/rTIL对：肾癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、黑色素瘤、肺癌和结直肠癌。通过在37℃下酶消化60分钟从肿瘤残余物中分离rTIL。用Cell Trace Yellow对eTIL染色，用Cell Trace Red对rTIL染色，以单独追踪不同的两个群。在37℃下，用IL-2+/-和OKT3(抗CD3抗体)培养1×106eTIL、5×105eTIL+5×105rTIL和1×106rTIL 4天，并通过流式细胞术评估增殖。
该研究的结果如图11所示。在图11中，通过Cell Trace染料的偏移(或稀释染料)证实：与单独的eTIL相比，在使用抗CD3抗体与rTIL共培养时，在所有五种肿瘤中来自CD4+或CD8+群的eTIL表现出增殖能力增强。红色代表eTIL，蓝色代表与rTIL共培养时的eTIL。
实施例8-共培养增殖测定的研究
评估eTIL和rTIL，鉴定rTIL和eTIL的基因表达谱的相似性和/或差异。
在该研究中，使用Nanostring的nCounter技术，该技术采用与mRNA复合(multiplex)的彩色编码条形码以提供基因表达的数字读数。将来自六个匹配的eTIL和rTIL样品的纯化RNA(RNeasy,Qiagen)与nCounter Immunology V2板密码集(panelcodeset)在热循环仪上杂交16小时。密码集由捕获探针和报告探针的混合物组成，密码集在热循环期间通过22bp相互作用与靶RNA复合。将样品装载至12孔SPRINT柱中并在nCounter SPRINT装置上检测。计数数据以自定义RCC格式导出，并与RLF文件匹配，RLF文件将基因名称与探测ID匹配。用nSolver 3.0(NanoString Technologies,Inc.)进行归一化和分析。
该研究的结果显示于图12和13中。如图12和13所示，当比较eTIL和rTIL时，基因表达谱显著不同(参见图12中的热图)。与eTIL相比，rTIL中的有几种基因显著上调或下调(图13)。
序列表
<110> 艾欧凡斯生物治疗公司（Iovance Biotherapeutics, Inc.）
<120> 残余肿瘤浸润淋巴细胞及其制备和使用方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Muromonab重链
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Muromonab轻链
<400> 2
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 3
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组人IL-2
<400> 3
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
115 120 125
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 4
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 阿地白介素
<400> 4
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组人IL-4
<400> 5
Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn
1 5 10 15
Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp
20 25 30
Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg
35 40 45
Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr
50 55 60
Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu
65 70 75 80
Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly
85 90 95
Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn
100 105 110
Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 6
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组人IL-7
<400> 6
Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
20 25 30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
35 40 45
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
50 55 60
Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu
65 70 75 80
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
85 90 95
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
100 105 110
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
115 120 125
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
130 135 140
Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组人IL-15
<400> 7
Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser
115
<210> 8
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-21
<400> 8
Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val
1 5 10 15
Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro
20 25 30
Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys
35 40 45
Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg
50 55 60
Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr
65 70 75 80
Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser
100 105 110
Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly
115 120 125
Ser Glu Asp Ser
130

Claims (30)

1.一种制备用于过继性T细胞疗法的残余肿瘤浸润淋巴细胞rTIL的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，肿瘤组织包含肿瘤浸润淋巴细胞TIL；
(b)破碎所述肿瘤组织；
(c)在透气性容器中，用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，提供肿瘤残余物和新生TIL(eTIL)；
(d)移除至少多个eTIL；
(e)使用消化混合物将肿瘤残余物酶消化为肿瘤残余细胞；以及
(f)在透气性容器中，用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞，提供数量扩增的残余肿瘤浸润淋巴细胞rTIL；
其中，相对于eTIL，rTIL表达T细胞衰竭标志物的水平降低，所述T细胞衰竭标志物选自TIM3、LAG3、TIGIT、PD-1、CTLA-4，以及它们的组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤组织选自：黑素瘤肿瘤组织、头颈部肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、卵巢肿瘤组织和急性髓样白血病骨髓或肿瘤组织。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述经辐照的饲养细胞包括经辐照的同种异体外周血单核细胞。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，IL-2以约3000IU/mL的初始浓度存在于第二细胞培养基中，OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在于第二细胞培养基中。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，相对于eTIL，rTIL中的CD8+和CD4+T细胞的至少一种T细胞衰竭标志物减少至少10％。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，T细胞衰竭标志物是CD8+T细胞中的LAG3标志物，相对于eTIL，rTIL中的LAG3标志物减少至少2倍。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，T细胞衰竭标志物是CD8+T细胞中的TIM3标志物，相对于eTIL，rTIL中的LAG3标志物减少至少3倍。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，T细胞衰竭标志物是CD4+T细胞中的TIM3标志物，相对于eTIL，rTIL中的LAG3标志物减少至少2倍。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，通过流式细胞术检测不到rTIL中的TIM3标志物和LAG3标志物。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，相对于eTIL中的CD56+表达，rTIL中的CD56+表达减少至少3倍。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，相对于eTIL中的CD69+表达，rTIL中的CD69+表达增加至少2倍。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，消化混合物包含脱氧核糖核酸酶、胶原酶和透明质酸酶。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述第一细胞培养基还包含细胞因子，所述细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21，以及它们的组合。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述第二细胞培养基还包含细胞因子，所述细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-15、IL-21，以及它们的组合。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括冷冻保存数量扩增的rTIL以形成冷冻保存的rTIL群的步骤。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述方法还包括解冻所述冷冻保存的rTIL群的步骤。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述rTIL基本上不含eTIL。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，用第二细胞培养基扩增肿瘤残余细胞的步骤包括：将eTIL添加到第二细胞培养基中以提供选定的rTIL对eTIL的比率。
19.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将eTIL添加到rTIL中以提供选定的rTIL对eTIL的比率的步骤。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中，所述选定的rTIL对eTIL的比率为至少1％的rTIL对eTIL。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述选定的rTIL对eTIL的比率为至多99.9％的rTIL对eTIL。
22.如权利要求18或19所述的方法，其中，所述选定的rTIL对eTIL的比率选自约1：99，约5：95，约10：90，约15：85，约20：80，约25：75，约30：70，约35：65，约40：60，约45：55，约50：50，约55：45，约60：40，约65：35，约70：30，约75：25，约80：20，约85：15，约90：10，约95：5以及约99：1的rTIL对eTIL。
23.一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，其中，所述治疗包括向患者递送治疗有效量的rTIL，所述rTIL根据权利要求1至22中任一项所述的方法制备。
24.一种治疗需要这种治疗的患者的癌症的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)根据权利要求1至22中任一项所述的方法，从患者切除的肿瘤中获得rTIL；
(b)在给患者施用rTIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者；
(c)给患者施用治疗有效量的rTIL，其中，在给患者施用之前，可以任选地冷冻保存和解冻所述治疗有效量的rTIL；以及
(d)在给患者施用rTIL之后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
25.如权利要求23至24中任一项所述的方法，其中，治疗有效量的eTIL以与rTIL的混合物形式被同时施用给患者。
26.如权利要求23至25中任一项所述的方法，其中，所述非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以60mg/m2/天的剂量持续2天施用环磷酰胺、然后以25mg/m2/天的剂量持续5天施用氟达拉滨的步骤。
27.如权利要求23至26中任一项所述的方法，其中，所述高剂量IL-2方案包括：每8小时静脉推注600,000或720,000IU/kg的阿地白介素或其生物仿制药或变体15分钟，直至耐受。
28.如权利要求23至27中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自黑色素瘤、双重难治性黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、肾细胞癌、急性髓样白血病、结直肠癌和肉瘤。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述癌症为乳腺癌，所述乳腺癌选自三阴性乳腺癌、雌激素受体阳性乳腺癌、孕激素受体阳性乳腺癌和雌激素受体阳性/孕激素受体阳性乳腺癌。
30.如权利要求28所述的方法，其中，所述癌症为肺癌，所述肺癌选自非小细胞肺癌和小细胞肺癌。
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