CN116948964A - 肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法及其用途 - Google Patents
肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法及其用途，所述方法包括：使经扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。本申请还涉及一种使用本申请的肿瘤浸润淋巴细胞预防和/或治疗肿瘤的方法。
Description
本申请为国际申请日2021年11月18日、国际申请号PCT/CN2021/131377于2022年6月20日进入中国国家阶段、申请号202180007175.3、发明名称“肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法及其用途”的分案申请。
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法及其用途。
背景技术
使用过继性自体转移肿瘤浸润淋巴细胞治疗肿瘤是一种治疗预后不良患者的有效方法。但是过继性自体转移肿瘤浸润淋巴细胞治疗肿瘤需要大量的肿瘤浸润淋巴细胞，而且目前来自患者肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞的扩增能力弱，细胞功能不强。因此如何提供一种稳健可靠的肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法是亟待解决的问题。
发明内容
本申请提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞的培养方法，所述培养方法具有选自以下组的一种或多种的效果：TIL细胞的数量增加，TIL细胞的分泌能力提高，TIL细胞的杀伤能力提高，TIL细胞的比例改变，中心记忆T细胞比例增加，调节性T细胞的比例降低，活化T细胞比例增加，肿瘤特异性T细胞比例增加，和干细胞样T细胞比例增加。
一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：使经扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，所述经扩增的TIL为经过体外扩增的TIL。
在一种实施方式中，所述经扩增的TIL为使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增后获得的TIL。
在一种实施方式中，与所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL相比，所述经扩增的TIL的数量增加至少1倍。
在一种实施方式中，其中所述经扩增的TIL经所述共培养后数量增加至至少50倍。
在一种实施方式中，其中所述经扩增的TIL经所述共培养后数量增加至约50-20000倍。
另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中在单个体外扩增阶段中，使经体外扩增和/或未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在第一个阶段的体外扩增中，使所述未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少两个阶段的体外扩增，且在第二个阶段的体外扩增中，使经体外扩增TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过第一阶段体外扩增和第二阶段体外扩增，且在所述第二阶段体外扩增中，使所述TIL与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，所述第一阶段体外扩增进行至少约7天。
在一种实施方式中，所述第一阶段体外扩增进行约7天至约14天。
在一种实施方式中，所述第二阶段体外扩增进行至少约7天。
在一种实施方式中，所述第二阶段体外扩增进行约7天至约14天。
在一种实施方式中，与在单个体外扩增阶段中使经体外扩增和/或未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触同时与饲养细胞共培养相比，在单个体外扩增阶段中使经体外扩增和/或未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养提高TIL的扩增效果和/或显示出改善的TIL特性。
在一种实施方式中，所述改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
在一种实施方式中，所述提高TIL的扩增效果包括选自以下组的一种或多种：增加TIL细胞的数量，改变TIL细胞的比例，提高TIL细胞的分泌能力，和提高TIL细胞的杀伤能力。
在一种实施方式中，所述改变TIL细胞的比例包括选自以下组的一种或多种：增加TIL中中心记忆T细胞比例，降低调节性T细胞的比例，增加活化T细胞比例，增加肿瘤特异性T细胞比例，和增加干细胞样T细胞比例。
在一种实施方式中，所述一定时间为至少约2小时。
在一种实施方式中，所述一定时间为约6到72小时。
在一种实施方式中，所述一定时间为约12到48小时。
在一种实施方式中，所述一定时间为约6、12、24、48或72小时。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约12小时或更多时间之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，使所述TIL在与所述T细胞激活剂和/或所述T细胞生长因子接触约12小时、约24小时、约48小时或约72小时之后与所述饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，所述T细胞共刺激分子选自以下组的一种或多种：CD80、CD86、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT、特异性结合CD3的抗体、特异性结合CD28的抗体、特异性结合HVEM的抗体、特异性结合CD40L的抗体、特异性结合OX40的抗体和特异性结合4-1BB的抗体。例如，T细胞共刺激分子选自以下组的一种或多种：分化簇80(CD80)、CD86、CD276、4-1BB配体(4-1BBL)、CD27、CD30、CD134、CD275、CD40、CD258、以及它们的功能活性片段。例如，T细胞共刺激分子选自以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、疱疹病毒进入介质(HVEM)、CD40L、OX40和4-1BB。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含CD3激动剂。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含抗CD3的抗体和/或其抗原结合片段。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含CD28激动剂。
在一种实施方式中，所述T细胞激活剂包含抗CD28的抗体和/或其抗原结合片段、CD80和/或其功能活性片段和/或CD86和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，所述T细胞共刺激分子为特异性结合CD3的抗体。
在一种实施方式中，使一种所述T细胞共刺激分子、或多种T细胞共刺激分子的每一种与所述TIL单独接触。
在一种实施方式中，使多种所述T细胞共刺激分子与所述TIL同时接触。
在一种实施方式中，分别单独加入一种所述T细胞共刺激分子、或多种T细胞共刺激分子的每一种到所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，同时加入多种所述T细胞共刺激分子到所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，一种所述T细胞共刺激分子以以下组的形式的一种或多种加入到所述TIL的细胞培养基中：表达所述T细胞共刺激分子的工程化细胞，包含所述T细胞共刺激分子的纳米颗粒，和包含所述T细胞共刺激分子的聚合物。
在一种实施方式中，多种所述T细胞共刺激分子以选自以下组的形式加入到所述TIL的细胞培养基中：混合物，融合蛋白，表达多种所述T细胞共刺激分子的工程化细胞，包含多种所述T细胞共刺激分子的纳米颗粒，和包含多种所述T细胞共刺激分子的聚合物。
在一种实施方式中，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、和γ干扰素。
在一种实施方式中，所述T细胞生长因子选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、和γ干扰素。
在一种实施方式中，所述T细胞生长因子为IL-2和/或其功能活性片段。
在一种实施方式中，每一种所述T细胞生长因子在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度各自独立地为至少约300IU/mL。
在一种实施方式中，所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少1000IU/mL。
在一种实施方式中，使一种所述T细胞生长因子、或多种T细胞生长因子的每一种与所述TIL单独接触。
在一种实施方式中，使多种所述T细胞生长因子与所述TIL同时接触。
在一种实施方式中，分别单独加入一种所述T细胞生长因子、或多种T细胞生长因子的每一种到所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，同时加入多种所述T细胞生长因子到所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，一种所述T细胞生长因子以选自以下组的形式的一种或多种加入到所述TIL的细胞培养基中：表达所述T细胞生长因子的工程化细胞，包含所述T细胞生长因子的纳米颗粒，和包含所述T细胞生长因子的聚合物。
在一种实施方式中，多种所述T细胞生长因子以选自以下组的形式的一种或多种加入到所述TIL的细胞培养基中：混合物，融合蛋白，表达多种所述T细胞生长因子的工程化细胞，包含多种所述T细胞生长因子的纳米颗粒，和包含多种所述T细胞生长因子的聚合物。
在一种实施方式中，所述TIL为源自肿瘤组织的碎片的TIL和/或源自冷冻保存后复苏的TIL。在一种实施方式中，所述TIL为源自所述肿瘤组织的碎片的TIL。
在一种实施方式中，所述碎片的体积约为1-27立方毫米。
在一种实施方式中，所述碎片的体积约为27立方毫米。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包括抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞包括选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞，和人工抗原呈递细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
在一种实施方式中，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
在一种实施方式中，所述TIL和饲养细胞共培养包括将所述饲养细胞的表面与所述TIL的表面相接触。
在一种实施方式中，所述TIL和饲养细胞共培养包括将所述饲养细胞加入所述TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，以约40:1-约400:1的所述饲养细胞与所述TIL的比例，将所述饲养细胞添加至所述TIL的细胞培养基中。
在另一方面，本申请提供一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述TIL经过本申请所述的方法获得。
在另一方面，本申请提供一种组合物，其包含本申请所述的TIL。
在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请所述的TIL和/或本申请所述的组合物，以及任选地药学上可接受的载体。
在另一方面，本申请提供一种影响肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者施用本申请所述的TIL和/或本申请所述的药物组合物。例如，所述影响肿瘤细胞生长的方法可以是体外方法。例如，所述影响肿瘤细胞生长的方法可以是离体方法。例如，所述影响肿瘤细胞生长的方法可以是非诊断且非治疗目的方法。例如，所述影响肿瘤细胞生长的方法可以是非治疗目的方法。例如，所述影响肿瘤细胞生长的方法可以是非诊断目的方法。
在另一方面，本申请提供一种本申请所述的TIL和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
在一种实施方式中，所述肿瘤选自实体瘤。
在一种实施方式中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
在另一方面，本申请提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包括向受试者施用本申请所述的TIL和/或本申请所述的药物组合物。
在一种实施方式中，所述肿瘤选自实体瘤。
在一种实施方式中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
在另一方面，本申请提供一种本申请所述的TIL和/或本申请所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗肿瘤。
在另一方面，本申请提供一种本申请所述的TIL和/或本申请所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗肿瘤，其中，所述肿瘤选自实体瘤。
在另一方面，本申请提供一种本申请所述的TIL和/或本申请所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗肿瘤，其中，所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是针对供者A-1、A-2、A-3和A-4，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养时，TIL增殖能力对比。
图2显示的是针对供者B-1和B-2，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL中，CD8+中或CD4+中CD45RA-CCR7+中心记忆T细胞(Tcm)比例对比。
图3显示的是针对供者B-3、B-4和B-5，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL中，CD8+中或CD4+中CD45RA-CCR7+中心记忆T细胞(Tcm)比例对比。
图4显示的是针对供者C-1和C-2，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL中，CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)比例对比。
图5显示的是针对供者D-1和D-2，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL中，CD8+中或CD4+中PD1+活化T细胞和LAG3+活化T细胞比例对比。
图6显示的是针对供者D-3、D-4和D-5，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL中，CD8+中CD28+活化T细胞比例对比。
图7显示的是针对供者E-1和E-2，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL中，CD8+中或CD4+中CD103+CD39+肿瘤特异性T细胞比例对比。
图8显示的是针对供者F-1和F-2，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL中，TCF1+干细胞样T细胞比例对比。
图9显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞增殖能力结果图。
图10显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD45RA-CCR7+中心记忆T细胞(Tcm)比例结果图。
图11显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的TCF1+干细胞样T细胞比例。
图12显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)比例。
图13显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(PD1+)比例。
图14显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD103+CD39+肿瘤特异性T细胞比例。
图15显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(CD28+)比例。
图16显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(41BB+)比例。
图17显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(CD25+)比例。
图18显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。
图19显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞因子分泌检测结果。
图20显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞增殖能力结果图。
图21显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD8+T细胞比例。
图22显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD45RO+CD62L+T细胞比例。
图23显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的NK T细胞比例。
图24显示的是加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)比例。
图25显示的是加入OKT3和IL-2的48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞杀伤能力结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“表达”通常是指编码目标多肽的基因在细胞内发生的转录和/或翻译过程。可以通过测量存在于细胞中的相应mRNA的量来确定宿主细胞中编码目标多肽的基因的转录水平。例如，可通过PCR或通过RNA杂交对编码目标多肽的基因转录的mRNA进行定量测量(参见Sambrook等，分子克隆：实验手册，ColdSpring Harbor LaboratoryPress(1989))。可以通过多种方法测量编码目标多肽的基因的翻译水平，例如通过ELISA，通过多肽生物活性测试，或通过蛋白质印迹或放射免疫测试法(参见Sambrook等，同上)。
在本申请中，术语“一个阶段的体外扩增”、“单个体外扩增阶段”、或“第一个阶段的体外扩增”等中的“阶段”通常是指TIL在体外经过的一段扩增过程。在一种实施方式中，每一个阶段之间可以是通过TIL细胞数量的变化来划分的，在一种实施方式中，当TIL细胞的数量增加至少约1倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一些实施方式中，当TIL细胞的数量增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一种实施方式中，每一个阶段之间也可以是通过TIL细胞培养的条件来划分的。在一种实施方式中，当细胞培养基中添加了或补充添加了T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一种实施方式中，当TIL细胞进行了离心和/或细胞洗涤后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一种实施方式中，每一个阶段之间也可以是通过TIL细胞培养的天数来划分的。在一种实施方式中，当TIL细胞体外培养约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约30天、约40天、约50天或约100天后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。
在本申请中，术语“第一个阶段的体外扩增”通常是指从组织中获得初级TIL后，使用T细胞生长因子进行扩增的阶段。在一种实施方式中，所述组织可以是肿瘤组织。在一种实施方式中，所述扩增可以是自体或者异体进行的体内扩增，或者可以是体外扩增。所述第一阶段扩增也可以称为preREP(快速扩增前)阶段。
在本申请中，术语“第二个阶段的体外扩增”通常是指从受试者体内取出的组织并进行扩增后，再次进行扩增的阶段。在一种实施方式中，与经第一阶段扩增的TIL相比，所述经第二阶段扩增的TIL细胞数量增加，例如可以增加至少约10倍(或至少约20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或者在一种实施方式中细胞的数量可以增加至少约100倍。在一种实施方式中，第二阶段扩增可以与第一阶段扩增的培养条件不同，例如加入的培养物质可以不同。所述第二阶段扩增也可以称为REP(快速扩增)阶段。
在本申请中，术语“体内”通常是指发生在受试者体内的事件。
在本申请中，术语“体外”通常是指在受试者体外发生的事件。
在本申请中，术语“离体”通常是指涉及对已从受试者体内移除的细胞、组织和/或器官进行治疗或进行手术的事件。在一种实施方式中，该细胞、组织和/或器官可以通过手术或治疗方法返回到受试者的身体。
在本申请中，术语“分泌”通常是指细胞将表达的多肽或蛋白转移到细胞外环境。
在本申请中，术语“分泌能力”通常是指细胞表达多肽或蛋白并将所述多肽或蛋白转移到细胞外环境的能力。
在本申请中，术语“辐照”通常是指通过射线对物质进行的处理。例如，在一种实施方式中，辐照可以是指通过X射线、α射线、β射线或γ射线对物质进行辐照。
在本申请中，术语“工程化细胞”通常是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的细胞。在一种实施方式中，工程化细胞可以经过基因修饰以表达根据本申请的T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子的TIL。
在本申请中，术语“共培养”通常是指将两个或更多个不同群体的细胞在它们之间有一定程度的接触的情况下培养。所述两个或更多个不同群体的细胞的“接触”，在一种实施方式中可以通过直接接触，即其中一个群体的细胞与另一个群体的细胞直接物理接触。或者在一种实施方式中可以通过共用培养基所介导的间接接触。所述共用的培养基可以含有由共培养细胞的至少一个群体所产生和释放的代谢产物，并用于培养另一个群体的细胞。
在本申请中，术语“接触”通常是指两个或更多个不同类型的物质以任何顺序、任何方式以及任何时长接触在一起。在一种实施方式中可以通过直接接触，例如可以将一种饲养细胞、T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子加入TIL细胞的培养基，在一种实施方式中可以通过间接接触，例如可以将饲养细胞产生和释放的代谢产物，用于培养TIL细胞。
在本申请中，术语“混合物”通常是指两个或更多个不同物质的组合。
在本申请中，术语“同时接触”、“共同接触”、“与...接触同时”、“同时”和“共同”通常是指向受试者施用两种以上物质，使得物质同时存在于受试者和/或受试者培养的环境中。同时接触可以包括以不同的组合物同时施用、以不同的组合物在不同时间施用，或以其中存在两种以上活性药物成分的组合物施用。
在本申请中，术语“扩增”通常是指在一段时间内细胞的数量增加若干倍。在一种实施方式中细胞的数量可以增加至少约3倍(或4、5、6、7、8或9倍)，在一种实施方式中细胞的数量可以增加至少约10倍(或20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或者在一种实施方式中细胞的数量可以增加至少约100倍。在本申请中，术语“经扩增”通常是指所述细胞经过上述一种或多种扩增。
在本申请中，术语“聚合物”通常是指由连接在一起的单独化学部分组成的分子，所述部分可相同或不同。在一种实施方式中，术语“聚合物”可以指尾尾相连而形成线性分子的单独化学部分，以及以分支(如“多臂”或“星型”)结构形式连接在一起的单独化学部分。在一种实施方式中聚合物可以包括例如水凝胶、聚乙二醇、或泊洛沙姆。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其具有聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中央疏水链，侧连两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。本申请包含的物质可以与本文所描述的或本领域已知的任何聚合物一起配制，或与它们一起给予。
在本申请中，术语“抗体”通常是指对指定蛋白质或肽或其片段有反应性的免疫球蛋白。此类抗体包括但不限于人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变型抗体、嫁接偶联抗体(即偶联或融合至其它蛋白质、放射性标记物、细胞毒素的抗体)、和体外生成的抗体。抗体可来自任何类的抗体，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD、和IgE，及来自任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗体。抗体可具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如卡帕(κ)或拉姆达(λ)的轻链。所述抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。抗体的恒定区可进行改变，例如突变，以修饰抗体的特性(例如以提高或降低下述一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应器细胞功能、或补体功能)。通常，抗体特异性结合预定抗原，例如与病症有关的抗原，病症例如炎性的、免疫性的、自身免疫性的、神经变性性的、代谢的、和/或恶性的病症。
在本申请中，术语“抗CD3抗体”通常是指靶向CD3的抗体或其变体，例如单克隆抗体，包括人、人源化、嵌合或鼠抗体，其针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体。抗CD3抗体可以包括OKT-3。抗CD3抗体还可以包括其他抗CD3抗体包括例如在一种实施方式中otelixizumab、teplizumab和visilizumab。
在本申请中，术语“IL-2”或“IL2”通常是指称为白细胞介素2的T细胞生长因子，并包括所有形式的IL-2，可以包括在一种实施方式中人和哺乳动物形式、保守性氨基酸取代、糖型修饰或变体，或其活性片段。编码IL2基因的GeneID可以为3558。
在本申请中，术语“抗原呈递细胞”、“抗原递呈细胞”、或“APC”通常是指，在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原的免疫系统细胞，如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC可以加工抗原并将其递呈至T细胞。在一种实施方式中，抗原呈递细胞可以包括选自以下组：外周单个核细胞，树突状细胞，和人工抗原呈递细胞。
在本申请中，术语“TIL特性”通常是指TIL细胞经过本申请培养方法获得的特性。TIL特性的变化可以包含：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量，或它们的任何组合。本申请的变化可以是提高或者降低。在本申请中，术语“扩增效果”通常是指细胞经过扩增后出现的效果。扩增效果的变化可以包括，细胞的数量和/或比例变化，分泌能力变化，杀伤能力变化或表达能力的变化，或它们的任何组合。所述变化可以是提高或者降低。
在本申请中，术语“经扩增”通常是指经过培养以产生细胞的数量的变化，经扩增的细胞也可以产生细胞的数量和/或比例变化，分泌能力变化，杀伤能力变化或表达能力的变化，或它们的任何组合。所述变化可以是提高或者降低。
在本申请中，术语“纳米颗粒”通常是指至少一个尺寸小于100nm的微观颗粒。通常，纳米颗粒具有50nm至500nm(即0.05μm至0.5μm)范围内的直径；在生理环境中结构稳定；且可以容纳更小的分子(如药物或其他生物活性剂)，然后可以将该分子递送至希望的部位。
在本申请中，术语“人工抗原呈递细胞”通常是指人工构建的用于展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原的免疫系统细胞。在一个实施方案中，可以包括分离的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其可以包含表达HLA-A/B/C(编码其的基因GeneID可以为3105、3106或3107)、CD64(编码其的基因GeneID可以为2209)、CD80(编码其的基因GeneID可以为941)、ICOS-L(编码其的基因GeneID可以为23308)和CD58(编码其的基因GeneID可以为965)的细胞，并可以被修饰以表达一种以上共刺激分子，所述以上可以包含本数。
在本申请中，术语“融合蛋白”通常是指含有第一多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物的氨基酸序列和异源多肽或蛋白质(即，不同于第一多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物的第二多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物，或者通常不是第一多肽或蛋白质或其片段、类似物或衍生物的一部分)的氨基酸序列的多肽或蛋白质。在某些情形中，融合蛋白可包含与异源蛋白、多肽或肽融合的预防性或治疗性药物。其中，所述异源蛋白、多肽或肽可以是或不是不同类型的预防性或治疗性药物。例如，可将具有免疫调节活性的两种不同蛋白质、多肽或肽融合到一起形成融合蛋白。在某些情形中，与异源蛋白、多肽或蛋白质融合前的初始多肽或蛋白质的活性相比，融合蛋白可以保留或提高了活性。
在本申请中，术语“杀伤能力”通常是指通过使所述细胞接触有效量的物质从而杀伤靶细胞来实现。在一个实施方案中，所述物质可以是TIL细胞。所述杀伤可以包括通过自身或者促进其它细胞或物质的CDC、凋亡、ADCC、和/或吞噬作用，或通过两种或更多种这些机制的组合以杀伤细胞。
在本申请中，术语“施用”通常是指通过本领域已知的任意途径，将物质递送给有此需要的受试者。药用载体和制剂或组合物也是本领域众所周知的。给药途径可以包括：静脉内的、肌肉内的、真皮内的、皮下的、透皮的、粘膜的、瘤内的和/或粘膜的。
在本申请中，术语“试剂盒”通常是指一起被包装在容器、接受器或其它容器中的两种或更多种组分，其中一种对应于本申请的物质。例如，包含本申请的TIL细胞。
在本申请中，术语“受试者”通常是指细胞或动物，可以是哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(家禽如鸡和鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。受试者包括动物疾病模型，例如肿瘤动物模型，和本领域技术人员已知的其它动物模型。
在本申请中，术语“试剂盒”通常是指一起被包装在容器、接受器或其它容器中的两种或更多种组分，其中一种对应于本申请的物质。例如，包含本申请的TIL细胞。
在本申请中，术语“饲养细胞(feeder)”通常是指体外生长和分泌至少一种因子至培养基并且可以用于支持培养的另一种所关注的细胞的生长的培养细胞。在一种实施方式中，饲养细胞可以包括抗原呈递细胞。
在本申请中，术语“特异性结合”通常是指识别特异性抗原，但是基本不识别或结合样品中其它分子的抗体。例如，如果一种抗体可以特异性结合来自一个物种的所述特异性抗原，则所述抗体还可以特异性结合来自其它的一个或多个物种的所述抗原或同源抗原。这种种间反应性本身可以不会改变抗体作为特异性的分类。在某些情形中，特异性结合至抗原的抗体还可以结合至抗原的不同等位形式。
在本申请中，术语“完整的培养过程”通常是指将细胞从患者体内分离的肿瘤组织中分离开始，经过一次或一次以上的扩增，最终获得可以施用于受试者的细胞的完整过程。
在本申请中，术语“细胞培养基”通常是指细胞例如哺乳动物细胞在其中生长的营养液。细胞培养基的配制在本领域中是熟知的。典型地，细胞培养基包括缓冲液、盐、碳水化合物、氨基酸、维生素以及必要的微量元素。细胞培养基可以含有或不含有血清、蛋白胨、和/或蛋白质。细胞培养基可以补充有另外的组分或浓度增加的组分，如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲液、抗生素、脂质、微量元素等，这取决于有待培养的细胞的要求和/或所希望的细胞培养参数。
在本申请中，术语“药物制剂”或“药物组合物”通常是指一种制备物，所述制备物可以允许有效成分的生物活性有效，并且可以不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。这类制剂是无菌的。“可药用的”赋形剂(载体、添加物)是可以合理地施用至受试哺乳动物以提供有效剂量的所用有效成分的那些赋形剂。
在本申请中，术语“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”通常是指最初作为白细胞获得的细胞群，所述细胞已经离开受试者的血流并迁移到肿瘤中。TIL可以包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17CD4+T细胞、天然杀伤细胞、树突细胞和M1巨噬细胞。TIL可以包括初级TIL和次级TIL。“初级TIL”可以是从受试者组织样品获得的那些TIL细胞，“次级TIL”可以是本申请中已扩增或经扩增的任何TIL细胞群。在一些实施方式中，所述肿瘤浸润淋巴细胞可以是未经分离纯化的，或者可以是与肿瘤细胞相互浸润的。在一种实施方式中，本申请的TIL可以是指TIL细胞群。
在本申请中，“CD4+细胞”通常是指CD4阳性的细胞，例如可以是T细胞。术语“CD4+细胞”，“CD4阳性细胞”可以同义使用。这些细胞可通过本领域知道的方法来鉴定，例如通过用荧光标记的针对CD4的抗体对细胞染色和使用荧光激活细胞分选。例如，已有的数据可以证明，CD4+细胞比例的提高可以使得细胞群分泌IFN-γ和/或TNF的能力提高，并可以提高T细胞群的促进肿瘤抑制的效果。例如，请见Tay,R.E.,Richardson,E.K.等人(2020).CancerGene Therapy,1-13.但是，本领域缺少一种提高CD4+细胞比例的方法，本申请可以提供一种影响CD4+细胞比例的方法。
在本申请中，“CD8+细胞”通常是指CD8阳性的细胞，例如可以是T细胞。术语“CD8+细胞”，“CD8阳性细胞”可以同义使用。这些细胞可通过本领域知道的方法来鉴定，例如通过用荧光标记的针对CD8的抗体对细胞染色和使用荧光激活细胞分选。
在本申请中，术语“中心记忆T细胞”通常是指具有长期记忆性的，并能够接受抗原再刺激的T细胞。中心记忆T细胞可以具有CD45RA-CCR7+的表型，例如可以是通过CD45RA-和CCR7+来鉴定中心记忆T细胞。又例如，中心记忆T细胞可以具有CD45RO+CD62L+的表型，例如可以是通过CD45RO+和CD62L+来鉴定中心记忆T细胞。中心记忆T细胞可以相比普通T细胞具有更强的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“调节性T细胞”通常是指一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群。调节性T细胞可以具有CD4+CD25+Foxp3+的表型，例如可以是通过CD4+、CD25+和Foxp3+来鉴定调节性T细胞。调节性T细胞可以具有抑制T细胞的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“活化T细胞”通常是指经过活化而可以具有抗肿瘤生长的能力的T细胞。活化T细胞可以具有PD1+、LAG3+或CD28+的表型，例如可以是通过PD1+、LAG3+或CD28+来鉴定活化T细胞。活化T细胞可以具有抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“肿瘤特异性T细胞”通常是指可以特异性抗肿瘤生长的T细胞。肿瘤特异性T细胞可以具有CD103+CD39+的表型，例如可以是通过CD103+和CD39+来鉴定肿瘤特异性T细胞。肿瘤特异性T细胞可以相比普通T细胞具有更特异性的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“干细胞样T细胞”通常是指可以具有自我增殖和/或分化的潜能的一类T细胞。干细胞样T细胞可以具有TCF1+的表型，例如可以是通过TCF1+来鉴定干细胞样T细胞。肿瘤特异性T细胞可以相比普通T细胞具有更强和/或更长期的抗肿瘤生长的能力。
在本申请中，术语“NK细胞”也称为“自然杀伤细胞”，通常是指一种细胞质中具有大颗粒的细胞。NK细胞由骨髓淋巴样干细胞发育而成，可以依赖于骨髓或胸腺微环境分化、发育。在本申请中，TIL细胞中的NK细胞的比例可以通过本申请的方法加以改变。
在本申请中，术语“肿瘤碎片”通常是指从受试者体内取出肿瘤组织后，可以通过破碎的方法，形成的肿瘤碎片。
在本申请中，术语“组合物”或“药物组合物”通常是指至少一种细胞以及至少一种和任选多于一种的其他药学上可接受的化学组分如运载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载体”通常是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种非毒性材料。这类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、以及任选地其他治疗剂。这类药学上可接受的制剂还可以含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可以用于在此所描述的配制品中的其他设想的载体、赋形剂、和/或添加剂可以包括：例如，调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)等等。适合用于在此所描述的配制品中的这些和另外已知的药物载体、赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的。
在本申请中，术语“T细胞共刺激分子”通常是指与T细胞上的相应结合受体结合的配体，并介导T细胞共刺激反应。共刺激分子可以是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子可以包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、NK细胞活化受体、BTLA(编码其的基因GeneID可以为151888)、Toll配体受体、OX40(编码其的基因GeneID可以为7293)、CD2(编码其的基因GeneID可以为914)、CD7(编码其的基因GeneID可以为924)、CD27(编码其的基因GeneID可以为939)、CD28(编码其的基因GeneID可以为940)、CD30(编码其的基因GeneID可以为943)、CD40(编码其的基因GeneID可以为958)、CDS、ICAM-1(编码其的基因GeneID可以为3383)、LFA-1(CD11a/CD18)(编码其的基因GeneID可以为3689)、4-1BB(CD137)(编码其的基因GeneID可以为3604)、B7-H3(编码其的基因GeneID可以为80381)、ICOS(CD278)(编码其的基因GeneID可以为29851)、GITR(编码其的基因GeneID可以为8784)、BAFFR(编码其的基因GeneID可以为115650)、LIGHT(编码其的基因GeneID可以为8740)、HVEM(LIGHTR)(编码其的基因GeneID可以为8764)、KIRDS2、SLAMF7(编码其的基因GeneID可以为57823)、NKp80(KLRF1)(编码其的基因GeneID可以为51348)、NKp44(编码其的基因GeneID可以为9436)、NKp30(编码其的基因GeneID可以为259197)、NKp46(编码其的基因GeneID可以为9437)、CD19(编码其的基因GeneID可以为930)、CD4(编码其的基因GeneID可以为920)、CD8α(编码其的基因GeneID可以为925)、CD8β(编码其的基因GeneID可以为926)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL7Rα(编码其的基因GeneID可以为)、ITGA4(编码其的基因GeneID可以为3676)、VLA1(编码其的基因GeneID可以为3672)、CD49a(编码其的基因GeneID可以为3672)、IA4(编码其的基因GeneID可以为3732)、CD49D(编码其的基因GeneID可以为3676)、ITGA6(编码其的基因GeneID可以为3655)、VLA-6(编码其的基因GeneID可以为3655)、CD49f(编码其的基因GeneID可以为3655)、ITGAD(编码其的基因GeneID可以为3681)、CD11d(编码其的基因GeneID可以为3681)、ITGAE(编码其的基因GeneID可以为3682)、CD103(编码其的基因GeneID可以为3682)、ITGAL(编码其的基因GeneID可以为3683)、CD11a(编码其的基因GeneID可以为3683)、LFA-1(编码其的基因GeneID可以为3683)、ITGAM(编码其的基因GeneID可以为3684)、CD11b(编码其的基因GeneID可以为3684)、ITGAX(编码其的基因GeneID可以为3687)、CD11c(编码其的基因GeneID可以为3687)、ITGB1(编码其的基因GeneID可以为3688)、CD29(编码其的基因GeneID可以为3688)、ITGB2(编码其的基因GeneID可以为3689)、CD18(编码其的基因GeneID可以为3689)、LFA-1(编码其的基因GeneID可以为3689)、ITGB7(编码其的基因GeneID可以为3695)、NKG2D(编码其的基因GeneID可以为22914)、NKG2C(编码其的基因GeneID可以为3822)、TNFR2(编码其的基因GeneID可以为7133)、TRANCE/RANKL(编码其的基因GeneID可以为8600)、DNAM1(CD226)(编码其的基因GeneID可以为10666)、SLAMF4(CD244、2B4)(编码其的基因GeneID可以为51744)、CD84(编码其的基因GeneID可以为8832)、CD96(Tactile)(编码其的基因GeneID可以为10225)、CEACAM1(编码其的基因GeneID可以为634)、CRTAM(编码其的基因GeneID可以为56253)、Ly9(CD229)(编码其的基因GeneID可以为4063)、CD160(BY55)(编码其的基因GeneID可以为11126)、PSGL1(编码其的基因GeneID可以为6404)、CD100(SEMA4D)(编码其的基因GeneID可以为10507)、CD69(编码其的基因GeneID可以为969)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)(编码其的基因GeneID可以为114836)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)(编码其的基因GeneID可以为6504)、BLAME(SLAMF8)(编码其的基因GeneID可以为56833)、SELPLG(CD162)(编码其的基因GeneID可以为6404)、LTBR(编码其的基因GeneID可以为4055)、LAT(编码其的基因GeneID可以为27040)、GADS(编码其的基因GeneID可以为9402)、SLP-76(编码其的基因GeneID可以为3937)、PAG/Cbp(编码其的基因GeneID可以为55824)、CD19a、和特异性结合CD3的配体、特异性结合CD28的配体、特异性结合HVEM的配体、特异性结合CD40L的配体、特异性结合OX40的配体、和特异性结合4-1BB的配体。共刺激胞内信号传导结构域指共刺激分子的胞内部分。胞内信号传导结构域可以包含从中衍生它的分子的完整胞内部分或完整天然胞内信号传导结构域或其功能性片段。
在本申请中，术语“T细胞生长因子”通常是指引起细胞增殖的生物活性多肽或小分子化合物。在一种实施方式中，T细胞生长因子可以选自以下组的一种或多种：IL-2(编码其的基因GeneID可以为3558)、IL-4(编码其的基因GeneID可以为3565)、IL-7(编码其的基因GeneID可以为3574)、IL-10(编码其的基因GeneID可以为3586)、IL-12(编码其的基因GeneID可以为3592或3593)、IL-15(编码其的基因GeneID可以为3600)、和γ干扰素(编码其的基因GeneID可以为3458)。
在本申请中，术语“基本上同时”通常是指接触过程的一段时间内TIL可以与两种以上的物质同时接触，但是可以不限于在整个接触过程中TIL总是与两种以上的物质同时接触。例如，基本上同时可以是指一段时间内TIL可以与至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的两种以上的物质的每种物质同时接触。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指任何新的病理性的组织增生。本申请的肿瘤可能是良性的，也可能是恶性的。本申请的肿瘤可能是实体的，也可能是血液的。术语“肿瘤”可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
在本申请中，术语“肿瘤组织”通常是指来自对象中的肿瘤，包括对象中的任何实体肿瘤和/或非实体肿瘤的任何组织的样品。
在本申请中，术语“约”和“大约”通常是指在统计上有意义的数值范围内。这样的范围可以在给定值或范围的一个数量级内，可以包括在50％内，可以包括在20％内，可以包括在10％内，可以包括在5％内。术语“约”或“大约”所包含的可允许变化取决于所研究的特定系统，并且本领域普通技术人员可以容易地理解。术语“以上”、“以下”、“至多”和“至少”可以包括本数。
发明详述
一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法。其中，可以使经扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养。一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：可以使经扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一段时间之后与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，所述经扩增的TIL可以为经过体外扩增的TIL。
在一种实施方式中，所述经扩增的TIL为使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL可以经过至少一个阶段的体外扩增后获得的TIL。例如，可以经过至少2个阶段的体外扩增、可以经过至少3个阶段的体外扩增、可以经过至少4个阶段的体外扩增、可以经过至少5个阶段的体外扩增、可以经过至少6个阶段的体外扩增、可以经过至少7个阶段的体外扩增、可以经过至少8个阶段的体外扩增、可以经过至少9个阶段的体外扩增、或者可以经过至少10个阶段的体外扩增。
例如，每一个阶段体外扩增之间可以是通过TIL细胞数量的变化来划分的，例如，当TIL细胞的数量增加至少约1倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。在一些实施方式中，当TIL细胞的数量增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍、或者至少约1000倍时，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，每一个阶段的体外扩增之间也可以是通过TIL细胞培养的条件的变化来划分的。例如，当细胞培养基中添加了或补充添加了T细胞激活剂和/或T细胞生长因子后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，本申请中T细胞激活剂可以和T细胞共刺激分子相互替换使用。例如，当细胞培养基中添加了或补充添加了IL-2后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，当细胞培养基中添加了或补充添加了饲养细胞后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，当TIL细胞进行了离心和/或细胞洗涤的操作后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。例如，每一个阶段之间也可以是通过TIL细胞培养的天数来划分的。例如，当TIL细胞体外培养约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约30天、约40天、约50天或约100天后，可以认为TIL细胞进入了下一个阶段的体外扩增。
例如，所述第二阶段体外扩增可以进行至少约7天。例如，所述第二阶段体外扩增可以进行至少约9天。例如，所述第二阶段体外扩增可以进行至多约14天。例如，所述第二阶段体外扩增可以进行至多约13天。例如，所述第二阶段体外扩增可以进行约7天至约14天、约9天至约14天、约7天至约13天或约9天至约13天。例如，本申请的第二阶段体外扩增可以进行至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、或至少约14天。例如，本申请的第二阶段体外扩增可以进行约9天至约14天，例如，本申请的第二阶段体外扩增可以进行约9天至约14天、约10天至约14天、约11天至约14天、约12天至约14天、约13天至约14天、约9天至约13天、约10天至约13天、约11天至约13天、约12天至约13天、约9天至约12天、约10天至约12天、约11天至约12天、或约10天至约11天。例如，本申请的第二阶段体外扩增可以认为是REP(rapid expansion protocol)阶段。
例如，所述第一阶段体外扩增可以进行至少约7天。例如，所述第一阶段体外扩增可以进行约7天至约14天。例如，本申请的第一阶段体外扩增可以进行至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、或至少约14天。例如，本申请的第一阶段体外扩增可以进行约7天至约14天、约8天至约14天、约9天至约14天、约10天至约14天、约11天至约14天、约12天至约14天、约13天至约14天、约9天至约13天、约10天至约13天、约11天至约13天、约12天至约13天、约9天至约12天、约10天至约12天、约11天至约12天、或约10天至约11天。例如，本申请的第一阶段体外扩增可以认为是preREP阶段。
例如，本申请第二阶段体外扩增进行的天数可以是从第二阶段体外扩增的开始时刻进行计算。例如，第二阶段体外扩增开始的当时，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约0天。例如，第二阶段体外扩增开始后进行了约24小时，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约1天。例如，第二阶段体外扩增开始的当天，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约0天。例如，本申请第二阶段体外扩增进行的天数可以是通过第二阶段体外扩增进行的天数进行计算。例如，第二阶段体外扩增开始后的第二天，可以认为是第二阶段体外扩增进行了约1天。
例如，本申请培养方法可以按照两步骤划分方式进行划分。例如，(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群在与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群。例如，所述步骤(A)可以进行约7天至约14天。例如，所述步骤(B)可以进行约7天至约14天。
例如，本申请培养方法可以按照三步骤划分方式进行划分。例如，(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)可以使所述第三TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群。例如，所述步骤(A)可以进行约7天至约14天。例如，所述步骤(B)可以进行约0天至约8天。例如，所述步骤(C)可以进行约5天至约14天。
例如，本申请培养方法可以按照四步骤划分方式进行划分。例如，(A)可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的第一TIL群与T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(A)得到第二TIL群；(B)可以使所述第二TIL群与T细胞激活剂和/或T细胞生长因子接触，其中，经所述步骤(B)得到第三TIL群；(C)可以使所述第三TIL群的任选的基因的表达提高或降低和/或活性增强或减弱，其中，经所述步骤(C)得到第四TIL群；(D)可以使所述第四TIL群与饲养细胞共培养，其中，经所述步骤(D)得到第五TIL群。例如，所述步骤(A)可以进行约7天至约14天。例如，所述步骤(B)可以进行约0天至约4天。例如，所述步骤(C)可以进行约0天至约4天。例如，所述步骤(D)可以进行约5天至约14天。
例如，本申请的改善的TIL特性包含选自以下组的一种或多种：增加的TIL细胞数量，增加的活细胞比例，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，提高的T细胞受体(TCR)克隆多样性和提高的组织和/或肿瘤中TIL细胞数量。
在一种实施方式中，可以使经扩增的TIL在与T细胞共刺激分子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，可以使经扩增的TIL在与T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，可以使经扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，可以使经扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后，与至少一部分饲养细胞共培养。例如，一部分饲养细胞与经扩增的TIL共培养可以是在经扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触的同时，至少另一部分的饲养细胞与经扩增的TIL共培养是在经扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后。例如至少另一部分的饲养细胞可以包含全部所用饲养细胞的约100％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、或约0.1％。
在一种实施方式中，所述经扩增的TIL细胞可以是在体外进行扩增。在一种实施方式中，所述经扩增的TIL细胞可以是在自体体内进行扩增。在一种实施方式中，所述经扩增的TIL细胞可以是在异体体内进行扩增。在一种实施方式中，所述经扩增的TIL细胞可以是在离体进行扩增。
在一种实施方式中，与所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL相比，所述经扩增的TIL的数量可以增加至少1倍。例如，与所述源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL相比，所述经扩增的TIL的数量可以增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、或者至少约50倍。
在一种实施方式中，所述经扩增的TIL细胞，与从肿瘤组织获得且未经体外扩增的TIL相比，所述经扩增的TIL细胞数量可以增加50倍以上。例如，与从肿瘤组织获得的TIL相比，所述经扩增的TIL细胞数量可以增加约50倍以上、约60倍以上、约70倍以上、约80倍以上、约90倍以上、约100倍以上、约200倍以上、约300倍以上、约400倍以上、约500倍以上、约600倍以上、约700倍以上、约800倍以上、约900倍以上、约2000倍以上、约3000倍以上、约4000倍以上、约5000倍以上、约6000倍以上、约7000倍以上、约8000倍以上、约9000倍以上、约10000倍以上、约15000倍以上、或者约20000倍以上。。
一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法。其中，使经第一阶段扩增的TIL经受第二阶段扩增，其中在所述第二阶段扩增中，可以使所述TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，在所述第二阶段扩增中，可以使所述TIL在与T细胞共刺激分子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，在所述第二阶段扩增中，可以使所述TIL在与T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，在所述第二阶段扩增中，可以使所述TIL在与T细胞共刺激分子和T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，在所述第二阶段扩增中，可以使所述TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后，与至少一部分饲养细胞共培养。例如，在所述第二阶段扩增中，一部分饲养细胞与TIL共培养可以是在TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触的同时，至少另一部分的饲养细胞与TIL共培养是在TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后。例如至少另一部分的饲养细胞可以包含全部所用饲养细胞的约100％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、或约0.1％。
例如，本申请可以以约40:1-约400:1的本申请饲养细胞与本申请TIL的比例，将本申请饲养细胞添加至本申请TIL的细胞培养基中。例如，本申请可以以约40:1-约400:1、以约40:1-约300:1、以约40:1-约200:1、以约40:1-约100:1、以约40:1-约90:1、以约40:1-约80:1、以约40:1-约70:1、以约40:1-约60:1、以约40:1-约50:1、以约50:1-约400:1、以约60:1-约400:1、以约70:1-约400:1、以约80:1-约400:1、以约90:1-约400:1、以约100:1-约400:1、以约200:1-约400:1、或以约300:1-约400:1的本申请饲养细胞与本申请TIL的比例，将本申请饲养细胞添加至本申请TIL的细胞培养基中。
在一种实施方式中，与第一阶段扩增的TIL相比，所述经第二阶段扩增的TIL细胞数量可以增加约50倍以上。例如，与第一阶段扩增的TIL相比，所述经第二阶段扩增的TIL细胞数量可以增加约50倍以上、约60倍以上、约70倍以上、约80倍以上、约90倍以上、约100倍以上、约200倍以上、约300倍以上、约400倍以上、约500倍以上、约600倍以上、约700倍以上、约800倍以上、约900倍以上、约1000倍以上、约2000倍以上、约3000倍以上、约4000倍以上、约5000倍以上、约6000倍以上、约7000倍以上、约8000倍以上、约9000倍以上、约10000倍以上、约15000倍以上、或者约20000倍以上。在一种实施方式中，TIL细胞的数量增加可以用扩增倍数表示，所述扩增倍数可以是，第二阶段扩增结束后相比于第二阶段扩增开始前，TIL细胞数量扩增至的倍数。例如，如果第二阶段扩增开始前TIL细胞数量为1×108，第二阶段扩增结束后TIL细胞数量为1×109，可以认为TIL细胞的扩增倍数为10。
一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中在单个体外扩增阶段中，可以使经体外扩增和/或未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
在另一种实施方式中，可以使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少两个阶段的体外扩增，其中在第二个阶段的体外扩增和/或之后的单个体外扩增阶段中，可以使经体外扩增和/或未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
例如，可以是使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过一个阶段的体外扩增，其中在第一个阶段的体外扩增中，可以使未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
例如，可以是使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过两个阶段的体外扩增，其中在第一个阶段的体外扩增中，可以使未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。也可以是使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过两个阶段的体外扩增，其中在第二个阶段的体外扩增中，可以使经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
例如，也可以是使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过两个阶段的体外扩增，其中在第一个阶段的体外扩增中，可以使未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，且其中在第二个阶段的体外扩增中，可以使经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
例如，可以是使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过三个阶段的体外扩增，其中在第一个阶段的体外扩增中，可以使未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。也可以是使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过三个阶段的体外扩增，其中在第二个阶段的体外扩增中，可以使经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。也可以是使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过三个阶段的体外扩增，其中在第三个阶段的体外扩增中，可以使经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
例如，也可以是使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过三个阶段的体外扩增，其中在第一个阶段的体外扩增中，可以使未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，且其中在第二个阶段的体外扩增中，可以使经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。例如，也可以是使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过三个阶段的体外扩增，其中在第一个阶段的体外扩增中，可以使未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，且其中在第三个阶段的体外扩增中，可以使经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。例如，也可以是使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过三个阶段的体外扩增，其中在第二个阶段的体外扩增中，可以使未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，且其中在第三个阶段的体外扩增中，可以使经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。例如，也可以是使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过三个阶段的体外扩增，其中在第一个阶段的体外扩增中，可以使未经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，且其中在第二个阶段的体外扩增中，可以使经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养，且其中在第三个阶段的体外扩增中，可以使经体外扩增的TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法。其中，可以使所述TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养，所述TIL在完整的培养过程中可以经过两个以上阶段的扩增，所述TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触与所述TIL和饲养细胞共培养可以发生在同一个阶段的扩增中。
在一种实施方式中，所述TIL在完整的培养过程中可以经过两个以上阶段的扩增，可以使的TIL在与T细胞共刺激分子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，所述TIL在完整的培养过程中可以经过两个以上阶段的扩增，可以使TIL在与T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，所述TIL在完整的培养过程中可以经过两个以上阶段的扩增，可以使TIL在与T细胞共刺激分子和T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，所述TIL在完整的培养过程中可以经过两个以上阶段的扩增，可以使TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后，与至少一部分饲养细胞共培养。例如，所述TIL在完整的培养过程中可以经过两个以上阶段的扩增，一部分饲养细胞与TIL共培养可以是在TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触的同时，至少另一部分的饲养细胞与TIL共培养是在TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后。例如至少另一部分的饲养细胞可以包含全部所用饲养细胞的约100％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、或约0.1％。
在一种实施方式中，所述TIL在完整的培养过程中可以经过两个以上阶段的扩增。例如，所述TIL在完整的培养过程中可以经过2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100个以上阶段的扩增。
在一种实施方式中，TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触与所述TIL和饲养细胞共培养可以发生在第一个阶段扩增中和/或第二个阶段扩增中。在一种实施方式中，TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触与所述TIL和饲养细胞共培养可以发生在第一个阶段扩增中、第二个阶段扩增中和/或第三个阶段扩增中。例如，TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触与所述TIL和饲养细胞共培养可以发生在第一个阶段扩增中。例如，TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触与所述TIL和饲养细胞共培养可以发生在第二个阶段扩增中。例如，TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触与所述TIL和饲养细胞共培养可以发生在第三个阶段扩增中。例如，TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触与所述TIL和饲养细胞共培养可以发生在第一个阶段扩增中和第二个阶段扩增中。例如，TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触与所述TIL和饲养细胞共培养可以发生在第一个阶段扩增中和第三个阶段扩增中。例如，TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触与所述TIL和饲养细胞共培养可以发生在第二个阶段扩增中和第三个阶段扩增中。例如，TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触与所述TIL和饲养细胞共培养可以发生在第一个阶段扩增中、第二个阶段扩增中和第三个阶段扩增中。
在一种实施方式中，与在所述TIL与T细胞共刺激分子和T细胞生长因子接触同时使所述TIL和饲养细胞共培养相比，在所述TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间间隔后使所述TIL和饲养细胞共培养可以提高所述TIL的扩增效果。例如，所述提高TIL的扩增效果可以包括选自以下组：增加TIL细胞的数量，改变TIL细胞的比例，提高TIL细胞的分泌能力，和提高TIL细胞的杀伤能力。在一种实施方式中，在所述TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间间隔后使所述TIL和饲养细胞共培养可以增加TIL细胞的数量。在一种实施方式中，在所述TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间间隔后使所述TIL和饲养细胞共培养可以提高TIL细胞的分泌能力。在一种实施方式中，在所述TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间间隔后使所述TIL和饲养细胞共培养可以提高TIL细胞的杀伤能力。
在一种实施方式中，在所述TIL与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触一定时间间隔后使所述TIL和饲养细胞共培养可以改变TIL细胞的比例。例如，所述可以改变TIL细胞的比例可以包括选自以下组：可以增加TIL中中心记忆T细胞(Tcm)比例，可以增加调节性T细胞(Treg)以外的TIL细胞的比例，可以降低调节性T细胞(Treg)的比例，可以增加活化T细胞比例，可以增加肿瘤特异性T细胞比例，和可以增加干细胞样T细胞比例。例如，所述可以改变TIL细胞的比例包括选自以下组：可以增加TIL中CD45RA-CCR7+中心记忆T细胞(Tcm)比例，可以增加CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)以外的TIL细胞的比例，可以降低CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)的比例，可以增加活化T细胞比例，可以增加CD103+CD39+肿瘤特异性T细胞比例，和可以增加TCF1+干细胞样T细胞比例。又例如，本申请改变TIL细胞的比例可以包括增加TIL中CD45RO+CD62L+中心记忆T细胞(Tcm)比例。例如，所述可以增加活化T细胞比例包括选自以下组：增加PD1+细胞比例、增加LAG3+细胞比例和增加CD28+细胞比例。所述改变TIL细胞的比例可以包括本申请方法培养的TIL细胞中中心记忆T细胞比例，活化T细胞比例，肿瘤特异性T细胞比例，和/或干细胞样T细胞，与在所述TIL与T细胞共刺激分子和T细胞生长因子接触同时使所述TIL和饲养细胞共培养相比，增加至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或者至少约99％。所述改变TIL细胞的比例可以包括本申请方法培养的TIL细胞中调节性T细胞(Treg)，与在所述TIL与T细胞共刺激分子和T细胞生长因子接触同时使所述TIL和饲养细胞共培养相比，减少至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或者至少约99％。
在一种实施方式中，可以使所述TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，所述之后可以是指之后2小时以上。例如，可以使所述TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触6到72小时、或12到48小时之后，与饲养细胞共培养。例如，可以使所述TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时或约72小时之后，与饲养细胞共培养。例如，可以使所述TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、或约14天之后，与饲养细胞共培养。
在一种实施方式中，可以使所述TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，所述T细胞共刺激分子可以选自以下组的一种或多种：CD80、CD86、B7-H3、4-1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT、特异性结合CD3的抗体、特异性结合CD28的抗体、特异性结合HVEM的抗体、特异性结合CD40L的抗体、特异性结合OX40的抗体和特异性结合4-1BB的抗体。
在一种实施方式中，所述TIL与T细胞共刺激分子接触可以包括一种或多种所述T细胞共刺激分子与所述TIL单独接触和/或多种所述T细胞共刺激分子与所述TIL同时接触。在一种实施方式中，可以包括一种或多种所述T细胞共刺激分子与所述TIL单独接触。在一种实施方式中，可以包括多种所述T细胞共刺激分子与所述TIL同时接触。例如，一种或多种所述T细胞共刺激分子可以单独加入到所述TIL的细胞培养基中，例如，多种所述T细胞共刺激分子可以同时加入到所述TIL的细胞培养基中。例如，一种所述T细胞共刺激分子可以以以下组的形式的一种或多种加入到所述TIL的细胞培养基中：表达所述T细胞共刺激分子的工程化细胞，嵌合所述T细胞共刺激分子的纳米颗粒，和嵌合所述T细胞共刺激分子的聚合物。例如，多种所述T细胞共刺激分子可以以选自以下组的形式加入到所述TIL的细胞培养基中：混合物，融合蛋白，表达多种所述T细胞共刺激分子的工程化细胞，嵌合多种所述T细胞共刺激分子的纳米颗粒，和嵌合多种所述T细胞共刺激分子的聚合物。例如，T细胞共刺激分子可以为特异性结合CD3的抗体，例如可以是Miltenyi Biotech的OKT3。
在一种实施方式中，可以使所述TIL在与T细胞共刺激分子和/或T细胞生长因子接触之后，与饲养细胞共培养。在一种实施方式中，所述T细胞生长因子可以选自以下组的一种或多种：IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、和γ干扰素。例如，T细胞生长因子可以为IL-2。在一种实施方式中，所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为约1000IU/mL以上。在一种实施方式中，所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度可以为约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约2600IU/mL、约2700IU/mL、约2800IU/mL、约2900IU/mL、约3000IU/mL、约3100IU/mL、约3200IU/mL、约3300IU/mL、约3400IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL、约8000IU/mL、约8500IU/mL、或约9000IU/mL以上。
在一种实施方式中，所述TIL与T细胞生长因子接触可以包括一种或多种所述T细胞生长因子与所述TIL单独接触和/或多种所述T细胞生长因子与所述TIL同时接触。在一种实施方式中，可以包括一种或多种所述T细胞生长因子与所述TIL单独接触。在一种实施方式中，可以包括多种所述T细胞生长因子与所述TIL同时接触。例如，一种或多种所述T细胞生长因子可以单独加入到所述TIL的细胞培养基中，例如，多种所述T细胞生长因子可以同时加入到所述TIL的细胞培养基中。例如，一种所述T细胞生长因子可以以下组的形式的一种或多种加入到所述TIL的细胞培养基中：表达所述T细胞生长因子的工程化细胞，嵌合所述T细胞生长因子的纳米颗粒，和嵌合所述T细胞生长因子的聚合物。例如，多种所述T细胞生长因子可以以选自以下组的形式加入到所述TIL的细胞培养基中：混合物，融合蛋白，表达多种所述T细胞生长因子的工程化细胞，嵌合多种所述T细胞生长因子的纳米颗粒，和嵌合多种所述T细胞生长因子的聚合物。
在一种实施方式中，所述TIL可以为源自所述肿瘤组织的碎片的TIL。在一种实施方式中，可以通过将肿瘤组织处理成肿瘤碎片获得所述TIL。在一种实施方式中，所述肿瘤碎片的体积约为1-27立方毫米。在一种实施方式中，所述肿瘤碎片的体积约为约1立方毫米、约2立方毫米、约3立方毫米、约4立方毫米、约5立方毫米、约6立方毫米、约7立方毫米、约8立方毫米、约9立方毫米、约10立方毫米、约11立方毫米、约12立方毫米、约13立方毫米、约15立方毫米、约17立方毫米、约19立方毫米、约20立方毫米、约21立方毫米、约23立方毫米、约24立方毫米、约25立方毫米、约26立方毫米或27立方毫米。
在一种实施方式中，所述饲养细胞可以包括抗原呈递细胞。在一种实施方式中，所述饲养细胞可以包括选自以下组的一种或多种：外周单个核细胞，树突状细胞，和人工抗原呈递细胞。例如，所述饲养细胞可以为外周单个核细胞。例如，所述饲养细胞可以为树突状细胞。例如，所述饲养细胞可以为人工抗原呈递细胞。例如，所述饲养细胞可以为分离的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其可以包含表达HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L和CD58的细胞，并可以被修饰以表达一种以上共刺激分子。在一种实施方式中，所述饲养细胞可以经过辐照。例如，可以经过伽马射线辐照，或可以经过X射线辐照。
在一种实施方式中，所述TIL可以和饲养细胞共培养。在一种实施方式中，所述共培养可以是TIL和饲养细胞的表面相接触，例如可以将所述饲养细胞加入所述TIL的细胞培养基中。在一种实施方式中，所述共培养可以是TIL和饲养细胞的表面相接触。在一种实施方式中，可以将所述饲养细胞固定在装置上并加入所述TIL的细胞培养基中。在一种实施方式中，可以将所述饲养细胞与TIL的细胞通过膜、网、栅格分离，但是可以进行物质交换或可以进行部分程度的接触。在一种实施方式中，可以将所述饲养细胞的细胞代谢产物加入所述TIL的细胞培养基中。例如，本申请可以以约40:1-约400:1的上述本申请饲养细胞与本申请TIL的比例，将本申请饲养细胞添加至本申请TIL的细胞培养基中。例如，本申请可以以约40:1-约400:1、以约40:1-约300:1、以约40:1-约200:1、以约40:1-约100:1、以约40:1-约90:1、以约40:1-约80:1、以约40:1-约70:1、以约40:1-约60:1、以约40:1-约50:1、以约50:1-约400:1、以约60:1-约400:1、以约70:1-约400:1、以约80:1-约400:1、以约90:1-约400:1、以约100:1-约400:1、以约200:1-约400:1、或以约300:1-约400:1的本申请饲养细胞与本申请TIL的比例，将本申请饲养细胞添加至本申请TIL的细胞培养基中。
一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法。从受试者组织样品获得的TIL细胞的方法可以是患者手术取得原位肿瘤样本或转移肿瘤样本，重量可以至少约1g，也可以多块组织合并。肿瘤组织在基础培养基内约2-8度运输，48小时内处理。组织块可以机械破碎至每块约1-27立方毫米大小，转移入透气培养袋或Grex中，加入T细胞无血清培养基和浓度为1000-9000IU/mL(例如可以是6000IU/mL)IL-2培养约3-14天。收集培养基中细胞，可以与组织块共同转移入透气培养袋、或Grex、或Xuri设备，T细胞无血清培养基可以添加CD3抗体约30ng/mL，IL-2(1000-9000IU/mL)，活化一定时间后添加辐照PBMC(TIL与PBMC按照比率1:40-1:400)，扩增培养约3-14天。过滤组织块，可以使用细胞处理系统收集培养基中细胞，清洗冻存，并检测。最终产品CD3比例可以大于80％，细胞活率可以大于70％，大于80％的T细胞可以为记忆效应T细胞和效应T细胞。经刺激后可以分泌IFNγ，可以具有活化T细胞比例上调的特征。
一方面，本申请提供一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述TIL可以根据本申请的培养方法培养得到。在一种实施方式中，本申请提供的TIL可以包含一种或一个批次的本申请的培养方法培养得到TIL。在一种实施方式中，本申请提供的TIL可以包含多种或多个批次的本申请的培养方法培养得到并以任意比例组合的TIL。
在一些实施方式中，可以将使用本申请方法扩增的TIL作为药物组合物施用于患者。在一些实施方式中，药物组合物可以是TIL在无菌缓冲液中的悬液。使用本申请的PBMC扩增的TIL可以通过本领域已知的任何合适途径施用。在一些实施方式中，T细胞可以以单次动脉内或静脉内输注施用，输注可以持续约30至60分钟。其他合适的施用途径可以包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可以施用任何合适剂量的TIL。在一些实施方式中，例如当肿瘤是黑色素瘤时，可以施用约2.3×109至约13.7×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约1×109至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，可以施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约2.3×109至约13.7×1010。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约1×109至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约5×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约6×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方式中，治疗有效剂量可以为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的数量可以为约1×106、约2×106、约3×106、约4×106、约5×106、约6×106、约7×106、约8×106、约9×106、约1×107、约2×107、约3×107、约4×107、约5×107、约6×107、约7×107、约8×107、约9×107、约1×108、约2×108、约3×108、约4×108、约5×108、约6×108、约7×108、约8×108、约9×108、约1×109、约2×109、约3×109、约4×109、约5×109、约6×109、约7×109、约8×109、约9×109、约1×1010、约2×1010、约3×1010、约4×1010、约5×1010、约6×1010、约7×1010、约8×1010、约9×1010、约1×1011、约2×1011、约3×1011、约4×1011、约5×1011、约6×1011、约7×1011、约8×1011、约9×1011、约1×1012、约2×1012、约3×1012、约4×1012、约5×1012、约6×1012、约7×1012、约8×1012、约9×1012、约1×1013、约2×1013、约3×1013、约4×1013、约5×1013、约6×1013、约7×1013、约8×1013，或约9×1013。在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL数量的范围可以为约1×106至5×106、约5×106至1×107、约1×107至5×107、约5×107至1×108、约1×108至5×108、约5×108至1×109、约1×109至5×109、约5×109至1×1010、约1×1010至5×1010、约5×1010至1×1011、约5×1011至1×1012、约1×1012至5×1012，或约5×1012至1×1013。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度可以小于组合物的例如约100％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％、约0.01％、约0.009％、约0.008％、约0.007％、约0.006％、约0.005％、约0.004％、约0.003％、约0.002％、约0.001％、约0.0009％、约0.0008％、约0.0007％、约0.0006％、约0.0005％、约0.0004％、约0.0003％、约0.0002％，或约0.0001％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度可以大于组合物的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19.75％、约19.50％、约19.25％、约19％、约18.75％、约18.50％、约18.25％、约18％、约17.75％、约17.50％、约17.25％、约17％、约16.75％、约16.50％、约16.25％、约16％、约15.75％、约15.50％、约15.25％、约15％、约14.75％、约14.50％、约14.25％、约14％、约13.75％、约13.50％、约13.25％、约13％、约12.75％、约12.50％、约12.25％、约12％、约11.75％、约11.50％、约11.25％、约11％、约10.75％、约10.50％、约10.25％、约10％、约9.75％、约9.50％、约9.25％、约9％、约8.75％、约8.50％、约8.25％、约8％、约7.75％、约7.50％、约7.25％、约7％、约6.75％、约6.50％、约6.25％、约6％、约5.75％、约5.50％、约5.25％、约5％、约4.75％、约4.50％、约4.25％、约4％、约3.75％、约3.50％、约3.25％、约3％、约2.75％、约2.50％、约2.25％、约2％、约1.75％、约1.50％、约125％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％、约0.01％、约0.009％、约0.008％、约0.007％、约0.006％、约0.005％、约0.004％、约0.003％、约0.002％、约0.001％、约0.0009％、约0.0008％、约0.0007％、约0.0006％、约0.0005％、约0.0004％、约0.0003％、约或0.0002％，或者约0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度范围可以为组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％，或约1％至约10％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的浓度范围可以为组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、或约0.1％至约0.9％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的量可以等于或小于约10g、约9.5g、约9.0g、约8.5g、约8.0g、约7.5g、约7.0g、约6.5g、约6.0g、约5.5g、约5.0g、约4.5g、约4.0g、约3.5g、约3.0g、约2.5g、约2.0g、约1.5g、约1.0g、约0.95g、约0.9g、约0.85g、约0.8g、约0.75g、约0.7g、约0.65g、约0.6g、约0.55g、约0.5g、约0.45g、约0.4g、约0.35g、约0.3g、约0.25g、约0.2g、约0.15g、约0.1g、约0.09g、约0.08g、约0.07g、约0.06g、约0.05g、约0.04g、约0.03g、约0.02g、约0.01g、约0.009g、约0.008g、约0.007g、约0.006g、约0.005g、约0.004g、约0.003g、约0.002g、约0.001g、约0.0009g、约0.0008g、约0.0007g、约0.0006g、约0.0005g、约0.0004g、约0.0003g、约0.0002g，或者约0.0001g。
在一些实施方式中，本申请的组合物中提供的TIL的量可以大于约0.0001g、约0.0002g、约0.0003g、约0.0004g、约0.0005g、约0.0006g、约0.0007g、约0.0008g、约0.0009g、约0.001g、约0.0015g、约0.002g、约0.0025g、约0.003g、约0.0035g、约0.004g、约0.0045g、约0.005g、约0.0055g、约0.006g、约0.0065g、约0.007g、约0.0075g、约0.008g、约0.0085g、约0.009g、约0.0095g、约0.01g、约0.015g、约0.02g、约0.025g、约0.03g、约0.035g、约0.04g、约0.045g、约0.05g、约0.055g、约0.06g、约0.065g、约0.07g、约0.075g、约0.08g、约0.085g、约0.09g、约0.095g、约0.1g、约0.15g、约0.2g、约0.25g、约0.3g、约0.35g、约0.4g、约0.45g、约0.5g、约0.55g、约0.6g、约0.65g、约0.7g、约0.75g、约0.8g、约0.85g、约0.9g、约0.95g、约1g、约1.5g、约2g、约2.5g、约3g、约3.5g、约4g、约4.5g、约5g、约5.5g、约6g、约6.5g、约7g、约7.5g、约8g、约8.5g、约9g、约9.5g，或者约10g。
在一些实施方式中，TIL可以单剂量施用。此种施用可以通过注射，例如静脉内注射。在一些实施方式中，TIL可以多剂量施用。剂量可以是每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。剂量可以是每月一次、每两周一次、每周一次或每2天一次。在一些实施方式中，TIL的施用可以连续施用。
在另一方面，本申请提供一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法。从受试者组织样品获得的TIL细胞的方法可以是患者手术取得原位肿瘤样本或转移肿瘤样本，重量可以至少约1g，也可以多块组织合并。肿瘤组织在样本运输液，例如可以是商业常用的肿瘤组织运输液、肿瘤组织保存液或肿瘤组织转运液，内约2-8度运输，48小时内处理。组织块可以机械破碎至每块约1-27立方毫米大小，转移入透气培养袋或Grex中，加入T细胞无血清培养基和浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2培养约3-14天。可以将收获的TIL细胞冻存后再复苏，也可以直接收集培养基中细胞，转移入透气培养袋、或Grex、或Xuri设备，T细胞无血清培养基可以添加本申请的CD3抗体、浓度为300-9000IU/mL(例如可以是1000-9000IU/mL，例如可以是6000IU/mL)的IL-2，活化本申请的TIL一定时间后，添加辐照PBMC(TIL与PBMC按照比率约1:40-约1:400)，扩增培养约3-14天。可以使用细胞处理系统收集培养基中细胞，清洗冻存，并检测。最终产品CD3比例可以大于80％，细胞活率可以大于50％，大于80％的T细胞可以为记忆效应T细胞和效应T细胞。经刺激后可以分泌IFN-γ，和/或可以具有活化T细胞比例上调的特征。
一方面，本申请提供一种药物制剂。在一些实施方式中，其可以包含本申请所述的TIL和/或本申请所述的组合物，与药学上可接受的载体。
一方面，本申请提供一种试剂盒，所述试剂盒可以包含本申请所述培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)方法的T细胞共刺激分子、T细胞生长因子和/或饲养细胞与记载本申请培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)方法的步骤的说明书。一方面，本申请提供一种试剂盒，所述试剂盒可以包含本申请所述的TIL和/或本申请所述的药物制剂。
一方面，本申请提供一种影响肿瘤细胞生长的方法，可以包括向受试者施用本申请所述的TIL和/或本申请所述的药物制剂。在一些实施方式中，影响肿瘤生长可以包含肿瘤的体积减少到施用前的例如约99％、约95％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％。
一方面，本申请提供本申请所述的TIL和/或本申请所述的药物制剂在制备药物中的应用，所述药物可以用于预防和/或治疗肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤选自实体瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
一方面，本申请提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，可以包括向受试者施用本申请所述的TIL和/或本申请所述的药物制剂。在一些实施方式中，所述肿瘤选自实体瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
一方面，本申请提供一种本申请所述的TIL和/或本申请所述的药物制剂，其可以用于预防和/或治疗肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤选自实体瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤可以选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的TIL培养方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞的培养方法
1.1饲养细胞接收及制备
1.1.1单采血接收
记录单采血信息，批号及体积，并复温至室温。
1.1.2PBMC(外周血单个核细胞)手动分离及冻存
使用75％酒精消毒血袋，转移至生物安全柜内。使用无菌剪刀剪开血袋后，将单采血转移至50mL离心管内，使用20mL注射器注入20mL PBS或生理盐水清洗血袋，将洗涤液一并转入50mL离心管内。每个50mL离心管内液体体积可以不超过30mL。将单采血3000g离心10分钟。离心过程中准备6-8支50mL离心管，加入已复温的淋巴细胞分离液(天津灏洋Ficoll)，20mL/支。离心结束后，弃掉上层血浆，使用PBS或生理盐水稀释细胞沉淀，将稀释后的血细胞混合液缓慢滴加上淋巴细胞分离液上层，可以不破坏界面，每管约加25mL样品，可以不超过28mL。
离心使用水平转子，500-600g离心15-30分钟，温度18-22℃，离心结束后得到的白膜层将处于生理盐水及Ficoll的分界面处。吸弃上层血浆及生理盐水，用移液管吸取中间白膜层至另一干净的50mL离心管内。使用PBS或生理盐水稀释收集到的白膜层，600g离心10分钟，室温。离心结束后弃上清，PBS或生理盐水清洗细胞一次，500g离心5分钟，室温。
如红细胞较多，离心结束后可以进行裂红，按照细胞沉淀体积与红细胞裂解液1:2至1:3加入红细胞裂解液，混匀，室温裂解10分钟中，中间轻柔混匀离心管2-3次，保证裂解效果，裂解完成后加入PBS或生理盐水清洗细胞。裂红后清洗细胞两次，400g离心6分钟，最后一次离心前取样计数。
弃上清，基础培养基重悬细胞，调整细胞密度约2-3×107/mL，液面高度可以不超过1厘米，每T225培养瓶中体积可以低于200mL；平铺状态下，X射线辐照50Gy。离心弃上清，根据计数结果冻存细胞，约1-2×108/mL，1-2mL/支；将细胞放入程序降温盒内转移至﹣80℃冰箱内冻存。
1.1.3PBMC自动分离及冻存
将血袋的管路与cpro分离套件(Cytiva)输入端无菌接管。若血量大于120mL，进行预浓缩步骤，可以将血液体积浓缩至120mL以内。可以使用neatcell程序进行PBMC分离及洗涤，洗涤液为生理盐水，中间体积20mL；重悬液为基础培养基，添加80mL/批。分离后每供者PBMC为一袋100mL，在平铺状态下，液面高度可以不超过1厘米，X射线辐照50Gy。辐照后取样计数，将3-5名供者PBMC悬液按照0.5:1至1:2的比例混合，使用culture wash程序收集细胞并洗涤三次，洗涤液为生理盐水；设置中间体积及终体积，使得每1×109个细胞不少于2mL；加入等量至2倍冻存液混匀。使用1倍冻存液调整细胞密度约为1×107/mL至2×108/mL，分装20mL/袋，程序降温仪内冻存，液氮保存。
1.2肿瘤组织接收及处理
1.2.1组织接收
接收供者的肿瘤组织及血样，核对样品信息并记录，打印相应样品标签。
1.2.2组织处理及培养
使用75％酒精消毒样品管及采血管，转移至生物安全柜内。根据上述PBMC手动分离及冻存操作程序分离血样中PBMC细胞并进行冻存。取一种具有透气表面的培养瓶和袋子，例如G-Rex100培养瓶(Wilson Wolf Manufacturing)，加入300mL已复温的完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，并添加浓度约为1000～9000IU/mL的IL-2，例如6000IU/mL的IL-2。取数个10厘米培养皿，加入适量培养基，使用无菌眼科镊从样品管中取出肿瘤组织于10厘米培养皿中，培养基量以刚没过肿瘤组织为准，观察组织形态并记录。洗涤组织并更换培养皿。使用眼科剪及眼科镊将进行初步剪切，去除脂肪组织及坏死组织，每块组织块继续剪碎至约27立方毫米大小。取非悬浮肿瘤组织块，使用20mL注射器去除内部活塞后，与培养袋连接，使用移液管将约1g组织块通过注射器转入培养袋内。将培养袋放入二氧化碳培养箱内进行培养。清理剪刀及镊子，并用75％酒精进行初步消毒后，超声清洗后进行灭菌，获得初级TIL。
1.3第一阶段扩增及收获
1.3.1第一阶段扩增
根据细胞生长状态，每3-7天补液或半量换液，保证细胞营养。使用完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，并添加浓度约为1000～9000IU/mL的IL-2，例如6000IU/mL的IL-2。第一阶段扩增的3-14天，例如可以第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天时取样计数，若细胞数目处于5×105至5×108之间时进入下述第一阶段扩增的收获步骤。
1.3.2第一阶段扩增的收获
收集第一阶段扩增结束细胞，离心，弃去培养基，使用PBS或生理盐水洗涤细胞一次，获得经第一阶段扩增的TIL，并取样计数留取约5×105至2×108细胞量进入下述第一阶段扩增步骤；取约5×105细胞量可以进行质量控制检测；其余细胞量加入等量2倍冻存液冻存。
1.4第二阶段扩增
1.4.1第二阶段扩增的TIL活化
取5×105至2×108的第一阶段扩增的细胞量，使用完全培养基，完全培养基可以任意地选用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基，并可以添加必须氨基酸及抗生素，调整细胞密度为5×105至2×106/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔，添加CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL，添加浓度约为1000～9000IU/mL的IL-2，例如6000IU/mL的IL-2。
1.4.2第二阶段扩增的扩大培养
第二阶段扩增加入OKT3和IL-2后的若干时间Tn以后(Tn可以取0小时到14天)，复苏1-5名供者混合的饲养细胞；将活化的TIL细胞，组织块及饲养细胞转入G-Rex100培养瓶或者透气袋内，补充完全培养基，每1-3天取样计数，并根据细胞状态补液或半量换液直至细胞总数大于1×109或第二阶段扩增培养达14天，终止培养。
1.4.3肿瘤浸润淋巴细胞的收获
取第二阶段扩增的细胞，离心后弃去培养基上清，并使用PBS或生理盐水或复方电解质溶液清洗三次，获得经第二阶段扩增的TIL，第三次清洗时取样计数，根据计数结果，最后一次离心后弃上清，取3×106细胞送质量控制检测；其余全部细胞加入冻存液，调整细胞密度1-3×108/mL冻存。
1.5肿瘤浸润淋巴细胞的应用
可以将复苏后的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞给予受试者静脉滴注。
实施例2饲养细胞不同添加时间培养的TIL增殖能力对比
在实施例1的1.4的第二阶段扩增的TIL活化中，第二阶段扩增加入OKT3和IL-2后的若干时间Tn以后(Tn可以取0小时到14天)，将饲养细胞加入肿瘤浸润淋巴细胞培养袋中。本实施例中Tn选取0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、5天、7天、和9天获得饲养细胞不同添加时间培养的TIL，并进行细胞计数的对比试验。
饲养细胞不同添加时间培养的TIL的增殖能力分析如图1所示。饲养细胞不同添加时间培养TIL的各组图中纵坐标的数值表示，第二阶段扩增结束后相比于第二阶段扩增开始前，TIL细胞数量扩增至的扩增倍数。4名供者来源的TIL增殖结果显示，加入OKT3和IL-2后的0小时后(即同时)添加饲养细胞培养的TIL，增殖能力弱于加入OKT3和IL-2后的24小时或48小时后加饲养细胞培养的TIL。
实施例3饲养细胞不同添加时间培养的TIL流式检测对比
在实施例1的1.4的第二阶段扩增的TIL活化中，第二阶段扩增加入OKT3和IL-2后的若干时间Tn以后(Tn可以取0小时到14天)，将饲养细胞加入肿瘤浸润淋巴细胞培养袋中。本实施例中Tn选取0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、5天、7天、和9天获得饲养细胞不同添加时间培养的TIL，并进行流式检测的对比试验。
TIL流式检测试验材料的来源
转录因子缓冲组(Transcription Factor Buffer Set)，厂家BD，货号562574；V底96孔板，厂家Corning，货号3894；流式管，厂家Corning，货号352052。
本实施例流式抗体购自BD或Biolegend。将每组1×105至5×105个细胞样品，加入流式管或V底96孔板内。600g离心3分钟，弃上清。PBS清洗一次，流式管1mL/管，96孔板250μL/孔，弃上清。加入配制好的抗体工作液进行细胞表面染色，抗体(BD或Biolegend)浓度为1:100至1:200，含活性检测染料1:10000。流式管100μL/管，96孔板50μL/孔染色，2-8℃避光孵育30分钟。染色过程中配制转录因子染色所需试剂：使用转录因子缓冲组(BD，Transcription Factor Buffer Set)稀释4×固定破膜液(BD，Fixation/Permeabilization)为1×工作液A；使用双蒸水稀释5×通透清洗液(BD，Perm/WashBuffer)为1×工作液B，四度预冷待用。染色结束后加入适量PBS清洗细胞2次(96孔板250μL/次，流式管1mL/次)，600g离心3分钟，离心后弃上清。细胞固定、破膜：充分重悬细胞，加入适量(96孔板100μL/孔，流式管1mL/管)1×工作液A进行固定破膜，2-8℃避光孵育40-50分钟。固定破膜结束，加入1×工作液B清洗细胞(96孔板250μL/次，流式管2mL/次)，2-8℃离心，350g离心6分钟，清洗两次。使用1×工作液B配制胞内抗体，抗体浓度为1:100至1:200，96孔板50μL/孔，流式管100μL/管，2-8℃避光染色30分钟。染色结束后，加入1×工作液B清洗细胞(96孔板250μL/次，流式管2mL/次)，2-8℃离心，350g离心6分钟，清洗两次。表面染色结束后，PBS清洗细胞一次(96孔板250μL/次，流式管1mL/次)，室温600g离心3分钟，离心后弃上清。使用100-500μL PBS重悬细胞，进行流式上机检测。
饲养细胞不同添加时间培养的TIL的流式结果分析如图2到图8所示。
图2到图3表示加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD45RA-CCR7+中心记忆T细胞(Tcm)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高中心记忆T细胞的比例。
图4表示加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更少的调节性T细胞的比例。
图5到图6表示加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的活化T细胞的比例，例如PD1+、LAG3+和/或CD28+细胞比例更高。
图7表示加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD103+CD39+肿瘤特异性T细胞比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的肿瘤特异性T细胞的比例。
图8表示加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的TCF1+干细胞样T细胞比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的干细胞样T细胞的比例。
实施例4饲养细胞不同添加时间培养的TIL的结果统计
在实施例1的1.4的第二阶段扩增的TIL活化中，取第一阶段扩增的细胞量，调整细胞密度为5×105至2×106/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔，添加CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL，添加浓度约为1000～9000IU/mL的IL-2，例如3000或6000IU/mL的IL-2。加入上述OKT3和IL-2后的0小时、24小时、48小时以后，将饲养细胞加入肿瘤浸润淋巴细胞的培养环境中。其中，TIL与饲养细胞可以按照比率1:40-1:400加入，第二阶段扩增培养约9-14天后收集全部细胞，检测和统计培养所得TIL的结果。
增殖能力检测
对于上述饲养细胞不同添加时间培养获得的TIL进行细胞计数。
不同供者肿瘤来源的TIL作为各自不同的批次；将各个批次的加入OKT3和IL-2同时(0h组)加入饲养细胞的试验组的数据作为基准1，将同批次其它时间点试验组的数据进行标准化处理，统计各试验组在第二阶段扩增相对于0h组的相对增殖能力。
图9显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞增殖能力结果图。相比于加入OKT3和IL-2后的0小时后(即同时)添加饲养细胞培养的TIL，加入OKT3和IL-2后的24小时或48小时后加饲养细胞培养的TIL增殖能力显著增强。
流式检测TIL细胞组成
对于上述饲养细胞不同添加时间培养获得的TIL群进行流式检测。
不同供者肿瘤来源的TIL作为各自不同的批次；将各个批次的加入OKT3和IL-2同时(0h组)加入饲养细胞的试验组的数据作为基准1，将同批次其它时间点试验组的数据进行标准化处理，统计各试验组在第二阶段扩增相对于0h组的细胞组成比例。
流式检测的试验流程可以参照本申请实施例3的内容。
图10显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD45RA-CCR7+中心记忆T细胞(Tcm)比例结果图。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高CD8+中和/或CD4+中的中心记忆T细胞的比例。
图11显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的TCF1+干细胞样T细胞比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高CD8+中的干细胞样T细胞的比例。
图12显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更少的调节性T细胞的比例。
图13显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(PD1+)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的活化T细胞的比例，例如CD8+中和/或CD4+中的PD1+细胞比例更高。
图14显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD103+CD39+肿瘤特异性T细胞比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的CD8+中和/或CD4+中的肿瘤特异性T细胞的比例。
图15显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(CD28+)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的活化T细胞的比例，例如CD8+CD28+细胞比例更高。
图16显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(41BB+)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的活化T细胞的比例，例如CD8+中和/或CD4+中的41BB+细胞比例更高。
图17显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的活化T细胞(CD25+)比例。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的活化T细胞的比例，例如CD8+中和/或CD4+中的CD25+细胞比例更高。
胞内因子表达检测
试验准备
配制胞内因子表达检测所需培养基：取T细胞培养基，按照体积比1:500添加CD107a抗体(BD)。
检测步骤
取各个试验组的TIL离心后，使用600μL上述胞内因子表达检测所需培养基重悬为1×106个细胞/mL，加入96孔板内，100μL/孔，置于37℃培养箱孵育过夜。
孵育结束后，200μL/孔PBS洗涤一次，600g离心3分钟，弃上清。配制抗体混合工作液进行细胞表面染色CD3/CD4/CD8(BD)，抗体浓度为1:100，viability(1:10000)，50μL/组染色，2-8℃避光孵育30分钟。染色结束后清洗细胞，使用PBS重悬，进行流式上机检测。
图18显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的胞内因子表达检测结果。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的胞内因子表达能力。例如，更高的CD3+中、CD8+中和/或CD4+中的CD107a表达能力。
细胞因子分泌检测
细胞因子分泌检测方法可以参照细胞因子检测试剂盒(BD)的说明书，将人Th1/Th2/Th17细胞因子标准品冻干粉(BD)使用2mL Assay Diluent稀释液(BD)复溶(标准品原液各细胞因子浓度均为5000pg/mL)并按顺序：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512，1:1024梯度稀释，标记为“标准品管”。取1管仅含有Assay Diluent稀释液作为参照。按照2μL/Beads/孔加入每种Capture Beads(BD)，然后按照10μL/孔加入PEDetection Reagent检测试剂(BD)并混合配制为混合物(mix)，按照22μL/孔加入V底96孔板内，随后按照10μL/孔加入各标准品和试验组的上清并混合，室温下避光孵育3小时。
孵育结束，每孔加入200μL Wash Buffer(BD)，500g离心3分钟。离心结束，每孔加入100μL Wash Buffer(BD)重悬，进行流式分析。
图19显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞因子分泌检测结果。结果显示，24小时或48小时后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的细胞因子分泌能力。例如，更高的TNF-α分泌能力、或更高的IFN-γ分泌能力。
实施例5饲养细胞不同添加时间培养的TIL的结果统计
在实施例1的1.4的第二阶段扩增的TIL活化中，取第一阶段扩增的细胞量，调整细胞密度为5×105至2×106/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔，添加CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL，添加浓度约为1000～9000IU/mL的IL-2，例如3000或6000IU/mL的IL-2。加入上述OKT3和IL-2后的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天以后，将饲养细胞加入肿瘤浸润淋巴细胞的培养环境中。其中，TIL与饲养细胞可以按照比率1:40-1:400加入，例如1:200，第二阶段扩增培养约9-14天后收集全部细胞，检测和统计培养所得TIL的结果。
增殖能力检测
对于上述饲养细胞不同添加时间培养获得的TIL进行细胞计数。
图20显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞增殖能力结果图。相比于加入OKT3和IL-2后的0小时后(即同时)添加饲养细胞培养的TIL，加入OKT3和IL-2后的12小时或更多时间后加饲养细胞培养的TIL增殖能力显著增强。
流式检测TIL细胞组成
对于上述饲养细胞不同添加时间培养获得的TIL群进行流式检测。
不同供者肿瘤来源的TIL作为各自不同的批次；将各个批次的加入OKT3和IL-2同时(0h组)加入饲养细胞的试验组的数据作为基准1，将同批次其它时间点试验组的数据进行标准化处理，统计各试验组在第二阶段扩增相对于0h组的细胞组成比例。
流式检测的试验流程可以参照本申请实施例3的内容。
图21显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD8+T细胞比例。结果显示，加入OKT3和IL-2后的12小时或更多时间后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的CD8+T细胞的比例。
图22显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD45RO+CD62L+T细胞比例。结果显示，加入OKT3和IL-2后的12小时或更多时间后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的记忆T细胞(Tcm，CD45RO+CD62L+)的比例。
图23显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的NK T细胞比例。结果显示，加入OKT3和IL-2后的12小时或更多时间后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更高的NK T细胞的比例。
图24显示的是，加入OKT3和IL-2的0小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、或5天后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)比例。结果显示，加入OKT3和IL-2后的12小时或更多时间后添加饲养细胞培养的TIL，相比同时添加饲养细胞培养的TIL，具有更少的调节性T细胞的比例。
实施例6本申请培养的TIL的杀伤能力检测
对于实施例1的1.4的第二阶段扩增的TIL活化中，取第一阶段扩增的细胞量，调整细胞密度为5×105至2×106/mL，于悬浮24孔培养板内，1mL/孔，添加CD3抗体，例如OKT3约30ng/mL，添加浓度约为1000～9000IU/mL的IL-2，例如3000或6000IU/mL的IL-2。加入上述OKT3和IL-2后的12小时至14天后，例如48小时以后，将饲养细胞加入肿瘤浸润淋巴细胞的培养环境中。其中，TIL与饲养细胞可以按照比率1:40-1:400加入，第二阶段扩增培养约9-14天后收集全部细胞，检测和统计培养所得TIL的细胞杀伤能力检测。
细胞准备
准备用于检测的各个试验组获得的TIL和用于共培养的靶细胞(例如A375黑色素瘤细胞和/或Hela宫颈癌细胞)。
检测步骤
用CFSE(5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，Sigma，21888-25MG-F)标记肿瘤细胞：用PBS清洗肿瘤细胞，重悬肿瘤细胞于500μL的PBS中；将CFSE加入500μL的PBS中，与500μL的肿瘤细胞PBS重悬液混合，至CFSE的终浓度为0.5μmol/L。37℃孵育6分钟后，加含10％ FBS的培养基清洗，600g离心5分钟，用X-vivo 15培养基或其它商用的T细胞培养基，例如Stem Cell，Lonza，Thermo，美天旎等品牌的T细胞培养基重悬肿瘤细胞浓度为1×106个细胞/mL。对各个试验组的TIL群600g离心5分钟，按照效靶比(TIL细胞与肿瘤细胞的比例)3:1重悬TIL细胞(即重悬TIL细胞浓度为3×106个细胞/mL)。于U底96孔板(Corning)中加入肿瘤细胞和TIL细胞各100μL，每组设置三个复孔。同时设置一组只包含肿瘤细胞的对照组。将孔板200g离心1分钟，置于37℃孵育4小时至过夜。其中，TIL与肿瘤细胞共培养时，可以不加激活TIL细胞的物质作为无激活组，或者加入transACT(Miltenyi，包含CD3抗体和CD28抗体的纳米基质材料)作为激活组。
孵育完成后，600g离心3分钟，弃上清，每孔加入20μL胰酶，37℃培养箱内孵育3-5分钟消化肿瘤细胞，消化完成后加入180μL含10％FBS的培养基终止消化。将Dapi(碧云天，C0060)用1：100稀释，然后每孔加入20μL稀释后的Dapi。进行流式上机检测。
杀伤率％＝Dapi+CFSE+细胞数/总CFSE+×100％，或杀伤率可以通过Dapi+细胞数/总肿瘤细胞数表示。
图25显示的是，加入OKT3和IL-2的48小时后添加饲养细胞培养的TIL，培养所得的TIL细胞的细胞杀伤能力结果。结果显示，加入OKT3和IL-2后的48小时后添加饲养细胞培养的TIL均具有显著的肿瘤细胞杀伤能力，例如黑色素瘤和/或宫颈肿瘤。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
Claims (10)
1.一种培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少一个阶段的体外扩增，其中在单个体外扩增阶段中，使经体外扩增和/或未经体外扩增的TIL在与包含特异性结合CD3的抗体以及IL-2的物质接触一定时间之后，与饲养细胞共培养。
2.根据权利要求1所述的方法，在第一个阶段的体外扩增中，使所述未经体外扩增的TIL在与包含特异性结合CD3的抗体以及IL-2的物质接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
3.根据权利要求1所述的方法，使源自肿瘤组织且未经体外扩增的TIL经过至少两个阶段的体外扩增，且在第二个阶段的体外扩增中，使经体外扩增TIL在与包含特异性结合CD3的抗体以及IL-2的物质接触一定时间之后与饲养细胞共培养。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，使经扩增的TIL在与包含特异性结合CD3的抗体以及IL-2的物质接触至少12小时之后与饲养细胞共培养。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述特异性结合CD3的抗体以以下组的形式的一种或多种加入到所述TIL的细胞培养基中：所述特异性结合CD3的抗体，表达所述特异性结合CD3的抗体的工程化细胞，包含所述特异性结合CD3的抗体的纳米颗粒，和包含所述特异性结合CD3的抗体的聚合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，所述IL-2在所述TIL的细胞培养基中的初始浓度为至少1000IU/mL。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，所述饲养细胞为外周单个核细胞。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，所述饲养细胞为经过辐照的饲养细胞。
9.一种影响肿瘤细胞生长的方法，包括施用经过权利要求1-8中任一项所述的方法获得的TIL，所述方法是非治疗目的的。
10.经过权利要求1-9中任一项所述的方法获得的TIL在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: No. 24, Lane 388, Shengrong Road, Pudong New Area, Shanghai, 200120 Applicant after: Suzhou Shashi Biotechnology Co.,Ltd. Applicant after: Shanghai Shashi Biotechnology Co.,Ltd. Applicant after: Zhuhai tuoyu Biotechnology Co.,Ltd. Applicant after: Shenzhen Shali Biotechnology Co.,Ltd. Address before: No. 24, Lane 388, Shengrong Road, Pudong New Area, Shanghai, 200120 Applicant before: Suzhou Shashi Biotechnology Co.,Ltd. Applicant before: Shanghai Shashi Biotechnology Co.,Ltd. Applicant before: Zhuhai tuoyu Biotechnology Co.,Ltd. Applicant before: Zhuhai gravel Biotechnology Co.,Ltd. |